BRPI0719446A2 - Uso de il-10 peguilada para tratar câncer - Google Patents

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BRPI0719446A2
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE IL- 10 PEGUILADA PARA TRATAR CÂNCER".
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a usos de moléculas de citocina de mamífero e reagentes relacionados. Mais especificamente, a invenção refere-se à identificação de proteínas citocina de mamífero quimicamente modificadas que podem ser usadas no tratamento de distúrbios proliferati- vos.
Antecedentes da Invenção Cânceres e tumores podem ser controlados ou erradicados pelo
sistema imune. O sistema imune inclui vários tipos de células linfóide e mie- lóide, por exemplo, monócitos, macrófagos, células dendríticas (DCs), eosi- nófilos, células T, células B e neutrófilos. Essas células linfóide e mielóide produzem proteínas de sinalização secretadas conhecidas como citocinas. As citocinas incluem, por exemplo, interleucina-10 (IL-10), interferon-gama (IFNy), IL-12 e IL-23. Resposta imune inclui inflamação, isto é, o acúmulo de células imunes sistemicamente ou em um local particular do corpo. Em res- posta a um agente infectivo ou substância estranha, células imunes secre- tam citocinas que, por sua vez, modulam proliferação, desenvolvimento, dife- renciação ou migração de célula imune. Resposta imune excessiva pode produzir conseqüências patológicas, tal como distúrbios autoimunes, en- quanto resposta imune prejudicada pode resultar em câncer. Resposta anti- tumor pelo sistema imune inclui imunidade inata, por exemplo, como media- da por macrófagos, células NK, e neutrófilos, e imunidade adaptativa, por exemplo, conforme mediada por células apresentando antígeno (APCs), células T e células B (vide, por exemplo, Abbas e outros (Eds.) (2000) Celu- lar and Molecular Immunology, W.B. Saunders Co., Filadélfia, PA; Oppe- nheim and Feldmann (Eds.) (2001) Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, Ca; von Andrian and Mackay (2000) New Engi J. Med. 343:1020-1034; Davidson and Diamond (2001) New Engl. J. Med. 345:340- 350).
Métodos de modulação de resposta imune têm sido usados no tratamento de cânceres, por exemplo, melanoma. Esses métodos incluem tratamento ou com citocinas tal como IL-2, IL-10, IL-12, fator-alfa de necrose de tumor (TNFafal), IFNy, fator de estimulação de colônia de granulócito ma- crófago (GM-CSF) e fator de crescimento transformante (TGF) ou com anta- gonistas de citocina (por exemplo, anticorpos), lnterleucina-10 foi primeiro caracterizada como um fator inibidor de síntese de citocina (CSIF; vide, por exemplo, Fiorentino e outros (1989) J. Exp. Med. 170:2081-2095). IL-10 é uma citocina pleiotrópica produzida por células T, células B, monócitos, que pode funcionar ambos como um imunossupressor e imunoestimulante (vide, por exemplo, Groux e outros (1998) J. Immunol. 160:3188-3193; e Hagen- baugh e outros (1997) J. Exp. Med. 185:2101-2110).
Modelos animais sugerem que IL-10 pode induzir ativação de célula NK e facilitar destruição de célula alvo de uma maneira dependente da dose (vide, por exemplo, Zheng e outros (1996) J. Exp. Med. 184:579- 584; Kundu e outros (1996) J. Natl. Câncer Inst. 88:536-541). Estudos adi- cionais indicam que a presença de IL-10 no microambiente de tumor se rela- ciona com melhor sobrevivência do paciente (vide, por exemplo, Lu e outros (2004) J. Clin. Oncol. 22:4575-4583).
Infelizmente, a meia-vida no soro para IL-10 é relativamente cur- ta, isto é, 2-6 horas (vide, por exemplo, Smith e outros (1996) Cellular Immu- nol. 173:207-214). A presente invenção se direciona a este problema através da provisão de métodos de uso de uma forma engenheirada de IL-10, por exemplo, uma IL-10 peguilada, para tratar câncer. Em adição a uma meia- vida no soro mais longa, a forma peguilada de IL-1 surpreendentemente exi- biu atividade de morte de tumor grande, por exemplo, através de grande re- crutamento de células T CD8+ para o sítio de tumor, quando comparado com IL-10 não-peguilada. Sumário da Invenção
A presente invenção é baseada na constatação de que IL-10 peguilada é um modulador aperfeiçoado de crescimento de tumor.
A presente invenção provê método de inibição ou redução de crescimento de um tumor ou câncer compreendendo contato do tumor com uma quantidade eficaz de uma interleucina-10 peguilada (PEG-IL-10). Em uma modalidade, a PEG-IL-10 é mono-PEG-IL-10. A PEG-IL-10 compreende um Iigante SC-PEG-IL-12K. Em modalidades alternativas, a PEG-IL-10 com- preende um Iigante metóxi-PEG-aldeído (PALD-PEG). Em certas modalida- des o Iigante PALD-PEG compreende uma molécula de PEG tendo um peso molecular selecionado do grupo consistindo em 5 KDa1 12 KDa ou 20 KDa. A PEG-IL-10 inibe crescimento do tumor ou câncer ou a PEG-IL-10 reduz o tamanho do tumor ou câncer. A PEG-IL-10 aumenta a infiltração de células T CD8+ no tumor quando comparado com IL-10 não-peguilada. Em outra mo- dalidade, PEG-IL-10 aumenta a expressão de pelo menos uma citocina in- flamatória, que pode ser selecionada do grupo consistindo em IFNy, IL-4, IL- 6, IL-10 e Iigante RANK (RANK-L). Em certas modalidades, a PEG-IL-10 é co-administrada com pelo menos um agente quimioterapêutico. O agente quimioterapêutico pode ser pelo menos um dos agentes quimioterapêuticos da Tabela 16. Em certas modalidades, o tumor ou câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de colo, câncer ovariano, câncer de mama, melanoma, câncer de pulmão, glioblastoma e leucemia.
A presente invenção compreende um método de tratamento de um indivíduo sofrendo de um câncer ou tumor compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de PEG-IL-10. Em uma modalidade, a PEG-IL-10 é mono-PEG-IL-10. A PEG-IL-10 compreende um Iigante SC- PEG-12K. Em outra modalidade, a PEG-IL-10 compreende um Iigante metó- xi-PEG-aldeído (PALD-PEG) que pode ter um peso molecular selecionado do grupo consistindo em 5 KDa, 12 KDa ou 20 KDa. PEG-IL-10 inibe cresci- mento do câncer ou tumor ou reduz o tamanho do tumor ou câncer. PEG-IL- aumenta a infiltração de células T CD8+ no tumor quando comparado com IL-10 não-peguilada. Em outra modalidade, PEG-IL-10 aumenta a ex- pressão de pelo menos uma citocina inflamatória. A citocina inflamatória é selecionada do grupo consistindo em IFNy, IL-4, IL-6, IL-10 e RANK-L. Em certas modalidades, a PEG-IL-10 é co-administrada com pelo menos um agente quimioterapêutico. O agente quimioterapêutico pode ser pelo menos um dos agentes quimioterapêuticos da Tabela 16. PEG-IL-10 reduz metás- tase de um câncer ou tumor. Em uma modalidade adicional, o tumor ou cân- cer é selecionado do grupo consistindo em câncer de colo, câncer ovariano, câncer de mama, câncer de pulmão, melanoma, glioblastoma e leucemia. Em certas modalidades, o indivíduo sendo tratado é humano e a PEG-IL-10 é PEG-IL-10 humana (PEG-hlL-10). Descrição Detalhada
Conforme aqui usado, incluindo as reivindicações apensas, as formas singulares de palavras tal como "um, uma" e "o, a" incluem suas refe- rências no plural correspondentes a menos que o contexto dite claramente o contrário. Todas as referências mencionadas aqui são incorporadas a título de referência até o mesmo ponto como se cada publicação, pedido de pa- tente ou patente individual fosse especificamente e individualmente indicado estar incorporado a título de referência. I. Definições
"Ativação", "estimulação" e "tratamento", se aplicando a células
ou a receptores, podem ter o mesmo significado, por exemplo, ativação, es- timulação ou tratamento de uma célula ou receptor com um ligante, a menos que de outro modo indicado pelo contexto ou explicitamente. "Ligante" com- preende Iigantes naturais e sintéticos, por exemplo, citocinas, variantes de citocina, análogos, muteínas e composições de ligação derivadas de anti- corpos. "Ligante" também compreende moléculas pequenas, por exemplo, miméticos de peptídeo de citocina e miméticos de peptídeo de anticorpos. "Ativação" pode se referir à ativação de célula conforme regulado por meca- nismos internos bem como por fatores externos ou ambientais. "Resposta", por exemplo, de uma célula, tecido, órgão ou organismo compreende uma mudança em comportamento bioquímico ou fisiológico, por exemplo, con- centração, densidade, adesão ou migração dentro de um compartimento biológico, taxa de expressão de gene ou estado de diferenciação, onde a mudança está relacionada com ativação, estimulação ou tratamento ou com mecanismos internos tal como programação genética.
"Atividade" de uma molécula pode descrever ou referir-se à liga- ção da molécula a um ligante ou a um receptor, para atividade catalítica; à habilidade em estimular expressão de gene ou sinalização, diferenciação ou maturação celular; à atividade antigênica, à modulação de atividades de ou- tras moléculas e similar. "Atividade" de uma molécula pode também se refe- rir à atividade em modulação ou manutenção de interações célula-para- célula, por exemplo, adesão, ou atividade na manutenção da estrutura de uma célula, por exemplo, membranas celulares ou citoesqueleto. "Atividade" pode também significar atividade específica, por exemplo, [atividade catalíti- ca]/[mg proteína] ou [atividade imunológica]/[mg proteína], concentração em um compartimento biológico ou similar. "Atividade proliferativa" compreende uma atividade que promove, que é necessária para ou que é especificamen- te associada com, por exemplo, divisão celular normal, bem como câncer, tumores, displasia, transformação celular, metástase e angiogênese.
"Administração" e "tratamento", se aplicado a um animal, ser humano, indivíduo experimental, célula, tecido, órgão ou fluido biológico, referem-se a contato de um agente, composto ou composição de diagnósti- co, terapêutico, farmacêutico exógeno com o animal, ser humano, indivíduo, célula, tecido, órgão ou fluido biológico. "Administração" e "tratamento" po- dem se referir a, por exemplo, terapêuticos, placebo, farmacocinéticos, diag- nóstico, pesquisa e métodos experimentais. "Tratamento de uma célula" compreende contato de um reagente com a célula, bem como contato de um reagente com um fluido, onde o fluido está em contato com a célula. "Admi- nistração" e "tratamento" também significam tratamentos in vitro e ex vivo, por exemplo, de uma célula, por uma composição reagente, de diagnóstico, ligação ou por outra célula. "Tratamento", como se aplica a um indivíduo humano, veterinário ou de pesquisa, refere-se a medidas de tratamento te- rapêutico, profiláticas ou preventivas, para aplicações em pesquisa e diag- nóstico. "Tratamento", como se aplica a um indivíduo humano, veterinário ou de pesquisa, ou célula, tecido ou órgão, compreende contato da PEG-IL-10 com um indivíduo humano ou animal, uma célula, tecido, compartimento fisi- ológico ou fluido fisiológico. "Tratamento de uma célula" também compreen- de situações onde PEG-IL-10 contata receptor de IL-10 (heterodímero de IL- 10R1 e IL-10R2), por exemplo, na fase fluida ou fase coloidal, bem como situações onde um agonista ou antagonista de IL-10 contata um fluido, por exemplo, onde o fluido está em contato com uma célula ou receptor, mas onde não foi demonstrado que o agonista ou antagonista contata diretamen- te a célula ou receptor.
"Caquexia" é uma síndrome de enfraquecimento envolvendo
perda de músculo (enfraquecimento muscular) e gordura, resultante de um distúrbio no metabolismo. A caquexia acontece em vários cânceres ("caque- xia de câncer"), distúrbio obstrutivo pulmonar crônico (COPD), falência de órgão avançada e AIDS. Caquexia de câncer é caracterizada por, por exem- pio, perda de peso acentuada, anorexia, astenia e anemia. Anorexia é um distúrbio resultante da falta de motivação em comer, por exemplo, aversão à comida (vide, por exemplo, MacDonaId e outros (2003) J. Am. Coll. Surg. 197:143-161; Rubin (2003) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100:5384-5389; Tis- dale (2002) Nature Reviews Câncer 2:862-871; Argiles e outros (2003) Drug Discovery Today 8:838-844; Lelli e outros (2003) J. Chemother. 15:220-225; Argiles e outros (2003) Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 6:401-406).
"Variantes de PEG-IL-10 conservativamente modificadas" se aplica a ambas as seqüências de aminoácido e ácido nucleico. Com relação a seqüências de ácido nucleico particulares, variantes conservativamente modificadas referem-se àqueles ácidos nucleicos que codificam seqüências de aminoácido idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucle- ico não codifica uma seqüência de aminoácido, para seqüências de ácido nucleico essencialmente idênticas. Por causa da degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos pode codificar qualquer dada proteína.
Como para seqüências de aminoácido, um versado vai reconhe- cer que uma substituição individual para uma seqüência de ácido nucleico, peptídeo, polipeptídio ou proteína que substitui um aminoácido conservado por um aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidos na se- quência codificada é uma "variante conservativamente modificada". Tabelas de substituição conservativa provendo aminoácidos funcionalmente similares são bem-conhecidas na técnica. Um exemplo de substituição conservativa é a troca de um aminoácido em um dos grupos que seguem por outro aminoá- cido do mesmo grupo (Pat. U.S. N0 5.767.063 expedida para Lee e outros; Kyte e Doolittle (1982) J. MoL Biol. 157:105-132);
(1) Hidrofóbica: Norleucina, lie, Vai, Leu, Phe, Cys ou Met;
(2) Hidrofílica neutra: Cys, Ser, Thr;
(3) Ácida: Asp, Glu;
(4) Básica: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) Resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly1 Pro;
(6) Aromática: Trp, Tyr, Phe;
(7) Aminoácidos pequenos: Gly, Ala, Ser.
"Quantidade eficaz" compreende uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir um sintoma ou sinal da condição médica. Quantidade eficaz também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar diagnóstico. Uma quantidade eficaz de um paciente ou indivíduo veterinário particular pode variar dependendo de fatores tal como a condição sendo tra- tada, a saúde geral do paciente, o método, via e dose de administração e a severidade de efeitos colaterais (vide, por exemplo, Pat. U.S. N0 5.888.530 expedida para Netti e outros). Uma quantidade eficaz pode ser a dose má- xima ou protocolo de dosagem que evita efeitos colaterais ou efeitos tóxicos significantes. O efeito vai resultar em uma melhora de uma medida de diag- nóstico ou parâmetro em pelo menos 5%, geralmente em pelo menos 10%, geralmente pelo menos 20%, geralmente em pelo menos 30%, de preferên- cia pelo menos 40%, com mais preferência pelo menos 50%, com mais pre- ferência pelo menos 60%, idealmente pelo menos 70%, mais idealmente pelo menos 80% e mais idealmente de todos pelo menos 90%, onde 100% é definido como o parâmetro de diagnóstico mostrado por um indivíduo normal (vide, por exemplo, Maynard e outros (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinicai Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Labo- ratoryand Good Clinicai Practice, Urch Publ., Londres, UK). Uma quantidade eficaz de PEG-IL-10 seria uma quantidade suficiente para reduzir um volume de tumor, inibir crescimento de tumor, prevenir metástase ou aumentar infil- tração de célula T CD8+ no sítio de tumor. "Exógeno" refere-se a substâncias que são produzidas fora de um organismo, célula ou corpo humano, dependendo do contexto. "Endóge- no" refere-se a substâncias que são produzidas dentro de uma célula, orga- nismo ou corpo humano, dependendo do contexto.
"Condição imune" ou "distúrbio imune" compreende, por exem-
plo, inflamação patológica, um distúrbio inflamatório e um distúrbio ou doen- ça autoimune. "Condição imune" refere-se também a infecções, infecções persistentes e condições proliferativas, tal como câncer, tumores e angiogê- nese, incluindo infecções, tumores e cânceres que resistem à irradiação pelo sistema imune. "Condição cancerosa" inclui, por exemplo, câncer, células cancerosas, tumores, angiogênese e condições pré-cancerosas tal com dis- plasia.
"Inibidores" e "antagonistas" ou "ativadores" e "agonistas" refe- rem-se a moléculas inibidoras ou de ativação, respectivamente, por exem- pio, para a ativação de, por exemplo, um ligante, receptor, co-fator, gene, célula, tecido ou órgão. Um modulador de, por exemplo, um gene, um recep- tor, um ligante ou uma célula é uma molécula que altera a atividade de um gene, receptor, ligante ou célula, onde atividade pode ser ativada, inibida ou alterada em suas propriedades reguladoras. O modulador pode agir sozinho ou ele pode usar um co-fator, por exemplo, uma proteína, íon de metal ou molécula pequena. Inibidores são compostos que diminuem, bloqueiam, previnem, retardam ativação, inativação, dessensibilização ou sub-regulam, por exemplo, de um gene, proteína, ligante, receptor ou célula. Ativadores são compostos que aumentam, ativa, facilitam, aumentam a atividade, sen- sibilização ou supra-regulam, por exemplo, de um gene, proteína, ligante, receptor ou célula. Um inibidor pode ser também definido como uma compo- sição que reduz, bloqueia ou inativa uma atividade constitutiva. Um "agonis- ta" é um composto que interage com um alvo para causar ou promover um aumento na ativação do alvo. Um "antagonista" é um composto que se opõe às ações de um agonista. Um antagonista previne, reduz, inibe ou neutraliza a atividade de um agonista. Um antagonista pode também prevenir, inibir ou reduzir atividade constitutiva de um alvo, por exemplo, um receptor alvo, mesmo onde não há nenhum agonista identificado.
Para examinar o grau de inibição, por exemplo, amostras ou en- saios compreendendo um dado, por exemplo, proteína, gene, célula ou or- ganismo são tratadas com um ativador ou inibidor potencial e são compara- dos com amostras controle sem o inibidor. Amostras controle, isto é, não tratadas com antagonista, são designadas com um valor de atividade relativa de 100%. Inibição é conseguida quando o valor de atividade relativo para o controle é cerca de 90% ou menos, tipicamente 85% ou menos, mais tipica- mente 80% ou menos, mais tipicamente 75% ou menos, geralmente 70% ou menos, mais geralmente 65% ou menos, mais geralmente 60% ou menos, tipicamente 55% ou menos, geralmente 50% ou menos, mais geralmente 45% ou menos, mais geralmente 40% ou menos, de preferência 35% ou menos, com mais preferência 30% ou menos, com mais preferência ainda 25% ou menos e com mais preferência menos do que 25%. Ativação é con- seguida quando o valor de atividade relativo ao controle é cerca de 110%, geralmente pelo menos 120%, mais geralmente pelo menos 140%, mais ge- ralmente pelo menos 160%, freqüentemente pelo menos 180%, mais fre- qüentemente pelo menos duas vezes, mais freqüentemente pelo menos 2,5 vezes, geralmente pelo menos 5-vezes, mais geralmente pelo menos 10 ve- zes, de preferência pelo menos 20 vezes, com mais preferência pelo menos 40 vezes e com mais preferência mais de 40 vezes ou mais.
Pontos finais em ativação ou inibição podem ser monitorados como segue. Ativação, inibição e resposta a tratamento, por exemplo, de uma célula, fluido fisiológico, tecido, órgão e indivíduo animal ou humano, podem ser monitoradas por um ponto final. O ponto final pode compreender uma quantidade ou porcentagem predeterminada de, por exemplo, um indí- cio de inflamação, oncogenicidade ou desgranulação ou secreção celular, tal como a liberação de uma citocina, oxigênio tóxico ou uma protease. O ponto final pode compreender, por exemplo, uma quantidade predeterminada de fluxo ou transporte de íon; migração celular; adesão celular; proliferação ce- lular; potencial para metástase; diferenciação celular; e mudança em fenóti- po, por exemplo, mudança em expressão de gene se relacionando à infla- mação, apoptose, transformação, ciclo celular ou metástase (vide, por e- xemplo, Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci., 30:145-158; Hood e Cheresh (2002) Nature Rev. Câncer, 2:91-100; Timme e outros (2003) Curr. Drug Targets, 4:251-261; Robbins e Itzkowitz (2002) Med. Clin North. Am., 86:1467-1495; Grady e Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Ge- net., 3:101-128; Bauer e outros (2002) Glia 36:235-243; Stanimirovic e Satho (2000) Brain Pathol., 10:113-126).
Um ponto final de inibição é geralmente 75% do controle ou me- nos, de preferência 50% do controle ou menos, com mais preferência 25% do controle ou menos e com mais preferência 10% do controle ou menos. Em geral, um ponto final de ativação é pelo menos 150% do controle, de preferência pelo menos duas vezes o controle, com mais preferência pelo menos quatro vezes o controle e com mais preferência pelo menos 10 vezes o controle.
Uma composição que é "marcada" é detectável, ou diretamente
ou indiretamente, através de métodos espectroscópicos, fotoquímicos, bio- químicos, imunoquímicos, isotópicos ou químicos. Por exemplo, rótulos úteis incluem 32P, 33P, 35S, 14C, 3H, 125I, isótopos estáveis, corantes fluorescentes, reagentes densos em elétron, substratos, rótulos de epítopo ou enzimas, por exemplo, conforme usado em imunoensaios ligados à enzima, ou fluorettes (vide, por exemplo, Rozinov e Nolan (1998) Chem. Biol. 5:713-728).
"Ligante" refere-se a, por exemplo, uma molécula pequena, pep- tídeo, polipeptídio e molécula associada à membrana ou ligada à membrana, ou complexo dos mesmos, que podem agir como um agonista ou antagonis- ta de um receptor. "Ligante" também compreende um agente que não é um agonista ou antagonista, mas pode se ligar ao receptor sem influenciar signi- ficantemente suas propriedades biológicas, por exemplo, sinalização ou a- desão. Além disso, "ligante" inclui um ligante ligado à membrana que foi mu- dado, por exemplo, através de métodos químicos ou recombinantes, para uma versão solúvel do ligante ligado à membrana. Por convenção, onde um ligante for ligado à membrana em uma primeira célula, o receptor geralmente acontece em uma segunda célula. A segunda célula pode ter a mesma iden- tidade ou uma diferente da primeira célula. Um Iigante ou receptor pode ser totalmente intracelular, isto é, ele pode residir no citosol, núcleo ou algum outro compartimento intracelular. O Iigante ou receptor pode mudar sua loca- lização, por exemplo, de um compartimento intracelular para a superfície externa da membrana de plasma. O complexo de um Iigante e receptor é chamado um "complexo de receptor ligante". Onde um Iigante e um receptor estão envolvidos em um curso de sinalização, o ligante acontece em uma posição a montante e o receptor acontece em uma posição a jusante do cur- so de sinalização.
"Moléculas pequenas" são providas para o tratamento de fisiolo-
gia e distúrbios de tumores e cânceres. "Molécula pequena" é definida como uma molécula com um peso molecular que é menos do que 10 kD, tipica- mente menos do que 2 kD e de preferência menos do que 1 kD. Moléculas pequenas incluem, mas não estão limitadas a, moléculas inorgânicas, molé- cuias orgânicas, moléculas orgânicas contendo um componente inorgânico, moléculas compreendendo um átomo radioativo, moléculas sintéticas, mimé- ticos de peptídeo e miméticos de anticorpo. Como um terapêutico, uma mo- lécula pequena pode ser mais permeável a células, menos suscetível à de- gradação e menos apta a elicitar uma resposta imune do que moléculas grandes. Moléculas pequenas, tal como miméticos de peptídeo de anticor- pos e citocinas, bem como toxinas de molécula pequena são descritas (vide, por exemplo, Casset e outros (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:198-205; Muyldermans (2001) J. Biotechnol. 74:277-302; Li (2000) Nat. Biotechnol. 18:1251-1256; Apostolopoulos e outros (2002) Curr. Med. Chem. 9:411-420; Monfardini e outros (2002) Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199; Do- mingues e outros (1999) Nat. Struct. Biol. 6.652-656; Sato e Sone (2003) Biochem. J. 371:603-608; Patente U.S. N0 6.326.482 expedida para Stewart e outros).
Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem a- gentes de alquilação tal como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN®); sulfo- natos de alquila tal como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridi- nas tal como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas; e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trieti Ienofosfo- ramida, trietilenotiofosforamida e trimetilolmelamina nitrogênio mostardas tal como chiorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembichi- na, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, uracil mostarda; nitrosouréias tal como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, rani- mustina; antibióticos tal como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, calicheamicina, carabicina, carmino- micina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorru- bicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubi- cina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zor- rubiccina; antimetabólitos tal como metotrexato e 5-fluoruracila (5-FU); aná- logos de ácido fólico tal como denopterina, metotrexato, pteropterina, trime- trexato; análogos de purina tal como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamipri- na, tioguanina; análogos de pirimidina tal como ancitabina, azacitidina, 6- azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; androgênios tal como calusterona, propionato de dromos- tanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais tal como ami- noglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolevulínico; amsa- crina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazi- quona; elfornitina; acetato de eliptínio; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiu- réia; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; phenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilidrazida; pro- carbazina; PSK®; razoxana; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretana; vindesina; dacarbazina; ma- nomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL® Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) e docetaxel (Taxotere®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucil; gencitabina; 6- tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tal como cis- platina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorrelbina; navelbina; novantrona;
teniposídeo; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT11; inibi- dor de topoisomerase RFS 2000; difluormetílornitina (DMFO); ácido retinói- co; esperamicinas; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceutica- mente aceitáveis de qualquer um dos acima. Também incluídos nesta defini- ção estão agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir ação de hormônios sobre tumores tal como antiestrogênios incluindo, por exemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazóis de inibição de aromatase, 4- hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremife- no (Fareston); e antiandrogênios tal como flutamida, nilutamida, bicalutami- da, Ieuprolida e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima.
Se liga "especificamente" ou "seletivamente", quando se referin- do a um ligante/receptor, anticorpo/antígeno, ou outro par de ligação, indica uma reação de ligação que é determinativa da presença da proteína em uma população heterogênea de proteína e outros biológicos. Então, sob condi- ções planejadas, um Iigante específico se liga a um receptor particular e não se liga em uma quantidade significante às outras proteínas presentes na amostra. O anticorpo, ou composição de ligação derivada do sítio de ligação de antígeno de um anticorpo, do método compreendido se liga a seu antíge- no, ou uma variante ou muteína do mesmo, com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior, de preferência pelo menos dez vezes maior, com mais preferência pelo menos 20 vezes maior e com mais preferência pelo menos 100 vezes maior do que a afinidade com qualquer outro anticorpo ou composição de ligação derivada do mesmo. Em uma modalidade preferida o anticorpo terá uma afinidade que é maior do que cerca de 109 litros/mol, con- forme determinado, por exemplo, pela análise Scatchard (Munsen e outros (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239).
"lnterleucina-10" ou "IL-10", conforme aqui usado, seja conjuga- da a um polietileno glicol, ou em uma forma não-conjugada, é uma proteína compreendendo duas subunidades não-covalentemente unidas para formar um homodímero. Conforme aqui usado, a menos que de outro modo indica- do, "interleucina-10" e "IL-10" podem se referir a IL-10 humana ou de ca- mundongo (Nos. de Acesso no Genbank NP_000563; M37897; ou US 6.217.857) que são também referidas como "hlL-10" ou "mlL-10".
"IL-10 peguilada" ou "PEG-IL-10" é uma molécula de IL-10 tendo uma ou mais moléculas de polietileno glicol covalentemente ligadas a um ou mais de um resíduo de aminoácido da proteína IL-10 através de um ligante, de modo que a ligação é estável. Os termos "IL-10 monopeguilada" e "mono- PEG-IL-10" significam que a molécula de polietileno glicol é covalentemente ligada a um resíduo de aminoácido único em uma subunidade do dímero de IL-10 através de um ligante. O peso molecular médio da porção PEG está de preferência entre cerca de 5.000 e cerca de 50.000 daltons. O método ou sítio de ligação de PEG à IL-10 não é crítico, mas de preferência a peguila- ção não altera, ou altera minimamente, a atividade da molécula biologica- mente ativa. De preferência, o aumento na meia-vida é maior do que qual- quer diminuição em atividade biológica. Para PEG-IL-10, atividade biológica é tipicamente medida através de avaliação dos níveis de citocinas inflamató- rias (por exemplo, TNFa, IFNy) no soro de indivíduos provocados com um antígeno bacteriano (lipopolissacarídeo, LPS) e tratados com PEG-IL-10, conforme descrito na US 7.052.686.
Conforme aqui usado, "meia-vida no soro", "abreviada "ti/2", sig- nifica meia-vida de eliminação, isto é, o momento quando a concentração no soro de um agente atingiu metade de seu valor inicial ou máximo, O termo "meia-vida no soro alta" usado aqui em referência a um agente sintético sig- nifica que o agente sintético é eliminado em uma taxa mais lenta do que ou o agente não-sintético, endógeno ou a versão recombinantemente produzida do mesmo. II. Geral
A presente invenção provê métodos de tratamento de distúrbios proliferativos, por exemplo, câncer, tumores, etc, com uma IL-10 peguilada. IL-10 induz atividade citotóxica de células T CD8, produção de anticorpo de célula B e suprime atividade de macrófago e inflamação de promoção de tumor (vide Chen e Zlotnik (1991) J. Immunol. 147:528-534; Groux e outros (1999) J. Immunol. 162:1723-1729; e Bergman e outros (1996) J. Immunol.
157:231-238). A regulagem de células CD8 é dependente da dose, onde as doses maiores induzem respostas citotóxicas mais fortes, no entanto a utili- dade de hlL-10 recombinante é limitada pela sua meia-vida curta. PEG-IL-10 mostrou uma propriedade inesperada de aumento da infiltração de células T CD8+ de um tumor, bem como aumento da expressão de citocinas inflama- tórias que desempenham um papel em imunidade de tumor. Tratamento com PEG-IL-3 deve então prover uma melhora significante para tratamento de tumor.
III. Polietileno Glicol ("PEG")
Polietileno glicol ("PEG") é uma porção química que foi usada na preparação de produtos de proteína terapêuticos. O verbo "peguilado" signi- fica ligar pelo menos uma molécula de PEG a outra molécula, por exemplo, uma proteína terapêutica. Por exemplo, Adagen, uma formulação peguilada de adenosina desaminase, é aprovada para tratamento de doença de imu- nodeficiência combinada severa; superóxido dismutase peguilada tem sido usada em testes clínicos para tratamento de lesão à cabeça; alfa interferon peguilado tem estado em testes clínicos de fase I para tratamento de hepati- te; glicocerebrosidase peguilada e hemoglobina peguilada são relatadas es- tar em testes pré-clínicos. A ligação de polietileno glicol foi mostrada prote- ger contra proteólise (vide, por exemplo, Sada e outros (1991) J. Fermentati- on Bioengineering 71:137-139).
Em sua forma mais comum, PEG é um poliéter linear ou ramifi- cado terminado com grupos hidroxila e tendo a estrutura geral:
HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
Para acoplar PEG a uma molécula (polipeptídio, polissacarídeos, polinucleotídeos e moléculas orgânicas pequenas) é necessário ativar a PEG através da preparação de um derivado da PEG tendo um grupo funcio- nal em um ou ambos os terminais. A via mais comum para conjugação de PEG de proteínas tem sido ativar a PEG com grupos funcionais adequados para reação com Iisina e grupos aminoácido N-terminais. Em particular, os grupos reativos mais comuns envolvidos em acoplamento de PEG a polipep- tídios são os grupos alfa e épsilon amino de lisina.
A reação de um Iigante de peguilação com uma proteína leva à ligação da porção PEG predominantemente nos sítios que seguem: o grupo alfa amino no N-terminal da proteína, o grupo épsilon amino na cadeia lateral de resíduos lisina e o grupo imidazol na cadeia lateral de resíduos histidina. Uma vez que a maioria das proteínas recombinantes possui um único grupo alfa e vários épsilon amino e imidazol, vários isômeros posicionais podem ser gerados dependendo da química do ligante.
Duas PEGs monometóxi ativadas de primeira geração ampla- mente usadas (mPEGs) foram carbonato de succinimidila PEG (SC-PEG; vide, por exemplo, Zalipsky e outros (1992) Biotechnol. Appl. Biochem. 15:100-114; e Miron e Wilcheck (1993) Bioconjug. Chem. 4:568-569) e PEG carbonato de benzotriazol (BTC-PEG; vide, por exemplo, Dolence e outros, Patente U.S. N0 5.650.234), que reagem de preferência com resíduos lisina para formar uma ligação carbamato, mas são também conhecidas reagir com resíduos histidina e tirosina. A ligação a resíduos histidina em IFNa foi mostrada ser uma ligação imidazolcarbamato hidroliticamente instável (vide, por exemplo, Lee e McNemar1 Patente U.S. N0 5.985.263).
Tecnologia de PEGuilação de segunda geração foi projetada para evitar essas ligações instáveis bem como a falta de seletividade em reatividade de resíduo. Uso de um ligante de PEG-aldeído se direciona a um sítio único no N-terminal de um polipeptídio através de aminação redutiva. IL-10 pode ser peguilada usando tipos diferentes de Iigantes e pH para che- gar a várias formas de uma molécula peguilada (vide, por exemplo, US 5.252.714, US 5.643.575, US 5.919.455, US 5.932.462, US 5.985.263 e US 7.052.686). IV. Atividade Biológica de PEG-IL-10
IL-10 humana induz desenvolvimento rápido de anticorpos de neutralização quando administrada a camundongos imunocompetentes. Pa- ra evitar este tipo de neutralização, administração subcutânea de PEG-hlL- 10 foi dada a um camundongo deficiente em células B, isto é, camundongos incapazes de produzir uma resposta de anticorpo. Tumores singenéicos bem estabelecidos nesses camundongos imunodeficientes foram ou significante- mente retardados em crescimento ou rejeitados completamente pela PEG- hll_-10. A restrição ou inibição de crescimento de tumor foi dependente de ambas as células T CD4 e CD8. Quando da depleção de células CD8, o efei- to inibidor de PEG-hlL-10 foi completamente abrogado. Então, PEG-hlL-10 induz respostas citotóxicas mediadas por CD8.
Análise adicional de tecido de tumor mostrou que PEG-IL-10 aumentou a infiltração de células T CD8+ no tumor em um nível maior do que aquele de IL-10 não-peguilada. O nível de expressão de citocina infla- matória pelas células CD8 infiltrantes foi também maior com tratamento com PEG-IL-10 comparado com tratamento com IL-10 não-peguilado. Tratamento de pacientes com tumor com PEG-IL-10 deve induzir uma resposta antitu- mor significante e conferir um benefício terapêutico significante. Uma proteína IL-10 usada na presente invenção contém uma
seqüência de aminoácido que compartilha uma homologia observada de pe- lo menos 75%, com mais preferência pelo menos 85% e com mais preferên- cia pelo menos 90% ou mais, por exemplo, pelo menos 95%, com a seqüên- cia de uma proteína IL-10 madura, isto é, sem quaisquer seqüências líder. Vide, por exemplo, Pat. U.S. N0 6.217.857. Homologia de seqüência de ami- noácido, ou identidade de seqüência, é determinada através da otimização de combinações de resíduo e, se necessário, através de introdução de lacu- nas conforme necessário. Seqüências de aminoácido homólogas são tipica- mente pretendidas incluir variações alélicas naturais, polimórficas e interes- pécies em cada respectiva seqüência. Proteínas ou peptídeos homólogos típicos terão de a partir de 25-100% de homologia (se lacunas puderem ser introduzidas) a 50-100% de homologia (se substituições conservativas forem incluídas) com a seqüência de aminoácido do polipeptídio da IL-10. Vide Needleham e outros, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Sankoff e outros em Time Warps, String Edits e Macromolecules: The Theory and Practice of Se- quence Comparison, 1983, Addison-Wesley, Reading, Mass.; e pacotes de software da InteIIiGenetics1 Mountain View, Calif., e do University of Wiscon- sin Genetics Computer Groups, Madison, Wis.
A porção de IL-10 nos conjugados de PEG-IL-10 pode ser glico- silada ou pode ser modificada com muteínas não-glicosiladas ou outros aná- logos, incluindo a proteína BCRF1 (IL-10 viral do Vírus Epstein Barr). Modifi- cações de seqüência codificando IL-10 podem ser feitas usando uma varie- dade de técnicas, por exemplo, mutagênese direcionada a sítio [Gilman e outros, Gene, 8:81-97 (1979); Roberts e outros, Nature, 328:731-734 (1987)] e podem ser avaliadas através de avaliação de rotina em um ensaio ade- quado para atividade de IL-10. Proteínas IL-10 modificadas, por exemplo, variantes, podem variar da seqüência de ocorrência natural no nível de es- trutura primária. Tais modificações podem ser feitas através de inserções, substituições, deleções e fusões de aminoácido. Variantes de IL-10 podem ser preparadas com vários objetivos em mente, incluindo aumento da meia- vida no soro, redução de uma resposta imune contra a IL-10, facilitação de purificação ou preparação, diminuição da conversão de IL-10 em suas subu- nidades monoméricas, melhora da eficácia terapêutica e diminuição da gra- vidade ou ocorrência de efeitos colaterais durante uso terapêutico. As vari- antes de seqüência de aminoácido são geralmente variantes predetermina- das não encontradas na natureza, embora outras possam ser variantes pós- traducionais, por exemplo, variantes glicosiladas. Qualquer variante de IL-10 pode ser usada na presente invenção contanto que ela retenha um nível a- dequado de atividade de IL-10. No contexto de tumor, atividade de IL-10 a- dequada seria, por exemplo, infiltração de célula T CD8+ em sítios de tumor, expressão de citocinas inflamatórias, tal como IFNy, IL-4, IL-6, IL-10 e RANK-L, a partir dessas células infiltrantes, níveis altos de TNFa ou IFNy em amostras biológicas.
IL-10 usada na presente invenção pode ser derivada de um mamífero, por exemplo, ser humano ou camundongo. IL-10 humana (hlL-10) é preferida para tratamento de seres humanos com necessidade de trata- mento com IL-10. IL-10 usada na presente invenção é de preferência uma IL-10 recombinante. Métodos descrevendo a preparação de IL-10 humana e de camundongo podem ser encontrados na Patente U.S. N0 5.231.012. Também incluídas estão variantes de ocorrência natural ou conservativa- mente substituídas de IL-10 humana e de camundongo. Em outra modalida- de da presente invenção, IL-10 pode ser de origem viral. A clonagem e a expressão de uma IL-10 viral do vírus Epstein Barr (proteína BCRF1) são reveladas em Moore e outros, Science, 248:1230 (1990).
IL-10 pode ser obtida de várias maneiras usando técnicas pa- drão conhecidas no campo, por exemplo, isolada e purificada de meios de cultura de células ativadas capazes de secretar a proteína (por exemplo, células T), quimicamente sintetizada ou técnicas recombinantes (vide, por exemplo, Merrifield, Science 233:341-47 (1986); Atherton e outros, Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, 1989, I.R.L. Press, Oxford, Pat. U.S. N0 5.231.012 que ensina métodos para a produção de proteínas tendo atividade de IL-10, incluindo técnicas recombinantes e outras sintéti- cas). De preferência, proteína IL-10 é obtida de ácidos nucleicos codificando o polipeptídio IL-10 usando técnicas recombinantes. IL-10 humana recombi- nante está também comercialmente disponível, por exemplo, da PeproTech., Inc., Rocky Hill1 N.J.
PEG-IL-10 pode ser feita usando técnicas bem conhecidas no campo. Polietileno glicol (PEG) pode ser sintetizado conforme descrito, por exemplo, em Lundblad, R.L. e outros (1988) Chemical Reagents for Protein Modification CRC Press, Inc., Vol. 1, pp. 105-125. PEG pode ser conjugada à IL-10 através do uso de um Iigante conforme descrito acima. Em certas modalidades, a PEG-IL-10 usada na invenção é mono-PEG-IL-10 onde uma a nove moléculas de PEG são covalentemente ligadas através de um Iigante ao grupo alfa amino do resíduo de aminoácido no N-terminal de uma subu- nidade do dímero de IL-10. IV. Composições terapêuticas. Métodos.
PEG-IL-10 pode ser formulada em uma composição farmacêuti- ca compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz da IL-10 e um veículo farmacêutico. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade suficiente para prover o resultado terapêutico desejado. De pre- ferência, tal quantidade tem efeitos colaterais negativos mínimos. A quanti- dade de PEG-IL-10 administrada para tratar uma condição tratável com IL- é baseada em atividade de IL-10 da proteína conjugada, que pode ser determinada através de ensaios de atividade de IL-10 conhecidos na técni- ca. A quantidade terapeuticamente eficaz para um paciente particular com necessidade de tal tratamento pode ser determinada considerando vários fatores, tal como a condição tratada, a saúde geral do paciente, método de administração, a severidade de efeitos colaterais e similar. No contexto de tumor, atividade de IL-10 adequada seria, por exemplo, infiltrado de célula T CD8 em sítios de tumor, expressão de citocinas inflamatórias, tal como IFNy, IL-4, IL-6, IL-10 e RANK-L, a partir dessas células infiltrantes, níveis altos de TNFa ou IFNy em amostras biológicas.
A quantidade terapeuticamente eficaz de IL-10 peguilada pode variar de a partir de cerca de 0,01 a cerca de 100 pg de proteína por kg de peso do corpo por dia. De preferência, a quantidade de IL-10 peguilada varia de a partir de cerca de 0,1 a 20 pg de proteína por kg de peso do corpo por dia, com mais preferência de a partir de cerca de 0,5 a 10 μg de proteína por kg de peso do corpo por dia e com mais preferência de a partir de cerca de 1 a 4 pg de proteína por peso do corpo por dia. Programas de administração menos freqüentes podem ser empregados usando a PEG-IL-10 da invenção uma vez que esta forma conjugada é de ação mais longa do que IL-10. A IL- peguilada é formulada em forma purificada e substancialmente livre de agregados e outras proteínas. De preferência, PEG-IL-10 é administrada através de infusão contínua de modo que uma quantidade na faixa de cerca de 50 a 800 pg de proteína é aplicada por dia (isto é, cerca de 1 a 16 Mg de proteína por kg de peso do corpo por dia de PEG-IL-10). A taxa de infusão diária pode ser variada com base no monitoramento de efeitos colaterais e de contagens de célula sangüínea.
Para preparar composições farmacêuticas contendo mono-PEG- IL-10, uma quantidade terapeuticamente eficaz de PEG-IL-10 é misturada com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. De preferência, o veículo ou excipiente é inerte. Um veículo farmacêutico pode ser qualquer substância não-tóxica, compatível, adequada para aplicação das composi- ções de IL-10 da invenção a um paciente. Exemplos de veículos adequados incluem solução salina normal, solução de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank. Veículos não-aquosos tal como óleos fixos e oleato de eti- Ia podem ser também usados. Um veículo preferido é dextrose 5%/solução salina. O veículo pode conter quantidades pequenas de aditivos tal como substâncias que aumentam a isotonicidade e estabilidade química, por e- xemplo, tampões e conservantes, vide, por exemplo, Remingtoris Pharma- ceutical Sciences e U.S. Pharmacopoeia: National Formulary, Mack Publi- shing Company, Easton, PA (1984). Formulações de agentes terapêuticos e de diagnóstico podem ser preparadas misturando com veículos, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveis na forma de, por exemplo, pós liofilizados, pastas fluidas, soluções ou suspensões aquosas (vide, por e- xemplo, Hardman e outros (2001) Goodman and GHmaris The Phrmacologi- cal Basis of Therapeutics, McGraw-HiII, Nova York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams e Wilkins, Nova York, NY. Avis e outros (Eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Mareei Dekker, NY; Lieberman e outros (Eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Mareei Dekker, NY; Lieberman e outros (Eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Mareei Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Mareei Dekker, Inc., Nova York, NY).
Composições da invenção podem ser administradas oralmente ou injetadas no corpo. Formulações para uso oral podem também incluir compostos para proteger mais a IL-10 de proteases no trato gastrointestinal. Injeções são geralmente intramusculares, subeutâneas, intradermais ou in- travenosas. Alternativamente, injeção intra-articular ou outras vias poderiam ser usadas em circunstâncias apropriadas.
Quando administrada parenteralmente, IL-10 peguilada é de pre- ferência formulada em uma forma injetável de dosagem unitária (solução, suspensão, emulsão) em associação com um veículo farmacêutico. Vide, por exemplo, Avis e outros, Eds., Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, N.Y. (1993); Lieberman e outros, Eds., Pharmaceutical Dosagem Forms: Tablets, Dekker, N.Y. (1990); e Lieberman e outros, eds., Pharmaceutieal Dosagem Forms: Disperse Systems, Dekker, N.Y. (1990). Alternativamente, composições da invenção podem ser introduzidas no cor- po de um paciente através de sistema de aplicação de fármaco implantável ou injetável, por exemplo, Urquhart e outros, Ann. Rev. Pharmaeoi Toxicoi 24:199-236 (1984); Lewis, ed., Controleed Release of Pestieides and Phar- maeeutieals, Plenum Press, Nova York (1981); Pat. U.S. Nos. 3.773.919; 3.270.960; e similar. A IL-10 peguilada pode ser administrada em veículos aquosos tal como água, solução salina ou veículos tamponados com ou sem vários aditivos e/ou agentes de diluição.
Uma quantidade eficaz para um paciente particular pode variar dependendo de fatores tal como a condição sendo tratada, a saúde geral do paciente, o método, via e dose de administração e a severidade de efeitos colaterais (vide, por exemplo, Maynard e outros (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinicai Praetiee, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinicai Practice, Urch Publ. Londres, UK).
Indivíduos veterinários, experimentais ou de pesquisa típicos incluem macacos, cachorros, gatos, ratos, camundongos, coelhos, porqui- nhos-da-índia, cavalos e seres humanos.
Determinação da dose apropriada pode ser feita pelo médico, por exemplo, usando parâmetros ou fatores conhecidos ou suspeitos na téc- nica de afetar tratamento ou previsto afetar tratamento. Em geral, a dose começa com uma quantidade um pouco menos do que a dose ótima e é aumentada em pequenos incrementos em seguida até que o efeito desejado ou ótimo seja conseguido com relação a quaisquer efeitos colaterais negati- vos. Medidas de diagnóstico importantes incluem aquelas de sintomas da, por exemplo, inflamaçãoou nível de citocinas inflamatórias produzidas. De preferência, um biológicüque será usado é derivado da mesma espécie que o animal alvo para o tslamento, deste modo minimizando uma resposta humoral ao reagente. Máódos para co-administração ou tratamento com um segundo agente terapêtico, por exemplo, uma citocina, esteróide, agente quimioterapêutico, antibitico ou radiação, são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Hartfnan e outros (Eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological is of Therapeutics, 10a ed., McGraw-HiII, Nova York, NY; Poole e Peteeon (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advan- ced Praetiee: A PraetieetApproaeh, Lippincott, Williams & Wilkins, Fila., PA; Chabner e Longo (eds.)(2001) Câncer Chemotherapy and Biotherapy, Lip- pincott, Williams & Wilkies, Fila., PA). Uma quantidade eficaz de agente te- rapêutico vai diminuir os sintomas, por exemplo, tamanho do tumor ou inibi- ção de crescimento de fcimor, tipicamente em pelo menos 10%; geralmente em pelo menos 20%; de preferência pelo menos cerca de 30%; com mais preferência pelo menos 40% e com mais preferência em pelo menos 50%. VI. Usos
A presente invenção provê métodos de tratamento de uma con- dição ou distúrbio proliferativo, por exemplo, câncer de útero, cérvice, mama, próstata, testículos, pênis, trato gastrointestinal, por exemplo, esôfago, orofa- ringe, estômago, intestinos delgado e grosso, colo ou reto, rim, célula renal, bexiga, osso, medula óssea, pele, cabeça ou pescoço, pele, fígado, vesícula biliar, coração, pulmão, pâncreas, glândula salivar, glândula adrenal, tireói- de, cérebro, por exemplo, gliomas, gânglios, sistema nervoso central (SNC) e sistema nervoso periférico (SNP) e sistema imune, por exemplo, baço ou timo. A presente invenção provê métodos de tratamento, por exemplo, tumo- res imunogênicos, tumores não-imunogênicos, tumores inativos, cânceres induzidos por vírus, por exemplo, cânceres de célula epitelial, cânceres de célula endotelial, carcinomas de célula escamosa, papilomavírus, adenocar- cinomas, linfomas, carcinomas, melanomas, leucemias, mielomas, sarco- mas, teratocarcinomas, cânceres quimicamente induzidos, metástase e an- giogênese. A invenção compreende também redução da tolerância a uma célula de tumor ou antígeno de célula de câncer, por exemplo, através da modulação da atividade de uma célula T reguladora (Treg) e ou uma célula T CD8 (vide, por exemplo, Ramirez-Montagut e outros (2003) Oncogene 22:3180-3187; Sawaya e outros (2003) New Englang. J. Med. 349:1501- 1509; Farrar e outros (1999) J. Immunol. 162:2842-2849; Le e outros (2001) J. Immunol. 167:6765-6772; Cannistra e Niloff (1996) New England J. Med. 334:1030-1038; Osborne (1998) New Engl. J. Med. 339:1609-1618; Lynch e Chapelle (2003) New Engl. J. Med. 348:919-932; Enzinger e Mayer (2003) New Engl. J. Med. 349:2241-2252; Forastiere e outros (2001) New England J. Med. 345:1890-1900; Izbicki e outros (1997) New Engl. J. Med. 337:1188- 1194; Holland e outros (eds.) (1996) Câncer Medicine Encyclopedia of Cân- cer, 4a ed., Academic Press, San Diego, CA).
Em algumas modalidades, a presente invenção provê métodos para tratamento de uma condição proliferativa, câncer, tumor ou condição pré-cancerosa tal como uma displasia com PEG-IL-10 e pelo menos um a- gente terapêutico ou de diagnóstico adicional. O agente terapêutico adicional pode ser, por exemplo, uma citocina ou antagonista de citocina, tal como IL- 12, interferon-alfa ou receptor de fator de crescimento antiepidermal, doxor- rubidina, epirrubicina, um antifolato, por exemplo, metotrexato ou fluoruraci- Ia, irinotecano, ciclofosfamida, radioterapia, terapia de hormônio ou anti- hormônio, por exemplo, androgênio, estrogênio, antiestrogênio, flutamida ou dietilestibestrol, cirurgia, tamoxifeno, ifosfamida, mitolactol, um agente de alquilação, por exemplo, melfalan ou cisplatina, etoposídeo, vinorelbina, vin- blastina, vindesina, um glucocorticóide, um antagonista de receptor de his- tamina, um inibidor de angiogênese, radiação, um sensibilizador de radia- ção, antraciclina, vinca alcalóide, taxano, por exemplo, paclitaxel e doceta- xel, um inibidor de ciclocelular, por exemplo, um inibidor de cinase depen- dente de ciclina, um anticorpo monoclonal contra outro antígeno de tumor, um complexo de anticorpo monoclonal e toxina, um adjuvante de célula T, um transplante de medula óssea ou células apresentando antígeno, por e- xemplo, terapia de célula dendrítica. Vacinas podem ser providas, por exem- plo, como uma proteína solúvel ou como um ácido nucleico codificando a proteína (vide, por exemplo, Le e outros, supra; Greco e Zellefsky (Eds.) (2000) Radiotherapy of Prostate Câncer, Harwood Academic, Amsterdam; Shapiro e Rechnt (2001) New ErtgL J. Med. 344:1997-2008; Hortobagyi (1998) New Engl. J. Med. 339:974-984; Catalona (1994) New Engl. J. Med.
331:996-1004; Naylor e Hadden (2003) Int. Immunopharmacol. 3:1205-1215; The Int. Adjuvant Lung CancerTriaI Collaborative Group (2004) New Engl. J. Med. 350:351-360; Salmon e outros (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Kudelka e outros (1998) New Engl. J. Med. 338:991-992; van Netten e outros (1996) New Engl. J. Med. 334:920-921). São também providos métodos de tratamento de hematopoiese
extramedular (EMH) de câncer. EMH é descrita (vide, por exemplo, Rao e outros (2003) Leuk. Lymphoma 44:715-718; Lane e outros (2002) J. Cutan. Pathol 29:608-612).
O escopo amplo da presente invenção é melhor compreendido com referência aos exemplos que seguem, que não pretendem limitar a in- venção às modalidades específicas.
Todas as citações aqui são incorporadas a título de referência até o mesmo ponto como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado ser incorporado a título de referência.
Muitas modificações e variações da presente invenção podem ser feitas sem se afastar do seu espírito e escopo, como será aparente à- queles versados na técnica. As modalidades específicas descritas aqui são oferecidas a título de exemplo apenas e a invenção deve ser limitada pelos termos das reivindicações apensas, junto com o escopo integral ao qual tais reivindicações são intituladas; e a invenção não deve ser limitada pelas mo- dalidades específicas que foram aqui apresentadas a título de exemplo. EXEMPLOS I. Métodos Gerais
Métodos padrão em biologia molecular são descritos (Maniatis e
outros (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook e Russell (2001) Molecular Clo- ning, 3a e<±, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Métodos padrão também aparecem em Ausubel e outros (2001) Current Pro- tocole in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. Nova York, NY, que descreve clonagem em células bacterianas e mutagênese de DNA (Vol. 1), clonagem em células de mamífero e levedura (Vol. 2), glicoconjuga- dos e expressão de proteína (Vol. 3) e bioinformática (Vol. 4).
Métodos para purificação de proteína incluindo imunoprecipita- ção, cromatografia, eletroforese, centrifugação e cristalização são descritos (Coligan e outros (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nova York). Análise química, modificação química, modificação pós-traducional, produção de proteínas de fusão, glicosilação de proteínas são descritas (vide, por exemplo, Coligan e outros (2000) Current Protocols in Protein Sciences, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., Nova York; Ausubel e outros (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-AIdrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amer- sham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384- 391). Produção, purificação e fragmentação de anticorpos policlonais e mo- noclonais são descritas (Coligan e outros (2001) Current Protocols in Immu- nology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nova York; Harlow e Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow e Lane, supra). Técnicas padrão para caracterização de intera- ções ligante/receptor estão disponíveis (vide, por exemplo, Coligan e outros (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., Nova York). Métodos de fabricação de PEG-IL-10 são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N0 7.052.686.
Métodos para cítometria de fluxo, incluindo seleção de célula ativada por fluorescência (FACS), estão disponíveis (vide, por exemplo, O- wens e outros (1994) Flow Cytometry Principies for Clinicai Laboratory Prac- tice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2a ed., Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Reagentes fluorescentes adequados para modificação de ácidos nucleicos, incluindo primers e sondas de ácido nuclei- co, polipeptídios e anticorpos, para uso, por exemplo, como reagentes de diagnóstico, estão disponíveis (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecu- lar Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogues, St. Louis1 MO).
Métodos padrão de histologia do sistema imune são descritos (vide, por exemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopa- thologyand Pathology, Springer Verlag, Nova York, NY; Hiatt e outros (2000) Color Atlas of Histology, Lippincot, Williams e Wilkins, Fila., PA; Louis e ou- tros (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-HiII, Nova York, NY).
Métodos para o tratamento e diagnóstico de câncer são descri- tos (vide, por exemplo, Alison (ed.) (2001) The Câncer Handbook, Grove's Dictionaries, Inc., St. Louis, MO; Oldham (ed.) (1998) Principies of Câncer Biotherapy, 3a ed., Kluwer Academic Publ., Hingham, MA; Thompson e ou- tros (eds.) (2001) Textbook of Melanoma, Martin Dunitz, Ltd., Londres, UK; Devita e outros (eds.) (2001) Câncer: Principies and Practice of Oncology, 6a ed., Lippincott, Fila., PA; Holland e outros (eds.) (2000) Holland-Frei Câncer Medicine, BC Decker, Fila, PA; Garrett e Sell (eds.) (1995) Celular Câncer Markers, Humana Press, Totowa, NJ; MacKie (1996) Skin Câncer, 2a ed., Mosby, St. Louis; Moertel (1994) New Engi J. Med. 330:1136-1142; Engle- man (2003) Semin. Oncoi 30 (3 Supl. 8):23-29; Mohr e outros (2003) Onko- Iogie 26:227-233).
Pacotes de software e bancos de dados para determinação de, por exemplo, fragmentos antigênico, seqüências líder, enovelamento de pro- teína, domínios funcionais, sítios de glicosilação e alinhamentos de seqüên- cia, estão disponíveis (vide, por exemplo, GenBank, Vector NTI® Suite (In- formax, Inc., Bethesda1 MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne e outros (2000) Bioinformatics 16:741-742; Menne e outros (2000) Bioinforma- tics Applications Note 16:741-742; Wren e outros (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; Von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17- 21; von Heijne (1986) NucIeicAcids Res. 14:4683-4690). II. IL-10 Pequilada
IL-10 foi dialisada contra fosfato de sódio 10 mM pH 7,0, NaCI 100 mM. A IL-10 dialisada foi diluída 3,2 vezes para uma concentração de 4 mg/mL usando o tampão de diálise. Antes da adição do ligante, SC-PEG- 12K (Delmar Scientific Laboratories, Maywood, IL), 1 volume de Na- tetraborato 100 mM em pH 9,1 foi adicionado a 9 volumes da IL-10 diluída para aumentar o pH da solução de IL-10 para 8,6. O ligante SC-PEG-12K foi dissolvido no tampão de diálise e o volume apropriado da solução de ligante (1,8 a 3,6 mol de ligante por mol de IL-10) foi adicionado à solução de IL-10 diluída para iniciar a reação de peguilação. A reação foi realizada a 5°C a fim de controlar a taxa da reação. A solução de reação foi levemente agitada durante a reação de peguilação. Quando o rendimento da mono-PEG-IL-10 conforme determinado através da HPLC de exclusão de tamanho (SE- HPLC) estava próximo de 40%, a reação foi parada adicionando solução de glicina 1M para uma concentração final de 30 mM. O pH da solução de rea- ção foi lentamente ajustado para 7,0 usando uma solução de HCI e a reação foi filtrada em 0,2 mícron e armazenada a -80°C.
Alternativamente, mono-PEG-IL-10 é preparada usando metóxi- PEG-aldeído (PALD-PEG) como um ligante (lnhale Therapeutic Systems Inc., Huntsville, Alabama). PALD-PEG pode ter pesos moleculares de 5 kDa, 12 kDa ou 20 kDa. IL-10 é dialisada e diluída conforme acima descrito, exce- to que o pH do tampão de reação está entre 6,3 e 7,5. Ligante PALD-PEG ativado é adicionado ao tampão de reação em uma razão molar 1:1. Ciano- boroidreto aquoso é adicionado à mistura de reação para uma concentração final de 0,5 a 0,75 mM. A reação é realizada em temperatura de (18-25°C) por 15-20 horas com agitação leve. A reação é extinta com glicina 1M. Ren- dimentos são analisados através de SE-HPLC. Mono-PEG-IL-10 é separada de IL-10 não-reagida, ligante PEG e di-PEG-IL-10 através de cromatografia em filtragem em gel e caracterizada por rp-HPLC e bioensaio (por exemplo, estimulação de células ou linhagens de célula responsivas à IL-10). III. Modelos de tumor:
Células de tumor de camundongo singenéico foram injetadas subcutaneamente ou intradermalmente a 104, 105 ou 106 células por inocula- ção de tumor. Modelos de carcinoma mamário Ep2, carcinoma de colo CT26, carcinoma escamoso da pele PDV6 e carcinoma de mama 4T1 foram usados (vide, por exemplo, Langowski e outros (2006) Nature 442:461-465). Camundongos Balb/C imunocompetentes ou Balb/C deficientes em célula B foram usados. PEG-mlL-10 foi administrada a camundongos imunocompe- tentes, enquanto tratamento com PEG-hlL-10 foi usado no camundongo de- ficiente em célula B. Tumores foram deixados atingir um tamanho de 100- 250 mm3 antes do tratamento ser iniciado. IL-10, PEG-mlL-10, PEG-hlL-10 ou controle tampão foi administrado subcutaneamente em um sítio distante do implante do tumor. Crescimento de tumor foi tipicamente monitorado duas vezes por semana usando compasso de calibre eletrônico. IV. Análise de tumor:
Tecidos de tumor e órgãos linfáticos foram coletados em vários pontos finais para medir expressão de mRNA para vários rótulos inflamató- rios e para realizar imunoistoquímica para vários rótulos de célula inflamató- ria. Os tecidos foram congelados rapidamente em nitrogênio líquido e arma- zenados a -80°C. Crescimento de tumor primário foi tipicamente monitorado duas vezes por dia usando compassos de calibre eletrônicos. Volume do tumor foi calculado usando a fórmula (largura2 χ comprimento/2) onde com- primento é a dimensão mais longa. Os tumores foram deixados atingir um tamanho de 90-250 mm3 antes do tratamento iniciar. V. Administração de IL-10 e/ou PEG-IL-10
mlL-10 ou PEG-mlL-10 foi administrada aos camundongos imu- nocompetentes, enquanto tratamento com PEG-hlL-10 foi usado nos ca- mundongos deficientes em célula B. mlL-10, PEG-mlL-10, PEG-hlL-10 ou controle veículo foi administrado subcutaneamente em um sítio distante do implante do tumor. PEG-lmL-10 usada nesses estudos foi preparada duas vezes com o Iigante SC-PEG-12K. As atividades biológicas de mlL-10 e PEG-mlL-10 foram avaliadas através da aplicação de um bioensaio de proli- 10
feração de curto prazo que utilizou MC/9, uma linhagem de mastócito de camundongo, que expressa receptores de mlL-10 endógenos (R1 e R2). As células MC/9 proliferam em resposta à co-estimulação com mlL-4 e mll_-10 (MC/9's não proliferam com apenas mll_-4 ou mll_-10). Proliferação foi medi- da através de meios colorimétricos usando Alamar Blue1 um corante indica- dor de crescimento baseado em detecção de atividade metabólica. A atividade metabólica de mlL-10 recombinante ou peguilada foi avaliada através do valor EC50, ou a concentração de proteína na qual estimulação metade-máxima é observada em uma curva de dose-resposta (Tabela 1). Tabela 1: Bioensaio de proliferação de MC/9 para a avaliação de bioativida-
de de reaqentes de mlL-10 e
PEG-mlL10 usados nesses estudos
Proteína EC50 (ng/mL) em Ensaio de MC/9 mlL-10 0,5711 PEG-mlL-10 4,039
Com base no bioensaio de MC/9, a atividade específica da mlL- peguilada usada no experimento é aproximadamente 7 vezes menor do que a atividade da mlL-10 usada (Tabela 1).
PEG-IL-10 foi administrada dia sim, dia não a camundongos car-
regando tumores de câncer de mama Ep2. Tratamento foi eficaz na redução do tamanho do tumor e induz rejeições de tumor.
Tabela 2: PEG mll_-10 reduz tamanho do tumor (mm3) em modelo de câncer de mama Ep2 em camundongos Balb/C ____
Dias após inoculação 11 15 18 21 25 27 33 Controle 300 450 500 750 1300 1500 2700 PEG-IL-10 300 400 310 280 250 50 0
20
Tratamento com PEG-mlL-10 foi também eficaz na redução de tamanho de tumor em modelos de tumor de camundongo imunocompetente singenéico PDV6, CT-26 e 4T1 (vide Tabelas 3, 4 e 5). Tabela 3: Estudo 04-M52 338: PEG mlL-10 começando dia 36 após implante
__,____ι_____ χ_____nro/c /--3\________A^^r. nx
Dias após inoculação 36 38 42 44 46 48 52 Controle 200 255 290 380 395 420 485 PEG-IL-10 210 265 200 190 155 110 55
Tabela 4: PEG mlL-10 começando dia 7 após implante reduz tamanho de tumor relativo a controle veículo de tumores CT26 (mm3) em camundongos BALB/c _
Dias após inoculação 10 15 17 20 22 24 Controle 155 424 791 1274 1737 2170 PEG-IL-10 136 212 291 336 450 455
Tabela 5: IL-10 e PEG- mlL-10 reduzem tamanho do tumor (mm3) de carci- noma de mama 4T1 __
Dias de Tratamento 20 24 29 33 Controle 200 410 584 1000 PEG-mlL-10 200 320 560 350 IL-10 200 290 575 400
Tabela 6: Estudo 05-M52-496. Tratamento de duas semanas com mll_-10 e mPEG IL10 começando 19 dias após implante reduz tamanho do tumor
Dias após Implante 20 24 29 33 PBS 200 410 584 1000 PEG-mlL-10 2000 320 560 350 mlL-10 200 290 575 400
VI. Estudos de Titulação de Dose
Em estudos de titulação de dose sangue da veia da cauda foi coletado de camundongos representantes de cada grupo nos momentos cor- respondendo ao pico esperado e durante os níveis de dose. Soro coletado foi ensaiado quanto à concentração de mlL-10 usando a plataforma Meso Scale Discovery que é baseada em tecnologia multidisposição; uma combi- nação de detecção por eletroquimiluminescência e disposições padroniza- das. Um teste t de student não-emparelhado bilateral foi usado para compa- rar o volume de tumor médio de camundongos tratados com mlL-10 ou PEG-mlL-10 agrupados por concentração de mlL-10 no soro com o volume de tumor médio de seu grupo controle veículo correspondente. Uma corre- ção de Welch foi usada quando dois grupos tinham variância desigual (p<0,05 do teste F).
Titulações de dose de PEG-mlL-10 e mlL-10 em camundongos
carregando carcinoma de mama 4T1 mostram que controle de tumor primá- rio e metástase de pulmão são tituláveis da dose com ambas mll_-10 e PEG- mlL-10. Em qualquer dada dose PEG-mlL-10 é mais eficaz do que mlL-10 (Tabela 7). Tratamento de duas vezes por dia foi iniciado no Dia 17 após implante, quando os volumes de tumor médios eram 84-90 mm3. Grupos de tratamento consistiam em 14 camundongos por grupo enquanto os grupos controle tinham 8 camundongos em cada grupo. Tampões Tris e Hepes e- ram os controles para mlL-10 e PEG mlL-10 respectivamente. Tabela 7. Estudo 06-M175-1103. mlL-10 e PEG-mlL-10 reduzem tamanho de tumor primário (mm3) em carcinoma de mama 4T1 em camundongos
Dias após Implante 17 21 24 27 30 34 38 42 Controle Veículo Tris 90 184 288 448 560 861 1126 1248 Controle Veículo Hepes 90 215 344 476 658 940 1261 1520 PEG-mlL-10 (0,5 mq/kg) 86 107 117 129 150 165 204 195 PEG-mlL-10 (0,1 mq/kg) 84 112 142 152 224 256 286 356 PEG-mlL-10 (0,01 mg/kg) 85 140 200 240 288 462 627 773 PEG-mlL-10 (0,001 mg/kg) 88 168 239 262 373 532 729 942 mlL-10 (1,0 mq/kg) 85 117 168 207 256 350 446 497 mlL-10 (0,1 mq/kg) 84 136 180 251 337 424 641 704 mlL-10 (0,01 mq/kg) 86 121 165 231 331 436 631 809 Titulações de dose de PEG-mlL-10 e mlL-10 em camundongos carregando carcinoma de célula escamosa PDV6 mostram que controle de tumor primário é titulável na dose com ambas mlL-10 e PEG-mlL-10, embora em qualquer dada dose PEG-mlL-10 seja mais eficaz do que mlL-10 (Tabela 8). A dose alta de tratamento com PEG-mlL-10 resultou em uma regressão de tumor de quase 100% e subsequente resistência à nova provocação (Ta- bela 9). Tratamento de duas vezes por dia foi iniciado no Dia 23 após im- plante, quando volumes de tumor médios eram 107-109 mm3 e continuou até dia 55 para todos os grupos tratados com mlL-10 e grupo tratado com PEG mlL-10 0,01 mg/kg. Tratamento com 0,1 mg/kg de PEG-mlL-10 foi pa- rado no dia 48 quando 100% de regressão de tumor foi vista quando os gru- pos restantes eram tratados até o dia 51. Grupos de tratamento consistiam em 10 camundongos por grupo enquanto cada controle veículo continha 6 camundongos. Tampão Tris e tampão Hepes eram o controle veículo para mlL-10 e PEG mlL-10, respectivamente. Reimplante foi feito 85 dias após o implante primário e 4 semanas após último tratamento com PEG-mlL-10. Havia 10 camundongos por grupo.
Tabela 8. Estudo 06-M52-1106. mlL-10 e PEG-mlL-10 reduzem o tamanho do tumor (mm3) de carcinoma de célula escamosa PDV6 em camundongos C57B16/J de uma maneira dependente da dose
Dias após Implante 23 27 30 33 36 40 L43 47 51 55 Controle Veículo Tris 111 179 232 318 412 493 635 848 958 Controle Veículo Hepes 107 210 293 433 541 653 712 761 986 PEG-mlL-10 (0,1 mg/kg) 108 99 55 31 17 11 3 1 1 1 PEG-mlL-10 (0,01 mg/kg) 107 131 92 97 95 114 119 123 183 228 PEG-mlL-10 (0,001 mg/kg) 109 191 191 241 327 455 535 mlL-10 (1,0 mg/kq) 107 129 144 143 124 87 51 36 52 75 mlL-10 (0,1 mq/kg) 107 85 85 88 117 121 130 143 182 217 mlL-10 (0,01 mg/kg) 107 120 150 146 196 244 262 263 249 250 Tabela 9: Estudo 06-M52-1106. Camundongos C57B1/6J que ficaram livres de tumores de carcinoma de célula escamosa PDV6 após 3 semanas de tratamento com PEG-mlL-10 são resistentes a reimplante na ausência de tratamento adicional _
Dias após implante 0 16 21 28 36 49 % de camundongos que são positivos para tumor Controle Veículo 0 113 145 188 418 761 100 PEG-mlL-10 (0,1 mg/kg) 0 0,3 0 7 16 47 10
VII. Estudos de Metástase de Pulmão
Metástase de pulmão no modelo de carcinoma de mama 4T1 foram quantificadas microscopicamente após ressecção do pulmão (Tabela 10) ou através de contagem de colônias metastáticas no pulmão após cultu- ra (Tabela 11) conforme descrito em Current Protocols in Immunology (Se- ção 20..2.4) John Wlley and Sons, Inc., Nova York; Harlow e Lane (1999). Resumidamente, pulmões coletados de um camundongo carregando tumor 4T1 foram picados e digeridos com um coquetel de colagenase/elastase se- guido por cultura em um ensaio de diluição limitante, em meio contendo 6- tioguanina. Apenas células 4T1 são resistentes a 6-tioguanina e cada uma pode ser quantificada através de contagem do número de colônias após ΙΟ- Ι 4 dias de cultura. Tratamento duas vezes por dia foi iniciado no Dia 17 após implante, quando os volumes de tumor médios eram 84-90 mm3. Tampões Tris e Hepes eram os controles para mlL-10 e PEG mlL-10, respectivamen- te. Metástase de pulmão medidas como número de colônias metastáticas culturadas por pulmão. Tabela 10. Estudo 05-M52-496. Tratamento de duas semanas com mlL-10 e PEG- mlL-10 começando 19 dias após implante reduz metástase de carcinoma de mama 4T1 (medido como número de metástase de pulmão por camundongo)_
Metástase de Tumor 33 dias após Inoculação Controle Veículo mll_-10 PEG-mlL-10 Camundongo N0 1 7 0 0 Camundongo N0 2 7 0 0 Camundongo N0 3 7 0 0 Camundongo N0 4 8 0 0 Camundongo N0 5 20 4 0
Tabela 11: Estudo 06-M175-1103. mlL-10 e PEG-mlL-10 reduzem metásta- se de pulmão de carcinoma de mama 4T1 em camundongos BALB/c de uma
maneira dependente da dose
Camun- dongo Metástase de Pulmão 42-45 dias após Implante Colônias por pulmão (x103) 1 Controle Controle mlL-10 mlL-10 mlL-10 PEG- PEG- PEG- PEG- veículo Veículo 1,0 mg/kg 0,1 mg/kg 0,01 mlL-10 mlL-10 mlL-10 mlL-10 tampão Tampão mg/kg 0,5 0,1 0,01 0,001 Tris Hepes mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg 1 362 481 76 116 1064 7,1 89 0,43 366 2 2,12 533 20 5,6 150 1,0 0,7 234 212 3 152 264 28,1 8,1 67,4 0,4 0,01 377 0,6 4 0,4 218 1,2 137 18 1,5 223 315 586 1000 517 45,7 257 77 0,3 0,07 0,54 486 6 474 93 21,7 2,72 1,2 0,02 10,1 1,67 844 7 524 1000 4,4 364 285 0 7,6 68 6,5 8 1000 1026 128,6 772 9,7 0,002 1,85 27 265 9 13,3 348 878 0,3 0,01 139 338 51,2 204 45 0,03 0,01 177 824 11 9,4 49 56 0,01 2,68 597 263 12 0,1 635 17,1 240 0,01 7,4 13 5,1 19,7 1014 0,02 2,94 0,01 14 0,02 750 72,2 0,01 0,01 0,01 Médio 418,0 499,0 16,7 170,5 69,8 0,17 1,28 47,5 338,0 Média 502,0 579,0 28,9 262,0 268,2 17,9 24,1 138,9 381,0 D.P. 519,0 467,0 36,5 276,9 397,1 64,0 61,8 183,7 284,0 Administração de PEG-mlL-10 ou IL-10 a camundongos carre- gando carcinoma de mama 4T1 reduz a taxa de metástase e aumenta a infil- tração de célula T CD8 e expressão de citocinas imunoestimuladoras, con- forme medido através de RT-PCR quantitativa (Tabelas 12 e 13). O número de células T CD8+ infiltrantes foi contado de seções representati- vas de vários tumores tingidos através de imunoistoquímíca para o rótulo de superfície de CD8 e verificado através de tingimento com anticorpos anti- CD3 e anti-TCRap.
Tabela 12: IL-10 e PEG mlL-10 induzem infiltração de célula T CD8+ em carcinoma 4T1 ____
controle IL-10 PEG-IL-10 Número Médio de Células CD8+/Campo 6,4 25,8 39,2
PEG-mlL-10 é mais eficaz do que IL-10 na indução de citocinas inflamatórias. RNA total de amostras de tumor homogeneizadas foi extraído e transcrito de modo reverso conforme previamente descrito (vide, por e- xemplo, Homey e outros (2000) J. Immunol. 164:3465-3470). DNA comple- mentar foi quantitativamente analisado quanto à expressão de citocinas a- través do ensaio de PCR de 5'-nuclease fluorgênico (vide, por exemplo, Hol- Iand e outros (1991) Proc. Nati Acad. Sei. 88:7276-7280). Produtos de PCR específicos foram continuamente medidos por meio de um ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) durante 40 ciclos. Os va- Iores foram normalizados para ubiquitina. Dados Iog transformados foram submetidos à análise estatística Kruskal-Wallis (método mediano). O nível de expressão (log transformado) corresponde à quantidade de citocina in- flamatória expressa na amostra de tumor, de modo que quanto maior o nível de expressão (log transformado), maior a quantidade de citocina inflamatória expressa na amostra de tumor. Tabela 13: PEG-mlL-10 administrada induz níveis sustentados de citocinas inflamatórias em carcinoma 4T1 24 horas após administração da dose
Citocina controle IL-10 PEG-mlL-10 IFNy 36,04 68,51 98,96 IL-4 7,77 13,13 40,32 IL-6 43,64 50,59 111,98 IL-10 9,94 41,62 106,16 Ligante RANK 19,14 36,13 46,08
V. Depleção de Células Imunes
Células T CD4+ e CD8+ foram depletadas através de eliminação mediada por anticorpo. 250 ug de anticorpos específicos para CD4 e CD8 foram injetados semanalmente para este propósito. Depleções de célula fo- ram verificadas usando análises FACS e IHC.
Depleção de células T CD4+ em camundongos BALB/c deficien- tes em célula B (CA29-lgh-6tmCgn) com anticorpos de CD4 inibe funciona- mento de PEG-hlL-10 em tumores (Tabela 14).
Tabela 14: Tratamento com PEG-hlL-10 começando 8 dias após implante de tumor falha em reduzir tamanho do tumor (mm3) de carcinoma de colo CT-26 após depleção de CD4 em camundongos BALB/c deficientes em célula B (C.12-/gh-6tm/Cgn)· _____,
Dias após Implante 8 10 13 19 27 PBS 173 322 391 841 1979 PEG-hlL-10 184 276 251 602 1332
Depleção de células T CD8 inibe completamente o efeito de
PEG mlL-10 sobre tumor singenéico (Tabela 15).
Tabela 15: Tratamento com PEG-hlL-10 começando 8 dias após implante de tumor falha em reduzir tamanho do tumor (mm3) de carcinoma de colo CT-26
Dias após Implante 8 10 13 19 27 PBS 151 335 584 1434 2746 PEG-hlL-10 226 575 1047 2449 4799 VI. Terapias de Combinação
PEG-IL-10 é administrada em combinação com agentes quimio- terapêuticos conhecidos. O agente quimioterapêutico pode ser administrado antes, concomitantemente com ou subsequente à administração de PEG-IL- 10. Exemplos de agentes quimioterapêuticos e faixas de dosagem são pro- vidos na Tabela 16.
Tabela 16: Faixas de dosagem de agente quimioterapêutico
Agente Quimioterapêutico Faixa de Dosagem Temozolomida 5 mg - 250 mg Gencitabina 200 mg - 1 g Doxorrubicina 1 mg/m2 - 50 mg/m2 Interferon-alfa 1 pg/kg - 300 pg/kg
Co-administração de PEG-IL-10 pode permitir uso de dosagens menores, menos tóxicas, dos agentes quimioterapêuticos, então evitando efeitos colaterais conhecidos.
Todas as citações aqui são incorporadas aqui a título de refe- rência ao mesmo ponto como se cada publicação ou pedido de patente indi- vidual fosse especificamente e individualmente indicado ser incorporado a título de referência.
Muitas modificações e variações da presente invenção podem
ser feitas sem se afastar do seu espírito e escopo, como será aparente à- queles versados na técnica. As modalidades específicas descritas aqui são oferecidas a título de exemplo apenas, e a invenção deve ser limitada pelos termos das reivindicações apensas, junto com o escopo integral de equiva- lentes aos quais tais reivindicações são intituladas; e a invenção não deve ser limitada pelas modalidades específicas que foram apresentadas aqui a título de exemplo.

Claims (23)

1. Método de inibição ou redução de crescimento de um tumor ou câncer compreendendo contato do tumor com uma quantidade eficaz de uma interleucina-10 peguilada (PEG-IL-10).
2. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a PEG-IL-10 compreende um Iigante metóxi-PEG-aldeído (PALD-PEG).
3. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a PEG-IL-10 inibe crescimento do tumor ou câncer.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a PEG-IL-10 reduz o tamanho do tumor ou câncer.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, onde PEG-IL-10 aumenta infiltração de células T CD8+ no tumor quando comparado com IL-10 não-peguilada.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, onde PEG-IL-10 aumenta a expressão de pelo menos uma citocina inflamatória.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, onde a citocina in- flamatória é selecionada do grupo consistindo em IFNy, IL-4, IL-6, IL-10 e Iigante RANK (RANK-L).
8. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a PEG-IL-10 é co-administrada com pelo menos um agente quimioterapêutico.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, onde o agente qui- mioterapêutico é pelo menos um dos agentes quimioterapêuticos da Tabela16.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o tumor ou câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de colon, câncer ova- riano, câncer de mama, melanoma, câncer de pulmão, glioblastoma e leu- cemia.
11. Método de tratamento de um indivíduo sofrendo de um cân- cer ou tumor compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade efi- caz de PEG-IL-10.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, onde a PEG-IL-10 compreende um Iigante metóxi-PEG-aldeído (PALD-PEG).
13. Método de acordo com a reivindicação 11, onde a PEG-IL- 10 inibe crescimento do câncer ou tumor.
14. Método de acordo com a reivindicação 11, onde a PEG-IL- reduz o tamanho do tumor ou câncer.
15. Método de acordo com a reivindicação 11, onde a PEG-IL- aumenta a infiltração de células T CD8+ no tumor quando comparado com IL-10 não-peguilada.
16. Método de acordo com a reivindicação 11, onde PEG-IL-10 aumenta a expressão de pelo menos uma citocina inflamatória.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, onde a citocina inflamatória é selecionada do grupo consistindo em IFNy, IL-4, IL-6, IL-10 e RANK-L.
18. Método de acordo com a reivindicação 11, onde a PEG-IL- é co-administrada com pelo menos uma gente quimioterapêutico.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, onde o agente quimioterapêutico é pelo menos um dos agentes quimioterapêuticos da Ta- bela 16.
20. Método de acordo com a reivindicação 11, onde PEG-IL-10 reduz metástase de um câncer ou tumor.
21. Método de acordo com a reivindicação 11, onde o tumor ou câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de colo, câncer ovari- ano, câncer de mama, câncer de pulmão, melanoma, glioblastoma e leuce- mia.
22. Método de acordo com a reivindicação 11, onde o indivíduo é ser humano.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, onde a PEG-IL- é PEG-IL-10 humana (PEG-hlL-10).
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