HU220103B - IL-10 új alkalmazása - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát interleukin–10 gyulladásos bélbetegségek,különösen fekélyes vastagbélgyulladás (colitis ulcerosa) és Crohn-betegség kezelésére használható gyógyszerkészítmények előállításáravaló alkalmazása és ilyen gyógyszerkészítmények előállítására szolgálóeljárás képezi. ŕ

Description

1

HU 220 103 B 2 A találmány gyulladásos bélbetegségek kezelésére szol-gáló készítményekre és előállításukra vonatkozik. Ezek-ben a készítményekben hatóanyagként interleukin-10-et (IL-10) alkalmazunk. A leukémiák, amelyek a hemopoetikus sejtek rossz-indulatú elváltozásainak a következménye, és vagy lim-foid vagy mieloid sejt eredetűek, a neoplazmák egy he-terogén csoportját alkotják. Az elváltozott sejtek elsőd-legesen vagy a csontvelőben vagy a nyirokszövetbenszaporodnak, gátolják a normál hemopoézist és az im-munitás kialakulását. Ezek a sejtek kijuthatnak a vérke-ringésbe, és beszűrődhetnek más szövetekbe is, és ezgyakran a különböző sejttípusok rendellenes eloszlásáteredményezi. Ilyen leukémiák például a következők:akut limfoid leukémia (ALL); akut mieloid leukémia(AML), krónikus mieloid leukémia (CLL), hajas sejtesleukémia és időskori T-sejt-leukémia (aduit T cell leu-kémia =ATL). Általános akut vagy krónikus leukémiá-kat különböztetnek meg klinikai lefolyásuk természetealapján. A limfómák, a leukémiákkal ellentétben, az olyan sej-tek daganatos elváltozásai, amelyek főként a limfoid szö-vetekben fordulnak elő. Általában kétféle limfómát kü-lönböztetnek meg, a Hodgkin-féle betegséget (Hodgkin-kór) és a non-Hodgkin-limfómát. A Hodgkin-kórban asejtek többsége T-sejt fenotípusú kis limfocita. A non-Hodgkin-limfömák több mint 90%-a B-sejt eredetű. E betegségek többségének a kezelése nem teljeseneredményes, és a mai technikák elsődlegesen a kemote-rápia és a besugárzás használatát helyezik előnybe. Je-lenleg azonban ezek a kezelések általában nem eredmé-nyeznek sem átmeneti javulást, sem gyógyulást. Igényvan tehát az ilyen betegségek, különösen az IL-2-függődaganatos sejtburjánzás veszélytelen és megbízható ke-zelésére.

Az IFN-γ hatékony aktivátora a makrofágoknak.Ezek a sejtek a gazdaszervezetek különböző fertőzőágensekkel és betegségekkel szembeni védelemért fele-lősek. Minthogy az IFN-y-nak fontos szerepe van a fer-tőzések elleni védelemben, szükség van olyan készítmé-nyekre és módszerekre, amelyek növelni tudják az IFN-γ-termelést.

Az immunrendszerben számos természetes és adap-tált immunreakció megy végbe, ezek két nagy csoportjáthumorális és celluláris immunválasznak nevezik. A Im-morális immunitás széles értelemben a B-sejtek - bele-értve a plazmasejteket - antitesttermelésének és műkö-désének a következménye. A celluláris immunitást sej-tek közvetítik, így T-sejtek, monociták, makrofágok éshisztociták. A T-sejtek tovább osztályozhatók különböző funk-cióik és markerek alapján. A T-sejtek például lehetnekT helper sejtek vagy T szuppresszor sejtek. A T-sejtekezenkívül aktiválás hatására citotoxikussá válhatnak,vagy más, speciálisabb funkciókat látnak el. Normál kö-rülmények között a T-sejtek és a B-sejtek között olyankölcsönhatások alakulnak ki, amelyek bizonyos mérté-kig egymás aktivitását szabályozhatják. Lásd például:Paul (szerkesztő) „Fundamentals of Immunology” [2.kiadás; Raven Press, New York (1989)]. A különböző atigénekkel szemben vagy a cellulárisvagy a humorális válaszok lehetnek túlsúlyban, általá-ban kölcsönösen kizárólagos módon. Bizonyos betegsé-gek súlyosságát - ilyen a lepra, leishmaniasis és bizo-nyos autoimmunitástípusok - az egyik válaszfajtának amásik feletti nem kívánt túlsúlya okozhatja [Mosmannet. al., Immunoi. Today, 8, 223 (1987); Mosmann et. al.,Ann. Rév. Immuntól., 7, 145 (1989); Parish, Transplant.Rév., 13, 35 (1972); Liew, Immunoi. Today, 10, 40(1989)].

Az immunrendszert szabályozó egyik mechaniz-must a citokineknek nevezett proteinek termelése jel-lemzi. A limfokinek olyan citokinek, amelyeket a T-sejtek és bizonyos B-sejtek termelnek, a monokineketpedig a monociták termelik. A citokinek, amelyek gliko-lizáltak is lehetnek, számos immunválaszt közvetítenek.

Az IL-4 egy olyan citokin, amely az antitesttermelőB-sejtek termelését képes stimulálni, elősegíti a killerT-sejtek vagy citotoxikus T-sejtek növekedését is. AzIL-4 az 1 típusú T helper sejteket (Thl) is képes gátol-ni. Ezzel viszont gátolhatja több B-sejt képződését vagya több B-sejtnek megfelelő antitesttermelést. Tehát azIL-4 a belső szabályozómechanizmus részét képezi.

Az IL-10 egy olyan citokin, amely számos reakciótvagy hatást közvetít. Az IL-10-et mind humán, mindegérsejtekből izolálták, és szerepet játszik a T helper-(Th-) sejtek különböző osztályai vagy alcsoportjai im-munválaszának a szabályozásában. A Th-sejtek külön-böző alcsoportokra oszlanak, és ezeket citokintermelőprofiljuk különbözteti meg. A Thl-T-sejt-klónok interleukin-2-t (IL-2-) ésIFN-y-t termelnek, míg a Th2-sejt-klónok IL-10-et,IL-4-et és interleukin-5-öt (IL-5) szekretálnak, általá-ban antigénekkel vagy mitogén lektinekkel való aktivá-lás után. Mind a két Th-sejt-klón-osztály termel citoki-neket, ilyen például a tumomekrózis α-faktor (TNF-a),az interleukin-3 (IL-3) és a granulocitamakrofág te-lepstimuláló faktor (GM-CSF). A Th-sejtek harmadiktípusa (ThO) IL-2-t, IFN-y-t, IL-4-et, IL-5-öt, TNF-a-t, IL-3-at és GM-CSF-et termel egyidejűleg. A Thl- és Th2-sejtek különböző citokintermelő tulaj-donságai helper funkcióikban tükröződnek. A Thl-sej-tek főként a késői típusú túlérzékenységi válaszban sze-repelnek, míg a Th2-sejtek az antitesttermeléssel vannakkapcsolatban. Minthogy az antitestválaszok (Th2-fo-lyamatok) és a késői típusú túlérzékenységi válaszok(Thl-folyamatok) gyakran kölcsönösen kizárják egy-mást, úgy gondolják, hogy a Thl- és Th2-sejtek egymás-sal ellentétes szabályozóhatásokat fejtenek ki. A Thl-sejtek által termelt IFN-γ gátolja a Th2-sejtek prolife-rációját, és a Th2-sejtek által termelt IL-10 tagolja aThl- sejt-klónok citokinszintetizálását, főként az IFN-y-és IL-2-termelést. A késői típusú túlérzékenység (DTH) egy olyan sejt-közvetített immunválasz, amelyet ödémaképződés jelle-mez és az, hogy a szövetekbe sejtek, főként T-sejtek,monociták és/vagy makrofágok szűrődnek be. Bizo-nyos citokinfajták külön-külön kapcsolatban vannak akésői típusú túlérzékenységi reakciókkal és a humorálisimmunválaszokkal [Cheret. al., J. Immunoi., 138, 3688 2 1

HU 220 103 B 2 (1987); Mosmann et. al., 1987 és 1989, lásd fentebb].Az ezen választípusokkal összefüggő betegségeket azokozhatja, hogy nem megfelelően termelődnek a cito-kinalcsoportok. A gyulladásos bélbetegség (inflammatory boweldisease=IBD) a gyomor-bél rendellenességek egyolyan csoportját alkotja, amelyet a gyomor-bél traktusegyes részeinek krónikus, nemspecifikus gyulladása jel-lemez. Emberben az IBD legszembetűnőbb eseteit, acolitis ulcerosát és a Crohn-betegséget számos tünet ésszövődmény kíséri: gyermekeknél a növekedés vissza-maradása, végbélelőesés, véres széklet (például: mele-na és/vagy hematochezia), sorvadás, vashiány és ané-mia, például vashiányos anémia és krónikus betegségek-kel járó vagy krónikus gyulladással járó anémia.

Az IBD etiológiája (kóroktana) nem világos. [Lásd:Wyngaarden és Smith (szerkesztő) Cecil’s Textbook ofMedicine (W. B. Saunders Co., (1985); Berkow (szer-kesztő); The Merck Manual of Diagnosis and Therapy(Merck Sharp and Dohme Research Laboratories,1982); Harrison’s Principles of Internál Medicine, 12.kiadás, McGraw-Hill, Inc. (1991)]. A colitis ulcerosa egy krónikus, nemspecifikus gyul-ladással és fekélyesedéssel járó betegség, amely elsőd-legesen a vastagbél-nyálkahártyán jelenik meg. Gyako-ri jellemzői a véres hasmenés, hasgörcsök, véres, nyál-kás széklet, rossz közérzet, láz, anémia, anorexia (ét-vágytalanság), súlyvesztés, leukocitózis, hipoalbuminé-mia és emelkedett vörösvérsejt-ülepedési sebesség(erythrocyte sedimentation rate=ESR). Szövődményeka közvetkezők lehetnek : vérzés, toxikus colitis, toxikusvastagbéltágulat, esetenként rektovaginális fisztulák ésa vastagbélrák megnövekedett veszélye. A colitis ulcerosához vastagbéltől független szövőd-mények is társulnak, ilyen az arthritis (ízületi gyulla-dás), spondylitis ankylopoetica (ízületi merevséget oko-zó csigolyagyulladás), sacroileitis (csípőbélgyulladás),posterior uveitis (hátulsó uvea gyulladás), erythema no-dosum (a bőr göbös beszűrődése), pyoderma gangre-nosum (üszkös bőrgennyedés) és episcleritis (szemín-hártya-gyulladás). A kezelés a betegség súlyosságátólés időtartamától függően nagymértékben változik. Pél-dául súlyos roham esetén gyakran folyadékterápiát java-solnak, hogy megelőzzék a dehidrációt és az elektro-lit-egyensúly felborulását. Ezenkívül néha hasznosak aspeciális étrendi rendszabályok is. A gyógyszerezés ma-gában foglalja a különböző kortikoszteroidokat, a szul-faszalazint és néhány származékát és esetleg az immun-szuppresszív szereket. A Crohn-betegségnek sok közös vonása van a coli-tis ulcerosaval. A Crohn-betegséget az különböztetimeg, hogy itt a laesiók (károsodások) élesen elhatá-rolódnak a szomszédos normál bélrésztől, ellentétben acolitis ulcerosa okozta laesiókkal, amelyek meglehető-sen diffúzak. Ezenkívül a Crohn-betegség túlnyomóana csípőbelet (ileitis) támadja meg, valamint csípőbelet(ileum) és vastagbelet (colon) (ileocolitis). Bizonyosesetekben csak a vastagbél betegedik meg (granuloma-tózus colitis), és néha az egész vékonybél (jejunoilei-tis). Ritkán a gyomor, nyombél (duodenum) vagy a nye- lőcső (oesophagus) itt érintett. A klinikai esetek nagyjá-ból felénél a laesiókban szarkoid típusú epitheloid gra-nulóma van jelen. A Crohn-betegség laesiói transzmurálisak is lehet-nek, beleértve a mély fekélyesedést, ödémát és Fibrózist,amely elzáródáshoz és fisztulaképződéshez, valamint tá-lyogképződéshez vezet. Ezek a tünetek különböztetikmeg a colitis ulcerosatól, amely rendszerint sokkal felü-letesebb laesiókkal jár, bár alkalmanként colitis ulcerosaesetén is láthatók fibrózisos szövődmények, elzáródás,fisztulaképződés és tályogok. Jelenleg az általánosan el-fogadott kezelés mindkét betegségnél hasonló, egyaránthasználják a szteroidokat, a szulfaszalazint és származé-kait és az immunszuppresszív szereket, mint a ciklo-sporin A-t, a merkapto-purint és azatioprint, amelyekmindegyike erős, nem kívánt mellékhatásokat okoz. A késői típusú túlérzékenység és a gyulladásos bél-betegség egészségügyi fontossága miatt igény van töké-letesebb készítményekre és módszerekre az ilyen álla-potok kezelésében. A találmány az előbb említett igényeket úgy elégítiki, hogy a fent említett állapotok kezelésére készítmé-nyeket és eljárásokat bocsát rendelkezésre.

Pontosabban, a találmány eljárást ismertet az IL-2-függő daganatos sejtburjánzás (neoplazmás sejtprolife-ráció) gátlására, mely eljárás abból áll, hogy egy olyanemlősszervezetnek, amelyet IL-2-függő daganatos pro-liferációs betegség támadott meg, az IL-10 hatékonymennyiségét adjuk be. A találmány módszert ad a betegek IFN-y-szintjé-nek a növelésére is. Eszerint IL-4 és IL-10 elleni anti-testekből hatékony mennyiséget adunk a betegnek,hogy a beteg IFN-γ-termelését növeljük. A találmány módszert bocsát rendelkezésre az emlő-sök gyulladásos bélbetegségének a kezelésére. A mód-szer abból áll, hogy egy olyan emlősszervezetnek, amelygyulladásos bélbetegségben szenved, az IL-10 haté-kony mennyiségét adjuk be.

Továbbá módszert ad a találmány arra nézve, hogyegy emlősszervezetben a T-sejtek citokintermelésénekgátlását előmozdítsuk. Ennek érdekében az IL-4 ésIL-10 hatékony mennyiségét egyszerre adjuk be az em-lősnek. Előnyös, ha az így kezelt emlős ember. A találmány eljárást ismertet a késői típusú túlérzé-kenységi reakció gátlására emlősben. Az eljárás abbóláll, hogy az IL-10 hatékony mennyiségét alkalmaz-zuk. Egy előnyös kiviteli alakban az IL-10-et az IL-4hatékony mennyiségével együtt adjuk be.

Az előbb említett eljárásokban előnyösen humánIL-4-et és IL-10-et használunk emberek kezelésére.

Minden itt idézett szakirodalmi közleményt teljesegészében referenciának tekintünk. A nukleinsavszek-venciákat a normál 5’->3’ konvenciónak megfelelőenjelöljük, és balról jobbra olvassuk. A szekvenciákban anukleotidbázisokat standard egybetűs rövidítéssel jelöl-jük (37 C. F. R 1.822 paragrafus).

Citokinek és antitestek eredete A leírásban az „interleukin-4” vagy „IL-4” egyolyan proteint jelent, amelynek (a) az aminosavszekven-ciája a WO 87/02990 számon közzétett nemzetközi sza- 3 1

HU 220 103 B 2 badalmi bejelentés le. ábráján bemutatott érett humánIL-4-szekvenciával lényegében azonos, és (b) biológiaiaktivitása a natív IL-4-ével azonos. Az aminosavszek-vencia lényegi azonossága azt jelenti, hogy egy másikIL-4-szekvencia, összehasonlítva a közzétett szabadal-mi bejelentésben szereplő szekvenciával, vagy ezzel azo-nos, vagy ettől különböző lehet egy vagy több olyan ami-nosawáltozás (deléciók, addíciók, szubsztitúciók) követ-keztében, amelyek lényegében nem befolyásolják hátrá-nyosan a biológiai aktivitást.

Az IL-4 a kereskedelemből, különböző forrásokból(például: Genzyme Corporation, Cambridge, MA.,USA) szerezhető be, vagy ismert módszerekkel állítha-tó elő természetes források felhasználásával vagy re-kombináns DNS-metodikák alkalmazásával [Sheehanet. al., J. Immunoi., 142, 884 (1989); Stames et. al., J.Immunoi., 145, 4185 (1990)].

Egy másik megoldás szerint, ismert IL-4 nukleotid-szekvenciákon alapuló oligonukleotidszonda-keverékekhasználatával azonosíthatjuk a standard módszerekkelelőállított genomiális vagy cDNS-gyűjteményekbenlévő IL-4-et kódoló DNS-t. Az ilyen módon azonosítottDNS restrikciós endonukleázos hasítással kimetszhető agyűjteményből, vagy pedig megfelelő primerekkel éspolimeráz-láncreakcióval (PCR) [Saiki et. al., Science,239, 487 (1988)] innen elkülöníthető. A DNS-t ezutánszekvenálhatjuk, és eukarióta expressziós rendszerbenvagy (ha szükséges, standard módszerekkel végzett int-rondeléció után) prokarióta vagy eukarióta expressziósrendszerben fejezhetjük ki. Természetesen mind acDNS-, mind a genomiális DNS-tárakat standard exp-ressziós klónozómódszerek alkalmazásával is szűrhetjükoligonukleotid-szondák és PCR használata helyett. Azígy előállított IL-4 ismert módszerekkel - immunké-miai vagy -biológiai módszerekkel - kimutatható.

Előnyös, ha a használt IL-4 humán rekombinánsIL-4. Mind a glikozilált IL-4 (például eukarióta exp-ressziós rendszerben termelt rekombináns IL-4), minda nem glikozilált protein (például kémiailag szintetizáltvagy bakteriális expressziós rendszerben termelt pro-tein) használható.

Ebben a leírásban az „interleukin-10” vagy„IL-10” egy olyan proteint jelent, amelynek (a) azaminosavszekvenciája lényegében a WO 91/00349 szá-mon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben is-mertetett érett (például szekréciós vezérszekvencia nél-küli) IL-10-nek felel meg, (b) biológiai aktivitása pedignatív IL-10-ével megegyező. Mind a glikozilált (pél-dául eukarióta sejtekben - ilyenek a CHO-sejtek - ter-melt), mind a nem glikozilált (például standard módsze-rekkel kémiailag szintetizált vagy E. coliban termelt)IL-10 felhasználható. Használhatók olyan muteinek ésmás analógok is - beleértve a BCRF1 (Epstein-Barr-vírusból származó virális IL-10; rövid elnevezése: vi-rális IL-10) proteint -, amelyek IL-10 biológiai aktivi-tással rendelkeznek. A WP 91/00349 számon közzétettnemzetközi szabadalmi bejelentésben számos olyan invitro vizsgálati módszer szerepel, amelyek alkalmasakIL-10-aktivitás mérésére. Az IL-10 több előnyös mó-dosítása szerepel ebben a bejelentésben. A találmányban való felhasználásra alkalmas IL-10több forrásból is előállítható. Izolálhatjuk az IL-10-etpéldául az ezen protein szekretálására képes aktivált T-sejtek tenyészetéből. Az IL-10-et vagy fragmentumaitezenkívül még a szakterületen ismert standard techni-kákkal is szintetizálhatjuk. [Lásd például: Merrifield,Science, 233, 341-347 (1986) és Atherton et. al., SolidPhase Peptide Synthesis, A Practical Approach, II. R. L.Press, Oxford (1989)]. A rekombináns humán IL-10 kereskedelmi áru is,megvásárolható például a PeproTech, Inc., cégtől(Rocky Hill, NJ., USA). A rekombináns IL-10 úgy is előállítható, ahogyfent leírtuk, az IL-4-re ismert humán IL-10 vagy virá-lis IL-10 vagy virális IL-10-szekvenciainformációkfelhasználásával. Rekombináns humán IL-10 előállítá-sára szolgáló módszereket ír le például a WO 91/00349számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés.Humán IL-10-et kódoló szekvenciákat tartalmazó kió-nok 1989. december 20-án lettek letétbe helyezve azAmerican Type Culture Collection (ATCC; Rockville,Maryland, USA) intézménynél 68191 és 68192 letétiszámok alatt. Az Epstein-Barr-vírus eredetű virálisIL-10 (BCRF1 protein) klónozását és expressziójátMoore és munkatársai [Science, 248, 1230 (1990)] is-mertették.

Előnyös, ha emberek kezelésére humán IL-10-ethasználunk, bár ehelyett virális IL-10-et vagy néhánymás emlősfajból származó IL-10-et is használhatunk.A legelőnyösebb, ha a használt IL-10 rekombináns hu-mán IL-10. Bármilyen forrásból származik az IL-4 és azIL-10, standard módszerekkel tisztíthatok, például- nem kizárólag - savas vagy sós kicsapással, ioncse-rés kromatográfiával, gélszűréssel, fém-kelát kromatog-ráfíával, gyorsított protein-folyadékkromatográfiával(fást protein liquid chromatography - FPLC), nagy tel-jesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC), prepara-tív korong- vagy függönyelektroforézissel, izoelektro-mos fokuszálással, alacsony hőmérsékleten szerves ol-dószerekkel való frakcionálással, ellenáramú szétvá-lasztással és immunaffinitás-kromatográíiával. IL-4 és IL-10 elleni antitesteket standard módsze-rekkel állíthatunk elő. Az itt használt „antitest” kifeje-zés mind poliklonális, mind monoklonális antitestekre(mAt) vonatkozik. Az antitestek lehetnek teljes immun-globulinok vagy ezek antigénkötő fragmentumai.

Poliklonális antitestek úgy állíthatók elő, hogy álla-tot, például nyulat, patkányt, kecskét, birkát, egeret stb.immunizálunk IL-4-gyel vagy IL-10-zel. Előnyös, haaz első injekció után egy vagy több további injekciótadunk az antitesttiter növelése céljából. Ezután vért ve-szünk az állatból, amelyből szérumot készítünk. A szé-rumot standard módszerekkel szűqük, így enzimimmu-noassay (ELISA) segítségével, amikor is a polipeptidetantigénként használjuk. Az immunglobulin-frakciókatstandard módszerekkel állítjuk elő.

Az IL-4 vagy IL-10 immunogenitását előnyösenúgy növeljük, hogy a számos ismert adjuváns egyiké-vel kombináljuk, vagy az immunizálás előtt nagy mére- 4 1

HU 220 103 B 2 tűvé konvertáljuk, például standard módszerekkel térhá-lósítjuk.

Az ilyen módon immunizált állatokból származó szé-rumot közvetlenül is használhatjuk. Azonban az IgG-frakciókat el is különíthetjük a szérumból standard mód-szerek segítségével, például plazmaforézissel vagy ad-szorpciós kromatográfiával, IgG-specifikus adszorben-sek, például immobilizált Protein A használatával. A monoklonális antitesteket, amelyek használatát atalálmányban előnyben részesítjük, standard módsze-rekkel állíthatjuk elő, például Köhler és munkatársai le-írása [Natúré, 256, 495 (1975); Eur. J. Immunoi., 6,511 (1976)] alapján. Lényegében egy állatot immunizá-lunk a fent ismertetett módon, hogy antitestszekretálószomatikus sejteket kapjunk. Ezeket a sejteket ezutánkivesszük az immunizált állatból, és mielómasejtekkelfuzionáljuk.

Az antitesttermelésre képes szomatikus sejtek - fő-képpen B-sejtek - alkalmasak mielóma-sejtvonallalvaló fúzióhoz. Ezek a szomatikus sejtek az immunizáltállat nyirokcsomóiból, lépéből és perifériás véréből szár-mazhatnak. Gyakran használnak patkánylépsejteket, rész-ben azért, mivel ezeknek a sejteknek viszonylag nagyszázaléka stabilan fuzionál egér-mielómasejtvonalakkal.Azonban humán, egér-, nyúl-, birka-, kecske- vagy ezekhelyett más sejtek használata is lehetséges.

Hibridómatermelő fúziós eljárások céljára speciali-zált mielóma-sejtvonalakat állítottak elő limfoid tumo-rokból [Köhler és Milstein, Eur. J. Immunoi., 6, 511(1976); Shulman et. al., Natúré, 276, 269 (1978); Volket. al., J. Virol., 42, 220 (1982)]. Az antitesttermelő lépvagy nyirokcsomósejtek és a mielómasejtek hibridjeitrendszerint úgy állítják elő, hogy a szomatikus sejteket10:1 arányban (ez az arány 20:1-től 1:1-ig változhat)mielómasejtekkel keverik össze olyan ágens vagy ágen-sek (kémiai, virális vagy elektromos) jelenlétében, ame-lyek elősegítik a sejtmembránok fúzióját. Fúziós mód-szereket ismertettek Köhler és Milstein (lásd előbb),Gefter és munkatársai [Somatic Cell Génét., 3, 231(1977)], és Volk és munkatársai [J. Virol., 42, 220(1982)]. Ezek a kutatók fúziót elősegítő ágensként Sen-dai vírust és polietilénglikolt (PEG) használtak.

Minthogy a fúziós eljárások igen kis gyakorisággalhoznak létre élő hibrideket (például, ha szomatikus sejt-forrásként lépet használunk, durván minden 1 χ 105 lép-sejtre jut egy hibrid), nagyon fontos, hogy olyan eszköz-zel rendelkezzünk, amellyel a fuzionált sejthibrideketel tudjuk választani a fuzionálatlanul maradt sejtektől.Egy olyan módszerre is szükség van, amely a kapott fu-zionált sejthibridek közül kimutatja a kívánt antitestter-melő hibridómákat. A fuzionált sejthibridek szelekcióját általában úgyvégezzük hogy olyan táptalajban tenyésztjük a sejteket,amely fenntartja a hibridómák növekedését, de megaka-dályozza a fuzionálatlan mielómasejtek növekedését,amelyek egyébként végtelenségig osztódnának. A fúzió-hoz használt szomatikus sejtek in vitro tenyészetbennem maradnak élők, és így nem okoznak problémát.Használhatunk például olyan mielómasejteket, amelyeknem tartalmaznak hipoxantin-foszforibozil transzferázt (HPRT-negatív sejtek). Az ilyen sejtekkel szembeni sze-lekciót hipoxantin/aminopterin/timidin (HAT-) tartal-mú táptalajban végezzük, mely táptalajban a fuzionáltsejtek túlélők maradnak a lépsejtek HPRT-pozitív geno-típusának köszönhetően. Használhatók különböző gene-tikai hiányosságokkal (gyógyszerérzékenység stb.) ren-delkező mielómasejtek is, amelyek a genotípusuk sze-rint kompetens hibridekkel szemben szelektálhatok azezek növekedését fenntartó táptalajban. Több hétre van szükség ahhoz, hogy a fuzionáltsejthibrideket szelektíven tenyésszük. Ezen időtartamelején szükséges azonosítani azokat a hibrideket, ame-lyek a kívánt antitestet termelik, hogy ezután ezeket le-hessen klónozni és szaporítani. Általában a kapott hibri-dek mintegy 10%-a termeli a kívánt antitestet, bár nemrendkívüli a körülbelül 1%-tól körülbelül 30%-ig teqe-dő tartomány sem.

Az antitesttermelő hibridek kimutatása számos stan-dard vizsgálómódszerrel kivitelezhető - például enzim-immunoassay, radioimmunoassay technikákkal - ame-lyek a szakirodalomban megtalálhatók [lásd példáulKennet et. al., (szerkesztő), Monoclonal Antibodies andHybridomas: A New Dimension in Biological Analy-ses, 376-384. oldal, Plenum Press, New York (1980)].

Mihelyt a kívánt fuzionált sejthibridet szelektáltuk,és beklónoztuk egyedi antitesttermelő sejtvonalakba,az egyes sejtvonalakat két standard eljárás valamelyiké-vel szaporítjuk el. A hibridómasejt-szuszpenziót beolt-hatjuk hisztokompatibilis állatba. A beoltott állatban,olyan tumorok fejlődnek ki, amelyek a fuzionált sejt-hibrid által termelt specifikus monoklonális antitestetszekretálják. Az állat testfolyadékait - a szérumot vagyaz ascites folyadékot - levesszük, és így magas kon-centrációban kapjuk meg a monoklonális antitesteket.Másképpen úgy járunk el, hogy az individuális sejtvo-nalakat in vitro, laboratóriumi tenyésztőedényekbenszaporítjuk el. Az egyetlen specifikus monoklonális an-titestet magas koncentrációban tartalmazó táptalajtdekantálással, szűréssel vagy centrifugálással aratjukle, majd tisztítjuk.

Mihelyt megkaptuk a kívánt monoklonális antitestettermelő hibridómát, különböző technikákat alkalmazha-tunk, hogy olyan interspecifikus monoklonális antitestek-hez jussunk, amelyekben az egyik fajból származó kötő-szakasz össze van kapcsolva egy másik fajból származóantitest nem kötő szakaszával [Liu et. al., Proc. Natl.Acad. Sci., 84, 3439 (1987)]. Például: egy rágcsálóbólszármazó monoklonális antitest CDR-eit (CDR=Comp-lementarity determining region) beültethetjük egy hu-mán antitest frameworkbe, miáltal a rágcsálóantitestet„humanizáljuk” [Riechmann et. al., Natúré, 332, 323(1988)]. Pontosabban, a CDR-eket beültethetjük olyanhumán antitest variábilis szakaszába, amelynek vagy van-nak vagy nincsenek humán konstans szakaszai. Ilyen me-todológiát használtak például a humán interleukin-2-re-ceptor p55 (Tac) alegysége elleni egér monoklonális anti-test humanizálására (Queen et. al., Proc. Natl. Acad.Sci., 86, 10029 (1989)].

Humán monoklonális antitesteket másként, Ban-chereau és munkatársai [Science, 251, 70 (1991)] mód- 5 1

HU 220 103 B 2 szereivel, IL-4 vagy IL-10 használatával is előállít-hatunk. A találmány antitestkötő fragmentumokra is vonat-kozik, ilyenek az Fab-, F(ab’)2-, Fv-fragmentumok stb.Az antitestfragmentumok használata és előállítása jól is-mert. [Vonatkozó szakirodalom Fab-fragmentumokra:Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunassays(Elsevier, Amsterdam, 1985); Fv-fragmentumokra;Hochman et. al., Biochemistry, 12, 1130 (1973); Sha-ron et. al., Biochemistry, 75, 1591 (1976); Ehrlich et.al., 4 355 023 számú amerikai egyesült államokbeli sza-badalmi leírás; és antitestfélmolekulákra: Auditore-Hargreaves, 4 470 925 számú amerikai egyesült álla-mokbeli szabadalmi leírás], A találmányban előnyösen használt IL-4 vagyIL-10 ellen termelt antitestek és antitestfragmentumokspecifikusan kötődnek IL-4-hez vagy IL-10-hez, ésneutralizálják az IL-4 vagy IL-10 biológiai aktivitását. lL-2-fiiggő daganatos sejtproliferáció gátlása

Egy alábbi példában bemutatjuk, hogy a humán és avirális IL-10 közvetlenül hat a humán T-sejtekre. Azttaláltuk, hogy mindegyik ThO-, Thl- és Th2-szerű sejtproliferatív válaszát gátolta az IL-10, ha Fcy RH-vel(CD32) transzfektált L-sejteket használtunk, akár anti-CD3 monoklonális antitestekkel, akár anti-CD2 mono-klonális antitestek egy mitogén párjával való kombiná-cióban. Ezenkívül a humán T-sejt-klónok antigénspeci-fikus proliferatív válaszait is gátolta az IL-10, ha a vo-natkozó II. osztályú MHC-molekulákkal transzfektáltegér L-sejteket használtuk APC-k (antigén presentingcell) gyanánt. Az IL-10 ebben a rendszerben nem befo-lyásolta a II. osztályú MHC expresszióját, minthogy atranszfektált II. osztályú MHC-gének konstitutív exp-ressziója az SV40 promoter szabályozása alatt állt.

Az IL-10 gátlóhatása elsődlegesen annak tudhatóbe, hogy az IL-10 a T-sejt-klónokra közvetlen hatástfejt ki, és ez a gátlás az IL-2-termelés mRNS-szintenvaló gátlása útján megy vége. A gátlóhatások specifiku-sak voltak IL-2-re, minthogy az IL-10 nem befolyá-solta az IFN-γ-, IL-4-, IL-5- és GM-CSF-termelést.Az IL-10-nek az IL-10-receptorral való kölcsönhatá-sa valószínűleg egy olyan szignálfolyamatot indít meg,amely specifikusan gátolja az IL-2-szintézist. Más vizsgálatok is használhatók a találmány szerin-ti készítmények hatékonyságának a bemutatására. Pél-dául használhatjuk a csupasz egérxenograft-modelleketis. Ilyen modelleket használnak a kemoterápiás szerekszéles változatának a tesztelésére [lásd: Howard et. al.,Cancer Rés., 57, 3274 (1991) és McLemore et. al., Can-derRes., 47, 5132 (1987)].

Az ilyen sejtproliferáció leukémiával - ilyen a B-sejt CLL - társulhat. Előnyös, ha a találmány szerintieljárással kezelt emlősök olyan beteg emberek, akiknélIL-2-függő daganatos sejtburjánzás áll fenn.

Az IL-2-függő daganatos sejtproliferáció gátlásáraszolgáló találmány szerinti eljárás abból áll, hogy egydaganatos sejtburjánzásban szenvedő emlősnek, előnyö-sen egy beteg embernek, az IL-10-ből terápiásán haté-kony dózist adunk be. Egy második biológiailag aktívágensből is beadhatunk terápiásán hatékony dózist.

Azokat a gyógyszerkészítményeket, amelyek IL-10-et és egy fiziológiásán elfogadható hordozót tartalmaz-nak, általában intravénásán alkalmazzuk. Az IL-10 lipo-szóma kapszulába is kiszerelhető.

Ebben a leírásban az „IL-2-függő daganatos sejt-burjánzás” alatt minden olyan új vagy rendellenes szö-vetnövekedést értünk, amelyben a növekedés szabályo-zatlan, progresszív, és a folyamatos proliferáció IL-2-fuggő. A növekedés lehet jóindulatú vagy rosszindula-tú. A rosszindulatú növekedést az jellemzi, hogy a daga-natsejtekben általában nagyobb fokú az anaplázia (diffe-renciáció). Az IL-2-függő daganatsejtek általában lim-foid vagy mieloid vonalakból származnak.

Az IL-2-t a T-sejtek termelik. Az IL-2 a különbö-ző sejttípusokra, így a T-sejtekre, NK-sejtekre és B-sejtekre, sokféle aktivitást fejt ki. Kimutatták, hogy azIL-2 T-sejt-növekedési faktorként működik, és fokoz-za a T-sejtek citokintermelését, ha a T-sejteket IL-2jelenlétében stimulálják. Az IL-2 aktiválja a természe-tes ölősejteket (NK-sejteket), hogy azok MHC nemspe-cifikus módon öljék a célsejteket. Ezenkívül az IL-2szerepet játszik az elkötelezett sejtek felszaporodásá-ban is, s ezáltal fokozza e sejtek antitesttermelését.

Az IL-2 említett aktivitásai alapján fontos lehet szá-mos betegség esetén az a körülmény, hogy az IL -10 gá-tolja az IL-2-termelést. Eszköze lehet az IL-10 pél-dául az IL-2 által ösztönzött T-sejt-proliferáció csök-kentésének, ahol a T-sejt-proliferáció és -növekedésnem kívánt, mint például a következő autoimmunbeteg-ségekben: autoimmun thyroiditis, inzulinfüggő diabé-tesz, rheumatoid arthritis, szisztémás lupus erythema-tosus és sclerosis multiplex.

Ezenfelül az IL-10, mivel csökkenteni képes azIL-2 hatására történő T-sejt-expanziót, potenciálisanhasznosítható klinikailag az akut graft versus hőst be-tegség kezelésében és az olyan krónikus gyulladásosbetegségek kezelésében, mint a gyulladásos bélbeteg-ség, a sarcoid és pulmonális fibrózis. Az IL-10-et fellehet használni továbbá az allergénspecifikus T-sejtek- amelyek az IL-4 és IL-5 fő termelői - IL-2 általösztönzött proliferációjának gátlása révén allergiás be-tegségek - például asztma és atópiás dermatitis - keze-lésére. A jelen találmány szerinti gyógyszerkészítmények-kel kezelhető daganatnövekedéssel járó betegségekközé tartoznak azok a leukémiák, amelyekről tudjuk,hogy IL-2-fiiggőek; ilyen a B-sejt CLL és ATL. A ta-lálmány szerinti gyógyszerkészítmények a legkülönbö-zőbb gyógyszer-alkalmazási rendszerekben is alkalma-sak használatra. A gyógyszeralkalmazás jelenlegi mód-szereiről rövid áttekintést ad Langer [Science, 249,1527 (1990)]. A beadható vegyületek elkészítésének amódszereit az ezen a szakterületen jártas szakemberekismerik vagy ezekkel tisztában vannak. E módszerekrészletesebb leírása megtalálható például a Reming-ton’s Pharmaceutical Science 17. kiadásában [MackPublishing Co., Easton, PA., (1985)]. A találmányban használt lL-10-et gyógyszerészeti-leg elfogadható közegekben - például: fiziológiás kony-hasóoldat, foszfáttal puffereit konyhasóoldat (PBS), 6 1

HU 220 103 B 2

Ringer-oldat, dextróz/konyhasó oldat, Hank-oldat és glü-kózoldat - alakítjuk gyógyszerformává. A fiziológiás körülmények megközelítése céljából akészítmények gyógyszerészeti lég elfogadható kiegészí-tóanyagokat is tartalmazhatnak, ilyenek a pufferhatásúszerek, vémyomás-beállító szerek, nedvesítőszerek, de-tergensek és hasonlók. Az adalékanyagok további aktívalkotórészeket is tartalmazhatnak, például baktericidszereket vagy stabilizálószereket. A betegnek beadottmennyiség a beadandó anyagtól, a beadás céljától - ezlehet profilaxis vagy terápia - a szervezet állapotától,az alkalmazás módjától és hasonlóktól függ. A gyógyszerkészítményeket általában transzdermá-lis vagy parenterális beadásra szánjuk, például intravé-nás, szubkután vagy intramuszkuláris alkalmazásra.Megkívántak a szájon át (orális) beadható gyógyszerfor-mák is, ezeket az összetétel módosításával úgy készít-jük el, hogy kikerüljék a gyomormiliőt. A készítményprofilaktikus és/vagy terápiás kezelésre használható.Előnyös, ha a gyógyszerkészítményt intravénásán alkal-mazzuk. A találmány tehát olyan készítményeket bo-csát rendelkezésre, amelyek megfelelő vivőanyagban -előnyösen vizes vivőanyagban - oldott vagy szuszpen-dált IL-10 polipeptidet tartalmaznak. Ezek a készítmé-nyek hagyományos sterilezési technikákkal sterilizálha-tok vagy sterilre szűrhetők. A kapott vizes oldatokat ebben a formában is csoma-golhatjuk a felhasználáshoz, de liofilizálhatjuk is, és aliofílizált készítményt steril vizes vivőanyagban oldjukfel használat előtt. Az IL-10-et egy második bioló-giailag aktív anyaggal együtt, például egy standard ke-moterápiás szerrel együtt is beadhatjuk. Ezek közé aszerek közé tartozik a vinkrisztin, daunorubicin, L-asz-paragináz, mitoxantron és amszakrin (a felsorolás nemkizáró jellegű).

Terápiás alkalmazás esetén a gyógyszerkészítmény-ből olyan mennyiséget adunk a betegnek, amennyi elég-séges az IL-2-fuggő daganatos sejtburjánzás gátlásához.A kívánt hatást eredményező megfelelő mennyiséget „te-rápiásán hatékony dózis”-nak nevezzük. Az IL-10 terá-piásán hatékony dózisát például a következő körülmé-nyek szabják meg: a konkrét felhasználás, azaz amiérta kezelést végezzük, a beadás módja, a beteg egészsé-gi állapota és a kezelő- (receptet író) orvos ítélőképes-sége. Például: folyamatos infúzió esetén egy 70 kg-osbetegnél a napi dózis általában körülbelül 500 ng-tól kö-rülbelül 800 pg- ig terjedő tartományba, előnyösen körül-belül 10 pg és 300 pg közé esik. A dózis általában700 ng/kg/nap és 16 pg/kg/nap között változik. A gyógyszerformákban az IL -10 koncentrációja erő-sen változik, azaz ml-enként körülbelül 10 pg-tól körül-belül 5 mg-ig, előnyösen körülbelül 100 pg-tól 2 mg-ig.A koncentrációt rendszerint elsődlegesen a folyadék tér-fogata, viszkozitása stb. szerint választjuk meg, a válasz-tott speciális beadási módnak megfelelően. Egy jellegze-tes, intravénás infúzióhoz szolgáló gyógyszerkészít-mény tehát úgy készíthető el, hogy az 250 ml dext-róz/konyhasó oldatot és 2,5 IL-10-et tartalmazzon.

Szilárd készítményekhez a hagyományos, atoxikusszilárd vivőanyagokat használhatjuk, ilyenek például a gyógyszerészeti minőségű mannit, laktóz, keményítő,magnézium-sztearát, a szacharin nátriumsója, talkum,cellulóz, glükóz, szacharóz, magnézium-karbonát és ha-sonlók. Orális alkalmazáshoz egy gyógyszerészetilegelfogadható, atoxikus összetételt formulázunk általáno-san alkalmazott kötőanyagok - mint az előbb felsoroltvivőanyagok - és általában 10-95% aktív hatóanyaghasználatával, amely a találmány szerinti IL-10 poli-peptid esetén előnyösen 25-75%.

Aeroszolos alkalmazáshoz előnyös, ha az IL-10-etfinom eloszlású formában, felületaktív anyaggal és haj-tógázzal juttatjuk ki. Az aeroszolban az IL-10 meny-nyisége általában 0,01-20% (tömeg%), előnyösen1-10% (tömeg%). A felületaktív anyagnak természete-sen atoxikusnak kell lennie, és előnyös, ha a hajtógáz-ban oldódik. Ilyen ágensek a 6-22 szénatomos zsírsa-vaknak - mint például a kapron-, kapril-, laurin-, pal-mitin-, sztearin-, linói-, linóién-, oleosztearin- és olein-sav - egy alifás polialkohollal vagy ciklusos anhidridjé-vel - ilyenek például az etilénglikol, glicerin, eritrit, ara-bit, mannit, szorbit, a szorbit hexitanhidrid-származé-kai - alkotott észterei vagy parciális észterei és ezen ész-terek poli(oxi-etilén)- és poli(oxi-propilén)- származé-kai. Vegyes észterek, például vegyes vagy természetesgliceridek, is alkalmazhatók. A készítményben a felületaktív anyagok mennyi-sége 0,1-20% (tömeg%), előnyösen 0,25-5% (tö-meg%). A készítmény többlettömegét rendszerint a haj-tógáz adja. A folyékony hajtógázok környezeti feltéte-lek mellett általában gázneműek és sűrítésük nyomásalatt történik. Az alkalmas folyékony halmazállapotúhajtógázok általában rövid szénláncú, legfeljebb 5 szén-atomot tartalmazó alkánok - mint a bután és propán -és előnyösen fluorozott vagy fluor-klórozott alkánok.Az említett anyagok keveréke szintén alkalmazható.Az aeroszolt úgy készítjük, hogy az alkalmas szeleppelellátott tartályt megtöltjük a megfelelő hajtógázzal,amely a finom eloszlású pepiidet (peptideket) és a felü-letaktív anyagot tartalmazza. Az alkotórészeket tehátmegemelt nyomás alatt tartjuk, amíg a szelep működte-tése révén ki nem eresztjük. A szérumfelezési idő növelésére az IL-10-et kapszu-lázhatjuk. Kolloid formában liposzómák belsejébe vezet-jük be. Alkalmazhatunk más, hagyományos technikákatis, amelyek a peptideknek hosszabb élettartamot biztosí-tanak. Bizonyos kiviteli alakokban tehát az IL-10-etliposzómába kapszulázzuk. Liposzómák készítésére kü-lönböző eljárások állnak rendelkezésre [lásd például:Szoka et. al., Ann. Rév. Biophys. Bioing., 9, 467 (1980)és a 4 235 871, 4 501 728 és 4 837 028 számú amerikaiegyesült államokbeli szabadalmi leírásokat].

Az elkészítés után a liposzómákat úgy méretezzük,hogy biztosítsuk a kívánt mérettartományt és a lipo-szómaméretek viszonylag szűk megoszlását. Több tech-nika áll rendelkezésre a liposzómák méretének beállítá-sára. Ilyen technikát ismertet a 4 737 323 számú ameri-kai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. Még a leghatékonyabb kapszulázási módszer mel-lett is előfordulhat, hogy az előzőleg méretezett lipo-szómaszuszpenzióban a gyógyszer 50%-a, vagy ennél 7 1

HU 220 103 B 2 több, szabad (nem kapszulázott) formában van jelen.Számos módszer áll rendelkezésre ahhoz, hogy a nembefogott vegyületet eltávolítsuk a liposzómaszuszpen-zióból. Az egyik módszer szerint a szuszpenzióbólnagy sebességű centrifiigálással leülepítjük a liposzó-mákat, így a szabad vegyület és a nagyon kis liposzó-mák a felülúszóban maradnak. Egy másik módszer sze-rint a szuszpenziót ultraszűréssel koncentráljuk, ezutána koncentrált liposzómákat egy másik közegben re-szuszpendáljuk. Még másképpen úgy járunk el, hogygélszűrést alkalmazunk, és így választjuk el a nagyliposzómarészecskéket az oldott molekuláktól.

Fenti kezelés után a liposzómaszuszpenziót az intra-vénás alkalmazáshoz megkívánt koncentrációra állítjukbe oly módon, hogy a liposzómákat megfelelő mennyi-ségű injekciós közegben reszuszpendáljuk, ha a lipo-szómákat például centrifiigálással vagy ultraszűrésselkoncentráltuk, vagy úgy, hogy koncentráljuk a szusz-penziót, ha a szer eltávolítására tett lépés növelte a tel-jes szuszpenzió térfogatát. A szuszpenziót ezután szű-réssel sterilizáljuk, ahogy előbb leírtuk. A találmányszerinti peptideket tartalmazó liposzómákat parenterá-lisan alkalmazhatjuk a fentebb leírt módon.

Megnövelt IFN-y-termelés A találmány szerinti eljárás különösen hasznos ab-ban az esetben, ha a beteg fertőző betegségben szen-ved, és a beteg immunrendszere gátolja az IFN-y-ter-melést IL-4- és IL-10-termelés következtében. Ilyenbetegség például a viszcerális leishmaniasis, a lep-ra lepromatosa és a gombafertőzések. A reprezentatívgombafertőzések közül a következő nemhez (genus) tar-tozó gombákat említjük meg: Candida, Paracoccidioi-domycosis Blastomyces és Cryptospiroidium.

Számos fertőző mikoroorganizmusnak közvetlenülvagy közvetve kedveznek az alacsony IFN-y-szintek.Ezek a fertőzések gyakran krónikusak, és jellemző rá-juk a fertőző ágenssel szembeni Th2 versus Thl vála-szok kiegyensúlyozatlansága. Ennek a kiegyensúlyozat-lanságnak az eredménye az IFN-y-t termelés Thl-sejtekáltal történő gátlása, ami a Th2-sejtek IL-4 és IL-10termelésének tudható be.

Előnyös, ha a találmányban használt antitestek a be-teg számára autológok. Szintén hasznosak az ugyanazonfajok sejtjeiből származó non-self antitestek. Más fajok-ból származó antitestek is használhatók, de a lehetségeskáros immunreakciók (HAMA) ellenőrzési módszerei-nek alkalmazása mellett. Például beteg emberekben a hu-manizált patkányantitestek minimálisra csökkenthetikaz immunválaszokat, ugyanígy a különböző, kötésre ké-pes fragmentumok is. Előnyös, ha az antitestek kötésikonstansa megközelíti vagy felülmúlja az IL-4 ésIL-10 természetes receptorához való affinitását.

Azokat az antitesteket tartjuk előnyösnek, amelyek-nek a kötési konstansa nem százszor kisebb, mint ezencitokineké, megfelelő receptoraikhoz, hanem ennél na-gyobb. A kötési tulajdonságok összehasonlítását stan-dard egyensúlyi módszerek használatával végezték el.Az alaptechnológia leírása megtalálható az „Immuno-chemistry” című kiadvány 1. kötete 25. fejezetében(Szerkesztő: D. M. Weir; 4. kiadás (1986); Blackwell

Scientific Publ. 25.1-25.30). Használhatunk más vizs-gálómódszert is, amikor is meghatározzuk az antitestazon moláris feleslegét, amely az IL-4 vagy IL-10meghatározott mennyiségét képes neutralizálni stan-dard in vitro bioassay-ben. Ilyen assay-ket írnak le pél-dául a következő szerzők: Mosmann és munkatársai [J.Immunoi. Methods, 116, 151 (1989) (IL-4)] és Fioren-tino és munkatársai [J. Exp. Med., 170, 2081 (1989)].Egy adott mennyiségű IL-4-et vagy IL-10-et az anti-testek 10-1000-szeres túlsúlya - ez az elfogadható tar-tomány - képes neutralizálni. A találmányi leírásban az „együtt alkalmazva” kife-jezés azt jelenti, hogy az IL-4 és IL-10 elleni antiteste-ket egymáshoz annyira közeli időben alkalmazzuk,hogy azok együtt vannak jelen a betegben. Az alkalma-zás sajátos sorrendje nem kritikus, az antitestek egyszer-re vagy külön is alkalmazhatók, ha azokat akár egy elő-zőleg végzett elegyítés után, akár egymástól elkülönít-ve adjuk be.

Az alkalmazás módja általában parenterális, előnyö-sen intravénás. Az antitesteket standard intravénás tech-nikákat használva infundáljuk a betegnek. Az antiteste-ket először steril, fiziológiásán kompatibilis közegben- ilyen a foszfáttal pufferolt konyhasóoldat - szuszpen-dáljuk. Gyógyszerészetileg elfogadható segédanyago-kat - mint lecitin, glükóz, antibiotikumok - is beadha-tunk az antitestekkel együtt.

Az együtt alkalmazott antitestek mennyisége antites-tenként 1-10 mg/kg testtömeg lehet. Az antitestekbőlolyan mennyiséget előnyös beadni, hogy a keringő anti-testek szintje egyenként körülbelül 1-150 pg, előnyö-sen 10-100 pg legyen szérum-ml-enként. Az antites-tek felezési ideje általában 2-7 nap, és ismételt beadá-suk akkor helyénvaló, ha mindegyik antitest szintje a kí-vánt érték alá esik. A szérumminták antitestszintjét aszokásos immunoassay-kkel, előnyösen ELISA-assay-vel, mérhetjük. Bár a találmány ezen kiviteli alakjának a bemutatásá-ra IL-4 és IL-10 monoklonális antitesteket haszná-lunk, más antagonisták ugyancsak használhatók. Pél-dául használhatunk olyan antitesteket is, amelyek speci-fikusan kötődnek az IL-4- vagy IL-10-receptorhoz, ésígy gátolják a citokin kötődését. Ehhez hasonlóan hasz-nálhatók az IL-4- és IL-10-receptor oldható formái is,amelyekből hiányzik a transzmembrán dómén. Végülaz IL-4 vagy IL-10 mutáns antagonista formáit is hasz-nálhatjuk, amelyek erősen kötődnek ugyan a megfelelőreceptorokhoz, de lényegében nincs biológiai aktivitá-suk. Egy ilyen mutáns IL-4-antagonistát írtak le Kruseés munkatársai [EMBO J., 11, 3237 (1992)]. Ebben azantagonistában a vad típusú humán IL-4 124. pozíciójá-ban lévő tirozinmaradékot aszparaginsavmaradékkal he-lyettesítették.

Az antagonistákat együttesen előnyösen intravéná-sán alkalmazzuk, steril vizes elegyet használva. Azelegy bármilyen gyógyszerészetileg elfogadható töltő-anyagot tartalmazhat, mint a steril pufferek, fiziológiáskonyhasóoldat, antibiotikumok és hasonlók. A kezelést általában akkor fejezzük be, ha a fertő-zés ellenőrzés alatt áll, amelyet a beteg klinikai válasza 8 1

HU 220 103 B 2 igazol. Hagyományos antibiotikumkezeléseket is alkal-mazhatunk a találmány szerinti kezeléssel együtt.

Gyulladásos bélbetegség A gyulladásos bélbetegség (inflammatory boweldisease=IBD) meghatározás alatt ebben a leírásban acolitis ulcerosa és a Crohn-betegség értendő. Az IBDkezelésére szolgáló IL-10-et előnyösen parenterálisan - például intravaszkulárisan - alkalmazzuk. A legelő-nyösebb az intravénás alkalmazás és ha a kezelt emlősember. A beadott IL-10 mennyisége általában körülbelül1 pg-tól körülbelül 100 mg-ig terjed testtömeg-kg-on-ként. Ez a tartomány körülbelül 10 pg-tól körülbelül1000 pg-ig teljed testtömeg-kg-onként. A legelőnyö-sebb, ha a testtömeg-kg-onként körülbelül 50 pg-tól kö-rülbelül 100 pg-ot alkalmazunk.

Az IL- 10-et egymagában vagy egy vagy több továb-bi terápiás szerrel együttesen alkalmazhatjuk. A bélszö-vetek szakaszosan ismétlődő gyulladásának szabályozá-sára használt szerek például a következők: kortikoszte-roidok, szulfaszalazin, a szulfaszalizin származékai, im-munszuppresszív szerek, mint a ciklosporin A, mekap-to-purin és azatioprin és más citokinek. Az együttes al-kalmazás lehet egymást követő vagy egyidejű. Az együt-tes alkalmazás általában azt jelenti, hogy egy meghatáro-zott időtartam folyamán a recipiensben több (kettő vagytöbb) terápiás szer van jelen. Általában, ha egy másodikszert egy első szer felezési idején belül adunk be, úgy te-kintjük, hogy a két szert együttesen alkalmazzuk. A találmány módszert ismertet arra nézve, hogy ho-gyan lehet előre meghatározni egy emlős hajlamosságátegy olyan gyulladásos állapot kialakulására, amelyet azIL-10 szuboptimális szintjei jellemeznek. A módszerabból áll, hogy egy emlősből vett mintát IL-10-szintrevizsgálunk. A szuboptimális szintek kimutathatatlanmennyiségeket tartalmaznak. A kimutatható szint azIL-10 egy ismert normál szintjéhez hasonlítható. Vagymásképpen, gyulladásos mediátorokra is vizsgálhatunk - ilyenek az IL-1, IL-6, TNF és INF-γ - kereskede-lemben kapható diagnosztikai készletekkel.

Egy vagy több mediátor-túltermelés jelezheti, hogynem áll rendelkezésre elegendő mennyiségű IL-10.Előnyös, ha vérmintát veszünk. A módszer számos gyul-ladásos állapotra való hajlam előzetes meghatározásátteszi lehetővé. Ilyen állapot egy IBD vagy egy anémia,egy arthritis, egy dermatitis vagy egy más, IBD-hez tár-sult szindróma.

Gyógyszerkészítmények is rendelkezésre állnak.Egy IBD-ben - colitis ulcerosa vagy Crohn-betegség -szenvedő emlősnél alkalmazandó gyógyszerkészítményaz IL-10-ből olyan mennyiséget tartalmaz, amely haté-konyan enyhíti az IBD legalább egy panaszát vagy tüne-tét az emlősben, tartalmaz továbbá egy gyógyszerészeti-leg elfogadható olyan hordozót, mint amilyeneket azelőbbiekben leírtunk. Általában a „panasz” kifejezés a betegségnek vagyegy beteg állapotának bármilyen szubjektív bizonyíté-kára vonatkozik. Ebben bennfoglaltatnak a beteg általészlelt tények. IBD-s panaszok a következők: hasme-nés, hasi fájdalom, láz, véresszéklet-ürítés (melena, he- matochezia) és súlyvesztés. A „tünet” kifejezés általá-ban a betegség vagy állapot bármilyen olyan objektívbizonyítékára vonatkozik, amelyet rendszerint a vizs-gáló orvos észlel, vagy olyan sajátságokra, amelyeketegy laboratóriumi kiértékelés vagy más vizsgálatok,mint például egy ultrahangvizsgálat vagy egy radiográ-fiás vizsgálat állapít meg. IBD-s tünetekre vonatkozó néhány példa: hasitérimé, glossitis (nyelvgyulladás), aftás fekély, végbél-repedés (fissura ani), végbél körüli sipoly (fistula peria-nilis), anémia, maiabszorpció és vashiány. Néha a pana-szok és a tünetek fedik egymást. Például: a beteg pana-szolja, hogy véres a széklete (panasz), és a székletmintalaboratóriumi vizsgálata vérre pozitív (tünet). A találmány ezen kiviteli alakjában használt gyógy-szerkészítmények előnyösen parenterális bevitelre al-kalmas formában készülnek. Előnyös, ha a hatékonymennyiség egyadagos ampullás kiszerelésű. A haté-kony mennyiséget több adagot tartalmazó fiolákba istölthetjük, de más kiszerelési formát is alkalmazhatunk.A gyógyszerészetileg elfogadható adalékanyagok közétartoznak az olyan vivőanyagok, mint a vizes vivőanya-gok, pufferek, hígítók, antimikrobiális szerek és konzer-válószerek. A citokinekre vonatkozó biológiai vizsgálatokat azIL-10-aktivitás meghatározására is fel lehet használni.A humán limfotoxin biológiai vizsgálatát Agarwal [Me-thods in Enzymology, 116, 441 (1985)] és Matthews ésmunkatársai [Clemens et. al., szerkesztő, Cytokines andIntererons: A Practical Approach, 221-225. oldal, IRLPress. Washington, D.C. (1987)] írták le. A humánIL-2-t és GM-CSF-et a faktorfüggő CTLL-2 ésKG-1 sejtvonalak (ATCC letéti számok: TIB 214, illet-ve CCL 246) segítségével vizsgálhatjuk. A humán IL-3vizsgálata azon alapul, hogy a hemopoetikus sejttelepekszéles változatát képes stimulálni lágy agartenyészetek-ben. Lásd például: Metcalf, „The Hemopoietic ColonyStimulating Factors” (Elsevier, Amsterdam, 1984). AzIFN-y-t antivirális assay-ben szűrhetjük. Lásd példáulMeager közleményét a Clemens et. al., szerkesztette ki-adványban, a 129-147. oldalán. Ezeknek a citokinek-nek a monitorozása hasznos információt adhat arra vo-natkozóan, hogy mikor alkalmaztuk az IL-10 hatékonymennyiségét. Immunkémiai assayket is használhatunk,mint például ELISA-t.

Az IL-10 vizes vivőanyagokban alkalmazható, ígyvízben, fiziológiás konyhasóoldatban vagy pufferolt vivő-anyagokban, amelyek különböző adalékanyagokat tartal-maznak vagy nem tartalmaznak, és/vagy hígítószerek-ben. IL-10-et tartalmazó szuszpenziót is készíthetünk,például cinkszuszpenziót. Az ilyen szuszpenziók szubku-tán vagy intramuszkuláris injekciókhoz használhatók. AzIL-10 és az adalékanyagok aránya széles tartományonbelül változhat, amíg mindkettőből hatékony mennyiségvan az elegyben. Dózisonként az IL-10 mennyisége kö-rülbelül 1 pg-tól körülbelül 100 mg-ig változhat. A teljes napi adag általában körülbelül 1 pg-tól körül-belül 100 mg-ig teljed testtömeg-kg-onként. Előnyös, haa dózist úgy választjuk meg, hogy testtömeg-kg-onkéntkörülbelül 10 pg-tól körülbelül 100 pg-ig terjedjen. Még 9 1

HU 220 103 B 2 előnyösebb, ha testtömeg-kg-ra számítva körülbelül50 pg-tól körülbelül 100 pg-ig választjuk meg a dózist.Az adagolást olyan séma szerint alkalmazzuk, amellyeleléijük a kívánt hatást. Az adagolás lehet periodikus,amely rövid vagy hosszú perióduson keresztül történik,vagy lehet rendszertelen, amelyet az ilyen gyulladásokszakaszosan ismétlődő természete megkíván. A készítmények vagy szájon keresztül (orálisan) vi-hetők be a szervezetbe, vagy injekciózás révén. Az orá-lis felhasználásra szolgáló készítmények olyan vegyüle-teket tartalmaznak, amelyek megvédik a polipeptideketa gyomor-bél traktusban jelen lévő proteázoktól. Az in-jekciók rendszerint intramuszkuláris, szubkután, int-radermális vagy intravénás alkalmazáshoz készülnek.Emellett az intraartikuláris injekció vagy más beadásimód is használható megfelelő körülmények között.Ezenkívül az IL-10-tartalmú készítmények a betegbebeültethetők vagy egy gyógyszerleadó rendszer haszná-latával a betegbe injektálhatok. Lásd például : Urquhartés munkatársai, Ann. Rév. Pharmacol. Toxicol., 24,199 (1984); Lewis (szerkesztő), „Controlled Release ofPesticides and Pharmaceuticals” (Plenum Press, NewYork, 1981); 3 773 919 és 3 270 960 számú amerikaiegyesült államokbeli szabadalmi leírások.

Előnyös, ha a peptidet parenterálisan alkalmazzuk,előnyösen egyadagos, injekciós gyógyszerformában. In-jekciós gyógyszerformák például az oldatok, szuszpen-ziók és emulziók. Előnyösebb, ha az IL-10 hatékonymennyiségét intravénásán alkalmazzuk. A „hatékony mennyiség” meghatározás ebben a le-írásban egy olyan mennyiséget jelent, amennyi elégsé-ges egy autoimmunállapot vagy egy nem kívánt vagyrendellenes gyulladás vagy immunválasz tüneteinekvagy panaszainak az enyhítésére. Tipikus gazdaszerve-zetek az egerek, patkányok, macskák, kutyák és a főem-lősök, beleértve az embereket. Egy adott beteg számáraa hatékony mennyiség különböző faktoroktól függhet,ilyenek a következők: a kezelendő állapot, a beteg álta-lános egészségi állapota, az alkalmazás módja, miként-je és a dózis, továbbá a mellékhatások súlyossága. A megfelelő dózist a klinikus állapítja meg, a szak-mában ismert paraméterek alapján. Az adagolást általá-ban az optimális dózisnál valamivel kisebb mennyiség-gel kezdjük, és ezután apránként növeljük addig, amígaz optimális hatást el nem érjük. (Lásd például: TheMerck Manual, 269. fejezet „Pharamcokinetics andDrug Administration”). A TNFa-, IFN-γ-, IL—1- ésIL-6-szintek fontos indikátorai annak, hogy mikor ér-jük el a hatékony szintet. Előnyös, ha a kezelt emlősfa-jokból származó IL-10-et használjuk.

Az IL-10-et általában gyógyszerhordozóval társít-va injektáljuk, például fiziológiás konyhasóoldatban,Ringer-oldatban, dextrózoldatban és más, a szakmábanismert vizes oldatban. Megfelelő nemvizes hordozók ishasználhatók, ilyenek például a stabil olajok és az etil-oleát. Előnyös hordozó az 5% dextrózt tartalmazó fizio-lógiás konyhasóoldat. Gyakran megkívánt, hogy a hor-dozók adalékanyagokat is tartalmazzanak, például puf-fereket és konzerválószereket vagy más anyagokat azizotónia és a kémiai stabilitás biztosítására. A teljes napi adagot egyetlen injekcióban vagy fo-lyamatos infundálással adhatjuk be. A készítményt el-oszthatjuk több kisebb adagra, bolusz intravénás alkal-mazáshoz vagy más úton történő bevitelhez, mint pél-dául intramuszkuláris injekcióhoz. Az IL-10-et előnyö-sen intravénás boluszként alkalmazzuk.

Az IL- 10-et egymagában vagy más terápiás szerek-kel együttesen alkalmazhatjuk. Ilyen szerek lehetnekgyulladásos bélbetegség indikációja esetén a kortiko-szteroidok, a szulfaszalazin, a szulfaszalazin származé-kai és néhány kiválasztott citotoxikus gyógyszer, minta ciklosporin A, merkapto-purin és azatioprin. A több-gyógyszeres kezelés általában külön-külön infundálvavagy egymást követően injektálva végezhető. Alkal-mas körülmények mellett a gyógyszereket elegyítjük,és így infundáljuk vagy szimultán együtt injektáljuk.Az IL-10-et például más citokinekkel, sztereoidokkalvagy más terápiás reagensekkel együtt adjuk be.

Megjegyzendő, hogy az IBD-tünetek időszakosanjelenhetnek meg, tehát hatásos kezelést úgy érhetünkel, ha kis dózisokat alkalmazunk a megfelelő pillanatok-ban. Egyébként kis adagok hosszú időn át történő folya-matos bevitele epizódmentes egészséget biztosíthat abetegségben szenvedő célállatok számára.

Az együttes alkalmazás történhet egy időben vagyegymás követően. Az „együttes alkalmazás” általábanazt jelenti, hogy mindkét citokin jelen van a recipiens-ben egy meghatározott időtartam alatt. Általában, haegy második citokin alkalmazására kerül sor a beadan-dó első citokin felezési idején belül, a két citokin alkal-mazása együtt történt. Az együttes alkalmazást előnyö-sen parenterálisan végezzük, és előnyösebben intravé-násán. A hatékony mennyiség az emlős testtömeg-kg-jaként körülbelül 15 pg-tól 1500 pg-ig teljed. Késői típusú túlérzékenységi reakciók gátlása A találmány ezen kiviteli alakja in vivő módszert is-mertet a késői típusú túlérzékenység gátlására emlős-ben. A módszer abból áll, hogy az emlősnek az IL-10hatékony mennyiségét adjuk be. Emlősnél az IL-4 ha-tékony mennyiségét együtt alkalmazzuk az IL-10-zel,és az emlős általában ember. Az IL-4 és IL-10 együt-tes alkalmazása lehet egyidejű vagy egymást követő.Az alkalmazás módja rendszerint parenterális, előnyö-sen intravaszkuláris. A találmány ezenkívül egy olyan módszert bocsátrendelkezésre, amely gátolja a sejtek vándorlását az em-lős szervezetében lévő gyulladás helyére. A sejtvándor-lás annak tulajdonítható, hogy az emlős sejtes immun-válasza összegyűjti vagy odavonzza a sejteket - így alimfocitákat, monocitákat és makrofágokat - a gyulla-dás helyére. Módszert ismertetünk duzzanat gátlásáraemlősszövetekben.

Fenti módszerek szerint IL-4-et és IL-10-et alkal-mazunk parenterálisan - például intravénásán - vagy ahelyi gyulladás közelében. Mind az IL-4, mind azIL-10 hatékony mennyiségét úgy választjuk meg, hogykörülbelül 15 pg-tól körülbelül 1500 pg-ig terjedjen azemlős testtömeg-kg-jára számítva. A találmány további in vivő módszert bocsát rendel-kezésre a késői típusú túlérzékenység korlátozására em- 10 1

HU 220 103 B 2 lősben. A módszer szerint mind az IL-10-ből, mind azIL-4-ből hatékony mennyiséget adunk az emlősnek, ésaz együttes alkalmazás parenterálisan történik. A haté-kony mennyiség körülbelül 15 pg-tól körülbelül1500 pg-ig terjed az emlős testtömeg-kg-jára számítva.A hatékony mennyiséget a körülbelül 100 pg-tól1000 pg-ig terjedő tartományból választhatjuk ki. A találmány egy olyan készletre (kitre) is vonatko-zik, amely elősegíti a T-sejtek citokintermelésénekIL-10 által közvetített gátlását. A kit az IL-4 és IL-10elegyének egy adagját tartalmazó ampullából áll. Am-pulla helyett más tartály is használható. Lehet fiola, mű-anyag zsák, üveg kémcső és hasonlók. Előnyös, ha azIL-4 és IL-10 elegyét egy olyan gyógyszerforma tar-talmazza, amely parenterális beadásra alkalmas. Az egy-adagos kiszerelést általában úgy választjuk meg, hogyaz mind az IL-4-ből, mind az IL-10-ből körülbelül15 pg-tól körülbelül 1500 pg-ig terjedő mennyiséget tar-talmazzon emlős-testtömeg-kg-onként. A találmány alapját az az elgondolás képezi, hogy azIL-4 és IL-10 együttesen hatnak a T-sejt-aktivitásra.Ez a találmány jelentette be először, hogy azonosította aspecifikusan T-sejtre vonatkozó kooperációt. Az eztmegelőző adatok rámutattak a makrofágokra vagy mo-nocitákra gyakorolt hatásokra és a makrofágok effektorszerepére. Az IL-4 és IL-10 additív hatása a T-sejt-aktivitásra meglepő, és további terápiás felhasználásuk-ra teremt lehetőséget a sejt közvetített immunitás tekinte-tében. Minthogy az IL-4 és IL-10 kombinációja előse-gíti a T-sejt-citokin-termelés IL-10 közvetített gátlását,a találmány hasznosítható minden olyan esetben, ahol acitokintermeléssel kapcsolatos T-sejt-válasz ellenőrzésekívánt. A példák a késői típusú túlérzékenységre, a sejtközvetített gyulladásra és a T-sejt-proliferációra és-aktiválásra kifejtett hatásokat tartalmazzák. Például, az I típusú diabetes mellitus autoimmun be-tegségre jellemző, hogy a szigetsejtekbe limfociták,makrofágok és plazmasejtek szűrődnek be. A T-sejtekcitokintermelésének a szuppressziója enyhítheti a diabé-tesz tüneteit és a szigetsejtek károsodását. A találmányezenkívül szerepet kaphat a szervátültetéssel és graf-tokkal kapcsolatos sejtközvetített immunválaszok keze-lésében is.

Ismeretes, hogy a vesekilökődésben szerepe van asejtközvetített immunitásnak. Az átültetett vese környe-zetében lévő citokinek sejtaktiválást, -proliferációt, -agg-regációt, -fibrogenezist, -növekedés-gátlást és citotoxi-citást eredményeznek. A találmány tehát a GVDH (graftversus hős disease) kezelésében is jótékony hatású le-het. Ezenfelül a megállapított DTH-halálokhoz sar-coidosis - egy limfoproliferatív rendellenesség - kap-csolódik, és az aktivált T- vagy helper sejtekhez későbbgranulóma (saqadaganat) társul. A találmányt a következő példákkal szemléltetjük,azonban ezek nem korlátozzák a találmány oltalmi kö-rét. Ha másként nem írjuk elő, a következőkben a szi-lárd anyagoknak a szilárd anyagokban, a folyadékok-nak a folyadékokban és a szilárd anyagoknak a folya-dékokban való százalékos arányát tömeg/tömeg, térfo-gat/térfogat, illetve tömeg/térfogat alapon adjuk meg. IL-2-juggő daganatos sejtburjánzás gátlása 1. példa

Az IL-10 gátolja a humán ThO-, Thl- és Th2-szerűkiónok proliferációját a CD32-vel transzfektált egér-L-sejteken térhálósított anti-CD3 monoklonális antitestek-kel való aktiválást követően.

Sejtek és sejtvonalak A következő T-sejtvonalakat használtuk: CD2+,CD3+, CD4+ és CD8-. A HY-06, 827 és 837 kiónokatelőzőleg Yssel és munkatársai [Eur. J. Immunoi., 16,1187 (1986)] és Haanen és munkatársai [J. Exp. Med.,174, 583 (1991)] írták le. A 827 T-sejt-klón a tetanusz-toxint (TT) ismeri fel a HLA-DR3-mal összefüggés-ben és a HY-06 T-sejt-klón a Mycobakterium leprae65 kD hősokkproteinjéből származó 2-12 peptidet is-meri fel. A 837 T-sejt-klón antigénspecificitása isme-retlen.

Az SP-B21 és SP-A3 T-sejt-klón olyan betegbőlszármazott, aki súlyos kombinált immunelégtelenség-ben (severe combined immunodeficiency=SCID) szen-vedett, és akit eredményesen gyógyítottak ki fetálistímusz- és fetális májtranszplantációval [Roncarolo et.al., J. Exp. Med., 168, 2139 (1988)]. Az NP12, NP14,és NP44 T-sejt-klónokat egy atópiás betegből vett peri-fériás vér mononukleáris sejtjei (PBMC) közül izolál-ták, és speciálisan a Dér p I molekula - a háziporatkafő allergénje - p89-l 17 peptidjére adott válaszként pro-liferálnak [Yssel et. al., J. Immunoi., 148, 738 (1992)].A CR253, CR378, CR380, AP74 és AP75 T-sejt-kló-nokat krónikus Lyme arthritisben szenvedő betegekPBMC-ből izolálták. A kiónok a Borrelia burgdorferi60 kD hősokkprotein homológgal (HSP60) reagálnak[Shanafelt et. al., J. Immunoi., 146, 3985 (1991)].

Ezeket a T-sejt-klónokat limfokintermelő profil-juk alapján T helper alcsoportokba soroltuk (1. táblá-zat). A T-sejt-klónokat (2xl05 sejt/ml) kéthetes idő-közönként 24 tartályos Linbro-lemezeken (FLOW,McLean, VA., USA) a következő sejtekből álló feeder-sejtkeverékkel stimuláltuk: ml-enként 106 besugárzott(4000 rád) allogén perifériás vérleukocita (PBL=pe-ripheral blood leukocyte), ml-enként 105 besugárzott(5000 rád) Epstein-Barr-vírussal transzformált JY B-sejtvonal (EBV-LCL) és 0,1 mg/ml tisztított PHA (fito-hemagglutanin; Wellcome Diagnostics, Beckenham,Kent, Egyesült Királyság). A stimulálást Spits és mun-katársai [J. Immunoi., 128, 95 (1982)] által leírtak sze-rint végeztük. Az egyes stimulálások után 3-4 nappala tenyészeteket elválasztottuk, és újból feltöltöttük20 E/ml rIL-2-tartalmú táptalajjal. A klónozott T-sejt-vonalakat és az EBV-LCL sejtvonalat 1% humán AB+szérummal kiegészített Yssel-féle táptalajban tenyész-tettük. CD-32-vel (Fcy-RII) transzfektált egér-L-sejteket(16.2CG7) készítettünk Peltz [J. Immunoi. 141, 1891(1988)] módszere szerint (a hivatkozott közleményt re-ferenciának tekintjük). Röviden kifejtve: az U937 mu-táns humán monocita sejtvonalból izolált, 16.2 jelűFcy-RII cDNS-klónt használtuk [lásd: Stuart et. al., J.Exp. Med., 166, 1668 (1987)]. Standard helyspecifikus 11 1

HU 220 103 B 2 mutagenizálótechnikákkal citoplazmatikus dómén nél-küli mutánst szerkesztettünk úgy, hogy olyan mutáció-kat vittünk be, amelyek az említett citoplazmatikus dó-mén első aminosava (arginin) után a két lizinkodontstopkodonná változtatták. Az egér-L-sejtek tranzienstranszfekcióját standard technikákkal végeztük.

Reagensek A rekombináns IL-10-et E. coliban fejeztük ki, és ade Waal Malefyt és munkatársai [J. Exp. Med., 174,915 (1991)] közleményében, valamint a WO 91/00349közzétételi számú nemzetközi szabadalmi leírásban(lásd előbb) közölt módszerek szerint tisztítottuk.

Proliferációs vizsgálatok A klónozott T-sejteket feeder sejtekkel való stimu-lása után 10-12 nap múlva használtuk. Ebben az állapot-ban a T-sejt-klónok kicsik voltak és „nyugalmi” („res-ting”) állapotban. A T-sejt-klónokat (2 x 104 sejt/tartály)CD32-vel transzfektált L-sejtekkel (2 x1ο4 sejt/tartály)inkubáltuk anti-CD3 mAt-ek (SPV-T3b) (1 pg/ml)[Spits et. al., Hybridoma, 2, 423 (1983)] jelenlétében,200 μΐ-ben, lapos fenekű tartályokkal ellátott lemezeken(Falcon Becton-Dickinson, Lincoln Park, NJ., USA).Az L-sejteket, mielőtt a T-sejtekhez adtuk, az mAt-tel(1 μΐ/ml) 1 órán át előinkubáltuk IL-10 (100 E/ml)jelenlétében vagy e nélkül, és 72 órán át tenyésztettük.Az L-sejteket mitomicin C-vel (50 mg/ml) (SigmaChemical Co., St. Louis, MO., USA) kezeltük 37 °C-on45 percig, és ezután négyszer mostuk használat előtt.A sejteket 72 órán át 37 °C-on 5% szén-dioxid mellettinkubáltuk, [3H]TdR-rel pulzáltuk 4 órán át, és a leara-tást Yssel és munkatársai [Eur. J. Immunoi., 16, 1187(1986)] szerint végeztük. Az eredmények, amelyeket a[3H]TdR-beépülés alapján cpm-ben fejeztünk ki, hárompárhuzamos tenyészet középértékének felelnek meg.

Az IL-10 hatása a T-sejt-klónok proliferációjáranem függött a T-sejtek limfokintermelési profiljától.A 837, SP-B21 és 827 T-sejt-klónok aktiválása hatásá-ra IL-2-t, IL-4-et és IFN-y-t termeltek, így ezeket hu-mán T0 kiónoknak tekintettük. A HY-06, CR253,CR378, CR380, AP74 és AP75 magas szinten termeltIFN-y-t, de nem kimutatható vagy csak kis mennyiségűIL-4-et és IL-5-öt termeltek. Ezek a kiónok képvise-lik a humán Thl-szerű kiónokat, míg az NP12 és NP44a Th2-szerű kiónoknak felelnek meg, mivel ezek nagymennyiségben termeltek IL-4-et és IL-5-öt, de ki-mutathatatlan vagy kevés IFN-y-t termeltek specifikusantigénjeikkel való aktiválást követően. Az SP-A3T-sejt-klón aktiválás után IL-2-t, IL-5-öt, IFN-y-t ésGM-CSF-et termelt, de IL-4-et nem.

Az 1. táblázatból látható, hogy az IL-10 a követke-ző T-sejt-klónok aktiválás utáni proliferációját gátolja:837, SP-B21, SP-A3, 827, HY-06, CR253, CR378,CR380, AP74, AP75, NP12 és NP44. Tehát azIL-10 minden T helper alcsoporthoz tartozó T-sejt-klón proliferációját képes volt gátolni. Az IL-10 általá-ban 20-50%-ban gátolta a T-sejt-klónok proliferáció-ját ezen kísérleti körülmények között. Ez a gátlás dózis-függő és specifikus volt, minthogy meg lehetett sem-misíteni 19F1 anti-IL-10 mAt-tel való neutralizációrévén.

Az egér-IL-10-nek, amely faj specifikus, nem volthatása ezen T-sejt-klónok proliferációjára, ami arra mu-tat, hogy az IL-10 közvetlenül hat a T-sejt-klónokra, ésnem az anti-CD3 mAt-ek térhálósítására használt,CD32-vel transzfektált egér-L-sejtek útján. Ezek az ered-mények mutatják, hogy az IL-10 közvetlenül gátolja ahumán ThO-, Thl- és Th2-klónokat a CD32-vel transz-fektált L-sejteken térhálósított anti-CD3 mAt-ekkel tör-ténő aktiválás után, a TCR/CD3 komplex útján. 1. táblázat IL-10 hatása a humán ThO-, Thl- és Th2-klónokproliferatív válaszára CD32-vel (Fc-RII) transzfektáltL-sejteken térhálósított anti-CD3 mAt-ekkel valóaktiválást követően T-sejt-klón- típus [3H]TdR-beépülcs (cpm xl0~3) T-sejt-klón Kontroll +IL-10(100 E/ml) T helper 837 69 51 SP-B21 88 51 827 5,5 3,5 SP-A3 28 12 T helper 1 HY-06 11 8 CR253 12,8 10 CR378 14,9 4,3 CR380 19,8 8,5 AP74 22 9 AP75 38 33 T helper 2 NP12 72 49 NP44 15,3 7 2. példa

Az IL-10 gátolja a CD4+ T-sejt-klónok proliferá-cióját, függetlenül az ICAM-1, LFS-3 vagy B7 általszolgáltatott kostimulációs szignáloktól. A humán T-sejt-klónok aktiválása a T-sejtek kiegé-szítőmolekuláinak az antigén bemutatósejteken (APC)lévő, velük ellentétes szerkezetekkel való kölcsönhatá-sa révén modulálható. Kimutatták, hogy az LFA-1 ésICAM-1, a CD2 és LFA-3, a CD28 és B7, vagya CTLA-4 és B7 közötti kölcsönhatások kostimulációsszignált bocsátanak ki, és ezzel fokozzák a T-sejtekproliferációját és effektorfunkcióit. Annak érdekében,hogy meghatározzuk, vajon az IL-10 gátolja-e a T-sejtek proliferációját azáltal, hogy zavarja ezen kiegé-szítőmolekulák konstimuláció funkcióját, olyan L-sej-teket állítottunk elő, amelyek CD32-t és ICAM-l-et,LFA-3-at vagy B7-et fejeznek ki. pCD-SRo.-LFA-3 HYG, pCDM8-ICAM-l HYG éspBJ-B7 HYG szerkesztése LFA-3-cDNS-t izoláltunk egy Raji cDNS-tárbólPCR-sokszorozással, LFA-3 specifikus primerekethasználva. A Raji cDNS-gyűjteményt a pCD-SRa vek-torba hoztuk létre, Matsui és munkatársai [Science,154, 1788 (1991)] közlése szerint. Az alábbi primere-ket használtuk az LFA-3 transzmembrán formájánakklónozására: 12 1

HU 220 103 B 2 szensz: 5 ’-GGCTGCAGCGACGAGCCATGGTTGCTGGGAGCGACGCG-3 ’ antiszensz: 5 ’-TTCATCTTCTGGTACCAATCAATTGGAGTTGGTTC-3 ’ (1-30 nukleotid) és(780-745 nukleotid).

Az LFA-3 szensz prímért Pstl-hellyel és az LFA-3antiszensz prímért KpnI-hellyel terveztük a sokszoro- 5zott termékek könnyű szubklónozásának megkönnyí-tésére. A sokszorozási az alábbi feltételek mellett végeztük:a Raji tárból 1 pg HindlII-mal emésztett DNS-plazmidotsokszoroztunk 50 pl reakcióelegyben, mely a primerek- 10bői 25-25 nmolt és a dGTP, dATP, dCTP és dTTP-ből(Pharmacia, Uppsala, Svédország) 125-125 mM-t, 50 mM kálium-kloridot, 10 mM trisz-HCl-t (pH=8,3), 1,5 mM magnézium-kloridot, 1 mg/ml zselatint és 5 egy-ség Taq-polimerázt (IBI, New Haven, CT., USA) tártál- 15mázott.

Az elegyeket Perkin-Elmer/Cetus DNS Thermalcycler készülékben, 20 cikluson (denaturálás 30 másod-perc, 90 °C; illesztés 30 másodperc 55 °C; polimerizá-lás 60 másodperc 72 °C) át inkubáltuk. A termékből 205 pl aliquot részt kivettünk, és egy második amplifi-kációs menetet végeztünk azonos feltételek mellett. A reakcióterméket kloroformmal extraháltuk, és 1%-osagarózgélre vittük fel. A várt 785 bp méretű sokszoro-zott terméket elválasztás után kivágtuk a gélből, szili- 25cium-dioxidra adszorbeáltuk Geneclean kit (Bio 101,

La Jolla, CA., USA) használatával, Pstl-gyel és Kpnl-gyel hasítottuk, és Bluescript II KS (+)-ban (Strata-gene, La Jolla, CA., USA) szubklónoztuk.

Standard technikákkal több, LFA-3-tartalmú kiónt 30izoláltunk. Ezek közül 4 kiónt szekvenáltunk didezoxi-terminációs módszerrel, Sequenase DNA sequencingkit (USB, Cleveland OH., USA) segítségével. Mind a4 klón 100%-ban azonos volt a leközölt szekvenciával.

Egy ilyen klón Pstl-KpnI fragmentumát izoláltuk, és 35pCD-SRa 296 expressziós vektorba szubklónoztuk(Matsui et. al., lásd előbb). A pCDMS-ICAM-1 [Blanchard et. al., J. Immu-noi., 138, 2417 (1987)] dr. Brian Seed (MassachusettsGeneral Hospital, Boston, MA., USA) adománya volt. 40A higromicin-B-rezisztenciát kódoló aminociklit fosz-fotranszferáz gén SV40 promoter és poliadenilációsszignálok szabályozása alá helyeztük, és standard tech-nikákkal beépítettük a pCD-SRa-LFA-3 és pCDM8-ICAM-1 S fii-helyeire, és így kaptuk a pCD-SRa- 45LFA-3 HYG, illetve pCDM8-ICAM-l HYG kióno-kat. A PBJ-B7 HYG kiónt, amely humán B7-et tartal-maz az SRa promoter szabályozása alatt [Makgoba et.al., Natúré, 331, 86 (1988)] dr. L. Lanier (DNAX Re-search Institute) bocsátotta rendelkezésünkre. 50 A HLA-DR3 vagy CD32 kifejező L-sejteket pC-SRa-LFA-3 HYG, pCDM8-ICAM-l HYG vagypBJ B7 HYG kiónokkal transzfektáltuk lipofekció(BRL, Gaithersburg, MD., USA) révén a gyártó által ja-vasolt eljárásnak megfelelően. A sejteket a transzfekció 55után 48 órával elválasztottuk, hozzáadtunk 200 pg/mlhigromicin B-t (Lilly, Indianapolis, IN., USA) tartalma-zó táptalajt, amelyet háromnaponként cseréltünk.

Tizenkét nap múlva egyedi higromicin-B-rezisztenstelepek voltak láthatók. Ezeket a sejteket egybegyűjtöt- 60 tűk, indirekt immunfluoreszcenciával LFA-3, ICAM-1vagy B7 kifejeződésre megfestettük, majd két egymástkövető, pozitív szortírozást eredményező menetben -FACS-Star Plus készülékben - tisztítottuk. A kotransz-fektált sejtvonalakat 200 pg/ml higromicin-B-vel és10% FCS-sel kiegészített RPMI 1640 táptalajon tartot-tuk fenn. A FACS-analízishez (FACS=fluorescence activatedcell sorter) a sejteket V fenekű mikrotitrálólemezeken(FLOW Laboratories, McLean, VA., USA) tisztítottmAt-tel (10 pg/ml) inkubáltuk 30 percig 4 °C-on, A sej-teket ezután kétszer mostuk 0,02 mM nátrium-azid és1% BSA-(Sigma, St. Louis, MO., USA) tartalmú PBS-sel, majd kecske-antiegér antitest FITC-jelzett F(ab’)2fragmentumainak (TAGO, Inc., Burlingame, CA.,USA) 1/40 hígításával inkubáltuk 30 percig 4 °C-on. Há-rom további mosás után a jelzett sejtmintákat folyadék-mikrofluorimetriával (FMF) analizáltuk FACScan-ké-szüléken (Becton-Dickinson, Sunnyvale, CA., USA).A használt TS 2/9 jelű anti-LFA-3 mAt-et Krensky ésmunkatársai [J. Immunoi., 132, 2180 (1984)] írták le.A használt LB2 jelű anti-ICAM-1 mAt-et és L307 jelűanti-B7 mAt-et Azuma és munkatársai [J. Exp. Med.,775, 353 (1992)] írták le. A T-sejt-klónokat CD32-t és ICAM-l-et, LFA-3-atvagy B7-et együttesen kifejező L-sejteken térhálósítottanti-CD3 vagy anti-CD2 mAt-ekkel aktiváltuk IL-10jelenlétében vagy IL-10 nélkül. Azt találtuk, hogy azSP-B21 és NP12 T-sejt-klónok proliferációja foko-zódott, ha a kiónokat CD32-vel transzfektált L-sejtek- amelyek az ICAM-l-et és LFA-t együtt fejezték ki -által bemutatott anti-CD3 mAt-ekkel stimuláltuk. AzLFA-3-mal való koexpresszió hatékonyabban fokozta aT-sejt-klónok proliferációját az ICÁM-1-hez vagy B7-hez viszonyítva, és következetesen 1-4-szeresére növel-te a proliferációt. Csak mérsékelt fokozódás volt megfi-gyelhető a proliferációban ICÁM-1-gyei való koexp-resszió esetén. A B7 általában nem befolyásolta a T-sejt-klónok proliferációját.

Az IL-10 gátolta a T-sejt-klónok proliferatív vála-szát a CD32-vel transzfektált L-sejteken térhálósítottanti-CD3 mAt-ekkel való aktiválást követően, mégICAM-1, LFA-3 és B7 jelenlétében is. Az LFA-3 ki-fejező L-CD32-sejtek által aktivált T-sejt-klónok prolife-rációját azonban az IL-10 kevésbé kifejezetten gátolta. A T-sejt-klónok proliferációját meg lehet indítaniaz L-CD32-sejteken térhálósított anti-CD2 mAt-ek mi-togén kombinációjával is, az SP-B21 és NP12 T-sejt-klónok esetén. T-sejt-klónokat (2 x1ο4 sejt/tartály) sti-muláltunk XI1-1 (0,5 mg/ml) és D66 (0,5 mg/ml) jelűanti-CD2 mAt-ekkel 200 μΐ-ben gömbölyű fenekű le-mezeken (Linbro, FLOW Laboratories, McLean, VA.,USA), mint előbb leírtuk. Az antitestek termelését Brot-tier ismertette [J. Immunoi., 735, 1624 (1985)]. A T-sejt-proliferációt nem befolyásolta, ha ICAM-1vagy LFA-3 koexpresszió történt. Azonban mérsékel-ten fokozott proliferációt figyeltünk meg, ha CD32-t és 13 1

HU 220 103 B 2 B7-et együttesen kifejező L-sejteket használtunk. A T-sejt-klónok anti-CD2 által inkubált proliferációja30-50%-ban szintén gátolt volt IL-10 jelenlétében, haCD32 és ICAM-1, LFA-3 vagy B7 kifejező L-sejtekethasználtunk. Az IL-10 nem befolyásolja a T-sejt-kló-nok LFA-1, CD2 vagy CD28 kifejezését. Összességé-ben ezek az eredmények arra mutatnak, hogy az IL-10-nek a T-sejt-proliferációra gyakorolt direkt gátlóhatá-sát nem az ICAM-1, LFA-3 vagy B7 által kibocsá-tott kostimulációs szignálokban való változások eredmé-nyezték. 3. példa

Az IL-4 nem, de az IL-2 meg tudja semmisíteni azIL-10 gátlóhatását a T-sejt-proliferációra.

Annak érdekében, hogy meghatározzuk, vajon azIL-2 vagy az 1L-4 tudja-e megsemmisíteni az IL-10által indukált T-sejt-proliferáció-gátlást, T-sejt-klóno-kat aktiváltunk CD32-t és ICAM-l-et, LFA-3-at vagyB7-et kifejező L-sejteken térhálósított anti-CD3 vagyanti-CD2 mAt-ekkel IL-2 vagy IL-4 jelenlétében.IL-2-ből 20 E/ml-t, IL-4-ből 200 E/ml-t adagoltunk.A tisztított rIL-4-et (specifikus aktivitás 2 χ 107 E/ml)a Schering-Plough Research (Bloomfield, NJ., USA)bocsátotta rendelkezésünkre.

Azt találtuk, hogy az IL-2 alacsony koncentrációkmellett teljesen meg tudja semmisíteni az IL-10 gátló-hatásait az SP-B21 és NP12 T-sejt-klónok proliferá-ciójára. Az IL-4 azonban, amelyet 200 E/ml koncentrá-cióban adagoltunk, nem volt képes megsemmisíteni azIL-10 T-sejt-proliferációra gyakorolt gátlóhatásait.A T-sejt-klónok 72 óráig tartó, IL-10 jelenlétében vég-zett tenyésztése nem gyengítette az IL-2-receptor οι-vagy β-láncának expreszióját. Ezenfelül, ha a T-sejt-klónokat PHA-val aktiváltuk IL-10 jelenlétében, eznem befolyásolt az IL-2-receptor a- és β-láncánakexpresszióját. A vizsgálathoz a Herve és munkatársai[Blood, 75, 1017 (1990)] által leírt BB10 anti-IL-2RamAt-et és a Takashita [J. Exp. Med., 169, 1323 (1989)]által leírt Tu27 anti-IL-2Rβ mAt-et használtuk. Össze-gezve az elmondottakat, az eredmények azt mutatják,hogy az IL-10 T-sejt-proliferációra kifejtett gátlóhatá-sát az IL-2 meg tudja semmisíteni, de az IL-4 nem, ésezt valószínűleg az IL-2-termelés gátlása okozza. 4. példa

Az IL-10 gátolja a humán T-sejt-klónok IL-2-ter-melését, de nem gátolja az IL-4-, IL-5-, IFN-, ésGM-CSF-termelést.

Megvizsgáltuk, hogy vajon az IL-10 közvetlen gátló-hatása a T-sejt-klónok proliferációjára az IL-2-termelésgátlásának köszönhető-e. Ennek érdekében a 837,SP-B21, 827, HY-06, CR253 NP12 és NP44 T-sejt-klónokat CD32-vel és ICAM-l-gyel, LFA-3-mal vagyB7-tel transzfektált L-sejteken térhálósított anti-CD3mAt-ekkel aktiváltuk, IL-10 jelenlétében vagy IL-10 nélkül 24 órán át, majd mértük az IL-2-, IL-4-, IL-5-,IFN-γ- és GM-CSF-termelést citokinspecifikus ELISA-módszerrel. Ezen ELISA-módszerek érzékenysége a kö-vetkező volt: IL-2-re 10 pg/ml; IL-4-re 50 pg/ml;IL-5-re 50 pg/ml; IFN-y-ra 300 pg/ml; és GM-CSF-re50 pgúnl. A limfokintermelési assay-hez T-sejt-klónokat gyűj-töttünk, feeder sejtekkel való stimulálás után 10-12 nap-pal, mint előzőleg leírtuk. A sejteket 37 °C-on 5% szén-dioxidot tartalmazó nedves atmoszférában inkubáltuk24 órán át, a tenyészet-felülúszókat learattuk, egyenlő ré-szekre osztottuk, és -20 °C-on tároltuk a vizsgálatokig. A T-sejt-klónok aktiválása IL-2-, IL-4-, IL-5-,GM-CSF- és IFN-y-termelést eredményezett, az illetőTh-sejt-alcsoportnak megfelelő citokintermelési profil-nak megfelelően. Általában akkor mértük a legmaga-sabb citokintermelési szintet, amikor a T-sejt-klónokatCD32 és LFA-3 vagy B7 kifejező L-sejtekkel aktivál-tuk. Valójában IL-2-termelést túlnyomóan olyan T-sejt-klónok felülúszójában mutattuk ki, amelyeket azL-CD32-LFA-3 és L-CD32-B7 transzfektált sejteketfedő anti-CD3-mal aktiváltunk. Az IL-10 erősen gátol-ta a T-sejt-klónok IL-2-termelését. Az IL-4-termeléstnem befolyásolta az IL-10, míg az IL-5-, GM-CSF-és IFN-y-termelést csak gyengén gátolta az IL-10. Te-hát az IL-10 specifikusan gátolja az aktivált humán T-sejt-klónok IL-2-termelését. 5. példa

Az IL-10 gátolja a humán T-sejt-klónok IL-2-ter-melését poliklonális aktiválás után. A továbbiakban szándékunk volt meghatározni,hogy vajon az IL-10 képes-e közvetlen hatást kifejtenia humán T-sejt-klónokra a limfokintermelés gátlására.Ezért a 827, SP-B21 és NP44 T-sejt-klónokat tetra-dekanoil-forbol-acetáttal (TPA; Calbiochem), anti-CD3 mAt-ekkel és TPA-val, PHA és TPA-val, vagy azanti-CD2 mAt-ek egy mitogén kombinációjával aktivál-tuk a járulékos sejtek távollétében. A T-sejt-klónokatlxlO6 sejt/ml koncentráció mellett stimuláltuk PHA-val (100 ng/ml), SPV-T3b anti-CD3 mAt-tel (1 pg/ml)és TPA-val (1 ng/ml). A 2. táblázatból látható, hogy a 827, SP-B21 ésNP44 T-sejt-klónok poliklonális aktiválása magas szintűlimfokintermelést eredményezett, limfokintermelési pro-filjuknak megfelelően. Az IL-10 erősen gátolta ezenkiónok IL-2-termelését minden vizsgált aktiválási módmellett, ugyanakkor az IL-4-, IL-5-, IFN-γ- ésGM-CSF-termelés nem károsodott. Az IL-10 képesvolt meggátolni ezen T-sejt-klónok IL-2-termelését, mi-után ezeket anti-CD3+TPA-val vagy Ca++ ionofor++TPA-val aktiváltuk, ami arra utal, hogy a gátlás me-chanizmusában nem játszanak szerepet T-sejt-recep-tor/CD3 szignáltranszdukciós folyamatok, és hogy ez amechanizmus inkább proteinkináz-C-aktiválás irányá-ban működik. 14 1

HU 220 103 B 2 2. táblázat IL-10 hatása a 827, HY-06 és NP44 T-sejt-klónok limfokintermelésére anti-CD3 mAt+TPA-val vagyPHA+TPA-val vagy ConA-val végzett aktiválást követően T-scjt- klón Stimulus Limfokintermelés (ng/ml) IL-2 IL-4 IL-5 IFN-γ GM-CSF - + - + - + - + - + 827 táptalaj ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND CD3+TPA 10,6 4,9 6,1 6,4 2,4 2,9 26,9 21,0 15,4 15,2 PHA+TPA 17,8 5,7 5,1 4,0 0,8 0,6 32,8 29,3 14,3 15,5 ConA 3,4 1,4 2,3 2,4 ND ND 32,6 33,7 14,0 15,2 HY-06 táptalaj ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND CD3+TPA 1,3 0,2 ND ND ND ND 23,9 25,5 10,0 13,2 PHA+TPA 5,0 2,0 ND ND ND ND 17,6 19,9 16,4 13,1 ConA 5,1 0,2 ND ND ND ND 12,8 14,9 14,2 13,3 NP44 táptalaj ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND CD3+TPA 0,5 ND 18,6 19,6 6,3 5,9 1,5 1,1 9,1 8,8 PHA+TPA 1,3 0,3 35,4 33,5 8,4 7,9 1,4 1,6 13,1 14,6 ConA 0,3 ND 20,1 18,7 7,8 7,3 2,6 2,6 18,9 18,9 A T-sejt-klónokat (106 sejt/ml) anti-CD3 mAt-ekkel (0,5 ug/ml) és TPA-val (1 ng/ml), PHA-val (200 ng/ml) és TPA-val vagy Con A-val (10 μg/ml) ak-tiváltuk IL-10 (100 E/ml) jelenlétében vagy IL-10 nélkül 24 órán át, ésazIL-2, IL-4, IL 5, IFN-γ- és GM-CSF-termelést mértük citokinspecifikusELISA-kitekkel. ND=not dctected=nem volt kimutatható (mennyisége az illető ELISA-érzékenysége alatt van). 6. példa A humán T-sejt-klónok IL-2-termelését az IL-10mRNS-szinten gátolja.

Annak meghatározása érdekében, hogy az IL-10milyen szinten gátolja az IL-2-termelést, az IL-2,IL-4, IL-5 és IFN-γ mRNS-expresszióját Northern- 35biotokkal analizáltuk NP12, HY-06, 827, SP-A3, 837és SP-B21 T-sejt-klónokban anti-CD3 mAt-ekkel ésTPA-val végzett aktiválás után, IL-10 jelenlétében ésIL-10 nélkül. Az össz-RNS-t Chirgwin és munkatársai[Biochem., 18, 5294 (1979)] módszerével izoláltuk. 40A Northem-analízist a de Waal Malefyt [J. Immunoi., 142, 3634 (1989)] által leírt módon végeztük. A Northem-analízishez a következő szondákat al-kalmaztuk: a Yokota és munkatársai [Lymphokines, 13, (1987)] által közölt pCD-hIL-2 285 bp méretűPstl-Xbal (1-285 nukleotid) fragmentumát, a Yokotaés munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 83, (1986)] általközölt pCD-hIL-4 318 bp méretű Nhel-EcoRI frag-mentumát (106-424 nukleotid), a Yokota által közölt(lásd előbb) pCD-hIFN 1100 bp méretű Pstl-HincII 50fragmentumát (5-1106 nukleotid) és a de Waal Male-fyt és munkatársai [J. Immunoi., 145, 2297 (1990)] ál-tal leírt pAL 1200 bp méretű PstI fragmentumát.

Az IL-10 erősen gátolta az ezekben a kiónokban ki-fejeződő IL-2 mRNS-szinteket, de nem befolyásolta aThO- és Th2-szerű kiónok IL-4 és IL-5 expressziójátvagy a ThO- és Thl-szerű kiónok IFN-γ expresszióját.

Ezek az eredmények mutatják, hogy az IL-10 mRNS-szinten specifikusan gátolja a humán T-sejt-klónokIL-2-termelését. 30 7. példa

Az IL-10 gátolja a perifériás vérsejtek közül izoláltT-sejtek IL-2-termelését.

Megvizsgáltuk, hogy vajon az IL-10 képes-e gátolnia nyugvó T-sejtek proliferációját és IL-2-termelését. T-sejteket izoláltunk perifériás vérből, amelyet vagy csakCD32-vel transzfektált L-sejteken térhálósított anti-CD3vagy anti-CD2 mAt-ekkel aktiváltunk, vagy olyanCD32 L-sejteken térhálósítottakkal, amelyek a CD32-vel együtt ICAM-l-et vagy LFA-3-at vagy B7-et fejez-nek ki. Az összperifériás vér mononukleáris (PBMNC)sejtet egészséges donorok fehérvérsejt-trombocita rétegé-ből (buffy coat), Ficoll-Hypaque (Sigma Diagnostics.,St. Louis, MO., USA) sűrűséggradiensben való centrifu-gálással izoláltuk A. Boyum közleménye [Scand. J. Clin.45 Láb. ívest., 21, (97. kiegészítés), 77 (1968)] szerint. A PBMNC-ből úgy tisztítottuk a T-sejteket, hogy aműanyagra nem tapadó sejteket nejlongyapotoszloponengedtük át, majd negatív elválasztás következett mág-neses térben való kimerítés révén. Röviden összefoglal-va: ΙΟΟχΙΟ6 BPMNC-t tenyésztettünk 30 percig37 °C-on 100 mm-es szövettenyésztő csészében (Bec-ton-Dickinson, Lincoln Park, NJ., USA), 1% humánAB szérumot tartalmazó Yssel táptalajban. A nem adhe-rens sejteket elválasztottuk, és nejlongyapot- (Robbins55 Scientific, Sunnyvale, CA., USA) oszlopon engedtük át[Julius et. al., Eur. J. Immunoi., 3, 645 (1973)]. A sej-teket ezután anti-CD14 (Leu M3), -CD 16 (Leu 11a),-CD 19 (Leu 12) és -CD56 (Leu 19) mAt-ek telítésikoncentrációval inkubáltuk 30 percig 4 °C-on, mostuk,60 majd birka-antiegér-IgG-vel fedett mágneses szemcsé- 15 1

HU 220 103 B 2 ken (Dynabeads M450, Dynal A. S., Oslo, Norvégia)inkubáltuk, 40:1 szemcse/sejt arány mellett. A keveréket 30 percig 4 °C-on, óvatos rázás mellettinkubáltuk, majd a rozettaképző sejteket mágneses parti-kulakoncentrátorral távolítottuk el, a gyártó cég előírá-sai szerint. A T-sejt-populáció 97-99%-a CD2+,CD3+volt. Az anti-CD14 (Leu M3), -CD16 (Leu 11a), -CD19(Leu 12) és -CD56 (Leu 19) mAt-eket és a megfelelőizotípusú kontroll-mAt-eket a Becton-Dickinson cég-től (Montain View, CA., USA) szereztük be. A PBMNC sejteket (2xl05 sejt/tartály) L-Fcy-RIItranszfektált sejteken térhálósított anti-CD3- vagy anti-CD2-antitestekkel stimuláltuk, mint fent leírtuk. A te-nyészet-felülúszókat 24 órás 37 °C-on való inkubálásután arattuk le.

Azt találtuk, hogy a nyugvó T-sejtek aktiválás szem-pontjából teljes mértékben a CD32 L-sejteken jelen lé-vő B7 antigén jelenlététől függnek. Sem a CD32 L-sej-teken térhálósított anti-CD3 mAt-ek, sem a CD432 L-sejteken térhálósított anti-CD2 mAt-ek nem voltak ké-pesek a T-sejtek proliferációjának és limfokintermelésé-nek indukálására. Ezenfelül, miután ezeket a sejteketICAM-l-gyel vagy LFA-3-mal kotranszfektáltuk, ak-kor is hatástalanok maradtak. Azonban, ha B7-tel ko-transzfektáltuk a CD32 L-sejteket, és ezeken térhálósí-tottuk az anti-CD2 vagy anti-CD3 mAt-eket, akkorezek a sejtek erős T-sejt-proliferációt és magas szintűIL-2-, IFN-γ- és GM-CSF-termelést indukáltak. AzIL-10 nem gátolta jelentősen a nyugvó T-sejtek pro-liferációját ilyen körülmények között. Ezzel szembengátolta ezen sejtek IL-2-termelését, de nem gátoltaIFN-γ- és GM-CSF-termelésüket. IL-10 jelenlétében azonban a termelt IL-2-szintekmég mindig elegendőek voltak a maximális proliferá-ció indulásához a vizsgálat időpontjában (3. nap). Ezekaz eredmények mind azt mutatják, hogy a járulékos sej-teken lévő B7-tel való kölcsönhatás révén a T-sejtekenlévő cD28-nak vagy CTLA-4-nek a bevonása feltétle-nül szükséges volt a nyugvó T-sejtek proliferációjánakés limfokintermelésének az indukciójához, és hogy azIL-10 még mindig képes volt gátolni ilyen körülmé-nyek között az IL-2-termelést. 8. példa

Az IL-10 gátolja az antigénspecifíkus T-sejt-proli-ferációt, ha humán HLA-molekulákkal transzfektált L-sejteket használunk APC gyanánt.

Vizsgáltuk az IL-10 hatását a tetanusztoxoid (TT)specifikus 827 T-sejt-klón és az M. leprae 65 kD hsp pt[2-12] specifikus HY-06 T-sejt-klón antigénspe-cifikus proliferációjára, ha HLA-DR3-mal vagyHLA-DR3 és ICAM-l-gyel, LFA-3-mal vagy B7-telfentiek szerint transzfektált egér-L-sejteket használtunkantigén bemutatósejtek (APC) gyanánt. A transzfektáltL-sejtek HLA-DR, ICAM-1, LFA-3 és B7 kifejezé-sének FACS-profilja azt mutatta, hogy az IL-10-neknincs hatása a II. osztályú MHC konstitutív kifejeződé-sére ezeken a sejteken. A tetanusztoxint dr. Bizzini (Pasteur Intézet, Párizs,Franciaország) bocsátotta rendelkezésünkre, és 1 pg/ml végső koncentrációban használtuk fel. A hsp pt [2—12]-tszilárd fázisú peptidszintetizáló metodológia segítségé-vel állítottuk elő, és analitikai reverz fázisú HPLC- ésaminosavanalízis segítségével vizsgáltuk. A peptideket0,5 pg/ml végső koncentrációban használtuk. A 827 és HY-06 T-sejt-klónok stimulálást, prolife-rációs vizsgálatait és a citokinméréseket úgy végeztük,mint előbb leírtuk. Azt találtuk, hogy az IL-10 dózis-függő módon gátolta a HY-06 és 827 T-sejt-klónok an-tigénspecifikus proliferációját HLA-DR3-mal transz-fektált L-sejtekkel, mint antigénbemutató sejtekkel(APC). A 10 E/ml mennyiségben adagolt IL-10 gátló-hatású volt, 100 E/ml és 500 E/ml mellett 30-50%-osproliferációgátlást kaptunk.

Ilyen eredményeket kaptunk akkor is, amikor az L-sejteket HLA-DR-rel és ICAM-l-gyel vagy LFA-3-mal vagy B7-tel transzfektáltuk, és ezeket használtukAPC-ként. A 827 és HY-06 T-sejt-klónok proliferatívválaszai növekedtek, amikor LFA-3-mal kotranszfek-tált L-sejteket használtunk, és az IL-10 gátlóhatása semvolt kifejezett. Az IL-10-nek a 827 és HY-06 proli-feratív válaszaira kifejtett gátlóhatását teljesen megsem-misítette a 19F1 neutralizáló anti-IL-10 mAt, és ez aztjelenti, hogy a gátlás specifikus. Ezek az eredményekmutatják, hogy az IL-10 gátolja a 827 és HY-06 pro-liferatív válaszát, ha APC gyanánt HLA-DR-rel transz-fektált egér-L-sejteket használunk.

Megállapítottuk, hogy az antigénspecifikus prolife-rációt az IL-10 a T-sejt szintjén gátolja. Ennek megha-tározására a 827 és HY-06 T-sejt-klónokat TT-vel éspt [2-12]-vel aktiváltuk humán vagy egér IL-10 jelenlé-tében, hogy megtudjuk, vajon az IL-10 az antigénbe-mutató L-sejtekre hat-e, vagy közvetlenül a T-sejt-kló-nokra. Mint fent megtárgyaltuk, a humán IL-10 humánés egérsejtekre egyaránt hat, de az egér-IL-10 csak azegérsejtekre van hatással.

Azt találtuk, hogy az egér-IL-10 nem volt képes gá-tolni a 827 és HY-06 sejtek antigénspecifikus proli-ferációját, ha csak HLA-DR-rel transzfektált vagy haICAM-l-gyel vagy LFA-3-mal vagy B7-tel kotransz-fektált L-sejteket használtunk APC-k gyanánt. Ezek azeredmények azt jelentik, hogy az IL-10 közvetlenülhat a humán T-sejt-klónok proliferációjára. A 827 és HY-06 T-sejt-klónokat TT-vel vagy pt[2-12]-vel aktiváltuk, egyedül HLA-DR-t kifejezővagy HLA-DR-t ICAM-l-gyel, LFA-3-mal vagyB7-tel kombinációban kifejező L-sejtekkel, IL-10 ésIL-2 jelenlétében vagy ezek nélkül, hogy megvizsgál-juk, vajon az exogén IL-2 képes-e megsemmisíteni azIL-10 gátlóhatását. Az IL-2 alacsony koncentrációiis meg tudják semmisíteni az IL-10 gátlóhatását a827 és HY-06 T-sejt-klónok antigénspecifikus prolife-rációjára. A HY-06 T-sejt-klónt pt [2-12]-vel aktiváltukegyedül HLA-DR3-at kifejező vagy HLA-DR3-atICAM-l-gyel, LFA-3-mal vagy B7-tel kombináltankifejező L-sejtekkel IL-10 jelenlétében vagy IL-10nélkül, és meghatároztuk az IL-2- és IFN-y-termelést a24 órás tenyészetek felülúszóiban. Az IL-10 gátolta aHY-06 T-sejt-klón antigénspecifikus aktiválását köve- 16 1

HU 220 103 B 2 tő IL-2-termelést, de nem gátolta IFN-y-termelését.Összegezve az eredményeket, megállapítható, hogyaz IL-10 gátolja az antigénspecifikus T-sejt-prolife-rációt azáltal, hogy specifikusan gátolja az IL-2-ter-melést.

Gyulladásos bélbetegség

Egy IBD egérmodellt fejlesztettünk ki. Ez a modellhozzájárul az IBD etiológiájának vagy mechanizmusá-nak a megvilágításához. Ezenkívül kísérleti terepet biz-tosít különböző terápiás szerek számára is. A modell el-készítésekor az IL-10 gént vagy eltávolítottuk vagy ha-tástalanná vagy kifejezhetetlenné tettük a kísérleti állat-ban. Az állatot úgy hívjuk, hogy „knockout” (KO) állat,tekintve, hogy az IL-10 gént kiütöttük belőle. A KO-t aszakterületen ismert számos módszer közül bármelyik-kel kivitelezhetjük. Például, elő tudunk állítani egy olyan transzgenikusállatot, amelynek IL-10 génjét inaktiváltuk. Lásd: C.Goodnow, „Transgenic Animals”, Encyclopedia of Im-munology, 1502-1504. oldal, szerkesztő: Roitt, Acade-mic Press, San Diego (1992). Röviden kifejtve: tisztítottDNS-t mikroinjektálunk megtermékenyített petesejtekpronukleuszába. Ezután az oocitákat sebészi úton a neve-lőanyák petevezetékébe implantáljuk. Más módon úgyjárunk el, hogy standard genetikai tenyésztőtechnikáksegítségével homozigóta mutáns állattörzset izolálunk.

Ezenkívül vannak olyan módszerek, amelyek inakti-válják a specifikus géneket az egér csíravonalában. Eb-ben az esetben egy mutáns transzgént vezetnek be avad típusú gén helyére homológ rekombináció révén.Embrionális őssejt- (embryonal stem cell=ES) vonalakizolálhatok egérblasztocitákból és in vitro tenyészthe-tők, később visszaültethetők egy másik blasztocitábaúgy, hogy a leendő egérben mind a szomatikus, mind acsíravonalszöveteket részben birtokba vegyék. (Good-now, 1503. oldal, lásd előbb). DNS-t vezettünk be tenyésztett ES-sejtekbe és ablasztocitákat sebészi úton nevelőanyába implantál-tuk. Heterozigóta mutáns szaporulatot kaptunk, ame-lyeket egymással pároztattunk, hogy végül az ivadé-koknak két mutáns allélja legyen, azaz homozigóta mu-tánsokat állítottunk elő. Ezekben az ivadékokban a szó-ban forgó génnek nincsenek működőképes allélj ei, így lehetővé válik a „genetikai operáció”, a specifikus gé-nek eltávolítása. A kapott ivadékok analízise révénmegtudhatjuk, hogy KO-egerekben milyen szerepevolt a célba vett génnek az eredő fenotípusok kialakítá-sában.

Olyan kísérleti állat létrehozására, amelyből egyadott gént töröltek, további módszereket ismertetnekMcMahon és munkatársai, „The Midbrain-Hidbrain Phe-notype of Wnt-1-/Wnt-- Mice Results from StepwiseDepletion of engrailed-Expressing Cells by 9,5 DaysPastcoitum”, Cell 69, 581 (1992) és Travis, „Scoring aTechnical Knockout in Mice”, Science, 256, 1392(1992). További alkalmazható technológiák magukbafoglalják a mutagenizáló módozatokat és az antiszensztechnológiákat, (lásd előbb; C. Goodnow, 1992). 9. példa A gyulladásos bélbetegség egérmodellje

Olyan egereket neveltünk, amelyeket megfosztot-tunk IL-10 génjüktől. Egy kiválasztott géntől megfosz-tott egér létrehozására szolgáló általános technológiákés eljárások leírását a következő közlemények, illetvekiadványok tartalmazzák. Kuhn et. al., Science, 254,707 (1991); Capecchi, Science, 244, 1288 (1989); Ro-bertson (szerkesztő) Teratocarcinomas and EmbryonicStem Cells: A Practical Approach, I. R. L. Press, Ox-ford (1987); Zijestra, et. al., Natúré, 336, 348 (1989).Azokat az egereket, amelyekből hiányzik az IL-10gén, IL-10T egereknek vagy „knockout” (KO) egerek-nek nevezzük.

Első csoport: Négy egeret öltünk le csontvelővizsgá-latokhoz. Csontvelőik egy részletének vizsgálatávalmeghatároztuk, hogy képesek-e mieoloid és eritroid pro-genitor sejtek termelésére (lásd a 3. táblázatot), meg-határoztuk továbbá őssejttermelésüket (4. táblázat).A csontvelők fennmaradt részét hosszan tartó csontvelő-tenyésztésre használtuk, hogy megállapítsuk, vajon amikrokömyezet sejtjei fenntartják-e a normál hemopoe-tikus fejlődést. A tímusz és a lép normál számú T-sejtetés normál számú B-sejtet tartalmazott. A hosszan tartóprogenitorsejt- és őssejtvizsgálatokat táblázatos formá-ban ismertetjük. A kontroliegerekből származó sejteketés a knockout-egerek sejtjeit külön-külön egyesítettük. 3. táblázat

Telepképző sejtek száma/combcsont (femur) Összscjt/femur GM BFU-e CFU-e Meg Meg/Mix Kontroll 9,5 x 106 18,430 475 42,500 2,470 285 IL-10T 9,5 xlO6 21,902 940 59,740 2,271 658 GM=granulociták és makrofágok; BFU=vérképző egység (blood forming unit); CFU=telepkcpző egység (colony forming unit); -e=eritroid;Meg=megakariocita telepet; Meg/Mix=más vonalakkal keveredett megakariociták. A vizsgálatban használt telepstimuláló faktorok:IL-3 + IL-6+eritropoetin (Epa). 4. táblázat

Tizennégy napos CFU-S számok

Kontrollcsoport 1,678 /femur IL-lOlT-csoport 1,517/femur 55 Az őssejttermelést az egér egyik combcsontjának CFU-Sszáma jellemzi. A CFU-S a halálos besugárzást kapottegér lépében a transzplantáció után keletkezett hemo-poetikus gócokat méri [Lásd: Till et. al., Radiation Re-search, 14, 213 (1961)]. 17 1

HU 220 103 B 2

Az IL-10T egerek nem mutattak semmilyen nyil-vánvaló fogyatékosságot a mieloid-, eritroid-, és ős-sejttermelésben. A hosszú ideig párhuzamosan futtatotttenyésztés folyamán minden tenyészetben - beleértveaz IL- 10T egerekből származó tenyészeteket - egy kö-tőszöveti vázréteg (supportív stroma) képződött. A te-nyészeteket két lépcsőben készítettük: a sejteket elő-ször tenyésztettük, hogy komplex stromarétegeket ké-pezzenek, amelyek a folyamatos hemopoézishez szük-ségesek. Ezután a tenyészeteket újból beoltottuk azo-nos típusú donorokból származó további csontvelősej-tekkel, hogy biztosítsák az aktuális prekurzorokat, ame- lyek a stromasejtekhez társulnak. E második lépéshez akkor fogtunk, amikor már rendelkezésünkre állt az egerek második és harmadik csoportja. Második és harmadik csoport: Az ezekből az álla- 5 tokból származó csontvelősejtekre azért volt szükség,hogy kiegészítsék a hosszú lejáratú csontvelő-tenyészté-si kísérleteket. Ezenkívül az erre a célra használt csont-velőt más eljárásokban is alkalmaztuk (lásd az 5-9. táb-lázatokat). Az IL-10T állatok anémiásak voltak, de 10 úgy tűnt, hogy a csontvelői prekurzor sejtekből a szoká-sos szintet tartalmazták. Ezért anémiájukat kivizsgál-tuk, és szerveiket szövettanilag értékeltük. 5. táblázat

Perifériás vérsejtszámok

Egér FVS/mlxlO6 VVS/mlxlO9 Trombocita/ml x 108 Kontroll 1. számú 7,2 7,3 12,6 2. számú 11,2 5,6 10,7 3. számú 10,0 6,7 8,5 4. számú 8,2 5,6 9,8 5. számú 7,7 5,6 8,0 IL-10T 1. számú 4,0 2,4 20,6 2. számú 4,8 7,1 8,0 3. számú 7,5 3,9 27,3 4. számú 6,5 5,5 23,9 F VS=fchérvérsej t;V VS=vörösvérscjt. 6. táblázatPerifériás vérképek

Egér Limf% Neut% Mono% Eoz% Retik% Kontroll 1. számú 87 12 1 0 2,4 2. számú 72 26 2 0 1,2 3. számú 80 18 1 1 0,6 IL 10T 1. számú 36 64 0 1 3,8 2. számú 40 57 0 3 5,3 3. számú 23 77 0 0 17,1

Limf: =Hmfociták; Neut=neutrofilek; Mono=monociták; Eoz=eozinfilek; Retik=rctikulociták. Vörösvérsejt-morfológia : A kontrollállatok normál külsejű vörösvérsejteket tar-talmaztak. Az IL-10T egerek vörösvérsejtjei változatosmorfológiát mutattak. Az IL-10T No. 1 mikrocitákat tar-talmazott; a 2. számú és 3. számú a mikrocitákon kívülnéhány makrocitát, polikromatikus sejtet és esetenkéntmagvas vörösvérsejteket tartalmazott. A vérkeneteket újmetilénkékkel festettük meg, és leszámoltuk a riboszo-mális festődést mutató sejteket. Pozitív festődés a na-gyon fiatal vörösvérsejtekben (retikulociták) fordult elő,ami a vérképző szervekből történő érés előtti kibocsátás-ra utal. Ezt retikulocitaszámnak nevezzük.

Az IL-10T egerek szerveinek szövettani vizsgálata: A felboncolt szív, tüdő, vese és tímusz megtekint-ve normálnak tűnt. A máj szintén a szokásos küllemetmutatta, eltekintve néhány mononukleáris és neutrofilgranulocitahelytől. A lépek rendellenes duzzadtak vol-tak. Jelen voltak a follikulusok, de a vörös belső puhaállomány tele volt hemopoetikus sejtekkel, főkéntmagvas vörösvérsejtekkel és blasztos formákkal (éret-len sejtekkel). Érett vörösvérsejtet nem, vagy csak ke-veset találtunk, és a makrofágokkal nem volt vasrak-tározás. 18 1

HU 220 103 B 2 7. táblázatLépvérképek

Egér Sejt/lép Limf Mono Neu Eoz Plazmasejt Blaszt Magvas wsejt az összsejt %-ában Kontroll 1. számú 1,5x10» 88 2 1 <1 <1 1 6 2. számú 1,5 xlO» 89 1 <1 <1 <1 2 7 3. számú 1,1x10» 79 3 4 1 2 2 8 1L-10T 1. számú 2,1x10» 64 2 7 1 1 2 22 2. számú 2,5x10» 54 2 13 3 1 6 21 3. számú 1,6x10» 43 2 10 1 1 10 32

Limf=limfociták; Mono=monociták; Neu=neutrofilek; Eoz=eozinofilek, Blaszt=blasztociták. 8. táblázatCsontvelői vérképek

Egér Neu Neu MB Eoz Eoz MB Magvas wsejt Plazma- sejt Limf Blaszt undif. (az összsejt %-ában) Kontroll 1. sz. 46 12 10 4 20 <1 4 4 2. sz. 39 9 5 3 37 <1 5 2 3. sz. 35 10 12 4 29 <1 6 2 IL-10T 1. sz. 46 12 7 2 28 <1 2 2 2. sz. 56 19 4 1 18 <1 1 1 3. sz. 53 14 2 1 27 1 1 1

Neu MB=neutrofil mieloblaszt; Eoz MB=eozinfil mieloblaszt; Lim=limfociták; Blaszt undif.=primitív, nem differenciálódott blasztociták. A következő adatokat a telepképző vizsgálatok ered- 40ményeként kaptuk. A vizsgálatokat lépsejtekkel, vala-mint csontvelői sejtekkel végeztük. IL-3+c-kit ligan-dumot használtunk IL-3+IL-6 helyett a telepképző sej-tek stimulálására. Az IL-3+c-kit ligandum kombináció hatékonyabban stimulálja az eritroid prekurzor sejteket,amit az első vizsgálatban (lásd előbb) kapott BFU-e szá-mok és a következő vizsgálatban kapott BFU-e számokösszehasonlítása bizonyít. 9. táblázat

Telepképző vizsgálatok

Egér GM GÉM GEMM BFU-e CFU-c MEG MEG/MIX Lép (telep/lép) Cl 18,535 618 309 9,268 42,322 618 1,236 C2 7,736 893 595 2,678 44,926 1,488 893 C3 8,670 650 650 7,152 71,741 433 433 KI 55,020 8,400 3,360 51,660 393,120 2,100 6,300 K2 111,060 25,746 10,601 96,925 498,762 14,135 12,116 K3 68,274 20,096 9,890 103,050 1012,633 14,357 9,252 19 1

HU 220 103 B 2 9. táblázat (folytatás)

Egér GM GÉM GEMM BFU-c CFU-c MEG MEGZM1X Csontvelő (telep/femur) Cl 37,300 3,632 838 7,963 35,065 978 419 C2 49,159 2,552 510 5,954 81,478 680 1,021 C3 30,343 1,916 639 6,069 24,754 958 958 KI 63,440 1,823 1,641 8,750 58,336 1,276 1,276 K2 37,340 6,570 438 8,870 47,085 986 1,424 K3 35,432 4,006 1,753 14,273 52,208 1,628 4,132 AC1.C2 és C3jelek ugyanazon kontroliegerekre vonatkoznak, amelyeket Kontroll No. l,No. 2, cs No. 3-nak neveztünk. AKI, K2 és K3 ugyanazonegerekre vonatkozik, amelyeket IL-10T No. 1, No. 2 és No. 3-nak neveztünk; GM=granulocita, makrofág; GEM=granulocita, eritroid, makrofág; GEMM=granulocita, eritroid, makrofág, megakariocita. 10. táblázat

Vizsgálatok okkult vérzésre

Egér 1. nap 2. nap Kontroll 1. számú neg. neg. 2. számú neg. neg. 3. számú nincs minta neg. IL-10T 1. számú neg. neg. 2. számú póz. póz. 3. számú póz. póz.

Székletvizsgálat

Az IL-10T egerek székletvizsgálata nem mutatottki petéket, amiből parazitafertőzésre lehetett volna kő- 35vetkeztetni. Érett paraziták jelenlétére utaló jelet sem afelső, sem az alsó béltraktusban nem találtunk.

Az állatokat a gyenge és erős anémia közötti állapotjellemezte. Az anémiát nem lehetett azzal magyarázni,hogy az állatok nem voltak képesek vörösvérsejteket ké- 40pezni. Az IL- 10T egereknél olyan jelek mutatkoztak,hogy megpróbálták kompenzálni az anémiát. Először aszokásosnál nagyobb számban termeltek vörösvérsejt-prekurzorokat lépeikben. Egerekben a lép normál körül-mények között is megpróbálná kompenzálni a vörösvér- 45sejthiányt. Az egérlépek kétszer nagyobbak voltak,mint a normál állatoké, és túlzott aktivitással próbáltakvörösvérsejteket termelni. Néhány állat jól kompenzált. Ezek vérében a szoká-soshoz közel volt a vörösvérsejtek száma, és nem bocsá- 50tottak a keringésbe sok éretlen vörösvérsejtet, mivelviszonylag normál retikulocitaszámmal rendelkeztek. A többi egér azonban visszamaradt volt, és éretlenül bo-csátották a keringésbe a sejteket, és ezért volt olyan ma-gas a retikulocitaszámuk (17%). Kevés keringő magvasvörösvérsejtet tartalmaztak.

Ezekben az egerekben a trombocitaszám is maga-sabb volt a szokásosnál, és lépeikben a megakariocitákszáma is emelkedett. Ez jelezte, hogy az egerek vérez-hetnek. A vérveszteség hozzájárulhatott a krónikus ané- 60 20 miához, amihez a vasraktárak kimerülése társult (a vas-hiány mind a lép, mind a csontvelő kompartmentumai-ban kétségtelen volt). Boncolásnál kiderült, hogy nemvolt belső vérzésük. A legtöbb IL-10T egérnél az ürü-lékben mutattunk ki vért, és végbélelőesést. Az egere- 25 két gondosan kivizsgáltuk, és megállapítottuk, hogy ne-gatívok végbélgilisztára, galandféregre vagy más para-zitafertőzésre. Közvetlenül összefüggést állapítottunkmeg az ürülékek vérpozitivitása és az állatok anémiájaközött.

Az anémia és a vérzés problémáján kívül az IL-10Tegerek vérében több a neutrofil granulocita, mint a lim-focita. Ez a fordítottja annak, ami egereknél szokásos.Lásd a perifériás vérképet (6. táblázat). Ez a megfigye-lés is egybevág a mieloid prekurzor sejtek számának rop-pant nagy megnövekedésével, amelyet a lép telepképzővizsgálataival mutattunk ki (9. táblázat). Tehát az egér„krónikus gyulladásos anémiában” szenvedett.

Boncolásnál szövetmetszeteket készítettünk IL-10Tegerekből és ugyanazon alomból származó kontrollege-rekből. A kontrolokból készített minták a szokásostólnem tértek el. Ami az IL-10T egereket illeti, normáltímusz- és gerincszöveteket tartalmaztak. A lépnél azeritroblasztok és a mieloblasztok plusz megakariocitákenyhe növekedése volt látható, egészen a jelentős növe-kedésig. Vörösvérsejt kevés volt, vagy lényegében nemfordult elő. A Prussian blue festés kimutatta, hogy a vas-raktárak kimerültek, és nyilvánvalóan növekedett az ext-ramedulláris hemopoézis (gerincvelőn kívüli vérképzés). A vasraktárak kimerülése a vérveszteségnek tulajdo-nítható, és ez rendellenes eritropoézist eredményezett.Makroszkópos vizsgálat szerint a lépek a normál méret-nél másfélszer-háromszor nagyobbak voltak. A mezen-terális nyirokcsomók a normál méretű nyirokcsomók-hoz képest igen nagyok voltak, majdnem akkorák, mint 55 egy normál lép. A B- és T-sejt follikulusok hasonlóanmegnagyobbodtak, és ez a kép egy gyulladásos válaszképének felel meg. A vékonybél-nyálkahártya és a nyálkahártya alattiszövet jól fejlettnek tűnt. Néhány metszetben a polimor-fonukleáris fehérvérsejtek (PMN) és a mononukleáris 20 1

HU 220 103 B 2 sejtek száma enyhe emelkedést mutatott. A vastagbélés végbél vizsgálatánál a végbélnél feltűnő gyulladástészleltünk, amely a közeli területekre is kiterjedt, bele-értve a vastagbél alsó szakaszát. Nagyszámú ödémát éssejtbeszűrodést észleltünk. Túlsúlyban volt a polimor-fonukleáris sejttípus, de eozinofilek, limfociták, plaz-masejtek és epiteloid sejtek (az epitheliumhoz hasonlósejtek) is jelen voltak. A gyulladás kiterjedt a nyálkahár-tyára, cryptára és a nyálkahártya alatti szövetre. Alkal-manként beszűrődéseket találtunk az izomrétegben, fő-ként a belső sphincter szakaszban. Több területen el-tűnt, vagy nem volt epithelium. A többgócú laesióknálaggregálódott vörösvérsejteket és PMN-sejteket tartal-mazó fibrózus anyagot figyeltünk meg. Néhány vérpá-lyát eltömtek a vörösvérsejtek. Az epiteloid sejtekbőlálló csomók korai granulóma képződésére utaltak, dejól fejlett granulómák nem látszottak. Nem volt bizonyí-ték olyan paraziták, peték vagy intracelluláris bakté-riumok jelenlétére, amelyek krónikus gyulladást okoz-hatnak. A sokszoros laesiókkal és a vérzéssel megegye-ző volt a széklet okkult vérzésre való vizsgálatának po-zitív eredménye. A teljes kép a másodlagos anémiávalés lesoványodással járó IBD-nek felelt meg. 10. példa

Az IL-10 KO-egerek válaszolnak exogén IL-10-zel való kezelésre. IL-10 géntől megfosztott négy egeret (IL-10 KO)és három kontroliegeret vizsgáltunk. A kontroliegerek-nél normál fizikai állapotot észleltünk. Mind a háromegérnél a székletminták okkult vérzésre végzett vizsgá-lata negatív volt. A végbelük is normál küllemű volt.Az IL-10 KO-egerek közül néhány szembetűnően ki-sebb volt, mint a kontrollállatok, és gyenge egészségi ál-lapotra utaló jeleket mutattak. Borzas volt a szőrük, ésnem voltak élénkek, összehasonlítva a normál kontrol-lokkal. A négy IL-10 KO-egér közül egy púpos volt,járásnál a testtartása szokatlan volt. Mind a négy egérvégbele duzzadt volt, eritémás végbélszövet vagy hatá-rozott végbélelőesés mellett. A kísérleti KO-egerek közül kettőnél határozottan po-zitív volt a székletminták két külön alkalommal okkultvétzésre végzett vizsgálata, míg a harmadik egér egy al-kalommal negatív volt, egy második alkalommal pedigkérdéses. Mind a négy KO-egér végbeléből keneteket ké-szítettünk, ezek közül háromnál gennyes exszudátumo-kat észleltünk nagyszámú neutrofil granulocitával. Az ál-latokból - amelyek a mintavételkor a végbélen keresztülvéreztek - készített egyes kendekben vörösvérsejteketis találtunk. Minthogy az IL-10 KO-egerek egyre sová-nyodtak, az IL-10 KO-egerek és a normál kontrollege-rek súlyát a vizsgálat részeként regisztráltuk. Három IL-10 KO-egémek két héten át naponta35 pg IL-10-et injektáltunk. Ennél a három egérnélrendszeresen gennyes exszudátumokat észleltünk (a há-rom közül csak kettőnél mutatkoztak vérzés jelei, és ahárom közül egy járt gömyedten és rendellenes módon).Egy IL-10 KO-egeret (vérzésre és gennyes exszudá-tumra negatív) és a normál kontrollokat két héten át na-ponta trisz-(Tromethamine) pufferrel oltottunk. Monito- roztuk az általános egészségi állapotot, a fizikai megjele- nést, a végbélexszudátumot, okkult vérzést és a súlyt.

Az IL-10 infúzióval való kezelés második hete utánmind a három IL-10 KO-egér élénkebb lett, kisimult aszőrük, testtartásuk, és járásuk normálra változott. Minda háromnál csökkent a végbélduzzanat, bár a gyulladásjelei még jelen voltak. A három egérnél negatív volt azokkult vérlelet és végbélkeneteikben vörösvérsejtre utalójel nem volt. Az exszudátum mennyisége csökkent; vég-bélkeneteikben azonban még találtunk neutrofil granu-locitákat. Az egyik állatnak a kenetében ekkor több epi-teliális sejtet és limfocitát figyelünk meg, mint neutrofilgranulocitát. Az egyik állat megtartotta a körülbelül16 g-os súlyát, a másik kettőnek 16 g-ról 17,8 g-ra, illet-ve 11,4 g-ról 14 g-ra nőtt a súlya.

Annál az IL-10 KO-egémél, amelyik két héten áttriszpuffert kapott, a székletminta még mindig negatívvolt okkult vérre. Bőséges exszudátumot mutatott, amelynagy számban tartalmazott neutrofil granulocitákat.A végbél még duzzadt volt és előesésre hajlamos. Az ál-lat púpos volt, és rendellenesen járt. Kétségtelen jeleitmutatta a fogyásnak is, súlya 16,6 g-ról 14 g-ra csök-kent. A normál kontrollok, amelyek ugyancsak triszinjek-ciókat kaptak, megtartották normál, egészséges küllemü-ket, beleértve végbelüket. Székletmintáik okkult vérre ne-gatívok maradtak, és nem észleltünk végbélexszudá-tumokat. Súlyuk 17,1 g-ról 19 g-ra, illetve 17,4 g-ról18,7 g-ra nőtt. Az állatok még több héttel később is folya-matosan híztak. 11. példa

Gyulladásos bélbetegséggel járó tünetek és pana-szok enyhítése IBD-ben szenvedő beteg embert a találmány szerintiIL-10-zel a következőképpen kezelhetünk. Ilyen beteg-nél általában a panaszok közé tartozik a hasmenés, hasifájdalom, lázmelena, hematochezia és súlyveszteség, to-vábbá az olyan tünetek, mint a hasi térimé, glossitits(nyelvgyulladás), aftás fekély, végbélrepedés, végbél kö-rüli sipoly, anémia, felszívódási zavar (maiabszorpció)és vashiány. A beteget kezdetben naponta 5 pg IL-10-zel kezeljük testtömeg-kg-onként. Ha a beteg súlya70 kg, a kezdődózis 350 pg IL-10/nap. Ezt a dózistnapi 50-150 pg-mal növelhetjük a beteg tűrőképességé-től és -válaszától függően. Az optimális 700 pg/nap(10 pg/kg/nap) dózist több nap múlva érjük el.

Az első kezelés előtt és ezután naponta az utolsó ke-zelés után még több napig, a beteget klinikai szempont-ból és laboratóriumi paraméterekkel monitorozzuk. Azalábbi laboratóriumi paramétereket használjuk: vérsejt-számolás, különös figyelemmel a teljes fehérvérsejt-számra és a vérképre. Különös jelentősége van annak,hogy vajon a fehérvérsejtszám normál marad-e, vagyhogy a beteg kezelése előtti szinthez képest van-e jelen-tős változás. A vérképet illetően különös figyelmet for-dítunk arra, hogy vajon jelennek-e meg éretlen formáka perifériás vérben, és hogy vajon a fehérvérsejtek kü-lönböző típusainak normál aránya változatlan marad-e,vagy változott. Speciális figyelmet fordítunk a perifé-riás vérben lévő limfociták és monociták arányára. 21 1

HU 220 103 B 2 A további monitorozható paraméterek a következők:vörösvérsejt-ülepedési sebesség (erythrociyte sedimenta-tion rate=ESR) (a magyar klinikai laboratóriumokbanhasznált jelölés: We), kémiai vizsgálatok, IL-6-, TNF-és IFN-y-vérszintek. Végül a beteg székletének rendsze-res, naponta végzett vizsgálata vérre és gennyes exszu-dátumra jelezheti a beteg kezelésre adott válaszát. A ke-zelés a bélgyulladás egy vagy több panaszának vagy tü-netének a javulását eredményezi. Késői típusú túlérzékenységi reakciók gátlása 12. példa

Csökkentett hatások egérben

Balb/c egereket - anti-DC4 monoklonális antitest-(mAt) előkezelés után 4 héttel - Leishmania major pro-tozoonnal fertőztünk. A Balb/c egy beltenyésztett, keres-kedelemből beszerezhető egértörzs, amelyet a SimonsenLaboratories-től (Gilroy, CA., USA) vásároltunk. A hasz-nált egerek 8-12 hetesek voltak. Az L. majort (a WHOtörzsjele: WHOM/-/173), promasztigot formájában te-nyésztettük Ml99 táptalajban (Gibco, Grand Island,NY., USA), amely 30% fetális boíjúszérumot (FCS; be-szerezhető a J. R. Scientific cégtől; Woodland, CA.,USA), 2 mM L-glutamint és 100-100 E/ml penicillint éssztreptomicint tartalmaz. A promasztigot alakokat stacio-nárius fázisban lévő tenyészetből arattuk le, és foszfáttalpufferolt konyhasóoldatban (PBS) mostuk. Az egerek-nek 1,5 xlO7 élő promasztigotot injiciáltunk szubkutána bal hátsó talpba. L. major antigént úgy készítettünk,hogy a parazitákat négy ciklusban lefagyasztottuk, és fel-olvasztottuk, majd lecentrifugáltuk. Az antigénkészít-ményt 2χ 106 organizmus/ml-nek megfelelő mennyiség-ben mértük be a tenyésztőtartályokba.

In vitro vizsgálatokhoz a következő monoklonális an-titesteket használtuk: neutralizáló antiegér-lL-4 mAt(ATCC HB188), neutralizáló antiegér-IL-10 mAt {előál-lítva a Chatelain és munkatársai [J. Immunoi., 148, 1182(1992)] által IL-4-re leírt eljárás szerint} és anti-egér-CD4 (ATCC TIB27). Az antitestkészítményeketszövettenyészetek felülúszóiból tisztítottuk ioncserés kro-matográfiával és gélszűréssel. A készítmények endotoxin-tartalma 3 endotoxinegységnél kevesebb volt (EE/mgprotein, Limulus agglutinációs vizsgálattal mérve).

Sejttisztítás céljára a következő mAt-eket használ-tuk: biotinezett RM-4-5 és RM-4-4, antiegér-CD4és AMS-32.1, antiegér-Mac-1 (ATCC TIB128),RA3-6B2, és antiegér-B220 [Coffman, ImmunologicalReviews, 69, 5 (1982)]. A rekombináns IL-4-et ésIL- 10-et E. coliban fejeztük ki, és affinitással tisztítot-tuk, mint előbb leírtuk.

Az L. major infekció helyére ürülő popliteális nyi-rokcsomókat (popliteal lymph node=LN) a fertőzésután 4-6 hét múlva eltávolítottuk a Balb/c vagy azanti-DC4-gyel előkezelt Balb/c egerekből, majd egy-sejtszuszpenziót készítettünk belőlük 0,25% bovin-szé-rumalbumint (BSA) tartalmazó PBS-ben. A CD4+T-sejtek tisztításánál minden manipulációt +4 °C-on vé-geztünk. Körülbelül 4χ 108 LN-sejtet jeleztünk 30 per-cen át 12-12 pg/ml anti-B220, anti-Mac-1, anti-CD8 és anti II. osztályú I-Ad-tartalmú 2 ml PBS/BSA oldat-tal. A mAt-ekkel jelzett sejtszuszpenziót PBS/BSA ol-dattal mostuk, majd 30 percen át forgó tárcsán birkaantipatkányantitesttel fedett Dynabeads-szemcsékkel(Dynabeads; beszerezhető a Robbins Scientific cégtől,Mountain View, CA., USA) inkubáltuk, 3 szemcse/sejtarány mellett. Negatív sejteket mágneses elválasztássalkaptunk. A kapott sejtszuszpenziót, amely körülbelül 85%CD4+ sejtet tartalmazott, tovább tisztítottuk CD4+ T-sejtekre, pozitív szelektálással, mágnessel aktivált sejt-szortírozó készülékben (MACS=Magnetic activatedcell sorter; Miltenyi, Düsseldorf, Németország). Úgyjártunk el, hogy a sejteket 12 pg/ml biotinezett anti-DC4-gyel jeleztük PBA/BSA-ban, 15 percig, 50 ml/108sejt mellett. A sejteket ezután PBS-ben mostuk, majdStreptavidin Microbeads szemcsékkel (Becton-Dickin-son, Sunnyvale, CA., USA) inkubáltuk 50 μ1/108 sejtmellett. Tizenöt perc múlva Streptavidin-PE-készít-ményt (Becton-Dickinson) adtunk a szuszpenzióhoz1/50 végső koncentrációban. További 5 perces inkubá-lás után a sejtszuszpenziót mostuk, és áteresztettük egymágnesezett oszlopon (MACS, Miltenyi, Düsseldorf,Németország) a gyártó cég előírása szerint. A mágnese-zett oszlop által visszatartott sejteket úgy oldottuk le,hogy az oszlopot eltávolítottuk a mágnestől, és alapo-san mostuk PBS/BSA-val. A kapott sejtpopuláció többmint 96% CD-I- sejtet tartalmazott. T-sejtre kimerített splenocitákat készítettünk normáldonorok lépéből, amelyekből az anti-CD4-gyel és anti-CD8-cal jelzett sejteket negatív szelekcióval, birka-antipatkány Dynabeads használatával távolítottuk el pon-tosan úgy, ahogy fent az LN-sejtekre leírtuk. A készítmé-nyek 99%-ban CD4- és CDS-negatívok voltak FACS-analízissel meghatározva.

Elválasztatlan nyirokcsomósejteket vagy tisztítottCD4+ T-sejteket tenyésztettünk párhuzamos tenyésze-tekben 250 μΐ 5% FCS-tartalmú cRPMI táptalajban ajelzett dózisok alkalmazása mellett, gömbölyű fenekű96 tartályos lemezeken, a tisztított CD4+ T-sejtek ese-tében 5 x 105 T-sejtre kimerített normál szplenocitávalegyütt, L. major antigén jelenlétében vagy e nélkül.A cRPMI táptalaj egy olyan összetételű táptalaj, amely10% FCS-, 2 mM L-glutamin-, 0,05 mM 2-ME-(2-mer-kapto-etanol-) és 100-100 E/ml penicillin- és sztrepto-micintartalmú RPMI1640 táptalajból áll (beszerezhetőa J. R. H. Bioscience cégtől, Lenexa, Kansas, USA).

Az antigén bemutatósejteket (APC) L. major anti-génnel (2xl06 organizmus/ml-nek megfelelő) vagycsak táptalajjal pulzáltuk 4 órán át. A T-sejtre kimerítettszplenocitákat ezután a tenyésztés előtt 1000 rád gam-ma-sugárzásnak tettük ki. Néhány esetben rekombinánsIL-10-et (rIL-10) (50 μg/ml), rekombináns IL-4-et(rIL-4) (100 pg/ml) és/vagy ezen citokinek elleni neut-ralizáló mAt-eket adtunk a tenyésztőtartályokhoz. A fe-lülúszókat 72 óra múlva arattuk le a citokinszintézisvizsgálatához. A felülúszók citokinszintjeit kétrétegű szendvics-ELISA-val mutattuk ki, ahogyan fent, az IFN-y-nál (lásdelőbb, Chatelain et. al., 1992), IL-4-nél (lásd előbb, 22 1

HU 220 103 B 2

Chatelain et. al., 1992), IL-10-nél és IL-3-nál leírtuk.A mintákat a tisztított rekombináns vagy természetescitokinnel készített standard görbékkel való összehason-lítás révén mennyiségileg értékeltük.

Az anti-CD4 mAt-tel való előkezelés kezdetben ki-merítette az állatban lévő T-sejteket, azonban végül fo-kozta az állat rezisztenciáját az L. major parazitafertő-zéssel szemben. Bár ez a jelenség ellentétes a jelen felfo-gással, és mechanizmusa is tisztázatlan, mégis pontosanmegfigyelhető volt. A DTH erős korrelációt mutatott azállat parazitafertőzéssel szembeni rezisztenciájával. A fertőzés után 4 héttel Leishmania antigént (fa-gyasztott, visszaolvasztott) injektáltunk az állat ellenke-ző oldalon lévő talpába (challenge). A következő 48 órafolyamán metrikus kaliberkörzővel mértük a talp duzza-dását. Mindegyik állat a citokinekből 5 dózist kapottintraperitoneálisan. Az egyik csoport 5 dózis IL-4-et,egy másik csoport 5 dózis IL-10-et, és egy harmadikcsoport az IL-4 és IL-10 kombinációjából kapott 5 dó-zist. Az 5 dózist 12 óránként adtuk, az első dózist az an-tigén challenge előtt 12 órával. 11. táblázat

Az IL-4 és IL-10 kombinációja gátoljaaz L. major antigénnel szembeni DTH-t

Kezelés Talpméret (mm χ 10 J) 20 pgIL-4 84±16 20 pg IL-10 68±7 20 pg IL-4+20 pg IL-10 33±11 4 pg IL-4+4 p IL-10 54±25 PBS-kontroll 91 ±20

All. táblázat az egerek talpának a méretét mutatja24 órával a Leishmania antigéninjekció után. A csakPBS-sel oltott kontrollállatok válasza hasonló volt azok-nak az állatoknak a válaszához, amelyek IL-4-et,IL-10-et vagy e kettő kombinációját kapták a jelzettdózisban. A citokineket intraperitoneálisan (ip.) alkal-maztuk 48 órán át 12 óránként, amelyet az antigénchallenge előtt 12 órával kezdünk. Minden csoport 5 ál-latból állt.

Az adatok mutatják, hogy a csak IL-4-gyel kezeltegerek körülbelül ugyanúgy viselkedtek, mint a PBS-sel kezelt egerek. Az egyedül IL-10-zel kezelt egerek-nél kisebb volt a duzzanat, mint a kontrolioknál.

Az IL-4 és IL-10 kombinációjával kezelt egerek alegkisebb duzzadással válaszoltak, különösen az a cso-port, amelyben 20-20 pg citokinnel történt a kezelés. 12. táblázat

Az IL-4 és IL-10 kombinációja gátolja az L. majorantigénnel szembeni DTH-t

Kezelés Talpméret(mmx 10-2) 50 pg IL-4 73±11 50 pg IL-10 65±12

Kezelés Talpméret(mmx 10~2) 50 pg IL-4+50 pg IL-10 43±13 20 pgIL-4+20 pgIL-10+ICA 42±9 20 pgIL-4+20 pgIL-10+ctIL-10+IL-4 93±21 PBS-kontroll 119±27 A 12. táblázat egy független második kísérlet ada-tait mutatja. A kísérlet kivitele azonos volt az előbb le-írt kísérletével, kivéve, hogy a talpadatokat a Leishma-nia antigénnel való oltás után 48 órával jegyeztük fel.

Minden csoport 5 állatból állt. Az IL-4 és IL-10gátlóhatását 2 mg IL-4 elleni mAt és 5 mg IL-10 elle-ni mAt alkalmazásával blokkoltuk. Az IL-4 és IL-10elleni antitesteket, amelyeket pozitív kontrollként hasz-náltunk, intaperitoneálisan alkalmaztuk a citokinekelső adása után 12 órával. Negatív kontroll gyanánt egyugyanazon izotípusú kontroll-mAt-ből (ICA) adott5 mg-nak nem volt hatása a gátlásra. A kontroll-mAt-et(ICA) Chatelain és munkatársai (1992, lásd előbb) sze-rint állítottuk elő.

Az IL-4 és IL-10 elleni antitestek alkalmazásáraazért került sor, hogy bemutassuk, miszerint az IL-4 ésIL-10 versengése csökkenti e citokinek hatékonyságát.Ezek az antitestek ezenkívül a rekombináns technoló-giával előállított citokinek számára további ellenőrzésilehetőséget biztosítanak.

Az adatok arra utalnak, hogy az IL-4 és IL-10kombinációja hatékonyabb egy állat DTH-reakciójánakcsökkentésében, mint bármelyik citokin egyedül. AzIL-10 egymaga hatékonyabb, mint az IL-4 egymaga,de kevésbé hatékony, mint a kombináció. A citokinekkombinációjának az egyes citokinek elleni mAt-ekkelvaló együttes alkalmazása a citokinkezelés hatékonysá-gának megsemmisítését eredményezi. 13. táblázat

Az LN-sejtek által termelt IFN-γ a DTH-indukációhelyére ürül ki

Kezelés IFN-γ (ng/ml) 20 pgIL-4 147±34 200 pg IL-10 109±49 200 pg IL-4±20 pg IL-10 53±33 PBS-kontroll 342±54 A 13. táblázat adatait úgy kaptuk, hogy a cito-kineket 12 óránként alkalmaztuk, kezdve az antigénchallenge előtt 12 órával és az antigén challenge után24 óráig bezárólag. A Leishmania antigéninjekció he-lyére ürülő nyirokcsomósejteket (LN=lymph node) azantigén challenge után 5 nappal eltávolítottuk azokbólaz állatokból, amelyek a citokineket és az angitént kap-ták. A 13. táblázatban a „kezelés” oszlop azoknak az ál-latoknak a kezelésére vonatkozik, amelyekből az LN-sejteket eltávolítottuk. A nyirokcsomókat in vitro L. ma- 23 1

HU 220 103 B 2 jor antigénnel (lefagyasztva, felolvasztva) stimuláltuk.A felülúszót 72 órával később IFN-y-tartalomra vizsgál-tuk. Az adatok három individuális állatból származnak(n=3 ± standard hiba).

Az adatok azt mutatják, hogy a citokinnel kezelt ál-latok kevesebb IFN-y-t termelnek, mint a PBS-sel ke-zelt kontrollállatok. Ezenfelül az IL-4 és IL-10 kombi-nációjával kezelt állatok jelentősen kevesebb IFN-y-ttermeltek, mint bármelyik olyan kísérleti kontrollállat,amely egyetlen citokint kapott. 14. táblázat

Az IL-4 és IL-10 gátolja a Thl-populációIFN-y-termelését

Adagolás IFN-γ (ng/ml) - 100±6 5 ng/ml IL-10 53 ±4 100 ng/ml IL-4 44±2 5 ng/ml IL-10+100 mg/ml IL-4 20±l A 14. táblázat adataihoz úgy jutottunk, hogy CD4+T-sejteket izoláltunk anti-CD4-gyel előkezelt állatok-ból, amelyeket 4 héttel korábban L. majorral fertőztünk.A sejteket in vitro stimuláltuk L. major (lefagyasztott,felolvasztott) antigénnel és T-sejtre kimerített szpleno-citákkal (5 χ 105/tartály), mint APC-forrással. Az IFN-y-szinteket 72 óra múlva határoztuk meg ELISA-mód-szerrel. Az „adagolás” oszlop alatt feltüntetett anyago-kat ahhoz a táptalajhoz adagoltuk, amelyben a Thl-sejteket tenyésztettük. A 14. táblázat adatai mutatják, hogy akár az IL-4-et, akár az IL-10-et adagoltuk önmagában, ezek jelen-tősen csökkentették a Thl-sejtek által termelt IFN-y-szinteket, összehasonlítva azokkal a kontroliokkal, ame-lyeket PBS-sel kezeltünk. Ezenfelül, ha az IL-4 ésIL-10 kombinációját adtuk a táptalajhoz, ez körülbelül50%-kal kevesebb IFN-y-t eredményezett, mint amikoraz egyes citokineket önmagukban adagoltuk.

Az előbb említett adatok mutatják, hogy az IL-10 kö-vetkezetesen csökkenti a DTH-választ, duzzadást és álta-lában a nyirokcsomókból és speciálisan a Thl-sejtekbőleredő IFN-y-termelést, összehasonlítva a kontroliokkal.Továbbá az IL-4 és IL-10 kombinációja felülmúljamind az IL-4-et, mint az IL-10-et ugyanazon dózis-tartományban, ha ezeket csak önmagukban használjuk.

Szekvenciák jegyzéke: 1. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői : (A) Hosszúság: 160 aminosavmaradék (B) Típus: aminosav(D) Topológia : lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia

Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin S1 5 A kombinációban végzett kezelés - mindkét citokinből20 pg mellett - eredményesebb volt, mint a szimpla ke-zelés, amikor is mind az IL-4-ből, mind az IL-10-bőltöbb mint kétszeres dózist (50 pg) alkalmaztunk. Tehátha az IL-4-ből és IL-10-ből 20-20 pg-ot adtunk kombi-nálva, a kezelés jótékonyabb hatást eredményezett, mintamikor vagy az IL-4-ből vagy az IL- 10-ből 50 pg-ot al-kalmaztunk egyetlen terápiás szer gyanánt. 13. példa 1 típusú diabetes mellitusban szenvedő beteg keze-lése

Kezeléshez olyan beteget választottunk, aki a Nem-zeti Diabetes Adat Csoport vagy a Világ EgészségügyiSzervezet (National Diabetes Data Group vagy WorldHealth Organization) által kidolgozott kritériumok alap-ján I típusú diabetes mellitusban szenvedett. A betegetkezdetben naponta 20-20 pg IL-4-gyel és IL-10-zelkezeltük testtömeg-kg-onként. Minthogy a beteg 70 kg-os volt, az egyes citokinekből a kezdő adag 1400 pgvolt. A dózist mint intravénás bolusz injekciót alkalmaz-tuk. A dózist naponta körülbelül 250x1000 pg-malemeltünk, a beteg tűrőképességétől és válaszától füg-gően. Több nap múlva körülbelül 7000 pg/nap dózist(100 pg/kg/nap) értünk el.

Az első kezelés előtt és ezután naponta, majd azutolsó kezelés után több napig a beteget klinikai szem-pontból és laboratóriumi paraméterekkel monitoroztuk.A laboratóriumi paraméterek a következők voltak: vér-cukor, vérsejtszám, különös figyelmet fordítottunk azösszfehérvérsejt számára és a vérképre. A vércukor-mo-nitorozás jól ismert a diabetikus kezelésben. Továbbifontossága van annak, hogy a fehérvérsejt mennyiségenormál marad-e, vagy jelentős változás nélkül marad-ea beteg kezelés előtti szintjéhez képest. Ami a vérképetilleti, különös figyelmet fordítottunk arra, hogy vajonmegjelennek-e éretlen formák a perifériás vérben, éshogy a fehérvérsejtek különböző típusainak normál ará-nya állandó marad-e vagy változott. Speciális figyel-met fordítottunk a perifériás vérben lévő limfociták ésmonociták arányára. A találmány sokféleképpen módosítható és változ-tatható anélkül, hogy a találmány tárgyától és szellemé-től eltérnénk. Ez nyilvánvaló azok számára, akik e szak-területen jártasak. Az itt leírt kiviteli alakok csak példa-ként szolgálnak, a találmányt csak a csatolt igénypon-tok szövege korlátozza.

Glu Asn Ser Cys Thr His Phe10 15 24

HU 220 103 B

Pro Gly Asn Leu Pro Asn Me t Leu Arg Asp Leu Arg Asp A1 a Phe 20 25 30 Ser Arg Val Ly s Thr Phe Phe Gin Me t Ly s As p Gin Leu Asp Asn 35 40 45 Leu Leu Leu Ly s Glu Ser Leu Leu Glu As p Phe Ly s Gly Tyr Leu 50 55 60 Gly Cy s Gin A1 a Leu Ser Glu Me t I le Gin Phe Tyr Leu Glu Glu 65 70 75 Val Me t Pro Gin Alá Glu Asn Gin Asp Pro Asp I le Ly s A1 a Hi s 80 85 90 Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Ly s Thr Leu Arg Leu Arg Leu 95 100 105 Arg Arg Cy s Hi s Arg Phe Leu Pro Cy s Glu Asn Ly s Ser Ly s A1 a 110 115 120 Val Glu Gin Val Ly s Asn A1 a Phe Asn Ly s Leu Gin Glu Ly s Gly 125 130 135 I le Tyr Ly s A1 a Me t Ser Glu Phe Asp I le Phe I le Asn Tyr 1 le 140 145 150 G1 u Alá Tyr Me t Thr Me t Ly s I le Arg Asn 155 160 2. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői: (A) Hosszúság: 147 aminosavmaradék (B) Típus: aminosav(D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia

Thr Asp Gin Cys Asp Asn Phe Pro Gin Me t10 Leu Arg Asp Leu Arg15 1 5 Asp A1 a Phe Ser Arg Val Ly s Thr Phe Phe Gin Thr Ly s Asp Glu 20 25 30 Val Asp Asn Leu Leu Leu Ly s Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Ly s 35 40 45 Gly Tyr Leu Gly Cys Gin A1 a Leu Ser Glu Me t I le Gin Phe Tyr 50 55 60 Leu Glu Glu Va 1 Me t Pro Gin Alá Glu Asn Gin Asp Pro Glu A1 a 65 70 75 Ly s Asp Hi s Va 1 Asn Ser Leu Gly Glu As n Leu Ly s Thr Leu Arg 80 85 90 Leu Arg Leu Arg Arg Cys Hi s Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Ly s 95 100 105 25

Claims (2)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás Crohnbetegség kezelésére alkalmazható gyógyszerkészít1. Interleukin-10 (IL-10) alkalmazása gyulladásos 35 mény előállítására.

   bélbetegség kezelésére alkalmazható gyógyszerkészít- 4. Az 1 -3. igénypontok szerinti alkalmazás, amelymény előállítására. ben az interleukin-10 humán interleukin-10 (hLI-10).
2. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás fekélyes vastagbélgyulladás (colitis ulcerosa) kezelésére alkalmazható gyógyszerkészítmény előállítására.

   Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Törőcsik Zsuzsanna főosztályvezető-helyettes Windor Bt., Budapest