SK21195A3 - Pharmaceutical substance containing il-4 and/or il-10 or antibodies against il-4 and il-10, method of manufacture and use thereof - Google Patents

Description

Vynález sa týka farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje IL-4 a/alebo IL-10 alebo protilátky proti IL-4 a IL-10, spôsobu jeho výroby a jeho použitie. Vynález sa podrobnejšie týka prostriedkov a spôsobu liečenia proliferácie neoplastických buniek závislých od interleukínu-2 (IL-2), hypersenzitívnych reakcií neskorého typu (DTH) a zápalových črevných ochorení a posilnenia inhibície produkcie cytokinu T bunkami alebo zvýšenie produkcie Γ'-interf erónu (IFN-Z). Tieto prostriedky a spôsoby využívajú interleukín-4 (IL-4), interleukín-10 (IL-10) alebo ich kombinácie alebo antagonistov IL-4 a 11-1 ako neutralizujúce protilátky. Doterajší stav techniky

Leukémie sú heterogénnou skupinou novotvarov pochádzajúcich od malígnej transformácie hematopoéznych (krvotvorných) buniek. Môžu byť odvodené buď od lymfoidných alebo myeloidných typov buniek. Transformované bunky primárne proliferujú v kostnej dreni a v lymfoidnom tkanive, kde interferujú s normálnou hematopoézou a imunitou. Môžu taktiež emigrovať do krvi a infiltrovať do iných tkanív, čo často vedie k abnormálnej distribúcii rôznych typov buniek. Príkladmi leukémie je lymfotická leukémia (ALL), akútna myeloidná leukémia (AML), chronická myeloidná leukémia (CML), chronická lymfocytická leukémia (CLL), leukémia vlasových buniek a leukémia dospelých T buniek (ATL). Leukémie sa typicky charakterizujú buď ako akútne alebo ako chronické, podľa povahy klinického priebehu.

Lymfómy, na rozdiel od leukémie, neoplastickej transformácie buniek, sa vyskytujú prevažne v lymfoidných tkanivách. Lymfómy sa typicky delia na Hodgkinovu chorobu a ne-Hodgkinove lymfómy. Pri Hodgkinovej chorobe väčšina buniek predstavuje malé lymfocyty 4 s T bunkovým fenotypom. Viac ako 90 % všetkých prípadov ne-Hodgkinových lymfómov predstavuje deriváty B buniek.

Liečenie väčšiny týchto ochorení nie je dosiaľ úplne úspešné. Dosiaľ známa technika sa primárne sústreďuje na použitie chemoterapie a ožarovania, avšak až do dneška’toto liečenie obyčajne stroskotáva pre dlhodobú remisiu alebo pre dlhodobú opateru. Existuje teda potreba bezpečného a spoľahlivého spôsobu liečenia týchto ochorení, zvlášť tých, pri ktorých proliferácia neoplastických buniek závisí od IL-2.

IFN-F je potencionálnym aktivátorom makrofágov, ktoré sú zodpovedné za obranu hostiteľa proti rôznym infekčným činidlám a ochoreniam. Kvôli dôležitej úlohe IFN-ť* v obrane proti infekciám, sú potrebné také prostriedky a spôsoby, ktoré môžu zvyšovať produkciu IFN-IT.

Imunitný systém prináša početné prirodzené a adaptívne imunitné reakcie, dve rozsiahle kategórie, ktoré sa nazývajú humorálna a bunková imunitná odpoveď. Humorálna odpoveď sa v širšom slova zmysle týka produkcie protilátok a pôsobenia B-buniek, vrátane buniek plazmy. Bunková imunita je sprostredkovaná bunkami, vrátane T-buniek, monocytov, makrofágov a histiocytov.

T-bunky môžu byť rozdelené do kategórií podľa rôznych funkcií alebo znakov. Napríklad T-bunky je možné klasifikovať ako T pomocné bunky alebo T supresorické bunky. T-bunky môžu byť tiež aktivované, takže sa stávajú cytotoxickými, alebo vytvárajú iné špecializovanejšie funkcie. Normálne majú T-bunky a B-bunky také interakcie, ktoré môžu v istom rozsahu regulovať vzájomnú aktivitu, viď napríklad Paul (red.): Fundamentals od Immunology, druhé vydanie, Raven Press, New York (1989).

V rôznych antigénoch môžu prevládať buď bunkové alebo humorálne odpovede, typicky vzájomne výlučným spôsobom. Nástup niektorých ochorení, napr. lepry, leishmaniózy a niektorých typov autoimunity, môže byť zapríčinený nevhodnou prevahou jednej trie4 dy odpovede nad druhou , viď Mosmann a kol.: Immunol. Today 8, 223 (1987) ; Mosmann a kol.: Ann. Rev. Immunol. 7, 145 (1989) ; Parish: Transplant Rev. 13., 35 (1972) a Liew: Immunol. Today 10.

(1989).

Jedným z mechanizmov, ktorými je imunitný systém regulovaný, zahrňuje produkciu proteínov, ktoré sa volajú cytokiny. Lymfokiny sú cytokiny produkované T-bunkami a niektorými B-bunkami. Monokiny sú cytokiny produkované monocytmi. Cytokiny, ktoré môžu byť glykozylované, sprostredkovávajú mnohé imunitné odpovede.

IL-4 je cytokin, ktorý je schopný stimulovať produkciu protilátky produkujúcej B-bunky, ktorá tiež’ podporuje rast ničiacich T-buniek alebo cytotoxických buniek. IL-4 môže tiež inhibovať aktivitu T-pomocných buniek typu 1 (Thl) a tie môžu ďalej inhibovať produkciu viacerých B-buniek alebo produkciu protilátok viacerými B-bunkami. IL-4 je teda súčasťou vnútorného regulačného mechanizmu.

IL-10 je cytokin, ktorý je schopný sprostredkovať mnohé činnosti alebo účinky. IL-10 bol izolovaný ako z myších, tak aj z ľudských buniek. Je prítomný pri regulácii imunitných odpovedí rôznych tried alebo podtried T-pomocných (Th) buniek. Th bunky sa môžu deliť na rôzne podskupiny, ktoré sa odlišujú produkciou cytokinov.

Thl T-bunkové klony produkujú interleukín-2 (IL-2) a IFN-Γ, zatiaľ čo Th2 bunkové klony vylučujú IL-10, IL-4 a interleukín-5 (IL —5), zvyčajne po aktivácii antigénmi alebo mitogénnymi lektínmi. Obe triedy Th bunkových klonov produkujú cytokiny, akými je nádorový nekrózny faktor-α (TNF-a), interleukín-3 (IL-3) a granulocyt-makrofágovú kolóniu stimulujúci faktor (GM-CSF). Tretia kategória Th buniek (ThO) produkuje IL-2, IFN-ť”, IL-4,

IL-5, TNF-α, IL-3 a GM-CSF súčasne.

Zostavy produkcií rôznych cytokinov buniek Thl a Th2 odrážajú ich pomocné funkcie. Thl bunky sú zahrnuté prevažne v hypertenzívnych odpovediach neskorého typu, zatiaľ čo Th2 bunky súvisia s produkciou protilátok. Nakoľko protilátková hypersenzivita (cesta Th2) a neskorého typu (cesta Thl) sú vzájomne často totožné, predpokladá sa, že bunky Thl a Th2 majú skrížené regulačné účinky. IFN-jf produkovaný bunkami Thl inhiijuje proliferáciu buniek Th2 a IL-10 produkovaný Thl bunkami inhibuje syntézu cytokinu klonmi buniek Thl, najmä produkciu IFN-F a IL-2.

Hypersenzitivita neskorého typu (DTH) je imunitnou odpoveďou sprostredkovanou bunkami, ktorá je charakterizovaná edémom a celulárnou infiltráciou tkaniva, zvyčajne T-bunkami a monocytmi a/alebo makrofágmi. Niektoré typy cytokinov súvisia s hypersenzitívnymi reakciami neskorého typu a humorálnymi imunitnými odpoveďami. Cher a kol.: J. Immunol. 138. 3688 (1987) a Hosmann a kol. (1987 a 1989, viď vyššie). Ochorenia súvisiace s týmito skupinami odpovedí môžu byt zapríčinené neprimeranou produkciou súvisiacich typov cytokinov.

Zápalové črevné ochorenie (IBD) sa týka skupiny gastrointestinálnych porúch, ktoré sa vyznačujú chronickým, nešpecifickým zápalom častí gastrointestinálneho traktu. Vredovitá kolitída a Crohnova choroba, najznámejšie z príkladov IBD ľudí, súvisia s viacerými príznakmi a komplikáciami, vrátane retardácie rastu detí, rektálneho prolapsu, krvou v stolici (napr. melena a/alebo hematochézia), chudnutie, nedostatok železa a anémia, napr. anémia z nedostatku železa a anémia z chronického ochorenia alebo chronického zápalu.

Pôvod IBD nie je objasnený, viď Wyngaarden a Smith (red.): Cecil's Textbook of Medicíne (W.B. Saunders Co., 1985), Berkov (red.): The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (Merck Sharp and Dohme Research Laboratories, 1982) a Harrison's Principles of Internal Medicíne, 12. vydanie, McGraw-Hill, Inc. (1991).

Vredovitá kolitída je chronickým, nešpecifickým, zápalovým a vredovitým ochorením, ktoré sa primárne prejavuje mukózou hrubého čreva. Často sa prejavuje krvácajúcou stolicou, abdominálnymi kŕčami, krvpu a hlienom v stolici, nevoľnosťou, horúčkou, anémiou, anorexiou, stratou hmotnosti, leukocytózou, hypoalbuminémiou a zvýšenou rýchlosťou sedimentácie erytrocytov (ESR). Medzi komplikácie patrí hemoragia, toxická kolitída, toxický megakolón, príležitostná rektovaginálna fistula a zvýšené riziko rozvinutia rakoviny časti hrubého čreva. ,

Vredovitá kolitída súvisí taktiež s komplikáciami, ktoré sú vzdialenejšie od časti hrubého čreva (tračníka), akými sú artritída, ankylózna spondylitída, sakroileitída, posteriórna uveitída, nodózny erytém, gangrenózna pyodermia a episkleritída. Liečenie závisí značne.od prudkosti a trvania ochorenia. Napríklad pri prudkom nástupe ochorenia je často indikovaná liečba na zabránenie dehydratácie a elektrolytovej nerovnováhy. Niekedy sú vhodné tiež špeciálne diétne opatrenia. Medzi liečivá patria rôzne kortikosteroidy, sulfasalazín a niektoré jeho deriváty a možné sú tiež imunosupresívne liečivá.

Crohnova choroba má veľa spoločných črt s vredovitou kolitídou. Crohnova choroba sa odlišuje tým, že poranenie má tendenciu sa ostro ohraničovať od priľahlého normálneho čreva, na rozdiel od poranenia vredovitou kolitídou, ktoré je skôr difúzne. Crohnova choroba ďalej ovplyvňuje prevažne dolnú časť tenkého čreva (ileitída) a dolnú časť tenkého čreva a časť hrubého čreva (ileokolitída). V niektorých prípadoch je zasiahnutá samotná časť hrubého čreva (granulomatózna kolitída) a niekedy tenké črevo (jejunoileitída). Vo vzácnych prípadoch je postihnutý žalúdok, dvanástorník alebo pažerák. Medzi poranenia patrí epiteloidný sarkoidný granulóm a asi polovica klinických prípadov.

Poranenie pri Crohnovej chorobe môže byť transmurálne, vrátane hlbokého zvredovatenia, edému a fibrózy, ktoré môžu viesť k obštrukcii a tvorbe fistule, rovnako aku ku vzniku vredu. To je v kontraste s vredovitou kolitídou, ktorá obyčajne vedie k oveľa jemnejším poraneniam, aj keď pri vredovitej kolitíde je príležitostne možné vidieť tiež komplikácie fibrózy, obštrukcie, tvorby fistúl a vredov. Bežné liečenie je v oboch prípadoch podobné. Zahrňuje použitie steroidov, sulfasalazínu a jeho derivátov a imunosupresívnych liečiv, akými sú cyklosporín A, merkaptopurín a azatioprin, ktoré môžu mať silné nežiadúce vedľajšie účinky.

Vzhľadom na lekársku dôležitosť hypersenzitivity neskorého typu a zápalového ochorenia čriev sú potrebné zlepšené prostriedky a spôsoby liečenia týchto stavov.

Podstata vynálezu

Vynález rieši spomínanú potrebu tým, že popisuje prostriedky a spôsoby liečenia hore uvedených stavov.

Podrobnejšie sa tento vynález týka spôsobu inhibovania neoplastickej proliferácie buniek, ktoré sú závislé od IL-2 a to tak, že cicavcovi, ktorý je postihnutý neoplastickou proliferáciou buniek závislých od IL-2, sa podáva efektívne množstvo IL-10.

Vynález popisuje aj spôsob zvýšenia hladiny IFN-Γ u pacienta tak, že sa súčasne pacientovi podáva také množstvo protilátok proti IL-4 a IL-10, ktoré je efektívne na zvýšenie produkcie IFN-Jf pacientom.

Vynález ďalej popisuje spôsob liečenia zápalového črevného ochorenia u cicavcov a to tak, že cicavcovi, ktorý je postihnutý zápalovým črevným ochorením, sa podáva efektívne množstvo IL-10.

Vynález popisuje tiež spôsob zosilenia inhibície produkcie cytokinu T-bunkami u cicavcov súčasným podávaním efektívneho množstva IL-4 a IL-10, pričom liečeným cicavcom je s výhodou človek.

Vynález popisuje aj spôsob inhibovania hyposenzitívnej reakcie neskorého typu u cicavcov tak, že sa podáva efektívne množstvo IL-10. Vo výhodnom uskutočnení sa efektívne množstvo IL-4 podáva^súčasne s IL-10.

Výhodne sa ľudský IL-4 a IL-10 používajú podľa vyššie uvedených spôsobov na liečenie človeka.

Všetky uvedené odkazy sú tu uvedené ako citácie. Všetky sekvencie tu uvedených nukleových kyselín majú normálnu 5'-3' konvenciu, pokiaľ sa čítajú zľava doprava. Pre bázy nukleotidov v sekvenciách sú použité štandardné jednopísmenové skratky (37

C.F.R. § 1.822) .

V ďalšej časti tohto popisu sú uvedené zdroje cytokinov a protilátok.

Pojem interleukín-4 alebo IL-4 tak, ako sa tu používa, predstavuje proteín, ktorý a) má amínokyselinovú sekvenciu v podstate identickú so sekvenciou maturovaného ľudského IL-4, popísaného na obr. IC v medzinárodnej patentovej prihláške č. WO 87/02990 a b) má biologickú aktivitu, ktorá je obvyklá pre prírodný IL-4. V podstate identická amínokyselinová sekvencia znamená, že sekvencia iného IL-4 v porovnaní so sekvenciou popísanou v publikovanej patentovej prihláške je rovnaká alebo sa odlišuje jednou alebo viacerými zmenami aminokyselín (delécia, pridanie, substitúcia), ktoré podstatne neovplyvňujú biologickú aktivitu.

IL-4 je komerčne dostupný z rôznych zdrojov, akým je Genzyme Corporation, Cambridge, Ma., alebo sa môže pripraviť známymi spôsobmi z prírodných zdrojov alebo technológiami rekombinácie DNA [Sheehan a kol.: J. Immunol. 142, 884 (1989) a Starneš a kol.: J. Immunol. 145, 4185 (1990)].

Na identifikáciu DNA kódujúcu IL-4 v genomových alebo cDNA knižniciach pripravených štandardnými spôsobmi sa môžu použiť i zmesi oligonukleotidových sond, ktoré sú založené na známych IL-4 nukleotidových sekvenciách. Takto identifikované DNA sa môžu vyčleniť z knižnice štiepením reštrikčnou endonukleázou alebo sa môžu pripraviť pomocou príslušných primerov a spôsobom polymerizačnej reťazovej reakcie (PCR) [Saiki a kol.: Science 239, 487 (1988)], môžu byť sekvenované a exprimované v eukaryotickom expresnom systéme alebo (po delécii intronu štandardnými spôsobmi, ak je to nutné) v prokaryotickom alebo eukaryotickom expresnom systéme. Avšak, ako cDNA, tak aj genomové DNA knižpice môžu byť analyzované aplikáciou štandardných spôsobov klonovania namiesto použitia oligonukleotidových sond alebo PCR. Takto vyrobený IL-4 sa potom deteguje známymi spôsobmi, akými sú imunochemické spôsoby alebo bioanalýzy.

Ako IL-4 sa výhodne používa ľudský rekombinantný IL-4. Môže sa tiež použiť glykozylovaný IL-4 (napr. rekombinantný IL-4 produkovaný v eukaryotickom expresnom systéme) rovnako ako neglykozylovaný proteín (napr. chemicky syntetizovaný alebo produkovaný bakteriálnym expresným systémom).

Pojem interleukín 10 alebo IL-10 tak, ako sa tu používa, predstavuje proteín, ktorý a) má amínokyselinovú sekvenciu maturovaného (napríklad s chýbajúcou sekvenciou sekrečného leaderu) IL-10 v podstate takú, aká je popísaná v medzinárodnej patentovej prihláške WO 91/00349 a b) má biologickú aktivitu, ktorá je obvyklá pre prírodný IL-10. Môže sa používať ako glykozylovaný (napríklad chemicky syntetizovaný štandardnými spôsobmi alebo produkovaný v E. coli) IL-10. Patria sem tiež i mutíny a ďalšie analógy, vrátane BCRFI (vírový IL-10 vírusu Epstein Barr; tiež jednoducho nazývaný vírový IL-10) proteínu, ktorý má biologickú aktivitu IL-10. Medzinárodná prihláška č. WO 91/00349 popisuje mnohé in vitro testy, ktoré sú vhodné na meranie aktivity IL-10. V tejto prihláške sú popísané mnohé výhodné modifikácie IL-10.

IL-10 vhodný na použitie podľa vynálezu sa môže získať z viacerých zdrojov. Napríklad sa môže izolovať z kultivačného média aktivovaných T-buniek schopných vylučovať tento proteín.

IL-10 alebo jeho aktívne fragmenty môžu byť tiež chemicky syntetizované známymi štandardnými technikami, viď napr. Merrifield : Science 233, 341 (1986) a Ätherton a kol.: Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, I.R.L. Press, Oxford 1989.

Rekombinantný ľudský IL-10 je tiež obchodným článkom, ktorý je možné získať od napr. PeproTech, Inc., Rocky Hill, NJ.

Rekombinantný IL-10 sa môže vyrábať tiež, ako jp hore uvedené pre IL-4, s využitím informácií o sekvenciách známeho ľudského IL-10 alebo vírového IL-10. Spôsoby výroby rekombinantného ľudského IL-10 sú popísané napr. v medzinárodnej patentovej prihláške č. WO 91/00349. Klony, obsahujúce sekvencie, ktoré kódujú ľudský IL-10, boli uložené v Americkej zbierke typov kultúr (ATCC), Rockville, Maryland, 20. decembra 1989 a boli im priradené čísla 68191 a 68192. Klonovanie a expresia vírového IL-10 (BCRFI proteínu) z vírusu Epstein Barr boli popísané Moorom a kol.[Science 248, 1230 (1990)].

Ľudský IL-10 sa s výhodou používa na liečenie ľudí, aj keď sa okrem neho môže použiť tiež vírový IL-10 alebo IL-10 z niektorého iného druhu cicavcov. Najvýhodnejšie sa ako IL-10 používa rekombinantný ľudský IL-10.

IL-4 a IL-10 z akéhokoľvek zdroja sa môžu čistiť štandardnými spôsobmi, vrátane (ale bez obmedzenia na tieto) zrážania kyselinou alebo soľou, chromatografiou na ionexe, chromatografiou na chelátoch kovov, gélovou filtráciou, rýchlou proteínovou kvapalinovou chromatografiou (FPLC), vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC), preparátívnou elektroforézou na diskovom géli alebo záclonovou elektroforézou, izoelektrickou fokusáciou, frakcionáciou z organického rozpúšťadla s nízkou teplotou varu, protiprúdnym roztrepávaním a imunoafinitnou chromatograf iou .

Protilátky proti IL-4 a IL-10 sa môžu pripravovať štandardnými spôsobmi. Slovo protilátka tak, ako sa tu používa, znamená ako polyklonálne, tak i monoklonálne protilátky (McAbs), zahrňuje tiež celé imunoglobulíny a ich fragmenty viažúce antigén .

Polyklonálne protilátky sa môžu pripravovať imunizáciou hostiteľského zvieraťa, akým je zajac, krysa, koza, ovca, myš, atď., IL-4 a IL-10. Po pôvodnej injekcii sa výhodne podá jedna alebo dve posilňujúce injekcie na zvýšenie titra protilátky, potom sa zvieraťu odoberie krv. Pripraví sa sérum, ktoré ₍sa analyzuje štandardným spôsobom, akým je ELISA s použitím polypeptidu ako antigénu. Štandardnými spôsobmi sa potom pripraví imunoglobulínová frakcia.

Imunogenita IL-4 sa zvýši kombináciou s jedným z mnohých pomocných činidiel a/alel?o konverziou na väčšiu formu pred imunizáciou, t.j. zosieťovaním štandardnými spôsobmi.

Sérum, ktoré sa pripraví z takto imunizovaných zvierat, sa môže používať priamo. IgG frakcia sa môže od séra oddeliť tiež štandardnými spôsobmi, ako napríklad plazmaforézou alebo adsorpčnou chromatografiou s použitím IgG špecifických adsorbentov, akým je imobi1izovaný proteín A.

Monoklonálne protilátky, ktoré sú výhodné na použitie podľa tohto vynálezu, sa môžu pripravovať štandardnými spôsobmi, napr. tak, ako to popisujú Kohler a kol.: [Náture 256, 495 (1975); Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976)]. Na prípravu somatických buniek, ktoré vylučujú protilátku, sa zviera imonizuje v podstate tak, ako je to vyššie uvedené. Tieto bunky sa potom z imunizovaného zvieraťa odoberú pre spojenie s bunkami myelómu.

Somatické bunky, ktoré majú schopnosť produkovať protilátky, zvlášť B bunky, sú vhodné na spojenie s líniou buniek myelómu. Tieto somatické bunky sa môžu odvodzovať od lymfatických uzlín, sleziny a perfiérnej krvi primárne imunizovaných zvierat. Často sa používajú bunky sleziny krýs, najmä preto, že tieto bunky produkujú relatívne vysoké percento stabilných spojení s myšími myelomovými líniami. Namiesto nich by však bolo možné používať ľudské, myšie, zajačie, ovčie, kozie alebo iné bunky.

Na použitie v postupoch produkujúcich hybridomové spojenia boli vyvinuté špecializované myelómové bunkové línie z lymfatických nádorov [Kohler a Milstein : Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976); Shulman a kol.: Náture 276, 269 (1978); Volk a kol.: J. Virol. 42, 220 (1982)]. Spôsoby generovania hybridov buniek sleziny alebo lymfatických žliaz produkujúcich protilátky a myelómových buniek zvyčajne zahrňujú zmiešanie somatických buniek s myelómovými bunkami v pomere 10 : 1 (aj keď tento pomer môže byť od 20 : 1 do 1:1) v prítomnosti činidla alebo činidiel (chemických, vírusových alebo elektrických), ktoré podporujú spojenie bunkových membrán. Spôsoby spojania sú popísané Kohlerom a Milsteinom : viď vyššie, Gefterom a kol.: Somatic Celí Genet. 3, 231 (1977), tiež Volkom a kol.: J. Virol. 42, 220 (1982). Činidlom podporujúcim spájanie, ktoré bolo použité pôvodcami vynálezu, bol vírus Sendai a polyetylénglykol (PEG).

Pretože postupy spojenia produkujú živé hybridy vo veľmi nízkych frekvenciách (napr. ak sa ako zdroj somatických buniek použije slezina, získa sa jeden hybrid na zhruba každých 1 x 10⁵ buniek sleziny), je podstatné mať prostriedky na oddelenie spájaných bunkových hybridov od ostatných nespojených buniek, zvlášť nespojených myelómových buniek. Nutné sú tiež prostriedky na detegovanie požadovaných hybridomov produkujúcich protilátky z iných výsledných spojených bunkových hybridov.

Oddelenie spojovaných bunkových hybridov sa zvyčajne uskutočňuje tak, že sa bunky kultivujú v médiu, ktoré podporuje rast hybridomov, ale bráni rastu nespojovaných myelómových buniek, ktoré by sa normálne delili do nekonečna. Somatické bunky použité na spojenie si neudržia dlhodobú životaschopnosť v in vitro kultúre a nepredstavujú teda žiadny problém. Môžu sa používať napríklad myelómové bunky, ktorým chýba hypoxantin-fosforibozyltransferáza (HPRT-negatívne). Výber z týchto buniek sa uskutočňuje v hypoxantin-aminopterin-tymidinovom (HAT) médiu, v ktorom spojované bunkové hybridy prežívajú vďaka HPRT-pozitívnemu genotypu buniek sleziny. Je možné tiež použiť myelómové bunky s rôznymi genetickými deficitmi (citlivosť na liečivá a pod.), ktoré je možné vybrať podľa média podporujúceho rast genotypicky príslušných hybridov.

Na selektívne kultivovanie spojovaných bunkových hybridov je potrebný čas niekoľkých týždňov. Na začiatku tejto doby je nutné identifikovať tie hybridy, ktoré produkujú požadovaný protilátky, takže sa môžu následne klonovať a množiť. Obecne produkuje požadovanú protilátku asi 10 % získaných hybridov, i keď nie je zriedkavé, že toto množstvo je od 1 do 30 %.

Detekcia hybridov produkujúcich protilátky sa môže uskutočňovať akýmkoľvek z nie.koľkých štandardných spôsobov testovania, vrátane testu ELISA a rádioimunoanalytických spôsobov, ktoré boli popísané v literatúre (viď napr. Kennet a kol. (red.): Monoclonal Antibodies and Hybridomas : A New Dimension in Biological Analyses, str. 376 až 384, Plénum Press, New York 1980).

Akonáhle sa raz požadované spojené bunkové hybridy vyberú a klonujú na jednotlivé bunkové línie produkujúce protilátku, každá bunková línia sa môže množiť jedným zo štandardných spôsobov. HistokompatibiInému zvieraťu sa môže injekčné podať suspenzia hybridomových buniek. V tomto zvierati sa potom vyvinú nádory, ktoré vylučujú špecifickú monoklonálnu protilátku produkovanú spojeným bunkovým hybridom. Telové kvapaliny zvieraťa, akým je sérum alebo kvapalina z ascitov, sa odoberú dutou ihlou. Získajú sa tak monoklonálne protilátky vo vysokej koncentrácii. Jednotlivé bunkové línie sa môžu množiť tiež in vitro v laboratórnych kultivačných nádobách. Kultivačné médium, ktoré obsahuje vysokú koncentráciu jednotlivej špecifickej monoklonálnej protilátky sa izoluje dekantáciou, filtráciou alebo odstreďovaním a následne sa vyčistí.

Akonáhle sa raz získa z hybridu, ktorý produkuje požadovanú monoklonálnu protilátku, môžu sa na prípravu interšpecifických monoklonálnych protilátok použiť spôsoby, v ktorých sa väzbová oblasť jedného druhu kombinuje s neväzbovou oblasťou protilátky iného druhu [Liu a kol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3439 (1987)]. Napríklad CDR z monoklonálnej protilátky hlodavca sa naočkuje na kostru ľudskej protilátky. Tým sa protilátka hlodavca poľudští [Riechmann a kol.: Náture 332, 323 (1988)]. Podrobnejšie, CDR sa môže naočkovať na premennú oblasť ľudskej protilátky s alebo bez ľudských stabilných oblastí. Takýto spôsob bol použitý napr. na poľudštenie myší monoklonálnou protilátkou na p55 (Tac) podjednotkou receptoru ľudského interleukínu-2 [Queen a kol.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989)].

Ľudské monoklonálne protilátky sa môžu pripravovať tiež s použitím IL-4 alebo IL-10 a spôsobov, ktoré sú popísané Banchereauom a kol.: Science 251, 70 (1991).

Tento vynález zahrňuje tiež fragmenty viažúce protilátku, akým je Fab, F(ab')ž, Fv, atď. Použitie a generácia fragmentov protilátok je dobre známa, napr. Fab fragmentov [Tijssen : Practice and Theory of Enzýme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam 1985)]3, Fv fragmentov [Hochman a kol.: Biochemistry 12, 1130 (1973); Sharon a kol.: Biochemistry .15, 1591 (1976); Ehrlich a kol.: US patent č. 4 355 023 ] a polovice molekuly protilátky (Auditore-Hargreaves, US patent č. 4 470 925).

Protilátky a fragmenty protilátok používané podľa tohto vynálezu sa môžu s výhodou viazať na IL-4 alebo IL-10 a.budú tak neutralizovať biologickú aktivitu IL-4 alebo IL-10, proti ktorým boli pripravené.

V ďalšej časti popisu bude popísaná inhibícia proliferácie neoplastických buniek závislých od IL-2.

Ako je uvedené nižšie v príkladoch, ľudský a vírusový IL-10 majú priamy vplyv na ľudské T bunky. Bolo zistené, že všetky proliferačné odpovede ľudských ThO-, Thl- a Th2- podobných buniek sú inhibované IL-10 vtedy, ak sa použijú L bunky transfektované

FcrRII (CD32) v kombinácii buď s anti-CD3 monoklonálnymi protilátkami alebo mitogénnym párom anti-CD2 monoklonálnych protilátok. Äntigénovo špecifické proliferačné odpovede klonov ľudských T buniek boli inhibované IL-10, ak sa ako APC použili myšie L bunky transfektované relevantnou triedou II MHC molekúl. IL-10 neovplyvňuje expresiu skupiny II MHC v tomto systéme, pretože konštitutívna expresia transfektovaných génov triedy II MHC je pod kontrolou promotora SV40.

i

Inhibičné účinky IL-10 primárne pochádzajú z priameho vplyvu IL-10 na klony T buniek inhibície produkcie IL-2 na úrovni mRNA. Inhibičné účinky boli špecifické pre IL-2, pretože IL-10 neovplyvňuje produkciu IFN-lf, IL-4, IL-5 a GM-CSF. Interakcia IL-10 s IL-10 receptorom zrejme vyvoláva signálnu cestu, ktorá špecificky inhibuje syntézu IL-2.

Na preukázanie účinnosti prostriedku podľa tohto vynálezu sa môžu použiť i iné testy. Napríklad sa môžu použiť modely xenoimplantátov nahých myší. Tieto modely boli použité na testovanie rozličných terapeutických činidiel [viď : Howard a kol.: Cancer Res. 51, 3274 (1991) a McLemore a kol.: Cancer Res. 47, 5132 (1987)].

Táto proliferácia buniek môže súvisieť s leukémiou, akou je B bunková CLL. Cicavcami, ktorí sú liečení spôsobom podľa tohto vynálezu, sú výhodne ľudia, ktorí sú postihnutí proliferáciou neoplastických buniek závislých od IL-2.

Spôsob inhibovania proliferácie neoplastických buniek závislých od IL-2 podľa tohto vynálezu sa vyznačuje tým, že sa cicavcovi, výhodne človeku, ktorý trpí na proliferáciu neoplastických buniek, podáva terapeuticky efektívna dávka druhého biologicky efektívneho činidla.

Farmaceutické prostriedky obsahujúce IL-10 a fyziologicky prijateľný nosič sa typicky podávajú intravenózne. IL-10 môže byť tiež obsiahnutý v tobolkách v lipozóme.

Pojem proliferácia neoplastických buniek závislých od IL-2 tak, ako sa tu používa, znamená akýkoľvek nový alebo abnormálny rast tkaniva, ktorý je nekontrolovateľný, progresívny a kontinuálna proi1iferácia závisí od IL-2. Rast môže byť buď benigný alebo maligný. Maligný rast je typicky charakterizovaný vyšším stupňom anaplazie (dediferenciácie) v neoplastických bunkách. Neoplastické bunky závislé od IL-2 sú typicky odvodené od lymfoidných alebo myeloidných línií.

t

IL-2 je produkovaný T bunkami. Má viac aktivít na rôzne typy buniek, vrátane T buniek, NK buniek a B buniek. Bolo dokázané, že IL-2 pôsobí ako rastový faktor T buniek a zvyšuje produkciu cytokinov T bunkami, ak sú stimulované v prítomnosti IL-2. IL-2 aktivuje bunky prírodného zabíjača (NK) na zabíjanie cieľových buniek MHC nešpecifickým spôsobom. IL-2 je tiež obsiahnutý pri expanzii buniek obmedzených vo voľbe, čím zvyšuje produkciu protilátok týmito bunkami.

Vzhľadom na tieto aktivity IL-2 by mohla byť v niektorých prípadoch ochorenia dôležitá inhibícia produkcie IL-2 spôsobená IL-10. Tá by mohla slúžiť napríklad ako prostriedok na zníženie IL-2 riadenej proliferácie T buniek v situáciách, kedy proliferácia a rast T buniek nie sú žiadúce, ako je to v prípade autoimunných ochorení, napr. pri autoimúnnej tyroiditíde, diabetes závislej od inzulínu, pri reumatickej artritíde, systémovej lupus erytematosus a pri skleróze multiplex.

Schopnosť IL-10 znižovať IL-2 riadenú expanziu T buniek má tiež potenciálne klinické využitie pri liečení hostiteľskej choroby pri akútnom zlomení versus a pri chronických zápalových ochoreniach, akými sú zápalové črevné ochorenia a sarkoidná a pľúcna fibróza. Naviac, inhibovaním IL-2 riadená proliferácia alergénových špecifických T buniek, ktoré sú silnými producentmi IL-4 a IL-5, sa IL-10 môže použiť na liečenie alergických ochorení, akými sú astma a atopická dermatitída.

Medzi ochorenia zahrňujúce neoplastický rast, ktoré môžu byť liečené farmaceutickými prostriedkami podľa tohto vynálezu, patrí leukémia, o ktorej je známe, že závisí od IL-2, ako je B bunková CLL a ATL. Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu sú vhodné na použitie v ^rôznych systémoch pre podávanie liečiv. Pre stručný prehľad týchto spôsobov podávania liečiv viď Langer : Science 249, 1527 (1990). Spôsoby prípravy zlúčenín, ktoré sú schopné na podávanie, sú odborníkom známe alebo zrejmé a sú podrobnejšie popísané napríklad v Remington's Pharmaceutical Science, 17. vydanie, Mack Publishing Company, Easton, Pa (1985). ,

IL-10, používaný podľa vynálezu, sa môže pripravovať ako prostriedok vo farmaceutický prijateľnom médiu, napríklad v soľnom roztoku, fosforečňanom pufrovanom soľnom roztoku (PBS), v Ringerovom roztoku, v soľnom roztoku s dextrózou, v Hankovom roztoku a v glukóze..Prostriedok môže obsahovať farmaceutický prijateľné pomocné činidlá, ako je to potrebné pre približne fyziologické podmienky, akými sú pufrovacie činidlá, činidlá upravujúce tonicitu, zmáčacie činidlá, detergentné činidlá a pod. Medzi prísady patria tiež ďalšie aktívne zložky, napr. baktericidné činidlá alebo stabilizátory. Množstvo podávané pacientovi bude závisieť od toho, čo sa podáva, od účelu podávania, ako je profylaxia alebo liečba, od stavu hostiteľa, od spôsobu podávania a od podobných faktorov.

Farmaceutické prostriedky sú typicky určené na transdermálne alebo parenterálne podávanie, napr. intravenózne, subkutánne alebo intramuskulárne. Žiadúce sú tiež formy pre orálne podávanie, ktoré sa môžu získať modifikáciou prostriedku tak, aby prešiel prostredím žalúdka. Tieto prostriedky sa môžu používať na profylaxiu a/alebo liečenie a s výhodou sa podávajú intravenózne. Tento vynález popisuje tiež prostriedky, ktoré obsahujú IL-10 polypeptid rozpustený alebo suspendovaný v prijateľnom nosiči, s výhodou vo vodnom nosiči. Tieto prostriedky môžu byť sterilizované konvenčnými spôsobmi sterilizácie, alebo sa môžu sterilné sfiltrovať.

Výsledné vodné roztoky sa môžu zabaliť na používanie ako ta ké alebo v lyofilizovanej forme. Lyofi 1izované prípravky sa pred podávaním spoja so sterilným vodným nosičom. IL-10 sa môže podávať tiež s druhým biologicky aktívnym činidlom, akým je štandardné chemoteijapeutické činidlo. Medzi takéto činidla patria, ale nie sú nimi obmedzené, vincristin, daunorubicin, L-asparagináza, mitoxantron a amsakrin.

Pri terapeutickej aplikácii sa farmaceutické prostriedky podávajú pacientovi v množstve, ktoré je dostatočné, na inhibovanie proliferácie neoplastických buniek závislých od IL-2. Množstvo, ktoré je potrebné na dosiahnutie požadovaného efektu, sa definuje ako terapeuticky efektívne množstvo. Terapeuticky efektívna dávka IL-10 sa bude meniť podľa, napríklad, príslušného použitia, na ktoré je liečenie určené, podľa spôsobu podávania, podľa zdravia a stavu pacienta a podľa posudku ošetrujúceho lekára. Napríklad dávka na kontinuálnu infúziu bude v rozmedzí od 500 Aig do 800 zig na deň pre pacienta s hmotnosťou 70 kg, s výhodou medzi 10 jaq a 300 ug. Typickou dávkou je dávka medzi 700 Aig/kg/deň a 16 Aig/kg/deň.

Koncentrácia IL-10 vo farmaceutickom prostriedku môže byť rôzna, t.j. od 10 wg do asi 5 mg/ml, s výhodou medzi 100 /ug až 2 mg na ml. Koncentrácia sa zvyčajne vyberie primárne podľa objemu kvapaliny, viskozity, atď., v súlade s príslušne zvoleným spôsobom podávania. Tak typický farmaceutický prostriedok na intravenóznu infúziu by mal obsahovať 250 ml soľného roztoku s dextrózou a 2,5 mg IL-10.

Pre pevné prostriedky sa môžu použiť konvenčné netoxické pevné nosiče, medzi ktoré patria napríklad nasledujúce látky s čistotou pre farmaceutické prostriedky : manitol, laktóza, škrob, stearát horečnatý, sodná soľ sacharínu, talok, celulóza, glukóza, sacharóza, uhličitan horecnaty a vyrobí framaceuticky prijateľný normálne používaných riedidiel, zvyčajne 10 až 95 % hmotn. akt IL-10 podľa vynálezu, s výhodou 2 podobne. Na orálne podávame sa netoxický prostriedok pridaním akými sú horeuvedené nosiče a ívnej zložky, t.j. polypeptidu 5 až 75 % hmotn.

Na podávanie vo forme aerosólu sa IL-10 s výhodou dodáva v jemne rozomletej forme spoločne s povrchovo aktívnym činidlom a hnacou látkou. Typický obsah IL-10 je 0,01 až 20 % hmotn., výhodne 1 až₄10 hmotn. Povrchovo aktívne činidlo musí však byť netoxické a s výhodou rozpustné v hnacej látke. Reprezentatívnymi príkladmi týchto činidiel sú estery alebo čiastočné estery mastných kyselín so 6 až 22 atómami uhlíka, ako je ester kyseliny kaprovej, oktánovej, laurovej, palmitovej, stearovej, linolovej, linolénovej, olestearovej a olejovej s alifatickým pplyhydroxyalkoholom alebo jeho cyklickým anhydridom, ako je napríklad etylénglykol, glycerol, erytritol, arbitol, manitol, sorbitol, anhydridy hexitolu odvodené od sorbitolu a polyoxyetylénové a polyoxypropylénové deriváty týchto esterov. Môžu sa používať zmiešané estery, ako sú zmesné alebo prírodné glyceridy.

Povrchovo aktívne činidlo môže predstavovať 0,1 až 20 % hmotn. z prostriedku, výhodne 0,25 až 5 % hmotn. Doplnenie prostriedku do príslušného množstva sa obvykle uskutoční hnacou látkou. Skvapalnenými hnacími látkami sú obyčajne plyny s teplotou miestnosti, ktoré sú skondenzované pod tlakom. Vhodnými kvapalnými hnacími látkami sú nižšie alkány s až 5 atómami uhlíka, ako je bután a propán, výhodne sú to fluorované a fluorchlorované alkány. Môžu sa používať tiež zmesi horeuvedených látok. Pri výrobe aerosólu sa nádoba s vhodným ventilom naplní príslušnou hnacou látkou, ktorá obsahuje jemne rozomletý peptid alebo peptidy a povrchovo aktívne činidlo. Tieto zložky sa potom udržujú pod zvýšeným tlakom, pokiaľ sa neuvoľnia ventilom.

Pre zvýšenie polčasu séra sa IL-10 môže uzavrieť do toboliek vložených do lumenu lipozómov, pripravených ako koloidná látka. Na predĺženie životnosti peptidov sa môžu použiť i iné konvenčné spôsoby. Tak v niektorých prípadoch sa IL-10 môže uzavrieť do tobolky v lipozóme. Na prípravu lipozómov sú známe rôzne spôsoby, ako je to popísané napr. Szokom a kol.: nn. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 467 (1980) a v US patentoch č. 4 235 871, 4 501 728 a 4 837 028 .

Po príprave sa veľkosť lipozómov môže upraviť tak, aby sa získalo požadované rozmedzie veľkosti a relatívne úzka distribúcia veľkosti lipozómov. Jeden z nich je popísaný v US patente č. 4 737 323. ,

I pri najúčinnejších spôsoboch prípravy toboliek môže pôvodná suspenzia lipozómov obsahovať až 50 alebo viac % hmotn. liečiva vo voľnej forme (t.j. vo forme neuzavretej do tobolky). Odstránenie neuzavretej zlúčeniny zo suspenzie ϋροζόφον je možné urobiť niekoľkými spôsobmi. Podľa jedného z nich sa lipozómy v suspenzii peletujú odstreďovaním pri vysokej rýchlosti. V supernatante tak ostane voľná zlúčenina a veľmi málo lipozómov. Podľa iného spôsobu sa suspenzia skoncentruje ultrafiltráciou, potom sa skoncentrované lipozómy resuspendujú v ďalšom médiu. Na oddelenie veľkých lipozómových častíc od rozpustených molekúl sa môže použiť tiež gélová filtrácia.

Na horeuvedené liečenie pre použitie ako intravenózne podanie sa suspenzia lipozómov upraví na žiadanú koncentráciu. Táto úprava zahrňuje resuspendovanie lipozómov vo vhodnom objekte média pre injekcie, lipozómy sa skoncentrujú, napríklad odstreďovaním alebo ultrafiltráciou alebo zahustením suspenzie. Suspenzia sa potom sterilizuje filtráciou, ako je to vyššie uvedené. Lipozómy obsahujúce peptidy podľa vynálezu sa môžu podávať parenterálne, ako je to už vyššie uvedené.

Zvýšená produkcia IFN-i*' : Spôsob podľa tohto vynálezu je zvlášť vhodný vtedy, ak pacient má infekčnú chorobu, pri ktorej pacientov imunitný systém inhibuje produkciu IFN-τ vďaka produkcii IL-4 a IL-10. Medzi reprezentatívne ochorenia tohto typu patrí viscerálna leishmanióza, lepra s infiltrátmi a pliesňové infekcie. Medzi pliesňové infekcie patria rody húb vybraté zo skupiny pozostávajúcej z : Candida, Paracoccidioidomycosis, Blastomyces a Cryptospiroidium.

Viacerým infekčným organizmom vyhovujú, buď priamo alebo nepriamo, nízke hladiny IFN-Γ· Tieto infekcie sú často chronické a je pre nich typická nerovnováha Th2 a Thl odpovedí na infekčné činidlo. Výsledkom tejto nerovnováhy je inhibícia produkcie IFN-!f bunkami Thl vďaka produkcii IL-4 a IL-10 bunkami Th2.

Protilátky použité v tomto vynáleze sú pre pacienta s výhodou autologné. Vhodné sú tiež nevlastné protilátky odvodené od buniek rovnakého druhu. Môžu sa používať protilátky z rôznych druhov, ale musia sa používať prostriedky na kontrolu možných nepriaznivých imunitných reakcií (HAMA). Napr. poľudštené krysie protilátky, rovnako ako rôzne väzbové fragmenty, môžu minimalizovať imunitnú odpoveď u ľudí. Výhodné tiež budú také protilátky, ktorých väzbové konštanty sú približne rovnaké alebo prevyšujú afinitu IL-4 a IL-10 k ich prírodným receptorom.

Výhodné sú také protilátky, ich odpovedajúce receptory viac cytokiny. Porovnanie väzbosti spôsobmi, pričom základná technológia ktoré majú väzbové konštanty na ako

100-krát menšie ako tieto sa uskutočňuje štandardnými je popísaná v kapitole 25, diel I : Immunochemistry, red. D.M. Weir, 4. vydanie, 1986, Blackwell Scientific Publ. 25.1 - 25.30. Je možné použiť tiež test na stanovenie molárneho nadbytku protilátky, ktorá neutralizuje definované množstvo IL-4 alebo IL-10 v štandardnom in vitro biologickom teste. Príklady takýchto testov je možné nájsť v Mosmannovi a kol.: J. Immunol. Methods 116, 151 (1989) (IL-4) a Fiorentinovi a kol.: J. Exp. Med. 170, 2081 (1989). Rozumným množstvom protilátok je také množstvo, ktoré neutralizuje dané množstvo IL-4 alebo IL-10 v 10- až 1000-násobnom nadbytku.

Pojem spoločne podávané tak, ako sa tu používa, znamená, že protilátky proti 11-4 a IL-10 sa podávajú časovo tak blízko seba, že u pacienta sú prítomné súčasne. Poradie podávania nie je rozhodujúce. Protilátky sa môžu podávať súčasne alebo oddelene, môžu byť vopred zmiešané alebo sa môžu podávať oddelene.

Prostriedky na podávanie sú typicky parenterálne, s výhodou intravenózne. Protilátky sa môžu pacientovi podávať infúziou štandardnými intravenóznymi spôsobmi. Protilátky sa najskôr sus pendujú v sterilnom, fyziologicky zlúčiteľnom médiu, ako je fosforečnanový soľný pufor. S protilátkami sa môžu zniešať farmaceutický prijateľné riedidlá, akým je lecitín, glukóza, dextróza a antibiotiká.·

Množstvo protilátky, ktoré sa podáva súčasne, sa pohybuje v rozmedzí 1 až 10 mg každej protilátky na kg telesnej hmotnosti. Je žiadúce, aby protilátka bola podávaná v takom množstve, ktoré poskytuje cirkulačnú hladinu 1 až 150 ^ig/ml, výhodný 10 až 100 ^ig/ml séra pre každú protilátku. Protilátky majú typický polčas 2 až 7 dní. Podanie je potrebné, zopakovať vtedy, ak hladina ktorejkoľvek protilátky klesne pod požadované množstvo. Množstvo protilátky vo vzorkách séra sa môže merať konvenčnými testami imunity, s výhodou testom ELISA.

Aj keď sú na ilustráciu príkladov uskutočnenia podľa tohto vynálezu použité monoklonálne protilátky proti IL-4 a IL-10, je možné použiť tiež iných antagonistov, napríklad protilátok, ktoré sa špecificky viažu na IL-4 alebo IL-10 receptory a tým inhibujú naviazanie cytokinu. Podobne sa môžu použiť rozpustné formy IL-4 alebo IL-10 receptora, ktorému chýbajú transmembránové domény. Nakoniec, môžu sa použiť antagonisti mutovaných foriem IL-4 a IL-10, ktoré sa silno viažu na odpovedajúce receptory, ale ktorým v podstate chýba biologická aktivita. Jeden z takýchto antagonistov IL-4 mutantu, v ktorom je zvyšok tyrozínu v polohe 124 prírodného ľudského IL-4 nahradený zvyškom kyseliny aspartovej, bol popísaný Krusom a kol.: EMBO J. 11. 3237 (1992).

Antagonisti sa s výhodu súčasne podávajú intravenózne ako sterilná vodná zmes. Táto zmes môže obsahovať akékoľvek farmaceutický prijateľné riedidlo, ako napr. sterilné pufry, soľný roztok, antibiotiká a pod.

Liečenie sa ukončí vtedy, ak je infekcia pod kontrolou, čo je možné zistiť podľa klinickej odpovede pacienta. Spoločne s týmto vynálezom je možné použiť i liečenie bežnými antibiotikami .

Zápalové črevné ochorenie : Pojem zápalové črevné ochorenie alebo IBD sa tu používa pre vredovitú kolitídu a Crohnovu chorobu. Podávanie IL-10 pri liečení IBD je s výhodou parenterálne,₄ ako napríklad intravaskulárne. Najvýhodnejším podávaním je intravenózne podávanie a liečeným cicavcom je človek.

Množstvo podávaného IL-10 je obyčajne v rozmedzí od 1 yug do 100 mg na kg telesnej hmotnosti. Najvýhodnejšou podávanou dávkou je množstvo od 50 pg do 100 ug na kg telesnej hmotnosti.

IL-10 sa môže podávať samotný alebo spoločne s jedným alebo viacerými ďalšími terapeutickými činidlami. Medzi príklady takýchto činidiel, ktoré sú vhodné na reguláciu epizodného zápalu črevného tkaniva, patria, kortikosteroidy, sulfasalazín, deriváty sulfasalazínu, imunosupresívne liečivá, ako je cyklosporín A, merkaptopurin, azatioprin a ďalšie cytokiny. Spoločné podávanie môže byť postupné alebo súbežné. Spoločné podávanie zvyčajne znamená, že viac (dve alebo viac) liečiv je u príjemcu prítomné istý špecifický čas. Platí, že ak sa druhé činidlo podáva počas polčasu prvého činidla, potom sa toto podávanie považuje za súčasné podávanie oboch činidiel.

Vynález popisuje aj spôsob predpovedania predispozície cicavca na vývoj zápalového stavu, ktoré sa vyznačuje suboptimálnymi dávkami IL-10 a ktoré obsahuje analyzovanie vzorky odobratej cicavcovi na hladinu IL-10. Suboptimálne hladiny zahrňujú nemerateľné množstvá. Merateľná hladina sa môže porovnať s normálnou hladinou IL-10. Komerčne dostupnými diagnostickými zostavami sa môžu testovať tiež mediátory zápalu, ako je IL-1, IL-6, TNF a IFN-Γ.

Nadprodukcia jedného z týchto mediátorov môže naznačovať, že sú dostupné nedostatočné množstvá IL-10. Zdrojom vzorky je s výhodou krv. Tento spôsob umožňuje predpovedať predispizíciu mnohých zápalových stavov, ako je IBD alebo anémia, artritída, dermatitída alebo iné príznaky súvisiace s IBD.

Podľa vynálezu sa získajú tiež farmaceutické prostriedky. Prostriedok na podávanie cicavcovi, ktorý má IBD, ako je vredovitá kolitída alebo Crohnova choroba, obsahuje také množstvo IL-10, ktoré, je efektívne na zlepšenie aspoň jedného príznaku alebo znaku IBD u cicavca, a hore popísaný farmaceutický nosič.

Pojem príznak (symptóm) znamená akýkoľvek subjektívny prejav choroby alebo pacientovho stavu. Patria sem príznaky vnímané pacientom. Medzi príklady príznakov IBD paijrí diarea, abdominálna bolesť, horúčka, melena, hematochézia a strata hmotnosti. Pojem znak sa obecne týka akéhokoľvek objektívneho dôkazu choroby alebo stavu, ktoré sa zistí laboratórnym vyhodnotením alebo inými testami, akými je ultrazvuková štúdia alebo rádiografický test.

Medzi niektoré príklady znakov IBD patria abdominálne ťažkosti, glositída, aftózny vred, análna fisura, perianálna fisura, anémia, malá absorpcia a nedostatok železa. Príležitostne sa znaky prekrývajú s príznakmi. Napríklad pacient si sťažuje na krvavú stolicu (príznak) a laboratórny test vzorky stolice je pozitívny na krv (znak).

Farmaceutické prostriedky podľa uskutočnenia tohto vynálezu sú výhodne vo forme, ktorá je vhodná na parenterálne podávanie. Efektívnym množstvom je s výhodou jednotková dávka v ampulke. Efektívne množstvo má byť prítomné tiež v liekovke obsahujúcej viac dáviek, alebo by sa malo ponúkať v nejakej forme. Medzi príklady farmaceutický prijateľných prísad patria riedidlá, akými sú vodné riedidlá, pufry, protimikrobiálne činidlá a ochranné činidlá.

Na stanovenie IL-10 aktivity sa môžu používať biologické testy cytokinov. Biologický test ľudského lymfotoxínu je popísaný Aggarwalom: Methods in Enzymology 116, 441 (1985) a Matthewsom a kol. (red. Clemens a kol.): Cytokines and Interferons; A Practical Approach, str. 221 až 225 (IRL Press, Washington, D.C. 1987). Ľudský IL-2 a GM-CSF môžu byť testované na faktor závis kých bunkových línií CTLL-2 a KG-1, ktoré sú dostupné od ATCC pod označením TIB 214 a CCL 246. Ľudský IL-3 je možné testovať na jeho schopnosť stimulovať tvorbu rôznych kolónií hematopoéznych buniek v kultúrach mäkkého agaru, napr. tak, ako to popisuje Metclaf: The Hemopoietic Colony Stimulating Factors (Elsevier, Amsterdam 1984). INF-Z môže byť kvantitatívne vyhodnocovaný antivírovými testami, napr. Meager v Clemensovi akol. (red.) na str. 129 až 147. Monitorovanie týchto cytokinov dáva užitočné informácie o tom, kedy bolo podané efektívne množstvo IL-10. Môžu sa používať tiež imunochemické testy, ako je ELISA.

IL-10 sa môže podávať vo vodných riedidlách, ako je voda, soľný roztok alebo pufrované riedidlá s pridaním alebo bez pridania rôznych prísad a/alebo riedidiel. Môže sa tiež pripraviť suspenzia, napríklad zinková suspenzia, ktorá obsahuje IL-10. Táto suspenzia je vhodná na subskutánne (sc) alebo intramuskulárne (im) injekcie. Množstvo IL-10 a prísady sa môže pohybovať v širokom rozpätí, pokiaľ sú obidve prítomné v efektívnych množstvách. Množstvo IL-10 by malo byť v rozmedzí od 1 /ug do 100 /ug.

Celkovú dennú dávku predstavuje množstvo od 1 flíg do 100 mg na kilogram telesnej hmotnosti, výhodne v rozmedzí od 10 /ug do 1000 /ug na kilogram telesnej hmotnosti, výhodnejšie v rozmedzí od 50 /ug do 100 yug na kilogram telesnej hmotnosti. Dávky sa podávajú podľa takej schémy, ktorou sa dosahuje požadovaný terapeutický účinok a ktorá môže byť periodická alebo nepravidelná, môže trvať kratší alebo dlhší čas podľa povahy takýchto zápalov.

Prostriedky sa do tela môžu dostávať orálne alebo injekčné. Medzi prostriedky orálneho podávania patria zlúčeniny, ktoré chránia polypeptidy pred proteinázami a ktoré sa vyskytujú v gastrointestinálnom trakte. Injekcie sú obyčajne intramuskulárne, subkutánne, intradermálne alebo intravenózne. Podľa okolností sa môžu podávať tiež intraartikulárne injekcie alebo použiť iné možnosti podávania. Prostriedky obsahujúce IL-10 môžu tiež byť pacientovi implantované alebo môžu byť podané injekčné systémom podávania liečiv, viď napr. Urguhart a kol.: Ann. Rev. Pharmacol.

Toxicol. 24 , 199 (1984), Lewis (red.): Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plénum Press, New York, 1981) a US patenty č. 3 773 919 a 3 270 960.

Peptid sa s výhodou podáva parenterálne, s výhodou v jednotkovej dávkovej injektovateľnej forme. Príkladmi injektovateľnej formy sú roztoky, suspenzie a emulzie. Výhodnejšie sa efektívne množstvo IL-10 podáva intravenózne.

Pojem efektívne množstvo tak, ako je tu definované, znamená množstvo, ktoré je dostatočné na zmiernenie príznaku alebo znaku autoimunného stavu alebo nežiadúcej zápalovej alebo imunitnej odpovede. Medzi typických cicavčích hostiteľov patria myši, krysy, mačky, psi a primáti vrátane človeka. Efektívne množstvo pre príslušného pacienta závisí od faktorov, ako je stav liečeného, celkový zdravotný stav pacienta, forma a dávka podávania a prejav vedľajších účinkov.

Stanovenie príslušnej dávky sa určuje podľa parametrov, ktoré sú odborníkom známe. Obvykle dávkovanie začína množstvom menším ako je optimálna dávka a zvyšuje sa malými prírastkami, pokiaľ sa nedosiahne optimálny účinok, viď The Merck Manual § 269 Pharmacokinetics and Drug Administration. Dôležitými indikátormi dosiahnutia efektívnej dávky sú hladiny TNFa, IFN-K, IL-1 a IL-6. Výhodne sa používa IL-10 odvodený od cicavčích typov.

Typicky sa IL-10 podáva injekčné spoločne s farmaceutickým nosičom, akým je normálny soľný roztok, Ringerov roztok, roztok dextrózy a ďalšie vodné nosiče odborníkom známe. Môžu sa používať tiež príslušné nevodné nosiče. Príkladom sú netuhnúce oleje a etyloleát. Výhodným nosičom je 5 % (hmotn.) roztok dextrózy v soľnom roztoku. Často sa vyžaduje, aby v nosiči boli prítomné pomocné činidlá, akými sú pufry a ochranné činidlá alebo iné látky na zvýšenie izotonicity a chemickej stability.

Celková denná dávka sa môže podávať ako jediná injekcia alebo ako kontinuálna infúzia. Môže byť tiež rozdelená do niekoľ kých menších dávok pre bolus intravenózne podanie alebo podanie inou formou, akou je intramuskulárna injekcia. IL-10 sa výhodne podáva ako intravenózny bolus.

IL-10 sa môže podávať samotný alebo v kombinácii s inými terapeutickými činidlami. Príkladmi takýchto činidiel pri indikácii zápalu čriev sú kortikosteroidy, sulfasalazín, deriváty sulfasalazínu a vybraté cytotoxické liečivá, akým je cyklosporín A, merkaptopurín a azatioprin. Násobné liečenie sa uskutočňuje tak, že sa oddelene podajú infúzie alebo sa po sebe podajú injekcie. V niektorých prípadoch sa násobné liečenie uskutočňuje tak, že sa liečivá zmiešajú a podávajú sa súčasne infúziou alebo injekciou, napr. IL-10 spoločne s inými cytokínmi, steroidmi alebo terapeutickými reakčnými činidlami.

Je potrebné uviesť, že príznaky IBD môžu byť prípadné, takže sa efektívne liečenie môže dosiahnúť podaním malých dávok vo vhodných momentoch. Malé množstvá kontinuálneho podávania môžu zabezpečiť dlhé obdobie bezepizódneho zdravia pre postihnuté cieľové živočíchy.

Podávanie môže byť súčasné alebo postupné. Obecne pojem súčasné podávanie znamená, že obidva cytokiny sú prítomné v príjemcovi počas špecifického časového intervalu. Zvyčajne platí, že ak sa druhý cytokin podáva počas polčasu prvého cytokinu, sú obidva cytokiny podávané súčasne. Súčasné podávanie je s výhodou parenterálne, výhodnejšie intravenózne. Efektívne množstvo sa zvolí v rozmedzí od 15 /ug do 1500 /ig na kilogram telesnej hmotnosti cicavca.

V tejto časti popisu je popísaná inhibícia hypersenzitívnych reakcií neskorého typu. Toto uskutočnenie vynálezu popisuje in vivo spôsob inhibovania reakcie hypersenzitivity neskorého typu u cicavcov, ktorý zahrňuje podávanie efektívneho množstva IL-10 cicavcovi. Efektívne množstvo IL-4 sa cicavcovi môže podávať súčasne s IL-10, pričom cicavcom je obyčajne človek. Podávanie IL-4 a IL-10 môže byť súčasné alebo postupné, obyčajne parenterálne, výhodne intravaskulárne.

Vynález popisuje aj spôsob inhibovania bunkovej migrácie na miesto uápalxj v tele cicavca. Migrácia buniek sa týka vyrovnania alebo pritiahnutia bunkovej imunitnej odpovede cicavca, ktorá zahrňuje lymfocyty, monocyty a makrofágy na miesto zápalu. Vynález popisuje aj spôsob inhibície edému v tkanivách.

Horeuvedené spôsoby popisujú podávanie IL-4 a/^lebo IL-10, ktoré je parenterálne, ako napr. intravaskulárne, alebo ktoré je v blízkosti miesta zápalu. Efektívne množstvo IL-4 alebo IL-10 sa obyčajne zvolí z rozmedzia od 15 yug do 1500 yug na kilogram telesnej hmotnosti cicavca.

Vynález ďalej popisuje in vivo spôsob obmedzenia reakcie hypersenzitivity neskorého typu u cicavcov, ktorý spočíva v súčasnom podávaní efektívneho množstva IL-4 a IL-10 cicavcovi, pričom súčasné podávanie je parenterálne a efektívne množstvo je v rozmedzí od 15 /ug do 1500 /ug na kilogram telesnej hmotnosti cicavca. Výhodné množstvo je možné zvoliť z rozmedzia od 100 Aig do 1000 /ug.

Vynález popisuje zostavu na posilnenie IL-10 sprostredkovanej inhibície produkcie cytokinu T bunkami u cicavcov. Zostava obsahuje ampulku s jednotkovou dávkovou zmesou IL-4 a IL-10. Miesto ampulky sa môže použiť i iná nádoba, ako liekovka, plastový sáčok, sklenená skúmavka a podobné. Zmes IL-4 a IL-10 je výhodne vo forme vhodnej na· parenterálne podávanie. Jednotková dávka sa zvolí z rozmedzia od 15 /ug do 1500 /ug ako IL-4, tak i IL-10 na kilogram telesnej hmotnosti cicavca.

Vynález sa týka aj spoločného účinku IL-4 a IL-10 na aktivitu T-buniek. Tento vynález prvýkrát popisuje, že táto spolupráca bola identifikovaná špecificky na T-bunkách. Predchádzajúce údaje naznačujú účinky na makrofágy alebo monocyty a efektorovú úlohu makrofága. Aditívny účinok IL-4 a IL-10 na aktivitu T-buniek je prekvapujúci a podporuje ďalšie terapeutické použitia, zvlášť vzhľadom na bunkami sprostredkovanú imunitu. Nakoľko kombinácia IL-4 a IL-10 posilňuje IL-10 sprostredkovanú inhibíciu produkcie cytokinu T-buniek, tento vynález je vhodný vtedy, ak je potrebné regulovať odpoveď T-buniek, ktorá sa týka produkcie cytokinu.

Λ

Medzi príklady patrí hypersenzitivita neskorého typu, bunkou sprostredkovaný zápal a proliferácia a aktivácia T-buniek.

Napríklad autoimunitné ochorenie diabetes mellitus typu I sa vyznačuje tým, že ostrovčeky buniek sú infiltrované lymfocytmi, makrofágmi a bunkami plazmy. Potlačenie produkcie cytokinu T-bunkami môže zmierniť príznaky a deštrukciu ostrovčeka buniek u pacienta s diabetes. Tento vynález môže hrať úlohu aj pri liečení bunkami sprostredkovaných imunitných odpovediach pri transplantáciách a implantáciách orgánov.

Je známe, že pri odmietaní ľadvín hrá úlohu imunita sprostredkovaná bunkami. Cytokiny v oblasti transplantovanej ľadviny spôsobujú aktiváciu buniek, proliferáciu, agregáciu, fibrogenézu, inhibíciu rastu a cytotoxicitu. Vynález môže hrať priaznivú úlohu aj pri liečení GVDH. Tiež sarkoidóza, lymfoproliferačná porucha, súvisia s dôkazom odumierania DTH a aktivovaných T alebo pomocných buniek s následnou tvorbou granulómu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález môže byť objasnený nasledujúcimi neobmedzujúcimi príkladmi. Pokiaľ nie je stanovené inak, percentá uvedené pre pevné látky v zmesi sú percentami hmotnostnými vzhľadom k hmotnostným dielom, kvapalín v kvapalinách objemovými k objemovým dielom a v prípade pevných látok v kvapalinách hmotnostné k objemovým dielom.

Inhibícia proliferácie neoplastických buniek závislých od IL-2

Príklad 1

IL-10 inhibuje proliferáciu ľudských ThO, Thl a Th2 podobných klonov po aktivácii anti-CD3 monoklonálnymi protilátkami zosieťovanými na myších L bunkách transfektovaných CD32.

Bunky a bunkové línie

Používajú sa línie T-buniek CD2*, CD3*, CD4+ a CD8⁺. Klony HY-06, 827 a 837 boli už skôr popísané [Yssel a kol.: Eur. J. Immunol. .16, 1187 (1986) a Haanom a kol.: J. Exp. Me,d. 174. 583 (1991)]. Kloň T buniek 827 rozpoznáva toxín tetanu (TT) v kontexte HLA-DR3 a kloň T buniek HY-06 rozpoznáva peptid 2-12 z proteinu Mycobacterium leprae s molekulovou hmotnosťou 65 000. Äntigénová špecifickosť klonu T buniek 837 nie je známa.

Klony T buniek SP-B21 a SP-A3 boli získané z pacienta, ktorý mal silnú kombinovanú nedostatočnú imunitu (SCID) a ktorému boli úspešne transplantované fetálny týmus a pečeň [Roncarolo a kol.: J. Exp. Med. 168. 2139 (1988)]. Klony T buniek NP 12, NP 14 a NP 44 boli získané z PBMC atopického pacienta a proliferujú špecificky v odpovedi na peptid p89-117 molekuly Der p 1 hlavného alergénu roztoča v bytovom prachu [Yssel a kol.: J. Immmunol. 148, 738 (1992)]. Klony T buniek CR253, CR378, AP74 a ΆΡ75 boli izolované z PBMC pacienta, ktorý mal chronickú Lymskú artritídu a reagujú na homológ heat shock proteinu Borrelia gurgdorferi s molekulovou hmotnosťou 60 000 (HSP60) [Shanafelt a kol.: J. Immunol. 146, 3985 (1991)].

Tieto klony buniek boli priradené k T pomocným podradám na základe ich profilov produkcie lymfokinov (tabuľka 1). Klony T buniek (2.10⁵ buniek/ml) boli stimulované v dvojtýždenných intervaloch zmesou krvných buniek, ktorá pozostáva z 10⁶ ožiarených (4 000 rad) alogénnych periférnych krvných leukocytov (PBL) na ml, 10⁵ ožiarených (5 000 rad) buniek na ml B bunkových línií transformovaných vírusom Epstein-Bar (EBV-LCL) JY a 0,1 mg/ml vyčistených PHA (Welcome Diagnostics, beckenham, Kent, Anglicko) v 24 jamkách Linbro dosiek (Flow, Mc Lean, Va.), ako to bolo už skôr popísané [Spits a kol.: J. Immunol. 128, 95 (1982). Tri až štyri dni po každej restimulácii sa kultúry rozštepia a ďalej sa expandujú v médiu, ktoré obsahuje 20 jednotiek rIL-2 na ml. Všetky klonované línie T buniek a EBV-LCL boli kultivované v Ysselovom médiu (Ys₄sel a kol.: J. Immunol. Methods 72, 219 (1984) doplnenom 1 % ľudského AB* séra.

Myšie L bunky transfektované CD32 (FCfRII) (16.2CG7) boli pripravené podľa Peltza:

J. Immunol.

141, 1891 (1988). Táto citácia je cDNA kloň, tu zahrnutá ako odkaz. Stručne - bol použitý FcZRII

16.2, izolovaný z ľudskej monocytovej bunkovej línie mutanta U937 (viď Stuart a kol.: J. Exp. Med. 166, 1668 (1987)). Použitím štandardných spôsobov miestne špecifickej mutagenézy sa vytvorí mutant, ktorému chýba cytoplazmová doména, zavedením mutácií, ktoré menia dva lyzínové kodóny po prvej aminokyseline (arginíne) predpokladanej cytoplazmovej domény na stop kodóny.

Prechodná transfekcia myších L buniek sa uskutočňuje štandardnými spôsobmi.

Reakčné činidlá

Rekombinantný IL-10 sa exprimuje v E. coli. Vyčistí sa podľa spôsobu popísaného v spisoch: de Waal Malefyt a kol.: J. Exp. Med. 174, 915 (1991) a WO 91/00349, viď vyššie.

Proliferačné testy

Klonované T bunky sa používajú 10 až 12 dní po stimulácii kŕmnymi bunkami. V tomto štádiu boli klony T buniek malé a v odpočívajúcom stave. Klony T buniek (2.10⁴ buniek na jamku) boli inkubované L bunkami transfektovanými CD32 (2.10⁴ buniek na jamku) v prítomnosti anti-CD3 mAbs (SPV-T3L·) )1 /ug/ml) [Spits a kol.: Hybridoma 2, 423 (1983)] v 200 ýul miskách s plochým dnom (Falcon, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ). L bunky boli predinkubované s mAbs (1 jug/ml) 1 hod. v prítomnosti alebo bez prítomnosti IL-10 (100 jednotiek na ml) pred tým, ako sa pridajú

T bunky, a boli kultivované 72 hodín. Na L bunky sa potom pôsobí mitomycinom C (50 mg/ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) pri teplote 37° C po dobu 45 minút a následne pred použitím sa štyrikrát premypú. Bunky sa inkubujú 72 hodín pri teplote 37° C a s 5 % oxidu uhličitého sa na ne pôsobí 4 hodiny [³H]TdR a boli izolované tak, ako to popisujú Yssel a kol.: Eur. J. Immunol. 16, 1187 (1986). Tieto výsledky boli vyjadrené ako počet impulzov za minútu zahrnutého [³H]TdR a predstavujú strednú hodnotu troch kultivácií.

Účinky IL-10 na proliferáciu klonov T buniek sa neodlišujú zostavou produkovaných T bunkových lymfokinov. Klony T buniek 837, SP-B21 a 827 po aktivácii produkujú IL-2, IL-4 a IFN-Ϋ^- a sú teda považované za reprezentantov ľudských ThO klonov. HY-06, CR 253, CR 378, CR 380, AP .74 a AP 75 produkujú vysoké hladiny IFN-Γ a nezistiteľné alebo nízke množstvo IFN-f po aktivácii ich špecifickým antigénom. Kloň T buniek SP-A3 po aktivácii produkuje IL-2, IL-5, IFN-Γ a GM-CSF, ale nikdy nie IL-4.

Ako je uvedené v tabuľke 1, IL-10 po aktivácii inhibuje proliferáciu klonov T buniek 837, SP-B21, SP-A3, 827, HY-06, CR 253, CR 378, CR 380, AP 74, AP 75, NP 12 a NP 44. IL-10 nie je teda schopný inhibovať proliferáciu klonov T buniek patriacich ku všetkým T pomocným podskupinám. Obecne IL-10 inhibuje proliferáciu klonov T buniek pri podmienkach tohto testu na 20 až 50 %. Táto inhibícia je závislá od dávky a je špecifická, pretože je možné ju zvrátiť neutrálizovaním anti-Il-10 mAb 19F1.

Tabuľka 1

Vplyv IL-10 na proliferačnú odpovedí ľudských ThO, Thl a Th2 klonov po aktivácii anti-CD3 mAbs zosieťovaných na CD32 (Fc RII) transfektovaných L bunkách inkorporácia [³H]TdR] (počet impulzov za minútu.10³)

typ klonov	T buniek	kloň T buniek	kontrola	+IL-10 (100 j./ml)
T pomocné	0	837	69	51
		SP-B21	88	51
		827	5,5	,3,5
		SP-A3	28	12
T pomocné	1	HY-06	11	8
		CR253	12,8	10
		CR378	14,9	4,3
		. CR380	19,8	8,5
T pomocné	2	ΆΡ74	22	9
		AP75	38	33
		NP12	72	49
		N044	15,3	7

Myší IL-10, ktorý je špecifickou časticou, nemá žiadny vplyv na proliferáciu týchto klonov ľudských T buniek. To naznačuje, že IL-10 priamo pôsobí na klony T buniek a nie na CD32 transfektovanej myšiej L bunky použitej na skrížené naviazanie anti-CD3 mAbs . Tieto výsledky ukazujú, že IL-10 priamo inhibuje proliferáciu ľudských ThO, Thl a Th2 klonov po aktivácii TCR/CD3 komplexom anti-CD3 mAbs zosietovaných na L bunkách transfektovaných CD32.

Príklad 2

IL-10 inhibuje proliferáciu CD4⁺ klonvv T buniek nezávisle od ko-stimulačných signálov poskytovaných ICÄM-1, LFA-3 alebo B7

Aktiváciu klonov ľudských T buniek je možné upraviť interakciou prídavných molekúl na T bunkách s ich opačnými štruktúrami na antigén prezentujúcich bunkách (APC). Ukázalo sa, že interakcia medzi LF^-1 a ICAM1, CD2 a LFA3, CD28 a B7 alebo CTLA-4 a B7 dáva ko-stimulačné signály posilňujúce proliferáciu a efektorové funkcie T buniek. Na stanovenie, či IL-10 inhibuje proliferáciu T buniek ovplyvnením ko-stimulačnej funkcie týchto prídavných molekúl, boli vytvorené L bunky, ktoré exprimujú CD32 a ICAM1, LFA-3 alebo B7.

Vytvorenie pCD-SRa-LFA-3 HYG, pCDM8-ICAM-l HYG a pBJ-B7 HYG

LFA-3 cDNA bola získaná z Raji cDNA knižnice PCR amplifikáciou použitia LFA-3 špecifických primerov. Raji cDNA knižnica bola vytvorená v pCD-SRa vektore, ako to bolo popísané skôr [Matsui a kol.: Science 154. 1788 (1991)]. Na klonovanie transmembránovej formy LFA-3 boli použité nasledujúce primery :

sense 5'-GGCTGCAGCGACGAGCCATGGTTGCTGGGAGCGACGCG-3' (nt 780 až 745) .

Na vhodné subklonovanie amplifikovaných produktov bol LFA-3 sense primer narhnutý s Pst-I miestom a LFA-3 antisense primer s miestom Kpn-I. Amplifikácia sa uskutočňuje pri nasledujúcich podmienkach: 1 /ug plazmidovej DNA rozštiepenej pô^sobením Hind-III z Raji knižnice sa amplifikuje v 50 jul reakciu obsahujúcej po 25 moloch každého primeru, po 125 ml dGTP, dATP, dCTP a dTTP (Pharmacia, Uppsala, Švédsko), 50 nM KC1, lOnM tris-HCl, pH 8,3,

1,5 mM MgClž, 1 mg/ml želatíny a 5 jednotiek Tag polymerázy (IBI, New Haven, Kt.) .

Zmesi sa inkubujú v 20 cykloch (denaturácia 30 s, 94° C, anelácia 30 s, 55° C, predĺženie 60 s, 72° C) prístrojom Perkin-Elmer /Cetus DNA Thermal Cycler. Odoberie sa 5 ul podiel a podrobí sa druhej časti amplifikácie pri rovnakých podmienkach. Reakcia sa extrahuje chloroformom a nanesie sa na 1 % agarový gel. Amplifikovaný produkt s očakávanou veľkosťou 785 párov nukleotidov sa po rozdelení vyreže z gélu, izoluje sa adsorpciou na silikagéli pomocou zostavy Geneclea kit (Bio 101, La Jolla, Ka.), rozštiepi sa pôsobením Pst-1 a Kpn-1 a subklonuje sa v Bluescripte II KS(+) (Stratagene, La Jolla, Ka. ) .

Štandardnými spôsobmi sa izolujú mnohé klony obsahujúce LFA-3. Štyri klony sa sekvenujú dideoxy-terminačnou metódou s použitím zostavy na sekvenovanie Sequenase DNA sequencing kit (USA, Cleveland, Oh.). Všetky štyri klony sú na 100 % identické s publikovanou sekvenciou. Izoluje sa Pst-l-Kpn-1 fragment jedného z týchto klonov a subklonuje sa do pCD-SRa 296 expresívneho vektora Matsui a kol., viď vyššie.

pCDM8-ICAM-l [Blanchard a kol.: J. Immunol. 138, 2417 (1987)] bol darom Dr. Briana Seeda (Massachusetts Generál Hospital, Boston, Ma.). Amínocyklitol-fosfotransferázový gén, ktorý kóduje rezistenciu na hydromycín-B, bol umiestnený pod kontrolu promotora SV-40 a polyadenylačných signálov a štandardnými spôsobmi bol vložený do miest Sfi-I pCD-SRa-LFA-3 a pCDM8-ICAM-l. Získajú sa tak pCD-SRa-LFA-3 HYG a pCDM8-ICAM-l HYG. pB7-B7-HYG obsahuje ľudský B7 pod kontrolou SRd promotora, Makgoba a kol.: Náture 331, 86 (1988). Bol získaný darom od Dr. L. Laniera (DNAX Research Inštitúte).

L bunky, ktoré expresiou dávajú HLA-DR3 alebo CD32, boli transfektované pCD-SRd-LFA-3-HYG, pCDM8-ICAM-l-HYG alebo pBJ-B7-HYG lipofekciou (BRL, Gaithersburg, Md.) podľa postupu uvedeného výrobcom. Bunky boli štiepené 48 hodín po transfekcii. Pridané bolo médium, ktoré obs-ahuje 200 /ug/ml hydromycínu-B (Lilly, Indianopoli s, In.), a toto médium bolo vymieňané každé 3 dni.

Po 12 dňoch boli viditeľné jednotlivé kolónie, rezistentné na hydromycín-B. Tieto bunky boli spojené, sfarbené na expresiu LFA-3, ICAM-1 alebo B7 nepriamou imunofluorescenciou a čistené dvoma po sebe nasledujúcimi kolami pozitívneho triedenia na FACSStar Plus. Kontransfektované bunkové línie boli udržiavané v RPMI-1640, doplnenom o 200 /ug/ml hydromycínu-B a 10 % FCS.

Pre FACS analýzu sa bunky inkubujú v mikrotitrovacích doskách s dnom v tvare V (Flow Laboratories, Mc Lean, Va.) s vyčistenou mAb (10 jug/ml) 30 minút pri 4° C. Po dvoch premytiach PBS, ktorý obsahujme 0,02 mM azidu sodného a 1 % BSA (Sigma, St. Louis, Mo.) boli bunky inkubované s 1/40 riedenia FITC označených fragmentov F (ab )2 koziej protimyšiej protilátky (TÁGO, Inc., Burlingame, Ka.) 30 minút pri 4° C. Po troch ďalších premytiach sa vzorky označených buniek analyzujú prietokovou mikrofluorimetriou (FMF) na FACScane (Becton Dickinson, Sunnyvale, Ka.), Používa sa anti-LFA-3 mAbs TS 2/9, ktorá bola popísaná Krenským a kol.: J. Immunol. 132, 2180 (1984). Boli použité anti-ICAM-1 mAb

LB2 a anti-B7 mAb L307, ktoré popísali Azuma a kol.: J. Exp. Med. 175, 353 (1992).

Klony T buniek boli aktivované pôsobením anti-CD3 alebo anti-CD2 mAbs zosieťovaných na L bunkách koexprimujúcich CD32 a ICAM-1, LFA-3 alebo B7 v neprítomnosti alebo v prítomnosti IL-10. Bolo zistené, že proliferácia klonov T buniek SP-B21 a NP 12 bola zosilnená vtedy, keď klony boli stimulované anti-CD3 mAbs prezentovanými CD32 transfektovanými L bunkami, ktoré koexprimovali ICAM-1 a LFA-3. Koexpresia LFA-3 bola účinnejšia pri zvyšovaní proliferácie klonov T buniek v porovnaní s ICAM-1 alebo B7 a viedla stabilne k 2 až 4-násobnému zvýšeniu proliferácie. Pri koexpresii ICAM-1 bolo pozorované len mierne zvýšenie proliferácie. B7 obyčajne neovplyvňuje proliferáciu klonov T buniek.

IL-10 inhiboval proliferačnú odpoveď klonov T buniek po aktivácii anti-CD3 mAbs zosieťovaných na L bunkách transfektovaných CD32 i v prítomnosti ICAM-1, LFA-3 a B7. Avšak inhibicia pôsobením IL-10 proliferácie klonov T buniek aktivovaných CD32 bunkami exprimujúcimi LFA-3 bola menej významná.

Proliferácia klonov T buniek by mohla byť indukovaná tiež mitogénnou kombináciou anti-CD2 mAbs zosieťovaných na L CD32 bunkách pre klony T buniek SP-B21 a NP-12. Klony T buniek (2.10⁴ buniek na jamku) boli stimulované anti-CD2 mAbs Xll-1 (0,5 mg/ml) a D66 (0,5 mg/ml) v 200 yul miskách s guľatým dnom (Linbro, Flow laboratories, Mc Lean, Va.), ako je vyššie uvedené. Produkcia týchto protilátok je popísaná Brottierom: J. Immunol. 135 , 1624 (1985).

Proliferácia T buniek nebola ovplyvnená vtedy, ak sa koexprimoval ICAM-1 alebo LFA-3. Bolo však pozorované mierne zvýšenie proliferácie vtedy, ak sa použili L bunky koexprimujúce CD32 a B7. Proliferácia klonov T buniek indukovaná a^ti-CD2 bola inhibovaná na 30 až 50 % tiež v prítomnosti IL-10 vtedy, ak boli použité L bunky exprimujúce CD32 a ICAM-1, LFA-3 alebo B7. IL-10 neovplyvnil expresiu LFA-l, CD2 alebo CDE28 klonov T buniek. Súhrnne tieto výsledky poukazujú na to, že priamy inhibičný vplyv IL-10 na proliferáciu T buniek nebol dôsledkom zmien ko-stimulačných signálov poskytovaných ICAM-1, LFA-3 alebo B7.

Príklad 3

IL-2, ale nie IL-4, môže zmeniť inhibíciu proliferácie T buniek indukovanou IL-10

Na stanovenie, či by IL-2 alebo IL-4 mohli zmeniť inhibíciu proliferácie T buniek indukovanou IL-10, boli klony T buniek aktivované anti-CD3 alebo anti-CD2 mAbs zosieťovanými na L bunkách expresujúcich CD32 a ICAM-1, LFA-3 alebo B7 v prítomnosti IL-2 alebo IL-4. IL-2 sa pridá v množstve 20 j./ml a IL-4 v množstve 200 j. /ml. Vyčistený -ľudský r-ILO-4 (špecifická aktivita 2.10⁷ j./mg) bol dodaný firmou Schering-Plough Research (Bloomfield, NJ. ) .

Bolo zistené, že pridanie IL-2 v nízkych koncentráciách by mohlo úspešne prevrátiť inhibičné účinky IL-10 na proliferáciu klonov T buniek SP-B21 a NP-12. Pridanie IL-4 v koncentrácii 200

j./ml by však nemohlo prevrátiť tieto inhibičné efekty IL-10 na proliferáciu T buniek. Kultivovanie klonov T buniek v trvaní až 72 hodín v prítomnosti IL-10 nevedie k zníženiu regulácie expre36 sie IL-2 receptora a alebo β reťazca. Naviac, aktivácia klonov T buniek PHA v prítomnosti IL-10 nemala žiadny efekt na indukciu expresie IL-2 receptora a a β reťazca. Bola použitá anti-IL-2Ra mAb B10, popísaná Hervom a kol.: Blood 75, 1017 (1990). Použitá bola tiež 3ηίΐ-ΙΕ-2Ρβ mAb Tu 27, popísaná Takeshitom: J. Exp. Med. 169. 1323 (1989). Tieto výsledky súhrnne ukazujú, že inhibícia proliferácie T buniek IL-10 by mohla byť prevrátená účinkom IL-2, nie však účinkom IL-4 a to pravdepodobne preto, že dochádza k inhibícii produkcie IL-2.

Príklad 4

IL-10 inhibuje produkciu IL-2, ale nie IL-4, 11-5, IFN-Γ a GM-CSF klony ľudských T buniek

Na stanovenie, či priamy inhibičný efekt IL-10 na proliferáciu klonov T buniek existuje vďaka inhibícii produkcie IL-2, boli klony T buniek 837, SP-B21, 827, HY-06, CR 253, NP 12 a NP 44 aktivované anti-CD3 mAbs zosieťovanými na L bunkách transfektovaných CD32 a ICAM-l, LFA-3 alebo B7 v neprítomnosti alebo v prítomnosti IL-10 po dobu 24 hodín. Produkcia IL-2, IL-4, IL-5, IFN-Γ a GM-CSF bola meraná testom ELISA špecifickým pre cytokin. Citlivosť týchto testov ELISA bola : IL-2 : lOpg/ml, IL-4 50 pg/ml, IL-5 : 50 pg/ml, IFN-4* : 300 pg/ml a GM-CSF : 50 pg/ml.

Klony T buniek boli izolovnaé na testy produkcie lymfokinov 10 až 12 dní po stimulácii kŕmnymi bunkami, ako to bolo už vyššie uvedené. Bunky boli inkubované 24 hodín pri teplote 37° C, vo zvlhčenej atmosfére s 5 % oxidu uhličitého, kultivačné supernatanty boli izolované, odstreďované pri 250 x G, rozdelené na jednotlivé podiely a pred testovaním skladované pri teplote -20° C.

Aktivácia klonov T buniek viedla k produkcii IL-2, IL-4, IL-5, GM-CSF a IFN-I*' podľa ich odpovedajúcich profilov produkcie Th bunkovej podrady cytokinov. Všeobecne boli namerané najvyššie hodnoty produkcie cytokinov vtedy, kedf klony T buniek boli aktivované L bunkami exprimujúcimi CD32 a LFA-3 alebo B7. V skutočnosti bola produkcia IL-2 detegovaná prevažne v supernatantoch klonov T Jsuniek aktivovaných anti-CD3 na L CD32-LFA-3 a L CD32-B7 transfektantoch. IL-10 silne inhibuje produkciu IL-2 klonmi T buniek. Produkcia IL-4 nebola ovplyvnená IL-10, zatiaľ čo produkcia IL-5, GM-CSF a IFN-/ bola IL-10 len nepatrne inhibovaná. IL-10 teda špecificky inhibuje produkciu IL-2 aktivovanými klonmi ľudských T buniek.

Príklad 5

IL-10 inhibuje produkciu IL-2 klonmi ľudských T buniek po polyklonálnej aktivácii

Na zistenie, či IL-10 je schopný priamo pôsobiť na klony ľudských T buniek pri inhibícii produkcie lymfokinu, boli klony T buniek 827, SP-B21 a NP 44 aktivované acetátom tetradekanoylforbolu (TPA) (Calbiochem), anti-CD3 mAbs a TPA, PHA a TPA alebo mitogénnou kombináciou anti-CD2 mAbs v neprítomnosti prídavných buniek. Klony T buniek boli stimulované pri koncentráciách 1.10⁶ buniek/ml, PHA (100/ug/ml), antiCD3 mAb SPV-T3b (l^ug/ml) a TPA (1 Mg/ml).

Ako je znázornené v tabuľke 2, polyklonálna aktivácia klonov T buniek 827, SP-B21 a NP 44 vedie k vysokým hladinám produkcie lymfokinu podľa ich produkcie. IL-10 silne inhibuje produkciu IL-2 týmito klonmi vo všetkých testovaných spôsoboch aktivácie, zatiaľ čo produkcia IL-4, IL-5, IFN-/ a GM-CSF nie je ovplyvnená. IL-10 bol schopný inhibovať produkciu IL-2 týmito klonmi T buniek po aktivácii anti-CD3 + TPA a následne Ca²⁺ ionoforom + TPA, čo naznačuje, že mechanizmus inhibície nezahrňuje cesty transdukcie signálu T bunkový receptor/CD3 a že tento mechanizmus pôsobí v smere aktivácie proteínovej kinázy C.

Tabuľka 2

Vplyv IL-10 na produkciu lymfokinov klonmi T buniek 827, HY-06 a NP 44 po a^tivácii anti-CD3 mAbs a ΤΡΆ, PHA a TPA alebo ConA

kloň T buniel	: stimul	produkcia	lymfokinov (ng/ml)
		IL-	•2	IL-4		IL-5
		—	+	—	+	—	+
827	médium	ND	ND	ND	ND	ND	ND
	CD3+TPA	10,6	4^9	6,1	6,4	2,4	2,9
	PHA+TPA	17,S	5^7	5,1	4,0	0,8	0,6
	ConA	3,4	1,4	2,3	2,4	ND	ND
HY-06	médium	ND	ND	ND	ND	ND	ND
	CD3+TPA	1,3	0,2	ND	ND	ND	ND
	PHA+TPA	5,0	2,0	ND	ND	ND	ND
	ConA	5,1	0,2	ND	ND	ND	ND
NP 44	médium	ND	ND	ND	ND	ND	ND
	CD3+TPA	0,5	ND	18,6	19,6	6,3	5,9
	PHA+TPA	1,3	0,3	35,4	33,5	8,4	7,9
	ConA	0,3	ND	20,1	18,7	7,8	7,3

Vplyv IL-10 na produkciu lymfokinov klonov T buniek 827, HY-06 a NP 44 po aktivácii anti-CD3 mAbs a TPA, PHA a TPA alebo ConA

kloň T buniek	4 stimul	produkcia	lymfokinov	(ng/ml)
			IFN-	τ		GM-CSF
			+	—	+		—
827		médium	ND	ND	ND		ND
		CD3+TPA	26,9	21,0	15,4		15,2
		PHA+TPA	32,8	39,3	14,3		15,5
		ConA	32,6	33,7	14,0		15,2
HY-06		médium	. ND	ND	ND		ND
		CD3+TPA	23,9	25,5	10,0		13,2
		PHA+TPA	17,6	19,9	16,4		13,1
		ConA	12,8	14,9	14,2		13,3
NP 44		médium	ND	ND	ND		N D
		CD3+TPA	1,5	1,1	9,1		8,8
		PHA+TPA	1,4	1,6	13,1		14,6
		ConA	2,6	2,6	18,9		18,9
Klony	T buniek (10e	buniek/ml)	boli	aktivované	ant i-	CD3 mAbs
(0,5 Mg/ml)	a TPA (1 ng/ml) , PHA	(200 ng/ml) a TPA	alebo	(ConA 10
Mg/ml)	bez	prítomnosti	alebo-v prítomnosti IL-10	(100 j	./ml) 24
hodín.	Produkcia IL-2,	IL-4, IL-5	, IFN-	T a GM-CSF	bola stanovená

testami ELISA špecifickými na cytokiny.

ND: znamená nedetegované (menej ako citlivosť príslušnej ELISY)

Príklad 6

IL-10 inhibuje IL-2 produkciu klonov ľudských T buniek na úrovni mRNA

Na stanovenie toho, na akej úrovni IL-10 inhibuje produkciu IL-2, bola Northernovými blotmi analyzovaná expresia IL-2, IL-4, IL-5 a IFN-f mRNA v klonoch T buniek NP-12, HY-06, 827, SP-A3, 837 a SP-B21 po aktivácii anti-CD3 mAba a TPA bez prítomnosti alebo v prítomnosti IL-10. Celková RNA bola izolovaná spôsobom podľa Chirgwina a kol.: Biochem. 18., 5294 (1979). Northernove analýzy boli urobené podľa de Waal Malefyta: J. Immunol. 142, 3634 (1989).

Pre Northernove analýzy boli použité nasledujúce sondy: PstI Xbal fragment (nt 1 až 285) s 285 pármi nukleotidov z pCD-hIL-2, ktorý popísali Yokota a kol.: In Lymphokines 13 (1987), Nhel-EcoRI fragment (nt 106 až 424) s 318 pármi nukleotidov z pCD-hIL-4, ktorý popísali Yokota a kol. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5894 (1986), Pstl-HincII fragment (nt 5 až 1106) s 1100 pármi nukleotidov, ktorý popísal Yokota (viď vyššie) a PstI fragment s 1200 pármi nukleotidov z pAl, ktorý popísali de Waal Malefyt a kol.: J. Immunol. 145, 2297 (1990).

IL-10 silne inhibuje množstvo IL-2 mRNA exprimovanej v týchto klonoch, ale neovplyvňuje expresiu IL-4 a IL-5 ThO a Th2 podobných klonov alebo expresiu IFN-ft ThO- a THl-podobných klonov. Tieto výsledky ukazujú, že IL-10 šoecificky inhibuje produkciu IL-2 klonov ľudských T buniek na úrovni mRNA.

Príklad 7

IL-10 inhibuje produkciu IL-2 T bunkami izolovanými z periférnych krvných buniek

V tomto príklade bolo zisťované, či IL-10 môže inhibovať proliferáciu a produkciu IL-2 odpočívajúcimi T bunkami. T bunky boli izolované z periférnej krvi a aktivované anti-CD3 alebo anti-CD2 mAbs zosieťovanými na CD32 transfektovaných L bunkách samotných alebo CD32 L bunkách, ktoré koexprimujú ICAM-1, LFA-3 alebo B7. Z poťahov zrazených leukocytov zdravých darcov sa odst reďovaním cez Ficoll-Hypaque (Sigma Diagnostics, St. Louis, Mo.) hustotný gradient podľa Boyuma A.: Scan. J. Clin. Lab. Invest 21 (Suppl. 97), 77 (1968) izoluje PBMNC.

T bunky sa vyčistia z PBMNC zachytením na umelej hmote, pasážovaním kolónou s nylonovou vlnou a negatívnou selekciou magnetickou depleciou. Stručne - 100.10® PBMNC sa kultivuje 30 minút pri teplote 37° C v 100 mm miske pre pletivové kultúry (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ.) v Ysselovom médiu doplnenom o 1 % ľudského AB séra. Nezachytené bunky sa odstránia a pasážujú sa kolónou s nylonovou vlnou (Robbins Scientific, Sunnyvale, Ka.) [Julius a kol.: Eur. J. Immunol. 3, 645 (1973)]. Bunky sa potom inkubujú s nasýtenými koncentráciami anti-CD14 (Leu M3), CD16 (LEU 11a), CD19 (Leu 12) a CD56 (Leu 19) mAbs 30 minút pri teplote 4° C, premyjú sa a inkubujú s magnetickými perličkami potiahnutými ovčím protimyším IgG (Dynabeads M450, Dynal A.s., Oslo, Nórsko) pri pomere perličiek k bunkám 40 : 1.

Táto zmes sa inkubuje a mierne trepe 30 minút pri teplote 4° C. Bunky v tvare ružice sa odstránia magnetickým koncentrátorom častíc podľa doporučenia výrobcu. Populácie T buniek boli 97 až 99 % CD2⁺, CD3*. Anti-CD14 (Leu-M3), CD16 (Leu 11a), CD19 (Leu

12) a CD56 (Leu 19) mAbs a kontrolné mAbs príslušných izotypov boli získané od Becton Dickinson, Mountain View, Ka.

PBMNC T bunky (2.10® buniek/jamku) boli stimulované anti-CD3 alebo anti-CD2 mAbs zosieťovanými na LFctRII bunkových transfektantoch, ako už bolo hore .uvedené. Po 24 hod. inkubácie pri teplote 37° C sa izolujú kultivačné supernatanty.

Bolo zistené, že odpočívajúce T bunky boli úplne závislé od prítomnosti antigénu B7 na CD32 L bunkách pre aktiváciu. Ako anti-CD3, tak anti-CD2 mAbs zosieťované na CD32 L bunkách boli neúčinné pri indukovaní proliferácie T buniek a produkcie lymfokinov. Naviac, tieto bunky ostávali neúčinné po kotransfekcii ICAM-1 alebo LFA-3 do týchto buniek. Avšak anti-CD2 alebo anti-CD3 mAbs zosieťované do CD32 buniek, ktoré boli kotransfek tované B7, indukovali silnú proliferáciu T buniek a vysoké množstvo produkcie IL-2, IFN-Γ a GM-CSF. IL-10 v týchto podmienkach významne neinhiboval proliferáciu odpočívajúcich T buniek. Oproti tomu IL-10 inhiboval produkciu IL-2, ale nie produkciu IFN-Γ a GM-CSF týmito bunkami.

Množstvo IL-2 produkované v prítomnosti IL-10 však bolo ešte dostatočné na indukovanie maximálnej proliferácie v okamihu testu (3. deň). Súhrnne tieto výsledky ukazujú, že angažovanie CD28 alebo CTLA-4 na T bunkách interakciou s B7 na prídavnej bunke bolo absolútne nutné na indukciu proliferácie a produkciu lymfokinu odpočívajúcimi T bunkami a že IL-10 bol v týchto podmienkach ešte stále schopný inhibovať produkciu IL-2.

Príklad 8

IL-10 inhibuje antigénovo špecifickú proliferáciu T buniek, ak sa ako APC použijú myšie L bunky transfektované ľudskými HLA molekulami

Skúmané boli účinky IL-10 na antigénovo špecifickú proliferáciu na toxín tetánu (TT) špecifického klonu T buniek 827 a M. Leprae 65 kD hsp pt [2-12] špecifického klonu T buniek HY-06, ak boli ako bunky prezentujúce antigén, použité myšie L bunky transfektované HLA-DR3 alebo HLA-DR3 a ICAM-l, LFA-3 alebo B7, ako je to hore uvedené. FACS profily expresie HLA-DR, ICAM-1, LFA-3 a B7 transfektantov L buniek ukázali, že IL-10 nemal žiadny vplyv na konštitutívnu expresiu skupiny II MHC týchto buniek.

Toxín tetánu bol poskytnutý Dr. B. Bizzinim (Inštitúte Pasteur, Paríž, Francúzsko) a bol použitý v konečnej koncentrácii 1 yug/ml. Hsp pt [2-12] bol pripravený spôsobom syntézy peptidov v pevnej fáze a skontrolovaný analytickou HPLC na obrátených fázach a amínokyselinovou analýzou. Peptidy boli používané v konečnej koncentrácii 0,5 /ug/ml.

Stimulácia klonov T buniek 827 a HY-06, analýzy proliferácie a merania cytokinov boli uskutočňované tak, ako je to vyššie uvedené. Bolo zistené, že IL-10 inhibuje antigénovo špecifickú proliferáciu HY-06 a 827 L bunkami transfektovanými HLA-DR3 ako antigén prezentujúcimi bunkami (APC) v závislosti od dávky. IL-10 pridaný v množstve 10 j./ml mal inhibičnú aktivitu a v dávke 100 j. /ml a 500 j./ml bola získaná 30 až 50 % inhibícia proliferácie.

Tieto výsledky boli potvrdené vtedy, ak ako APC boli použité L bunky transfektované HLA-DR a ICAM-1, LFA-3 alebo B7. Proliferačné odpovede klonov T buniek 827 a HY-06 boli zvýšené, ak sa použili L bunky kotransfektované LFA-3, a inhibičný účinok IL-10 bol menej významný. Inhibícia proliferačných odpovedí 827 a HY-06 pôsobením IL-10 bola úplne prevrátená neutralizovaním anti-IL-10 mAb 19F1, čo poukazuje na špecifickosť inhibície. Tieto výsledky ukázali, že IL-10 inhiboval antigénovo špecifické proliferačné odpovede 827 a HY-06, ak sa ako APC použili HLA-DR transfektované myšie L bunky.

Bolo zistené, že inhibícia antigénovo špecifickej proliferácie pôsobením IL-10 existuje na úrovni T buniek. Aby sa toto potvrdilo, boli klony T buniek 827 a HY-06 aktivované TT a pt [2-12] v prítomnosti ľudského alebo myšieho IL-10. Tým sa skúmalo, či IL-10 pôsobil na antigén prezentujúce L bunky alebo priamo na klony T buniek. Ako bolo hore diskutované, ľudský IL-10 je účinný na ľudské a myšie bunky, ale myší IL-10 je účinný len na myšie bunky.

Bolo zistené, že myší IL-10 nebol schopný inhibovať antigénovo špecifickú proliferáciu 827 a HY-06, ak sa ako APC použili L bunky transfektované HLA-DR alebo kotransfektované ICAM-1, LFA-3 alebo B7. Tieto výsledky ukazujú, že IL-10 mal priamy vplyv na proliferáciu klonov ľudských T buniek.

Klony T buniek 827 a HY-06 boli aktivované TT alebo pt [2-12] s L bunkami exprimujúcimi HLA-DR alebo v kombinácii s

ICAM-1, LFA-3 alebo B7 v prítomnosti alebo bez prítomnosti IL-10 a IL-2, aby sa zistilo, či pridanie exogénneho IL-2 zmení inhibičné účinky IL-10. Nízke koncentrácie IL-2 by mohli prevrátiť inhibičné účinky IL-10 na antigénovo špecifickú proliferáciu klonov T buniek 827 a HY-06.

Kloň T buniek HY-06 bol aktivovaný pt [2-12] s L bunkami exprimujúcimi HLA-DR3 samotný alebo v kombinácii s ICAM-1, LFA3 alebo B7 v prítomnosti alebo bez prítomnosti IL-10. Produkcia IL-2 a IFN-f bola stanovená v kultúre supernatantov izolovaných po 24 hodinách. IL-10 inhiboval produkciu IL-2, ale nie IFN-f klonom T buniek HY-06 po antigénovo špecifickej aktivácii. Súhrnne tieto výsledky ukazujú, že IL-10 inhiboval antigénovo špecifickú proliferáciu T buniek špecifickou inhibíciou produkcie IL-2.

Zápalové črevné ochorenia

Bol vyvinutý myší model IBD. Tento model prispieva na objasnenie pôvodu alebo mechanizmu IBD. Je tiež experimentálnym podkladom pre rôzne terapeutické činidlá. Pre vývoj tohto modelu sa gén IL-10 buď odstráni alebo sa uskutoční to, že v pokusnom zvierati bude neúčinný alebo neexpresovateľný. 0 tomto zvierati sa potom hovorí, že má gén IL-10 ochromený alebo že ide o knockautované zviera (KO). KO je možné dosiahnúť niekoľkými rôznymi spôsobmi, ktoré sú odborníkom známe.

Je možné napríklad získať transgenného živočícha, ktorého gén IL-10 má byť inaktivovaný, viď Goodnow C.: Transgenic Animals“, 1502 až 1504, Encyclopedia od Immunology, Ritt (red.), Academic Press, San Diego (1992). V stručnosti- vyčistená DNA sa podá mikroinjekciou do pronuklea oplodnených oocytov, potom sa sa oocyty chirurgicky implantujú do vajcovodu zvieraťa použitého ako pestúnka. Na izoláciu homozygotného mutovaného zvieraťa kmeňa je možné použiť tiež štandardné spôsoby genetického kríženia.

Existujú tiež spôsoby, ktoré inaktivujú špecifické gény v zárodočnej línii myší. V tomto prípade sa do miesta génu prírodného typu homológovej rekombinácie zavedie mutovaný transgén. Línie embryonálnych kmeňových (ES) buniek sa môžu izolovať a kultivovať in vitro z myších blastocytov a neskôr reimplantovať do iného blastocytu tak, aby čiastočne kolonizovali ako somatické tkanivá tak i tkanivá zárodočnej línie výslednej myši (Goodnow na str. 1503 ) .

Do ES buniek v kultúre sa zavedie DNA. Blastocyty sa chirurgicky implantujú do pestúnky. Výsledkom je heterozygotný mutantný predok, ktorý sa navzájom skríži, takže nakoniec má potomok dve mutované alely, napr. sa získa homozygotný mutant. Títo potomci by nemali mať žiadne funkčné alely génu, o ktorý ide, a mali by umožňovať genetické vyrezanie, aby sa odstránili špecifické gény. Analýza výsledného potomka môže poskytnúť pohľad na úlohu cieľového génu v KO myši pri získavaní výsledných fenotypov.

Ďalšie spôsoby tvorenia experimentálnych zvierat s deléciami príslušného génu uvádza napr. viď McMahon a kol.: The Midbrain-Hindbrain Phenotype of Wnt-1-/Wnt-1-Mice results from Stepwise Depletion of engrailed - Expressing Cells by 9.5 Days Postcoitum, Celí 69, 581 (1992), a Tráviš Scoring a Technical Knockout in Mice, Science 256, 1392 (1992). Ďalšie aplikovateľné spôsoby v odbornej literatúre popisujú spôsoby mutagenézy a antisenzie technológie, viď hore uvedený Goodnow C. (1992).

Príklad 9

Myší model pre zápalové črevné ochorenie

Boli získané myši, ktoré boli zbavené génu IL-10, viď Kuhn a kol.: Science 254, 7097 (1991) ; Capecchi: Science 244, 1288 (1989) ; Robertson (red.) Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A Practical Approach, I.R.L. Press, Oxford 1987, a

Zijestra a kol.: Náture 336 (1986) pre popisy všeobecného spôsobu a postupov získania myší zbavených zvoleného génu. Na myši, ktorým chýba gén IL-10, sa tu odkazuje ako na IL-10 myši alebo ako na knockoutované (KO) myši.

Prvá skupina : Štyri myši boli zabité pre analýzu kostnej drene. Časť ich drene bola analyzovaná, aby sa stanovila ich schopnosť produkovať myeloidných a erytroidných predkov (viď tabuľka 3) a aby bola posúdená produkcia kmeňových buniek (viď tabuľka 4). Ostatná časť drene bola použitá na dlhodobú kultiváciu kostnej drene, aby sa posúdila schopnosť buniek z najbližšieho okolia podporovať normálnu hematopoéznu generáciu. Brzlík a slezina obsahovali normálne počty T buniek a normálne počty B buniek. Analýzy krátkodobého predka a kmeňových buniek sú uvedené nižšie v tabuľkovej forme. Bunky z kontroly a z KO myší boli spojené oddelene.

Tabuľka 3

Počet kolónií vytváraných buniek /stehenná kosť

celkový počet buniek/
/stehenná	kosť	GM	BFU-e	CFU-e	Meg	Meg/Mix
kontrola:	9,5.106	18430	475	42500	2470	285
IL-2T:	9,4.106	21902	940	59740	2271	658

GM znamená granulocyty a makrofágy

BFU znamená jednotky tvoriace krv

CFU znamená jednotky tvoriace kolóniu

-e znamená erytroid

Meg znamená megakaryocytické kolónie

Meg/Mix znamená megakaryocyty zmiešané s inými líniami

Faktory stimulujúce kolónie použité v teste: IL-3 + IL-6 + erytropoetín (Epo)

Tabuľka 4

Počet CFU-S 14. deň kontrolná skupina: 1678 na stehennú kosť

IL10T skupina: 1517 na stehennú kosť

Produkcia kmeňových buniek znamená počet CFU-S v stehennej kosti myši. CFU-S je mierou tvorby hemopoéznych uzlíkov v slezine smrteľne ožiarených myší po transplantácii, viď Till a kol.: Radiation Research 14, 213 (1961).

IL10T myši nevykazovali žiadny zrejmý defekt pri produkcii myeloidných, erytroidných a kmeňových buniek. Súčasne dlhodobé kultúry vytvorili vrstvu podporného väzivového tkaniva vo všetkých kultúrach z IL-10 myší. Tieto kultúry boli usporiadané do dvoch stupňov: Prvý stupeň : bunky boli kultivované tak, aby vytvorili komplexné vrstvy podporného tkaniva potrebné na podporu kontinuálnej tvorby krvi. Tieto kultúry boli potom preočkované ďalšími bunkami kostnej drene z ekvivalentných typov donorov, takže poskytli skutočne prekurzory, ktoré asociujú s bunkami podporného väzivového tkaniva. Tento druhý stupeň bol urobený po tom, čo bola dostupná druhá a tretia skupina myší.

Druhá a tretia skupina: Na dokončenie dlhodobých pokusov kultivácie kostnej drene boli potrebné bunky kostnej drene týchto zvierat. Okrem použitia ich kostnej drene na tieto účely boli urobené ďalšie procedúry (viď tabuľky 5 až 9). IL-10T - zvierat boli anemické, ale zdalo sa, že majú normálne hladiny prekurzorov kostnej drene. Preto boli vyhodnotené ich anémie a ich orgány boli histologický vyšetrené.

Tabuľka 5

Počty v periférnej krvi

myši	WBC/ml .10®	RBC/ml .10®	doštičiek/ml .10®
kontrola	č.	1	7,2	7,3	12,6
	č.	2	11,2	5,6	10,7
	č.	3	10,0	6,7	8,5
	č.	4	8,2	5,6	9,8
	č.	5	7,7	5,6	8,0
IL-10T	v c	. 1	4,0	2,4	20,6
	č.	2	4,8	7,1	8,0
	č.	3	7,5	3,9	27,3
	v c.	4	6,5	5,5	23,9

WBC znamená biele krvinky RBC znamená červené krvinky

Tabuľka 6

Diferenciály periférnej krvi

myši	% lýmf.	% neut.	% mono.	% eos.	% retik.
kontrola č.	1	87	12	1	0	2,4
č.	2	72	26	2	0	1,2
v c.	3	80	18	1	1	0,6
IL-10T č.	1	36	64	0	1	3,8
č.	2	40	57	0	3	5,3
č.	3	23	77	0	0	17,1

lýmf, znamená lymfocyty neut. znamená neutrofily mono. znamená monocyty eos. znamená esosinofily retik. znamená retikulocyty

RBC morfológia: Všetky kontrolné zvieratá mali normálny vzhľad červených krviniek (RBC). IL-10T myši vykazovali rozličnú morfológiu. IL-10T č. 1 mali mikrocytické bunky, č. 2 a 3 mali mikrocytické bunky a nejaké makrocytické, polychrómne bunky a prípadne nukleované červené krvinky (NRBC). Nátery červených krviniek boli zafarbené novou metylénovou modrou. Spočítané boli bunky so zafarbením ribozómov. Pozitívne zafarbenie sa vyskytuje vo veľmi mladých červených krvinkách (retikulocytov) a zahrňuje prematurované uvoľnenie z hemopoéznych orgánov. Tento počet sa označuje ako počet retikulocytov.

Histológia orgánov IL-10T myší: Podľa prehliadky časti srdca, pľúc, ľadvín a brzlíka sa zdá, že všetko je normálne. Pečeň sa zdá byť tiež v poriadku až na náhodilé ložiská jednojadrových a neutrofi Iných granolocytov. Slezina bola makroskopický abnormálna. Boli prítomné folikuly, ale oblasť červenej drene bola vyplnená hematopoéznymi bunkami, väčšinou NRBC a blastocytmi (nematurované bunky). Bolo nájdených niekoľko alebo nebola nájdená žiadna RBC a nebolo zistené ukladanie železa v makrofágoch.

Tabuľka 7

Diferenciály buniek sleziny

				(% z	celkového	i množstva	buniek)
myši	bunky/	lýmf.	mono.	neu	eos .	bunky/	blast.	nuk.
	slezina					plazma		RBC
kontrola
č . 1	1,5.108	88	2	1	<1	<1	1	6
č . 2	1,5.108	89	1	<1	<1	<1	2	7
č. 3	1,1.108	79	3	4	1	2	2	8
IL-10T
č. 1	2,1.108	64	2	7	1	1	2	22
č . 2	2,5.108	54	2	13	3	1	6	21
č. 3	1,6.108	43	2	10	1	1	10	32

lýmf, znamená lymfocyty mono. znamená monocyty neu. znamená neutrofily eos. znamená eozinofily blast. znamená blastocyty nuk.RBC znamená nukleované červené krvinky

Tabuľka 8

Diferenciály kostnej drene (% z celkového množstva)

myši	neu.	neu. MB	eos.	eos. MB	nuk. RBC	plazma bunky	lym.	blast nedif
kontrola č. 1	46	12	10	4	20	<1	4	4
č . 2	39	9	5	3	37	<1	5	2
Č. 3	35	10	12	4	29	<1	6	2
IL-10T č. 1	46	12	7	2	28	<1	2	2
č. 2	56	19	4	1	18	<1	1	1
č . 3	53	14	2	1	27	1	1	1

neu. MB znamená neutrofilný myeloblast eos. MB znamená eozinofilný myeloblast nuk. RBC znamená nukleované RBC blast nedif. znamená primitívny nediferencovaný blastocyt lym. znamená lymfocyty

Nasledujúce údaje sú výsledkami analýz tvorby kolónií. Tieto analýzy boli robené s bunkami sleziny a tiež s bunkami kostnej drene. Na stimulovanie buniek tvoriacich kolónie boli použité IL-3 + C-kit ligand namiesto IL-3 + IL-6. Kombinácia IL-3 + C-kit ligand je pri stimulovaní erytroidných prekurzorov účinnejšia, ako je to vidieť z porovnania počtov BFU-e získaných pri prvej analýze (hore) s počtami BFU-e získanými v nasledujúcich analýzach .

Tabuľka 9

Testy tvorby kolónií

myš	GM	GEM	GEMN slezina	BFU-e (kolónií	CFU-e j/slezina)	MEG	MEG/MIX
Cl	18535	618	309	9268	42322	618	1236
C2	7736	893	595	2678	44926	1488	893
C3	8670	650	650	7152	71741	433	433
KÍ	55020	8400	3360	51660	393120	2100	6300
K2	111060	25746	10601	96925	498762	14135	12116
K3	68274	20096	9890	103050	1012633	14357	9252
		kostná	dreň (kolónie/stehenná kosť)
Cl	37300	3632	838	7963	35065	978	419
C2	49159	2552	510	5954	81478	680	1021
C3	30343	1916	639	6069	24754	958	958
KÍ	63440	1823	1641	8750	58336	1276	1276
K2	37340	6570	438	8870	47085	986	1424
K3	35432	4006	1753	14273	52208	1628	4132

Cl, C2 a C3 sa týkajú rovnakých kontrolných myší, tiež označovaných ako kontrola č. 1, č. 2 a č. 3

ΚΙ, K2 a K3 sa týkajú rovnakých myší označovaných tiež ako IL-10T č . 1, č. 2 a č . 3

GM znamená granulocyt, makrofág

GEM znamená granulocyt, erytroid, makrofág

GEMN znamená granulocyt, erytroid, makrofág, megakaryocyt

Tabuľka 10

Testy krvi vo výkaloch

myš	1. deň	2. deň
kontrola č. 1	neg.	neg.
č. 2	neg.	neg.
č . 3	žiadna vzorka	neg.
IL-10T č. 1	neg.	neg.
č. 2	poz.	poz.
Č. 3	poz.	poz.

Vyšetrenie výkalov

Štúdie výkalov IL-10T myší nezistili prítomnosť vajíčok, ktoré by poukázali na infekciu parazitmi. Neexistuje žiadny dôkaz prítomnosti maturovaných parazitov v tenkom alebo v hrubom čreve.

Zvieratá boli mierne až značne anemické. Anémiu nie je možné vysvetliť neschopnosťou generovať erytrocyty. IL-10T myši vykazujú snahou vyrovnať sa s anémiou. Po prvé, myši produkovali v svojej slezine väčší ako normálny počet prekurzorov RBC. Slezina myší má snahu kompenzovať deficit RBC, je dvakrát väčšia ako v normálnych zvieratách a vykazuje nadmernú aktivitu pri snahe generovať RBC.

Niektoré z myší boli dobre kompenzované. Vykazovali takmer normálny počet RBC v krvi a nemali uvoľnených veľa nematurovaných buniek v obehu, pretože počet ich retikulocytov bol relatívne normálny. Iné myši však boli mimo normálnej hodnoty a do obehu vpúšťali nematurované bunky, čo je dôvodom pre to, prečo mali taký vysoký počet retikulocytov (t.j. 17 $). V obehu cirkulovalo tiež niekoľko nukleovaných RBC.

Tieto myši mali tiež vyšší ako normálny počet doštičiek a zvýšený počet megakaryocytov v svojej slezine. To bol znak toho, že môžu krvácať. Stratou krvi je možné vysvetliť chronickú anémiu s vyčerpaním zásob železa (tento deficit železa bol zrejmý ako v kompartmentoch sleziny, tak i v kostnej dreni). Po pitve bolo jasné, že myši nemali žiadne vnútorné krvácanie, avšak väčšina z IL-10T myší mala v svojich výkaloch krv a tiež mala prolapsus konečníka. Myši boli podrobne vyšetrené a bolo zistené, že sú negatívne na mrľu detskú, na pásomnicu alebo na iné parazitárne infekcie. Bola zistená priama korelácia medzi pozitívnym nálezom krvi vo výkaloch a silou ich anémie.

Okrem anémie a problému s krvácaním mali IL-10T myši v krvi viac neutrofi Iných granulocytov akeo lymfocytov. To je opakom toho, čo je u myší normálnym stavom, viď diferenciál periférnej krvi (tabuľka 6). Toto pozorovanie je v súlade tiež s obrovským zvýšením myeloidných prekurzorov zistených v testoch tvorby kolónií v slezine (tabuľka 9). Myši teda trpeli príznakom anémie z chronického zápalu.

Pri pitve boli skúmané sekcie tkanív pripravených z IL-10T myší a kontrolných myší z rovnakého hniezda. Všetky vzorky kontrôl sa zdali byť normálne. Pokiaľ ide o IL-10T myší, tkanivo brzlíka a chrbtice bolo normálne. Slezina vykazovala mierne až značné zvýšenie erytroblastov a myeoloblastov plus megakaryocytov. Sústava RBC bola malá alebo v podstate neexistovala. Zafarbenie pruskou modrou ukázalo na vyčerpanie zásob železa. To bol dôkaz zvýšenej extramedulárnej hematopoézy.

Vyčerpanie zásob železa je v súlade so stratou krvi a vedie k abnormálnej erytropoéze. Pri makroskopickom skúmaní vykazovali sleziny 1,5 až 3-krát väčšiu veľkosť ako normálne. Mezenterické lymfatické uzliny boli veľmi veľké v porovnaní s normálnymi a boli takmer tak veľké, ako normálna slezina. Podobne boli zväčšené folikuly Ba T buniek. Tento obraz je v súlade so zápalovou odpoveďou.

Tenké črevo malo dobre vytvorenú mukózu a submukózu. V niektorých sekciách bol počet polymorfonukleovaných bielych buniek (PMN) a jednojadrových buniek mierne zvýšený. Hrubé črevo a konečník vykazovali viditeľný zápal konečníka od približne dolnej časti tračníka. Je zrejmé značné množstvo edému a infiltrujúcich buniek. Prevládajúcim typom buniek boli PMN, ale prítomné boli aj eozinofily, lymfocyty, plazmové bunky a epiteloidné bunky (bunky, ktoré pripomínajú epitel). Zápal zasiahol mukózu, krypty a submukózu. Príležitostne sa infiltráty nachádzali v svalovej vrstve, najmä vo vnútornej oblasti zvierača. Na mnohých plochách sa stratil alebo bol neprítomný epitel. Viac poranení vykazoval fibrózny materiál s agregovanými RBC a PMN. Niektoré krvné cievy boli zapcháte RBC. Zhluky epitelových buniek predpokladajú včasnú tvorbu granulómu, ale granulómy neboli zrejme dobre vytvorené. Nebol dokázaný žiadny výskyt parazitov, vajíčok alebo intracelulárnych baktérií, ktoré by mohli spôsobiť chronický zápal. Násobné poranenia a hemoragie boli v súlade s pozitívnym výsledkom testu na skrytú krv vo výkaloch. Celkový obraz bol v súlade s IBD, s druhou anémiou a chudnutím.

Príklad 10

IL-10 K0 myši odpovedajú na liečenie exogénnym IL-10

Boli skúmané štyri myši, ktoré boli zbavené IL-10 génu (IL-10 KO), a tri normálne kontrolné myši. Vzhľad kontrolných myší bol normálny. Všetky tri kontrolné myši boli negatívne na výskyt skrytej krvi vo vzorkách výkalov a mali aj normálne vyzerajúci konečník. Niektoré z IL-10 KO myší boli zjavne menšie ako kontroly a vykazovali znaky slabšieho zdravia. Mali zješené chlpy a malý životný elán v porovnaní s normálnymi kontrolami. Jedna zo štyroch IL-10 KO myší bola zhrbená a mala abnormálnu chôdzu. Všetky štyri IL-10 KO myši mali napuchnutý konečník a erytematózne rektálne tkanivo alebo prolapsus konečníka.

Dve z pokusných KO myší mali pozitívny nález na skrytú krv vo vzorkách výkalov dvakrát, zatiaľ čo tretia myš bola raz negatívna a druhýkrát nejednoznačná. Rektálne nátery boli urobené všetkým štyrom myšiam. Tri mali hnisavé výpotky s veľkým počtom neutrofilných granulocytov. V jednotlivých náteroch zvierat, ktoré v čase odoberania vzoriek krvácali z konečníka, boli prítomné tiež erytrocyty. Pretože IL-10 KO myši časom vykazovali pokles síl, bola ako časť skúmania zaznamenávaná hmotnosť IL-10 KO myší a normálnych kontrolných myší.

Trom z IL-10 myší bolo injekčné denne v priebehu dvoch týždňov podávaných 35 ;ug IL-10. Tieto tri myši mali stále hnisavé výpotky (len 2 z 3 mali tiež známky krvácania a 1 z 3 sa zhrbila a abnormálne behala). Jednej IL-10 KO myši (negatívnej na krvácanie a hnisavý výpotok) a normálnym kontrolám boli denne v priebehu dvoch týždňov podávané injekcie trometamínového (TRIS) pufra. Bol sledovaný celkový zdravotný stav, fyzický zjav, rektálny výpotok, výskyt skrytej krvi a hmotnosť.

Po dvoch týždňoch infúzie IL-10 všetky tri IL-10 KO myši mali zvýšenú životnú silu, hladké chlpy, normálne držanie tela a normálnu chôdzu. Všetkým trom sa zmenšil opuch konečníka, aj keď ešte boli prítomné znaky zápalu. Všetky tri myši mali negatívne výsledky na skrytú krv a v ich rektálnom nátere sa nevyskytovali erytrocyty. Množstvo výpotkov bolo znížené, v ich rektálnych náteroch však boli pozorovateľné ešte neutrofi Iné granulocyty. Náter jedného zo zvierat teraz mal viac epitelových a lýmfocytových buniek ako neutrofi Iných granulocytov. Jedno zo zvierat si udržiavalo svoju hmotnosť približne 16 gramov, u ďalších dvoch sa hmotnosť zvýšila zo 16 na 17,8 g a z 11,4 na 14 gramov.

IL-10 KO myš, ktorej bol podávaný TRIS pufor po dobu dvoch týždňov, mala negatívny výskyt skrytej krvi vo vzorke stolice. Myš mala silný výpotok, ktorý obsahoval veľké množstvo neutrofilných granulocytov. Konečník bol ešte stále opuchnutý a citlivý na prolapsus. Zviera bolo zhrbené, malo abnormálnu chôdzu a vykazovalo tiež zrejmé znaky chudnutia. Jeho hmotnosť sa znížila zo 16,6 g na 14 g. Normálne kontroly, ktorým bol tiež injekčné podávaný TRIS pufor, si zachovali svoj normálny zdravotný vzhľad, vrátane konečníka. Vzorky stolice boli negatívne na skrytú krv a neboli zistené žiadne výpotky z konečníka. Ich hmotnosť sa zvýšila zo 17,1 na 19 g a 17,4 g na 18,7 g, dokonca aj o niekoľko týždňov neskôr zvieratá mali stále zvýšenú hmotnosť.

Príklad

Zlepšovanie znakov alebo príznakov zápalového črevného ochorenia

Človek ako pacient s IBD môže byť liečený IL-10 podľa vynálezu nasledujúcim spôsobom. Takýto pacient má príznaky, medzi ktoré patrí diarea, abdominálna bolesť, horúčka, melena, hematochézia a strata hmotnosti, a znaky, medzi ktoré patrí abdominálna hmotnosť, glositída, aftózny vred, análna fisura, perianálna fisura, anémia, malá sorbcia a deficit železa. Pacient sa zo začiatku lieči 5 pg IL-10 na kg hmotnosti na deň. Ak 70 kg, začiatočná dávka je 350 pg IL-10 na deň. Táto dáva ako intravenózny bolus.

na deň podľa znášanlivosti a deň (10 >ug na kg na

Táto dávka sa zvyšuje o

Optimálne počas niekoľkých pacient váži dávka sa po50 až 150 pg dávky reakcie pacienta, deň) sa dosiahnu

700 Mg na dní .

niekoľko dní po a potom denne až

Pred rametrami, počtu počty celkovému je to, či významnej množstvom pred liečením pacienta. Vzhľaveľká pozornosť venovaná formy a či rôznych typov bielych pomeru lymfocytov a začiatkom liečenia skončení liečenia sa pacient sleduje klinicky a laboratórnymi pamedzi ktoré patrí počet krviniek vzhľadom k bielych krviniek a diferenciál. Zvlášť zaujímavé bielych krviniek zostávajú v normále alebo bez v porovnaní s ich diferenciál bielych krviniek je tomu, či sa v periférnej krvi objavujú nematurované zostáva stály, alebo sa mení normálny pomer krviniek. Zvláštna pozornosť monocytov v periférnej krvi.

zmeny dom na sa venuje

Medzi ďalšie parametre, ktoré môžu byť sledované, patrí rýchlosť sedimentácie erytrocytov (ESR), chemické profily a množstvo IL-6, TNF a IFN-Γ v krvi. Nakoniec pravidelne, napríklad denne, sa hodnotí stolica pacienta na krv a hnisavý výpotok, čo môže ukazovať na reakciu pacienta na liečenie. Liečením sa zlepšuje jeden alebo viac príznakov alebo znakov črevného zápalu.

Inhibícia hypersenzitívnych reakcií neskorého typu

Príklad 12

Zníženie účinkov v myšiach

Na BALB/c myší sa vopred pôsobí anti-CD4 monoklonálnou protilátkou (MoAb) a po štyroch týždňoch sú infikované Leishmania major. BALB/c sú komerčne dostupné myši inbredného kmeňa získané od Simonsen Laboratories (Gilroy, Kalifornia). Tieto myši sa používajú vo veku 8 až 12 týždňov. L. major (kmeň W3H0 označenia WHOM/-/173) sa kultivuje ako promastigoty v M199 (dostupné od GIBCO, Grand Island, NY.) obsahujúcom 30 % plodového teľacieho séra (FCS) (dostupné od J.R. Scientific, Woodland, Ka.), 2 mM L-glutamínu a po 100 j./ml penicilínu a streptomycínu. Promastigoty sa izolujú z kultúry v stacionárnej fáze a premyjú sa soľným roztokom pufrovaným fosforečnanom (PBS). Myši sa potom infikujú 1,5.10⁷ živými promastigotmi injekčné subkutánne do ľavej zadnej tlapky. Antigén L. major sa pripraví štyrmi cyklami zmrazenia a roztopenia parazitov a nasledujúcim odstreďovaním. Antigénový prípravok sa pridá do kultivačných jamiek v množstve 2.10⁶ organizmov na ml.

Pre in vitro testy boli použité nasledujúce monoklonálne protilátky (McAbs): neutralizujúci protimyší IL-4 MoAb (ATCC Č.HB188), neutralizujúci protimyší IL-10 McAb (pripravený spôsobom pre anti-IL-4 popísaný Chatelainom a kol.: J. Immunol. 148, 1182 (1992)) a protimyší CD4 (ATCC č. TIB207). Všetky protilátkové prostriedky boli vyčistené zo supernatantov pletivovej kultúry chromatografiou na ionexe a gélovou filtráciou. Obsahovali menej ako 3 endotoxínové jednotky (EU) na mg proteínu podľa merania Limulusovým testom aglutinácie.

Na čistenie buniek boli použité nasledujúce vyčistené McAbs: biotinylovaná RM-4-5 a RM-4-4, protimyší CD4 a AMS-32.1, protimyší Mac-1 (ATCC č. TIB128), RA3-6B2 a protimyší B220 [Coffman: Immunological Reviews 69., 5 (1982)]. Rekombinantný myší IL-4 a IL-10 boli exprimované v E. coli a vyčistené afinitnou chromatografiou, ako to bolo už popísané.

Podkolenné lymfatické uzliny (LN) odvádzajúce sekréty z miesta infekcie L.major boli odstránené 4 až 6 týždňov po infekcii myší BALB/c alebo BALB/c vopred liečených anti-CD4 a rozdelené na suspenzie jednotlivých buniek v PBS obsahujúcom 0,25 % hovädzieho sérového albumínu (BSA). Pri čistení CD4+ T buniek boli všetky úkony robené pri teplote 4° C. Asi 4.10⁸ LN buniek bolo označených 2 ml PBS/BSA roztokom obsahujúcim po 12 /ig/ml antiB22O, anti-Mac-1, anti-CD8 a anti-triedy II I-A^d po dobu 30 minút. Suspenzia McAb označených buniek sa po premytí PBS/BSA inkubovala na rotujúcom kolese 30 minút s ovčími protikrysími potiahnutými perličkami Dynabeads (Dynabeads sú dostupné od firmy Robbins Scientific, Mountain View, Ka.) v pomere 3 perličky na bunku. Magnetickým oddelením boli získané negatívne bunky.

CD4+ T bunky boli ďalej obohatené z výslednej suspenzie buniek, ktoré mali 85 % CD4+, pozitívnym výberom magneticky aktivovaných buniek druhom buniek (MACS, Miltenyi, Diisseldorf, Nemecko). Stručne -bunky sa značia 12 /ug/ml biotinylovaným anti-CD4 v PBS/BSA, 50 ml/10⁸ buniek, 1-5 minút. Premyjú sa PBS a inkubujú sa streptavidinovými mikroperličkami (od firmy Becton Dickinson, Sunnyvale, Ka.) v množstve 50 /ul/10⁸ buniek. Po 15 minútach sa pridá Streptavidin-PE na konečnú koncentráciu 1/50. Po ďalších 5 minútach inkubácie sa suspenzia buniek premyje a nechá sa prejsť magnetickou kolónou. Bunky, ktoré sa na zmagnetizovanej kolóne zadržia, sa eluujú odstránením kolóny od magnetu a viacerým premytím PBS/BSA. Výsledná populácia buniek bola viac ako 96 % CD4+.

Splenocyty zbavené T buniek boli pripravené zo sleziny nor málnych darcov, z ktorých boli negatívnou selekciou použitím ovčích proti-krysích Dynabeads odstránené anti-CD4 a anti-CD8 zafarbené bunky presne podľa horeuvedeného popisu pre LN bunky. Prípravky boli bežne na 99 % negatívne na CD4 a CD8 podľa FACS analýzy.

Neoddelené bunky lymfatických uzlín alebo vyčistené CD4+ T bunky boli usporiadané do dvojnásobných kultúr v cRPMI obsahujúcom 5 % FCS vo vyznačených dávkach, v 250 ul objemových doskách s 96 jamkami s guľatým dnom spoločne, v prípade vyčistených CD4+ T buniek, 5.10⁵ normálnych buniek zbavených splenocytov v prítomnosti alebo v neprítomnosti antigénu L. major. cRPMI označuje úplné kultivačné médium obsahujúce RPMI-1640 (dostupné od J.R.H. Biosciences, Lenaxa, Kansas), 10 % FCS, 2 mM L-glutamínu, 0,05 mM 2-ME a 100 jednotiek penicilínu a streptomycínu na ml.

Na bunky prezentujúce antigén (APC) sa pôsobilo 4 hodiny antugénom L. major (ekvivalent 2.10⁶ organizmov/ml), alebo samotným médiom 4 hodiny. Splenocyty zbavené T buniek boli pred kultivovaním vystavené jamiek sa v (rIL-10) (50 a/alebo neutralizujúci pôsobeniu Γ-žiareniu (1000 niektorých prípadoch /ug/ml)/ rekombinantný McAbs na tieto rad.). Do kultivačných pridá rekombinatný IL-10 IL-4 (rIL-4) (100 ng/ml) cytokiny. Supernatanty na detekciu syntézy cytokinov sa izolujú po 72 hodinách.

Množstvo cytokinov v supernatantoch sa stanovuje dvojmiestnym sendvičovým testom ELISA, ako je to hore popísané pre IFN-Γ, IL-4, IL-10 a IL-3 (viď Chatelain a kol., 1992). Vzorky boli kvantitatívne vyhodnotené porovnaním so štandardnými krivkami vyčisteného rekombinantného alebo prírodného cytokinu.

Predbežné pôsobenie anti-CD4 MoAb pôvodne odstránilo živočíšne dostupné T bunky, ale nakoniec posilnilo rezistenciu živočícha na parazitárnu reakciu vyvolanú L. major. Aj keď bol tento jav protizmyselný a jeho mechanizmus nie je jasný, bol často pozorovaný. DTH silne koreluje s frezistenciou živočícha na parazitárnu infekciu.

Štyri týždne po infekcii bola u živočíchov vyvolaná reakcia antigénom Leishmania (získaný roztavením a zmrznutím) v protiľahlej tlapke. Počas nasledujúcich 48 hodín bolo opuchanie tlapky merané kaliprom. Každému zvieraťu bolo intraperitoneálne podaných 5 dáviek cytokinov. Jednej skupine bolo podaných 5 dáviek IL-4, druhej 5 dáviek IL-10 a tretej skupine 5 dáviek kombinácie IL-4 s IL-10. Každá z 5 dáviek bola podávaná po 12 hodinách s tým, že prvá dávka bola podaná 12 hodín pred vyvolaním reakcie antigénom.

Tabuľka 11

Kombinácia IL-4 s IL-10 inhibuje DTH na antigény L. major

liečenie	veľkosť tlapky (mm.102)
20 Mg IL-4	84 ± 16
20 M? IL-10	68 ± 7
20 M9 IL-4 + 20 ug IL-10	33 ± 11
4 Mg IL-4 + 4 ug IL-10	54 + 25
PBS kontrola	91 ± 20

Tabuľka 11 ukazuje veľkosť myšej tlapky po 24 hodinách od injekcie antigénu Leishmania. Odpoveď kontrolných zvierat, ktorým . bola podaná injekcia samotného PBS, je porovnaná s odpoveďou zvierat, ktorým bol podaný IL-4, IL-10 alebo kombinácia oboch v ♦ uvedených množstvách. Cytokiny boli podávané intraperitoneálne (ip) každých 12 hodín pod dobu 48 hodín s tým, že prvá dávka bola podaná 12 hodín pred vyvolaním reakcie antigénom. V každej skupine bolo 5 zvierat. Tieto výsledky ukazujú, že myšiam liečeným samotným IL-4 sa darilo približne rovnako ako myšiam liečeným PBS. Myši, ktoré boli liečené samotným IL-10, mali menšie opuchy ako kontrolné myši. Myši, ktoré s IL-10 mali najmenšie opuchy, po 20 Mg každého cytokinu.

boli liečené kombináciou IL-4 najmä skupina, ktorá bola liečená

Tabuľka 12

Kombinácia IL-4 s IL-10 inhibuje DTH na antigény L. major

1iečenie				veľkosť	tlapky	(mm.102)
50 Aig IL-4					73	+	11
50 /ug IL-10					65	+	12
50 /ug IL-4 +	50	Mg	IL-10		43	+	13
20 jug IL-4 +	20	Mg	IL-10 +	ICA	42	+	9
20 /ug IL-4 +	20	Mg	IL-10 +	QlL-10 + aIL-4	93	+	21
PBS kontrola					119	+	27

Tabuľka 12 ukazuje údaje druhého nezávislého pokusu. Rámec pokusu bol rovnaký až na to, že údaje o tlapke boli zisťované 48 hodín po injekcii antigénu Leishmania.

V každej skupine bolo 5 zvierat. Inhibičný účinok IL-4 a IL-10 bol blokovaný podávaním 2 mg monoklonálnej protilátky proti IL-4 a 5 mg monoklonálnej protilátky proti IL-10. Protilátky proti IL-4 a IL-10, použité ako kontroly, boli podané ip 12 hodín pred prvým podaním cytokinov. 5 mg izotypovej kontrolnej monoklonálnej protilátky (ICA), pridanej ako negatívna kontrola, nemalo na inhibíciu žiadny vplyv. ICA bola pridaná podľa už spomínaného Chatelaina a kol., 1992.

Protilátky proti IL-4 a IL-10 boli pridané preto, aby sa ukázalo, že kompetícia na IL-'-é a IL-10 znižuje účinok cytokinov. Tieto protilátky tiež dávajú ďalšiu kontrolu rekombinantne produkovaných cytokinov.

Tieto údaje ukazujú, že kombinácia IL-4 s IL-10 je na zníženie DTH reakcie zvieraťa účinnejšia ako ktorýkoľvek cytokin samotný. IL-10 samotný je účinnejší ako samotný IL-4, ale menej účinný ako kombinácia. Podávanie kombinácie cytokinov s monoklonálnymi protilátkami proti obom cytokinom vedie k negácii účinnosti liečenia cytokinmi.

Tabuľka 13

Produkcia IFN-Z z LN buniek miesta indukcie DTH liečenie

IFN-f (ng/ml)

20 Aig IL-4	147	± 34
20 /ug IL-10	109	± 49
20 /ug IL-4 + 20 zig IL-10	53	± 33
PBS kontrola	242	± 54

Údaje v tabuľke 13 boli získané podávaním cytokinov každých 12 hodín až do 24 hodín po vyvolaní reakcie antigénom, začínajúc 12 hodín pred vyvolaním reakcie antigénom. Bunky z lymfatických uzlín (LN) z miesta injekcie antigénu Leishmania boli odobraté zvieratám, ktorým bol podaný cytokin a antigén, 5 dní po vyvolaní reakcie antigénom.Stĺpec označený liečenie“ sa týka liečenia zvierat, ktorým boli odobraté bunky LN. Lymfatické uzliny boli stimulované in vitro pôsobením antigénu L. major získaného zmrazovaním a roztápaním. Supernatant bol testovaný na obsah IFN-f p o 72 hodinách. Uvedené údaje sú od troch jednotlivých zvierat (n = 3 ± štandardná chyba).

Tieto údaje ukazujú, že zvieratá liečené cytokinom poskytujú menej IFN-Γ ako kontroly liečené PBS. Naviac zvieratá, ktoré boli liečené kombináciou IL-4 s IL-10, mali oveľa menej IFN-Z akc· hociktoré iné z kontrolných zvierat, ktorému bol podaný jeden cytokin.

Tabuľka 14

IL-4 a IL-10 inhibícia produkcie IFN-Γ populáciou Thl pridané

IFN-f (ng/ml) nič ng/ml IL-10

100 ng/ml IL-4 ng/ml IL-10 a 100 ng/ml IL-4

100 ± 6 ± 4 + 2 ± 1

Na získanie údajov uvedených v tabuľke 14 boli z myší, na ktoré bolo vopred pôsobené anti-CD4, infikovaných L. major, po 4 týždňoch získané CD4+ T bunky (3,5.10⁵/jamku). Bunky boli stimulované in vitro antigénom L. major získaným zmrazovaním a roztápaním spoločne s plenocytmi zbavenými T buniek (5.10⁵/jamku), ako zdrojom APC. Hladiny IFN-f boli stanovené po 72 hodinách testom ELISA. Stĺpec označený ''pridané znamená látky pridané k médiu, v ktorom boli kultivované Thl bunky.

Údaje z tabuľky 14 ukazujú, že ako IL-4, tak i IL-10 pri samostatnom podávaní významne znižujú hladiny IFN-Γ produkované Thl bunkami v porovnaní s kontrolami liečenými PBS. Naviac, pridanie kombinácie IL-4 s IL-10 k médiu vedie k asi 50 % zníženiu IFN-Γ , ako pridanie ktoréhokoľvek cytokinu samotného.

Predchádzajúce údaje ukazujú, že IL-10 v porovnaní s kontrolami znižuje DTH odpoveď, opuchy a produkciu IFN-Γ z lymfatických žliaz všeobecne a z Thl buniek špecificky. Kombinácia IL-4 s IL-10 je lepšia ako samostatný IL-4 alebo IL-10 pri rovnakom dávkovaní. Kombinačná liečba s 20 Mg každého cytokinu vykazuje lepšie výsledky pri jednej liečbe než viac ako dvojnásobná dávka (50 /ug) ako IL-4, tak i IL-10. Dávka 20 Aig IL-4 alebo IL-10 podaná ako kombinačná liečba vykazuje teda priaznivejšie účinky ako 50 /1? buď IL-4 alebo IL-10, pokiaľ sú tieto podávané ako jediné terapeutické činidlo.

Príklad 13

Liečenie pacienta s diabetes mellitus typu I

Na liečenie bol vybratý pacient s diabetes mellitus typu I alebo s diabetes mellitus závislým od inzulínu, podľa diagnózy a podľa kritérií vyvinutých bucf National Diabetes Data Group alebo Svetovou zdravotníckou organizáciou. Pacient bol zo začiatku liečený 20 /ug ako IL-4, tak IL-10 na kg telesnej hmotnosti na deň. Ak pacient vážil 70 kg, začiatočná dávka bola 1400 Aig každého cytokinu denne. Táto dávka bola podávaná ako intravenózny bolus injekcie. Táto dávka bola zvyšovaná o 250 až 1000 jug na deň podľa znášanlivosti pacienta a podľa jeho odpovede. Po niekoľkých λ dňoch bola dosiahnutá optimálna dávka 7000 Aig na deň (100 /ug na kg na deň).

Pred prvým liečením a potom denne, až niekoľko dní po poslednom liečení, bol pacient sledovaný klinicky a laboratórne. Medzi laboratórne sledované parametre patrí glukóza v krvi a počet krviniek so zvláštnou pozornosťou zameranou na celkový počet bielych krviniek a jeho diferenciál. Sledovanie glukózy v krvi je dobre známe z liečenia diabetikov. Ďalej sa sledovalo, či množstvo bielych krviniek zostáva v normále alebo bez výraznej zmeny v porovnaní s množstvom pred liečením. Pokiaľ ide o diferenciál bielych krviniek, zvláštna pozornosť bola venovaná tomu, či sa nematurované formy objavujú v periférnej krvi a či je normálny pomer rôznych typov bielych krviniek konštantný, alebo či sa mení. Špeciálna pozornosť bola venovaná pomeru lymfocytov a monocytov v periférnej krvi.

, Je možné urobiť veľa modifikácií a variácií tohto vynálezu bez toho, aby sa tieto odchýlili od jeho rozsahu. Tu uvedené špe• cifické uskutočnenia sú príkladmi. Vynález je obmedzený len pripojenými patentovými nárokmi.

Zoznam sekvencií

Sekvencia vzorca I

Ser

Pro

Gly

Gin

Gly

Thr

Gin

Ser

Glu

Asn

Ser

Cys

Thr

His

Phe

1

5

10

15

Pro

Gly

Asn

Leu

Pro

Asn

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Alp

Phe

20

25

30

Ser

Arg

Val

Lyz

Thr

Phe

Phe

Gin

Met

Lyz

Asp

Gin

Leu

Asp

Asn

k

35

40

45

Leu

LEu

Leu

Lyz

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Asp

Phe

Lyz

Gly

Tyr

Leu

50

55

60

Gly

Cys

Gin

ALa

Leu

Ser

Glu

Met

íle

Gin

Phe

TYr

Leu

Glu

Glu

65

70

75

Val

Met

Pro

Gin

ALa

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Asp

íle

Lyz

Ala

His

80

85

90

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lyz

Thr

Leu

Arg

LEu

Arg

Leu

95

100

105

Arg

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lyz

Ser

Lyz

Ala

110

115

120

Val

Glu

Gin

Val

Lyz

Asn

Ala

Phe

Asn

Lyz

Leu

Gin

Glu

Lyz

Gly

125

130

135

íle

Tyr

Lyz

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

íle

Phe

íle

Asn

Tyr

íle

140

145

150

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Met

Lyz

íle

Arg

Asn

B

155

160

4

Sekvencia vzorca II

Thr

Asp

Gin

Cys

Asp

Asn

Phe

Pro

Gin

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

1

5

10

15

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

Val

Lyz

Thr

Phe

Phe

Gin

Thr

Lyz

Asp

Glu

20

25

30

Val

Asp

Asn

Leu

Leu

Leu

Lyz

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Asp

Phe

Lyz

35

40

45

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Met

íle

Gin

Phe

Tyr

50

55

60

Leu

Glu

Glu

Val

Met 65

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn 70

Gin

Asp

Pro

Glu

Ala 75

Lyz

Asp

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lyz

Thr

Leu

Arg

80

85

90

Leu

Arg

Leu

Arg

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lyz

95

100

105

Ser

Lyz

Ala

Val

Glu

Gin

íle

Lyz

Asn

Ala

Phe

Asn

Lyz

Leu

Gin

110

115

120

Glu

Lyz

Gly

íle

Tyr

Lyz

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

íle

Phe

íle

125

130

135

Asn

Tyr

íle

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

íle

Lyz

Ala

Arg

140

145

147

Sekvencia vzorca III

GGCCTGCAGCG ACGAGCCATG GTTGCTGGGA GCGACGCG

Sekvencia vzorca IV

TTCATCTTCT GGTACCAATC AATTGGAGTT GGTTC

Claims (4)

1. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že jeho použitie je zvolené zo skupiny pozostávajúcej z :

a) inhibovania proliferácie neoplastických buniek závislých od IL-2,

b) zvýšenia hladín IFN-Z,

c) liečenia zápalového črevného ochorenia,

d) zosilnenia inhibície produkcie cytokinu a

e) inhibovania hypersenzitívnej reakcie neskorého typu, pri- čom tento farmaceutický prostriedok obsahuje farmaceutický prijateľný nosič a na použitie ad a), prípadne b), c) d) alebo e) :

i) IL-10, ii) protilátky proti IL-4 a IL-10, iii) IL-10, iv) IL-4 a IL-10 a

v) IL-10.

2. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1 e) v), vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje IL-4.

3. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že ako IL-4 alebo IL-10 sa používa ľudský IL-4 alebo IL-10.

4. Spôsob výroby farmaceutického prostriedku, vyznačujúci sa t ý m, že jeho použitie je zvolené zo skupiny pozostávajúcej z :

a) inhibovania proliferácie neoplastických buniek závislých od IL-2, zvýšenia hladín IFN-Γ, liečenia zápalového črevného ochorenia, zosilnenia inhibície produkcie cytokinu a

b)

c)

d)

e) inhibovania hypersenzi t ívnej reakcie neskorého typu, pri-

čom tento spôsob zahrňuje zmiešanie farmaceutický prijateľné ho nosiča a na použitie ad a), prípadne b), c), d) alebo e) i) IL-10, ii) protilátok proti IL-4 a IL-10, iii) IL-10, iv) IL-4 a IL-10 a v) IL-10.

Spôsob sa t výroby podľa nároku 4 ý m, že ďalej obsahuje

e) v), v zmiešanie y z n a

IL-4 s čujú nosičom

IL-10.

výroby podľa nároku 4 alebo 5, ý a IL-10.

Spôsob sa t m, že ako IL-4 alebo IL-10 sa y z n a používa čujú ľudský IL-4

Použitie

IL-10, protilátok proti IL-4 a

IL-10,

IL-4 a IL-10 a

IL-10

IL-10, na a)

b)

c)

d)

e)

i) ii) iii) iv)

v) inhibovanie proliferácie neoplastických buniek závislých od IL-2, prípadne zvýšenie hladín IFN-Γ, liečenie zápalového črevného ochorenia, zosilnenia inhibície produkcie cytokinu a inhibovanie hypersenzitívnej reakcie neskorého typu.

8 .

Použi tie podľa nároku 7 e) v), v y znač tým, že i IL-4 sa podáva súčasne s IL- -10. Použitie i) IL-10, ii) protilátok proti IL-4 a IL-10, iii) IL-10, iv) IL-4 a IL- 10 a v) IL-10

u j ú c e sa

9 .

na výrobu liečiva pre :

a) inhibovanie proliferácie neoplastických buniek závislých od IL-2, prípadne,

b) zvýšenie hladín IFN-Γ,

c) liečenie zápalového črevného ochorenia,

d) zosilnenia inhibície produkcie cytokinu a

e) inhibovanie hypersenzitívnej reakcie neskorého typu.

10. Použitie podľa nároku 9 e) v), vyznačujúce sa h t ý m, že liečivo ďalej obsahuje IL-4.

• 11. Použitie podľa hociktorého z nárokov 7 až 10, vyznačujúce sa tým, že ako IL-4 alebo IL-10 sa používa ľudský IL-4 alebo IL-10.