KR20190066067A - 루푸스 치료를 위한 단일클론항체 및 이의 치료방법 - Google Patents

루푸스 치료를 위한 단일클론항체 및 이의 치료방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CD6과 CD6 리간드 활성화된 백혈구 세포 접착 분자(ALCAM)의 상호 작용의 차단없이 CD6의 SRCR 도메인1(D1)에 결합하는 인간화 IgG1항-CD6 단일클론항체(T1h)를 이용하여 루푸스를 치료하는데 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

루푸스 치료를 위한 단일클론항체 및 이의 치료방법
본 발명은 흉선 상피세포, 단핵 세포, 활성화된 T-세포 및 다양한 다른 세포 유형의 세포 표면에 존재하는 CD6의 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부(SRCR) 도메인 1(D1)에 결합하는 인간화 IgG1이소타입 항-CD6 단일클론항체(T1h)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 CD6과 CD6리간드의 활성화된 백혈구 세포 접착 분자(ALCAM)의 상호 작용을 차단하지 않으면서 T-세포의 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CD6의 SRCR 도메인 1(D1)에 결합하는 항-CD6 단일클론항체를 사용하여 루푸스를 치료하는데 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
인간 전신성 자가면역질환의 원형인, 루푸스는 다양한 다 기관 손상을 특징으로 한다. 결합 조직을 공격하는 항체를 포함하고있는 자가면역질환이다. 이 질병은 거의 100만명의 미국인, 주로 20-40세 사이의 여성에게 영향을 주는 것으로 추정된다. 루푸스의 주요 형태는 전신적인 것(전신 홍반성 루푸스, SLE)이며, 항핵 항체의 생성, 순환하는 면역 복합체 및 보체시스템의 활성화와 관련되어 있다. SLE의 발병 기전은 여전히 잘 알려져 있지 않지만, B세포, T세포 및 단핵구가 질병의 진행에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히, 다클론 B-세포 및 T-세포의 과도한 활성 증가가 있으며 이러한 증가는 다양한 자기 항원에 대한 T-세포 및 항체 반응의 생산을 특징으로 한다. T-세포의 활성화는 특정 에피토프(epitope)에 대한 자가 반응 B세포의 생산을 자극한 다음 다른 에피토프로 확산될 수 있다는 이론이 있다. 이러한 항체 반응은 전술한 바와 같이 항핵 항체(ANA) 및 항-이중 가닥 DNA 항체와 같은 자기 항원에 대한 자가 항체의 생산을 포함할 수 있다.
SLE는 해로운 과정/경로의 길항작용이나 유익한 과정/경로의 자극에 의해 면역 반응을 조절함으로써 치료될 수 있다. 면역자극활성을 갖는 분자를 억제하거나 면역 반응을 억제하는 중화 항체를 사용하는 것이 면역 관련 질병을 개선시키는 효과적인 방법이다.
CD6은 인간 T세포 및 B세포의 서브 세트뿐만 아니라 일부 B-세포 만성 림프구성 백혈병 및 뉴런에 의해 우세하게 발현되는 중요한 세포 표면 단백질이다. CD6은 타입 I 대식세포의 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부 도메인(SRCR)에 상동이 있는 적어도 하나의 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질의 큰 패밀리의 구성원이다.
항-CD6 단일클론항체(mAbs)를 이용한 블로킹 연구는 CD6이 흉선 상피(TE)세포와 T-세포 부착 상호 작용을 조절함으로써 T-세포 발달에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
추가적인 연구는 CD6이 T세포 활성화에 중요한 보조 분자로 기능할 수 있음을 나타내는 것이다. 예를 들어, 특정 항-CD6 mAb는 직접적으로 T세포에 대한 미토겐(mitogen)이며, 반면에 다른 것들은 항-CD3, 항-CD2 또는 포르볼 12 미리스테이트 13 아세테이트(PMA)[Gangemi et al., J. Immunol. 1989, 143:2439-2447; Osorio et al., Immunol. 1994, 154: 123-133; Aruffo et al., J. Exp. Med. 1991, 174:949-952]와 함께 T-세포 증식을 공동 자극시킬 수 있다. T-세포 활성화에 대한 CD6의 역할의 또 다른 증거는 CD6이 Ser 및 Thr 잔기에 과인산화[Swack et al., Mol. Immunol. 1989 26:1037-1049; Swack et al., J. Biol. Chem. 1991, 266:7137-7143; Cardenas et al., J. Immunol. 1990, 145:1450-1455] 및 Tyr 잔기에 인산화[Wee et al., J. Exp. Med. 1993, 177:219-223]되고, T-세포 활성화가 되는 것을 보여주는 연구에서 비롯된다. 이들 및 다른 연구들은 CD6이 생체 내(in vivo) 미숙 및 성숙 T-세포 모두의 중요한 조절제(modulator)로서 작용하여, T-세포 활성화 및 신호 전달 모두에 영향을 미치는 것임을 보여준다.
성숙한 CD6 단백질의 세포 외 도메인은 3개의 SRCR 도메인(이하 D1, D2 및 D3로 명명됨)으로 구성된다. D3는 막 근위 SRCR 도메인에 상응하며 짧은 33-아미노산 스토킹 영역(stalk region)이 뒤따른다. 이러한 세포 외 도메인은 짧은 막관통 도메인과 가변 길이의 세포질 도메인을 통해 세포막에 고정되어 있다[Liu, K. and E.K. Adv Exp Med Biol, 2001. 490: p. 1-6].
인간 IgG1 불변 도메인(CD6-Rgs)에 융합된 CD6의 선택된 세포 외 도메인을 포함하는 CD6-면역글로불린 융합 단백질을 이용한 연구는 “활성화된 백혈구 세포 접착 분자”(ALCAM)로 명명된 CD6 리간드의 동정 및 클로닝을 유도했다[Patel, et al., J. Exp. Med. 1995. 181:1563-1568; Bowen et al., J. Exp. Med 1995, 181:2213-2220]. ALCAM은 막 근위 SRCR 도메인에 해당하는 CD6의 도메인3에 결합한다[Whitney, et. al., J. Biol. Chem. 1995, 270: 18187-18190].
T-세포 조절에서 CD6/ALCAM 상호 작용의 역할에 대한 연구는 이 수용체-리간드 쌍이 흉선 상피 세포에 대한 CD6 발현 세포의 부착을 매개할 수 있음을 보여주었다[Bowen et al., J. Exp. Med 1995, 181:2213-2220]. 이 증거와 다른 증거는 CD6/ALCAM 상호작용이 T-세포의 발달과 활성화를 조절하는데 중요하다는 것을 시사한다.
CD6의 기능적 특성은 불완전하지만, T-세포 및 T-세포 전구체의 골수를 제거하기 위한 임상 환경에서 항 CD6 mAb가 성공적으로 적용되었다. 이러한 결과는 CD6이 생체 내(in vivo) T-세포 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다는 가설을 뒷받침한다. CD6은 또한 초기 및 후기 T-세포 항원 제시 세포(APC) 상호 작용을 매개하는 면역학적 시냅스의 일부인 것으로 보고되었다[Gimferrer I. J Immunol 2004. 173: 2262-2270].
미국 특허 제6,372,215호는 인간CD6(Hcd6) 또는 인간 CD6 스토크(stalk) 도메인(CD6S)의 SRCR 도메인3(D3)에 특이적으로 결합하고 CD6에 결합하는 활성화된 백혈구 세포 부착 분자(ALCAM)를 억제하는 항체 및 기타 결합제를 개시한다.
이전 간행물과 특허는 IOR-T1에서 T1h(인간화된 IOR-T1)으로 인간화하기 위해 수행된 쥐의 항- CD6(IOR-T1) 단일 클론 항체의 서열과 아미노산 변형들을 개시했다. 미국 특허 제 5,712,120호 및 이와 동등한 EP0699755는 마우스 단일클론항체를 인간화하는 특정 방법 및 IOR-T1 및 T1h의 서열이 개시한다. 미국 특허 제 6,572,857호 및 이와 동등한 EP0807125는 IOR-T1 및 T1h(인간화 IOR-T1)의 서열을 개시한다. Roque-Navarro 간행물[Roque-Navarro L., et. al., Hybridoma and Hybridomics 2003.22:245-257]은 마우스 단일클론항체를 인간화하는 특정 방법 및 IOR-T1 및 T1h의 서열에 대하여 논의한다. “단일클론항체 및 그 방법”이라는 제목의 PCT/IN2008/00562는다발성 경화증, 이식 거부 및 이식편 대 숙주 질환과 같은 자가면역질환의 치료로서 CD6의 표적화에 대해 논의한다.
루푸스의 치료를 위한 개선된 치료 방법 및 조성물에 대한 시급한 요구가 있다. 현재, 루푸스는 전형적으로 코르티코스테로이드 및 면역 억제제로 치료되고 있다. 몇몇 구체예에서, 항체는 림프구를 현저하게 고갈시키는데 사용되고, 다른 구체예에서는 림프구가 고갈되지 않는다. CD6에 결합하는 ALCAM을 방해하지 않으면서 CD6의 D1 도메인에 결합하여 T-세포 활성화를 억제하는 항-CD6 단일클론항체를 제공하는 것은 유익할 것이며 상기 항-CD6 단일클론항체는 루푸스를 치료하고 루푸스 타입의 질병에서 통상 발생하는 T세포의 증식을 억제하는 능력을 가지고 있다.
미국등록특허 제6,372,215호 미국등록특허 제5,712,120호 유럽등록특허 제0699755호 미국등록특허 제6,572,857호 유럽등록특허 제0807125호 PCT/IN2008/00562
Gangemi et al., Anti-T12, An Anti-CD6 Monoclonal-Antibody, Can Activate Human Lymphocytes-t, J. Immunol. 1989, 143:2439-2447. Bott et al., Activation of Human T-cells Through CD6 - Functional-Effects of A Novel Anti-CD6 Monoclonal-Antibody and Definition of 4 Epitopes of The CD6 Glycoprotein, Int. Immunol. 1993, 7:783-792. Morimoto et al., 2h1 - A Novel Antigen Involved In Lymphocyte-T Triggering, J. Immunol. 1988, 140:2165-2170. Osorio et al., The Anti-CD6 mab, IOR-t1, Defined a New Epitope on The Human CD6 Molecule That Induces Greater Responsiveness In T-cell Receptor/CD3-Mediated T-cell Proliferation, Cell. Immunol. 1994, 154: 123-133. Swack et al., Structural Characterization of CD6 - Properties of 2 Distinct Epitopes Involved In T-cell Activation Structural Characterization of CD6 - Properties of 2 Distinct Epitopes Involved In T-cell Activation, Mol. Immunol. 1989 26:1037-1049. Swack et al., Biosynthesis And Posttranslational Modification of CD6, a T-cell Signal-Transducing Molecule, J. Biol. Chem. 1991, 266:7137-7143.; Cardenas et al., Phosphorylation-Dephosphorylation of The CD6 Glycoprotein Renders 2 Isoforms of 130 and 105 Kilodaltons - Effect of Serum and Protein-Kinase-C Activators, J. Immunol. 1990, 145:1450-1455. Wee et al., Tyrosine Phosphorylation of CD6 By Stimulation of CD3 - Augmentation By The CD4 and CD2 Coreceptors, J. Exp. Med. 1993, 177:219-223. Aruffo et al., The Lymphocyte Glycoprotein-CD6 Contains a Repeated Domain-Structure Characteristic Of a New Family Of Cell-surface And Secreted Proteins, J. Exp. Med. 1991, 174:949-952. Wee, et al., Characterization Of A CD6 Ligand(s) Expressed On Human-Derived And Murine-Derived Cell-Lines And Murine Lymphoid-Tissues, Cell. Immunol. 1994, 158:353-364. Patel, et al., Identification And Characterization of A 100-Kd Ligand For CD6 On Human Thymic Epithelial-Cells, J. Exp. Med. 1995. 181:1563-1568. Bowen et al., Cloning, Mapping, And Characterization of Activated Leukocyte-Cell Adhesion molecule (ALCAM), a CD6 Ligand, J. Exp. Med 1995, 181:2213-2220. Whitney, et. al., The Membrane-Proximal Scavenger Receptor Cysteine-Rich Domain of CD6 Contains The Activated Leukocyte Cell-Adhesion Molecule-Binding Site, J. Biol. Chem. 1995, 270: 18187-18190. Gimferrer I. Relevance of CD6-mediated interactions in T-cell activation and proliferation, J Immunol 2004. 173: 2262-2270. Roque-Navarro L., et. al., Humanization of Predicted T-cell Epitopes Reduces the Immunogenicity of Chimeric Antibodies: New Evidence Supporting A simple Method, Hybridoma and Hybridomics 2003.22:245-257. Alonso-Ramirez, R., et al., Rationale for Targeting CD6 as a Treatment for Autoimmune Diseases. Arthritis. 2010: p. 130646. Rodriguez, P.C., et al., A clinical exploratory study with itolizumab, an anti-CD6 monoclonal antibody, in patients with rheumatoid arthritis. Immunol. Results. 2012, 2: p. 204-11. Blank, M. and Y. Shoenfeld, Experimental models of systemic lupus erythematosus: anti-dsDNA in murine lupus. Rheumatology (Oxford), 2005. 44(9): p. 1086-9. Liu, K. and E.K. Wakeland, Delineation of the pathogenesis of systemic lupus erythematosus by using murine models. Adv Exp Med Biol, 2001. 490: p. 1-6. Perry, D., et al., Murine models of systemic lupus erythematosus. J Biomed Biotechnol. 2011: p. 271694. Theofilopoulos, A.N. and F.J. Dixon, Murine models of systemic lupus erythematosus. Adv Immunol, 1985. 37: p. 269-390. Mannoor, K., et al., Expression of natural autoantibodies in MRL-lpr mice protects from lupus nephritis and improves survival. 2012, J Immunol. 188(8): p. 3628-38. Adhya, Z., S. Borozdenkova, and M.Y. Karim, The role of cytokines as biomarkers in systemic lupus erythematosus and lupus nephritis. 2011, Nephrol Dial Transplant. 26(10): p. 3273-80. Marian, V. and J.H. Anolik, Treatment targets in systemic lupus erythematosus: biology and clinical perspective. 2012 Arthritis Res Ther. 14 Suppl 4: p. S3. Poole, B.D., et al., Cytokines in systemic lupus erythematosus. J Biomed Biotechnol. 2010: p. 735169. Richards, H.B., et al., Interleukin 6 dependence of anti-DNA antibody production: evidence for two pathways of autoantibody formation in pristane-induced lupus. J Exp Med, 1998. 188(5): p. 985-90. Li, Y., et al., Anti-DNA B cells in MRL/lpr mice show altered differentiation and editing pattern. J Exp Med, 2002. 196(12): p. 1543-52.
본 발명은 T-세포의 활성화를 감소 또는 방지하고, T세포의 증식을 억제하며, 보체 의존성 세포 독성(CDC)의 유도를 감소시키고 CD6에 결합하는 ALCAM을 방해하지 않으면서 CD6의 도메인1(D1)에 결합하는 항-CD6 단일클론항체(T1h)에 관한 것으로, 상기 항-CD6 단일클론항체는 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산서열 또는 이의 약 97%이상 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 루푸스를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 루푸스로부터 고통받는 개체에게 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이루어진 항-CD6 단일클론항체의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 피부 홍반성 루푸스, 중추 신경계(CNS) 루푸스, 심혈관 증상, 폐 증상, 간 증상, 혈액학적 증상, 위장 증상, 근골격 증상, 신생아 홍반성 루푸스, 소아기 전신 홍반성 루푸스, 약물-유발성 홍반성 루푸스, 항-인지질 증후군, 또는 루푸스 증상을 일으키는 보체 결핍 증후군 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 하나 이상의 증상 또는 루푸스 시스템을 갖는 개체를 치료하는데 사용될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD6 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 세포는 진핵(예를 들어, 인간, 마우스, 원숭이 또는 토끼 세포와 같은 포유 동물)이거나 또는 원핵(예를 들어, 대장균 세포와 같은 박테리아 세포)일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 루푸스를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에게 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD6 단일클론항체 또는 이와 결합하는 항원 결합 단편을 개체에 투여하는 것을 포함하며, 상기 항-CD6 단일클론항체의 용도는 전염증성 사이토카인의 감소를 나타내는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD6 단일클론항체를 사용하여 염증성 증상을 조절하는 방법을 제공한다. 상기 단일클론항체는 화학 치료제, 면역 억제제, 항-말라리아 약물, 세포 독성제, 인테그린 길항제, 사이토카인 길항제 또는 호르몬과 병용될 수 있다.
상기 면역 억제제는 프레드니손(prednisone), 메토트렉세이트(methotrexate), 아자티오프린(azathioprine) 또는 시클로포스파미드(cyclophosphamide)를 포함할 수 있다. 중요한 것은 상기 본 항-CD6 단일클론항체의 투여는 면역 억제제의 감소된 양을 제공함으로써 다른 잠재적인 병원체에 대한 신체 방어를 약화시키고, 이로 인해 개체가 감염 및 다른 암과 같은 잠재적 질병에 민감하게 되는 면역 억제제의 부정적 효과를 피할 수 있게 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 항-핵 항체(ANA) 및/또는 항-이중가닥 DNA(dsDNA) 항체의 수준이 증가된 개체에서 T-세포의 활성화를 감소시키는 방법을 제공하며, 본 발명의 항-CD6 단일클론항체를 환자에게 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항-CD6 항체의 치료학적 유효량을 적어도 제2화합물과 조합하여 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 루푸스 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 제2화합물은 전형적으로 루푸스를 치료하는데 사용되는 치료제, 예를 들어, 표준 치료 또는 실험적 치료제이다. 본 발명의 병용 요법에서 상기 항-CD6 항체 및 추가 치료제는 환자에게 적절하게 임의의 순서로 투여될 수 있다. 상기 항-CD6 항체 및 추가 제제(들)은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 추가 제제(들)은 상기 항-CD6 요법 전 또는 후에 투여될 수 있다. 또한 본 발명은 이러한 병용 요법에 유용한 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 서열번호 3 또는 이의 상보체에 기재된 뉴클레오티드 서열; 및 (b) 서열번호 4 또는 이의 상보체에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 CD6의 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부(SRCR) 도메인(D1)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 루푸스 치료에 유용한 의약의 제조에 있어서 전술한 상기 항-CD6 항체의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 루푸스 이외의 자가면역질환이 없는 개체에 대한 치료 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 제조 물품을 제공한다: (a) 본 발명의 항-CD6 단일클론항체를 포함하는 용기; 및 (b) 개체에 루푸스를 치료하기 위한 지침이 담긴 패키지 삽입물, 상기 지침은 루푸스의 부정적 효과를 감소시키는데 효과적인 항체량을 대상에게 투여한다고 지시한다.
본 발명의 전술한 목적 및 측면 및 다른 목적 및 측면들은 본원의 도면 및 하기에 기술된 명세서에서 상세하게 설명된다.
도 1은 정상 및 SLE 마우스의 림프절을 외부에서 검사한 것을 나타내는 것이다: SLE 마우스(오른쪽 패널)는 팽창된 림프절(화살표로 표시)과 확대된 타액선을 보여준다.
도 2는 장기 무게와 림프샘 장애(lymphadenopathy)의 비교를 나타내는 것이다: 동물(n=6)은 60 또는 600 μg의 α-mCD6 또는 60 μg 랫드 IgG(이소타입 대조군)를 10일동안 복강내 투여하였다(복용량 당 3주, 격일로). 림프샘 장애 연구 종료 시점에서 (a)를 측정하고(범위 0-3; 림프절이 조금/ 전혀 부풀어오르지 않음에서 심함) 장기 무게를 측정하였다(b-d). 림프샘 장애 점수(a)와 비장의 크기(c) 및 타액선의 크기(d)에서 유의한 감소가 관찰되었다(p<0.05, 일원 분산 분석(one way ANOVA) 이후 다중 비교 테스트).
도 3은 세포 증식 분석 결과를 나타내는 것이다: 각 군으로부터 림프 세포의 단일 세포 현탁액을 항-mCD3 매개 증식시켰다. α-mCD6 처리군은 항-CD3매개 증식에서 유의한(p<0.05; 일원 분산 분석(one way ANOVA) 이후 다중 비교 테스트) 저 반응성을 나타내었다.
도 4는 사이토카인 분석 결과를 나타내는 것이다: 증식 분석에서의 상청액을 사이토카인 비즈 어레이(Cytokine Bead Array, CBA)분석에 의한 사이토카인 방출을 측정하는데 사용하였다. α-mCD6은 이소타입군(Isotype group)에 비해 처리군(분석 목적으로 두 그룹을 합쳤다)에서 IFN-γ(p<0.05; 맨-휘트니 테스트)의 분비를 유의하게 감소시켰다. TNF-α는 이소타입 처리군에 비해 처리군에서 더 낮았지만 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(p<0.09).
도 5는 혈청ANA 및 항-dsDNA항체 분석 결과를 나타내는 것이다: 이소타입 및 α-mCD6처리 마우스로부터의 혈청은 ELISA를 이용하여 ANA및 dsDNA항체를 분석(1:100 희석)하는데 사용되었다.
도 6은 마우스 치료를 위한 투약 요법을 나타내는 것이다.
도 7 (A) 플라스미드 및 게놈DNA로부터 유도된 T1h의 VH(서열번호 3) 및 Vk(서열번호 4)의 뉴클레오티드 서열; (B) VH(서열번호 1) 및 Vk(서열번호 2)의 아미노산 서열; (C) 서열차이를 강조하기 위해 본 특허(서열번호 2)에 개시된 서열과 비교하여 이전 공보(서열번호 5)에 개시된 Vk 아미노산서열 비교.
도 8은 T1h 및 ALCAM 또는 T1h 단독 존재 하에 CD6-Fc로 묶인 플레이트의 ELISA 기록을 나타내는 것이다.
도 9는 림프구에 대한 T1h의 용량 의존적 억제를 막대 그래프로 나타내는 것이다. 상기 도면은 다양한 농도(50 ug/ml, 25 ug/ml, 12.5 ug/ml, 6.25 ug/ml)에서 PHA활성화 림프구의 T1h억제 %를 나타내는 것이다. hR3(비 특이적 항체)를 동일한 농도로 사용하였다.
도 10은 알라마르 블루(Alamar Blue)를 사용한 CDC분석에서 리툭산(Rituxan)과 T1h사이의 세포 독성 배수 차이를 나타내는 것이다.
도 11은 T1h항체(5 ㎍ / ml), hR3항체(5 ㎍ / ml) 및 라파마이신(1.2 ㎍ / ml)을 처리하거나 또는 항체를 처리하지 않은(대조군) HUT78세포를 CO2 인큐베이터에서 37 ℃로 밤새 배양한 결과를 나타내는 것이다. 세포를 아넥신V(AnnexinV)표지 용액으로 처리한 후 유동 세포 계측 분석을 실시하였다. 가로축은 아넥신V FITC로그, 세로축은 PI/PE텍사스레드(Texas red).
도 12는 T1h항체(10 ㎍ / ml), hR3항체(이소타입 대조군)을 처리하거나 또는 항체를 처리하지 않은(대조군) 것을 PBMCs와 함께 CO2 인큐베이터에서 37 ℃로 5일동안 배양한 결과를 나타내는 것이다. 세포는 배양 전에 파상풍 변독소(Tetanus toxoid)로 자극되었다. 상기 증식은 알라마르 블루 염료(Alamar blue dye)로 측정하였다. T1h의 존재 하에 증식 억제는 관찰되지 않았다.
도 13은 라지(Raji)세포가 면역 형광에 의해 진정한 B세포이며 또한 MHCII항원을 발현한다는 것을 나타내는 것이다.
도 14는 미토마이신(mitomycin)이 처리된 라지(Raji)세포의 존재 하에 PBMC가 증식하는 것을 나타내는 것이다. 양성대조군은 PHA의 존재 하에 PBMC 성장을 보여준다. sT1h는 항체가 없거나 또는 hR3대조군과 비교하여 T세포 증식(t테스트에 의해 유의적으로)을 억제한다. 각 실험은 6개의 다른 웰(well)에서 얻은 평균 및 표준 편차이다.
본 발명은 ALCAM 결합을 방해하지 않으면서 CD6의 도메인1(D1)에 결합할 수 있고, T-세포의 증식을 억제할 수 있는 항-CD6 단일클론항체를 제공하며, 상기 항-CD6 단일클론항체가 전신 홍반성 루푸스로인한 염증 증상을 감소시킨다. 또한, 항-CD6 단일클론항체가 시험관 내(in vitro)에서 보체 의존성 세포 독성(CDC)를 유도하지 않는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한 당업계의 기술 범위 내에 있는 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 예를 들어, Sambrook, et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))를 참조한다.
정의
본 명세서에서 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가져야한다. 또한, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함하고 복수의 용어는 단수를 포함해야한다.
본 발명을 기술하고 청구할 때, 하기 용어가 본원에 제시된 정의에 따라 사용될 것이다.
본 발명에서 사용된, “루푸스(Lupus)”는 결합 조직을 공격하는 항체를 포함하는 자가면역질환 또는 장애이다. 루푸스의 주요 형태는 전신적인 것, 피부 SLE 및 아급성 피부 SLE를 포함하는 전신 홍반성 루푸스(SLE) 뿐만 아니라 다른 타입의 루푸스(신염, 신장 외, 뇌염, 소아, 비-신장, 원반 및 탈모증을 포함하는)를 포함한다.
본 발명에서 사용된, “항-CD6 항체(Anti-CD6 antibody)”는 일반적으로 인간 CD6(hCD6)의 SRCR 도메인1(D1)에 특이적으로 결합하는 항체이다. 본 발명의 바람직한 측면에서, CD6의 인간 SRCR 도메인 1에 특이적으로 결합하고 활성화된 백혈구 세포 접착 분자(ALCAM)결합을 방해하지 않는 천연 및 인위적으로 변형된 항체 및 항체 단편을 포함하는 항체 및 다른 면역글로불린이 제공된다.
본 발명에서 사용된, “개체(subject)”는 인간 개체이다. 일반적으로 이러한 개체는 루푸스 치료를 받을 자격이 있다. 본 명세서의 목적을 위해 그러한 자격이 있는 개체는 예를 들어 새로운 활성기(flare)로 새롭게 진단받았거나, 이전에 진단받았거나 새로운 활성기에 의존적인 만성 스테로이드에 걸리거나 또는 루푸스 발병에 위험이 있는 것과 같이, 하나 이상의 징후, 증상 또는 루푸스의 다른 지표를 경험하거나 경험하고 있거나 또는 루푸스로 진단된 개체이다.
본 발명에서 사용된, 루푸스를 진단하기 위해 사용되는 “증상(symptoms)”또는 다른 지표는 뺨에 발진, 원반형 발진 또는 붉게 일어난 반점; 햇빛에 대한 반응과 같은 감광성(photosensitivity); 코 또는 입에 있는 궤양과 같은 구강 궤양; 둘 이상의 주변 관절을 포함하는 비-부식성 관절염과 같은 관절염; 소변에 과도한 단백질과 같은 신장 질환; 발작(경련)과 같은 신경 징후; 및 용혈성 빈혈, 백혈구 감소증, 림프구 감소증 또는 혈소판 감소증과 같은 혈액학적 증상이 있다.
본 발명에서 사용된, “단일클론항체(monoclonal antibody, mAb)”는 실질적으로 균질한 항체 집단의 항체를 지칭하며; 즉, 해당 집단의 개별 항체가 미량으로 존재할 수 있는 자연적으로 발생하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일클론항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 결정기인 “에피토프(epitope)”에 대항하여 유도된다. 따라서, 수식어 “단일클론(monoclonal)”은 동일한 에피토프(epitope)에 대한 실질적으로 균질한 항체집단을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 단일클론항체는 당업계에 공지된 임의의 기술 또는 방법에 의해 제조될 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 당업계에 공지된 재조합 DNA 방법, 파지 항체 라이브러리를 사용하여 재조합적으로 생산된 단일클론의 단리 방법을 포함한다.
본 발명에서 사용된, “보체-의존성 세포 독성(Complement-dependent cytotoxicity)” 또는 “CDC”는 보체의 존재하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체로 된 분자(예를 들어, 항체)에 대한 보체 시스템의 제1성분의 결합에 의해 개시된다.
본 발명에서 사용된, “사이토카인(cytokine)”은 세포간 매개체로서 다른 세포에 작용하는 한 세포 집단에 의해 방출된 단백질에 대한 일반적인 용어이다. 그러한 사이토카인의 예는 림포카인(lymphokines), 모노카인(monokines); IL-1, IL-1 α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15 등의 인터류킨(ILs), TNF- α 또는 TNF -β와 같은 종양괴사인자가 있다.
본 발명에서 사용된 “성장-억제성(growth-inhibitory)”항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 예방 또는 감소시키는 항체이다. 예를 들어, 항체는 시험관(in vitro) 및/또는 생체 내(in vivo)에서 T-세포의 증식을 예방하거나 감소시킬 수 있다.
본 발명에서 사용된 “치료학적 유효량(therapeutically effective amount)”은 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 복용량 및 필요한 기간 동안의 유효량을 의미한다.
본 발명에서 사용된 “자가면역질환(autoimmune disease)”은 개체 자체의 조직 또는 기관으로부터 발생하거나 직접적으로 영향을 미치는 질병 또는 장애이며, 자기 항원(예, 핵 항원)의 에피토프에 특이적인 자가 항체의 분비와 같이, B세포에 의한 정상적인 신체 조직 및 항원에 반응하는 항체의 생산의 결과이거나 그로 인해 악화되는 것이다.
본 발명에서 사용된, 특정 항체에 의한 아폽토시스(프로그램된 세포 사멸)의 결정, 즉 예를 들어 T-세포의 아폽토시스를 유도하거나 유도하지 않는 것의 결정은 표준 아폽토시스 분석법(standard apoptosis assays), 예를 들어 아넥신V(annexinV), DNA단편화, 세포 수축, 소포체의 확장, 세포 단편화, 및/또는 막소포(세포 사멸체라고 불림)에 의해 결정된다.
본 발명에서 기술된 본 발명의 측면은 또한 ”구성된” 및 “본질적으로 이루어진” 측면을 포함한다.
본 발명의 첫 번째 측면에 따르면, 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 CD6에 결합하는 ALCAM을 방해하지 않으면서 CD6의 D1도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 항-CD6 단일클론항체가 제공된다. 상기 항-CD6 단일클론항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 3 및 서열번호 4를 포함하거나 또는 그 서열과 적어도 90%의 상동성을 가지며, 서열번호 1 및 서열번호 2를 코딩한다.
본 발명의 항-CD6 단일클론항체의 제조 방법
본 발명은 또한 개시된 항-CD6 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 핵산(들)을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 당업자라면 알 수 있듯이, 이는 항체의 성질에 따라 다양한 방법으로 수행될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산이 제공된다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있다. DNA, cDNA 또는 게놈 DNA, 핵산 유사체 및 합성 DNA 형태의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 범위 내에 있다. DNA는 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있으며, 단일가닥이면 코딩(센스) 또는 비-코딩(안티센스)가닥일 수 있다. 항-CD6 단일클론항체를 코딩하는 코딩 서열은 본 발명에서 제공된 코딩서열과 동일하거나 또는 상이한 코딩서열일 수 있으며, 이 서열은 유전 코드의 중복성 또는 축퇴성의 결과로서, 본 발명에서 제공된 DNA와 동일한 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 항-CD6 단일클론항체를 코딩하는 핵산(들)은 발현 벡터 내에 통합되어 염색체 외(extrachromosomal)이거나 또는 도입된 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 발현 벡터는 임의의 수의 적절한 조절 서열(전사 및 번역 조절 서열, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 인핸서, 복제기점 등을 포함하나 이에 한정되지는 않음) 또는 다른 구성 요소(선택 유전자 등)를 포함할 수 있으며, 이들 모두는 당업계에 공지된 바와 같이 작동 가능하도록 연결된다. 일부 경우에 2개의 핵산을 사용하여 각각 상이한 발현 벡터(예를 들어, 제1발현 벡터에는 중쇄, 제2발현 벡터에는 경쇄)에 넣거나, 또는 동일한 발현 벡터에 넣을 수 있다. 조절 서열의 선택을 포함한 발현 벡터(들)의 설계는 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등의 요소에 좌우될 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다.
일반적으로, 핵산 및/또는 발현은 재조합 숙주 세포를 생성하기 위해, 선택된 숙주 세포에 적합한 임의의 방법(예를 들어, 형질 전환, 형질 감염, 전기 천공법, 감염)을 사용하여 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있고, 그러한 핵산 분자(들)은 하나 이상의 발현 조절 요소(예를 들어, 벡터 내, 세포에 과정에 의해 생성된 구조체 내, 숙주 세포 게놈에 통합된)에 작동 가능하게 연결된다. 생성된 재조합 숙주 세포는 발현에 적합한 조건(예를 들어 유도체의 존재 하에, 적절한 비-인간 동물에서, 적절한 염, 항생제, 영양 보충제 등이 보충된 적절한 배양 배지에서 등)하에 유지될 수 있으며 이에 의해 코딩된 폴리펩타이드(들)이 생성된다. 어떤 경우에는 중쇄가 한 세포에서 생성되고 경쇄는 다른 세포에서 생성된다.
상기 발현 벡터는 재조합 숙주 세포 내에서 단일클론항체의 합성을 수득하기위해 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 대장균(E. coli) 세포, 사마귀(COS)세포, 중국 햄스터 난소(CHO)세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주세포로 형질 감염될 수 있다. 효모, 곤충, 및 식물세포는 재조합 항체를 발현하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 측면에서, 항체는 소 또는 닭과 같은 형질 전환 동물에서 생성될 수 있다.
항체 분자 생물학, 발현, 정제 및 스크리닝에 대한 일반적인 방법은 예를 들어, 문헌 Antibody Engineering, edited by Kontermann & Dubel, Springer, Heidelberg, 2001 and 2010에 기술되어 있다.
투여 방법
후술되는 사용 방법에서의 투여를 위해, 상기 항-CD6 단일클론항체는 투여 전에 비 독성의 약학적으로 허용 가능한 담체물질(예를 들어, 생리식염수 또는 인산 완충 식염수)와 혼합될 수 있으며, 정맥 내 또는 동맥 내 주사에 의한 비경구 투여(예를 들어, 주사)와 같은 의학적으로 적절한 임의의 방법을 사용하여 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용된 항-CD6 단일클론항체의 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 항체를 동결 건조 제형 또는 수용액 형태의 임의의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여 제조될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 투여된 용량 및 농도에서 수혜자에게 비 독성이며, 인산염, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산(ascorbic acid) 및 메티오닌(methionine)을 포함하는 항산화제; 옥타데실디메틸벤질암모늄(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)와 같은 방부제; 헥사메토늄 클로라이드(hexamethonium chloride); 벤즈알코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 벤즈에토늄 클로라이드(benzethonium chloride); 페놀(phenol), 뷰틸(butyl) 또는 벤질(benzyl) 알코올(alcohol); 메틸(methyl) 또는 프로필(propyl) 파라벤(paraben)과 같은 알킬 파라벤(alkyl parabens); 카테콜(catechol); 레조르시놀(resorcinol); 시클로헥사놀(cyclohexanol); 3-펜탄올(3-pentanol) 및 m-크레졸(m-cresol); 저분자량(약 10잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)과 같은 친수성 중합체; 글라이신(glycine), 글루타민(glutamine), 아스파라긴(asparagine), 히스티딘(histidine), 아르기닌(arginine) 또는 라이신(lysine)과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노오스(mannose) 또는 덱스트린(dextrins)을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로즈(sucrose), 만니톨(mannitol), 트레할로스(trehalose) 또는 소르비톨(sorbitol)과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN™PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다.
상기 항-CD6 단일클론항체는 또한 예를 들어 코아세르베이션(coacervation)기술에 의해 또는 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로오스(hydroxymethylcellulose) 또는 젤라틴-마이크로 캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트(methylmethacylate)) 마이크로 캡슐과 같은 계면 중합 각각에 의해 마이크로 캡슐에 포획되거나, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노 입자 및 나노 캡슐)에 포획되거나 또는 매크로에멀젼(macroemulsions)에 의해 포획될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.
서방성제제가 준비될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항-CD6 단일클론항체를 포함하는 고체-소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 매트릭스는 성형된 제품의 형태 예를 들어, 필름 또는 마이크캡슐과 같은 형태로 존재한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르(polyesters), 하이드로겔(hydrogels), L-글루탐산의 공중 합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트(ethylene-vinyl acetate) 및 분해성 락트산-글리콜산(lactic acid-glycolic acid) 공중 합체를 포함한다.
상기 항-CD6 단일클론항체는 예컨대 볼러스(bolus)로서 정맥 내 투여와 같은 공지된 방법 또는 근육 내 복강 내, 뇌 척수막 내, 피하, 관절 내, 활액낭 내, 척수 강내 또는 구강 경로에 의한 일정 시간에 걸친 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 상기 항-CD6 단일클론항체의 정맥 또는 피하 투여가 바람직하다.
본 발명에 따른 루푸스 관련 질환의 치료에는 사용된 항-CD6 단일클론항체의 “치료학적 유효량”을 포함한다. 주목할만하게, 치료학적 유효량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 개개인의 체중과 같은 요소 및 개개인에서 목적하는 반응을 도출해내기 위한 항-CD6 단일클론항체의 능력에 따라 달라질 수 있다.
복용법은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼러스(bolus)가 투여될 수 있고, 여러 번 분할된 용량이 시간이 지남에 따라 투여될 수 있고 또는 복용량은 치료 상황의 긴급한 사정에 따라 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항-CD6 단일클론항체의 유효량 및 복용법은 루푸스-타입 질환의 중증도에 의존적이며, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항-CD6 단일클론항체의 치료학적 유효량에 대한 예시적 비-제한 범위는 개체 체중 당 약 0.01-100mg/kg, 예를 들어 0.01-50mg/kg, 예를 들어 약0.01-25mg/kg이다. 당업계의 통상의 지식을 가진 의료 전문가는 필요한 약학 조성물의 유효량을 용이하게 결정할 수 있고 요구되는 약학적 조성물의 유효량을 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사는 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 수준보다 낮은 수준으로 항-CD6 단일클론항체 투여량을 시작할 수 있고, 원하는 효과가 달성될때까지 점차적으로 투여량을 증가시킬 수 있다.
일 실시 양태에서, 항-CD6 단일클론항체는 개체 체중 당 1 내지 500mg/kg, 예를 들어, 20 내지 200mg/kg의 주간 복용량으로 주입에 의해 투여된다. 이러한 투여는 예를 들어 1 내지 8회, 예컨대 3내지 5회 반복될 수 있다. 대안적으로, 투여는 2 내지 24시간 동안, 예컨대 2 내지 12시간의 기간 동안 연속 주입으로 수행될 수 있다.
일 실시 양태에서, 항-CD6 단일클론항체는 10mg 내지 200mg의 주간 복용량으로 7회까지, 예를 들어 4 내지 6회 투여된다. 상기 투여는 2내지 24시간, 예컨대 2 내지 12시간의 기간 동안 연속 주입에 의해 수행될 수 있다. 이러한 용법은 필요에 따라, 예를 들어 6개월 또는 12개월 후에 1회 이상 반복될 수 있다.
다음의 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시되었지만, 본 발명의 범위를 어떤식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 실시예는 분석 과정에서 사용된 통상적인 방법에 대한 상세한 설명을 포함하지 않는다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 수많은 문헌에 기재되어 있다.
실험예 1
CD6은 주로 림프구에서 발현되며, 많은 자가면역질환과 관련이 있는 보조자극분자이다[Alonso-Ramirez, R., et al., Arthritis. 2010: p. 130646; Rodriguez, P.C., et al., 2012, 2: p. 204-11]. 항-마우스 CD6(α-mCD6)은 CD6의 도메인1에 특이적으로 결합하고 이톨리쥬맙(Itolizumab)의 대리 항체이다. 이 항체를 사용하는 이전의 연구는 마우스에서 다발성 경화증에 대한 모델인 EAE(실험적인 자가면역 뇌염)의 유의한 개선을 나타냈다. 현재 연구에서, 항체는 MRLFas/Ipr 마우스에서 평가되는데, 이는 인간의 루푸스 유사 질환을 위한 관련 마우스 모델이다. α-mCD6 처리는 이소타입 대조군(isotype control)에 비해 림프샘 장애, 비장 및 타액선 괄약근의 유의한 감소를 보였다(p<0.05). α-mCD6를 처리한 동물은 IFN-γ(p<0.04) 및 TNF-α(p<0.09)와 같은 전염증성 사이토카인의 방출 감소와 함께 항-CD3 매개 T-세포 증식 분석에서 저반응성(hypo-proliferation)을 보였다.
MRLFas/Ipr 마우스는 자가면역질환과 같은 루푸스에서 사용되는 잘 알려진 동물 모델이다[Blank, M. and Y. Rheumatology (Oxford), 2005. 44(9): p. 1086-9; Liu, K. and E.K. Wakeland, Adv Exp Med Biol, 2001. 490: p. 1-6; Perry, D., et al., J Biomed Biotechnol. 2011: p. 271694; Theofilopoulos, A.N. and F.J. Dixon, Adv Immunol, 1985. 37: p. 269-390]. 이 모델은 주로 B 및 T-세포의 증식에 우세하게 영향을 주는 Fas 유전자에 자발적 돌연변이를 갖는다. 이 돌연변이는 림프구의 조절되지 않는 증식으로 아폽토시스를 막아, 도 1에서와 같이 림프절(림프샘 장애), 타액선 및 비장의 엄청난 증대를 초래한다. 이 모델은 또한 인간에서 루푸스 신염과 유사한 사구체 신염을 보여준다[Mannoor, K., et al., 2012, J Immunol. 188(8): p. 3628-38]. 마우스에서 질병 발병은 8주부터 16-18주 사이에 사망할 때까지이다[Perry, D., et al., J Biomed Biotechnol. 2011: p. 271694; Theofilopoulos, A.N. and F.J. Dixon, Adv Immunol, 1985. 37: p. 269-390].
전신 홍반성 루푸스(SLE)는 주로 중년 여성(여자 대 남자 비율 9:1)에 영향을 미치는 자가면역질환이다. SLE의 특징으로는 피부 발진, 관절통, 재발성 흉막염 및 신장질환이 있다.
이 연구는 이 루푸스 모델에서 α-mCD6의 용도에 대해 설명한다. 동물(그룹당 n=6, 12주령)에 60 및 600 μg/복용량의 α-mCD6 또는 60 μg/복용량의 랫드 IgG(이소타입 대조군)을 복강 내(i.p.) 10일간(복용량 당 3주) 처리하였다. 16주령에 동물을 희생시켰다. 테스트한 요법은 도 6에 나타난다. 연구가 끝난 다음 매개 변수가 평가되었다.
- 림프샘 장애의 측정 이후 연구가 끝난 시점에서 장기 수집 및 평가
- 연구 기간 동안 단백뇨(Proteinuria)-측정
- 연구 종결 시 혈액 수집
- 림프절과 비장을 이용한 증식 분석
- 마우스 혈청으로부터 항-핵 항체 및 항-이중가닥 DNA 항체 측정
- 증식 분석으로부터 사이토카인 분석
결과:
α-mCD6가 적용된 특정 림프 기관의 감소와 이와 관련된 림프샘 장애의 감소는 연관되어 있음
α-mCD6 항체를 처리한 루푸스 마우스는 도 2에 나타난 바와 같이, 림프샘 장애 점수 및 기관 즉, 비장, 타액선의 무게가 이소타입 대조군과 비교하여 유의한 감소를 보였다. 그룹들 사이에서 단백뇨, 신장 및 흉선 크기의 차이는 없었다(데이터는 표시되지 않음).
처리된α-mCD6 는 전염증성 사이토카인의 감소와 이와 관련된 항-CD3매개 증식에 저반응성을 보임
α-mCD6로 처리한 동물의 림프절 유도 세포는 이소타입이 처리된 그룹과 비교하여 항-CD3에 의한 T세포 증식에 저반응성을 나타내었으며(p<0.05), 이는 도 3에 나타난 바와 같이 질병 억제와 관련된 T세포 활성화의 억제를 나타내는 것이다.
사이토카인은 SLE의 발병에 중요한 역할을 한다[Adhya, Z., S. Borozdenkova, and M.Y. Karim, 2011, Nephrol Dial Transplant. 26(10): p. 3273-80; Marian, V. and J.H. Anolik, 2012 Arthritis Res Ther. 14 Suppl 4: p. S3; Poole, B.D., et al., J Biomed Biotechnol. 2010: p. 735169; Richards, H.B., et al., J Exp Med, 1998. 188(5): p. 985-90]. Th1/Th2/Th17사이토카인은 증식 분석에서 상청액으로부터 측정되었다. 도 4에 나타난 바와 같이, α-mCD6 처리군은 대조군과 비교하여 IFN-γ및 TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인의 더 낮은 방출을 보여준다. 그러나, 그룹간에 평가된 다른 사이토카인(IL-2, IL-6, IL-10 및 IL-17)에서는 차이가 없었다.
α-mCD6가 처리된 동물은 B 세포 반응에 영향을 줄 수 있음
항-핵 항체(ANA)와 항-dsDNA는 일반적으로 루푸스 병에서 관찰되는 주요 자가항체이다. 이것은 또한 이 동물 모델에서도 관찰된다[Blank, M. and Y. Rheumatology (Oxford), 2005. 44(9): p. 1086-9; Perry, D., et al., J Biomed Biotechnol. 2011: p. 271694; Theofilopoulos, A.N. and F.J. Dixon, Adv Immunol, 1985. 37: p. 269-390; Li, Y., et al., J Exp Med, 2002. 196(12): p. 1543-52]. 도 5에 나타난 바와 같이, 이소타입 처리군과 비교하여 α-mCD6의 처리는 마우스 혈청에서 ANA 및 항-dsDNA항체가 더 적게 관찰되었다. 하지만 이 감소는 통계적으로 유의미한 감소는 아니었다.
이 초기 용량 조사연구에서 60 및 600 μg/복용량은 측정된 물리적 및 생물학적 종점에서 비교할만한 효능을 보였다. 이것은 60 μg/복용량에 의한 용량 포화를 시사한다. 따라서 α-mCD6 항체의 사용은 마우스 모델에서 루푸스 유사 증상을 완화시킬 수 있음을 보여주었다.
실험예 2
ELISA에 의하면 T1h및 ALCAM은 CD6의 동일한 도메인에 결합하지 않음
다양한 농도의 ALCAM-Fc를 CD6-Fc로 코팅된 ELISA 플레이트에 T1h의 고정된 농도로 함께 배양할 때, T1h는 ALCAM-Fc의 모든 농도에서 검출되었다. 이 실험은 T1h가 ALCAM 결합 도메인(도메인3)과 다른 도메인에 결합한다는 것을 시사한다.
rhCD6FC/키메라(R 및 D 시스템)(100 μg/ml)를 코팅 버퍼(coating buffer)로 희석시키고 100μl를 96 웰(well) 넉-막시솔프 (Nunc-Maxisorp) 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 그런 다음 플레이트를 4°C에서 밤새 배양했다. 플레이트를 PBS Tween 20으로 3회 세척하였다. 이어서, 차단 용액(1%PBS 내 2% BSA+0.1%Tween 20) 200 μl를 첨가하고 37°C에서 1시간동안 배양하였다. 배양 후 플레이트를 PBS Tween으로 다시 3회 세척한 후, 다양한 농도의 T1h 단일클론항체(0.2mg/ml) 및 rhALCAMFc(R 및 D시스템)을 첨가하였다. 이것을 37°C에서 1시간동안 배양하였다. 이후 플레이트를 PBS Tween으로 3회 세척하였다. 웰에 블로킹 완충액으로 희석한 항 인간 IgG(Fab)2 ALP(1:20000)의 200 μl을 첨가하고 37°C에서 1시간동안 배양하였다. 플레이트를 PBS Tween으로 3회 세척하고 p-니트로페닐 포스페이트(PNPP)기질 200 μl을 각 웰에 첨가하고 37°C에서 배양하여 15분동안 발색시킨다. 판독(Reading)은 BIOTEK 마이크로 플레이트 리더기를 이용하여 405nm에서 수행하였다. 실험은 다양한 농도의 ALCAM의 존재가 T1h가 CD6 수용체에 결합하는 것을 방해하지 않음을 나타내는 것이다. 그림8에 나타난 바와 같이 ALCAM과 T1h사이의 경쟁이 없다는 것은 둘에 대한 결합 도메인이 다름을 암시한다.
실험예 3
CFSE를 이용한 유동 세포 계측법에 의한 림프구 증식 억제
PBMC를 수확하고 PBS로 세척하였다. 세포(7.5X106)를 PBS 중 2 μM카르복시플루오레신 숙신이미딜 에스테르(carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSF) 농도 1ml에 재현탁시켰다. 세포를 정확히 37°C에서 10분간 배양하였다. 로즈웰 파크 기념 연구소(RPMI)의 10ml, 10%FBS를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 세포를 10ml의 PBS로 2회 세척하였다. 세포 조제물을 1.5 X 106세포/ml의 세포 밀도에서 5ml의 PBS로 재현탁시키고 200μl를 각 BD FACS 튜브에 첨가하였다. 다양한 농도(50 μl/ml, 25μl/ml, 12.5 μl/ml 및 6.25 μl/ml)에 필수적이며 비특이적 항체 200μl를 첨가하고 37°C에서 30분간 배양하였다. 2ml 의PBS를 각 튜브에 첨가하고 실온에서 5분간 1200RPM으로 원심분리하여 비 결합 항체를 세척하였다. 1ml의 RPMI, 10%FBS를 각 튜브 내의 펠렛에 첨가하였다. RPMI 10% FBS 중의 1ml의 PHA 20 μg/ml를 각각의 튜브에 첨가하여 증식을 자극하였다. 튜브의 총 부피는 2ml이고 PHA의 최종 농도는 10 μg/ml이다. 튜브를 볼텍싱(vortexed)하고 37°C에서 3일동안 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고 4°C에서 1200RPM으로 5분동안 스핀다운하였다. 상청액을 버리고 1 X PBS 500 μl에 재현탁시켰다. 총 20000사건은 초당 약 200건의 사건에서 수집되었으며, FITC 채널에서 관측되었다.
억제(inhibition) % ={[PHA-(T1h+PHA)]/PHA}*100
(상기 PHA=PHA세포 단독, PHA+T1h = (PHA+T1h)-세포 단독, PHA+hR3 = (PHA + hR3)-세포 단독)
세포 단독(cells alone)는 CFSE+세포이다.
이 데이터는 T1h항체가 PHA자극된 림프구의 증식 억제를 용량 의존적인 방법으로 매개한다는 것을 시사한다. 억제 비율은 정상인 사이의 고유한 편차로 인해 개인마다 다를 수 있다. 그러나 전반적으로, 도 9에나타난 바와 같이 PHA 자극된 림프구의 용량 의존적 억제는 T1h에서는 관찰되었지만 비특이적 항체 hR3에서는 관찰되지않았다.
실험예 4
T1h는 보체 의존성 세포 독성(CDC)를 매개하지 않음
알라마르 블루(리자주린) 기반 분석법은 세포 살상을 촉진하는 항체의 능력을 측정하는데 사용된다. 이것은 항체가 세포 표면 항원에 결합함으로써 표적 세포 용해를 일으키는 보체를 고정 및 활성화시킴으로써 유도된다. 리자주린(Resazurin)은 산화 환원-활성 염료로 환원시 파란색에서 분홍색으로 변한다.
전체 혈액으로부터 혼합 인간 혈청을 멸균 튜브에 수집하고, 혈액을 실온에서 4시간이상 응고시키고, 900g에서 20분동안 원심 분리하였다. 혈청을 수확했다; 분주하고 -80°C에서 보관하였다. 표적 세포(Wil-2S/HUT-78)를 희석 완충액으로 세척하고, 2 x 105세포/mL로 재현탁시켰다. 항체를 목적하는 최종 농도의 4배의 희석된 완충액으로 희석시켰다. 보체를 목적하는 최종 농도의 4배로 희석시켰다(즉, 1:10의 최종 농도애 대해 1:2.5 희석). 50μL 의 각희석된 항체, 희석된 보체 및 50μL의 세포 현탁액(10,000세포/웰)을 96-웰 평면-바닥 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 다음과 같은 대조군 웰(well)이 포함된다: 표적 세포 +Ab 단독(자발적 세포 사멸), 표적 세포+혈청 단독(배경 용해), 및 표적 세포+10% SDS(최대 세포 사멸을 위한). 양성대조군은 상이한 농도의 리툭산(Rituxan)으로 처리된 Wil-2S 세포였다. 96-웰 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 배양하였다. 알라마르 블루 50 μL /웰을 각 웰에 넣고 37°C에서 밤새 배양하였다. 형광은 530nm 조사, 590nm 방출 및 감도 = 35인 분광 광도계 Biotek Synergy.TM. HT에서 측정되었다. 그 결과 도 10에 나타난 바와 같이 T1h가 리툭산에 비해 CDC를 유도하지 않는다는 것을 시사한다. 따라서, 이 실험의 결과는 항-CD6 단일클론항체가 CD6을 발현하는 세포주, 즉 HUT78에서 CDC를 유도하지 않음을 결정적으로 증명한다.
실험예 5
T1h는 HUT78세포에서 아폽토시스를 유도하지 않음
세포 사멸의 특징 중 하나는 포스포티딜세린(phosphotidyl serine, PS)이 원형질막 내부에서 외부로 전이하는 것이다. 세포 사멸 세포막의 외부 전단에 존재하는 포스포티일 세린(phosphotidyl serine)의 분석은 세포 사멸성 및 괴사성 세포 구별을 위해 아넥신-V-플루오레세인 및 프로피듐 요오드화물(PI)을 이용하여 수행하였다. 아넥신 V는 포스포티딜 세린(phosphtidyl serine)에 대해 높은 친화성을 갖는 Ca2+의존성 인지질 결합 단백질이다. PI가 별개의 괴사성 세포에 결합하는 동안, 아넥신-V-플루오레세인은 세포 사멸 세포에 결합한다. 이 방법은 세포 사멸성 및 괴사성 세포 집단을 구별하는데 도움된다. 초기 세포 사멸 개체군은 아넥신 V만 양성균이지만 후기 세포 사멸은 아넥신V및 PI 모두 양성균이다.
세포를 수확하고 3.3 X 105세포/ml(최종 세포: 5 X 105세포)의 1.5ml를 각 35mm 접시에 뿌렸다. 요구되는 항체의 양을 각각의 접시에 첨가하여 최종 농도(5μg/ml)를 만들었다. 대조 접시에는 항체가 첨가되지 않았다. 양성 대조군 세포를 1.2μg/ml의 농도에 라파마이신과 함께 배양하였다. 세포를 5% CO2 인큐베이터에 밤새 배양하였다. 세포를 FACS 튜브 BD Falcon Cat No:352054로 옮기고 실온(RT)에서 1200RPM으로 5분간 원심분리하였다. 상청액을 버리고 2ml의 PBS에 재현탁시키고 실온에서 5분간 1200RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 버리고 100μl의 아넥신-V-플루오레세인 표지 용액을 첨가하고 실온에서 10-15분 동안 배양하였다. 세포를 2ml의 PBS로 세척하고 1200RPM에서 5분간 원심분리 하였다. 상청액을 버렸다. 세포를 0.5ml의 PBS에 재현탁시키고, 유동세포 계측기(3000세포가 게이팅됨)에 의해 획득되었다. 샘플은 아넥신 V의 경우 FITC채널에서, PI의 경우 PE 텍사스 레드(Texas Red)채널에서 판독되었다. 라파마이신 투여군에서 아넥신 V단독 및 PI 단독 샘플은 보상을 가능하게하기 위해 실행되었다.
T1h로 처리한 HUT78 세포는 40%의 아폽토시스를 보였으며, 이는 아넥신 V FITC 채널에 처리되지 않은 대조군과 거의 동일하다. 처리되지않고 비특이적인 항체(hR3항체)가 처리된 세포에서는 각각 35.3% 및 36.5%의 아폽토시스를 보이는 반면 양성 대조군 라파마이신은 54.3%의 아폽토시스를 보였다. 이 데이터는 도 11에 나타난 바와 같이 T1h가 HUT789세포에서 아폽토시스를 매개하지 않는다는 것을 시사한다.
실험예 6
파상풍 변독소 매개 T세포 증식 분석에서 T1h에 의한 기억 T세포 억제 없음
PBMC를 피콜-파크(Amersham Cat No: 17-14403-03), 밀도 구배 원심 분리법으로 단리하였다. 버퍼코트는 건강한 기증자로부터 얻어지며 항상 신선항 상태로 수확된다. 이어서 PBMC를 PBS(인비트로젠)에서 세척하였다. PBMC를 0.3 X 106세포/ml의 세포 밀도에서 보충된 5% FBS 가 첨가된 2ml의 RPMI배지에서 재현탁시켰다. 그 후, 세포를 T1h 10 μg/ml 및 무균 BD FACS 5ml 튜브에서 비특이적 대조군으로 사용되는hR3의 존재 또는 부재하에 30분동안 배양하였다. 배양 후 세포를 볼텍싱(vortexed)하고 세포 현탁액 100 μl를 각각 웰에 첨가하였다. 100 μl 의 파상풍 변독소 (Cat #582231, CALBIOCHEM) (10 μg /ml) 작동 용액 (RPMI media with 5% FBS) 를 각 웰에 첨가하여 기억 T-세포 증식을 자극하였다. 플레이트를 37°C에서 CO2 인큐베이터에서 5일 동안 배양하였다. 65μl 의 알라마르 블루를 각 웰에 넣고 37°C에서 CO2 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 형광은 530nm 조사, 590nm 방출 및 감도 = 35인 분광 광도계 Biotek Synergy.TM. HT에서 측정되었다.
도 12에 제시된 실험 결과는 파상풍 변독소가 투여량 의존적인 방법으로 T세포의 증식을 자극하지만, T1h는 이러한 세포 증식의 억제를 나타내지 않는다는 것을 나타내는 것이다. 이는 T1h가 기억-T세포의 증식을 억제하지 않는다는 것을 강하게 암시한다. 이것은 순환 기억 T세포 증식이 영향을 받지 않으며, T1h치료 환자가 감염되기 쉽지 않기 때문에 T1h치료에 유리하다.
실험예 7
T1h는 PBMCs와 라지(Raji)세포에 의해 매개된 혼합 림프구 반응에서 T-세포의 증식을 억제함
라지(Raji)/PBMC세포를 수확하고 1 X PBS에 재현탁시켰다. 라지세포/PBMCs의 8 X 105세포/ml를 1ml의 미토마이신(25 μl/ml)에 재현탁시켰다. 세포를 37°C에서 CO2 인큐베이터에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후 5% FBS 가 첨가된 2ml의 RPMI를 각 튜브에 첨가하고 실온에서 5분간 1200RPM으로 원심분리하여 미토마이신을 제거하였다. 상청액을 버리고 5 FBS가 첨가된 2ml의 RPMI를 첨가하고 원심분리하였다. 상청액을 버리고 세포를 RPMI배지에 재현탁시켰다.
96 웰 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 50 μl의 PBMS(4 X 105세포/ml)를 첨가하였다. 100 μl의 항체 희석 T1h 또는 hR3(10 μg/ml)을 각 웰에 첨가하고 37°C에서 CO2 인큐베이터에서 30분동안 배양하였다. 50 μl의 미토마이신이 처리된 라지(Raji)세포(4 x 105 cells/ml)를 각각의 웰에 첨가하였다. 분석과 함께 포함된 대조군은 미토마이신 처리된 라지(Raji)세포 단독, PBMC 단독, 미토마이신 처리된 라지(Raji)세포+PHA, 미토마이신 처리된 라지(Raji) + PBMC였다. 플레이트를 37°C에서 CO2 인큐베이터에서 5일동안 배양하였다. 65 μl 의 알라마르 블루를 각 웰에 넣고 37°C에서 CO2 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 형광은 530nm 조사, 590nm 방출 및 감도 = 35인 분광 광도계 Biotek Synergy.TM. HT에서 측정되었다. 그 결과 T1h는 라지(Raji)세포가 항원 제시 세포 및 PBMC인 편도 MLR을 특이적으로 억제할 수 있다는 것을 도 13 및 14의 결과를 통해 알 수 있다.
<110> Biocon Limited <120> A MONOCLONAL ANTIBODY AND A METHOD OF USE FOR THE TREATMENT OF SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS <130> PCT00713 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Tyr Asp Leu Asp Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Arg Ser Tyr 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Leu Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> exon <222> (1)..(357) <400> 3 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caagtttagt agatatgcca tgtcttgggt tcgccaggct 120 ccggggaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtagtta catctactat 180 ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgtcaagaa caccctgtat 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagacgagat 300 tacgacctgg actactttga ctcctggggc caaggcaccc ttgtcaccgt ctcctca 357 <210> 4 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> exon <222> (1)..(318) <400> 4 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat cggtgggaga cagagtcact 60 atcacttgca aggcgagtcg ggacattaga agctatttaa cctggtacca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaagaccct gatctattat gcaacaagct tggcagatgg ggtcccgtcg 180 agattcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggagtct 240 gacgatacag caacttacta ctgtctacaa catggtgaga gtccaacgct cggctcgggg 300 accaagctgg aaatcaaa 318 <210> 5 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asp Ile Arg Ser Tyr 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 100 105

Claims (25)

  1. CD6에 결합하는 ALCAM을 방해하지 않고 CD6의 도메인1(D1)에 결합하는 항-CD6 단일클론항체(T1h)를 포함하는 개체에서 루푸스를 치료하기 위한 조성물로서, 상기 항-CD6 단일클론항체는 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항-CD6 단일클론항체가 개체에서 루푸스의 증상을 감소시키기 위한 치료학적 유효량인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 루푸스는 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 피부 홍반성 루푸스, 중추 신경계(CNS) 루푸스, 신생아 홍반성 루푸스, 소아기 전신 홍반성 루푸스, 약물-유발성 홍반성 루푸스 또는 루푸스 발현을 초래하는 보체 결핍 증후군을 포함하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 루푸스의 증상은 심혈관 증상, 폐 증상, 간 증상, 혈액학적 증상, 위장 증상 및/또는 근골격 증상을 포함하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항-CD6 단일클론항체가 T-세포의 활성화를 감소 또는 방지하고, T-세포 증식 억제 및/또는 보체 의존성 세포 독성(CDC)의 유도를 감소시키는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항-CD6 단일클론항체는 서열번호 3 및 서열번호 4를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나 또는 뉴클레오티드 서열은 이 서열들과 90%이상 상동성을 가지며 서열번호 1 및 서열번호 2를 코딩하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 비경구투여에 의해 전달되도록 제제화된 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 항-CD6 단일클론항체는 화학 치료제, 면역 억제제, 항-말라리아 약물, 세포 독성제, 인테그린 길항제, 사이토카인 길항제 또는 호르몬과 병용되는 것인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 면역 억제제는 프레드니손(prednisone), 메토트렉세이트(methotrexate), 아자티오프린(azathioprine) 또는 시클로포스파미드(cyclophosphamide)인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 치료학적 유효량은 개체 체중 당 약 0.01 내지 약 100mg/kg인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항-CD6 단일클론항체가 전염증성 사이토카인의 감소를 유발하는 조성물.
  12. CD6에 결합하는 ALCAM을 방해하지 않고 CD6의 도메인1(D1)에 결합하는 항-CD6 단일클론항체(T1h)를 투여하는 것을 포함하는 개체에서 루푸스를 치료하는 방법으로서, 상기 항-CD6 단일클론항체는 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항-CD6 단일클론항체는 치료된 개체에서 루푸스의 증상을 감소시킬 수 있는 치료학적 유효량인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 루푸스는 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 피부 홍반성 루푸스, 중추 신경계(CNS) 루푸스, 신생아 홍반성 루푸스, 소아기 전신 홍반성 루푸스, 약물-유발성 홍반성 루푸스 또는 루푸스 발현을 초래하는 보체 결핍 증후군을 포함하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 루푸스의 증상은 심혈관 증상, 폐 증상, 간 증상, 혈액학적 증상, 위장 증상 및/또는 근골격 증상을 포함하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 항-CD6 단일클론항체가 T-세포의 활성화를 감소 또는 방지하고, T-세포 증식 억제 및/또는 보체 의존성 세포 독성(CDC)의 유도를 감소시키는 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 항-CD6 단일클론항체는 서열번호 3 및 서열번호 4를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나 또는 뉴클레오티드 서열은 이 서열들과 90%이상 상동성을 가지며 서열번호 1 및 서열번호 2를 코딩하는 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 항-CD6 단일클론항체가 비경구 전달에 의해 투여되는 방법.
  18. 제12항에 있어서, 상기 항-CD6 단일클론항체를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  19. 제12항에 있어서, 항-CD6 단일클론항체는 화학 치료제, 면역 억제제, 항-말라리아 약물, 세포 독성제, 인테그린 길항제, 사이토카인 길항제 또는 호르몬과 병용되는 것인 방법.
  20. 제12항에 있어서, 상기 치료학적 유효량은 개체 체중 당 약 0.01 내지 약 100mg/kg인 방법.
  21. 제12항에 있어서, 상기 항-CD6 단일클론항체는 전염증성 사이토카인의 감소를 유발하는 것인, 방법.
  22. 제12항에 있어서, 상기 개체는 루푸스 이외의 자가면역질환을 갖지 않는 것인, 방법.
  23. 항-핵 항체(ANA) 및/또는 항-이중가닥 DNA 항체의 수치가 증가된 환자 개체에서 T-세포의 활성화를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 항-CD6 단일클론항체의 치료학적 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하고, 상기 항-CD6 단일클론항체는 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 치료학적 유효량은 개체 체중 당 약 0.01 내지 약 100mg/kg인 것인 방법.
  25. 루푸스 치료에 유용한 약제 제조에서의 항-CD6 단일클론항체의 용도로서, 상기 항-CD6 단일 클론 항체는 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 용도.
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