JP2020503251A - モノクローナル抗体および狼瘡の処置のための使用の方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の別の側面は、狼瘡以外の自己免疫疾患を有しない対象に対する処置方法を提供する。
本発明の上記およびその他の目的および側面は、本明細書における図面および下記に記述される仕様において、詳細に説明される。
本発明は、CD6のドメイン1(D1)に結合することを可能とし、ALCAMの結合を妨げることなくT細胞増殖を阻害する、抗CD6モノクローナル抗体を提供し、ここで、抗CD6モノクローナル抗体は、全身性の狼瘡に起因する炎症状態を低減させる。さらに、抗CD6モノクローナル抗体は、in vitroで補体依存性細胞毒性(CDC)を誘導しないことが見出されている。
本明細書中において他に定義しない限り、本発明に関して使用する科学および技術用語は、当業者に普通に理解されている意味を有するものとする。さらに、別様に文脈から要求されない限り、単数形の用語は複数形を包含するものとし、複数形の用語は単数形を包含するものとする。
本発明を記載およびクレームすることにおいては、以下の専門用語を、本明細書中に定めた定義に従って使用する。
本明細書中において使用する「成長阻害」抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞の増殖を、防止または低減させるものである。例えば、抗体は、in vitroおよび/またはin vivoにおいてT細胞の増殖を防止または低減させ得る。
本明細書中において使用する「自己免疫疾患」は、個体の自身の組織または臓器から生じ、およびそれらに対して向けられ、ならびに、自己抗原(例として、核抗原)からのエピトープに対して特異的である自己抗体の分泌などの、正常な体内組織および抗原と反応する抗体のB細胞による生産によってもたらされるか、またはそれらによって増悪する、疾患または障害である。
本明細書中において記載された本発明の側面は、「からなる」および「から本質的になる」という側面もまた包含することが理解される。
本発明はさらに、開示されている抗CD6抗体を生産するための方法を提供する。これらの方法は、本発明の抗体をコードする単離された核酸(単数または複数)を含有する宿主細胞を培養することを網羅する。当業者には当然認識される通り、これは、抗体の性質に応じて種々のやり方によって行うことができる。
以下に記載される使用の方法における投与のために、抗CD6モノクローナル抗体は、投与の前に、非毒性の薬学的に許容し得る担体物質(例として、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水)と混合されてもよく、あらゆる医学上適当な手順、例として、非経口投与(例として、注入)、例えば静脈内または動脈内注入などによって投与されることとなる。
CD6は、リンパ球上に主に発現する共刺激分子であり、数多くの自己免疫疾患[16,17]と関連する。抗マウスCD6(α−mCD6)は、CD6のドメイン1に特異的に結合し、イトリズマブに対するサロゲート抗体である。この抗体を使用した以前の研究は、マウスにおける多発性硬化症についてのモデルであるEAE(実験的自己免疫性脳脊髄炎)の有意な改善を実証した。本研究において、抗体は、ヒトにおける狼瘡様疾患と関係のあるマウスモデルであるMRLFas/lprマウスにおいて評価される。
・リンパ節腫脹の測定とこれに続く臓器の回収および研究の最後の評価
・研究の期間の間中に測定した蛋白尿
・研究終了時の採血
・リンパ節および脾臓を用いた増殖アッセイ。
・マウス血清からの抗核抗体および抗dsDNA抗体測定。
・増殖アッセイからのサイトカイン分析。
α−mCD6でのリンパ節腫脹の減少と、それに伴う関連する特定のリンパ器官の縮小。
図2に示すとおり、α−mCD6抗体で処置した狼瘡マウスは、アイソタイプ対照と比較して、リンパ節腫脹スコアおよび臓器すなわち脾臓、唾液腺の重量の有意な低減を示した。群の間で、測定された蛋白尿、腎臓および胸腺のサイズには、差がなかった(データ示さず)。
図3に示すとおり、α−mCD6で処置した動物からのリンパ節由来細胞は、アイソタイプ処置群と比較して、抗CD3に媒介されるT細胞の増殖(p<0.05)への低応答性を示しており、これは、おそらく疾患抑制と関連するであろうT細胞活性化の抑制を示唆している。
抗核抗体(ANA)および抗ds−DNAは、狼瘡疾患において一般的に観察される主要な自己抗体である。これもまた、この動物モデルにおいて観察される[18、20、21、27]。図5に示すとおり、α−mCD6での処置は、アイソタイプ処置群と比較してマウス血清中におけるより少ないANAおよび抗ds−DNA抗体を示した。低減は、しかしながら、統計的に有意ではなかった。
ELISAによると、T1hとALCAMはCD6上の同じドメインに結合しない
CD6−Fcで被覆されたELISAプレート中で、様々な濃度のALCAM−Fcを、固定された濃度のT1hと一緒にインキュベートしたとき、T1hは全ての濃度のALCAM−Fcで検出された。この実験から、Th1が、ALCAM結合ドメイン(ドメイン3)とは異なるドメインに結合するということが提案された。
CFSEを使用したフローサイトメトリーによるリンパ球増殖阻害
PBMCを採取し、PBS中で洗浄した。細胞(7.5×106)を、1mlの、PBS中における濃度2μMのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)中に再懸濁させた。細胞を、厳密に37℃で10分間インキュベートした。10mlのRoswell Park Memorial Institute培地(RPMI)、10%FBSを加えることで反応を止めた。細胞を、10mlのPBSで2回洗浄した。細胞調製物を、次に、1.5×106細胞/mlの細胞密度で、5mlのPBS中に再懸濁させ、200μlを各BD FACSチューブに加えた。200μlの所要および非特異的抗体を各種の濃度(それぞれ50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/mlおよび6.25μg/ml)で加え、37℃で30分間インキュベートした。
(ここで、PHA=PHA−細胞単独
PHA+T1h=(PHA+T1h)−細胞単独
PHA+hR3=(PHA+hR3)−細胞単独)
細胞単独は、CFSE+細胞 である。
T1hは補体依存性細胞毒性(CDC)を媒介しない
アラマーブルー(レサズリン)に基づいたアッセイは、抗体の、細胞殺滅を促進する能力を測定するために使用される。これは、それによって補体を固定および活性化させて標的細胞溶解を結果としてもたらす細胞表面抗原への抗体の結合によって誘導される。レサズリンは、還元されると色が青色からピンク色へ変化する酸化還元活性色素である。
T1hはHUT78細胞においてアポトーシスを誘導しない
アポトーシスの特質の1つは、原形質膜の内部から外部へのホスファチジルセリン(PS)の移行である。アポトーシス細胞と壊死細胞との区別のために、アネキシンVフルオレセインおよびヨウ化プロピジウム(PI)を使用することにより、アポトーシス細胞膜の外葉についてのホスファチジルセリンの分析が行われる。
破傷風トキソイド媒介性T細胞増殖アッセイにおいてはT1hによるメモリーT細胞の阻害はない
PBMCを、Ficoll-Paque(Amersham、カタログ番号:17-14403-03)、密度勾配遠心分離により単離した。軟膜を、健常ドナーから取得し、常に新鮮な状態で採取した。PBMCを、次に、PBS(Invitrogen)中で洗浄した。PBMCを、次に、0.3×106細胞/mlの細胞密度で、5%FBSを補充した2mlのRPMI培地中に再懸濁させた。細胞を、次に、T1h 10μg/mlおよび非特異的対照として使用するhR3とともにまたはそれなしで、滅菌BD FACS 5mlチューブ中で30分間インキュベートした。
T1hは、PBMCおよびRaji細胞により媒介される混合リンパ球反応においてT細胞増殖を阻害する
Raji/PBMC細胞を採取して、1×PBS中に再懸濁させた。8×105細胞/mlのRaji細胞/PBMCを、1mlのマイトマイシン(25μg/ml)中に再懸濁させた。細胞を、CO2インキュベーター中で37℃にて30分間インキュベートした。インキュベーション後に、2mlの5%FBS添加RPMIを各チューブに加え、マイトマイシンを取り除くために、RTにて5分間、1200RPMで遠心分離した。上清を捨て、再度、2mlの5FBS添加RPMIを加えて遠心分離した。上清を捨て、細胞をRPMI培地中に再懸濁する。
本明細書中において引用されている全ての参考文献の内容は、ここに全ての目的のために参照により本明細書中に組み込まれる。
Claims (25)
- 対象において狼瘡を処置するための組成物であって、CD6へのALCAMの結合を妨げることなくCD6のドメイン1(D1)に結合する抗CD6モノクローナル抗体(T1h)を含み、ここで、抗CD6モノクローナル抗体は、配列番号1および配列番号2のアミノ酸配列を含み、およびここで、抗CD6モノクローナル抗体は、対象における狼瘡の症候を低減させるための治療有効量である、前記組成物。
- 狼瘡が、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚エリテマトーデス、中枢神経系(CNS)狼瘡、新生児エリテマトーデス、小児期全身性エリテマトーデス、薬剤誘発性エリテマトーデス、または結果として狼瘡症状をもたらす補体欠損症候群を含む、請求項1に記載の組成物。
- 狼瘡の症候が、心血管症状、肺症状、肝臓症状、血液学的症状、胃腸症状および/または筋骨格症状を含む、請求項1に記載の組成物。
- 抗CD6モノクローナル抗体が、T細胞の活性化を低減させるかまたは防止する、T細胞増殖を阻害する、および/または補体依存性細胞毒性(CDC)の誘導を低減させる、請求項1に記載の組成物。
- 抗CD6モノクローナル抗体が、配列番号3および配列番号4を含むヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも90%同一性を有し、配列番号1および配列番号2をコードするヌクレオチド配列、によってコードされる、請求項1に記載の組成物。
- 非経口投与による送達のために製剤化された、請求項1に記載の組成物。
- 薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 抗CD6モノクローナル抗体が、化学療法剤、免疫抑制性剤、抗マラリア薬、細胞毒性剤、インテグリン拮抗薬、サイトカイン拮抗薬、またはホルモンと組み合わせられる、請求項1に記載の組成物。
- 免疫抑制剤が、プレドニゾン、メトトレキサート、アザチオプリンまたはシクロホスファミドである、請求項8に記載の組成物。
- 治療有効量が、対象の体重あたり約0.01〜約100mg/kgである、請求項1に記載の組成物。
- 抗CD6モノクローナル抗体が、炎症促進性サイトカインの低減を引き起こす、請求項1に記載の組成物。
- 対象において狼瘡を処置するための方法であって、CD6へのALCAMの結合を妨げることなくCD6のドメイン1(D1)に結合する抗CD6モノクローナル抗体(T1h)を投与することを含み、ここで、抗CD6モノクローナル抗体は、配列番号1および配列番号2のアミノ酸配列を含み、およびここで、抗CD6モノクローナル抗体は、処置される対象における狼瘡の症候を低減させるための治療有効量である、前記方法。
- 狼瘡が、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚エリテマトーデス、中枢神経系(CNS)狼瘡、新生児エリテマトーデス、小児期全身性エリテマトーデス、薬剤誘発性エリテマトーデス、または結果として狼瘡症状をもたらす補体欠損症候群を含む、請求項12に記載の方法。
- 狼瘡の症候が、心血管症状、肺症状、肝臓症状、血液学的症状、胃腸症状および/または筋骨格症状を含む、請求項12に記載の方法。
- 抗CD6モノクローナル抗体が、T細胞の活性化を低減させるかまたは防止する、T細胞増殖を阻害する、および/または補体依存性細胞毒性(CDC)の誘導を低減させる、請求項12に記載の方法。
- 抗CD6モノクローナル抗体が、配列番号3および配列番号4を含むヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも90%同一性を有し、配列番号1および配列番号2をコードするヌクレオチド配列、によってコードされる、請求項12に記載の方法。
- 抗CD6モノクローナル抗体が、非経口送達により投与される、請求項12に記載の方法。
- 抗CD6モノクローナル抗体を薬学的に許容し得る担体と組み合わせることをさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 抗CD6モノクローナル抗体が、化学療法剤、免疫抑制性剤、抗マラリア薬、細胞毒性剤、インテグリン拮抗薬、サイトカイン拮抗薬、またはホルモンと組み合わせられる、請求項12に記載の方法。
- 治療有効量が、対象の体重あたり約0.01〜約100mg/kgである、請求項12に記載の組成物。
- 抗CD6モノクローナル抗体が、炎症促進性サイトカインの低減を引き起こす、請求項12に記載の方法。
- 対象が、狼瘡以外の自己免疫疾患を有しない、請求項12に記載の方法。
- 抗CD6モノクローナル抗体の治療有効量を対象に投与することを含む、抗核抗体(ANA)および/または抗二本鎖DNA(dsDNA)抗体のレベルが上昇した対象患者においてT細胞の活性化を低減する方法であって、抗CD6モノクローナル抗体が、配列番号1および配列番号2のアミノ酸配列を含む、前記方法。
- 治療有効量が、対象の体重あたり約0.01〜約100mg/kgである、請求項23に記載の方法。
- 抗CD6モノクローナル抗体が配列番号1および配列番号2のアミノ酸配列を含む、狼瘡の処置のために有用な医薬の製造における抗CD6モノクローナル抗体の使用。
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