MX2010012812A - Metodos de tratamiento que utilizan proteinas de union del receptor de la interleucina-21. - Google Patents

Metodos de tratamiento que utilizan proteinas de union del receptor de la interleucina-21.

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Maya Arai
Davinder Gill
Laird Bloom
Yulia Vugmeyster
Deborah A Young
Heath M Guay
Karissa K Adkins
Amy Arlene Weaver
Sadhana Jain
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Abstract

La presente invención proporciona proteínas de unión y fragmentos que se unen al antígeno de las mismas, incluyendo anticuerpos humanos, que se unen de manera específica al receptor de la interleucina-21 (IL-21R) humano, y métodos para utilizar los mismos; las proteínas de unión pueden actuar como, por ejemplo, antagonistas de la actividad del lL-21R, para modular por lo tanto, las respuestas inmunes en general y aquéllas mediadas por el IL-21R en particular; las composiciones y métodos descritos pueden utilizarse, por ejemplo, en el diagnósticos, tratamiento y/o prevención de trastornos asociados con el IL-21R, por ejemplo, trastornos inflamatorios, enfermedades autoinmunes, alergias, rechazo de transplante y otros trastornos del sistema inmune.

Description

ÉTODOS DE TRATAMIENTO QUE UTILIZAN PROTEÍNAS DE DEL RECEPTOR DE LA INTERLEUC1NA-21 REFERENCIA CRUZADA Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad de la So ente Provisional de E.U.A. No. 61/055,543, presentada en May 8, y la Solicitud de Patente Provisional de E.U.A. No. 61 sentada en Septiembre 23 del 2008, el contenido de las c rpora en la presente, como referencia en su totalidad.
CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona con proteínas de mentos que se unen al antígeno de las mismas, que se unen al iedades farmacodinámicas y farmacocinéticas de los anticuerp nción.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los antígenos inician las respuestas inmunes y activa laciones más grandes de linfocitos: células T y células B. De ontrar el antígeno, las células T proliferan y se diferencian e toras, mientras que las células B proliferan y se diferencian en c ma que secretan anticuerpos. Estas células efectoras secr onden a las citocinas, que son proteínas pequeñas (m ximadamente 30 kDa) secretadas por los linfocitos y otros tipos c La IL-21 humana es una citocina que muestra una hom ecuencia con la IL-2, IL-4 e IL-15 (Parrish-Novak et al. (2000 :57-63). A pesar de la baja homología de la secuencia entre las El IL-21 R humano es un receptor de la citocina de la cía uencias nucleotídicas y de aminoácidos que codifican la IL-21 h receptor (IL-21 R), se describen en las Publicaciones de rnacional Nos. WO 00/053761 y WO 01/085792; Parrish-Nov 0) supra y Ozaki et al. (2000) Proa Nati. Acad. Sci. USA 97: 1 L-21 R tiene la homología de la secuencia más alta con la cad ptor de la IL-2 y la cadena a del receptor de la IL-4 (Ozaki et ra). Tras la unión al ligando, el IL-21 R se asocia con la ca ptor de la citocina gamma común (ye), que es compartida plejos del receptor para IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13 e IL-15 2000) supra Asao et al. (2001 ) J. Immunol. 167: 1 -5).
El IL-21 R se expresa en los tejidos linfoides, particularr células T, células B, células citotóxicas naturales (NK), células d ) y macrófagos (Parrish-Novak et al. (2000) supra), lo que permit - I. Immunol. 241 :66-74).
En la autoinmunidad, la ruptura del gen de la IL-21 y la i IL-21 recombinante, han mostrado modular la progresión de la r ve autoinmune experimental (EAMG) y la encefalomielitis au erimental (EAE), respectivamente (King et al. (2004) Cell 1 ki et al. (2004) J. Immunol. 173:5361-71 ; Vollmer et al. (2005) J. :2696-2701 ; Liu et al. (2006) J. Immunol. 176:5247-54). En estos erimentales, se ha sugerido que la manipulación de la se diada por IL-21 , altera directamente la función de las células las B, las células T auxiliares y las células NK.
Así, la presente invención proporciona agentes ter edosos para tratar, por ejemplo, enfermedades autoinmunes qu ueando la trayectoria de señalización de la IL-21 , es decir, an i-IL-21 R. Con el fin de que un agente terapéutico, tal como un a i-IL-21 R, sea efectivo in vivo, debe determinarse una concentr BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención describe el aislamiento y caract las proteínas de unión, por ejemplo, anticuerpos humanos y frag mismos, que se unen de manera específica al IL-21 R humano proteínas de unión descritas en la presente se derivan del a \5, que se describe en la Patente de E.U A No. 7,495,085, la tot ual se incorpora por lo tanto como referencia en la presente. Las unión de la presente invención tienen un grado de afinidad mucho 1 R humano y/o murino que el anticuerpo 18A5 parental.
La invención proporciona, al menos en parte, agentes d 1 R (tales como proteínas de unión y fragmentos que se unen al las mismas), que se unen al IL-21 R, en particular, el IL-21 R hu afinidad y especificidad. Las proteínas de unión y los fragment n al antígeno de las mismas de la presente invención, tam R. Así, las proteínas de unión anti-IL-21 R de la invención, son iagnóstico y tratamiento de los trastornos asociados con el IL- plo, trastornos inflamatorios, enfermedades autoinmunes, azo de transplante, trastornos hiperproliferativos de la sangre, tornos del sistema inmune, como se describe más completame enté.
En consecuencia, en un aspecto, las proteínas de uni nción tienen como característica una proteína de unión aisl plo, un anticuerpo aislado) o un fragmento que se une al antige a, que se une al IL-21 R, en particular, el IL-21 R humano. E alidades, la proteína de unión al anti-IL-21 R (por ejemplo, ant de tener una o más de las siguientes características: (1 ) es una nión monoclonal o de una sola especificidad; (2) es una proteína ana; (3) es una proteína de unión generada in vitro (4) es una pr n generada in vivo (por ejemplo, un sistema de ratón transgé o menos; (12) inhibe la proliferación mediada por el IL-21 R muri las BaF3 que expresan el IL-21 R murino con una oximadamente 0.5 nM o menos; (13) inhibe la proliferación media 1 R humano de las células TF1 que expresan el IL-21 R humano de aproximadamente 14.0 nM o menos; (14) inhibe la pro iada por la IL-21 de las células B primarias humanas con un oximadamente 1.9 nM o menos; (15) inhibe la proliferación media 1 de las células T CD4+ primarias humanas con una oximadamente 1.5 nM o menos; (16) inhibe la proliferación media 1 de las células T CD4+ primarias murinas con una oximadamente 5.0 nM o menos;(17) tiene una eliminación del cu dia de aproximadamente 0.1-7.5 ml/hr/kg después de, por ej inistración intravenosa (i.v.) a animales, por ejemplo, mamíf plo, humanos, primates no humanos, roedores; (18) tiene una vi eliminación media de aproximadamente 20-700 horas despué la dosis media de aproximadamente 200-10,000 pg*hr/ml (por 1 ificación) después de, por ejemplo, la administración i.v., s.c, ales, por ejemplo, mamíferos, por ejemplo, humanos, pri anos, roedores; (22) tiene una Cmax normalizada con la dos ncentración máxima en suero) de aproximadamente 0.5-30 pg/ml por ejemplo, la administración i.v., s.c, o i.p. a animales, por míferos, por ejemplo, humanos, primates no humanos, roedore dula la expresión de las citocinas sensibles a la IL-21 o los genes IL-21.
Las modalidades ilustrativas no limitantes de las prot n de la invención (el término "proteínas de unión" también incl ere a los fragmentos que se unen al antígeno de las mismas, conf piado), son referidas en la presente como AbA-AbZ, y la córre s términos con los términos utilizados en la Solicitud de isional de E.UA No. 61/055,543, se presenta en el Cuadro 2 tiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos formados de anticuerpos intactos).
Una modalidad de la invención es un método para enir un trastorno asociado con el IL-21 R en un sujeto, que co iinistrar al sujeto una proteína de unión o un fragmento que s geno de la misma, que se une de manera específica al IL-21 R hu cantidad suficiente para inhibir o reducir la actividad de la unes en el sujeto, tratando o previniendo por lo tanto el trast de la proteína de unión o el fragmento que se une al antíge ma, comprende al menos una secuencia de aminoácidos que es ximadamente 95% idéntica con una secuencia de ami ccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 14, 16, 1 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 6 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, , 108, 110, 112, 114, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 1 geno de la misma, que se une de manera específica al IL-21 R hu cantidad suficiente para inhibir o reducir la actividad de las nes en el sujeto, tratando o previniendo por lo tanto el trast de la proteína de unión o el fragmento que se une al antíge a, comprende al menos una secuencia de aminoácidos codifi secuencia nucleotídica que es al menos aproximadamente 95% i secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de Os: 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 8 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 1 17, 119, 1 , 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 1 , 157, 159, 161 , 239, 241 , 243, 245 y 247.
En una modalidad de la invención, la proteína de un mento que se une al antígeno comprende al menos una secu noácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO geno de la misma, que se une de manera específica al IL-21 R hu cantidad suficiente para inhibir o reducir la actividad de la unes en el sujeto, tratando o previniendo por lo tanto el trast de la proteína de unión o el fragmento que se une al antíge ma, comprende al menos una secuencia de aminoácidos que es oximadamente 95% idéntica con una secuencia de ami ccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 1 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 5 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 9 , 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 1 18, 120, 122, 124, , 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, , 162-195, 213-229, 240, 242, 244, 246 y 248, y en donde, si la pr n o el fragmento que se une al antígeno comprende al m uencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 95 las secuencias seleccionadas del grupo que consiste de las SEQ , 154, 156, 158, 160, 162, 165-168, 171-193, 213-229, 240, 242, 8.
Otra modalidad de la invención es un método para venir un trastorno asociado con el IL-21 R en un sujeto, que co inistrar al sujeto una proteína de unión o fragmento que s igeno de la misma, que se une de manera específica al IL-21 R hu cantidad suficiente para inhibir o reducir la actividad de la unes en el sujeto, tratando o previniendo por lo tanto el tras de la proteína de unión o el fragmento que se une al antíge iria, comprende al menos una secuencia de aminoácidos codifi secuencia nucleotídica que es al menos aproximadamente 95% i secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de NOs: 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 3 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 7 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 113, uencia nucleotidica que es al menos aproximadamente 95% ¡dén uencias nucleotídicas seleccionadas del grupo que consiste de la s: 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 4 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 8 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, , 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, , 157, 159, 161 , 239, 241 , 243, 245 y 247.
En una modalidad de la invención, la proteína de u mento que se une al antígeno comprende al menos una secu noácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID N 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 4 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 8 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, , 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, , 158, 160, 162-195, 213-229, 240, 242, 244, 246 y 248, en do 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 7 , 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, , 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, , 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165-168, 171-193, 213-229, , 246 y 248.
Una modalidad adicional de la invención es un mét ar o prevenir un trastorno asociado con el IL-21 R en un su prende administrar al sujeto una proteína de unión o fragmen al antígeno de la misma, que se une de manera específica al I de la proteína de unión o el fragmento que se une al antíg ma, comprende una cadena ligera y una cadena pesada, y en ena pesada comprende al menos una secuencia de am eccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 14, 16, 1 , 72, 88, 90, 92, 94, 213, 218, 219, 240 y 242. En una mod teína de unión o el fragmento que se une al antígeno comp prende una cadena ligera y una cadena pesada, y en donde la a comprende al menos una secuencia de aminoácidos selecció o que consiste de las SEQ ID NOs: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 3 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 74, 76, 78, 80, 82, 8 100, 102, 104, 106, 108, 214-217, 220-229, 244, 246 y 248. alidad, la proteína de unión o el fragmento que se une al prenden un dominio VL y un dominio VH, y el dominio VL comp os una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las : 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 5 62, 64, 66, 215, 217, 221 , 223, 225, 227 y 229.
En otra modalidad de los métodos de la invención, la ada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada d consiste de las SEQ ID NOs: 88, 90, 92, 94, 213, 218, 219, 240 y ena ligera comprende una secuencia de aminoácidos selecció o que consiste de las SEQ ID NOs: 96, 98, 100, 102, 104, 106, 1 petitiva la unión de una proteína de unión seleccionada del g iste de AbA-AbW, H3-H6, L1-L6, L8-L21 y L23-L25 al IL-21 R hu cantidad suficiente para inhibir o reducir la actividad de las unes en el sujeto, tratando o previniendo por lo tanto el trastorno, alidad, la proteína de unión o el fragmento que se une al antíge a, comprende una cadena pesada, una cadena ligera o un frag comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del g siste de las SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 3 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 7 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 1 , 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, , 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165-168, 171-193, 213-229, , 246 y 248. En aún otra modalidad, la proteína de unión o el fr se une al antígeno de la misma, comprende una cadena pes ena ligera o un fragmento Fv que comprende una secu , AbV y/o AbW, y la proteína de unión inhibe de manera com n de AbO, AbP, AbQ, AbR, AbS, AbT, Abll, AbV y/o AbW ano.
En una modalidad de los métodos de la invención, el ciado con el IL-21 R se selecciona del grupo que consiste de t inmunes, condiciones inflamatorias, alergias, rechazo de trans tornos hiperproliferativos de la sangre. En otra modalidad, el ciado con el IL-21 R se selecciona del grupo que consiste de t unes, trastornos hiperproliferativos de la sangre, rechazo de tra rmedad de injerto versus el hospedero, alergia (incluyend pica), diabetes mellitus, trastornos artríticos (incluyendo artritis re itis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis soriática, e uilosante), espondiloartropatía, esclerosis múltiple, encefa stenia grave, lupus eritematoso sistémico (SLE), lupus eri neo, tiroiditis autoinmune, dermatitis (incluyendo dermatitis asociación para el IL-21 R humano de al menos 105 M"V1. dalidad, la proteína de unión o el fragmento que se une al antíg ma, inhibe la proliferación de las células BAF3 mediada por la I CI5o de aproximadamente 1.75 nM o menos, en donde las célul prenden un receptor de la IL-21 humana. En otra modalidad, la unión o el fragmento que se une al antígeno de la misma, liferación de las células TF1 mediada por la IL-21 con una oximadamente 14 nM o menos, en donde las células TF1 compr eptor de la IL-21 humana. En aún otra modalidad, la proteína de mento que se une al antígeno de la misma, inhibe la proliferación la IL-21 de las células B primarias humanas con una oximadamente 1.9 nM o menos, en donde las células B comprend humano. En aún otra modalidad, la proteína de unión o el frag une al antígeno de la misma, inhibe la proliferación mediada por la células CD4+ primarias humanas, con una CI50 de aproximada expresión de al menos un gen sensible a la IL-21 en la primera m igre puesta en contacto con el ligando de la IL-21 ; poner en con unda muestra de sangre del sujeto con el ligando de la IL-sencia de un anticuerpo anti-IL-21 R; determinar el nivel de expre nos un gen sensible a la IL-21 en la segunda muestra de sangre tacto con el ligando de la IL-21 en la presencia del anticuerpo an omparar los niveles de expresión de al menos un gen sensible erminado anteriormente, en donde un cambio en el nivel de expre nos uno de los genes sensibles a la IL-21 , indica que el a i-IL-21 R, es un anticuerpo terapéutico. En otra modalidad de la i ujeto es un mamífero, por ejemplo, un mono o un humano, dalidad, al menos un gen sensible a la IL-21 se selecciona del g siste de TNF, IFNy, IL-6. IL-8, IL-10, CD19, STAT3, TBX21 , CSF F1 , IL-2Ra e IL-21 R. En una modalidad adicional, al meno - - do con el anticuerpo anti-IL-21 R con un ligando de la IL-21 ; dete \ de expresión de al menos un gen sensible a la IL-21 en la mu gre del sujeto tratado con el anticuerpo anti-IL-21 R, y puesto en el ligando de la IL-21 ; y comparar el nivel de expresión de al sensible a la IL-21 determinado anteriormente, con el nivel de e l menos un gen sensible a la IL-21 en una muestra de sangre sta en contacto con el ligando de la IL-21 , en donde la muestra d rente es de un sujeto no tratado con el anticuerpo anti-IL-21 R. alidad de la invención, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, u humano. En otra modalidad, al menos un gen sensible a la cciona del grupo que consiste de TNF, IFNy, IL-6, IL-8, IL-1 3, TBX21 , CSF1 , GZMB, PRF1 , IL-2Ra e IL-21 R. En una m ional, al menos un gen sensible a la IL-21 se selecciona del g siste de CD19, GZMB, PRF1 , IL-2Ra, IFNy e IL-6. En otra m - - uencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 95% una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que co SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 4 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 8 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, , 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, , 154, 156, 158, 160, 162, 165-168, 171-193, 213-229, 240, 242, 8. En una modalidad adicional, la proteína de unión o el fragmen al antígeno de la misma, se administra localmente.
Una modalidad de la invención es un método para incre acia de una formulación de vacuna utilizada para inmunizar a u comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticament una proteína de unión o fragmento que se une al antígeno de l se une de manera específica al IL-21 R humano, en donde la pr n o el fragmento que se une al antígeno de la misma, com se une al antígeno de la misma, se administra antes, durante y/o a inmunización.
Otra modalidad de la invención proporciona un mét ctar la presencia del IL-21 R en una muestra in vitro, que comp er en contacto una muestra con una proteína de unión o fragmen al antígeno de la misma, que se une de manera específica ano, y (b) detectar la formación de un complejo entre la proteína l fragmento que se une al antígeno de la misma, y la muestra, diferencia significativa en la formación del complejo en la mu ción a un control o a la muestra o nivel de referencia, es indicat sencia de IL-21 R en la muestra, y en donde la proteína de u mento que se une al antígeno de la misma, comprende al m uencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 95 una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que co SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 4 de manera específica al IL-21 R humano a un sujeto bajo condici miten la unión de la proteína de unión o el fragmento que s ígeno de la misma al IL-21 R, y (b) detectar la formación de un re la proteína de unión o el fragmento que se une al antígeno de l IL-21 R, en donde una diferencia significativa en la formación del el sujeto, con relación al control o la muestra o nivel de referen ación del complejo, es indicativa de la presencia de IL-21 R, y en teína de unión o el fragmento que se une al antígeno de l prende al menos una secuencia de aminoácidos que es oximadamente 95% idéntica con las secuencias de am ccionadas del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 14, 16, 1 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 6 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, , 108, 1 10, 112, 1 14, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, , 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, po que consiste de un inhibidor d la citocina, un inhibidor del f cimiento, un inmunosupresor, un agente antiinflamatorio, un tabólico, un inhibidor enzimático, un agente citotóxico y u Stático. En las modalidades adicionales, el agente terapéutico se po que consiste de un antagonista del TNF, un antagonista de la agonista de la IL-15, un antagonista de la IL-17, un antagonista d antagonista de la IL-19, un antagonista de la IL-20, un antagoni 1 , un antagonista de la IL-23, un agente que disminuye las célu nte que disminuye las células B, metotrexato, leflunomida, amicina) o un análogo del mismo, un inhibidor de cox2, un inh A2, un NSAID, y un inhibidor de p38. Como en otros métod nción, en algunas modalidades, el sujeto es un mamífero, por ej ano.
Otra modalidad de la invención proporciona un mét dir, determinar y/o valorar los niveles de producción de los anticue nción, que no son restrictivas de la invención como se recla ras acompañantes constituyen una parte de esta especificació la descripción, sirven únicamente para ilustrar las modalida tan la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A-1 C describen la neutralización de la pro las células IL-21 R-BaF3 humanas por scFv. Las células se mezcl cFv indicada y a continuación se incubaron con 100 pg/ml ana. La proliferación se midió mediante CELLTITER-GLO® ( poration, Madison, Wl) después del 48 horas.
Las Figuras 2A-2C describen la neutralización de la pro células IL-21 R-TF1 humanas por scFv. Las células se mezclar v indicada y a continuación se incubaron con 100 pg/ml de CIÓ con IL-21 R-H/F murino biotinilado, y las mezclas se agre uerpo 18A5 inmovilizado en una placa para ELISA. La ca 21 R se detectó con HRP-estreptavidina, y la competencia por la 21 R se indicó con una reducción en la señal de A450.
Las Figuras 5A-5I describen la neutralización de la prol ndiente de la IL-21 por 21 pares de cadena pasada/cadena lig uerpos, como se indica en las figuras, se agregaron a las célula e agregó posteriormente, y la proliferación se midió con CEL ® después del 48 horas. Los ensayos se realizaron en las células 3 humanas con 100 pg/ml de la IL-21 humana (Figuras 5A-5C) R-TF1 humanas con 100 pg/ml de !a IL-21 humana (Figuras 5 las IL-21 R-BaF3 murinas con 400 pg/ml de la IL-21 murina I).
Las Figuras 6A-6L describen la unión de 21 IgG anti-I las CHO que expresan de manera transitoria el IL-21 R humano la superficie. Los anticuerpos anti-IL-21 R se capturaron en I ana, y la unión posterior a IL-21 R-H/F murino, IL-13-H/F human ano o IL-4R soluble humano se midió en un instrumento BIACO lthcare, Piscataway, NJ). La Figura 7D muestra que el IL-2R h -4R soluble humano se capturan por los anticuerpos anti-IL-2Rp específicos, respectivamente (control).
Las Figuras 8A-8D describen la unión de los an -IL-21 R al IL-21 R humano y murino. Los anticuerpos anti-IL-21 R cados, se capturaron en IgG anti-humana inmovilizada roplaqueta BIACORE™. Las concentraciones variables de /FLAG humano (Figuras 8A-8B) y el IL-21 R-His/FLAG murino (Fig , se dejaron fluir sobre la microplaqueta, y se verificó la u ciación.
Las Figuras 9A-9D describen la unión de los an - - - Las Figuras 10A-10B describen la valoración del epito icuerpos IL-21 R. En el experimento descrito en la 10A (véase t tración a la izquierda del eje Y), el IL-21 R-H/F murino (proteína -Flag), se capturó por el anticuerpo anti-IL-21 R AbS inmovilizad roplaqueta BIACORE™. Los anticuerpos anti-IL-21 R adiciónal , D5 (D5-20, un anticuerpo de IL-21 R anti-murino neutralizante), icuerpo de control de IL-21 R anti-murino no neutralizante)), fluye microplaqueta, y se verificó su unión al IL-21 R-H/F capturad erimento descrito en la Figura 10B, el IL-21 R-H/F humano se ca nticuerpo anti-IL-21 R AbS inmovilizado en una microplaqueta BIA anticuerpos anti-IL-21 R adicionales (AbS, AbT, y 9D2 (un anti trol de IL-21 R anti-humano no neutralizante)), fluyeron roplaqueta y se verificó su unión al IL-21 R-H/F capturado.
Las Figuras 1 1A-11 C describen la neutralizació liferación de las células IL-21 R-BaF3 humanas y las células IL-iferación dependiente de la IL-21 de las células B primarias huma uerpos indicados se agregaron a las células B primarias huma los anticuerpos anti-CD40 y la IL-21 humana. La incorpor imidina se midió después de tres días. La Figura 12A de paración entre AbQ, AbR, AbS, AbT, AbU, IL-13 mutante tri uerpo parental 18A5; la Figura 12B describe la comparación en , AbW, AbU y el control de lgG1 humana (hlg1 ).
La Figura 13 describe la neutralización de la prol endiente de la IL-21 de las células T CD4+ primarias human cuerpos indicados se agregaron a las células T CD4+ primarias adas junto con la IL-21 humana, y la incorporación de 3H-t¡m ió después de tres días.
La Figura 14 describe la neutralización de la prol endiente de la IL-21 de las células T CD8+ primarias murin cuerpos indicados se agregaron a las células T CD8+ primarias o un control positivo, y un anticuerpo anti-IL-13 se incluyó como ativo.
La Figura 16 describe la unión al complemento C1q cuerpos anti-IL-21 R. Los anticuerpos anti-IL-21 R indic ovilizaron en una placa para ELISA y, después de la incubación c ano, la unión a C1q se midió con C1q anti-humano de po cuerpo IgY anti-pollo conjugado con HRP. El anticuerpo a imab (RITUXAN®), se incluyó como un control positivo, y el a -IL-13 se incluyó como un control negativo.
Las Figuras 17A-17C describen las secuencias de ami AbQ, incluyendo los dominios VH y VL, las CDR (H1 , H2, H3, L1 , s regiones constantes.
Las Figura 18A-18C describen las secuencias de ami AbR, incluyendo los dominios VH y VL, las CDR (H1 , H2, H3, L1 , S regiones constantes. s regiones constantes.
Las Figuras 22A-22C describen las secuencias de ami AbO, incluyendo los dominios VH y VL, las CDR (H1 , H2, H3, L1 , s regiones constantes.
Las Figuras 23A-23C describen las secuencias de ami AbP incluyendo los dominios VH y VL, las CDR (H1 , H2, H3, L1 , S regiones constantes.
Las Figuras 24A-24C describen las secuencias de ami AbU, incluyendo los dominios VH y VL, las CDR (H1 , H2, H3, L1 , S regiones constantes.
Las Figura 25A-25C describen las secuencias de ami AbV, incluyendo los dominios VH y VL, las CDR (H1 , H2, H3, L1 , S regiones constantes.
Figuras 26A-26G describen los resultados generado dios adicionales que se realizaron de manera similar a aquéllos r 450. La Figura 27B describe la competencia de AbS y la IL-e al IL-21 R murino. AbS y mlL-21 se mezclaron y se apli 21 R-Fc inmovilizado en placas para ELISA, y se verificó la unión antés llenos), el anticuerpo de control del isotipo (triángulos abi 21 (cuadrados).
La Figura 28 describe la incorporación de 3H- ndiente de la IL-21 en las células T CD3 de rata en la presenci uerpos anti-IL-21 R AbS, AbU, AbV o AbW, o un anticuerpo de co o, hlgG1-TM.
Las Figuras 29A-29B describen la unión de AbS a cualq isoformos de IL-21 R-Fc de conejo presentado inmovilizando anti G anti-ratón en la ausencia (Figura 29A) o presencia (Figura io acondicionado al 10% que contiene IL-21 de conejo.
Las Figuras 30A-30H describen la respuesta al an ario específico de NP en animales tratados con anticuerpos anti ecifico de NP (ASC) encontrado en la médula ósea al final del p dio de dos meses.
Las Figuras 31A-31 G describen los anticuerpos anti le hebra (anti-ADNds) en ratones MKL-Fas/pr tratados con los an Í-IL-21 R. Ratones MKL-Fas/pr machos de doce semanas de aron con solución salina (control) o con los anticuerpos mutant cados (10 mg/kg i.p. , 3X/semana); un anticuerpo mutante triple A 7 de lgG1 humana de IL-13 anti-humana sin reactividad a la IL-2 13 TM) se utilizó como el control del isotipo. El suero re manalmente se probó mediante ELISA para la presencia del ant Figura 31A muestra los títulos del anticuerpo anti-ADNds des amiento. La Figura 31 B muestra los títulos del anticuerpo an sangrado. La Figura 31 C muestra los títulos del anticuerpo an pués de dos semanas de dosificación. La Figura 31 D muestra l anticuerpo anti-ADNds después de cuatro semanas de dosifica teada en las Figuras 31 B-31 G indican el nivel de detección.
Las Figuras 32A-32B describen los depósitos de Ig nes de ratones MKL-Fas/pr tratados con anticuerpos anti-IL-21 R. -Faslpr de doce semanas de edad se trataron (10 mg/kg i.p., 3X solución salina (control) o los anticuerpos mutantes triples indi icuerpo mutante triple A234 A235 A237 de lgG1 humana i-humana sin reactividad a la IL-21 murina, se utilizó como el c ipo. Después de 10 semanas de tratamiento, los ratones se sacr depósitos de IgG en los ríñones se identificaron unocitoquímica (Figura 32B; los glomérulos se indican mediant ontinuos; los ejemplos de los depósitos de IgG se indican has). La intensidad de la tinción se calificó en una escala de 1 ).
Las Figuras 33A-33B describen los depósitos de I plemento C3 en los ríñones de ratones MRL-Faslpr tratados plemento C3 en los cerebros de ratones MRL-Faslpr tratados ( 3X/semana) con los anticuerpos anti-IL-21 R. Los ratones cho de doce semanas de edad se trataron con solución salina ( los anticuerpos mutantes triples indicados. Después de diez ser amiento, los ratones se sacrificaron y los depósitos de IgG (Fig (Figura 34B), y del complemento C3 (Figura 34C) en el ce ntificaron mediante inmunocitoquímica. La intensidad de la t ficó en una escala de 1-5.
Las Figuras 35A-35C describen los infiltrados linfocític nes de ratones MRL-Fas/pr tratados con los anticuerpos anti-IL- nes MRL-Fas/pr machos de doce semanas de edad se trataron ( , 3X/semana) con solución salina (control) o con los anticuerpos les indicados. Después de diez semanas de tratamiento, los r rificaron y las secciones de riñon teñidas con hematoxilina/eosin minaron para la infiltración de los linfocitos en tres zonas, los i rificaron y las secciones de pulmón teñidas con H/E se examinar tración linfocítica. El número de linfocitos se calificó en una escal Las Figuras 37A-37B describen la respuesta al a i-humano de ratón (MAHA) en ratones MRL-Fas/pr tratados icuerpos anti-IL-21 R. Los ratones MRL-Fas/pr machos de doce se d se trataron (10 mg/kg i.p., 3X/semana) con los anticuerpos les indicados. El suero, recolectado bisemanalmente, se probó SA para la presencia de anticuerpos murinos capaces de uni mos anticuerpos humanos con los cuales se trataron los ratone o para la presencia de anticuerpos murinos capaces de uni s anticuerpos humanos anti-IL-21 (Figura 37B). Los asteris ura 37A indican una diferencia significativa en comparación con ado con anti-IL-13 (p<0.05).
Las Figuras 38A-38D describen el desarrollo de los an i-ADNds en ratones MRL-Fas/pr tratados con los anticuerpos an al de ratones BALB/C para crear una bolsa de aire, las b flaron. Dos días más tarde, solución salina (control) o los ant antes triples indicados se inyectaron i.p. Cien ng de la IL-21 ctaron en la bolsa de aire 24 horas después de la inyec cuerpo. Seis horas más tarde, las bolsas se lavaron con 3 mi d recuentos de las células totales (Figura 39A), monocitos (Figu citos (Figura 39C), y neutrófilos (Figura 39D) se determinaron. describe los recuentos de células totales en una replica erimentos mostrados en las Figuras 39A-39D. Las Figuras criben la infiltración de las células totales en las bolsas de aire pués del tratamiento con IL-21. de ratón y anticuerpos anti-IL- ra 39F describen la infiltración celular después de la administraci lL-21 durante 6 horas o 1 pg de mlL-21 durante 20 horas, en la sencia de AbS o el anticuerpo de control. Las Figuras 39G-39H filtración celular en las bolsas de aire de rata en experimentos re en ratones CD-1 después de una sola administración intrav cutánea. Las concentraciones por debajo del límite de cuantific ron como cero para el cálculo de la media y la desviación están para cada punto de datos.
La Figura 41 describe los perfiles de concentración-ti en ratones DBA y MKL-Faslpr después de una sola admi peritoneal. Las concentraciones por debajo del límite de cuantifi ron como cero para el cálculo de la media y la desviación están para cada punto de datos.
Las Figuras 42A-42B describen las concentraciones ervadas y predichas en ratones MRL-Fas/pr después de inistraciones i.p. a dosis de 10, 5 y 2.5 mg/kg, 3X/semana, dur anas. Las concentraciones por debajo del límite de cuantific ron como cero para el cálculo de la media y la SD. N = 7-8 por ición. nes. La Figura 44A muestra un perfil después una administraci kg i.v. en ratones CD-1. La Figura 44B muestra un perfil des inistración de 10 mg/kg i.p. en ratones MRL-Fas/pr. La Fi estra un perfil después una administración de 8 mg/kg i.p. en rato concentraciones por debajo del límite de cuantificación se trata o para el cálculo de la media y la desviación estándar. N = 4-8 to de datos.
La Figura 45 describe las concentraciones de AbT obs dichas en ratones MKL-Fas/pr después de múltiples administracio is de 20 mg/kg, 3X semana, durante diez semanas. Las concen debajo del límite de cuantificación se trataron como cero para el edia y la desviación estándar. N = 6-8 por punto de medición.
Las Figuras 46A-46B describen los perfi centración-tiempo de AbT y AbS en macacos de Java despu inistraciones como se muestran. Las concentraciones por d Y; ng/ml) de AbS, AbT y un control del isotipo en ratas Spragu D) después de una sola dosis de 10 mg/kg i.v. La Figura 48B de icuerpos anti-IL-21 R AbS-AbW después de una sola dosis de 10 ratas S-D. Los puntos de datos individuales <LOQ (45 ng/mL), s o cero para el cálculo de la media y la SD. Si el valor medi ajo del LOQ (por ejemplo, cuando todos los animales tuvieron Q), los punto de datos no se muestran.
La Figura 49 describe las concentraciones medias en g/ml) de AbS en ratas S-D después de una sola dosis i.v., i.p., o Las Figuras 50A-50D describen la biodistribución de 12 nes C57BL/6 con el gen desactivado para IL-21 R y del tipo ntrol) después de una sola dosis intravenosa de 2.5 mg/kg. La Fi estra la concentración de 125l-AbS en tejidos en ratones C5 trol. La Figura 50B muestra la concentración de 125l-AbS en rato desactivado de IL-21 R. La Figura 50C muestra la concent muestra la concentración de 125l-AbS en tejidos en ratones M Figura 51 B muestra los recuentos en orina de 125l-AbS en L-Faslpr.
La Figura 52 describe la concentración en suero de 125 nes MRL-Fas/pr después de una sola dosis de 2.5 y 10 mg/kg centraciones por debajo del LOQ se trataron como cero para el c edia y la SD. N = 4-8 para cada punto de datos.
La Figura 53A describe el por ciento de inhibición (eje resión de IL-2Ra (IL2RA), PRF1 , IL-6 y CD19 inducida por I ementar las concentraciones de AbS (eje X) en las muestras d pleta humana, calculada de las veces de cambio; la Figura 53B nhibición del nivel de expresión relativo inducido por IL-21 (RQ; en respuesta a incrementar las concentraciones de AbS centración de Ab (nM)) en las muestras de sangre completa hum La Figura 54 describe los genes incluidos en TLDA a l y PRF1) después de la incubación con IL-21 y diferentes concen bS o el control TM de lgG1 (eje X). Las Figuras 56B-56C descri to de inhibición (eje Y) de la respuesta a IL-21 de los mism pués del tratamiento con diferentes concentraciones de AbS o de lgG1 (eje X).
Las Figuras 57A-57B describen la distribución de los v ntificación Relativa (RQ) para la expresión del gen IL-2Ra e pleta de macacos de Java machos, después de estimulacione IL-21 humana recombinante. La Figura 57A demuestra el a ograma (eje Y) para los valores RQ (eje X), y la Figura 57B de lisis del histograma (eje Y) para los valores RQ transformados X), que se obtuvieron utilizando un paquete de programas est línea sólida representa la distribución Gaussiana. La línea esenta el RQ de corte para el reclutamiento en el estudio in vivo zando la fórmula: log {RQ<je corte} = media de los valores ta el día 148 para AbS y hasta el día 36 para AbT (eje X). Los p s con las concentraciones en suero por debajo del LOQ inf L) no se muestran.
Las Figuras 59A-59C muestran la correlación centraciones en suero del anticuerpo (segundo eje Y), la acodinámica (PD) ("RQ"; primer eje Y), y la respuesta al a -producto (indicado por "A"), incluyendo la respuesta del a -producto neutralizante (indicada por "AN"), después de iinistración de 10 mg/kg i.v. del anticuerpo anti-IL-21 R AbS a ma a machos, medidas en varios tiempos pre y postadministración d X; Tiempo días)). Las Figuras 59A-59C describen los resultados males 1-3, respectivamente.
Las Figuras 60A-60C muestran las correlaciones si éilas en las Figuras 59A-59C para AbT (una sola administraci kg i.v.). Las Figuras 60A-60C describen los resultados para los Las Figuras 62A-62B describen las concentraciones ind mi) de AbS después de tres administraciones i.v. semanales (flec ura 62A) o 10 mg/kg (Figura 62B) a macacos de Java machos y uestos al toxoide tetánico.
Las Figuras 63A-63B describen el escalamiento alom parámetros de PK de AbS después de la administración i.v. Peso ; potencial del lapso máximo (en años; MLP). La Figura 63A repr MLP (eje Y) graficado contra el peso corporal (eje X); la Fig esenta el volumen de distribución (eje Y) graficado contra el peso X). Las lineas sólidas representan las curvas ajustadas basá regresión lineal utilizando los datos de los ratones, ratas y ma a. Las líneas punteadas representan los intervalos de confianza d Las Figuras 64A-64B representan el escalamiento alom parámetros PK de AbT después de la administración i.v. Peso ; peso del cerebro ("BW"). La Figura 64A representa a CL*B rina y los títulos de anticuerpo en suero de IgG anti-ADNds se m ió del estudio, y cada dos semanas posteriormente durante 10 animales tratados con CTLA4-lg mostraron reducciones signific títulos de anti-ADNds (asteriscos; p<.05) en las semanas 4-10.
Las Figuras 66A-66C describen los efectos de la neut i-IL-21 R en el desenlace de la enfermedad en un modelo de X iterapéutico de la artritis reumatoide. Los ratones DBA/1 h unizaron y reforzaron con colágeno bovino del tipo II; cuando 10 males en el estudio exhibieron hinchazón de la pata, los ra ificaron 3X/semana durante 30 días con 8 mg/kg del anticuerpo isotipo de lgG2a murino, el anticuerpo D5 de IL-21 R anti-ratón (a lgG2a murino), mTNFRII-Fc (control positivo, isotipo de lgG2 ura 66A); o el anticuerpo anti-IL-13TM (anticuerpo de control del i 1 humano), AbT o AbS (Figura 66B). Las calificaciones de los ividuales en el día 30 del estudio se describen en la Figura 66C. is del vehículo o AbS (flechas), los macacos se inmunizaron una con toxoide tetánico. Los macacos se sangraron de manera r és del curso del estudio, y se examinaron para los títulos del antic ro de IgM (Figura 67A) e IgG (Figura 67B) específicos del tétanos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las proteínas de unión de la presente invención se almente del anticuerpo parental 18A5, pero difieren de 18A uencias de aminoácidos de las porciones de la región 3 que dét plementariedad (CDR3) de la cadena pesada y/o la caden más, las proteínas de unión presentes muestran una potencia unirse a, y neutralizar tanto el IL-21 R humano como m paración con 18A5 en el formato equivalente (por ejemplo, scF neutralización de alta potencia del IL-21 R de ambas especies (h entes.
Definiciones Con el fin de que la presente invención pueda entend lmente, se definen primero ciertos términos. Las definiciones ad xponen a través de la descripción detallada y en algún otro lu ecificación.
El término "proteína de unión" como se utiliza en la uye cualquier proteína natural, recombinante, sintética o éticamente, o una combinación de las mismas, que se une a un eína objetivo o péptído, o fragmentos de los mismos. Las prot n de la invención pueden incluir anticuerpos, o pueden derivar os un fragmento de anticuerpo. Las proteínas de unión pued eínas naturales y/o proteínas que se diseñan de manera sintéti eínas de unión de la invención pueden unirse a un antígeno aminoácidos que imitan la región hipervariable. Los fragment eínas de unión también pueden incluir fragmentos funcionale cuerpo, tal como, por ejemplo, Fab, Fab\ F(ab')2, Fe, Fd, Fd\ Fv inio variable de un anticuerpo (dAb). Las proteínas de unión pu cadena doble o sencilla, y pueden comprender un solo dominio d tiples dominios de unión.
Las proteínas de unión también pueden incluir las prot ón a la inmunoglobulina del dominio de unión, incluyendo el polip inio de unión que está fusionado o conectado de otra mane ulación de la inmunoglobulina o polipéptido de la región que act rticulación, que a su vez se fusiona o conecta de otra manera a u comprende una o más regiones constantes nativas o diseñada ena pesada de inmunoglobulina diferente a CH1 , por ejemplo, las 2 y CH3 de la IgG y la IgA, o las regiones CH3 y CH4 de la IgE (v plo, Ledbetter et al, Publicación de Patente de E.UA 2005/ onado o conectado de otra manera al polipéptido de la región (o CH3 en el caso de un constructo derivado todo o en parte icamente, tales proteínas de fusión a la inmunoglobulina del do n son capaces de al menos una actividad inmunológica seleccio po que consiste de citotoxicidad mediada por las células depend cuerpo, fijación del complemento, y/o unión a un objetivo, por eje geno objetivo. Las proteínas de unión de la invención pueden cualquier especie, incluyendo de manera no exclusiva, de rat ano, camello, llama, peces, tiburón, cabra, conejo, pollo y bovino El término "anticuerpo" como se utiliza en la presente, na inmunoglobulina que es reactiva a una proteína o péptido des ragmento de los mismos. Los anticuerpos adecuados incluyen, d exclusiva, anticuerpos humanos, anticuerpos primatizados, an éricos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoes ¡cuerpos policlonales, anticuerpos poliespecíficos, anticue n constante de la cadena pesada elegida de, por ejemplo, IgG o lgG4. El anticuerpo también puede tener una cadena ligera por ejemplo, kappa (?) o lambda (?). Los anticuerpos de la i den derivarse de cualquier especie incluyendo, de manera no e n, rata, humano, camello, llama, peces, tiburón, cabra, conejo, nos. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden alter plo, mutarse, para modificar las propiedades del anticuerpo (por mentar o disminuir uno o más de: unión al receptor Fe, glucosil uerpo, el número de residuos de cisteína, la función de las toras o la función del complemento). Típicamente, el anticuerp anera específica a un antígeno predeterminado, por ejemplo, un iado con un trastorno, por ejemplo, un trastorno inflamatorio, inmune, neurodegenerativo, metabólico y/o maligno.
El término "proteína de unión de un solo dominio" como a presente, incluye cualquier andamio de unión de un solo domini eínas de unión de un solo dominio pueden ser cualquiera en la lesquier proteínas de unión de un solo dominio futuras, y pueden cualquier especie incluyendo, de manera no exclusiva, ratón, ello, llama, peces, tiburón, cabra, conejo, pollo y bovinos. En alidades de la invención, un andamio de la proteína de unión d inio puede derivarse de una región variable de la inmuno ontrada en peces, tal como, por ejemplo, la que se deriva del i lunoglobulina conocido como el Receptor del Antígeno Novedo :ontrado en el suero de tiburón. Los métodos para producir los unión de un solo dominio derivados de una región variable NAR"), se describen en la Publicación de la Solicitud Internacional D14161 y Streltsov (2005) Protein Sci. 14(11 ):2901-09.
En otras modalidades, una proteína de unión de un sol jna proteína de unión de un solo dominio natural, que se ha desc iica como un anticuerpo de cadena pesada desprovisto de las ilias, además de Camelidae, también pueden utilizarse para pr enas de unión de cadena pesada desprovistas naturalment enas ligeras. Las moléculas de VHH son aproximadamente diez v ueñas que las moléculas de IgG tradicionales. Son polipéptidos muy estables, resistentes a condiciones extremas de pH y tem más, son resistentes a la acción de las proteasas, que no es el C anticuerpos convencionales. Además, la expresión in vitro de de producir VHH funcionales plegados de manera apropiada, dimiento. Además, las proteínas de unión generadas en los C den reconocer los epitopos diferentes a aquellos reconocido ¡cuerpos generados in vitro vía las bibliotecas de anticuerpos unización de mamíferos diferentes a los Camélidos (véase, por Publicaciones de las Solicitudes Internacionales Nos. WO 97/ 94/004678, ambas incorporadas en la presente como referencia).
Los términos "dominio que se une al antígeno" y "fragm tienen la función de unión al antígeno del dominio de unión al to. Los ejemplos de los fragmentos que se unen al antígeno eína de unión incluyen, de manera no exclusiva: (1 ) un fragmento mento monovalente que tiene los dominios VLl VH, CL y CH1 mento F(ab')2, un fragmento bivalente que tiene dos fragmen zados por un puente de disulfuro en la región de articulación mento Fd, que tiene dos dominios VH y uno CH1 ; (4) un fragmento el los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo mento dAb (véase, por ejemplo, Ward et al. (1989) Nature 341 : tiene un dominio VH; (6) una CDR aislada; y (7) un fragmento va sola cadena (scFv). Aunque los dos dominios de un fragmento son codificados por genes separados, puede unirse, utilizando mbinantes, mediante un enlazante sintético que permite que s o una sola cadena de proteína en la cual las regiones VL y VH se formar moléculas monovalentes (conocidas como scFv) (vé cuerpo), que reduce o bloquea la actividad de una traye alización o un antígeno, por ejemplo, la trayectoria de señalizaci L-21 R o el antígeno de IL-21 R. Un "anticuerpo anti-producto", za en la presente, se refiere a un anticuerpo formado en respu eína exógena, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-21 R. Un "a -producto neutralizante", como se utiliza en la presente, se refi cuerpo anti-producto que bloquea la actividad in vivo de la ducida de manera exógena, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL- nas modalidades de la invención, un anticuerpo anti-tralizante disminuye la actividad in vivo de un anticuerpo IL- plo, la actividad farmacodinámica (PD) in vivo de un anticuerpo d como la capacidad de un anticuerpo anti-IL-21 R para modular la as citocinas o genes sensibles a la IL-21 ).
El término "cantidad efectiva", se refiere a una dosifi tidad que es suficiente para regular la actividad del IL-21 R para rest, Departamento de Salud y Servicios de E.U.A., Publicación 3242. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir re inoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina d minal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas agénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o mediante ática in vivo), por ejemplo, en las CDR, y en particular, las C icuerpo humano puede tener al menos una, dos, tres, cuatro, cin iciones reemplazadas como un residuo de aminoácidos qu ificado por la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal h Las frases "inhibe", "antagoniza", "bloquea" o "neut vidad del IL-21 R y sus análogos, se refieren a una reducción, in inución de otra manera, de al menos una actividad del IL-21 R, d n a un anticuerpo anti-IL-21 R, en donde, la reducción es rela vidad del IL-21 R en la ausencia del mismo anticuerpo. La acti 1 R puede medirse utilizando cualquier técnica conocida en el ca 4/0265960; 2006/0159655; 2006/0024268; y 2008/0241098), a11 (véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud Interna 01/085792; Parrish-Novak et al. (2000) supra; Ozaki et al. (200 se une a un ligando de la IL-21. IL-21 R es homólogo a la partida de los receptores de IL-2 e IL-15, e IL-4a (Ozaki et ra). Tras la unión al ligando, el IL-21 R es capaz de interactuar ena del receptor de la citocina gamma (ye) común e inducir la fos STAT1 y STAT3 (Asao et al. (2001) supra) o STAT5 (Ozaki et ra). El IL-21 R muestra una distribución del tejido linfoide exten inos "receptor de la interleucina 21 " o "IL-21 R" o lo similar, ta eren a un polipéptido (de manera preferida, de origen de mam mplo, IL-21 R murino o humano) o, conforme el contexto lo req inucleótido que codifica tal polipéptido, que es capaz de interact 1 (de manera preferida IL-21 de origen de mamífero, por ejem uencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 o la SEQ I fragmento de la misma; (3) una secuencia de aminoácidos ificada por una secuencia nucleotídica de IL-21 R de mamífero na mento de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO:1 (humana - corres GENBANK® No. de Acceso NM_021798) o la SEQ | rina-correspondiente a GENBANK® No. de Acceso NM 0218 mento de la misma); (4) una secuencia de aminoácidos codificad uencia nucleotídica que es sustancialmente homologa a, por ej nos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% homologa a una secuencia nu uesta en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3 o un fragmento de l una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia nu enerada de una secuencia nucleotídica de IL-21 R natural o un f la misma, por ejemplo, SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3, o un frag isma; o (6) una secuencia nucleotídica que se híbrida a un uencias nucleotídicas anteriores bajo condiciones rigurosas, por B y T (Parrish-Novak et al. (2000) supra Kasaian et al. (2002 la unión de la IL-21 al IL-21 R, la activación del IL-21 R condu plo, la señalización de STAT5 o STAT3 (Ozaki et al. (2000) s ino "interleucina-21 " o "IL-21 también se refiere a un polipé era preferida de origen de mamífero, por ejemplo, IL-21 ana), o conforme el contexto lo requiera, un polinucleótido que c péptido, que es capaz de interactuar con el IL-21 R (de manera rigen de mamífero, por ejemplo, IL-21 R murino o humano), y qu os una de las siguientes características: (1 ) una secue noácidos de IL-21 de mamífero natural o un fragmento de la mi plo, una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID ana), o un fragmento de la misma; (2) una secuencia de ami tancialmente homologa a, por ejemplo, al menos 85%, 90%, 95 o homologa a una secuencia de aminoácidos expuesta en la :212, o un fragmento de la misma; (3) una secuencia de aminoác isma; o (6) una secuencia nucleotídica que se híbrida a un uencias nucleotídicas anteriores bajo condiciones rigurosas, por diciones altamente rigurosas.
Los términos "actividad del IL-21 R" y lo similar (por ividad del IL-21 R", "actividad de IL-21/IL-21 R"), se refiere a al n ceso molecular iniciado o interrumpido como resultado de la 1 R. Las actividades del IL-21 R incluyen, de manera no excl racción con, por ejemplo, unión a un ligando, por ejemplo, un p IL-21 ; (2) asociación con o activación de la transducción de bién llamada "señalización", que se refiere a la cascada intrace rre en respuesta a un estímulo particular y moléculas de transduc al (por ejemplo, cadena gamma (ye) y JAK1), y/o estimular la fos activación de las proteínas STAT, por ejemplo, STAT5 y/o S ular la proliferación, diferenciación, función de las células vidad citolítica, secreción de citocina, y/o supervivencia de la ejemplo, una representación del fago in vitro, microplaqueta de pr alquier otro método en el cual las secuencias candidatas puedan u capacidad para unirse a un antígeno).
El término "aislado", se refiere a una molécula q ancialmente libre de su medio natural. Por ejemplo, una proteina sustancialmente libre del material celular u otras proteínas de un ente de tejido de la cual se deriva. El término también se r araciones en donde la proteína aislada está suficientemente p posiciones farmacéuticas, o es al menos 70-80% (peso/peso) os 80-90% (peso/peso) pura, al menos 90-95% (peso/peso) p os 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% (peso/peso) pura.
La frase "por ciento idéntico" o "por ciento de identi re a la similitud entre al menos dos secuencias diferentes. Este p entidad puede determinarse mediante algoritmos de alineación e ejemplo, la Herramienta de Investigación de la Alineación Loca IOS 4:11-17), que se ha incorporado en el programa ALIGN (ver ando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalizaci itud del hueco de 12, y una penalización del hueco de 4. El por tidad se calcula usualmente comparando secuencias de longitud El término "repertorio" se refiere a al menos una s leotídica derivada total o parcialmente de al menos una secue ifica al menos una inmunoglobulina. Las secuencias pueden g iante el rearreglo in vivo de los segmentos V, D y J de las adas, y los segmentos V y J de las cadenas ligeras. De maner secuencias pueden generarse de una célula en respuesta a la cu earreglo, por ejemplo, estimulación in vitro. De manera alterna s las secuencias pueden obtenerse mediante empalme del ADN leotídica, mutagénesis u otros métodos (véase, por ejemplo, la P .A. No. 5,565,332). Un repertorio puede incluir sólo una sec de incluir una pluralidad de secuencias, incluyendo unas en una oximadamente 106 M"V1. Si es necesario, la unión no específi ucirse sin afectar sustancialmente ta unión específica por las co unión variables. Las condiciones de unión apropiadas, tales centración de la proteína de unión, la fuerza iónica de la peratura, tiempo permitido para la unión, concentración de u ueante (por ejemplo, seroalbúmina o caseína de leche), etc. orarse por un experto con experiencia utilizando técnicas de rut diciones ilustrativas se exponen en la presente, pero otras co ocidas por la persona con experiencia ordinaria en la técnica, ca alcance de esta invención.
Como se utiliza en la presente, los términos "riguroso", similar, describen condiciones para la hibridación y lavad inucleótidos aislados de la presente invención pueden utilizar das de hibridación y cebadores para identificar y aislar ácidos tienen secuencias idénticas a, o similares a aquéllas que cod diciones de rigor diferente. El rigor de una reacción de hibridació ificultad con la cual cualquiera de dos moléculas de ácidos nuc idará una con la otra, y las condiciones bajo las cuales perm idadas. De manera preferida, cada polinucleótido hibridante se polinucleótido correspondiente bajo condiciones de rigor con era más preferida, condiciones rigurosas, y de manera más diciones altamente rigurosas. Las condiciones rigurosas se con ellos con experiencia en la técnica, y pueden encontrarse en, por rent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. .1-6.3.6. Ambos métodos acuoso y no acuoso se describen rencia, y cualquiera puede utilizarse. Un ejemplo de condic idación rigurosa es la hibridación en 6X de cloruro de sodio/ io (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por al menos un l X de SSC/SDS al 0.1 % a 50°C. Las condiciones de hibridación bién se logran con lavados en, por ejemplo, 0.2X de SSC/SDS condiciones M-R.
CUADRO 1 Condiciones de hibridación ndición Híbrido Longitud del Temperatura de Temperatura Híbrido (pb)1 hibridación y lavado Amortiguador2 Amortiguado ADN:ADN > 50 65°C; 1X de SSC o 65°C; 0.3X de 42°C; 1X de SSC, 50% de formamida ADN.ADN <50 TB*; 1Xde SSC TB*; 1 de SS ADN:ARN > 50 67°C; 1Xde SSCo45°C¡ 67°C; 0.3X de 1X de SSC, 50% de formamida ADN:ARN <50 TD*; 1Xde SSC TD*; 1Xde SS ARN:ARN >50 70°C; 1Xde SSC o'50°C; 70°C; 0.3X de 1X de SSC, 50% de formamida ARN:ARN <50 TF*; 1X de SSC TF*; 1X de SS ADN:ADN > 50 65°C; 4X de SSCo42°C; 65°C; IXdeS 4X de SSC, 50% de formamida ADN:ADN <50 TH*; 4X de SSC TH*; 4X de SS ndición Híbrido Longitud del Temperatura de Temperatura Híbrido (pb)1 hibridación y lavado Amortiguador2 Amortiguador ADN:ARN > 50 67°C; 4X de SSC o 45°C; 67°C; 1X de S 4X de SSC, 50% de formamida ADN:ARN < 50 Tj*; 4X de SSC *; 4X de SSC ARN:ARN > 50 70°C; 4X de SSC o 50°C; 67°C; 1X de S 4X de SSC, 50% de formamida ARN:ARN < 50 "IV; 2X de SSC V; 2X de SS ADN:ADN >50 50°C; 4X de SSC o 40°C; 50°C; 2X de S 6X de SSC, 50% de formamida ADN:ADN < 50 TN*¡ 6X de SSC TN*; 6X de SS ADN:ARN > 50 55°C; 4X de SSC o 42°C; 55°C; 2X de S 6X de SSC, 50% de formamida ADN:ARN < 50 Tp*; 6X de SSC Tp*; 6X de SS ARN:ARN > 50 60°C; 4X de SSC o 45°C¡ 60°C; 2X de S 6X de SSC, 50% de formamida ARN:ARN < 50 TR*; 4X de SSC TR*; 4X de SS longitud del híbrido es aquélla anticipada para la región hibrida nucleótidos hibridantes. Cuando se híbrida un polinucleóti nucleótido objetivo de secuencia desconocida, se supone que la híbrido es la del polinucleótido hibridante. Cuando los polinucle de menos de 50 pares de bases de longitud, debe ser 5-10°C m emperatura de fusión (Tm) del híbrido, en donde Tm se dete erdo con las siguientes ecuaciones. Para los híbridos de men es de bases de longitud, Tm (°C) = 2(# de A + T bases) + 4(# es). Para los híbridos de entre 18 y 49 pares de bases de longitu 1.5 + 16.6(log10Na+) + 0.41 (%G + C) - (600/N), en donde N es bases en el híbrido, y Na+ es la concentración de los iones so ortiguador de hibridación (Na+ para 1X de SSC = 0.165 M). ejemplos adicionales de condiciones rigurosas para la híbrid inucleótido se proporcionan en Sambrook et al. (1989) Molecular oratory Manual, Capítulos 9 & 1 1 , Coid Spring Harbor Laborato ld Spring Harbor, NY, y Ausubel et al. eds. (1995) Current Pr lecular Biology Sects. 2.10 & 6.3-6.4, John Wiley & So rporadas en la presente como referencia. uencia (de manera más preferida, al menos aproximadamente tidad; de manera más preferida, al menos aproximadamente tidad) con los polinucleótidos descritos. Los polinucleótidos aisla ente invención también pueden utilizarse como sondas de hibri adores para identificar y aislar ADN que tienen secuencias que péptidos homologas a los polinucleótidos descritos. Estos homól nucleótidos y polipéptidos aislados de una especie diferente a a polipéptidos y polinucleótidos descritos, o dentro de las mismas o con una similitud de la secuencia significativa a los polinucl péptidos descritos. De manera preferida, los homólogos polinucl en al menos aproximadamente 50% de identidad de la secu ñera más preferida, al menos aproximadamente 75% de iden ñera más preferida, al menos aproximadamente 90% de identidad nucleótidos descritos, cuando los homólogos de polipéptido nos aproximadamente 30% de identidad de la secuencia (de ma Las frases "sustancialmente como se expone", "sustanc tica" y "sustancialmente homologas", significan que la secu oácidos o nucleotídica relevante (por ejemplo, CDR, dominios n idénticos a, o tendrán diferencias insustanciales (por ejemplo, sustituciones conservadas de aminoácidos) en comparación encias que se exponen. Las diferencias insustanciales incl bios menores de aminoácidos, tales como una o dos sustitucione encia de cinco aminoácidos de una región especificada. En el nticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad os aproximadamente 50% de afinidad del primer anticuerpo.
Las secuencias sustancialmente idénticas u homolog encias descritas en la presente, también son parte de esta solic nas modalidades, la identidad de la secuencia puede ximadamente 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o ma era alterna, existe una identidad u homología sustancial cu células inmunes o las respuestas inmunes de una man iplementa el uso de las proteínas de unión anti-IL-21 R. En una la invención, un agente terapéutico es un anticuerpo terapéu plo, un anticuerpo anti-IL-21 R. En otra modalidad de la inve nte terapéutico es una proteína de unión terapéutica, por eje ocuerpo anti-IL-21 R. Los ejemplos no limitantes y usos de los péuticos se describen en la presente.
Como se utiliza en la presente, una "cantidad terapéut tiva" de una proteína de unión a anti-IL-21 R (por ejemplo, un an refiere a una cantidad de la proteína de unión que es efectiva, inistración de una dosis única o múltiple a un sujeto (tal como un ano) para tratar, prevenir, curar, retardar, reducir la severida iar al menos un síntoma de un trastorno o un trastorno recu longar la supervivencia del sujeto más allá de lo esperado en la al tratamiento. En una modalidad, una cantidad terapéuticament ervivencia de un sujeto más allá de los esperado en la ausen amiento.
Proteínas de unión anti-IL-21 R La descripción de la presente solicitud proporciona teínas de unión anti-IL-21 R que comprenden nuevos fragmento n al antígeno. Numerosos métodos conocidos por aque eriencia en la técnica están disponibles para obtener las prot n o los fragmentos que se unen al antígeno de las mismas. Por proteínas de unión anti-IL-21 R que comprenden anticuerpos, ducirse utilizando métodos de ADN recombinante (véase, por ej ente de E.U.A. No. 4,816,567). Los anticuerpos monoclonales den producirse mediante la generación de hibridomas de acuerd todos conocidos (véase, por ejemplo, Kohler y Milstein (197 :495-99). Los hibridomas formados de esta manera se selec Un método ejemplar para hacer proteínas de un prenden anticuerpos, incluye selección de bibliotecas de expr eínas, por ejemplo, bibliotecas de expresión de fagos o riboson esentación del fago se describe, por ejemplo, en la Patente de ? 3,409; Smith (1985) Science 228:1315-17; Clackson et al. (1991 :624-28; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-97; y las Publi Solicitud Internacional Nos. WO 92/018619; WO 91/0172 20791 ; WO 92/015679; WO 93/001288; WO 92/001047; WO 92/O 90/002809.
Además del uso de bibliotecas de representación, el ecificado puede utilizarse para inmunizar a un animal no hum plo, un macaco de Java, un pollo o un roedor (por ejemplo, ster o rata). En una modalidad, el animal no humano incluye parte de un gen de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, e ñar razas de ratones deficientes en la producción del anticuerpo cuerpo monoclonal que se obtiene de un animal no huma tinuación se modifican (por ejemplo, humanizada, deshuma érica), utilizando técnicas de ADN recombinante conocidas en e ha descrito una variedad de procedimientos para hacer an éricos (véase, por ejemplo, Morrison et al. (1985) Proc. Nati. A 81 (21):6851-55; Takeda et al. (1985) Nature 314(6010):452-54; E.U.A. Nos. 4,816,567 y 4,816,397; Publicaciones de Solicitud . EP 0 171 496 y EP 0 173 494; y Patente del Reino Unido No. ). Las proteínas de unión humanizadas también pueden produ plo, utilizando ratones transgénicos que expresan los genes hu na pesada y ligera, pero son incapaces de expresar los gen na pesada y ligera de la inmunoglobulina endógena del ratón ente de E.U.A. No. 5,225,539), describe un método de injerto plar, que puede utilizarse para preparar las proteínas d mizadas descritas en la presente. Todas las CDR de una pr uencias equivalentes de los dominios variables Fv humanos. Los mplares para generar las proteínas de unión humanizadas o frag mismas se proporcionan por, por ejemplo, Morrison (1985) :1202-07; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; y las Patentes . 5,585,089; 5,693,761 ; 5,693,762; 5,859,205; y 6,407,213. dos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias d leicos que codifican todos o parte de los dominios variables unoglobulina de al menos una de la cadena pesada o ligera. Tal leicos pueden obtenerse de un hibridoma que produce un a tra un objetivo predeterminado, como se describió anteriormente, otras fuentes. El ADN recombinante que codifica la mol icuerpo humanizada puede clonarse en un vector de expresión ap En ciertas modalidades, una proteína de unión huma jora por la introducción de una sustitución conservadora, una susti secuencia del consenso, sustituciones de la línea ger las T o "desinmunización" mediante los métodos descritos plo, las Publicaciones de Solicitud Internacional Nos. WO 98/ 00/034317. Brevemente, los dominios variables de cadena ena de la proteína de unión (tal como, por ejemplo, una proteína vada de un anticuerpo), pueden analizarse para los péptidos que HC Clase II; estos péptidos representan los epitopos de las nciales (como se define en, por ejemplo, las Publicaciones de rnacional Nos. WO 98/052976 y WO 00/034317). Para la detecci opos de las células T potenciales, puede aplicarse un procedi elado por computadora denominado "ensartamiento peptídico", y base de datos de los péptidos que se unen al MHC de clase II Je buscarse para motivos presentes en las secuencias VH y VL, cribió en las Publicaciones de Solicitud Internacional Nos. WO 9 0 00/034317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alo cipales del MHC de Clase II, y por lo tanto, constituyen epitop unol. Today 16(5):237-42; Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: omlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-38. El directorio porciona un directorio extenso de las secuencias de la región vari unoglobulina humana (recopilada por Tomlinson et al., MRC Ce eño de Proteínas, Cambridge, RU). Estas secuencias pueden o una fuente en la secuencia humana, por ejemplo, para las reg rco y las CDR. Las regiones del marco humano de consenso den utilizarse, como se describe en, por ejemplo, la Patente de E 00,064.
En ciertas modalidades, una proteína de unión puede región constante de la inmunoglobulina alterada o Fe. Por eje teínas de unión producidas de acuerdo con las enseñanzas de la den unirse de manera más fuerte o con más especificidad a las ctoras tales como el complemento y/o receptores Fe, que pueden ias funciones inmunes de la proteína de unión, tales como la activi ab. Clin. Med. 126:330-41. Para las técnicas de producción adici roteína de unión/anticuerpo, véase, por ejemplo, Antibodies: A L nual (1988) Harlow et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory. La nción no está limitada necesariamente a cualquier fuente odo de producción u otras características especiales de una pr n o un anticuerpo.
Las proteínas de unión que comprenden an iunoglobulinas) son típicamente proteínas glucosiladas tetr puestas de dos cadenas ligeras (L) de aproximadamente 25 , y dos cadenas pesadas (H) de aproximadamente 50 kDa cada S de cadenas ligeras, denominadas lambda (?) y kappa (?), ontrarse en los anticuerpos. Dependiendo de la secu inoácidos del dominio constante de las cadenas pesa unoglobulinas pueden asignarse a cinco clases principales: A, D, arias de estas ueden dividirse además en subclases isoti ponsables por las interacciones específicas del anticuerpo con el CDR son referidas como CDR1 , CDR2 y CDR3. Los constitu CDR en la cadena pesada son referidos como H1 , H2 y H3 ridos aquí como H1 CDR, H2 CDR y H3 CDR, respectivamente), los constituyentes de las CDR en la cadena ligera son referidos y L3 (también referidos en la presente como L1 CDR, L2 CDR y pectivamente).
La CDR3 es típicamente la fuente mayor de diversidad tro del sitio de unión al antígeno. H3 CDR, por ejemplo, pued a como dos residuos de aminoácidos o mayor que 26 aminoáci ucturas de la subunidad y la configuración tridimensional de es de inmunoglobulinas son bien conocidas en la técnica. isión de la estructura del anticuerpo, véase, por ejemplo, Harl 88) supra. Alguien con experiencia en la técnica, reconocerá uctura de subunidad, por ejemplo, una estructura CH, VH, CL, VL, ndar es la definición de "AbM" utilizado por el programa de mod cuerpo AbM de Oxford Molecular's (véase, generalmente, por ein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Do ibody Engineering (2001 ) Duebel y Kontermann eds., Spring delberg). Las modalidades descritas con respecto a las CDR den implementarse de manera alterna utilizando las relaciones ilares, con respecto a las espiras hipervariables de Chothia o a la nidas por AbM.
El fragmento Fab consiste de los dominios VH-CH1 zados de manera covalente por un enlace de disulfuro entre las stantes. El fragmento Fv es más pequeño y consiste de los domi enlazados de manera no covalente. Para superar la tendenci iinios enlazados de manera no covalente a disociarse, puede c scFv. La scFv contiene un polipéptido flexible que enlaza (1) el t VH al término N de V|_, o (2) el término C de V|_ al término N d inio incluyen proteínas de unión, en donde las CDR son part éptido de un solo dominio. Los ejemplos incluyen, de ma usiva, proteínas de unión de cadena pesada, proteínas de u n desprovistas naturalmente de de cadena ligeras, proteínas de olo dominio derivadas de anticuerpos de cuatro cadenas conven einas de unión diseñadas y andamios de proteínas de un solo rentes a aquellos derivados de los anticuerpos. Las proteínas de solo dominio incluyen cualquiera conocida en la técnica, a lquier proteína de un solo dominio determinada o aprendida en el f Las proteínas de unión de un solo dominio pueden deri lquier especie, incluyendo, de manera no exclusiva, ratón, ello, llama, peces, tiburón, cabra, conejo, pollo y bovinos. En un a invención, la proteína de unión de un solo dominio puede deri región variable de la inmunoglobulina encontrada en peces, tal c plo, la que se deriva del isotipo de inmunoglobulina conoci ena pesada desprovisto naturalmente de una cadena ligera, se c presente como un VHH O un nanocuerpo, para distinguirlo vencional de inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Tal molé de derivarse de anticuerpos creados en especies de Cameli plo, en camellos, llamas, dromedarios, alpacas y guanaco, y nas veces un dominio variable de camélido o camelizado (vé plo, Muyidermans (2001 ) J. Biotechnol. 74(4):277-302, incorpor enté como referencia). Otras especies, además de aquéllas en l elidae, también pueden producir proteínas de unión de caden provistas naturalmente de cadenas ligeras. Las moléculas de ximadamente diez veces más pequeñas que las moléculas de I péptidos únicos y son muy estables, resistiendo condiciones extr y temperatura. Además, son resistentes a las acciones de las p ue no es el caso para los anticuerpos convencionales. Ad resión in vitro de VHH puede producir VHH funcionales plegados d adas/ligeras, y dos diferentes sitios de unión. Las proteínas pecíficas pueden producirse mediante una variedad de uyendo la fusión de hibridomas o el enlace de fragmentos Fab' (v plo, Songsivilai y Lachmann (1990) Clin. Exp. Immunol. 7 telny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-53). En una mod eína de unión biespecífica comprende un primer polipéptido del nión, tal como un fragmento Fab', enlazado vía una región consta unoglobulina a un segundo polipéptido del dominio de unión.
Otra proteína de unión de acuerdo con la invenció prender, por ejemplo, una proteína de fusión de inmunoglob inio de unión, que incluye un polipéptido del dominio de unión onado o conectado de otra manera a un polipéptido de la r ulación o que actúa como la articulación de la inmunoglobulina, , está fusionado o conectado de otra manera a una región que co o más regiones constantes nativas o diseñadas de una cadena p era al polipéptido de la región de articulación y un polipéptido de stante CH3 de cadena pesada de la inmunoglobulina nativa o dis en el caso de un constructo derivado todo o en parte de la IgE), onado o conectado de otra manera al polipéptido de la región (o CH3 en el caso de un constructo derivado todo o en parte d camente, tales proteínas de fusión de inmunoglobulina del do n, son capaces de al menos una actividad inmunológica selecci po que consiste de la citotoxicidad mediada por las células depen icuerpo (ADCC), fijación del complemento y/o unión a un obj plo, un antígeno objetivo, tal como el IL-21 R humano.
Las proteínas de unión de la invención también prender peptidomiméticos. Los peptidomiméticos son moléc tienen péptidos que imitan los elementos de la estructura secund teína (véase, por ejemplo, Johnson et al. Peptide Turn Mi echnology and Pharmacy (1993), Pezzuto et al. eds., Chapma piedades naturales de los péptidos de selección descritos en la o con características alteradas y potencialmente mejoradas.
Otras modalidades de proteínas de unión útiles para pr nción, incluyen proteínas de fusión. Estas moléculas generalme a o una porción sustancial de un péptido de selección, por ejempl n anticuerpo anti IL-21 R, enlazado a un término N o C, a to ción de un segundo polipéptido o proteína. Por ejemplo, las pro on pueden emplear secuencias líderes (o señal) de otras espe mitir la expresión recombinante de una proteína en un h erólogo. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos, o las secu os nucleicos que codifican las secuencias de aminoácido eínas de unión y los fragmentos que se unen al antígeno de la la presente invención, comprenden una secuencia líder (o señal) ccionarse de las SEQ ID NOs: 87-109 y 239-248. Otra fusión ú dición de un dominio inmunológicamente activo, tal como un e ntes antiangiogénicos, hormonas, citocinas, factores de cre acos peptídicos, anticuerpos, fragmentos Fab de anticuerpos, a teínas receptoras, enzimas, lectinas, proteínas del MHC, prot esión celular y proteínas de unión. Los métodos para ge teínas de fusión son bien conocidos por aquellos con experien ica. Tales proteínas pueden producirse, por ejemplo, mediante mica utilizando reactivos de reticulación bifuncional, mediante la sí o de la proteína de fusión completa, o mediante la unión de una s ADN que codifica el péptido de selección a una secuencia de ifica al segundo péptido o proteína, seguido por la expresión de la fusión intacta.
En una modalidad, el péptido de selección, por ejempl á fusionado con una región constante de la cadena pesa unoglobulina, tal como un fragmento Fe, que contiene dos domi ión constante y una región de articulación, pero carece de Un aspecto de la presente invención comprende prot n y fragmentos que se unen al antígeno de las mismas, que s R. La descripción proporciona CDR novedosas que se han de bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. La estruct teína que se utiliza generalmente para portar una CDR, es un ada o ligera del anticuerpo o una porción de la misma, en dond localiza en una región asociada con una CDR natural. Las estr caciones de los dominios variables pueden determinarse como se Kabat et al. ((1991) supra).
Las modalidades ilustrativas de las proteínas de mentos que se unen al antígeno de las mismas) de la inve ntifican como AbA-Abll, H3-H6, L1-L6, L8-L21 , y L23-L25. Las s ADN y de aminoácidos de las modalidades no ilustrativas no limi proteínas de unión de anti-IL-2 R de la invención, se exponen e NOs: 5-195, 213-229 y 239-248. Las secuencias de ADN y de am CUADRO 2A relación de los códigos del anticuerpo presentes y las design previas igo presente Designación previa VHP/VL2 VHP/VL3 VHP VL11 VHP/VL13 VHP/VL14 VHP/VL17 VHP VL18 VHP/VL19 VHP/VL24 VH3NLP VH3NL3 VH3NL13 VH6NL13 VH6NL24 VHP/VL16; VHPTMNL16 VHP VL20; VHPTMNL20 VH3NL2; VH3DMNL2 VH3NL18; VH3DMNL18 CUADRO 2B ecuencias de aminoácidos y nucleotídicas de los dominios V scFv y CDR de las proteínas de unión ilustrativas de la inven EGIÓN TIPO SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID H3 H4 H5 H6 VH AA NO:14 NO:16 NO:18 NO:20 VL AA NO:10 NO:10 NO:10 NO:10 scFv AA NO:110 NO:112 NO: 1 14 NO 116 DR H1 AA NO:163 NO:163 NO: 163 NO 163 DR H2 AA NO:164 NO: 164 NO:164 NO 164 DR H3 AA NO: 165 NO: 166 NO: 167 NO 168 DR L1 AA NO:194 NO: 194 NO: 194 NO :194 DR L2 AA NO:195 NO: 195 NO: 195 NO 195 DR L3 AA NO:170 NO: 170 NO:170 NO 170 VH ADN NO: 13 NO:15 NO:17 NO:19 VL ADN NO:9 NO:9 NO:9 NO:9 scFv ADN NO:109 NO:1 11 NO:113 NO:115 CUADRO 2B (continuación) EGIÓN TIPO SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID L2 L3 L4 L5 CUADRO 2B (continuación) CUADRO 2B (continuación) EGIÓN TIPO SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID L13 L14 L15 L16 VH AA NO:6 NO:6 NO:6 NO:6 VL AA NO:44 NO:46 NO:48 NO:50 CUADRO 2B (continuación) CUADRO 2B (continuación) REGIÓN TIPO SEQ ID SEQ ID L24 L25 VH AA NO:6 NO:6 VL AA NO:64 NO:66 Las proteínas de unión de anti-IL-21 R de la presente i den comprender regiones constantes del anticuerpo o parte as. Por ejemplo, un dominio VL puede unirse en su extremo C t ominio constante de cadena ligera como CK O ??. De manera si inio VHl o porción del mismo, puede unirse a toda o parte de un ada como IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y cualquier subclase de isoti ones constantes son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, 1991 ) supra). Por lo tanto, las proteínas de unión dentro del al invención incluyen dominios VH y VLt o porciones de los binados con regiones constantes conocidos en la técnica.
Ciertas modalidades comprenden un dominio VHl un do na combinación de los mismos, del fragmento Fv de AbA-AbZ 6, L8-L21 , y/o L23-L25. Las modalidades adicionales compren , tres, cuatro, cinco o seis CDR de los dominios VH y VL. Las prot n cuyas secuencias de la CDR son las mismas que, o similar nea germinal de consenso.
En una modalidad, la mutagénesis se utiliza para h eína de unión más similar a una o más de las secuencias de minal. Esto puede ser deseable cuando las mutaciones se intro R de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) a t agénesis somática o a través de PCR susceptible a error. Las se a línea germinal para los dominios VH y VL pueden identificarse r alineaciones de las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleic ase de datos BASE V (MRC Centro para Diseño de Proteínas, E V es un directorio extenso de todas las secuencias de la regió la línea germinal humana recopiladas de más de mil se licadas, incluyendo aquéllas en la circulación actual en las bibli os de GENBANK® y EMBL. En algunas modalidades, las FR de mutan de conformidad con las correspondencias más cercanas e datos BASE V y las porciones de la CDR se mantienen intactas. zando técnicas conocidas en el campo, tales como ELISA, tecn ensor (tal como análisis de interacción bioespecifica) u otras uyendo aquéllas descritas en esta solicitud.
Está contemplado que las proteínas de unión de la i dan unirse a otras proteínas, tales como, por ejemplo, mbinantes que comprenden todo o una porción del IL-21 R.
Alguien con experiencia ordinaria en la técnica recono proteínas de unión descritas pueden utilizarse para detectar, bir las proteínas que difieren algo del IL-21 R. Por ejemplo, esas den ser homólogos de IL-21 R. Se espera que las proteínas de i-IL-21 R se unan a proteínas que comprenden una secuencia q nos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más. Idé lquier secuencia de al menos 100, 80, 60, 40 ó 20 aminoácidos la secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 2 ó 4.
Además de los análisis de homología de la secuencia, Current Communicacións in Molecular Biology, Cold Sprin oratory, Cold Spring Harbor, NY).
La descripción proporciona un método para obtener pro ón anti-IL-21 R. El método comprende crear proteínas de unió uencias VH y/o VL que están alteradas de aquéllas secuencias de resente. Tales proteínas de unión pueden derivarse por una per eriencia utilizando técnicas conocidas en el campo. Por ejer tituciones, supresiones y adiciones de aminoácidos pueden introd regiones FR y/o CDR. Los cambios en FR se diseñan usualm orar la estabilidad y la inmunogenicidad de la proteína de unión, los cambios en las CDR se diseñan típicamente para incre idad de la proteína de unión por su antígeno. Los cam ementan la afinidad, pueden probarse alterando una o más secu DR y midiendo la afinidad de la proteína de unión por su objetiv ejemplo, Antibody Engineering (2a ed. 1995) Borrebaeck ed iones CD , también pueden hacerse siempre que no afecten d ersa (por ejemplo, reduzcan la afinidad por más del 50% en co la proteína de unión no sustituida), las propiedades de uni teína de unión. También pueden hacerse sustituciones para corre a germinal la proteína de unión o estabilizar su sitio que s ígeno.
Las modificaciones conservadoras producirán moléc en características funcionales y químicas similares a aquéll lécula de la cual se hacen tales modificaciones. En contr dificaciones sustanciales en las características funcionales y/o quí olécula, pueden lograrse seleccionando sustituciones en la sec inoácidos que difieren de manera significativa en su efecto para la estructura de la cadena principal molecular en el área de la s ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (2) la rofobicidad de la molécula en el sitio objetivo y/o (3) el tama servadoras o no conservadoras), pueden determinarse por aqu eriencia en la técnica al momento de que tales sustituciones se ejemplo, las sustituciones de aminoácidos pueden utiliza tificar residuos importantes de la secuencia de la molécula ementar o disminuir la afinidad de las moléculas descritas en la sustituciones de aminoácidos ejemplares incluyen, de ma lusiva, aquéllas expuestas en el Cuadro 3.
CUADRO 3 Sustituciones de aminoácidos ejemplares siduos originales Sustituciones Sustituciones ejemplares conservadoras (A) Val, Leu, lie Val (R) Lys, Gln, Asn Lys (N) Gln Gln (D) Glu Glu s (C) Ser, Ala Ser (S) Thr, Ala, Cys Thr (T) Ser Ser (W) Tyr, Phe Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe l (V) He, Met, Leu, Phe, Ala, Leu Norleucina En ciertas modalidades, las sustituciones de ami servadoras también abarcan residuos de aminoácidos no natural rporan típicamente mediante síntesis peptídica química más que esis en los sistemas biológicos.
En una modalidad, el método para hacer un dominio VH prende agregar, suprimir o sustituir al menos un aminoácid inios VH descritos, o combinando los dominios VH descritos con dominio VLt y probando el dominio VH variante para la unión a IL dulación de la actividad de I L-21 R/l L-21.
Un método análogo para hacer un dominio VL eináceos (por ejemplo, polietilenglicol, polipropilengl oxialquilenos) en las maneras expuestas en las Patentes de E. 0.835; 4,496,689; 4,301 ,144; 4,670,417; 4,791 ,192; y 4,179,3 teínas de unión pueden modificarse químicamente mediante co alenté a un polímero, por ejemplo, para incrementar su vida me ulación sanguínea. Los polímeros ejemplares y los métodos de stran en las Patentes de E.U.A. Nos. 4,766,106; 4,179,337; 4,4 09,546.
Las proteínas de unión descritas pueden modificarse pa glucosilación; esto es, al menos una porción de carbohidrat rimirse o agregarse a la proteína de unión. La supresión o a s de glucosilación puede agregarse cambiando la secu inoácidos para suprimir o crear sitios de consenso de glucosila bien conocidos en la técnica. Otros medios para agregar por bohidrato es el acoplamiento químico o enzimático de los glu el dominio Fe, puede mejorar la inmunogenicidad de una co acéutica (véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud Inte WO 2008/052030). Para las moléculas inmunoglobulina, ostrado que la unión del carbohidrato N enlazado a Asn-297 de es crítico para la actividad de ADCC. Su eliminación enzimática és de la mutación del sitio de consenso o enlazado a N resulta e una actividad ADCC. En las glucoproteinas, los carbohidrato se al átomo de nitrógeno de la amida en la cadena lateral aragina en un motivo tripeptídico Asn-X-Thr/Ser. Este osilación, denominada glucosilación enlazada a N, comienza en oplásmico (ER) con la adición de múltiples monosacáridos a un f col para formar un complejo de carbohidrato ramificado de 14 e complejo de carbohidrato se transfiere a continuación a la diante el complejo de oligosacariltransferasa (OST). Antes d oproteina deje el paso del ER, tres moléculas de glucosa se r carbohidratos N enlazados generalmente tienen en común un n tasacárido, que consiste de tres residuos de mañosa y cetilglucosamina. Finalmente, en el Golgi trans, otros residuos d den agregarse, seguido por la galactosa (Gal) y un ácido siálico l). El procesamiento del carbohidrato en el complejo de Golgi e cosilación terminal" para distinguirlo de la "glucosilación central", r en el ER. Las unidades del carbohidrato del complejo fina ar muchas formas y estructuras, algunas de las cuales tienen d tro ramificaciones (denominadas biantenares, trianten antenares). Varias enzimas están involucradas en el procesa gi, incluyendo las manosidasas de Golgi IA, IB y IC, la GIcNAc-tr manosidasa II de Golgi, GIcNAc-transferasa II, galactosil tran il transferasa.
Los métodos para alterar la región constante de una pr n (tal como, por ejemplo, la región constante de un anticu lares.
Por ejemplo, es posible alterar la afinidad de una regi proteína de unión (por ejemplo, una IgG, tal como una IgG huma (por ejemplo, Fe gamma R1) o C1q. La afinidad puede plazando al menos un residuo especificado con al menos un res una funcionalidad apropiada en su cadena lateral, o introduci o funcional cargado, tal como glutamato o aspartato, o tal vez u olar aromático tal como fenilalanina, tirosina, triptófano o alanin ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,624,821 ).
Por ejemplo, reemplazando en residuo 297 (asparag ina en la región constante de la IgG, inhibe de manera signifi utamiento de las células efectoras, mientras que sólo reduce lig oximadamente tres veces más débil) la afinidad por C1q (vé plo, la Patente de E.U.A. No. 5,624,821). La numeración de los la cadena pesada es aquélla del índice EU (véase Kabat et a Pueden producirse proteínas de unión modificadas q interacción reducida con un receptor de Fe. Por ejemplo, se ha en la lgG3 humana, que se une al receptor gamma R1 de Fe hu ibio de Leu 235 a Glu destruye su interacción con el recept aciones en sitios adyacentes o cercanos en la región de enla ulación de una proteína de unión (por ejemplo, reemplazando los , 235 y 237 con Ala), también puede utilizarse para afectar la afini teína de unión por el receptor gamma R1 de Fe. La numeraci iduos en la cadena pesada se basa en el índice EL) (véase Ka 91 ) supra). Así, en algunas modalidades de la invención, la regi proteínas de unión de la invención contiene al menos una mutac ión constante, tal como, por ejemplo, cambiar Leu a Ala en la pos 34?), cambiar Leu a Ala en la posición 235 (L235A), y/o cambiar la posición 237 (G237A). En una modalidad, la región Fe de la pr n contiene dos mutaciones en la región constante, L234A y G 24,821.
Las proteínas de unión de la invención pueden marcars rca detectable o funcional. Estas marcas incluyen radiomar mplo, 1311 y 99Tc), marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de atasa alcalina), y otras porciones químicas (por ejemplo, biotina).
La invención también tiene como característica una pr ón aislada o fragmento que se une al antígeno de la misma, que 1 R, en particular, el IL-21 R humano. En ciertas modalidades, la unión al anti-IL-21 R puede tener al menos una de las s acterísticas: (1 ) es una proteína de unión monoclonal o de ecificidad; (2) es una proteína de unión humana; (3) es una pr ón generada in vitro; (4) es una proteína de unión generada in mplo, sistema de ratón transgénico); (5) inhibe la unión de IL-21 es una lgG1 ; (7) se une a IL-21 R humano con una constante de a al menos aproximadamente 105 M"1s"1; (8) se une al IL-21 R murin os; (13) inhibe la proliferación mediada por IL-21 R humano de la que expresan el IL-21 R humano con una Cl50 de aproximadam o menos; (14) inhibe la proliferación mediada por la IL-21 de las arias humanas con una CI50 de aproximadamente 1.9 nM o me be la proliferación mediada por la IL-21 de las células T CD4+ anas con una CI50 de aproximadamente 1.5 nM o menos; (16) liferación mediada por la IL-21 de las células T CD4+ primarias una CI50 de aproximadamente 5.0 nM o menos; (17) tiene una eli cuerpo total media de aproximadamente 0.1-7.5 ml/hr/kg despué plo, la administración i.v. a animales, por ejemplo, mamíf plo, humanos, primates no humanos, roedores; (18) tiene una vi eliminación media de aproximadamente 20-700 hr después plo, la administración i.v., s.c. o i.p. a animales, por ejemplo, m ejemplo, humanos, primates no humanos, roedores; (19) tiene un distribución medio en estado estacionario de aproximadamente malizada con la dosis media (concentración máxima en s oximadamente 0.5-30 pg/ml después de, por ejemplo, la admi sx. o i.p. a animales, por ejemplo, mamíferos, por ejemplo, ates no humanos, roedores; y (23) modula la expresión de las sibles a la IL-21 o los genes sensibles a la IL-2 .
Alguien con experiencia en la técnica apreciará ificaciones descritas anteriormente no son exhaustivas, y que s modificaciones serán obvias para el experto con experiencia a enseñanzas de la presente descripción. Ácidos nucleicos, clonación y sistemas de expresión La descripción proporciona ácidos nucleicos aisla ifican las proteínas de unión descritas. Los ácidos nucleico prender ADN o ARN, y pueden ser sintéticos (completa o parcial ombinantes (completa o parcialmente). La referencia a una s , 97%, 98%, 99% o más idéntica a la misma, o que es capaz de condiciones rigurosas a las secuencias).
En una modalidad, los ácidos nucleicos aislado uencias nucleotídicas que codifican regiones variables de la ada y de cadena ligera de una proteína de unión a anti-IL- prende al menos una CDR elegida de las secuencias de amino SEQ ID NOs: 163-195, o una secuencia que codifica una CDR q uno o dos o tres o cuatro aminoácidos de las secuencias descri sente.
El ácido nucleico puede codificar sólo la región varia ena ligera o la cadena pesada, o puede codificar una región con adena ligera o pesada de la proteína de unión, enlazada d ativa a una región variable correspondiente. En una modalidad, iable de la cadena ligera está enlazada a una región constante e región constante kappa o lambda. La región constante de l zclas de los mismos), excepto para las sitios de restricción modific ilar, pueden mutarse de acuerdo con las técnicas están porcionar secuencias génicas. Para codificar las secuenci taciones pueden afectar las secuencias de aminoácidos como s particular, las secuencias nucleotídicas sustancialmente idénti ivadas de V, D, J nativos, constantes, cambian y otras de tales s critas en la presente están contempladas (en donde, "derivado" i secuencia es idéntica a, o modificada de otra secuencia).
En una modalidad, los ácidos nucleicos difieren (por ren por sustitución, inserción o supresión) de aquellos de las s porcionadas (por ejemplo, por al menos de uno, pero menos de 1 0 nucleótidos; al menos uno, pero menos de 1 %, 5%, 10% o 20 leótidos en el ácido nucleico objeto). Si es necesario para este secuencias deben alinearse para la homología máxima. Las s bucle" de las supresiones o inserciones, o malas corresponde prende al menos un constructo de ácido nucleico descrito en la pr También se proporciona un método para hacer una ificada de un ácido nucleico que comprende las secuencias descri enté. El método comprende cultivar las células hospede diciones apropiadas, de manera que expresan la proteína d leico. Después de la expresión y producción, el dominio VH o mbro de unión específico, puede aislarse y/o purificarse lquier técnica adecuada, y a continuación utilizarse confor piado. El método también puede incluir los pasos de fusionar leico que codifica una scFv con ácidos nucleicos que codifican un e una proteína de unión, y expresar el ácido nucleico fusionad la. El método también puede incluir el paso de corregir con inal.
Los fragmentos que se unen al antígeno, los dominios \ s moléculas de ácido nucleico codificantes y los vectores pueden emente, las células hospederas adecuadas incluyen células de las de insecto, células de planta, células de levadura o arióticas, por ejemplo, E. coli. Las células de mamífero disponib ica para la expresión del polipéptido heterólogo incluyen líneas cíticas (por ejemplo, NSO), células HEK293, células de ovario de o (CH0), células COS, células HeLa, células de riñon de hámst las de oocito y células de un animal transgénico, por ejemplo eliales de mamífero. En otras modalidades, los ácidos nucle ifican las proteínas de unión de la invención se colocan bajo el c promotor específico del tejido (por ejemplo, un promotor espe ífero), y las proteínas de unión se producen en animales tran ejemplo, las proteínas de unión son secretadas en la leche de u sgénico, tal como una vaca, cerdo, caballo, oveja, cabra sgénico.
Los vectores adecuados pueden elegirse o construi criben en, por ejemplo, in Current Protocols in Molecular Biolog 2) Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons.
Un aspecto adicional de la descripción, proporciona u a introducir el ácido nucleico en una célula hospedera. Par arióticas, las técnicas de transfeccion adecuadas pueden incluir f ió, DEAE-Dextrano, electroporación, transfeccion mediada por li ansduccion utilizando un retrovirus u otros viruses, por ejemplo, V ulovirus. Para las células bacterianas, las técnicas adecuada uir transformación con cloruro de calcio, electroporación y tra zando un bacteriófago. La introducción del ADN puede seguirs todo de selección (por ejemplo, resistencia al fármaco) para selec las que contienen el ácido nucleico.
Usos de las proteínas de unión anti-IL-21 R Las proteínas de unión anti-IL-21 R que actúa ematopoyética (por ejemplo, una célula de linaje mieloide, li oide, o células precursoras de las mismas), y por lo tanto, zarse para tratar una variedad de trastornos inmunes y t rproliferativos de la sangre. Los ejemplos de trastornos/t unes asociados con el IL-21 R que pueden tratarse, incluyen, d exclusiva, rechazo de transplante, enfermedad de injerto v pedero (GVHD), alergias (por ejemplo, alergia atópica), y enfer inmunes. Las enfermedades autoinmunes incluyen, de m usiva, diabetes mellitus, trastornos artríticos (incluyend matoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis so ondilitis anquilosante), espondiloartropatía, esclerosis efalomielitis, miastenia grave, lupus eritematoso sistémico (SL matoso cutáneo, tiroiditis autoinmune, dermatitis (incluyendo pica y dermatitis eczematosa), soriasis, síndrome de Sjóg uyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa), asma (incluye viosa apropiada). La inflamación que resulta de una respuesta inr dependiente de la IL-21/IL-21 R puede tratarse con las proteínas d composiciones de esta invención. En el modelo de ratón de oinmune experimental (EAE) para la esclerosis múltiple (vé mplo, Tuohy et al. (1988) J. Immunol. 141 :1126-30; Sobel et al. unol. 132:2393-401 ; y Traugott (1989) Cell Immunol. 119:11 amiento de ratones con inyecciones de un anticuerpo de IL-21 R e manera continua después) la inducción de la EAE, retardó d funda el inicio de la enfermedad. Las proteínas de unión o los fr se unen al antígeno de las mismas de la presente invención izarse en método para tratar o prevenir la esclerosis múltiple en su mplo, en humanos.
La artritis es una enfermedad caracterizada por la infla articulaciones. La artritis reumatoide (RA), es la forma más fre itis, que involucra la inflamación del tejido conectivo y de la ucción de la CIA (y de manera continua), exacerbó la enferme reción incrementada de citocinas y quimiocinas inflamatorias, y d s importante, los niveles incrementados de la enfermedad que re respuestas inmunes que son dependientes de la IL-21 , puede las proteínas de unión de la invención. De manera similar, las unión o los fragmentos que se unen al antígeno de las mism sente invención, pueden utilizarse en métodos para tratar o prev tras enfermedades artríticas en sujetos, por ejemplo, en humanos.
El rechazo del transplante es el fenómeno inmunol de los tejidos de un donador son "atacados" de manera específi ulas inmunes del hospedero. Las principales células de "ataque ulas T, cuyos receptores de las células T reconocen las moléculas donador como "extrañas". Este reconocimiento activa las célul lifera y secreta una variedad de citocinas y proteínas citolít truyen finalmente el transplante. Las células T en la reacción de echazo de transplante y las enfermedades relacionadas (por HD), que son dependientes de la IL-21 en sujetos, por eje anos.
El lupus eritematoso sistémico (SLE) es una en oinmune caracterizada por la presencia de autoanticuerpos, in ¡cuerpos para el ADN, antígenos nucleares y ribonucleoproteína oanticuerpos están asociados con el tejido y el daño de órganos.
SLE es desconocida, pero la aparición de autoanticuerpos su bición inadecuada de las células T o las células B autorreacti teínas de unión o los fragmentos que se unen al antígeno de la la presente invención pueden utilizarse en métodos para i vidades mediadas por la IL-21 de las células T y las c orreactivas y/o para tratar o prevenir el SLE o enfermedades rela sujetos, por ejemplo, en humanos o en ratones MRL-Fas/pr (un n para el SLE) (Immunologic Defects in Laboratory Animái ? ides o eritroides, o células precursoras de las mismas. Los eje trastornos neoplásicos incluyen cánceres leucémicos y tumor re, médula ósea (por ejemplo, mieloma), y tejido linfoide (por mas). En ciertas modalidades, la presente invención está di miento de varios cánceres leucémicos incluyendo, de ma usiva, leucemia promieloide aguda (APML), leucemia mielógen IL) y leucemia mielógena crónica (CML) (revisado en Vaickus (1 . Oncol./Hemotol. 11 :267-97). Los ejemplos de malignidades linfo den tratarse mediante los métodos presentes incluyen, de m usiva, leucemia linfoblástica aguda (ALL, que incluye ALL de li de linaje T), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia proli L), leucemia de las células pilosas (HCL) y macroglobulin denstrom (WM). Las formas adicionales de linfomas malignos qu rse mediante la presente invención incluyen, de manera no e ma no de Hodgkin, linfoma de las células T periféricas, leucemi to una proteína de unión a anti-IL-21 R o un fragmento que s ígeno de la misma, como se describe en la presente, en una ciente para disminuir, inhibir o reducir la respuesta de fase agu to. En una modalidad, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un sufre de un trastorno asociado con el IL-21 R como se descri sente, incluyendo, por ejemplo, trastornos respiratorios, t matorios y trastornos autoinmunes.
Terapia de combinación En una modalidad, una composición farmacéut prende al menos una proteína de unión al anti-IL-21 R o un fragm une al antígeno de la misma, y al menos un agente terapé inistran en una terapia de combinación. La terapia es útil p diciones o trastornos patológicos, tales como trastornos in matorios. El término "en combinación" en este contexto, signifi péutico adicional. Los agentes adicionales pueden incluir al bidor de las citocinas, inhibidor del factor de crecimiento, inmuno nte antiinflamatorio, inhibidor metabólico, inhibidor de enzimas tóxico y/o agente citostático, como se describe con más tinuación. Tales terapias de combinación puede utilizar de tajosa dosificaciones menores de los agentes terapéuticos admi ando así posibles toxicidades o complicaciones asociadas oterapias varias. Además, los agentes terapéuticos descrit senté actúan en trayectorias que difieren de la trayectoria de IL-2 >r lo tanto, se espera que mejoren y/o sinergicen los efecto eínas de unión anti-IL-21 R.
Los agentes terapéuticos utilizados en combinación eínas de unión anti-IL-21 R pueden ser aquellos agentes que inte rentes etapas en la respuesta autoinmune y la respuesta inf terior. En una modalidad, al menos una proteína de unión a ibinación con las proteínas de unión anti-IL-21 R descritas en la uyen, de manera no exclusiva, antagonistas de al menos una int r ejemplo, IL-1 , IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 2, IL-13, IL-15, IL-16, IL-1 2), citocina (por ejemplo, TNF-a, LT, EMAP-II y GM-CSF), o imiento (por ejemplo, FGF y PDGF). Los agentes también pued manera no exclusiva, antagonistas de al menos un receptor rleucina, citocina o factor de crecimiento. Las proteínas i-IL-21 R también pueden combinarse con inhibidores (por icuerpos) para las moléculas de la superficie celular tales como C 4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7. .2), CD90, o sus ligandos (por ejemplo, CD154 (gp39, C -1/ICAM-1 o VLA-4/VCAM-1 (véase Yusuf-Makagiansar et al. (20 . Rev. 22(2): 146-67)). Los antagonistas que pueden utili ibinación con las proteínas de unión anti-IL-21 R descritas en la den incluir anta onistas de IL-1 IL-12 TNF-a IL-15 IL-17 IL-1 uyen anticuerpos para IL-18, fragmentos solubles del receptor d eínas de unión de IL- 8 (IL-18BP, Mallet et al. (2001) Circ. Res. plos de antagonistas de la IL-1 incluyen inhibidores de la En vierte la Interleucina 1 (ICE) (tales como Vx740), antagonistas de plo, IL-1 RA (anakinra, Amgen)), slL-1 Rll (Immunex), y anticu ptor anti-IL-1.
Los ejemplos de antagonistas del TNF incluyen anticuer NF (por ejemplo, TNF-a humano), tal como D2E7 (anticuerpo a ano, Patente de E.U.A. No. 6,258,562, HUMIRA™, BASF, Pa , CDP-571/CDP-870/BAY- 0-3356 (anticuerpos anti-TNF-a hum ltech/Pharmacia), cA2 (anticuerpo anti-TNF-a quimérico, REMI tocor), y fragmentos del anticuerpo anti-TNF (por ejemplo, os ejemplos incluyen fragmentos o derivados del receptor TNF so plo, p55 o p75 humano), tales como p55 kdTNFR-lgG (proteína - ™ - ):S284 y Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. (1995) 268:37-42).
En otras modalidades, las proteínas de unión an critas en la presente, pueden administrarse en combinación con de lo siguiente: antagonistas de IL-13, tales como receptores bles y/o anticuerpos anti-IL-13; y antagonistas de IL-2, tal eínas de fusión de IL-2 (por ejemplo, DAB 486-IL-2 y/o DAB agen (véase, por ejemplo, Arthritis Rheumatism (1993) 36: cuerpos anti-IL-2R (por ejemplo, anti-Tac (anticuerpo humanizad ign Labs (véase, Cáncer Res. (1990) 50(5): 1495-502))) binación incluye proteínas de unión anti-IL-21 R en combina bidores anti-CD4 no empobrecedores, tales como IDEC-CE9.1/S icuerpo anti-CD4, IDEC/SmithKIine). Aún otras combinaciones eínas de unión anti-IL-21 R con antagonistas de la tr stimuladora CD80 (B7.1 ) y CD86 (B7.2) (tales como ant ptores solubles o ligandos antagonísticos), ligando de la glucopr den utilizarse en combinación con las proteínas de unión IL-21 R a presente incluyen, de manera no exclusiva, al menos uno de: inflamatorios no esteroidales (NSAID) (tales como ibuprofeno, se, por ejemplo, Arthritis Rheumatism (1996) 39(9):S280), n se, por ejemplo, NeuroReport (1996) 7:1209-13), meloxicam, pi fenaco e indometacina); sulfasalazina (véase, por ejemplo, umatism (1996) 39(9):S281 )); corticosteroides (tales como predn acos antiinflamatorios supresores de la citocina (CSAID); e inhibi iosíntesis nucleotídica (tales como un inhibidor de la biosíntesis ejemplo, un antagonista de folato tal como metotrexato), y un inh iosíntesis de pirimidina (por ejemplo, un inhibidor de la dihid hidrogenasa (DHODH) tal como leflunomida (véanse, por ejemplo umatism (1996) 39(9):S131 y Inflammation Research (1996) 45:1 Los ejemplos de inhibidores adicionales incluyen al m corticosteroides (oral, inhalados e inyección local); inmunosu mplo, Arthritis Rheumatism (1996) 39(9):S81 )¡ inhibidores odiesterasa (tales como R973401 ; véase, por ejemplo, umatism (1996) 39(9):S282)¡ inhibidores de la fosfolipasa (por ej ibidor de la fosfolipasa citosólica 2 (cPLA2), tal como análog uorometil cetona; véase la Patente de E.U.A. No. 6,350,892); in factor de crecimiento de las células endoteliales vasculares ibidores del receptor de VEGF; e inhibidores de la angiogénesis.
Las proteínas de unión anti-IL-21 R descritas en la dén utilizarse en combinación con otros agentes terapéuticos p tornos inmunes específicos, como se discute con más tinuación.
Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar los t íticos (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis inflamatori matoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis y artritis soriátic l una proteína de unión a anti-IL-21 R puede combinarse, in i-CD22); inhibidores de molécula pequeña (tales como meto unomida); sirolimus (rapamicina) y análogos de los mismos (por -779); inhibidores de cox2 y cPLA2; NSAID; p38, TPL-2, ibidores de NFKB; RAGE o RAGE soluble; inhibidores de P-s GL-1 (tales como anticuerpos de los mismos e inhibidores de üeña); agonistas del receptor beta del estrógeno (ERB); y agó B-NFKB. Los agentes terapéuticos que pueden coadminist rmularse con al menos un antagonista de IL-21/IL-21 R pueden os uno de: un fragmento soluble de un receptor de TNF (por eje 75 humanos), tales como 75 kdTNFR-lgG (proteína de fusión del TNF-lgG de 75 kD, ENBREL™); metotrexato; leflunomida; y pamicina) o un análogo de los mismos (por ejemplo, CCI-779).
Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar la Itiple con las cuales una proteína de unión a anti-IL-21 R nbinarse, incluyen interferón-ß (por ejemplo, IFNp-1a e ronidazol; inhibidores de la lipoxigenasa; mesalamina; oí alazida; antioxidantes; inhibidores del tromboxano; antagoni ptor de IL-1 ; anticuerpos monoclonales anti-IL-1 ; an ocionales anti-IL-6; factores de crecimiento; inhibidores de la puestos de piridinil-imidazol; antagonistas del TNF como se desc sente; IL-4, IL-10, IL-13 y/o TGFp o agonistas de las mismas (por cuerpos agonistas); IL-11 ; profármacos conjugados con glucu trano de prednisolona, dexametasona o bu odesoxinucleótidos de fosforotioato antisentido ICAM-1 (ISIS 2 rmaceuticals, Inc.); receptor 1 del complemento soluble (TP1 nees, Inc.); mesalazina de liberación lenta; metotrexato; antago tor que Activa las Plaquetas (PAF); ciprofloxacina y lignocaína.
En otras modalidades, una proteína de unión anti-IL-21 zarse en combinación con al menos un anticuerpo dirigido a otros lucrados en la regulación de las respuestas inmunes, por Otro aspecto de la presente invención se relaciona con r a cabo la administración combinada de las proteínas d IL-21 R con otros agentes terapéuticos. En una modalida prende al menos una proteína de unión anti-IL-21 R formulad ador farmacéutico, y al menos un agente terapéutico, formulado apropiado en una o más preparaciones farmacéuticas separadas.
Usos de diagnóstico Las proteínas de unión de la invención también pueden detectar la presencia del IL-21 R en muestras biológicas. Al corr resencia o nivel de estas proteínas con una condición medida, alg riencia en la técnica puede diagnosticar la condición médica a ejemplo, las células T estimuladas incrementan su expresión de I concentración inusualmente alta de células T que expresan el I rticulaciones, puede indicar inflamación de la articulación y posibl dén proporcionarse en un kit de diagnóstico que incorporal al m estos procedimientos para detectar el IL-21 R. El kit puede conte ponentes, empaques, instrucciones, reactivos y/u otro mate dar a la detección de la proteína y utilizar el kit.
Las proteínas de unión pueden modificarse con m ectables, incluyendo grupos de ligando (por ejemplo, biotina), flu móforos, radioisótopos, reactivos densos en electrones o enzi imas se detectan por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa d nte se detecta por su capacidad para convertir la tetrametil IB) a un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetr ipañeros de unión adecuados incluyen biotina y avidina, IgG y pr ros pares de receptor-ligando conocidos en la técnica.
Las proteínas de unión también pueden estar e cionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión ciación no covalente o de otra manera), a al menos otra entidad Composiciones farmacéuticas y métodos de administra Ciertas modalidades de la invención incluyen composici prenden las proteínas de unión descritas. Las composiciones p cuadas para uso farmacéutico y administración a pacient posiciones comprenden una proteína de unión de la presente in excipiente farmacéutico. Como se utiliza en la presente, ll acéutico" incluye solventes, medios de dispersión, recub ntes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y que r orción, etc., que son compatibles con la administración farmacé de estos agentes para las sustancias farmacéuticamente activa ocido en la técnica. Las composiciones también pueden conte puestos activos que proporcionan funciones suplementarias, adic péuticas mejoradas. Las composiciones farmacéuticas tambié uirse en un recipiente, paquete o distribuidor, junto con las inst a la administración. cutánea, cutánea o transdérmica.
Las soluciones o suspensiones utilizadas para la a dérmica o subcutánea, incluyen típicamente al menos un ientes componentes: un diluyente estéril tal como agua, soluci ites fijos, polietilenglicol, glicerina, propilenglicol u otros éticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico abenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito ntes quelantes tales como ácido etilendiamintetraacético rtiguadores tales como acetato, citrato o fosfato; y agentes icidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajus os o bases mediante métodos conocidos en la técnica, paraciones pueden encerrarse en ampollas, jeringas desechable múltiples dosis.
Las soluciones o suspensiones utilizadas para la admi avenosa incluyen un portador, tal como solución salina fisiológi alcoholes (por ejemplo, manitol y sorbitol), o cloruro de sodio, uirse en la composición. La absorción prolongada de la co de lograrse agregando un agente que retarda la absorción, por oestearato de aluminio o gelatina.
Las composiciones orales incluyen un diluyente ine tador comestible. Para el propósito de la administración oral, las unión pueden incorporarse con excipientes y colocarse, por eje letas, trociscos, cápsulas o gelatina. Los agentes de unión o los uvantes compatibles farmacéuticamente pueden incluirse posición. Las composiciones pueden contener (1 ) un aglutinante losa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; (2) un exci o almidón o lactosa, (3) un agente desintegrante tal como ácido ogel o almidón de maíz; (4) un lubricante tal como este gnesio; (5) un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal y nte edulcorante o saborizante. administración transmucosal o transdérmica, se utilizan pe piados para la barrera a ser permeada. Para la administración lación, las proteínas de unión pueden suministrarse en un SOI de un recipiente o distribuidor presurizado, que contiene un pr ejemplo, líquido o gas), o un nebulizador.
En ciertas modalidades, las proteínas de unión de esta i preparadas con portadores para proteger las proteínas de unión inación rápida del cuerpo. Los polímeros biodegradables (por tato de etilen vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, c ortoésteres y ácido poliláctico), se utilizan con frecuencia. Los la preparación de tales formulaciones son conocidos por aqu eriencia en la técnica. Las suspensiones liposomales pueden o portadores farmacéuticamente aceptables también. Los li den prepararse de acuerdo con los métodos establecidos conoci ica (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 4,522,81 1 ). idad de tiempo. La infusión continua también puede utilizarse.
Como se utiliza en la presente, el término "sujeto" ir humanos y animales no humanos. Los sujetos pueden i iente humano que tiene un trastorno caracterizado por cél resan el IL-21 R, por ejemplo, una célula cancerosa o una célula término "animales no humanos" de la invención, incluye t ebrados, tales como primates no humanos, oveja, perros, vaca bios, reptiles, etc.
Los ejemplos de intervalos de dosificación que inistrarse a un sujeto pueden elegirse de: 1 pg/kg a 20 mg/kg, 1 g/kg, 1 pg/kg a 1 mg/kg, 10 pg/kg a 1 mg/kg, 10 pg/kg a 100 p g a 1 mg/kg, 250 pg/kg a 2 mg/kg, 250 pg/kg a 1 mg/kg, 500 µ kg, 500 pg/kg a 1 mg/kg, 1 mg/kg a 2 mg/kg, 1 mg/kg a 5 mg/kg, 5 g/kg, 10 mg/kg a 20 mg/kg, 15 mg/kg a 20 mg/kg, 10 mg/kg a 2 g/kg a 25 mg/kg, 20 mg/kg a 25 mg/kg y 20 mg/kg a 30 mg/kg ( cuadas para el paciente. Cada unidad de dosificación cont tidad predeterminada de proteína de unión calculada para pr cto terapéutico en asociación con el portador. La unidad de do ende de las características de la proteína de unión y del efecto te ticular a ser alcanzado.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de la composició erminarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en lares o en animales experimentales, por ejemplo, determinando l is letal al 50% de la población), y la ED50 (la dosis terapéut ctiva en 50% de la población). La relación de la dosis entre lo cos y terapéuticos es el índice terapéutico, y puede expresarse ción LD50/ED50. Las proteínas de unión que exhiben grande péuticos pueden ser menos tóxicas y/o más terapéuticamente efe Los datos obtenidos de los ensayos del cultivo celu udios animales pueden utilizarse para formular un intervalo de do centración en plasma circulante que incluya la CI50 (es centración de la proteína de unión que alcanza una inhibició ima de los síntomas). Los efectos de cualquier dosificación den verificarse mediante un bioensayo adecuado. Los ejempl nsayos adecuados incluyen ensayos de replicación del ADN, ados en la transcripción, ensayos de expresión del gen, ensayos L-21/IL-21 R, y otros ensayos inmunológicos.
En una modalidad de la invención, una dosis puede fo un ensayo de células de sangre completa ex vivo. En tal moda nsayo adecuado para determinar y verificar una dosificación uye un método para determinar una concentración mínima en proteína de unión anti-IL-2 R, necesaria para inhibir o reducir la IL-21 R, tal como la modulación de la expresión de los genes sens 1. En una modalidad de la invención, el gen sensible a la cciona de la siguiente lista no limitante: TNF, IFNy, IL-6, IL-8, IL-1 IL-21.
El contenido completo de todas las referencias, solici ente y patentes citadas a través de esta solicitud, se incorporan p o referencia en la presente.
EJEMPLOS La invención se ilustrará además en los siguientes eje itantes. Estos Ejemplos se exponen para ayudar en el entendimi ención, pero no pretenden, ni deben interpretarse como que l anee de ninguna manera. Los Ejemplos no incluyen las des alladas de los métodos convencionales que serian bien cono éllos con experiencia ordinaria en la técnica.
EJEMPLO 1 EJEMPLO 2 Construcción de la biblioteca Las bibliotecas de representación del fago se basaron 5 parental, utilizando un vector pCANTABp en el cual scFv se f extremo 3' al gen intacto III. Varias secuencias de la CDR3 se zando técnicas bien conocidas en el campo.
Dos bloque superpuestos de seis codones consec torizaron en la CDR3 de VH y VL, produciendo un total d iotecas: H3B1 , H3B2, L3B1 y L3B2. Lo siguiente identifica las s leotídicas y de aminoácidos, respectivamente: IL-21 R: CDR VH Q ID NOs: 199 y 200]; H3B1 (tamaño de la biblioteca 1.40x109) s: 201 y 202]; H3B2 (tamaño de la biblioteca 1.00x109) [SEQ ID N ]; IL-21 R: CDR3 VL de 18A5 [SEQ ID NOs: 205 y 206]; L3B1 (tam lioteca 9.00x1o9) [SEQ ID NOs: 207 y 208]; L3B2 (tamaño de la EJEMPLO 3 Selección del fago Todos los derivados de 18A5 se aislaron de las biblio v anteriores mediante la selección del fago capaz de unirse en ción a las proteínas de fusión His-Flag del dominio extracelular IL-21 R biotinilado (ubiotin-hlL-21 R-H/F") y a las proteínas d Flag del dominio extracelular murino del IL-21 R b t¡n-mlL-21 R-H/F"); todos los procedimientos y técnicas relacion elección son bien conocidos por alguien con experiencia en la téc l de veintisiete scFv de anti-IL-21 R se aislaron medi edimientos de selección del fago.
EJEMPLO 4 Selección de la biblioteca EJEMPLO 4.1 Preparación del material periplásmico crudo ("peri-preps") utilizarse en los ensayos de selección Dependiendo de las condiciones de cultivo utilizad de expresarse en solución en el espacio periplásmico bacterian cir la liberación de scFv en el periplasma, placas de 96 pozos p contienen 990 µ? de medio 2xTY con glucosa ai 0.1 %/100 icilina, se inocularon con reservas de glicerol congeladas (una o) utilizando el recolector de Colonias QPix2 (Genetix, Ne aterra) y se cultivaron a 37°C (999 rpm) durante aproximada as. Los cultivos se indujeron con IPTG a una concentración final y se cultivaron durante la noche a 30°C (999 rpm). El cont ¡plasma bacteriano (peri-preps) se liberó mediante choque emente, las placas se centrifugaron y las pelotillas se resuspen EJEMPLO 4.2 nsayo de competencia del epitopo para la selección de la bibl Aquellos scFv capaces de competir con el anticuer ntal para la unión a IL-21 R humano o murino se identificaron de ccionados mediante un ensayo con fluorescencia homogéneo el tiempo (HTRF®). El anticuerpo 18A5 parental se modificó d alenté con criptato, un derivado de europio, de acuerdo rucciones en un Kit de Marcado con Criptato HTRF® (Cisbio, ). Las Peri-preps de scFv se prepararon como se describió ante e diluyeron al 0.25% en PBS/fluoruro de potasio 0.4 M/BSA ortiguador de HTRF®); a continuación, 10 µ? de la mezcla se tra S pozos de placas negras de 384 pozos poco profundos (Nunc, R . Cinco µ? del anticuerpo 18A5 conjugado con criptato se agr tinuación a cada pozo, seguido por 5 µ? de una mezcla de un aces de competir con el anticuerpo 18A5 parental para la in-hlL-21 R-H/F se eligieron para el análisis adicional.
EJEMPLO 5 nálisis de la secuencia del ADN de scFv derivados de la bibli Amplificación con PCR de las regiones scFv para el análisis secuenciamiento Se determinaron las secuencias de 287 variantes ivadas de 18A5 con unión mejorada a IL-21 R con respecto a lécula de scFv de 18A5 parental, y las frecuencias de los am ontrados en cada posición se determinaron. Entre las clonas d (1.7%) se derivaron de una biblioteca que mutó los últi inoácidos de, por ejemplo, la SEQ ID NO: 169 (en el término C de , mientras que el resto se derivó de una biblioteca que mutó los ortiguador HN (Epicentre Biotechnologies, Madison, Wl), de acu instrucciones del fabricante. Cinco µ? de una dilución 1 :10 de teriano en fase estacionaria se utilizaron como la plantilla para un reacción final de 20 µ?. Las condiciones del ciclado utilizado f io caliente de 2 minutos a 94°C, 30 ciclos de desnaturalización uto), recocido del cebador a 55°C (2 minutos) y extensión a uto), seguido por una extensión final a 72°C (5 minutos). Los pro PCR se verificaron mediante electroforesis sobre gel de agar iaron con Exol/SAP (fosfatasa alcalina de camarón) a uenciamiento con el cebador M13rev.
Las SEQ ID NOs para las secuencias de la CDR3 de v se listan en el Cuadro 4. Estas scFv se eligieron para e cional basándose en los ensayos descritos en el Ejemplo 6.
CUADRO 4 L6 169 176 L9 169 177 L9 169 178 L10 169 179 L1 1 169 180 L12 169 181 L13 169 182 L14 169 183 L15 169 184 L16 169 185 L17 169 186 L18 169 187 L19 169 188 L20 169 189 L21 169 190 L23 169 191 L24 169 192 L25 169 193 EJEMPLO 6 Caracterización de la scFv derivada de la biblioteca resión de las scFv se indujo con IPTG a una concentración fina , y los cultivos se cultivaron durante la noche a 30°C. Las c lectaron mediante centrifugación y se resuspendieron en rtiguador periplásmico TES, seguido por la adición de 1 m :agua y una incubación en hielo durante 30 minutos. Los li trifugaron a 3200 rpm durante 10 minutos a 4°C, y los sobrenad aron a MgC 2 mM. Las scFv se capturaron en PHYTTPs yNexus) mediante el paso repetido del sobrenadante sobre PHY robot de manejo de líquidos MINITRAK™ IX de Perkin Elmer ), seguido por lavado en amortiguador de lavado IMAC y elu azol 200 mM, Tris 50 mM, NaCI 300 mM (pH 8.0). El amortig rcambió por PBS mediante tres ciclos de dilución 1 :10 en PBS, la concentración en una placa de filtro de corte de peso mol 00 (placa de ultrafiltración de 96 pozos Millipore MULTIS RACEL™, Millipore, Billerica, MA). Las muestras se cua EJEMPLO 6.2 savos para la proliferación dependiente de la IL-21 de las cél sobreexpresan el IL-21 R humano o murino Los ensayos de inhibición se realizaron con proteínas ivadas de 18A5 (scFv y IgG) para medir su bloqueo de la pro endiente de la IL-21 de las líneas celulares transfectadas co ano o murino. Las células BaF3, una línea de células pre-B mu ulas TF1 , una línea de células eritroides humanas, se tra oviralmente con IL-21 R y proteína fluorescente verde (GFP). La cultivaron de manera rutinaria en RPMI 1640 con FBS al 10%, L- M, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina y ß-merca 0.00036%. Los cultivos de células IL-21 R-BaF3 hum iementaron con 50 ng/ml de IL-21 humana; los cultivos de las c -BaF3 murinas se su lementaron con 10 U/ml de IL-3 los cultiv almente tres veces. Veinticinco µ? de las muestras de la proteína gregaron a las células y se incubaron durante 30 minutos a 37° Veinte µ? del medio de ensayo que contienen 100-400 pg/ml ana o murina se agregaron a cada pozo, y las células se i nte 48 horas adicionales. La proliferación se midió llevando las peratura ambiente, agregando 15 µ?/???? de CELLTITE bando durante 10 minutos a temperatura ambiente y mid iniscencia con un lector de placas ENVISION™ de Perkin Elmer. a purificación con las puntas PhyNexus IMAC, 108 scFv se prob eutralizacion de la proliferación dependiente de la IL-21 de las tr lares. Todas mostraron neutralización de las células IL-2 anas, con Cl50 menores que, o iguales a aquéllas de la scFv ntal. Un subconjunto mostró una fuerte neutralización de la pro las células IL-21 R-BaF3 murinas y las células IL-21 R-TF1 huma s de las 27 clonas más potentes se muestran en las Figuras 1A EJEMPLO 6.3 Ensayo de competencia cuantitativa del epitopo Las scFv purificadas se analizaron de manera cuantitativ cidad para competir con el anticuerpo 18A5 parental para la R murino en un inmunoanálisis enlazado a enzimas (ELI uerpo 18A5 parental se recubrió durante la noche a 4°C en plac s Nunc MAXISORP® a una concentración de 0.75 pg/ml en P s se lavaron 3X utilizando PBS, y a continuación se bloquearon ras a temperatura ambiente en PBS/BSA al 1%/Tween-20 al 0.0 se mezclaron con mll_-21 R-H/F biotinilado 36 nM y se incubaron inutos a temperatura ambiente. Las placas bloqueadas se la PBS, y 50 µ?/???? de las mezclas de scFv/IL-21 R se transfirier s apropiadas y se incubaron durante 1 hora a temperatura a placas se lavaron 5X con PBS antes de la adición de una dilució ental para la unión al IL-21 R-H/F murino biotinilado con CI50 men éilas de la scFv de 18A5. Los datos de la competencia con el epit 27 clonas con las potencias más altas en los ensayos de neut ados en células se muestran en las Figuras 4A-4C y se resum dro 5.
CUADRO 5 utralización del IL-21R humano y murino en los ensayos bas uías y la competencia con el anticuerpo 18AS para la unión a murino Cl50 (mM) en el CI50 (mM) en el Cl50 (mM) en el Clso (m Ensayo de Ensayo de Ensayo de ELIS Neutralización de Neutralización de Neutralización de Compet IL-21R-BaF3 IL-21R-TF1 IL-21R-BaF3 Epito Humano Humano Murino IL-21R 3 7.7 98.1 25.68 1 ? 3.8 9.3 nd n 5 7.9 178.5 53.66 1 6 13.8 150 (estimado) nd 1 8 3.7 54.4 8.34 9 4.5 35.3 13.59 1 0 3.1 57.5 15.39 1 9.4 100 (estimado) 162.27 2 3 1.5 15.3 nd 1 4 2.4 18.7 3.73 5 3.7 33.1 15.55 EJEMPLO 7 nversión del 18A5 de IqG parental a la secuencia de la linea q Los siguientes quince scFv con las regiones VL mo o con la VL de 18A5 parental de la línea germinal (véase a conti ligieron para la conversión a la IgG humana lambda: L2, L3, L6, , L14, L16, L17, L18, L19, L20, L23, L24 y L25. Cuatro scFv ones VH modificadas, H3, H4, H5 y H6, junto con VH de 18A5 pa nea germinal (véase a continuación) se eligieron para la conver humana de longitud completa. resión en las células de mamífero por GENEART, utilizando entados. Una alineación de las secuencias de 18A5 paren uencias de 18A5 corregidas por la línea germinal se mu tinuación: paración de la Cadena Pesada de 18A5 VH de 18AS parental GTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGACTTCGGAGACCCTGTCCCTCACC TCTGGTTACTCCATCAGCAGTGGTTACTACTGGGGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAG TGGATTGGGAGTATCTCTCATACTGGGAACACCTACTACAACCCGCCCCTCAAGAGTCGC CAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGAC TATTACTGTGCGCGAGGTGGGGGAATTAGCAGGCCGGAGTACTGGGGCAAAGGCACCCTG TCGAGX (SEQ ID NO:5) VH de 185A con la línea germinal GGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTCTCTGA GTCCGGCTACTCCATCTCCTCCGGCTACTACTGGGGCTGGATCAGACAGCCTCCTGGCA GTGGATCGGCTCCATCTCTCACACCGGCAACACCTACTACAACCCCCCTCTGAAGTCCA CTCCGTGGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCTGTGACCGCTGCCG GTACTACTGTGCCAGAGGCGGCGGAATCTCCAGACCTGAGTACTGGGGCCAGGGCACCC GTCCTCT (SEQ ID NO: 7) VH de 18A5 con la línea germinal X VH de 18AS parental 51 TCCATCTCTCACACCGGCAACACCTACTACAACCCCCCTCTGAAGTCC I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 51 AGTATCTCTCATACTGGGAACÁCCTACTACAACCCGCCCCTCAAGAGT • * · · 01 AGTGACCATCTCCGTGGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCT I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I M 01 CGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACT • · · · 51 CCTCTGTGACCGCTGCCGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCG I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I M I I I I I I I I I I 51 GCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGAGGTG « · * « 01 GGAATCTCCAGACCTGAGTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTG I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 01 GGAATTAGCAGGCCGGAGTACTGGGGCAAAGGCACCCTGGTCACCGTC 51 CTCT 354 (SEQ ID NO : 7 ) I 51 GAGT 354 (SEQ ID NO:5) mparación de la Cadena Ligera de 18A5 Vi de 18A5 parental CTTCTGAGCIGACTCAGGACCCICC TGTGTCIGTGGCCTTGGGAC GACAGTCACGCTCA VL de 18A5 con la linea germinal x VL de 18A5 parental • · · · * TCCTCTGAGCTGACCCAGGATCCTGCTGTGTCTGTGGCCCTGGGCCAGA II I II I I I I I I I I I I I I I III I I I I I M I I I I I I I I I I I I I I I I TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTCCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGA • · · * « CGTCAGGATCACCTGCCAGGGCGATAGCCTGAGAACCTACTACGCCTCC I I I I I Mil I I I I I I I II I I i I I I I I I I I I I II II II AGTCACGCTCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAACCTATTATGCAAGC GGTATCAGCAGAAGCCTGGACAGGCCCCTGTGCTGGTGATCXACGGCAA I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I GGTACCAGCAGAAGTCAGGACAGGCCCCTATACTTCTCCTCTATGGTAA • · · * · CACAAGAGGCCATCCGGCATCCCTGACAGATTCTCCGGCTCCTCCTCTG I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I CACAAACGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGCTTCTCTGGCTCCACCTCAG • * * * · CAATACCGCCTCCCTGACCATCACCGGCGCTCAGGCCGAGGACGAGGCC I M II III I I I I I I I I I I II I I I I I I I I II II I I I I I I I AGACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGACGAGGCT • · * * · ACTACTACTGTAACTCCCGGGACTCTTCCGGCAACCCTCACGTGCTGTT I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I i I I I I II II I I I I I ACTATTACTGTAACTCCCGGGACTCCAGTGGCAACCCCCATGTTCTGTT • * IGSISHTGNTYYNPPLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAV GISRP la linea germinal VIGSISHTGNTYYNPPLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAN GISRP ental EYWGKGTLVTVSS la línea germinal EYWGQGTLVTVSS uencia de VL corregida con la línea germinal (los cambi uencia parental están en negrillas y subrayados): ental (SEQ ID NO: 10) LTQDPPVSVALGQTVTLTCQGDSLRTYYASWYQQKSGQAPIL la línea germinal (SEQ ID NO: 12) LTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRTYYASWYQQKPGQAPVL ental EJEMPLO 8 Conversión de la scFv derivada de la biblioteca a IqG Las regiones CDR3 de los dominios VL y VH de los deri v de 18A5 mejorados se amplificaron mediante PCR y se subclo marcos de VL y VH corregidos con la línea germinal de 18A5 iante el siguiente método. Un fragmento de la PCR que abarca l el gen VH de 18A5 con la línea germinal se generó me lificación del plásmido pSMED2_OP18A5G_hulgG1 con los c HII_ll_VH_F (5 -GCTTGGCGCGCACTCTCAGGTGCAGCTGCA Q ID NO:230] y GVH_R_for_BssHII (5'-TCAGGGAGAACTGGT [SEQ ID NO:231]. Un fragmento de la PCR que abarca la porci VH de la clona de scFv mejorada VH3 se amplificó con los s adores: G_VH_E_for_Sall (S'-TCCAAGAACCAGTTCTCCCTG-S") :232] y scFv_Sall_VH_R ACGTCGACAGGACTCACCACTCGAGACGG-3')) [SEQ ID NO: ? de codificar la secuencia del segmento J de VH para conform encia de la línea germinal JH1 , y se ligó a un vector de l stante del triple mutante de la lgG1 humana.
Los genes VL de las scFv mejoradas se subclonaron étodo similar. Un fragmento de la PCR que abarca la porción 5 de 18A5 se generó mediante amplificación del EN2_OP18A5G_hu Lambda con los cebadores BssHII CTTGGCGCGCACTCTTCCTCTGAGCTGACCCAG-3') [SEQ ID cFv_VL_RJor_BssHII (5'-GCCTGAGCCCCAGTGATGGTCA-3') :236]. Los fragmentos de la PCR que abarcan las porciones es VL de las clonas de scFv mejoradas se amplificaron con los c _F_for_Xbal (5'-ACCGCCTCCCTGACCATCAC-3') [SEQ ID N v_Xbal_VL_R CCGTCTAGAGTTATTCTACTCACCTAAAACGGTGAGCTGGG EJEMPLO 9 Caracterización de la IqG mejorada in vitro EJEMPLO 9.1 Expresión transitoria a escala pequeña de las proteínas de u Las clonas se probaron para la función en el for completa, después de la expresión transitoria en células co ena ligera en el conjunto de dieciséis secuencias de prueba (VL ental con la línea germinal y L2, L3, L6, L9, L11 , L13, L14, L16, , L20, L23, L24 y L25) se aparearon con cada cadena pesa junto de cinco secuencias de prueba (H3, H4, H5 y H6, junto co minio VH de 18A5 parental con la línea germinal). Cada plásmido 4 pg) se combinó con el reactivo de transfección TRANSIT idison, Wl), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y los EJEMPLO 9.2 ctividad de la IqG anti-IL-21R en la neutralización de la prolife celular Las 80 IgG expresadas de manera transitoria en ndicionado libre de suero se probaron para la actividad en los en roliferación dependiente de la IL-21 en tres líneas celulares cribió anteriormente: (1 ) células IL-21 R-BaF3 humanas, (2) célula 3 murinas y (3) células IL-21 R-TF1 humanas. Todos los straron neutralización de la proliferación de las células BaF3 que L-21 R humano, y todos los pares, excepto aquéllos que involucr straron neutralización de las células TF1 que expresan el IL-21 R tos no mostrados). Todos los 80 pares también mostraron neut la proliferación de las células BaF3 que expresan el IL-21 R muri tralización más fuerte asociada generalmente con las cadena iñas con 400 pg/ml de la IL-21 murina (Figuras 5G-5I). La IL-21 s s células después de los anticuerpos indicados; la proliferación CELLTITER-GLO® después de 48 horas. Las Figuras 26A-26C estudios adicionales que demuestran una inhibición similar en las líneas celulares.
EJEMPLO 9.3 Unión de la IgG anti-IL-21R al IL-21 R de rata y de macaco de expresado de manera transitoria Un subconjunto de proteínas de unión se probó para la 1 R de rata, macaco de Java o humano, o la subunidad comú ana expresada de manera transitoria en las superficies de -PA-Dukx. Las células se transfectaron 48 horas antes del ensa del ensayo, las células se lavaron suavemente 5X en PBS que peratura ambiente. Las células se lavaron a continuación /CaMg y todo el amortiguador de lavado se eliminó. Las c baron con 100 µ? de TMB hasta que la reacción del color al ración, se detuvo con 100 µ? de H2S04 0.18 M, y se leyeron a A4 or de placas ENVISION™ de Perkin Elmer.
Todas las veintiún IgG unidas a las células CHO exp era transitoria (Figuras 6A-6C), el IL-21 R de rata (Figuras 6D-caco de Java (Figuras 6G-6I). La mayoría no mostró unión por e do a una proteína de control (cadena común gamma (?) resada de manera transitoria en células CHO, pero un subconjun D, AbE, AbF, AbH, AbL y AbM) se unió por encima del fondo a s (Figuras 6J-6L). Los datos se resumen en el Cuadro 6. humano, rata y macaco de Java expresado en células CHO Oí -si Oí 00 EJEMPLO 9.4 lisis B1ACORE™ de la selectividad de la unión de la IgG anti-l IL-21R humano La especificidad de unión a un subconjunto de prot n anti-IL-21 R expresadas de manera transitoria (aquí anticue bó en un instrumento de resonancia con plasmón en la CORE™ 2000. Las IgG anti-humana, los anticuerpos de inmuno imurinos e IL-21 R-H/F murino se inmovilizaron en una micropla oximetilo-dextrano grado investigación (CM5) utilizando acopla ¡na estándar. La superficie de la microplaqueta del sensor se a C/NHS durante 7 minutos a una velocidad de flujo de 20 µ?/mi er flujo de la célula se utilizó como la superficie de referencia par ndice de refracción volumétrico, los efectos de la matriz y la ecífica. Los anticuerpos de captura (7,150 unidades de resona S anticuerpos de control (IL-2Rp anti-humano murino e IL-4R anti rino (R&D Systems, Minneapolis, MN); IL-13 anti-humana human bridge, MA)) se diluyeron en amortiguador HBS/EP suplemen ro bovino al 2% y se inyectó en todas las cuatro celdas de fl roplaqueta BIACORE™, capturando 500-700 (RU) del anticuer icuerpo de captura apropiado para las especies. Después de u lavado de 5 segundos, se inyectaron soluciones 50 nM de una pr trol positivo (IL-21 R-H/F murino), dos proteínas humanas relacion L-21 R (IL-2Rp humano y slL-4R humano (R&D Systems)), o una reada con His/FLAG no relacionada (IL-13-H/F humana) s icuerpos capturados en la microplaqueta. Las fases de aso ciación se verificaron durante 120 y 180 segundos, respecti uido por dos inyecciones de 5 µ? de glicina (pH 1.5) para gen erficie capturante completamente activa. Todos los experimentos realizaron a 25°C en amorti uador HBS/EP. Los efectos d l l ble humano podrían capturarse por los anticuerpos anti-IL-2Rp específicos (Figura 7D).
EJEMPLO 9.5 Purificación de los anticuerpos expresados de manera transi Siete anticuerpos (versiones de muíante triple de ana: AbS, AbT, AbO, AbP y AbU y las versiones del mulante dobl ) se expresaron de manera transitoria en células cos-7 y se p a el análisis adicional. Además, también se prepararon tres vers con las colas de la IgG humana que se espera que tengan les de unión al receptor Fe (lgG1 del tipo silvestre, lgG4 y les de lgG1). Se siguió el protocolo TRANSIT^ descrito anteri epto que se utilizaron 25 µg de cada plásmido para transfectar la cada uno de ocho matraces T-175. Después de la primera recole EJEMPLO 9.6 Análisis BIACORE™ de la unión del anticuerpo al IL-21R hum murino La cinética de unión de los anticuerpos anti-IL-21 R a IL ano y murino se probó en un instrumento de resonancia con pl uperficie BIACORE™. Los anticuerpos de IgG anti-humana (I poration) se inmovilizaron en una microplaqueta de carboxi-metil 5) grado investigación, utilizando acoplamiento con amina está erficie se activó con EDC/NHS durante 7 minutos a un fluj inuto. La primera celda de flujo se utilizó como una sup rencia para corregir el índice de refracción volumétrico, los efec triz y la unión no específica. El anticuerpo anti-humano-Fc se di ml en amortiguador de acetato de sodio 10 mM (pH 5.0) y 2 dades de resonancia (RU) se capturaron en cada una de las cuat tica del IL-21 R humano y murino, y la fase de disociación s nte 15 minutos para hll_-21 R y durante 5 minutos para mlL-21 R, dos inyecciones de 10 µ? y una inyección de 30 µ? de glicina (pH 1 nerar una superficie capturante completamente activa. T erimentos de unión se hicieron a 25°C en amortiguador HBS/ orte de las muestras se mantuvo a 15°C. Los efectos del bla rtiguador se sustrajeron para cada sensograma utilizando refer le. Los sensogramas se muestran en las Figuras 8A-8B (IL-21 R- ano) y las Figuras 8C-8D (IL-21 R-His/FLAG murino). Los pa ticos de la unión se muestran en el Cuadro 7A, y los datos ionales de un experimento replicado de muestran en el Cuadro 7 Además, AbS y AbT se probaron para la cinética de 1 R-His/FLAG de macaco de Java mediante el protocolo riormente. Los perfiles de unión a IL-21 R-H/F humano y de m a fueron similares a AbS y AbT (Figuras 9A-9D). Las Figura CUADRO 7A arámetros cinéticos de la unión del anticuerpo anti-IL-21R a I His/FLAG humano y murino IL-21 R humano IL-21 R murino CUADRO 7B arámetros cinéticos de la unión del anticuerpo anti-IL-21R a I His/FLAG humano IL-21 R humano ícuerpo ka kd KD 1/Ms 1/8 M EJEMPLO 9.7 Ensayo de competencia del epitopo B1ACORE Los anticuerpos AbS y AbT y el anticuerpo parental tovilizaron directamente en una microplaqueta CM5 BIACORE™ murino (100 nM) se dejó fluir sobre la microplaqueta dur undos, seguido por un lavado (100 segundos), y a continuación una solución de AbS, AbT, D5 o un anticuerpo anti-mlL tralizante (7C2) se dejaron fluir sobre la superficie. No se obse ional con AbS, AbT y D5, indicando que su sitio de unión en mlL bloqueado por la unión concurrente a AbS, AbT o al anticuer ura 10A). En contraste, el anticuerpo anti-IL-21 R 7C2 de c tralizante fue capaz de unirse a mlL-21 R-H/F capturado en AbS, icuerpo 18A5, indicando que este anticuerpo de control se u opo diferente del unido por los anticuerpos de captura.
EJEMPLO 9.8 Ensayos de proliferación basados en células Las IgG purificadas se probaron para la actividad en en roliferación dependiente de la IL-21 en tres líneas celulares cribió anteriormente: células IL-21 R-BaF3 humanas, células IL-2 rinas y células IL-21 R-TF- humanas. Todas mostraron u bición de la proliferación dependiente del IL-21 R humano y mu potencia mayor que aquélla de la IgG de 18A5 parental (Figuras dro 8). Los ensayos se realizaron en células IL-21 R-BaF3 hum pg/ml de la IL-21 humana (Figura 11 A), células IL-21 R-BaF3 mu pg/ml de la IL-21 murina (Figura 11 B), y células IL-21 R-TF-1 100 pg/ml de la IL-21 humana (Figura 1C). La Figura 26D de ultados de un estudio adicional de los efectos de estos anticuerp las IL-21 R-BaF3 humanas.
CUADRO 8 utralización de la proliferación de las células IL-21R-BaF3 hu EJEMPLO 9.9 Ensayos de proliferación de las células B primarias human Los anticuerpos anti-IL-21 R se probaron por su capaci ibir la proliferación dependiente de la IL-21 de las células B rataron con anticuerpos anti-IL-21 R humano diluidos en seri bador a 37°C ajustad a CO2 al 5% durante 30 minutos. Las adas se estimularon a continuación con 0.5 pg/ml de mAb anti-C sciences, San José, CA) y 10 ng/ml de citocina IL-21 durante 3 d bador a 37°C ajustado a CO2 al 5%. En el día 3, los cu ulsaron con 0.5 Ci/pozo de 3H-timidina (Perkin Elmer (NE olectaron 5 horas más tarde en esteras de filtro de fibra de rporación de 3H-timidina se determinó mediante recuento con ido. Todos los anticuerpos mejorados neutralizaron la pro endiente de IL-21 con una potencia mayor que el anticuerpo 18A uras 12A-12B, Cuadro 9; véase también la Figura 26E).
CUADRO 9 eutralización de la proliferación de las células B primarias hu Anticuer o Neutralización de la rolif EJEMPLO 9.10 Ensayos de proliferación de las células T primarías human Los anticuerpos anti-IL-21 R se probaron por su capaci ibir la proliferación dependiente de la IL-21 de las células T CD4+ anas. Las células de la cubierta amarilla de donadores human obtuvieron del Hospital General de Massachusetts. Las células T aron mediante selección negativa utilizando el cóctel de enriqu las células T CD4+ ROSETTESEP™ (StemCell Technologies), d las instrucciones del fabricante. La población resultante fue -8 ulas T CD4+/CD3+. Las células CD4+ humanas enriquecidas ante 3 días con microesferas recubiertas con anti-CD3/anti-CD28 contiene FBS al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 reptomicina, L-glutamina 2 mM y HEPES en un incubador a 37°C C>2 al 5%. Después de la activación, las microesferas se elimin ónales y se impulsaron con 1 Ci/pozo de 3H-timidina (Perk ?)) durante las 6 horas finales del ensayo. Las células se recole ras de filtro de fibra de vidrio y la incorporación de la 3H-ti rminó mediante recuento de centelleo líquido. Todos los an orados neutralizaron la proliferación dependiente de la IL-21 ncía mayor que el anticuerpo 18A5 parental (Figura 13, Cua se también la Figura 26F).
CUADRO 10A eutralización de la proliferación de las células T primarias hu Anticuerpo Neutralización de la prolif de las células T Cl50 ( O 0.06 P 0.02 Q 0.08 R 0.04 S 0.06 os de ratones BALB/C hembra de 12 semanas se recolectar pensión de una sola célula de los células del bazo se empo las rojas sanguíneas utilizando NH4CI 0.16 M en Tris 0.017 M células del bazo y de los nodos linfáticos se reunieron y enri a las células CD8+ utilizando un Kit de Columna del Subconjunt las T murinas (R&D Systems). Las células CD8+ murina pendidas en DMEM que contiene suero de becerro fetal a iementadas con ß-mercaptoetanol 0.05 mM, L-glutamina inoácidos no esenciales 0.1 mM, piruvato de sodio 1 mM, 100 icilina, 100 Mg/ml de estreptomicina y 50 pg/ml de gentam placaron en placas de activación anti-mCD3 de 96 pozos (BD Bios gregó mlL-21 (50 ng/ml) a todos los pozos. Los anticuerpos de p aron por triplicado empezando a 20 pg/ml. Las células se ante 3 días en un incubador a 37°C/C02 al 10%. Durante las as de cultivo las células se marcaron con 0.5 µ?? de metil-3H-timi CUADRO 10B eutralización de la proliferación de las células T primarias m Anticuerpo Neutralización de la prolife de las células T Cl50 (n O 4.92 P sin inhibición Q 0.85 R 0.13 S 0.02 T 0.61 U 1.79 ticuerpo 18A5 >85 EJEMPLO 9.12 Ensayo ADCC Los anticuerpos anti-IL-21 R se probaron por su capaci cir la toxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) cu n a las células objetivo. El día antes del experimento, las P C, y a continuación se lavaron con suero bovino fetal una vez y veces. Las células se emplacaron en una placa de 96 pozos c o a 2x105 células/pozo en 100 µ? de medio. Cincuenta µ? d cuerpos se agregaron a las células BJAB, seguido por 5x106 PB ando una relación final de 1 :25 de células objetivo:efectoras. La incubaron a 37°C durante 6 horas y se tiñeron con yoduro de pro a marcar las células muertas y que están muriendo. La destrucci las objetivo (CFSE+) se valoró midiendo la tinción con Pl en un lujo FACSCALIB UR™ (BD Biosciences). Sólo un anticuerpo an , que tiene la región constante de la lgG1 humana del tipo tró un ADCC por encima del nivel de fondo mostrado por un antic trol anti-IL-13 que no se unió a las células objetivo. Todos los an los mismos dominios variables como AbZ, incluyendo las formas ana (AbY), y aquéllas con las formas del mutante doble (A ante triple (AbT) de la lgG1 humana, mostraron sólo niveles de EJEMPLO 9.13 ELISA de Clq Con el fin de determinar si la unión a la superficie de la los anticuerpos anti-IL-21 R probablemente conduce a la cit endiente del complemento (CDC), los anticuerpos se probaro acidad para unirse al componente del complemento C1 q en u anticuerpos IL-21 R y rituximab (RITUXAN®) se diluyeron en mi. Los anticuerpos diluidos (100 µ?) se recubrieron en una placa alta unión COSTAR® (Corning Life Sciences, Lowell, MA) durante °C. Las placas se lavaron 3X con PBS/Tween-20 y se bloquearo e amortiguador de bloqueo (NaP04 0.1 M, NaCI 0.1 M, gelatina een al 0.01 %) durante 1 hora a temperatura ambiente. El suer se determinó previamente que contenía C1q (Quidel, San Dieg yó 1 :50 en PBS. Después de 1 hora de bloqueo, las placas se ara detener la reacción y a continuación se leyeron a 450 nm. icuerpo anti-IL-21 R, AbZ, que tiene la región constante de la lgG1 tipo silvestre, mostró unión a C1 q por encima del nivel de fondo un anticuerpo de control con una región constante de la lgG1 tante triple que había mostrado previamente falta de unión a C1 anticuerpos con los mismos dominios variables que AbZ, inclu as con lgG4 humana (AbY), y aquéllos con las formas muta X) y mutante triple (AbT) de la lgG1 humana, mostraron sólo n do de la unión a C1q (Figura 16). Todos los otros anticuerpos a bados contenían la forma mutante triple de la lgG1 humana y ón a C1q de fondo.
EJEMPLO 9.14 Ensayo de competencia de la citocina terior con el reactivo de detección TMB. La IL-21 de ratón fue uear la unión de mlL-21 R a AbT casi completamente por enci l, indicando que el anticuerpo y la citocina compiten por la unión ino (Figura 27A).
Se realizó un segundo ensayo para demostrar que el a se une al IL-21 R murino de una manera que compite con la 1. El IL-21 R-Fc murino se capturó en placas para ELISA recubi nticuerpo de lgG2a anti-ratón. Las placas se bloquearon con B PBS y se lavaron y se agregaron concentraciones variables de a en la presencia de 10 pg/ml de mlL-21. La unión de mlL-21 ai etectó con un anticuerpo anti-His6 conjugado con HRP, y la unió receptor se detectó con un anticuerpo de Ig anti-human centraciones de AbS por encima de aproximadamente 2 pg/ml pletamente la unión de mlL-21 a mlL-21 R-Fc, indicando que el a citocina compiten por la unión al IL-21 R murino (Figura 27B). diluciones en serie de los anticuerpos anti-IL-21 R humanos y la control del isotipo se hicieron en medio de cultivo (Medio dificado por Dulbecco, que contiene FCS al 10%, L-g a-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, reptomicina y gentamicina) en placas de cultivo de tejido de 96 p do plano, que se habían prerrecubierto con 1 g de anticue i-rata (BD Pharmingen Cat# 554829), seguido por la adición de 5 1 de rata y 20,000 CD3 células T por pozo. Las células se ante 3 días en un incubador humidificado a C02 al 10%, 37°C. D as 5 horas del cultivo, las células se marcaron con 0.5 pCi de 3 Amersham Cat# TRA- 120). Las placas se recolectaron en e de fibra de vidrio mediante un recolector de placas Tomtec Ma taron en un Contador Microbeta 1450 de Perkin Elmer.
La respuesta de las células T de rata a 5 ng/ml de IL-2 6 veces por encima de la respuesta de fondo a 1 µg de anti-CD3 CUADRO 11 loqueo de la proliferación de las células T de rata dependient IL-21 por los anticuerpos anti-IL-21R Anticuerpos CI50 (nM) CI50 (nM experimento 1 experimen AbS 35.98 27.07 AbU 172.79 105.46 AbV 70.55 59.23 AbW 159.06 94.74 EJEMPLO 9.16 Unión de AbS a IL-21 R de conejo Con el fin de demostrar que el anticuerpo AbS se une conejo, los dominios extracelulares de dos isoformos de la I ejo se subclonaron como fusiones Fe y se expresaron de sitoria en células HEK293. El IL-21 R-Fc de conejo (ya sea el iso cando que AbS compite con la IL^21 de conejo para unirse al I ejo (Figura 29B).
EJEMPLO 10 Caracterización de la IgG mejorada in vivo EJEMPLO 10.1 neutralización del IL-21 R con los anticuerpos anti-IL-21R. Ab hibe la generación de respuestas del anticuerpo de IgG al an dependiente de las células T in vivo La IL-21 es importante para que el isotipo de las c bie a ciertas subclases de IgG y la diferenciación a las células del , para determinar la eficacia de los anticuerpos anti-IL-21 Rt AbS , la capacidad de estos anticuerpos para inhibir las respue 14 (Figura 30B). El tratamiento con AbS o AbT no afectó la ma respuestas de la IgM en este estudio. Las respuestas del anticue específico de NP se retardaron en las células tratadas con Ab o se demuestra por una respuesta desminuida en comparació trol del isotipo en el día 7. Las respuestas del anticuerpo d ecífico de NP fueron similares en los ratones tratados con el c ipo, con AbS y con AbT en el día 14 (Figura 30A). Estos datos la neutralización de IL-21 R in vivo utilizando AbS o AbT puede i era transitoria la inducción de las respuestas iniciales del antic a un antígeno dependiente de las células T.
Un segundo estudio que prueba a AbS y AbT porcionó resultados similares (Figuras 30C-30F). Las respuestas ecífica de NP se redujeron de manera transitoria en el día unización en los ratones tratados con AbS o AbT, pero fueron si ratones tratados con el control del isotipo en puntos de unizaron con NP-CGG y descansaron durante al menos un r mitirles generar células B de memoria y células de plasma de l dan lugar a títulos del anticuerpo en suero de IgG a lar oximadamente un mes después de la inmunización, los ratones s semana i.p. con solución salina o 10 mg/kg de AbS o AbT, o el a control del isotipo durante dos meses. Los títulos del anticuerpo ro específico de NP se verificaron cada dos semanas mediante E nes C57BL/6 tuvieron altos títulos de anticuerpos de IgG ecíficos de NP un mes después de la inmunización, cuando se los ratones C57BL/6 sin exposición, consistente con la formac unidad humoral a largo plazo para NP. Los títulos del anticuerp suero específico de NP permanecieron estables durante el udio en los ratones tratados con el anticuerpo de control del is amiento con AbS o AbT no afecta estos títulos del anticuerpo (Fig spués de la inmunización, las células B generan células de plas EJEMPLO 10.2 Función del anticuerpo anti-IL-2 R en el modelo del SLE Los anticuerpos anti-IL-21 R AbS y AbT se probaro acidad para aliviar la enfermedad en el modelo murino MKL- s eritematoso sistémico (SLE). Los ratones MKL-Fastpr des omas de manera espontánea que se parecen a aquéllos observa s humano, incluyendo altos títulos de anticuerpos anti-ADN ra (anti-ADNds) en circulación, inmunoglobulina y depós plemento C3 en los glomérulos, la presencia de infiltrados linfo iñon y el pulmón, y en la enfermedad severa, proteinuria, linfade ones de la piel. Los ratones MRL-Fas/pr macho se obtuvieron de oratory (Bar Harbor, ME) y empezando a las 12 semanas de ed porcionó AbS, AbT, solución salina o un anticuerpo de IL-13 anti control con la misma región constante de la lgG1 humana muíant amiento, los animales se sacrificaron, y las secciones de riñon y c minaron para los depósitos de Ig y de C3 mediante inmunohist infiltraciones celulares en el riñon y los pulmones se midieron men de las secciones de tejido teñidas con H/E.
El tratamiento de los ratones MRL-Faslpr con el anticu uea a IL-21 R AbS, redujo de manera significativa los ni ¡cuerpo de IgG anti-ADNds en suero, en comparación con los ados con solución salina o con el anticuerpo de IL-13 anti-hu trol, empezando a las 2 semanas postratamiento y continuando semanas postratamiento (Figuras 31A-31 G). Los anticuerpos an redujeron a niveles indetectables por el tratamiento con AbS nes a la semana 4 (Figura 3 D), 5/10 a la semana 6 (Figura 31 E) emana 8 (Figura 31 F), en comparación con los animales tratad ción salina y el anticuerpo de IL-13 de control (todos los ratones ieron títulos detectables del anticuerpo anti-ADNds). El tratamien es significativamente diferente de los grupos tratados con soluci nti-IL-13 (p<0.01) después de 2 semanas de dosificación (Figur anas (Figura 31 D); 6 semanas (Figura 31 E); 8 semanas (Figura anas (Figura 31G).
El tratamiento con AbS también redujo de manera signi osición de Ig y del complejo C3 inmune y la patología del paración con los controles tratados con el anticuerpo anti-IL-13 uras 32A-32B, 33A-33B). Los ratones MRL-Fas/pf macho anas de edad se trataron (10 mg/kg i.p.t 3X/semana) con soluci trol) o con los anticuerpos mutantes triples indicados (un a tante A234 A235 A237 de lgG1 de IL-13 anti-humana sin reactiv 1 murina, se utilizó como un control del isotipo). Después de 10 tratamiento, los ratones se sacrificaron y la Ig y los depósitos de nes se identificaron mediante inmunocitoquímica. Las Figuras criben los depósitos de IgG en los ríñones de ratones MRL-Fas/p nsidad de la tinción se calificó en una escala de 1-5. La deposició complemento C3 en los ríñones se redujo de manera significativa AbS, en comparación con el anticuerpo de control anti-IL-13 (Fig ). Las Figuras 34A-34C describen la deposición de la IgG (Fig I (Figura 34B) y C3 (Figura 34C) en los cerebros de ratones trata ósitos de IgG (p<0.05; Figura 34A) pero no la IgM (Figura 3 ura 34C) se redujeron en los cerebros de ratones tratados con iparación con controles tratados con el anticuerpo anti-IL- nsidad de la tinción se calificó en una escala de 1-5. El tratam no reduce la deposición del complejo inmune en los ríñones o los ratones MRL-Fas/pr (Figuras 32A-34C).
La infiltración de los linfocitos en los ríñones y pulmon nes MKL-Fas/ f también se examinó histológicamente. L- as/pr machos de doce semanas de edad se trataron (10 m semana) con solución salina (control) o con los anticuerpos ificativa el número de linfocitos medido en los pulmones de lo L-Faslpr, en comparación con los controles tratados con solución S cuerpo anti-IL-13 (p<0.01 y p<0.05, respectivamente; Figura 36).
Tomados juntos, estos datos muestran que el tratami mejora la enfermedad similar al lupus en los ratones MKL-Fas/pr, el tratamiento con AbT parece ser menos eficaz en este modelo a examinar la discrepancia en la eficacia del tratamiento con AbS ratones MRL-Fas/pr, el suero de estos ratones se examinó uestas del anticuerpo anti-producto mediante ELISA. Los L-Faslpr macho de doce semanas de edad se trataron (10 m semana) con los anticuerpos mutantes triples indicados. lectado bisemanalmente se probó mediante ELISA para la pres ¡cuerpos murinos capaces de unirse a los mismos anticuerpos los cuales se trataron los ratones. Los ratones MKL-Faslpr g uestas al anticuerpo anti-humano (MAHA) para todos los tres an Para examinar la dependencia de la dosis de la neutrali 1 R en el desarrollo de la enfermedad en el modelo MKL-Fas/pr, bra de ocho semanas de edad se les administró AbS (dosis de 1 kg), AbT (dosis de 20 mg/kg) o el anticuerpo de control del isoti 20, 10, 5 ó 2.5 mg/kg) i.p. 3X/semana durante 10 semanas. Los r baron para los anticuerpos anti-ADNds en suero y se examinaro einuria, linfadenopatía y lesiones en la piel cada dos semanas. 10 semanas de dosificación, los animales se sacrificaron y las s riñon se examinaron para los depósitos de inmunoglobulina lunohistoquímica, y los infiltrados de las células inmunes se diante examen de las secciones de riñon teñidas con H&E.
Los ratones MRL-Fas/pr tuvieron niveles detectable cuerpos de IgG anti-ADNds al inicio del estudio, y estos an ementaron en título durante el curso del estudio en todos los g amiento. Sin embargo, el tratamiento con AbS a todas las dosis minaron para los signos clínicos de la enfermedad. Muy poco nes MKL-Fas, r utilizados en este estudio desarrollaron lesiones roteinuria clínicamente significativa, de manera que los efe miento con AbS y AbT en estos aspectos de la enfermedad no rarse. El tratamiento con AbS y AbT a todas las dosis probadas, esarrollo de la linfadenopatía en el estudio. Sin embargo, los dep y los infiltrados de células inmunes se observaron fácilment nes de los ratones tratados con el control del isotipo, consisten arrollo de nefritis por lupus en estos ratones. El tratamiento con AbS redujo de manera significativa el número medio de infiltrad las inmunes y los depósitos de la IgG en el riñon, mientra amiento con 5 y 2.5 mg/kg de AbS no tuvo efecto en estos pará estudio (Figuras 38C-38D). El tratamiento con AbT a la dos kg incrementó el número medio de infiltrados de células inmu tó los depósitos de IgG en el riñon de los ratones MRL-Fas/pr bolsas de aire se crearon inyectando a ratones BALB/C de 8-10 3 mi de aire bajo la piel dorsal. Tres días más tarde, las b flaron. Dos días después del reinflado, se inyectó i.p. soluci tro!) o los anticuerpos indicados a la dosis indicada. La IL-21 mu se inyectó en una bolsa de aire 24 horas después de la inye cuerpo. Seis horas más tarde, las bolsas se lavaron con 3 mi d recuentos celulares totales (Figura 39A), monocitos (Figura 39B), ura 39C), y neutrófilos (Figura 39D) se determinaron con un CE bott, Abbott Park, IL).
La inyección de la IL-21 murina en la bolsa de aire con emento significativo en las células totales (p=0.0002), .0137), linfocitos (p=0,0035) y neutrófilos (p=0.0004) en la bolsa as más tarde, en comparación con la solución salina (Figura amiento con AbS o AbT condujo a reducciones significativ tración celular en la bolsa de aire, en comparación con el tratami era significativa por AbS (10 mg/kg, p = 0.0032), pero no por AbT.
Se obtuvieron resultados similares en un segundo izado para examinar la capacidad de AbS y AbT en el modelo de aire murino. La infiltración de las células totales en la bolsa s jo de manera significativa por AbS cuando se administra a 13), 5 (p = 0.0027) y 2 mg/kg (p = 0.029), y por AbT a 10 m 07) (Figura 39E).
El efecto de AbS en la infiltración de la respuesta celula el modelo de la bolsa de aire en la rata también se exam rminar si estos anticuerpos podrían neutralizar el IL-21 R en la r as se crearon inyectando a ratas S-D hembra de 8 semanas de i de aire en el tejido subcutáneo de la espalda. Tres días más t as se reinflaron inyectando 10 mL adicionales en la bolsa. Dos e, las ratas se inyectaron con la cantidad designada del control d ticuerpo AbS. El siguiente día, se inyectó solución salina o 1-20 as condiciones (p<0.05) (Figura 39F). Para determinar la dosis que podría inhibir la infiltración celular en la bolsa de aire en est la rata, se realizaron estudios adicionales en los cuales se les ad ratas 20 pg de la IL-21 murina y 10 mg/kg del control del isotipo o /kg de AbS. La administración de 10 mg/kg de AbS redujo d nificativa la infiltración de las células en la bolsa de aire de la rata incremento no significativo en la infiltración celular en la bolsa d ervó en las ratas tratadas con 3 mg/kg de AbS. El tratamiento co AbS incrementó de manera significativa la infiltración celular en la paración con las ratas tratadas con el control del isotipo (p<0.0 ). Estas observaciones se repitieron en un segundo estudio, en amiento con 10 mg/kg redujo de manera significativa la infiltraci la bolsa de aire de la rata, inducida por 20 pg de la IL-21 murina este estudio, el tratamiento con 3 y 1 mg/kg de AbS incrementó d nificativa la infiltración celular en la bolsa (p<0.05) (Figura 39H). tificativa la infiltración celular accionada por la IL-21 en la bo 75), mientras que la administración de AbS a 1 mg/kg incre era significativa la infiltración celular inducida por la IL-21 en la b 57). El tratamiento con AbS o el anticuerpo de control del ¡s kg en la ausencia del tratamiento con IL-21 , no incrementó la i lar en la bolsa, indicando que la infiltración celular incrementa a provocada por el tratamiento con AbS a 1 mg/kg, fue dependie unistración de la IL-21 murina y el anticuerpo anti-IL-21 R en est ura 39I).
Para determinar si el incremento en las células en el m olsa de aire de la rata era dependiente de la administración de la L-21 murina (20 pg), se realizó un experimento en el cual las ron con 10, 20 ó 40 pg de IL-21 murina y con 1 ó 10 mg/kg de ervó una inhibición significativa de la infiltración celular en la bols kg de AbS, en respuesta a 10 (p = 0.003) y 20 pg (p = 0.003) 1 murina en este modelo (Figura 39J). Estos datos indican de afectar la infiltración celular en la bolsa de aire de la rata, en r IL-21 murina, con la inhibición de esta respuesta lograda con una g/kg de AbS.
EJEMPLO 10.4 Farmacodinámica en ratones CD-1 después de la administra intravenosa o subcutánea de AbS Las concentraciones en suero de los anticuerpos a anos se determinaron mediante ELISA calificados, como se de uadro 13. El ELISA anti-IL-21 R utilizó un IL-21 R monomérico His como un reactivo de captura y Fe anti-humano (conj xidasa de rábano picante (HRP)) como un reactivo detector. El la enzima, S.S'.S^'-tetrametilbencidina (TMB), se utilizó para pr parámetros PK se determinaron utilizando un módulo de an ipartimental (Modelo 200 para la dosificación i.p. y s.c. y Módulo osificación i.v.) del paquete de programas de PK WinNonlin (ve rsight, Mountain View, CA). El programa aplica un proc pendiente del modelo y los métodos estándar descritos por rier (Pharmacokinetics (2a ed. 1982) Marcel-Dekker, Inc., New a bajo la curva de concentración en suero vs. tiempo (AUC) s zando el método trapezoidal lineal. La pendiente de la fase rente se estimó por una regresión lineal logarítmica utilizando puntos de datos y la constante de la velocidad terminal (?) se de diente. El AUCo,« se estimó como la suma de AUC0-t (en don po de la última concentración mensurable) y Ct/?. La vida medi inación aparente se calculó como 0.693/?. Las prediccione centraciones después de múltiples regímenes de dosifica lizaron mediante r osi i n no ar m ri liz media de la eliminación (ti/2) de 162 horas (-6.8 días). El vo ribución en estado estacionario (Vdss) fue de 306 ml/kg, sugirien estaba confinado principalmente al sistema vascular (Figura 40 La farmacocinética de AbS en ratones CD-1 pareció ser ntervalo de la dosis de 10-100 mg/kg. Después de la admi venosa de 100 mg/kg de AbS a ratones CD-1 macho, el AUC0 92 pg*hr/ml, C5m¡n fue 1160 pg/ml, la CL fue -1.3 ml/hr/kg, Vds g, y la vida media de la eliminación fue -391 hr (-16.2 días) (F dro 14).
Después de una administración de 10 mg/kg s.c. d nes CD-1 , la absorción de AbS fue lenta (Tmax de 48 hor isponibilidad subcutánea fue de 81 %. El valor de ¡2 medio desp inistración subcutánea fue de -195 horas (-8.1 días) y similar baron con la mezcla. Después de la incubación con las perlas, la có en el analizador M-Serie 384 BioVeris. Se aplicó un magn turar las perlas paramagnéticas en un electrodo superficial, y los unidos de lavaron. El Abs rutenilado capturado en las perlas tricamente mediante la aplicación del voltaje, resultando en la pr uz. La luz se midió mediante fotodetectores con la lectura en uni uesta (RU).
Los controles positivo y negativo también se utiliza rminar las RU del punto de corte, que se define como el doble d ías del control negativo. Las muestras se probaron inicialment ato de selección a diluciones de 1 :25 y 1 :75. Las muestras que mayores que o igual a las RU del punto de corte se consideraron e reanalizaron en una serie de dilución completa para con ltado positivo y determinar el título (la dilución recíproca que gen iguales a las RU del punto de corte). Para muestras positivas, s les altos de AbS en algunas muestras podrían haber interferi ección de los anticuerpos anti-AbS. El resumen del inicio de la r nticuerpo anti-AbS a través de varios tiempos, y a través de las males y razas/modelos, se muestra en el Cuadro 23.
La presencia de anticuerpos anti-AbS también se dete horas (27 días), 984 horas (41 días) y 1320 horas (55 días) de mg/kg i.v. de AbS a los ratones CD-1 (n=3 por punto de guno de los ratones probados fue positivo para los anticuerpos an os puntos de medición.
EJEMPLO 10.5 Farmacocinética en ratones DBA y MRL-Fas'pr después de administración intraperitoneal de AbS Las concentraciones en suero de los anticuerpos a tro parámetros. Los parámetros PK se calcularon como se ind plo 10.4. Las predicciones de las concentraciones des menes con múltiples dosis se realizaron mediante la superpo métrica, utilizando el programa WinNonlin y suponiendo una al en los ratones MKL-Faslpr y DBA en el intervalo de la dosis d kg (dosis única).
Después de una sola dosis i.p. de 8 mg/kg de AbS a machos, la concentración máxima en suero (Cmax) y la exposició e AbS fueron de 62 pg/ml y 7229 pg*hr/ml, respectivamente. La media de la eliminación (ti 2) de AbS fueron de 6 horas y 140 ho ), respectivamente (Figura 41 ). De ocho de los animales proba arrollaron respuesta al anticuerpo anti-AbS a las 672 horas, dét zando el ensayo con perlas paramagnéticas descrito en el Eje adro 12). El resumen del inicio de la respuesta al anticuerpo a és de varios tiem os, a través de las es ecies ani CUADRO 12 mg/kq i.p. a ratones DBA Después de una sola dosis intraperitoneal de 10 mg/kg L-Faslpr hembra de doce semanas de edad, la concentración m ro (Cmax) y la exposición (AUC0-oo) de AbS fueron de 51 pg/m hr/ml, respectivamente. La Tmax y la vida media de la eliminació fueron 3 horas y 46 hr (-1.9 días), respectivamente (Figura 41).
En comparación con los ratones DBA y CD-1 , la e malizada con la dosis de AbS pareció ser menor en los ratones M adro 14). Esto no fue totalmente inesperado, puesto que se ha r liminación de la IgG normal en los ratones MRL-Fas/pr (especial omas de la enfermedad en acientes con SLE véase Zhou et Cuando el AbS se administró a ratones MRL-Fas,pr i.p. mg/kg por dosis 3X/semana durante 10 semanas (Ejemplo 10.2), pos de dosis tuvieron una reducción significativa en los título cuerpos anti-ADNds en comparación con el control del isoti ana mutante triple de IL-13 anti-humana). Para los grupos de do mg/kg, los niveles mínimos en estado estacionario de AbS se a iante ELISA. A los puntos de medición de 2 y 4 semanas, casi stras probadas del grupo de 2.5 mg/kg tuvieron niveles indetecta mi) de AbS en el suero, una muestra tuvo niveles muy bajos (5 a el grupo de 10 mg/kg, hubo una alta variabilidad interanim centraciones de AbS en suero; sin embargo, los niveles dianos en estado estacionario fueron -3-10 veces may paración con aquéllos predichos utilizando los datos PK del e sola dosis en los ratones MKL-Fas/pr (Figuras 42A-42B). Cu os de una sola dosis i.p. obtenidos en la raza de ratón DBA se altos por encima del límite de cuantificación superior de 4.74 rítmicas del título. Sin embargo, en lugar de la acción farm erada del AbS a respuestas de IgG retrasadas y/o reducidas, e una dosificación más alta de AbS bajo los regímenes de múltipl jera la respuesta MAHA contra sí mismo, resultando en concen suero de AbS más altas observadas, en comparación con eradas basándose únicamente en los datos PK de una sola d ho, en ratones MKL-Fas/pr, la respuesta MAHA a AbS fue - 1 or, en comparación con aquélla de una IgG humana del co ipo, administrada vía el mismo régimen de múltiples dosis de 1 emana durante 10 semanas (Figura 37A).
EJEMPLO 10.6 PK de AbS en macacos de Java hembra como un reactivo de captura y un Fe anti-humano conjugado ÍO un reactivo detector, como se describió para los ratones C mplo 10.4. La concentración en suero del anticuerpo de control d macacos (anticuerpo anti-IL-13) también se midió mediante EL ensayo, el ligando recombinante de IL-13 humana, que cont ea de fusión del octapéptido FLAG, se capturó mediante un a ocional anti-FLAG. Las muestras en suero que contienen el a i-IL-13 se detectaron con Fc-HRP anti-humano. El sustrato de l S se utilizó para producir un producto final coloreado para vis culo de prueba unido. Los parámetros PK se calcularon para cad vidual utilizando métodos no compartimentales.
Todos los seis macacos hembra que se administraron c mg/kg (n=3 para las rutas de administración i.v. y s.c.) tuvieron u upta en los niveles de AbS en la fase terminal (a -408 horas p iriendo la posible formación de anticuerpos anti-producto. Los v io fue de -7.9 días. El volumen de distribución medio en cionario (Vdss) fue bajo (-125 ml/kg), sugiriendo que AbS inado principalmente al sistema vascular. La exposición media bS fue de 9728 pg*hr/ml.
Después de una sola administración de 100 mg/kg i.v. d macacos de Java, la CL fue de -1.08 ml/hr/kg, Xy2 fue de 279 ), AUCo-oo fue -92867 pg*hr/ml y Vdss fue -21 1 ml/kg. Así, en g de AbS fue aproximadamente lineal en el intervalo de dosis d kg.
Después de la administración de 10 mg/kg s.c. de acos hembra, la absorción de AbS fue lenta (Tmax medio de -34 iodisponibilidad s.c. media fue de -43%. El valor medio de /2 de administración de 10 mg/kg s.c. a macacos fue de 52 horas (-2. lar a aquél observado después de la administración de 10 m respuesta anti-AbS persistió a todos los puntos de medición p sta 27 semanas). Así, la respuesta al anticuerpo anti-AbS parec K de AbS en los macacos después de una sola administraci kg i.v. o s.c. Para el grupo de la dosis de 100 mg/kg i.v.t 1 de 3 positivo para los anticuerpos anti-AbS en las semanas 6 y 8, c rítmicos de 1.8 y 4.6, respectivamente.
CUADRO 13 ecíes Captura del Detector Intervalo de Dilución Curva zas Ensayo del cuantíficación Minima estándar Ensayo (ng/mL en Requerida (ng/ml 100% de en 5% de suero) suero) atón IgG antiigG- 32-500 20 0.78-100 BA humana biotina antihumana atón IgG antiIgG- 33.4-630 20 0.514- e os e en raones y macacos em ra se determinó para las rutas i.p. y s.c. ndo los puntos de datos con la caída abrupta en la concentración.
CUADRO 15 rmación de los anticuerpos anti-AbS (logaritmo del titulo) en CD-1 machos después de una sola dosis IV o SC de 10 mg/ po intravenoso Tiempo (hora) SAN 576 672 26 2.65 27 2.54 28 < 1.40a 29 2.16 30 <1.40a 40 2.81 41 2.34 42 2.32 43 2.79 44 < 1.40a 45 3.25 46 1.79 47 3.28 48 <1.40a 49 3.21 50 3.18 95 <1.40a 96 3.27 97 3.53 98 3.73 99 < 1.40a 100 3.65 1.40 significa un resultado negativo. = número del animal del estudio CUADRO 16 rmación de los anticuerpos anti-AbS (logaritmo del titulo) en de Java hembra después de una sola dosis IV o SC de 10 m po intravenoso Tiempo SAN SAN SA (horas) 1 2 3 336 < 1.40a <1.40 <1. 504 2.35 2.33 2. 672 3.61 3.22 2. 804 .7 o subcutáneo Tiempo SAN SAN SA (horas) 4 5 6 336 <1.40a <1.40 <1. 504 3.00 2.68 2.3 672 3.52 3.64 2.5 804 4.10 3.71 2.4 1008 3.91 3.73 2.8 1176 4.11 3.59 3.2 2016 4.29 3.77 3.6 2856 4.25 3.61 3.5 3696 4.26 3.49 3.4 4536 4.39 3.56 3.5 40 significa un resultado negativo. = número del animal del estudio EJEMPLO 10.7 PK de AbT en ratones icciones de las concentraciones después de regímenes con is se realizaron mediante superposición no paramétrica utili rama WinNonlin y suponiendo una cinética lineal en ratones MK en el intervalo de dosis de 2.5-10 mg/kg (dosis única) para Ab rvalo de dosis de 8-20 mg/kg (dosis única) para AbT.
Después de la administración i.v. de 10 mg/kg de A nes CD-1 macho, la exposición (AUC0.oo) de AbT fue de 4551 ura 44A; Cuadro 18). La concentración media en el primer ición del muestreo después de la administración i.v. (C5min) fue ~ eliminación de AbT en ratones CD-1 fue relativamente lenta, encia por la eliminación corporal total baja (CL) de -2.2 ml/hr/kg media de la eliminación (ti/2) de 210 hr (-8.8 días). El vol ribución en estado estacionario (Vdss) fue de 572 ml/kg. Desp iinistracion de 10 mg/kg i.v. a ratones, AbT pareció tener una CL a ratones DBA, la exposición y la vida media de AbT se redujero %, respectivamente, en comparación con los parámetros PK espondientes.
Después de una sola dosis i.p. de 0 mg/kg a ratones M bra de doce semanas, la concentración máxima en suero (C osición (AUCo-oo) de AbT fueron de 23 pg/ml y 957 ectivamente (Figura 44B; Cuadro 18). La Tmax y la vida me inación (ti/2) de AbT fueron de 6 horas y 21 horas, respecti pués de la administración i.p. a ratones MRL-Fas'pr, la exposición ia de AbT se redujeron -66% y -54%, respectivamente, en co los parámetros PK de AbS correspondientes. A las 2 semanas, to de medición para AbT en el cual se observó una reducción en l i-ADNds, los niveles medianos de AbT fueron 4-5 veces ma paración con aquéllos predichos por las simulaciones utilizando - /pr tiples administraciones de AbT y la incapacidad de AbT para s uesta MAHA contra sí mismo.
En línea con los resultados descritos para AbT, la e alizada con la dosis de AbT parece ser menor en los ratones M omparación con aquélla en los ratones DBA y CD-1 (Cuadro 18).
A diferencia de AbS, cuando AbT se administró a L-Faslpr i.p. a 10 mg/kg o 20 mg/kg por dosis 3X/semana du anas, sólo se observaron efectos limitados en el desarroll rmedad en los ratones MKL-Faslpr (Ejemplo 10.2). La administr (10 mg/kg) no resultó en una reducción significativa de los título ds en todos los puntos de medición evaluados. La administr te mg/kg de AbT resultó en la reducción transitoria en los títul -ADNds a las 2 semanas; sin embargo, los títulos de anti-ADNds rentes del control en puntos de medición posteriores (4, 6, anas) (Cuadro 19). Para el grupo de 20 mg/kg de AbT, niveles imos medianos de AbT fueron menores que el límite de detec i). A las 2 semanas, el único punto de medición para AbT en ervó una reducción en los títulos de anti-ADNds, los niveles med fueron 4-5 veces mayores en comparación con aquéllos predich ulaciones utilizando datos PK del estudio de una sola dosis e L-Faslpr y similares, con comparación con aquéllos predicho ulación con los datos de una sola dosis obtenidos de los rató ura 45). Esta observación está en línea con aquéllas para el gru kg de AbS. Sin pretender apegarse a una teoría, una posible ex los niveles de AbT relativamente menores en el punto de me semanas (en comparación con aquéllos de AbS) y los tectables de AbT en los puntos de medición posteriores, es la ucción de MAHA, desencadenada por múltiples administracione incapacidad de AbT para suprimir la respuesta de MAHA contra s La concentraciones en suero de los anticuerpos an anos se determinaron mediante ELISA calificados como se descr dro 17. El ELISA anti-IL-21 R utilizó un IL-21 R monomérico mar como un reactivo de captura y un Fe anti-humano conjugado a H reactivo detector, como se describió en el Ejemplo 10.6. Se util producir un producto final coloreado para visualizar el artículo d o. La concentración en suero del anticuerpo de control del isoti acos (anticuerpo anti-IL-13) también se midió mediante ELISA, cribió en el Ejemplo 10.6. Los parámetros PK se calcularon có en el Ejemplo 10.6.
Después de una sola administración intravenosa de 10 a macacos de Java hembra, la eliminación media en suero (C ml/hr/kg y la vida media de eliminación media (ti/2) fue de -2.6 men de distribución medio en estado estacionario (Vdss) fue de ~2 ex osición media AUC -o de AbT fue de 1476 *hr/ml Cuadro acos, la Tmax media fue ~6 horas, y la biodisponibilidad subcutáne de -43%. El valor de t1/2 medio después de una administració g s.c. a macacos fue de 63 horas (-2.6 días), y similar a rvada después de una administración de 10 ó 100 mg/kg i.v. (Cua CUADRO 17 Resumen ELISA para AbT en suero de ratón y macaco hem cies Captura del Detector Intervalo de Dilución Curva as ensayo del ensayo cuantificación requerida estándar (ng/ml en 100% mínima (ng/ml) de suero) d d tón IgG antiIgG-biotina 32-500 20 0.78-100 A humana anti(en 5% de humana suero) tón IgG antiIgG-biotina 66.8-1260 40 0.514-102 humana anti(en 2.5% humana de suero) tón IL-21 R IgG-HRP 45-768 20 1-38.4 (en ra -1 marcado anti5% de con His humana suero) monomérico aco IL-21R IgG-HRP 30-512 20 0.44-38.4 ava marcado anti(en 5% de con His humana suero) edios de AbT en ratones y macados hembra CUADRO 19 Concentraciones medias de AbS y AbT después de múltipl dosificaciones a ratones MRL!pr EJEMPLO 10.9 Farmacocinética de 125I-D5 en ratones DBA El anticuerpo IL-21 R 125l-anti-murino D5-20 ("D5"), s aperitonealmente en ratones DBA machos sin ayuno en una sola g/kg. Las muestras de suero se tomaron en los puntos de me 76 horas, y los niveles de D5 se cuantificaron midiendo la re cipitable del ácido tricloroacético (TCA). El perfil de PK del antic CUADRO 20 Parámetros farmacocinéticos de 125I-D5 en ratones DBA ma t¼ (horas) Tmax (horas) Cmax (Mg mL) A 125I-D5 143.9 6 36 5 EJEMPLO 10.10 Farmacocinética en ratas Sprague-Dawley después de un administración intravenosa, subcutánea o intraperitoneal de anticuerpos anti-IL-21R La PK de AbS, AbT, AbV, AbU y AbW, así como un a ontrol del isotipo, se examinó después de una sola dosis de 10 ratas S-D. El ensayo bioanalítico para la cuantificación centraciones en suero del artículo de prueba, un ensayo para la los anticuerpos anti-AbS en suero de rata, y los cálculos farmaco ificativamente más rápido (p<0.05) que para una IgG del control d .4 mL/hr/kg). (Cuadro 21 y Figura 48A). Todas las ratas (n = 6), declinación abrupta en la concentración en suero de AbS, de ma bS no fue detectable en y después de 15 días postdosis. Esta de la concentración en suero de AbS se relacionó probablement sencia de anticuerpos anti-AbS detectados en el día 15 y en t tos de medición posteriores en todos los seis animales. Deber las diferencias en los perfiles de concentración-tiempo en rata y la IgG de control, probablemente no se explican entéram uestas anti-producto, puesto que las concentraciones medias pezaron a divergir ían inicialmente como 24 horas postdosis, y difir de 4 veces en el punto de medición de una semana. El centración-tiempo y los parámetros PK de AbV se parecen estre uellos de AbS en las ratas.
Después de una sola dosis de 10 mg/kg i.v. a CUADRO 21 D después de la administración de 10 mq/kg i.v. = eliminación en suero. Vdss = Volumen de distribución e cionario. AUC = Área bajo la curva. oncentración a 5 minutos, el primer punto de medición del pués de la administración IV. os niveles de AbS fueron <LOQ después del punto de medició as en todas las ratas. odos los animales en todos los grupos de dosis tuvieron una caíd g/mg) después de la administración i.v.
A las 168-504 horas después de una sola administració . a ratas, hubo una declinación abrupta en los niveles de AbS en ales (Figura 49). En los grupos i.v. y s.c., los niveles de AbS e debajo del LOQ para el ensayo (45.0 ng/mL) a 360 horas hasta e dio (840 horas). En el grupo i.p., no hubo AbS detectable emp 576 horas hasta el final del estudio. Utilizando el ensayo c amagnéticas descrito en los Ejemplos 10.4 y 1 1 , los anticuerpos detectaron en todos los animales para todos los grupos de d nto como a las 360 horas postdosis (el primer punto de me streo tomado para la evaluación del anticuerpo anti-AbS) y pe ta el final del estudio (840 horas). Los títulos logarítmicos uesta anti-AbS alcanzaron 4.01 a >4.74 unidades al final del est as las muestras probadas. Así, la declinación abrupta en AbS se ablemente con la formación de anticuerpos anti-AbS. hr/kg para las dosis de 1 mg/kg y 10 mg/kg i.v., respectivamente, dia de la eliminación promedio (ti/2) fue de 40 ± 10 y 1 13 ± 24 h dosis de 1 mg/kg y de 10 mg/kg i.v., respectivamente. Los pará AbS no fueron proporcionales a la dosis en el intervalo de dosi kg después de la administración i.v. a ratas, puesto que las exp malizadas con las dosis promedio (AUC0-oo/dosis), CL y U ificativamente diferentes (p<0.01 , prueba t no apareada) entre I osis de 1 y 10 mg/kg.
Después de una sola dosis de 10 mg/kg i.p. de AbS a Co-00 en suero promedio fue de 3929 ± 979 pg*hr/mL y la biodisp mada promedio (BA) fue de 62 ± 15% (con los datos de la A po de 10 mg/kg, i.v. utilizados para el cálculo de BA) (Cuadro 22). suero promedio fue de 31 ± 14 pg/mL y se alcanzó a Tmax de 20 pués de una dosis de 10 mg/kg i.p. a ratas, no hubo una va ranimal significativa en el \V2 terminal aparente con el valor prome horas.
SD) de AbS en ratas S-D después de una sola dosificación i.v.. i.p. o s.c. cada animal individual. medición del muestreo después de la administración i.v. se muestra para Grupos 3 y 4. dministración i.p. o s.c, se calculó utilizando los datos de la AUC para el el Grupo 1 (p<0.01).
El resumen del inicio de la respuesta al anticuerpo ant s los animales, incluyendo las ratas S-D, se resumen en el Cuadr CUADRO 23 cio de la respuesta al anticuerpo anti-AbS después de una sol de AbS a ratones, ratas y macacos EJEMPLO 11 ficó mediante filtración. Brevemente, ~ 100-200 pg del artículo d incubaron durante 25 minutos con 1-2 mCi de 125l (PerkinEl )-BEADS, y -100-200 µ? de PBS. La mezcla de reacción se s O-BEADS y se transfirió a un dispositivo de filtración Centricon kD, Millipore). La purificación se realizó agregando -5-10 mi de uotas de 1-2 mL) y centrifugando a 2,000X g hasta que el volu ara superior del dispositivo de filtración bajo a -200-500 µ?.
La solución de dosificación se preparó combinando la re del artículo de prueba no marcado, el amortiguador de la form razador de 125l. La pureza de la solución de dosificación s zando SDS-PAGE reductor y no reductor. La solución de dosifi paró una vez, un día antes de la dosificación de la primera co ales. uota, y las muestras se centrifugaron a -12,000 rpm durante 0 radioactividad soluble en TCA en el sobrenadante (con el volume rnen de la muestra utilizado para el recuento de la radioactividad erminó mediante recuento gamma. La reactividad del precipitad una muestra dada [cpm totales - 2 x TCA - cpm solubles], la ecífica de la solución de dosificación (cpm/ng), así como las fec estra (ts (día)) y las mediciones de la solución de dosificación (to zaron para calcular la concentración radioactiva equivalente (ng muestra dada utilizando la fórmula: A promedio - cpm precipitable/EXP(-0.693/60.2 x (ts - tD)] / ecífica x volumen de la muestra].
EJEMPLO 11.3 terminación de los recuentos acumulativos totales (como po unto de medición indicado.
Para determinar la fracción de la radioactividad soluble uotas de 50 µ? de orina se mezclaron con 50 µ? de suero de rató ultando en muestras de 100 µ?) y se analizaron mediante ma. Una alícuota de 100 µ? de TCA al 20% se agregó a cada m µ?, y las muestras de 200 µ? se centrifugaron a -12,000 rpm d utos. La radioactividad soluble en TCA en los 100 µ? de sobrena rminó mediante recuento gamma. La fracción del yodo libre s zando, la fórmula: [2 x 100% x cpm soluble en TCA en 1 renadante / cpm total en 50 µ? de orina].
EJEMPLO 11.4 Análisis de biodistribución Las muestras de tejido se colocaron en tubos prepes tejido dado en un punto de medición dado, se calcularon utili ción de la concentración equivalente radioactiva en el tejido (pg ella del suero (pg eq/ml). Los recuentos de tejido totales como is se calcularon utilizando la fórmula: [100% x cpm de la muest 3/60.2 x (ts - to)] / [actividad específica x dosis].
EJEMPLO 11.5 macocinética y biodistribución en los ratones de control y co IL-21R desactivado después de una dosis intravenosa de 2.5 En los ratones C57BL/6 del tipo silvestre (control), h linación en los niveles medios en suero de AbS con relación a aq ratones con el gen de IL-21 R desactivado, empezando a los 1 pués de una sola dosis de 2.5 mg/kg i.v. de 125l-AbS (Figura 50 14 (336 horas), 60% de los controles (n = 10) y 0% de los raton o semanas, aproximadamente 55% (cinco de nueve) muestras tipo silvestre y ninguna de las muestras de suero con el gen d activado, probaron positivas en el ensayo del anticuerpo anti-AbS.
En los ratones de control, la eliminación corporal total (C ml/hr/kg, y la vida media de la eliminación (ti 2) fue de 120 ho ). En los ratones con el gen de IL-21 R desactivado, la CL fue r/kg, y Xy2 fue de 256 horas (10.7 días) (Cuadro 14). En cons pués de una dosis de 2.5 mg/kg Lv., los ratones con el gen d activado tuvieron una exposición en suero más alta (AU paración con los controles (Cuadro 14).
En general, para los ratones de control y con el gen d activado, las concentraciones más altas de 125l-AbS se encont ro en comparación con otros tejidos examinados (Figuras 50 dros 24 y 25). Sin embargo, en el último punto de medición de horas se encontraron niveles detectables de 125l-AbS en lo control (-90-165 horas) en comparación con aquéllas en los tejid nes con el gen de IL-21 R desactivado (-230-270 hora secuencia, las exposiciones del tejido (AUCo-oo) fueron menore nes de control en comparación con los ratones con el gen d activado (Cuadro 26). Así, después de una dosis de 2.5 mg/kg i. s ratones con el gen de IL-21 R desactivado, la exposición al s o fue mayor en comparación con los controles.
CUADRO 24 elación de la concentración radioactiva equivalente media (± ido a suero (T/S) después de una sola dosis intravenosa de 2. de 125l-AbS a ratones C57BU6 1 hora 48 horas 168 horas 336 grasa 0.009910.0062 0.0849+0.0289 0.0619±0.0144 0.231 fémures 0.0360+0.0126 0.1203±0.0124 0.1108±0.0140 0.697 corazón 0.0776±0.0109 0.1588±0.0143 0.1122±0.0123 0.383 ?? 3X la cpm de fondo), se trataron como "0" para el cálculo de la esviación estándar (SD). no se calculó para los puntos de medición después de 336 hor horas), puesto que las concentraciones en suero estuvieron p límite de detección.
CUADRO 25 elación de la concentración radioactiva equivalente media (± ido a suero (T/S) después de una sola dosis intravenosa de 2. de 125l-AbS a ratones con el gen de IL-21R desactivado 1 hora 48 horas 168 horas 336 grasa 0.0063±0.0022 0.0718±0.0353 0.0856±0.0475 0.088 fémures 0.0327±0.0069 0.1283±0.0555 0.1 169+0.0104 0.123 corazón 0.0733±0.0152 0.1569+0.0172 0.1526±0.0213 0.168 riñon 0.1491±0.0417 0.1570±0.0218 0.158810.0347 0.168 stino grueso 0.01 12±0.0034 0.0666±0.0133 0.0612±0.01 1 1 0.056 hígado 0.1550+0.0466 0.1434±0.0706 0. 190+0.0549 0.078 pulmones 0.3495±0.1671 0.2722+0.0529 0.1 17810.0707 0.251 horas), puesto que las concentraciones en suero estuvieron po límite de detección.
CUADRO 26 C57BL/6 IL-21R KO Crnax3 Tmax AUCo^ Crnax8 Tmax pg eq/ml hora hr* pg \ig eq/ml hora eq/ml rasa 0.66 48 120 0.64 48 ures 0.93 48 213 1.17 48 razón 1.79 1 258 1.97 1 iñon 3.06 1 352 4.07 1 estino 0.59 48 105 0.61 48 ueso gado 3.77 1 317 4.24 1 odos 1.21 48 303 9.88 1 áticos lmón 4.84 1 447 1.21 48 sculo 0.61 48 128 0.60 48 elético piel 2.44 48 567 2.48 48 EJEMPLO 11.6 macocinética y biodistribución en ratones MRL-Fas/pr despué dosis intraperitoneal de 2.5 mg/kq Después de una sola dosis i.p. de 2.5 mg/kg de 125l L-Fas,pr hembra (-10-12 semanas de edad), el p centración-tiempo en suero fue bifásico, mostrando una d tivamente más lenta en los niveles de AbS durante la primera tdosis (ti/2 -54 horas) y una declinación más rápida después d tdosis (ti 2 -12 horas), sugiriendo la formación de anticuerpos uras 51A y 52). De hecho, 4 de 4 ratones en el tiempo de me horas, y 4 de 4 ratones en el tiempo de medición de 408 horas, itivos para los anticuerpos anti-producto (con títulos medios reí 1 y -4.43 unidades de título logarítmico, respectivamente). De 25 kg i.p. (probablemente antes de la formación de los anticuer ducto)f las concentraciones más altas de AbS se encontraron a todos los tejidos examinados. Después de la primera se centración en suero declinó más rápidamente en comparació linación del AbS en el tejido, de manera que las relacion centración T/S fueron significativamente más altas que 1 (Cuadro o-oo en tejidos fue -90-300 pg eq*hr/ml (Cuadro 28). En el tejid ia de la eliminación aparente (calculada basándose en el co os de 24-312 horas), fue de -40-55 horas. Niveles relativame ro todavía detectables) de radioactividad persistieron en el tejido l del estudio (siete semanas postdosis) (Figura 51A).
CUADRO 27 ?? 3X la cpm de fondo), se trataron como "0" para el cálculo de la esviación estándar (SD). no se calculó para los puntos de medición después de 240 hora las concentraciones en suero estuvieron por debajo del l cción en la mayoría de los ratones.
CUADRO 28 osición de 125l-AbS en el tejido de ratones MRL-Fas/pr despué sola dosis de 2.S mg/kg IP Cmax Tmax AUC pg eq/ml horas hr* g grasa 2.9 24 25 riñon 1.8 24 19 hígado 1.0 24 9 nodos 1.8 24 13 linfáticos EJEMPLO 12 ropiedades inhibidoras de los anticuerpos anti-IL-21R en la s humana EJEMPLO 12.1 La respuesta agonista de la sangre completa humana a IL-21 neutralizada por el tratamiento ex vivo del anticuerpo anti-IL- La sangre completa humana se extrajo por el Prog adores de Sangre Humana en Cambridge, MA. Todas las mu jre humana se recolectaron en tubos de preparación de célula utainer™ BD. Los tubos de recolección contenían heparina sód stras se mantuvieron a temperatura ambiente y se pr ediatamente. La sangre se dividió en alícuotas de 1 a 2 mL, en c ados con IL-21 , AbS o las proteínas de control. Cuando las mu 00 con puntas ART 1000E (# de Catálogo 72830-042), y se agr rotubos de 2.0 mL (Axygen Scientific, # de Catálogo 1001 - tiene 1.3 mL de RNAIater® proporcionado por el Kit para Sangre oPure™ (Ambion, Austin, TX; # de Catálogo AM 1928) y se pletamente mediante cinco inversiones completas. Las mu acenaron a temperatura ambiente durante la noche y a contin gelaron a -80°C en espera de la purificación del ARN.
El ARN se aisló utilizando el Protocolo para Sangre oPure™ (Ambion, # de Catálogo AM 1928). El procedim (amiento de ARN Humano RiboPure™ consiste de lisis celula ución basada en guanidinio y la purificación inicial del ARN racción con fenol/cloroformo, y una purificación final del ARN racción en fase sólida en un filtro de fibra de vidrio. El ADN idual se retiró de acuerdo con las instrucciones del fabricant amiento con la DNAsa utilizando los reactivos DNA-free™ propo bidor de RNasa adicional a 50 U/muestra (ABI, # de Catálogo N8 muestras de ADNc se almacenaron a -20°C hasta que se r PCR (PCR en tiempo real). La cantidad de ADNc cargado en u rreglo de Baja Densidad Taqman®, se determinó utilizando el re bajo del ARN obtenido con un experimento. Las muestras de arón en un detector de secuencias ABI PRISM 7900 (Programa Secuencias v2.2.2, Applied Biosystems), utilizando condiciones d iico universales de 50°C durante 2 minutos, 95°C durante 10 m tinuación 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 Para verificar los efectos ex vivo de la IL-21 , se r erimentos para probar si la sangre completa humana respondía cambios detectables en los niveles de expresión del gen. L pleta de donadores humanos se incubó en la presencia o aus 1 , y los niveles de ARN se determinaron utilizando tarjetas T zaron dos diferentes TLDA para medir los niveles de expresión L-21 más consistentes observados en las muestras de sangre co cuatro humanos probados bajo las condiciones de ensayo selecc muestran en el Cuadro 29. Las respuestas significativas a I rvaron para IL6, IFNy, CD19, PRF1 , IL10, IL2Ra y GNLY. De esante, el tratamiento con IL-21 a concentraciones de 30 ng/ L y 500 ng/mL produjeron resultados similares (Cuadro 29).
CUADRO 29 mbios en la expresión del gen dependiente de IL-21 en las m de sangre humana completa IL21 IL21 IL21 Cambio Desviación (30 ng/mL) {100 ng/mL) (500 ng/mL) promedio estándar Cambio Cambio Cambio compuesto compuesta ( promedio (2 promedio (4 promedio (2 Humanos) Humanos) Humanos) 20.17 13.24 32.14 19.70 22.51 7.65 6.51 7.23 6.97 2.34 9 2.72 2.78 2.78 2.76 0.94 1 2.43 2.87 2.72 2.72 1.08 0 3.17 2.49 2.66 2.70 1.26 Para determinar si el AbS tiene la actividad de bloqueo la activación dependiente de IL-21/IL-21 R de las células hu acidad de este anticuerpo para bloquear la activación depen 1 en la sangre humana se probó en uno de los donadores huma uras 53A-53B muestran la inhibición efectiva (en comparació trol de lgG1 Hu) de la activación dependiente de IL-21 de l stbles a IL-21 por los anticuerpos.
Estos resultados definen los métodos para medir la re 1 en las muestras de sangre humana completa; así, este ensa zarse para detectar la inhibición de la activación dependiente de anticuerpos anti-IL-21 R en entornos experimentales o clínicos, el ensayo no requiere más sangre que la que puede recole era rutinaria e involucra manipulación ex vivo mínima.
EJEMPLO 12.2 bridge, MA. Las muestras se mantuvieron a temperatura am epto en donde se indique de otra manera, se procesaron en el tr na hora de la recolección. Cuando las muestras se trataron con inmunoglobulina e IL-21 , el reactivo de inmunoglobulina se agre la adición de la IL-21. Las muestras se incubaron a 37°C en un I ma Scientific Reach-ln Modelo # 3956 por la duración indicada mi clan completamente a aproximadamente 7 RPM utilizando un torio Rotamix (# de Catálogo RKVS) de Appropriate Technical R (ATR) (serie #0995-52 y #0695-36), o utilizando el Agitador/Gi 0 Labquake® (# de Catálogo 400110) durante la in teriormente, 0.5 mL de cada muestra se retiraron y se agr rotubos de 2.0 mL (Axygen Scientific, # de Catálogo 10011-7 tienen 1.3 mi de RNAIater®, que se proporciona con el Kit par ana RiboPure™ (Ambion, # de Catálogo AM1928) y se pletamente mediante cinco inversiones completas. Sigui troles endógenos (GAPDH, GUSB, ZNF592 y PGK1 en la Figur zaron como "normalizadores", debido a que la expresión de est cambia con el tratamiento y los genes proporcionaron los valore sistentes a través de todas las muestras. Los valores Ct de lo erimentales (sin AbS y sin IL-21 agregada), se utilizaro ibradores". La expresión de un gen en una muestra dada se calc el gen - Ct del promedio de los controles endógenos para esa t de la muestra). El valor de la expresión del gen (AACt) se calc de la muestra - ACt del "calibrador". La cuantificación relativa ( es de cambio se calcularon como 2' áC[.
Con el fin de determinar el tiempo y la dosis ópti amiento con IL-21 para la generación de una señal máxima, las sangre completa de cinco donadores sanos se incubaron en la 3.3, 10 ó 30 ng/ml de IL-21 durante 2, 4, 6 ó 24 horas. El ARN puesta ex vivo a IL-21 fueron: dos horas de estimulación con 10 1. Los genes sensibles a IL-21 más confiables fueron GZ 1 RA, IL-6 y PRF1.
Para determinar la dosis de AbS para bloquear óptimar etos de IL-21 , las muestras de cuatro donadores individ incubaron durante 2 horas a las concentraciones indicadas pa 1TM, ambas diluidas en PBS, antes de la adición de 10 ng/ml pués de la adición de IL-21 , las muestras se incubaron durante dónales.
La adición de 0.1 pg/mL de AbS resultó en la inhibición manera que se utilizaron 0.003 pg/mL de AbS para los exp teriores. AbS, pero no IgGUM, inhibieron la respuesta de todo es probados en los cuatro donadores, como se demuestra en la -56C. La CI5o para todos los seis genes se presenta en el Cuadr ueó de manera exitosa los efectos de 10 ng/mL de IL-21 en la gen. Esta inhibición se redujo cuando la concentración de Ab os <0.003 pg/mL (20 pM). GZMB, IFNy, IL-2R<x, IL-6 y PRF arcadores de sangre confiables de IL-21 R/IL-21 y la activ icuerpo a las 2 horas; sin embargo, todos los seis genes (GZ Ra, IL-6, PRF1 y CD19), se identificaron como biomarcadores d ana útiles para la actividad de IL-21 R/IL-21. Además, 10 ng/mL traron disminuir la expresión del gen del gen TBX-21 en el mism ta disminución se invirtió completamente por AbS a 0.03 pg/mL ( strados).
EJEMPLO 13 PK y PD de AbS y AbT en macacos de Java machos riles, libres de nucleasa de 2 mL (Axygen, # de catálogo 10 - ron con el vehículo (L-histidina 10 mM, sacarosa al 5%), 50 n 1 humana recombinante (rhulL-21), 50 ng/mL de rhulL-21 con a ontrol de IgG 30 nM, o 50 ng/mL de rhulL-21 con el anticuerpo an nM durante 4 horas a 37°C en un agitador de plataforma. acos hembra, las muestras de sangre completa (0.5 mL), se trat ehículo o 20 ng/mL de rhulL-21. Las células mononucleares d férica y las muestras de sangre se aislaron mediante el método acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE He ll-Paque™ plus) y se lavaron una vez en PBS.
El aislamiento del ARN se realizó utilizado el Kit de Pure™ (Ambion, # de Catálogo AM1928; machos) o el kit de gen, hembras), de acuerdo con las instrucciones del fabrica imiento del ARN se determinó utilizando un espectrofotómetro N 0 A (NanoDrop, Wilmington, DE), y la calidad del ARN se valoró caco de Java. Cada reacción de síntesis del ADNc se mezc zcla Maestra para PCR 2x TaqMan® (Applied Biosystems, # de 4437), y 100 pL se cargaron en una tarjeta TLDA. Las tarjetas cesaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la am realizó utilizando un Sistema de Detección de la Secuencia A 0HT. Los parámetros del ciclado utilizados para cada corrida fue ue: 50°C durante 2 minutos, 95°C durante 10 minutos y 40 ciclo ante 15 segundos, seguido por 60°C durante 1 minuto. Los um lo (CT) se calcularon utilizando al Programa de Detección de la rsión 2.3, Applied Biosystems).
Para los macacos hembra, la RT-PCR cuantitativa Taí R , solo se realizó utilizando cebadores y sondas precalifica R (Applied Biosystems; los mismos cebadores y sondas de IL ellos en la TLDA a la medida para los macacos machos).
Para machos hembras la cuantificación relativa Los macacos machos cuya sangre mostró una expre de varios genes relacionados con la función inmune cuando se ivo con IL-21 en comparación con el vehículo (RQ>1.5), se sele la inclusión en este estudio. Los valores de RQ de cinco genes 1 R, PRF1 , GZMB e IL-6) para nueve macacos seleccionados dios descritos a continuación, representados por el número del Animal), se muestran en el Cuadro 31. El número del gru resenta si los animales seleccionados se trataron con AbS (Grup upo B), o IgG de control (Grupo C) en los experimentos posterio ales 10-13 no se seleccionaron para estudios adicionales.
CUADRO 31 antificación relativa (RQ) de la expresión de los genes induci ción ex vivo de IL-21 a sangre completa obtenida de macacos machos Se determinó que IL-2Ra tienen la magnitud más gra alta) y el cambio más consistente (porcentaje más alto de ani ían RQ>1.5) en la expresión del gen inducida por IL-21 de I luados, y por lo tanto, se considera el mejor gen único para vidad farmacodinámica (PD) de los anticuerpos anti-IL-21 R. Las sangre completa de todos los macacos incluidos en el estudi ían valores de RQ de IL-2R mayores que 1.5 después de la esti vivo con IL-21. Sin embargo, se observó una variabilidad in ificativa en los valores de RQ de IL-2Ra, con valores que varían .
Para obtener un número mayor de muestras acterización de la distribución de la respuesta de IL-2Ra a rhuIL ayo ex vivo, las muestras de sangre se obtuvieron de 24 macaco bra adicionales, estimulados ex vivo con rhulL-21 , y se analizaro IL-21. El valor mediano de RQ de IL-2Ra (n=37) fue 3.2 y el Ínte 1.5-8.1.
Los valores de RQ para la expresión de IL-2Ra obteni a basal de 37 macacos fueron transformados con logarit ribucion de los valores de RQ y log {RQ} se probó en las po malidad de Shapiro-Wilk y D'Agostino & Pearson (GraphPad phPad Software Inc). La hipótesis de la normalidad se rechaz ribucion de RQ (p<0.05) pero no para la distribución de log {RQ} a la prueba de Shapiro-Wilk y p = 0.48 para la prueba de D'A rson). Los valores de RQ transformados con el logaritmo se aju istribución normal (R2=0.69) utilizando el programa GraphPad Pri ribucion de los valores de RQ de IL-2R RQ y la transformaci ritmo (log2) de los valores de RQ obtenidos en el ensayo ex os los 37 macacos (n=13 machos; n=24 hembras), se muestr ales que responden a la estimulación con IL-21. Los anim res de RQ de más de 2.3 (-81 %; 30 de 37) se definieron com ales que responden y se consideró que satisfacen el criterio de el estudio de la PD de los anticuerpos anti-IL-21 R.
Para confirmar que la expresión del gen inducida por I endiente de la captación del IL-21 R de macaco de Java, las mu gre completa del macaco se incubaron de manera simultánea co un anticuerpo anti-IL-21 R (AbT; 30 nM) antes del aislamiento del lisis de expresión del gen. Como se esperaba, la adición ex viv manera simultánea con IL-21 , inhibió fuertemente los cambi resión del gen inducida por IL-21 en el ensayo de sangre com ir, valor de RQ <1.5; Figura 57C).
EJEMPLO 13.2 Diseño del estudio para experimentos in vivo Las muestras de sangre (-7.0 ml_) para la determina vidad PD (todos los tres grupos) se recolectaron en tubos que to de sodio como el anticoagulante. Las muestras de sangre ( la determinación de las concentraciones en suero de AbS o AbT luación de los anticuerpos anti-producto se recolectaron en t coagulante, se dejaron coagular a temperatura ambiente ximadamente 15 minutos y se procesaron para la recolección iante centrifugación. El programa de recolección de la mu cribe en el Cuadro 32. Después del día 50, se agregaron p ición de muestreo para los animales 1 y 3 en el grupo del AbS ( a demostrar la reversibilidad de la actividad PD. El día 1 , tambié o la "administración de la dosis", es el día en el cual los anticu inistraron a los macacos. "Predosis" se refiere al tiempo de re la muestra antes de la administración de la dosis, y "postdosis" se o de recolección de la muestra des ués de la administración de CUADRO 32 iseño del estudio in vivo y recolección de la muestra en maca Java machos Grupo (Dosis ) Tiempo (días) Recolección Animal # muestra , AbS (10 mg/kg, IV) -13, 1 (preD y 5 minutos Animales 1 Animales 1-3 postdosis), 2, 8, 15, 22, 36, 50 71 , 92c Animal 3 92, 106, 113, 134, 148° Animal 1 t AbT (10 mg/kg, IV) -13, 1 (pre y 5 minutos Animales Animales 4-6 postdosis) 2, 8, 15, 22, 36 C, Control IgG (10 -13, 1 (pre y 5 minutos Animales mg/kg, IV) postdosis) 2, 8, 15, 22, Animales 7-9 36 Para los Grupos A y B, el suero se recolectó para v centraciones del artículo de prueba y los anticuerpos anti-prod gre completa se recolectó para el ensayo de PD ex vivo. Para el o se recolectaron las muestras de sangre completa.
EJEMPLO 13.3 Concentraciones en suero de AbS y AbT Para determinar las concentraciones en suero de AbS zaron los ELISA descritos en el Ejemplo 10. Los estudios de cacos de Java descritos en el Ejemplo 10 indicaron que despué administración i.v., AbS se eliminó de manera marcadamente m comparación con AbT. En este estudio, el muestreo extenso uerido para la determinación de un conjunto completo de param se realizó debido al volumen de muestra relativamente grande a el ensayo PD y las limitaciones de los volúmenes de sangre qu olectarse de cada macaco de Java individual. Las muestras erminación de las concentraciones de anti-IL-21 R en suero se amente en aquellos puntos de medición en los cuales la activid ró para permitir la correlación entre las concentraciones en s ales dosificados con AbS (Figura 58). Sin embargo, en el día 36 tos de medición posteriores, las concentraciones en suero de A al 2 declinaron rápidamente (a -0.6 pg/mL) en comparación con los animales 1 y 3 (a -2 pg/mL). En el día 50, el animal 2 no t ctable en suero (menos que el LOQ de 30 ng/mL), mientras ales 1 y 3 tenían concentraciones en suero de AbS de -0.9-1 pg/ i/2 estimada del AbS fue más corta para el animal 2 (-6.2 paración con aquélla para los animales 1 y 3 (-12 y ectivamente).
Como se espera basándose en los estudios de PK pués de una administración de una sola dosis de 10 mg/k centración en suero de AbT declinó de manera marcadamente m comparación con aquélla de AbS (Figura 58). Los tres ificados con AbS tuvieron perfiles de concentración-tiempo y valor (véase, por ejemplo, el Ejemplo 10).
CUADRO 33 ncentraciones máxima y última detectable y vida media de eli pués de la administración de 10 mg/kg IV de AbS y AbT a ma Java machos rupo Animal C máxima ti/2 (días) Cúltima (AbS) 1 200 12 0.91 2 139 6.2 0.56 3 153 14 0.37 Media 164 11 0.61 SD 32 3.9 0.27 (AbT) 4 145 2.5 0.36 5 155 2.3 0.26 6 201 2.1 0.25 Media 167 2.3 0.29 SD 30 0.16 0.06 xima Concentración a los 5 minutos (también referida como C5m¡n), EJEMPLO 13.4 Respuesta PD de AbS y AbT en macacos de Java machos El ensayo de sangre completa ex vivo para la detecci ición de la expresión inducida por IL-21 por los anticuerpos an como se describió en el Ejemplo 12.1. Para todos los nueve tados en este estudio, cada muestra de sangre completa pr dosis se dividió en cuatro alícuotas de 1.5 mL La primera y otas se trataron con IL-21 humana recombinante o con vehí rador para los cálculos de RQ), y se utilizaron para valorar si el ar ba circulante afectaba la expresión del gen IL-2Ra inducida por ivo (es decir, la actividad PD). La tercera alícuota se trató con IL- ticuerpo anti-IL-21 R (30 nM), y la cuarta alícuota se trató con IL- nticuerpo de control de IgG (control negativo para el anticuerp ). La tercera y cuarta alícuotas se utilizaron para valorar si la inhi la administración de la dosis y persistió hasta el día 22 para el ani nos hasta el día 50 para los animales 1 y 3, cuando las concentra ro de AbS estaban en, o por encima de 6 nM (0.9 pg/mL) par cacos (las Figuras 59A-59C y el Cuadro 33). Ex vivo la exp Ra inducida por IL-21 regresó a los valores predosis (es decir, la se perdió) en el día 92 para los animales 1 y 3, coincidente con l medición en los cuales las concentraciones en suero fueron <LO y 59C). Para el animal 2, la actividad PD se perdió en el día 3 oncentración en suero de AbS declinó a un nivel relativamente b (0.6 pg/mL). Para todos los puntos de medición examinado udio, la actividad PD de AbS apareció toda o ninguna, de manera camente una inhibición completa de la expresión del gen IL-2Ra IL-21 (RQ <1.5), o una falta de inhibición (RQ similar a aqu estra predosis correspondiente). Una respuesta PD parcial fue renciar, debido a la variabilidad intraanimal observada en los v <1.5), cuando las concentraciones en suero de AbT estaban e ma de 1.3 pg/mL (Figuras 60A-60C y Cuadro 33). La activida ió (RQ >1.5) en el día 15 para todos los tres macacos. En las angre obtenidas en el día 15 de los animales 5 y 6, los valores d R parecieron similares a los valores predosis correspondientes ( ida completa de la actividad PD) y las concentraciones en suero on menores que 1.8 nM. Hubo una respuesta PD parcial en las angre obtenidas en el día 15 del animal 4, puesto que el valor d R RQ observado de 2.7 fue menor que aquél en la predosis (R l punto de medición del día 22 posterior (RQ=5.3; Figura 60A). mbién tuvo una \ 2 estimada ligeramente mayor y una concentr ro de AbT algo más alta en el día 15 (-2.5 nM), en comparació ales 5 y 6 (Figuras 60A-60C). Estos datos sugieren que la Cmi esaria para mantener la actividad PD fue de aproximadamente 2.5 l n r l l i ti o la ex resión d l ectivamente. En el punto de medición del día 15, la activida ía perdido completa o parcialmente en los tres macacos dosifica , mientras que todos los tres macacos en el grupo de la dosis n concentraciones en suero de AbS relativamente altas (-6.0-7. a actividad PD completa. Así, el AbS tuvo una duración más lar idad PD y una ti 2 más larga en macacos de Java.
EJEMPLO 13.5 Respuesta del anticuerpo anti-producto En el primer punto de medición en donde se observó la actividad PD, la adición ex vivo de un anticuerpo anti-IL-21 R, sir rhulL-21 , inhibió la inducción de la expresión del gen IL-2R (RQ s los macacos dosificados con AbS y AbT, indicando que el regr esión del gen inducida por rhulL-21 estaba mediado a través de I o del AbS y todos los tres animales (4-6) en el grupo de AbT arrollado anticuerpos neutralizantes anti-producto.
La presencia de anticuerpos anti-AbT neutralizantes ales dosificados con AbT se confirmó utilizando un ensayo basa citométrico ortogonal (FACS). TF-1 y TF-1/rhulL-21 R (célul sfectadas con rhulL-21 R) se cultivaron en medio RPMI que co i de huGMCSF (R&D Systems). Los cultivos de células conflu trifugaron a 300 g durante 10 minutos, se resuspendieron en m uero OptiMEM (Invitrogen Corporation) a 106 células/mL, y se inc durante 2 horas. Las células se lavaron entonces en PBS/BS se resuspendieron en amortiguador de PBS enfriado con hi tuvieron en hielo hasta la tinción. Para determinar la EC50 p ina y la unión de AbT-biotina a las células TF-l/rhulL-21 R, las cél -1/rhulL-21 R parentales (105 células por prueba) se incub -biotina, o con el control de IgG-biotina utilizando diluciones de 3 La dilución requerida mínima (MRD) para probar las mu ro en este ensayo se determinaron como de 1 :6 en PBS/BSA a probar la inhibición de AbT-biotina a las células TF-1/rhulL-21 R a la presencia de la actividad neutralizante), las células TF-1/rhul incubaron con suero de macacos dosificados con anti-IL-21 R ( ciones de 3 veces en serie empezando en la MRD), se tiñeron co -biotina (a la concentración EC50 estimada), se lavaron en PB , se tiñeron con estreptavidina-APC, y se analizaron para la G escribió anteriormente. Cada muestra de suero se corrió por dup experimentos individuales, y el valor de GMFI promedio para l licas se obtuvo para cada punto de dilución. El valor de GMFI rel a muestra de suero para cada punto de dilución se calculó utiliz uía [100% * GMFI promedio/GMFI promedio predosis]. Una m sideró positiva si el valor de GMFI relativo era menor que, o igu la MRD. Para las muestras positivas, el logaritmo del título s CUADRO 34 ormación de los anticuerpos neutralizantes a n ti -AbT (logarit IO) después de la administración de 10 mg/kg i.v. de AbT a m de Java machos Puesto que sólo uno de los animales dosificados con Ab encia de anticuerpos neutralizantes anti-AbS en el ensayo de la gen IL-2Ra ex vivo, las muestras en suero de los macacos dosific se probaron en un ensayo basado en perlas param troquimioluminiscente, descrito en el Ejemplo 1 1.5 que detecta cuerpos anti-AbS neutralizantes como no neutralizantes. En este muestras de suero se coincubaron con AbS biotinilado y pectivamente. Así, entre los tres animales dosificados con AbS, uvo la ti 2 más corta y el inicio más rápido y el título más a puesta del anticuerpo anti-AbS. El animal 2 también fue el únic ificado con AbS que mostró evidencia de una respuesta de an i-AbS neutralizantes en el ensayo de expresión del gen IL-2Ra ilar a todos los tres macacos dosificados con AbS.
CUADRO 35 rmación de anticuerpos anti-AbS (logaritmo del título) despu administración de 10 mg/kg i.v. de AbS a macacos de Java m TIEMPO ANIMAL 1 ANIMAL 2 ANIM (DÍAS) Predosis Negativo Negativo Nega 15 Negativo Negativo Nega 22 Negativo Negativo Nega 36 Negativo 2.13 Nega 50 Ne ativo 3.43 Ne a EJEMPLO 14 y PD de los anticuerpos anti-IL-21R adicionales en macacos La farmacocinética de AbV, AbU y AbW se examinó de sola dosis i.v. (10, 10 y 1 mg/kg, respectivamente) a los macacos exposición a la proteína y los parámetros PK se compararon con l iniciales obtenidos con AbS y AbT (Cuadro 36 y Figura 61). Los nalíticos y los cálculos de la PK se realizaron como se describió T en el Ejemplo 13.
Para todos los compuestos, hubo una variabilidad int ificativa en la fase terminal, relacionada probablemente con el ini ación de los anticuerpos anti-producto. Después de una sola do kg i.v. a macacos, AbV y AbS parecieron tener concentraciones m o y parámetros PK similares. Después de una sola dosis i.v. a y AbS parecieron tener la CL media más lente, la /2 media má macacos de Java (véase también el Ejemplo 10.10). ministraci n i.v. de los anticuerpos anti-IL-21R humanos a macacos de Java n exposición a la proteína, n=3 por grupo de dosis, a menos que se indique de r unto de medición des ués de la administración IV En el mismo estudio, la actividad PD de AbU-AbW (Ab l) en macacos se examinó utilizando el ensayo de la expresión cida por rhulL-21 ex vivo (descrito en el Ejemplo 13).
A los cinco minutos, el primer punto de medición del -AbW tuvo actividad PD en todos los macacos, es decir, mo bición completa de la expresión del gen inducida por rhulL-21 en e angre completa ex vivo, similar a los datos obtenidos para AbS y idad PD se perdió con la eliminación de AbU-AbW del suero.
EJEMPLO 15 armacocinética de AbS después de la administración intraver macacos de Java machos y hembra expuestos al toxoide teta La PK de AbS se examinó después de una sola admi tres veces a la semana de 2 ó 10 mg/kg de AbS a los macacos centración media a los 5 minutos después de la 1 a dosis (C5m¡n is (Cdiai4, 5 min) , así como la exposición media después de la Cdíai -dia2i) se incrementó con el nivel de la dosis. En el gr kg, la C5min media fue de 28.4 ± 2.50 pg/mL, la Cdíai4, 5m¡n medi ± 11.0 pg/mL y la AUCdiai 4 día2i media fue de 1279 ± 592 pg»hr/ o de 10 mg/kg, la C5m¡n media fue de 120 ± 59.9, la Cdiai4, smin 52 + 21.9 pg/mL y la AUCdiai 4 día2i media fue de 7700 ± 782 pg»h media de la eliminación (ti/2) después de la tercera administraci fue de 25.6 ± 22.7 y 168 ± 56.5 horas en los grupos de 2 y 1 ectivamente (p = 0.0002) (Figuras 62A-62B).
En el grupo de 2 mg/kg, las concentraciones de AbS d damente después de la tercera administración i.v.f y todos acos resultaron positivos para los anticuerpos anti-AbS en el día anas después de la tercera dosis) hasta el final del estudio, en l /2 relativamente corta Fi ura 62A . En el ru o de 10 m /k d EJEMPLO 16 dicción de la farmacocinética de AbS y AbT en humanos des una sola administración Para predecir la PK de AbS y AbT en humanos, se utiliz edimientos. Para el primer procedimiento, se supuso que los pa (tales como CL y el volumen de distribución) de un Ab anti-IL-21 anos, sería similar a aquéllos en los macacos de Java. Para el edimiento, se utilizó una escala alométrica para estimar los pa humanos basándose en los datos de los animales obtenidos de s y macacos de Java después de una sola administración i. cuerpo anti-IL-21 R. La escala alométrica de CL se realizó utili te para el potencial máximo de la duración de la vida (MLP) para S ajustes de peso del cerebro para AbT, de acuerdo con los critos previamente en Mahmood (1996) Eur. J. Drug eliminación (CL) y un volumen de distribución en estado est s) pequeño de AbS en los humanos. La CL predicha de AbS 2-1.3 mL/hr/kg y el Vdss estimado sería de -92.4-125 mL/kg. De dosis i.v. de 1 mg/kg de AbS a un sujeto humano de 60 kg, el esti xposición (AUC0.-) es de 1393 pg*hr/mL, basándose en el val nido por el método de la escala alométrica. Para AbT, e edimientos sugieren una CL mayor de -5-8.5 mL/hr/kg y un 5-202 mL/hr/kg.
EJEMPLO 17 tratamiento con AbS no afecta la enfermedad en el modelo de por lupus murino NZBWF1/J El anticuerpo anti-IL-21 R AbS se probó por su capaci administró solución salina (control del vehículo), CTLA-4lg (lgG2 trol positivo), anticuerpo anti-E.tenella (control del isotipo d ina), AbS, o un control del isotipo de anticuerpo humano (antic 1 humana con triple mutación) a una dosificación de 400 semana durante 10 semanas vía inyección i.p. Las muestras de aron cada dos semanas y se probaron para los anticuerpos anti- mediante ELISA. La orina se recolectó y examinó cada dos a los niveles de proteína utilizando Albustix (Bayer HealthCare, T . Todos los grupos de animales tuvieron niveles similares de prot io del estudio, y el grado de proteinuria se escaló en la soluci i-E.tenella y el control de hlgGITM durante el curso del estudi ). El tratamiento con la proteína CTLA-4lgr que había viamente aliviar la enfermedad en este modelo, evitó el desa teinu a incrementada en esos ratones. En contraste, el tratam no afectó el desarrollo de la proteinuria en ratones NZBWF1/J c EJEMPLO 18 Efectos del tratamiento con anticuerpos anti-IL-21 R en un m semiterapéutico de ratón de la artritis inducida por colágeno Los anticuerpos AbS y AbT se probaron por su capaci cir la enfermedad en un modelo murino de la artritis inducida por la artritis reumatoide. Los ratones DBA/1 hembra se inm dérmicamente en la cola con 100 mg de colágeno de bovino d lsificado en adyuvante completo de Freund, y a continu rzaron con 100 mg de colágeno bovino del tipo II emulsifi uvante incompleto de Freund, 21 días más tarde en el mis pués de la segunda inmunización con colágeno del bovino del ti s se examinaron para la hinchazón y se calificaron para la sev escala de 0-16, con 0 que representa sin hinchazón y 16 q rmedad severa. Una vez que 10% de los animales en el trol del isotipo en el día final del estudio fue menor de 4, en una 6 (Figura 66C). Además, aunque el tratamiento con el contro NFRII-Fc redujo la enfermedad en este estudio, las di adísticamente significativas en la severidad de la enfermedad ervaron entre este grupo de tratamiento y la enfermedad del gru el control del isotipo en el día 22 después de la dosifica amiento con el anticuerpo IL-21 R anti-ratón (D5) o con los anticue 1 R humanos (AbS y AbT) tampoco afectó la severidad de la en este estudio (Figuras 66A-66B).
EJEMPLO 19 rueba de los efectos del anticuerpo en la formación de la res mnésica del anticuerpo a la inmunización del tétanos en mac Java e IgG antitetánicos mediante ELISA. Cuarenta y tres días desp unización primaria, los grupos de macacos de Java machos y 3 asignaron de manera aleatoria y se les administró solució ículo), 2 mg/kg de AbS, o 10 mg/kg de AbS como un bolo i.v le a braquial/cefálica o safena a un volumen de la dosis de ml/kg (e 2 mi de vehículo) 1X/semana durante 3 semanas. Veinticuat pués de administrar la primera dosis de AbS o el vehículo, los ma unizaron una segunda vez con 0.5 mi de toxoide tetánico en d idas igualmente (0.25 mi), intramuscularmente, y la sangre se anera rutinaria y se examinó para los títulos de los anticuerpos antitetánicos mediante ELISA. Los anticuerpos del tétanos de I uero fueron detectables en los macacos de Java machos y hem scurso de 14 días después de la inmunización con el toxoide ura 67A). Los títulos de IgM en suero específicos del tét biaron después de la inmunización secundaria con el toxoide te ación de las respuestas amnésicas del anticuerpo para el toxoid zando este protocolo de tratamiento (Figura 67B).
Equivalentes Aquellos con experiencia en la técnica reconocerán aces de determinar, utilizando no más que la experimentación hos equivalentes de las modalidades específicas de la invención la presente. Tales equivalentes pretenden estar abarcados ientes reivindicaciones.

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- El uso de una proteína de unión o fragmento que ígeno de la misma, que se une de manera específica al IL-21 R a preparar un medicamento para tratar o prevenir un trastorno el IL-21 R en un sujeto, en donde la proteína de unión o el fragm une al antígeno de la misma, comprende al menos una secu inoácidos que es al menos aproximadamente 95% idéntica uencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la s: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 4 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 8 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, , 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 4. - El uso como el que se reclama en la reivindicad de la proteína de unión o el fragmento que se une al antígeno es u 5. - El uso como el que se reclama en la reivindicad de la proteína de unión o el fragmento que se une al antígeno es u 6. - El uso como el que se reclama en la reivindicaci de la proteína de unión o el fragmento que se une al antígen . 7. - El uso de una proteína de unión o fragmento que s geno de la misma, que se une de manera específica al IL-21 R preparar un medicamento para tratar o prevenir un trastorno el IL-21 R en un sujeto, en donde la proteína de unión o el fragm une al antígeno de la misma, comprende al menos una secu noácidos codificada por una secuencia nucleotídica que es a ximadamente 95% idéntica a una secuencia nucleotídica seleccio o que consiste de las SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 2 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 8 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, , 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, , 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165-168, 171-193, 213-229, 240, y 248. 9.- El uso de una proteína de unión o fragmento que igeno de la misma, que se une de manera específica al IL-21 R a preparar un medicamento para tratar o prevenir un trastorno el IL-2 R en un sujeto, en donde la proteína de unión o el frag une al antígeno de la misma, comprende al menos una secu inoácidos que es al menos aproximadamente 95% idéntica uencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la s: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 4 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 8 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, nos aproximadamente 95% idéntica con las secuencias de ami ccionadas del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 14, 16, 1 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 6 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, , 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, , 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, , 171-193, 213-229, 240, 242, 244, 246 y 248. 10.- El uso de una proteína de unión o fragmento que ígeno de la misma, que se une de manera específica al IL-21 R a preparar un medicamento para tratar o prevenir un trastorno el IL-21 R en un sujeto, en donde la proteína de unión o el frag une al antígeno de la misma, comprende al menos una secu inoácidos codificada por una secuencia nucleotídica que es oximadamente 95% idéntica a una secuencia nucleotídica selecci po que consiste de las SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 2 NOs: 5, 7, 9 y 1 1 , entonces la proteína de unión o el fragmento q antígeno, también deben comprender al menos una secu inoácidos codificada por una secuencia nucleotídica que es oximadamente 95% idéntica a las secuencias nucleotídicas sele grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 2 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 6 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, , 113, 1 15, 117, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 , 239, 241 , 2 . 11.- El uso como el que se reclama en la reivindicac de la proteína de unión o el fragmento que se une al antígeno c enos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo qu las SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 3 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 7 prender también al menos una secuencia de aminoácidos q nos aproximadamente 95% idéntica con las secuencias de ami ccionadas del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 14, 16, 1 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 6 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, , 108, 1 10, 1 12, 1 14, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, , 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, , 171 -193, 213-229, 240, 242, 244, 246 y 248. 12.- El uso de una proteína de unión o fragmento que ígeno de la misma, que se une de manera específica al IL-parar un medicamento para tratar o prevenir un trastorno asocia 1 R en un sujeto, en donde la proteína de unión o el fragmento q ntígeno de la misma, comprende una cadena ligera y una caden n donde la cadena pesada comprende al menos una secu inoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 6 76, 78, 80, 82, 84, 86, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 214-217, , 246 y 248. 14. - El uso como el que se reclama en la reivindicació de la proteína de unión o el fragmento que se une al antígeno co dominio V|_ y un dominio VH, y en donde el dominio VH comp os una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las s: 14, 16, 18 y 20. 15. - El uso como el que se reclama en la reivindicació de la proteína de unión o el fragmento que se une al antígeno co dominio VL y un dominio VH, y en donde el dominio VH com os una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las s :22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 5 62, 64, 66, 215, 217, 221 , 223, 225, 227 y 229. 16. - El uso como el que se reclama en la reivindicación ? que consiste de AbA-AbW, H3-H6, L1 -L6, L8-L21 y L23-L arar un medicamento para tratar o prevenir un trastorno asocia 1 R en un sujeto, en donde la proteína de unión o el fragmento qu ntígeno, inhiben de manera competitiva la unión de una proteína ccionada del grupo que consiste de AbA-AbW, H3-H6, L1-L6, -L25 al IL-21 R humano. 18.- El uso como el que se reclama en la reivindicació de la proteína de unión o el fragmento que se une al antíge ma, comprende una cadena pesada, una cadena ligera o un fragr comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del g siste de las SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 3 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 7 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 1 12, , 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 1 , 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165-168, 171-193, 213-229, , 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 117, 1 19, 121 , 123, 125, 1 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 1 , 239, 241 , 243, 245 y 247. 20. - El uso como el que se reclama en la reivindicació de la proteína de unión se une de manera específica a un epito que es reconocido por AbO, AbP, AbQ, AbR, AbS, AbT, AbU, , y en donde la proteína de unión inhibe de manera competitiva bO, AbP, AbQ, AbR, AbS, AbT, AbU, AbV y/o AbW al IL-21 R hu 21. - El uso como el que se reclama en cualquier indicaciones 1 , 9, 12, 13 y 17, en donde el trastorno asociado c se selecciona del grupo que consiste de trastornos autoi diciones inflamatorias, alergias, rechazo de transplantes, y tr rproliferativos de la sangre. 22. - El uso como el que se reclama en la reivindicació de el trastorno asociado con el IL-21 R se selecciona del g mento que se une al antígeno de la misma, inhibe la proliferaci las BAF3 mediada por la IL-21 con una Cl50 de aproximadament enos, y en donde las células BAF3 comprenden un receptor d ana. 25. - El uso como el que se reclama en cualquier indicaciones 1 , 9, 12, 13 y 17, en donde la proteína de u mento que se une al antigeno de la misma, inhibe la proliferaci las TF1 mediada por la IL-21 con una CI50 de aproximadamente nos, y en donde las células TF1 comprenden un receptor de ana. 26. - El uso como el que se reclama en cualquier indicaciones 1 , 9, 12, 13 y 17, en donde la proteína de u mento que se une al antígeno de la misma, inhibe la proliferación la IL-21 de las células B primarias humanas con una oximadamente 1.9 nM o menos, y en donde las células B compr 28. - Un método in vitro para determinar si un anticuerp es un anticuerpo anti-IL-21 R terapéutico, que comprende los p poner en contacto una primera muestra de sangre de un sujet do de la IL-21 ; (b) determinar un nivel de expresión de al meno sible a la IL-21 en la primera muestra de sangre puesta en conta do de la IL-21 ; (c) poner en contacto una segunda muestra de s to con el ligando de la IL-21 en la presencia de un anticuerpo an determinar el nivel de expresión de al menos un gen sensible a la egunda muestra de sangre puesta en contacto con el ligando d la presencia del anticuerpo anti-IL-21 R y (e) comparar los ni resión de al menos un gen sensible a la IL-21 determinado en l y (d), en donde el cambio en el nivel de expresión de al meno sible a la IL-21 indica que el anticuerpo anti-IL-21 R es un a péutico. 29. - El método in vitro de conformidad con la reivindic ulación en el nivel de expresión de al menos un gen sensible a la muestra de sangre de un sujeto. 32. - El método in vitro de conformidad con la reivindic cterizado además porque la detección de la modulación en el resión de al menos un gen sensible a la IL-21 comprende los pas er en contacto una muestra de sangre de un sujeto previament el anticuerpo anti-IL-21 R con un ligando de la IL-21 ; (b) dete l de expresión de al menos un gen sensible a la IL-21 en la m gre del sujeto previamente tratado con el anticuerpo anti-IL-21 R ontacto con el ligando de la IL-21 ; y (c) comparar el nivel de exp enos un gen sensible a la IL-21 determinado en el paso (b) con e resión de al menos un gen sensible a la IL-21 en una muestra d rentes puesta en contacto con el ligando de la IL-21 , en donde la angre diferente es de un sujeto no tratado con el anticuerpo anti-I 33. - El método in vitro de conformidad con la reivindic 35.- El método in vitro de conformidad con la reivindic cterizado además porque al menos un gen sensible a la IL-21 es
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