KR101482959B1

KR101482959B1 - Ｂ-세포 만성 림프구성 백혈병의 진단 및 치료에 유용한 종양 세포에서 세포사멸을 유도할 수 있는 약학 조성물

Info

Publication number: KR101482959B1
Application number: KR1020097015727A
Authority: KR
Inventors: 호세 엔리께 몬테로 카시미로; 루비 알론소 라미레스; 롤란도 페레스 로드리구에스
Original assignee: 센트로 데 인뮤놀러지아 모레큘러
Priority date: 2006-12-26
Filing date: 2007-12-24
Publication date: 2015-01-15
Also published as: CN101678101B; AU2007336564A1; JO3016B1; MY154819A; US20100047242A1; RU2454245C2; EP2119453A1; PE20081841A1; AU2007336564B2; CN101678101A; ITTO20070944A1; KR20090122911A; EP2119453A4; PT2119453E; CA2676188A1; HK1140696A1; ES2542861T3; CA2676188C; CL2007003825A1; DK2119453T3

Abstract

본 발명은 면역학 분야, 특히 백혈구 분화 항원 CD6을 인지하는 인간화 단일클론성 항체를 포함하는 일족의 약학 조성물들에 관한 것이다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 목적은 림프증식 증후군(lymphoproliferative syndrome) 및 특히 B-세포 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL)을 진단하고 치료하기 위한 인간화된 항-CD6 단일클론성 항체를 포함하는 약학 조성물들을 제공한다. 본 발명의 본질은 CD6 항원을 인지하는 인간화 단일클론성 항체의 적용, 및 B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자 유래 악성 세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도할 수 있는 항체를 포함하는 일족의 약학 조성물의 적용에 있으며, 이로 인해 임상적 및 조직학적 항-종양 효과를 얻을 수 있다. 본 발명의 적용 분야는 종양 분야까지 확대되고 있다.

류마티스 관절염, 백혈구 분화 항원 CD6, 약학 조성물, 단일클론성 항체

Description

Ｂ-세포 만성 림프구성 백혈병의 진단 및 치료에 유용한 종양 세포에서 세포사멸을 유도할 수 있는 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CAPABLE OF INDUCING APOPTOSIS IN TUMOUR CELLS, USEFUL FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF B-CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA}

본 발명은 B-세포 만성 림프구성 백혈병(B-cell chronic lymphocytic leukemia, CLL)의 치료에 유용한 약학 조성물들로서, 종양 세포들에서 세포사멸(apoptosis)을 유도할 수 있는 백혈구 분화 항원 CD6을 인지하는 인간화 단일클론성 항체를 포함하는 약학 조성물들에 관한 것이다.

단일클론성 항체(MAb)의 치료학적 연관성이 의학 분야에서 입증되어 왔다. 특히 암에 있어서 MAb는 상이한 종류의 종양을 앓고 있는 환자에서 현재 모든 치료학적 의료 설비에 속한다(Weiner, L.M. 등, (2006) Hum Antibodies 15(3):103; Imai, K. 등, (2006) Nat Rev Cancer 6(9):714).

세포사멸(apoptosis)은 세포 죽음의 자연적인 생물학적 기작이지만, 치료학적으로 유도될 수도 있다. 세포사멸은 종양 세포 성장을 억제하고 몇몇 약제에 대해 주장되는 작용 기작을 구성하는 적절한 방법을 나타낸다. 여기서 상기 약제는 몇몇 종류의 종양을 앓고 있는 환자에서 치료용으로 사용되는 MAb를 포함한다. 결 과적으로, 세포사멸에 의해 중재되는 세포 죽음을 조장하는 성능을 갖는 약물에 대한 연구가 종양 의학(medical oncology) 분야와 관련이 있다(Cartron, G. 등, (2004) Blood 104:2635).

림프세포 증식 증후군(lymphoproliferative syndrome)들 및특히 B-세포 만성 림프구성 백혈병(B-CLL)은 현대의 건강 문제를 구성하고 있다. B-CLL은 서구 세계와 가장 높은 연관성을 갖는 백혈병이며, 치료 효과가 있는 치료제가 개발되어 있지 않다(Chiorazzi, N. 등,(2005) N Engl J Med 352(8):804; Herishanu, Y. 등, (2005) Transfus Apher Sci 32(1):85). 현재, 종양 세포들을 제거할 수 있는 mAb들의 사용은 환자에 있어서 적절한 치료학적 선택 사항이다(Robak, T. (2005) Transfus Apher Sci 32(1):33). 그럼에도 불구하고, CD52 및 CD20에 특이적인 MAb들의 사용에 기초한 이러한 접근법에 있어서 주요 단점으로 인해 각 개체의 정상적인 림프구의 제거 또한 유도하는 항-종양 치료 효과가 매우 제한적이다(Nuckel, H. 등, (2005) Eur J Pharmacol 514(2-3):217; Cartron, G. 등, (2004) Blood 104:2635). 특이적 인지의 결핍은 연장된 림프구 감소증(lymphopenia)을 증진시키는데, 이러한 림프구 감소증은, 암에 대한 고유의 특성으로 인해 빈번하게 발생하는 감염에 대해 이미 민감하게 반응하는 치료 환자에 있어서 상기 감염에 대한 위험 인자를 포함한다(Boye, J. 등, (2003) Ann Oncol 14(4):520; Cartron, G. 등, (2004) Blood 104:2635; Potter, M.(1999) 12(4):359; Ravandi, F. 등, (2006) Cancer Immunol Immunother 55(2):197).

B-CLL 환자 유래 종양 세포들은 정상적인 B 림프구의 특징인 세포 표면 마 커(cell surface marker, 예를 들어 CD19 및 CD20)들을 발현한다. 특히, 종양 세포의 발생은 백혈구 분화 항원 CD5를 동시 발현하는 말초 혈액 유래의 B 림프구들과 연관이 있다(Herishanu, Y. 등, (2005) Transfus Apher Sci 32(1):85). CD5는 말초 혈액에서 종양 세포 하위 개체의 정황상 마커만을 나타낼 수 있기 때문에 B-CLL 특유의 마커이만 이에 제한되지는 않는다. 그리고 상기 CD5가 골수에서 유래되는지, 아니면 골수외 공급원(extra-medullar source)으로부터 발생하는지에 대해서는 여전히 알려진 바가 없다(Caligaris-Cappio, F. 등, (2004) Hematol Oncol Clin N Am 18:849).

상기 백혈구 분화 항원 CD6은 제한적으로 연구되고 특성 분석이 거의 이루어지지 않은 분자이다. 표면 당단백질로서 상기 CD6는 T 림프구에서 주로 발현된다. 근본적으로, 이들 세포는 동시-자극 기능을 갖는 수용체를 포함하는 것으로 간주되지만, 이의 근본적인 기작은 공지되어 있다(Aruffo, A. 등, (1997) Immunol Today18 (10):498; Patel, D.D. (2000) J Biol Regul Homeost Agents 2000 14(3):234). 성숙한 흉선세포들에서 CD6의 발현은 이러한 림프성 기관(lymphoid organ)에서의 림프구 성숙 과정 동안에 세포사멸에 대한 이들의 내성과 연관되어 있다(Singer N.G. 등, (2002) Int Immunol. 14(6):585).

흥미롭게도, CD6 분자는 정상 개체의 말초 혈액에서 유래한 B 림프구의 소수 하위개체에서 발현되지만, 이들 세포에서 기원 및 기능적 특성에 관한 이해도는 제한되어 있다. 부가적으로, B-CLL 환자 유래 말초 혈액 단핵구 세포들은 또한 CD6 분자를 발현한다. 상기 CD6 분자는 CD5 분자와 동시에 발현되는 것으로 간주되지 만, 이러한 분자와는 달리 CD6은 결과적으로 B-CLL 환자에서 유래한 시료에서만 분석되었다.

더욱이, 특이성 단일클론성 항체에 대한 CD5 분자의 인지는 B-CLL 환자에서 유래한 종양 세포에서 세포사멸을 유도하지만, 단지 상기 종양 세포의 하위군에서만 세포사멸을 유도한다(Pers, J.O. 등, (2002) Leukemia 16:44).

상기 CD6 분자는 쥐(murine)의 MAb ior-t1A에 의해 인지된다. B-CLL 환자에서 유래한 시료를 이용한 이전 연구에서, 쥐(murine)의 MAb ior-t1A가 B 림프구에서 항-IgM 항체에 의해 유도된 세포사멸을 억제하는 것으로 밝혀졌다(Osorio, L.M. 등,(1997) Blood, 89(8):2833). 다른 한편으로는 이러한 쥐의 항-CD6 MAb의 치료 조성물들은 건선 치료 효과를 갖는다(Montero, E. 등,(1999) Autoimmunity 29(2):155).

결과적으로, 유전 공학법을 이용하여 T1h(유럽특허 제 0807125 호)로 명명된 쥐의 항-인간 CD6 MAb의 인간화 변형체가 수득되었다.

상기 인간화된 MAb T1h를 이용하여 본 발명자들은 말초 혈액 유래 종양 세포들에서 발현되고 B-CLL 환자 유래 골수 상에서 발현된 CD6 분자를 인지한다는 것을 발견하였다. 또한, T1h MAb는 또한 CD5 분자를 발현하지 않는 종양 세포를 인지하며, 이때, CD5 분자는 CD6을 CD5 하위 개체를 포함하는 종양 마커로 제조한다. 더욱이, 상기 인간화 단일클론성 항체 T1h는 B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자 유래 종양 세포에서 세포사멸을 유도하지만, 정상적인 림프구에서는 세포사멸을 유도하지 않는다.

본 발명의 신규성은 림프증식 증후군 환자, 특히 B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자에 적용하기 위한 항-CD6 단일클론성 항체를 포함하는 일족의 치료 조성물들에 있다. 놀랍게도, 상기 인간화 단일클론성 항체 T1h에 대한 CD6 분자의 인지는 상기 CD6 분자를 발현하는, 림프증식 증후군을 앓고 있는 환자에서 유래한 종양 세포에서 세포사멸을 유도하며, 특히 B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자 유래의 종량 B 림프구에서 세포사멸을 유도하여, 이러한 종류의 종양에서 T1h MAb의 치료학적 이용을 가능케 한다. 또한, T1h MAb 처리로 인해 방사선 요법, 화학요법제들 또는 기타 생물 요법과 인간화 단일클론성 항체 T1h의 복합적 사용을 조장할 수 있는 세포 독성 약물의 효과에 대해 악성 세포가 감작된다.

본 발명은 림프세포 증식성 질환(lymphoproliferative disorders)을 앓고 있는 환자에 효과적인 인간 항원 CD6을 인지하는 단일클론성 항체의 치료 조성물들에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 인간 백혈구 분화 항원 CD6을 인지하는 인간화 단일클론성 항체 T1h를 포함하는 약학 조성물들의 용도, 및 B-세포 만성 림프구성 백혈병을 진단하고 치료하기 위한 이들의 용도를 포함한다.

"인간화 단일클론성 항체"란 용어는 유럽 특허공보 제 0699755 호에 개시된 바와 같은 유전 공학법에 의해 수득된 단일클론성 항체를 지칭한다. 본 발명의 목적은 기탁 번호 제 ECACC 96112640 호로 기탁된 분비용 하이브리도마 IOR-T1A로부터 수득된 인간화된 MAb T1h를 포함하는 치료 조성물을 제공하는 것으로, 상기 치료 조성물은 하기 성분으로부터 선택된 임의의 약제 단독 또는 이들의 조합에 의해 상기 CD6 분자를 인지함으로써 B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자 유래 악성 세포들에서 세포사멸을 유도할 수 있다:

- 플루다라빈(fludarabine)과 같은 화학요법제들 및

- 항-CD20 항체들과 같은 악성 림프구의 표면 분자에 특이적인 단일클론성 항체.

또한, 본 발명의 약학 조성물들은 생리 완충액일 수 있는 적절한 부형제를 포함하고, 체중 당 0.05 내지 1mg/Kg 투여량 범위로 주사에 의해 투여될 수 있다. 다른 한편으로는, 본 발명은 상기 B-세포 만성 림프구성 백혈병을 진단하기 위해 사용되는 항-CD6 단일클론성 항체를 포함하는 진단 시약에 관한 것이다.

1. 인간화된 항-인간 CD6 단일클론성 항체 T1h를 포함하는 일족의 약학 조성물들

상기 인간화된 항-인간 CD6 단일클론성 항체 T1h는 유럽 특허 공개공보 제 0 807 125 A2 호에 개시된 바와 같이 기탁 번호 제 ECACC 96112640 호로 기탁된 분비용 하이브리도마 IOR-T1A로부터 수득하였다. 본 발명의 약학 조성물은 인간화 단일클론성 항체 T1h를 포함한다. 부가적으로, 이러한 조성물은 유럽 특허 공개공보 제 0 807 125 호에 개시된 바와 같이 적절한 부형제로서 생리 완충액을 포함하되, 상기 생리 완충액은 정맥 주사용으로 사용하기 위한 치료용 단일클론성 항체를 제조하기 위해 사용되는 다른 용액들과 유사하다. 본 발명의 상기 조성물은 단위 체중 당 0.05 내지 1mg/Kg의 투여량 범위로 주사에 의해 투여된다. 본 발명의 조성물은 단위 체중 당 0.05 내지 1mg/Kg의 투여량 범위로 주사에 의해 투여된다.

2. 인간화 단일클론성 항체 T1h의 특이적 인지의 특성화

B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자에서 유래한 말초 혈액 단핵구 세포 및 골수 세포들은 FITC-접합 항-인간 CD19 MAb로 염색한다. 이후에 세포를 비오틴에 접합된 항-인간 CD6 단일클론성 항체(T1h), PE-Cy5에 접합된 항-인간CD5(Pharmingen) 또는 비오틴에 접합된 항-인간 CD20(리툭시맵(rituximab, Rx)과 같은 단일클론성 항체와 함께 배양한다. 비오틴 접합 항체의 결합은 스트렙타비딘(streptavidin)-PE-Cy5.5 접합체를 이용하여 검출한다. 적어도 10,000개의 살아 있는 세포들을 유세포 분석기(Flow Cytometer FACScan)로 수득한다. 죽은 세포는 프로피디움 요오드 염색으로 제외시킨다.

3. B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자 유래 세포에 대한 인간화 단일클론성 항체의 항암 효과의 특성화

정상 개체 유래 말초 혈액 단핵구 세포 또는 B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자 유래 단핵구 세포를 0.1/mL의 상기 인간화 단일클론성 항체 T1h 또는 아이소타입 대조군(R3h 단일클론성 항체)으로 시험관 내에서 5% CO₂의 존재 하에 37℃에서 18 시간 동안 처리한다. 이어, 세포들을 세척하고, 실온에서 10분 동안 FITC에 접합된 아넥신 V(Annexin V)와 함께 배양한다. 이후에 세포들을 프로피디움 요오드(PI)로 염색하고, 유세포 분석기(Flow Cytometer FACScan)로 수득한다. 사멸세포는 아넥신 V+/PI-로 정의된다.

도 1은 B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자 유래 말초 혈액 단핵구 세포에서 인간화 단일클론성 항체 T1h에 의해 한정되는 CD6 발현을 나타낸다. 잠재성 종양 특이적 항원.

도 2는 B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자 유래 골수 세포에서 인간화 단일클론성 항체 T1h에 의해 한정되는 CD6 발현을 나타낸다. 잠재성 종양 특이적 항원.

도 3은 CD5 분자의 발현에 음성 반응을 나타내는 B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자 유래 말초 혈액 단핵구 세포에서 인간화 단일클론성 항체 T1h에 의해 한정되는 CD6 발현을 나타낸다.

4는 인간화 단일클론성 항체 T1h를 이용하여 B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자 유래 악성 세포의 세포 사멸을 유도하는 것을 보여준다.

실시예

하기 실시예들은 본 발명을 예시하도록 의도되다. 상기 인간화된 항-인간 CD6 단일클론성 항체 T1h를 유럽 특허 공개공보 제 0 807 125 A2 호에 개시된 바와 같이 기탁 번호 제 ECACC 96112640 호로 기탁된 하이브리도마 IOR-T1A로부터 수득하였다.

실시예 1: 인간화된 항-인간 CD6 단일클론성 항체 T1h는 B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자의 말초 혈액 유래 악성 세포를 인지한다.

19명의 B-세포 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL) 환자 유래 말초 혈액 단핵구 세포들에서 T1h MAb의 인지를 평가하였으며, CD19 및 CD20 마커에 의해 한정되는 B 세포 상에서 CD6 분자의 발현을 측정하였다. 또한, 정상적인 개체 유래 시료를 이용하여 이들 세포 마커들의 발현을 비교하였다(도 1). 상기 시료들을 분석하기 위해 FACScan을 이용하여 유세포 분석법으로 상기 연구를 수행하였다. 정상 수치는 도 1에서 적색 정사각형으로 나타나 있다.

실시예 2: 인간화된 항-인간 CD6 단일클론성 항체 T1h는 B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자의 골수 유래 악성 세포를 인지한다.

4명의 4 B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자 유래 말초 혈액 단핵구 세포에서 T1h MAb의 인지를 평가하였으며, CD19 및 CD20 마커에 의해 한정되는 B 세포 상에서 CD6 분자의 발현을 측정하였다. 또한, 정상적인 개체 유래 시료를 이용하여 이들 세포 마커들의 발현을 비교하였다(도 2). 상기 시료들을 분석하기 위해FACScan을 이용하여 유세포 분석법으로 상기 연구를 수행하였다.

실시예 3: 인간화된 항-인간 CD6 단일클론성 항체 T1h는 CD5 분자를 발현하지 않는 B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자 유래 악성 세포를 인지한다.

4 B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자 유래 말초 혈액 단핵구 세포(도 3(a)) 및 골수 세포(도 3(b))에서 T1h MAb의 인지를 평가하였으며, 악성 세포에서 CD6 및 CD5 분자들의 공시 발현을 측정하였다. 시료 1은 CD6+CD5+ 종양 세포를 갖는 환자를 나타내고, 시료 2는 CD6+CD5- 종양 세포를 갖는 환자를 나타낸다. 상기 시료들을 분석하기 위해 FACScan을 이용하여 유세포 분석법으로 상기 연구를 수행하였다.

실시예 4: 인간화 단일클론성 항체 T1h는 B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자 유래 악성 세포의 세포 사멸을 유도한다.

B-세포 만성 림프구성 백혈병 환자 유래 악성 세포의 세포 사멸을 유도하는 인간화 단일클론성 항체 T1h의 능력을 평가하였다. 상기 인간화 단일클론성 항체 T1과 함께 상기 종양 세포를 시험관 내에서 배양한 후, 아넥신 V 및 프로피디움 요오드-음성 염색에 의한 염색에 세포들이 양성 반응을 나타내는 표준 규격에 따라 세포사멸(apoptosis)시에 상기 세포들의 비율(%)을 측정하였다. 덱사메타손(Dex) 및 리툭시맵(Rx, 항-CD20 단일클론성 항체)은 양성 대조군으로서 사용되었다. 상기 인간화 단일클론성 항체 R3h(IgG1 아이소타입, 항-인간 상피세포 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor)에 특이적임)는 음성 대조군으로서 사용되었다. 그 결과(도 4)는 어떠한 처리도 하지 않는 세포(무처리)와 비교하였다. 상기 시료들을 분석하기 위해 FACScan을 이용하여 유세포 분석법으로 상기 연구를 수행하였다.

Claims

B-세포 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL)의 치료에 유용한 약학 조성물에 있어서, 항-CD6 인간화 단일클론성 항체 및 적절한 부형제를 포함하고, 상기 항-CD6 인간화 단일클론성 항체는 인간화된 IOR항체 T1h로서 기탁 번호 제 ECACC 96112640 호로 기탁된 하이브리도마 IOR-T1A에 의해 생성되며, 악성 B 림프구의 세포사멸성 세포 사멸 (apoptotic cell death)을 유도할 수 있는 함량으로 상기 조성물 중에 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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제1항에 있어서, 화학요법제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 화학요법제는 인산플루다라빈(fludarabine phosphate)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항-CD6 인간화 단일클론성 항체는 CD19 및 CD20 마커를 갖는 B 세포들 표면의 CD6 분자들에 대해서 특이적인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 적절한 부형제는 생리 완충액인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 항-CD6 인간화 단일클론성 항체를 체중 1 Kg 당 0.05 내지 1 mg의 투여량 범위로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
CD19 및 CD20 마커를 갖는 악성 B 세포들 표면의 CD6 분자들에 대해서 결합함으로써 B-세포 만성 림프구성 백혈병을 진단하는 데 사용되는 제1항에 따른 인간화된 항체 T1h를 포함하는 진단 시약.
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