KR20140061374A - 조절 t 세포, 및 cd6-발현 또는 cd4, cd25 및 cd127의 조합을 사용하여 이를 확인 및 단리하는 방법 - Google Patents
조절 t 세포, 및 cd6-발현 또는 cd4, cd25 및 cd127의 조합을 사용하여 이를 확인 및 단리하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
조절 T 세포, 조절 T 세포를 포함하는 조성물, 조절 T 세포 또는 이의 부분집합 집단의 확인, 단리, 강화, 수득 및/또는 확장 방법, 이같은 방법을 수행하는데 유용한 성분들을 포함하는 키트, 및 조절 T 세포 또는 이같은 조절 T 세포를 포함하는 조성물을 면역-기반 장애의 치료를 필요로 하는 개체에게 투여함으로서 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 방법이 본 명세서에서 개시된다.
Description
배경
T 세포 또는 T 림프구는 림프구로 공지된 백혈구 군에 속하고, 세포-매개 면역에서 중심적인 역할을 한다. 이는 T 세포 수용체 (TCR)로 칭해지는 T 세포 표면 상의 특수 수용체의 존재에 의해 B 세포와 같은 다른 림프구 유형과 구별될 수 있다. T 헬퍼 세포 (TH 세포), 세포독성 T 세포 (TC 세포, 또는 CTL), 중앙 메모리 T 세포 (TCM 세포) 및 이펙터 메모리 T 세포 (TEM 세포)가 포함되는 메모리 T 세포 (TM 세포), 내츄럴 킬러(Natural killer) T 세포 (NKT 세포), 감마 델타 T 세포 (γδT 세포), 및 조절 T 세포 (Treg 세포)가 포함되는, 각각 기능이 별개인 T 세포의 여러 상이한 부분집합이 발견되었다.
억제인자 T 세포로 또한 공지된 조절 T 세포는 다른 세포의 면역 응답을 억제하는 작용을 하는 T 세포의 특수 하위집단이다. 예를 들어, Treg 세포는 면역 반응 동안 T 세포-매개 면역을 억제하는 것에서, 그리고 흉선의 음성 선별 과정에서 탈출한 자가-반응성 T 세포를 억제하는 것에서 주요 역할을 한다. 그리하여, Treg 세포는 과도한 면역성 반응을 방지하는 중요한 "자가-점검"을 제공하고, 따라서 면역계 항상성 및 자가-항원에 대한 내성의 유지에 결정적이다.
Treg 세포의 2가지 주요 클래스는 천연 발생 Treg 세포 및 적응성 Treg 세포이다. 천연 발생 Treg 세포 (CD4+CD25+FoxP3+ Treg 세포로 또한 공지됨)는 흉선에서 생겨나고, TSLP로 활성화된 골수양 (CD11c+) 및 형질세포양 (CD123+) 수지상 세포 양쪽 모두와 발달 중인 T 세포 간의 상호작용에 연관되었다. 적응성 Treg 세포 (Tr1 세포, Th2 세포, Th3 세포, 및 Th17 세포가 포함됨)는 정상적인 면역 응답 동안 주변부에서 유래되는 것으로 보이고, Treg 세포 발달 및 기능을 촉진하는 것으로 보인다.
적응성 Treg 세포는 천연 발생 Treg 세포와 다수의 속성을 공유하지만, 중요한 세포 표면 바이오마커 및 기능 속성 면에서 상이할 수 있다. 예를 들어, Tr1 및 Th3 세포는 각각 IL-10 및 TGFβ를 생산하는 것으로 기술되었다. 마우스에서 이러한 세포 부분집합을 단리(isolate)하고, 강화(enrich)하고, 확장(expand)시키는 능력이 면역학적 질환에서 신규한 치료적 개입에 이름에 따라 이러한 결과는 면역요법에 대한 신규 접근법에 이르렀다.
자가-내성의 중요한 성분으로서의 천연-발생 Treg 세포가 확인되어, 면역학 및 면역 내성을 제어하는 기본적인 프로세스에서의 주요 연구 분야가 열렸다. 조절 T 세포는 독특하고 강건한 치료 프로파일을 지닌다. 이러한 세포는 조절 활성이 발달되기 위해 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)-매개 활성화를 필요로 하지만, 이의 이펙터 기능은 세포-세포 접촉 및 억제성 사이토카인 생산의 조합을 통해 국소적인 염증 응답을 조절하면서 비-특이적인 것으로 보인다. 수많은 연구에서, 자가면역 질환, 이식 및 이식편-대-숙주 질환에서의 병리학적 면역 응답을 억제하는 것에서의 천연-발생 Treg 세포의 강력한 영향이 실연되었다. 그러나, 인간 환경에서의 천연-발생 Treg 세포의 연구 및 적용에 대한 주요 장애물은 Treg 세포를 규정하고 다른 T 세포 부분집합, 예를 들어, TH 세포, TC 세포, TCM 세포, TEM 세포로부터 분리하기 위한, 뿐만 아니라 Treg 세포의 상이한 하위집단들 사이에서 구별하기 위한 특이적 세포 표면 바이오마커의 결여였다.
Treg 세포를 확인하거나, 단리하거나, 강화하거나, 또는 다른 방식으로 활용하기 위한 연구에서 다수의 상이한 방법이 사용된다. 천연-발생 Treg 세포에 대한 가장 널리 사용되는 마커는 분화 클러스터(cluster of differentiation) 4 (CD4), 분화 클러스터 25 (CD25), 포크헤드(forkhead)/날개형-나선(winged-helix) 전사 인자 상자 P3 (FoxP3), 세포독성 T 림프구-연관 항원 4 (CTLA-4), 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체 패밀리-관련 유전자 (GITR), 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3), 및 분화 클러스터 127 (CD127)이다. 불행하게도, 상기 열거된 마커들이 엄격하게 Treg 세포-특이적이지 않다는 것을 시사하는 증거가 축적되고 있다. 예를 들어, CD25 및 CD4 표면 마커 (CD4+CD25+ 세포)의 높은 발현은 처음에는 천연-발생 Treg 세포를 확인하는데 사용되었다. 그러나, CD4는 TH 세포, 및 TM 세포의 하위집단에서도 발현된다. CD25 또한 병원체에 대한 면역 응답 동안과 같은 면역 활성화 환경에서 비-조절 T 세포에서 발현된다. 따라서, CD4 및 CD25 발현에 의해 정의될 때, Treg 세포는 약 5-10％의 성숙형 TH 세포를 포함한다. Foxp3의 세포 발현의 추가적인 측정이 천연-발생 Treg 세포 (CD4+CD25+FoxP3+ 세포)의 더욱 특이적인 분석을 허용하였다. 그러나, Foxp3은 활성화된 TEM 세포에서 또한 일시적으로 발현되고, CD4+ CD25low /- T 세포, TH 세포, TC 세포, 및 메모리 T 세포를 포함하여, 대부분의 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 활성화 시 Foxp3을 일시적으로 발현한다는 것이 현재 잘 기록되어 있다. 또한, FoxP3은 염색 전에 세포막 투과를 필요로 하는 핵 마커이다. 따라서, 이러한 바이오마커의 사용은 기능 연구 또는 면역요법에서의 사용을 위해 생육성 천연-발생 Treg 세포를 분리하거나, 단리하거나, 강화하거나 또는 확장시키는 것과 같은 후속 프로세싱 단계를 방해한다.
CD127의 부가가 인간에서 천연-발생 Treg 세포 (CD127low /- 발현 패턴을 나타냄)와 TH 세포 (CD127+ 발현 패턴을 나타냄)를 구별하는데 사용될 수 있는 것으로 제안되었다. 그러나, 대부분의 CD4+ T 세포가 활성화 시 CD127을 하향-조절한다는 것이 최근 보고되었다. 또한, CD127 상실은 인간 편도선에서 B 세포에 도움을 제공하는 T 여포 헬퍼 세포 (TFH 세포)의 특징적인 특색이다. CTLA-4는 활성화 2-3일 후에 모든 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 상향-조절되는, T-세포 활성화의 음성 조절인자이다. 유사하게, GITR 및 LAG-3의 발현이 활성화 시 TEM 세포에서 유도된다. 따라서, 모든 현재 사용되는 Treg 세포 바이오마커 (CD25, CTLA-4, GITR, CD127, LAG-3, GARP 및 FoxP3)는 일반적인 T-세포 활성화 마커인 것으로 보인다. 그러므로, 이러한 바이오마커들은 Treg 세포-특이적인 것으로 보이지 않고, 따라서 천연-발생 Treg 세포를 활성화된 TH 세포와 같은 다른 T 세포 부분집합으로부터 구별하는데 신뢰할 수 없다. 따라서, 천연 및 적응성 조절 T 세포 중 다수가 현재의 바이오마커 연구에서 놓쳐질 것이고, 이는 특정 자가면역 환경에서의 결핍 또는 결함과 관련된 결론에 이의를 제기하게 한다.
따라서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 개선된 확인, 단리, 강화 및 확장 방법, 뿐만 아니라 개체에서 면역 반응을 조정하는 방법을 개발하는 것이 요구된다. 추가적으로, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 개체에서 면역 반응을 조정하기 위한 이같은 화합물의 용도를 개발하는 것이 요구된다. 마지막으로, 상기 기술된 방법을 수행하는데 유용한 바이오마커 및/또는 기타 성분을 포함하는 키트를 개발하는 것이 요구된다.
본 개시내용은 일반적으로 면역억제성 조절 T 세포를 확인하는 것에서, 뿐만 아니라 또 다른 바이오마커와 조합되어 사용되는 경우 면역억제성 조절 T 세포의 별개의 하위집단들을 확인하는 것에서 분화 클러스터 6 (CD6)이 특히 유용한 바이오마커라는 발견에 관한 것이다.
따라서, 본 명세서의 측면들은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확인하는 방법을 개시한다. 한 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고; 이때 CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확인하는 방법. 또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고; 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확인하는 방법.
또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; 및 T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고; 이때 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확인하는 방법. 또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; 및 T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고; 이때 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확인하는 방법. 또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; 및 T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고; 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확인하는 방법.
샘플은 혈액으로부터 수득된, 예를 들어, 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 림프, 흉선, 골수, 또는 임의의 특정한 관심 조직/기관 샘플 (췌장, 눈, 심장, 간, 신경, 소장, 피부, 근육, 연골, 인대, 활액 및/또는 관절이 비제한적으로 포함됨)로부터 단리된 T 세포를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 기타 바이오마커에는 CD127 바이오마커, 분화 클러스터 49d (CD49d) 바이오마커, 분화 클러스터 38 (CD38) 바이오마커, 분화 클러스터 45RA (CD45RA) 바이오마커, 인간 백혈구 항원 혈청형 DR (HLA-DR) 바이오마커, FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, GITR 바이오마커, LAG-3 바이오마커, 엑토뉴클레오티다제(ectonucleotidase) (CD39) 바이오마커, 이카로스(Ikaros) 패밀리 아연-손가락 핵 단백질의 구성원 (헬리오스(Helios)) 바이오마커, 오펀(orphan) 수용체 FcRL3 (FcRL3) 바이오마커, 사이토카인 수용체 7 (CCR7 또는 CD197) 바이오마커, 사이토카인 수용체 4 (CCR4 또는 CD194) 바이오마커, 사이토카인 수용체 8 (CCR8 또는 CDw198), 분화 클러스터 CD62L (CD62L) 바이오마커, 유도성 T-세포 공동-자극인자 (ICOS 또는 CD278) 바이오마커, 분화 클러스터 103 (CD103) 바이오마커, 세포 예정사(programmed dead)-1 (PD-1) 바이오마커, 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 OX40의 구성원 (CD134) 바이오마커, 당단백질-A 반복 우세 (GARP) 바이오마커, 분화 클러스터 45RB (CD45RB) 바이오마커, 분화 클러스터 45RO (CD45RO) 바이오마커, 분화 클러스터 95 (CD95) 바이오마커, 분화 클러스터 122 (CD122) 바이오마커, 분화 클러스터 147 (CD147), 분화 클러스터 8 (CD8) 바이오마커, 또는 이들의 임의의 조합물이 포함된다. 이러한 추가적인 바이오마커의 사용은 면역억제성 조절 T-세포의 하위집단을 확인하는데 특히 유용하다. 개시된 바이오마커는 항체 또는 리간드일 수 있고, 표지될 수 있거나 표지되지 않을 수 있다. 표지되는 경우, 바이오마커는 형광단, 양자점, 인광, 화학발광 화합물, 생체발광 화합물, 발색 화합물, 동위원소 화합물 예컨대 란탄족, 방사성 동위원소, 효소, 비오틴 또는 아비딘 분자, 또는 바이오마커가 결합한 세포를 검출하는데 유용한 임의의 기타 표지로 표지될 수 있다. 샘플 및 유용한 바이오마커가 포함되는 확인 단계는 본원에 개시된 바와 같다. 확인 단계는 표지된 바이오마커를 유동 세포측정기, 세포 분류기, 자기 입자/비드, 보체 용해, 세포 패닝(panning), 또는 세포 단리 또는 강화를 위한 당업자에게 공지된 기타 방법과 함께 사용할 수 있다. 또 다른 측면에서, 개시된 방법은 샘플을 스크리닝하는데 사용된 바이오마커가 FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, 또는 FoxP3 바이오마커 및 CTLA-4 바이오마커 양쪽 모두를 포함하지 않는다는 것을 조건으로 한다. 본원에 개시된 방법은 확인된 면역억제성 조절 T-세포 집단을 단리하거나 강화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 개시된 방법은 확인, 단리 또는 강화된 면역억제성 조절 T-세포 집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서의 다른 측면은 본원에 개시된 바와 같이 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계, 및 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 방법을 개시한다. 한 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 방법. 또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 방법.
또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 방법. 또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 방법. 또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 방법.
샘플 및 유용한 바이오마커가 포함되는 확인 단계는 본원에 개시된 바와 같다. 단리 단계는 표지된 바이오마커를 유동 세포측정기, 세포 분류기, 자기 입자/비드, 또는 세포 단리를 위한 당업자에게 공지된 기타 방법과 함께 사용할 수 있다. 확인 및 단리는 임의의 순서로 또는 동시에 공통적인 결정인자를 검출하는데 사용되는 구별가능한 다중 바이오마커들을 사용하는 것에 의해 진행될 수 있다. 또 다른 측면에서, 개시된 방법은 샘플을 스크리닝 및/또는 단리하는데 사용된 바이오마커가 FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, 또는 FoxP3 바이오마커 및 CTLA-4 바이오마커 양쪽 모두를 포함하지 않는다는 것을 조건으로 한다. 본원에 개시된 방법은 단리된 면역억제성 조절 T-세포 하위집단을 강화하거나 확장시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서의 또 다른 측면은 본원에 개시된 바와 같이 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계, 본원에 개시된 바와 같이 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계, 및 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 방법을 개시한다. 한 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 방법. 또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 방법.
또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 방법. 또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 방법. 또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD4+ CD25+ CD6low/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD4+ CD25+ CD6low/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 방법.
샘플 및 유용한 바이오마커가 포함되는 확인 단계, 뿐만 아니라 표지된 바이오마커 및 방법이 포함되는 단리 단계는 본원에 개시된 바와 같다. 자극성 조성물은 항원-특이적인 TCR/CD3 활성화제를 포함하고, 공동자극제, 제2 조절 T 세포 자극제, 또는 T 세포 생존 또는 성장 작용제가 포함되는 하나 이상의 추가적인 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 별법적으로, 원하는 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 먼저 강화 또는 확장시킨 후, 본원에 개시된 바와 같이 단리할 수 있다.
본 명세서의 또 다른 측면은 개체-적합성 T 세포의 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 조정하는 방법을 개시한다. 한 측면에서, 개체-적합성 T 세포의 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 조정하는 방법. 또 다른 측면에서, 개체-적합성 T 세포의 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 조정하는 방법.
또 다른 측면에서, 개체-적합성 T 세포의 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 조정하는 방법. 또 다른 측면에서, 개체-적합성 T 세포의 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 조정하는 방법. 또 다른 측면에서, 개체-적합성 T 세포의 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 조정하는 방법.
샘플 및 유용한 바이오마커가 포함되는 확인 단계, 뿐만 아니라 표지된 바이오마커 및 방법이 포함되는 단리 단계는 본원에 개시된 바와 같다. 개시된 방법은 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여하기 전에 본원에 개시된 바와 같이 원하는 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 강화하거나 확장시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 별법적으로, 본원에 개시된 바와 같이 샘플을 스크리닝하기 전에 및/또는 본원에 개시된 바와 같이 원하는 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 단리하기 전에 생물학적 샘플 내의 개체-적합성 T-세포의 집단이 강화 또는 확장될 수 있다.
본 명세서의 다른 측면은 본원에 개시된 방법 중 임의의 것을 수행하는데 유용한 성분을 포함하는 키트를 개시한다. 한 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인 및/또는 단리 또는 확장을 위한 키트는 CD6 바이오마커 리간드를 포함한다. 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리 및/또는 강화를 위한 키트는 CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드를 포함한다. 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리 및/또는 강화를 위한 키트는 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드를 포함한다. 이같은 개시된 키트는 CD127 바이오마커 리간드, CD49d 바이오마커 리간드, CD38 바이오마커 리간드, CD45RA 바이오마커 리간드, HLA-DR 바이오마커 리간드, FoxP3 바이오마커 리간드, CTLA-4 바이오마커 리간드, GITR 바이오마커 리간드, LAG-3 바이오마커 리간드, CD39 바이오마커 리간드, 헬리오스 바이오마커 리간드, FcRL3 바이오마커 리간드, CCR7 바이오마커 리간드, CCR4 바이오마커 리간드, CCR8 바이오마커 리간드, CD62L 바이오마커 리간드, ICOS 바이오마커 리간드, CD103 바이오마커 리간드, PD-1 바이오마커 리간드, CD134 바이오마커 리간드, GARP 바이오마커 리간드, CD45RB 바이오마커 리간드, CD45RO 바이오마커 리간드, CD95 바이오마커 리간드, CD122 바이오마커 리간드, CD147 바이오마커 리간드, CD8 바이오마커 리간드, 또는 이들의 임의의 조합물을 추가로 포함할 수 있다. 개시된 바이오마커 리간드는 항체 또는 리간드일 수 있고, 표지될 수 있거나 표지되지 않을 수 있다. 표지되는 경우, 바이오마커 리간드는 형광단, 양자점, 인광, 화학발광 화합물, 생체발광 화합물, 발색 화합물, 동위원소 화합물 예컨대 란탄족, 방사성 동위원소, 효소, 비오틴 또는 아비딘 분자, 또는 바이오마커가 결합한 세포를 검출하는데 유용한 임의의 기타 표지로 표지될 수 있다. 표지되지 않는 경우, 키트는 바이오마커 리간드를 표지하는데 유용한 표지 및 기타 시약을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확장을 위한 키트는 본원에 개시된 바와 같은 자극성 조성물을 포함한다. 이같은 키트는 CD6 바이오마커 리간드 또는 본원에 개시된 바와 같은 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드를 추가로 포함할 수 있다. 개시된 키트는 양성 및/또는 음성 대조군을 추가로 포함할 수 있다. 추가적으로, 개시된 키트는 키트 내용물을 사용하는 것에 의한 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리, 강화 및/또는 확장을 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서의 또 다른 측면은 본원에 개시된 바와 같은 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 방법에 의해 수득된 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 포함하는 조성물을 개시한다. 한 측면에서, 본원에 개시된 바와 같이 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계 및 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 수득된다. 또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 수득된다. 또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 수득된다.
또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 수득된다. 또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 수득된다. 또 다른 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 수득된다
샘플 및 유용한 바이오마커가 포함되는 확인 단계는 본원에 개시된 바와 같다. 단리 단계는 표지된 바이오마커를 유동 세포측정기, 세포 분류기, 자기 입자/비드, 보체 용해, 세포 패닝, 또는 세포 단리를 위한 당업자에게 공지된 기타 방법과 함께 사용할 수 있다. 확인 및 단리는 임의의 순서로 또는 동시에 공통적인 결정인자를 검출하는데 사용되는 구별가능한 다중 바이오마커들을 사용하는 것에 의해 진행될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 확인된 면역억제성 조절 T-세포 집단을 강화하거나 확장시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서의 또 다른 측면은 면역 응답을 치료하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 포함하는 조성물의 용도를 개시한다. 면역 응답은 자가면역 응답일 수 있다.
본 명세서의 다른 측면은 α-CD6 항체를 개체에게 투여하고, 이에 의해 개체 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 강화하는 단계를 포함하며, 상기 투여가 CD6hi/+ 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 작동불가능하게 하지만, CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포는 작동불가능하게 하지 않는, 개체 내의 면역억제성 조절 T-세포를 강화하는 방법을 개시한다.
본 명세서의 다른 측면은 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합을 확인하는 방법을 개시한다. 한 측면에서, 이러한 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커, CD6 바이오마커, 및 1개의 추가적인 바이오마커인 FoxP3 바이오마커, CD45RA 바이오마커, CCR4 바이오마커, CD39 바이오마커 또는 HLA-Dr 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고; 이때 면역억제성 조절 T-세포의 4가지 별개의 성숙 부분집합의 검출이 i) CCR4low 발현 패턴, CD39low 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD6low/-CD45RA+ 발현 패턴; ii) CCR4- 발현 패턴, CD39- 발현 패턴, 또는 HLA-Dr- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD6low /-CD45RA+ 발현 패턴; iii) CCR4hi /+ 발현 패턴, CD45RA- 발현 패턴, CD39hi /+ 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow /- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25hi/+CD6low/- 발현 패턴; 및 iv) CR4hi /+ 발현 패턴, CD45RA- 발현 패턴, CD39low/- 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow /- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD6+ 발현 패턴을 기초로 하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 이러한 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커, CD127 바이오마커, 및 1개의 추가적인 바이오마커인 FoxP3 바이오마커, CD45RA 바이오마커, CCR4 바이오마커, CD39 바이오마커 또는 HLA-Dr 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고; 이때 면역억제성 조절 T-세포의 4가지 별개의 성숙 부분집합의 검출이 i) CCR4low 발현 패턴, CD39low 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+ 발현 패턴; ii) CCR4- 발현 패턴, CD39- 발현 패턴, 또는 HLA-Dr- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD127low /-CD45RA+ 발현 패턴; iii) CCR4hi /+ 발현 패턴, CD45RA- 발현 패턴, CD39hi /+ 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow /- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25hi /+CD127low /- 발현 패턴; 및 iv) CR4hi /+ 발현 패턴, CD45RA- 발현 패턴, CD39low/- 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow /- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD127+ 발현 패턴을 기초로 하는 단계를 포함할 수 있다. 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합에는 비제한적으로 나이브(naive) 또는 휴지형(resting) 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합, 미성숙형 또는 메모리 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합, 성숙형 또는 이펙터 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합, 및 최종 분화형 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 포함된다.
도면의 간단한 설명
도 1의 a는 CD4/FOXP3 및 CD25/FOXP3 발현에 대해 CD4+ 림프구를 분석하는 점도표를 나타내고; 도 1의 b는 CD4+FOXP3- 및 CD4+CD25+FOXP3- 세포 집단 각각과 비교된 CD4+FOXP3+ 및 CD25+FOXP3+ 세포 집단 상에서의 CD6의 낮은 발현 또는 음성 발현의 오버레이(overlay) 도표를 나타낸다.
도 2의 a는 CD4+ 림프구를 분석하는 점도표를 나타내고; 도 2의 b는 CD6/CD25 발현, 및 CD25+CD6low /-, CD25-CD6low /- 및 CD25-CD6+의 3가지 상이한 CD4+ 세포 부분집합 상에서의 FOXP3 발현에 대해 CD4+ 림프구를 분석하는 점도표를 나타낸다.
도 3은 CD6/CD25 발현, 및 CD25+CD6low /-, CD25-CD6low /- 및 CD25-CD6+의 3가지 상이한 림프구 부분집합 상에서의 FOXP3 발현에 대해 림프구를 분석하는 점도표를 나타낸다.
도 4의 a는 CD6low /- 및 CD6+ 세포 집단에서의 FOXP3 발현에 대해 PBMC를 분석하는 점도표를 나타내고; 도 4의 b는 전체 PBMC, PBMC CD6low /- 및 PBMC CD6+ 세포 집단에서의 FOXP3+ 세포 발현 ％의 그래프를 나타낸다.
도 5a는 CD25/CD4 발현, CD25/CD6 발현 및 CD25/CD127 발현, 및 CD25+, CD25+CD6low/-, 및 CD25+CD127low /-의 CD4+ 세포 부분집합에서의 FOXP3 발현에 대해 림프구를 분석하는 점도표를 나타내고; 도 5b는 CD6 및 CD127 발현, 및 CD6low /-CD127low/- 및 CD6+CD127+의 CD4+CD25+ 세포 부분집합 상에서의 FOXP3 발현에 대해 CD4+CD25+ 림프구를 분석하는 점도표를 나타내며; 도 5c는 상이한 마커 조합으로 규정되는 상이한 nTreg 집단에서의 FOXP3 발현의 그래프를 나타낸다. 막대 그래프는 9명의 상이한 건강한 기증자의 말초혈로부터 단리된 PBMC로부터 수득된 평균 + SD를 나타낸다. FOXP3+의 유의하게 높은 강화가 CD4+CD25hi, CD6-Treg 및 CD127-Treg 집단과 비교하여 CD6lo /-CD127lo /- 세포에서 관찰된다 (p<0.009, 유-맨-휘트니(U-Mann-Whitney) 테스트).
도 6의 a는 CD4+CD25+CD6low /- 세포 (CD6-nTreg) 및 CD4+CD25+CD127low /- 세포 (CD127-nTreg) 분류 체계를 사용한 분류 전 및 후의 세포 순도의 대표적인 결과의 점도표를 나타내고; 도 6의 b는 CD4+CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 세포가 α-CD3 및 α-CD28 모노클로날 항체로 자극된 CD8+ T 세포 증식에 대한 유의한 (r<0.99) 용량-응답 억제 기능이 있었음을 실연하는 Treg-억제 검정법을 나타낸다. 전구체 빈도 (pf)의 억제 백분율 (억제율 ％= pf 샘플/ pf 증식 대조군 × 100)이 제시된다. CD4+CD25+CD6lo/-에서의 4개의 샘플 및 연구의 양성 대조군으로서의 CD4+CD25+CD127lo /- nTreg-검정법 실험에서의 9개의 샘플로부터 평균 및 SD가 계산되었다.
도 7은 FOXP3/CD45RA 발현에 대해 CD6low /- FOXP3+ 림프구를 분석하는 점도표를 나타낸다.
도 8은 FOXP3, CTLA-4, CD45RA, 또는 HLA-Dr 발현에 대해 CD4+CD25+CD6low /- 림프구를 분석하는 점도표를 나타낸다.
도 9a는 GARP 및 CD39 발현 또는 CD45RA 및 CCR4 발현에 대해 CD4+CD25+, CD25+/CD6low/-, 및 CD25+CD127low /- 림프구를 분석하는 점도표를 나타내고; 도 9b는 CD4 및 FOXP3 발현, HLA-Dr 및 FOXP3 발현, 또는 CTLA-4 및 FOXP3 발현에 대해 CD4+CD25+, CD25+/CD6low /-, 및 CD25+CD127lo /- 림프구를 분석하는 점도표를 나타내며; 도 9c는 CD4+CD25+, CD25+/CD6low /-, 및 CD25+CD127lo /- 세포 집단에서의 FOXP3, HLA-Dr, 또는 CTLA-4 발현의 그래프를 나타낸다. 막대 그래프는 5명의 건강한 대조군 샘플로부터 수득된 평균 + SD를 나타낸다.
도 10의 a는 CD45RA 및 CCR4 발현에 대해 CD4+CD25+CD6low /-CD127low /- 림프구를 분석하는 점도표, 및 CD45RA+CCR4- (나이브/휴지형, N/R), CD45RA+/CCR4low (미성숙형/메모리, I/Me) 및 CD45RA-/CCR4hi (성숙형/이펙터, Ma/E)의 3가지 세포 집단 부분집합의 확인을 나타내고; 도 10의 b는 HLA-Dr 및 CD39 발현에 대해 N/R, I/Me, 및 Ma/E 집단 부분집합을 분석하는 점도표를 나타내며, 이때 화살표는 마커 발현 방향을 나타내고; 도 10의 c는 CD45RA 및 CCR4 발현에 대해 CD4+CD25hiCD6+CD127+ 림프구를 분석하는 점도표, 및 세포 집단 부분집합 CCR4hiCD39-HLA-DR- (최종 분화형, TD)의 확인을 나타내고; 도 10의 d는 HLA-Dr 및 C39 발현에 대해 TD 집단 부분집합을 분석하는 점도표를 나타내고; 도 10의 e는 N/R, I/Me, Ma/E, 및 TD 집단 부분집합에서의 CD25, CD39, HLA-Dr 및 CD62L 발현량의 그래프를 나타내고; 도 10의 f는 CD6lo/-CD127lo/- nTreg에서의 nTreg-연관 마커의 역-게이팅(back-gating) 및 3-D 분석의 조합에 의해 CD45RA/CCR4 2변량 분석에 의해 규정되는 N/R, I/Me, 및 Ma/E 집단 부분집합을 분석하고, 대부분의 HLA-DR+ 세포가 CCR4 및 CD39를 공동-발현한다는 것을 나타내는 점도표를 나타내고; 도 10의 g는 HLA-DR-CD45RA+ (2.3 ± 0.3), HLA-DR-CD45RA- (3.2 ± 0.3), 및 HLA-DR+CD45RA- (5.0 ± 0.7)에서의 FOXP3 발현의 그래프를 나타내고; 도 10의 h는 CD45RA 및 GARP 발현에 대해 CD4+CD25hiCD6low /-CD127low /- nTreg 집단을 분석하는 점도표, 및 CD45RA+GARP- (Pop1), CD45RA-GARP- (Pop2) 및 CD45RA-GARP+ (Pop3)의 3가지 세포 집단 부분집합의 확인을 나타내며, 이때 화살표는 마커 발현 방향을 나타내고; 도 10의 i는 CD45RA 및 GARP 발현에 대해 CD4+CD25hiCD6+CD127+ nTreg 집단을 분석하는 점도표를 나타낸다.
도 1의 a는 CD4/FOXP3 및 CD25/FOXP3 발현에 대해 CD4+ 림프구를 분석하는 점도표를 나타내고; 도 1의 b는 CD4+FOXP3- 및 CD4+CD25+FOXP3- 세포 집단 각각과 비교된 CD4+FOXP3+ 및 CD25+FOXP3+ 세포 집단 상에서의 CD6의 낮은 발현 또는 음성 발현의 오버레이(overlay) 도표를 나타낸다.
도 2의 a는 CD4+ 림프구를 분석하는 점도표를 나타내고; 도 2의 b는 CD6/CD25 발현, 및 CD25+CD6low /-, CD25-CD6low /- 및 CD25-CD6+의 3가지 상이한 CD4+ 세포 부분집합 상에서의 FOXP3 발현에 대해 CD4+ 림프구를 분석하는 점도표를 나타낸다.
도 3은 CD6/CD25 발현, 및 CD25+CD6low /-, CD25-CD6low /- 및 CD25-CD6+의 3가지 상이한 림프구 부분집합 상에서의 FOXP3 발현에 대해 림프구를 분석하는 점도표를 나타낸다.
도 4의 a는 CD6low /- 및 CD6+ 세포 집단에서의 FOXP3 발현에 대해 PBMC를 분석하는 점도표를 나타내고; 도 4의 b는 전체 PBMC, PBMC CD6low /- 및 PBMC CD6+ 세포 집단에서의 FOXP3+ 세포 발현 ％의 그래프를 나타낸다.
도 5a는 CD25/CD4 발현, CD25/CD6 발현 및 CD25/CD127 발현, 및 CD25+, CD25+CD6low/-, 및 CD25+CD127low /-의 CD4+ 세포 부분집합에서의 FOXP3 발현에 대해 림프구를 분석하는 점도표를 나타내고; 도 5b는 CD6 및 CD127 발현, 및 CD6low /-CD127low/- 및 CD6+CD127+의 CD4+CD25+ 세포 부분집합 상에서의 FOXP3 발현에 대해 CD4+CD25+ 림프구를 분석하는 점도표를 나타내며; 도 5c는 상이한 마커 조합으로 규정되는 상이한 nTreg 집단에서의 FOXP3 발현의 그래프를 나타낸다. 막대 그래프는 9명의 상이한 건강한 기증자의 말초혈로부터 단리된 PBMC로부터 수득된 평균 + SD를 나타낸다. FOXP3+의 유의하게 높은 강화가 CD4+CD25hi, CD6-Treg 및 CD127-Treg 집단과 비교하여 CD6lo /-CD127lo /- 세포에서 관찰된다 (p<0.009, 유-맨-휘트니(U-Mann-Whitney) 테스트).
도 6의 a는 CD4+CD25+CD6low /- 세포 (CD6-nTreg) 및 CD4+CD25+CD127low /- 세포 (CD127-nTreg) 분류 체계를 사용한 분류 전 및 후의 세포 순도의 대표적인 결과의 점도표를 나타내고; 도 6의 b는 CD4+CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 세포가 α-CD3 및 α-CD28 모노클로날 항체로 자극된 CD8+ T 세포 증식에 대한 유의한 (r<0.99) 용량-응답 억제 기능이 있었음을 실연하는 Treg-억제 검정법을 나타낸다. 전구체 빈도 (pf)의 억제 백분율 (억제율 ％= pf 샘플/ pf 증식 대조군 × 100)이 제시된다. CD4+CD25+CD6lo/-에서의 4개의 샘플 및 연구의 양성 대조군으로서의 CD4+CD25+CD127lo /- nTreg-검정법 실험에서의 9개의 샘플로부터 평균 및 SD가 계산되었다.
도 7은 FOXP3/CD45RA 발현에 대해 CD6low /- FOXP3+ 림프구를 분석하는 점도표를 나타낸다.
도 8은 FOXP3, CTLA-4, CD45RA, 또는 HLA-Dr 발현에 대해 CD4+CD25+CD6low /- 림프구를 분석하는 점도표를 나타낸다.
도 9a는 GARP 및 CD39 발현 또는 CD45RA 및 CCR4 발현에 대해 CD4+CD25+, CD25+/CD6low/-, 및 CD25+CD127low /- 림프구를 분석하는 점도표를 나타내고; 도 9b는 CD4 및 FOXP3 발현, HLA-Dr 및 FOXP3 발현, 또는 CTLA-4 및 FOXP3 발현에 대해 CD4+CD25+, CD25+/CD6low /-, 및 CD25+CD127lo /- 림프구를 분석하는 점도표를 나타내며; 도 9c는 CD4+CD25+, CD25+/CD6low /-, 및 CD25+CD127lo /- 세포 집단에서의 FOXP3, HLA-Dr, 또는 CTLA-4 발현의 그래프를 나타낸다. 막대 그래프는 5명의 건강한 대조군 샘플로부터 수득된 평균 + SD를 나타낸다.
도 10의 a는 CD45RA 및 CCR4 발현에 대해 CD4+CD25+CD6low /-CD127low /- 림프구를 분석하는 점도표, 및 CD45RA+CCR4- (나이브/휴지형, N/R), CD45RA+/CCR4low (미성숙형/메모리, I/Me) 및 CD45RA-/CCR4hi (성숙형/이펙터, Ma/E)의 3가지 세포 집단 부분집합의 확인을 나타내고; 도 10의 b는 HLA-Dr 및 CD39 발현에 대해 N/R, I/Me, 및 Ma/E 집단 부분집합을 분석하는 점도표를 나타내며, 이때 화살표는 마커 발현 방향을 나타내고; 도 10의 c는 CD45RA 및 CCR4 발현에 대해 CD4+CD25hiCD6+CD127+ 림프구를 분석하는 점도표, 및 세포 집단 부분집합 CCR4hiCD39-HLA-DR- (최종 분화형, TD)의 확인을 나타내고; 도 10의 d는 HLA-Dr 및 C39 발현에 대해 TD 집단 부분집합을 분석하는 점도표를 나타내고; 도 10의 e는 N/R, I/Me, Ma/E, 및 TD 집단 부분집합에서의 CD25, CD39, HLA-Dr 및 CD62L 발현량의 그래프를 나타내고; 도 10의 f는 CD6lo/-CD127lo/- nTreg에서의 nTreg-연관 마커의 역-게이팅(back-gating) 및 3-D 분석의 조합에 의해 CD45RA/CCR4 2변량 분석에 의해 규정되는 N/R, I/Me, 및 Ma/E 집단 부분집합을 분석하고, 대부분의 HLA-DR+ 세포가 CCR4 및 CD39를 공동-발현한다는 것을 나타내는 점도표를 나타내고; 도 10의 g는 HLA-DR-CD45RA+ (2.3 ± 0.3), HLA-DR-CD45RA- (3.2 ± 0.3), 및 HLA-DR+CD45RA- (5.0 ± 0.7)에서의 FOXP3 발현의 그래프를 나타내고; 도 10의 h는 CD45RA 및 GARP 발현에 대해 CD4+CD25hiCD6low /-CD127low /- nTreg 집단을 분석하는 점도표, 및 CD45RA+GARP- (Pop1), CD45RA-GARP- (Pop2) 및 CD45RA-GARP+ (Pop3)의 3가지 세포 집단 부분집합의 확인을 나타내며, 이때 화살표는 마커 발현 방향을 나타내고; 도 10의 i는 CD45RA 및 GARP 발현에 대해 CD4+CD25hiCD6+CD127+ nTreg 집단을 분석하는 점도표를 나타낸다.
상세한 설명
본 명세서는 CD6이 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포를 확인하는데 특히 유용한 바이오마커라는 발견에 관한 것이다. 본 명세서는 인간 T-세포의 표면막에서의 CD6의 낮은 발현 또는 음성 발현의 검출이 천연-발생 조절 T-세포의 규정을 개선한다는 것을 개시한다. 이러한 CD6low /- 검출은 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 개선된 확인, 단리, 강화 및/또는 확장 방법의 발달을 허용한다. 또한, CD6low /- 면역억제성 조절 T-세포를 단리하고/하거나, 강화하고/하거나 확장시키는 능력은 면역-기반 장애를 치료하는데 유용한 세포 요법의 발달을 가능하게 한다.
본 명세서의 측면은, 부분적으로, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확인하는 방법을 개시한다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD6low/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; 및 T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고; 이때 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고; 이때 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; 및 T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고; 이때 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고; 이때 CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드 및 CD127 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; 및 T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고; 이때 CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고; 이때 CD4+ CD25+ CD6low/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; 및 T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고; 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커, CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고; 이때 CD25+ CD6low/- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드, CD6 바이오마커 리간드 및 CD127 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; 및 T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커, CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고; 이때 CD25+ CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 경우에, "샘플" 또는 "생물학적 샘플"이라는 용어는 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 제거되고 조절 T 세포를 함유하는 조직 또는 체액을 지칭한다. 샘플은 혈액 및/또는 혈액 분획 (말초혈 샘플 예컨대 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 샘플 또는 혈액이 포함됨), 골수 세포 샘플일 수 있다. 샘플은 임의의 특정한 관심 조직/기관 샘플을 또한 포함할 수 있고, 이에는 림프, 흉선, 췌장, 눈, 심장, 간, 신경, 소장, 피부, 근육, 연골, 인대, 활액 및/또는 관절이 비제한적으로 포함된다. 샘플은 건강한 개체 또는 원치 않는 면역 응답에 시달리는 세포, 조직 및/또는 기관이 있는 개체가 포함되는 임의의 개체로부터 취해질 수 있다. 예를 들어, 알레르기, 이식편 대 숙주 질환, 세포 또는 기관 이식, 또는 자가면역 질환 또는 장애가 있는 개체로부터 샘플이 취해질 수 있다. 이같은 샘플을 수득하는 방법은 면역학 및 의학 분야의 숙련가에게 주지되어 있다. 이는 일상적인 절차를 사용하여 혈액 또는 혈액 성분을 채혈하고 가공하는 것, 또는 골수 또는 기타 조직 또는 기관으로부터 표준 의학 기술을 사용하여 생검을 수득하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 경우에, "바이오마커"라는 용어는 림프구 상에서 발현되거나 또는 상이한 림프구 부분집합 상에서 차별적으로 발현되는 에피토프, 항원 또는 수용체를 지칭한다. 일부 바이오마커의 발현은 특정 B 세포 또는 T 세포 계통 또는 성숙 경로의 세포에 대해 특이적이고, 그 밖의 것들의 발현은 동일한 세포의 활성화 상태, 위치, 또는 분화에 따라 변한다. 바이오마커는 세포 표면 바이오마커 또는 세포내 바이오마커일 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용된 바이오마커는 모두 세포 표면 바이오마커이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용된 바이오마커는 모두 세포내 바이오마커이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용된 바이오마커는 세포 표면 바이오마커 및 세포내 바이오마커 양쪽 모두를 포함한다. 예시적인 바이오마커에는, 비제한적으로, CD4 바이오마커, CD25 바이오마커, CD6 바이오마커, CD127 바이오마커, CD49d 바이오마커, CD38 바이오마커, CD45RA 바이오마커, HLA-DR 바이오마커, FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, GITR 바이오마커, LAG-3 바이오마커, CD39 바이오마커, 헬리오스 바이오마커, FcRL3 바이오마커, CCR7 바이오마커, CCR4 바이오마커, CCR8 바이오마커, CD62L 바이오마커, ICOS 바이오마커, CD103 바이오마커, PD-1 바이오마커, CD134 바이오마커, GARP 바이오마커, CD45RB 바이오마커, CD45RO 바이오마커, CD95 바이오마커, CD122 바이오마커, CD147 바이오마커 및 CD8 바이오마커가 포함된다. 개시된 방법을 실행하는데, 그리고 개시된 키트를 이루는데 유용한 기타 바이오마커가 업계에 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커, CD6 바이오마커, CD127 바이오마커, CD49d 바이오마커, CD38 바이오마커, CD45RA 바이오마커, HLA-DR 바이오마커, FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, GITR 바이오마커, LAG-3 바이오마커, CD39 바이오마커, 헬리오스 바이오마커, FcRL3 바이오마커, CCR7 바이오마커, CCR4 바이오마커, CCR8 바이오마커, CD62L 바이오마커, ICOS 바이오마커, CD103 바이오마커, PD-1 바이오마커, CD134 바이오마커, GARP 바이오마커, CD45RB 바이오마커, CD45RO 바이오마커, CD95 바이오마커, CD122 바이오마커, CD8 바이오마커, 또는 이들의 임의의 조합물의 세포 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커, CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커, CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커, CD6 바이오마커, CD127 바이오마커, CD49d 바이오마커, CD38 바이오마커, CD45RA 바이오마커, HLA-DR 바이오마커, FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, GITR 바이오마커, LAG-3 바이오마커, CD39 바이오마커, 헬리오스 바이오마커, FcRL3 바이오마커, CCR7 바이오마커, CCR4 바이오마커, CCR8 바이오마커, CD62L 바이오마커, ICOS 바이오마커, CD103 바이오마커, PD-1 바이오마커, CD134 바이오마커, GARP 바이오마커, CD45RB 바이오마커, CD45RO 바이오마커, CD95 바이오마커, CD147 바이오마커, CD122 바이오마커, CD8 바이오마커, 또는 이들의 임의의 조합물이 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커, CD6 바이오마커, CD127 바이오마커, CD49d 바이오마커, CD38 바이오마커, CD45RA 바이오마커, HLA-DR 바이오마커, FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, GITR 바이오마커, LAG-3 바이오마커, CD39 바이오마커, 헬리오스 바이오마커, FcRL3 바이오마커, CCR7 바이오마커, CCR4 바이오마커, CCR8 바이오마커, CD62L 바이오마커, ICOS 바이오마커, CD103 바이오마커, PD-1 바이오마커, CD134 바이오마커, GARP 바이오마커, CD45RB 바이오마커, CD45RO 바이오마커, CD95 바이오마커, CD122 바이오마커, CD147 바이오마커, CD8 바이오마커, 또는 이의 임의의 조합물이 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커, CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커, 및 추가적인 바이오마커인 CD4 바이오마커, CD127 바이오마커, CD49d 바이오마커, CD38 바이오마커, CD45RA 바이오마커, HLA-DR 바이오마커, FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, GITR 바이오마커, LAG-3 바이오마커, CD39 바이오마커, 헬리오스 바이오마커, FcRL3 바이오마커, CCR7 바이오마커, CCR4 바이오마커, CCR8 바이오마커, CD62L 바이오마커, ICOS 바이오마커, CD103 바이오마커, PD-1 바이오마커, CD134 바이오마커, GARP 바이오마커, CD45RB 바이오마커, CD45RO 바이오마커, CD95 바이오마커, CD122 바이오마커, CD147 바이오마커, CD8 바이오마커, 또는 이들의 임의의 조합물 중 하나 이상의 세포 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커, 및 추가적인 바이오마커인 CD127 바이오마커, CD49d 바이오마커, CD38 바이오마커, CD45RA 바이오마커, HLA-DR 바이오마커, FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, GITR 바이오마커, LAG-3 바이오마커, CD39 바이오마커, 헬리오스 바이오마커, FcRL3 바이오마커, CCR7 바이오마커, CCR4 바이오마커, CCR8 바이오마커, CD62L 바이오마커, ICOS 바이오마커, CD103 바이오마커, PD-1 바이오마커, CD134 바이오마커, GARP 바이오마커, CD45RB 바이오마커, CD45RO 바이오마커, CD95 바이오마커, CD122 바이오마커, CD147 바이오마커, CD8 바이오마커, 또는 이들의 임의의 조합물 중 하나 이상의 세포 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커, CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커, 및 추가적인 바이오마커인 CD4 바이오마커, CD49d 바이오마커, CD38 바이오마커, CD45RA 바이오마커, HLA-DR 바이오마커, FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, GITR 바이오마커, LAG-3 바이오마커, CD39 바이오마커, 헬리오스 바이오마커, FcRL3 바이오마커, CCR7 바이오마커, CCR4 바이오마커, CCR8 바이오마커, CD62L 바이오마커, ICOS 바이오마커, CD103 바이오마커, PD-1 바이오마커, CD134 바이오마커, GARP 바이오마커, CD45RB 바이오마커, CD45RO 바이오마커, CD95 바이오마커, CD122 바이오마커, CD147 바이오마커, CD8 바이오마커, 또는 이들의 임의의 조합물 중 하나 이상의 세포 발현 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 단, 샘플을 스크리닝하는데 사용된 2가지 이상의 상이한 바이오마커가 FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, 또는 FoxP3 바이오마커 및 CTLA-4 바이오마커 양쪽 모두를 포함하지 않는 것을 조건으로 하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 단, 샘플을 스크리닝하는데 사용된 2가지 이상의 상이한 바이오마커가 FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, 또는 FoxP3 바이오마커 및 CTLA-4 바이오마커 양쪽 모두를 포함하지 않는 것을 조건으로 하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 단, 샘플을 스크리닝하는데 사용된 2가지 이상의 상이한 바이오마커가 FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, 또는 FoxP3 바이오마커 및 CTLA-4 바이오마커 양쪽 모두를 포함하지 않는 것을 조건으로 하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 단, 샘플을 스크리닝하는데 사용된 2가지 이상의 상이한 바이오마커가 FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, 또는 FoxP3 바이오마커 및 CTLA-4 바이오마커 양쪽 모두를 포함하지 않는 것을 조건으로 하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커 및 CD25 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 단, 샘플을 스크리닝하는데 사용된 2가지 이상의 상이한 바이오마커가 FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, 또는 FoxP3 바이오마커 및 CTLA-4 바이오마커 양쪽 모두를 포함하지 않는 것을 조건으로 하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 단, 샘플을 스크리닝하는데 사용된 3가지 이상의 상이한 바이오마커가 FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, 또는 FoxP3 바이오마커 및 CTLA-4 바이오마커 양쪽 모두를 포함하지 않는 것을 조건으로 하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 단, 샘플을 스크리닝하는데 사용된 3가지 이상의 상이한 바이오마커가 FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, 또는 FoxP3 바이오마커 및 CTLA-4 바이오마커 양쪽 모두를 포함하지 않는 것을 조건으로 하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커, CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 단, 샘플을 스크리닝하는데 사용된 3가지 이상의 상이한 바이오마커가 FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, 또는 FoxP3 바이오마커 및 CTLA-4 바이오마커 양쪽 모두를 포함하지 않는 것을 조건으로 하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커, 및 CD127 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 단, 샘플을 스크리닝하는데 사용된 3가지 이상의 상이한 바이오마커가 FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, 또는 FoxP3 바이오마커 및 CTLA-4 바이오마커 양쪽 모두를 포함하지 않는 것을 조건으로 하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 경우에, "바이오마커 리간드"라는 용어는 림프구 상에서 발현되거나 또는 상이한 림프구 부분집합 상에서 차별적으로 발현되는 에피토프, 항원 또는 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 바이오마커 리간드에는 항체가 포함된다. 본원에서 사용되는 경우에, "항체"라는 용어는 특정 항원에 응답하여 제조되고 이러한 항원에 특이적으로 결합하는, 면역계에 의해 생성된 분자를 지칭하고, 천연 발생 항체 및 비-천연 발생 항체 양쪽 모두를 포함한다. 예를 들어, 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 이량체, 다량체, 다중특이적 항체, 재조합 항체, 인간화 또는 영장류화 항체, 키메라 항체, 이관능성 항체, 세포-연관 항체 예컨대 Ig 수용체, 선형 항체, 디아바디(diabody), 또는 미니바디(minibody) (단편이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한), 및 이의 단일쇄 유도체일 수 있다. 항체는 VH 및 VL 도메인, 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전장 면역글로불린 분자, 또는 전장 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 단편, 예를 들어, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fc 단편, Fd 단편, Fv 단편일 수 있다. 항체는 임의의 척추동물 종 (예를 들어, 인간, 염소, 말, 당나귀, 뮤린(murine), 래트, 토끼 또는 닭)으로부터 유래될 수 있고, 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 클래스 (예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM) 또는 서브클래스 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있다. 천연 발생 항체, 비-천연 발생 항체, 및 이의 항원성 화합물-결합 단편의 구조에 대한 일반적인 개시내용에 대해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]; [Borrabeck, Antibody Engineering, 2d ed. (Oxford University Press 1995)]를 참조하고, 이들 각각은 이에 의해 전문이 참조로 포함된다.
예시적인 바이오마커 리간드에는 α-CD4 모노클로날 항체, α-CD25 모노클로날 항체, α-CD6 모노클로날 항체, α-CD127 모노클로날 항체, α-CD49d 모노클로날 항체, α-CD38 모노클로날 항체, α-CD45RA 모노클로날 항체, α-HLA-DR 모노클로날 항체, α-FoxP3 모노클로날 항체, α-CTLA-4 모노클로날 항체, α-GITR 모노클로날 항체, α-LAG-3 모노클로날 항체, α-CD39 모노클로날 항체, α-헬리오스 모노클로날 항체, α-FcRL3 모노클로날 항체, α-CCR7 모노클로날 항체, α-CCR4 모노클로날 항체, α-CCR8 모노클로날 항체, α-CD62L 모노클로날 항체, α-ICOS 모노클로날 항체, α-CD103 모노클로날 항체, α-PD-1 모노클로날 항체, α-CD134 모노클로날 항체, α-GARP 모노클로날 항체, α-CD45RB 모노클로날 항체, α-CD45RO 모노클로날 항체, α-CD95 모노클로날 항체, α-CD122 모노클로날 항체, α-CD147 모노클로날 항체 및 α-CD8 모노클로날 항체가 포함된다. 이같은 모노클로날 항체들은 시판되고, 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences) (캘리포니아주 산호세), 이바이오사이언시즈(eBiosciences) (캘리포니아주 샌디에고) 참조.
또 다른 실시양태에서, CD6 바이오마커 리간드는 CD166 (ALCAM) 리간드 또는 임의의 CD6 공동-자극성 신호이다.
바이오마커 리간드는 표지되거나 또는 표지되지 않을 수 있다. 표지되는 경우, 바이오마커는 형광단, 양자점, 인광, 화학발광 화합물, 생체발광 화합물, 발색 화합물, 동위원소 화합물 예컨대 란탄족, 방사성 동위원소, 효소, 비오틴 또는 아비딘 분자, 또는 바이오마커가 결합한 세포를 검출하는데 유용한 임의의 기타 표지와 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 부착될 수 있다. 표지를 항체에 부착하는 방법은 당업자에게 주지되어 있다. 특히 바람직한 표지는 생리학적 조건 하에 미리 정해진 효소와의 접촉에 의해 쉽게 절단 또는 분리될 수 있거나 또는 가수분해에 적용될 수 있는 링커에 의해 바이오마커 리간드에 부착되는 것들이다. 바이오마커 리간드는 샘플과의 접촉 전 또는 후, 또는 바이오마커와의 접촉 전 또는 후에 표지될 수 있다. 바이오마커 리간드에 결합하는 표지된 항체와의 접촉에 의해 바이오마커 리간드가 표지될 수도 있다. 바이오마커 리간드가 자기 입자, 예컨대 상자성 나노입자 (독일의 밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec))와 접합될 수도 있다.
본원에 개시된 바와 같이 T 세포의 집단을 포함하는 샘플이 바이오마커 리간드와 접촉된다. 샘플을 바이오마커 리간드와 접촉시키는 것은 바이오마커 리간드가 이의 동족 바이오마커에 특이적으로 결합하는 것을 촉진하는 방식으로 행해진다. 전형적으로, 이는 생리학적 조건 하에 행해진다. 예를 들어, 바이오마커 리간드가 항체인 경우, 항체를 샘플과 접촉시키는 것은 항체가 이의 상응하는 바이오마커에 결합함으로써 항체/바이오마커 복합체가 생성되는 것을 초래하는 조건 하에 행해진다.
본원에 개시된 바와 같이 T 세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출한다. 형광성, 생체발광성, 화학발광성, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적, 자기, 또는 당업자에게 공지된 기타 물리적 수단을 기초로 하는 검출 방법을 사용하여, 표지된 바이오마커를 스크리닝할 수 있다. 크기, 부피, 밀도, 불투명도, 또는 당업자에게 공지된 기타 물리적 수단을 기초로 하는 검출 방법을 사용하여, 표지되지 않은 바이오마커를 스크리닝할 수 있다.
한 실시양태에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계가 세포 분류기를 사용하여 달성된다. 세포 분류기는 당업자에게 주지되어 있고, 일반적으로 복합적인 세포 혼합물을 단리 세포 유형의 분획들로 분리할 수 있다. 전형적으로, 분류할 세포들이 소형 노즐 구멍으로부터 발산되는 담체 액체의 가는 분출물로서 도입된다. 노즐을 떠난 직후에, 유체의 유체역학적으로 포커싱(focusing)된 스트림(stream)이 하나 이상의 엄밀하게 포커싱된 광, 일반적으로는 레이저 광의 광선의 웨이스트(waist)를 통과한다. 다수의 검출기가 스트림이 광선을 통과하는 지점을 조준한다: 하나는 광선과 일직선이고 (전방 산란기 또는 FSC), 몇몇은 이에 수직이며 (측면 산란기 또는 SSC), 하나 이상의 형광 검출기에 대해 수직이다. 광선을 통과하는 0.2 ㎛ 내지 150 ㎛의 각각의 현탁된 입자는 빛을 산란시키고, 입자에서 발견되거나 입자에 부착된 형광 화학물질이 광원보다 더 긴 파장의 방출광으로 여기될 수 있다. 산란된 광 및 형광의 이러한 조합이 검출기에 의해 채집되고, 각각의 검출기 (각각의 형광 방출 피크에 대해 1개)에서의 휘도의 변동을 분석함으로써, 각각의 개별적인 입자의 물리적 및 화학적 구조에 관한 다양한 유형의 정보를 이끌어 낼 수 있다. 유동 세포측정기에 의해 생성된 데이터를 1차원으로 도표화하여 히스토그램이 생성될 수 있거나, 또는 2차원 점도표로 또는 심지어 3차원으로 도표화할 수 있다. "게이트(gate)"로 칭해지는 일련의 부분집합 추출을 생성시킴으로써, 형광 강도를 기초로 이러한 도표 상의 영역들을 순차적으로 분리할 수 있다. 판매 중인 일부 유동 세포측정기는 형광에 대한 필요를 제거하였고, 측정용 광 산란기만을 사용한다. 기타 유동 세포측정기는 각각의 세포의 형광, 산란된 광 및 투과된 광의 영상을 형성한다.
이러한 실시양태의 한 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계가 형광-표지 바이오마커 리간드를 사용하는 유동 세포측정기에 의해 달성된다. 유동 세포측정 분류는 특수 유형의 세포 유동측정법이다. 이는 생물학적 세포들의 비균질 혼합물을 각각의 세포의 특이적인 광 산란 및 형광 특성을 기초로 한번에 1개의 세포씩 2개 이상의 용기 내로 분류하는 방법을 제공한다. 개별적인 세포로부터의 형광 신호의 신속하고, 객관적이며, 정량적인 기록, 뿐만 아니라 특정 관심 세포의 물리적 분리를 제공하기 때문에, 이는 유용한 과학 기구이다. 유동 세포측정 분류기는 초 당 200,000 이벤트를 초과하는 속도로 세포를 용이하게 분석할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 담체 유체의 물리학, 및 액적 간에 세포가 분포되는 통계학이 분류 속도를 초 당 약 50,000개의 세포로 제한한다. 속도와 신뢰할 수 있는 분리의 이러한 조합은 개별적인 세포들이 기타 용도를 위해 단리 또는 강화될 수 있게 한다.
또 다른 실시양태에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계가 자기성으로 표지된 바이오마커 리간드를 사용하여 자기-활성화 세포 분류 (MACS)에 의해 달성된다. MACS는 특정 바이오마커에 대한 바이오마커 리간드로 코팅된 자기 나노입자와 함게 인큐베이션하는 것에 의해 세포가 분리되도록 한다. 자기 나노입자는 산화철 및 다당류 코트로 구성된 초상자성 나노입자를 포함할 수 있다. 바람직하게는 자기 나노입자는 콜로이드성 현탁액에서 유지되기에 충분하도록 소형이고, 이는 세포 표면 바이오마커에 대한 신속하고 효율적인 결합을 허용한다. 이러한 실시양태의 측면에서, 자기 나노입자는 직경 약 1 nm 내지 직경 약 100 nm, 예를 들어, 직경 약 25 nm, 직경 50 nm, 직경 75 nm, 또는 직경 100 nm이다. 이러한 실시양태의 다른 측면에서, 자기 나노입자의 부피는 전형적인 포유동물 세포의 부피의 약 1/백만, 전형적인 포유동물 세포의 부피의 약 5/백만, 또는 전형적인 포유동물 세포의 부피의 약 10/백만이다. 바람직하게는 자기 나노입자는 유동 세포측정법을 방해하지 않고, 생체분해성이며, 세포 기능에 대한 효과가 무시할 정도이다. 자기 나노입자에 대한 항체 커플링은 직접적일 수 있거나, 또는 리간드 예컨대 형광단, 양자점, 인광, 화학발광 화합물, 생체발광 화합물, 발색 화합물, 동위원소 화합물 예컨대 란탄족, 방사성 동위원소, 효소, 비오틴 또는 아비딘 분자, 또는 바이오마커가 결합한 세포를 검출하는데 유용한 임의의 기타 표지에 대한 제2 항체를 통해 간접적일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계가 고체-상 부착에 의해 달성된다. 한 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계가 본원에 기술된 바와 같은 바이오마커 리간드를 사용하여 패닝 또는 고체-상 친화력 크로마토그래피에 의해 달성된다. 한 측면에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계가 자기성으로 표지된 본원에 기술된 바와 같은 바이오마커 리간드를 사용하여 고체-상 자기 비드에 의해 달성된다. 예를 들어, 전문이 참조로 포함된 미국 특허 출원 공개 2005/0186207 참조.
또 다른 실시양태에서, T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계가 보체 세포 용해에 의해 달성된다. 보체 세포 용해는 항체가 인식하는 원하지 않는 세포 집단을 제거하는데 사용되고, 세포 표면 상의 "보체 시스템"으로 칭해지는 효소성 분자들의 케스케이드를 고정 및 활성화하는 특정 유형의 항체의 기능을 기초로 한다. 최종 반응은 막 내의 물리적 구멍을 개방하는 것을 초래하고, 삼투에 의한 세포 용해를 일으킨다. 전형적으로, 세포를 30분 동안 4℃에서 항체와 함께 인큐베이션하고, 보체 효소의 공급원을 첨가하고, 37℃에서 인큐베이션한다. 마지막으로, 세포를 등장 완충제로 세정하면, 세포를 사용할 수 있다.
하나 이상의 바이오마커의 특징적인 발현 패턴을 기초로 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인된다. 일반적으로, 당업자에게 공지된 바와 같은 염색 강도에서의 쉽게 인식가능한 차이를 기초로 바이오마커 또는 바이오마커들의 발현 수준에 따라 이같은 세포들이 확인된다. 전형적으로, 바이오마커의 발현은 높음 (바이오마커hi), + (바이오마커+), 낮음 (바이오마커low) 및 - (바이오마커-)로 분류된다.
바이오마커 리간드를 사용하여 스크리닝할 때 강하게 또는 밝게 염색되는 세포는 바이오마커+로 지칭되고, 높은 수준의 바이오마커 발현을 나타내는 세포를 가리킨다. 예를 들어, CD4hi /+, CD25hi /+, CD6hi /+, CD127hi /+, CD49dhi /+, CD38hi /+, CD45RAhi/+, HLA-DRhi /+, FoxP3hi /+, CTLA-4hi /+, GITRhi /+, LAG-3hi /+, CD39hi /+, 헬리오스hi/+, FcRL3hi /+, CCR7hi /+, CCR4hi /+, CCR8hi /+, CD62Lhi /+, ICOShi /+, CD103hi /+, PD-1hi /+, CD134hi/+, GARPhi /+, CD45RBhi /+, CD45ROhi /+, CD95hi /+, CD122hi /+, CD147hi /+ 및 CD8hi /+는 각각 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커, CD6 바이오마커, CD127 바이오마커, CD49d 바이오마커, CD38 바이오마커, CD45RA 바이오마커, HLA-DR 바이오마커, FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, GITR 바이오마커, LAG-3 바이오마커, CD39 바이오마커, 헬리오스 바이오마커, FcRL3 바이오마커, CCR7 바이오마커, CCR4 바이오마커, CCR8, CD62L 바이오마커, ICOS 바이오마커, CD103 바이오마커, PD-1 바이오마커, CD134 바이오마커, GARP 바이오마커, CD45RB 바이오마커, CD45RO 바이오마커, CD95 바이오마커, CD122 바이오마커, CD147 바이오마커, CD8 바이오마커에 대해 지시된 표지된 바이오마커 리간드를 사용하여 스크리닝할 때 강하게 또는 밝게 염색되는 세포를 지칭한다.
바이오마커 리간드를 사용하여 스크리닝할 때 약하게 또는 흐릿하게 염색되거나 또는 전혀 염색되지 않는 세포는 바이오마커low /-로 지칭되고, 높은 수준의 바이오마커 발현을 나타내는 세포를 가리킨다. 예를 들어, CD4low /-, CD25low /-, CD6low/-, CD127low /-, CD49dlow /-, CD38low /-, CD45RAlow /-, HLA-DRlow /-, FoxP3low /-, CTLA-4low/-, GITRlow /-, LAG-3low /-, CD39low /-, 헬리오스low /-, FcRL3low /-, CCR7low /-, CCR4low /-, CCR8low/-, CD62Llow /-, ICOSlow /-, CD103low /-, PD-1low /-, CD134low /-, GARPlow /-, CD45RBlow /-, CD45ROlow/-, CD95low /-, CD122low /-, CD147low /- 및 CD8low /-는 각각 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커, CD6 바이오마커, CD127 바이오마커, CD49d 바이오마커, CD38 바이오마커, CD45RA 바이오마커, HLA-DR 바이오마커, FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, GITR 바이오마커, LAG-3 바이오마커, CD39 바이오마커, 헬리오스 바이오마커, FcRL3 바이오마커, CCR7 바이오마커, CCR4 바이오마커, CCR8, CD62L 바이오마커, ICOS 바이오마커, CD103 바이오마커, PD-1 바이오마커, CD134 바이오마커, GARP 바이오마커, CD45RB 바이오마커, CD45RO 바이오마커, CD95 바이오마커, CD122 바이오마커, CD147 바이오마커, CD8 바이오마커에 대해 지시된 표지된 바이오마커 리간드를 사용하여 스크리닝할 때 약하게 또는 흐릿하게 염색되거나 또는 전혀 염색되지 않는 세포를 지칭한다.
세포를 바이오마커hi 세포로 지정하기 위한 한계값은 모든 세포에 대해 관찰된 형광 강도 분포의 관점에서 설정될 수 있고, 이때 형광 강도의 상위 2％, 3％, 5％, 7％ 또는 10％ 내의 세포가 바이오마커hi 세포로 지정된다. 이러한 실시양태의 측면에서, CD4hi 세포, CD25hi 세포, CD6hi 세포, CD127hi 세포, CD49dhi 세포, CD38hi 세포, CD45RAhi 세포, HLA-DRhi 세포, FoxP3hi 세포, CTLA-4hi 세포, GITRhi 세포, LAG-3hi 세포, CD39hi 세포, 헬리오스hi 세포, FcRL3hi 세포, CCR7hi + 세포, CCR4hi 세포, CCR8hi 세포, CD62Lv 세포, ICOShi 세포, CD103hi 세포, PD-1hi 세포, CD134hi 세포, GARPhi 세포, CD45RBhi 세포, CD45ROhi 세포, CD95hi 세포, CD122hi 세포, CD147hi 세포, 및/또는 CD8hi 세포는 스크리닝되는 모든 세포에 대해 관찰된 형광 강도와 비교하여 90％ 이상, 93％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 또는 98％ 이상의 형광 강도를 나타낸다.
세포를 바이오마커+ 세포로 지정하기 위한 한계값은 모든 세포에 대해 관찰된 형광 강도 분포의 관점에서 설정될 수 있고, 이때 형광 강도의 상위 10％, 20％, 30％, 40％ 또는 50％ 내의 세포가 바이오마커+ 세포로 지정된다. 이러한 실시양태의 측면에서, CD4+ 세포, CD25+ 세포, CD6+ 세포, CD127+ 세포, CD49d+ 세포, CD38+ 세포, CD45RA+ 세포, HLA-DR+ 세포, FoxP3+ 세포, CTLA-4+ 세포, GITR+ 세포, LAG-3+ 세포, CD39+ 세포, 헬리오스+ 세포, FcRL3+ 세포, CCR7+ 세포, CCR4+ 세포, CCR8+ 세포, CD62L+ 세포, ICOS+ 세포, CD103+ 세포, PD-1+ 세포, CD134+ 세포, GARP+ 세포, CD45RB+ 세포, CD45RO+ 세포, CD95+ 세포, CD122+ 세포, CD147+ 세포, 및/또는 CD8+ 세포는 스크리닝되는 모든 세포에 대해 관찰된 형광 강도와 비교하여 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 또는 50％ 이상의 형광 강도를 나타낸다.
세포를 바이오마커low 세포로 지정하기 위한 한계값은 모든 세포에 대해 관찰된 형광 강도 분포의 관점에서 설정될 수 있고, 이때 형광 강도의 하위 50％, 40％, 30％, 20％, 또는 10％에 속하는 세포가 바이오마커low/- 세포로 지정된다. 이러한 실시양태의 측면에서, CD4low 세포, CD25low 세포, CD6low 세포, CD127low 세포, CD49dlow 세포, CD38low 세포, CD45RAlow 세포, HLA-DRlow 세포, FoxP3low 세포, CTLA-4low 세포, GITRlow 세포, LAG-3low 세포, CD39low 세포, 헬리오스low 세포, FcRL3low 세포, CCR7low 세포, CCR4low 세포, CCR8low 세포, CD62Llow 세포, ICOSlow 세포, CD103low 세포, PD-1low 세포, CD134low 세포, GARPlow 세포, CD45RBPlow 세포, CD45ROPlow 세포, CD95Plow 세포, CD122low 세포, CD147low 세포, 및/또는 CD8low 세포는 스크리닝되는 모든 세포에 대해 관찰된 형광 강도와 비교하여 50％ 이하, 40％ 이하, 30％ 이하, 20％ 이하, 또는 10％ 이하의 형광 강도를 나타낸다.
세포를 바이오마커- 세포로 지정하기 위한 한계값은 모든 세포에 대해 관찰된 형광 강도 분포의 관점에서 설정될 수 있고, 이때 형광 강도의 하위 10％, 7％, 5％, 3％, 또는 2％에 속하는 세포가 바이오마커- 세포로 지정된다. 이러한 실시양태의 측면에서, CD4- 세포, CD25- 세포, CD6- 세포, CD127- 세포, CD49d- 세포, CD38- 세포, CD45RA- 세포, HLA-DR- 세포, FoxP3- 세포, CTLA-4- 세포, GITR- 세포, LAG-3- 세포, CD39- 세포, 헬리오스- 세포, FcRL3- 세포, CCR7- 세포, CCR4- 세포, CCR8- 세포, CD62L- 세포, ICOS- 세포, CD103- 세포, PD-1- 세포, CD134- 세포, GARP- 세포, CD45RB- 세포, CD45RO- 세포, CD95- 세포, CD122- 세포, CD147- 세포, 및/또는 CD8- 세포는 스크리닝되는 모든 세포에 대해 관찰된 형광 강도와 비교하여 10％ 이하, 7％ 이하, 5％ 이하, 3％ 이하, 또는 2％ 이하의 형광 강도를 나타낸다.
모든 세포에 대한 바이오마커 염색의 빈도 분포를 수득하고, 더 높은 염색 집단 및 더 낮은 염색 집단에 대한 집단 곡선 피트(fit)를 생성시킴으로써 세포를 또한 구별할 수 있다. 그 후, 개별적인 세포들을 각각의 집단 분포의 통계학적 분석을 기초로 이들이 속할 것 같은 집단에 할당한다. 한 실시양태에서, 바이오마커low/- 세포는 바이오마커+ 세포보다 1배 이하, 2배 이하 또는 3배 이하의 형광을 나타낸다. 이러한 실시양태의 측면에서, CD4low /- 세포, CD25low /- 세포, CD6low /- 세포, CD127low /-+ 세포, CD49dlow /- 세포, CD38low /- 세포, CD45RAlow /- HLA-DRlow /- 세포, FoxP3low/- 세포, CTLA-4low /- 세포, GITRlow /- 세포, LAG-3low /- 세포, CD39low /- 세포, 헬리오스low/- 세포, FcRL3low /- 세포, CCR7low /- 세포, CCR4low /- 세포, CCR8low /- 세포, CD62Llow/- 세포, ICOSlow /- 세포, CD103low /- 세포, PD-1low /- 세포, CD134low /- 세포, GARPlow/- 세포, CD45RBlow /- 세포, CD45ROlow /- 세포, CD95low /- 세포, CD122low /- 세포, CD147low/- 세포, 및 CD8low /- 세포는 각각 CD4+ 세포, CD25+ 세포, CD6+ 세포, CD127+ 세포, CD49d+ 세포, CD38+ 세포, CD45RA+ 세포, HLA-DR+ 세포, FoxP3+ 세포, CTLA-4+ 세포, GITR+ 세포, LAG-3+ 세포, CD39+ 세포, 헬리오스+ 세포, FcRL3+ 세포, CCR7+ 세포, CCR4+ 세포, CCR8+ 세포, CD62L+ 세포, ICOS+ 세포, CD103+ 세포, PD-1+ 세포, CD134+ 세포, GARP+ 세포, CD45RB+ 세포, CD45RO+ 세포, CD95+ 세포, CD122+ 세포, CD147+ 세포, 및 CD8+ 세포보다 1배 이하, 2배 이하 또는 3배 이하의 형광을 나타낸다.
한 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인된다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인된다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low/- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인된다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- CD38low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인된다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- CD49low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인된다.
이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인된다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD25+ CD6low /- CD127low/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인된다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- CD127low /- CD49dlow /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인된다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- CD127low /- CD38low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인된다.
이러한 실시양태의 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD4+ CD25+ CD6low /- CD127low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD49dlow /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD38low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD45RAlow /- 발현 패턴, CD25+ CD6low/- CD127low /- CD49dlow /- 발현 패턴, CD25+ CD6low /- CD127low /- CD38low /- 발현 패턴, 또는 CD6low /- CD127low /- CD49dlow /- CD38low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인된다.
이러한 실시양태의 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD4+ CD25+ CD6low /- HLA-Dr+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- HLA-Drlow /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- FoxP3+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- FoxP3low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low/- CTLA-4+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CTLA-4low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low/- GITR+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- GITRlow /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- LAG-3+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- LAG-3low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD39+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD39low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- 헬리오스+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- 헬리오스low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- FcRL3+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- FcRL3low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CCR7+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CCR7low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CCR4+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CCR4low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CCR8+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low/- CCR8low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD62L+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD62Llow/- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- ICOS+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- ICOSlow/- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD103+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD103low/- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- PD-1+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- PD-1low/- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD134+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD134low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- GARP+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- GARPlow /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD45RB+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD45RBlow /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD45RO+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD45ROlow /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD95+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD95low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD122+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD122low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low/- CD147low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD8+ 발현 패턴, 또는 CD4+ CD25+ CD6low/- CD8low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인된다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /-, 및 추가적인 바이오마커 발현 패턴인 CD4+ 발현 패턴, CD25+ 발현 패턴, CD127low /- 발현 패턴, CD49dlow/- 발현 패턴, CD38low /- 발현 패턴, CD45RAlow /- 발현 패턴, HLA-Dr+ 발현 패턴, HLA-Drlow /- 발현 패턴, FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, GITR+ 발현 패턴, GITRlow /- 발현 패턴, LAG-3+ 발현 패턴, LAG-3low/- 발현 패턴, CD39+ 발현 패턴, CD39low /- 발현 패턴, 헬리오스+ 발현 패턴, 헬리오스low/- 발현 패턴, FcRL3+ 발현 패턴, FcRL3low /- 발현 패턴, CCR7+ 발현 패턴, CCR7low/- 발현 패턴, CCR4+ 발현 패턴, CCR4low /- 발현 패턴, CCR8+ 발현 패턴, CCR8low/- 발현 패턴, CD62L+ 발현 패턴, CD62Llow /- 발현 패턴, ICOS+ 발현 패턴, ICOSlow/- 발현 패턴, CD103+ 발현 패턴, CD103low /- 발현 패턴, PD-1+ 발현 패턴, PD-1low/- 발현 패턴, CD134+ 발현 패턴, CD134low /- 발현 패턴, GARP+ 발현 패턴, GARPlow /- 발현 패턴, CD45RB+ 발현 패턴, CD45RBlow /- 발현 패턴, CD45RO+ 발현 패턴, CD45ROlow/- 발현 패턴, CD95+ 발현 패턴, CD95low /- 발현 패턴, CD122+ 발현 패턴, CD122low/- 발현 패턴, CD147+ 발현 패턴, CD147low /- 발현 패턴, CD8+ 발현 패턴, 또는 CD8low/- 발현 패턴 중 하나 이상을 포함하는 T-세포를 기초로 확인된다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD25+ CD6low /-, 및 추가적인 바이오마커 발현 패턴인 CD4+ 발현 패턴, CD127low /- 발현 패턴, CD49dlow /- 발현 패턴, CD38low /- 발현 패턴, CD45RAlow /- 발현 패턴, HLA-Dr+ 발현 패턴, HLA-Drlow/- 발현 패턴, FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low/- 발현 패턴, GITR+ 발현 패턴, GITRlow /- 발현 패턴, LAG-3+ 발현 패턴, LAG-3low/- 발현 패턴, CD39+ 발현 패턴, CD39low /- 발현 패턴, 헬리오스+ 발현 패턴, 헬리오스low/- 발현 패턴, FcRL3+ 발현 패턴, FcRL3low /- 발현 패턴, CCR7+ 발현 패턴, CCR7low/- 발현 패턴, CCR4+ 발현 패턴, CCR4low /- 발현 패턴, CCR8+ 발현 패턴, CCR8low/- 발현 패턴, CD62L+ 발현 패턴, CD62Llow /- 발현 패턴, ICOS+ 발현 패턴, ICOSlow/- 발현 패턴, CD103+ 발현 패턴, CD103low /- 발현 패턴, PD-1+ 발현 패턴, PD-1low/- 발현 패턴, CD134+ 발현 패턴, CD134low /- 발현 패턴, GARP+ 발현 패턴, GARPlow /- 발현 패턴, CD45RB+ 발현 패턴, CD45RBlow /- 발현 패턴, CD45RO+ 발현 패턴, CD45ROlow/- 발현 패턴, CD95+ 발현 패턴, CD95low /- 발현 패턴, CD122+ 발현 패턴, CD122low/- 발현 패턴, CD147+ 발현 패턴, CD147low /- 발현 패턴, CD8+ 발현 패턴, 또는 CD8low/- 발현 패턴 중 하나 이상을 포함하는 T-세포를 기초로 확인된다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- CD127low /-, 및 추가적인 바이오마커 발현 패턴인 CD4+ 발현 패턴, CD25+ 발현 패턴, CD49dlow /- 발현 패턴, CD38low /- 발현 패턴, CD45RAlow /- 발현 패턴, HLA-Dr+ 발현 패턴, HLA-Drlow/- 발현 패턴, FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low/- 발현 패턴, GITR+ 발현 패턴, GITRlow /- 발현 패턴, LAG-3+ 발현 패턴, LAG-3low/- 발현 패턴, CD39+ 발현 패턴, CD39low /- 발현 패턴, 헬리오스+ 발현 패턴, 헬리오스low/- 발현 패턴, FcRL3+ 발현 패턴, FcRL3low /- 발현 패턴, CCR7+ 발현 패턴, CCR7low/- 발현 패턴, CCR4+ 발현 패턴, CCR4low /- 발현 패턴, CCR8+ 발현 패턴, CCR8low/- 발현 패턴, CD62L+ 발현 패턴, CD62Llow /- 발현 패턴, ICOS+ 발현 패턴, ICOSlow/- 발현 패턴, CD103+ 발현 패턴, CD103low /- 발현 패턴, PD-1+ 발현 패턴, PD-1low/- 발현 패턴, CD134+ 발현 패턴, CD134low /- 발현 패턴, GARP+ 발현 패턴, GARPlow /- 발현 패턴, CD45RB+ 발현 패턴, CD45RBlow /- 발현 패턴, CD45RO+ 발현 패턴, CD45ROlow/- 발현 패턴, CD95+ 발현 패턴, CD95low /- 발현 패턴, CD122+ 발현 패턴, CD122low/- 발현 패턴, CD147+ 발현 패턴, CD147low /- 발현 패턴, CD8+ 발현 패턴, 또는 CD8low/- 발현 패턴 중 하나 이상을 포함하는 T-세포를 기초로 확인된다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD4+ CD25+ CD6low/-, 및 추가적인 바이오마커 발현 패턴인 CD127low /- 발현 패턴, CD49dlow /- 발현 패턴, CD38low /- 발현 패턴, CD45RAlow /- 발현 패턴, HLA-Dr+ 발현 패턴, HLA-Drlow /- 발현 패턴, FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, GITR+ 발현 패턴, GITRlow /- 발현 패턴, LAG-3+ 발현 패턴, LAG-3low /- 발현 패턴, CD39+ 발현 패턴, CD39low /- 발현 패턴, 헬리오스+ 발현 패턴, 헬리오스low /- 발현 패턴, FcRL3+ 발현 패턴, FcRL3low /- 발현 패턴, CCR7+ 발현 패턴, CCR7low /- 발현 패턴, CCR4+ 발현 패턴, CCR4low /- 발현 패턴, CCR8+ 발현 패턴, CCR8low /- 발현 패턴, CD62L+ 발현 패턴, CD62Llow /- 발현 패턴, ICOS+ 발현 패턴, ICOSlow /- 발현 패턴, CD103+ 발현 패턴, CD103low /- 발현 패턴, PD-1+ 발현 패턴, PD-1low /- 발현 패턴, CD134+ 발현 패턴, CD134low /- 발현 패턴, GARP+ 발현 패턴, GARPlow /- 발현 패턴, CD45RB+ 발현 패턴, CD45RBlow /- 발현 패턴, CD45RO+ 발현 패턴, CD45ROlow /- 발현 패턴, CD95+ 발현 패턴, CD95low /- 발현 패턴, CD122+ 발현 패턴, CD147+ 발현 패턴, CD147low/- 발현 패턴, CD8+ 발현 패턴, 또는 CD8low /- 발현 패턴 중 하나 이상을 포함하는 T-세포를 기초로 확인된다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD25+ CD6low /- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- CD127low /- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD25+ CD127low /- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD4+ CD25+ CD127low/- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD25+ CD6low /- CD127low/- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 2개 이상의 별개의 집단이 CD6low/- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴 또는 FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴 또는 CTLA-4low /- 발현 패턴, CD45RA+ 발현 패턴 또는 CD45RAlow /- 발현 패턴, HLA-Dr+ 발현 패턴 또는 HLA-Drlow /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 2개 이상의 별개의 집단이 CD25+ CD6low /- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴 또는 FoxP3low/- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴 또는 CTLA-4low/- 발현 패턴, CD45RA+ 발현 패턴 또는 CD45RAlow/- 발현 패턴, HLA-Dr+ 발현 패턴 또는 HLA-Drlow/- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 2개 이상의 별개의 집단이 CD6low/- CD127low /- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴 또는 FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴 또는 CTLA-4low /- 발현 패턴, CD45RA+ 발현 패턴 또는 CD45RAlow /- 발현 패턴, HLA-Dr+ 발현 패턴 또는 HLA-Drlow /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 2개 이상의 별개의 집단이 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴 또는 FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴 또는 CTLA-4low /- 발현 패턴, CD45RA+ 발현 패턴 또는 CD45RAlow /- 발현 패턴, HLA-Dr+ 발현 패턴 또는 HLA-Drlow /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 2개 이상의 별개의 집단이 CD25+ CD6low /- CD127low /- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴 또는 FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴 또는 CTLA-4low /- 발현 패턴, CD45RA+ 발현 패턴 또는 CD45RAlow /- 발현 패턴, HLA-Dr+ 발현 패턴 또는 HLA-Drlow/- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 2개 이상의 별개의 집단이 CD4+ CD25+ CD6low /- CD127low /- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 확인되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴 또는 FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴 또는 CTLA-4low /- 발현 패턴, CD45RA+ 발현 패턴 또는 CD45RAlow /- 발현 패턴, HLA-Dr+ 발현 패턴 또는 HLA-Drlow/- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
본 명세서의 측면들은, 부분적으로, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 방법을 개시한다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계, 및 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드 및 CD127 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계, 및 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커, 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커, CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드, CD6 바이오마커 리간드 및 CD127 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커, CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
스크리닝 및 접촉 단계는 본원에 기술된 바와 같다.
하나 이상의 바이오마커의 특징적인 발현 패턴을 기초로 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 단리 또는 강화된다. 본원에 개시된 스크리닝 단계에 대한 것과 같이, 당업자에게 공지된 바와 같은 염색 강도에서의 쉽게 인식가능한 차이를 기초로 바이오마커 또는 바이오마커들의 발현 수준에 따라 이같은 세포들이 단리 또는 강화된다. 전형적으로, 바이오마커의 발현 패턴의 발현은 높음 (바이오마커hi), + (바이오마커+), 낮음 (바이오마커low) 및 - (바이오마커-)로 분류된다.
면역억제성 조절 T-세포의 집단은 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 세포로 실질적으로 구성될 수 있다. 본원에서 사용되는 경우에, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 세포의 집단에 관하여 사용될 때의 "실질적으로"라는 용어는 집단으로부터의 세포의 총 개수의 80％ 이상이 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 세포 집단을 지칭한다. 이러한 실시양태의 측면에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포의 집단은, 예를 들어, 집단으로부터의 세포의 총 개수의 83％ 이상, 85％ 이상, 88％ 이상, 또는 90％ 이상, 93％ 이상, 95％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상을 구성한다. 이러한 실시양태의 다른 측면에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포의 집단은, 예를 들어, 샘플로부터의 T-세포의 원천 집단과 비교하여 2배 이상, 4배 이상, 8배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 50배 이상, 또는 100배 이상을 구성한다.
관심 세포의 양성 선별 또는 음성 선별을 사용하여 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 단리 또는 강화될 수 있다. 추가적으로, 관심 세포의 양성 선별 및 음성 선별 양쪽 모두를 사용하여 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 단리 또는 강화될 수 있다. 본원에서 사용되는 경우에, "양성 선별"이라는 용어는 특정 세포 상에서의 바이오마커의 높거나 양성인 발현을 기초로 세포의 혼합물 또는 출발 집단으로부터 특정 세포를 선별하는 것을 지칭한다. 본원에서 사용되는 경우에, "음성 선별"이라는 용어는 특정 세포 상에서의 바이오마커의 낮거나 음성인 발현을 기초로 세포의 혼합물 또는 출발 집단으로부터 특정 세포를 선별하는 것을 지칭한다. 세포의 양성 또는 음성 선별에 사용되는 바이오마커는, 예를 들어, 유동 세포측정 분류기, MACS, 고체-상 부착, 패닝, 및 크로마토그래피에 의해 검출될 수 있다. 세포 상의 2개 이상의 바이오마커의 면역선별이 1개 이상의 단계에서 수행될 수 있고, 이때 각각의 단계가 하나 이상의 바이오마커를 양성적으로 또는 음성적으로 선별한다. 2개 이상의 바이오마커의 면역선별이 유동 세포측정 분류기를 사용하여 1개의 단계에서 수행되는 경우, 2개 이상의 상이한 바이오마커가 상이한 형광단으로 표지될 수 있다.
이러한 실시양태의 측면에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포의 집단이, 예를 들어, 세포의 원천 집단으로부터의 세포의 총 개수와 비교하여 20％ 이상, 30 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 또는 90％ 이상만큼 강화된다. 이러한 실시양태의 다른 측면에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포의 집단이, 예를 들어, 세포의 원천 집단으로부터의 세포의 총 개수와 비교하여 2배 이상, 4배 이상, 8배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 50배 이상, 또는 100배 이상만큼 강화된다.
이러한 실시양태의 다른 측면에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포의 집단이, 예를 들어, 샘플 내의 세포의 총 개수의 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 또는 98％ 이상으로 강화된다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포의 집단이, 예를 들어, 샘플 내의 세포의 총 개수의 약 80％ 내지 약 85％, 약 80％ 내지 약 90％, 약 80％ 내지 약 95％, 약 80％ 내지 약 98％, 약 80％ 내지 약 100％, 약 85％ 내지 약 90％, 약 85％ 내지 약 95％, 약 85％ 내지 약 98％, 약 85％ 내지 약 100％, 약 90％ 내지 약 95％, 약 90％ 내지 약 98％, 또는 약 90％ 내지 약 100％로 강화된다.
이러한 실시양태의 다른 측면에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포의 하위집단이, 예를 들어, 샘플 내의 세포의 총 개수로부터 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 또는 98％ 이상으로 단리된다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포의 하위집단이, 예를 들어, 샘플 내의 세포의 총 개수로부터 약 80％ 내지 약 85％, 약 80％ 내지 약 90％, 약 80％ 내지 약 95％, 약 80％ 내지 약 98％, 약 80％ 내지 약 100％, 약 85％ 내지 약 90％, 약 85％ 내지 약 95％, 약 85％ 내지 약 98％, 약 85％ 내지 약 100％, 약 90％ 내지 약 95％, 약 90％ 내지 약 98％, 또는 약 90％ 내지 약 100％로 단리된다.
또 다른 측면에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 샘플 내의 세포로부터 CD6+ 세포를 고갈시키는 음성 선별 계획에 의해 단리된다. 또 다른 측면에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 샘플 내의 세포로부터 CD6+ 세포를 고갈시키는 음성 선별 계획에 의해 강화된다.
하나 이상의 바이오마커의 특징적인 발현 패턴을 기초로 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 수득된다. 형광성, 생체발광성, 화학발광성, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적, 자기, 크기, 부피, 밀도, 불투명도, 또는 당업자에게 공지된 기타 물리적 수단을 기초로 하는 검출 방법을 사용하여, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 세포가 단리 또는 강화된다.
한 실시양태에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계가 본원에 개시된 바와 같은 세포 분류기를 사용하여 달성된다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계가 본원에 개시된 바와 같은 유동 세포측정 분류기를 사용하여 달성된다. 또 다른 실시양태에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계가 본원에 개시된 바와 같은 MACS를 사용하여 달성된다. 바이오마커 발현 패턴이 본원에 개시된 바와 같은 관심 세포의 양성 선별 또는 음성 선별에 사용될 수 있다. 세포의 양성 또는 음성 선별에 사용되는 바이오마커 발현 패턴이, 예를 들어, 유동 세포측정 분류기, MACS, 패닝, 및 크로마토그래피에 의해 검출될 수 있다.
세포를 바이오마커hi 세포, 바이오마커+ 세포, 바이오마커low 세포, 또는 바이오마커- 세포로 지정하기 위한 한계값은 본원에 개시된 바와 같다. 본원에 개시된 바와 같이 모든 세포에 대한 바이오마커 염색의 빈도 분포를 수득하고 더 높은 염색 집단 및 더 낮은 염색 집단에 대한 집단 곡선 피트를 생성시킴으로써 세포를 또한 구별할 수 있다.
한 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 단리 또는 강화된다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 단리 또는 강화된다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 단리 또는 강화된다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- CD38low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 단리 또는 강화된다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- CD49low/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 단리 또는 강화된다.
이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 단리 또는 강화된다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD25+ CD6low /- CD127low/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 단리 또는 강화된다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- CD127low /- CD49dlow/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 단리 또는 강화된다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- CD127low /- CD38low/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 단리 또는 강화된다.
이러한 실시양태의 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD4+ CD25+ CD6low /- CD127low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD49dlow /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD38low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD45RAlow /- 발현 패턴, CD25+ CD6low/- CD127low /- CD49dlow /- 발현 패턴, CD25+ CD6low /- CD127low /- CD38low /- 발현 패턴, 또는 CD6low /- CD127low /- CD49dlow /- CD38low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 단리 또는 강화된다.
이러한 실시양태의 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD4+ CD25+ CD6low /- HLA-Dr+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- HLA-Drlow /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- FoxP3+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- FoxP3low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low/- CTLA-4+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CTLA-4low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low/- GITR+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- GITRlow /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- LAG-3+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- LAG-3low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD39+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD39low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- 헬리오스+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- 헬리오스low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- FcRL3+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- FcRL3low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CCR7+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CCR7low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CCR4+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CCR4low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CCR8+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low/- CCR8low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD62L+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD62Llow/- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- ICOS+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- ICOSlow/- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD103+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD103low/- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- PD-1+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- PD-1low/- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD134+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD134low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- GARP+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- GARPlow /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD45RB+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD45RBlow /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD45RO+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD45ROlow /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD95+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD95low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD122+ 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD122low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low/- CD147low /- 발현 패턴, CD4+ CD25+ CD6low /- CD8+ 발현 패턴, 또는 CD4+ CD25+ CD6low/- CD8low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 단리 또는 강화된다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- 발현 패턴, 및 추가적인 바이오마커 발현 패턴인 CD4+ 발현 패턴, CD25+ 발현 패턴, CD127low /- 발현 패턴, CD49dlow/- 발현 패턴, CD38low /- 발현 패턴, CD45RAlow /- 발현 패턴, HLA-Dr+ 발현 패턴, HLA-Drlow /- 발현 패턴, FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, GITR+ 발현 패턴, GITRlow /- 발현 패턴, LAG-3+ 발현 패턴, LAG-3low/- 발현 패턴, CD39+ 발현 패턴, CD39low /- 발현 패턴, 헬리오스+ 발현 패턴, 헬리오스low/- 발현 패턴, FcRL3+ 발현 패턴, FcRL3low /- 발현 패턴, CCR7+ 발현 패턴, CCR7low/- 발현 패턴, CCR4+ 발현 패턴, CCR4low /- 발현 패턴, CCR8+ 발현 패턴, CCR8low/- 발현 패턴, CD62L+ 발현 패턴, CD62Llow /- 발현 패턴, ICOS+ 발현 패턴, ICOSlow/- 발현 패턴, CD103+ 발현 패턴, CD103low /- 발현 패턴, PD-1+ 발현 패턴, PD-1low/- 발현 패턴, CD134+ 발현 패턴, CD134low /- 발현 패턴, GARP+ 발현 패턴, GARPlow /- 발현 패턴, CD45RB+ 발현 패턴, CD45RBlow /- 발현 패턴, CD45RO+ 발현 패턴, CD45ROlow/- 발현 패턴, CD95+ 발현 패턴, CD95low /- 발현 패턴, CD122+ 발현 패턴, CD122low/- 발현 패턴, CD147+ 발현 패턴, CD147low /- 발현 패턴, CD8+ 발현 패턴, 또는 CD8low/- 발현 패턴 중 하나 이상을 포함하는 T 세포를 기초로 단리 또는 강화된다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD25+ CD6low /- 발현 패턴, 및 추가적인 바이오마커 발현 패턴인 CD4+ 발현 패턴, CD127low /- 발현 패턴, CD49dlow/- 발현 패턴, CD38low /- 발현 패턴, CD45RAlow /- 발현 패턴, HLA-Dr+ 발현 패턴, HLA-Drlow/- 발현 패턴, FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low/- 발현 패턴, GITR+ 발현 패턴, GITRlow /- 발현 패턴, LAG-3+ 발현 패턴, LAG-3low/- 발현 패턴, CD39+ 발현 패턴, CD39low /- 발현 패턴, 헬리오스+ 발현 패턴, 헬리오스low/- 발현 패턴, FcRL3+ 발현 패턴, FcRL3low /- 발현 패턴, CCR7+ 발현 패턴, CCR7low/- 발현 패턴, CCR4+ 발현 패턴, CCR4low /- 발현 패턴, CCR8+ 발현 패턴, CCR8low/- 발현 패턴, CD62L+ 발현 패턴, CD62Llow /- 발현 패턴, ICOS+ 발현 패턴, ICOSlow/- 발현 패턴, CD103+ 발현 패턴, CD103low /- 발현 패턴, PD-1+ 발현 패턴, PD-1low/- 발현 패턴, CD134+ 발현 패턴, CD134low /- 발현 패턴, GARP+ 발현 패턴, GARPlow /- 발현 패턴, CD45RB+ 발현 패턴, CD45RBlow /- 발현 패턴, CD45RO+ 발현 패턴, CD45ROlow/- 발현 패턴, CD95+ 발현 패턴, CD95low /- 발현 패턴, CD122+ 발현 패턴, CD122low/- 발현 패턴, CD147+ 발현 패턴, CD147low /- 발현 패턴, CD8+ 발현 패턴, 또는 CD8low/- 발현 패턴 중 하나 이상을 포함하는 T 세포를 기초로 단리 또는 강화된다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- CD127low /- 발현 패턴, 및 추가적인 바이오마커 발현 패턴인 CD4+ 발현 패턴, CD25+ 발현 패턴, CD49dlow/- 발현 패턴, CD38low /- 발현 패턴, CD45RAlow /- 발현 패턴, HLA-Dr+ 발현 패턴, HLA-Drlow/- 발현 패턴, FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low/- 발현 패턴, GITR+ 발현 패턴, GITRlow /- 발현 패턴, LAG-3+ 발현 패턴, LAG-3low/- 발현 패턴, CD39+ 발현 패턴, CD39low /- 발현 패턴, 헬리오스+ 발현 패턴, 헬리오스low/- 발현 패턴, FcRL3+ 발현 패턴, FcRL3low /- 발현 패턴, CCR7+ 발현 패턴, CCR7low/- 발현 패턴, CCR4+ 발현 패턴, CCR4low /- 발현 패턴, CCR8+ 발현 패턴, CCR8low/- 발현 패턴, CD62L+ 발현 패턴, CD62Llow /- 발현 패턴, ICOS+ 발현 패턴, ICOSlow/- 발현 패턴, CD103+ 발현 패턴, CD103low /- 발현 패턴, PD-1+ 발현 패턴, PD-1low/- 발현 패턴, CD134+ 발현 패턴, CD134low /- 발현 패턴, GARP+ 발현 패턴, GARPlow /- 발현 패턴, CD45RB+ 발현 패턴, CD45RBlow /- 발현 패턴, CD45RO+ 발현 패턴, CD45ROlow/- 발현 패턴, CD95+ 발현 패턴, CD95low /- 발현 패턴, CD122+ 발현 패턴, CD122low/- 발현 패턴, CD147+ 발현 패턴, CD147low /- 발현 패턴, CD8+ 발현 패턴, 또는 CD8low/- 발현 패턴 중 하나 이상을 포함하는 T 세포를 기초로 단리 또는 강화된다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴, 및 추가적인 바이오마커 발현 패턴인 CD127low /- 발현 패턴, CD49dlow /- 발현 패턴, CD38low /- 발현 패턴, CD45RAlow /- 발현 패턴, HLA-Dr+ 발현 패턴, HLA-Drlow /- 발현 패턴, FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, GITR+ 발현 패턴, GITRlow /- 발현 패턴, LAG-3+ 발현 패턴, LAG-3low /- 발현 패턴, CD39+ 발현 패턴, CD39low /- 발현 패턴, 헬리오스+ 발현 패턴, 헬리오스low /- 발현 패턴, FcRL3+ 발현 패턴, FcRL3low /- 발현 패턴, CCR7+ 발현 패턴, CCR7low /- 발현 패턴, CCR4+ 발현 패턴, CCR4low /- 발현 패턴, CCR8+ 발현 패턴, CCR8low /- 발현 패턴, CD62L+ 발현 패턴, CD62Llow /- 발현 패턴, ICOS+ 발현 패턴, ICOSlow /- 발현 패턴, CD103+ 발현 패턴, CD103low /- 발현 패턴, PD-1+ 발현 패턴, PD-1low /- 발현 패턴, CD134+ 발현 패턴, CD134low /- 발현 패턴, GARP+ 발현 패턴, GARPlow /- 발현 패턴, CD45RB+ 발현 패턴, CD45RBlow /- 발현 패턴, CD45RO+ 발현 패턴, CD45ROlow /- 발현 패턴, CD95+ 발현 패턴, CD95low /- 발현 패턴, CD122+ 발현 패턴, CD122low /- 발현 패턴, CD147+ 발현 패턴, CD147low /- 발현 패턴, CD8+ 발현 패턴, 또는 CD8low /- 발현 패턴 중 하나 이상을 포함하는 T 세포를 기초로 단리 또는 강화된다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T 세포를 기초로 단리 또는 강화되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD25+ CD6low /- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T 세포를 기초로 단리 또는 강화되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low/- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD6low /- CD127low /- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T 세포를 기초로 단리 또는 강화되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD25+ CD127low /- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T 세포를 기초로 단리 또는 강화되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T 세포를 기초로 단리 또는 강화되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD4+ CD25+ CD127low/- 발현 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T 세포를 기초로 단리 또는 강화되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
또 다른 실시양태에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 CD25+ CD6low /- CD127low/- 발현 패턴, 및 하나 이상의 추가적인 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T세포를 기초로 단리 또는 강화되고, 단, 추가적인 바이오마커 발현 패턴이 FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물이 아니라는 것을 조건으로 한다.
본 명세서의 측면들은, 부분적으로, 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 방법을 개시한다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계, 및 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 확장시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드 및 CD127 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD4+ CD25+ CD6low/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD4+ CD25+ CD6low/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD4+ CD25+ CD6low/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및 CD25+ CD6low/- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드, CD6 바이오마커 리간드 및 CD127 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커, CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD25+ CD6low/- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
스크리닝, 접촉 및 단리 단계는 본원에 기술된 바와 같다.
원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 확장시키는 단계는 표준 세포 배양 절차를 사용하여 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 자극성 조성물은 항원-특이적으로 결합하고 T 세포 수용체 복합체를 활성화하는 것에 의해 T 세포의 성장을 촉진한다. 자극성 조성물은 유효량의 항원-특이적인 TCR/CD3 활성화제를 포함한다. 자극성 조성물은 하나 이상의 추가적인 작용제, 예를 들어, 공동자극제, 제2 조절 T 세포 자극제, 또는 일반적으로 T 세포의 생존 및/또는 성장을 촉진하는 작용제를 더 포함할 수 있다. 자극성 조성물은 용액 또는 현탁액 중에 존재할 수 있다. 활성화 및 확장을 촉진하기 위해, TCR/CD3 활성화제 및 TCR 공동자극제는 전형적으로 3차원 고체 표면, 예컨대 숙주 세포, 비드, 또는 기타 기판 상에 고정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Thomas et al, Clin. Immunol. 105: 259-272 (2002)]를 참조하고, 이는 이에 의해 전문이 참조로 포함된다. 기판으로서 사용하기에 적절한 세포에는 인공 항원-제시 세포 (aAPC)가 포함된다. 예를 들어, 문헌 [Kim, et al., Nat. Biotechnol. 22(4):403-410 (2004)]; 및 [Thomas, et al., Clin. Immunol. 105(3): 259-272 (2002)]를 참조하고, 이들 각각은 이에 의해 전문이 참조로 포함된다. 비드는 전형적으로는 직경 범위가 1 ㎛ 내지 20 ㎛인, 플라스틱, 유리, 또는 임의의 기타 적절한 물질일 수 있다. 한 실시양태에서, 활성화제가 2:1 내지 1:5, 바람직하게는 1:1 내지 1:3의 세포:비드 비로 제공되는 상자성 비드 상에 고정될 수 있다. 최적의 비드 크기는 경험적으로 결정될 수 있지만, 전형적으로는 이러한 크기는 직경 1 ㎛ 내지 20 ㎛의 범위에 속한다.
TCR/CD3 활성화제는 항원 비-특이적 활성화제, 예를 들어, α-CD3 항체, 및 항원-특이적 활성화제, 예를 들어, 주요 조직적합성 복합체 (MHC)-펩티드 다량체가 포함되는, TCR/CD3에 대한 다가 항체 또는 리간드이다. 예를 들어 문헌 [Yee, et al., Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8+ T cell clones for the treatment of patients with metastatic melanoma: In vivo persistence, migration, and antitumor effect of transferred T cells, Proc Natl. Acad. Sci. USA 99(25): 16168-16173 (2002)]; [Butterfield, et al., T-Cell responses to HLA-A*0201 immunodominant peptides derived from .alpha.-fetoprotein in patients with hepatocellular cancer, Clin. Cancer Res. 9(16): 5902-5908 (2003)]; 및 [Yee, et al., Isolation of high avidity melanoma-reactive CTL from heterogeneous populations using peptide-MHC tetramers, J. Immunol. 162: 2227-2230 (1999)]를 참조하고, 이들 각각은 이에 의해 전문이 참조로 포함된다. MHC-펩티드 다량체는 MHC 클래스 I/항원성 펩티드 복합체 또는 MHC 클래스 II/항원 펩티드 복합체일 수 있다. 항원 펩티드는 자가항원성 펩티드 또는 동종항원 펩티드일 수 있다. 항원 펩티드는 전형적으로 자가면역 질환-연관 펩티드, 개체에게 투여되는 경우 자가면역 반응을 조정하는데 효과적인 펩티드, 또는 개체에서 원치 않는 면역 응답을 촉구하는 항원이다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2008/0131445 (Bluestone, et al., CD127 Expression Inversely Correlates wit FoxP3 and Suppressive Functions of CD4+ Tregs)를 참조하고, 이는 이에 의해 전문이 참조로 포함된다. 본원에서 사용되는 경우에, "자가항원 펩티드" 또는 "자가-항원"라는 용어는 포유동물에 대해 천연이고 포유동물에서 병리학적으로 면역원성인 항원 또는 에피토프를 지칭한다.
자가항원성 펩티드는 MHC 클래스 II 분자와 복합체를 형성할 수 있는 미모토프(mimotope) 펩티드일 수도 있다. 미모토프 펩티드는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2008/0131445 (Bluestone, et al., CD127 Expression Inversely Correlates wit FoxP3 and Suppressive Functions of CD4+ Tregs)에 기술되어 있고, 이는 이에 의해 전문이 참조로 포함된다. 본원에서 사용되는 경우에, "동종항원 펩티드"라는 용어는 동일한 종으로부터의 또 다른 개체에게 주사되는 경우에 이를 제거하는 것을 목표로 하는 면역 응답을 촉발하는, 생물의 자가-인식 시스템의 일부인 항원 또는 에피토프를 지칭한다. 예시적인 MHC 클래스 II 분자/펩티드 복합체가, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2008/0131445 (Bluestone, et al., CD127 Expression Inversely Correlates wit FoxP3 and Suppressive Functions of CD4+ Tregs)에 기술되어 있고, 이는 이에 의해 전문이 참조로 포함된다.
그렇지 않으면 통상적인 T 세포로부터 TCR/CD3 활성화제를 사용하여 조절 T 세포를 확장시키는 프로토콜은 자가항원-특이적 MHC-펩티드 사량체, 펩티드-펄스(pulsed) DC (문헌 [Yamazaki, et al., J. Exp. Med. 198: 235-247, 2003]) 또는 인공 APC (문헌 [Maus, et al., Nat. Biotechnol. 20:143-148, 2002])를 사용하여 세포 표면 표현형과 독립적으로 개체로부터 조절 T 세포를 확장시키는 것을 포함한다. 또한, 시험관내 및 생체내 접근법의 조합이 요법의 효과를 강화할 수 있다. 예를 들어, 최근의 연구는 자가 항원, 변경된 펩티드 리간드 및 심지어 비-특이적인 자극 예컨대 FcR에 결합하지 않는 α-CD3 모노클로날 항체의 투여가 항원-특이적 조절 T 세포 활성을 촉진할 수 있다는 것을 나타냈다. 예를 들어, 문헌 [Apostolou, et al., J. Exp. Med. 199: 1401-1408 (2003)]; [Belghith, et al., Nat. Med. 9: 1202-1208 (2003)]을 참조하고, 이들 각각은 이에 의해 전문이 참조로 포함된다. 따라서, 조절 T 세포를 유도하기 위한 생체내 면역화를 생체외 확장과 조합하는 것 또는 이의 반대가 유리할 수 있다.
한 실시양태에서, 자극성 조성물은 MHC 클래스 I/항원성 펩티드 복합체, 특히 이같은 MHC/펩티드 복합체의 응집물을 포함한다. 이러한 실시양태의 측면에서, 자극성 조성물은 MHC 클래스 I/동종항원 펩티드 복합체 또는 MHC 클래스 I/항원성 펩티드 복합체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 자극성 조성물은 MHC 클래스 II/항원성 펩티드 복합체, 특히 이같은 MHC/펩티드 복합체의 응집물을 포함한다. 이러한 실시양태의 측면에서, 자극성 조성물은 MHC 클래스 II/동종항원 펩티드 복합체 또는 MHC 클래스 II/항원성 펩티드 복합체를 포함한다. 다수의 적용가능한 방법이 기능성 MHC 클래스 I/펩티드 및 MHC 클래스 II/펩티드 복합체를 생성시키기 위해 업계에 공지되어 있다.
TCR 공동자극제 활성화제는 예를 들어 CD28, GITR, B7-1/2, CD5, ICOS, OX40 또는 CD40과 같은 TCR 공동자극제에 대해 특이적인 다가 항체 또는 리간드이다. 예를 들어, 문헌 [Shimizu et al., Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance, Nat. Immunol. 3(2): 135-142 (2002)]; [Tone et al., Mouse glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand is co-stimulatory for T cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100(25): 15059-15064 (2003)]을 참조하고, 이들 각각은 이에 의해 전문이 참조로 포함된다. 공동자극제는 작동제 항체, 예컨대 CD28, GITR, B7-1/2, CD5, ICOS, OX40 또는 CD40에 결합하는 작동제 항체일 수 있다.
제2 조절 T 세포 자극제는 사이토카인, 예를 들어, 간세포 성장 인자, 과립구 콜로니 자극 인자, 인터루킨 예컨대 IL-2, IL-6, IL-7, IL-13, 및 IL-15이다. 유효량은 전형적으로 약 200 내지 약 2500 IU/㎖이다.
한 실시양태에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 확장시키는 단계가 T-세포의 하위집단을 항원과 접촉시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단이 세포의 집단을 항원-특이적 조절 T 세포 자극성 조성물과 접촉시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 자극성 조성물은 MHC 클래스 II/자가항원성 펩티드 복합체를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단이 세포의 집단을 항원-특이적 조절 T 세포 자극성 조성물 및 또 다른 자극제 또는 제2 조절 T 세포 자극제와 접촉시키는 것에 의해 달성될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 확장시키는 단계가 T-세포의 하위집단을 작동제 항체와 접촉시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 작동제 항체는 α-CD3 항체 또는 α-CD28 항체이다.
또 다른 실시양태에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 확장시키는 단계가 T-세포의 하위집단을 작동제 항체 및 제2 자극제와 접촉시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 제2 자극제는 사이토카인이다. 이러한 실시양태의 측면에서, 사이토카인은 인터루킨, 예를 들어, IL-2이다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 확장시키는 단계가 T-세포의 하위집단을 TGFβ 또는 라파마이신의 존재 하에 α-CD3 항체 또는 α-CD28 항체, 및 IL-2와 접촉시키는 것에 달성될 수 있다.
자극성 조성물의 각각의 성분의 최적의 농도, 배양 조건 및 기간은 일상적인 실험을 사용하여 경험적으로 결정할 수 있다. 최대 확장이 경험적으로 결정되고, 이는 예를 들어 세포 유형, 인큐베이션 조건에 의해 변할 것이다. 이러한 실시양태의 측면에서, 원하는 바이오마커 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 최대 확장은, 예를 들어, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 300배 이상, 500배 이상 또는 800배 이상일 수 있다.
본 명세서의 측면들은, 부분적으로, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 방법을 개시한다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 입양 세포 면역요법이다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 개체-적합성 T 세포의 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계; T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 방법은 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여하기 전에 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 방법은 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여하기 전에 CD6low/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 방법은 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여하기 전에 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 방법은 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여하기 전에 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD6low /- CD127low /-발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 방법은 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여하기 전에 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드 및 CD127 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커 및 CD1276 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD6low /- CD127low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 방법은 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여하기 전에 CD6low/- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD4+ CD25+ CD6low/- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 방법은 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여하기 전에 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 방법은 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여하기 전에 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커, CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD25+ CD6low/- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- CD127low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 방법은 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여하기 전에 CD25+ CD6low /- CD127low/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드, CD6 바이오마커 리간드 및 CD127 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커, CD6 바이오마커 및 CD127 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; CD25+ CD6low/- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및 CD25+ CD6low /- CD127low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계를 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 방법은 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여하기 전에 CD25+ CD6low /- CD127low/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함한다.
스크리닝, 접촉, 단리 및 확장 단계는 본원에 기술된 바와 같다. 수득된 생물학적 샘플은 개체-적합성 T-세포의 집단을 포함한다. 본원에서 사용되는 경우에, "개체-적합성 T-세포"라는 용어는 과도한 만성 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)을 초래하지 않으면서, 임의적으로는 면역억제 요법과 함께, 대상체 내로 도입될 수 있는 세포를 지칭한다. 수득된 개체-적합성 T-세포의 집단은 항원 또는 자가항원-특이적 조절 T 세포를 포함할 수 있고, 항원 또는 자가항원-특이적 조절 T 세포가 존재하는 임의의 공급원, 예컨대 말초혈, 제대혈, 흉선, 림프절, 지라 및 골수로부터 유래될 수 있다. 생물학적 샘플은 건강한 개체, 또는 본원에 개시된 바와 같은 요법에 부합하는 본원에 개시된 바와 같은 면역-기반 장애를 앓고 있거나 이로부터 회복 중인 개체로부터 수득될 수 있다.
한 실시양태에서, 개체-적합성 세포의 집단을 포함하는 생물학적 샘플, 즉 자가 세포가 개체로부터 수득된다. 또 다른 실시양태에서, 개체-적합성 세포의 집단을 포함하는 생물학적 샘플이 개체와 상이한 기증자로부터 수득된다. 기증자는 바람직하게는 동계이지만, 또한 동종이계일 수 있거나, 심지어 이종발생성일 수 있고, 단, 과도한 만성 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)을 초래하지 않으면서, 임의적으로는 면역억제 요법과 함께, 대상체 내로 도입될 수 있다는 점에서 수득된 세포는 개체-적합성이다. 동종이계 기증자 세포는 바람직하게는 인간-백혈구-항원 (HLA)-적합성이고, 전형적으로는 면역억제 요법과 함께 투여된다. 대상체-적합성이 되기 위해, 이종발생성 세포가 감마 방사선조사 또는 PEN10 처리에 적용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조절 T 세포의 공급원은 사체 조직으로부터의 것일 수 있다.
원하는 바이오마커 발현 패턴의 하위집단 T-세포가 개체에게 투여된다. 개체는 면역 반응의 조정을 원하는 임의의 포유동물일 수 있다. 개체에는 인간이 포함되고, 인간은 환자일 수 있다. 전형적으로, 면역-기반 장애에 대한 통상적인 치료의 후보인 임의의 개체가 본원에 개시된 면역-기반 장애 치료의 후보이다. 수술전 평가는 이러한 절차의 모든 관련 위험 및 이점이 개시된 철저한 사전 동의서에 더하여 일상적인 이력 및 신체 검사를 전형적으로 포함한다.
원하는 바이오마커 발현 패턴의 하위집단 T-세포는 조절 T 세포의 집단이다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD6low /- 발현 패턴을 포함한다.
이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD6low /- CD38low /- 발현 패턴을 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD6low /- CD49low /- 발현 패턴을 포함한다.
이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD4+ CD25+ CD6low/- 발현 패턴을 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD25+ CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD6low /- CD127low /- CD49dlow /- 발현 패턴을 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD6low /- CD127low/- CD38low /- 발현 패턴을 포함한다.
이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD4+ CD25+ CD6low/- CD127low /- 발현 패턴을 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD4+ CD25+ CD6low /- CD49dlow /- 발현 패턴을 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD4+ CD25+ CD6low /- CD38low /- 발현 패턴을 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD4+ CD25+ CD6low /- CD45RAlow /- 발현 패턴을 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD25+ CD6low /- CD127low /- CD49dlow /- 발현 패턴을 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD25+ CD6low /- CD127low/- CD38low /- 발현 패턴을 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD6low /- CD127low /- CD49dlow /- CD38low /- 발현 패턴을 포함한다.
이러한 실시양태의 다른 측면에서, 조절 T 세포의 집단은 CD6low /- 발현 패턴, CD25+ CD6low /- 발현 패턴, 또는 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴 중 하나를 포함하고, CD127low/- 발현 패턴, CD49dlow /- 발현 패턴, CD38low /- 발현 패턴, CD45RAlow /- 발현 패턴, HLA-Dr+ 발현 패턴, HLA-Drlow /- 발현 패턴, FoxP3+ 발현 패턴, FoxP3low /- 발현 패턴, CTLA-4+ 발현 패턴, CTLA-4low /- 발현 패턴, GITR+ 발현 패턴, GITRlow /- 발현 패턴, LAG-3+ 발현 패턴, LAG-3low /- 발현 패턴, CD39+ 발현 패턴, CD39low /- 발현 패턴, 헬리오스+ 발현 패턴, 헬리오스low /- 발현 패턴, FcRL3+ 발현 패턴, FcRL3low /- 발현 패턴, CCR7+ 발현 패턴, CCR7low /- 발현 패턴, CCR4+ 발현 패턴, CCR4low /- 발현 패턴, CCR8+ 발현 패턴, CCR8low /- 발현 패턴, CD62L+ 발현 패턴, CD62Llow /- 발현 패턴, ICOS+ 발현 패턴, ICOSlow /- 발현 패턴, CD103+ 발현 패턴, CD103low /- 발현 패턴, PD-1+ 발현 패턴, PD-1low /- 발현 패턴, CD134+ 발현 패턴, CD134low /- 발현 패턴, GARP+ 발현 패턴, GARPlow /- 발현 패턴, CD45RB+ 발현 패턴, CD45RBlow /- 발현 패턴, CD45RO+ 발현 패턴, CD45ROlow /- 발현 패턴, CD95+ 발현 패턴, CD95low /- 발현 패턴, CD122+ 발현 패턴, CD122low /- 발현 패턴, CD147low /- 발현 패턴, CD8+ 발현 패턴, CD8low /- 발현 패턴, 또는 이들의 임의의 조합물을 추가로 포함한다.
전형적으로, 개체에게 투여되는 원하는 바이오마커 발현 패턴의 조절 T-세포는 미리 정해진 항원- 또는 자가항원-특이적 조절 T 세포를 포함하는 조성물이다. 이같은 미리 정해진 항원- 또는 자가항원-특이적 조절 T 세포는 표적화된 알레르기 또는 자가면역 반응과 연관된 미리 정해진 항원 또는 자가항원에 대해 특이적인 것이 바람직한 세포로부터 본원에 개시된 방법을 사용하여 수득 및 확장된다. 개체에게 투여되는 조절 T-세포는 억제성 또는 기타 생물학적 인자, 예컨대 IL-4, 줄기 세포 성장 인자, 혈관신생 조절제, 또는 유전 결함을 염증 부위에 전달하는 "트로이 목마"로서의 역할을 할 수 있다.
면역-기반 장애에 대해 개체가 치료된다. 본원에서 사용되는 경우에, "면역-기반 장애"라는 용어는 비정상적인 면역 응답이 개체에서의 면역-기반 장애의 발병기전에 기여하는 용태, 장애 또는 질환을 지칭한다. 비정상적인 면역 응답은 원치 않는 면역 또는 자가면역 응답을 특징으로 하는 개체에서의 임의의 면역 반응이다. 개시된 치료 방법은 숙주에서의 비정상적인 면역 응답의 조정이 요망되는 다양하고 상이한 면역-기반 장애를 치료하는데 유용하다. 면역-기반 장애에는, 비제한적으로, 자가면역 용태, 장애 또는 질환, 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, 암, 면역-기반 염증성 질환, 및 포유동물 및 인간을 침습하고 포유동물 및 인간에서 잔존하는 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 생물로부터의 감염성 비-자가 항원에 대한 지속적이고 진행성인 면역 반응이 포함된다. 이같은 용태 및 장애에는 알레르기 및/또는 천식이 포함된다. 알레르기 및 천식은 꽃가루, 동물 비듬 및 식품 단백질과 같은 외래 또는 비-자가 항원으로의 민감화에 기인할 수 있다. 유발성 외래 항원의 공급원은 식물, 진균, 곰팡이, 또는 기타 환경 오염물일 수 있다. 예를 들어, 면역-기반 장애는 항원이 자가항원인 자가면역 응답, 항원이 자가항원인 이식편 대 숙주 면역 응답, 항원이 해로운 면역 응답을 유발하는 이식된 조직 또는 기관 또는 알레르기원의 정제 또는 미정제 성분인 알레르기, 천식, 조직 또는 기관 이식 거부 또는 이식편 대 숙주 면역 응답일 수 있다.
자가면역은 포유동물 및 인간을 침습하고 포유동물 및 인간에서 잔존하는 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 생물로부터의 감염성 비-자가 항원과 별개인 비-감염성 자가 항원에 대한 지속적이고 진행성인 면역 반응으로 정의된다. 자가면역 응답은 개체의 면역계가 자가-항원을 외래 물질로 인식하여, 자가-반응성 이펙터 면역 세포의 생산에 이를 때 발생한다. 자가 반응성 이펙터 면역 세포에는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 및 B 세포가 포함되지만 이에 한정되지 않는 다양한 계통으로부터의 세포가 포함된다. 정확한 메커니즘은 상이하지만, 자가면역 질환을 앓고 있는 개체 내의 자가반응성 이펙터 면역 세포의 존재는 개체의 조직 및 세포의 파괴에 이르러, 병리학적 증상을 초래한다. 당업자에게 공지된 바와 같이 자가면역 질환에 걸린 개체가 진단될 수 있다. 이같은 개체는 증상에 의해 및/또는 개체로부터 샘플을 수득하고, 자가반응성 T 세포를 단리하고, 개체 내의 자가반응성 T 세포의 수준을 대조군과 비교하는 것에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2006/0105336 참조. 개체 내의 이같은 세포의 존재, 따라서 개체 내의 자가면역 질환, 예컨대 항원 특이적 자가면역 질환의 존재를 결정하기 위한 다수의 검정법이 당업자에게 공지되어 있고, 개시된 방법에서 쉽게 사용된다. 관심의 대상인 검정법에는, 예를 들어, 문헌 [Autoimmunity 36(6-7): 361-366 (2003)]; [J. Pediatr. Hematol. Oncol. 25(Suppl 1): S57-S61 (2003)]; [Proteomics 3(11): 2077-2084 (2003)]; [Autoimmun. Rev. 2(1): 43-49 (2003)]에 기술된 것들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
자가면역 용태, 장애 또는 질환은 각각의 질환의 주요 임상병리학적 특색에 따라 전신성 및 기관-특이적 자가면역 용태, 장애 또는 질환으로 크게 분류될 수 있다. 전신성 자가면역 용태, 장애 또는 질환에는, 비제한적으로, 전신 홍반 루푸스 (SLE), 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 류머티스성 관절염 및 다발근육염이 포함된다. 기관-특이적 자가면역 용태, 장애 또는 질환은 내분비학 (제1형 당뇨병, 하시모토 갑상선염, 애디슨병 등), 피부과학 (보통 천포창, 건선, 피부경화증), 혈액학 (자가면역 용혈성 빈혈), 신경성 (다발성 경화증)일 수 있거나, 또는 신체 조직의 사실상 모든 제한된 덩어리를 수반할 수 있다. 자가면역 용태, 장애 또는 질환에는, 비제한적으로, 급성 파종 뇌척수염 (ADEM), 애디슨병, 알레르기 또는 민감증, α-인지질 항체 증후군 (APS), 관절염, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 위염, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환, 자가면역 다발성 내분비병증 증후군, 자가면역 포도망막염, 물집유사 천포창, 복강 질환, 샤가스병, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 결장염, 크론병, 제1형 당뇨병 (IDDM), 자궁내막증, 섬유근육통, 굿패스쳐 증후군, 그레이브병, 길랑 바레 증후군 (GBS), 하시모토 갑상선염, 화농성 한선염, 특발성 혈소판감소성 자반병, 염증성 장 질환, 사이질 방광염, 루푸스 (원판상 홍반 루푸스, 약물-유도 홍반성 루푸스, 루푸스 신장염, 신생아 루푸스, 아급성 피부 홍반 루푸스 및 전신성 홍반 루푸스 포함), 국소 피부경화증, 다발성 경화증 (MS), 중증 근무력증, 근육병증, 기면증, 신경근긴장증, 보통 천포창, 악성 빈혈, 원발성 쓸개관 간경화, 재발성 파종 뇌척수염 (다상성 파종 뇌척수염), 류머티스 열, 정신분열병, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 건초염, 갑상선염, 혈관염, 및 백반증이 포함된다. 미국 특허 출원 공개 2006/138059 (Pamela D. Van Schaack & Kenneth L. Tong, Treatment of Autoimmune Disorder with a Neurotoxin)를 참조하고, 이는 이에 의해 전문이 참조로 포함된다. 다발성 경화증 (EAE: 실험적 자가면역 뇌척수염), 중증 근무력증 (EMG: 실험적 중증 근무력증) 및 신경염 (EAN: 실험적 자가면역 신경염)을 포함하여, 내성을 유도하기 위해 자가항원의 T 세포 에피토프를 사용하는 다수의 동물 모델이 확립되어 있다.
본 발명의 측면은, 부분적으로, 이식 거부를 제공한다. 이식 거부는 수용자의 면역계가 이식된 기관 또는 조직을 공격하여 이식물 수용자의 신체가 이식된 기관 또는 조직을 받아들이지 않을 때 발생한다. 적응성 면역 응답인 이식 거부는 T 세포 매개 및 체액성 면역 (항체) 메커니즘 양쪽 모두를 통해 매개된다. 미스매치되는(mismatched) 대립유전자의 개수가 거부 응답의 속도 및 규모를 결정한다. 상이한 이식물에 대해 상이한 메커니즘이 작용하는 경향이 있다.
이식 거부는 초급성 거부, 급성 거부, 또는 만성 거부로 분류될 수 있다. 초급성 거부는 기증자에 대한 선재 항체 (예를 들어, ABO 혈액형 항체)가 있는 수용자에서의 보체-매개 응답이다. 초급성 거부는 이식하고 나서 수분 이내에 발생하고, 중증 전신성 염증 응답을 방지하도록 즉각적으로 제거되어야 한다. 급속한 혈액 응고가 발생한다.
급성 거부는 빠르게는 이식 1주일 후에 시작할 수 있다 (즉각적인 초급성 거부와 대조적임). 급성 거부의 위험은 이식 후 최초 3개월에 가장 높다. 그러나, 급성 거부는 이식하고 나서 수개월 내지 수년 후에 또한 발생할 수 있다. 급성 거부가 일반적으로 이식 1주일 후에 시작하는 이유는 T-세포가 거부 메커니즘에 수반되기 때문이다. 거부가 시작되기 전에 이러한 T-세포가 분화되어야 한다. T-세포는 이식된 조직 내의 세포가 용해되게 하거나, 또는 이식된 조직의 괴사를 야기하는 사이토카인을 생산한다. 급성 거부의 단일 에피소드는 적절하게 인식 및 치료된다면 우려를 야기하지 않고, 기관 부전에 거의 이르지 않는다. 급성 거부는 면역억제 약물의 사용을 통해 면역 응답이 변경되지 않는 한 모든 이식에서 어느 정도 발생한다 (일란성 쌍둥이 간의 이식 제외). 이는 신체의 모든 세포 상에 존재하는 HLA의 미스매치에 의해 야기된다. 각각의 HLA의 다수의 상이한 대립유전자가 있어서, 기증자 조직 및 수용자 신체 내의 모든 HLA 사이의 완벽한 매치가 매우 드물다.
이식된 기관 또는 조직의 만성 거부는 거부가 이식된 조직에 대한 이해가 부족한 만성 염증성 및 면역 응답에 기인하는 경우이다. 폐 이식 후의 만성 거부는 폐 이식 환자에서의 장기 이환률 및 사망률의 주된 원인이다.
이식편-대-숙주 질환 (GVHD)이 "이식 거부"라는 용어에 또한 포함된다. GVHD는 이식된 골수 내의 기능성 면역 세포가 수용자를 "외래물질"로 인식하고 면역학적 공격을 개시하는 동종이계 골수 이식의 통상적인 합병증이다. 이는 특정 상황 하에 수혈에서 또한 일어날 수 있다. GVHD는 급성 및 만성 형태로 분류된다. 급성 또는 전격 형태의 이러한 질환 (aGVHD)은 일반적으로 이식 후 최초 100일 이내에 관찰되고, 관련된 이환률 및 사망률로 인해 이식에 대한 주요 난점이다. 만성 형태의 이식편-대-숙주 질환 (cGVHD)은 일반적으로 100일 후에 발생한다. cGVHD의 중등도 내지 중증 사례의 출현은 장기 생존에 불리하게 영향을 미친다. 급성 및 만성 GVHD는 상이한 면역 세포 부분집합, 상이한 사이토카인 프로파일, 다소 상이한 숙주 표적을 수반하는 것으로 보이고, 치료에 상이하게 응답한다.
급성 GVHD는 간, 피부 및 점막, 위장관, 면역계 (조혈계, 예를 들어, 골수 및 흉선) 자체, 및 폐 (특발성 폐렴 형태)에 대한 선별적인 손상을 특징으로 한다. 위장관의 급성 GVHD는 중증 장 염증, 점막 박리(sloughing), 중증 설사, 복부 통증, 구역, 및 구토를 초래할 수 있다. 이는 전형적으로 장 생검을 통해 진단된다. 간 GVHD는 급성 환자에서의 빌리루빈 수준에 의해 측정된다. 피부 GVHD는 확산성 반점구진성 발진을 초래하고, 때때로 레이스 패턴을 초래한다. 급성 GVHD는 하기와 같이 단계화된다: 각각의 기관이 개별적으로 낮게는 1에서 높게는 4까지 단계화되는 종합 등급 (피부-간-장). IV등급 GVHD 환자는 일반적으로 예후가 불량하다. GVHD가 중증이고, 제어되기 위해 스테로이드 및 추가적인 작용제를 수반하는 강한 면역억제를 필요로 하면, 환자에서 면역억제의 결과로 중증 감염이 발달될 수 있고, 환자가 감염으로 사망할 수 있다. 만성 GVHD는 상기 기관들을 또한 공격하지만, 이의 장기 과정에 걸쳐 결합 조직 및 외분비샘에 대한 손상을 또한 야기할 수 있다.
본원에 개시된 항원-특이적 조절 T 세포는 병원성이 병원체의 세포병변 효과의 결과가 아니라 감염원에 대한 면역염증성 응답에 의해 야기되는 손상인 감염성 질환을 치료하는데 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 발현된 바이러스 항원을 표적으로 하는 조절 T 세포는 바이러스-유도 면역염증성 질환을 치료할 수 있는데, 이는 이러한 T 세포가 감염에 의해 야기되는 국소적인 조직 손상을 억제하는데, 그리고 자가면역 질환 발달을 자극하는 염증을 감소시키는데 사용될 수 있기 때문이다. 바이러스-유도 면역염증성 질환의 비제한적인 예로는 C형 간염, HSV-유도 각막 염증, 콕사키(Coxsackie)-유도 췌장염, 및 콕사키-유도 제1형 당뇨병이 포함된다.
본원에서 사용되는 경우에, "치료하는"이라는 용어는 개체에서 면역-기반 장애의 임상 증상을 감소시키거나, 호전시키거나, 또는 제거하는 것; 또는 개체에서 면역-기반 장애의 임상 증상의 개시를 지연시키거나 또는 방지하는 것을 지칭한다. 예를 들어, "치료하는"이라는 용어는 면역-기반 장애가 특징으로 하는 용태의 증상을, 예를 들어, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상 또는 100％ 이상만큼 감소시키는 것을 의미할 수 있다. 면역-기반 장애의 증상에는, 비제한적으로, 부종, 충혈, 홍반, 타박상, 압통, 경직, 부어오름, 발열, 오한, 코막힘, 머리 무거움, 호흡 곤란, 체액 정체, 혈병, 식욕 상실, 심박수 증가, 육아종 형성, 섬유소, 고름, 비-점착성 장액, 궤양, 자가-반응성 이펙터 면역 세포의 생산 증가, 염증, 및 통증이 포함된다. 면역-기반 장애와 연관된 실제 증상이 주지되어 있고, 면역-기반 장애의 위치, 면역-기반 장애의 원인, 면역-기반 장애의 중증도, 면역-기반 장애에 감염된 조직 또는 기관이 비제한적으로 포함되는 요인들을 고려하여 당업자가 이를 결정할 수 있다.
본 발명의 측면은, 부분적으로, 자가면역 장애 또는 이식 거부와 연관된 증상을 감소시키는 것을 제공한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 감소되는 증상은 염증, 피로, 어지러움, 권태감, 발열 상승 및 높은 체온, 수족에서의 저온에 대한 극심한 민감성, 근육 및 관절의 허약 및 경직, 체중 변화, 소화 또는 위장 문제, 낮은 혈압 또는 높은 혈압, 과민성, 불안, 또는 우울증, 불임 또는 성욕 감소 (낮은 리비도), 혈당 변화, 및 자가면역 질환의 유형에 따른 기관 또는 조직 크기의 변화, 또는 기관 또는 조직 파괴이다.
본 발명의 측면은, 부분적으로, 염증과 연관된 증상을 감소시키는 것을 제공한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 감소되는 증상은 부종, 충혈, 홍반, 타박상, 압통, 경직, 부어오름, 발열, 오한, 코 및 기관지를 비롯한 호흡관의 울혈, 동(sinus) 울혈, 호흡 문제, 체액 정체, 혈병, 식욕 상실, 심박수 증가, 육아종 형성, 섬유소, 고름, 또는 비-점착성 장액, 궤양 형성, 또는 통증이다.
본원에 개시된 치료 방법과 함께 사용되는 본원에 개시된 조절 T 세포의 양은 전형적으로 치료적 유효량일 것이다. 본원에서 사용되는 경우에, "치료적 유효량"이라는 용어는 "치료적 유효 용량"과 동의어이고, 의사가 추구하는 생물학적 또는 임상 응답을 이를 필요로 하는 개체에서 일으킬 조절 T 세포의 양을 지칭한다. 비제한적인 예로서, 유효량은 부종, 충혈, 홍반, 타박상, 압통, 경직, 부어오름, 발열, 오한, 코막힘, 머리 무거움, 호흡 곤란, 체액 정체, 혈병, 식욕 상실, 심박수 증가, 육아종 형성, 섬유소, 고름, 비-점착성 장액, 궤양, 자가-반응성 이펙터 면역 세포의 생산 증가, 염증, 또는 통증과 같은 면역-기반 장애의 증상을 감소시키는데 충분한 양이다.
개시된 방법의 특정 용도를 위해 투여될 적합한 유효량이 본원에서 제공된 지침을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 면역-기반 장애를 특징으로 하는 용태의 증상을 치료하는 것에서의 본원에 개시된 조절 T 세포의 유효성을 하나 이상의 임상 증상, 및/또는 이러한 용태와 연관된 생리학적 지표를 관찰함으로써 결정할 수 있다. 치료에 대한 면역-기반 장애에 걸린 개체의 응답을 이의 증상의 중증도를 결정함으로써 또는 면역-기반 장애에 걸린 개체로부터의 샘플 내의 자가반응성 T 세포의 빈도를 결정함으로써 모니터링할 수 있다. 면역-기반 장애의 증상의 중증도가 자가반응성 T 세포의 개수와 상호관련될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2006/0105336 참조. 또한, 샘플 내의 자가반응성 T 세포 개수의 증가를 증상의 중증도를 최소화하도록 및/또는 증상이 나타나기 전에 면역-기반 장애를 치료하도록 의도되는 치료를 적용하기 위한 지표로서 사용할 수 있다. 또 다른 예로서, 면역-기반 장애를 특징으로 하는 용태의 증상을 치료하는 것에서의 본원에 개시된 조절 T 세포의 유효성을 기존의 T-세포 주입 요법으로의 임상 경험에 의존하여 결정할 수 있다. 동반 요법에 대한 요구 감소에 의해 면역-기반 장애에서의 개선이 또한 지시될 수 있다. 당업자는 특정 면역-기반 장애와 연관된 적합한 증상 또는 지표를 알 것이고, 개체가 본원에 개시된 바와 같은 치료에 대한 후보인지를 결정하는 방법을 알 것이다. 당업자는 요법 과정에 걸쳐 개체의 용태를 모니터링할 수 있다는 것과 투여되는 본원에 개시된 화합물 또는 조성물의 유효량이 이에 따라 조정될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
이러한 실시양태의 측면에서, 치료적 유효량의 본원에 개시된 조절 T 세포는 면역-기반 장애와 연관된 증상을, 예를 들어, 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상 또는 100％ 이상만큼 감소시킨다. 이러한 실시양태의 다른 측면에서, 치료적 유효량의 본원에 개시된 조절 T 세포는 면역-기반 장애와 연관된 증상을, 예를 들어, 10％ 이하, 20％ 이하, 30％ 이하, 40％ 이하, 50％ 이하, 60％ 이하, 70％ 이하, 80％ 이하, 90％ 이하 또는 100％ 이하만큼 감소시킨다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 치료적 유효량의 본원에 개시된 조절 T 세포는 면역-기반 장애와 연관된 증상을, 예를 들어, 약 10％ 내지 약 100％, 약 10％ 내지 약 90％, 약 10％ 내지 약 80％, 약 10％ 내지 약 70％, 약 10％ 내지 약 60％, 약 10％ 내지 약 50％, 약 10％ 내지 약 40％, 약 20％ 내지 약 100％, 약 20％ 내지 약 90％, 약 20％ 내지 약 80％, 약 20％ 내지 약 20％, 약 20％ 내지 약 60％, 약 20％ 내지 약 50％, 약 20％ 내지 약 40％, 약 30％ 내지 약 100％, 약 30％ 내지 약 90％, 약 30％ 내지 약 80％, 약 30％ 내지 약 70％, 약 30％ 내지 약 60％, 또는 약 30％ 내지 약 50％만큼 감소시킨다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 조절 T 세포의 치료적 유효량은 면역-기반 장애와 연관된 증상을, 예를 들어, 1주일 이상, 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상, 9개월 이상, 10개월 이상, 11개월 이상, 또는 12개월 이상 동안 감소시키는데 충분한 투여량이다.
이러한 실시양태의 다른 측면에서, 본원에 개시된 조절 T 세포의 치료적 유효량은, 예를 들어, 약 1×107개의 세포, 약 1×108개의 세포, 약 1×109개의 세포, 약 1×1010개의 세포, 또는 약 1×1011개의 세포이다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 조절 T 세포의 치료적 유효량은, 예를 들어, 1×107개 이상의 세포, 1×108개 이상의 세포, 1×109개 이상의 세포, 1×1010개 이상의 세포, 또는 1×1011개 이상의 세포이다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 조절 T 세포의 치료적 유효량은, 예를 들어, 약 1×107개의 세포 내지 약 1×1011개의 세포, 약 1×108개의 세포 내지 약 1×1011개의 세포, 약 1×109개의 세포 내지 약 1×1011개의 세포, 약 1×1010개의 세포 내지 약 1×1011개의 세포, 약 1×107개의 세포 내지 약 1×1010개의 세포, 약 1×108개의 세포 내지 약 1×1010개의 세포, 약 1×109개의 세포 내지 약 1×1010개의 세포, 또는 약 1×108개의 세포 내지 약 1×109개의 세포이다.
본원에 개시된 조절 T 세포는 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 비제한적인 예로서, 세포가 정맥 내로, 또는 억제될 면역 응답의 위치에 인접한 체강, 예컨대 복막강 내로 전달될 수 있거나, 또는 직접적으로 면역 반응 부위 내에 또는 이에 인접하게 주사될 수 있다. 예를 들어, 정맥내 투여가 많은 이같은 용태의 치료에서 유리하다.
주사에 의한 투여를 위한 통상적인 제약상 허용되는 비경구 담체를 사용하여 본원에 개시된 조절 T 세포를 약제 및 제약 조성물로 제형할 수 있다. 이러한 담체는 비독성 및 치료적일 수 있고, 다수의 제형이 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences]에 기재되어 있다. 부형제의 비제한적인 예는 식염수, 링거 용액, 식염수-덱스트로스 용액, 및 행크의 평형 염액이다. 제약 조성물은 미량의 첨가물 예컨대 등장성, 생리학적 pH 및 안정성을 유지시키는 물질을 또한 함유할 수 있다. 본원에 개시된 조절 T 세포를 포함하는 약제 및 조성물은 단위 용량 양식일 수 있다. 일반적으로, 단위 용량은 치료적 유효량의 조절 T-세포를 함유할 것이다. 이러한 양은 일반적으로 환자의 연령, 사이즈, 성별, 치료될 용태 및 이의 중증도, 세포 상태, 및 샘플 기증자로부터 수득되는 바와 같은 이의 원래 특성에 좌우될 것이다. 치료적으로 유효한 투여량을 확인하기 위해 투여량을 적정하는 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 조절 T 세포의 치료적 유효량은 약 1×107개 내지 약 1×1011개이다.
본 명세서의 측면은, 부분적으로, 본원에 개시된 방법 중 임의의 것을 수행하는데 유용한 성분을 포함하는 키트를 제공한다.
한 실시양태에서, 키트는 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리 및/또는 강화에 필요한 성분을 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인 및/또는 단리를 위한 키트는 CD6 바이오마커 리간드를 포함한다.
이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리 및/또는 강화를 위한 키트는 CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드를 포함한다.
이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리 및/또는 강화를 위한 키트는 CD6 바이오마커 리간드 및 CD127 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드를 포함한다.
한 실시양태에서, 이러한 키트들은 3가지 상이한 세포 표면 바이오마커 리간드를 사용하는, 전혈을 사용하는 1-단계 염색 프로토콜로서 디자인된다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 키트는 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 키트는 CD25 바이오마커 리간드, CD6 바이오마커 리간드 및 CD127 바이오마커 리간드를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 키트는 CD6 바이오마커 리간드, CD127 바이오마커 리간드, 및 CD49d 바이오마커 리간드를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 키트는 CD6 바이오마커 리간드, CD127 바이오마커 리간드, 및 CD38 바이오마커 리간드를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 키트는 CD6 바이오마커 리간드, CD49d 바이오마커 리간드, 및 CD38 바이오마커 리간드를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 키트는 FOXPS 바이오마커 리간드를 양성 대조군으로서 포함한다.
이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리 및/또는 강화를 위한 키트는 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드를 포함한다.
이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리 및/또는 강화를 위한 키트는 CD25 바이오마커 리간드, CD6 바이오마커 리간드 및 CD127 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드를 포함한다.
이러한 실시양태의 다른 측면에서, 본원에 개시된 바와 같은 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리 및/또는 강화를 위한 키트는 CD49d 바이오마커 리간드, CD38 바이오마커 리간드, CD45RA 바이오마커 리간드, HLA-DR 바이오마커 리간드, FoxP3 바이오마커 리간드, CTLA-4 바이오마커 리간드, GITR 바이오마커 리간드, LAG-3 바이오마커 리간드, CD39 바이오마커 리간드, 헬리오스 바이오마커 리간드, FcRL3 바이오마커 리간드, CCR7 바이오마커 리간드, CCR4 바이오마커 리간드, CCR8 바이오마커 리간드, CD62L 바이오마커 리간드, ICOS 바이오마커 리간드, CD103 바이오마커 리간드, PD-1 바이오마커 리간드, CD134 바이오마커 리간드, GARP 바이오마커, CD45RB 바이오마커, CD45RO 바이오마커, CD95 바이오마커, CD122 바이오마커, CD147 바이오마커, CD8 바이오마커 리간드, 또는 이들의 임의의 조합물을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리 및/또는 강화를 위한 키트는 양성 및/또는 음성 대조군, 및/또는 키트 내용물을 사용함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확인, 단리 및/또는 강화하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리 및/또는 강화를 위한 키트는 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확장시키는데 필요한 성분을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 키트는 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확장시키기 위해 필요한 성분을 포함한다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확장을 위한 키트는 자극성 조성물을 포함한다. 이러한 실시양태의 측면에서, 자극성 조성물은 유효량의 항원 또는 동종항원을 포함한다. 이러한 실시양태의 다른 측면에서, 자극성 조성물은 유효량의 TCR/CD3 활성화제를 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 자극성 조성물은 공동자극제, 제2 조절 T 세포 자극제, T 세포의 생존 및/또는 성장을 일반적으로 촉진하는 작용제, 또는 이들의 임의의 조합물을 추가로 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확장을 위한 키트는 α-CD3 항체, α-CD28 항체, IL-2 또는 IL-15, 및 TGFβ 또는 라파마이신이 포함되는 자극성 조성물을 포함한다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확장을 위한 키트는 양성 및/또는 음성 대조군, 및/또는 키트 내용물을 사용함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확장시키기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확장을 위한 키트는 접시 또는 플라스크와 같은 배양 용기, 배양 배지, 또는 세포 성장을 촉진시키는데 유용한 임의의 필요한 완충제, 인자를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확장을 위한 키트는 본원에 개시된 바와 같은 CD6 바이오마커 리간드, 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드, 또는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드를 추가로 포함할 수 있다.
개시된 바이오마커 리간드는 항체 또는 리간드일 수 있고, 표지될 수 있거나 표지되지 않을 수 있다. 표지되는 경우, 바이오마커는 형광단, 양자점, 인광, 화학발광 화합물, 생체발광 화합물, 발색 화합물, 동위원소 화합물 예컨대 란탄족, 방사성 동위원소, 효소, 비오틴 또는 아비딘 분자, 또는 바이오마커가 결합한 세포를 검출하는데 유용한 임의의 기타 표지와 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 부착될 수 있다. 표지되지 않는 경우, 키트는 바이오마커 리간드를 표지하는데 유용한 표지 및 기타 시약을 추가로 포함할 수 있다. 표지를 항체에 부착하는 방법은 당업자에게 주지되어 있다. 특히 바람직한 표지는 생리학적 조건 하에 미리 정해진 효소와의 접촉에 의해 쉽게 절단 또는 분리될 수 있거나 또는 가수분해에 적용될 수 있는 링커에 의해 바이오마커 리간드에 부착되는 것들이다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, CD4 바이오마커 리간드는 형광-표지 항-CD4 모노클로날 항체이고, CD25 바이오마커 리간드는 형광-표지 항-CD25 모노클로날 항체이며, CD6 바이오마커 리간드는 형광-표지 항-CD6 모노클로날 항체이고, CD127 바이오마커 리간드는 형광-표지 항-CD127 모노클로날 항체이다.
개시된 자극성 조성물은 유효량의 항원-특이적인 TCR/CD3 활성화제를 포함할 수 있다. 자극성 조성물은 하나 이상의 추가적인 작용제, 예를 들어, 공동자극제, 제2 조절 T 세포 자극제, 또는 T 세포의 생존 및/또는 성장을 일반적으로 촉진하는 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 자극성 조성물은 용액 또는 현탁액 중에 존재할 수 있거나, 또는 고체 표면, 예를 들어, 숙주 세포, 비드 또는 기타 기판 상에 고정될 수 있다. 기판으로서 사용하기에 적절한 세포에는 인공 항원-제시 세포 (aAPC)가 포함된다. 비드는 전형적으로는 직경 범위가 1 ㎛ 내지 20 ㎛인, 플라스틱, 유리, 자기, 또는 임의의 기타 적절한 물질일 수 있다. 자극성 조성물, TCR/CD3 활성화제, 공동자극제, 제2 조절 T 세포 자극제, 및 생존 및/또는 성장 촉진 인자는 본원에 기술된 바와 같다.
본원에 기술된 바와 같은 설명서는 다양한 형태로 대상 키트 내에 존재할 수 있고, 하나 이상의 설명서가 키트 내에 존재할 수 있다. 이러한 설명서가 존재할 수 있는 한가지 형태는 적절한 매체 또는 기판, 예를 들어, 정보가 인쇄되어 있는 종이 조각 또는 조각들 상의 인쇄 정보로서, 키트 포장지, 포장 삽입물 등에 존재하는 형태이다. 또 다른 수단은 정보가 기록되어 있는 컴퓨터 판독가능 매체, 예를 들어, 디스켓, 테이프, 또는 CD일 것이다. 존재할 수 있는 또 다른 수단은 원격 장소에서 정보에 접근하도록 인터넷을 통해 사용될 수 있는 웹사이트 주소이다. 임의의 편리한 수단이 키트 내에 존재할 수 있다.
본 명세서의 측면은, 부분적으로, 본원에 개시된 방법에 따라 수득된 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 포함하는 조성물을 개시한다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 포함하는 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 방법에 따라 제조된다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 포함하는 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확장시키는 방법에 따라 제조된다. 이러한 실시양태들의 측면에서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단에는 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포, CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포, CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포, CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포, CD25+ CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포, 또는 CD4+ CD25+ CD6low /- CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포가 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 포함하는 조성물은 제약 조성물이다. 치료적 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 면역억제성 조절 T-세포를 통상적인 제약상 허용되는 부형제와 조합함으로써 제약 조성물을 제조할 수 있다. 전형적인 조절 T 세포의 치료적 유효량이 본원에 개시되고, 전형적으로는 약 1×107개의 세포 내지 약 1×1011개의 세포이다. 바람직하게는, 이러한 제약 조성물은 개체에게 투여되었을 때 불리한 반응, 알레르기성 반응, 또는 기타 적절치 않거나 원치 않는 반응을 일으키지 않는다. 본원에 개시된 제약 조성물은 의학 및 수의학 용도에 유용하다. 제약 조성물을 개체에게 단독으로 또는 다른 보충 활성 화합물, 작용제, 약물 또는 호르몬과 조합하여 투여할 수 있다. 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 가루화, 유화, 캡슐화, 포획 및 동결건조가 비제한적으로 포함되는 다양한 공정 중 임의의 것을 사용하여 제약 조성물을 제작할 수 있다. 제약 조성물은 멸균 용액, 현탁액, 또는 투여에 적절한 임의의 기타 투여 형태가 비제한적으로 포함되는 다양한 형태 중 임의의 형태를 취할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 포함하는 조성물이 본원에 개시된 바와 같은 개체에서의 면역-기반 장애를 치료하는 방법에서 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 포함하는 조성물이 본원에 개시된 바와 같은 면역-기반 장애의 치료를 위한 약제를 제작하는데 사용된다.
본 명세서의 측면은, 부분적으로, 개체에서 면역억제성 조절 T-세포를 강화하는 방법을 개시한다. 한 측면에서, 개시된 방법은 α-CD6 항체를 개체에게 투여하고, 이에 의해 개체 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 강화하는 단계를 포함하며, 상기 투여는 CD6hi /+ 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 작동불가능하게 하지만, CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포는 작동불가능하게 하지 않는다.
개시된 방법을 실행하는데 유용한 항-CD6 항체가, 예를 들어, 미국 6,372,215 (Starling, et al., Monoclonal Antibodies to human CD6); 및 미국 6,572,857 (Casimiro, et al., Anti-CD6 Monoclonal Antibodies and Their Uses)에 기술되어 있고, 이들 각각은 이에 의해 전문이 참조로 포함된다. α-CD6 항체는 본원에 개시된 바와 같은 임의 종류의 항체일 수 있다.
임의의 적절한 투여량 제형 및 투여 경로를 사용하여 α-CD6 항체가 투여될 수 있다. 예를 들어, α-CD6 항체를 포함하는 조성물이 주사에 의해 투여될 수 있다.
본원에 개시된 개체에서의 면역억제성 조절 T-세포를 강화하는 방법과 함께 사용되는 본원에 개시된 α-CD6 항체의 양은 전형적으로 치료적 유효량일 것이다. 면역억제성 조절 T-세포를 강화하기 위해 개체에서 투여되는 α-CD6 항체와 관련하여, 치료적 유효량은 의사가 추구하는 생물학적 또는 임상 응답을 이를 필요로 하는 개체에서 일으킬 α-CD6 항체의 양을 지칭한다. 비제한적인 예로서, α-CD6 항체의 유효량은 개체에서 면역억제성 조절 T-세포를 강화하는데 충분한 양이다.
이러한 실시양태의 측면에서, α-CD6 항체의 치료적 유효량은 개체 내의 CD6low/- 발현 패턴을 포함하는 세포의 개수와 비교하여, CD6hi /+ 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포의 집단을, 예를 들어, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 또는 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 또는 90％ 이상만큼 작동불가능하게 하는 것이다. 이러한 실시양태의 다른 측면에서, α-CD6 항체의 치료적 유효량은 개체 내의 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 세포의 개수와 비교하여, CD6hi/+ 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포의 집단을, 예를 들어, 2배 이상, 4배 이상, 8배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 50배 이상, 또는 100배 이상만큼 작동불가능하게 하는 것이다.
이러한 실시양태의 측면에서, α-CD6 항체의 치료적 유효량은 개체 내의 CD6hi/+ 발현 패턴을 포함하는 세포의 개수와 비교하여, CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포의 집단을, 예를 들어, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 또는 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 또는 90％ 이상만큼 강화하는 것이다. 이러한 실시양태의 다른 측면에서, α-CD6 항체의 치료적 유효량은 개체 내의 CD6hi /+ 발현 패턴을 포함하는 세포의 개수와 비교하여, CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 면역억제성 조절 T-세포의 집단을, 예를 들어, 2배 이상, 4배 이상, 8배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 50배 이상, 또는 100배 이상만큼 강화하는 것이다.
본 명세서의 측면들은 하기와 같이 기술될 수도 있다:
1. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고,
이때 CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확인하는 방법.
2. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; 및
T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고;
이때 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확인하는 방법.
3. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고;
이때 CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확인하는 방법.
4. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; 및
T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고;
이때 CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확인하는 방법.
5. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고;
이때 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확인하는 방법.
6. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; 및
T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고;
이때 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확인하는 방법.
7. 실시양태 1 내지 6에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 단리하거나 강화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
8. 실시양태 7에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 자극성 조성물로 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
9. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및
CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 방법.
10. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계;
T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및
CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 방법.
11. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및
CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 방법.
12. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계;
T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및
CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 방법.
13. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및
CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 방법.
14. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계;
T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및
CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 방법.
15. 실시양태 9 내지 14에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
16. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계;
CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및
CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 방법.
17. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계; 및
T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계;
CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및
CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 방법.
18. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계;
CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및
CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 방법.
19. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계;
T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계;
CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및
CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 방법.
20. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계;
CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및
CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 방법.
21. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계;
T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계;
CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및
CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 확장된 집단을 수득하는 방법
22. 개체-적합성 T-세포의 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계;
CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및
CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계
를 포함하는, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 방법.
23. 개체-적합성 T-세포의 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD6 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계;
T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD6 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계;
CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및
CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계
를 포함하는, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 방법.
24. 개체-적합성 T-세포의 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계;
CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및
CD25+ CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계
를 포함하는, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 방법.
25. 개체-적합성 T-세포의 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계;
T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계;
CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및
CD25+ CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계
를 포함하는, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 방법.
26. 개체-적합성 T-세포의 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계;
CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및
CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계
를 포함하는, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 방법.
27. 개체-적합성 T-세포의 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드와 접촉시키는 단계;
T-세포의 집단을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계;
CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및
CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 단계
를 포함하는, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 방법.
28. 실시양태 22 및 23에 있어서, CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여하기 전에 CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 자극성 조성물로 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
29. 실시양태 24 및 25에 있어서, CD25+ CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여하기 전에 CD25+ CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 자극성 조성물로 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
30. 실시양태 26 및 27에 있어서, CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여하기 전에 CD4+ CD25+ CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 자극성 조성물로 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
31. 실시양태 8, 16 내지 21, 및 28 내지 30에 있어서, 자극성 조성물이 항원-특이적인 TCR/CD3 활성화제를 포함하는 방법.
32. 실시양태 31에 있어서, 자극성 조성물이 공동자극제, 제2 조절 T 세포 자극제, 또는 T 세포 생존 또는 성장 작용제를 추가로 포함하는 방법.
33. 실시양태 32에 있어서, 자극성 조성물이 α-CD3 항체, α-CD28 항체, IL-2 또는 IL-15, 및 TGFβ 또는 라파마이신을 포함하는 방법.
34. 실시양태 1 내지 33에 있어서, 샘플이 PBMC 샘플인 방법.
35. 실시양태 1 내지 33에 있어서, 샘플이 혈액 샘플, 림프양 조직 샘플, 흉선 샘플, 췌장 샘플, 눈 샘플, 심장 샘플, 간 샘플, 신경 샘플, 장 샘플, 피부 샘플, 근육 샘플, 연골 샘플, 또는 인대 샘플인 방법.
36. 실시양태 1, 2, 7, 8, 15 내지 17, 22, 23, 28, 및 31 내지 35에 있어서, CD6 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD6 모노클로날 항체인 방법.
37. 실시양태 3, 4, 7, 8, 15, 18, 19, 24, 25, 29, 및 31 내지 35에 있어서, CD25 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD25 모노클로날 항체이고, CD6 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD6 모노클로날 항체인 방법.
38. 실시양태 5 내지 8, 15, 20, 21, 26, 27, 및 30 내지 35에 있어서, CD4 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD4 모노클로날 항체이고, CD25 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD25 모노클로날 항체이며, CD6 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD6 모노클로날 항체인 방법.
39. 실시양태 1 내지 38에 있어서, CD127 바이오마커 리간드, CD49d 바이오마커 리간드, CD38 바이오마커 리간드, CD45RA 바이오마커 리간드, HLA-DR 바이오마커 리간드, FoxP3 바이오마커 리간드, CTLA-4 바이오마커 리간드, GITR 바이오마커 리간드, LAG-3 바이오마커 리간드, CD39 바이오마커 리간드, 헬리오스 바이오마커 리간드, FcRL3 바이오마커 리간드, CCR7 바이오마커 리간드, CCR4 바이오마커 리간드, CCR8 바이오마커 리간드, CD62L 바이오마커 리간드, ICOS 바이오마커 리간드, CD103 바이오마커 리간드, PD-1 바이오마커 리간드, CD134 바이오마커 리간드, GARP 바이오마커 리간드, CD45RB 바이오마커 리간드, CD45RO 바이오마커 리간드, CD95 바이오마커 리간드, CD122 바이오마커 리간드, CD147 바이오마커 리간드, CD8 바이오마커 리간드, 또는 이들의 임의의 조합물을 추가로 포함하는 방법.
40. 실시양태 1 내지 39에 있어서, CD127 바이오마커, CD49d 바이오마커, CD38 바이오마커, CD45RA 바이오마커, HLA-DR 바이오마커, FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, GITR 바이오마커, LAG-3 바이오마커, CD39 바이오마커, 헬리오스 바이오마커, FcRL3 바이오마커, CCR7 바이오마커, CCR4 바이오마커, CCR8 바이오마커, CD62L 바이오마커, ICOS 바이오마커, CD103 바이오마커, PD-1 바이오마커, CD134 바이오마커, GARP 바이오마커, CD45RB 바이오마커, CD45RO 바이오마커, CD95 바이오마커, CD122 바이오마커, CD147 바이오마커, CD8 바이오마커, 또는 이들의 임의의 조합물을 추가로 포함하는 방법.
41. 실시양태 1 내지 40에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD127 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD127low /- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
42. 실시양태 1 내지 41에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD49d 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD49dlow /- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
43. 실시양태 1 내지 42에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD38 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD38low/- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
44. 실시양태 1 내지 43에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD45RA 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD45RAlow/- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
45. 실시양태 1 내지 44에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 HLA-Dr 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 HLA-Dr+ 또는 low /- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
46. 실시양태 1 내지 45에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 FoxP3 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 FoxP3+ 또는 low/- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
47. 실시양태 1 내지 46에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CTLA-4 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CTLA-4+ 또는 low /- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
48. 실시양태 1 내지 47에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 GITR 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 GITR+ 또는 low/- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
49. 실시양태 1 내지 48에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 LAG-3 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 LAG-3+ 또는 low/- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
50. 실시양태 1 내지 49에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD39 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD39+ 또는 low/- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
51. 실시양태 1 내지 50에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 헬리오스 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 헬리오스+ 또는 low /- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
52. 실시양태 1 내지 51에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 FcRL3 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 FcRL3+ 또는 low/- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
53. 실시양태 1 내지 52에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CCR7 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CCR7+ 또는 low/- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
54. 실시양태 1 내지 53에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CCR4 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CCR4+ 또는 low /- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
55. 실시양태 1 내지 54에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CCR8 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CCR8+ 또는 low/- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
56. 실시양태 1 내지 55에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD62L 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD62L+ 또는 low/- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
57. 실시양태 1 내지 56에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 ICOS 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 ICOS+ 또는 low/- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
58. 실시양태 1 내지 57에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD103 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD103+ 또는 low/- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
59. 실시양태 1 내지 58에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 PD-1 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 PD-1+ 또는 low/- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
60. 실시양태 1 내지 59에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD134 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD134+ 또는 low/- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
61. 실시양태 1 내지 60에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 GARP 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 GARP+ 또는 low /- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
62. 실시양태 1 내지 61에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD45RB 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD45RB+ 또는 low /- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
63. 실시양태 1 내지 62에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD45RO 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD45RO+ 또는 low /- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
64. 실시양태 1 내지 63에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD95 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD95+ 또는 low /- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
65. 실시양태 1 내지 64에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD122 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD122+ 또는 low /- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
66. 실시양태 1 내지 65에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD147 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD147+ 또는 low /- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
67. 실시양태 1 내지 66에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD8 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD8+ 또는 low /- 발현 패턴을 추가로 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
68. CD6 바이오마커 리간드를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리 및/또는 강화를 위한 키트.
69. 실시양태 68에 있어서, CD6 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD6 모노클로날 항체인 키트.
70. CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리 및/또는 강화를 위한 키트.
71. 실시양태 70에 있어서, CD25 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD25 모노클로날 항체이고, CD6 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD6 모노클로날 항체인 키트.
72. CD6 바이오마커 리간드 및 CD127 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리 및/또는 강화를 위한 키트.
73. 실시양태 72에 있어서, CD6 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD6 모노클로날 항체이고, CD127 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD127 모노클로날 항체인 키트.
74. CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리 및/또는 강화를 위한 키트.
75. 실시양태 74에 있어서, CD4 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD4 모노클로날 항체이고, CD25 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD25 모노클로날 항체이며, CD6 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD6 모노클로날 항체인 키트.
76. CD25 바이오마커 리간드, CD6 바이오마커 리간드 및 CD127 바이오마커 리간드가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리 및/또는 강화를 위한 키트.
77. 실시양태 76에 있어서, CD25 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD25 모노클로날 항체이고, CD6 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD6 모노클로날 항체이며, CD127 바이오마커 리간드가 형광-표지 항-CD127 모노클로날 항체인 키트.
78. 실시양태 68 내지 77에 있어서, 키트가 CD49d 바이오마커 리간드, CD38 바이오마커 리간드, CD45RA 바이오마커 리간드, HLA-DR 바이오마커 리간드, FoxP3 바이오마커 리간드, CTLA-4 바이오마커 리간드, GITR 바이오마커 리간드, LAG-3 바이오마커 리간드, CD39 바이오마커 리간드, 헬리오스 바이오마커 리간드, FcRL3 바이오마커 리간드, CCR7 바이오마커 리간드, CCR4 바이오마커 리간드, CCR8 바이오마커 리간드, CD62L 바이오마커 리간드, ICOS 바이오마커 리간드, CD103 바이오마커 리간드, PD-1 바이오마커 리간드, CD134 바이오마커 리간드, GARP 바이오마커 리간드, CD45RB 바이오마커 리간드, CD45RO 바이오마커 리간드, CD95 바이오마커 리간드, CD122 바이오마커 리간드, CD147 바이오마커 리간드, CD8 바이오마커 리간드, 또는 이들의 임의의 조합물을 추가로 포함하는 키트.
79. 자극성 조성물을 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확장을 위한 키트.
80. 실시양태 79에 있어서, 자극성 조성물이 항원-특이적인 TCR/CD3 활성화제를 포함하는 키트.
81. 실시양태 79 및 80에 있어서, 자극성 조성물이 공동자극제, 제2 조절 T 세포 자극제, 또는 T 세포 생존 또는 성장 작용제를 추가로 포함하는 키트.
82. 실시양태 79에 있어서, 자극성 조성물이 α-CD3 항체, α-CD28 항체, IL-2 또는 IL-15, 및 TGFβ 또는 라파마이신을 포함하는 키트.
83. 실시양태 79 내지 82에 있어서, 키트가 CD6 바이오마커 리간드, 또는 실시양태 68 내지 79의 키트 중 어느 하나를 추가로 포함하는 키트.
84. 실시양태 79 내지 81에 있어서, 키트가 CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드, 또는 실시양태 68 내지 79의 키트 중 어느 하나를 추가로 포함하는 키트.
85. 실시양태 79 내지 81에 있어서, 키트가 CD6 바이오마커 리간드 및 CD127 바이오마커 리간드, 또는 실시양태 68 내지 79의 키트 중 어느 하나를 추가로 포함하는 키트.
86. 실시양태 79 내지 81에 있어서, 키트가 CD4 바이오마커 리간드, CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드, 또는 실시양태 68 내지 79의 키트 중 어느 하나를 추가로 포함하는 키트.
87. 실시양태 79 내지 81에 있어서, 키트가 CD25 바이오마커 리간드, CD6 바이오마커 리간드 및 CD127 바이오마커 리간드, 또는 실시양태 68 내지 79의 키트 중 어느 하나를 추가로 포함하는 키트.
88. 실시양태 7 내지 22 또는 31 내지 67의 방법에 따라 수득된 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 포함하는 조성물.
89. 실시양태 88에 있어서, 조성물이 제약 조성물인 조성물.
90. α-CD6 항체를 개체에게 투여하고, 이에 의해 개체 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 강화하는 단계를 포함하며, 상기 투여가 CD6hi /+ 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 작동불가능하게 하지만, CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포는 작동불가능하게 하지 않는, 개체 내의 면역억제성 조절 T-세포를 강화하는 방법.
91. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커, CD6 바이오마커, 및 1개의 추가적인 바이오마커인 FoxP3 바이오마커, CD45RA 바이오마커, CCR4 바이오마커, CD39 바이오마커, 또는 HLA-Dr 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고;
이때 면역억제성 조절 T-세포의 4가지 별개의 성숙 부분집합의 검출이 i) CCR4low 발현 패턴, CD39low 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD6low /-CD45RA+ 발현 패턴; ii) CCR4- 발현 패턴, CD39- 발현 패턴, 또는 HLA-Dr- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD6low /-CD45RA+ 발현 패턴; iii) CCR4hi/+ 발현 패턴, CD45RA- 발현 패턴, CD39hi /+ 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow /- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25hi /+CD6low /- 발현 패턴; 및 iv) CR4hi /+ 발현 패턴, CD45RA- 발현 패턴, CD39low /- 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow /- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD6+ 발현 패턴을 기초로 하는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합을 확인하는 방법.
92. 실시양태 91에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나가 나이브 또는 휴지형 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이고, 이러한 나이브 또는 휴지형 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 CD4+CD25+CD6low /-CD45RA+CCR4- 발현 패턴, CD4+CD25+CD6low /-CD45RA+CD39- 발현 패턴, 또는 CD4+CD25+CD6low /-CD45RA+HLA-Dr- 발현 패턴을 포함하는 방법.
93. 실시양태 91 또는 92에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나가 미성숙형 또는 메모리 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이고, 이러한 미성숙형 또는 메모리 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 CD4+CD25+CD6low /-CD45RA+CCR4low 발현 패턴, CD4+CD25+CD6low /-CD45RA+CD39low 발현 패턴, 또는 CD4+CD25+CD6low /-CD45RA+HLA-Drlow 발현 패턴을 포함하는 방법.
94. 실시양태 91 내지 93에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나가 성숙형 또는 이펙터 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이고, 이러한 성숙형 또는 이펙터 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 CD4+CD25hi/+CD6low/-CCR4hi/+ 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD6low /-CD45RA- 발현 패턴, CD4+CD25hi/+CD6low/-CD39hi/+ 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD6low /-CCR4hi /+CD45RA- 발현 패턴, CD4+CD25hi/+CD6low/-CCR4hi/+CD39hi/+ 발현 패턴, 또는 CD4+CD25hi /+CD6low /-CCR4hi /+HLA-DRlow 발현 패턴을 포함하는 방법.
95. 실시양태 91 내지 94에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나가 최종 분화형 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이고, 이러한 최종 분화형 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 CD4+CD25hi/+CD6hi/+CCR4hi/+ 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD6hi /+CD45RA- 발현 패턴, CD4+CD25hi/+CD6hi/+CD39low 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD6hi /+HLA-Drlow 발현 패턴, CD4+CD25hi/+CD6hi/+CCR4hi/+CD45RA- 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD6hi /+CCR4hi /+CD39low 발현 패턴, 또는 CD4+CD25hi /+CD6hi /+CCR4hi /+HLA-DRlow 발현 패턴을 포함하는 방법.
96. T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커, CD127 바이오마커, 및 1개의 추가적인 바이오마커인 FoxP3 바이오마커, CD45RA 바이오마커, CCR4 바이오마커, CD39 바이오마커, 또는 HLA-Dr 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고;
이때 면역억제성 조절 T-세포의 4가지 별개의 성숙 부분집합의 검출이 i) CCR4low 발현 패턴, CD39low 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+ 발현 패턴; ii) CCR4- 발현 패턴, CD39- 발현 패턴, 또는 HLA-Dr- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD127low /-CD45RA+ 발현 패턴; iii) CCR4hi /+ 발현 패턴, CD45RA- 발현 패턴, CD39hi /+ 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow /- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25hi /+CD127low /- 발현 패턴; 및 iv) CR4hi /+ 발현 패턴, CD45RA- 발현 패턴, CD39low/- 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow /- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD127+ 발현 패턴을 기초로 하는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합을 확인하는 방법.
97. 실시양태 96에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나가 나이브 또는 휴지형 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이고, 이러한 나이브 또는 휴지형 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+CCR4- 발현 패턴, CD4+CD25+CD127low /-CD45RA+CD39- 발현 패턴, 또는 CD4+CD25+CD127low /-CD45RA+HLA-Dr- 발현 패턴을 포함하는 방법.
98. 실시양태 96 또는 97에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나가 미성숙형 또는 메모리 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이고, 이러한 미성숙형 또는 메모리 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 CD4+CD25+CD127low /-CD45RA+CCR4low 발현 패턴, CD4+CD25+CD127low /-CD45RA+CD39low 발현 패턴, 또는 CD4+CD25+CD127low /-CD45RA+HLA-Drlow 발현 패턴을 포함하는 방법.
99. 실시양태 96 내지 98에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나가 성숙형 또는 이펙터 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이고, 이러한 성숙형 또는 이펙터 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 CD4+CD25hi/+CD127low/-CCR4hi/+ 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD127low /-CD45RA- 발현 패턴, CD4+CD25hi/+CD127low/-CD39hi/+ 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD127low /-CCR4hi /+CD45RA- 발현 패턴, 또는 CD4+CD25hi /+CD127low /-CCR4hi /+CD39hi /+ 발현 패턴, 또는 CD4+CD25hi /+CD127low /-CCR4hi/+HLA-DRlow 발현 패턴을 포함하는 방법.
100. 실시양태 96 내지 99에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나가 최종 분화형 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이고, 이러한 최종 분화형 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 CD4+CD25hi/+CD127hi/+CCR4hi/+ 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD127hi /+CD45RA- 발현 패턴, CD4+CD25hi/+CD127hi/+CD39low 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD127hi /+HLA-Drlow 발현 패턴, CD4+CD25hi/+CD127hi/+CCR4hi/+CD45RA- 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD127hi /+CCR4hi /+CD39low 발현 패턴, 또는 CD4+CD25hi /+CD127low /-CCR4hi /+HLA-DRlow 발현 패턴을 포함하는 방법.
101. 실시양태 91 내지 100에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나 이상을 단리하거나 강화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
102. 실시양태 91 내지 101에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나 이상을 자극성 조성물로 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
103. 실시양태 102에 있어서, 자극성 조성물이 항원-특이적인 TCR/CD3 활성화제를 포함하는 방법.
104. 실시양태 102 또는 103에 있어서, 자극성 조성물이 공동자극제, 제2 조절 T 세포 자극제, 또는 T 세포 생존 또는 성장 작용제를 추가로 포함하는 방법.
105. 실시양태 102에 있어서, 자극성 조성물이 α-CD3 항체, α-CD28 항체, IL-2 또는 IL-15, 및 TGFβ 또는 라파마이신을 포함하는 방법.
106. 실시양태 91 내지 105에 있어서, 샘플이 PBMC 샘플인 방법.
107. 실시양태 91 내지 106에 있어서, 샘플이 혈액 샘플, 림프양 조직 샘플, 흉선 샘플, 췌장 샘플, 눈 샘플, 심장 샘플, 간 샘플, 신경 샘플, 장 샘플, 피부 샘플, 근육 샘플, 연골 샘플, 또는 인대 샘플인 방법.
실시예
하기의 비제한적인 실시예들은 이제 구현되는 대표적인 실시양태들의 더욱 완전한 이해를 용이하게 하기 위해 설명의 목적으로만 제공된다. 이러한 실시예들은 조절 T 세포의 확인, 수득, 확장 방법, 본원에 개시된 방법 중 임의의 것을 수행하는데 유용한 성분을 포함하는 키트, 및 조절 T 세포를 포함하는 조성물을 비롯하여, 본 명세서에 기술된 실시양태 중 어느 것도 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1
CD4
+
FOXP3
+ 및
CD25
+
FOXP3
+ 세포 집단이
CD6
발현이 더 낮다
CD4+FOXP3+, CD25+FOXP3+ 및 CD4+CD25+FOXP3+ 조절 T 세포에서의 CD6 발현의 분포를 실연하기 위해, 다색 유동 세포측정법 분석을 수행하여 이러한 세포 부분집합에서의 CD6 발현 패턴을 결정하였다.
수확된 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 CD4, CD25, CD6의 세포 표면 발현에 대해, 그리고 세포내 발현에 대해 FOXP3으로 염색하였다. 간략하게, 건강한 대조군으로부터의 PBMC를 피콜(Ficoll) 구배 원심분리에 의해 헤파린처리 혈액으로부터 단리하였다. 약 1-2×106개의 수확된 PBMC/100 ㎖의 1× PBS-2％ 인간 AB 혈청 (HABS)-1％ 파라포름알데히드 (PFA)를 4℃에서 20 내지 30분 동안 하기의 모노클로날 항체들의 세포 표면 염색 칵테일과 함께 인큐베이션하였다: α-CD6-FITC, α-CD4-PC7, 및 α-CD25-APC. 인큐베이션된 세포를 1× PBS-2％ HABS-1％ PFA로 2회 세정하고, 고정시키고, 펌/픽스 버퍼(Perm/Fix Buffer) (이바이오사이언스(eBioscience))로 투과성이게 만들고, 펌/워시 버퍼(Perm/Wash Buffer) (이바이오사이언스)로 2회 세정한 후, 인간 IgG와 함께 4℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. α-FOXP3-퍼시픽 블루(Pacific blue) 클론 206D (바이오레전드(BioLegend)) 모노클로날 항체를 포함하는 세포내 염색 칵테일을 이러한 세포에 첨가하고, 암실에서 60분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 펌/워시 버퍼로 세정한 후, 1× PBS-2％ HABS로 세정하고, 500 ㎕의 1× PBS-2％ HABS-1％ PFA 중에 재현탁시켰다.
다색 세포 유동측정법 분석을 위해, 500,000개를 초과하는 세포를 405 nm, 488-nm, 및 633-nm 레이저가 장착된 유동 세포측정기 (갈리오스(GALLIOS)™ 유동 세포측정기)를 사용하여 분석하였고, 림프구를 전방 및 측면 광 산란기를 기초로 게이팅(gating)하였다. 자가형광, 아이소타입(isotype) 및 FMO 대조군을 사용하여 음성 및 양성 형광 이벤트의 히스토그램 위치를 확립하였고, 결과는 각각의 모노클로날 항체에 대한 음성 영역보다 높은 세포의 백분율로서 및/또는 별개의 집단들의 형광 강도의 평균 (MFI)으로서 표현되었다. 염색 프로토콜에서 사용된 형광색소와 접합된 인간 림프구 마커에 대한 항체로의 단일 튜브 염색을 사용하여 보정 대조군을 수행하였다. 형광 마이너스 원(fluorescence minus one) 대조군, 아이소타입 대조군, 및/또는 공지된 음성 세포 집단에 의해 FOXP3 염색에 대한 음성 대조군을 결정하였다. 결과는 2개의 샘플의 대표적인 평가이다. 서미트(Summit) 5.0 또는 칼루자(Kaluza) 1.1을 사용하여, 수집된 데이터의 분석을 수행하였다. 증식 검정법에서 전구체 빈도를 분석하기 위한 모드피트(ModFit) 소프트웨어를 사용하였다. 통계 분석을 위해, 마이크로소프트 오피스 엑셀 2003 및 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5.01을 사용하였다.
결과는 CD4 FOXP3 림프구 집단이 CD4+FOXP3- 발현 패턴을 포함하는 세포 (MFI 6.3 대 11.6)와 비교하여 CD4+FOXP3+ 발현 패턴을 포함하는 세포에서 표면 CD6 바이오마커 발현이 약 2배 낮았음을 나타낸다는 것을 가리킨다 (도 1의 a). 유사하게, CD25 FOXP3 림프구 집단의 분석은 CD6 바이오마커 발현이 CD4+CD25+FOXP3- 발현 패턴을 포함하는 세포 (MFI 6.2 대 12.5) 또는 CD4+CD25-FOXP3- 발현 패턴을 포함하는 세포 (MFI 6.2 대. 11.4)와 비교하여 CD4+CD25+FOXP3+ 발현 패턴을 포함하는 세포에서 2배 낮았음을 나타낸다 (도 1의 b).
인간 천연 발생 T 조절 (nTreg)이 접촉-의존적 시험관내 억제에서 수반되는 CD4+FOXP3+, CD4+CD25+ 또는 CD4+CD25+FOXP3+ 세포로서 규정되었다. 이러한 결과는 CD4+CD25+FOXP3+ 및/또는 CD4+CD25hiFOXP3+ nTreg 세포가 더 낮은 CD6 바이오마커 발현을 나타낸다는 것을 가리킨다. CD6 음성 T 세포는 동종이식반응성(alloreactive) 응답을 개시하는 능력이 결여된 것으로 나타났고, 무력성(anergic) 세포로 간주되었다. nTreg 세포 상에서의 CD6 발현 결여는 왜 이러한 조절 세포가 또한 무력성 세포인지의 한 메커니즘을 시사하였다.
실시예
2
CD4
+
CD25
+
CD6
low
/-
세포 집단이
FOXP3
을 발현한다
CD4/CD25/CD6 하위집단 상에서의 FOXP3 마커의 발현을 평가하기 위해, 다색 세포 유동측정법 분석을 수행하여 이러한 조절 T 세포 부분집합에서의 FOXP3 발현 패턴을 결정하였다.
실시예 1에 기술된 바와 같이 인간 PBMC를 단리하고, 수확하고, 세포 표면 바이오마커 발현 및 세포내 바이오마커에 대해 염색하였다. 다색 세포 유동측정법 분석을 위해, 500,000개를 초과하는 세포를 유동 세포측정기 (갈리오스™ 유동 세포측정기)를 사용하여 분석하였고, 림프구를 전방 및 측면 광 산란기를 기초로 게이팅하였다. CD4+ 림프구를 CD6/CD25 발현에 대해 점도표에서 분석하였다. FOXP3 발현을 3가지 CD4+ 세포 부분집합에서 분석하였다: CD25+CD6low /-, CD25-CD6low /- 및 CD25-CD6+. 형광 마이너스 원 대조군, 아이소타입 대조군 및 공지된 음성 세포 집단에 의해 FOXP3 염색에 대한 음성 대조군을 결정하였다. 샘플 크기 및 데이터 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같았다.
결과는 CD4+CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 림프구의 94.2％가 FOXP3을 또한 발현한다는 것을 드러낸다 (도 2의 b). 그러나, CD4+CD25-CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 림프구의 9.5％만 FOXP3을 발현하였고, CD4+CD25-CD6+ 발현 패턴을 포함하는 림프구의 1.8％만 FOXP3을 발현하였다 (도 2의 b). 이러한 결과는 FOXP3+ 세포가 CD25 바이오마커 발현에 대해 비균질성임을 확증하지만, CD6low /- 발현 패턴의 조절 T 세포에서 FOXP3+ nTreg 세포의 대부분이 확인되는 것으로 보인다는 것을 드러낸다.
실시예 3
CD25
+
CD6
low
/-
세포 집단이
FOXP3
을 발현한다
림프구 CD25+CD6low /- 하위집단에서의 FOXP3 발현을 평가하기 위해, 다색 세포 유동측정법 분석을 수행하여 이러한 조절 T 세포 부분집합에서의 FOXP3 발현 패턴을 결정하였다.
실시예 1에 기술된 바와 같이 인간 PBMC를 단리하고, 수확하고, 세포 표면 바이오마커 발현 및 세포내 바이오마커에 대해 염색하였다. 다색 세포 유동측정법 분석을 위해, 500,000개를 초과하는 세포를 유동 세포측정기 (갈리오스™ 유동 세포측정기)를 사용하여 분석하였고, 림프구를 CD6/CD25 발현에 대해 점도표에서 분석하였다. FOXP3 발현을 3가지 세포 부분집합에서 분석하였다: CD25+CD6low /-, CD25-CD6low/- 및 CD25-CD6+. 형광 마이너스 원 대조군, 아이소타입 대조군 및 공지된 음성 세포 집단에 의해 FOXP3 염색에 대한 음성 대조군을 결정하였다. 샘플 크기 및 데이터 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같았다.
결과는 CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 림프구의 89.2％가 FOXP3을 또한 발현한다는 것을 드러낸다 (도 3). 그러나, CD25-CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 림프구의 9.0％만 FOXP3을 발현하였고, CD25-CD6+ 발현 패턴을 포함하는 림프구의 1.8％만 FOXP3을 발현하였다 (도 3). 이러한 분석은 CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 림프구가 FOXP3에 대해 발현 수준이 높은 주요 집단 (89.2％), 및 낮은 FOXP3 발현 또는 FOXP3 발현 부재를 나타내는 소수 집단 (10.7％)의 2개의 집단 부분집합을 포함하였음을 가리킨다 (도 3). 추가적으로, 이러한 실험은 CD25low /-CD6+ 발현 패턴을 포함하는 세포가 FOXP3을 발현하지 않은 반면, CD25low /-CD6low /- 발현 패턴의 세포는 FOXP3을 또한 발현한 세포의 소수 부분집합을 함유하였음을 가리켰다 (9.0%) (도 3). 이러한 결과는 FOXP3+ 세포가 CD25 바이오마커 발현에 대해 비균질성임을 가리키지만, CD6low /- 발현 패턴의 조절 T 세포에서 FOXP3+ nTreg 세포의 대부분이 확인되는 것으로 보인다는 것을 드러낸다.
실시예 4
CD6
low
/-
세포 집단이
FOXP3
을 발현한다
FOXP3+ 세포 상에서의 CD6 고갈의 효과를 평가하기 위해, 다색 세포 유동측정법 분석을 수행하여 CD6+ 및 CD6low /- 세포 부분집합에서의 FOXP3 발현 패턴을 결정하였다.
실시예 1에 기술된 바와 같이 인간 PBMC를 단리하고, 수확하고, 세포 표면 바이오마커 발현 및 세포내 바이오마커에 대해 염색하였다. 다색 세포 유동측정법 분석을 위해, 500,000개를 초과하는 세포를 유동 세포측정기 (갈리오스™ 유동 세포측정기)를 사용하여 분석하였고, 림프구를 CD6/CD4 발현에 대해 점도표에서 분석하였다. FOXP3 발현을 2가지 세포 부분집합에서 분석하였다: PBMC CD6low /- 및 PBMC CD6+. 형광 마이너스 원 대조군, 아이소타입 대조군 및 공지된 음성 세포 집단에 의해 FOXP3 염색에 대한 음성 대조군을 결정하였다. 샘플 크기 및 데이터 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같았다.
이러한 분석 또한 PBMC CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 림프구가 PBMC CD6+ 발현 패턴을 포함하는 림프구 (8.3％)보다 FOXP3에 대해 더 높은 발현 수준 (41.5％)을 나타냈음을 나타냈다 (도 4의 a). 이러한 결과는 PBMC에서의 CD6 고갈이 FOXP3+ nTreg 세포의 유의한 강화를 일으킬 수 있음을 실연하였다.
실시예 5
CD4
+
CD25
+
CD6
low
/-
CD127
low
/-
세포 집단이
FOXP3
+
발현의 높은 강화를 나타낸다
FOXP3에 대해 더욱 균질한 CD4+CD25+ 세포 집단을 확인하기 위해, 다색 세포 유동측정법 분석을 수행하여 이러한 조절 T 세포 부분집합에서의 CD6 및 CD127 발현 패턴을 결정하였다.
4명의 건강한 개체로부터 PBMC를 수득하였고 α-CD127-PE 모노클로날 항체를 세포 표면 염색 칵테일에 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기술된 바와 같이 인간 PBMC를 단리하고, 수확하고, 세포 표면 바이오마커 발현 및 세포내 바이오마커에 대해 염색하였다. 다색 세포 유동측정법 분석을 위해, 500,000개를 초과하는 세포를 유동 세포측정기 (갈리오스™ 유동 세포측정기)를 사용하여 분석하였고, 림프구를 전방 및 측면 광 산란기를 기초로 게이팅하였다. CD4+ 림프구를 CD4/CD25 발현, CD127/CD25 발현, 및 CD6/CD25 발현에 대해 점도표에서 분석하였다. CD4+CD25+ 림프구를 CD127/CD6 발현에 대해 점도표에서 분석하였다. FOXP3 발현을 하기의 CD4+ 세포 부분집합에서 분석하였다: CD25+, CD25+CD127low /-, CD25+CD6low /-, CD25+CD6low/-CD127low/- 및 CD25+CD6+CD127+. 형광 마이너스 원 대조군, 아이소타입 대조군 및 공지된 음성 세포 집단에 의해 FOXP3 염색에 대한 음성 대조군을 결정하였다. 샘플 크기 및 데이터 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같았다.
결과는 CD4+CD25hi 세포 (85.1％ FOXP3+), CD4+CD6low /- (87.9％ FOXP3+) 및 CD4+CD127low/- 세포 (88.0％ FOXP3+) 간에 FOXP3 발현에서 유의한 차이가 발견되지 않았음을 가리킨다 (도 5a). 현저하게, CD4+CD25hi 세포를 CD6 및 CD127 발현에 대해 분석했을 때, 이러한 분석은 CD4+CD25+CD127low /-CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 세포의 94.9％가 FOXP3을 발현하였음을 드러냈고 (도 5b), 이는 92.8％가 FOXP3을 발현한 CD4+CD25+CD127low /- 세포에 필적하는 수준이었다. 반대로, CD4+CD25hiCD6+CD127+ 세포 부분집합은 낮은 FOXP3 발현 (22.6％)을 나타냈다 (도 5b). 총괄적으로, CD4+CD25hi < CD4+CD6low /- = CD4+CD127low /- < CD4+CD25hiCD6lo /-CD127lo /- 집단으로부터 FOXP3+ 세포가 점진적으로 강화되었다 (도 5c). 따라서, CD6 및 CD127 표면 마커의 조합으로 FOXP3+ 세포가 가장 높게 강화된 CD4+CD25hi 집단이 확인되었고, 이러한 결과는 균질한 FOXP3+ 세포 집단이 CD4+CD25+CD127low /-CD6low /- 발현 패턴을 기초로 확인될 수 있다는 것을 가리킨다.
실시예 6
CD4
+
CD25
hi
/+
CD6
low
/-
세포 집단이 T-세포 활성화를 억제한다
CD4+CD25hi /+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 림프구의 억제 기능을 실연하기 위해, 분류된 세포로의 억제 검정법을 수행하여, 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)-기반 증식 검정법을 사용하여 동종이계 CD8+ 응답자 T-세포의 증식을 억제하는 첨가된 CD4+CD25hi /+CD6low /- 세포의 능력을 평가하였다.
건강한 대조군으로부터의 인간 PBMC를 피콜 구배 원심분리에 의해 헤파린처리 혈액으로부터 단리하였다. 약 20-30×106개의 수확된 PBMC/500 ㎕의 완전 세포 배양 배지를 4℃에서 30분 동안 하기의 모노클로날 항체들의 세포 표면 염색 칵테일과 함께 인큐베이션하였다: α-CD6-APC, α-CD4-PC7, 및 α-CD25-PE. 인큐베이션된 세포를 1× PBS로 2회 세정하고, 약 10×106개의 세포/㎖의 밀도로 완전 배지에 재현탁시켰다.
유동 세포측정법을 사용하는 세포 분류를 위해, 약 60,000개 내지 100,000개의 세포를 순차적 게이트 정의를 기초로 세포 분류기 (MOFLO® XDP 세포 분류기)를 사용하여 완전 배지에서 분류하였다. 전방 및 측면 광 산란기를 기초로 림프구를 게이팅하였고, SSC-H/SSC-W 및 FSC-H/FSC-W 점도표에 의해 더블릿(doublet)을 배제하였다. CD4+ 림프구를 CD25/CD6 발현에 대해 점도표에서 분석하였다. 2개의 CD4+ 부분집합을 고속 세포 분류용으로 선택하였다: CD25+CD6low /- (FOXP3+ Treg 세포) 및 CD25-CD6+ (FOXP3- 비-Treg 세포).
결과는 이러한 분류 체계가 96％ 순수한 CD4+CD25+CD6low /- 세포 집단의 단리를 초래하였음을 실연하였다 (도 6의 a).
Treg-억제 검정법을 수행하기 위해, 500 ㎕의 0.6 μM CFSE를 1명의 건강한 개체로부터 단리된, T-응답자 (Tresp) 세포로 지정된 1백만-2천만개의 PBMC를 포함하는 500 ㎕ 세포 현탁액에 첨가하였다. 세포 현탁액 혼합물을 약 20℃에서 약 5분 동안 인큐베이션하고, 약 1 ㎖의 저온 HABS를 첨가하고, 이러한 혼합물을 약 1분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 약 10 ㎖의 1× PBS를 첨가하고, 이러한 혼합물을 약 1500 rpm에서 약 20℃에서 약 5분 동안 원심분리하였다. 세포를 완전 세포 배양 배지 (RMPI 1640, 글루타맥스(Glutamax)-I, 25 mM 헤페스(Hepes), 2.5％ 인간 AB 혈청, 피루브산나트륨, 100 U/㎖ 페리실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, + 비필수 아미노산 및 2-머캅토에탄올)에 약 1×106개의 세포/㎖의 밀도로 재현탁시켰다.
억제 검정법은 Treg 세포 개수의 적정을 기초로 하였다. 약 30,000개 내지 50,000개의 전체 세포를 하기의 분류된 CD4+CD25+CD6low /- Treg 세포 대 Tresp 세포 비로 96웰 플레이트에 플레이팅하였다: 1:1, 1:2, 1:4, 및 1:8. 플레이팅된 세포를 37℃, 5％ CO2 대기 및 95％ 습도에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 0.5 ㎍/㎖의 가용성 α-CD3 및 α-CD28 모노클로날 항체로 자극하고, 37℃, 5％ CO2 대기 및 95％ 습도에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 수확하기 위해, 세포를 750 rpm, 약 20℃에서 3분 동안 원심분리하고, 배지를 흡인하고, 150 ㎕의 신선한 배양 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. "PBMC 미염색" 대조군을 제외한 각각의 웰에 약 4 ㎕의 α-CD8-APC 모노클로날 항체를 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 약 200 ㎕의 1× PBS, 10％ HABS를 각각의 웰에 첨가하고, 96웰 플레이트를 750 rpm, 약 20℃에서 3분 동안 원심분리하고, 배지를 흡인하고, 약 200 ㎕의 1× PBS, 10％ HABS를 각각의 웰에 첨가하였다. 약 5 ㎕의 7AAD를 각각의 웰에 첨가하여 생육성 세포를 확인하였다. 유동 세포측정법을 사용하여 Treg 세포 억제를 분석하기 위해, 전방 및 측면 광 산란기를 기초로 세포를 게이팅한 후, 7AAD+ 발현 패턴을 포함하는 세포를 배제하고, CD8+ 발현 패턴을 포함하는 세포를 CFSE 염색에 의해 분석하여 세포 증식을 평가하였다. CD4+CD25-CD6+ 발현 패턴을 포함하는 분류된 비-Treg 세포 집단이 모든 실험에서 음성 대조군으로서 사용되었다. 자극되지 않은 응답자 세포의 CFSE 히스토그램으로 모집단이 정의되었고, 활성화된 응답자의 증식을 모드피트(ModFit) LT 소프트웨어 (베러티 소프트웨어 하우스(Verity Software House), v3.0; 메인주 탑쉠)를 사용하여 전구체 빈도 (pf)를 계산하는 것에 의해 결정하였다. 3가지 샘플의 대표적인 결과를 평가하였고, 이는 각각의 Treg:Tresp 비 샘플에 대한 pf의 억제율 ％로서 표현된다.
결과는 CD4+CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 세포에 α-CD3 및 α-CD28 모노클로날 항체로 자극된 CD8+ T 세포에 대한 용량-응답 억제 기능이 있었음을 나타낸다 (도 6의 b). 1:1 Treg:Tresp 비에서 최대 억제율 (57％)이 관찰되었다. 억제 활성이 검정법에 대한 양성 대조군으로서 사용된 분류된 CD4+CD25hiCD127lo /- 세포의 것과 유사하였다 (도 6의 b). 음성 대조군으로서 사용된 분류된 CD4+CD25-CD6+ 또는 CD4+CD25-CD127+ 비-Treg 세포는 억제 활성을 나타내지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 이러한 결과는 CD4+CD25+CD6low /- 세포 집단이 억제성 조절 세포를 함유한다는 것을 가리킨다. 총괄적으로, 높은 FOXP3 발현, Treg-연관 항원 (CD4 및 CD25)의 특징적인 분포, 및 확립된 시험관내 기능 검정법에서의 억제인자 활성으로, 천연 조절 T-억제인자 세포가 세포 표면 CD6의 낮은/음성 발현을 나타낸다는 것과 CD4+CD25+CD6low/- 발현 패턴으로 조절 T-세포 억제 세포가 확인되었다는 것으로 결론지어졌다.
실시예
7
CD25
+
CD6
low
/-
세포
집단 상에서의
T
reg
-연관
마커의
특성화
CD6low /- 발현 패턴이 균질성 또는 비균질성 세포 집단을 정의하였는지 여부를 결정하기 위해, 상이한 바이오마커 발현 패턴이 CD25+ CD6low 조절 T 세포에서 관찰되었는지 여부를 결정하기 위해 다양한 바이오마커를 사용하여 다색 세포 유동측정법 분석을 수행하였다.
α-CD45RA-ECD, 및 α-HLA-Dr-APCA750 모노클로날 항체를 세포 표면 염색 칵테일에 첨가하고 α-CTLA-4-PC5 모노클로날 항체를 세포내 염색 칵테일에 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기술된 바와 같이 인간 PBMC를 단리하고, 수확하고, 세포 표면 바이오마커 발현 및 세포내 바이오마커에 대해 염색하였다. 다색 세포 유동측정법 분석을 위해, 500,000개를 초과하는 세포를 유동 세포측정기 (갈리오스™ 유동 세포측정기)를 사용하여 분석하였고, 림프구를 전방 및 측면 광 산란기를 기초로 게이팅하였다. 림프구를 CD6/FOXP3 발현에 대해 점도표에서 분석하였다. 형광 마이너스 원 대조군 및 공지된 음성 세포 집단에 의해 FOXP3 염색에 대한 음성 대조군을 결정하였다. 다색 세포 유동측정법 분석의 제2 라운드에서, 500,000개를 초과하는 세포를 분석하였다. 림프구를 전방 및 측면 광 산란기를 기초로 게이팅하였고, CD45RA/FOXP3 발현 패턴을 기초로 CD45RA, HLA-Dr 및 CTLA-4 Treg-연관 마커로 분석하였다. 샘플 크기 및 데이터 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같았다.
CD6 및 FOXP3 발현 분석으로부터의 결과는 조절 T 세포의 3가지 별개의 집단이 식별될 수 있음을 가리킨다 (도 7). CD6low /- 세포의 약 22.0％가 CD45RA+FOXP3low/- 발현 패턴을 추가로 포함하는 세포이고; CD6low /- 세포의 약 37.1％가 CD45RA-FOXP3+ 발현 패턴을 추가로 포함하는 세포이며; CD6low /- 세포의 약 29.2％가 CD45RA-FOXP3low /- 발현 패턴을 추가로 포함하는 세포이다. 추가적인 바이오마커를 사용한 이러한 3가지 CD6low /- 세포 집단의 추가적인 분석이 표 1에서 제시된다.
| 표 1. 3가지 CD6 low /- 세포 집단의 분석 | |||
| CD45RA+FOXP3 low /- | CD45RA-FOXP3 low /- | CD45RA-FOXP3 + | |
| CTLA-4+ | 34.0% | 62.1% | 91.7% |
| HLA-Dr+ | 3.1% | 21.8% | 61.6% |
| CD25+ | 100% | 100% | 100% |
CD45RA+FOXP3low 휴지형 Treg 세포 및 CD45RA-FOXP3high 활성화 Treg 세포 (양쪽 모두 시험관내 억제 기능이 있음), 및 CD45RA-FOXP3low 사이토카인-분비 비-억제성 Treg 세포가 포함되는, 3가지 표현형 및 기능성 Treg 세포 부분집합이 최근 제안되었다. CD6 바이오마커를 사용한 결과는 이러한 3가지 아유형이 쉽게 확인 및 단리될 수 있음을 가리킨다.
실시예 8
CD4
+
CD25
+
CD6
low
/-
세포
집단 상에서의
T
reg
-연관
마커의
특성화
CD4+CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 림프구를 더욱 충분히 특성화하기 위해, 다색 세포 유동측정법 분석을 수행하여 이러한 조절 T 세포 부분집합에서의 CD127, CD45A, HLA-Dr, 및 CLTA-4 발현 패턴을 결정하였다.
α-CD127-PE, α-CD45RA-ECD, 및 α-HLA-Dr-APCA750 모노클로날 항체를 세포 표면 염색 칵테일에 첨가하고 α-CTLA-4-PC5 모노클로날 항체를 세포내 염색 칵테일에 첨가한 것을 제외하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 인간 PBMC를 단리하고, 수확하고, 세포 표면 바이오마커 발현 및 세포내 바이오마커에 대해 염색하였다. 다색 세포 유동측정법 분석을 위해, 0.5-1.0×106개의 세포를 유동 세포측정기 (갈리오스™ 유동 세포측정기)를 사용하여 분석하였고, 림프구를 전방 및 측면 광 산란기를 기초로 게이팅하였다. CD4+ 림프구를 CD6/CD25 발현에 대해 점도표에서 분석하였다. CD25+/CD6low /- 림프구를 FOXP3, CTLA-4, CD45RA, 및 HLA-Dr 발현에 대해 점도표에서 분석하였다. 형광 마이너스 원 대조군 및 공지된 음성 세포 집단에 의해 FOXP3 염색에 대한 음성 대조군을 결정하였다. 샘플 크기 및 데이터 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같았다.
결과는 CD4+CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 세포가 상이한 수준의 CTLA-4, CD45RA 및 HLA-Dr을 발현하였음을 나타낸다. CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 세포의 대부분 (84.5％)은 FOXP3을 또한 발현하였다 (도 8). 결과는 CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 림프구의 62.7％가 또한 CTLA-4를 발현하였음을 또한 드러냈고 (도 8), 이는 CTLA-4를 발현하는 주요 집단 (62.7％) 및 이러한 바이오마커를 발현하지 않는 소수 집단 (37.3％)인 CD25+CD6low /- 조절 T 세포의 2개의 별개의 집단이 존재한다는 것을 가리킨다 (도 8). 유사하게, CD25+CD6low /- 조절 T 세포의 2개의 별개의 집단이 CD45RA 및 HLA-Dr 바이오마커를 기초로 확인되었다. CD45RA에 대해, CD25+CD6low /- 조절 T 세포의 2개의 별개의 집단은 CD45RA를 발현하지 않은 주요 집단 (79.4％) 및 이러한 바이오마커를 발현한 소수 집단 (20.6％)이었다 (도 8). HLA-Dr에 대해, CD25+CD6low /- 조절 T 세포의 2개의 별개의 집단은 HLA-Dr를 발현하지 않은 주요 집단 (68.0％) 및 이러한 바이오마커를 발현한 소수 집단 (32.0％)이었다 (도 8). 이러한 결과는 추가적인 바이오마커의 사용이 CD4+CD25+CD6low /- 또는 CD25+CD6low/- 조절 T 세포의 별개의 부분집합 집단들을 확인하는데 유용하다는 것을 가리킨다.
실시예
9
CD4
+
CD25
hi
CD6
lo
/-
및
CD4
+
CD25
hi
CD127
lo
/-
집단의
바이오마커
발현의 비교
CD4+CD25hiCD6lo /-와 CD4+CD25hiCD127lo /- Treg 집단 사이의 차이를 식별하기 위해, 이러한 조절 T 세포 부분집합들의 바이오마커 발현 패턴이 상이한지 여부를 결정하기 위해 다양한 바이오마커를 사용하여 다색 세포 유동측정법 분석을 수행하였다.
5명의 건강한 개체로부터 PBMC를 수득하고 형광-표지 모노클로날 항체의 하기의 3개의 패널 중 하나를 사용하여 세포를 염색한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기술된 바와 같이 인간 PBMC를 단리하고, 수확하고, 세포 표면 바이오마커 발현 및 세포내 바이오마커에 대해 염색하였다: 1) 패널 8c (α-CD4-PC7, α-CD25-APC-AF647, α-CD6-FITC, α-CD127-PE, α-CD45RA-ECD, α-HLA-Dr-APC-AF750, α-CTLA-4-PC5, α-FOXP3-퍼시픽 블루); 2) 패널 10c-1 (α-CD4-크롬 오렌지(Krome Orange), α-CD25-PC7, α-CD6-FITC, α-CD127-APC-CF700, α-CD45RA-APC-AF750, α-CD62L-ECD, α-CD39-APC-AF647, α-CCR4-PE, α-HLA-Dr-퍼시픽 블루, 및 α-7AAD); 또는 3) 패널 10c-2 (α-CD4-크롬 오렌지, α-CD25-PC7, α-CD6-FITC, α-CD127-APC-CF700, α-CD45RA-APC-AF750, α-CD62L-ECD, α-CD39-APC-AF647, α-GARP-PE, α-HLA-Dr-퍼시픽 블루, 및 α-7AAD). 다색 세포 유동측정법 분석을 위해, 500,000개를 초과하는 세포를 유동 세포측정기 (갈리오스™ 유동 세포측정기)를 사용하여 분석하였고, 림프구를 전방 및 측면 광 산란기를 기초로 게이팅하였다. CD4+CD25+ 림프구를 CD127 또는 CD6 발현에 대해 게이팅한 후, 다른 바이오마커 중 하나에 대해 점도표에서 분석하였다. 샘플 크기 및 데이터 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같았다.
결과는 바이오마커 CCR4, CD39, HLA-DR, CD45RA, GARP 및 CTLA-4의 발현 패턴과 관련하여 CD4+CD25hiCD6lo /-와 CD4+CD25hiCD127lo /- Treg 집단 사이에서 유의한 차이가 관찰되지 않았음을 가리킨다 (도 9a, 9b, 및 9c). 그러나, 놀랍게도, HLA-Dr, CCR4, GARP, CD39 및 CD45RA 바이오마커 발현 분포에서의 비균질성이 CD4+CD25hiCD6lo/- 및 CD4+CD25hiCD127lo /- Treg 집단에서 관찰되었고, 이는 상이한 세포 성숙 단계를 나타낼 것 같은 nTregs에서의 상이한 부분집합에 대한 가능성을 가리킨다 (도 9a 및 9b).
실시예 10
CD4
+
CD25
hi
CD6
lo
/-
CD127
lo
/-
세포
집단 상의
T
reg
-연관
마커의
특성화
CD4+CD25hiCD6lo /-CD127lo /- 발현 패턴을 포함하는 림프구를 더욱 충분히 특성화하기 위해, nTreg 분화/성숙 경로에서의 상이한 단계들이 구별될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 다양한 바이오마커를 사용하여 다색 세포 유동측정법 분석을 수행하였다.
세포를 하기의 형광-표지 모노클로날 항체를 사용하여 염색한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기술된 바와 같이 인간 PBMC를 단리하고, 수확하고, 세포 표면 바이오마커 발현 및 세포내 바이오마커에 대해 염색하였다: α-CD4-크롬 오렌지, α-CD25-PC7, α-CD6-FITC, α-CD127-APC-CF700, α-CD45RA-APC-AF750, α-CD39-APC-AF647, α-CCR4-PE 또는 α-GARP-PE, α-HLA-Dr-퍼시픽 블루 또는 α-FOXP3-퍼시픽 블루. 다색 세포 유동측정법 분석을 위해, 500,000개를 초과하는 세포를 유동 세포측정기 (갈리오스™ 유동 세포측정기)를 사용하여 분석하였고, 림프구를 전방 및 측면 광 산란기를 기초로 게이팅하였다. CD4+CD25+ 림프구를 CD127 및 CD6 발현에 대해 게이팅한 후, 다른 바이오마커 중 하나에 대해 점도표에서 분석하였다. 샘플 크기 및 데이터 분석은 실시예 1에 기술된 바와 같았다.
먼저, CD4+CD25hi /+CD6lo /-CD127lo /- 발현 패턴을 포함하는 세포를 메모리와 나이브 T-세포 단계를 구별하기 위해 CD45RA 발현에 대해 시험하였고, 국소 조직, 특히 피부로의 세포 운송에 필요한 세포 귀향 마커로서 CCR4 발현에 대해 시험하였다. 결과에서 3가지 세포 집단이 확인되었다: 1) nTreg 나이브/휴지형 (N/R) 부분집합으로 칭해지는 CD45RA+CCR4-; 2) 미성숙형/메모리 (I/Me)로 칭해지는 CD45RA+CCR4lo; 및 3) 성숙형/이펙터 (Ma/E)로 칭해지는 CD45RA-CCR4hi (도 10의 a). 이러한 부분집합 각각에서의 CD39 발현의 분석에서, N/R 부분집합에서의 7.9％ CD39 발현; I/Me 부분집합에서의 31.3％ CD39 발현; 및 Ma/E 부분집합에서의 82.9％ CD39 발현으로 성숙 과정을 통한 CD39 발현에서의 점진적인 증가가 드러났다. HLA-Dr 발현 분석은 발현이 Ma/E 부분집합에서 검출되었음 (35.8％)을 가리켰다. 흥미롭게, 거의 모든 HLA-DR-양성 세포가 Ma/E 단계에서 CD39를 공동-발현하였다 (도 10의 b). 이러한 결과는 HLA-DR 발현이 CD39와 비교하여 더 늦은 nTreg 성숙 단계에서 나타난다는 것을 시사한다.
CD4+CD25+CD6+CD127+ 발현 패턴을 포함하는 세포의 분석을 CD45RA 및 CCR4 발현에 대해 시험하였다. 결과는 세포의 대다수 (60％)가 CD45RA-CCR4hi였음을 드러냈고 (도 10의 c), 이때 CD39 발현 (11.5％) 및 HLA-Dr 발현 (4.8％)이 낮았다 (도 10의 d). 이러한 마지막 집단은 최종 분화형 (TD) nTreg 부분집합을 나타내는 것으로 보이는 nTreg 분화/성숙 경로에서의 제4 세포 집단 부분집합을 나타냈다. CD45RA/CCR4 부분집합에서의 각각의 마커에 대해 MFI를 분석하여 유사한 결과가 수득되었다 (도 10의 e). 흥미롭게, CD62L 마커가 nTreg-TD 부분집합에서 고 MFI 발현으로 전체 CD45RA/CCR4 구획에서 발현되었다 (도 10의 e). CD4+CD25+CD6lo /-CD127lo/- 집단 상에서의 Treg-연관 마커 발현의 역-게이팅 및 3-D 분석의 조합을 사용하여, 본 발명가들은 대다수의 HLA-Dr+ 세포가 CD39 및 CCR4를 공동-발현한다는 것을 관찰하였다 (도 10의 f).
마지막으로, 여러 nTreg 부분집합에서의 FOXP3 MFI 발현의 검사는 HLA-Dr-CD45RA- 및 HLA-Dr-CD45RA+ 세포와 비교했을 때 HLA-Dr+CD45RA- 부분집합이 더 높은 FOXP3 발현을 나타냈다는 것을 실연한 한편, 이중 음성 HLA-Dr/CD45RA 부분집합에서는 중등도의 FOXP3 발현이 실연되었다 (도 10의 g). 총괄적으로, 이러한 발현 패턴 분석에서 표 2에 제시된 바와 같은 nTreg 분화/성숙 경로에서의 4개의 세포 집단 부분집합이 확인되었다.
| 표 2. 천연 조절 T-억제 인자 세포 분화/성숙 경로의 분석 | ||||
|
바이오마커
|
세포 집단 부분 집합 | |||
|
나이브
/휴지형
|
미성숙형 /메모리 | 성숙형/ 이펙터 |
최종
분화형 |
|
| CD4 | + | + | + | + |
| CD25 | hi | hi | hi | + |
| CD6 | lo/- | lo/- | lo/- | + |
| CD127 | lo/- | lo/- | lo/- | + |
| FOXP3 | lo | lo | hi | lo |
| CD45RA | + | + | - | - |
| CCR4 | - | lo/- | hi | hi |
| CD39 | - | lo | + | lo |
| HLA-Dr | - | lo | lo | lo |
| -, 분석된 세포 집단에서의 약 9% 미만의 바이오마커 검출. lo, 분석된 세포 집단에서의 약 10% 내지 약 49%의 바이오마커 검출. +, 분석된 세포 집단에서의 약 50% 내지 약 89%의 바이오마커 검출. hi, 분석된 세포 집단에서의 약 90% 초과의 바이오마커 검출. |
||||
본 발명가들은 CD45RA 및 GARP 발현을 사용하여 CD4+CD25hi /+CD6lo /-CD127lo /- Treg 집단을 또한 분석하였다. 결과에서 3가지 CD4+CD25+CD6lo /-CD127lo /- 세포 집단 부분집합이 확인되었다: 1) CD45RA+GARP- (Pop1); 2) CD45RA-GARP- (Pop2); 및 3) CD45RA-GARP+ (Pop3) 세포 (도 10의 h). 각각의 CD45RA/GARP 부분집합에서의 CD39 및 HLA-Dr 발현 분석은 Pop1에서 Pop2 및 Pop3으로의 CD39 발현 증가를 나타냈다. 그러나, GARP 발현과 nTreg 세포의 활성화 상태 간의 양성 상관관계를 나타내는 기존의 보고 (문헌 [Wang, et al., Expression of GARP Selectively Identifies Activated Human FOXP3+ Regulatory T Cells, Proc Natl Acad Sci U S A 106: 13439-13444, 2009])와 달리, HLA-Dr 발현이 GARP- (Pop2) 및 GARP+ (Pop3) 하위집단 양쪽 모두에 존재하였다 (도 10의 h). 또한, GARP 발현이 CD4+CD25+CD6+CD127+ 세포 상에서도 검출되었다 (도 10의 i).
결론적으로, 본 명세서의 측면들이 구체적인 실시양태를 언급하는 것에 의해 강조되었지만, 당업자는 이러한 개시된 실시양태들이 단지 본원에 개시된 내용의 원리를 설명한다는 것을 쉽게 인식할 것임을 이해하여야 한다. 따라서, 개시된 내용이 어떠한 방식으로도 본원에 기술된 특정 방법, 프로토콜 및/또는 시약 등에 한정되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 그러므로, 개시된 내용에 대한 다양한 변형 또는 변화 또는 이의 별법적인 구성이 본 명세서의 취지로부터 벗어나지 않으면서 본원의 교시내용에 따라 이루어질 수 있다. 마지막으로, 본원에서 사용된 술어는 단지 특정 실시양태를 기술하는 것을 목적으로 하고, 청구항에 의해서만 규정되는 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 정확하게 제시 및 기술된 바와 같은 것에 한정되지 않는다.
본 발명을 수행하기 위해 발명가들에게 공지된 최상의 방식을 포함하여, 본 발명의 특정 실시양태들이 본원에서 기술된다. 물론, 상기 설명을 읽으면 이러한 기술된 실시양태들에서의 변동이 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명가는 당업자가 적합하게 이같은 변동을 사용할 것으로 예상하고, 본 발명가는 본 발명이 본원에서 구체적으로 기술된 것과 다르게 실행되는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용되는 바와 같은 이에 첨부된 청구항에서 언급된 내용의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 또한, 본원에서 달리 지시되거나 또는 정황에 의해 달리 명확하게 모순되지 않는 한, 모든 가능한 변형의 상기 기술된 실시양태들의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.
본 발명의 별법적인 실시양태들, 요소들, 또는 단계들을 군으로 나누는 것은 제한으로 해석되지 않아야 한다. 각각의 군 구성원은 개별적으로 또는 본원에 개시된 다른 군 구성원과의 임의의 조합으로 지칭 및 청구될 수 있다. 군의 하나 이상의 구성원이 편리 및/또는 특허성의 이유로 군 내에 포함될 수 있거나 또는 군으로부터 삭제될 수 있는 것으로 예상된다. 임의의 이같은 포함 또는 삭제가 발생하는 경우, 명세서는 첨부된 청구항에서 사용된 모든 마쿠쉬 군의 기재를 충족시키도록 변형된 바와 같은 군을 함유하는 것으로 간주된다.
달리 지시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구항에서 사용된 특성, 항목, 양, 파라미터, 성질, 용어 등을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이라는 용어가 이를 수식하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 경우에, "약"이라는 용어는 이렇게 한정된 특성, 항목, 양, 파라미터, 성질 또는 용어가 언급된 특성, 항목, 양, 파라미터, 성질 또는 용어의 값의 위아래로 ±10％의 범위를 포함한다는 것을 의미한다. 따라서, 반대로 지시되지 않는 한, 명세서 및 첨부된 청구항에 기재된 수치 파라미터는 변할 수 있는 근사값이다. 최소한, 그리고 균등론의 적용을 청구항의 범주로 제한하려는 시도로서가 아니라, 각각의 수치 표시는 적어도 보고된 유의한 자릿수(digit)의 숫자의 견지에서, 그리고 일반적인 반올림 기술을 적용함으로써 해석되어야 한다. 본 발명의 넓은 범주를 기재하는 수치 범위 및 값이 근사값일지라도, 특정 실시예에서 기재된 수치 범위 및 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치 범위 또는 값은 이들 각각의 테스트 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 초래되는 특정 오차를 본질적으로 함유한다. 본원에서의 값의 수치 범위의 열거는 단지 이러한 범위 내에 속하는 각각의 개개 수치를 개별적으로 지칭하는 것의 속기법으로서의 역할을 하도록 의도된다. 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 수치 범위의 각각의 개별적인 값은 이것이 본원에서 개별적으로 열거되는 바와 같이 본 명세서 내에 포함된다.
본 발명을 기술하는 정황에서 (특히 하기의 청구항의 정황에서) 사용된 관사 ("a", "an", "the") 및 유사한 지시물은 본원에서 달리 지시되거나 또는 정황에 의해 명확하게 모순되지 않는 한 단수형 및 복수형 양쪽 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 지시되거나 또는 정황에 의해 달리 명확하게 모순되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공되는 임의의 모든 예, 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위해 의도되고, 달리 청구된 본 발명의 범주를 제한하지 않는다. 본 명세서 내의 어떠한 언어도 본 발명의 실행에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 가리키는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
본원에 개시된 특정 실시양태가 ~로 이루어지는 또는 ~로 본질적으로 이루어지는의 언어를 사용하여 청구항에서 추가로 제한될 수 있다. 청구항에서 사용되는 경우에 (출원된 바와 같은지 또는 보정으로 부가되었는지 여부와 관계 없음), "~로 이루어지는"이라는 전환 용어는 청구항에서 특정되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. "~로 본질적으로 이루어지는"이라는 전환 용어는 청구항의 범주를 특정 물질 또는 단계 및 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들에 한정한다. 이렇게 청구된 본 발명의 실시양태는 본원에서 내재적으로 또는 명확하게 기술되고 가능하게 된다.
본 명세서에서 언급 및 확인된 모든 특허, 특허 공개, 및 기타 간행물은, 예를 들어, 본 발명과 함께 사용될 수 있는 이같은 간행물에 기술된 조성물 및 방법을 기술하고 개시하는 목적을 위해, 전문이 참조로 본원에 개별적으로 및 명확하게 포함된다. 이러한 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 개시내용에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여 어떠한 것도 본 발명가들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이같은 개시내용을 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 날짜에 관한 언급 또는 이러한 문서의 내용에 관한 표현 모두는 출원인에게 입수가능한 정보를 기초로 하고, 이러한 문서의 내용 또는 날짜의 정확성에 관한 어떠한 시인도 구성하지 않는다.
Claims (27)
- T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고;
이때 CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확인하는 방법. - 제1항에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 단리(isolating)하거나 강화(enriching)하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제2항에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확장(expanding)시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD127 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD25+CD6low /-CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커 및 CD127 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+CD25+CD6low/-CD127low/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 HLA-Dr 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+CD25+CD6low /-HLA-Drlow/- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 스크리닝 단계가 하기를 추가로 포함하는 방법:
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD49d 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- CD49dlow /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD38 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- CD38low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD45RA 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- CD45RAlow /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 FoxP3 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- FoxP3+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CTLA-4 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- CTLA-4+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 GITR 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- GITR+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 LAG-3 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- LAG-3+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD39 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- CD39+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 헬리오스(Helios) 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- 헬리오스+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 FcRL3 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- FcRL3+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CCR7 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- CCR7+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CCR4 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- CCR4+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CCR8 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- CCR8+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD62L 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- CD62L+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 ICOS 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- ICOS+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD103 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- CD103+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 PD-1 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- PD-1+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD134 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- CD134+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 GARP 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- GARP+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD45RB 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- CD45RB+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD45RO 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- CD45RO+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD95 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- CD95+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD122 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- CD122+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것; 및/또는
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD8 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+ CD25+ CD6low /- CD8+ 또는 low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것. - 개체-적합성 T-세포의 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계;
CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 단계; 및
CD25+CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 투여함으로써, 개체에서 면역 반응을 치료하는 단계
를 포함하는, 개체에서 면역-기반 장애를 치료하는 방법. - 제9항에 있어서, CD25+CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 도입하기 전에 CD25+CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제9항에 있어서, 스크리닝 단계가 하기를 추가로 포함하는 방법:
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, CD4+CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 것;
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD127 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, CD25+CD6low /-CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 것; 또는
T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커 및 CD127 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, CD4+CD25+CD6low /-CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리하는 것. - 제9항에 있어서, 면역-기반 장애가 자가면역 용태, 장애 또는 질환, 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, 또는 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 생물로부터의 감염성 비-자가 항원에 대한 지속적이고 진행성인 면역 반응인 방법.
- CD25 바이오마커 리간드 및 CD6 바이오마커 리간드가 포함되는 2가지 이상의 상이한 바이오마커 리간드를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포의 집단의 확인, 단리 및/또는 강화를 위한 키트.
- 제13항에 있어서, CD4 바이오마커 리간드, CD127 바이오마커 리간드, CD49d 바이오마커 리간드, CD45RA 바이오마커 리간드, HLA-DR 바이오마커 리간드, FoxP3 바이오마커 리간드, CTLA-4 바이오마커 리간드, GITR 바이오마커 리간드, LAG-3 바이오마커 리간드, CD39 바이오마커 리간드, 헬리오스 바이오마커 리간드, FcRL3 바이오마커 리간드, CCR7 바이오마커 리간드, CCR4 바이오마커 리간드, CCR8 바이오마커 리간드, CD62L 바이오마커 리간드, ICOS 바이오마커 리간드, CD103 바이오마커 리간드, PD-1 바이오마커 리간드, CD134 바이오마커 리간드, GARP 바이오마커 리간드, CD45RB 바이오마커 리간드, CD45RO 바이오마커 리간드, CD95 바이오마커 리간드, CD122 바이오마커 리간드, CD8 바이오마커 리간드, 또는 이들의 임의의 조합물을 추가로 포함하는 키트.
- T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커 및 CD6 바이오마커가 포함되는 3가지 이상의 상이한 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하는 단계; 및
CD4+CD25+CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단을 단리함으로써, 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 수득하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 수득된 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 포함하는 조성물. - 제15항에 있어서, 스크리닝 단계가 T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD127 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고, 이때 CD4+CD25 +CD6low /-CD127low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포의 하위집단의 검출로 샘플 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단이 확인되는 것을 추가로 포함하는 조성물.
- 제15항에 있어서, 방법이 CD4+CD25+CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 개체 내로 도입하기 전에 CD4+CD25+CD6low /- 발현 패턴의 하위집단 T-세포를 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 조성물.
- T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커, CD6 바이오마커, 및 1개의 추가적인 바이오마커인 FoxP3 바이오마커, CTLA-4 바이오마커, CD45RA 바이오마커 또는 HLA-Dr 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고;
이때 면역억제성 조절 T-세포의 2가지 별개의 집단의 검출이 i) CD4+ CD25+ CD6low/- FoxP3+ 발현 패턴 및 CD4+ CD25+ CD6low /- FoxP3low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포, ii) CD4+ CD25+ CD6low /- CTLA-4+ 발현 패턴 및 CD4+ CD25+ CD6low /- CTLA-4low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포, iii) CD4+ CD25+ CD6low /- CD45RA+ 발현 패턴 및 CD4+ CD25+ CD6low /- CD45RAlow /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포, 또는 iv) CD4+ CD25+ CD6low /- HLA-Dr+ 발현 패턴 및 CD4+ CD25+ CD6low /- HLA-Drlow /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 기초로 하는 단계
를 포함하는, 2가지 이상의 별개의 면역억제성 조절 T-세포 집단을 확인하는 방법. - T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커, CD6 바이오마커, 및 1개의 추가적인 바이오마커인 FoxP3 바이오마커, CD45RA 바이오마커, CCR4 바이오마커, CD39 바이오마커 또는 HLA-Dr 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고;
이때 면역억제성 조절 T-세포의 4가지 별개의 성숙 부분집합의 검출이 i) CCR4low 발현 패턴, CD39low 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD6low/-CD45RA+ 발현 패턴; ii) CCR4- 발현 패턴, CD39- 발현 패턴, 또는 HLA-Dr- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD6low /-CD45RA+ 발현 패턴; iii) CCR4hi /+ 발현 패턴, CD45RA- 발현 패턴, CD39hi /+ 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow /- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25hi/+CD6low/- 발현 패턴; 및 iv) CR4hi /+ 발현 패턴, CD45RA- 발현 패턴, CD39low/- 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow /- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD6+ 발현 패턴을 포함하는 발현 패턴을 기초로 하는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합을 확인하는 방법. - 제19항에 있어서,
면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나가 나이브(naive) 또는 휴지형(resting) 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이고, 이러한 나이브 또는 휴지형 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 CD4+CD25+CD6low/-CD45RA+CCR4- 발현 패턴, CD4+CD25+CD6low /-CD45RA+CD39- 발현 패턴, 또는 CD4+CD25+CD6low /-CD45RA+HLA-Dr- 발현 패턴을 포함하고/하거나;
면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나가 미성숙형 또는 메모리 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이고, 이러한 미성숙형 또는 메모리 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 CD4+CD25+CD6low /-CD45RA+CCR4low 발현 패턴, CD4+CD25+CD6low /-CD45RA+CD39low 발현 패턴, 또는 CD4+CD25+CD6low /-CD45RA+HLA-Drlow 발현 패턴을 포함하고/하거나;
면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나가 성숙형 또는 이펙터 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이고, 이러한 성숙형 또는 이펙터 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 CD4+CD25hi /+CD6low /-CCR4hi /+ 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD6low /-CD45RA- 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD6low /-CD39hi /+ 발현 패턴, CD4+CD25hi/+CD6low/-CCR4hi/+CD45RA- 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD6low /-CCR4hi /+CD39hi /+ 발현 패턴, 또는 CD4+CD25hi /+CD6low /-CCR4hi /+HLA-DRlow 발현 패턴을 포함하고/하거나;
면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나가 최종 분화형 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이고, 이러한 최종 분화형 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 CD4+CD25hi /+CD6hi /+CCR4hi /+ 발현 패턴, CD4+CD25hi/+CD6hi/+CD45RA- 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD6hi /+CD39low 발현 패턴, CD4+CD25hi/+CD6hi/+HLA-Drlow 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD6hi /+CCR4hi /+CD45RA- 발현 패턴, CD4+CD25hi/+CD6hi/+CCR4hi/+CD39low 발현 패턴, 또는 CD4+CD25hi /+CD6hi /+CCR4hi /+HLA-DRlow 발현 패턴을 포함하는 방법. - 제18항에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나 이상을 단리하거나 강화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제21항에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나 이상을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- T-세포의 집단을 포함하는 샘플을 스크리닝하여 CD4 바이오마커, CD25 바이오마커, CD127 바이오마커, 및 1개의 추가적인 바이오마커인 FoxP3 바이오마커, CD45RA 바이오마커, CCR4 바이오마커, CD39 바이오마커, 또는 HLA-Dr 바이오마커의 세포 발현 수준을 검출하고;
이때, 면역억제성 조절 T-세포의 4가지 별개의 성숙 부분집합의 검출이 i) CCR4low 발현 패턴, CD39low 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+ 발현 패턴; ii) CCR4- 발현 패턴, CD39- 발현 패턴, 또는 HLA-Dr- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD127low /-CD45RA+ 발현 패턴; iii) CCR4hi /+ 발현 패턴, CD45RA- 발현 패턴, CD39hi /+ 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow /- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25hi /+CD127low /- 발현 패턴; 및 iv) CR4hi /+ 발현 패턴, CD45RA- 발현 패턴, CD39low/- 발현 패턴, 또는 HLA-Drlow /- 발현 패턴과 조합된 CD4+CD25+CD127+ 발현 패턴을 포함하는 발현 패턴을 기초로 하는 단계
를 포함하는, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합을 확인하는 방법. - 제23항에 있어서,
면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나가 나이브 또는 휴지형 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이고, 이러한 나이브 또는 휴지형 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 CD4+CD25+CD127low /-CD45RA+CCR4- 발현 패턴, CD4+CD25+CD127low /-CD45RA+CD39- 발현 패턴, 또는 CD4+CD25+CD127low /-CD45RA+HLA-Dr- 발현 패턴을 포함하고/하거나;
면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나가 미성숙형 또는 메모리 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이고, 이러한 미성숙형 또는 메모리 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 CD4+CD25+CD127low /-CD45RA+CCR4low 발현 패턴, CD4+CD25+CD127low /-CD45RA+CD39low 발현 패턴, 또는 CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+HLA-Drlow 발현 패턴을 포함하고/하거나;
면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나가 성숙형 또는 이펙터 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이고, 이러한 성숙형 또는 이펙터 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 CD4+CD25hi /+CD127low /-CCR4hi /+ 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD127low /-CD45RA- 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD127low /-CD39hi /+ 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD127low /-CCR4hi /+CD45RA- 발현 패턴, 또는 CD4+CD25hi /+CD127low /-CCR4hi/+CD39hi/+ 발현 패턴, 또는 CD4+CD25hi /+CD127low /-CCR4hi /+HLA-DRlow 발현 패턴을 포함하고/하거나;
면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나가 최종 분화형 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이고, 이러한 최종 분화형 면역억제성 조절 T-세포 집단 부분집합이 CD4+CD25hi /+CD127hi /+CCR4hi /+ 발현 패턴, CD4+CD25hi/+CD127hi/+CD45RA- 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD127hi /+CD39low 발현 패턴, CD4+CD25hi/+CD127hi/+HLA-Drlow 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD127hi /+CCR4hi /+CD45RA- 발현 패턴, CD4+CD25hi /+CD127hi /+CCR4hi /+CD39low 발현 패턴, 또는 CD4+CD25hi/+CD127hi/+CCR4hi/+HLA-DRlow 발현 패턴을 포함하는 방법. - 제23항에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나 이상을 단리하거나 강화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제25항에 있어서, 면역억제성 조절 T-세포 집단의 4가지 별개의 성숙 부분집합 중 하나 이상을 자극성 조성물과 접촉시킴으로써 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- α-CD6 항체를 개체에게 투여하고, 이에 의해 개체 내의 면역억제성 조절 T-세포의 집단을 강화하는 단계를 포함하며, 상기 투여가 CD6hi /+ 발현 패턴을 포함하는 T-세포를 작동불가능하게 하지만, CD6low /- 발현 패턴을 포함하는 T-세포는 작동불가능하게 하지 않는, 개체 내의 면역억제성 조절 T-세포를 강화하는 방법.
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