JP2022550132A - 制御性ｔ細胞を含む組成物ならびにそれを作製および使用する方法 - Google Patents

Abstract

エクスビボで増殖された臍帯血由来の制御性Ｔ細胞の集団が本明細書で提供される。それを作製および使用する方法も提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０２０年８月１１日に出願された米国特許仮出願第６３／０６４，１２９号、２０２０年６月１２日に出願された米国特許仮出願第６３／０３８，３４５号、２０２０年３月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／９９０，９１３号、および２０１９年９月２６日に出願された米国特許仮出願第６２／９０６，２８３号の利益を主張し、これらの各々の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本開示は、一般に、免疫制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の分野に関する。より具体的には、本開示は、Ｔｒｅｇの濃縮された臍帯血由来の集団、ならびにそれを作製および使用する方法を提供する。

Ｔｒｅｇは、自然に免疫応答を抑制および制御する。多数の自己免疫疾患、炎症性疾患、および悪性腫瘍は、Ｔｒｅｇの欠乏／欠損および／または抑制機能の消耗、または内因性Ｔｒｅｇの総細胞数によって直接引き起こされるか、または悪化し、これにより、引き換えにいくつかの疾患の症状につながる、細胞および組織の損傷につながる、自己反応性細胞傷害性Ｔ細胞の無制限の増殖が可能になる。このような欠陥のあるＴｒｅｇを同種異系の健康な臍帯血由来のＴｒｅｇに置き換えて補充すると、基礎疾患の臨床的改善につながって、自己反応性細胞傷害性Ｔ細胞の有害な作用を抑制することによって恒常性の再確立につながり得る。これらの自己免疫疾患、炎症性障害および悪性腫瘍のための追加の治療を開発する必要性が当該技術分野に残っている。

本明細書で提供されるのは、少なくとも約１×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞を含むヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、（ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋、および（ｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であり、ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性である、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団である。本明細書でさらに提供されるのは、少なくとも約１×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞を含むヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、（ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋、（ｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＸＣＲ４^＋、および（ｉｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であり、ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性である、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団である。本明細書でさらに提供されるのは、少なくとも約１×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞を含むヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、（ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋、（ｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋α４β７^＋、および（ｉｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であり、ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性である、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団である。また、本明細書で提供されるのは、少なくとも約１×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞を含むヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、（ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋、（ｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１１ａ^＋、および（ｉｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であり、ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性である、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団である。いくつかの実施形態にでは、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、少なくとも約１×１０^９個のヒトＴｒｅｇ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル細胞内染色色素またはＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット細胞内染色色素を使用するアッセイによって免疫抑制性であると決定される。

本明細書でさらに提供されるのは、少なくとも１つの凍結保存されたヒト臍帯血ユニットから活性化ヒト制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖された集団を産生するための方法であり、この方法は、ａ）凍結保存されたヒト臍帯血ユニットを解凍することと、ｂ）機能的に閉じたシステムで解凍された臍帯血ユニットを希釈および洗浄することと、ｃ）ＣＤ２５^＋細胞表面発現に基づく二重選択法を使用して内在性Ｔｒｅｇ細胞を単離することと、ｄ）ガス透過性培養器中での培地中、有効量のインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下で、かつ最大１０日間、最大１２日間、または最大１４日間、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬の存在下で、単離されたＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞をエクスビボで増殖させることであって、培地を約４８時間ごとに交換して、活性化ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞の集団を産生する、増殖させることと、ｅ）培地から活性化ＣＤ２５^＋細胞を採取して、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を産生することと、を含む。

いくつかの実施形態では、凍結保存されたヒト臍帯血ユニットは、ウォーターバス中で単一のステップで解凍される。

いくつかの実施形態では、希釈および洗浄ステップは、手動洗浄を含まない。いくつかの実施形態では、希釈および洗浄ステップは、ＰＢＳ、ＥＤＴＡ、および約０．５％のヒト血清アルブミンを含む溶液中で行われる。

いくつかの実施形態では、凍結保存されたヒト臍帯血ユニットの出発物質についての選択基準には、供給者の資格、総有核細胞カウント、凍結前の細胞生存率、凍結保存されたボリューム、収集日、保管条件、サイトメガロウイルスの血清陽性、人種および民族、母体ドナーの歴史、家族の病歴、ドナーの母親の感染症プロファイルが含まれる。いくつかの実施形態では、単一の臍帯血ユニットが使用される。いくつかの実施形態では、２つ～４つのプールされた臍帯血ユニットが使用される。いくつかの実施形態では、４つを超えるプールされた臍帯血ユニットが使用される。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２５に特異的に結合する試薬は、抗ＣＤ２５抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５に特異的に結合する試薬は、固体支持体にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、固体支持体は、磁性マイクロビーズである。いくつかの実施形態では、二重強磁性カラム法を使用して、ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞を単離する。

いくつかの実施形態では、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬は、抗ＣＤ３被覆ビーズおよび抗ＣＤ２８被覆ビーズを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３被覆ビーズおよび抗ＣＤ２８被覆ビーズは、１：１の比率である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法の培養ステップにおいて、ＣＤ２５^＋細胞ならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８被覆ビーズは、１：１の比率である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法の培養ステップにおいて、約１×１０^６個のＣＤ２５^＋細胞／ｍｌが培養される。

いくつかの実施形態では、有効量のＩＬ－２は、最大約１０００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、有効量のＩＬ－２は、約１０００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、単離されたＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞は、本明細書に記載の方法の培養ステップの直前に、ＩＬ－２を含む培地中に懸濁される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法の培養ステップにおいて、ＣＤ２５^＋細胞は、最初に、１０ｃｍ^２の膜表面積を有するガス透過性培養器中で培養される。いくつかの実施形態では、培養物は、その後、１００ｃｍ^２の膜表面積を有するガス透過性培養器に移される。いくつかの実施形態では、培養物は、本明細書に記載の方法の培養ステップにおいて混合および再懸濁されない。

いくつかの実施形態では、約１×１０^９～約１０×１０^９個の活性化ＣＤ２５^＋細胞は、培養の１０日、１２日、または１４日後に採取される。

本明細書でさらに提供されるのは、少なくとも１つの凍結保存されたヒト臍帯血ユニットから活性化ヒト制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖された集団を産生するための方法であり、この方法が、ａ）凍結保存されたヒト臍帯血ユニットをウォーターバス中で単一ステップで解凍することと、ｂ）手動洗浄を伴わない機能的に閉じたシステムにおいてＰＢＳ、ＥＤＴＡ、および０．５％のヒト血清アルブミンを含む溶液中で、解凍された臍帯血ユニットを希釈および洗浄することと、ｃ）二重強磁性カラム法を使用したＣＤ２５^＋細胞表面発現に基づく二重選択法を使用して、内在性Ｔｒｅｇ細胞を単離することと、ｄ）ガス透過性培養器中での培地中、約１０００ＩＵ／ｍｌのインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下で、かつ最大１０日間、最大１２日間、または最大１４日間、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８被覆ビーズの存在下で、単離されたＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞をエクスビボで増殖させることであって、培地を約４８時間ごとに交換して、活性化ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞の集団を産生し、ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞ならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８被覆ビーズが１：１の比率であり、培養物が混合および再懸濁されない、増殖させることと、ｅ）培地から活性化ＣＤ２５^＋細胞を採取して、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を産生することと、を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を凍結保存することをさらに含む。

本明細書でさらに提供されるのは、本明細書に記載の方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団である。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される集団のいずれかにおけるＴｒｅｇ細胞は、少なくとも９０％のＣＸＣＲ４^＋である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される集団のいずれかにおけるＴｒｅｇ細胞は、少なくとも９５％のＣＸＣＲ４^＋、少なくとも９５％のＣＤ４５ＲＡ^＋および少なくとも８０％のＣＤ４５ＲＯ^＋である。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、少なくとも９５％のＣＸＣＲ４^＋、少なくとも９５％のＣＤ４５ＲＡ^＋、少なくとも８０％のＣＤ４５ＲＯ^＋、少なくとも９５％のＣＤ９５^＋、少なくとも９５％のＨＬＡＤＲ^＋、少なくとも９５％のａｌｐｈａ４ｂｅｔａ７^＋、少なくとも１５％のＣＸＣＲ３ｈｉ^＋、少なくとも９５％のＣＣＲ６^＋、少なくとも９５％のＣＤ５４^＋、少なくとも９５％のＣＤ１１Ａ^＋、少なくとも８５％のＣＤ４５ＲＡＲＯ^＋、少なくとも８０％のＣＴＬＡ４^＋、少なくとも８０％のＧＰＲ８３^＋および少なくとも８０％のＣＤ６２Ｌ^＋である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される集団のいずれかにおけるヒトＴｒｅｇ細胞は、ＦＯＸＰ３の高発現およびＲＯＲγｔの低発現を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される集団のいずれかにおけるヒトＴｒｅｇ細胞は、それらのポリクローナルＴ細胞受容体Ｖβ（ＴＣＲ Ｖβ）レパートリーを維持する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される集団のいずれかにおけるヒトＴｒｅｇ細胞は、使用前に凍結保存される。

本明細書で提供されるのはまた、少なくとも１つの凍結保存されたヒト臍帯血ユニットから産生された活性化ヒト制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖された集団を凍結保存するための方法であり、この方法は、ａ）凍結保存されたヒト臍帯血ユニットを解凍することと、ｂ）機能的に閉じたシステムで解凍された臍帯血ユニットを希釈および洗浄することと、ｃ）ＣＤ２５^＋細胞表面発現に基づく二重選択法を使用して、内在性Ｔｒｅｇ細胞を単離することと、ｄ）ガス透過性培養器中での培地中、有効量のインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下で、かつ最大１０日間、最大１２日間、または最大１４日間、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬の存在下で、単離されたＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞をエクスビボで増殖させることであって、培地を約４８時間ごとに交換して、活性化ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞の集団を産生する、増殖させることと、ｅ）培地から活性化ＣＤ２５^＋細胞を採取して、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を産生することと、ｆ）定義された基準に基づいて臨床使用のために活性化培養ヒトＴｒｅｇ細胞を放出することと、ｇ）特徴的な表現型を有する放出された活性化培養ヒトＴｒｅｇ細胞を凍結保存することと、を含む。

本明細書でさらに提供されるのは、対象における移植片対宿主病を治療または予防するための方法であり、この方法は、対象に、有効量の本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または有効量の本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を投与することを含む。本明細書で提供されるのはまた、対象における移植片対宿主病を治療または予防するための方法であり、この方法は、対象に、（ｉ）有効量の本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または有効量の本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団、ならびに（ｉｉ）ルキソリチニブを投与することを含む。

本明細書で提供されるのはまた、対象における骨髄不全症候群を治療または予防するための方法であり、この方法は、対象に、有効量の本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または有効量の本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を投与することを含む。いくつかの実施形態では、骨髄不全症候群は、再生不良性貧血、原発性骨髄線維症または骨髄異形成症候群である。本明細書でさらに提供されるのは、対象における原発性骨髄線維症を治療または予防するための方法であり、この方法は、対象に、（ｉ）有効量の本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または有効量の本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団、ならびに（ｉｉ）ルキソリチニブを投与することを含む。

本明細書でさらに提供されるのは、対象における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療または予防するための方法であり、この方法は、対象に、有効量の本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または有効量の本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を投与することを含む。

本明細書で提供されるのはまた、対象における多発性骨髄腫を治療または予防するための方法であり、この方法は、対象に、有効量の本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または有効量の本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を投与することを含む。

本明細書でさらに提供されるのは、対象における神経炎症性障害を治療または予防するための方法であり、この方法は、対象に、有効量の本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または有効量の本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を投与することを含む。いくつかの実施形態では、神経炎症性障害は、ギランバレー症候群、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症または脱髄性神経障害である。

本明細書でさらに提供されるのは、対象における重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染に関連する呼吸器疾患、障害または状態を治療または予防するための方法であり、この方法は、対象に、有効量の本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または有効量の本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を投与することを含む。いくつかの実施形態では、呼吸器疾患、障害または状態は、ＣＯＶＩＤ－１９（コロナウイルス疾患）媒介性急性呼吸窮迫症候群（ＣｏＶ－ＡＲＤＳ）である。

本明細書でさらに提供されるのは、対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を治療または予防するための方法であり、この方法は、対象に、有効量の本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または有効量の本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＳは、キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法に関連している。

いくつかの実施形態では、有効量のヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、対象に静脈内投与される。

いくつかの実施形態では、有効量のヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、対象の体重の約１×１０^６～約１×１０^７個のＴｒｅｇ細胞／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量のヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、約１×１０^８個のＴｒｅｇ細胞～約３×１０^８個のＴｒｅｇ細胞である。

いくつかの実施形態では、有効量のヒトＴｒｅｇ細胞の集団の投与に続いて、対象における循環炎症性サイトカインレベルは、投与前の対象における循環炎症性サイトカインレベルと比較して減少する。

いくつかの実施形態では、治療前に、対象が有効量のヒトＴｒｅｇ細胞の集団に応答するかどうかを決定するために、対象の血清バイオマーカーが、検査される。いくつかの実施形態では、治療後に、臨床反応との相関を決定するために、対象の血清バイオマーカーが検査される。いくつかの実施形態では、血清バイオマーカーを連続的に検査して、その後のＴｒｅｇ細胞による再処理が必要かどうかを検査する。

いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、本明細書に開示される方法によって治療される対象に適合する血液型の１つ以上の臍帯血ユニットから調製される。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、本明細書に開示される方法によって治療される対象に対する６ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）マッチのうちの少なくとも３ＨＬＡマッチである臍帯血ユニットから調製される。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、本明細書に開示される方法によって治療される対象に対するＨＬＡマッチではない臍帯血ユニットから調製される。

本明細書でさらに提供されるのは、薬剤の調製における本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団の使用である。

室温（１５～３０℃）または４℃で保管した新鮮な活性化Ｔｒｅｇ細胞の生存率（７ＡＡＤ）を測定したアッセイによる結果を示す線グラフである（Ｎ＝９）。 増殖した活性化Ｔｒｅｇ細胞が免疫抑制性であることを示す一連のグラフを示す。抑制アッセイでは、従来のＴ細胞（Ｔｃｏｎ）（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^－）細胞を解凍し、メーカーの指示に従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色した。臍帯血ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎは、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる継続的な活性化の存在下で様々な比率に配置され、フローサイトメトリーを使用して３日後に分析された。図２Ａは、異なる比率でＴｒｅｇと共培養された場合に、増殖する従来のＴ細胞の大幅な抑制を示す。図２Ｂは、ＨＬＡマッチドペア（ｐ＝０．０３）およびＨＬＡミスマッチペア（ｐ＝０．０３、２－サイドｔ検定）において０日目に新鮮に単離された臍帯血と比較した場合に、１４日目に採取された活性化された増殖臍帯血Ｔｒｅｇの大幅に増加した抑制能力を示す。（ｎ＝２） 活性化Ｔｒｅｇ細胞が、ＨＬＡバリアを越えて免疫抑制性であり得ることを示す線グラフである。異種移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデル（Ｐａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １６（１０：９０－１００（２０１３））を使用して、非ＳＣＩＤガンマヌル（ＮＳＧ）マウスに亜致死的照射を行い、続いてＨＬＡ Ａ２陽性ドナーに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＧＶＨＤを誘発するための１×１０^７個の細胞の用量で注射した。処置群では、ＨＬＡ Ａ２陰性ドナーに由来する臍帯血Ｔｒｅｇを、ＰＢＭＣ注射の１日前に１×１０^６個の細胞の用量で注射した。マウスを、生存について追跡した。１ｌｏｇ少ない用量でも、ＣＢ Ｔｒｅｇは、ＧＶＨＤの有害な影響を救うことができ、ＰＢＭＣのみの群と比較した場合に、４０日目に統計的に有意な優れた生存率（ログランク；ｐ＝０．００３）がもたらされた。 増殖された活性化Ｔｒｅｇ細胞が抑制性を維持し続け、ＲＯＲγｔを発現せず、ストレスに応答してＩＬ－１０発現の相互増加を示すことを示す一連のグラフおよびプロットを示す。臍帯血Ｔｒｅｇは、ＩＬ－２およびＣＤ３／ＣＤ２８共発現ビーズの存在下で培養中に増殖した。細胞はまた、０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌまたは２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６で処理された。細胞は４８時間ごとに供給され、フローサイトメトリーに基づく分析がＲＯＲγｔの細胞内染色ならびにＩＬ－１０およびＩＬ－１７のサイトカイン放出アッセイのために実行された。 凍結保存された臍帯血（ＣＢ）Ｔｒｅｇ細胞は、新鮮なＣＢ Ｔｒｅｇ細胞と比較して、同等の抑制機能を有することを示すグラフを示す。図５Ａ：ポジティブコントロールには、ＣＤ３／２８ビーズの存在下でのＴｃｏｎ細胞が含まれる。図５Ｂ：ネガティブコントロール－ＣＤ３／２８ビーズの非存在下でのＴｃｏｎ細胞。図５Ｃ：新鮮なＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の共培養はＴｃｏｎ細胞の増殖を抑制する。図５Ｄ：凍結保存されたＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の共培養は、Ｔｃｏｎ細胞の増殖を抑制する。 増殖された臍帯血ＴｒｅｇがＴ細胞受容体Ｖβレパートリーのガウス（ポリクローナル）分布を示すことを示す一連のグラフである。市販のキット（Ｔｅｌ－Ｔｅｓｔ、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、ＴＸ）を使用してＴｒｅｇから全ＲＮＡを抽出し、逆転写（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用してｃＤＮＡを調製した。次に、ＣＤＲ３領域は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって２３個のＴＣＲ Ｖβサブセットに対して増幅された。得られたＰＣＲ産物はキャピラリー電気泳動および定量的デンシトメトリーに供され、各ＴＣＲ Ｖβファミリー内のフラグメント長の多様性を評価した。 増殖された臍帯血Ｔｒｅｇは、デキサメタゾン（「Ｄｅｘ」または「ステロイド」と呼ばれる）の存在下で抑制性を維持することを示す。「Ｔｃｏｎ」は、従来のＴ細胞を指す。「Ｔｒｅｇ」は、制御性Ｔ細胞を指す。左上および左下のパネルは、ステロイド（－）である。右上および右下のパネルには１００μｇ／ｍＬのステロイドが含まれている。 凍結保存された活性化Ｔｒｅｇ細胞は一貫した表現型を示し、新鮮な活性化Ｔｒｅｇ細胞と同様に免疫抑制が可能であることを示す。図８Ａは、解凍時の凍結保存されたＴｒｅｇにおけるＣＤ２５、ＣＤ８およびＣＤ１２７の発現を示す。図８Ｂは、凍結保存されたＴｒｅｇがＨｅｌｉｏｓおよびＦｏｘＰ３の高発現を示すことを示す。図８Ｃは、凍結保存されたＴｒｅｇが、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット色素ベースの抑制アッセイを使用して、増殖する従来のＴ細胞を抑制することを示す。 異種マウス移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルを使用した研究の結果を示す。異種移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデル（Ｐａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １６（１０：９０－１００（２０１３））を使用して、新鮮な活性化Ｔｒｅｇ細胞または凍結保存された（凍結された）活性化Ｔｒｅｇ細胞を、１×１０^７個の細胞の用量で、ＧＶＨＤ予防のための１×１０^７個の細胞の用量でドナー末梢血単核細胞の１日前に投与した。図９Ａは、ＧＶＨＤスコアに対する新鮮な活性化Ｔｒｅｇ細胞または凍結保存された（凍結された）活性化Ｔｒｅｇ細胞の効果を示すグラフである。図９Ｂは、マウスの体重に対する新鮮な活性化Ｔｒｅｇ細胞または凍結保存された（凍結された）活性化Ｔｒｅｇ細胞の効果を示すグラフである。「ＣＢ」は、臍帯血を指す。「ＰＢＭＣ」は、末梢血単核細胞を指す。 異種マウス移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルを使用した研究の設計を示す。図１０Ａは、ＮＳＧマウスが－１日目に亜致死的照射を受け、続いて臍帯血（ＣＢ）Ｔｒｅｇ－１×１０^７個の細胞が注射され、０日目にＰＢＭＣ－１×１０^７個の細胞が注射されるＧＶＨＤ予防研究設計を示す。続いて、体重およびＧＶＨＤスコアの測定のためにマウスを１日おきに追跡する。末梢血および血清は、ベースラインで、その後は＋７日目から１週間間隔で採取される。図１０Ｂは、ＮＳＧマウスが－１日目に亜致死的照射を受け、０日目にＰＢＭＣ－１×１０^７個の細胞の注射を受けるＧＶＨＤ治療研究設計を示す。ＣＢ Ｔｒｅｇ－１×１０^７個の細胞の注射は、＋４、＋１１、＋１８、および＋２５日目に投与される。続いて、体重、ＧＶＨＤスコアおよび生存率の測定のために、マウスを１日おきに追跡する。末梢血および血清は、ベースラインで、その後は＋７日目から１週間間隔で採取される。「ＰＢＭＣ」は、末梢血単核細胞を指す。「凍結Ｔｒｅｇ」は、凍結保存されたＴｒｅｇを指す。「ＮＳＧ」とは、非ＳＣＩＤガンマヌルマウスを指す。 異種マウス移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルにおける体重変動（図１１Ａ）および生存（図１１Ｂ）に対する凍結保存された活性化Ｔｒｅｇの投与の効果を示す。「予防」は、図１０Ａに示される研究設計を指す。「処置」は、図１０Ｂに示される研究設計を指す。「コントロール」とは、Ｔｒｅｇ細胞が投与されていないネガティブコントロールを指す。 コントロール、予防および処置群の異種マウス移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルにおけるベースライン、＋７日後および＋１４日後のＰＢＭＣ注入の末梢血サイトカイン分析の結果を示す。図１２ＡＩＰ－１０、図１２Ｂ：ＴＮＦα、図１２Ｃ：ＧＭ－ＣＳＦ、図１２Ｄ：ＭＩＰ－１β、図１２Ｅ：ＦＬＴ－３Ｌ、図１２Ｆ：ＩＦＮ－γ。 活性化Ｔｒｅｇ（臍帯血（ＣＢ）Ｔｒｅｇのみ）または活性化ＴｒｅｇおよびＰＢＭＣ（ＣＢ Ｔｒｅｇ＋ＰＢＭＣ）で治療されたマウスの画像を示す。ホタルルシフェラーゼ標識ＣＢ Ｔｒｅｇの注入後の生物発光スキャンは、注射後＋１日までに、ＰＢＭＣの注射に関係なく、すべてのマウスの肺、肝臓、および脾臓でＣＢ Ｔｒｅｇが検出されたことを示した。＋３日目までに、ＣＢ Ｔｒｅｇは、ＰＢＭＣ（ＣＢ Ｔｒｅｇのみ）が継続的に存在しないマウスでは検出され得なくなったが、ＰＢＭＣレシピエントマウス（ＣＢ Ｔｒｅｇ＋ＰＢＭＣ）では引き続き検出された。ＰＢＭＣが増殖しているマウスでは、スキャンにより、ＧＶＨＤ標的臓器の持続性および増殖さえも示唆される。 活性化Ｔｒｅｇで処置したマウスの画像を示す。ＧＦＰ標識ＨＬ－６０急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞株を３×１０^６個の細胞の用量で、以下の４つの群すべてのＮＳＧマウスに注射した：１）コントロールマウス（ＰＢＳ＆ＡＭＬ）：ＨＬ６０＋ＰＢＳを投与、２）Ｔｒｅｇマウス（ＡＭＬ＋Ｔｒｅｇ）：ＨＬ６０＋Ｔｒｅｇ（１×１０^７個の細胞）を投与、３）Ｔｃｏｎマウス（ＡＭＬ＋Ｔｃｏｎ）：ＨＬ６０＋Ｔｃｏｎ（１×１０^７個の細胞）を投与、４）Ｔｃｏｎ＋Ｔｒｅｇマウス（ＡＭＬ＋Ｔｃｏｎ＋Ｔｒｅｇ）：ＨＬ６０＋Ｔｃｏｎ（１×１０^７個の細胞）＋Ｔｒｅｇ（１×１０^７個の細胞）を投与。注射されたＴｃｏｎおよびＴｒｅｇの腫瘍体積負荷に対する影響を理解するために、マウスを１週間間隔で撮影した。マウスは、コントロール（ＰＢＳ処理）およびＣＢ Ｔｒｅｇのみで処置されたマウスにおける腫瘍に屈した。Ｔｃｏｎのレシピエントは腫瘍を排除することができたが、ＧＶＨＤで死亡した。ＴｃｏｎおよびＴｒｅｇのレシピエントは、腫瘍コントロールおよびＧＶＨＤの欠如により、生存期間を延長することができた。 全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の異種マウスモデルにおいて、ＳＬＥ－ＰＢＭＣの生着後９週間、活性化Ｔｒｅｇ細胞の単回注射によりＣＤ４５^＋エフェクターＴ細胞のレベルが低下したことを示す線グラフを示し、ＳＬＥ－ＰＢＭＣ（３×１０^６個の細胞）をＮＳＧマウスに注射し、ＣＢ Ｔｒｅｇ（１×１０^７個の細胞）をＳＬＥ－ＰＢＭＣ注射の１週間後に注射する。「ＰＢＭＣ」は、末梢血単核細胞を指す。 全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の異種マウスモデルにおいて、ＳＬＥ－ＰＢＭＣ（３×１０^６個の細胞）の注射後４週間から活性化Ｔｒｅｇ細胞（１×１０^７個の細胞）を週４回注射すると生存率が改善したことを示すグラフを示す。 全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の異種マウスモデルにおいて、活性化Ｔｒｅｇ細胞を週４回注射すると抗二本鎖ＤＮＡ抗体（ｄｓ ＤＮＡ Ｉｇ）のレベルが低下したことを示す棒グラフを示す。 全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の異種マウスモデルにおいて、活性化Ｔｒｅｇ細胞を週４回注射すると尿中アルブミンのレベルが低下し（図１７Ａ）、尿中クレアチニン漏出が減少した（図１７Ｂ）ことを示すプロットを示す。 全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の異種マウスモデルにおいて、活性化Ｔｒｅｇ細胞を週４回注射すると腎組織が改善したことを示す一連の画像を示す。 全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の異種マウスモデルにおいて、活性化Ｔｒｅｇの投与によりヒトｓＣＤ４０Ｌの血清濃度が低減することを示す統計分析のグラフおよび結果を示す。 活性化された凍結保存されたＴｒｅｇの毎週の注射が循環ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞における持続的な減少（図２０Ａ）、ならびに全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の異種マウスモデルにおける脾臓、骨髄、肺および肝臓におけるＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の浸潤の減少（図２０Ｂ）をもたらしたことを示すグラフを示す。「ＰＢＭＣ」は、末梢血単核細胞を指す。 多発性骨髄腫の異種マウスモデルにおけるＴｒｅｇの投与の効果を示す一連のグラフおよび画像を示す。図２１Ａは、経時的なマウス体重への影響を示す折れ線グラフである。ＣＢ Ｔｒｅｇレシピエントは体重を維持するが、「骨髄腫単独」群における減少は、腫瘍接種後４週目頃に体重が減少し始めることを示す。図２１Ｂは、経時的な末梢血中の循環骨髄腫細胞への影響を示す折れ線グラフである。毎週採血を行い、単離した細胞を循環中のヒトＣＤ３８^＋細胞について分析した。循環性骨髄腫細胞における有意な増加は、Ｔｒｅｇレシピエントと比較して、「骨髄腫単独」群において明らかであった（ｐ＝０．００２）。図２１Ｃは、腫瘍負荷の視覚化を示す一連の画像を示す。毎週の生物発光イメージングによって監視されるように、ＭＭ１Ｓ細胞の最小限の証拠は、「骨髄腫単独」のマウスの広範な腫瘍と比較して、ＣＢ Ｔｒｅｇレシピエントにおいて視覚化された。図２１Ｄは、経時的な腫瘍負荷の定量化を示す折れ線グラフである。生物発光イメージングの認定では、１７、２４、３１日目に有意に高いシグナルが観察された。三角形はＣＢ Ｔｒｅｇ ｉ．ｖ．注射を示し、矢印はＭＭ１Ｓ細胞ｉ．ｖ．注射を示す。 活性化Ｔｒｅｇの投与により多発性骨髄腫の異種マウスモデルにおいて生存を改善することを示すグラフを示す。異種骨髄腫モデルでは、骨髄腫細胞注射前の臍帯血（ＣＢ）Ｔｒｅｇ注射により、「骨髄腫単独」群と比較して、全生存期間が改善された。Ｐ＝０．０３９は、ログランク検定によって決定された。 活性化Ｔｒｅｇの投与により、多発性骨髄腫の異種マウスモデルにおいて、血漿ＩＬ－６レベルが低下することを示す棒グラフを示す。異種骨髄腫マウスモデルでは、骨髄腫細胞の注射の１日前に臍帯血（ＣＢ）Ｔｒｅｇの注射により、骨髄腫の生着が妨げられ、血清炎症性サイトカインＩＬ－６のレベルの低下と相関する全生存期間の改善につながった。循環血漿マウスＩＬ－６レベルの測定は、２８日目および３５日目に「骨髄腫単独」マウスと比較して、より低いレベルを示した。平均±ＳＥＭ。＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０１は、各時点で対応のないスチューデントｔ検定によって決定された。 多発性骨髄腫の異種マウスモデルにおいて、活性化Ｔｒｅｇ細胞の投与により、骨髄（図２４Ａ）および脾臓（図２４Ｂ）における骨髄腫負荷が減少したことを示す棒グラフを示す。各群の３匹のマウスを安楽死させ、臓器を２５日目に採取した。骨髄および脾臓の細胞をＣＤ３８抗体で染色し、フローサイトメトリーによってＭＭ．１Ｓ細胞の集団を分析した。 細胞がＩＬ－６に曝露されるとき、臍帯血から単離された活性化Ｔｒｅｇ細胞によるサイトカイングランザイムＢの分泌を示す。 実施例９に記載の筋萎縮性側索硬化症の治療における臍帯血由来の制御性Ｔ細胞の投与の安全性および有効性を評価するための臨床試験のタイムラインを示す。 実施例１０に記載のＣＯＶＩＤ－１９（コロナウイルス病）媒介性急性呼吸窮迫症候群（ＣｏＶ－ＡＲＤＳ）の治療における臍帯血由来制御性Ｔ細胞の投与の安全性および有効性を評価するための臨床試験についてのプロトコルの図を示す。 骨髄不全を患う対象の治療における臍帯血由来の制御性Ｔ細胞の投与の安全性および有効性を評価するための第１相臨床試験の初期の結果の要約を示す。 活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団を含む様々な産物の臍帯血選択基準を提供する表である。「ＡＡＢＢ」は、アメリカ血液バンク協会を指す。「ＦＡＣＴ」とは、細胞療法認定機構を指す。「ＣＬＩＡ」とは、臨床検査室改善法を指す。 活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団を含む様々な産物の臍帯血選択基準を提供する表である。「ＣＫ０８０２．ａ４ｂ７」は「ＣＫ０８０２．α４β７」を指す。 Ｔｒｅｇ細胞、Ｔｃｏｎ細胞およびルキソリチニブの共培養開始後９６時間での０．０５μＭルキソリチニブの非存在下または存在下での活性化Ｔｒｅｇ細胞による抑制率を示す線グラフである。ｘ軸は、Ｔｒｅｇ細胞とＴｃｏｎ細胞の比率を示す。Ｒｕｘｏ＝ルキソリチニブ。 （１）活性化Ｔｒｅｇ細胞、（２）ルキソリチニブおよび／または（３）カンプトテシンの組み合わせの存在下または非存在下で病原性ループス細胞によって放出されるインターフェロン（ＩＦＮ）－ガンマの量を示す棒グラフである。Ｒｕｘ＝ルキソリチニブ。ＳＬＥ－ＰＢＭＣ＝全身性エリテマトーデスを有する対象に由来する末梢血単核細胞。Ｄ６＝６日目。 ルキソリチニブおよび活性化Ｔｒｅｇ細胞レジメンによる異種マウス移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルの治療の概略図を示す。ＰＢＭＣ＝末梢血単核細胞。 異種マウスＧＶＨＤモデルにおけるＧＶＨＤスコア（図３４Ａ）または生存率（図３４Ｂ）に関する（１）活性化Ｔｒｅｇ細胞（２）ルキソリチニブ、または（３）活性化Ｔｒｅｇ細胞およびルキソリチニブによる処置の効果を示すグラフを示す。ＲｕｘまたはＲ＝ルキソリチニブ。ＰＢＭＣ＝末梢血単核細胞。 異種マウスＧＶＨＤモデルにおける活性化Ｔｒｅｇ細胞の持続性に関する（１）活性化Ｔｒｅｇ細胞、（２）ルキソリチニブ、または（３）活性化Ｔｒｅｇ細胞およびルキソリチニブによる処置の効果を示す一連の棒グラフを示す。図３５Ａは、ヒトＣＤ４５細胞のパーセンテージを示す。図３５Ｂは、ＣＤ４およびＣＤ４５を共発現するヒトＣＤ４５細胞のパーセンテージを示す。図３５Ｃは、ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞と標識されたヒトＣＤ４５細胞のパーセンテージを示す。ＲｕｘまたはＲ＝ルキソリチニブ。 異種マウスＧＶＨＤモデルにおけるサイトカイン分泌に関する（１）活性化Ｔｒｅｇ細胞、（２）ルキソリチニブ、または（３）活性化Ｔｒｅｇ細胞およびルキソリチニブによる処置の効果を示す一連の棒グラフを示す。図３６Ａは、血漿ＩＬ－７の正規化されたレベルを示す。図３６Ｂは、血漿ＩＬ－１５の正規化されたレベルを示す。図３６Ｃは、血漿ＩＬ－４の正規化されたレベルを示す。Ｒｕｘｏ＝ルキソリチニブ。 異種マウスＧＶＨＤモデルにおける炎症性サイトカイン分泌に関する（１）活性化Ｔｒｅｇ細胞、（２）ルキソリチニブ、または（３）活性化Ｔｒｅｇ細胞およびルキソリチニブによる処置の効果を示す一連の棒グラフを示す。図３７Ａは、血漿ＩＬ－１ａの正規化されたレベルを示す。図３７Ｂは、血漿ＩＬ－１７の正規化されたレベルを示す。図３７Ｃは、血漿ＩＦＮａ２の正規化されたレベルを示す。図３７Ｄは、血漿ＦＧＦ－１２の正規化されたレベルを示す。図３７Ｅは、血漿マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）の正規化されたレベルを示す。Ｒｕｘｏ＝ルキソリチニブ。 異種マウスＧＶＨＤモデルにおける抗炎症性サイトカイン分泌に関する（１）活性化Ｔｒｅｇ細胞、（２）ルキソリチニブ、または（３）活性化Ｔｒｅｇ細胞およびルキソリチニブによる処置の効果を示す一連の棒グラフを示す。図３８Ａは、血漿ＩＬ－１ＲＡの正規化されたレベルを示す。図３８Ｂは、血漿ＩＬ－１ａ３の正規化されたレベルを示す。図３８Ｃは、血漿ＩＬ－１２ｐ７０の正規化されたレベルを示す。Ｒｕｘｏ＝ルキソリチニブ。 異種マウスＧＶＨＤモデルにおける血液学的パラメータに関する（１）活性化Ｔｒｅｇ細胞、（２）ルキソリチニブ、または（３）活性化Ｔｒｅｇ細胞およびルキソリチニブによる処置の効果を示す一連の棒グラフを示す。図３９Ａは、ヘモグロビンレベルを示す。図３９Ｂは、血小板レベルを示す。ＲｕｘまたはＲ＝ルキソリチニブ。 トランスウェル遊走アッセイの概略図である。標的細胞は骨髄腫細胞または白血病細胞（ネガティブコントロール）である。アクター細胞は、ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞またはＴｅｆｆ細胞である。 骨髄腫および白血病の標的細胞の遊走に関するＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の影響を示す一連の棒グラフを示す。図４０Ｂは、ＣＢ Ｔｒｅｇが減少し、Ｔｅｆｆ細胞がＭＭ１Ｓ（骨髄腫細胞株）の遊走を完全にブロックすることを示す（ｐ＜０．００１）。図４０Ｃは、ＣＢ Ｔｒｅｇが減少し、Ｔｅｆｆ細胞がＲＰＭＩ８２２６（骨髄腫細胞株）の遊走を完全にブロックすることを示す（ｐ＝０．０４）。図４０Ｄは、ＣＢ ＴｒｅｇがＵ２６６（骨髄腫細胞株）の遊走を減少させるが、有意には減少させないことを示す。Ｔｅｆｆ細胞はＵ２６６の遊走をブロックする。図４０Ｅは、ＣＢ ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞がＨＬ－６０（急性骨髄性白血病細胞株）の遊走にいずれの影響も及ぼさないことを示す。図４０Ｆは、ＣＢ ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ細胞がＮａｌｍ６（プレＢ細胞白血病細胞株）の遊走にいずれの影響も及ぼさないことを示す。＊＊Ｐ＜０．０５は、各時点で対応のないスチューデントｔ検定によって決定された。図４０Ｂ～図４０Ｄのｙ軸は、細胞数×１０^３／μＬを示す。 骨髄不全（ＢＭＦ）を有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験の設計の概略図を示す。 ＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験の臨床データをまとめた図である。 ＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験の臨床データをまとめた表である。 ＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験の奏効データの持続性をまとめたグラフである。 ＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験における患者１の治療歴をまとめた図を示す。 ベースライン時ならびにＴｒｅｇ細胞投与１ヶ月後および４ヶ月後のＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験における患者１の臨床データを示す。 ＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験における患者１の炎症性サイトカインレベルを示す一連のグラフである。ｘ軸はＴｒｅｇ細胞投与後の日数を示す。左上のパネル：ＣＸＣＬ－５。右上のパネル：ＩＬ－１７。左下のパネル：ＩＬ－１５。右下のパネル：ＭＣＰ。 ＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験における患者１の炎症性サイトカインレベルを示す一連のグラフである。ｘ軸はＴｒｅｇ細胞投与後の日数を示す。左上のパネル：ＩＬ－８。右上のパネル：ｓＣＤ４０Ｌ。左下のパネル：ＭＩＰ－１。右下のパネル：ＳＤＦ－１α＋１β。 ベースライン時ならびにＴｒｅｇ細胞投与後１ヶ月および４ヶ月のＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験における患者１の脾腫測定値を示す棒グラフを示す。 ＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験における患者２の治療歴をまとめた図である。 ＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験における患者２の炎症性サイトカインレベルを示す一連のグラフである。ｘ軸はＴｒｅｇ細胞投与後の日数を示す。 ＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験における患者３の経時的なＴＰＯレベルを示すグラフである。 ＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験における患者３についての経時的な血小板（ＰＬＴ）輸血の必要量を示す。 ＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験における患者３についての経時的な濃厚赤血球（ＰＲＢＣ）輸血の必要量を示す。 ＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験における患者４についての経時的な血小板（ＰＬＴ）輸血の必要量を示す。 ＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験における患者４についての経時的な濃厚赤血球（ＰＲＢＣ）輸血の必要量を示す。 ＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験における患者６についての経時的な血小板（ＰＬＴ）輸血の必要量を示す。 ＢＭＦを有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験における患者６についての経時的な濃厚赤血球（ＰＲＢＣ）輸血の必要量を示す。 ｉ）模擬キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、ｉｉ）臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞、ｉｉｉ）ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞、または（ｉｖ）臍帯血由来のＴｒｅｇ細胞＋ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞で処置した異種リンパ腫マウスモデルの研究からのデータを示す。 ｉ）模擬キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、ｉｉ）臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞、ｉｉｉ）ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞、または（ｉｖ）臍帯血由来のＴｒｅｇ細胞＋ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞で処置した異種リンパ腫マウスモデルの研究からのデータをまとめた表を示す。図６０Ａは、様々な群の生存時間の比較を示す。図６０Ｂは、様々な臓器におけるＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞／μＬを示す。 多発性骨髄腫の異種マウスモデルにおけるＴｒｅｇの複数の投与量の投与の効果を示す一連のグラフおよび画像を示す。図６１Ａは、（１）ＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞単独、（２）骨髄腫細胞およびＣＤ３^＋Ｔ従来型細胞（Ｔｃｏｎ）、（３）骨髄腫細胞および臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒｅｇ）、または（４）骨髄腫細胞、Ｔｃｏｎ細胞およびＴｒｅｇ細胞（Ｔｃｏｎ Ｔｒｅｇ）を投与されたマウスの経時的なマウス体重への影響を示す折れ線グラフである。図６１Ｂは、ＣＤ３^＋Ｔ従来型細胞（Ｔｃｏｎ）またはＴｃｏｎ細胞とＴｒｅｇ細胞との組み合わせ（Ｔｃｏｎ ｗ Ｔｒｅｇ）で処置されたマウスの非侵襲的生物発光イメージング（ＢＬＩ）で生成された一連の画像を示す。図６１Ｃは、ＢＬＩによる腫瘍負荷の定量化を示す折れ線グラフである。図６１Ｄは、Ｔｃｏｎ細胞単独で処置されたマウスにおける髄外再発の例を示す画像である。図６１Ｅは、Ｔｒｅｇ細胞を用いたＣＤ３およびＢＣＭＡ（ＢｉＴＥ（登録商標））に対する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの投与についての実験計画を示す。図６１Ｆは、ＢｉＴＥ（登録商標）およびＰａｎＴ細胞、あるいはＢｉＴＥ（登録商標）、ＰａｎＴおよびＴｒｅｇ細胞の組み合わせで処置されたマウスの非侵襲的ＢＬＩで生成された一連の画像を示す。図６１Ｇは、ＢｉＴＥ（登録商標）を介した体重減少に対するＴｒｅｇ投与の効果を示す線グラフである。図６１Ｈは、ＧＶＨＤ（移植片対宿主病）スコアに対するＴｒｅｇ投与の効果を示す棒グラフである。

健康な制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、胸腺の欠失を回避するか、または胸腺外の抗原を認識するこれらの細胞の活性化および増殖を防ぐことにより、自己反応性細胞傷害性Ｔ細胞から体を保護する。したがって、Ｔｒｅｇは、恒常性および免疫制御、ならびに自己免疫の発生に対して宿主を保護するために重要である。さらに、注入されたＴｒｅｇおよび生来のＴｒｅｇの両方には、ｉ）Ｔｒｅｇの生存に不可欠な過剰なＩＬ－２を産生するエフェクターＴ細胞の増殖、およびｉｉ）組織内に存在する損傷した抗原提示細胞／樹状細胞によって放出されるホーミングシグナルによる炎症領域が存在する。

いくつかの種類のＴｒｅｇが記載されているが、最も特徴的で最も強力なサブセットは、ＣＤ４ならびに高レベルのＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα）およびＦｏｘＰ３、フォークヘッドボックスＰ３遺伝子産物およびＣＤ１２７^ｌｏを発現する。これらのＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋ＣＤ１２７^ｌｏＴｒｅｇは、胸腺で発生して胸腺選択を受ける天然のＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）と、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）などのサイトカインの影響下で末梢で発生する内在性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）にさらに細分化され得る。（Ｏｈｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３８（３）：４１４－２３（２０１３）を参照されたい。）

それらの内在性状態では、Ｔｒｅｇ細胞は、免疫恒常性を維持し、自然免疫および獲得免疫の両方を調節することによって自己免疫応答を制限する上で重要な役割を果たす。Ｔｒｅｇ細胞は、末梢性免疫寛容を維持し、自己免疫反応および病原性組織の損傷を阻害することによる免疫恒常性に不可欠である。（Ｂｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １８９（１０）：４７０５－１１（２０１２）、Ｓｃｈｎｅｉｄａｗｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２２（１８）：３１１６－２１（２０１３）およびＴａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ ５（１１）：ａ０１５５５２（２０１３））を参照されたい。）しかし、自己免疫疾患では、欠陥のある内因性Ｔｒｅｇは、自己反応性の細胞傷害性Ｔ細胞／エフェクターＴ細胞の猛攻撃から体を効果的に保護することができない。

Ｔｒｅｇ療法の開発に対する１つのハードルは、制御性Ｔ細胞の不安定性であり、これはしばしば炎症性エフェクターＴ細胞の表現型に「反転」する。例えば、Ｔｒｅｇ細胞はＦＯＸＰ３の発現を下方制御し、それによってＥ３ユビキチンリガーゼＳｔｕｂ１の活性およびＨｓｐ７０依存的様式によってエフェクターＴ細胞様機能を獲得することができる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１３ Ａｕｇ ２２；３９（２）：２７２－８５）。

この困難に対処するために、本開示は、臍帯血由来のＴｒｅｇを使用する。臍帯血は免疫原性が低く、公的および私的臍帯血バンクで過剰に利用可能である。臍帯血（ＣＢ）は、抑制性が高いために、末梢血（ＰＢ）とは異なり、エピジェネティックな特性が異なり、血球の比率が異なる。さらに、臍帯血細胞は、原始的で、免疫反応性が低く、ナイーブであり、より高い増殖指数を示し、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の境界を越えて機能することができる。臍帯血に由来するＴｒｅｇがナイーブであり、他のＴｒｅｇ源と比較して抑制性が高くかつ可塑性に欠けるために、臍帯血源は独特である。同様に、臍帯血細胞は、出産のストレスの間、多くのサイトカインによって絶えず刺激されるために、それらは起こりうる有毒な環境物質に対してあまり敏感ではない。

Ｔｒｅｇ療法の開発に対する別のハードルは、進行中の炎症を鎮めるために一定期間にわたって繰り返し注入され得る臨床的に適切な細胞数である。本明細書に開示されるのは、少なくとも１つの凍結保存されたヒト臍帯血ユニットから、活性化ヒト制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖された集団を産生するための方法である。開示されるのはまた、本明細書に記載の方法によって産生された活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団である。本明細書にさらに開示されるのは、対象に有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団を投与することによって疾患または障害を治療するための方法である。本明細書にさらに開示されるのは、少なくとも１つの凍結保存されたヒト臍帯血ユニットから産生された活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を凍結保存するための方法である。本明細書でさらに開示されるのは、免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞の集団である。

定義
別途定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語のすべては、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。矛盾する場合、本明細書が、定義を含めて、優先するものとする。本明細書および特許請求の全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、完全体もしくは完全体の群を含むことを意味するが、任意の他の完全体もしくは完全体の群を除外するものではないことを理解されたい。文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。「例えば（ｅ．ｇ．）」または「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」という用語に続く任意の例、網羅的または限定的であることを意味するものではない。

本明細書で使用されるように、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、具体的に述べられていないか、文脈から明らかでない限り、単数形または複数形であると理解される。

本明細書で使用されるように、「または」という用語は、具体的に述べられていないか、文脈から明らかでない限り、包括的であると理解される。

数値の直前の「約」という用語は、±０％～１０％の数値、±０％～１０％、±０％～９％、±０％～８％、±０％～７％、±０％～６％、±０％～５％、±０％～４％、±０％～３％、±０％～２％、±０％～１％、±０％～１未満％、またはその中の任意の他の値もしくは値の範囲を意味する。例えば、「約４０」は、４０の±０％～１０％（すなわち、３６～４４）を意味する。

「活性化された」Ｔｒｅｇ細胞の集団は、刺激されたＴｒｅｇ細胞が炎症の一貫した抑制をもたらすことを可能にするＣＤ３／２８ビーズによるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激の存在下で、培養条件下および本明細書で指定された細胞密度での高濃度のインターロイキン－２（ＩＬ－２）への連続的な曝露の結果として生成された均質な細胞集団として定義され得る。

本明細書で使用される場合、「抗体フラグメント」または「抗原結合フラグメント」は、抗原に結合する少なくとも可変領域を含む従来型のまたはインタクトな抗体の一部分を含む、従来型のまたはインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例には、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、線形抗体、およびＶ_Ｈ領域（ＶＨＨ）のみを含む単一ドメイン抗体が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、本明細書では、ヒト、飼育動物および家畜、ならびに動物園の動物、スポーツ動物、およびイヌ、ウマ、ネコなどのペットの動物、ならびにウシ、ヒツジ、ブタ、およびヤギなどの農業使用動物を含む任意の哺乳動物を指すように互換的に使用される。１つの好ましい哺乳動物は、成人、子供、および高齢者を含むヒトである。対象はまた、イヌ、ネコ、およびウマなどのペットの動物であってもよい。農業用動物の例には、ブタ、ウシおよびヤギが含まれる。

本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、特に明記しない限り、そのような用語が適用される疾患、障害もしくは状態、またはそのような疾患、障害または状態の１つ以上の症状のプロセスを逆転、緩和、阻害、または予防することを指し、症状もしくは合併症の発症を予防するため、または症状もしくは合併症を軽減するための、または疾患、状態、もしくは障害を排除するための本明細書に記載の組成物、医薬組成物、または剤形のいずれかの投与を含む。場合によっては、治療は、治癒的または改善的である。

本明細書で使用される場合、「予防する」とは、予防されるべきものまたは事象、例えば、疾患、障害または状態を生み出すことまたは発生させることを全体的もしくは部分的に予防すること、または改善もしくは制御すること、または低減もしくは停止することを意味する。

本明細書で使用される「治療有効量」および「有効量」などの句は、患者、または患者の細胞、組織、もしくは臓器に投与して、寛解させるまたは治療効果の代わりなどとして治療効果を達成するために必要な量を示す。有効量は、研究者、獣医、医師、または臨床医が求めている細胞、組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的反応を誘発するのに十分である。適切な有効量または治療有効量の決定は、当該技術分野の日常的なレベルのスキルの範囲内である。

本明細書で使用される「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」、「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」、「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」などの用語は、治療薬による治療を必要とする対象への治療薬の移動、送達、導入、または輸送の任意の機序を指す。そのような機序には、眼内、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、鼻腔内、および皮下投与が含まれるが、これらに限定されない。

制御性Ｔ細胞の増殖した集団を産生するための方法
Ｔｒｅｇ細胞は循環血液または臍帯血に低頻度でしか存在しないため、臨床的に適切なＴｒｅｇ細胞用量の産生には、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋表現型を有するＴｒｅｇ細胞のエクスビボでの濃縮および増殖が必要である。

本明細書に記載の方法のいずれにおいても、臍帯血バンクおよびドナーは、本明細書に記載の方法でヒト臍帯血を使用する前に認定され得る。いくつかの実施形態では、ヒト臍帯血のユニットは、米国、欧州連合、または供給者の資格基準を満たした他の地域の公的臍帯血バンクによって供給される。臍帯血ユニットの認定には、スクリーニングおよび検査に基づいて、ドナーが関連する感染性疾患の証拠を有していないことの検証が含まれる場合がある。母体年齢、在胎週数、総有核細胞（ＴＮＣ）カウント、凍結前の細胞生存率、凍結保存量、収集日、保管条件、人種、民族性、母体ドナーの歴史（例えば、感染症の病歴、旅行歴）、家族の病歴、サイトメガロウイルスの血清陽性、妊娠糖尿病、高血圧などのうちの１つ以上を含む追加の選択基準が適用される場合がある。選択基準は、使用前に臍帯血ユニットの一貫性を保証するために関連している場合がある。活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団を含む様々な産物の臍帯血選択基準を図２９および図３０に提供する。

いくつかの実施形態では、細胞出発物質（ＣＢＵ）が、免疫磁気選択を使用して、解凍され、洗浄され、ＣＤ２５^＋単核細胞（ＭＮＣ）のために濃縮される。ＣＤ２５^＋ＭＮＣは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）および抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを含むガス透過性培養デバイスに入れられる。細胞は、最大１０日間、最大１２日間、または最大１４日間培養増殖される。いくつかの実施形態では、細胞は、８～１０日間または１０～１２日間培養増殖される。８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目または１４日目に、増殖された細胞を採取して洗浄し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを免疫磁気法で除去する。次に、ビーズを取り除いた細胞を製剤化し、パッケージ化する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、少なくとも１つの凍結保存されたヒト臍帯血ユニットから活性化ヒト制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖された集団を産生するための方法であり、この方法は、ａ）凍結保存されたヒト臍帯血ユニットを解凍することと、ｂ）機能的に閉じたシステムまたは閉じたシステムにおいて解凍された臍帯血ユニットを希釈および洗浄することと、ｃ）ＣＤ２５^＋細胞表面発現に基づく二重選択法を使用して内在性Ｔｒｅｇ細胞を単離することと、ｄ）ガス透過性培養器中での培地中、有効量のインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下で、かつ最大１４日間、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬の存在下で、単離されたＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞をエクスビボで増殖させることであって、培地を約４８時間ごとに交換して、活性化ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞の集団を産生する、増殖させることと、ｅ）培地から活性化ＣＤ２５^＋細胞を採取して、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞は、特定の表現型を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、解凍ステップ（すなわち、ステップａ））の前に、最適な凍結保存された臍帯血ユニットを選択するアルゴリズムを使用することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、採取ステップ（すなわち、ステップｆ））の後に、定義された基準に基づく臨床使用のための特徴的な表現型を有する活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を放出することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、単一の臍帯血ユニット（ＣＢＵ）が使用される。いくつかの実施形態では、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上）プールされたＣＢＵが使用される。いくつかの実施形態では、２つ～４つのプールされたＣＢＵが使用される。いくつかの実施形態では、ＣＢＵは健康なドナーから収集され、使用前に凍結される。

いくつかの実施形態では、凍結保存されたヒト臍帯血ユニットは、ウォーターバス中で（例えば、３７℃＋／－１度で）単一のステップで解凍される。いくつかの実施形態では、凍結保存された臍帯血ユニットの解凍は、バッグが半解凍したと感じられるまで、それが３７℃（＋／－１度）のウォーターバス中に沈められている間にバッグを穏やかにマッサージすることを含む。その後、細胞は、洗浄プロセスのためにすぐに移動される。

いくつかの実施形態では、解凍された臍帯血ユニットは、自動化細胞処理システム（例えば、機能的に閉じたシステムまたは閉じたシステム）を使用する自動化された洗浄に供される。いくつかの実施形態では、自動化細胞処理システムは、Ｓｅｐａｘシステム（Ｂｉｏｓａｆｅ）である。Ｓｅｐａｘシステムは、特定の血液成分を単離する必要がある細胞療法での使用が意図された遠心分離およびポンプデバイスである。その原理は、遠心分離に基づいており、血液粒子の密度および大きさに応じた分離を可能とする。血液成分は個別のバッグに収集され、輸血のためにすぐに利用できる。自動化細胞処理システムは、最大１００ｍｌの開始容量から５０～１５０ｍｌの最終容量まで可能にし得る。初期容量と希釈容量との間の希釈率は、０．５～２．０倍の範囲で調整可能である。洗浄サイクルには、１サイクルの標準洗浄、または特定の状況では２サイクルの高洗浄を含めることができる。自動細胞処理システムは、初期産物の希釈、容積モル浸透圧濃度回復、洗浄、遠心分離、上清抽出、および細胞再懸濁を自動的に実行するようにプログラムされる。通常、開始容量は２５ｍｌに設定され、最終容量は１００ｍｌ、希釈率は１．０に設定される。洗浄試薬は、５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ）、および１０％のデキストラン－４０（Ｄ－４０）（Ｈｏｓｐｉｒａ）を含む。洗浄後、臍帯血細胞は、臍帯血洗浄バッグに収集される。

いくつかの実施形態では、塩基性洗浄媒体は、約２０ｍｌの２５％ＨＳＡおよび約１０００ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、作業用洗浄媒体は、約３００ｍｌの塩基性洗浄緩衝液および約５０ｍｇの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）および約２５００単位のＤＮａｓｅを含む。いくつかの実施形態では、改変された媒体は、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５媒体（Ｌｏｎｚａ）および約１０ｍｌのＧｌｕｔａＭＡＸ－１および約１００ｍｌの解凍されたヒトＡＢ血清を含む。いくつかの実施形態では、洗浄媒体は、ＰＢＳ、ＥＤＴＡ、および０．５％ＨＳＡを含む。

いくつかの実施形態では、洗浄ステップは、手動洗浄を含まない。

いくつかの実施形態では、自動洗浄された臍帯血細胞は、作業用洗浄媒体を使用して追加の手動洗浄を受け、最終容量は２００ｍｌで構成され、再構成された細胞は室温で３００ｇで１０分間遠心分離される。最終的に、洗浄した細胞を０．０９ｍｌに１００×１０^６個の細胞の濃度で再懸濁する。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２５に特異的に結合する試薬は、抗ＣＤ２５抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５に特異的に結合する試薬は、固体支持体にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズ、カラム、またはプレートである。いくつかの実施形態では、固体支持体は、磁性マイクロビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズは、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルおよびアクリルアミドのコポリマー、ジビニルベンゼンで架橋されたポリスチレン、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、天然スポンジ、制御多孔性ガラス、金属、架橋デキストランまたはアガロースゲルを含む。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２５マイクロビーズは、１００×１０^６個の細胞あたり０．０２ｍｌのＣＤ２５マイクロビーズの比率で、洗浄された臍帯血細胞に添加される。細胞およびマイクロビーズを４℃で３０分間一緒にインキュベートする。いくつかの実施形態では、強磁性球で作製されたＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）は、外部磁場と組み合わせて使用され、非標識細胞は自由に通過することができ、一方、磁気標識されたＣＤ２５^＋細胞は、カラム内で懸濁状態に保持され、実際にはカラムマトリックスを「結合」しない。この懸濁液は、細胞へのストレスを最小限に抑え、細胞の凝集を回避することで効率的な滅菌洗浄を可能にする。ＬＳカラムは、作業用洗浄媒体を使用してプライミングされ、マイクロビーズで標識されたＣＤ２５^＋細胞は磁場に付着したＬＳカラムを通過することができる。次いで、ＬＳカラムを磁場から除去し、プランジャーを使用して、ＣＤ２５マイクロビーズに結合し、ポジティブフラクション１として標識された緩く保持された細胞を押し出す。二重選択法では、ポジティブフラクション１は、ここで、プライミングされたＬＳカラムを通過できる開始溶液として挙動し、ポジティブフラクション２が収集されるステップが繰り返され、最終的に、２つのポジティブフラクションが混合されて最終選択のＣＤ２５^＋細胞が得られる。いくつかの実施形態では、二重強磁性カラム（例えば、ＬＳカラム）法を使用して、ＣＤ２５^＋細胞を単離する。

いくつかの実施形態では、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬は、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメント、および抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬は、抗ＣＤ３被覆ビーズおよび抗ＣＤ２８被覆ビーズ（すなわち、「抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ」）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３被覆ビーズおよび抗ＣＤ２８被覆ビーズは、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬において１：１の比率である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５^＋細胞が、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬の存在下で培養される場合、ＣＤ２５^＋細胞および抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズは、１：１の比率である。

いくつかの実施形態では、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を産生するための方法において使用される有効量のＩＬ－２は、最大約１０００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、有効量のＩＬ－２は、約１０００ＩＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、ヒトＩＬ－２である。いくつかの実施形態では、単離されたＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞は、本明細書に記載の方法の培養ステップの直前に、ＩＬ－２を含む培地中に懸濁される。

いくつかの実施形態では、培養ステップの間、培地は、細胞を乱すことなく、約４８時間ごとに交換される。いくつかの実施形態では、培養物は、本明細書に記載の方法の培養ステップにおいて混合および再懸濁されない。

いくつかの実施形態では、約１×１０^６個のＣＤ２５^＋細胞／ｍｌは、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を産生するための方法においてＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５^＋細胞は、最初に、１０ｃｍ^２の膜表面積を有するガス透過性培養器で培養される。いくつかの実施形態では、培養物は、その後、１００ｃｍ^２の膜表面積を有するガス透過性培養器に移される。

いくつかの実施形態では、約０．５×１０^９～約１２×１０^９、または約１×１０^９～約２×１０^９個の活性化ＣＤ２５^＋細胞は、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬の存在下で、培養の１４日後に採取される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の製造プロセスは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ集団の５０倍以上の増殖をもたらす。いくつかの実施形態では、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団は、採取ステップの後に凍結保存される。いくつかの実施形態では、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団は、採取ステップの後に凍結保存されず、投与のために急速に放出される。

本明細書でさらに提供されるのは、少なくとも１つの凍結保存されたヒト臍帯血ユニットから活性化ヒト制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖された集団を産生するための方法であり、この方法は、ａ）凍結保存されたヒト臍帯血ユニットをウォーターバス中で単一ステップで解凍することと、ｂ）手動洗浄を伴わない機能的に閉じたシステムにおいてＰＢＳ、ＥＤＴＡ、および約０．５％のヒト血清アルブミンを含む溶液中で、解凍された臍帯血ユニットを希釈および洗浄することと、ｃ）二重強磁性カラム法を使用したＣＤ２５^＋細胞表面発現に基づく二重選択法を使用して、内在性Ｔｒｅｇ細胞を単離することと、ｄ）ガス透過性培養器中での培地中、約１０００ＩＵ／ｍｌのインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下で、かつ最大１０日間、最大１２日間、または最大１４日間、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８被覆ビーズの存在下で、単離されたＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞をエクスビボで増殖させることであって、培地を約４８時間ごとに交換して、活性化ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞の集団を産生し、ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞ならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８被覆ビーズが１：１の比率であり、培養物が混合および再懸濁されない、増殖させることと、ｅ）培地から活性化ＣＤ２５^＋細胞を採取して、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を産生することと、を含む。

採取後、Ｔｒｅｇ細胞は、汚染、生存率、純度について試験され、細胞数をカウントし、かつ／またはフローサイトメトリーを使用して検査され得る。

いくつかの実施形態では、有効成分（ＤＳ）は、制御性Ｔ細胞表現型（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋）を有する有核臍帯血細胞を含むか、またはそれからなる液体細胞懸濁液である。いくつかの実施形態では、ＤＳは、有核臍帯血細胞を含むかまたはそれからなる液体細胞懸濁液であり、その約６０％以上が制御性Ｔ細胞表現型（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋）を有し、約１０％未満がＴ細胞傷害性／抑制細胞の表現型（ＣＤ４^－ＣＤ８^＋）を有する。いくつかの実施形態では、最終産物（ＤＰ）は、５０ｍＬの最終容積中に、０．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａを含むかまたはそれからなる賦形剤溶液中に懸濁された有効成分を含むかまたはそれからなる液体細胞懸濁液である。

いくつかの実施形態では、条件付きＣＤ８^＋細胞枯渇ステップは、必要に応じて、最終製剤の前に、活性化Ｔｒｅｇ細胞の集団におけるＣＤ４^－ＣＤ８^＋細胞傷害性／抑制Ｔ細胞の含有量を低減させるために使用される。採取する前に、ＣＤ８に特異的に結合する試薬（すなわち、抗ＣＤ８抗体またはその抗原結合フラグメント）を使用して培地からＣＤ８^＋細胞を枯渇させ、試薬に結合するいずれの細胞も除去することができる。いくつかの実施形態では、この試薬は、例えば、ビーズ、カラム、およびプレートなどの固体支持体にコンジュゲートされ得る。例えば、ビーズは、抗ＣＤ８抗体で被覆された磁性マイクロビーズであってもよい。ビーズは、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルおよびアクリルアミドのコポリマー、ジビニルベンゼンなどで架橋されたポリスチレン、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、天然スポンジ、シリカゲル、制御多孔性ガラス、金属、架橋デキストランス、およびアガロースゲルを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で一般的に使用される任意の材料から作製することができる。

ＣＤ８^＋細胞の枯渇に続いて、本明細書に記載の方法は、ＣＤ４^－ＣＤ８^＋細胞の存在について培地に残っている細胞を分析するステップをさらに含み得る。例えば、この分析は、ＣＤ４^－ＣＤ８^＋である培地に残っている細胞の数を決定することを含み得る。培地に残っている細胞の１０％以上がＣＤ４^－ＣＤ８^＋細胞である場合、２回目のＣＤ８^＋細胞枯渇を実行することができる。

細胞培養の最後に、濃度が３×１０^６個の細胞あたり１００を超える場合は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズを除去する追加のステップが実行され得る。

臨床使用のために特徴的な表現型を有する活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖した集団を放出するための基準には、７０％以上の７アミノ－アクチノマイシン－Ｄ（７－ＡＡＤ）生存率、６０％以上のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋純度、「生物なし」のグラム染色、および５ＥＵ／ｋｇ未満のエンドトキシンが含まれる。

いくつかの実施形態では、最大１０００倍を超える大規模な増殖を伴う大きな容量の産物を生成することができ、細胞の最終集団は、最大１４日間の培養後に採取された、細胞数が約０．５×１０^９～１２×１０^９個のＴｒｅｇ細胞の範囲である均質で明確なＴｒｅｇ細胞である。いくつかの実施形態では、最終産物は、室温で保管された場合には最大８時間安定したままであり得、４℃で保管された場合には９６時間安定したままであり得る。

いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ４、α４β７またはＣＤ１１ａの細胞表面発現を濃縮するために、追加のステップが実行される。

いくつかの実施形態では、製造プロセスは、以下のステップの一部またはすべてを含む。

ステップ１：臍帯血ユニット（ＣＢＵ）の解凍（０日目）
入力：ＣＢＵ
出力：解凍後のＣＢＵ
凍結したＣＢＵは、液体窒素（ＬＮ２）気相貯蔵庫から取り出され、解凍中のポートの汚染を防ぐためにプラスチックのオーバーラップバッグに入れられる。包み込んだクライオバッグをすぐに３７℃のウォーターバスに入れ、バッグを穏やかにこねて均一に解凍することにより、迅速に解凍する。出力である解凍後のＣＢＵは、以下についてサンプリングされる。
・有核細胞（ＮＣ）カウント
・生存率％（トリパンブルー）
試験結果は、プロセスの監視に使用される。

ステップ２：ＣＢＵを希釈および洗浄する（０日目）
入力：解凍後のＣＢＵ
出力：洗浄後のＣＢＵ
急速解凍の直後に、解凍後ＣＢＵバッグの内容物がＳｅｐａｘ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）単回使用使い捨てキットの入力ラインに取り付けられる。細胞を、０．９％のＮａＣｌ中に１０％の低分子量デキストラン（ＬＭＤ）を含むＳｅｐａｘシステム内で希釈し、かつ洗浄する。Ｓｅｐａｘ洗浄の出力（洗浄後ＣＢＵ）は約１００ｍＬであり、以下についてサンプリングされる。
・有核細胞（ＮＣ）カウント
・生存率％（トリパンブルー）
試験結果は、プロセスの監視に使用される。

ステップ３：選択前の洗浄（０日目）
入力：洗浄後のＣＢＵ
出力：ＣＢ単核細胞（ＭＮＣ）
洗浄後のＣＢＵ細胞は、室温で１０分間４００ｘｇ（遠心力）で遠心分離される。穏やかに吸引することによって上清を除去した後、細胞（ＣＢ ＭＮＣ）をＭｉｌｔｅｎｙｉ ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液中約８～１０ｍＬの容量に再懸濁する。出力であるＣＢ ＭＮＣはサンプリングされない。

ステップ４：ＣＤ２５抗体のインキュベーション（０日目）
入力：ＣＢ ＭＮＣ
出力：インキュベーション後のＣＢ ＭＮＣ
ＣＢ単核細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗ＣＤ２５マイクロビーズとともに４～８℃で１５分間、断続的に手動で混合しながらインキュベートされる。インキュベーション後、細胞と抗ＣＤ２５マイクロビーズの混合物を洗浄し、プルモザイムとＭｇＣｌ_２を添加したＭｉｌｔｅｎｙｉ ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液に約１０ｍＬの容量に再懸濁する。出力であるインキュベーション後のＣＢ ＭＮＣはサンプリングされない。

ステップ５：ＣＤ２５ポジティブ選択（０日目）
入力：インキュベーション後のＣＢ ＭＮＣ
出力：ＣＤ２５^＋ＭＮＣ
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ２５抗体試薬とのインキュベーションステップに続いて、インキュベーション後のＣＢ ＭＮＣは、ＭｉｄｉＭＡＣＳデバイスに取り付けられたＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム中に移行され、これは、磁石を使用することによって抗ＣＤ２５標識細胞を捕捉する。免疫磁気選択後、細胞は磁場から解放され、出力ＣＤ２５^＋ＭＮＣが、以下についてサンプリングされる。
・有核細胞（ＮＣ）カウント
・生存率％（トリパンブルー）
・生存率％（７－ＡＡＤフローサイトメトリー）
・％ＣＤ４^－ＣＤ８^＋（フローサイトメトリー）
・％ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋（フローサイトメトリー）
試験結果は、プロセスの監視に使用される。

ステップ６：培養増殖の開始（０日目）
入力：ＣＤ２５^＋ＭＮＣ
出力：培養０日目
ＣＤ２５^＋で選択したＭＮＣを洗浄し、１％のグルタミンを含むＸ－Ｖｉｖｏ１５およびインターロイキン－２（ＩＬ－２、１０００ＩＵ／ｍＬ）を含む１０％のヒトＡＢ血清中に懸濁させ、次いで、ビーズに対する細胞の比１：１でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと混合する。細胞およびビーズの混合物は、表面積が１０ｃｍ^２のガス透過性増殖（１０Ｍ）システム中に移行され、かつ３７℃で５％のＣＯ２でのインキュベーションに移行される。細胞懸濁液の揺さぶりまたは撹拌はされない。このステップではサンプリングは行われない。
ガス透過性増殖（１０Ｍ）システムは、円筒形の無菌の単回使用使い捨てプラスチックデバイスからなる。細胞および媒体をガス透過性増殖システムに移行した後に、細胞は容器の底に存在し、表面はガス透過性である。１０Ｍシステムのガス透過膜は、１０ｃｍ^２の表面積を有する。このシステムは、従来のインキュベーター中に配置されるが、サンプリング、媒体除去、媒体添加、または細胞採取のためには、必要に応じて、断続的に取り外され得る。

ステップ７：ＩＬ－２の添加（２日目または３日目）
入力：培養０日目
出力：２／３日目の培養＋ＩＬ－２
２日目または３日目（最終の媒体／ＩＬ－２交換から６６時間未満）に、新鮮なＩＬ－２をガス透過性増殖（１０Ｍ）システム中の培養細胞に１０００ＩＵ／ｍＬで添加して、消費されたと推定されるＩＬ－２を補充する。このステップではサンプリングは行われない。表面積が１００ｃｍ^２であるガス透過性増殖（１００Ｍ）システム中の細胞は、３７℃で５％のＣＯ２でのインキュベーションに戻される。細胞懸濁液の揺さぶりまたは撹拌はされない。

ステップ８：移行およびフィード（４日目、５日目、または６日目）
入力：２／３日目の培養＋ＩＬ－２
出力：４／５／６日目の培養＋新鮮な媒体＋ＩＬ－２
４、５、または６日目（最終の媒体／ＩＬ－２交換から６６時間未満）に、ガス透過性増殖（１０Ｍ）システム中の培養細胞のアリコートを取り出し、以下についてサンプリングされる。
・有核細胞（ＮＣ）カウント
・生存率％（トリパンブルー）
ＮＣカウントおよび生存率％は、培養増殖のプロセスの監視に使用される。
ガス透過性増殖（１０Ｍ）システム中の残りの培養細胞は、１０００ｍＬの容量に追加された新鮮な媒体（１％グルタミンおよび１０％ヒトＡＢ血清を含むＸ－Ｖｉｖｏ１５、および１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２）を含む、ガス透過性増殖（１００Ｍ）システムに移行される。ガス透過性増殖（１００Ｍ）システム中の細胞は、３７℃で５％のＣＯ２でのインキュベーションに戻される。細胞懸濁液の揺さぶりまたは撹拌はされない。
ガス透過性増殖（１００Ｍ）システムは、円筒形の無菌の単回使用使い捨てプラスチックデバイスからなる。細胞および媒体をガス透過性増殖システムに移行した後に、細胞は容器の底に存在し、表面はガス透過性である。１００Ｍシステムのガス透過膜は、１００ｃｍ^２の表面積を有する。このシステムは、従来のインキュベーター中に配置されるが、サンプリング、媒体除去、媒体添加、または細胞採取のためには、必要に応じて、断続的に取り外され得る。

ステップ９：ＩＬ－２の添加（７日目または８日目）
入力：４／５／６日目の培養＋新鮮な媒体＋ＩＬ－２
出力：７／８日目の培養＋ＩＬ－２
７日目または８日目（最終の媒体／ＩＬ－２交換から６６時間未満）に、新鮮なＩＬ－２をＧ－Ｒｅｘ １００Ｍシステム中の培養細胞に添加して、消費されたと推定されるＩＬ－２を補充する。このステップではサンプリングは行われない。ガス透過性（１００Ｍ）システム中の細胞は、３７℃で５％のＣＯ２でのインキュベーションに戻される。細胞懸濁液の揺さぶりまたは撹拌はされない。

ステップ１０：ＩＬ－２の添加（９日目または１０日目）
入力：７／８日目の培養＋ＩＬ－２
出力：９／１０日目の培養＋ＩＬ－２
９日目または１０日目（最終の媒体／ＩＬ－２交換から６６時間未満）に、新鮮なＩＬ－２をガス透過性増殖（１００Ｍ）システム中の培養細胞に添加して、消費されたと推定されるＩＬ－２を補充する。このステップではサンプリングは行われない。ガス透過性増殖（１００Ｍ）システム中の細胞は、３７℃で５％のＣＯ２でのインキュベーションに戻される。細胞懸濁液の揺さぶりまたは撹拌はされない。

ステップ１１：ＩＬ－２の添加（１１日目または１２日目）
入力：９／１０日目の培養＋ＩＬ－２
出力：１１／１２日目の培養＋ＩＬ－２
１１日目または１２日目（最終の媒体／ＩＬ－２交換から６６時間未満）に、培養細胞が、以下についてサンプリングされる。
・マイコプラズマ
・無菌性
マイコプラズマ（最終報告；放出基準は、マイコプラズマ種の陰性）および無菌性（中間報告；放出基準は最終製剤およびロット放出の４８～７２時間前に得られたサンプルに関して「成長なし」の報告）の試験結果は、１４日目の最終産物の放出のために使用される。
サンプリング後、新鮮なＩＬ－２をガス透過性増殖（１００Ｍ）システム中の培養細胞に添加し、消費されたと推定されるＩＬ－２を補充する。ガス透過性増殖（１００Ｍ）システム中の細胞は、３７℃で５％のＣＯ２でのインキュベーションに戻される。細胞懸濁液の揺さぶりまたは撹拌はされない。

ステップ１２：採取前のサンプル（１４日目）
入力：１１／１２日目の培養＋ＩＬ－２
出力：採取前１４日目、サンプリング
１４日目に、培養増殖したＴ－Ｒｅｇ細胞を採取する前に、細胞懸濁液が、以下についてサンプリングされる。
・マイコプラズマ
マイコプラズマ試験はこの時点で繰り返されるが、産物の急激な放出前には、結果は通常利用可能ではない。しかし、１１／１２日目のマイコプラズマ試験の結果は、急激な放出のために使用される。
マイコプラズマのサンプリング後、ガス透過性増殖（１００Ｍ）システム中の１０００ｍＬの総細胞懸濁液容量の７５０ｍＬが除去され、残りの培養物が、以下についてサンプリングされる。
・有核細胞（ＮＣ）カウント
・生存率％（トリパンブルー）
・％ＣＤ４^－ＣＤ８^＋（フローサイトメトリー）
ＮＣカウントおよび生存率％は、プロセスの監視に使用される。％ＣＤ４^－ＣＤ８^＋は、ＣＤ８^＋細胞の免疫磁気的枯渇の必要性を決定するために使用される（条件付きステップＳ－１）。％ＣＤ４^－ＣＤ８^＋細胞集団が、培養増殖細胞の１０％超を表す場合。ＣＤ８の枯渇が必要な場合は、１４日目の採取後に条件付きステップＳ－１が実行される（ステップ１３）。

ステップ１３：採取（１４日目）
入力：採取前１４日目、サンプリング
出力：Ｔ－Ｒｅｇ採取物
サンプリング後、ガス透過性増殖（１００Ｍ）システム中の残りの２５０ｍＬの容量は、細胞回収を最適化するためにガス透過性増殖フラスコをすすいで５００ｍＬコニカルに移され、注入緩衝液で容量は４００ｍＬ（０．５％のＨＳＡを含むＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ）になる。５００ｍＬコニカルチューブを４００ｘｇで２回、室温で１０分間遠心分離し、０．５％のＨＳＡを含むＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａで細胞を洗浄し、ビーズ除去用の１５ｍＬコニカルチューブ中で０．５％のＨＳＡを含むＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａで細胞懸濁液を１０ｍＬの容量にする（ステップ１４）。

条件付きステップＳ－１：ＣＤ８の枯渇
入力：Ｔ－Ｒｅｇ採取物
出力：ＣＤ８枯渇後
ステップ１２でのサンプリングから得られた％ＣＤ４^－ＣＤ８^＋フローサイトメトリーの結果が、ＣＤ４^－ＣＤ８^＋細胞集団が培養増殖細胞の１０％超を表すことを示している場合、ＣＤ８の枯渇が実行される。ＣＤ８を枯渇させるには、Ｔ－Ｒｅｇ採取物を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ８マイクロビーズとともに４～８℃で１５分間穏やかに撹拌しながらインキュベートし、次いで、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラムに移し、次いで、ＭｉｄｉＭＡＣＳデバイスを使用して免疫磁気的に選択する。ＣＤ８の枯渇後の出力が、以下についてサンプリングされる。
・有核細胞（ＮＣ）カウント
・生存率％
・％ＣＤ４^－ＣＤ８^＋（フローサイトメトリー）

ステップ１４：ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの洗浄および除去（１４日目）
入力：採取１４日目
出力：Ｔ－Ｒｅｇ採取物、脱ビーズ物
採取したＴ－Ｒｅｇ細胞懸濁液を含む１５ｍＬコニカルチューブをＤｙｎａｌ ＭＰＣ－１磁石に２分間入れる。磁石を解放する前に、上清（細胞を含み、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを含まない）を別の１５ｍＬコニカルチューブ中に収集する（「脱ビーズ物＃１」）。磁石を解放したら、残りのビーズおよび細胞を、０．５％のＨＳＡを含む２ｍＬのＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａに再懸濁させ、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ－１磁石中に２分間入れ、上清を収集し、「脱ビーズ物＃１チューブ」に移す。次いで、「脱ビーズ物＃１」チューブをＤｙｎａｌ ＭＰＣ－１磁石に２分間入れ、磁石を解放する前に、上清を別の１５ｍＬコニカルチューブ中に収集する（「脱ビーズ物＃２」）。「脱ビーズ物＃２」チューブ内の細胞懸濁液は、現在約１７ｍＬの容量であり、以下についてサンプリングされる。
・有核細胞（ＮＣ）カウント
・生存率％（トリパンブルー）
・％ＣＤ４^－ＣＤ８^＋（フローサイトメトリー）
・％ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋（フローサイトメトリー）
・生存率％（７－ＡＡＤ、フローサイトメトリー）
・残留ビーズ
このステップの出力であるＴ－Ｒｅｇ採取物、脱ビーズ物は、有効成分（原薬）である。有核細胞（ＮＣ）カウントおよび生存率％（トリパンブルー）は、プロセスの監視に使用される。％ＣＤ４^－ＣＤ８^＋（フローサイトメトリー；放出基準は≦１０％）、％ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋（フローサイトメトリー；放出基準は≧６０％）、生存率％（７－ＡＡＤ色素排除）、および残留ビーズアッセイ（放出基準は、３×１０^６個の有核細胞あたり１００ビーズ未満である）が、最終産物の急速な放出に使用される。

ステップ１５：製剤化およびパッケージ化（１４日目）
入力：Ｔ－Ｒｅｇ採取物、脱ビーズ物
出力：Ｔ－Ｒｅｇ最終産物
Ｔ－Ｒｅｇ採取物、脱ビーズ物は、１５ｍＬコニカルチューブから３００ｍＬトランスファーパックに移される。コニカルチューブを１０ｍＬのＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ＋０．５％ＨＳＡですすぎ、このすすぎ液に３００ｍＬのトランスファーパックを加える。トランスファーパック中の細胞懸濁液は、約５４ｍＬの容量になり、以下についてサンプリングされる。
・グラム染色
・エンドトキシン
・無菌性
グラム染色（光学顕微鏡による；「生物が見られない」の放出基準）およびエンドトキシン（Ｅｎｄｏｓａｆｅ ＰＴＳシステムを使用；放出基準＜５ＥＵ／ｍＬ）の結果が、最終産物の急速な放出に利用可能である。この時点での滅菌試験の結果は急速な放出には利用可能ではないが、１１／１２日目の時点からの滅菌試験の中間結果が急速な放出に使用される。
サンプリング後、トランスファーパックに取り付けられているトランスファーセットがシーリングで取り外される。サンプリング後、最終産物容器中の細胞懸濁液（最終産物）の容量は約５０ｍＬである。
これらの製造ステップは、以下に提供される表にもまとめられており、この表は、最終製剤まで継続され、プロセス内／中間産物または有効成分の保持ステップは定義されていない製造プロセスのフローチャート（第１の表）、および条件付きＣＤ８細胞枯渇ステップのフローチャート（第２の表）を提示する。このプロセスは、有効成分（ＤＳ）の製造に至るステップから、最終産物（ＤＰ）の最終製剤およびパッケージングまで連続しているため、ＤＳおよびＤＰの両方の製造が示されている。

活性化制御性Ｔ細胞の凍結保存のための方法
本明細書で提供されるのは、エクスビボで増殖されたヒトＴｒｅｇ細胞（例えば、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞）の集団を凍結保存するための方法である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの凍結保存されたヒト臍帯血ユニットから産生された活性化ヒト制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖された集団を凍結保存するための方法は、ａ）凍結保存されたヒト臍帯血ユニットを解凍することと、ｂ）機能的に閉じたシステムにおいて解凍された臍帯血ユニットを希釈および洗浄することと、ｃ）ＣＤ２５^＋細胞表面発現に基づく二重選択法を使用して、内在性Ｔｒｅｇ細胞を単離することと、ｄ）ガス透過性培養器中での培地中、有効量のインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下で、かつ最大１４日間、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬の存在下で、単離されたＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞をエクスビボで増殖させることであって、培地を約４８時間ごとに交換して、活性化ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞の集団を産生する、増殖させることと、ｅ）培地から活性化ＣＤ２５^＋細胞を採取して、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖した集団を産生することと、ｆ）活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖した集団を凍結保存することと、を含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、ステップｅ）とステップｆ）との間で定義された基準に基づいて、臨床使用のために活性化培養ヒトＴｒｅｇ細胞を放出させることをさらに含む。

当該技術分野で知られている任意の適切な凍結保存プロセスを、本明細書に記載の方法で使用することができる。例えば、ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結カクテルを使用し、その後、特別に定義されたプログラムを使用して制御された速度の冷凍庫に入れることで凍結保存され得る。凍結保存された産物は、－１８０℃で少なくとも数ヶ月間保管され得る。凍結保存された産物を解凍すると、Ｔｒｅｇ細胞は、ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）およびＨｅｌｉｏｓの高発現で細胞表面および細胞内表現型を維持し、インビトロ細胞抑制アッセイ（図８Ａ～図８Ｃ）ならびに異なる動物モデルにおけるインビボデータ（図９Ａ～図９Ｂ）によって示されるようにそれらの抑制機能を保持することができる。

いくつかの実施形態では、１ｍｌあたり約１０×１０^６個の細胞の濃度で、５ｍｌバイアルあたり最大約５０×１０^６個の細胞が凍結保存される。いくつかの実施形態では、約１００×１０^６個の細胞～約１×１０^８個の細胞が、最大１０ｍｌ～１００ｍｌの容量で単一の極低温バッグ中に凍結保存され得る。

いくつかの実施形態では、凍結保存の目的のために、採取されたヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団は、４℃の温度で１０分間、４００ｇで遠心分離され得る。総細胞数は、自動細胞カウンターを使用して計算され得、クライオバイアルの数は、総細胞数を５０×１０^６個の細胞で除算することによって推定され得る。続いて、凍結ストック溶液は、５％または１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標））を含む事前に製剤化された溶液を含む凍結ストック溶液を使用して、５ｍｌのクライオバイアルあたり最大５０×１０^６個の細胞を凍結保存し得る。細胞が遠心分離されている間、制御された速度の冷凍庫がオンにされ、制御された速度の冷凍庫が適切な開始温度に達すると、「ユーザを待機しているプログラム－続行するにはここをクリック」というコマンドが表示される。凍結ストック溶液と混合すると、最大５０×１０^６個の細胞からなるクライオバイアルを、凍結アルゴリズムを使用して制御された速度の冷凍庫に入れて、細胞の凍結速度を整調することを可能にして、細胞死を回避し、細胞機能を維持する。凍結プログラムが完了した後、クライオバイアルは制御された速度の冷凍庫から取り出され、長期凍結保存のために－１９０℃という低い温度の液体窒素極低温冷凍庫に入れられる。

増殖されたＴｒｅｇ集団は、いくつかのアリコートに凍結保存して、治療投与に適した臨床用量を生成することができる。

制御性Ｔ細胞の集団および医薬組成物
本明細書に開示されているのは、本明細書に記載の方法によって産生されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団である。この集団は、同種異系細胞療法の使用に適している。いくつかの態様では、ヒトＴｒｅｇ細胞は免疫抑制性である。

いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、ＣＤ４およびＣＤ２５に対して陽性である。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ２５に対して陽性である。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５およびＣＤ２８に対して陽性である。

本明細書で提供されるのは、少なくとも約６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋および約１０％以下のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であるヒトＴｒｅｇ細胞の集団である。いくつかの実施形態では、少なくとも約６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋および約１０％以下のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であるヒトＴｒｅｇ細胞の集団が、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯをさらに共発現する。

いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、少なくとも約９０％のＣＸＣＲ４^＋である。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、少なくとも約９５％のＣＸＣＲ４^＋、少なくとも約９５％のＣＤ４５ＲＡ^＋、および少なくとも約８０％のＣＤ４５ＲＯ^＋である。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、少なくとも約９５％のＣＸＣＲ４^＋、少なくとも約９５％のＣＤ４５ＲＡ^＋、少なくとも約８０％のＣＤ４５ＲＯ^＋、少なくとも約９５％のＣＤ９５^＋、少なくとも約９５％のＨＬＡＤＲ^＋、少なくとも約９５％のａｌｐｈａ４ｂｅｔａ７^＋、少なくとも約１５％のＣＸＣＲ３ｈｉ^＋、少なくとも約９５％のＣＣＲ６^＋、少なくとも約９５％のＣＤ５４^＋、少なくとも９５％のＣＤ１１Ａ^＋、少なくとも約８５％のＣＤ４５ＲＡＲＯ^＋、少なくとも約８０％のＣＴＬＡ４^＋、少なくとも約８０％のＧＰＲ８３^＋および少なくとも約８０％のＣＤ６２Ｌ^＋である。いくつかの実施形態では、そのような細胞表面マーカーの発現は、フローサイトメトリーによって測定される。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、エクスビボで増殖されている。

いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^ｌｏＦＯＸＰ３^ｈｉの表現型を有し、ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋の追加の共発現を示すヒトＴｒｅｇ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^－ＦｏｘＰ３^ｈｉおよびＨｅｌｉｏｓ^＋の表現型を有するヒトＴｒｅｇ細胞を含む。いくつかの実施形態では、活性化ヒトＴｒｅｇの増殖された表現型は次のとおりである：α４β７^ｈｉＣＣＲ３^ｌｏＣＣＲ４^ｈｉＣＣＲ６^ｈｉＣＣＲ７^ｈｉＣＤ１０３^ｌｏＣＤ１１ａ^ｈｉＣＤ１３７^ｌｏＣＤ２８^ｈｉＣＤ３１^＋ＣＤ３９^ｌｏＣＤ５４^ｈｉＣＤ６２Ｌ^ｈｉＣＤ７^ｈｉＣＤ９５^ｈｉＣＸＣＲ３^ｌｏＣＸＣＲ４^ｈｉＨＬＡ－ＡＢＣ^ｈｉＨＬＡＤＲ^ｈｉＰＤ１^ｌｏＰＤ－ＬＩ^ｌｏおよび細胞内ＣＤ１５４^ｈｉＦＯＸＰ３^ｈｉＨｅｌｉｏｓ^ｈｉＧＩＴＲ^ｈｉＲＯＲγｔ^ｌｏＴｂｅｔ^ｌｏ。いくつかの実施形態では、神経向性ヒトＴｒｅｇの集団は、ＣＤ９５／ＣＸＣＲ４／ＣＤ３１／ＣＤ３９^ｈｉ／ＣＴＬＡ４／ＨＥＬＩＯＳ／ＣＸＣＲ３／ＣＤ２８の表現型を有する。

いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、約６０％以上のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞および約１０％未満のＣＤ４^－ＣＤ８^＋Ｔ細胞傷害性／抑制細胞のフローサイトメトリー表現型を有する。

いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、ＦＯＸＰ３の高発現およびＲＯＲγｔの低発現を示すヒトＴｒｅｇ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、ストレスの多い条件下でＩＬ－１７を分泌しないか、またはＲＯＲγＴを示さないヒトＴｒｅｇ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、それらのポリクローナルＴ細胞受容体Ｖβ（ＴＣＲ Ｖβ）レパートリーを維持するヒトＴｒｅｇ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、使用前に凍結保存される。

いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、細胞内Ｈｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって産生されるヒトＴｒｅｇ細胞は、ストレスの多い条件下でそれらの免疫抑制機能および表現型を保持する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって産生されるヒトＴｒｅｇ細胞は、ステロイド（例えば、デキサメタゾン、プレドニゾンまたはプレドニゾロン）の存在下でそれらの生存率および抑制機能を保持する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって産生されるヒトＴｒｅｇ細胞は、それらのエピジェネティックシグネチャーおよび本明細書に記載の選択／増殖プロトコルの性質のために、インターロイキン－１７（ＩＬ－１７）分泌に抵抗し、末梢血Ｔｒｅｇと比較して炎症誘発性ＴＨ１７細胞に「反転」する可能性があまりない。

本明細書に記載の集団におけるＴｒｅｇ細胞の対象となる生物活性は、免疫抑制機能であり、ＣＦＳＥの細胞内染色色素（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）またはＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット色素を使用したインビトロ抑制アッセイによって測定され得る。このアッセイでは、Ｔｒｅｇ細胞を正常な末梢血Ｔレスポンダー（Ｔｒｅｓｐ）細胞と様々な比率で共培養し、フローサイトメトリー法を使用して増殖細胞を検出し、最大８つの細胞分裂の細胞増殖を追跡できるＣＦＳＥまたはＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレットの細胞内色素の取り込みを検出する。Ｔｒｅｇ細胞によるＴレスポンダー（Ｔｒｅｓｐ）細胞の抑制の程度は、Ｔｒｅｇ細胞のＴｒｅｓｐ細胞に対する比率および分裂した細胞の生成に関連して定量化され得る。Ｔｒｅｇ細胞による効果的な抑制が存在する場合、第１世代の分裂レスポンダー細胞内の抑制は、Ｔｒｅｇ細胞のＴｒｅｓｐ細胞に対する比率が低い場合と比較して、Ｔｒｅｇ細胞に対するＴｒｅｓｐ細胞の比率が高いほど大きくなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の集団中のＴｒｅｇ細胞は、Ｔｒｅｇ細胞が、Ｔｒｅｇ：Ｔｃｏｎ比が４：１の場合に、増殖するＴ従来型（Ｔｃｏｎ）細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％を抑制する場合、免疫抑制性であるとみなされる。

いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、阻害性サイトカインであるインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）の産生の増加などのパラクリン機能を示すが、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）の産生は示さない。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、ＩＬ－６処理に応答してグランザイムＢを分泌する（例えば、図２５を参照されたい）。

本明細書で提供されるのは、少なくとも約１×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞を含むヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、（ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋、および（ｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であり、ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性である、集団である。本明細書でさらに提供されるのは、少なくとも約１×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞を含むヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、（ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋、（ｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＸＣＲ４^＋、および（ｉｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であり、ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性である、集団である。本明細書でさらに提供されるのは、少なくとも約１×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞を含むヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、（ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋、（ｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋α４β７^＋、および（ｉｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であり、ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性である、集団である。また、本明細書で提供されるのは、少なくとも約１×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞を含むヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、（ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋と、（ｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１１ａ^＋と、（ｉｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であり、ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性である、集団である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、少なくとも約１×１０^９個のヒトＴｒｅｇ細胞または少なくとも約１×１０^１０個のヒトＴｒｅｇ細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、約１×１０^８～１×１０^１０個、約１×１０^８～１×１０^９個、または約１×１０^９～１×１０^１０個のヒトＴｒｅｇ細胞を含む。

いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、新鮮な単回投与産物（例えば、ＣＫ０８０１）として製剤化される。ＣＫ０８０１産物は、産物が投与される対象に対して、６つのＨＬＡ（ヒト白血球抗原）のうちの少なくとも３つがマッチ（例えば、６つのＨＬＡのうちの３つ、６つのうちの４つ、６つのうちの５つ、または６つのうち６つが一致）する臍帯血から産生される。ＣＫ０８０１産物は、対象の体重に基づいた用量で単回注入として対象に投与される。この産物は、免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０１産物は、ＣＤ２５^＋選択を介して、かつ１４日間の培養期間後に単離される。いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０１産物の放出基準は、（ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋（Ｔ－制御性表現型）、および（ｉｉ）≦１０％ＣＤ４^－ＣＤ８^＋（Ｔ－細胞傷害性／抑制表現型）である。いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０１産物は、炎症性骨髄疾患またはギランバレー症候群を治療するために対象に投与される。

いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、凍結保存されたおよび／または複数回投与産物（例えば、ＣＫ０８０２、ＣＫ０８０２．ＣＸＣＲ４、ＣＫ０８０２．α４β７もしくはＣＫ０８０２．ＣＤ１１ａ）として製剤化される。いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２、ＣＫ０８０２．ＣＸＣＲ４、ＣＫ０８０２．α４β７またはＣＫ０８０２．ＣＤ１１ａは、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む注入可能な凍結保存培地に製剤化される。ＣＫ０８０２、ＣＫ０８０２．ＣＸＣＲ４、ＣＫ０８０２．α４β７およびＣＫ０８０２．ＣＤ１１ａは、産物が投与される対象に対してＨＬＡマッチしてはいない。いくつかの実施形態では、これらの産物は、産物が投与される対象に対する６つのＨＬＡマッチのうちの２つ、６つのうちの１つ、または６つのうちの０である。これらの産物の各々は、固定用量の複数回投与注入として対象に投与される。これらの産物は、免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２産物は、ＣＤ２５^＋選択を介し、かつ１４日間の培養期間後に単離される。いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２産物の放出基準は、（ｉ）１０ｍＬ中の１００×１０^６個のＴｒｅｇ／バッグ（１０×１０^６個のＴｒｅｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋（Ｔ－制御性表現型）、および（ｉｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋（Ｔ－細胞傷害性／抑制表現型）である。いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２産物は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）（例えば、ＣｏＶ－ＡＲＤＳ）またはサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）（例えば、キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法によるＣＲＳ）を治療するために対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２産物は、０、３、および７日目に対象に投与される。

いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２．ＣＸＣＲ４産物は、ＣＤ２５^＋選択およびＣＸＣＲ４での追加の濃縮を介して、かつ１０～１２日間の培養期間後に単離される。いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２．ＣＸＣＲ４産物の放出基準は、（ｉ）１０ｍＬ中の１００×１０^６個のＴｒｅｇ／バッグ（１０×１０^６個のＴｒｅｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋（Ｔ－制御性表現型）、（ｉｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＸＣＲ４^＋（骨髄ホーミングサブタイプ）、および（ｉｖ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋（Ｔ－細胞傷害性／抑制表現型）である。いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２．ＣＸＣＲ４産物は、骨髄線維症、再生不良性貧血、または免疫性血小板減少症を治療するために対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２．ＣＸＣＲ４産物は、最大６ヶ月間毎月対象に投与される。

いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２．α４β７産物は、ＣＤ２５^＋選択およびα４β７での追加の濃縮を介して、かつ８～１０日間の培養期間後に単離される。いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２．α４β７産物の放出基準は、（ｉ）１０ｍＬ中の１００×１０^６個のＴｒｅｇ／バッグ（１０×１０^６個のＴｒｅｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋（Ｔ－制御性表現型）、（ｉｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋α４β７^＋（胃腸ホーミングサブタイプ）、および（ｉｖ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋（Ｔ－細胞傷害性／抑制表現型）である。いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２．α４β７産物は、胃腸移植片対宿主病または炎症性腸疾患を治療するために対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２．α４β７産物は、以下の投薬レジメンで対象に投与される：（ｉ）誘導：毎週最大４週間、および（ｉｉ）維持：毎月最大６ヶ月間。

いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２．ＣＤ１１ａ産物は、ＣＤ２５^＋選択およびＣＤ１１ａでの追加の濃縮を介して、かつ８～１０日間の培養期間後に単離される。いくつかの実施形態において、ＣＫ０８０２．ＣＤ１１ａ産物の放出基準は、（ｉ）１０ｍＬ中の１００×１０^６個のＴｒｅｇ／バッグ（１０×１０^６個のＴｒｅｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋（Ｔ－制御性表現型）、（ｉｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１１ａ^＋（ニューロンホーミングサブタイプ）、および（ｉｖ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋（Ｔ－細胞傷害性／抑制表現型）である。いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２．ＣＤ１１ａ産物は、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、または脱髄性神経障害を治療するために対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２．ＣＤ１１ａ産物は、以下の投薬レジメンで対象に投与される：（ｉ）誘導：毎週最大４週間、および（ｉｉ）維持：毎月最大６ヶ月間。

ヒトＴｒｅｇ細胞の様々な集団の臍帯血ユニット選択基準は、図２９および図３０に提供されている。

ＣＫ０８０２の細胞出発材料は、正常で健康な無関係のドナーからの臍帯血（ＣＢＵ）の単一ユニットである。臨床的に関連するＴｒｅｇ細胞用量の産生には、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋表現型を有するＴｒｅｇ細胞のエクスビボでの濃縮および増殖が含まれる。いくつかの実施形態では、１４日間の製造プロセスは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ集団の５０倍以上の増殖をもたらす。異なるレシピエントを意図した複数回投与は、単一の増殖プロセスから製造され得る。Ｔｒｅｇ細胞は、注入のために臨床部位に輸送される前に、採取され、凍結保存され、試験され、臨床使用のために放出される。

ＣＫ０８０２はポリクローナルであり、Ｖ－ベータレパートリーを幅広く表現し、細胞内ＦＯＸＰ３染色を高度に表現している。ＣＫ０８０２は、ＴＳＤＲ（Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域）の一貫した低メチル化にも関連しており、これは、天然に存在するヒトＴｒｅｇでは一般的である。

いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２有効原薬（ＤＳ）は有核臍帯血細胞からなる液体細胞懸濁液であり、その６０％以上が制御性Ｔ細胞表現型（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋）を有し、その１０％未満がＴ細胞傷害性／抑制性細胞表現型（ＣＤ３^＋ＣＤ４^－ＣＤ８^＋）を有する。いくつかの実施形態では、ＣＫ０８０２最終製剤（ＤＰ）は、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む注入可能な凍結保存培地に１０×１０^６個のＴｒｅｇ細胞／ｍＬの細胞濃度で懸濁されたＣＫ０８０２有効原薬を含む生細胞の懸濁液である。

ＣＫ０８０２製剤の組成の例が、表２に提供されている。

本明細書でさらに開示されるのは、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団と、１つ以上の薬学的または獣医学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはビヒクルを含む医薬組成物である。

「薬学的に許容される」および「獣医学的に許容される」という用語は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料などの、薬学的または獣医学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを指す。各成分は、医薬製剤の他の成分と適合性があるという意味で「薬学的に許容される」または「獣医学的に許容される」でなければならない。また、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、またはその他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織または臓器と接触して使用するのに適している必要がある。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：２００５、およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ａｓｈ ａｎｄ Ａｓｈ Ｅｄｓ．，Ｇｏｗｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ：２００７；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅ－ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｇｉｂｓｏｎ Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００４を参照されたい）。

本開示の医薬組成物は、その意図された投与経路（すなわち、眼内、網膜下、非経口、静脈内、動脈内、皮内、皮下、経口、吸入、経皮、局所、経粘膜、腹腔内または胸膜内および／または直腸投与）と適合するように製剤化される。

本開示による治療実体の投与は、改善された移動、送達、耐性などを提供するために製剤に組み込まれる適切な担体、賦形剤、および他の薬剤とともに投与されることが理解されよう。多数の適切な製剤が、すべての製薬化学者に知られている以下の処方集に記載されている：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１５ｔｈ ｅｄ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９７５））、特に、その中のＢｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒによる第８７章。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有小胞（リポフェクチン（商標）など）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油および油中水型エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が含まれる。前述の混合物のいずれも、製剤中の有効成分が製剤によって不活性化されず、製剤が生理学的に適合性があり、投与経路に耐えられるという条件で、本開示による治療および療法において適切であり得る。Ｂａｌｄｒｉｃｋ Ｐ．“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｕｉｄａｎｃｅ．”Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０－８（２０００）、Ｗａｎｇ Ｗ．“Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１－２）：１－６０（２０００）、Ｃｈａｒｍａｎ ＷＮ“Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ ｏｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ－ｓｏｍｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｏｎｃｅｐｔｓ．”Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．８９（８）：９６７－７８（２０００）、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８－３１１（１９９８）および製薬化学者によく知られている製剤、賦形剤、および担体に関連する追加情報の引用も参照されたい。

注射用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）もしくは分散液、および細胞の滅菌注射用溶液もしくは分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。すべての場合において、本組成物は、滅菌でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度まで流動性であるべきである。製造および保管条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散の場合には必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。いくつかの実施形態では、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを本組成物に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを本組成物に含めることによってもたらされ得る。

滅菌注射用溶液は、必要な量の有効成分を適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙される成分のうちの１つまたは組み合わせとともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、本活性化合物を、塩基性分散媒および上に列挙されるものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末剤の場合、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、その事前に滅菌濾過された溶液から、有効成分の粉末剤に加えて、任意の追加の所望の成分が得られる。

いくつかの実施形態では、有効成分は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む放出制御製剤などの、身体からの急速な排除から化合物を保護する担体とともに調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用できる。そのような製剤の調製のための方法は、当業者には明らかであろう。材料は、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染細胞を標的とするリポソームを含む）は、薬学的に許容される担体として使用できる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に知られている方法に従って調製され得る。

単位剤形は、本明細書で使用される場合、治療される対象のための単一用量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の有効成分を含有する。本開示の単位剤形の仕様は、活性化合物の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに固体の治療のためのそのような活性化合物を配合する当該技術分野に固有の制限によって決定され、直接依存する。

最終産物の組成の一例（賦形剤に懸濁された有効成分からなる）を以下の表に示す。いくつかの実施形態では、最終剤形は、約５０ｍＬ～約１００ｍＬの容量を有する。いくつかの実施形態では、最終産物の細胞成分は、単一の臍帯血ユニットまたは複数のプールされた臍帯血ユニット由来の培養増殖された、主にＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋表現型を有する制御性Ｔ細胞である臍帯血由来の単核細胞からなる。

いくつかの実施形態では、最終的に製剤化された産物は、密封された３００ｍＬのポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）プラスチック血液バッグに含まれ、使用するために提供される。このバッグは、患者への投与のために使用される従来の静脈内（ＩＶ）投与セットのプラスチックスパイクでアクセスされ得るポートを有する。

いくつかの実施形態では、最終産物を製剤化するために使用される賦形剤は、以下を含み得る。

いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の方法によって産生された活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団および１つ以上の他の治療薬を含む。本明細書で提供されるのはまた、本明細書に記載の組成物（例えば、容器、パック、またはディスペンサー）を使用または投与の説明書とともに含む、１つ以上の自己免疫疾患、障害、または状態を治療するためのキットである。本明細書に記載の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団のいずれかを含む容器および使用説明書を含む製造物も提供される。

治療方法および治療用途
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生される有効量のヒトＴｒｅｇ細胞（例えば、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞）の集団を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患、障害または状態を治療するための方法である。本明細書でさらに提供されるのは、本明細書で開示される有効量のヒトＴｒｅｇ細胞の集団を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患、障害または状態を治療するための方法である。いくつかの実施形態では、疾患、障害または状態は、自己免疫疾患、障害、または状態である。いくつかの実施形態では、疾患、障害または状態は、炎症性疾患、障害、または状態である。いくつかの実施形態では、疾患、障害または状態は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、炎症性腸疾患、骨髄不全（例えば、再生不良性貧血、原発性骨髄線維症または骨髄異形成症候群）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性がん（例えば、多発性骨髄腫または炎症性乳がん）、神経炎症性障害（例えば、ギランバレー症候群、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症または脱髄性多発ニューロパチー）、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または免疫不全症候群（例えば、ｉＰＥＸ（免疫調節不全多発性内分泌障害腸症Ｘ連鎖））である。いくつかの実施形態では、疾患、障害または状態は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染に関連する呼吸器疾患、障害または状態である。いくつかの実施形態では、疾患、障害または状態は、ＣＯＶＩＤ－１９（コロナウイルス病）媒介性急性呼吸窮迫症候群（ＣｏＶ－ＡＲＤＳ）である。

いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、意図されたレシピエントにヒト白血球抗原（ＨＬＡ）マッチされた１つ以上の臍帯血ユニットから産生される。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、意図されたレシピエントにＨＬＡマッチされていない１つ以上の臍帯血ユニットから産生される。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、対象に適合性のある血液型の１つ以上の臍帯血ユニットから調製される。

いくつかの実施形態では、臍帯血由来Ｔｒｅｇは、抗炎症効果を生成するために以下の特性の１つ以上を示し得る：１）レシピエント抗原提示細胞（ＡＰＣ）との直接関与およびＴエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞との相互作用の遮断（すなわち、直接相互作用を通じて炎症誘発性免疫細胞を抑制することによって）、２）トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、およびインターロイキン－３５（ＩＬ－３５）を含む抑制サイトカインの放出、３）アポトーシスにつながるＴｅｆｆへのＩＬ－２供給の枯渇、ならびに／または４）グランザイム／パーフォリン産生において役割を果たす（すなわち、グランザイムＢまたはパーフォリンを分泌し、それによってナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞死をもたらす）。さらに、炎症部位での注入された臍帯血由来のＴｒｅｇの局所増殖は、生存の利点をもたらし、疾患の制御に必要な抗炎症作用を生じさせ得る。

最終産物中のＴｒｅｇ細胞の投与量は、対象の体重１ｋｇあたりの細胞数として表され得る。本明細書に記載の方法のいずれかで使用するための適切な細胞用量の決定は、当該技術分野の日常的なレベルの技術の範囲内にある。いくつかの実施形態では、有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、対象の体重の１×１０^５～約１×１０^８個のＴｒｅｇ細胞／ｋｇ、または約１×１０^６～約１×１０^７個のＴｒｅｇ細胞／ｋｇである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかについての細胞用量は、以下であり得る。
用量レベル１：約１×１０^６個のＴｒｅｇ細胞／ｋｇ
用量レベル２：約３×１０^６個のＴｒｅｇ細胞／ｋｇ
用量レベル３：約１×１０^７個のＴｒｅｇ細胞／ｋｇ

いくつかの実施形態では、対象の体重に依存しない固定用量が投与され得る。いくつかの実施形態では、用量は、約１×１０^８個の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞～約３×１０^８個のＴｒｅｇ細胞であり得る。例えば、用量は、約１×１０^８、約３×１０^８、または約１×１０^９個の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞であり得る。

いくつかの実施形態では、有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、対象に静脈内投与される。

いくつかの実施形態では、単回用量の有効量のヒトＴｒｅｇ細胞の集団が、対象に投与される。いくつかの実施形態では、複数回用量の有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団が、対象に投与される。いくつかの実施形態では、最大１０（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）またはそれ以上の反復用量のＴｒｅｇ細胞が投与され得る。複数回用量が投与される場合、これらの用量は定期的（すなわち、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、毎週、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、５週間ごと、６週間ごと、１～２週間ごと、１～３週間ごと、１～４週間ごと、１～５週間ごと、１～６週間ごと、２～３週間ごと、２～４週間ごと、２～５週間ごと、２～６週間ごと、３～４週間ごと、３～５週間ごと、３～６週間ごと、４～５週間ごと、４～６週間ごと、または５～６週間ごと）に投与され得る。いくつかの実施形態では、用量は、約４～６週間ごとに対象に投与される。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、４週間の期間にわたって毎週投与され、その後、少なくとも６～９ヶ月（すなわち、６、７、８、または９ヶ月）の期間にわたって毎月投与され得る。

いくつかの実施形態では、有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団の投与後に、対象における循環炎症性サイトカインレベルは、投与前の対象における循環炎症性サイトカインレベルと比較して減少する。いくつかの実施形態では、循環炎症性サイトカインは、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）または腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦα）である。

いくつかの実施形態では、治療の前に、対象が有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団に応答するかどうかを決定するために、対象の血清バイオマーカーが検査される。いくつかの実施形態では、治療後に、対象の血清バイオマーカーが、臨床反応との相関性を決定するために検査される。いくつかの実施形態では、血清バイオマーカーは、Ｔｒｅｇ細胞によるその後の再治療が必要であるかどうかを検査するために連続的に検査される。

いくつかの実施形態では、ジフェンヒドラミンは、有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団の投与の前に対象に投与される。いくつかの実施形態では、約５０ｍｇのジフェンヒドラミンが投与される。いくつかの実施形態では、ジフェンヒドラミンは、有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団の投与の約３０分前に投与される。

本明細書でさらに提供されるのは、薬剤の調製における本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団の使用である。薬剤は、疾患、障害または状態を治療または予防するために使用され得る。

移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）
本明細書で提供されるのは、対象における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療または予防するための方法であり、この方法は、有効量の、本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団、または、有効量の、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象におけるＧＶＨＤの１つ以上の症状を改善、軽減、または予防する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＧＶＨＤを有する対象の生存を延長する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、移植を受けた後に対象がＧＶＨＤを発症するのを防ぐ。

本明細書でさらに提供されるのは、対象におけるＧＶＨＤを治療または予防するための方法であり、この方法は、対象に、（ｉ）有効量の、本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団、または、有効量の、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団、および（ｉｉ）ルキソリチニブを投与することを含む。いくつかの実施形態では、ルキソリチニブは対象に継続的に投与され、ヒトＴｒｅｇ細胞は２、３または４週間ごとに対象に投与される。いくつかの実施形態では、ルキソリチニブは、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、または２５ｍｇの錠剤として１日２回経口投与される。

同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、多くの血液悪性腫瘍の唯一の治療選択肢である。しかし、この手順のより広範な使用に対する主な障壁は、移植片からのＴ細胞が宿主の組織を異物として認識するときに発生し、罹患率および死亡率の主な原因であるＧＶＨＤの発症である。（Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ８１（４）：１８３－９３（２０１３）、Ｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２（１）：２５－３２（２０１３）、およびＱｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １７（８）：９６６－７５（２０１３）を参照されたい）。急性ＧＶＨＤ（ａＧＶＨＤ）は通常、ＨＳＣＴ後の最初の１００日以内に発生し、ＮＫ細胞およびマクロファージなどの他の炎症細胞型を動員する活性化Ｔ細胞からの「サイトカインストーム」を伴い、皮膚、腸、および肝臓などの組織における炎症性病変の原因となる。ａＧＶＨＤは、移植患者の約１５％で死の原因となる。（Ｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２（１）：２５－３２（２０１３）およびＱｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １７（８）：９６６－７５（２０１３）を参照されたい）。慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）は、移植後最初の１００日後に発生し、複数の臓器、特に、腸、肝臓、肺、骨髄、胸腺、および皮膚に影響を与える全身性炎症および組織破壊を特徴とする。ｃＧＶＨＤは、同種ＨＳＣＴレシピエントの３０～６５％で発生し、主に感染症と戦う能力の低下により、５年間の死亡率が３０～５０％と極度の罹患率を引き起こす。ａＧＶＨＤは、主に、Ｔｈ１／Ｔｈ１７駆動型プロセスであると考えられ、ｃＧＶＨＤは、主に、Ｔｈ２駆動型応答によって駆動されると考えられている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象におけるａＧＶＨＤの１つ以上の症状を改善、軽減、または予防する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象におけるｃＧＶＨＤの１つ以上の症状を改善、軽減、または予防する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療方法は、移植片対白血病（ＧＶＬ）活性、白血病細胞を殺傷する同種免疫細胞による有益な免疫応答の利益を失うことなくＧＶＨＤを抑制するために使用され得る（Ｅｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９（９）：１１４４－５０（２００３）を参照されたい）。

ＧＶＨＤを最小限に抑えるための現在の戦略では、カルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）、シクロスポリン、およびタクロリムスなどの薬物による長期にわたる免疫抑制療法が要請される。しかし、この長期にわたる免疫抑制は、免疫機能の遅延をもたらし、感染性合併症および移植後リンパ増殖性疾患のリスクをもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、対象におけるＧＶＨＤを治療または予防するための方法であり、この方法は、他の免疫抑制療法を投与せずに、有効量の、本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団、または、有効量の、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を対象に投与することを含む。

ＧＶＨＤの異種マウスモデルを使用して、ＧＶＨＤの治療における臍帯血由来の制御性Ｔ細胞の機能を評価することができる。（Ｐａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １６（１０：９０－１００（２０１３）を参照されたい）。

骨髄不全症候群（ＢＭＦ）
本明細書で提供されるのは、対象における骨髄不全症候群（ＢＭＦ）を治療または予防するための方法であり、この方法は、有効量の、本明細書に開示される方法によって生成される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団、または、有効量の、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、有効量の新鮮な単回投与のＴｒｅｇ細胞産物（例えば、ＣＫ０８０１）が、ＢＭＦを治療または予防するために投与される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象におけるＢＭＦの１つ以上の症状を改善、軽減、または予防する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＢＭＦを有する対象の生存を延長する。

ＢＭＦは、骨髄（ＢＭ）の造血前駆体の減少または欠如につながる、１つ以上の主要な造血系の産生の減少を指す。これは、後天性および遺伝性の２つのカテゴリーに分類できる。後天性ＢＭＦ症候群には、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、および原発性骨髄線維症が含まれる。後天性ＢＭＦ症候群の病因には、ＢＭ微小環境および環境要因が関与している。これらの症候群の大多数にとって、免疫機能障害の役割は、ＢＭ欠損の原因および維持の両方において重要であると認識されている。

再生不良性貧血（ＡＡ）
本明細書で提供されるのは、対象における再生不良性貧血（ＡＡ）を治療または予防するための方法であり、この方法は、有効量の、本明細書に開示される方法によって生成される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団、または、有効量の、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を対象に投与することを含む。

ＡＡは、末梢血（ＰＢ）における汎血球減少症を特徴とし、骨髄（ＢＭ）形成不全ＡＡは、ＢＭ造血前駆細胞について、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞、およびＴｈ１７細胞などの自己反応性細胞傷害性Ｔ細胞による攻撃を特徴とするＢＭＦ症候群である。（Ｂｒｏｄｋｓｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３６５（９４７１）：１６４７－５６（２００５）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ ７５（２）：７９－９３（２０１０）、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １５（３）：１６２０６８（２００８）、およびｄｅ Ｌａｔｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１６（２０）：４１７５－８４（２０１０）を参照されたい）。

免疫介在性の造血破壊のメカニズムには、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、Ｔ細胞集団による自己ＣＤ３４^＋細胞への直接的な毒性、およびＴｈ１７免疫応答などの阻害性サイトカインの過剰産生を与えるＴｈ１分極応答が含まれる。（ｄｅ Ｌａｔｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１６（２０）：４１７５－８４（２０１０）、Ｇｉａｎｎａｋｏｕｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １２４（１）：９７－１０５（２００４）、Ｓｌｏａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １００（４）：１１８５－９１（２００２）、およびＳｏｌｏｍｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０７（１０）：３９８３－９１（２００６）を参照されたい）。その意味で、ＡＡは、異常なＴ細胞免疫恒常性を引き起こす欠陥および欠損の制御性Ｔ細胞と組み合わさった過剰な細胞傷害性自己反応性Ｔ細胞のために、特定の自己免疫疾患であり、ＢＭが主な標的臓器である。

本明細書で提供されるのはまた、対象における後天性特発性再生不良性貧血を治療する方法であり、対象は、適合された同胞ドナー造血幹細胞移植（ＭＳＤ－ＨＳＣＴ）に不適格であるか、または免疫抑制療法（ＩＳＴ）に対して応答性が低いと予測される。

後天性ＡＡの診断は、
汎血球減少症を引き起こし得る他の障害の除外および周知のカミッタ基準に基づき得る。（Ｃａｍｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ４５（３）：３５５－６３（１９７５）を参照されたい）。

以下の表に示すように、ＡＡ応答基準（Ｋｉｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １７２（２）：１８７－２０７（２０１６）を参照されたい）を使用して、本明細書に記載の治療法に対するＡＡを有する対象の応答を決定し得る。

骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）
本明細書で提供されるのは、対象における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を治療または予防するための方法であり、この方法は、有効量の、本明細書に開示される方法によって生成される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団、または、有効量の、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を対象に投与することを含む。

ＭＤＳは、血球産生障害がアポトーシスの増加の結果である可能性がある、効果のない造血を特徴とする。アポトーシスを逃れる異常な前駆細胞のクローン増殖は、明白な急性白血病への進化を引き起こす可能性がある。（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １４（１）：２－８（２０００）およびＢａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ３７（１）：１５－２９（２０００）を参照されたい）。免疫機能の調節不全は、ＭＤＳにおいて認められた事実である。（Ｆｏｚｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ３７（８）：９４７－５５（２００９）を参照されたい）。可能なメカニズムの中で、Ｔ細胞媒介性造血の阻害は、特に低リスクで低細胞性のＭＤＳの典型的な特徴として認識されている。（Ｅｐｐｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ ２５（１２）：１０７５－８３（２００１）を参照されたい）。一部の種類のＭＤＳにおける血球減少症は、正常および異常な骨髄（ＢＭ）前駆細胞のサイトカインまたは細胞媒介性自己免疫抑制のいずれかが原因である可能性がある。（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ３７（１）：１５－２９（２０００）を参照されたい）。これらのメカニズムは、特に形成不全型のＭＤＳ（ＨＭＤＳ）で機能する可能性があり（Ｔｕｚｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ９１（３）：６１２－１７（１９９５）を参照されたい）、これは、確立された自己免疫病因を伴う疾患である臨床的に再生不良性貧血（ＡＡ）としばしば重複する。（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３６（１９）：１３６５－７２（１９９７）を参照されたい）。

ＭＤＳを有する患者は、ＣＤ４とＣＤ８との比率の低下、複数の活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞クローンの増殖、および阻害性サイトカインの過剰産生を示す。（Ｓｅｌｌｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ９５（９）：１９１１－２２（２００２）を参照されたい）。ＭＤＳ患者における免疫エフェクターメカニズムには、直接的な殺傷だけでなく、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、およびＦａｓ－リガンド（Ｆａｓ－Ｌ）などの造血前駆細胞に対する阻害活性を有するサイトカインの放出も含まれ得る。（Ｚａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９８（１０）：３０５８－６５（２００１）を参照されたい）。これらの病態生理学的経路と一致して、これらのサイトカインのレベルの増加は、ＭＤＳ患者の血液および骨髄で記載されており、これらの患者で見られる多数のアポトーシス性骨髄細胞の原因である可能性がある。（Ｓｅｌｌｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ９５（９）：１９１１－２２（２００２）を参照されたい）。

現在、ＭＤＳの診断（Ｇａｎｇａｔ ｅｔ ｌａ．，Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ９１（１）：７６－８９（２０１６）を参照されたい）は、（ｉ）ヘモグロビン＜１０ｇ／ｄＬである持続的な（＞６ヶ月の期間）および著しい血球減少症、絶対好中球カウント＜１．８×１０^９／Ｌ、血小板カウント＜１００×１０^９／Ｌ、（ｉｉ）著しい骨髄異形成、または過剰芽細胞もしくは典型的な細胞遺伝学的異常、ならびに（ｉｉｉ）鑑別診断の除外の存在に基づいて確立されている。（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ３７（１）：１５－２９（２０００）を参照されたい）。一般的な末梢血知見には、大球性貧血、網状赤血球減少症、低分葉好中球による好中球減少症（偽ペルゲル・ヒュエット）、骨髄芽球および血小板減少症を含む循環未成熟骨髄細胞が含まれる。

以下の表に示すように、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＩＷＧ）の応答基準（Ｃｈｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０８（２）：４１９－２５（２００６）を参照されたい）を使用して、本明細書に記載される治療法に対してＭＤＳを有する対象の応答を決定することができる。

原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）
本明細書で提供されるのは、対象における原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）を治療または予防するための方法であり、この方法は、有効量の、本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団、または、有効量の、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＰＭＦを治療または予防するために対象に投与されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団は、少なくとも約９０％のＣＸＣＲ４^＋である。

本明細書でさらに提供されるのは、対象におけるＰＭＦを治療または予防するための方法であり、この方法は、対象に、有効量の、（ｉ）本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団、または、有効量の、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団、および（ｉｉ）ルキソリチニブを投与することを含む。いくつかの実施形態では、ルキソリチニブは対象に継続的に投与され、ヒトＴｒｅｇ細胞は２、３または４週間ごとに対象に投与される。いくつかの実施形態では、ルキソリチニブは、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、または２５ｍｇの錠剤として１日２回経口投与される。

ＰＭＦはクローン造血幹細胞障害であり、患者の５０％がヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）２遺伝子ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆに構成的に活性化された変異を有する。ＰＭＦは一般に、変異した幹細胞または前駆造血細胞から生じるとみなされているが、免疫調節不全が一般的である。例えば、炎症性サイトカインの血漿レベルが増加し、自己免疫の臨床的および実験的症状が現れる。（Ｂａｒｏｓｉ Ｃｕｒｒ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｍａｌｉｇ Ｒｅｐ ９（４）：３３１－３９（２０１４）を参照されたい）。このクローン性骨髄増殖は、反応性骨髄線維症（骨髄線維症）、および脾臓または複数の臓器における髄外造血を特徴的に伴う。

炎症誘発性サイトカインは、ＰＭＦにおいて非常に高レベルであり、疾患の病因に寄与することが知られている。実際には、ルキソリチニブによる治療は、ＩＬ－６、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αなどの炎症誘発性サイトカインの循環レベルの劇的な低下に関連する。

ＰＭＦの診断は、表７に記載されている基準を使用して行われ得る（Ｂａｒｂｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ８（２）：１５（２０１８）を参照されたい）。

以下の表に示される、改訂された国際作業部会－骨髄増殖性腫瘍研究および治療（ＩＷＧ－ＭＲＴ）ならびに欧州白血病ネットワーク（ＥＬＮ）の対応基準（Ｔｅｆｆｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２２（８）：１３９５－９８（２０１３）を参照されたい）は、本明細書に記載の治療法に対するＰＭＦを有する対象の応答を決定するために使用され得る。

全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
本明細書で提供されるのは、対象における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療または予防するための方法であり、この方法は、有効量の、本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団、または、有効量の、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象におけるＳＬＥの１つ以上の症状を改善、軽減、または予防する。いくつかの実施形態では、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞を対象に投与した後、尿中のアルブミンの溢流は減少し、糸球体におけるＳＬＥ細胞浸潤は減少し、かつ／または毛包は保存される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＳＬＥを有する対象の生存を延長する。

ＳＬＥは、慢性の多系炎症性自己免疫疾患である。狼瘡は、関節、皮膚、腎臓、心臓、肺、血管、および／または脳を含む体の多くの部分に影響を与える可能性がある。例えば、ＳＬＥは、関節痛もしくは関節炎、レイノー現象、頬および他の発疹、胸膜炎または心膜炎、腎臓もしくはＣＮＳの関与、および／または血球減少症として現れる可能性がある。

炎症性がん
本明細書で提供されるのは、対象における炎症性がんを治療または予防するための方法であり、この方法は、有効量の、本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団、または、有効量の、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、炎症性がんは、多発性骨髄腫または炎症性乳がんである。いくつかの実施形態では、多発性骨髄腫の治療レジメンは、有効量のヒトＴｒｅｇ細胞の集団および炎症性がんを治療するのに有用な二重特異性タンパク質（例えば、抗体）の投与を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性タンパク質は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。いくつかの実施形態では、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、ＣＤ３およびＢＣＭＡに結合する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、対象における炎症性がんの１つ以上の症状を改善、軽減、または予防する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、炎症性がんを有する対象の生存を延長する。

神経炎症性障害
本明細書で提供されるのは、対象における神経炎症性障害を治療または予防するための方法であり、この方法は、有効量の、本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団、または、有効量の、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、炎症性がんは、ギランバレー症候群または筋萎縮性側索硬化症である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、対象における神経炎症性障害の１つ以上の症状を改善、軽減、または予防する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、神経炎症性障害を有する対象の生存を延長する。

ギランバレー症候群（ＧＢＳ）
本明細書で提供されるのは、対象におけるギランバレー症候群（ＧＢＳ）を治療または予防するための方法であり、この方法は、有効量の、本明細書に開示される方法によって生成される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団、または、有効量の、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を対象に投与することを含む。

本明細書で提供されるのはまた、対象におけるＧＢＳを治療する方法であり、対象は、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）または血漿交換による治療に応答しない。

ＧＢＳは、神経の炎症による筋力低下の急速な発症を特徴とする自己免疫障害である。２つの主要なサブタイプ、（１）急性炎症性脱髄性多発神経障害（ＡＩＤＰ）および（２）急性軸索神経障害（ＡＭＡＮ）がある。ＧＢＳの正確な原因は不明であるが、感染に対する免疫応答が神経に損傷を与える自己免疫応答を引き起こすという強力な証拠がある。

実験的自己免疫性神経炎（ＥＡＮ）は、末梢神経系の免疫性炎症性脱髄障害であり、ＡＩＤＰの動物モデルとして作用する。本明細書に記載される治療法は、この動物モデルで試験され得る。これは一般に、Ｐ０またはＰ２などのミエリンタンパク質による免疫化によって感受性が高い動物株中に誘導され、血液神経関門の破壊、自己反応性Ｔ細胞およびマクロファージの浸潤、末梢神経系の脱髄を引き起こす（Ｓｏｌｉｖｅｎ，Ｂ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ Ｐｅｒｉｐｈｅｒ Ｎｅｒｖ Ｓｙｓｔ，２０１２．１７ Ｓｕｐｐｌ ２：ｐ．２８－３３）。ＥＡＮは、末梢神経タンパク質Ｐ０、Ｐ２、および末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）の神経突起形成エピトープ（Ｈｕｇｈｅｓ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９．１００（１－２）：ｐ．７４－９７）または感作Ｔ細胞の養子移入によって積極的に開始され得る。

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）
本明細書で提供されるのは、対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療または予防するための方法であり、この方法は、有効量の、本明細書に開示される方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団、または、有効量の、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団（例えば、１×１０^８個、３×１０^８個または１×１０^９個の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞）を対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、対象における神経炎症性障害を治療または予防するための方法であり、この方法は、有効量の、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団を対象に投与することを含む。

ＡＬＳは、随意筋を制御するニューロンの死が関与するまれな神経疾患である。その結果、重度の筋萎縮が起こり、歩く能力および話す能力が失われる。この疾患は、約８０％の５年死亡率を特徴とする。自己免疫性神経炎症は、ＡＬＳの病因および進行の基礎を形成する。実際には、ＡＬＳ患者は脊髄における炎症が増強されており、ミクログリアの活性化の程度は疾患の重症度に対応している。

ＡＬＳでは、Ｔｒｅｇは機能不全であり、レスポンダーＴリンパ球の増殖を抑制する効果が低くなる。さらに、後期ＡＬＳは、Ｍ１様マクロファージ／ミクログリアおよび炎症性エフェクターＴ細胞の浸潤を特徴とする。ＡＬＳ患者はＴｒｅｇ（ＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋）が減少する傾向があり、進行速度はＴｒｅｇ細胞カウントと負の相関がある。同様に、低いＦｏｘＰ３ ｍＲＮＡレベルは、急速なＡＬＳ進行の予測因子である。さらに、ＡＬＳ患者から採取したＴｒｅｇは、健康な対象と比較して、Ｔｈ１７細胞の増殖を抑制する能力が低下している。

ＣＯＶＩＤ－１９（コロナウイルス病）媒介性急性呼吸窮迫症候群（ＣｏＶ－ＡＲＤＳ）
本明細書で提供されるのは、対象におけるＣＯＶＩＤ－１９（コロナウイルス病）媒介性急性呼吸窮迫症候群（ＣｏＶ－ＡＲＤＳ）を治療または予防するための方法であり、この方法は、有効量の、本明細書に開示される方法によって産生されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団、または、有効量の、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団（例えば、約１×１０^８個または約３×１０^８個の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞）を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、約１×１０^８個または約３×１０^８個の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞が、０日目および３日目に対象に投与される。いくつかの実施形態では、約１×１０^８個または約３×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞が、０日目、３日目および７日目に対象に投与される。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞は、凍結保存された同種臍帯血由来のＴｒｅｇ細胞（ＣＫ０８０２）である。いくつかの実施形態では、ヒトＴｒｅｇ細胞は、単剤として投与される。

いくつかの実施形態では、対象は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に感染しているか、または感染している疑いがある。

病原性の高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、急速なウイルス複製、大規模な炎症性細胞浸潤、および炎症誘発性サイトカイン／ケモカイン応答の上昇に関連しており、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺線維症および死につながる急性肺損傷を引き起こす。ウイルス感染の初期段階には、強力なウイルス複製、および発熱、咳などを含む臨床症状が含まれる。ウイルス感染の第２の段階には、高熱、低酸素血症、肺炎のような症状への進行、およびウイルス力価の終わりに向かう進行性の低下が含まれる。ウイルス感染の第３の段階には、過剰増殖性の宿主の炎症反応、サイトカインおよびケモカインの過剰産生、調節不全の自然免疫応答、ならびにＡＲＤＳが含まれる。臨床的には、ＡＲＤＳは、急性低酸素性呼吸不全および胸部Ｘ線での両側性肺浸潤を特徴とする。

制御されていないサイトカインストームは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した一部の対象の呼吸器合併症の鋭敏さが原因である可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣｏＶ－ＡＲＤＳサイトカインストームは、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、またはＴＧＦβ）およびケモカイン（例えば、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、およびＩＬ－８）の増加を含む。より高いウイルス力価および調節不全サイトカイン／ケモカイン応答は、肺への炎症細胞の大量の浸潤を組織化する。いくつかの実施形態では、ＣｏＶ－ＡＲＤＳサイトカインストームは、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０）の減少を含む。前臨床肺損傷モデルでは、ＣＢ－Ｔｒｅｇ細胞の注射により、次のことが起こった：ｉ）炎症性Ｔ細胞の減少、ｉｉ）肺胞出血の減少、ｉｉｉ）肺上皮および肺胞の再生、ｉｖ）ＣｏＶ－ＡＲＤＳに関係するＩＬ－１７およびＩＬ－６を含む炎症性サイトカインの減少。

死亡率が５０％を超える人工呼吸法を含む支持療法を除いて、特定の治療法は存在しない。新しい治療オプションが緊急に必要とされている。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、組織の修復および再生につながる複数のメカニズムを介して炎症誘発性の肺の損傷を制限する特殊な種類のＴ細胞である。

いくつかの実施形態では、有効量の、本明細書に開示されるヒトＴｒｅｇ細胞の集団の投与が、炎症を解消することによって、ＣｏＶ－ＡＲＤＳまたはＣｏＶ－ＡＲＤＳの症状を治療し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または有効量の本明細書に開示される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団の投与が、抑制サイトカイン（例えば、ＴＧＦ－β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、またはＩＬ－３３）の放出を誘導し得る。

いくつかの実施形態では、これらの治療方法で使用されるヒトＴｒｅｇ細胞は、ＣｏＶ－ＡＲＤＳ関連の炎症部位への輸送に関与する肺組織についてのホーミングマーカーであるＣＣＲ４を発現する。

本明細書に記載されているすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載の態様および実施形態のいずれも、以下の特定の非限定的な本発明の実施例／実施形態を含む、本発明の概要、図面、および／または本発明の詳細な説明において本明細書に開示される他の任意の態様または実施形態と組み合わせることができる。

以下の実施例は、当業者に、本明細書に記載されるおよび特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法がどのように作製および評価され、意図されるかについての完全な開示および説明を提供するために提示されており、発明者が彼らの発明とみなすものの範囲を純粋に例示するものであり、かつ制限することを意図するものではない。数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するための努力がなされてきたが、本明細書ではいくらかの誤差および偏差を考慮に入れる必要がある。特に明記されていない限り、パーツは重量パーツであり、温度は摂氏または周囲温度での温度であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。

実施例１：臍帯血から活性化制御性Ｔ細胞の増殖された集団を産生する
凍結保存されたヒト臍帯血ユニット（ＣＢＵ）を、資格のある米国の公的臍帯血バンクから入手した。ＣＢＵを急速解凍した。解凍した臍帯血ユニットを、Ｓｅｐａｘデバイス（Ｂｉｏｓａｆｅ）を使用して、開始容量を２５ｍｌに設定して自動洗浄し、最終容量を１００ｍｌに設定し、１．０の希釈係数に設定した。使用した洗浄試薬は、５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ）および１０％のデキストラン－４０（Ｄ－４０）（Ｈｏｓｐｉｒａ）であった。洗浄後、臍帯血細胞を臍帯血洗浄バッグ中に収集した。

洗浄を目的として、基本的な洗浄媒体は、１０００ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液に対する２０ｍｌの２５％ＨＳＡであり、作業用洗浄媒体は、３００ｍｌの塩基性洗浄緩衝液および５０ｍｇの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）および２５００ユニットのＤＮａｓｅであり、その場合、改変媒体は、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５媒体（Ｌｏｎｚａ）および１０ｍｌのＧｌｕｔａＭＡＸ－１および１００ｍｌの解凍したヒトＡＢ血清であった。自動洗浄が完了した後、洗浄された臍帯血細胞を、作業用洗浄媒体を使用して追加の手動洗浄を行い、最終容量を２００ｍｌで構成し、再構成された細胞を室温で１０分間３００ｇで遠心分離した。最後に、洗浄した細胞を、０．０９ｍｌで１００×１０^６個の細胞の総有核細胞（ＴＮＣ）カウントの濃度に再懸濁した。

続いて、ＣＤ２５マイクロビーズを、１００×１０^６個のＴＮＣあたり０．０２ｍｌのヒトＣＤ２５試薬の比率で添加した。細胞およびマイクロビーズを、摂氏４度で３０分間一緒にインキュベートした。インキュベーションステップに続いて、細胞をＭｉｄｉＭＡＣＳデバイスに取り付けられたＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラム中に移動させ、磁石を使用して抗ＣＤ２５標識細胞を捕捉した。免疫磁気選択後、細胞を磁場から解放した。

約１×１０^６個のＣＤ２５^＋細胞を洗浄し、１％のＬ－グルタミン、１０％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびインターロイキン－２（ＩＬ－２、１０００ＩＵ／ｍＬ）を含むＸ－ＶＩＶＯ中に懸濁させた。次いで、溶液を、ビーズに対する細胞の比１：１で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズと混合した。混合物を１０ｃｍ^２の膜表面積を有するガス透過性培養器に移動させ、続いて、０および培養物を膜表面積１００ｃｍ^２のガス透過性培養器に移動させ、合計１４日間インキュベートし、培地は細胞を乱すことなく４８時間ごとに交換された。１４日後、細胞を採取し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを磁性粒子濃縮器で除去した。次いで、細胞を最終媒体中に再懸濁した。

細胞は、製造プロセスの様々な時点でサンプリングされ、それらの特性は、表９に示されている。

図１に示されるように、上記の方法によって産生された増殖された活性化Ｔｒｅｇ細胞は、室温（１５～３０℃）または４℃で保管された場合に安定であった。図１は、フローサイトメトリーに基づくアッセイの結果を示し、７－アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）は一般に生細胞から除外されているように見えるため、ＤＮＡと結合するとスペクトルシフトを受ける蛍光インターカレーターである７ＡＡＤを使用して生細胞を評価する。細胞を、１マイクロリットルの７ＡＡＤストック溶液の存在下で氷上で３０分間インキュベートする。インキュベーション期間後できるだけ早く、バイオレットおよび４８８ｎｍの励起を使用して、染色された細胞をフローサイトメトリーで分析し、４４０ｎｍおよび６７０ｎｍのバンドパスフィルター（またはそれらに近い相当するもの）を使用して蛍光発光を測定する。生細胞は、低レベルの蛍光のみを示す。

増殖された活性化Ｔｒｅｇ細胞の表現型は、細胞培養の開始時（０日目）、ならびに細胞培養の開始後８日目および１４日目にフローサイトメトリーによって測定された。結果を表１０に示す。

図２Ａおよび図２Ｂに示されるように、増殖された活性化Ｔｒｅｇ細胞は抑制的であり、７０～９６％の抑制を示す。図４Ａ～図４Ｄに示されるように、増殖した活性化Ｔｒｅｇ細胞はＲＯＲγｔを発現せず、ストレスに応答してＩＬ－１０発現における相互増加を示す。図４Ａは、ＩＬ－６がＴｒｅｇ細胞の抑制活性に影響を及ぼさないことを示す。図４Ｂは、ＩＬ－６がＴｒｅｇ細胞によるＲＯＲγ発現に影響を及ぼさないことを示す。図４Ｃは、ＩＬ－６がＴｒｅｇ細胞によるＩＬ－１７Ａ産生に影響を及ぼさないことを示す。図４Ｄは、ＩＬ－６がＴｒｅｇ細胞によるＩＬ－１０産生の増加を誘導することを示す。図２５は、ＩＬ－６がＴｒｅｇ細胞によるグランザイムＢ産生を誘導することを示す。さらに、増殖した活性化Ｔｒｅｇ細胞は、ＨＬＡバリアを越えて免疫抑制性であり得る（図３）。増殖された活性化Ｔｒｅｇは、Ｔ細胞受容体Ｖβレパートリーのガウス（ポリクローナル）分布を示す（図６）。

増殖された活性化Ｔｒｅｇ細胞は、ステロイドの存在下でも抑制性を維持する。図７Ａおよび図７Ｂは、Ｔｒｅｇ細胞がデキサメタゾンの存在下で抑制性を維持することを示す。ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎ細胞の生存率に対するプレドニゾンの効果を以下に示す。

実施例２：臍帯血からの活性化制御性Ｔ細胞の増殖された集団の凍結保存
実施例１に記載の方法によって産生された増殖された活性化Ｔｒｅｇ細胞を、以下のように凍結保存した。

５ｍｌバイアルあたり合計５０×１０^６個の細胞を、１ｍｌあたり１０×１０^６個の細胞の濃度で凍結保存した。採取された活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を、４℃の温度で１０分間４００ｇで遠心分離した。総細胞数を自動セルカウンターを使用して計算し、総細胞数を５０×１０^６個の細胞で除算することによってクライオバイアルの数を推定した。続いて、凍結ストック溶液が１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｃｒｙｏｓｔｏｒ）を含む事前に製剤化された溶液からなる凍結ストック溶液を使用して、５ｍｌのクライオバイアルあたり最大５０×１０^６個の細胞を凍結保存した。細胞を遠心分離している間、制御された速度の冷凍庫をオンにし、制御された速度の冷凍庫が適切な開始温度に達すると、「プログラムは続行するのにユーザがここをクリックするのを待機している」というコマンドが表示された。凍結ストック溶液と混合すると、最大５０×１０^６個の細胞各々を含むクライオバイアルを、凍結アルゴリズムを使用して制御された速度の冷凍庫に入れて、細胞の凍結速度を整調することを可能にして、細胞死を回避し、細胞機能を維持する。凍結プログラムが完了した後、クライオバイアルを制御された速度の冷凍庫から取り出し、長期間の凍結保存のために－１９０℃の温度の液体窒素極低温冷凍庫に入れた。

凍結保存された活性化Ｔｒｅｇ細胞は一貫した表現型を示し、新鮮な活性化Ｔｒｅｇ細胞と同様に免疫抑制が可能である（図８Ａ～図８Ｃ）。凍結保存された活性化Ｔｒｅｇ細胞は、Ｈｅｌｉｏｓの高発現（図８Ｂ）および増殖する従来のＴ細胞の抑制（図８Ｃ）を示す。実施例３にさらに記載されているように、凍結保存された新鮮な増殖された活性化Ｔｒｅｇ細胞は、移植片対宿主病の予防または治療において同等である。

実施例３：臍帯血由来の制御性Ｔ細胞による移植片対宿主病の予防および治療
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の異種マウスモデルを使用して、実施例１および２に記載された方法によって産生された臍帯血由来の制御性Ｔ細胞の機能を評価した。ＧＶＨＤのモデルは、Ｐａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １６（１０：９０－１００（２０１３））に記載されている。ＧＶＨＤの予防に対するＴｒｅｇの効果を研究するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ ＩＬ－２Ｒγヌル（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）は、１×１０^７個のＴｒｅｇ細胞の注射の１日前、および１×１０^７個のヒトＰＢＭＣの静脈内注入の２日前に、亜致死的全身照射（Ｊ．Ｌ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｍａｒｋ Ｉ－２５ Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ，Ｓａｎ Ｆｅｒｎａｎｄｏ，ＣＡによって１分間にわたって送達された１３７Ｃｓ源から３００ｃＧｙ）を受けた。臨床ＧＶＨＤスコアリングシステムを使用して、マウスを評価した。（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６９（４）：６９１－９３（２０００）を参照されたい）。新鮮な臍帯血由来のＴｒｅｇおよび凍結保存されたＴｒｅｇによる治療は、同等のＧＶＨＤスコア（図９Ａ）および体重への影響（図９Ｂ）をもたらした。

凍結保存されたＴｒｅｇの投与は、異種マウスモデルにおいてＧＶＨＤを予防および治療した。図１０Ａは、ＧＶＨＤ予防に対する単回Ｔｒｅｇ注入の効果を監視するための研究デザインを示す。図１０Ｂは、ＧＶＨＤ治療に対する複数回Ｔｒｅｇ注入の効果を監視するための研究デザインを示す。図１１Ａ～図１１Ｂに示されるように、活性化Ｔｒｅｇの投与は、ＧＶＨＤの予防および治療の両方を行い得る。活性化Ｔｒｅｇの投与は、ＰＢＭＣ注入後１４日目に末梢血中の炎症性サイトカインのレベルを抑制する（図１２Ａ～図１２Ｆ）。活性化Ｔｒｅｇは、治療されたマウスの炎症部位に分布する（図１３）。さらに、活性化Ｔｒｅｇは、従来のＴ細胞媒介性抗白血病効果を妨害しない（図１４）。

実施例４：凍結保存された臍帯血由来の制御性Ｔ細胞による全身性エリテマトーデスの治療
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の異種マウスモデル（Ａｎｄｒａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２０１１ Ｓｅｐ；６３（９）：２７６４－２７７３）を利用し、全身性エリテマトーデス由来の末梢血単核細胞を非ＳＣＩＤガンマヌル（ＮＳＧ）マウスに移植した。０日目に静脈内注射により３×１０^６個のヒトＳＬＥ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が移植された雌のＲａｇ２^－／－γｃ^－／－マウス。マウスは疾患を発症することを許され、移植後３０日目に、それらは２つのグループ、ｉ）コントロールおよびｉｉ）治療に分けられた。１×１０^７個のエクスビボで増殖され、凍結保存され、同種異系で、ＨＬＡにマッチしないＣＢ Ｔｒｅｇを、ＳＬＥ異種移植片に１週間に１回、尾静脈から４週間にわたって静脈内注射した。表現型分析、サイトカインアッセイ、および抗二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ ＩｇＧ抗体分析のために、連続採血を実行した。クレアチニンおよびアルブミンの定量化のために、尿サンプルの連続検査を実行した。採取された臓器の組織病理学的検査は、１３週目の計画された安楽死時に実行された。

このＳＬＥモデルを使用して、例１および２で説明した方法で産生された臍帯血由来の制御性Ｔ細胞の機能を評価した。図１５に示されるように、活性化されたＴｒｅｇ細胞の単回注射は、ＳＬＥ－ＰＢＭＣの生着後９週間、ＣＤ４５^＋エフェクターＴ細胞のレベルを減少させた。ＳＬＥ－ＰＢＭＣは０日目に注射され、臍帯血（ＣＢ）Ｔｒｅｇの毎週の注射は、＋４週目から開始して行われた。活性化Ｔｒｅｇ細胞の１週間に４回の注射は、ＳＬＥマウスにおける生存率を改善し（図１６Ａ）、抗二本鎖ＤＮＡ抗体（ｄｓＤＮＡ Ｉｇ）のレベルを減少させた（図１６Ｂ）。抗二本鎖ＤＮＡ抗体の存在は、狼瘡疾患活性のマーカーである。Ｔｒｅｇレシピエントは、体重増加が維持され、ＧＶＨＤスコアが低いことを示した。活性化Ｔｒｅｇ細胞の１週間に４回の注射はまた、ＳＬＥマウスにおける、尿アルブミンのレベルを減少させ（図１７Ａ）、尿クレアチニン流出を減少させ（図１７Ｂ）、腎組織学を改善した（図１８）。図１９に示すように、活性化Ｔｒｅｇの投与は、ＳＬＥマウスにおけるヒトｓＣＤ４０Ｌの濃度を低減させる。また、活性化された凍結保存されたＴｒｅｇの毎週の注射は、循環ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の持続的な減少（図２０Ａ）、ならびに脾臓、骨髄、肺および肝臓におけるＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の浸潤の減少をもたらした（図２０Ｂ）。各群の２つのインデックスケースからの組織病理学的結果は、Ｔｒｅｇレシピエントが腎臓のＴ細胞（ＣＤ３^＋）およびＢ細胞（ＣＤ２０^＋）の減少、およびコントロール群と比較して糸球体および腎実質へのリンパ球浸潤の減少を示すことを示した。

実施例５：新鮮な臍帯血由来の制御性Ｔ細胞による多発性骨髄腫の治療
トランスウェル遊走アッセイ
８．０μｍのポアポリカーボネートメンブレンインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳ）を備えた６．５ｍｍの２４ウェルトランスウェルプレートを使用した。Ｔエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）を、ＣＤ３^＋ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。ホタルルシフェラーゼ／ＧＦＰ標識ＭＭ１．Ｓおよび野生型ＲＰＭＩ８２２６細胞は、Ｏｒｌｏｗｓｋｉ研究所（ＭＤアンダーソンがんセンター（ＭＤＡＣＣ））から入手した。Ｕ２６６およびＨＬ－６０細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。Ｎａｌｍ６細胞は、血液病理学研究所（ＭＤＡＣＣ）から提供された。ＲＰＭＩ ８２２６およびＮａｌｍ６細胞は、製造元の指示に従って、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。標的細胞：ＧＦＰ標識ＭＭ１．Ｓ（３×１０^５個の細胞）；ＧＦＰ標識Ｕ２６６（３×１０^５個の細胞）；およびＣＦＳＥ染色ＲＰＭＩ８２２６（３×１０^５個の細胞）；またはネガティブコントロールＧＦＰ標識ＨＬ－６０（１．５×１０^５個の細胞）もしくはＣＦＳＥ染色Ｎａｌｍ６（６×１０^５個の細胞）をそれぞれ３００μＬの媒体に再懸濁し、トランスウェルの上部コンパートメントに播種した。アクター細胞のＣＢ Ｔｒｅｇ（１×１０^６個の細胞）またはポジティブコントロールＣＤ３^＋Ｔｅｆｆ（１×１０^６個の細胞）を７５０μＬの媒体に再懸濁し、下部コンパートメントに添加した。実験の概略図を図４０Ａに示す。遊走された標的細胞を、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標））を使用して分析した。

骨髄腫細胞の輸送に対するＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の影響を理解するために、トランスウェル実験を設定し、標的細胞をトランスウェルの上部コンパートメントに播種した（図４０Ａ）。これらの標的細胞は、骨髄腫細胞：ＧＦＰ－ＭＭ１．Ｓ、ＧＦＰ－Ｕ２６６またはＣＦＳＥ－ＲＰＭＩ８２２６であった。さらに、２つの白血病細胞株をネガティブコントロール標的細胞：ＧＦＰ－ＨＬ６０（急性骨髄性白血病）またはＣＦＳＥ－Ｎａｌｍ６（プレＢ白血病）として使用した。アクター細胞は、下部コンパートメントに播種され、ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞、またはポジティブコントロールとして、Ｔｅｆｆ細胞であった。このような対策は、ＣＢ Ｔｒｅｇの骨髄腫特有の影響を分離するためにとられた。ＣＢ Ｔｒｅｇは、ＭＭ１．Ｓ（図４０Ｂ；ｐ＜０．０１））およびＲＰＭＩ ８２２６（図４０Ｃ；ｐ＝０．０４）の移動を防ぐことができたが、Ｕ２６６（図４０Ｄ；ｐ＝０．１４）は、防ぐことができなかった。ＨＬ－６０（図４０Ｅ）またはＮａｌｍ６（図４０Ｆ）を含む白血病細胞株の遊走パターンに対するＣＢ Ｔｒｅｇの影響は見られなかった。

異種多発性骨髄腫マウスモデル
多発性骨髄腫の異種マウスモデルを使用して、実施例１および２に記載された方法によって産生された臍帯血由来の制御性Ｔ細胞の機能を評価した。非ＳＣＩＤγヌル雌マウス（ジャクソン研究所、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に、ホタルルシフェラーゼ標識ＭＭ１．Ｓ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）（３×１０^６細胞／マウス）を、１×１０^７個のエクスビボで増殖されたＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の有無にかかわらず、尾静脈から静脈内注射した。ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞を、ＭＭ１．Ｓ細胞注入の１日前に注入した。続いて、以前に記載されたように、マウスを撮影した（Ｐａｒｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１４．１６（１）：ｐ．９０－１００）。マウスは、週に一度出血した。血漿サンプルは、マウスのサイトカインレベルを測定するためにＥｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｌｇａｒｙ、ＡＢ、Ｃａｎａｄａ）に送られた。溶解した血液を、抗ヒトＣＤ４５／ＡＰＣ（Ｔｈｅｒｍｏ、抗ヒトＣＤ２５／ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、抗ヒトＣＤ３８／ＡＰＣｅＦｌｕｏｒ７８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および抗マウスＣＤ４５／Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩによって取得した。安楽死時に、骨髄および脾臓を採取した。

カプランマイヤー法を使用して生存率を推定し、ログランク検定を使用してグループを比較した。２つのグループを、対応のないスチューデントｔ検定によって比較し、３つ以上の平均は一元配置分散分析とそれに続く多重比較のためのボンフェローニ検定によって比較した。これらの値は、平均と平均の標準誤差として表される。Ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であるとみなされた。すべての統計分析およびグラフの生成は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実施された。

骨髄腫生着の阻止に対するＣＢ Ｔｒｅｇの効果を理解するために、腫瘍の発生（コントロール群）を可能にするために３×１０^６個のＭＭ１．Ｓ細胞が静脈内注射された異種骨髄腫マウスモデル。治療群では、骨髄腫細胞の注射の１日前にＣＢ Ｔｒｅｇ（１×１０^７個の細胞）を注射した。マウスの体重を週に２回測定し、腫瘍接種後３週目まで両群で体重は同等のままであり、「骨髄腫単独」のマウスの体重の減少が見られ、安楽死時に有意差が明らかであった（図２１Ａ）。骨髄腫の負荷は末梢血において定量化され、差が安楽死時までに統計的に有意になったＴｒｅｇレシピエントと比較して、コントロール群では２８日目までに循環ＣＤ３８^＋骨髄腫細胞がわずかに増加し、同様の傾向が観察された（図．２１Ｂ；骨髄腫単独：０．８％±０．３対Ｔｒｅｇを伴う骨髄腫：１２．４％±２．９、Ｐ＝０．００２）。

非侵襲的生物発光を使用して、マウスを毎週撮影し、ＧＦＰ標識ＭＭ１．Ｓ細胞の有意な取り込みが、腫瘍接種後約３週間で再びコントロール群において明らかになり、４週目までに広まり、ＣＢ Ｔｒｅｇレシピエントにおいて最小の発光が検出された（図２１Ｃ）。腫瘍の進行は急速であり、ＣＢ ＴｒｅｇレシピエントにおいてＢＬＩによって定量化された腫瘍負荷の増加は、観察期間にわたってコントロール群におけるそれと比較して、有意に遅延された（図２１Ｄ）。

骨髄腫細胞は炎症性腫瘍の微小環境で繁殖し、インターロイキン－６（ＩＬ－６）は骨髄腫疾患の進行の主要なドライバーとして関与していたため（Ｈａｒｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ），２０１８，９：ｐ．７８８）、この炎症性サイトカインに対するＣＢ Ｔｒｅｇの影響を調べた。図２３に示すように、循環ＩＬ－６レベルは、「骨髄腫単独」の群における血漿ＩＬ－６レベルの有意な増加が測定され、５週目まで増加するのが継続したとき、腫瘍接種後４週目まで２つの群で同等であった。最終的に、腫瘍負荷の増加および炎症負荷の増加は、「骨髄腫単独」の群での死亡率に変換され、Ｔｒｅｇレシピエントについての統計的に有意な生存の利点につながった（図２２）。安楽死時に、腫瘍細胞を、採取した臓器で測定し、２つの群間で比較した。骨髄腫細胞は、「骨髄腫単独」の群と比較して、Ｔｒｅｇレシピエントの骨髄においてはほとんど検出できなかった（図２４Ａ；０．６％±０．１対９０．０％±２．２、Ｐ＜０．０００１）。同様のパターンが脾臓でも観察された（図２４Ｂ；骨髄腫＋Ｔｒｅｇ：１．３％±０．４対骨髄腫単独：１２．９％±４．２、Ｐ＝０．００９）。

データは、骨髄腫細胞の注射前のＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の単回注射が、最終的に骨髄腫の生着にとって敵対的な状態になるＩＬ－６産生の欠如によって示されるように、インビボで骨髄腫細胞によって生成される炎症シグナルの抑制を可能にする十分な増殖上の利点を与えるという仮説を支持する。腫瘍負荷および体重減少の物理的兆候、ならびに循環および臓器浸潤性骨髄腫細胞のオーバーレイは、ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の全身性抗炎症効果を強化する。

確立された骨髄腫疾患への影響
方法：３×１０^６個のＧＦＰ標識ＭＭ．１Ｓ細胞をＮＳＧマウスに注入し、続いて＋１４日目に５×１０^６個のＣＤ３^＋Ｔ従来型（Ｔｃｏｎ）細胞を注入した。Ｔｃｏｎ処理マウスのサブセットでは、１×１０^７個のＣＢ Ｔｒｅｇ細胞が＋１６、＋２３、および＋３０日に注射された（以下の実験計画表を参照されたい）。マウスを、体重およびＧＶＨＤスコアについて１日おきに追跡した。非侵襲的生物発光イメージング（ＢＬＩ）を連続して実行した。細胞分析およびサイトカインアッセイのために、毎週採血を行った。安楽死時に、組織病理学およびフロー分析のために、血液、脾臓および骨髄を採取した。続く実験では、ＣＤ３およびＢＣＭＡに対する二重特異性抗体（ＢＣＭＡ－ＢｉＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー））の腹腔内注射を、ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の存在下または非存在下で異種骨髄腫モデルに投与した。ＢｉＴＥ（登録商標）の抗腫瘍作用を促進するために、すべてのマウスにＰａｎ Ｔ細胞を添加した。実験計画を図６１Ｅに示す。

結果：ＴｃｏｎおよびＴｃｏｎ＋Ｔｒｅｇレシピエントの両方は、骨髄腫単独または骨髄腫＋Ｔｒｅｇ群と比較して、それらの体重を維持した（図６１Ａ）。Ｔｒｅｇの添加は、Ｔｃｏｎ媒介性抗骨髄腫効果を妨げず、再発の遅延を防止した（図６１Ｂ～図６１Ｄ）。Ｔｒｅｇ＋ＢｉＴＥ（登録商標）の添加は、ＢｉＴＥ（登録商標）単独で治療されたマウスと比較して、同程度の腫瘍制御をもたらした（図６１Ｆ）。Ｔｒｅｇの添加は、ＢｉＴＥ（登録商標）媒介性抗骨髄腫効果を妨げなかった。Ｔｒｅｇの添加は、対応する高いＧＶＨＤスコア（図６１Ｈ）を伴うＢｉＴＥ（登録商標）誘発性の体重減少を軽減した（図６１Ｇ）。

実施例６：骨髄不全症候群および他の自己免疫疾患の治療における臍帯血由来制御性Ｔ細胞を投与するための安全性および有効性の評価
研究の理論的根拠
臍帯血由来の制御性Ｔ細胞による養子療法は、循環炎症誘発性サイトカインを減少させ、転帰を改善することができる可能性がある。以前の研究では、臍帯血由来の制御性Ｔ細胞の注入は安全であり、ＧＶＨＤの予防に効果的である可能性があるが、前臨床試験と臨床試験の両方での効果は、インビボでＴｒｅｇのＴｃｏｎに対する比率に強く依存しているようにみえる。ＧＶＨＤを最小限に抑えるための現在の戦略では、カルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）、シクロスポリン、タクロリムスなどの薬物による長期にわたる免疫抑制療法が要請される。しかし、この長期にわたる免疫抑制は、免疫機能の遅延をもたらし、感染性合併症および移植後リンパ増殖性疾患のリスクをもたらす。したがって、臍帯血由来の制御性Ｔ細胞による養子療法は、ＧＶＨＤおよび他の自己免疫疾患の治療に魅力的な代替手段となる可能性がある。

臍帯血由来の制御性Ｔ細胞産物（ＣＫ０８０１）は、単一の臍帯血ユニット（ＣＢＵ）に由来し、本明細書に記載の方法に従って製造された、エクスビボで増殖される制御性Ｔ細胞からなる。

この研究の目的は、骨髄異形成、骨髄線維症、再生不良性貧血を含む治療抵抗性骨髄不全症候群を有する患者にＣＫ０８０１を投与することが安全かつ実用的であるかどうかを評価することである。再発／難治性の骨髄不全を有し、標準治療に応答しなかった患者のみが、これらの研究に登録される。この研究では、投与するのに安全な可能な限り最高の用量と、ＣＫ０８０１が骨髄不全症候群の症状を改善するかどうかとを判定する。

この研究に参加する資格のある参加者は、標準的な治療法で治療することができないか、またはその意思がないか、標準的な治療法に失敗している。

主要目的
主要目的は、ＣＫ０８０１注入時に各々開始する事象のいずれかとして定義されるＣＫ０８０１の用量制限毒性を決定することである。
・２４時間以内の重度（グレード３または４）の注入毒性（ＮＣＩ－ＣＴＣＡＥ Ｖ４．０）
・３０日以内のレジメン関連の死亡
・３０日以内の重度（グレード３または４）のサイトカイン放出症候群

二次的目的
・疾患特異的応答の予備評価
・疾患特異的反応の持続時間

探索的目的
末梢血および骨髄の免疫再構築および炎症性サイトカインをベースラインおよび治療後の設定で予定されたフォローアップで評価すること。サンプルは、各注入の－１０日目、０日目、＋３日目、＋７日目、＋１４日目、＋２１日目、＋３０日目、＋６０日目、＋９０日目、および１年後に採取される。

群および介入

研究設計
標準の３＋３フェーズＩ統計設計が利用され、３人の患者が用量レベル１：１×１０^６／ｋｇで治療される。用量制限毒性（ＤＬＴ）が観察されない場合、用量は、３人の患者の次のコホートに対して、用量レベル２：（範囲）＞１×１０^６／ｋｇ～１×１０^７／ｋｇに段階的に増大される。ＤＬＴが観察されない場合、用量は用量レベル３：（範囲）＞１×１０^７／ｋｇ～１．５×１０^７／ｋｇに段階的に増大される。

１つのＤＬＴが用量レベルで観察された場合、３人のさらなる患者がそのレベルで治療される。追加のＤＬＴがない場合、その用量レベルはＭＴＤとして定義される。

用量レベル２または３で≧２つのＤＬＴの場合、以前の用量レベルはＭＴＤとして定義される。用量レベル１で≧２つ以上のＤＬＴの場合、データ安全性モニタリング委員会（ＤＳＭＢ）は、研究の継続を検討および評価する。

ＭＴＤは、６人の患者が＜２つのＤＬＴの用量レベルで治療されるときに決定される。最大１８人の患者が治療される。

被験者の各研究コホート（３人または６人の患者）への登録時に、コホートは、最終患者が０日目（ＣＫ０８０１の注入）を完了した３０日後まで閉じられる。用量漸増は、以前に投与されたコホートのＤＳＭＢレビュー後にのみ発生する可能性がある。

適格基準が満たされている場合、対象は合意され、研究に登録される。

治験薬
ソースおよび薬理学
ＣＫ０８０１（臍帯血由来制御性Ｔ細胞）は、Ｃｅｌｌｅｎｋｏｓ ＧＭＰ施設で、所定の基準に基づいて選択され、製造での使用が認定された単一の同種異系の無関係なドナー臍帯血ユニットを使用して製造される。ＣＫ０８０１は、Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａおよび０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）中のＴｒｅｇおよび最終製剤の採取物を伴って、ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇの免疫磁気選択および１４日間の培養増殖プロセスを使用して製造される。最終的な細胞産生物は、すべての利用可能な試験結果のレビューを含む、正式なロット放出プロセスの後にのみ放出される。ロット放出基準には、≧７０％の７ＡＡＤ生存率、≧６０％の％ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞純度、＜１０％の％ＣＤ４^－／ＣＤ８^＋細胞、＜１００／３×１０^６個の細胞の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ａｂビーズカウント、「微生物なし」でのグラム染色、＜５ＥＵ／ｋｇのエンドトキシン、無菌性（最終製剤の４８～７２時間前にサンプリング）陰性、マイコプラズマ陰性が含まれる。

臍帯血の探索、選択、製造施設への出荷
ＣＫ０８０１の生成のためにＣｅｌｌｅｎｋｏｓ、Ｉｎｃ．に提供される臍帯血ユニットは、細胞治療認定財団（ＦＡＣＴ）または米国血液バンク協会（ＡＡＢＢ）の最低認定基準を満たす個別に認定されかつ選択された臍帯血バンク（ＣＢＢ）から取得される。適格なＣＢユニットは、認可済みまたは非認可のいずれかに分類でき、事前に決定された資格基準を満たす。

合意時に、対象はＨＬＡタイピング用の血液サンプルを提供する。結果は、臍帯血の探索および選択のプロセスを容易にするために、スポンサーの臨床コーディネーターに提供される。スポンサーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＤＲＢ１遺伝子座の６つの抗原のうち３、４、５、または６でレシピエント（対象）にＨＬＡマッチされる標準探索アルゴリズムに従って、利用可能な臍帯血ユニットを特定し、研究代表者（ＰＩ）にリストが提供される。スポンサーおよびＰＩは、所定の基準に基づいて適切な臍帯血ユニットを選択する。

臍帯血ユニットが選択された後、スポンサーの臨床コーディネーターが出荷と輸送のロジスティクスを手配し、ユニットはＣｅｌｌｅｎｋｏｓのＧＭＰ製造施設に出荷される。製造施設に到着すると、臍帯血ユニットは検査され、チェックインされ、ＣＢのドナー／レシピエントの出荷要求に対して検証される。許容基準（識別、ラベリング、温度を含む）を満たす臍帯血ユニットは、液体窒素、気相貯蔵冷凍庫に≦－１５０℃で－１４日目（製造開始）まで保管され、対象の計画された注入スケジュールと調整される。

注入の前に、スポンサーの臨床コーディネーターと現場臨床チームは、所定の時点および時間枠でＣＫ０８０１の注入を手配する責任がある。ＣＫ０８０１は、最終製剤から８時間以内に投与される必要がある。

スポンサーの臨床コーディネーターはＣＫ０８０１の臨床現場への輸送を手配する。現場の臨床チームは、ＣＫ０８０１の受け取り、受け入れ、準備、および管理を担当する。

製剤化および安定性
ＣＫ０８０１は、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ＋０．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）緩衝液中で最終細胞用量に製剤化される。ＣＫ０８０１の注入は、最終製剤から８時間以内に行われる必要がある。

保管および取り扱い
ＣＫ０８０１は、１５℃～３０℃の温度を維持することが検証された輸送コンテナで臨床現場に輸送され、注入前に１５℃～３０℃に維持される。

毒性
臍帯血由来の制御性Ｔ細胞の注入は安全であることが以前に示されているが、臨床診療の標準に従って、対象はＣＫ０８０１の注入中に監視される必要がある。各注入日のバイタルサインの推奨タイミング：注入前、注入開始後１５分、注入開始後３０分、注入開始後１時間、注入開始後２時間、その後標準的な臨床診療ごと。

バイタルサインには、体温、呼吸、血圧、脈拍が含まれる。

投与経路
ＣＫ０８０１は、中央または末梢ラインを介して、５ｍｌ／分の速度を超えないように投与される。投与後、バッグおよびラインは通常の生理食塩水で繰り返し洗い流される。

ＣＫ０８０１注入
この試験では、３つの異なる用量レベルでのＣＫ０８０１の注入が検討される。標準の３＋３フェーズＩ統計設計が使用される。

コンディショニングやリンパ球枯渇は患者に投与されない。３人の患者は用量レベル１：１×１０^６／ｋｇのＩＢＷで治療される。用量制限毒性（ＤＬＴ）が観察されない場合、用量は用量レベル２：（範囲）次の３人の患者のコホートについて３×１０^６／ｋｇのＩＢＷに段階的に増大される。ＤＬＴが観察されない場合、用量は用量レベル３：（範囲）１×１０^７／ｋｇのＩＢＷに段階的に増大される。

１つのＤＬＴが用量レベルで観察された場合、３人のさらなる患者がそのレベルで治療される。追加のＤＬＴがない場合、その用量レベルがＭＴＤとして定義される。

用量レベル２または３で≧２つのＤＬＴである場合、以前の用量レベルがＭＴＤとして定義される。用量レベル１で≧２つのＤＬＴである場合、データ安全性モニタリング委員会（ＤＳＭＢ）は、研究の継続を検討および評価する。

ＭＴＤは、６人の患者が＜２つのＤＬＴの用量レベルで治療されるときに決定される。

患者は、ＣＫ０８０１の注入の３０分前にジフェンヒドラミン（ベネドリル（登録商標））５０ｍｇのＩＶピギーバック（ＩＶＰＢ）およびアセトアミノフェン６５０ｍｇ（経口）で前投薬される。ＣＫ０８０１は、０．９％の塩化ナトリウム（通常の生理食塩水）ＵＳＰ以外の溶液を含んではならないＩＶラインを介して、１５～３０分間にわたって重力流によって注入される。ＣＫ０８０１は、標準的な血液製剤チューブと互換性がある。フィルターの使用は禁止されている。

研究集団の選
包含基準
１．再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、または骨髄線維症を含む骨髄不全症候群の診断基準を満たす対象。
２．ＣＫ０８０１世代で利用可能なＨＬＡマッチ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１で≧３／６）臍帯血ユニット。
３．対象は１８歳以上である。
４．ビリルビン≦２ｘＵＬＮおよびＳＧＰＴ（ＡＬＴ）≦２ｘＵＬＮ（ジルベール症候群が文書化されている場合を除く）。
５．Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ－Ｇａｕｌｔの式を使用して、＞５０ｍＬ／分のクレアチニンクリアランスを計算した。
６．Ｚｕｂｒｏｄパフォーマンスステータス≦２。
７．出産の可能性のある（ＦＰＣＰ）の女性対象は、尿または血清妊娠検査で陰性でなければならない。注：ＦＰＣＰは閉経前と定義されており、外科的に滅菌されていない。ＦＰＣＰは、最大限に効果的な避妊を使用すること、または研究全体を通して異性間の行為を控えることに同意する必要がある。効果的な避妊法には、子宮内避妊器具、経口および／または注射可能なホルモン、避妊、または２つの適切なバリア方法（例えば、殺精子剤を使用した子宮頸管キャップ、殺精子剤を使用した横隔膜）が含まれる。
８．対象は、研究関連の評価、訪問、長期のフォローアップを含む、プロトコルに必要なすべての手順に従うことに同意している。
９．対象は、インフォームドコンセントを喜んで提供することができる。

除外基準
１．対象は、ＣＫ０８０１注入前の４週間以内に治験薬を受け取った。
２．対象は、ＣＫ０８０１注入前２１日以内に放射線療法または化学療法を受けている。
３．対象は、以前に臍帯血由来の制御性Ｔ細胞療法を受けている。
４．既知のＨＩＶ血清陽性。
５．対象は、制御不能な感染症を患っており、治療７日後に適切な抗菌剤に反応していない。プロトコルＰＩは、適格性の最終的なアービターである。
６．治験責任医師の意見では、患者が高い重度の毒性リスクを負う、および／またはＣＫ０８０１の活性を損なうという、制御されていない併発疾患のある対象。
７．対象は、妊娠中または授乳中である。
８．幹細胞移植によって引き起こされる骨髄不全。
９．同意を提供できない対象、または治験責任医師の意見では、プロトコル要件に完全に準拠する可能性が低い対象。

データ収集
ＣＫ０８０１の注入に関連する治療および毒性データは、最初のＣＫ０８０１注入の日から最後の注入後最大３０日まで収集される。

研究関連の死亡またはその後の代替治療を伴う文書化された疾患の進行を経験する対象は、治療の失敗とみなされ、それ以上のデータ収集なしで、事象の時点で打ち切られた観察として扱われる。インフォームドコンセントを撤回するか、またはコンプライアンス違反のために研究を中止した対象も、その時点で打ち切られる。

結果判定法
主な結果判定法：
１．ＣＴＣＡＥ ｖ４．０によって評価された治療関連の有害事象の参加者数により、有害事象および重篤な有害事象の収集によって骨髄不全に苦しむ対象にＣＫ０８０１を注入することの安全性を評価する
用量制限毒性は、ＣＫ０８０１注入時に各々開始する事象のいずれかを含むように定義される。
・２４時間以内の重度（グレード３または４）の注入毒性（ＮＣＩ－ＣＴＣＡＥ Ｖ４．０）
・３０日以内のレジメン関連の死亡
・３０日以内の重度（グレード３または４）のサイトカイン放出症候群
［時間枠：注入から３０日］
二次結果判定法：
２．治療に対する疾患特異的応答および応答の期間の予備評価
［時間枠：１２ヶ月］
他の事前に指定された結果判定法：
３．骨髄（ＢＭ）免疫再構成および炎症性サイトカインを評価する
骨髄のサンプルは、ベースラインで採取され、治療後の設定でスケジュールされたフォローアップが行われ、免疫再構成および炎症性サイトカインが分析される
［時間枠：１２ヶ月］
４．末梢血（ＰＢ）の免疫再構築および炎症性サイトカインを評価する
末梢血は、ベースラインで採取され、治療後の設定でスケジュールされたフォローアップが行われ、免疫再構成および炎症性サイトカインが分析される
［時間枠：１２ヶ月］

骨髄不全（ＢＭＦ）を有する患者における同種臍帯血由来Ｔｒｅｇ細胞の第１相臨床試験の結果
試験設計の概略図を図４１に示す。相関研究のタイミングを下の表に示す。図２８は、骨髄不全を患っている対象におけるＣＫ０８０１の第１相臨床試験が初期の有効性シグナルを示すのに失敗したことを示す。

図４２は、第１相臨床試験において治療を受けている対象の説明を提供する。臨床データの要約を図４３および図４４に示す。

コホートＩ
患者１の治療歴を図４５に示す。患者は、原発性骨髄線維症と診断された６３歳の男性である。患者は、１×１０^６個のＴｒｅｇ細胞／ｋｇ（６７００万個の細胞）で治療され、１７分かけて注入された。患者は、ルキソリチニブ２０ｍｇのＰＯ（経口）ＢＩＤ（１日２回）も受けた。患者の臨床データを図４６Ａおよび図４６Ｂに示す。炎症性サイトカインレベルを図４７および図４８に示す。患者は、ＳＤＦ１α－ＣＸＣＲ４軸（図４８）と相関するＪＡＫ２突然変異負荷（図４６Ｂ）および脾腫（図４９）の減少を示した。Ｔｒｅｇ細胞投与前（ＰＲＥ）および投与後（ＰＯＳＴ）の患者の骨髄評価を以下の表に示す。

患者２の治療歴を図５０に示す。患者は、青年および若年成人（ＡＹＡ）における骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）と診断された４６歳の女性である。患者は１×１０^６個のＴｒｅｇ細胞／ｋｇ（６０００万個の細胞）で治療され、２０分かけて注入された。患者は、ルキソリチニブ２０ｍｇのＰＯ（経口）ＢＩＤ（１日２回）も受けた。炎症性サイトカインレベルを図５１に示す。Ｔｒｅｇ細胞投与前（ＰＲＥ）および投与後（ＰＯＳＴ）の患者の骨髄評価を以下の表に示す。

患者３は後天性再生不良性貧血と診断された１９歳の女性で、輸血に依存している。患者は１×１０^６個のＴｒｅｇ細胞／ｋｇ（５０００万個の細胞）で治療され、２５分かけて注入された。患者はエルトロンボパグおよびシクロスポリン（ＣＳＡ）も服用していた。時間の経過に伴う患者のＴＰＯレベルを図５２に示す。経時的な患者の血小板輸血の必要量を図５３に示す。経時的な患者のＰＲＢＣ（濃厚赤血球）輸血の必要量を図５４に示す。Ｔｒｅｇ細胞投与前（ＰＲＥ）および投与後（ＰＯＳＴ）の患者の骨髄評価を以下の表に示す。

コホートＩＩ
患者４は特発性の重度の再生不良性貧血と診断された２９歳の男性である。患者は３×１０^６個のＴｒｅｇ細胞／ｋｇで治療された。患者は、ｈＡＴＧ＋ＣＳＡ＋ステロイド＋ｅｌｔｏｍｂｏｐａｇ＋Ｐｅｇ－ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍも使用していた。経時的な患者の血小板輸血の必要量を図５５に示す。経時的な患者のＰＲＢＣ（濃厚赤血球）輸血の必要量を図５６に示す。Ｔｒｅｇ細胞投与前（ＰＲＥ）および投与後（ＰＯＳＴ）の患者の骨髄評価を以下の表に示す。

患者５は、原発性骨髄線維症（本態性血小板血症（ＥＴ））と診断された６２歳の女性である。患者は３×１０^６個のＴｒｅｇ細胞／ｋｇで治療された。Ｔｒｅｇ細胞投与前（ＰＲＥ）および投与後（ＰＯＳＴ）の患者の骨髄評価を以下の表に示す。

患者６は、原発性骨髄線維症（グレード２、低細胞性輸血依存性）と診断された７４歳の男性である。患者はＬＣＬ－１６１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、バーゼル、スイス）による治療に失敗した。患者は３×１０^６個のＴｒｅｇ細胞／ｋｇで治療された。経時的な患者の血小板輸血の必要量を図５７に示す。経時的な患者のＰＲＢＣ（濃厚赤血球）輸血の必要量を図５８に示す。Ｔｒｅｇ細胞投与前（ＰＲＥ）および投与後（ＰＯＳＴ）の患者の骨髄評価を以下の表に示す。

結論
●コホート１（用量＝１×１０^６個の細胞／ｋｇ）およびコホート２（用量＝３×１０^６個の細胞／ｋｇ）で治療された６人の患者においてＳＡＥは観察されなかった。
●患者＃１のＪＡＫ２変異対立遺伝子の改善。応答の耐久性＝６ヶ月
●患者＃２のＭＰＮスコアの改善。応答の耐久性４ヶ月
●患者＃３の赤血球と血小板の輸血要件の改善。応答の耐久性４週間
●患者＃４の赤血球および血小板輸血の改善。応答の耐久性４週間
●患者＃５の慢性疼痛の改善。耐久性４週間
●患者＃６の赤血球および血小板輸血の改善。４週間で実施された評価
●患者＃１、＃２の骨髄細胞性の改善
●患者＃３、＃４の骨髄異形成の改善
●患者＃４（安定）を除くすべての場合に、Ｍ：Ｅ比が減少する

実施例７：治療抵抗性ギランバレー症候群の治療における臍帯血由来の制御性Ｔ細胞を投与するための安全性および有効性の評価
この研究では、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）を有する患者にＣＫ０８０１（臍帯血由来の制御性Ｔ細胞産物）を投与することが安全で実用的かどうかを調べる。さらに、安全に投与するのに安全な可能な限り最高の用量が決定される。同様に、この研究では、ＣＫ０８０１がＧＢＳの症状を改善し得るかどうかも調べる。

標的層
この研究の標的集団は、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）治療または血漿交換による標準治療に対して応答しない患者である。

登録
最大１８人の成人患者（１８～７０歳）が登録される。

適格性
包含基準：
１．対象はギランバレー症候群（ＧＢＳ）についての診断基準を満たしている。
２．ＣＫ０８０１世代で利用可能なＨＬＡマッチ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１で≧３／６）臍帯血ユニット。
３．１８～７０歳の対象。
４．対象は、ＧＢＳ障害スケールスコア４を有し、ＩＶＩＧまたはＰＥ治療の１週間後も変化していない。
５．対象は、ＣＫ０８０１注入の≧４週間前にＩＶＩＧ／ＰＥ治療を完了している。
６．対象は、プレゼンテーションの時点で≧７のエラスムスＧＢＳ結果スコア（ｍＥＧＯＳスコア）を変更し、ＩＶＩＧまたはＰＥ治療の１週間後には変わらなかった。
７．≦２ｘＵＬＮのビリルビンおよび≦２ｘＵＬＮのＡＬＴ（ジルベール症候群を除く）。
８．１８～７０歳の成人患者についてのＣｏｃｋｒｏｆｔ－Ｇａｕｌｔ方程式を使用して、＞５０ｍＬ／分のクレアチニンクリアランスを計算した。
９．出産の可能性のある（ＦＰＣＰ）の女性対象は、尿または血清妊娠検査で陰性でなければならない。注：ＦＰＣＰは閉経前と定義されており、外科的に滅菌されていない。ＦＰＣＰは、最大限に効果的な避妊を使用すること、または研究全体を通して異性間の行為を控えることに同意する必要がある。効果的な避妊法には、子宮内避妊器具、経口および／または注射可能なホルモン、避妊、または２つの適切なバリア方法（例えば、殺精子剤を使用した子宮頸管キャップ、殺精子剤を使用した横隔膜）が含まれる。
１０．対象は、研究関連の評価、訪問、長期のフォローアップを含む、プロトコルに必要なすべての手順に従うことに同意している。
１１．対象は、書面によるインフォームドコンセントを喜んで提供することができる。対象が疾患関連の合併症（例えば、上肢麻痺）のために一時的に合意書に署名できない場合、法的に認可された代表者（ＬＡＲ）が使用される。対象は、可能になり次第同意書に署名する。

除外基準：
１．対象は、ＣＫ０８０１注入前４週間以内に免疫療法、化学療法、生物学的または治験薬を投与された。
２．対象は、以前にＣＢ Ｔｒｅｇ療法を受けている。
３．対象は、制御不能な感染症を有しており、治療７日後に適切な抗菌剤に応答していない。プロトコルＰＩは、適格性の最終的なアービターである。
４．対象は、生ウイルス（例えば、はしか、おたふく風邪、風疹、水痘）のワクチン接種を受けている。
５．対象は妊娠中または授乳中である。
６．ＨＩＶ血清陽性
７．同意を提供できない対象、または治験責任医師の意見では、プロトコル要件に完全に準拠する可能性が低い対象。

群および介入

投薬（フェーズＩ３＋３）
この研究では、ＣＫ０８０１を３回投与する。各用量レベルで最低３人の患者が治療される。患者が受ける用量は、各用量レベルが完了した後、次の患者が次に最も高い用量レベルを受け取るため、研究に入るタイミングに依存する。
●投与量レベル１：ＣＫ０８０１ ＩＶ １×１０^６／ｋｇ理想体重
●投与量レベル２：ＣＫ０８０１ ＩＶ ３×１０^６／ｋｇ理想体重
●投与量レベル３：ＣＫ０８０１ ＩＶ １×１０^７／ｋｇ理想体重

プライマリーエンドポイント
この研究のプライマリーエンドポイントは、用量制限毒性である。
●２４時間以内に重度（グレード３または４）の注入毒性。
●３０日以内に重度（グレード３または４）のサイトカイン放出症候群。
●３０日以内のレジメン関連死亡

結果判定法
主な結果判定法：
１．有害事象および重篤な有害事象の数を収集して、免疫グロブリン静注による標準治療に応答しないギランバレー症候群（ＧＢＳ）患者にＣＫ０８０１を注入することの安全性の予備評価を提供する。
［時間枠：注入から３０日］
２．用量制限毒性は、以下の事象（各々ＣＫ０８０１注入時に開始する）のいずれかを含むように定義される。
・２４時間以内の重度（グレード３または４）の注入毒性（ＮＣＩ－ＣＴＣＡＥ Ｖ４．０）
・３０日以内のレジメン関連の死亡、
・３０日以内に重度（グレード３または４）のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）
［時間枠：注入から３０日］
他の事前に指定された結果測定：
３．ＣＫ０８０１注入後の末梢血（ＰＢ）プロファイリングの評価０日目のＣＫ０８０１の注入により、患者の末梢血特性に変化が生じたかどうかの評価
［時間枠：スクリーニング、０日目および１週目、２週目、４週目、１２週目、２４週目］
４．ＣＫ０８０１注入後の末梢血炎症性サイトカインの評価
０日目のＣＫ０８０１の注入により、患者が末梢血に炎症性サイトカインを発症したかどうかの評価
［時間枠：スクリーニング、０日目および１週目、２週目、４週目、１２週目、２４週目］
５．ＧＢＳ障害スコアの潜在的な変化の評価（質問票）
健康状態（０）から死亡（６）までの範囲の７つの障害スコアを評価する質問票
［時間枠：スクリーニング、０日目および１週目、２週目、４週目、１２週目、２４週目］
６．全体的なニューロパチー制限スケール（ＯＮＬＳ）の潜在的な変化の評価（質問票）
全体的なニューロパチー制限尺度（ＯＮＬＳ）は、通常の日常活動を行う際の患者の腕の症状（しびれ、うずき、脱力感）および脚（歩く、走る、歩行の変化、車椅子の必要性）を決定する質問票である。腕のスケールは０（通常）から５（両腕の障害がすべての意図的な動きを妨げる）であり、脚のスケールは０（歩行／階段を上る／走行に影響されない）から７（ほとんど一日中車椅子またはベッドに制限され、脚の意図的な動きが何もできない）である。
［時間枠：スクリーニング、０日目および１週目、２週目、４週目、１２週目、２４週目］
７．Ｒａｓｃｈにより構築された全体的な障害スケールの潜在的な変化の評価（質問票）
日常活動と患者さんの健康との関係を測る質問票。スコアは０～２であり、０＝活動を実行できない、２＝活動を実行しやすい。アンケートには、屋内または屋外での歩行、上半身または下半身の洗浄、着替え、食事、食器洗い、買い物などの活動が含まれる。全体的な合計生スコアは１～４８であり、これは０～１００の中心小体メトリックと相関する。
［時間枠：スクリーニング、０日目および１週目、２週目、４週目、１２週目、２４週目］
８．ＭＲＣ（医学研究審議会）の合計スコアの潜在的な変化の評価（質問票）
ＭＲＣ合計スコアは、肩外転筋、肘屈筋、手首伸筋、膝伸筋、および両側の足背屈筋を含む６つの筋肉グループのＭＲＣスコアの合計であり、６０（正常）から０（四肢麻痺）の範囲である。
［時間枠：スクリーニング、０日目および１週目、２週目、４週目、１２週目、２４週目］
９．Ｒａｓｃｈにより構築されたＭＲＣモデルの潜在的な変更の評価（アンケート）
ＭＲＣ合計スコアは、肩外転筋、肘屈筋、手首伸筋、膝伸筋、および両側の足背屈筋を含む６つの筋肉グループのＭＲＣスコアの合計であり、４８（正常）から０（四肢麻痺）の範囲である。
［時間枠：スクリーニング、０日目および１週目、２週目、４週目、１２週目、２４週目］
１０．倦怠感重症度尺度（ＦＳＳ）の潜在的な変化の評価（質問票）
倦怠感に関連する活動を９（倦怠感の兆候なし）から６３（倦怠感を最も無効にする）のスケールで測る質問票
［時間枠：スクリーニング、０日目および１週目、２週目、４週目、１２週目、２４週目］
１１．Ｒａｓｃｈにより構築された倦怠感重症度尺度（ＲＦＳＳ）の潜在的な変化の評価（質問票）
倦怠感に関連する活動を０（倦怠感の兆候なし）から２１（倦怠感を最も無効にする）のスケールで測定する質問票
［時間枠：スクリーニング、０日目および１週目、２週目、４週目、１２週目、２４週目］
１２．ＥｕｒｏＱｏｌ Ｅ－５Ｄ健康質問票の潜在的な変化の評価（質問票）
ＥｕｒｏＱｏｌ Ｅ－５Ｄ健康質問票は、患者の可動性、セルフケア活動、他の通常の活動（家事、余暇活動など）、痛み／不快感のレベル、および不安／うつ病を試験するための確認される簡単な健康質問票である。スケールは０（患者が想像できる最悪の健康）から１００（患者が想像できる最高の健康）である。
［時間枠：スクリーニング、０日目および１週目、２週目、４週目、１２週目、２４週目］
１３．フォームＡのエントリー質問票とフォローアップ質問票のフォームＢ（第１週目および第２週目の質問票）の比較に基づく患者の状態の潜在的な変化の評価（質問票）
エントリー質問票は、呼吸または可動性に影響を与える併存疾患、ＧＢＳを患う他の家族、先行事象（例えば、風邪、胃腸炎）、痛みの種類（例えば、筋肉痛、関節痛、神経因性疼痛）、痛みの場所、腕または脚の衰弱、反射の状態、感覚障害、運動失調、強制肺活量を含む患者の全体的な状態のスクリーニングレベルベースラインを確立する。このフォームにより、ユーザは、患者が換気を必要とするか、６ヶ月以内に歩くことができるかを予測することができる。
［時間枠：スクリーニング、０日目および１週目、および２週目］
１４．フォームＡのエントリー質問票とフォローアップ質問票のフォームＢ（４週目、１２週目、および２４週目の質問票）の比較に基づく患者の状態の潜在的な変化の評価（質問票）
このフォーム（質問票）は、エントリー質問票と同じ情報を使用して、登録以降の患者の状態の変化を文書化するメカニズムを提供する。
［時間枠：スクリーニング、０日目および１週目、２週目、４週目、１２週目、２４週目］
１５．フォームＡのエントリー質問票とフォローアップ質問票のフォームＣ（１週目、２週目、４週目、１２週目、および２４週目の質問票）の比較に基づく患者の状態の潜在的な変化の評価（質問票）
このフォーム（質問票）は、エントリー質問票と同じ情報を使用して、登録以降の患者の状態の変化を文書化するメカニズムを提供する。
［時間枠：スクリーニング、０日目および１週目、２週目、４週目、１２週目、２４週目］
１６．フォームＡのエントリー質問票とフォローアップ質問票のフォームＴ（１週目、２週目、４週目、１２週目、および２４週目の質問票）の比較に基づく患者の状態の潜在的な変化の評価（質問票）
このフォーム（質問票）は、エントリー質問票と同じ情報を使用して、登録以降の患者の状態の変化を文書化するメカニズムを提供する。
［時間枠：スクリーニング、０日目および１週目、２週目、４週目、１２週目、２４週目］

実施例８：後天性特発性再生不良性貧血および低形成性骨髄異形成症候群の治療における臍帯血由来制御性Ｔ細胞の投与の安全性および有効性の評価
標的集団
この研究の標的集団は、同胞ドナーの造血幹細胞移植（ＭＳＤ ＨＳＣＴ）に不適格であるか、または免疫抑制療法（ＩＳＴ）への応答が悪いと予測される患者である。

登録
最大１８人の成人患者が登録される。

投薬
●用量レベル１：ＣＫ０８０２．ＣＸＣＲ４ ＩＶ １×１０^８個の細胞
●用量レベル２：ＣＫ０８０２．ＣＸＣＲ４ ＩＶ ３×１０^８個の細胞

プライマリーエンドポイント
この研究のプライマリーエンドポイントは、注入反応であるサイトカイン放出症候群までの時間、および／または３０日以内の死亡である。

セカンダリーエンドポイント
この研究のセカンダリーエンドポイントは、血液学的改善である。

実施例９：筋萎縮性側索硬化症の治療における臍帯血由来制御性Ｔ細胞の投与の安全性および有効性の評価
標的集団
・後天性ＡＬＳの成人ＡＬＳ患者（≧１８歳）
・インフォームドコンセントを提供する能力
・発症が≦２年の被験者
・≧６０％の努力性肺活量が予測される
・対象の合計ＡＬＳＦＲＳ－Ｒスコアが≧２４で、尺度の１２項目すべてで少なくとも２ポイントのスコアがある。
・発症からスクリーニングまでの進行が０．３ポイント／月を超える患者

登録
５２人の成人患者。

治験薬
ＣＫ０８０２．ＣＤ１１ａ（ＣＤ１１ａが豊富な凍結保存、複数回投与、臍帯血由来の制御性Ｔ細胞）

投薬
誘導：以下の用量レベルでの毎週のＩＶ ＣＫ０８０２．ＣＤ１１ａ用量×４
●コホート１：ＣＫ０８０２．ＣＤ１１ａ ＩＶ １×１０^８個のＴｒｅｇ細胞
●コホート２：ＣＫ０８０２．ＣＤ１１ａ ＩＶ ３×１０^８個のＴｒｅｇ細胞

維持：両方のコホートに対して４週間ごとに６回の追加投与
群および介入

治療のタイムラインを図２６に示す。
フェーズＩＢ：
主要目的
○安全性および忍容性
＊ＣＴＣＡＥ ｖ４．０３（ＡＥ、ＳＡＥ、ＤＬＴ）に基づく治療関連の有害事象
二次的目的
○効能
＊改訂されたＡＬＳ機能評価尺度（ＡＬＳＦＲＳ－Ｒ）
＊努力性肺活量（ＦＶＣ）
＊筋力のためのハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）
○探索
＊炎症性バイオマーカーおよび免疫再構築

エンドポイントの調査
臨床応答：
１．改訂されたＡＬＳ機能評価尺度（ＡＬＳＦＲＳ－Ｒ）に関して６ヶ月間にわたって６ポイント改善された。
２．機能状態の変化率
３．筋萎縮性側索硬化症機能評価尺度（ＡＬＳＦＲＳ－Ｒ）スコアの傾きの変化
４．努力性肺活量（ＦＶＣ）の変化、および
５．筋力の変化

ＡＬＳＦＲレスポンダー分析（治療前と比較して治療後に改善した対象の割合）
・事前に指定されたレスポンダー分析では、治療前の勾配と比較した治療後のＡＬＳＦＲＳ－Ｒ勾配における１ヶ月あたりの改善率および絶対点の改善の両方を調べる。
・２５％、５０％、７５％、１００％の改善に対する患者の評価。
・臨床的に意味がある＝２５％
・有意に臨床的に意味がある＝５０％
フィッシャーの正確確率検定を使用して、片側ｐ値＜０．０５として定義された統計的有意性。
４、８、１２、１６、２４週目に実行される評価

臨床試験設計：フェーズＩｂ臨床試験
研究設計：
・この試験は、ＣＫ０８０２．ＣＤ１１ａの第Ｉ相、３＋３試験設計、単回漸増用量、安全性、忍容性になる。
・固定用量戦略は、２つの用量レベルを試験する。
＊低用量：１×１０^８個の細胞；
＊高用量：３×１０^８個の細胞；
最小６人の患者および最大１２人の患者がこの試験に登録される。
１２人の対象のコホートは、合計（最小）患者＝１２人で上記の表に示されているように、シーケンスごとに３人の対象がいる３つの治療シーケンスのうちの１つにランダム化される。

臨床試験設計：探索的研究。
・末梢血
・Ｔ細胞コンパートメント：Ｔｒｅｇ、エフェクターＴ細胞、抗ウイルス活性
・炎症性サイトカインの血清：インターロイキン（ＩＬ）１、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８
・インターフェロンガンマ、ＳＴ２、ＲＥＧ３ａ、ＯＰＮ、フォリスタチン、エラフィン、ＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦＲ－１
・Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）
・マクロファージ走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）
・８－ヒドロキシ－２’－デオキシグアノシン（８－ＯＨｄＧ）
・マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）
・比率：グルタチオンジスルフィド、ＧＳＳＧ／還元型グルタチオン、ＧＳＨ
追加の探索的サイトカイン：ＳＣＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ１ａ、ＭＣＰ１、ＭＣＰ２、ＴＡＲＣ、ＭＩＰ３ａ、ＴＥＣＫ、ＣＴＡＣＫ、ＣＣＬ２８、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＴＬＲ
・脳脊髄液
・リン酸化ニューロフィラメント重鎖（ｐＮＦＨ）
・Ｃｈｉｔ－１
・プロスタグランジンＥ２
・ＶＥＧＦ
・ＩＬ－６
・ＧＭＣＳＦ
・ＩＬ－２、ＩＬ－８、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７
・ＭＩＰ－１β
・ＦＧＦ
・Ｇ－ＣＳＦ
・ＭＩＰ－１α
・ＭＣＰ－１
・ＩＦＮ－γ
・Ｘ線検査
・インビボで測定されたグリア活性化［^１１Ｃ］－ＰＢＲ２８ＰＥＴは、ＡＬＳを有する人々における病理学的に関連する領域で増加し、臨床測定値と相関している。（Ａｌｓｈｉｋｈｏ，ＡＮＮ ＮＥＵＲＯＬ ２０１８）
・統合されたＰＥＴ－ＭＲおよび^１Ｈ－ＭＲＳイメージングは、ニューロンの完全性および神経炎症のマーカー間の関連性を示し、ＡＬＳにおける疾患メカニズムへの貴重な洞察を提供する可能性がある。（Ｒａｔａｉ，ＮｅｕｒｏＩｍａｇｅ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ ２０（２０１８）３５７－３６４）

実施例１０：ＣＯＶＩＤ－１９（コロナウイルス病）媒介性急性呼吸窮迫症候群（ＣｏＶ－ＡＲＤＳ）の治療における臍帯血由来制御性Ｔ細胞投与の安全性と有効性の評価
ＣｏＶ－ＡＲＤＳの治療のための凍結保存された複数回投与臍帯血由来制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞（ＣＫ０８０２）のフェーズＩＢ／ＩＩａ試験の臨床試験設計を図２７に示す。３つの治療群：治療群１：プラセボ。治療群２：１×１０^８個のＣＫ０８０２細胞；治療群３：３×１０^８個のＣＫ０８０２細胞がある。投薬レジメンは、０日目、３日目（＋／－１）および７日目（＋／－１）に注入される３回の用量である。ＣＫ０８０２は静脈内投与される。研究対象集団は、ＣＯＶＩＤ－１９によって誘発された中等度から重度の急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の挿管された成人である。最小１５人の患者および最大４５人の患者が登録される。

目的
主要目的
このプロトコルの目的は、バンクコード血液ユニット（ＣＫ０８０２）から増殖された制御性Ｔ細胞注入が、ＣＯＶＩＤ－１９感染に続発する中等度から重度のＡＲＤＳに苦しむ挿管患者の罹患率および死亡率を安全に減少させることができるかどうかを判定することである。

エンドポイントおよび相関性
プライマリーエンドポイント
２つの主な結果は次のようになる
●ＣＫ０８０２注入から４８時間以内のレジメン関連の重度の≧グレード３の毒性（ＮＣＩ－ＣＴＣＡＥ（米国国立がん研究所の有害事象共通用語基準）Ｖ４．０）
●２８日間の成功治療、Ｓ２８＝［最初の注入日から２８日後に挿管されていない状態で生存している］と定義される。

セカンダリーエンドポイント
最初の注入日から、最初の注入日から最大２８日までに記録された二次転帰には、次のものが含まれる。
●抜管までの時間
●酸素化要求量（ＰａＯ２：ＦｉＯ２比）は０日目から＋１１日目までの間で変化する
●人工呼吸器のない日数
●臓器不全のない日数
●最初の２８日間のＩＣＵにいない日数
●２８日間の全死因死亡率

計画された非エンドポイント相関性分析
実験室の相関関係および一般的な評価０、３、７、１１、２１、２８日目
●Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｏｒｇａｎ Ｆａｉｌｕｒｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＳＯＦＡ）スコア［Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，１９９６．２２（７）：ｐ．７０７－１０］
●炎症マーカー：血清フェリチン、プロカルシトニン、Ｄ－ダイマーおよびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）
●末梢血リンパ球サブセット分析
●人工呼吸器ステータスパラメータ（挿管されている場合）およびＡＢＧ（利用可能な場合）

調査産物
ＣＫ０８０２（凍結保存された臍帯血由来の制御性Ｔ細胞）は、凍結保存され、ＡＲＤＳの治療のための静脈内注入として使用する準備ができている同種異系の既製の制御性Ｔ細胞を指す。

ソースおよび薬理学
Ｔｒｅｇは、事前に決定された選択基準に基づいて、資格のある公的な、認可済みの、または認可されていない米国のＣＢバンクから得られる同種異系の無関係な臍帯血（ＣＢ）ユニットから分離される。ＣＢユニットは、洗浄液として１０％のデキストラン４０および５％のヒト血清アルブミンを使用して、３７℃のウォーターバス中で標準的な手順に従って解凍および処理される。ＣＢ細胞は、凝集を防ぐために免疫磁気選択の前に、ＭｇＣｌ_２ｒＨｕＤＮＡｓｅ／クエン酸ナトリウムカクテル中に再懸濁される。ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の濃縮は、直接コンジュゲートした抗ＣＤ２５磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＭＡＣＳ分離デバイスを使用したポジティブ選択によって達成される。選択後、ＣＤ２５＋細胞を、ＧＲＥＸフラスコ内で、１０％のヒトＡＢ血清（熱不活化；Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）で懸濁された－ＶＩＶＯ１５媒体（Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）において約１×１０^６個の細胞／ｍＬの濃度で懸濁する。ＣＤ２５＋細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）被覆Ｄｙｎａｂｅａｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、ビーズと細胞の比率が１：１で１４±１日間培養される。０日目に、培養物に、１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を補充する。細胞は、１．０×１０６個の生存有核細胞／ｍＬの密度で維持され、３７℃で５％のＣＯ_２中で１４日間培養される。

培養１４日目に、細胞を回収し、Ｄｙｎａｂｅａｄを磁気分離により除去し、Ｔｒｅｇ細胞をＰｌａｓｍａｌｙｔｅ＋０．５％Ｉ緩衝液中に再懸濁する。Ｔｒｅｇ産物（ＣＫ０８０２）は、注入の放出基準に合格する必要があり、以下が含まれる：≧７０％の７ＡＡＤ生存率、純度≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞、＜１０％のＣＤ４^－／ＣＤ８^＋細胞、３×１０^６細胞あたり＜１００の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ｍＡＢビーズカウント、「生物なし」でのグラム染色、および＜５ＥＵ／ｋｇのエンドトキシン。

次いで、採取した細胞を、臨床用クライオバッグに分注し、制御された速度の冷凍庫を使用して凍結保存し、細胞用量を含むＣＫ０８０２産物としてラベル付けする。

ＣＫ０８０２注入
この試験では、ＣＫ０８０２用量レベル１＝１．０×１０^８個の細胞および用量レベル２：３．０×１０^８個の細胞の注入を検討する。患者は、ＣＫ０８０２の注入の３０分前に５０ｍｇのベネドリル（登録商標）をＩＶＰＢ（ＩＶピギーバック）で事前に投薬される。ＣＫ０８０２は、重力によって、少なくとも３０分間にわたって、好ましくは１時間以内に注入される必要がある。ＣＫ０８０２は、標準的な血液製剤のチューブおよびフィルターと互換性がある。

プラセボ注入
３０ｍｌのクライオバッグ中への凍結保存された賦形剤を注入。患者は、プラセボの注入の３０分前にベネドリル（登録商標）５０ｍｇをＩＶＰＢ（ＩＶピギーバック）で事前に投薬される。プラセボは、重力によって、３０分以内に、好ましくは解凍後１時間以内に注入される必要がある。プラセボは、標準的な血液製剤のチューブおよびフィルターと互換性がある。

調査対象集団
この研究では、以下に詳述する包含／除外基準のすべてを満たす対象を募集する。

包含基準
１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のＲＴ－ＰＣＲベースの診断を有することが文書化される。
２．ベルリン基準で定義されている中等度から重度のＡＲＤＳ［Ｆｏｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ，２０１２．３０７（２３）：ｐ．２５２６－３３］：＞５ｃｍＨ２Ｏの呼気終末陽圧（ＰＥＥＰ）で評価された２００ｍｍＨｇ以下の吸入酸素濃度（ＦｉＯ２）に対する動脈酸素分圧（ＰａＯ２）の比率。
３．１２０時間未満の挿管
４．≧１８歳
５．インフォームドコンセントを提供する能力またはインフォームドコンセントを提供する権限を有する正式に任命されたヘルスケア代理人

除外基準
１．研究者の意見では、スクリーニングから４８時間以上生存する可能性は低い。
２．研究調査員の意見では、研究の結果を混乱させるか、または研究への参加によって患者に追加のリスクをもたらす可能性のある、身体検査の所見および／または病気の病歴。
３．体外式膜型人工肺（ＥＣＭＯ）または高頻度振動換気（ＨＦＯＶ）を、現在受けている
４．妊娠中の女性
５．研究者の意見では、ＣＫ０８０２治療の安全性に影響を与える可能性がある、治療登録開始時に活動性細菌血症または同時に活動性の中等度から重度の他の感染症を有する患者。
６．＞１２０時間挿管された患者
７．ＤＭＳＯまたはブタもしくはウシタンパク質に対する既知の過敏症
８．治験責任医師の意見では、ＣＫ０８０２治療の安全性に影響を与える可能性のある、末期臓器疾患
９．ステロイドはリンパ溶解性であり、注入されたＴｒｅｇ細胞に有害である可能性がある。ストレス用量以上のステロイド療法は除外される：６時間ごとに５０ｍｇを超えるヒドロコルチゾン、または０．５ｍｇ／ｋｇ／日を超えるメチルプレドニゾロンを静脈内投与するかもしくは６０ｍｇを超えるメチルプレドニゾロンを毎日経口投与する他の全身ステロイド。
１０．治験用細胞治療薬の投与

研究中の評価
臨床評価
割り当てられた治療群の最初の用量の注入日のベースライン評価：ＣＫ０８０２またはプラセボ、その後、割り当てられた治療群の最初の用量の注入後１４日間のその後の毎日の評価：ＣＫ０８０２またはプラセボ。

換気パラメータ：
範囲（最小値および最大値）を使用した１日の平均記録
・プラトー圧力
・一回呼吸量
・平均気道内圧
・ＦｉＯ２
・ＰＥＥＰ
・ＰａＯ２／ＦｉＯ２比
・Ｃ－ＳＴＡＴ／コンプライアンス（肺の静的コンプライアンス）

動脈血ガス：
範囲（最小値および最大値）を使用した１日の平均記録
・動脈のｐＨ
・酸素分圧（ＰａＯ２）
・二酸化炭素の分圧（ＰａＣＯ２）
・重炭酸塩（ＨＣＯ３）
・酸素飽和度（Ｏ_２Ｓａｔ）

バイタルサイン：
範囲（最小値および最大値）を使用した１日の平均記録
・体温
・血圧（ＢＰ）：収縮期および拡張期のＢＰ測定値
・呼吸数
・心拍数

ＳＯＦＡスコア
Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｏｒｇａｎ Ｆａｉｌｕｒｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＳＯＦＡ）スコアは、検査結果および臨床データに基づいてＩＣＵの死亡率を予測する。

ＳＯＦＡスコア

実施例１１：臍帯血由来の制御性Ｔ細胞の細胞抑制活性に対する凍結保存の効果
凍結保存された臍帯血（ＣＢ）Ｔｒｅｇ細胞（ＣＫ０８０２）は、新鮮なＣＢ Ｔｒｅｇ細胞と比較して、同等の抑制機能を有することが示された。Ｔｃｏｎ細胞は、ポジティブコントロール群でのＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット色素の連続希釈によって明らかであるように、共刺激ＣＤ３／２８ビーズの存在下で高い増殖率を示し（図５Ａ）、ＣＤ３／２８ビーズの非存在下でのネガティブコントロール群ではそのような増殖は捕捉されなかった（図５Ｂ）。増殖したＣＢ Ｔｒｅｇ細胞は、新鮮な培養物に由来するか（図５Ｃ）、凍結保存されたアリコートから解凍されたか（図５Ｄ）であり、増殖するＴｃｏｎ細胞の同程度の抑制は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット染料の希釈の不足によって示された。

実施例１２：臍帯血由来の制御性Ｔ細胞の活性に対するルキソリチニブの効果
ルキソリチニブは、インビトロおよびインビボの両方で臍帯血由来のＴｒｅｇ細胞機能を改善した。以前の報告では、患者のＴｒｅｇ細胞に対するルキソリチニブの悪影響が説明されていたため、これらの所見は予想外であった。

図３１に示されるように、解凍された凍結保存された臍帯血（ＣＢ）Ｔｒｅｇ細胞へのルキソリチニブの添加は、インビトロでのＴｒｅｇ細胞の抑制機能を回復させた。解凍したＣＢ Ｔｒｅｇ細胞を二次培養に入れると、Ｔｒｅｇ細胞は時間経過とともに抑制機能を失う。ルキソリチニブの添加により抑制機能を回復させることができる。

ルキソリチニブおよびＣＢ Ｔｒｅｇ細胞は、病原性ループス細胞由来のインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の放出を抑制する相乗効果を示す。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ－ＰＢＭＣ）を有する被験者に由来する末梢血単核細胞は、高レベルの炎症性サイトカインＩＦＮγを分泌する。ＩＦＮ－γのレベルは、ルキソリチニブまたはＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の添加によって減少する。しかし、一緒に加えると、ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞およびルキソリチニブの組み合わせは、ＳＬＥ－ＰＢＭＣ由来のＩＦＮγの放出を相乗的に抑制する（図３２）。カンプトテシンは、非特異的な炎症性刺激がＣＢ Ｔｒｅｇ細胞由来のＩＦＮγ分泌を増加させないことを示すためのコントロールとして使用される。

異種マウス移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルは、図３３に示すように、ルキソリチニブおよび活性化ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞レジメンで治療された。ＮＳＧマウスは、－１日目に亜致死的照射を受け、続いて０日目に１×１０^７個のドナー末梢血（ＰＢ）単核細胞（ＭＮＣ）を注射された。１日１ｍｇの経口ルキソリチニブを、１×１０^７個のＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の存在下または非存在下でマウスに継続的に与え、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でタグ付けし、＋４、＋７、＋１１、＋１８日目に投与した。マウスを、体重、ＧＶＨＤスコア、生存率について１日おきに追跡した。細胞コンパートメントおよびサイトカインアッセイを分析するために、連続採血を行った。

併用治療は、マウスモデルにおいてＧＶＨＤスコアを低下させ（図３４Ａ）、生存率を改善した（図３４Ｂ）。ルキソリチニブは、マウスモデルにおけるＣＢ Ｔｒｅｇの持続性を改善した（図３５Ａ～図３５Ｃ）。ルキソリチニブは、単剤として、およびＣＢ Ｔｒｅｇ細胞と組み合わせて、ヒト細胞の数を減少させた（図３５Ａ）。ルキソリチニブは、ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞と組み合わせて投与された場合、ＣＤ４およびＣＤ２５共発現細胞の割合を増加させた（図３５Ｂ）。ルキソリチニブは、単独で投与されたＣＢ Ｔｒｅｇ細胞と比較して、ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞と組み合わせて投与された場合、循環ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の割合を増加させた（図３５Ｃ）。

ルキソリチニブは、ＩＬ－７およびＩＬ－１５の生存シグナル経路を強化し、異種マウスＧＶＨＤモデルのＣＢ Ｔｒｅｇ細胞に対するＩＬ－４の阻害性シグナル経路を弱めた。ルキソリチニブをＣＢ Ｔｒｅｇ細胞と組み合わせて投与した場合、血漿ＩＬ－７（図３６Ａ）および血漿ＩＬ－１５（図３６Ｂ）のレベルが増加した。ＩＬ－７の利用可能性の増加は、Ｔｒｅｇの生存を強化し、Ｔｒｅｇの分子シグネチャーを安定させ、表面のＩＬ－２Ｒα発現を強化し、Ｔｒｅｇ細胞のＩＬ－２結合を改善する（Ｓｃｈｍａｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１２（４３）：１３３３０－５，２０１５）。ＩＬ－１５は、ＲＯＲγｔおよびＩＬ－１７発現の上方制御を障害し、Ｔｒｅｇ増殖を改善する（Ｔｏｓｉｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ７：１０８８８）。ルキソリチニブをＣＢ Ｔｒｅｇ細胞と組み合わせて投与した場合、血漿ＩＬ－４レベルは低下した（図３６Ｃ）。Ｔｈ２細胞によるＩＬ－４産生は、Ｔｒｅｇによって阻害される（Ｐａｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５；１７４：７６４５－７６５３）。

ルキソリチニブとＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の組み合わせは、異種マウスＧＶＨＤモデルにおける炎症性サイトカインの分泌を減少させた。ＩＬ－１ａ（図３７Ａ）、ＩＬ－１７（図３７Ｂ）およびＩＦＮａ２（図３７Ｃ）の血漿レベルは、ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞へのルキソリチニブの添加によって減少した。ＦＧＦ－１２（図３７Ｄ）およびマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）（図３７Ｅ）のレベルは、ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞のみ、ルキソリチニブのみ、およびルキソリチニブとＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の組み合わせの投与によって等しく減少した。

ルキソリチニブとＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の組み合わせは、異種マウスＧＶＨＤモデルにおける抗炎症性サイトカインの分泌を増加させた。ＩＬ－１ＲＡ（図３８Ａ）、ＩＬ－１ａ３（図３８Ｂ）およびＩＬ－１２ｐ７０（図３８Ｃ）の血漿レベルは増加した。ルキソリチニブとＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の組み合わせは、異種マウスＧＶＨＤモデルの血液学的パラメータを改善した。ルキソリチニブ細胞およびＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の両方を投与すると、血小板のレベルが増加した（図３９Ｂ）。１４日目に、ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞＋ルキソリチニブ群におけるヘモグロビンレベルの増加と比較して、ルキソリチニブ単独群におけるヘモグロビンレベルの有意な減少が明らかである（図３９Ａ）。

実施例１３：臍帯血由来の制御性Ｔ細胞がキメラ抗原受容体Ｔ細胞に及ぼす影響
異種リンパ腫モデルは、０．３×１０^６個のＧＦＰ標識Ｒａｊｉ細胞をすべてのマウスに０日目に注射し、続いてｉ）モックＣＡＲ Ｔ、ｉｉ）ＣＡＲＴなし、またはｉｉｉ）＋５日目のＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞の０．３×１０^６個の細胞を注射したＮＳＧマウスを使用して生成した。＋１１、＋１８、＋２５日目に１×１０^７個のＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の追加注射が、ＣＡＲ Ｔなしの群、および１群あたり３匹のマウスがいるＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ群に追加された。マウスは、体重、ＧＶＨＤスコアおよび生存率について追跡された。非侵襲的生物発光を使用して、腫瘍の負荷を評価するために連続撮影を実行した。細胞分析およびサイトカインアッセイのために連続的に血液を採取した。

図５９Ａに示されるように、ＧＦＰ標識Ｒａｊｉ細胞のインビボ増殖は、＋４日ごとにすべてのマウスにおいて明白であった。ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔは、模擬ＣＡＲ Ｔ細胞ではなく、＋１１日目に腫瘍負荷を減少させた。しかし、＋１４日目に、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞レシピエントを含むすべてのマウスが進行を示したのに対し、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ＋ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞レシピエントは生物発光の証拠を示さなかった。ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ＋ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞レシピエントにおける優れた生存率は、他の治療群と比較した場合に明らかであった（図６０Ａ）。安楽死の時点で、ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞の検出について様々な臓器が評価され、ＣＤ１９－ＣＡＲＴ＋ＣＢ Ｔｒｅｇ細胞レシピエントでのみ回収された（図６０Ｂ）。ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔレシピエントは、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ＋ＣＢ Ｔｒｅｇ群で減少したＩＦＮ－γ（図５９Ｂ）およびＴＮＦ－α（図５９Ｃ）を含む＋１６日目のＰＢサンプルにおいて炎症性サイトカインの増加を示した。さらに、抗炎症性サイトカインＩＬ－１ＲＡの相互増加が、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ単独と比較して、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ＋ＣＢ Ｔｒｅｇ群で観察された（図５９Ｄ）。

異種リンパ腫モデルにおけるＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞へのＣＢ Ｔｒｅｇ細胞の追加は、サイトカインストームの抑制につながり、ＣＡＲ Ｔ細胞の標的有効性を改善した。

番号付き実施形態
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の番号付き実施形態について記載している。

１．少なくとも約１×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞を含むヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、（ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋であり、かつ（ｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であり、ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性である、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団。

２．少なくとも約１×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞を含むヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、（ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋であり、（ｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＸＣＲ４^＋であり、かつ（ｉｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であり、
ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性である、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団。

３．少なくとも約１×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞を含むヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、（ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋であり、（ｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋α４β７^＋であり、かつ（ｉｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であり、
ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性である、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団。

４．少なくとも約１×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞を含むヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、（ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋であり、（ｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１１ａ^＋であり、かつ（ｉｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であり、ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性である、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団。

５．少なくとも約１×１０^９個のヒトＴｒｅｇ細胞を含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の集団。

６．カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル細胞内染色色素またはＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット細胞内染色色素を使用するアッセイによってヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性であると決定される、実施形態１～５のいずれか１つに記載の集団。

７．少なくとも１つの凍結保存されたヒト臍帯血ユニットから活性化ヒト制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖された集団を産生するための方法であって、方法が、
ａ）凍結保存されたヒト臍帯血ユニットを解凍することと、
ｂ）機能的に閉じたシステムにおいて解凍された臍帯血ユニットを希釈および洗浄することと、
ｃ）ＣＤ２５^＋細胞表面発現に基づく二重選択法を使用して、内在性Ｔｒｅｇ細胞を単離することと、
ｄ）ガス透過性培養器中での培地中、有効量のインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下で、かつ最大１０日間、最大１２日間、または最大１４日間、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬の存在下で、単離されたＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞をエクスビボで増殖させることであって、培地を約４８時間ごとに交換して、活性化ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞の集団を産生する、増殖させることと、
ｅ）培地から前記活性化ＣＤ２５^＋細胞を採取して、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を産生することと、を含む、方法。

８．単一の臍帯血ユニットが使用される、実施形態７に記載の方法。

９．２つ～４つのプールされた臍帯血ユニットが使用される、実施形態７に記載の方法。

１０．ＣＤ２５に特異的に結合する前記試薬が、抗ＣＤ２５抗体またはその抗原結合フラグメントである、実施形態７～９のいずれか１つに記載の方法。

１１．ＣＤ２５に特異的に結合する試薬が、固体支持体にコンジュゲートされる、実施形態７～１０のいずれか１つに記載の方法。

１２．固体支持体が、磁性マイクロビーズである、実施形態１１に記載の方法。

１３．ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬が、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、実施形態７～１１のいずれか１つに記載の方法。

１４．ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬が、抗ＣＤ３被覆ビーズおよび抗ＣＤ２８被覆ビーズを含む、実施形態７～１２のいずれか１つに記載の方法。

１５．抗ＣＤ３被覆ビーズおよび抗ＣＤ２８被覆ビーズが、１：１の比率である、実施形態１４に記載の方法。

１６．ＣＤ２５^＋ならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８被覆ビーズが、１：１の比率である、実施形態１４または１５の方法。

１７．有効量のＩＬ－２が、最大約１０００ＩＵ／ｍｌである、実施形態７～１６のいずれか１つに記載の方法。

１８．有効量のＩＬ－２が、約１０００ＩＵ／ｍｌである、実施形態７～１７のいずれか１つに記載の方法。

１９．ステップｃ）で単離されたＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞が、ステップｄ）の直前にＩＬ－２を含む培地中に懸濁される、実施形態７～１８のいずれか１つに記載の方法。

２０．ステップｅ）において、約１×１０^６個のＣＤ２５^＋細胞／ｍｌが培養される、実施形態７～１９のいずれか１つに記載の方法。

２１．ステップｅ）において、細胞が、最初に、１０ｃｍ^２の膜表面積を有するガス透過性培養器中で培養される、実施形態７～２０のいずれか１つに記載の方法。

２２．続いて、培養物が、１００ｃｍ^２の膜表面積を有するガス透過性培養器に移される、実施形態２１に記載の方法。

２３．ステップｄ）において、培養物が、混合および再懸濁されない、実施形態７～２２のいずれか１つに記載の方法。

２４．約１×１０^９個～約２×１０^９個の活性化ＣＤ２５^＋細胞が、１４日間の培養後に採取される、実施形態７～２３のいずれか１つに記載の方法。

２５．ステップａ）において、凍結保存されたヒト臍帯血ユニットが、ウォーターバス中で単一のステップで解凍される、実施形態７～２４のいずれか１つに記載の方法。

２６．ステップｂ）が、手動洗浄を含まない、実施形態７～２５のいずれか１つに記載の方法。

２７．ステップｂ）が、ＰＢＳ、ＥＤＴＡ、および約０．５％のヒト血清アルブミンを含む溶液中で行われる、実施形態７～２６のいずれか１つに記載の方法。

２８．二重強磁性カラム法が、ステップｃ）において使用されて、ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞を単離する、実施形態７～２７のいずれか１つに記載の方法。

２９．少なくとも１つの凍結保存されたヒト臍帯血ユニットから活性化ヒト制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖された集団を産生するための方法であって、前記方法が、
ａ）凍結保存されたヒト臍帯血ユニットをウォーターバス中で単一ステップで解凍することと、
ｂ）手動洗浄を伴わない機能的に閉じたシステムにおいてＰＢＳ、ＥＤＴＡ、および０．５％のヒト血清アルブミンを含む溶液中で、解凍された臍帯血ユニットを希釈および洗浄することと、
ｃ）二重強磁性カラム法を使用したＣＤ２５^＋細胞表面発現に基づく二重選択法を使用して、内在性Ｔｒｅｇ細胞を単離することと、
ｄ）ガス透過性培養器中での培地中、約１０００ＩＵ／ｍｌのインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下で、かつ最大１０日間、最大１２日間、または最大１４日間、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８被覆ビーズの存在下で、単離された活性化ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞をエクスビボで増殖させることであって、培地を約４８時間ごとに交換して、活性化ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞の集団を産生し、
ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞ならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８被覆ビーズが１：１の比率であり、
培養物が混合および再懸濁されない、増殖させることと、
ｅ）培地から前記活性化ＣＤ２５^＋細胞を採取して、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖した集団を産生することと、を含む、方法。

３０．方法が、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を凍結保存することをさらに含む、実施形態７～２９のいずれか１つに記載の方法。

３１．実施形態７～３０のいずれか１つに記載の方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、Ｔｒｅｇ細胞が、少なくとも９０％のＣＸＣＲ４^＋である、集団。

３２．Ｔｒｅｇ細胞が、少なくとも９０％のＣＸＣＲ４^＋である、実施形態１～６のいずれか１つに記載の集団。

３３．Ｔｒｅｇ細胞が、少なくとも９５％のＣＸＣＲ４^＋、少なくとも９５％のＣＤ４５ＲＡ^＋および少なくとも８０％のＣＤ４５ＲＯ^＋である、実施形態１～６、３１および３２のいずれか１つに記載の集団。

３４．Ｔｒｅｇ細胞が、さらに、少なくとも９５％のＣＤ９５^＋、少なくとも９５％のＨＬＡＤＲ^＋、少なくとも９５％のａｌｐｈａ４ｂｅｔａ７^＋、少なくとも１５％のＣＸＣＲ３ｈｉ^＋、少なくとも９５％のＣＣＲ６^＋、少なくとも９５％のＣＤ５４^＋、少なくとも９５％のＣＤ１１Ａ^＋、少なくとも８５％のＣＤ４５ＲＡＲＯ^＋、少なくとも８０％のＣＴＬＡ４^＋、少なくとも８０％のＧＰＲ８３^＋、および少なくとも８０％のＣＤ６２Ｌ^＋である、実施形態１～６および３１～３３のいずれか１つに記載の集団。

３５．Ｔｒｅｇ細胞が、少なくとも９５％のＣＸＣＲ４^＋、少なくとも９５％のＣＤ４５ＲＡ^＋、少なくとも８０％のＣＤ４５ＲＯ^＋、少なくとも９５％のＣＤ９５^＋、少なくとも９５％のＨＬＡＤＲ^＋、少なくとも９５％のａｌｐｈａ４ｂｅｔａ７^＋、少なくとも１５％のＣＸＣＲ３ｈｉ^＋、少なくとも９５％のＣＣＲ６^＋、少なくとも９５％のＣＤ５４^＋、少なくとも９５％のＣＤ１１Ａ^＋、少なくとも８５％のＣＤ４５ＲＡＲＯ^＋、少なくとも８０％のＣＴＬＡ４^＋、少なくとも８０％のＧＰＲ８３^＋および少なくとも８０％のＣＤ６２Ｌ^＋である、実施形態１～６および３１～３４のいずれか１つに記載の集団。

３６．Ｔｒｅｇ細胞が、ＦＯＸＰ３の高発現およびＲＯＲγｔの低発現を示す、実施形態１～６および３１～３５のいずれか１つに記載の集団。

３７．Ｔｒｅｇ細胞が、それらのポリクローナルＴ細胞受容体Ｖβ（ＴＣＲ Ｖβ）レパートリーを維持する、実施形態１～６および３１～３６のいずれか１つに記載の集団。

３８．Ｔｒｅｇ細胞が、使用前に凍結保存される、実施形態１～６および３１～３７のいずれか１つに記載の集団。

３９．少なくとも１つの凍結保存されたヒト臍帯血ユニットから産生された活性化ヒト制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖された集団を凍結保存するための方法であって、前記方法が、
ａ）凍結保存されたヒト臍帯血ユニットを解凍することと、
ｂ）機能的に閉じたシステムにおいて解凍された臍帯血ユニットを希釈および洗浄することと、
ｃ）ＣＤ２５^＋細胞表面発現に基づく二重選択法を使用して、内在性Ｔｒｅｇ細胞を単離することと、
ｄ）ガス透過性培養器中での培地中、有効量のインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下で、かつ最大１０日間、最大１２日間、または最大１４日間、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬の存在下で、単離されたＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞をエクスビビボで増殖させることであって、培地を約４８時間ごとに交換して、活性化ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞の集団を産生する、増殖させることと、
ｅ）培地から活性化ＣＤ２５^＋細胞を採取して、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を産生することと、
ｆ）活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を凍結保存することと、を含む、方法。

４０．対象における移植片対宿主病を治療または予防するための方法であって、方法が、対象に、有効量の、実施形態５～２８および３９のいずれか１つに記載の方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または実施形態１～６および３１～３８のいずれか１つに記載の集団を投与することを含む、方法。

４１．対象における移植片対宿主病を治療または予防するための方法であって、方法が、対象に、（ｉ）有効量の、実施形態７～３０および３９のいずれか１つに記載の方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または実施形態１～６および３１～３８のいずれか１つに記載の集団、ならびに（ｉｉ）ルキソリチニブを投与することを含む、方法。

４２．対象における骨髄不全症候群を治療または予防するための方法であって、方法が、対象に、有効量の、実施形態７～３０および３９のいずれか１つに記載の方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または実施形態１～６および３１～３８のいずれか１つに記載の集団を投与することを含む、方法。

４３．骨髄不全症候群が、再生不良性貧血、原発性骨髄線維症または骨髄異形成症候群である、実施形態４２に記載の方法。

４４．対象における原発性骨髄線維症を治療または予防するための方法であって、方法が、対象に、（ｉ）有効量の、実施形態７～３０および３９のいずれか１つに記載の方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または実施形態１～６および３１～３８のいずれか１つに記載の集団、ならびに（ｉｉ）ルキソリチニブを投与することを含む、方法。

４５．対象における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療または予防するための方法であって、方法が、対象に、有効量の、実施形態７～３０および３９のいずれか１つに記載の方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または実施形態１～６および３１～３８のいずれか１つに記載の集団を投与することを含む、方法。

４６．対象における多発性骨髄腫を治療または予防するための方法であって、方法が、対象に、有効量の、実施形態７～３０および３９のいずれか１つに記載の方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または実施形態１～６および３１～３８のいずれか１つに記載の集団を投与することを含む、方法。

４７．対象における神経炎症性障害を治療または予防するための方法であって、方法が、対象に、有効量の、実施形態７～３０および３９のいずれか１つに記載の方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または実施形態１～６および３１～３８のいずれか１つに記載の集団を投与することを含む、方法。

４８．神経炎症性障害が、ギランバレー症候群、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症または脱髄性神経障害である、実施形態４７に記載の方法。

４９．対象における重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染に関連する呼吸器疾患、障害または状態を治療または予防するための方法であって、方法が、対象に、有効量の、実施形態７～３０および３９のいずれか１つに記載の方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または実施形態１～６および３１～３８のいずれか１つに記載の集団を投与することを含む、方法。

５０．呼吸器疾患、障害または状態が、ＣＯＶＩＤ－１９（コロナウイルス疾患）媒介性急性呼吸窮迫症候群（ＣｏＶ－ＡＲＤＳ）である、実施形態４９に記載の方法。

５１．対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を治療または予防するための方法であって、方法が、対象に、有効量の、実施形態７～３０および３９のいずれか１つに記載の方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または実施形態１～６および３１～３８のいずれか１つに記載の集団を投与することを含む、方法。

５２．ＣＲＳが、キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法に関連している、実施形態５１に記載の方法。

５３．有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団が、対象に対して静脈内投与される、実施形態４０～５２のいずれか１つに記載の方法。

５４．有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団が、対象の体重の約１×１０^６～約１×１０^７個のＴｒｅｇ細胞／ｋｇである、実施形態４０～５３のいずれか１つに記載の方法。

５５．有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団が、約１×１０^８Ｔｒｅｇ細胞～約３×１０^８Ｔｒｅｇ細胞である、実施形態４０～５３のいずれか１つに記載の方法。

５６．有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団の複数回用量が、対象に投与される、実施形態４０～５５のいずれか１つに記載の方法。

５７．３回の用量または４回の用量が、対象に投与される、実施形態５６に記載の方法。

５８．用量が、対象に約４～６週間ごとに投与される、実施形態５６または５７に記載の方法。

５９．有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団の投与に続いて、対象における循環炎症性サイトカインレベルが、投与前の対象における循環炎症性サイトカインレベルと比較して減少する、実施形態４０～５８のいずれか１つに記載の方法。

６０．治療前に、対象が有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団に応答するかどうかを決定するために、対象の血清バイオマーカーが検査される、実施形態４０～５９のいずれか１つに記載の方法。

６１．治療に続いて、臨床反応との相関を決定するために、対象の血清バイオマーカーが検査される、実施形態４０～６０のいずれか１つに記載の方法。

６２．血清バイオマーカーを連続的に検査して、その後のＴｒｅｇ細胞による再処理が必要かどうかを検査する、実施形態６１に記載の方法。

６３．活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団が、対象に適合する血液型のうちの１つ以上の臍帯血ユニットから調製される、実施形態４０～６２のいずれか１つに記載の方法。

６４．活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団が、対象に対する６ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）マッチのうちの少なくとも３ＨＬＡマッチである臍帯血ユニットから調製される、実施形態４０～６３のいずれか１つに記載の方法。

６５．活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団が、対象に対するＨＬＡマッチではない臍帯血ユニットから調製される、実施形態４０～６２のいずれか１つに記載の方法。

６６．薬剤の調製における実施形態１～６および３１～３８のいずれか１つに記載の集団の使用

Claims (66)

1. 少なくとも約１×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞を含むヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、
   （ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋であり、かつ
   （ｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であり、
   前記ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性である、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団。
2. 少なくとも約１×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞を含むヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、
   （ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋であり、
   （ｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＸＣＲ４^＋であり、かつ
   （ｉｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であり、
   前記ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性である、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団。
3. 少なくとも約１×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞を含むヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、
   （ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋であり、
   （ｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋α４β７^＋であり、かつ
   （ｉｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であり、
   前記ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性である、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団。
4. 少なくとも約１×１０^８個のヒトＴｒｅｇ細胞を含むヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、
   （ｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋であり、
   （ｉｉ）≧６０％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１１ａ^＋であり、かつ
   （ｉｉｉ）≦１０％のＣＤ４^－ＣＤ８^＋であり、
   前記ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性である、ヒトＴｒｅｇ細胞の集団。
5. 少なくとも約１×１０^９個のヒトＴｒｅｇ細胞を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の集団。
6. カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル細胞内染色色素またはＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット細胞内染色色素を使用するアッセイによって前記ヒトＴｒｅｇ細胞が免疫抑制性であると決定される、請求項１～５のいずれか一項に記載の集団。
7. 少なくとも１つの凍結保存されたヒト臍帯血ユニットから活性化ヒト制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖された集団を産生するための方法であって、前記方法が、
   ａ）前記凍結保存されたヒト臍帯血ユニットを解凍することと、
   ｂ）機能的に閉じたシステムにおいて前記解凍された臍帯血ユニットを希釈および洗浄することと、
   ｃ）ＣＤ２５^＋細胞表面発現に基づく二重選択法を使用して、内在性Ｔｒｅｇ細胞を単離することと、
   ｄ）ガス透過性培養器中での培地中、有効量のインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下で、かつ最大１０日間、最大１２日間、または最大１４日間、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬の存在下で、前記単離されたＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞をエクスビボで増殖させることであって、前記培地を約４８時間ごとに交換して、活性化ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞の集団を産生する、増殖させることと、
   ｅ）前記培地から前記活性化ＣＤ２５^＋細胞を採取して、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を産生することと、を含む、方法。
8. 単一の臍帯血ユニットが使用される、請求項７に記載の方法。
9. ２つ～４つのプールされた臍帯血ユニットが使用される、請求項７に記載の方法。
10. ＣＤ２５に特異的に結合する前記試薬が、抗ＣＤ２５抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
11. ＣＤ２５に特異的に結合する前記試薬が、固体支持体にコンジュゲートされる、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記固体支持体が、磁性マイクロビーズである、請求項１１に記載の方法。
13. ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する前記試薬が、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびに抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項７～１１のいずれか一項に記載の方法。
14. ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する前記試薬が、抗ＣＤ３被覆ビーズおよび抗ＣＤ２８被覆ビーズを含む、請求項７～１２のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記抗ＣＤ３被覆ビーズおよび前記抗ＣＤ２８被覆ビーズが、１：１の比率である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ＣＤ２５^＋細胞ならびに前記抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８被覆ビーズが、１：１の比率である、請求項１４または１５に記載の方法。
17. 前記有効量のＩＬ－２が、最大約１０００ＩＵ／ｍｌである、請求項７～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記有効量のＩＬ－２が、約１０００ＩＵ／ｍｌである、請求項７～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. ステップｃ）で単離された前記ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞が、ステップｄ）の直前にＩＬ－２を含む培地中に懸濁される、請求項７～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. ステップｅ）において、約１×１０^６個のＣＤ２５^＋細胞／ｍｌが培養される、請求項７～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. ステップｅ）において、前記細胞が、最初に、１０ｃｍ^２の膜表面積を有するガス透過性培養器中で培養される、請求項７～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 続いて、培養物が、１００ｃｍ^２の膜表面積を有するガス透過性培養器に移される、請求項２１に記載の方法。
23. ステップｄ）において、前記培養物が、混合および再懸濁されない、請求項７～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 約１×１０^９個～約２×１０^９個の活性化ＣＤ２５^＋細胞が、１４日間の培養後に採取される、請求項７～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. ステップａ）において、前記凍結保存されたヒト臍帯血ユニットが、ウォーターバス中で単一のステップで解凍される、請求項７～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. ステップｂ）が、手動洗浄を含まない、請求項７～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. ステップｂ）が、ＰＢＳ、ＥＤＴＡ、および約０．５％のヒト血清アルブミンを含む溶液中で行われる、請求項７～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 二重強磁性カラム法が、ステップｃ）において使用されて、ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞を単離する、請求項７～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 少なくとも１つの凍結保存されたヒト臍帯血ユニットから活性化ヒト制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖された集団を産生するための方法であって、前記方法が、
    ａ）前記凍結保存されたヒト臍帯血ユニットをウォーターバス中で単一ステップで解凍することと、
    ｂ）手動洗浄を伴わない機能的に閉じたシステムにおいてＰＢＳ、ＥＤＴＡ、および０．５％のヒト血清アルブミンを含む溶液中で、前記解凍された臍帯血ユニットを希釈および洗浄することと、
    ｃ）二重強磁性カラム法を使用したＣＤ２５^＋細胞表面発現に基づく二重選択法を使用して、内在性Ｔｒｅｇ細胞を単離することと、
    ｄ）ガス透過性培養器中での培地中、約１０００ＩＵ／ｍｌのインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下で、かつ最大１０日間、最大１２日間、または最大１４日間、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８被覆ビーズの存在下で、前記単離されたＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞をエクスビボで増殖させることであって、前記培地を約４８時間ごとに交換して、活性化ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞の集団を産生し、
    前記ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞ならびに前記抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８被覆ビーズが１：１の比率であり、
    培養物が混合および再懸濁されない、増殖させることと、
    ｅ）前記培地から前記活性化ＣＤ２５^＋細胞を採取して、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖した集団を産生することと、を含む、方法。
30. 前記方法が、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の前記増殖された集団を凍結保存することをさらに含む、請求項７～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 請求項７～３０のいずれか一項に記載の方法によって産生される活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団であって、前記Ｔｒｅｇ細胞が、少なくとも９０％のＣＸＣＲ４^＋である、集団。
32. 前記Ｔｒｅｇ細胞が、少なくとも９０％のＣＸＣＲ４^＋である、請求項１～６のいずれか一項に記載の集団。
33. 前記Ｔｒｅｇ細胞が、少なくとも９５％のＣＸＣＲ４^＋、少なくとも９５％のＣＤ４５ＲＡ^＋および少なくとも８０％のＣＤ４５ＲＯ^＋である、請求項１～６、３１および３２のいずれか一項に記載の集団。
34. 前記Ｔｒｅｇ細胞が、さらに、少なくとも９５％のＣＤ９５^＋、少なくとも９５％のＨＬＡＤＲ^＋、少なくとも９５％のａｌｐｈａ４ｂｅｔａ７^＋、少なくとも１５％のＣＸＣＲ３ｈｉ^＋、少なくとも９５％のＣＣＲ６^＋、少なくとも９５％のＣＤ５４^＋、少なくとも９５％のＣＤ１１Ａ^＋、少なくとも８５％のＣＤ４５ＲＡＲＯ^＋、少なくとも８０％のＣＴＬＡ４^＋、少なくとも８０％のＧＰＲ８３^＋、および少なくとも８０％のＣＤ６２Ｌ^＋である、請求項１～６および３１～３３のいずれか一項に記載の集団。
35. 前記Ｔｒｅｇ細胞が、少なくとも９５％のＣＸＣＲ４^＋、少なくとも９５％のＣＤ４５ＲＡ^＋、少なくとも８０％のＣＤ４５ＲＯ^＋、少なくとも９５％のＣＤ９５^＋、少なくとも９５％のＨＬＡＤＲ^＋、少なくとも９５％のａｌｐｈａ４ｂｅｔａ７^＋、少なくとも１５％のＣＸＣＲ３ｈｉ^＋、少なくとも９５％のＣＣＲ６^＋、少なくとも９５％のＣＤ５４^＋、少なくとも９５％のＣＤ１１Ａ^＋、少なくとも８５％のＣＤ４５ＲＡＲＯ^＋、少なくとも８０％のＣＴＬＡ４^＋、少なくとも８０％のＧＰＲ８３^＋および少なくとも８０％のＣＤ６２Ｌ^＋である、請求項１～６および３１～３４のいずれか一項に記載の集団。
36. 前記Ｔｒｅｇ細胞が、ＦＯＸＰ３の高発現およびＲＯＲγｔの低発現を示す、請求項１～６および３１～３５のいずれか一項に記載の集団。
37. 前記Ｔｒｅｇ細胞が、それらのポリクローナルＴ細胞受容体Ｖβ（ＴＣＲ Ｖβ）レパートリーを維持する、請求項１～６および３１～３６のいずれか一項に記載の集団。
38. 前記Ｔｒｅｇ細胞が、使用前に凍結保存される、請求項１～６および３１～３７のいずれか一項に記載の集団。
39. 少なくとも１つの凍結保存されたヒト臍帯血ユニットから産生された活性化ヒト制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増殖された集団を凍結保存するための方法であって、前記方法が、
    ａ）前記凍結保存されたヒト臍帯血ユニットを解凍することと、
    ｂ）機能的に閉じたシステムにおいて前記解凍された臍帯血ユニットを希釈および洗浄することと、
    ｃ）ＣＤ２５^＋細胞表面発現に基づく二重選択法を使用して、内在性Ｔｒｅｇ細胞を単離することと、
    ｄ）ガス透過性培養器中での培地中、有効量のインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下で、かつ最大１０日間、最大１２日間、または最大１４日間、ＣＤ３およびＣＤ２８に特異的に結合する試薬の存在下で、前記単離されたＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞をエクスビボで増殖させることであって、前記培地を約４８時間ごとに交換して、活性化ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞の集団を産生する、増殖させることと、
    ｅ）前記培地から前記活性化ＣＤ２５^＋細胞を採取して、活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の増殖された集団を産生することと、
    ｆ）活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の前記増殖された集団を凍結保存することと、を含む、方法。
40. 対象における移植片対宿主病を治療または予防するための方法であって、前記方法が、前記対象に、有効量の、請求項５～２８および３９のいずれか一項に記載の方法によって産生される前記活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または請求項１～６および３１～３８のいずれか一項に記載の集団を投与することを含む、方法。
41. 対象における移植片対宿主病を治療または予防するための方法であって、前記方法が、前記対象に、（ｉ）有効量の、請求項７～３０および３９のいずれか一項に記載の方法によって産生される前記活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または請求項１～６および３１～３８のいずれか一項に記載の集団、ならびに（ｉｉ）ルキソリチニブを投与することを含む、方法。
42. 対象における骨髄不全症候群を治療または予防するための方法であって、前記方法が、前記対象に、有効量の、請求項７～３０および３９のいずれか一項に記載の方法によって産生される前記活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または請求項１～６および３１～３８のいずれか一項に記載の集団を投与することを含む、方法。
43. 前記骨髄不全症候群が、再生不良性貧血、原発性骨髄線維症または骨髄異形成症候群である、請求項４２に記載の方法。
44. 対象における原発性骨髄線維症を治療または予防するための方法であって、前記方法が、前記対象に、（ｉ）有効量の、請求項７～３０および３９のいずれか一項に記載の方法によって産生される前記活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または請求項１～６および３１～３８のいずれか一項に記載の集団、ならびに（ｉｉ）ルキソリチニブを投与することを含む、方法。
45. 対象における全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療または予防するための方法であって、前記方法が、前記対象に、有効量の、請求項７～３０および３９のいずれか一項に記載の方法によって産生される前記活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または請求項１～６および３１～３８のいずれか一項に記載の集団を投与することを含む、方法。
46. 対象における多発性骨髄腫を治療または予防するための方法であって、前記方法が、前記対象に、有効量の、請求項７～３０および３９のいずれか一項に記載の方法によって産生される前記活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または請求項１～６および３１～３８のいずれか一項に記載の集団を投与することを含む、方法。
47. 対象における神経炎症性障害を治療または予防するための方法であって、前記方法が、前記対象に、有効量の、請求項７～３０および３９のいずれか一項に記載の方法によって産生される前記活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または請求項１～６および３１～３８のいずれか一項に記載の集団を投与することを含む、方法。
48. 前記神経炎症性障害が、ギランバレー症候群、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症または脱髄性神経障害である、請求項４７に記載の方法。
49. 対象における重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染に関連する呼吸器疾患、障害または状態を治療または予防するための方法であって、前記方法が、前記対象に、有効量の、請求項７～３０および３９のいずれか一項に記載の方法によって産生される前記活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または請求項１～６および３１～３８のいずれか一項に記載の集団を投与することを含む、方法。
50. 前記呼吸器疾患、障害または状態が、ＣＯＶＩＤ－１９（コロナウイルス疾患）媒介性急性呼吸窮迫症候群（ＣｏＶ－ＡＲＤＳ）である、請求項４９に記載の方法。
51. 対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を治療または予防するための方法であって、前記方法が、前記対象に、有効量の、請求項７～３０および３９のいずれか一項に記載の方法によって産生される前記活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の集団または請求項１～６および３１～３８のいずれか一項に記載の集団を投与することを含む、方法。
52. 前記ＣＲＳが、キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法に関連している、請求項５１に記載の方法。
53. 前記有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の前記集団が、前記対象に対して静脈内投与される、請求項４０～５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 前記有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の前記集団が、前記対象の体重の約１×１０^６～約１×１０^７個のＴｒｅｇ細胞／ｋｇである、請求項４０～５３のいずれか一項に記載の方法。
55. 前記有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の前記集団が、約１×１０^８個のＴｒｅｇ細胞～約３×１０^８個のＴｒｅｇ細胞である、請求項４０～５３のいずれか一項に記載の方法。
56. 有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の前記集団の複数回用量が、前記対象に投与される、請求項４０～５５のいずれか一項に記載の方法。
57. ３回の用量または４回の用量が、前記対象に投与される、請求項５６に記載の方法。
58. 前記用量が、前記対象に約４～６週間ごとに投与される、請求項５６または５７に記載の方法。
59. 前記有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の前記集団の投与に続いて、前記対象における循環炎症性サイトカインレベルが、前記投与前の前記対象における前記循環炎症性サイトカインレベルと比較して減少する、請求項４０～５８のいずれか一項に記載の方法。
60. 治療前に、前記対象が前記有効量の活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の前記集団に応答するかどうかを決定するために、前記対象の血清バイオマーカーが検査される、請求項４０～５９のいずれか一項に記載の方法。
61. 治療に続いて、臨床反応との相関を決定するために、前記対象の血清バイオマーカーが検査される、請求項４０～６０のいずれか一項に記載の方法。
62. 前記血清バイオマーカーを連続的に検査して、その後のＴｒｅｇ細胞による再処理が必要かどうかを検査する、請求項６１に記載の方法。
63. 活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の前記集団が、前記対象に適合する血液型のうちの１つ以上の臍帯血ユニットから調製される、請求項４０～６２のいずれか一項に記載の方法。
64. 活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の前記集団が、前記対象に対する６ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）マッチのうちの少なくとも３ＨＬＡマッチである臍帯血ユニットから調製される、請求項４０～６３のいずれか一項に記載の方法。
65. 活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の前記集団が、前記対象に対するＨＬＡマッチではない臍帯血ユニットから調製される、請求項４０～６２のいずれか一項に記載の方法。
66. 薬剤の調製における請求項１～６および３１～３８のいずれか一項に記載の集団の使用。

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