KR20220066165A - 조절 t 세포를 포함하는 조성물 및 그의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

조절 t 세포를 포함하는 조성물 및 그의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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KR20220066165A
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Abstract

생체 외에서 확장된 제대혈 유래 조절 T 세포의 집단이 본원에 제공된다. 또한, 이의 제조 및 사용 방법이 제공된다.

Description

조절 T 세포를 포함하는 조성물 및 그의 제조 및 사용 방법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 미국 임시 특허 출원 제63/064,129호(2020년 8월 11일 출원), 미국 임시 특허 출원 제63/038,345호(2020년 6월 12일 출원), 미국 임시 특허 출원 제62/990,913호(2020년 3월 17일 출원), 및 미국 임시 특허 출원 제62/906,283호(2019년 9월 26일 출원)의 이익을 주장하며, 이들 각각의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 원용되어 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 일반적으로 면역-조절 T 세포(Treg) 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 Treg의 풍부한 제대혈 유래 집단, 뿐만 아니라 이의 제조 및 사용 방법을 제공한다.
Treg는 자연적으로 면역 반응을 억제하고 조절한다. 수많은 자가면역 질환, 염증성 장애, 및 악성종양은 Treg 결핍/결함 및/또는 내인성 Treg의 억제 기능 또는 총 세포 수의 소진에 의해 직접 유발되거나 악화되며, 이는 자가반응성 세포독성 T 세포의 무제한 증식을 허용하여 세포 및 조직 손상을 유발하고 그 결과 여러 질환 징후로 전환된다. 이러한 결함 있는 Treg를 동종이형 건강한 제대혈 유래 Treg로 교체하고 보충하면 자가반응성 세포독성 T 세포의 해로운 작용을 억제하여 항상성의 재확립을 유도하여 기저 질환의 임상적 개선을 유도할 수 있다. 이러한 자가면역 질환, 염증성 장애, 및 악성종양에 대한 추가 치료법을 개발할 필요가 당업계에 남아 있다.
다음과 같은 약 1x108개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는 인간 Treg 세포의 집단이 본원에 제공된다: (i) ≥ 60% CD4+CD25+; 및 (ii) ≤ 10% CD4-CD8+; 여기서 인간 Treg 세포는 면역억제성임. 다음과 같은 약 1x108개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는 인간 Treg 세포의 집단이 본원에 추가로 제공된다: (i) ≥ 60% CD4+CD25+; (ii) ≥ 60% CD4+CD25+CXCR4+; 및 (iii) ≤ 10% CD4-CD8+; 여기서 인간 Treg 세포는 면역억제성임. 다음과 같은 약 1x108개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는 인간 Treg 세포의 집단이 본원에 추가로 제공된다: (i) ≥ 60% CD4+CD25+; (ii) ≥ 60% CD4+CD25+α4β7+; 및 (iii) ≤ 10% CD4-CD8+; 여기서 인간 Treg 세포는 면역억제성임. 다음과 같은 약 1x108개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는 인간 Treg 세포의 집단이 본원에 또한 제공된다: (i) ≥ 60% CD4+CD25+; (ii) ≥ 60% CD4+CD25+CD11a+; 및 (iii) ≤ 10% CD4-CD8+; 여기서 인간 Treg 세포는 면역억제성임. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 적어도 약 1x109개의 인간 Treg 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포는 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 세포내 염색 염료 또는 CellTrace™ Violet 세포내 염색 염료를 사용하는 검정에 의해 면역억제성인 것으로 결정된다.
적어도 하나의 동결보존된 인간 제대혈 유닛으로부터 활성화된 인간 T 조절(Treg) 세포의 확장된 집단을 생성하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법이 본원에 추가로 개시된다: a) 동결보존된 인간 제대혈 유닛을 해동하는 단계; b) 상기 해동된 제대혈 유닛을 기능적으로 폐쇄된 시스템에서 희석 및 세척하는 단계; c) CD25+ 세포 표면 발현을 기반으로 하는 이중 선택 방법을 사용하여 자연 발생 Treg 세포를 단리하는 단계; d) 최대 10일, 최대 12일, 또는 최대 14일 동안, 배양 배지(들)에서, 기체 투과성 배양기에서, 유효량의 인터류킨-2(IL-2)의 존재 하에 그리고 CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약의 존재 하에, 단리된 CD25+ Treg 세포를 생체 외에서 확장하여 활성화된 CD25+ Treg 세포의 집단을 생성하는 단계- 상기 배양 배지는 약 48시간마다 교체됨 -; 및 e) 배양 배지로부터 활성화된 CD25+ 세포를 수확하여, 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 생성하는 단계.
일부 실시형태에서, 동결보존된 인간 제대혈 유닛은 수조에서 단일 단계로 해동된다.
일부 실시형태에서, 희석 및 세척 단계는 수동 세척을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 희석 및 세척 단계는 PBS, EDTA, 및 약 0.5% 인간 혈청 알부민을 포함하는 용액에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 동결보존된 인간 제대혈 유닛의 출발 물질에 대한 선택 기준은 공급자 자격; 총 유핵 세포 수; 사전 동결 백분율 세포 생존 능력; 동결보존 부피; 수집 날짜; 저장 조건; 거대세포바이러스 혈청양성; 인종 및 민족성; 모성 공여자 이력; 가족 병력; 공여자 어머니 전염병 프로필을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 제대혈 유닛이 사용된다. 일부 실시형태에서, 2 내지 4개의 풀링된 제대혈 유닛이 사용된다. 일부 실시형태에서, 4개 초과의 풀링된 제대혈 유닛이 사용된다.
일부 실시형태에서, CD25에 특이적으로 결합하는 시약은 항-CD25 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시형태에서, CD25에 특이적으로 결합하는 시약은 고체 지지체에 접합된다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 자성 마이크로비드이다. 일부 실시형태에서, 이중 강자성 컬럼 방법을 사용하여 CD25+ Treg 세포를 단리한다.
일부 실시형태에서, CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약은 항-CD3 코팅된 비드 및 항-CD28 코팅된 비드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 코팅된 비드 대 항-CD28 코팅된 비드는 1:1 비로 존재한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법의 배양 단계에서, CD25+ 세포 대 항-CD3 및 항-CD28 코팅된 비드는 1:1 비로 존재한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법의 배양 단계에서, 약 1x106개의 CD25+ 세포/ml가 배양된다.
일부 실시형태에서, IL-2의 유효량은 약 1000 IU/ml 이하이다. 일부 실시형태에서, IL-2의 유효량은 약 1000 IU/ml이다. 일부 실시형태에서, 단리된 CD25+ Treg 세포는 본원에 기재된 방법의 배양 단계의 바로 시작 시에 IL-2를 포함하는 배양 배지에 현탁된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법의 배양 단계에서, CD25+ 세포가 10 cm2의 막 표면적을 갖는 기체 투과성 배양기에서 초기에 배양된다. 일부 실시형태에서, 후속적으로 배양물은 100 cm2의 막 표면적을 갖는 기체 투과성 배양기로 옮겨진다. 일부 실시형태에서, 배양물은 본원에 기재된 방법의 배양 단계에서 혼합 및 재현탁되지 않는다.
일부 실시형태에서, 배양 10 일, 12 일, 또는 14일 후에 약 1x109 내지 약 10x109개의 활성화된 CD25+ 세포가 수확된다.
적어도 하나의 동결보존된 인간 제대혈 유닛으로부터 활성화된 인간 T 조절(Treg) 세포의 확장된 집단을 생성하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법이 본원에 추가로 개시된다: a) 동결보존된 인간 제대혈 유닛을 수조에서 단일 단계로 해동하는 단계; b) 상기 해동된 제대혈 유닛을, 수동 세척 없이 기능적으로 폐쇄된 시스템에서 PBS, EDTA, 및 약 0.5% 인간 혈청 알부민을 포함하는 용액에서 희석 및 세척하는 단계; c) 이중 강자성 컬럼 방법을 사용하여 CD25+ 세포 표면 발현을 기반으로 하는 이중 선택 방법을 사용하여 자연 발생 Treg 세포를 단리하는 단계; d) 최대 10일, 최대 12일, 또는 최대 14일 동안, 배양 배지(들)에서, 기체 투과성 배양기에서, 약 1000 IU/ml의 인터류킨-2(IL-2)의 존재 하에 그리고 항-CD3 및 항-CD28 코팅된 비드의 존재 하에, 단리된 CD25+ Treg 세포를 생체 외에서 확장하여 활성화된 CD25+ Treg 세포의 집단을 생성하는 단계- 상기 배양 배지는 약 48시간마다 교체됨; CD25+ Treg 세포 대 항-CD3 및 항-CD28 코팅 비드가 1:1 비로 존재함; 배양물은 혼합 및 재현탁되지 않음 -; 및 e) 배양 배지로부터 활성화된 CD25+ 세포를 수확하여, 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 생성하는 단계.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 동결보존하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단이 본원에 추가로 제공된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 집단에서 Treg 세포는 적어도 90% CXCR4+이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 집단에서 Treg 세포는 적어도 95% CXCR4+, 적어도 95% CD45RA+, 및 적어도 80% CD45RO+이다. 일부 실시형태에서, Treg 세포는 적어도 95% CXCR4+, 적어도 95% CD45RA+, 적어도 80% CD45RO+, 적어도 95% CD95+, 적어도 95% HLADR+, 적어도 95% 알파4베타7+, 적어도 15% CXCR3hi+, 적어도 95% CCR6+, 적어도 95% CD54+, 적어도 95% CD11A+, 적어도 85% CD45RARO+, 적어도 80% CTLA4+, 적어도 80% GPR83+, 및 적어도 80% CD62L+이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 집단에서 인간 Treg 세포는 FOXP3의 높은 발현 및 RORγt의 낮은 발현을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 집단에서 인간 Treg 세포는 그의 다클론 T 세포 수용체 Vβ(TCR Vβ) 레퍼토리를 유지한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 집단의 인간 Treg 세포는 사용 전에 동결보존된다.
적어도 하나의 동결보존된 인간 제대혈 유닛으로부터 생성된 활성화된 인간 T 조절(Treg) 세포의 확장된 집단을 동결보존하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법이 본원에 또한 제공된다: a) 동결보존된 인간 제대혈 유닛을 해동하는 단계; b) 상기 해동된 제대혈 유닛을 기능적으로 폐쇄된 시스템에서 희석 및 세척하는 단계; c) CD25+ 세포 표면 발현을 기반으로 하는 이중 선택 방법을 사용하여 자연 발생 Treg 세포를 단리하는 단계; d) 최대 10일, 최대 12일, 또는 최대 14일 동안, 배양 배지(들)에서, 기체 투과성 배양기에서, 유효량의 인터류킨-2(IL-2)의 존재 하에 그리고 CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약의 존재 하에, 단리된 CD25+ Treg 세포를 생체 외에서 확장하여 활성화된 CD25+ Treg 세포의 집단을 생성하는 단계- 상기 배양 배지는 약 48시간마다 교체됨 -; e) 배양 배지로부터 활성화된 CD25+ 세포를 수확하여, 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 생성하는 단계; f) 정의된 기준을 기반으로 임상 사용을 위해 활성화된 배양된 인간 Treg 세포를 방출하는 단계; 및 g) 특징적인 표현형을 갖는 방출된 활성화된 배양된 인간 Treg 세포를 동결보존하는 단계.
대상체에서 이식편 대 숙주 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 대상체에서 이식편 대 숙주 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, (i) 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단 및 (ii) 룩소리티닙을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 또한 제공된다.
대상체에서 골수 부전 증후군을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 또한 제공된다. 일부 실시형태에서, 골수 부전 증후군은 재생 불량성 빈혈, 원발성 골수섬유증, 또는 골수이형성 증후군이다. 대상체에서 원발성 골수섬유증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, (i) 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단 및 (ii) 룩소리티닙을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다.
대상체에서 전신성 홍반성 루푸스(SLE)를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다.
대상체에서 다발성 골수종을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 또한 제공된다.
대상체에서 신경-염증성 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 일부 실시형태에서, 신경-염증성 장애는 길랑-바레 증후군, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 또는 탈수초성 신경병증이다.
대상체에서 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염과 관련된 호흡기 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 일부 실시형태에서, 호흡기 질환, 장애, 또는 병태는 COVID-19(코로나바이러스 질환) 매개 급성 호흡 곤란 증후군(CoV-ARDS)이다.
대상체에서 사이토카인 방출 증후군(CRS)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 일부 실시형태에서, CRS는 키메라 항원 수용체 T-세포 요법과 관련된다.
일부 실시형태에서, 유효량의 인간 Treg 세포의 집단이 대상체에게 정맥내 투여된다.
일부 실시형태에서, 유효량의 인간 Treg 세포의 집단은 약 1x106개 내지 약 1x107개의 Treg 세포/대상체의 체중 kg이다. 일부 실시형태에서, 유효량의 인간 Treg 세포의 집단은 약 1x108개 Treg 세포 내지 약 3x108개 Treg 세포이다.
일부 실시형태에서, 유효량의 인간 Treg 세포의 집단을 투여한 후, 대상체에서 순환 염증성 사이토카인 수준은 투여 전 대상체에서 순환 염증성 사이토카인 수준에 비해 감소된다.
일부 실시형태에서, 치료 전에, 대상체가 유효량의 인간 Treg 세포의 집단에 반응할지 여부를 결정하기 위해 대상체의 혈청 바이오마커를 검사한다. 일부 실시형태에서, 치료 후, 임상 반응과의 상관관계를 결정하기 위해 대상체의 혈청 바이오마커를 검사한다. 일부 실시형태에서, 혈청 바이오마커를 연속적으로 검사하여 Treg 세포를 사용한 후속 재치료가 필요한지 여부를 검사한다.
일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 본원에 개시된 방법에 의해 치료될 대상체에 적합한 혈액형의 하나 이상의 제대혈 유닛으로부터 제조된다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 본원에 개시된 방법에 의해 치료될 대상체에 대해 6개 중 적어도 3개 HLA(인간 백혈구 항원) 매치인 제대혈 유닛으로부터 제조된다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 본원에 개시된 방법에 의해 치료될 대상체에 대해 HLA 매치가 아닌 제대혈 유닛으로부터 제조된다.
약제의 제조에서의, 본원에 개시된 인간 Treg 세포의 집단의 용도가 본원에 추가로 제공된다.
도 1은 실온(15 내지 30℃) 또는 4℃에서 저장된 신선한 활성화된 Treg 세포의 생존율(7AAD)을 측정하는 분석 결과를 보여주는 선 그래프이다. N=9.
도 2a 내지 도 2b는 확장된 활성화된 Treg 세포가 면역억제성이라는 것을 보여주는 일련의 그래프를 도시한다. 억제 분석을 위해 통상적인 T 세포(Tcon)(CD4+CD25-) 세포를 해동하고 제조사의 지침에 따라 CellTrace™ Violet(ThermoFisher)로 염색하였다. CD3/CD28 비드에 의한 지속적인 활성화의 존재 하에 제대혈 Treg 및 Tcon을 다양한 비로 배치하고 3일 후 유세포 분석을 사용하여 분석했다. 도 2a는 다른 비로 Treg와 공동 배양할 때 증식하는 통상적인 T 세포의 상당한 억제를 도시한다. 도 2b는 HLA 매치 쌍(p=0.03) 및 HLA 미스매치 쌍(p=0.03, 양면 t-검정)에서 0일차에 새로 단리된 제대혈 Treg와 비교할 때 14일차에 수확된 활성화된 확장된 제대혈 Treg의 억제 능력이 유의하게 증가되었음을 도시한다. (n=2)
도 3은 활성화된 Treg 세포가 HLA 장벽을 가로질러 면역억제성일 수 있음을 보여주는 선 그래프이다. 이종 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 모델(문헌[Parmar et al., Cytotherapy 16(10:90-100 (2013)])을 사용하여, 비-SCID 감마 널(NSG) 마우스에 준치사량의 방사선을 조사한 다음, HLA A2 양성 공여자로부터 유래된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 1x107개의 세포의 용량으로 주입하여 GVHD를 유도하였다. 처리 아암에서, HLA A2 음성 공여자로부터 유래된 제대혈 Treg를 PBMC 주입 하루 전에 1x106개의 세포의 용량으로 주입하였다. 마우스의 생존을 추적했다. 1 로그 더 적은 용량에서도 CB Treg는 GVHD의 해로운 영향을 구제할 수 있었고 PBMC 단독 투여 아암과 비교하여 40일차에 통계적으로 유의한 우월한 생존(로그 순위; p=0.003)을 보였다.
도 4a 내지 도 4d는 확장된 활성화된 Treg 세포가 계속 억제성을 유지하고, RORγt를 발현하지 않으며, 스트레스에 대한 반응으로 IL-10 발현의 상호 증가를 나타내는 것을 보여주는 일련의 그래프 및 플롯을 도시한다. 제대혈 Treg는 IL-2 및 CD3/CD28 공동 발현 비드의 존재 하에 배양물에서 확장되었다. 세포는 또한 0 ng/ml, 40 ng/ml, 또는 200 ng/ml IL-6으로 처리되었다. 48시간마다 세포에 영양을 공급하고, RORγt의 세포내 염색 및 IL-10 및 IL-17에 대한 사이토카인 방출 분석에 대해 유세포 분석 기반 분석을 수행했다.
도 5a 내지 도 5d는 동결보존된 제대혈(CB) Treg 세포가 신선한 CB Treg 세포와 비교하여 유사한 억제자 기능을 갖는다는 것을 보여주는 그래프를 도시한다. 도 5a: 양성 대조군은 CD3/28 비드가 있는 Tcon 세포를 포함한다. 도 5b: 음성 대조군 - CD3/28 비드가 없는 Tcon 세포. 도 5c: 신선한 CB Treg 세포의 공동 배양은 Tcon 세포 증식을 억제한다. 도 5d: 동결보존된 CB Treg 세포의 공동 배양은 Tcon 세포 증식을 억제한다.
도 6은 확장된 제대혈 Treg가 T 세포 수용체 Vβ 레퍼토리의 가우스(다클론) 분포를 나타낸다는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 시판 키트(Tel-Test, Friendswood, TX)를 사용하여 Treg에서 총 RNA를 추출하고, 역전사(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 cDNA를 준비했다. 그 다음, CDR3 영역을 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 23개의 TCR Vβ 부분 집합에 대해 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 모세관 전기영동 및 정량적 농도측정법에 적용하여 각 TCR Vβ 패밀리 내에서 단편 길이의 다양성을 평가했다.
도 7a 내지 도 7b는 확장된 제대혈 Treg가 덱사메타손("Dex" 또는 "스테로이드"로 지칭됨)의 존재 하에 억제성을 유지함을 보여준다. "Tcon"은 통상적인 T 세포를 지칭한다. "Treg"는 조절 T 세포를 지칭한다. 왼쪽 상단과 왼쪽 하단 패널은 스테로이드(-)이다. 상단 오른쪽 및 하단 오른쪽 패널은 100 μg/mL 스테로이드이다.
도 8a 내지 도 8c는 동결보존된 활성화된 Treg 세포가 일관된 표현형을 나타내고 신선한 활성화된 Treg 세포와 유사한 면역억제 능력이 있음을 도시한다. 도 8a는 해동 시 동결보존된 Treg에서의 CD25, CD8, 및 CD127 발현을 도시한다. 도 8b는 동결보존된 Treg가 헬리오스 및 FoxP3의 높은 발현을 나타냄을 도시한다. 도 8c는 동결보존된 Treg가 CellTrace™ Violet 염료 기반 억제 분석을 사용하여 통상적인 T 세포 증식을 억제함을 도시한다.
도 9a 내지 도 9b는 이종 마우스 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 모델을 사용한 연구 결과를 보여준다. 이종 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 모델(문헌[Parmar et al., Cytotherapy 16(10:90-100 (2013)])을 사용하여, 신선한 활성화된 Treg 세포 또는 동결보존(동결된) 활성화된 Treg 세포는 GVHD 예방에 대해 1x107개 세포의 용량으로 공여자 말초혈 단핵 세포보다 하루 전에 1x107개 세포의 용량으로 투여되었다. 도 9a는 GVHD 점수에 대한 신선한 활성화된 Treg 세포 또는 동결보존된(동결된) 활성화된 Treg 세포의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 9b는 마우스의 체중에 대한 신선한 활성화된 Treg 세포 또는 동결보존(동결된) 활성화된 Treg 세포의 효과를 나타내는 그래프이다. "CB"는 제대혈을 지칭한다. "PBMC"는 말초 혈액 단핵 세포를 지칭한다.
도 10a 내지 도 10b는 이종 마우스 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 모델을 사용한 연구 디자인을 보여준다. 도 10a는 NSG 마우스에 -1일차에 준치사량의 방사선을 조사한 다음 0일차에 제대혈(CB) Treg - 1x107개의 세포를 주입하고 PBMC - 1x107개의 세포를 주입하는 GVHD 예방 연구 디자인을 도시한다. 그 후, 체중 및 GVHD 점수의 측정을 위해 마우스를 격일로 추적한다. 말초 혈액 및 혈청은 기준선에서 그리고 그 후 +7일차에 시작하여 매주 간격으로 채취된다. 도 10b는 NSG 마우스에 -1일차에 준치사량의 방사선을 조사하고 0일차에 PBMC - 1x107개의 세포를 주입하는 GVHD 치료 연구 디자인을 도시한다. CB Treg - 1x107개의 세포 주사는 +4, +11, +18, 및 +25일차에 투여된다. 그 후, 체중, GVHD 점수 및 생존의 측정을 위해 마우스를 격일로 추적한다. 말초 혈액 및 혈청은 기준선에서 그리고 그 후 +7일차에 시작하여 매주 간격으로 채취된다. "PBMC"는 말초 혈액 단핵 세포를 지칭한다. "동결된 Treg"는 동결보존된 Treg를 지칭한다. "NSG"는 비-SCID 감마 널 마우스를 지칭한다.
도 11a 내지 도 11b는 이종 마우스 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 모델에서 체중 변동(도 11a) 및 생존(도 11b)에 대한 동결보존된 활성화된 Treg 투여의 효과를 도시한다. "예방"은 도 10a에 도시된 연구 디자인을 지칭한다. "치료"는 도 10b에 도시된 연구 설계를 지칭한다. "대조군"은 Treg 세포가 투여되지 않은 음성 대조군을 지칭한다.
도 12a 내지 도 12f는 대조군, 예방 및 치료 아암의 이종 마우스 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 모델에서 기준선일, PBMC 주입 후 +7일차 및 +14일차의 말초 혈액 사이토카인 분석 결과를 도시한다. 도 12a: IP-10; 도 12b: TNFα; 도 12c: GM-CSF; 도 12d: MIP-1β; 도 12e: FLT-3L; 도 12f: IFN-γ.
도 13은 활성화된 Treg(제대혈(CB) Treg 단독) 또는 활성화된 Treg 및 PBMC(CB Treg + PBMC)로 처리된 마우스의 이미지를 도시한다. 반딧불이 루시페라아제 표지된 CB Treg 주입 후 생물발광 스캐닝은 주입 후 +1일차까지 PBMC 주입에 관계없이 모든 마우스의 폐, 간, 및 비장에서 CB Treg가 검출되었음을 보여주었다. +3일차까지, CB Treg는 마우스에서 PBMC의 지속적인 존재 없이 더 이상 검출될 수 없었지만(CB Treg 단독) PBMC 수용자 마우스에서는 계속 검출되었다(CB Treg + PBMC). 증식하는 PBMC를 가진 마우스에서 스캔은 GVHD 표적 기관에서 지속성 및 심지어 증식을 시사한다.
도 14는 활성화된 Treg로 처리된 마우스의 이미지를 도시한다. GFP-표지된 HL-60 급성 골수성 백혈병(AML) 세포주를 모든 4개의 아암의 NSG 마우스에 3x106개의 세포의 용량으로 주입하였다: 1) 대조군 마우스(PBS & AML): HL60+PBS 받음; 2) Treg 마우스(AML + Treg): HL60+Treg(1x107개 세포) 받음; 3) Tcon 마우스(AML + Tcon): HL60+Tcon(1x107개 세포) 받음; 4) Tcon+Treg 마우스(AML + Tcon + Treg): HL60 + Tcon(1x107개 세포) + Treg(1x107개 세포) 받음. 종양 부피 부하에 대한 주입된 Tcon 및 Treg의 영향을 이해하기 위해 마우스를 매주 이미징하였다. 마우스는 대조군(PBS 처리) 및 CB Treg 단독 처리 마우스에서 종양에 굴복했다. Tcon의 수용자는 종양을 제거할 수 있었지만 GVHD로 사망했다. Tcon 및 Treg의 수용자는 종양 제어 및 GVHD의 부재로 연장된 생존을 가질 수 있었다.
도 15는 활성화된 Treg 세포의 단회 주입이 SLE-PBMC(3x106개 세포)가 NSG 마우스에 주입되고 CB Treg(1x107개 세포)가 SLE-PBMC 주사 1주 후에 주입된 전신성 홍반성 루푸스(SLE)의 이종 마우스 모델에서 SLE-PBMC의 생착 후 9주 동안 CD45+ 이펙터 T 세포의 수준을 감소시켰다는 것을 나타내는 선 그래프를 도시한다. "PBMC"는 말초 혈액 단핵 세포를 지칭한다.
도 16a는 SLE-PBMC(3x106개 세포) 주사 후 4주에 시작하여 활성화된 Treg 세포(1x107개 세포)의 매주 4회 주사가 전신 홍반성 루푸스(SLE)의 이종 마우스 모델에서 생존을 개선하였다는 것을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 16b는 활성화된 Treg 세포의 매주 4회 주사가 전신 홍반성 루푸스(SLE)의 이종 마우스 모델에서 항-이중 가닥 DNA 항체(ds DNA Ig)의 수준을 감소시켰다는 것을 보여주는 막대 그래프를 도시한다.
도 17a 내지 도 17b는 활성화된 Treg 세포의 매주 4회 주사가 전신 홍반성 루푸스(SLE)의 이종 마우스 모델에서 소변 알부민의 수준을 감소시키고(도 17a) 소변 크레아티닌 누출을 감소시켰다(도 17b)는 것을 보여주는 플롯을 도시한다.
도 18은 활성화된 Treg 세포의 매주 4회 주사가 전신 홍반성 루푸스(SLE)의 이종 마우스 모델에서 신장 조직학을 개선하였다는 것을 보여주는 일련의 이미지를 도시한다.
도 19는 활성화된 Treg의 투여가 전신성 홍반성 루푸스(SLE)의 이종 마우스 모델에서 인간 sCD40L의 혈청 농도를 감소시킨다는 것을 보여주는 통계적 분석의 결과 및 그래프를 도시한다.
도 20a 내지 도 20b는 전신 홍반성 루푸스(SLE)의 이종 마우스 모델에서 활성화된 동결보존된 Treg의 매주 주사가 순환 CD8+ 이펙터 T 세포를 지속적으로 감소시켰을 뿐만 아니라(도 20a) 비장, 골수, 폐 및 간에서 CD8+ 이펙터 T 세포의 침윤을 감소시켰다(도 20b)는 것을 보여주는 그래프를 도시한다. "PBMC"는 말초 혈액 단핵 세포를 지칭한다.
도 21a 내지 도 21d는 다발성 골수종의 이종 마우스 모델에서 Treg의 투여 효과를 보여주는 일련의 그래프 및 이미지를 도시한다. 도 21a는 시간 경과에 따른 마우스 체중에 대한 효과를 나타내는 선 그래프이다. CB Treg 수용자는 체중을 보존하는 반면 "골수종 단독" 아암에서의 감소는 종양 접종 후 약 4주차부터 체중 감소를 나타낸다. 도 21b는 시간 경과에 따른 말초 혈액 내 순환 골수종 세포에 대한 효과를 나타내는 선 그래프이다. 매주 혈액 채취를 수행하고 단리된 세포에서 순환 중인 인간 CD38+ 세포를 분석하였다. 순환 골수종 세포의 상당한 증가는 Treg 수용자와 비교하여 "골수종 단독" 아암에서 분명했다(p=0.002). 도 21c는 종양 부하 시각화를 보여주는 일련의 이미지를 도시한다. 매주 생물발광 이미징으로 모니터링한 바와 같이, "골수종 단독" 마우스에서의 광범위한 종양과 비교하여 CB Treg 수용자에서 MM1S 세포의 최소 증거가 시각화되었다. 도 21d는 시간 경과에 따른 종양 부하 정량화를 보여주는 선 그래프이다. 생물발광 이미징의 적격성 평가에서 17일, 24일, 및 31일에 훨씬 더 높은 신호가 관찰되었다. 삼각형은 CB Treg i.v 주사를 나타내고 화살표는 MM1S 세포 i.v. 주사를 나타낸다.
도 22는 활성화된 Treg의 투여가 다발성 골수종의 이종 마우스 모델에서 생존을 개선한다는 것을 보여주는 그래프를 도시한다. 이종 골수종 모델에서, 골수종 세포 주사 전 제대혈(CB) Treg 주사는 "골수종 단독" 아암에 비해 전체 생존을 개선하였다. P = 0.039는 로그 순위 테스트에 의해 결정되었다.
도 23은 활성화된 Treg의 투여가 다발성 골수종의 이종 마우스 모델에서 혈장 IL-6 수준을 감소시킨다는 것을 보여주는 막대 그래프를 도시한다. 이종 골수종 마우스 모델에서, 골수종 세포 주사 하루 전 제대혈(CB) Treg 주사는 골수종 생착을 방지하고 혈청 염증성 사이토카인 IL-6의 수준 감소와 상관관계가 있는 전체 생존을 개선하였다. 순환 혈장 마우스 IL-6 수준의 측정은 28일차 및 35일차에 "골수종 단독" 마우스와 비교하여 더 낮은 수준을 나타냈다. 평균 ± SEM. *P < 0.0001, **P < 0.001, ***P<0.01는 각 시점에서 페어링되지 않은 스튜던트 t-검정에 의해 결정되었다.
도 24a 내지 도 24b는 활성화된 Treg 세포의 투여가 다발성 골수종의 이종 마우스 모델에서 골수(도 24a) 및 비장(도 24b)에서 골수종 부담을 감소시켰음을 보여주는 막대 그래프를 도시한다. 각 그룹의 3마리의 마우스를 안락사시키고 25일차에 기관을 수확하였다. 골수 및 비장의 세포를 CD38 항체로 염색하고 유세포 분석에 의해 MM.1S 세포의 집단을 분석하였다.
도 25는 세포가 IL-6에 노출되었을 때 제대혈로부터 단리된 활성화된 Treg 세포에 의한 사이토카인 그랜자임 B의 분비를 도시한다.
도 26은 실시예 9에 기재된 바와 같은 근위축성 측삭 경화증의 치료에서 제대혈 유래 T 조절 세포 투여의 안전성 및 효능을 평가하기 위한 임상 시험에 대한 타임 라인을 도시한다.
도 27은 실시예 10에 기재된 바와 같은 COVID-19(코로나바이러스 질환) 매개 급성 호흡곤란 증후군(CoV-ARDS)의 치료에서 제대혈 유래 T 조절 세포 투여의 안전성 및 효능을 평가하기 위한 임상 시험에 대한 프로토콜의 도표를 도시한다.
도 28은 골수 부전을 앓고 있는 대상체의 치료에서 제대혈 유래 T 조절 세포 투여의 안전성 및 효능을 평가하기 위한 1상 임상 시험의 초기 결과의 요약을 도시한다.
도 29는 활성화된 인간 Treg 세포의 집단을 포함하는 다양한 생성물에 대한 제대혈 선택 기준을 제공하는 표이다. "AABB"는 미국 혈액 은행 협회를 지칭한다. "FACT"는 세포 치료 인증 재단을 지칭한다. "CLIA"는 임상 실험실 개선 수정안을 지칭한다.
도 30은 활성화된 인간 Treg 세포의 집단을 포함하는 다양한 생성물에 대한 제대혈 선택 기준을 제공하는 표이다. "CK0802.a4b7"은 "CK0802.α4β7"을 지칭한다.
도 31은 Treg 세포, Tcon 세포 및 룩소리티닙의 공동 배양 개시 후 96시간에 0.05 μM 룩소리티닙의 부재 또는 존재 하에 활성화된 Treg 세포에 의한 억제율을 도시하는 선 그래프이다. x축은 Tcon 세포에 대한 Treg 세포의 비를 나타낸다. Ruxo = 룩소리티닙.
도 32는 (1) 활성화된 Treg 세포; (2) 룩소리티닙; 및/또는 (3) 캄토테신의 조합의 존재 또는 부재 하에 병원성 루푸스 세포에 의해 방출된 인터페론(IFN) - 감마의 양을 도시하는 막대 그래프이다. Rux = 룩소리티닙. SLE-PBMC = 전신성 홍반성 루푸스가 있는 대상체로부터 유래된 말초 혈액 단핵 세포. D6 = 6일차.
도 33은 룩소리티닙 및 활성화된 Treg 세포 요법을 사용한 이종 마우스 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 모델의 치료에 대한 개략도를 도시한다. PBMC = 말초 혈액 단핵 세포.
도 34a 내지 도 34b는 이종 마우스 GVHD 모델에서 GVHD 점수(도 34a) 또는 생존율(도 34b)에 대한 (1) 활성화된 Treg 세포; (2) 룩소리티닙; 또는 (3) 활성화된 Treg 세포 및 룩소리티닙을 사용한 치료의 효과를 나타내는 그래프를 도시한다. Rux 또는 R = 룩소리티닙. PBMC = 말초 혈액 단핵 세포.
도 35a 내지 도 35c는 이종 마우스 GVHD 모델에서 활성화된 Treg 세포 지속성에 대한 (1) 활성화된 Treg 세포; (2) 룩소리티닙; 또는 (3) 활성화된 Treg 세포 및 룩소리티닙을 사용한 치료의 효과를 보여주는 일련의 막대 그래프를 도시한다. 도 35a는 인간 CD45 세포의 백분율을 나타낸다. 도 35b는 CD4 및 CD45를 공동 발현하는 인간 CD45 세포의 백분율을 나타낸다. 도 35c는 표지된 CB Treg 세포인 인간 CD45 세포의 백분율을 나타낸다. Rux 또는 R = 룩소리티닙.
도 36a 내지 도 36c는 이종 마우스 GVHD 모델에서 사이토카인 분비에 대한 (1) 활성화된 Treg 세포; (2) 룩소리티닙; 또는 (3) 활성화된 Treg 세포 및 룩소리티닙을 사용한 치료의 효과를 보여주는 일련의 막대 그래프를 도시한다. 도 36a는 혈장 IL-7의 정규화된 수준을 도시한다. 도 36b는 혈장 IL-15의 정규화된 수준을 도시한다. 도 36c는 혈장 IL-4의 정규화된 수준을 도시한다. Ruxo = 룩소리티닙.
도 37a 내지 도 37e는 이종 마우스 GVHD 모델에서 염증성 사이토카인 분비에 대한 (1) 활성화된 Treg 세포; (2) 룩소리티닙; 또는 (3) 활성화된 Treg 세포 및 룩소리티닙을 사용한 치료의 효과를 보여주는 일련의 막대 그래프를 도시한다. 도 37a는 혈장 IL-1a의 정규화된 수준을 도시한다. 도 37b는 혈장 IL-17의 정규화된 수준을 도시한다. 도 37c는 혈장 IFNa2의 정규화된 수준을 도시한다. 도 37d는 혈장 FGF-12의 정규화된 수준을 도시한다. 도 37e는 혈장 대식세포 유래 케모카인(MDC)의 정규화된 수준을 도시한다. Ruxo = 룩소리티닙.
도 38a 내지 도 38c는 이종 마우스 GVHD 모델에서 항-염증성 사이토카인 분비에 대한 (1) 활성화된 Treg 세포; (2) 룩소리티닙; 또는 (3) 활성화된 Treg 세포 및 룩소리티닙을 사용한 치료의 효과를 보여주는 일련의 막대 그래프를 도시한다. 도 38a는 혈장 IL-1RA의 정규화된 수준을 도시한다. 도 38b는 혈장 IL-1a3의 정규화된 수준을 도시한다. 도 38c는 혈장 IL-12p70의 정규화된 수준을 도시한다. Ruxo = 룩소리티닙.
도 39a 내지 도 39b는 이종 마우스 GVHD 모델에서 혈액학적 파라미터에 대한 (1) 활성화된 Treg 세포; (2) 룩소리티닙; 또는 (3) 활성화된 Treg 세포 및 룩소리티닙을 사용한 치료의 효과를 보여주는 일련의 막대 그래프를 도시한다. 도 39a는 헤모글로빈 수준을 나타낸다. 도 39b는 혈소판 수준을 나타낸다. Rux 또는 R = 룩소리티닙.
도 40a는 트랜스웰 이동 분석의 개략도이다. 표적 세포는 골수종 세포 또는 백혈병 세포(음성 대조군)이다. 액터 세포는 CB Treg 세포 또는 Teff 세포이다.
도 40b 내지 도 40f는 골수종 및 백혈병 표적 세포 이동에 대한 CB Treg 세포의 효과를 보여주는 일련의 막대 그래프를 도시한다. 도 40b는 CB Treg가 감소하고 Teff 세포가 MM1S(골수종 세포주) 이동을 완전히 차단한다는 것을 도시한다(p<0.001). 도 40c는 CB Treg가 감소하고 Teff 세포가 RPMI8226(골수종 세포주) 이동을 완전히 차단한다는 것을 도시한다(p=0.04). 도 40d는 CB Treg가 U266(골수종 세포주) 이동을 감소시키지만 유의하게 감소시키지 않는다는 것을 도시한다. Teff 세포는 U266 이동을 차단한다. 도 40e는 CB Treg 및 Teff 세포가 HL-60(급성 골수성 백혈병 세포주)의 이동에 영향을 미치지 않음을 도시한다. 도 40f는 CB Treg 및 Teff 세포가 Nalm6(전-B 세포 백혈병 세포주)의 이동에 영향을 미치지 않음을 도시한다. **P < 0.05는 각 시점에서 페어링되지 않은 스튜던트 t-검정에 의해 결정되었다. 도 40b 내지 도 40d의 y축은 세포 수 x 103/μL를 나타낸다.
도 41은 골수 부전(BMF) 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험을 위한 디자인의 개략도를 도시한다.
도 42는 BMF 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험의 임상 데이터를 요약한 도표를 도시한다.
도 43은 BMF 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험의 임상 데이터를 요약한 표를 도시한다.
도 44는 BMF 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험으로부터의 반응 데이터의 지속성을 요약한 그래프를 도시한다.
도 45는 BMF 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험에서 환자 1의 치료 이력을 요약한 도표를 도시한다.
도 46a 내지 도 46b는 기준선 및 Treg 세포 투여 1개월 및 4개월 후 BMF 환자의 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험에서 환자 1의 임상 데이터를 도시한다.
도 47은 BMF 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험에서 환자 1의 염증성 사이토카인 수준을 도시하는 일련의 그래프이다. x축은 Treg 세포를 투여한 후의 일수를 나타낸다. 왼쪽 상단 패널: CXCL-5. 오른쪽 상단 패널: IL-17. 왼쪽 하단 패널: IL-15. 오른쪽 하단 패널: MCP.
도 48은 BMF 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험에서 환자 1의 염증성 사이토카인 수준을 도시하는 일련의 그래프이다. x축은 Treg 세포를 투여한 후의 일수를 나타낸다. 왼쪽 상단 패널: IL-8. 오른쪽 상단 패널: sCD40L. 왼쪽 하단 패널: MIP-1. 오른쪽 하단 패널: SDF-1α + 1β.
도 49는 기준선 및 Treg 세포 투여 1개월 및 4개월 후 BMF 환자의 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험에서 환자 1의 비장 비대 측정을 보여주는 막대 그래프를 도시한다.
도 50은 BMF 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험에서 환자 2의 치료 이력을 요약한 도표를 도시한다.
도 51은 BMF 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험에서 환자 2의 염증성 사이토카인 수준을 나타내는 일련의 그래프이다. x축은 Treg 세포를 투여한 후의 일수를 나타낸다.
도 52는 BMF 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험에서 환자 3의 시간 경과에 따른 TPO 수준을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 53은 BMF 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험에서 환자 3에 대한 시간 경과에 따른 혈소판(PLT) 수혈 요건을 도시한다.
도 54는 BMF 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험에서 환자 3에 대한 시간 경과에 따른 패킹된 적혈구(PRBC) 수혈 요건을 도시한다.
도 55는 BMF 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험에서 환자 4에 대한 시간 경과에 따른 혈소판(PLT) 수혈 요건을 도시한다.
도 56은 BMF 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험에서 환자 4에 대한 시간 경과에 따른 패킹된 적혈구(PRBC) 수혈 요건을 도시한다.
도 57은 BMF 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험에서 환자 6에 대한 시간 경과에 따른 혈소판(PLT) 수혈 요건을 도시한다.
도 58은 BMF 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험에서 환자 6에 대한 시간 경과에 따른 패킹된 적혈구(PRBC) 수혈 요건을 도시한다.
도 59a 내지 도 59d는 i) 모의-키메라 항원 수용체(CAR) T 세포, ii) 제대혈 유래 Treg 세포, iii) CD19-CAR T 세포, 또는 (iv) 제대혈 유래 Treg 세포 + CD19-CAR T 세포로 처리된 이종 림프종 마우스 모델의 연구로부터의 데이터를 도시한다.
도 60a 내지 도 60b는 i) 모의-키메라 항원 수용체(CAR) T 세포, ii) 제대혈 유래 Treg 세포, iii) CD19-CAR T 세포, 또는 (iv) 제대혈 유래 Treg 세포 + CD19-CAR T 세포로 처리된 이종 림프종 마우스 모델의 연구로부터의 데이터를 요약한 표를 도시한다. 도 60a는 다양한 그룹에 대한 생존 시간의 비교를 도시한다. 도 60b는 다양한 기관에서 CD19-CAR T 세포/μL를 도시한다.
도 61a 내지 도 61h는 다발성 골수종의 이종 마우스 모델에서 Treg의 다중 용량(multiple doses)의 투여 효과를 보여주는 일련의 그래프 및 이미지를 도시한다. 도 61a는 하기가 투여된 마우스의 시간 경과에 따른 마우스 체중에 대한 효과를 나타내는 선 그래프이다: (1) MM.1S 골수종 세포 단독; (2) 골수종 세포 및 CD3+ T 통상적인 세포(Tcon); (3) 골수종 세포 및 제대혈 유래 Treg 세포(Treg); 또는 (4) 골수종 세포, Tcon 세포 및 Treg 세포(Tcon Treg). 도 61b는 CD3+ T 통상적인 세포(Tcon)로 또는 Tcon 세포와 Treg 세포의 조합(Treg가 있는 Tcon)으로 처리된 마우스의 비침습성 생물발광 이미징(BLI)으로 생성된 일련의 이미지를 도시한다. 도 61c는 BLI에 의한 종양 부하 정량화를 도시하는 선 그래프이다. 도 61d는 Tcon 세포 단독으로 처리한 마우스에서 골수외 재발의 예를 나타내는 이미지이다. 도 61e는 Treg 세포와 함께 CD3 및 BCMA(BiTE®)에 대한 이중특이적 T-세포 인게이저의 투여를 위한 실험 디자인을 도시한다. 도 61f는 BiTE® 및 PanT 세포로 또는 BiTE®, PanT, 및 Treg 세포의 조합으로 처리한 마우스의 비침습성 BLI로 생성된 일련의 이미지를 도시한다. 도 61g는 BiTE®-매개 체중 감소에 대한 Treg 투여의 효과를 보여주는 선 그래프이다. 도 61h는 GVHD(이식편 대 숙주 질환) 점수에 대한 Treg 투여의 효과를 보여주는 막대 그래프이다.
건강한 조절 T 세포(Treg)는 흉선 결실을 피하거나 흉선외 항원을 인식하는 이들 세포의 활성화 및 증식을 방지함으로써 자가-반응성 세포독성 T 세포로부터 신체를 보호한다. 따라서, Treg는 항상성 및 면역 조절뿐만 아니라 자가면역의 발달로부터 숙주를 보호하는 데 중요하다. 또한, 주입 및 선천적 Treg는 둘 모두 하기로 인해 염증 부위를 일으킨다: i) Treg의 생존에 필수적인 잉여 IL-2를 생성하는 증식하는 이펙터 T 세포; 및 ii) 조직에 존재하는 손상된 항원 제시 세포/수지상 세포에 의해 방출되는 귀소 신호.
여러 유형의 Treg가 설명되었지만, 가장 잘 특성화되고 가장 강력한 부분 집합은 CD4와 높은 수준의 CD25(IL-2Rα) 및 FoxP3, 포크헤드 박스 P3 유전자 생성물 및 CD127lo를 발현한다. 이러한 CD4+CD25+FoxP3+CD127lo Treg는 흉선에서 발달하고 흉선 선택을 받는 자연 Treg(nTreg)와 변형 성장 인자 β(TGFβ)와 같은 사이토카인의 영향 하에 말초에서 발달하는 유도된 Treg(iTreg)로 더 세분화될 수 있다. (문헌[Ohkura et al., Immunity 38(3):414-23 (2013)] 참조).
자연 상태에서, Treg 세포는 선천 면역 및 후천 면역 둘 모두를 조절함으로써 면역 항상성을 유지하고 자가면역 반응을 제한하는 데 중요한 역할을 한다. Treg는 말초 내성을 유지하고 자가면역 반응과 병원성 조직 손상을 억제함으로써 면역 항상성에 필수적이다. (문헌[Burrell et al., J. Immunol 189(10):4705-11 (2012)]; 문헌[Schneidawind et al., Blood 122(18):3116-21 (2013)]; 및 문헌[Tang et al., Col Spring Harb Perspect Biol 5(11):a015552 (2013)] 참조). 그러나, 자가면역 질환에서, 결함이 있는 내인성 Treg는 자가-반응성 세포독성/이펙터 T 세포의 맹공격으로부터 신체를 효과적으로 보호할 수 없다.
Treg 요법의 개발에 대한 한 가지 장애물은 조절 T 세포의 불안정성이며, 이는 종종 염증 이펙터 T 세포 표현형으로 "뒤집어"진다. 예를 들어, Treg 세포는 FOXP3의 발현을 하향 조절하여 Hsp70 의존적 방식으로 그리고 E3 유비퀴틴 리가제 Stub1을 활성화함으로써 이펙터 T 세포 유사 기능의 획득을 허용할 수 있다(문헌[Chen et al., Immunity. 2013 Aug 22;39(2):272-85]).
이러한 어려움을 해결하기 위해, 본 개시내용은 제대혈 유래 Treg를 사용한다. 제대혈은 면역원성이 낮고 공공 및 민간 제대혈 은행에서 잉여 상태로 입수 가능하다. 제대혈(CB)은 말초혈(PB)과 구별되는데, 이는 더 억제성이며 다른 후성 유전적 특성과 혈구 비율이 다르기 때문이다. 더욱이, 제대혈 세포는 원시적이고 덜 면역 반응성이며 순진하며 더 높은 증식 지수를 나타내며 인간 백혈구 항원(HLA) 경계를 넘어 기능할 수 있다. 제대혈 공급원은 제대혈 유래 Treg가 다른 Treg 공급원에 비해 순진하고 더 억제성이며 가소성이 부족하기 때문에 고유하다. 마찬가지로, 제대혈 세포는 출산 스트레스 동안 많은 사이토카인에 의해 지속적으로 자극을 받기 때문에 가능한 독성 환경 물질에 덜 민감하다.
Treg 요법의 개발에 대한 또 다른 장애물은 진행 중인 염증을 진압하기 위해 일정 기간에 걸쳐 반복적으로 주입될 수 있는 임상적으로 적절한 세포 수이다. 적어도 하나의 동결보존된 인간 제대혈 유닛으로부터 활성화된 인간 T 조절(Treg) 세포의 확장된 집단을 생성하는 방법이 본원에 개시된다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단이 또한 개시된다. 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하여 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 추가로 개시된다. 적어도 하나의 동결보존된 인간 제대혈 유닛으로부터 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 동결보존하기 위한 방법이 본원에 추가로 개시된다. 면역억제성 Treg 세포의 집단이 본원에 추가로 개시된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 업계의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 본 명세서(정의부분 포함)가 우선한다. 본 명세서 및 청구항 전체에 걸쳐서, 단어 "포함하다", 또는 "포함하는" 또는 "포함한"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수들의 그룹의 포함을 의미하는 것으로 이해될 수 있지만, 임의의 다른 정수 또는 정수들의 그룹의 배제는 아니다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다. 용어 "예를 들어("e.g." 또는 "for example")" 뒤에 오는 모든 예(들)은 완전하거나 제한적인 것을 의미하지 않는다.
구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본원에 사용된 단수형 용어는 단수형 또는 복수형으로 이해된다.
구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다.
수치 바로 앞의 "약"이라는 용어는 수치의 ± 0% 내지 10%, ± 0% 내지 10%, ± 0% 내지 9%, ± 0% 내지 8%, ± 0% 내지 7%, ± 0% 내지 6%, ± 0% 내지 5%, ± 0% 내지 4%, ± 0% 내지 3%, ± 0% 내지 2%, ± 0% 내지 1%, ± 0% 내지 1% 미만, 또는 그 안의 다른 값이나 값 범위를 의미한다. 예를 들어, "약 40"은 40의 ± 0% 내지 10%(즉, 36 내지 44)를 의미한다.
"활성화된" Treg 세포 집단은 염증의 일관된 억제를 유도하는 자극된 Treg 세포를 허용하는 CD3/28 비드에 의한 T 세포 수용체(TCR) 자극의 존재 하에 본원에 명시된 배양 조건 및 세포 밀도 하에 고농도의 인터루킨-2(IL-2)에 지속적으로 노출된 결과 생성된 균질한 세포 집단으로 정의될 수 있다.
본원에 사용된 "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"은 항원에 결합하는 적어도 가변 영역을 함유하는 통상적인 또는 온전한 항체의 일부를 포함하는 통상적인 또는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, 단쇄 Fv(scFv), Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 및 VH 영역(VHH)만을 함유하는 단일 도메인 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "환자" 또는 "대상체"는 인간, 사육 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠, 및 애완 동물을 포함하는 임의의 포유동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 및 소, 양, 돼지, 염소를 포함한 농업용 동물을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 하나의 바람직한 포유동물은 성인, 어린이 및 노인을 포함하는 인간이다. 대상체는 또한 개, 고양이 및 말을 포함하는 애완 동물일 수 있다. 농업용 동물의 예는 돼지, 소 및 염소를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 달리 명시되지 않는 한 이러한 용어가 적용되는 질환, 장애 또는 병태 또는 이러한 질환, 장애, 또는 병태의 하나 이상의 증상을 역전, 완화, 억제, 또는 예방하는 것을 의미하며 증상 또는 합병증의 발병을 예방하거나 증상 또는 합병증을 완화하거나 질환, 병태 또는 장애를 제거하기 위한 본원에 기재된 임의의 조성물, 약학 조성물, 또는 투여 형태의 투여를 포함한다. 일부 경우, 치료는 치유적 또는 호전적(ameliorating)이다.
본원에 사용된 바와 같이, "예방하는"은 예를 들어, 질환, 장애, 또는 병태와 같은 예방할 사물 또는 사건의 생성 또는 발생을 전체적으로 또는 부분적으로 예방하거나, 개선 또는 제어하거나, 감소 또는 정지시키는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "치료학적 유효량" 및 "유효량" 등의 어구는 개선 또는 대안적으로 치유 효과와 같은 치료 효과를 달성하기 위해 환자, 또는 환자의 세포, 조직 또는 기관에 투여하는 데 필요한 양을 나타낸다. 유효량은 연구자, 수의사, 의사 또는 임상의가 추구하는 세포, 조직, 시스템, 동물, 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 이끌어내기에 충분하다. 적절한 유효량 또는 치료 유효량의 결정은 당업계의 통상적인 기술 수준 내에 있다.
본원에 사용된 용어 "투여하는", "투여하다", "투여"는 치료를 필요로 하는 대상체에게 제제를 이동, 전달, 도입, 또는 수송하는 임의의 방식을 지칭한다. 이러한 방식은 안구내, 경구, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 피내, 비강내, 및 피하 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
T-조절 세포의 확장된 집단을 생성하는 방법
Treg 세포는 순환 혈액 또는 제대혈에서 낮은 빈도로만 존재하기 때문에 임상적으로 관련된 Treg 세포 용량을 생성하려면 CD4+CD25+ 표현형을 갖는 Treg 세포의 생체 외 농축 및 확장이 필요하다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 제대혈 은행 및 공여자는 본원에 기재된 방법에서 인간 제대혈을 사용하기 전에 자격을 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간 제대혈 유닛은 미국, 유럽 연합, 또는 공급자 자격 기준을 충족한 다른 지역의 공공 제대혈 은행에 의해 공급된다. 제대혈 유닛의 적격성 평가에는 선별 및 검사를 기반으로 공여자가 관련 전염병의 증거가 없다는 확인이 포함될 수 있다. 하기 중 하나 이상을 포함하는 추가의 선택 기준이 적용될 수 있다: 산모 연령, 잉태 연령, 총 유핵 세포(TNC) 카운트, 사전 동결 세포 생존율, 동결보존 부피, 수집 날짜, 저장 조건, 인종, 민족, 모성 공여자 이력(예를 들어, 전염병 이력, 여행 이력), 가족 병력, 거대 세포 바이러스 혈청 양성, 임신성 당뇨병, 고혈압 등. 선택 기준은 사용 전에 제대혈 유닛의 일관성을 보장하는 것과 관련이 있을 수 있다. 활성화된 인간 Treg 세포의 집단을 포함하는 다양한 생성물에 대한 제대혈 선택 기준이 도 29 및 도 30에 제공된다.
일부 실시형태에서, 세포 출발 물질(CBU)은 해동되고, 세척되고, 면역자성 선택을 사용하여 CD25+ 단핵 세포(MNC)에 대해 농축된다. CD25+ MNC는 인터류킨-2(IL-2) 및 항-CD3/항-CD28 비드가 있는 기체 투과성 배양 장치에 배치된다. 세포는 최대 10일 기간, 최대 12일 기간, 또는 최대 14일 기간 동안 배양 확장된다. 일부 실시형태에서, 세포는 8 내지 10일 동안 또는 10 내지 12일 동안 배양 확장된다. 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 또는 14일차에 확장된 세포를 수확하고 세척하고 면역자성 방법으로 CD3/CD28 비드를 제거한다. 그런 다음 탈-비드(de-bead) 세포가 제형화되고 포장된다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 동결보존된 인간 제대혈 유닛으로부터 활성화된 인간 T 조절(Treg) 세포의 확장된 집단을 생성하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법이 본원에 개시된다: a) 동결보존된 인간 제대혈 유닛을 해동하는 단계; b) 상기 해동된 제대혈 유닛을 기능적으로 폐쇄된 시스템 또는 폐쇄된 시스템에서 희석 및 세척하는 단계; c) CD25+ 세포 표면 발현을 기반으로 하는 이중 선택 방법을 사용하여 자연 발생 Treg 세포를 단리하는 단계; d) 최대 14일 동안, 배양 배지(들)에서, 기체 투과성 배양기에서, 유효량의 인터류킨-2(IL-2)의 존재 하에 그리고 CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약의 존재 하에, 단리된 CD25+ Treg 세포를 생체 외에서 확장하여 활성화된 CD25+ Treg 세포의 집단을 생성하는 단계- 상기 배양 배지는 약 48시간마다 교체됨 -; 및 e) 배양 배지로부터 활성화된 CD25+ 세포를 수확하여 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 생성하는 단계. 일부 실시형태에서, 활성화된 인간 Treg 세포는 특정 표현형을 갖는다. 일부 실시형태에서, 방법은 해동 단계(즉, 단계 a)) 전에 최적의 동결보존된 제대혈 유닛을 선택하기 위한 알고리즘을 사용하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 수확 단계(즉, 단계 f)) 후에 정의된 기준을 기반으로 임상적 사용을 위해 특징적인 표현형을 갖는 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 방출하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 제대혈 유닛(CBU)이 사용된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 이상)의 풀링된 CBU가 사용된다. 일부 실시형태에서, 2 내지 4개의 풀링된 CBU가 사용된다. 일부 실시형태에서, CBU는 건강한 공여자로부터 수집되고 사용 전에 동결된다.
일부 실시형태에서, 동결보존된 인간 제대혈 유닛은 수조(예를 들어, 37℃ +/- 1℃)에서 단일 단계로 해동된다. 일부 실시형태에서, 동결보존된 제대혈 유닛의 해동은 백이 묽은 느낌이 들 때까지 37℃(+/- 1℃) 수조에 침지되는 동안 백을 부드럽게 마사지하는 것을 포함한다. 그런 다음, 세포는 세척 과정을 위해 즉시 옮겨진다.
일부 실시형태에서, 해동된 제대혈 유닛은 자동화 세포 처리 시스템(예를 들어, 기능적으로 폐쇄된 시스템 또는 폐쇄된 시스템)을 사용하여 자동화 세척된다. 일부 실시형태에서, 자동화 세포 처리 시스템은 Sepax 시스템(Biosafe)이다. Sepax 시스템은 특정 혈액 성분을 단리해야 하는 세포 치료에 사용하기 위한 원심 분리 및 펌프 장치이다. 그 원리는 원심 분리를 기반으로 하여 혈액 입자의 밀도와 크기에 따라 분리가 가능하다. 혈액 성분은 개별 백에 수집되어 즉시 수혈이 가능하다. 자동화 세포 처리 시스템은 최대 100 ml의 시작 부피에서 50 내지 150 ml의 최종 부피까지 허용할 수 있다. 초기 부피와 희석 부피 사이의 희석 비는 0.5 내지 2.0배 범위로 조정 가능하다. 세척 사이클은 1 사이클의 표준 세탁을 포함하거나 특정 상황에서는 2 사이클의 높은 세탁을 포함할 수 있다. 자동화 세포 처리 시스템은 초기 생성물의 희석, 삼투압 복원, 세척, 원심 분리, 상청액 추출, 및 세포 재현탁을 자동으로 수행하도록 프로그래밍된다. 일반적으로, 시작 부피는 25 ml로 설정되며; 최종 부피는 100 ml로 설정되고 희석 인자는 1.0으로 설정된다. 세척 시약은 5% 인간 혈청 알부민(HSA)(CSL Behring) 및 10% 덱스트란-40(D-40)(Hospira)을 포함한다. 세척 후, 제대혈 세포는 제대혈 세척 백에 수집된다.
일부 실시형태에서, 기본 세척 배지는 약 20 ml의 25% HSA 및 약 1000 ml의 PBS/EDTA 완충액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 작업 세척 배지는 약 300 ml의 기본 세척 완충액 및 약 50 mg의 염화마그네슘(MgCl2) 및 약 2500 단위의 DNase를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 배지는 X-Vivo 15 배지(Lonza) 및 약 10 ml의 GlutaMAX-1 및 약 100 ml의 해동된 인간 AB 혈청을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세척 배지는 PBS, EDTA, 및 0.5% HSA를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세척 단계는 수동 세척을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 자동 세척을 완료한 후, 작업 세척 배지를 사용하여 세척된 제대혈 세포를 추가 수동 세척하며; 여기서 최종 부피는 200 ml로 구성되고 재구성된 세포를 실온에서 300g에서 10분 동안 원심 분리한다. 마지막으로, 세척된 세포를 0.09 ml에 100x106개의 세포 농도로 재현탁한다.
일부 실시형태에서, CD25에 특이적으로 결합하는 시약은 항-CD25 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시형태에서, CD25에 특이적으로 결합하는 시약은 고체 지지체에 접합된다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 비드, 칼럼 또는 플레이트이다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 자성 마이크로비드이다. 일부 실시형태에서, 비드는 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 아크릴 수지, 유리, 실리카 겔, 폴리스티렌, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 비닐과 아크릴아미드의 공중합체, 디비닐벤젠으로 가교된 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 라텍스 겔, 폴리스티렌, 덱스트란, 고무, 실리콘, 플라스틱, 니트로셀룰로오스, 천연 스펀지, 제어 기공 유리, 금속, 가교 덱스트란 또는 아가로스 겔을 포함한다.
일부 실시형태에서, CD25 마이크로비드는 100x106개 세포당 0.02 ml CD25 마이크로비드의 비로 세척된 제대혈 세포에 첨가된다. 세포와 마이크로비드를 4℃에서 30분 동안 함께 배양한다. 일부 실시형태에서, 강자성 구체로 만들어진 LS 컬럼(Miltenyi)은 외부 자기장과 조합하여 사용되며, 여기서 표지되지 않은 세포는 자유롭게 통과할 수 있는 반면, 자기적으로 표지된 CD25+ 세포는 컬럼 내에서 현탁액에 유지되고 컬럼 매트릭스를 실제로 "결합"하지는 않는다. 이 현탁액은 세포에 가해지는 스트레스를 최소화하고 세포 응집을 방지하여 효율적인 멸균 세척을 가능하게 한다. LS 컬럼은 작업 세척 배지를 사용하여 프라이밍되고 CD25+ 마이크로비드 표지된 세포는 자기장에 부착된 LS 컬럼을 통과할 수 있다. 그런 다음 LS 컬럼을 자기장에서 제거하고 플런저를 사용하여 CD25 마이크로비드에 결합되고 양성 분획 1로 표시된 느슨하게 유지된 세포를 밀어낸다. 이중 선택 방법에서, 양성 분획 1은 이제 프라이밍된 LS 컬럼을 통과할 수 있는 시작 용액으로 기능하고 양성 분획 2가 수집되고 마지막으로 두 양성 분획이 혼합되어 CD25+ 세포의 최종 선택을 얻을 수 있는 단계가 반복된다. 일부 실시형태에서, 이중 강자성 컬럼(예를 들어, LS 컬럼) 방법을 사용하여 CD25+ 세포를 단리한다.
일부 실시형태에서, CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약은 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 항-CD28 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약은 항-CD3 코팅된 비드 및 항-CD28 코팅된 비드(즉, "항-CD3/항-CD28 코팅된 비드")를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 코팅된 비드 대 항-CD28 코팅된 비드는, CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약에 1:1 비로 존재한다. 일부 실시형태에서, CD25+ 세포가 CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약의 존재 하에 배양될 때 CD25+ 세포 대 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드는 1:1 비로 존재한다.
일부 실시형태에서, 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 생성하기 위한 방법에 사용되는 IL-2의 유효량은 최대 약 1000 IU/ml이다. 일부 실시형태에서, IL-2의 유효량은 약 1000 IU/ml이다. 일부 실시형태에서, IL-2는 인간 IL-2이다. 일부 실시형태에서, 단리된 CD25+ Treg 세포는 본원에 기재된 방법의 배양 단계의 바로 시작 시에 IL-2를 포함하는 배양 배지에 현탁된다.
일부 실시형태에서, 배양 단계 동안, 배양 배지는 세포를 방해하지 않고 약 48시간마다 교체된다. 일부 실시형태에서, 배양물은 본원에 기재된 방법의 배양 단계에서 혼합 및 재현탁되지 않는다.
일부 실시형태에서, 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 생성하기 위한 방법에서 약 1x106개의 CD25+ 세포/ml는 CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약의 존재 하에 배양된다. 일부 실시형태에서, CD25+ 세포가 10 cm2의 막 표면적을 갖는 기체 투과성 배양기에서 초기에 배양된다. 일부 실시형태에서, 후속적으로 배양물은 100 cm2의 막 표면적을 갖는 기체 투과성 배양기로 옮겨진다.
일부 실시형태에서, CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약의 존재 하에 배양 14일 후에 약 0.5x109개 내지 약 12x109개, 또는 약 1x109개 내지 약 2x109개 활성화된 CD25+ 세포가 수확된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 제조 방법은 CD4+CD25+ Treg 집단의 50배 이상의 확장을 야기한다. 일부 실시형태에서, 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단은 수확 단계 후에 동결보존된다. 일부 실시형태에서, 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단은 수확 단계 후에 동결보존되지 않고 투여를 위해 빠르게 방출된다.
적어도 하나의 동결보존된 인간 제대혈 유닛으로부터 활성화된 인간 T 조절(Treg) 세포의 확장된 집단을 생성하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법이 본원에 추가로 개시된다: a) 동결보존된 인간 제대혈 유닛을 수조에서 단일 단계로 해동하는 단계; b) 상기 해동된 제대혈 유닛을, 수동 세척 없이 기능적으로 폐쇄된 시스템에서 PBS, EDTA, 및 약 0.5% 인간 혈청 알부민을 포함하는 용액에서 희석 및 세척하는 단계; c) 이중 강자성 컬럼 방법을 사용하여 CD25+ 세포 표면 발현을 기반으로 하는 이중 선택 방법을 사용하여 자연 발생 Treg 세포를 단리하는 단계; d) 최대 10일, 최대 12일, 또는 최대 14일 동안, 배양 배지(들)에서, 기체 투과성 배양기에서, 약 1000 IU/ml의 인터류킨-2(IL-2)의 존재 하에 그리고 항-CD3 및 항-CD28 코팅된 비드의 존재 하에, 단리된 CD25+ Treg 세포를 생체 외에서 확장하여 활성화된 CD25+ Treg 세포의 집단을 생성하는 단계- 상기 배양 배지는 약 48시간마다 교체됨; CD25+ Treg 세포 대 항-CD3 및 항-CD28 코팅 비드가 1:1 비로 존재함; 배양물은 혼합 및 재현탁되지 않음 -; 및 e) 배양 배지로부터 활성화된 CD25+ 세포를 수확하여, 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 생성하는 단계.
수확 후, Treg 세포는 오염, 생존 능력, 순도에 대해 시험되고, 세포 수에 대해 계수되고/계수되거나 유세포 분석을 사용하여 검사될 수 있다.
일부 실시형태에서, 활성 물질(DS)은 T-조절 세포 표현형(CD4+CD25+)을 갖는 유핵 제대혈 세포를 포함하거나 이로 이루어진 액체 세포 현탁액이다. 일부 실시형태에서, DS는 유핵 제대혈 세포를 포함하거나 이로 이루어진 액체 세포 현탁액이며, 이 중 ≥ 약 60%는 T-조절 세포 표현형(CD4+CD25+)을 갖고 < 약 10%는 T 세포독성/억제자 세포 표현형(CD4-CD8+)을 갖는다. 일부 실시형태에서, 최종 생성물(DP)은 최종 부피 50 mL 중 0.5% 인간 혈청 알부민(HSA)과 혈장-Lyte A를 포함하거나 이로 이루어진 부형제 용액에 현탁된 활성 물질을 포함하거나 이로 이루어진 액체 세포 현탁액이다.
일부 실시형태에서, 조건부 CD8+ 세포 고갈 단계는 필요한 경우 최종 제형 전에 활성화된 Treg 세포의 집단에서 CD4-CD8+ 세포독성/억제자 T-세포의 함량을 감소시키기 위해 사용된다. 수확 전에, CD8에 특이적으로 결합하는 시약(즉, 항-CD8 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 사용하고 시약에 결합하는 임의의 세포를 제거하여 배양 배지에서 CD8+ 세포를 고갈시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 시약은 예를 들어 비드, 컬럼, 및 플레이트와 같은 고체 지지체에 접합될 수 있다. 예를 들어, 비드는 항-CD8 항체로 코팅된 자성 마이크로비드일 수 있다. 비드는 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 아크릴 수지, 유리, 실리카 겔, 폴리스티렌, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 비닐과 아크릴아미드의 공중합체, 디비닐벤젠 등과 가교된 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 라텍스 겔, 폴리스티렌, 덱스트란, 고무, 실리콘, 플라스틱, 니트로셀룰로오스, 천연 스펀지, 실리카 겔, 제어 기공 유리, 금속, 가교 덱스트란, 및 아가로스 겔을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에서 일반적으로 사용되는 임의의 재료로 제조될 수 있다.
CD8+ 세포 고갈 후, 본원에 기재된 방법은 CD4-CD8+ 세포의 존재 하에 배양 배지에 남아 있는 세포를 분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 분석은 CD4-CD8+인 배양 배지에 남아 있는 세포의 수를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 배양 배지에 남아 있는 세포의 ≥10%가 CD4-CD8+ 세포인 경우, CD8+ 세포 고갈의 두 번째 라운드를 수행할 수 있다.
세포 배양의 마지막에, 농도가 3x106개의 세포당 100보다 높은 경우 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드의 제거의 추가 단계가 수행될 수 있다.
임상 사용을 위한 특징적인 표현형을 갖는 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 출시하기 위한 기준은 하기를 포함할 수 있다: 7 아미노-액티노마이신-D(7-AAD) 생존 능력 ≥70%, CD4+CD25+ 순도 ≥60%, '유기체가 없는' 그램 염색, 및 내독소 <5 EU/kg.
일부 실시형태에서, 최대 1000배 초과의 대규모 팽창을 갖는 대용량 생성물이 생성될 수 있고, 여기서 세포의 최종 집단은 균질하고 잘 정의된 Treg 세포로서, 최대 14일의 배양 후에 수확되는 세포 수는 대략 0.5x109개 내지 12x109개 Treg 세포이다. 일부 실시형태에서, 최종 생성물은 실온에서 저장할 때 최대 8시간 동안 및 4℃에서 보관할 때 최대 96시간 동안 안정하게 유지될 수 있다.
일부 실시형태에서, CXCR4, α4β7 또는 CD11a의 세포 표면 발현을 강화하기 위해 추가 단계가 수행된다.
일부 실시형태에서, 제조 과정은 하기 단계 중 일부 또는 전부를 포함한다:
단계 1: 제대혈 유닛(CBU) 해동(0일차)
투입물: CBU
산출물: 해동 후의 CBU
동결된 CBU를 액체 질소(LN2) 증기 상 저장소에서 제거하여 해동 동안 포트의 오염을 방지하기 위해 플라스틱 포장 백에 넣는다. 포장된 크라이오백은 즉시 37℃ 수조에 넣고 균일하게 해동되도록 백을 부드럽게 반죽하여 빠르게 해동한다. 산출물, 해동 후의 CBU는 다음을 위해 샘플링된다:
ㆍ 유핵 세포(NC) 카운트
ㆍ 생존 능력 % (트리판 블루)
시험 결과는 프로세스 모니터링에 사용된다.
단계 2: CBU 희석 및 세척(0일차)
투입물: 해동 후의 CBU
산출물: 세척 후의 CBU
급속 해동 직후, 해동 후의 CBU 백의 내용물을 Sepax(GE Healthcare) 일회용 키트의 투입물 라인에 부착한다. 세포를 희석하고 0.9% NaCl 중 10% 저분자량 덱스트란(LMD)으로 Sepax 시스템 내에서 세척한다. Sepax 세척의 산출물(세척 후의 CBU)은 대략 100 mL이며 다음을 위해 샘플링된다:
ㆍ 유핵 세포(NC) 카운트
ㆍ 생존 능력 % (트리판 블루)
시험 결과는 프로세스 모니터링에 사용된다.
단계 3: 사전 선택 세척(0일차)
투입물: 세척 후의 CBU
산출물: CB 단핵 세포(MNC)
세척 후의 CBU 세포를 실온에서 10분 동안 400 x g(원심력)에서 원심 분리한다. 부드러운 흡인으로 상층액을 제거한 후, 세포(CB MNC)를 Miltenyi PBS/EDTA 완충액에서 대략 8 내지 10 mL의 부피로 재현탁한다. 산출물, CB MNC는 샘플링되지 않는다.
단계 4: CD25 항체 배양(0일차)
투입물: CB MNC
산출물: 배양 후의 CB MNC
CB 단핵 세포를 간헐적인 수동 혼합과 함께 4 내지 8℃에서 15분 동안 Miltenyi 항-CD25 마이크로비드와 함께 배양한다. 배양 후, 세포 및 항-CD25 마이크로비드 혼합물을 세척하고 풀모자임 및 MgCl2가 보충된 Miltenyi PBS/EDTA 완충액에 대략 10 mL의 부피로 재현탁한다. 산출물, CB MNC 배양 후는 샘플링되지 않는다.
단계 5: CD25 양성 선택(0일차)
투입물: 배양 후의 CB MNC
산출물: CD25+ MNC
Miltenyi CD25 항체 시약을 사용한 배양 단계에 후속하여, 배양 후의 CB MNC를 MidiMACS 장치에 부착된 Miltenyi LS 컬럼으로 옮기고 자석을 사용하여 항-CD25 표지된 세포를 포획한다. 면역자성 선택 후, 세포를 자기장으로부터 해방하고, 산출물, CD25+ MNC를 다음을 위해 샘플링한다:
ㆍ 유핵 세포(NC) 카운트
ㆍ 생존 능력 % (트리판 블루)
ㆍ 생존 능력 % (7-AAD 유세포 분석)
ㆍ %CD4-CD8+ (유세포 분석)
ㆍ %CD4+CD25+ (유세포 분석)
시험 결과는 프로세스 모니터링에 사용된다.
단계 6: 배양 확장 시작(0일차)
투입물: CD25+ MNC
산출물: 0일차 배양물
CD25+ 선택된 MNC를 세척하고 1% 글루타민이 포함된 X-Vivo 15 및 인터류킨-2(IL-2, 1000 IU/mL)가 포함된 10% 인간 AB 혈청에 현탁한 다음, 1:1의 비드 대 세포 비로 CD3/CD28 비드와 혼합한다. 세포 + 비드 혼합물을 10 cm2의 표면적을 갖는 기체 투과성 팽창(10M) 시스템으로 옮기고 5% CO2와 함께 37℃에서 배양한다. 세포 현탁액은 락킹 또는 진탕하지 않는다. 이 단계에서는 샘플링을 수행하지 않는다.
기체 투과성 팽창(10M) 시스템은 원통형 모양의 멸균 일회용 플라스틱 장치로 이루어진다. 세포와 배지를 기체 투과성 팽창 시스템으로 옮긴 후, 세포는 표면이 기체 투과성인 용기 바닥에 있다. 10M 시스템의 기체 투과성 막은 10 cm2의 표면적을 갖는다. 시스템은 통상적인 배양기에 배치되지만, 샘플링, 배지 제거, 배지 추가, 또는 세포 수확을 위해 필요에 따라 간헐적으로 제거될 수 있다.
단계 7: IL-2 첨가(2일차 또는 3일차)
투입물: 0일차 배양물
산출물: 2/3일차 배양물 + IL-2
2일차 또는 3일차에(마지막 배지/IL-2 변경 이후 < 66시간), 새로운 IL-2를 기체 투과성 확장(10M) 시스템에서 배양된 세포에 1000 IU/mL로 첨가하여 IL-2를 보충하며, 이는 소비한 것으로 추정된다. 이 단계에서는 샘플링을 수행하지 않는다. 100 cm2의 표면적을 갖는 기체 투과성 팽창(100M) 시스템의 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 배양으로 되돌린다. 세포 현탁액은 락킹 또는 진탕하지 않는다.
단계 8: 이동 및 공급(4일차, 5일차 또는 6일차)
투입물: 2/3일차 배양물 + IL-2
산출물: 4/5/6일차 배양물 + 신선한 배지 + IL-2
4, 5, 또는 6일차에(마지막 배지/IL-2 변경 이후 < 66시간), 기체 투과성 확장(10M) 시스템에서 배양된 세포의 분취량을 제거하고 다음을 위해 샘플링한다:
ㆍ 유핵 세포(NC) 카운트
ㆍ 생존 능력 % (트리판 블루)
NC 카운트 및 생존 능력 %는 배양-확장의 과정 모니터링에 사용된다.
기체 투과성 확장(10M) 시스템의 나머지 배양된 세포는 기체 투과성 확장(100M) 시스템으로 옮겨지고 신선한 배지가 1000 mL의 부피에 첨가된다(1% 글루타민 및 10% 인간 AB 혈청을 포함하는 X-Vivo 15, 및 IL-2 1000 IU/mL). 기체 투과성 팽창(100M) 시스템의 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 배양으로 되돌린다. 세포 현탁액은 락킹 또는 진탕하지 않는다.
기체 투과성 팽창(100M) 시스템은 원통형 모양의 멸균 일회용 플라스틱 장치로 이루어진다. 세포와 배지를 기체 투과성 팽창 시스템으로 옮긴 후, 세포는 표면이 기체 투과성인 용기 바닥에 있다. 100M 시스템의 기체 투과성 막은 100 cm2의 표면적을 갖는다. 시스템은 통상적인 배양기에 배치되지만, 샘플링, 배지 제거, 배지 추가, 또는 세포 수확을 위해 필요에 따라 간헐적으로 제거될 수 있다.
단계 9: IL-2 첨가(7일차 또는 8일차)
투입물: 4/5/6일차 배양물 + 신선한 배지 + IL-2
산출물: 7/8일차 배양물 + IL-2
7일차 또는 8일차에(마지막 배지/IL-2 변경 이후 < 66시간), 새로운 IL-2를 G-Rex 100M 시스템에서 배양된 세포에 첨가하여 IL-2를 보충하며, 이는 소비한 것으로 추정된다. 이 단계에서는 샘플링을 수행하지 않는다. 기체 투과성(100M) 시스템의 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 배양으로 되돌린다. 세포 현탁액은 락킹 또는 진탕하지 않는다.
단계 10: IL-2 첨가(9일차 또는 10일차)
투입물: 7/8일차 배양물 + IL-2
산출물: 9/10일차 배양물 + IL-2
9일차 또는 10일차에(마지막 배지/IL-2 변경 이후 < 66시간), 새로운 IL-2를 기체 투과성 확장(100M) 시스템에서 배양된 세포에 첨가하여 IL-2를 보충하며, 이는 소비한 것으로 추정된다. 이 단계에서는 샘플링을 수행하지 않는다. 기체 투과성 팽창(100M) 시스템의 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 배양으로 되돌린다. 세포 현탁액은 락킹 또는 진탕하지 않는다.
단계 11: IL-2 첨가(11일차 또는 12일차)
투입물: 9/10일차 배양물 + IL-2
산출물: 11/12일차 배양물 + IL-2
11일차 또는 12일차에(마지막 배지/IL-2 변경 이후 < 66시간), 배양된 세포를 다음을 위해 샘플링한다:
ㆍ 마이코플라스마
ㆍ 불임
마이코플라스마(최종 보고서; 마이코플라스마 종에 대해 출시 기준은 음성) 및 불임(중간 보고서; 출시 기준은 최종 제형 및 로트 출시 48 내지 72시간 전에 수득한 샘플에 대하여 "성장 없음"으로 보고)에 대한 시험 결과가 14일차에 최종 생성물 출시에 사용된다.
샘플링 후, 새로운 IL-2를 기체 투과성 확장(100M) 시스템에서 배양된 세포에 첨가하여 IL-2를 보충하며, 이는 소비한 것으로 추정된다. 기체 투과성 팽창(100M) 시스템의 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 배양으로 되돌린다. 세포 현탁액은 락킹 또는 진탕하지 않는다.
단계 12: 수확 전 샘플(14일차)
투입물: 11/12일차 배양물 + IL-2
산출물: 14일차 수확 전 물질, 샘플링됨
14일차에, 배양-확장된 T-Reg 세포를 수확하기 전에, 세포 현탁액을 다음을 위해 샘플링한다:
ㆍ 마이코플라스마
이 시점에서 마이코플라스마 시험이 반복되지만, 생성물의 빠른 출시 이전에는 일반적으로 결과를 얻을 수 없다. 그러나, 11/12일차의 마이코플라즈마 시험 결과가 빠른 출시를 위해 사용된다.
마이코플라즈마 샘플링 후, 기체 투과성 팽창(100M) 시스템에서 총 세포 현탁액 부피 1000 mL 중 750 mL를 제거하고 나머지 배양액을 다음을 위해 샘플링한다:
ㆍ 유핵 세포(NC) 카운트
ㆍ 생존 능력 % (트리판 블루)
ㆍ %CD4-CD8+ (유세포 분석)
NC 카운트와 생존 능력%는 과정 모니터링에 사용된다. %CD4-CD8+는 CD8+ 세포의 면역자성 고갈에 대한 필요를 결정하는 데 사용된다(조건부 단계 S-1). %CD4-CD8+ 세포 집단이 배양-확장된 세포의 >10%를 나타내는 경우. CD8 고갈이 필요한 경우, 조건부 단계 S-1은 14일차에 수확 후 수행된다(단계 13).
단계 13: 수확(14일차)
투입물: 14일차 수확 전 물질, 샘플링됨
산출물: T-Reg 수확물
샘플링 후, 기체 투과성 팽창(100M) 시스템의 나머지 250 mL 부피는 세포 회수를 최적화하기 위해 기체 투과성 팽창 플라스크를 헹구면서 500 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 주입 완충액(0.5% HSA가 포함된 Plasma-Lyte)으로 부피를 최대 400 mL로 만들었다. 500 mL 원뿔형 튜브를 실온에서 10분 동안 400 x g에서 2회 원심분리하여 0.5% HSA가 포함된 Plasma-Lyte A로 세포를 세척하고, 세포 현탁액은 비드 제거를 위한 15 mL 원뿔형 튜브에서 0.5% HSA가 포함된 Plasma-Lyte A를 사용하여 부피를 10 mL로 만들었다(단계 14).
조건부 단계 S-1: CD8 고갈
투입물: T-Reg 수확물
산출물: CD8 고갈 후 물질
12단계에서 샘플링의 %CD4-CD8+ 유세포 분석 결과가 CD4-CD8+ 세포 집단이 배양-확장된 세포의 >10%를 나타냄을 지시하는 경우, CD8 고갈이 수행된다. CD8 고갈의 경우, T-Reg 수확물을 Miltenyi CD8 마이크로비드와 함께 4 내지 8℃에서 15분 동안 부드럽게 교반하면서 배양한 다음, Miltenyi LS 컬럼으로 옮긴 다음, MidiMACS 장치를 사용하여 면역 자기적으로 선택된다. 산출물, CD8 고갈 후 물질은 다음을 위해 샘플링된다:
ㆍ 유핵 세포(NC) 카운트
ㆍ 생존 능력 %
ㆍ %CD4-CD8+ (유세포 분석)
단계 14: CD3/CD28 비드 세척 및 제거(14일차)
투입물: 14일차 수확물
산출물: 탈-비드 T-Reg 수확물
수확한 T-Reg 세포 현탁액을 함유하는 15 mL 원뿔형 튜브를 Dynal MPC-1 자석에 2분 동안 둔다. 상층액(세포 함유, CD3/CD28 비드가 없음)은 자석을 해방하기 전에 또 다른 15 mL 원뿔형 튜브에 수집된다("탈-비드 #1). 자석이 해방되면, 나머지 비드와 세포를 0.5% HSA가 포함된 Plasma-Lyte A 2 mL에 재현탁하고 Dynal MPC-1 자석에 2분 동안 둔다; 상층액을 수집하여 "탈-비드 #1 튜브"로 옮긴다. 그런 다음 "탈-비드 #1" 튜브를 Dynal MPC-1 자석에 2분 동안 두고 상층액을 또 다른 15 mL 원뿔형 튜브에 수집한 후 자석을 해방한다("탈-비드 #2). 현재 부피가 약 17 mL인 "탈-비드 #2" 튜브 중 세포 현탁액은 다음을 위해 샘플링된다:
ㆍ 유핵 세포(NC) 카운트
ㆍ 생존 능력 % (트리판 블루)
ㆍ %CD4-CD8+ (유세포 분석)
ㆍ %CD4+CD25+ (유세포 분석)
ㆍ 생존 능력 % (7-AAD, 유세포 분석)
ㆍ 잔류 비드
이 단계의 산출물인 탈-비드 T-Reg 수확물은 활성 물질(약물)이다. 유핵 세포(NC) 수 및 생존 능력 %(트리판 블루)은 과정 모니터링에 사용된다. %CD4-CD8+(유세포 분석; 출시 기준은 ≤10%임), %CD4+CD25+(유세포 분석; 출시 기준은 ≥60%임), %생존 능력(7-AAD 염료 배제), 및 잔류 비드 분석(출시 기준은 3 x 106개의 유핵 세포당 100개 미만의 비드임)이 최종 생성물의 빠른 출시에 사용된다.
단계 15: 제형화 및 포장(14일차)
투입물: 탈-비드 T-Reg 수확물
산출물: T-Reg 최종 생성물
탈-비드 T-Reg 수확물을 15 mL 원뿔형 튜브에서 300 mL 이동 팩으로 옮긴다. 원뿔형 튜브를 10 mL의 Plasma-Lyte A + 0.5% HSA로 헹구고, 당해 헹굼물을 300 mL 이동 팩에 첨가한다. 이동 팩의 세포 현탁액을 약 54 mL의 부피로 만들고 다음에 대하여 샘플링한다:
ㆍ 그람 염색
ㆍ 내독소
ㆍ 불임
최종 생성물의 신속한 방출을 위해 그람 염색(광현미경 사용; "유기체 없음"의 방출 기준) 및 내독소(Endosafe PTS 시스템 사용; 방출 기준 < 5 EU/mL)의 결과를 사용할 수 있다. 이 시점에서의 불임 시험 결과는 빠른 방출에 대해서는 알 수 없으나, 11/12일자 시점의 불임 시험 중간 결과는 빠른 방출에 이용된다.
샘플링 후, 이동 팩에 부착된 이동 세트를 밀봉하여 제거한다. 샘플링 후, 최종 생성물 용기의 세포 현탁액(최종 생성물)의 부피는 약 50 mL이다.
이러한 제조 단계는 아래에 제공된 표에도 요약되어 있으며, 공정 중/중간 생성물 또는 활성 물질에 대해 정의된 보류 단계가 없는 최종 제형을 통해 연속적인 제조 공정의 흐름도(첫 번째 표)와 조건부 CD8 세포 고갈 단계의 흐름도(두 번째 표)를 나타낸다. 공정은 활성 물질(DS)의 제조로 이어지는 단계부터 최종 생성물(DP)의 최종 제형 및 포장에 이르기까지 연속적이기 때문에 DS와 DP 둘 모두의 제조가 표시된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
활성화된 T-조절 세포의 동결보존 방법
인간 Treg 세포(예를 들어, 활성화된 인간 Treg 세포)의 생체 외에서 확장된 집단을 동결보존하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 동결보존된 인간 제대혈 유닛으로부터 생성된 활성화된 인간 T 조절(Treg) 세포의 확장된 집단을 동결보존하기 위한 방법은 하기를 포함한다: a) 동결보존된 인간 제대혈 유닛을 해동하는 단계; b) 상기 해동된 제대혈 유닛을 기능적으로 폐쇄된 시스템에서 희석 및 세척하는 단계; c) CD25+ 세포 표면 발현을 기반으로 하는 이중 선택 방법을 사용하여 자연 발생 Treg 세포를 단리하는 단계; d) 최대 14일 동안, 배양 배지(들)에서, 기체 투과성 배양기에서, 유효량의 인터류킨-2(IL-2)의 존재 하에 그리고 CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약의 존재 하에, 단리된 CD25+ Treg 세포를 생체 외에서 확장하여 활성화된 CD25+ Treg 세포의 집단을 생성하는 단계- 상기 배양 배지는 약 48시간마다 교체됨 -; e) 배양 배지로부터 활성화된 CD25+ 세포를 수확하여, 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 생성하는 단계; 및 f) 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 동결보존하는 단계.
일부 실시형태에서, 방법은 단계 e)와 단계 f) 사이에 정의된 기준을 기반으로 임상 사용을 위해 활성화된 배양된 인간 Treg 세포를 방출하는 단계를 추가로 포함한다.
당업계에 공지된 임의의 적합한 동결보존 공정이 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 Treg 세포의 확장된 집단은 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함하는 동결 칵테일을 사용하고 특별히 정의된 프로그램(들)을 사용하여 제어된 속도 동결기에 후속적으로 배치하여 동결보존할 수 있다. 동결보존된 생성물은 -180℃에서 적어도 몇 개월 동안 저장될 수 있다. 동결보존된 생성물의 해동 시, Treg 세포는 FOXP3(포크헤드 박스 P3) 및 헬리오스의 높은 발현으로 세포 표면과 세포내 표현형을 유지할 수 있으며, 시험관 내 세포 억제 분석(도 8a 내지 도 8c) 및 다양한 동물 모델의 생체 내 데이터(도 9a 내지 도 9b)에 의해 입증된 바와 같이 억제 기능을 유지할 수 있다.
일부 실시형태에서, 최대 약 50x106개의 세포가 ml당 약 10x106개의 세포의 농도로 5 ml 바이알당 동결보존된다. 일부 실시형태에서, 약 100x106개의 세포 내지 약 1x108개의 세포가 최대 10 ml 내지 100 ml의 부피로 단일 크라이오백에 동결보존될 수 있다.
일부 실시형태에서, 동결보존의 목적을 위해, 인간 Treg 세포의 수확된 확장된 집단은 4℃의 온도에서 10분 동안 400g에서 원심분리될 수 있다. 총 세포 수는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 계산될 수 있으며 크라이오바이알의 수는 총 세포 수를 50x106개의 세포로 나누어 추정될 수 있다. 그 후, 동결 스톡 용액이 5% 또는 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)(Cryostor®)가 포함된 사전 제형화된 용액을 포함하는 동결 스톡 용액을 사용하여 5 ml 크라이오바이알당 최대 50x106개의 세포를 동결보존할 수 있다. 세포가 원심분리되는 동안 제어 속도 동결기가 켜지고 제어 속도 동결기가 적절한 시작 온도에 도달하면 "사용자를 기다리는 프로그램-계속하려면 여기를 클릭하십시오"라는 명령이 나타난다. 동결 스톡 용액과 혼화되면, 최대 50x106개의 세포로 이루어진 크라이오바이알이 동결 알고리즘을 사용하여 제어된 속도 동결기에 배치되어 세포 사멸을 방지하고 세포 기능을 보존하기 위해 세포를 서서히 동결할 수 있다. 동결 프로그램이 완료된 후, 크라이오바이알은 제어 속도 동결기에서 제거되고 장기간 동결보존을 위해 -190℃만큼 낮은 온도에서 액체 질소 극저온 동결기에 배치된다.
확장된 Treg 집단은 치료 투여를 위한 적절한 임상 용량(들)을 생성하기 위해 여러 분취물로 동결보존될 수 있다.
T-조절 세포 집단 및 약학 조성물
본원에 기재된 방법에 의해 생성된 인간 Treg 세포의 집단이 본원에 개시된다. 집단은 동종이형 세포 치료 용도에 적합하다. 일부 양태에서, 인간 Treg 세포는 면역억제성이다.
일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 CD4 및 CD25에 대해 양성이다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 CD3, CD4, 및 CD25에 대해 양성이다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 CD3, CD4, CD25, CD45RO, CD45RA, CD95, 및 CD28에 대해 양성이다.
적어도 약 60% CD4+CD25+ 및 약 10% 이하 CD4-CD8+인 인간 Treg 세포의 집단이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 60% CD4+CD25+ 및 약 10% 이하 CD4-CD8+인 인간 Treg 세포의 집단은 추가로 CD45RA 및 CD45RO를 공동 발현한다.
일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 적어도 약 90% CXCR4+이다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 적어도 약 95% CXCR4+, 적어도 약 95% CD45RA+, 및 적어도 약 80% CD45RO+이다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 적어도 약 95% CXCR4+, 적어도 약 95% CD45RA+, 적어도 약 80% CD45RO+, 적어도 약 95% CD95+, 적어도 약 95% HLADR+, 적어도 약 95% 알파4베타7+, 적어도 약 15% CXCR3hi+, 적어도 약 95% CCR6+, 적어도 약 95% CD54+, 적어도 약 95% CD11A+, 적어도 약 85% CD45RARO+, 적어도 약 80% CTLA4+, 적어도 약 80% GPR83+, 및 적어도 약 80% CD62L+이다. 일부 실시형태에서, 이러한 세포 표면 마커의 발현은 유세포 분석에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 생체 외에서 확장되었다.
일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 CD4+CD25+CD127loFOXP3hi의 표현형을 갖고 CD45RA+CD45RO+의 추가적인 공동 발현을 나타내는 인간 Treg 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 CD4+CD25+CD127-FoxP3hi 및 헬리오스+의 표현형을 갖는 인간 Treg 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 활성화된 인간 Treg의 확장된 표현형은 다음과 같다: α4β7hiCCR3loCCR4hiCCR6hiCCR7hiCD103loCD11ahiCD137loCD28hiCD31+CD39loCD54hi CD62LhiCD7hiCD95hiCXCR3loCXCR4hiHLA-ABChiHLADRhiPD1loPD-LIlo 및 세포내 CD154hiFOXP3hiHelioshiGITRhiRORγtloTbetlo. 일부 실시형태에서, 향신경성 인간 Treg의 집단은 CD95/CXCR4/CD31/CD39hi/CTLA4/HELIOS/CXCR3/CD28의 표현형을 갖는다.
일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 ≥ 약 60% CD4+CD25+ Treg 세포 및 < 약 10% CD4-CD8+ T-세포독성/억제 세포의 유세포 분석 표현형을 갖는다.
일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 FOXP3의 높은 발현 및 RORγt의 낮은 발현을 나타내는 인간 Treg 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 IL-17을 분비하지 않거나 스트레스가 많은 조건 하에서 RORγT를 나타내는 인간 Treg 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 그의 다클론 T 세포 수용체 Vβ(TCR Vβ) 레퍼토리를 유지하는 인간 Treg 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 사용 전에 동결보존된다.
일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 세포내 헬리오스를 발현한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 인간 Treg 세포는 스트레스가 많은 조건 하에 면역억제 기능 및 표현형을 유지한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 인간 Treg 세포는 스테로이드(예를 들어, 덱사메타손, 프레드니손 또는 프레드니솔론)의 존재 하에 그의 생존 능력 및 억제 기능을 유지한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 인간 Treg 세포는 인터류킨-17(IL-17) 분비에 저항하고 말초 혈액 Treg보다 염증 유발성 TH17 세포로 "뒤집힐" 가능성이 훨씬 적은데 이들의 후성 유전적 특징과 본원에 기재된 선택/확장 프로토콜의 특성 때문이다.
본원에 기재된 집단에서 Treg 세포에 대한 관심 생물학적 활성은 면역억제 기능이며, 이는 CFSE(카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르) 또는 CellTrace™ 바이올렛 염료의 세포내 염색 염료를 사용하는 시험관 내 억제자 검정에 의해 측정될 수 있다. 이 검정에서, Treg 세포는 다양한 비로 정상 말초 혈액 T-반응기(Tresp) 세포와 공동 배양되고, 증식하는 세포는 CFSE 또는 CellTrace™ 바이올렛의 세포내 염료의 혼입을 검출하기 위한 유세포 분석법을 사용하여 검출되며, 이는 최대 8개의 세포 분열에 대한 세포 증식을 추적할 수 있다. Treg 세포에 의한 T-반응기(Tresp) 세포의 억제 정도는 Treg 세포 대 Tresp 세포의 비 및 분할된 세포의 생성과 관련하여 정량화될 수 있다. Treg 세포에 의한 효과적인 억제가 존재하는 경우, 분열 반응자 세포의 1세대 내 억제는 Tresp 세포에 대한 Treg의 낮은 비에 비해 Tresp 세포에 대한 Treg의 높은 비에서 더 크다. 일부 실시형태에서, Treg:Tcon 비가 4:1인 경우, Treg 세포가 증식하는 T 통상적(Tcon) 세포의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%를 억제하는 경우, 본원에 기재된 집단 내의 Treg 세포는 면역억제성인 것으로 간주된다.
일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 억제 사이토카인 인터류킨-10(IL-10)의 생성을 증가시키지만 형질전환 성장 인자 β(TGFβ)의 생성은 증가하지 않는 것과 같은 측분비 기능을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포 집단은 IL-6 치료에 반응하여 그랜자임 B를 분비한다(예를 들어, 도 25 참조).
다음과 같은 약 1x108개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는 인간 Treg 세포의 집단이 본원에 제공된다: (i) ≥ 60% CD4+CD25+; 및 (ii) ≤ 10% CD4-CD8+; 여기서 인간 Treg 세포는 면역억제성임. 다음과 같은 약 1x108개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는 인간 Treg 세포의 집단이 본원에 추가로 제공된다: (i) ≥ 60% CD4+CD25+; (ii) ≥ 60% CD4+CD25+CXCR4+; 및 (iii) ≤ 10% CD4-CD8+; 여기서 인간 Treg 세포는 면역억제성임. 다음과 같은 약 1x108개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는 인간 Treg 세포의 집단이 본원에 추가로 제공된다: (i) ≥ 60% CD4+CD25+; (ii) ≥ 60% CD4+CD25+α4β7+; 및 (iii) ≤ 10% CD4-CD8+; 여기서 인간 Treg 세포는 면역억제성임. 다음과 같은 약 1x108개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는 인간 Treg 세포의 집단이 본원에 또한 제공된다: (i) ≥ 60% CD4+CD25+; (ii) ≥ 60% CD4+CD25+CD11a+; 및 (iii) ≤ 10% CD4-CD8+; 여기서 인간 Treg 세포는 면역억제성임. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 인간 Treg 세포의 집단은 적어도 약 1x109개의 인간 Treg 세포 또는 적어도 약 1x1010개의 인간 Treg 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 인간 Treg 세포의 집단은 약 1x108 내지 1x1010, 약 1x108 내지 1x109, 또는 약 1x109 내지 1x1010개의 인간 Treg 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 새로운 단일 용량 생성물(예를 들어, CK0801)으로 제형화된다. CK0801 생성물은 생성물이 투여되는 대상체에 대해 6개 중 3개 이상 HLA(인간 백혈구 항원) 매치(예를 들어, 6개 중 3개, 6개 중 4개, 6개 중 5개, 또는 6개 중 6개 HLA 매치)인 제대혈로부터 제조된다. CK0801 생성물은 대상체의 체중을 기준으로 하는 용량으로 단일 주입으로 대상체에게 투여된다. 이 생성물은 면역억제성 Treg 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, CK0801 생성물은 14일의 배양 기간 후에 CD25+ 선택을 통해 단리된다. 일부 실시형태에서, CK0801 생성물에 대한 출시 기준은 다음과 같다: (i) ≥ 60% CD4+CD25+ (T-조절 표현형); 및 (ii) ≤ 10% CD4-CD8+ (T- 세포독성/억제자 표현형). 일부 실시형태에서, CK0801 생성물은 염증성 골수 질환 또는 길랑-바레 증후군을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 동결보존 및/또는 다중 용량 생성물(예를 들어, CK0802, CK0802.CXCR4, CK0802.α4β7 또는 CK0802.CD11a)로서 제형화된다. 일부 실시형태에서, CK0802, CK0802.CXCR4, CK0802.α4β7, 또는 CK0802.CD11a는 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 함유하는 주입 가능한 동결보존 배지에서 제형화된다. CK0802, CK0802.CXCR4, CK0802.α4β7, 및 CK0802.CD11a는 생성물이 투여되는 대상체에 대해 HLA가 매치되지 않는다. 일부 실시형태에서, 이들 생성물은 생성물이 투여되는 대상체에 대해 6개 중 2개, 6개 중 1개, 또는 6개 중 0개의 HLA 매치이다. 이들 제품의 각각은 고정 용량의 다중 용량 주입으로 대상체에게 투여된다. 이들 생성물은 면역억제성 Treg 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, CK0802 생성물은 14일의 배양 기간 후에 CD25+ 선택을 통해 단리된다. 일부 실시형태에서, CK0802 생성물에 대한 출시 기준은 다음과 같다: (i) 10 mL 중 100x106 Treg/백 (10x106 Treg/ml); (ii) ≥ 60% CD4+CD25+ (T- 조절 표현형); 및 (iii) ≤ 10% CD4-CD8+ (T 세포독성/억제자 표현형). 일부 실시형태에서, CK0802 생성물은 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)(예를 들어, CoV-ARDS) 또는 사이토카인 방출 증후군(CRS)(예를 들어, 키메라 항원 수용체 T-세포 요법으로 인한 CRS)을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, CK0802 생성물은 0일차, 3일차, 및 7일차에 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, CK0802.CXCR4 생성물은 10 내지 12일의 배양 기간 후에 CD25+ 선택 및 CXCR4에 대한 추가 농축을 통해 단리된다. 일부 실시형태에서, CK0802.CXCR4 생성물에 대한 출시 기준은 다음과 같다: (i) 10 mL 중 100x106 Treg/백 (10x106 Treg/ml); (ii) ≥ 60% CD4+CD25+ (T- 조절 표현형); (iii) ≥ 60% CD4+CD25+CXCR4+ (골수 귀소 하위유형); 및 (iv) ≤ 10% CD4-CD8+ (T 세포독성/억제자 표현형). 일부 실시형태에서, CK0802.CXCR4 생성물은 골수 섬유증, 재생 불량성 빈혈, 또는 면역 혈소판 감소증을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, CK0802.CXCR4 생성물은 최대 6개월 동안 매월 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, CK0802.α4β7 생성물은 CD25+ 선택 및 α4β7에 대한 추가 농축을 통해 및 8 내지 10일의 배양 기간 후에 단리된다. 일부 실시형태에서, CK0802.α4β7 생성물에 대한 출시 기준은 다음과 같다: (i) 10 mL 중 100x106 Treg/백 (10x106 Treg/ml); (ii) ≥ 60% CD4+CD25+ (T- 조절 표현형); (iii) ≥ 60% CD4+CD25+α4β7+ (위장 귀소 하위유형); 및 (iv) ≤ 10% CD4-CD8+ (T 세포독성/억제자 표현형). 일부 실시형태에서, CK0802.α4β7 생성물은 위장 이식편 대 숙주 질환 또는 염증성 장 질환을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, CK0802.α4β7 생성물은 하기 투여 요법으로 대상체에게 투여된다: (i) 유도: 최대 4주 동안 매주; 및 (ii) 유지: 최대 6개월 동안 매월.
일부 실시형태에서, CK0802.CD11a 생성물은 CD25+ 선택 및 CD11a에 대한 추가 농축을 통해 및 8 내지 10일의 배양 기간 후에 단리된다. 일부 실시형태에서, CK0802.CD11a 생성물에 대한 출시 기준은 다음과 같다: (i) 10 mL 중 100x106 Treg/백 (10x106 Treg/ml); (ii) ≥ 60% CD4+CD25+ (T- 조절 표현형); (iii) ≥ 60% CD4+CD25+CD11a+ (뉴런 귀소 하위유형); 및 (iv) ≤ 10% CD4-CD8+ (T 세포독성/억제자 표현형). 일부 실시형태에서, CK0802.CD11a 생성물은 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 또는 탈수초성 신경병증을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, CK0802.CD11a 생성물은 하기 투여 요법으로 대상체에게 투여된다: (i) 유도: 최대 4주 동안 매주; 및 (ii) 유지: 최대 6개월 동안 매월.
다양한 인간 Treg 세포 집단에 대한 제대혈 유닛 선택 기준이 도 29 및 도 30에 제공된다.
CK0802의 세포 출발 물질은 정상적이고 건강하고 혈연관계가 아닌 공여자로부터의 단일 유닛의 제대혈(CBU)이다. 임상적으로 관련된 Treg 세포 용량의 생성은 CD4+CD25+ 표현형을 갖는 Treg 세포의 생체 외 농축 및 확장을 포함한다. 일부 실시형태에서, 14일 제조 공정은 CD4+CD25+ Treg 집단의 50배 이상의 확장을 초래한다. 단일 확장 과정에서 다양한 수용자를 위한 다중 용량을 제조할 수 있다. Treg 세포는 주입을 위해 임상 현장으로 운송되기 전에 임상 사용을 위해 수확, 동결보존, 시험, 및 출시된다.
CK0802는 V-베타 레퍼토리의 광범위한 표현 및 세포내 FOXP3 염색의 높은 표현을 갖는 다클론이다. CK0802는 또한 자연적으로 발생하는 인간 Treg에서 흔한 TSDR(Treg 특이적 탈메틸화 영역)의 일관된 저메틸화와 관련이 있다.
일부 실시형태에서, CK0802 활성 약물 물질(DS)은 유핵 제대혈 세포로 이루어진 액체 세포 현탁액이며, 이 중 ≥ 60%는 T-조절 세포 표현형(CD3+CD4+CD25+)을 갖고 < 10%는 T 세포독성/억제자 표현형 (CD3+CD4-CD8+)을 갖는다. 일부 실시형태에서, CK0802 최종 약물 생성물(DP)은 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 함유하는 주입가능한 동결보존 배지에서 10x106 Treg 세포/mL의 세포 농도로 현탁된 CK0802 활성 약물 물질을 포함하는 살아 있는 세포의 현탁액이다.
CK0802 약물 생성물의 조성의 예는 표 2에 제공된다.
Figure pct00007
활성화된 인간 Treg 세포의 집단 및 하나 이상의 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 비히클을 포함하는 약학 조성물이 본원에 추가로 개시된다.
용어 "약학적으로 허용되는" 및 "수의학적으로 허용되는"은 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 약학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 지칭한다. 각 성분은 약학 제형의 다른 성분과 양립할 수 있다는 의미에서 "약학적으로 허용되는" 또는 "수의학적으로 허용되는" 것이어야 한다. 또한 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성 또는 기타 문제나 합병증 없이 인간 및 동물의 조직 또는 기관과 접촉하여 사용하기에 적합해야 하며 합리적인 이점/위험 비에 상응해야 한다. (문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition]; 문헌[Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005]; 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th Edition]; 문헌[Rowe et al., Eds., The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2005]; 및 문헌[Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd Edition]; 문헌[Ash and Ash Eds., Gower Publishing Company: 2007]; 문헌[Pharmaceutical Pre-formulation and Formulation, Gibson Ed., CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2004)] 참조).
본 개시내용의 약학 조성물은 그의 의도된 투여 경로(즉, 안구내, 망막하, 비경구, 정맥내, 동맥내, 피내, 피하, 경구, 흡입, 경피, 국소, 경점막, 복강내 또는 흉막내, 및/또는 직장 투여)와 양립 가능하도록 제형화된다.
본 개시내용에 따른 치료제의 투여는 개선된 이동, 전달, 내성 등을 제공하기 위해 제형에 혼입되는 적합한 담체, 부형제, 및 기타 제제와 함께 투여될 것임을 이해할 것이다. 모든 약학 화학자에게 알려진 처방집에서 다수의 적절한 제형을 확인할 수 있다: 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), 특히 Chapter 87 by Blaug, Seymour]. 이러한 제형은 예를 들어 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포(예컨대 Lipofectin™), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔, 및 카보왁스를 함유하는 반고체 혼합물을 포함한다. 전술한 혼합물 중 임의의 것이 본 개시내용에 따른 치료 및 요법에 적절할 수 있으며, 단, 제형의 활성 성분이 제형에 의해 불활성화되지 않고 제형이 생리학적으로 양립가능하고 투여 경로에 견딜 수 있어야 한다. 또한, 문헌[Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000)], 문헌[Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000)], 문헌[Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000)], 문헌[Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)] 및 제약 화학자에게 잘 알려진 제형, 부형제, 및 담체와 관련된 추가 정보에 대한 인용 참조.
주사용으로 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 세포 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하며, 시린지 사용이 용이할 정도로 유동성이 있어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 등장성제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 소듐 클로라이드를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시키는 방식으로 유도될 수 있다.
멸균 주사액은 필요한 양의 활성 물질을 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 필요에 따라, 멸균 여과하는 방식으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질과 상기 열거된 것 중에서 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시키는 방식으로 제조된다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 사전 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공건조 및 동결건조이다.
일부 실시형태에서, 활성 물질은 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같이 화합물이 신체로부터 신속하게 제거되는 것을 보호할 담체를 사용하여 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성 및 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 재료는 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.에서 상업적으로 입수할 수 있다. 리포좀 현탁액(바이러스 항원에 대한 단일클론 항체로 감염된 세포를 표적으로 하는 리포좀 포함)이 또한 약학적으로 허용 가능한 담체로 사용될 수 있다. 이는, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같이, 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
본원에 사용된 단위 투여 형태는 치료하고자 하는 대상에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 나타내며; 각각의 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 선결된 양의 활성 물질을 함유한다. 본 개시내용의 투여 단위 형태에 대한 사양은 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성될 특정 치료 효과, 및 개인의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 기술에 내재된 한계에 좌우되며 직접적으로 이에 따라 달라진다.
(부형제에 현탁된 활성 물질로 이루어진) 최종 생성물 조성의 한 예가 아래 표에 나타나 있다. 일부 실시형태에서, 최종 투여 형태는 약 50 mL 내지 약 100 mL의 부피를 갖는다. 일부 실시형태에서, 최종 생성물의 세포 성분은 단일 제대혈 유닛 또는 여러 개의 풀리된 제대혈 유닛으로부터 배양-확장된 주로 CD4+CD25+ 표현형을 갖는 T-조절 세포인 제대혈 유래 단핵 세포로 이루어진다.
Figure pct00008
일부 실시형태에서, 최종 제형화된 생성물은 밀봉된 300 mL 폴리염화비닐(PVC) 플라스틱 혈액 백에 사용을 위해 함유되고 제공된다. 백에는 환자에게 투여하기 위해 사용되는 통상적인 정맥내(IV) 투여 세트의 플라스틱 스파이크로 접근할 수 있는 포트가 있다.
일부 실시형태에서, 최종 생성물을 제형화하는 데 사용되는 부형제는 하기를 포함할 수 있다:
Figure pct00009
일부 실시형태에서, 조성물은 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포제의 집단 및 하나 이상의 다른 치료제를 포함한다. 사용 또는 투여에 대한 지침서와 함께 본원에 기재된 조성물을 (예를 들어, 용기, 팩 또는 디스펜서에) 포함하는 하나 이상의 자가면역 질환, 장애, 또는 병태를 치료하기 위한 키트가 또한 본원에 제공된다. 본 명세서에 기재된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 및 사용 지침을 포함하는 용기를 포함하는 제조 물품도 제공된다.
치료 방법 및 치료 용도
질환, 장애 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환, 장애, 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 유효량의 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 인간 Treg 세포(예를 들어, 활성화된 인간 Treg 세포)의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 본원에 제공된다. 또한, 질환, 장애 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환, 장애, 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애, 또는 병태는 자가면역 질환, 장애, 또는 병태이다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태는 염증성 질환, 장애, 또는 병태이다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애, 또는 병태는 이식편 대 숙주 질환(GVHD), 염증성장 질환, 골수 부전(예를 들어, 재생 불량성 빈혈, 원발성 골수섬유증 또는 골수이형성 증후군), 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 염증성 암(예를 들어, 다발성 골수종 또는 염증성 유방암), 신경-염증성 장애(예를 들어, 길랑-바레 증후군, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 다발성 경화증 또는 탈수초성 신경병증), 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 면역결핍 증후군(예를 들어, iPEX(면역 이상 조절 다내분비병증 장병증 X-연관))이다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애, 또는 병태는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염과 관련된 호흡기 질환, 장애 또는 병태이다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애, 또는 병태는 COVID-19(코로나바이러스 질환) 매개 급성 호흡 곤란 증후군(CoV-ARDS)이다.
일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 의도된 수용자와 인간 백혈구 항원(HLA)-매치된 하나 이상의 제대혈 유닛으로부터 생성된다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 의도된 수용자와 HLA 매치되지 않은 하나 이상의 제대혈 유닛으로부터 생성된다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포의 집단은 대상체에 적합한 혈액형의 하나 이상의 제대혈 유닛으로부터 제조된다.
일부 실시형태에서, 제대혈 유래 Treg는 항-염증성 효과를 생성하기 위해 하기 특성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 1) 수용체 항원 제시 세포(APC)와의 직접적인 결합 및 T-이펙터(Teff) 세포와의 상호작용 차단(즉, 직접적인 상호작용을 통해 전-염증성 면역 세포를 억제함으로써); 2) 형질전환 성장 인자 β(TGFβ), 인터류킨-10(IL-10) 및 인터류킨-35(IL-35)를 포함하는 억제 사이토카인의 방출; 3) 아포토시스로 이어지는 Teff에 대한 IL-2 공급의 고갈; 및/또는 4) 그랜자임/퍼포린 생성에서 역할을 함(즉, 그랜자임 B 또는 퍼포린을 분비하여 자연 살해(NK) 세포 및 CD8+ T 세포 사멸을 유도함). 더욱이, 염증 부위에 주입된 제대혈 유래 Treg의 국소 증식은 생존 이점을 제공하고 질환 제어에 필요한 항-염증성 작용을 생성할 수 있다.
최종 생성물의 Treg 세포 용량은 대상체의 체중 kg당 세포 수로 표현될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법에 사용하기 위한 적절한 세포 용량의 결정은 당업계의 통상적인 기술 수준 내에 있다. 일부 실시형태에서, 활성화된 인간 Treg 세포의 집단의 유효량은 약 1x105개 내지 약 1x108개의 Treg 세포/대상체의 체중 kg, 또는 약 1x106개 내지 약 1x107개의 Treg 세포/대상체의 체중 kg이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 방법에 대한 세포 용량은 하기와 같을 수 있다:
용량 수준 1: 약 1 x106 Treg 세포/kg
용량 수준 2: 약 3 x106 Treg 세포/kg
용량 수준 3: 약 1 x107 Treg 세포/kg
일부 실시형태에서, 대상체의 체중에 의존하지 않고 고정 용량이 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 용량은 약 1x108 활성화된 인간 Treg 세포 내지 약 3x108 Treg 세포일 수 있다. 예를 들어, 용량은 약 1x108, 약 3x108, 또는 약 1x109 활성화된 인간 Treg 세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포의 집단이 대상체에게 정맥내 투여된다.
일부 실시형태에서, 유효량의 인간 Treg 세포 집단의 단일 용량이 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포 집단의 다중 용량이 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, Treg 세포의 최대 10(즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10) 이상의 반복 용량이 투여될 수 있다. 다중 용량이 투여되는 경우, 이러한 용량은 일정한 간격(즉, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 매주마다, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 1 내지 2주마다, 1 내지 3주마다, 1 내지 4주마다, 1 내지 5주마다, 1 내지 6주마다, 2 내지 3주마다, 2 내지 4주마다, 2 내지 5주마다, 2 내지 6주마다, 3 내지 4주마다, 3 내지 5주마다, 3 내지 6주마다, 4 내지 5주마다, 4 내지 6주마다, 또는 5 내지 6주마다)으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 용량이 약 4 내지 6주마다 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, Treg 세포는 4주의 기간 동안 매주 투여된 후 적어도 6 내지 9(즉, 6, 7, 8, 또는 9)개월의 기간 동안 매월 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포의 집단을 투여한 후, 대상체에서 순환 염증성 사이토카인 수준은 투여 전 대상체에서 순환 염증성 사이토카인 수준에 비해 감소된다. 일부 실시형태에서, 순환 염증성 사이토카인은 인터류킨-6(IL-6), 인터페론 감마(IFNγ) 또는 종양 괴사 인자-알파(TNFα)이다.
일부 실시형태에서, 치료 전에, 대상체가 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포의 집단에 반응할지 여부를 결정하기 위해 대상체의 혈청 바이오마커를 검사한다. 일부 실시형태에서, 치료 후, 임상 반응과의 상관관계를 결정하기 위해 대상체의 혈청 바이오마커를 검사한다. 일부 실시형태에서, 혈청 바이오마커를 연속적으로 검사하여 Treg 세포를 사용한 후속 재치료가 필요한지 여부를 검사한다.
일부 실시형태에서, 디펜하이드라민은 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포 집단을 투여하기 전에 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 50 mg의 디펜하이드라민이 투여된다. 일부 실시형태에서, 디펜하이드라민은 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포 집단을 투여하기 약 30분 전에 투여된다.
약제의 제조에서의, 본원에 개시된 인간 Treg 세포의 집단의 용도가 본원에 추가로 제공된다. 약제는 질환, 장애, 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다.
이식편 대 숙주 질환(GVHD)
대상체에서 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에서 GVHD의 하나 이상의 증상을 개선, 감소, 또는 예방한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 GVHD를 갖는 대상체의 생존을 연장시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체가 이식을 받은 후 GVHD가 발병하는 것을 예방한다.
대상체에서 GVHD를 치료 또는 예방하는 방법으로서, (i) 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단 및 (ii) 룩소리티닙을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 일부 실시형태에서, 룩소리티닙은 대상체에게 연속적으로 투여되고 인간 Treg 세포는 2, 3 또는 4주마다 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 룩소리티닙은 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 또는 25 mg 정제로 경구로 하루 2회 복용한다.
동종이형 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)은 많은 혈액 악성 종양에 대한 유일한 치료 옵션이다. 그러나, 이 절차의 보다 광범위한 사용에 대한 주요 장벽은 이식편의 T 세포가 숙주의 조직을 외부 조직으로 인식할 때 발생하고 질병률 및 사망률의 주요 원인인 GVHD의 발생이다. (문헌[Warren et al., Tissue Antigens 81(4):183-93 (2013)]; 문헌[Sung et al., Stem Cells Transl Med 2(1):25-32 (2013)]; 및 문헌[Qian et al., J Cell Mol Med 17(8):966-75 (2013)] 참조). 급성 GVHD(aGVHD)는 일반적으로 HSCT 후 첫 100일 이내에 발생하며 피부, 장 및 간과 같은 조직에 염증성 병변을 일으키는 NK 세포 및 대식세포와 같은 다른 염증성 세포 유형을 모집하는 활성화된 T 세포의 "사이토카인 폭풍"을 수반한다. aGVHD는 이식 환자의 대략 15%에서 사망을 유발한다. (문헌[Sung et al., Stem Cells Transl Med 2(1):25-32 (2013)]; 및 문헌[Qian et al., J Cell Mol Med 17(8):966-75 (2013)] 참조). 만성 GVHD(cGVHD)는 이식 후 처음 100일 후에 발생하며 여러 기관, 특히 장, 간, 폐, 골수, 흉선, 및 피부에 영향을 미치는 전신 염증 및 조직 파괴를 특징으로 한다. cGVHD는 동종이형 HSCT 수용자의 30 내지 65%에서 발생하며 주로 감염과 싸우는 능력 손상으로 인해 5년 사망률이 30 내지 50%인 극심한 질병률을 유발한다. aGVHD는 주로 Th1/Th17-유도된 과정으로 생각되는 반면 cGVHD는 주로 Th2-유도된 반응에 의해 유도되는 것으로 생각된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에서 aGVHD의 하나 이상의 증상을 개선, 감소, 또는 예방한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에서 cGVHD의 하나 이상의 증상을 개선, 감소, 또는 예방한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 치료 방법은 백혈병 세포를 사멸시키는 동종이형 면역 세포에 의한 유익한 면역 반응인 이식편 대 백혈병(GVL) 활성의 이점의 손실 없이 GVHD를 억제하는 데 사용될 수 있다(문헌[Edinger et al., Nat Med 9(9):1144-50 (2003)] 참조).
GVHD를 최소화하기 위한 현재 전략은 칼시뉴린 억제제(CNI), 사이클로스포린 및 타크로리무스와 같은 약물을 사용한 장기간의 면역억제 요법을 요구한다. 그러나, 이러한 장기간의 면역억제는 면역 기능을 지연시켜 감염 합병증과 이식 후 림프증식성 장애의 위험을 초래한다. 일부 실시형태에서, 대상체에서 GVHD를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 임의의 다른 면역억제제를 투여하지 않고, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
GVHD의 이종 마우스 모델을 사용하여 GVHD의 치료에서 제대혈 유래 T-조절 세포의 기능을 평가할 수 있다. (문헌[Parmar et al., Cytotherapy 16(10:90-100 (2013)] 참조).
골수 부전 증후군(BMF)
대상체에서 골수 부전 증후군(BMF)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 유효량의 새로운 단일 용량 Treg 세포 생성물(예를 들어, CK0801)이 BMF를 치료 또는 예방하기 위해 투여된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에서 BMF의 하나 이상의 증상을 개선, 감소, 또는 예방한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 BMF를 갖는 대상체의 생존을 연장시킨다.
BMF는 골수(BM)에서 조혈 전구체의 감소 또는 부재를 초래하는 하나 이상의 주요 조혈 계통의 감소된 생성을 지칭한다. 후천성 및 유전성의 두 가지 카테고리로 나눌 수 있다. 후천성 BMF 증후군에는 재생 불량성 빈혈, 골수이형성 증후군, 및 원발성 골수섬유증이 포함된다. 후천성 BMF 증후군의 병인은 BM 미세 환경과 환경 요인을 포함한다. 이러한 증후군의 대부분에서 면역 기능 장애의 역할은 BM 결함의 기원과 유지 모두에서 중요한 것으로 인식된다.
재생 불량성 빈혈(AA)
대상체에서 재생 불량성 빈혈(AA)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
AA는 말초 혈액(PB)의 범혈구감소증 및 골수(BM) 저형성증을 특징으로 하며, AA는 BM 조혈 전구 세포에 대한 자가반응성 세포독성 T 세포, 예컨대 CD8+ 세포독성 T 세포, CD4+ Th1 세포, 및 Th17 세포에 의한 공격을 특징으로 하는 BMF 증후군이다. (문헌[Brodksy et al., Lancet 365(9471):1647-56 (2005)]; 문헌[Li et al., Crit Rev Oncol Hematol 75(2):79-93 (2010)]; 문헌[Young et al., Curr Opin Hematol 15(3):162068 (2008)]; 및 문헌[de Latour et al., Blood 116(20):4175-84 (2010)] 참조).
조혈의 면역 매개 파괴 메커니즘은 T-세포 집단에 의한 자가 CD34+ 세포에 대한 억제 사이토카인, 예컨대 인터페론-γ(IFN-γ), 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 및 인터류킨-2(IL-2) 직접적인 독성의 과도한 생성을 부여하는 Th1 분극 반응 및 Th17 면역 반응을 포함한다. (문헌[de Latour et al., Blood 116(20):4175-84 (2010)]; 문헌[Giannakoulas et al., Br J Haematol 124(1):97-105 (2004)]: 문헌[Sloand et al., Blood 100(4):1185-91 (2002)]; 및 문헌[Solomou et al., Blood 107(10):3983-91 (2006)] 참조). 그런 의미에서, AA는 비정상적인 T 세포 면역 항상성을 유도하는 결함이 있을 뿐만 아니라 결핍이 있는 조절 T 세포와 조합으로 과활성 세포독성 자가 반응성 T 세포로 인한 특정 자가면역 질환이며 BM이 주요 표적 기관이다.
대상체에서 후천성 특발성 재생 불량성 빈혈을 치료하는 방법으로서, 대상체는 매치된 형제 공여자 조혈모세포 이식(MSD-HSCT)에 부적격이거나 면역억제 요법(IST)에 대한 불량한 반응자로 예측되는 방법이 본원에 또한 제공된다.
후천성 AA의 진단은 범혈구감소증을 유발할 수 있는 다른 장애의 배제 및 잘 알려진 Camitta 기준을 기반으로 할 수 있다. (문헌[Camitta et al., Blood 45(3):355-63 (1975)] 참조).
AA 반응 기준(문헌[Killick et al., Br J Haematol 172(2):187-207 (2016)] 참조)은 아래 표에 나타낸 바와 같이 본원에 기재된 치료 방법에 대한 AA를 갖는 대상체의 반응을 결정하기 위해 사용될 수 있다:
Figure pct00010
골수이형성 증후군(MDS)
대상체에서 골수이형성 증후군(MDS)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
MDS는 손상된 혈액 세포 생성이 증가된 아포토시스의 결과일 수 있는 비효율적인 조혈을 특징으로 한다. 아포토시스를 피하는 비정상적인 전구 세포의 클론 확장은 명백한 급성 백혈병으로의 진화를 유발할 수 있다. (문헌[Rosenfeld, Leukemia 14(1):2-8 (2000)] 및 문헌[Barrett et al., Semin Hematol 37(1):15-29 (2000)] 참조). 면역 기능의 조절 장애는 MDS에서 인정되는 사실이다. (문헌[Fozza et al., Exp Hematol 37(8):947-55 (2009)] 참조). 가능한 메커니즘 중에서 T 세포 매개 조혈 억제는 특히 저위험 및 저세포 MDS의 전형적인 특징으로 인식되었다. (문헌[Epperson et al., Leuk Res 25(12):1075-83 (2001)] 참조). 일부 유형의 MDS에서 혈구감소증은 정상 및 비정상 골수(BM) 전구 세포의 사이토카인 또는 세포 매개 자가면역 억제로 인한 것일 수 있다. (문헌[Barrett et al., Semin Hematol 37(1):15-29 (2000)] 참조). 이러한 메커니즘은 특히 자가면역 병인이 확립된 질환인 재생 불량성 빈혈(AA)과 임상적으로 종종 겹치는 MDS(HMDS)(문헌[Tuzuner et al., Br J Haematol 91(3):612-17 (1995)] 참조)의 저형성 형태에서 작동할 수 있다. (문헌[Young et al., N Engl J Med 336(19):1365-72 (1997)] 참조).
MDS가 있는 환자는 CD4 대 CD8 비 감소, 다중 활성화된 CD8+ T-세포 클론의 확장, 및 억제 사이토카인의 과잉 생산을 나타낸다. (문헌[Selleri et al., Cancer 95(9):1911-22 (2002)] 참조). MDS 환자의 면역 이펙터 메커니즘에는 직접적인 사멸뿐만 아니라 조혈 전구 세포에 대하여 억제 활성을 갖는 인터페론-γ(IFN-γ), 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 및 Fas-리간드(Fas-L)와 같은 사이토카인의 방출이 포함될 수 있다. (문헌[Zang et al., Blood 98(10):3058-65 (2001)] 참조). 이러한 병태생리학적 경로와 일치하여 MDS 환자의 혈액 및 골수에서 증가된 수준의 사이토카인이 설명되었으며 이러한 환자에서 발견되는 많은 수의 세포자멸 골수성 세포의 원인일 가능성이 높다. (문헌[Selleri et al., Cancer 95(9):1911-22 (2002)] 참조).
현재, MDS의 진단(문헌[Gangat et al., Am J Hematol 91(1):76-89 (2016)] 참조)은 하기의 존재를 기반으로 확립된다: (i) 지속적(>6개월 기간) 및 유의한 혈구감소증(들) 헤모글로빈 <10 g/dL, 절대 호중구 수 <1.8x109/L, 혈소판 수 <100x109/L, (ii) 유의미한 골수 이형성증, 또는 아세포 과잉 또는 전형적인 세포유전학적 이상, 및 (iii) 감별 진단의 배제. (문헌[Barrett et al., Semin Hematol 37(1):15-29 (2000)] 참조). 일반적인 말초 혈액 소견으로는 거대적혈구 빈혈, 망상적혈구감소증, 저분절된 호중구를 동반한 호중구감소증(슈도 Pelger-Huet), 골수아세포 및 혈소판감소증을 포함한 순환하는 미성숙 골수 세포가 포함된다.
아래 표에 보여지는 바와 같이, 국제 연구 그룹(IWG: International Working Group) 반응 기준(문헌[Cheson et al., Blood 108(2):419-25 (2006)] 참조)을 사용하여 본원에 기재된 치료 방법에 대한 MDS를 갖는 대상체의 반응을 결정할 수 있다:
Figure pct00011
원발성 골수섬유증(PMF)
대상체에서 원발성 골수섬유증(PMF)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, PMF를 치료 또는 예방하기 위해 대상체에게 투여된 인간 Treg 세포의 집단은 적어도 약 90% CXCR4+이다.
대상체에서 PMF를 치료 또는 예방하는 방법으로서, (i) 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단 및 (ii) 룩소리티닙을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 일부 실시형태에서, 룩소리티닙은 대상체에게 연속적으로 투여되고 인간 Treg 세포는 2, 3 또는 4주마다 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 룩소리티닙은 5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg 또는 25 mg 정제로 경구로 하루 2회 복용한다.
PMF는 환자의 50%가 야누스 키나제(JAK)2 유전자인 JAK2V617F에서 구성적으로 활성화된 돌연변이를 갖는 클론 조혈 줄기 세포 장애이다. PMF는 일반적으로 돌연변이된 줄기 또는 전구 조혈 세포에서 발생하는 것으로 간주되지만 면역 조절 장애는 일반적이다. 예를 들어, 염증성 사이토카인의 혈장 수준이 증가하고 자가면역의 임상 및 실험실 징후가 있다. (문헌[Barosi Curr Hematol Malig Rep 9(4):331-39 (2014)] 참조). 이 클론성 골수증식은 특징적으로 반응성 골수섬유화증(골수 섬유증)과 비장 또는 여러 기관의 골수외 조혈을 동반한다.
염증유발성 사이토카인은 PMF에서 매우 높은 수준으로 질병 발병기전에 기여하는 것으로 알려져 있다. 사실, 룩소리티닙을 사용한 치료는 IL-6 및 종양 괴사 인자(TNF)-α를 포함한 염증유발성 사이토카인의 순환 수준의 극적인 감소와 관련이 있다.
PMF의 진단은 표 7에 제시된 기준을 사용하여 이루어질 수 있다(문헌[Barbui et al., Blood Cancer Journal 8(2):15 (2018)] 참조):
Figure pct00012
아래 표에 보여지는 바와 같이, 개정된 국제 연구 그룹-골수증식성 신생물 연구 및 치료(IWG-MRT) 및 유럽-백혈병 네트워크(ELN) 응답 기준(문헌[Tefferi et al., Blood 122(8):1395-98 (2013)] 참조)을 사용하여 본원에 기재된 치료 방법에 대한 PMF를 갖는 대상체의 반응을 결정할 수 있다:
Figure pct00013
Figure pct00014
전신성 홍반성 루푸스(SLE)
대상체에서 전신성 홍반성 루푸스(SLE)를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에서 SLE의 하나 이상의 증상을 개선, 감소, 또는 예방한다. 일부 실시형태에서, 활성화된 인간 Treg 세포를 대상체에 투여한 후, 소변 중 알부민 유출이 감소되고; 사구체의 SLE 세포 침윤이 감소하고/감소하거나; 모낭이 보존된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 SLE를 갖는 대상체의 생존을 연장시킨다.
SLE는 만성, 다기관, 염증성 자가면역 장애이다. 루푸스는 관절, 피부, 신장, 심장, 폐, 혈관, 및/또는 뇌를 포함한 신체의 많은 부분에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, SLE는 관절통 또는 관절염, 레이노 현상, 말라 및 기타 발진, 흉막염 또는 심낭염, 신장 또는 CNS 침범, 및/또는 혈액 혈구감소증으로 나타날 수 있다.
염증성 암
대상체에서 염증성 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 염증성 암은 다발성 골수종 또는 염증성 유방암이다. 일부 실시형태에서, 다발성 골수종에 대한 치료 요법은 유효량의 인간 Treg 세포 집단의 투여 및 염증성 암의 치료에 유용한 이중특이적 단백질(예를 들어, 항체)의 투여를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 단백질은 이중특이적 T-세포 인게이저이다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 T-세포 인게이저는 CD3 및 BCMA에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에서 염증성 암의 하나 이상의 증상을 개선, 감소, 또는 예방한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 염증성 암을 갖는 대상체의 생존을 연장시킨다.
신경-염증성 장애
대상체에서 신경-염증성 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 염증성 암은 길랑-바레 증후군 또는 근위축성 측삭 경화증이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에서 신경-염증성 장애의 하나 이상의 증상을 개선, 감소, 또는 예방한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 신경-염증성 장애를 갖는 대상체의 생존을 연장시킨다.
길랑-바레 증후군(GBS)
대상체에서 길랑-바레 증후군(GBS)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
또한, 대상체에서 GBS를 치료하는 방법으로서, 대상체는 정맥내 면역글로불린(IVIG) 또는 혈장 교환을 사용한 치료에 반응하지 않는 방법이 본원에 제공된다.
GBS는 신경 염증으로 인한 근육 약화의 급속한 발병을 특징으로 하는 자가면역 장애이다. 두 가지 주요 하위 유형이 있다: (1) 급성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(AIDP) 및 (2) 급성 축삭 신경병증(AMAN). GBS의 정확한 원인은 알려져 있지 않지만 감염에 대한 면역 반응이 신경을 손상시키는 자가면역 반응을 일으킨다는 강력한 증거가 있다.
실험적 자가면역 신경염(EAN)은 AIDP의 동물 모델로서 작용하는 말초 신경계의 면역 매개 염증성 탈수초 장애이다. 본원에 설명된 치료 방법은 이 동물 모델에서 시험될 수 있다. 이는 혈액-신경 장벽의 붕괴, 자가반응 T 세포 및 대식세포의 침윤, 및 말초신경계의 탈수초화를 유발하는 P0 또는 P2와 같은 미엘린 단백질로의 면역화에 의해 감수성 동물 균주에서 일반적으로 유도된다(문헌[Soliven, B., Autoimmune neuropathies: insights from animal models. J Peripher Nerv Syst, 2012. 17 Suppl 2: p. 28-33.]). EAN은 말초 신경 단백질 P0, P2 및 말초 수초 단백질 22(PMP22)의 신경 생성 에피토프(문헌[Hughes, R.A., et al., Pathogenesis of Guillain-Barre syndrome. J Neuroimmunol, 1999. 100(1-2): p. 74-97.]) 또는 감작된 T 세포의 입양 전달에 의해 능동적으로 개시될 수 있다.
근위축성 측삭 경화증(ALS)
대상체에서 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단(예를 들어, 1x108, 3x108 또는 1x109 활성화된 인간 Treg 세포)을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시형태에서, 대상체에서 신경-염증성 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
ALS는 수의근을 제어하는 뉴런의 사멸을 포함하는 희귀 신경 질환이다. 이는 걷고 말하는 능력의 상실과 함께 심각한 근육 위축을 초래한다. 이 질환은 대략 80%의 5년 사망률을 특징으로 한다. 자가면역 신경-염증은 ALS 발병 및 진행의 초석을 형성한다. 사실, ALS 환자는 척수의 염증이 증가하고 미세아교세포의 활성화 정도는 질환의 중증도에 상응한다.
ALS에서, Treg는 기능장애가 있고 반응자 T-림프구 증식을 억제하는데 덜 효과적이다. 더욱이, 후기 ALS는 M1-유사 대식세포/미세아교세포 및 염증유발성 이펙터 T 세포의 침윤을 특징으로 한다. ALS 환자는 Treg(CD4+/CD25+)가 감소하는 경향이 있으며 진행 속도는 Treg 세포 수와 음의 상관관계가 있다. 마찬가지로, 낮은 FoxP3 mRNA 수준은 빠른 ALS 진행의 예측인자이다. 더욱이, ALS 환자에게서 채취한 Treg는 건강한 대상체에 비해 Th17 세포의 증식을 억제하는 능력이 감소했다.
COVID-19(코로나바이러스 질환) 매개 급성 호흡 곤란 증후군(CoV-ARDS)
대상체에서 COVID-19(코로나바이러스 질환) 매개 급성 호흡 곤란 증후군(CoV-ARDS)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포 집단 또는 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단(예를 들어, 약 1x108 또는 약 3x108 활성화된 인간 Treg 세포)을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 약 1 x 108 또는 약 3 x 108개의 활성화된 인간 Treg 세포가 0일차 및 3일차에 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1 x 108 또는 약 3 x 108개의 인간 Treg 세포가 0일차, 3일차, 및 7차일에 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포는 동결보존된 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포(CK0802)이다. 일부 실시형태에서, 인간 Treg 세포는 단일 제제로서 투여된다.
일부 실시형태에서, 대상체는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 감염되거나 감염된 것으로 의심된다.
고병원성 SARS-CoV-2는 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS); 폐 섬유증 및 사망을 유발하는 급성 폐 손상을 초래하는 빠른 바이러스 복제, 대규모 염증 세포 침윤 및 증가된 염증유발성 사이토카인/케모카인 반응과 관련이 있다. 바이러스 감염의 초기 단계에는 강력한 바이러스 복제 및 발열, 기침 등을 포함한 임상 증상이 포함된다. 바이러스 감염의 두 번째 단계는 고열, 저산소혈증, 폐렴과 유사한 증상으로의 진행 및 마지막으로 갈수록 바이러스 역가의 점진적인 감소를 포함한다. 바이러스 감염의 세 번째 단계는 과도한 숙주 염증 반응, 사이토카인 및 케모카인의 과도한 생성, 조절되지 않은 선천 면역 반응, 및 ARDS를 포함한다. 임상적으로, ARDS는 급성 저산소성 호흡 부전과 흉부 x-선 상의 양측 폐 침윤을 특징으로 한다.
제어되지 않은 사이토카인 폭풍은 SARS-CoV-2에 감염된 일부 대상체에서 호흡기 합병증의 심각도에 대한 책임이 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, CoV-ARDS 사이토카인 폭풍은 염증유발성 사이토카인(예를 들어, IFN-γ, IL-1, IL-6, IL-12, 또는 TGFβ) 및 케모카인(예를 들어, CCL2, CXCL10, CXCL9, 및 IL-8)의 증가를 포함한다. 더 높은 바이러스 역가와 조절되지 않은 사이토카인/케모카인 반응은 염증 세포가 폐로 대량으로 침투하는 것을 조정한다. 일부 실시형태에서, CoV-ARDS 사이토카인 폭풍은 항-염증성 사이토카인(예를 들어, IL-10)의 감소를 포함한다. 전임상 폐 손상 모델에서, CB-Treg 세포를 주입하면 다음과 같은 결과가 나타난다: i) 염증성 T-세포의 감소; ii) 폐포 출혈의 감소; iii) 폐 상피 및 폐포의 재생; 및 iv) CoV-ARDS와 관련된 IL-17 및 IL-6을 포함한 염증성 사이토카인의 감소.
사망률이 50%를 초과하는 기계적 환기를 포함한 보조 요법을 제외하고는 특별한 치료가 존재하지 않는다. 새로운 치료 옵션이 긴급하게 필요하다. 조절 T 세포(Treg)는 조직 복구 및 재생으로 이어지는 여러 메커니즘을 통해 염증 유발 폐 손상을 제한하는 특수한 유형의 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 유효량의 본원에 개시된 인간 Treg 세포 집단의 투여는 염증을 해결함으로써 CoV-ARDS 또는 CoV-ARDS의 증상을 치료할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 유효량의 집단의 투여는 억제자 사이토카인(예를 들어, TGF-β, IL-6, IL-10, IL-17, IL-18, 또는 IL-33)의 방출을 유도할 수 있다.
일부 실시형태에서, 이러한 치료 방법에 사용된 인간 Treg 세포는 염증의 CoV-ARDS 관련 부위로의 수송을 담당하는 폐 조직에 대한 귀소 마커인 CCR4를 발현한다.
모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원 그 전체가 참조로서 구체적으로 그리고 개별적으로 포함되는 것으로 표시되는 바와 동일한 정도로 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
본원에 기재된 임의의 양태 및 실시형태는 본 발명의 하기 특정한 비제한적 실시예/실시형태를 포함하는 본 발명의 요약, 도면 및/또는 본 발명의 상세한 설명에 개시된 바와 같은 임의의 다른 양태 또는 실시형태와 조합될 수 있다.
하기 실시예는 본원에 기술되고 청구된 화합물, 조성물, 물품, 장치, 및/또는 방법이 어떻게 수행되고 평가되는지에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 순전히 예시를 위한 것이며 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 본원에서는 일부 오류 및 편차를 고려할 필요가 있다. 달리 표시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 온도는 섭씨 또는 주위 온도이며, 압력은 대기압 또는 그 근처의 압력이다.
실시예
실시예 1: 제대혈로부터의 활성화된 T-조절 세포의 확장된 집단의 생성
동결보존된 인간 제대혈 유닛(CBU)은 자격을 갖춘 공공 미국 제대혈 은행으로부터 입수하였다. CBU를 빠르게 해동하였다. 해동된 제대혈 유닛은 시작 부피 25 ml, 최종 부피 100 ml 및 희석 인자 1.0으로 설정된 Sepax 장치(Biosafe)를 사용하여 자동 세척되었다. 사용된 세척 시약은 5% 인간 혈청 알부민(HSA)(CSL Behring) 및 10% 덱스트란-40(D-40)(Hospira)이었다. 세척 후, 제대혈 세포를 제대혈 세척 백에 수집하였다.
세척의 목적을 위해, 기본 세척 배지는 20 ml의 25% HSA 내지 1000 ml PBS/EDTA 완충액이었고; 작업 세척 배지는 300 ml의 염기성 세척 완충액 및 50 mg의 염화마그네슘(MgCl2) 및 2500 단위의 DNase였고; 그 다음 변형된 배지는 X-Vivo 15 배지(Lonza) 및 10 ml의 GlutaMAX-1 및 100 ml의 해동된 인간 AB 혈청이었다. 자동 세척을 완료한 후, 작업 세척 배지를 사용하여 세척된 제대혈 세포를 추가 수동 세척하였으며; 여기서 최종 부피는 200 ml로 구성하였고 재구성된 세포를 실온에서 300g에서 10분 동안 원심 분리하였다. 마지막으로, 세척된 세포를 0.09 ml 중 100x106 세포의 총 유핵 세포(TNC) 카운트의 농도로 재현탁하였다.
이어서, CD25 마이크로비드를 100x106 TNC당 0.02 ml 인간 CD25 시약의 비로 첨가하였다. 세포와 마이크로비드를 섭씨 4도에서 30분 동안 함께 배양하였다. 배양 단계 후, 세포를 MidiMACS 장치에 부착된 Miltenyi LS 컬럼으로 옮기고 자석을 사용하여 항-CD25 표지된 세포를 포획하였다. 면역자성 선택 후, 세포를 자기장으로부터 해방하였다.
대략 1x106개의 CD25+ 세포를 세척하고 1% L-글루타민, 10% 인간 혈청 알부민(HSA) 및 인터류킨-2(IL-2, 1000 IU/mL)와 함께 X-VIVO에 현탁하였다. 이어서, 용액을 1:1의 비드 대 세포 비로 항-CD3/항-CD28 비드와 혼합하였다. 혼합물을 10 cm2의 막 표면적을 갖는 기체 투과성 배양기로 옮기고, 후속적으로 배양물을 100 cm2의 막 표면적을 갖는 기체 투과성 배양기로 옮기고, 총 14일 동안 배양하였으며, 여기서 배양 배지는 세포를 방해하지 않고 48시간마다 교체하였다. 14일 후, 세포를 수확하고, 항-CD3/항-CD28 비드를 자성 입자 농축기로 제거하였다. 그 다음, 세포를 최종 배지에 재현탁하였다.
세포는 제조 과정의 다양한 지점에서 샘플링되었으며, 그 특성은 표 9에 나타나 있다.
Figure pct00015
도 1에 도시된 바와 같이, 위에서 설명한 방법으로 생성된 확장된 활성화된 Treg 세포는 실온(15-30℃) 또는 4℃에서 저장할 때 안정적이었다. 도 1은 7AAD가 일반적으로 살아있는 세포에서 제외되는 것처럼 보이기 때문에 DNA와 결합 시 스펙트럼 이동을 겪는 형광 인터칼레이터인 7-아미노액티노마이신 D(7AAD)를 사용하여 살아있는 세포를 평가하는 유세포 분석 기반 분석의 결과를 도시한다. 세포를 30분 동안 1 마이크로리터 7AAD 스톡 용액의 존재 하에 얼음 상에서 배양하였다. 배양 기간 후 가능한 한 빨리 염색된 세포를 보라색 및 488 nm 여기를 사용하고 440 nm 및 670 nm 대역통과 필터(또는 거의 동등한 필터)를 사용하여 형광 방출을 측정하는 유세포 분석법으로 분석한다. 살아있는 세포는 낮은 수준의 형광만 나타낸다.
확장된 활성화된 Treg 세포의 표현형은 세포 배양 개시(0일차)뿐만 아니라 세포 배양 개시 후 8일차 및 14일차에 유세포 분석에 의해 측정되었다. 결과는 표 10에 나타나 있다.
Figure pct00016
확장된 활성화된 Treg 세포는 억제성이며, 도 2a 및 도 2b에 도시된 바와 같이 70-96% 억제를 나타낸다. 도 4a 내지 도 4d에 도시된 바와 같이, 확장된 활성화된 Treg 세포는 RORγt를 발현하지 않고 스트레스에 대한 반응으로 IL-10 발현의 상호 증가를 나타낸다. 도 4a는 IL-6이 Treg 세포의 억제 활성에 영향을 미치지 않음을 도시한다. 도 4b는 IL-6이 Treg 세포에 의한 RORγ 발현에 영향을 미치지 않음을 도시한다. 도 4c는 IL-6이 Treg 세포에 의한 IL-17A 생성에 영향을 미치지 않음을 도시한다. 도 4d는 IL-6이 Treg 세포에 의한 증가된 IL-10 생성을 유도함을 도시한다. 도 25는 IL-6이 Treg 세포에 의한 그랜자임 B 생성을 유도함을 도시한다. 뿐만 아니라, 확장된 활성화된 Treg 세포는 HLA 장벽을 가로질러 면역억제성일 수 있다(도 3). 확장된 활성화된 Treg는 T 세포 수용체 Vβ 레퍼토리의 가우시안(다클론) 분포를 나타낸다(도 6).
확장된 활성화된 Treg 세포는 스테로이드의 존재 하에 억제성을 유지한다. 도 7a 및 도 7b는 Treg 세포가 덱사메타손의 존재 하에 억제성을 유지함을 도시한다. Treg 및 Tcon 세포의 생존 능력에 대한 프레드니손의 효과는 아래에 나타나 있다.
Figure pct00017
Treg 세포는 아래와 같이 프레드니손이 존재할 때 억제성을 유지한다.
Figure pct00018
실시예 2: 제대혈로부터의 활성화된 T-조절 세포의 확장된 집단의 동결보존
실시예 1에 기재된 방법에 의해 생성된 확장된 활성화된 Treg 세포를 다음과 같이 동결보존하였다.
총 50x106개의 세포를 ml당 10x106개의 세포의 농도로 5 ml 바이알당 동결보존하였다. 활성화된 인간 Treg 세포의 수확된 확장된 집단을 4℃의 온도에서 10분 동안 400g에서 원심분리하였다. 총 세포 수는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 계산할 수 있으며 크라이오바이알의 수는 총 세포 수를 50x106개의 세포로 나누어 추정할 수 있다. 그 후, 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)(Cryostor)를 포함하는 사전 제형화된 용액으로 이루어진 동결 스톡 용액을 사용하여 5 ml 크라이오바이알당 최대 50x106개의 세포를 동결보존하였다. 세포가 원심분리되는 동안 제어 속도 동결기를 켰고 제어 속도 동결기가 적절한 시작 온도에 도달하면 "사용자를 기다리는 프로그램-계속하려면 여기를 클릭"이라는 명령이 나타났다. 동결 스톡 용액과 혼화되면, 최대 50x106개의 세포를 함유하는 크라이오바이알을 동결 알고리즘을 사용하여 제어된 속도 동결기에 배치하여 세포를 서서히 동결하여 세포 사멸을 방지하고 세포 기능을 보존하였다. 동결 프로그램이 완료된 후, 크라이오바이알을 제어 속도 동결기에서 제거하고 장기간 동결보존을 위해 -190℃의 온도에서 액체 질소 극저온 동결기에 배치하였다.
동결보존된 활성화된 Treg 세포는 일관된 표현형을 나타내고 신선한 활성화된 Treg 세포와 유사한 면역억제 능력이 있다(도 8a 내지 도 8c). 동결보존된 활성화된 Treg 세포는 헬리오스의 높은 발현(도 8b) 및 증식하는 통상적인 T 세포의 억제(도 8c)를 나타낸다. 실시예 3에 추가로 기재된 바와 같이, 동결보존된 및 신선한 확장된 활성화된 Treg 세포는 이식편 대 숙주 질환의 예방 또는 치료에 비슷하다.
실시예 3: 제대혈 유래 T-조절 세포를 사용한 이식편 대 숙주 질환의 예방 및 치료
이식편 대 숙주 질환(GVHD)의 이종 마우스 모델을 사용하여 실시예 1 및 2에 기재된 방법에 의해 생성된 제대혈 유래 T-조절 세포의 기능을 평가하였다. GVHD의 모델은 문헌[Parmar et al., Cytotherapy 16 (10:90-100 (2013))]에 기재되어 있다. GVHD 예방에 대한 Treg의 효과를 연구하기 위해, NOD/SCID IL-2Rγ 널(NSG) 마우스(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)는 1x107개의 Treg 세포를 주사하기 1일 전에 및 1x107개의 인간 PBMC를 정맥내 주입하기 2일 전에 준치사량의 전신 방사선 조사(J. L. Shepherd and Associates Mark I-25 Irradiator, San Fernando, CA에 의해 1분에 걸쳐 전달한 137Cs 소스의 300 cGy)를 받았다. 마우스는 임상 GVHD 점수 시스템을 사용하여 평가되었다. (문헌[Reddy et al., Transplantation 69(4):691-93 (2000)] 참조). 신선한 제대혈 유래 Treg 및 동결보존된 Treg를 사용한 처리는 유사한 GVHD 점수(도 9a) 및 체중에 대한 영향(도 9b)을 생성하였다.
동결보존된 Treg의 투여는 이종 마우스 모델에서 GVHD를 예방하고 치료하였다. 도 10a는 GVHD 예방에 대한 단일 Treg 주입의 효과를 모니터링하기 위한 연구 디자인을 도시한다. 도 10b는 GVHD 치료에 대한 다중 Treg 주입의 효과를 모니터링하기 위한 연구 디자인을 도시한다. 도 11a 내지 도 11b에 도시된 바와 같이, 활성화된 Treg의 투여는 GVHD를 예방하고 치료할 수 있다. 활성화된 Treg의 투여는 PBMC 주입 후 14일차에 말초 혈액에서 염증성 사이토카인의 수준을 억제한다(도 12a 내지 도 12f). 활성화된 Treg는 처리된 마우스의 염증 부위에 분배된다(도 13). 더욱이, 활성화된 Treg는 통상적인 T 세포-매개 항-백혈병 효과를 방해하지 않는다(도 14).
실시예 4: 동결보존된 제대혈 유래 T-조절 세포를 사용한 전신성 홍반성 루푸스의 치료
전신성 홍반성 루푸스(SLE)의 이종 마우스 모델(문헌[Andrade et al., Arthritis Rheum. 2011 Sep; 63(9): 2764-2773])을 사용하여 전신성 홍반성 루푸스로부터의 말초 혈액 단핵 세포를 비-SCID 감마 널(NSG) 마우스에 이식하였다. 암컷 Rag2-/-γc-/- 마우스에 3x106 인간 SLE-말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 0일차에 정맥 주사에 의해 이식하였다. 마우스는 질병이 발병하도록 하고 이식 후 30일차에 2 그룹으로 나누었다: i) 대조군 및 ii) 처리군. 1x107개의 생체 외에서 확장된, 동결보존된, 동종이형, 비-HLA 매치된 CB Treg를 꼬리 정맥을 통해 4주 동안 일주일에 한 번 SLE 이종이식편에 정맥 주사하였다. 표현형 분석, 사이토카인 분석 및 항-이중 가닥(ds) DNA IgG 항체 분석을 위해 연속 채혈을 수행하였다. 소변 샘플의 연속 검사는 크레아티닌 및 알부민 정량화를 위해 수행하였다. 수확된 기관의 조직병리학적 검사는 계획된 안락사 시점인 13주에 수행하였다.
이 SLE 모델을 사용하여 실시예 1 및 2에 기재된 방법에 의해 생성된 제대혈 유래 T-조절 세포의 기능을 평가하였다. 도 15에 도시된 바와 같이, 활성화된 Treg 세포의 단회 주사는 SLE-PBMC의 생착 후 9주 동안 CD45+ 이펙터 T 세포의 수준을 감소시켰다. SLE-PBMC는 0일차에 주사되었고, 제대혈(CB) Treg 매주 주사는 +4주부터 시작되었다. 활성화된 Treg 세포의 4주간의 주사는 SLE 마우스에서 생존을 개선하고(도 16a) 항-이중 가닥 DNA 항체(dsDNA Ig)의 수준을 감소시켰다(도 16b). 항-이중 가닥 DNA 항체의 존재는 루푸스병 활성의 마커이다. Treg 수용자는 체중 증가가 보존되었고 GVHD 점수가 더 낮았다. 활성화된 Treg 세포의 4주간의 주사는 또한 SLE 마우스에서 소변 알부민의 수준을 감소시키고(도 17a), 소변 크레아티닌 유출을 감소시키고(도 17b), 신장 조직학을 개선하였다(도 18). 도 19에 나타낸 바와 같이, 활성화된 Treg의 투여는 SLE 마우스에서 인간 sCD40L의 농도를 감소시킨다. 또한, 활성화된 동결보존된 Treg의 매주 주사는 순환 CD8+ 이펙터 T 세포의 지속적인 감소(도 20a) 뿐만 아니라 비장, 골수, 폐, 및 간에서 CD8+ 이펙터 T 세포의 침윤 감소를 야기하였다(도 20b). 각 아암의 2가지 지표 경우의 조직병리학적 결과는 Treg 수용자가 신장에서 감소된 T 세포(CD3+) 및 B 세포(CD20+)를 나타낼 뿐만 아니라 대조 아암과 비교하여 사구체 및 신장 실질로의 림프구 침윤의 감소를 나타냄을 입증하였다.
실시예 5: 신선한 제대혈 유래 T 조절 세포를 사용한 다발성 골수종의 치료
트랜스웰 이동 분석
8.0 μm 기공 폴리카보네이트 막 삽입물(Corning, Corning, NY, US)이 있는 6.5 mm 24웰 트랜스웰 플레이트를 사용하였다. T 이펙터 세포(Teff)는 CD3+ 마이크로비드(Miltenyi Biotec)를 사용하여 단리되었다. 반딧불이 루시퍼라제/GFP 표지된 MM1.S 및 야생형 RPMI 8226 세포는 Orlowski 연구소(MD Anderson Cancer Center(MDACC))에서 수득하였다. U266 및 HL-60 세포는 American Type Culture Collection(Manassas, VA)에서 구입하였다. Nalm6 세포는 혈액 병리학 연구소(MDACC)에서 제공하였다. RPMI 8226 및 Nalm6 세포를 제조사의 지침에 따라 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)(Invitrogen)로 염색하였다. 표적 세포: GFP 표지된 MM1.S(3x105 세포); GFP 표지된 U266(3x105 세포); 및 CFSE 염색된 RPMI 8226(3x105 세포); 또는 음성 대조군 GFP 표지된 HL-60(1.5x105 세포) 또는 CFSE 염색된 Nalm6(6x105 세포)을 각각 300 μL의 배지에 재현탁하고 트랜스웰의 상부 구획에 시딩하였다. 액터세포 CB Treg(1x106개의 세포) 또는 양성 대조군 CD3+ Teff(1x106개의 세포)를 750 μL 배지에 재현탁하고 하부 구획에 첨가하였다. 실험의 개략도가 도 40a에 도시되어 있다. 이동된 표적 세포는 유세포 분석기(BD FACSCanto™)를 사용하여 분석하였다.
골수종 세포의 트래피킹에 대한 CB Treg 세포의 영향을 이해하기 위해, 표적 세포가 트랜스웰의 상부 구획에 시딩되는 트랜스웰 실험을 설정하였다(도 40a). 이들 표적 세포는 골수종 세포였다: GFP-MM1.S, GFP-U266, 또는 CFSE-RPMI 8226. 추가로, 두 개의 백혈병 세포주를 음성 대조군 표적 세포로 사용하였다: GFP-HL60(급성 골수성 백혈병) 또는 CFSE-Nalm6(전-B 백혈병). 액터 세포는 하부 구획에 시딩되었고 CB Treg 세포 또는 양성 대조군으로서 Teff 세포였다. 이러한 조치는 CB Treg의 골수종 특이적 효과를 단리하기 위해 취해졌다. CB Treg는 MM1.S(도 40b; p<0.01)) 및 RPMI 8226(도 40c; p=0.04)의 이동을 방지할 수 있었지만 U266(도 40d; p=0.14)의 이동은 방지할 수 없었다. HL-60(도 40e) 또는 Nalm6(도 40f)을 포함하는 백혈병 세포주의 이동 패턴에 대한 CB Treg의 효과는 관찰되지 않았다.
이종 다발성 골수종 마우스 모델
다발성 골수종의 이종 마우스 모델을 사용하여 실시예 1 및 2에 기재된 방법에 의해 생성된 제대혈 유래 T-조절 세포의 기능을 평가하였다. 비-SCID γ-널 암컷 마우스(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에 1x107 생체 외에서 확장된 CB Treg 세포가 있거나 없는, 반딧불이 루시페라제 표지된 MM1.S 세포(ATCC, Manassas, VA)(3x106 세포/마우스)를 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하였다. CB Treg 세포는 MM1.S 세포 주입 하루 전에 주입되었다. 이후에 이전에 설명한 대로 마우스를 이미징화하였다(문헌[Parmar et al., Cytotherapy, 2014. 16(1): p. 90-100]). 마우스는 일주일에 한 번 채혈하였다. 혈장 샘플은 마우스 사이토카인 수준을 측정하기 위해 Eve Technologies(Calgary, AB, Canada)로 보내졌다. 용해된 혈액은 항-인간 CD45/APC(Thermo Fisher Scientific), 항-인간 CD25/PE(Becton Dickinson), 항-인간 CD38/APCeFluor780(Thermo Fisher Scientific), 및 항-마우스 CD45/Pacific Blue(Thermo Fisher Scientific)로 염색하였다. 세포는 BD FACSCanto™ II에 의해 획득되었다. 안락사에서 골수와 비장을 수확하였다.
Kaplan Meier 방법을 사용하여 생존을 추정하고, 로그 순위 시험을 사용하여 그룹을 비교하였다. 두 그룹은 페어링되지 않은 스튜던트 t-검정으로 비교하고 3개 이상의 평균은 일방향 ANOVA 이어서 Bonferroni 시험으로 다중 비교를 수행하였다. 값은 평균과 평균의 표준 오차로 표현된다. P 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 모든 통계 분석 및 그래프 생성은 GraphPad Prism7.0(San Diego, CA)을 사용하여 수행되었다.
골수종 생착 차단에 대한 CB Treg의 효과를 이해하기 위해, 3x106 MM1.S 세포가 정맥내 주사된 이종 골수종 마우스 모델을 종양 발달을 허용하였다(대조군 아암). 치료 아암에서, 골수종 세포를 주입하기 하루 전에 CB Treg(1x107 세포)를 주입하였다. 마우스의 체중을 매주 2회 측정하였고 체중은 종양 접종 후 3주까지 두 아암에서 비슷한 수준으로 유지되었으며, "골수종 단독" 마우스의 체중 감소가 보이고 안락사 시 유의한 차이가 분명했다(도 21a). 골수종 부담은 그 차이가 안락사 시점까지 통계적으로 유의해지는 Treg 수용자와 비교하여 대조군 아암에서 28일까지 순환 CD38+ 골수종 세포에서 약간의 증가와 함께 유사한 경향이 관찰된 말초 혈액에서 정량화되었다(도 21b; 골수종 단독: 0.8% ± 0.3 vs. Treg가 있는 골수종: 12.4% ± 2.9, P=0.002).
비침습성 생물발광을 사용하여, 마우스를 매주 이미징하였고, GFP 표지된 MM1.S 세포의 상당한 흡수는 종양 접종 후 대략 3주째에 대조군 아암에서 다시 분명했고 4주째에 널리 퍼진 반면, 최소 발광은 CB Treg 수용자에서 검출되었다(도 21c). 종양 진행은 빨랐고, CB Treg 수용자에서 BLI에 의해 정량화된 종양 부하의 증가는 관찰 기간 동안 대조군 아암에서의 것과 비교하여 상당히 지연되었다(도 21d).
골수종 세포는 염증성 종양 미세환경에서 잘 성장하고 인터류킨-6(IL-6)은 골수종 질환 진행의 주요 동인과 관련되어 있기 때문에(문헌[Harmer et al. Front Endocrinol (Lausanne), 2018, 9: p. 788]), 이 염증성 사이토카인에 대한 CB Treg의 영향을 조사했다. 도 23에 도시된 바와 같이, 순환 IL-6 수준은 "단독 골수종" 아암에서 혈장 IL-6 수준의 유의한 증가가 측정되고 5주차까지 계속 증가할 때 종양 접종 후 4주까지 두 아암에서 비슷했다. 마지막으로, 종양 부하의 증가와 염증 부담의 증가는 "골수종 단독" 아암에서 사망률로 번역되어 Treg 수용자에게 통계적으로 유의한 생존 이점을 제공했다(도 22). 안락사 시, 종양 세포를 수확한 장기에서 측정하고 두 아암 사이에서 비교했다. 골수종 세포는 "골수종 단독" 아암과 비교하여 Treg 수용자의 골수에서 거의 검출할 수 없었다(도 24a; 0.6% ± 0.1 vs 90.0% ± 2.2, P<0.0001). 비장에서도 유사한 패턴이 관찰되었다(도 24b; 골수종 + Treg: 1.3% ± 0.4 vs 골수종 단독: 12.9% ± 4.2, P=0.009).
데이터는 골수종 세포 주입 전 CB Treg 세포의 단회 주입이, 궁극적으로 골수종 생착을 위한 적대적인 상태로 변환되는 IL-6 생성의 부족에 의해 보여지는 바와 같이, 생체 내에서 골수종 세포에 의해 생성된 염증 신호의 약화를 허용하는 충분한 증식 이점을 제공한다는 가설을 지지한다. 순환 및 장기 침윤 골수종 세포뿐만 아니라 체중 감소의 물리적 징후와 종양 부담의 중첩은 CB Treg 세포의 전신 항-염증 효과를 강화한다.
확립된 골수종 질환에 대한 효과
방법: 3x106 GFP 표지된 MM.1S 세포를 NSG 마우스에 주입한 다음 +14일차에 5x106개의 CD3+ T 통상적인(Tcon) 세포를 주입했다. Tcon 처리된 마우스의 부분 집합에서 1x107개의 CB Treg 세포를 +16일차, +23일차, 및 +30일차에 주입했다(아래 실험 디자인 표 참조). 마우스는 체중 및 GVHD 점수에 대해 격일로 추적되었다. 비침습성 생물발광 이미징(BLI)을 연속적으로 수행했다. 세포 분석 및 사이토카인 분석을 위해 매주 채혈을 수행했다. 안락사 시, 조직병리학 및 유세포 분석을 위해 혈액, 비장, 및 골수를 수확하였다. 후속 실험에서 CD3 및 BCMA에 대한 이중특이적 항체(BCMA-BiTE®(이중특이적 T-세포 인게이저))의 복강내 주사를 CB Treg 세포의 존재 또는 부재 하에 이종 골수종 모델에 투여했다. Pan T 세포는 BiTE®의 항-종양 작용을 촉진하기 위해 모든 마우스에 첨가되었다. 실험 디자인은 도 61e에 도시되어 있다.
Figure pct00019
결과: Tcon 및 Tcon+Treg 수용자 둘 모두는 골수종 단독 또는 골수종 + Treg 아암과 비교하여 체중을 유지했다(도 61a). Treg의 첨가는 Tcon 매개 항-골수종 효과를 방해하지 않았고 지연된 재발을 방지하였다(도 61b - 도 61d). Treg + BiTE®의 첨가는 BiTE® 단독 처리된 마우스와 비교하여 유사한 정도의 종양 제어를 유도하였다(도 61f). Treg의 첨가는 BiTE® 매개 항-골수종 효과를 방해하지 않았다. Treg의 첨가는 상응하는 높은 GVHD 점수(도 61h)와 함께 BiTE®-유도 체중 감소(도 61g)를 완화시켰다.
실시예 6: 골수 부전 증후군 및 기타 자가면역 장애의 치료에서 제대혈 유래 T-조절 세포 투여에 대한 안전성 및 효능 평가
연구 근거
제대혈 유래 T-조절 세포를 이용한 입양 요법은 순환 전염증성 사이토카인을 감소시키고 결과를 개선할 수 있다. 이전 연구에서, 제대혈 유래 T 조절 세포의 주입은 안전하고 GVHD 예방에 효과적일 수 있다는 것이 입증되었지만, 전임상 및 임상 연구 모두에서의 효과는 생체 내 Tcon에 대한 Treg의 비에 크게 의존하는 것으로 보인다. GVHD를 최소화하기 위한 현재 전략은 칼시뉴린 억제제(CNI), 사이클로스포린 및 타크로리무스와 같은 약물을 사용한 장기간의 면역억제 요법을 요구한다. 그러나, 이러한 장기간의 면역억제는 면역 기능을 지연시켜 감염 합병증과 이식 후 림프증식성 장애의 위험을 초래한다. 따라서, 제대혈 유래 T-조절 세포를 사용한 입양 요법은 GVHD 및 기타 자가면역 질환의 치료를 위한 매력적인 대안이 될 수 있다.
제대혈 유래 T-조절 세포 세포 생성물(CK0801)은 단일 제대혈 유닛(CBU)으로부터 유래되고 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 생체 외에서 확장된 T-조절 세포로 이루어진다.
본 연구의 목적은 골수이형성증, 골수섬유증, 및 재생 불량성 빈혈을 포함하는 치료 불응성 골수 부전 증후군 환자에게 CK0801을 투여하는 것이 안전하고 실용적인지 평가하는 것이다. 재발성/불응성 골수 부전이 있고 표준 치료에 반응하지 않은 환자만이 이 연구에 등록될 것이다. 이 연구는 투여하기에 안전한 최대 가능 용량과 CK0801이 골수 부전 증후군의 증상을 개선할 수 있는지 여부를 결정할 것이다.
이 연구에 참여할 자격이 있는 참가자는 표준 요법으로 치료할 수 없거나 치료를 원하지 않거나 표준 요법에 실패한 적이 있다.
1차 목표
1차 목표는 CK0801 주입 시 각각 시작되는 이벤트로 정의된 CK0801의 용량 제한 독성을 결정하는 것이다.
ㆍ 24시간 이내에 심각한(3등급 또는 4등급) 주입 독성(NCI-CTCAE V4.0)
ㆍ 30일 이내 요법 관련 사망
ㆍ 30일 이내에 중증(3등급 또는 4등급) 사이토카인 방출 증후군
2차 목표
ㆍ 질환 특이적 반응의 예비 평가
ㆍ 질환 특이적 반응 기간
탐색 목표
기준선에서 말초 혈액 및 골수 면역 재구성 및 염증성 사이토카인을 평가하고 치료 후 설정에서 예정된 후속 조치를 취한다. 샘플은 각 주입 후 -10일, 0일, +3일, +7일, +14일, +21일, +30일, +60일, +90일, 및 1년에 채취될 것이다.
아암 및 개입
Figure pct00020
연구 디자인
3명의 환자가 용량 수준 1: 1x106/kg에서 치료되는 표준 3 + 3 I상 통계 디자인이 사용될 것이다. 용량 제한 독성(DLT)이 관찰되지 않는 경우, 용량은 3명의 환자의 다음 코호트에 대해 용량 수준 2: (범위) > 1x106/kg 내지 1x107/kg으로 증량될 것이다. DLT가 관찰되지 않는 경우, 용량은 용량 수준 3: (범위) > 1x107/kg 내지 1.5x107/kg으로 증량될 것이다.
하나의 DLT가 용량 수준에서 관찰되는 경우, 3명의 추가 환자가 해당 수준에서 치료될 것이다. 추가 DLT가 없는 경우, 해당 용량 수준은 MTD로 정의될 것이다.
용량 수준 2 또는 3에서 ≥ 2 DLT인 경우, 이전 용량 수준은 MTD로 정의된다. 용량 수준 1에서 ≥ 2 DLT인 경우, 데이터 안전성 모니터링 위원회(DSMB)는 연구 지속을 검토하고 평가할 것이다.
MTD는 6명의 환자가 < 2 DLT로 용량 수준에서 치료될 때 결정된다. 최대 18명의 환자가 치료될 것이다.
각 연구 코호트(3명 또는 6명의 환자)에 대상체를 등록하면, 코호트는 최종 환자가 0일(CK0801의 주입)을 완료한 후 30일까지 폐쇄될 것이다. 용량 증량은 이전에 투여된 코호트에 대한 DSMB 검토 후에만 발생할 수 있다.
대상체는 적격성 기준이 충족된다면 동의하고 연구에 등록될 것이다.
연구 생성물
소스 및 약리학
CK0801(제대혈 유래 T-조절 세포)은 Cellenkos GMP 시설에서 사전 결정된 기준에 따라 선별되고 제조에 사용 가능한 자격을 갖춘 단일 동종이형 혈연관계가 아닌 공여자 제대혈 유닛을 사용하여 제조된다. CK0801은 CD25+ Treg의 면역자성 선택과 14일 배양-확장 과정을 사용하여 Treg의 수확과 Plasma-Lyte A 및 0.5% 인간 혈청 알부민(HSA)의 최종 제형으로 제조된다. 최종 세포 생성물은 사용 가능한 모든 시험 결과의 검토를 포함하여 공식 로트 출하 프로세스 후에만 출시된다. 로트 출하 기준은 하기를 포함한다: 7AAD 생존 능력 ≥70%, %CD4+CD25+ 세포 순도 ≥60%, %CD4-/CD8+ 세포 < 10%, 항-CD3/항-CD28 Ab 비드 카운트 <100(3 x106 세포당), "유기체가 없는" 그램 염색, 내독소 <5 EU/kg, 불임(최종 제형화 48 내지 72시간 전에 샘플링) 음성, 및 마이코플라스마 음성.
제대혈 검색, 선택, 및 제조 시설로의 출하
CK0801 생성을 위해 Cellenkos, Inc.에 제공된 제대혈 유닛은 세포 치료 인증 재단(FACT) 또는 미국 혈액 은행 협회(AABB)에 대한 최소 인증 표준을 충족하는 개별 자격을 갖춘 선별된 제대혈 은행(CBB)에서 입수될 것이다. 적격 CB 유닛은 면허가 있거나 없는 것으로 분류될 수 있으며 사전 결정된 자격 기준을 충족할 것이다.
동의 시, 대상체는 HLA 유형화를 위한 혈액 샘플을 제공할 것이다. 결과는 제대혈 검색 및 선택 과정을 용이하게 하기 위해 스폰서의 임상 코디네이터에게 제공될 것이다. 스폰서는 HLA-A, -B 및 DRB1 유전자좌에서 6개 항원 중 3개, 4개, 5개, 또는 6개에서 수용자(대상체)와 HLA 매치인 표준 검색 알고리즘에 따라 사용 가능한 제대혈 유닛을 식별하고 PI(연구 책임자)에게 목록을 제공할 것이다. 스폰서와 PI는 미리 결정된 기준에 따라 적절한 제대혈 유닛을 선택할 것이다.
제대혈 유닛이 선택된 후, 스폰서의 임상 코디네이터가 출하 및 운송 물류를 주선하고 유닛은 Cellenkos의 GMP 제조 시설로 출하될 것이다. 제조 시설에 도착하면 제대혈 유닛이 검사되고, 체크인되고, CB 공여자/수용자 출하 요청에 대해 확인된다. 허용 기준(식별, 라벨링, 및 온도 포함)을 충족하는 제대혈 유닛은 -14일(제조 시작)까지 ≤ -150℃에서 액체 질소, 증기 상 저장 동결기에 저장될 것이며, 이는 대상체의 계획된 주입 일정과 조정될 것이다.
주입 전, 스폰서의 임상 코디네이터와 현장 임상 팀은 미리 결정된 시점과 시간대에 CK0801의 주입 주선을 담당할 것이다. CK0801은 최종 제형의 8시간 이내에 투여되어야 한다.
스폰서자의 임상 코디네이터가 CK0801의 임상 현장으로의 운송을 주선할 것이다. 현장의 임상 팀은 CK0801의 접수, 승인, 준비, 및 투여를 담당할 것이다.
제형 및 안정성
CK0801은 Plasmalyte + 0.5% 인간 혈청 알부민(HSA) 완충액에서 최종 세포 용량으로 제형화된다. CK0801의 주입은 최종 제형의 8시간 이내에 이루어져야 한다.
저장 및 취급
CK0801은 15℃ 내지 30℃의 온도를 유지하도록 검증된 운송 용기에서 임상 현장으로 운송될 것이고, 주입 전에 15℃ 내지 30℃에서 유지될 것이다.
독성
제대혈 유래 T-조절 세포의 주입은 이전에 안전한 것으로 나타났지만, 임상 실습 표준에 따라 CK0801 주입 동안 대상체를 모니터링해야 한다. 각 주입 당일 활력 징후의 권장 시간: 주입 전, 주입 시작 후 15분, 주입 시작 후 30분, 주입 시작 후 1시간, 주입 시작 후 2시간 그리고 표준 임상 실습에 따라.
활력 징후는 온도, 호흡, 혈압, 및 맥박을 포함할 것이다.
투여 경로
CK0801은 중심 라인이나 말초 라인을 통해 투여되며 5ml/분을 초과하지 않는다. 투여 후, 백 및 라인은 생리 식염수로 반복적으로 세척될 것이다.
CK0801 주입
이 시험에서는 3가지 다른 용량 수준에서 CK0801의 주입을 조사할 것이다. 표준 3 + 3 I상 통계 디자인이 사용될 것이다.
컨디셔닝 또는 림프-고갈은 환자에게 투여되지 않을 것이다. 3명의 환자가 용량 수준 1: 1x106/kg IBW에서 치료될 것이다. 용량 제한 독성(DLT)이 관찰되지 않는 경우, 용량은 3명의 환자의 다음 코호트에 대해 용량 수준 2: (범위) 3x106/kg IBW로 증량될 것이다. DLT가 관찰되지 않는 경우, 용량은 용량 수준 3: (범위) 1x107/kg IBW로 증량될 것이다.
하나의 DLT가 용량 수준에서 관찰되는 경우, 3명의 추가 환자가 해당 수준에서 치료될 것이다. 추가 DLT가 없는 경우, 해당 용량 수준은 MTD로 정의될 것이다.
용량 수준 2 또는 3에서 ≥ 2 DLT인 경우, 이전 용량 수준은 MTD로 정의된다. 용량 수준 1에서 ≥ 2 DLT인 경우, 데이터 안전성 모니터링 위원회(DSMB)는 연구 지속을 검토하고 평가할 것이다.
MTD는 6명의 환자가 < 2 DLT로 용량 수준에서 치료될 때 결정될 것이다.
환자는 CK0801 주입 30분 전에 디펜하이드라민(Benadryl®) 50 mg IV 피기백(IVPB) 및 아세트아미노펜 650 mg(경구)으로 사전 투약될 것이다. CK0801은 0.9% 염화나트륨(일반 식염수) USP 이외의 다른 용액을 포함하지 않아야 하는 IV 라인을 통해 15 내지 30분에 걸쳐 중력 흐름에 의해 주입된다. CK0801은 표준 혈액 제품 튜브와 호환된다. 필터 사용은 금지된다.
연구 집단의 선택
포함 기준
1. 재생불량성 빈혈, 골수이형성 증후군, 또는 골수섬유증을 포함하는 골수 부전 증후군의 진단 기준을 충족하는 대상체.
2. CK0801 생성에 사용 가능한 HLA 매치된(HLA-A, HLA-B, 및 HLA-DRB1에서 ≥ 3/6) 제대혈 유닛.
3. 18세 초과의 대상체.
4. 빌리루빈 ≤ 2 x ULN 및 SGPT(ALT) ≤ 2 x ULN(길버트 증후군이 기록되지 않은 경우).
5. Cockcroft-Gault 방정식을 사용하여 > 50 mL/분의 계산된 크레아티닌 청소율.
6. Zubrod 성능 상태 ≤ 2.
7. 가임기 여성 대상체(FPCP)는 소변 또는 혈청 임신 검사에서 음성이어야 한다. 참고: FPCP는 폐경 전으로 정의되며 외과적으로 멸균되지 않는다. FPCP는 최대한 효과적인 피임법을 사용하거나 연구 전반에 걸쳐 이성애 활동을 자제하는 데 동의해야 한다. 효과적인 피임법에는 자궁 내 장치, 경구 및/또는 주사 가능한 호르몬; 피임, 또는 2가지 적절한 차단 방법(예를 들어, 살정제가 있는 자궁경부 캡, 살정제가 있는 가로막)을 포함한다.
8. 대상체는 연구 관련 평가, 방문, 및 장기 후속 조치를 포함하여 모든 프로토콜 요구 절차를 준수하는 데 동의했다.
9. 대상체는 사전 동의를 제공할 의지와 능력이 있다.
배제 기준
1. 대상체는 CK0801 주입 전 4주 이내에 연구용 제제를 받았다.
2. 대상체는 CK0801 주입 전 21일 이내에 방사선 또는 화학요법을 받았다.
3. 대상체는 이전에 제대혈 유래 T-조절 세포 요법을 받은 적이 있다.
4. 알려진 HIV 혈청 양성.
5. 대상체는 치료 7일 후에 적절한 항균제에 반응하지 않는 제어되지 않는 감염을 갖는다. 프로토콜 PI는 자격의 최종 중재자이다.
6. 조사자의 의견에 따르면 환자를 중증 독성 및/또는 CK0801의 활성을 손상시킬 더 큰 위험에 처하게 하는 제어되지 않는 병행 질병이 있는 대상체.
7. 대상체가 임신 중이거나 모유 수유 중이다.
8. 줄기세포 이식으로 인한 골수 부전.
9. 동의를 제공할 수 없거나 조사자의 의견에 따라 프로토콜 요건을 완전히 준수할 것 같지 않은 대상체.
데이터 수집
CK0801의 주입과 관련된 치료 및 독성 데이터는 CK0801 주입 첫날부터 마지막 주입 후 30일까지 수집될 것이다.
연구 관련 사망 또는 후속 대체 치료로 기록된 질환 진행을 경험한 대상체는 치료 실패로 간주되고 추가 데이터 수집 없이 이벤트 시점에 검열된 관찰로 처리된다. 사전 동의를 철회하거나 비순응으로 인해 연구에서 제외된 피험자도 해당 시점에서 검열될 것이다.
결과 조치
1차 결과 조치:
1. 부작용 및 심각한 부작용의 집합으로 골수 부전으로 고통받는 대상체에서 CK0801 주입의 CTCAE v4.0 평가 안정성에 의해 평가된 치료 관련 부작용이 있는 참가자 수
용량 제한 독성은 CK0801 주입 시점에 각각 시작되는 모든 사건을 포함하도록 정의될 것이다.
ㆍ 24시간 이내에 심각한(3등급 또는 4등급) 주입 독성(NCI-CTCAE V4.0)
ㆍ 30일 이내 요법 관련 사망
ㆍ 30일 이내에 중증(3등급 또는 4등급) 사이토카인 방출 증후군
[시간 프레임: 주입으로부터 30일]
2차 결과 조치:
2. 치료에 대한 질환 특이적 반응 및 반응 기간에 대한 예비 평가
[시간 프레임: 12개월]
기타 사전 지정된 결과 조치:
3. 골수(BM) 면역 재구성 및 염증성 사이토카인 평가
기준선에서 골수 샘플을 채취하고 치료 후 설정에서 예정된 후속 조치를 취하고 면역 재구성 및 염증성 사이토카인에 대해 분석한다
[시간 프레임: 12개월]
4. 말초 혈액(PB) 면역 재구성 및 염증성 사이토카인 평가
기준선에서 말초 혈액을 채취하고 치료 후 설정에서 예정된 후속 조치를 취하고 면역 재구성 및 염증성 사이토카인에 대해 분석한다
[시간 프레임: 12개월]
골수 부전(BMF) 환자에서 동종이형 제대혈 유래 Treg 세포의 1상 임상 시험의 결과
시험 디자인의 개략도가 도 41에 도시되어 있다. 상관 연구의 시기는 아래 표에 나타나 있다. 도 28은 골수 부전을 앓고 있는 대상체에서 CK0801에 대한 1상 임상 시험이 조기 효능 신호를 나타냈음을 도시한다.
Figure pct00021
도 42는 1상 임상 시험에서 치료 중인 대상체에 대한 설명을 제공한다. 임상 데이터의 요약은 도 43 및 도 44에 제공된다.
코호트 I
환자 1에 대한 치료 이력이 도 45에 나타나 있다. 환자는 원발성 골수섬유증으로 진단받은 63세 남성이다. 환자는 17분에 걸쳐 주입된 1x106개의 Treg 세포/kg(6,700만 세포)으로 처리되었다. 환자는 또한 룩소리티닙 20 mg PO(경구) BID(1일 2회)를 복용하고 있었다. 환자의 임상 데이터는 도 46a 및 도 46b에 나타나 있다. 염증성 사이토카인 수준은 도 47 및 도 48에 나타나 있다. 환자는 SDF1α-CXCR4 축과 상관 관계가 있는 JAK2 돌연변이 부담(도 46b) 및 비장 비대(도 49)의 감소를 나타냈다(도 48). Treg 세포 투여 이전(PRE) 및 이후(POST) 환자의 골수 평가는 아래 표에 나타나 있다.
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
환자 2에 대한 치료 이력이 도 50에 나타나 있다. 환자는 청소년 및 젊은 성인(AYA)에서 골수증식성 신생물(MPN)으로 진단받은 46세 여성이다. 환자는 20분에 걸쳐 주입된 1x106개의 Treg 세포/kg(6,000만 세포)으로 처리되었다. 환자는 또한 룩소리티닙 20 mg PO(경구) BID(1일 2회)를 복용하고 있었다. 염증성 사이토카인 수준은 도 51에 나타나 있다. Treg 세포 투여 이전(PRE) 및 이후(POST) 환자의 골수 평가는 아래 표에 나타나 있다.
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
환자 3은 후천성 재생 불량성 빈혈로 진단받은 19세 여성으로 수혈 의존성이다. 환자는 25분에 걸쳐 주입된 1x106개의 Treg 세포/kg(5,000만 세포)으로 처리되었다. 환자는 또한 엘트롬보팍과 사이클로스포린(CSA)을 복용하고 있었다. 시간 경과에 따른 환자의 TPO 수준은 도 52에 도시되어 있다. 시간 경과에 따른 환자의 혈소판 수혈 요건은 도 53에 나타나 있다. 시간 경과에 따른 환자의 PRBC(패킹된 적혈구 세포) 수혈 요건은 도 54에 나타나 있다. Treg 세포 투여 이전(PRE) 및 이후(POST) 환자의 골수 평가는 아래 표에 나타나 있다.
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
코호트 II
환자 4는 특발성 중증 재생 불량성 빈혈로 진단받은 29세 남성이다. 환자는 3x106 Treg 세포/kg으로 처리되었다. 환자는 또한 hATG + CSA + 스테로이드 + 엘트롬보팩 + 페그-필그라스팀을 복용하고 있었다. 시간 경과에 따른 환자의 혈소판 수혈 요건은 도 55에 나타나 있다. 시간 경과에 따른 환자의 PRBC(패킹된 적혈구 세포) 수혈 요건은 도 56에 나타나 있다. Treg 세포 투여 이전(PRE) 및 이후(POST) 환자의 골수 평가는 아래 표에 나타나 있다.
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
환자 5는 원발성 골수섬유증(본태성 혈소판 증가증(ET))으로 진단받은 62세 여성이다. 환자는 3x106 Treg 세포/kg으로 처리되었다. Treg 세포 투여 이전(PRE) 및 이후(POST) 환자의 골수 평가는 아래 표에 나타나 있다.
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
환자 6은 원발성 골수섬유증(2 등급, 저세포성 수혈 의존성)으로 진단받은 74세 남성이다. 환자는 LCL-161(Novartis, Basel, Switzerland)을 사용한 치료에 실패했다. 환자는 3x106 Treg 세포/kg으로 처리되었다. 시간 경과에 따른 환자의 혈소판 수혈 요건은 도 57에 나타나 있다. 시간 경과에 따른 환자의 PRBC(패킹된 적혈구 세포) 수혈 요건은 도 58에 나타나 있다. Treg 세포 투여 이전(PRE) 및 이후(POST) 환자의 골수 평가는 아래 표에 나타나 있다.
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
결론
ㆍ 코호트 1(용량 = 1x106개의 세포/kg) 및 코호트 2(용량 = 3x106개의 세포/kg)에서 치료된 6명의 환자에서 SAE가 관찰되지 않았음
ㆍ 환자 #1에서 JAK2 돌연변이 대립유전자의 개선. 응답 지속 시간 = 6개월
ㆍ 환자 #2에서 MPN 점수의 개선. 응답 지속 시간 = 4개월
ㆍ 환자 #3에서 적혈구 및 혈소판 수혈 요건의 개선. 응답 지속 시간 = 4주
ㆍ 환자 #4에서 적혈구 및 혈소판 수혈의 개선. 응답 지속 시간 = 4주
ㆍ 환자 #5에서 만성 통증의 개선. 지속 시간 = 4주
ㆍ 환자 #6에서 적혈구 및 혈소판 수혈의 개선. 4주에 수행된 평가
ㆍ 환자 #1; #2에서 골수 세포질의 개선
ㆍ 환자 #3; #4에서 골수 형성이상의 개선
ㆍ M:E 비의 감소는 환자 #4(안정적)를 제외한 모든 경우이다
실시예 7: 치료 저항성 길랑-바레 증후군 치료에서 제대혈 유래 T-조절 세포 투여에 대한 안전성 및 효능 평가
이 연구에서는 길랑-바레 증후군(GBS) 환자에게 CK0801(제대혈 유래 T-조절 세포 생성물)을 투여하는 것이 안전하고 실용적인지를 조사할 것이다. 또한, 주어질 수 있는 가장 높은 가능한 용량이 결정될 것이다. 마찬가지로, 이 연구는 CK0801이 GBS의 증상을 개선할 수 있는지 여부도 조사할 것이다.
표적 집단
이 연구의 표적 집단은 정맥내 면역글로불린(IVIG) 치료 또는 혈장 교환에 의한 표준 치료에 반응하지 않는 환자이다.
등록
최대 18명의 성인 환자(18-70세)가 등록될 것이다.
적임
포함 기준:
1. 대상체는 길랑-바레 증후군(GBS)에 대한 진단 기준을 충족한다.
2. CK0801 생성에 사용 가능한 HLA 매치된(HLA-A, HLA-B 및 HLA-DRB1에서 ≥ 3/6) 제대혈 유닛.
3. 18세 내지 70세의 대상체 연령.
4. 대상체는 4의 GBS 장애 스케일 점수를 갖고 IVIG 또는 PE 치료 후 1주 동안 변경되지 않았다.
5. 대상체는 CK0801 주입 ≥ 4주 전에 IVIG/PE 치료를 완료하였다.
6. 대상체는 제시 시점에 ≥ 7의 수정된 Erasmus GBS 결과 점수(mEGOS 점수)를 갖고 IVIG 또는 PE 치료 후 1주 동안 변경되지 않았다.
7. 빌리루빈 ≤ 2 x ULN 및, ALT ≤ 2 x ULN(길버트 증후군이 아닌 경우).
8. 18 내지 70세의 성인 환자에 대해 Cockroft-Gault 방정식을 사용하여 > 50 mL/분의 계산된 크레아티닌 청소율.
9. 가임기 여성 대상체(FPCP)는 소변 또는 혈청 임신 검사에서 음성이어야 한다. 참고: FPCP는 폐경 전으로 정의되며 외과적으로 멸균되지 않는다. FPCP는 최대한 효과적인 피임법을 사용하거나 연구 전반에 걸쳐 이성애 활동을 자제하는 데 동의해야 한다. 효과적인 피임법에는 자궁 내 장치, 경구 및/또는 주사 가능한 호르몬; 피임, 또는 2가지 적절한 차단 방법(예를 들어, 살정제가 있는 자궁경부 캡, 살정제가 있는 가로막)을 포함한다.
10. 대상체는 연구 관련 평가, 방문 및 장기 후속 조치를 포함하여 모든 프로토콜 요구 절차를 준수하는 데 동의했다.
11. 대상체는 사전 서면 동의를 제공할 의지와 능력이 있다. 대상체가 질환 관련 합병증(예를 들어, 상지 마비)으로 인해 일시적으로 동의서에 서명할 수 없는 경우 법적 대리인(LAR)이 사용될 것이다. 대상체는 가능한 한 빨리 동의서에 서명할 것이다.
배제 기준:
1. 대상체는 CK0801 주입 전 4주 이내에 면역요법, 화학요법, 생물학적 또는 연구용 제제를 받았다.
2. 대상체는 이전에 CB Treg 요법을 받은 적이 있다.
3. 대상체는 치료 7일 후에 적절한 항균제에 반응하지 않는 제어되지 않는 감염을 갖는다. 프로토콜 PI는 자격의 최종 중재자이다.
4. 대상체는 살아있는 바이러스(예를 들어, 홍역, 볼거리, 풍진, 수두) 백신을 맞았다.
5. 대상체가 임신 중이거나 모유 수유 중이다.
6. HIV 혈청 양성.
7. 동의를 제공할 수 없거나 조사자의 의견에 따라 프로토콜 요건을 완전히 준수할 것 같지 않은 대상체.
아암 및 개입
Figure pct00040
투여 (I상 3+3)
이 연구 동안 CK0801의 3회 용량이 제공될 것이다. 각 용량 수준에서 최소 3명의 환자가 치료될 것이다. 환자가 받는 용량은 각 용량 수준이 완료된 후 다음 환자가 다음으로 가장 높은 용량 수준을 받게 되므로 연구에 참여하는 시기에 따라 다르다.
ㆍ 용량 수준 1: 이상적인 체중의 CK0801 IV 1x106/kg
ㆍ 용량 수준 2: CK0801 IV 3x106/이상적인 체중의 kg
ㆍ 용량 수준 3: CK0801 IV 1x107/이상적인 체중의 kg
1차 종료점
이 연구의 1차 종료점은 용량 제한 독성일 것이다:
ㆍ 24시간 이내에 심각한(3등급 또는 4등급) 주입 독성;
ㆍ 30일 이내에 중증(3등급 또는 4등급) 사이토카인 방출 증후군;
ㆍ 30일 이내 요법 관련 사망
결과 조치
1차 결과 조치:
1. 정맥 면역글로불린으로 표준 치료에 반응하지 않는 길랑-바레 증후군(GBS) 환자에서 CK0801 주입의 안전성에 대한 예비 평가를 제공하기 위해 부작용 및 심각한 부작용의 수를 수집할 것이다
[시간 프레임: 주입으로부터 30일]
2. 용량 제한 독성은 임의의 하기 사건(CK0801 주입 시점에 각각 시작됨)을 포함하도록 정의될 것이다.
ㆍ 24시간 이내에 심각한(3등급 또는 4등급) 주입 독성(NCI-CTCAE V4.0)
ㆍ 30일 이내 요법 관련 사망,
ㆍ 30일 이내에 중증(3등급 또는 4등급) 사이토카인 방출 증후군(CRS);
[시간 프레임: 주입으로부터 30일]
기타 사전 지정된 결과 조치:
3. 0일차에 CK0801 주입이 환자의 말초 혈액 특성 변화를 유발했는지 여부를 평가하는 CK0801 주입 후 말초 혈액(PB) 프로파일링 평가
[시간 프레임: 스크리닝, 0일차 및 1주차, 2주차, 4주차, 12주차, 및 24주차]
4. CK0801 주입 후 말초 혈액 염증성 사이토카인 평가
0일차에 CK0801 주입이 환자의 말초 혈액에서 염증성 사이토카인을 발달시켰는지 여부 평가
[시간 프레임: 스크리닝, 0일차 및 1주차, 2주차, 4주차, 12주차, 및 24주차]
5. GBS 장애 점수의 잠재적 변화 평가(설문지)
건강한 상태(0) 내지 사망(6) 범위의 7가지 장애 점수를 평가하는 설문지
[시간 프레임: 스크리닝, 0일차 및 1주차, 2주차, 4주차, 12주차, 및 24주차]
6. 전반적인 신경병증 제한 스케일(ONLS)의 잠재적인 변화 평가(설문지)
전반적인 신경병증 제한 스케일(ONLS)은 정상적인 일상 활동을 수행할 때 환자의 팔(마비, 따끔거림, 쇠약) 및 다리(걷기, 뛰기, 보행 변화, 휠체어 필요)의 증상을 결정하는 설문지이다. 팔 스케일은 0(정상) 내지 5(모든 의도적인 움직임을 방해하는 양쪽 팔의 장애)이고 다리 스케일은 0(걷기/계단 오르기/달리기는 영향을 받지 않음) 내지 7(하루 종일 휠체어 또는 침대로 제한, 다리에서 의도적인 움직임을 할 수 없음)이다.
[시간 프레임: 스크리닝, 0일차 및 1주차, 2주차, 4주차, 12주차, 및 24주차]
7. Rasch가 만든 전반적인 장애 스케일의 잠재적 변화 평가(설문지)
일상 활동과 환자의 건강 사이의 관계를 측정하는 설문지. 점수는 0 내지 2이며 여기서 0=활동을 수행할 수 없음이고 2=활동을 수행하기 용이함이다. 설문지는 실내외 걷기, 상체 또는 하체 씻기, 옷입기, 먹기, 설거지하기, 쇼핑하기와 같은 활동을 포함한다. 전반적인 합산 원점수는 0 내지 100의 중심 메트릭과 상관관계가 있는 1 내지 48이다.
[시간 프레임: 스크리닝, 0일차 및 1주차, 2주차, 4주차, 12주차, 및 24주차]
8. 의학연구협의회(MRC: Medical Research Council) 합계 점수의 잠재적 변화 평가(설문지)
MRC 합계 점수는 60(정상) 내지 0(사지 마비) 범위의 어깨 외전근, 팔꿈치 굴곡근, 손목 신근, 무릎 신근, 및 양쪽 발 배굴근을 포함하는 6개 근육군의 MRC 점수의 합이다.
[시간 프레임: 스크리닝, 0일차 및 1주차, 2주차, 4주차, 12주차, 및 24주차]
9. Rasch가 만든 MRC 모델의 잠재적 변화 평가(설문지)
MRC 합계 점수는 48(정상) 내지 0(사지 마비) 범위의 어깨 외전근, 팔꿈치 굴곡근, 손목 신근, 무릎 신근, 및 양쪽 발 배굴근을 포함하는 6개 근육군의 MRC 점수의 합이다.
[시간 프레임: 스크리닝, 0일차 및 1주차, 2주차, 4주차, 12주차, 및 24주차]
10. 피로 심각도 스케일(FSS)의 잠재적 변화 평가(설문지)
피로와 관련된 활동을 9(피로의 징후 없음) 내지 63(가장 무력한 피로)의 스케일로 측정하는 설문지
[시간 프레임: 스크리닝, 0일차 및 1주차, 2주차, 4주차, 12주차, 및 24주차]
11. Rasch가 만든 피로 심각도 스케일(RFSS)의 잠재적 변화 평가(설문지)
피로와 관련된 활동을 0(피로의 징후 없음) 내지 21(가장 무력한 피로)의 스케일로 측정하는 설문지
[시간 프레임: 스크리닝, 0일차 및 1주차, 2주차, 4주차, 12주차, 및 24주차]
12. EuroQol E-5D 건강 설문지의 잠재적 변화 평가(설문지)
EuroQol E-5D 건강 설문지는 환자의 이동성, 자가 관리 활동 수행 능력, 기타 일상 활동(예를 들어, 가사, 여가 활동), 통증/불편함 정도, 불안/우울증을 시험하기 위한 검증되고 간단한 건강 설문지이다. 스캐일은 0(환자가 상상할 수 있는 최악의 건강) 내지 100(환자가 상상할 수 있는 최상의 건강)이다.
[시간 프레임: 스크리닝, 0일차 및 1주차, 2주차, 4주차, 12주차, 및 24주차]
13. A형 입력 설문지와 후속 B형 설문지(1주차 및 2주차 설문지)의 비교를 기반으로 한 환자 상태의 잠재적 변화 평가(설문지)
등록 설문지는 호흡 또는 이동성에 영향을 미치는 동반이환, GBS가 있는 다른 가족 구성원, 선행 사건(예를 들어, 감기, 위장염), 통증 유형(예를 들어, 근육통, 관절통, 신경병증성 통증), 통증 위치, 팔이나 다리의 쇠약, 반사의 상태, 감각 결핍, 운동 실조, 강제 폐활량을 포함하는 환자의 전반적인 상태에 대한 스크리닝 수준 기준을 설정한다. 이 양식을 통해 사용자가 환자가 인공 호흡기가 필요할지 또는 6개월 이내에 걸을 수 있을지를 예측할 수 있다.
[시간 프레임: 스크리닝, 0일차 및 1주차 및 2주차]
14. A형 입력 설문지와 후속 B형 설문지(4주차, 12주차, 및 24주차 설문지)의 비교를 기반으로 한 환자 상태의 잠재적 변화 평가(설문지)
이 양식(설문지)은 등록 이후 환자 상태의 변경 사항을 문서화하는 메커니즘을 제공하기 위해 등록 설문지와 동일한 정보를 사용한다.
[시간 프레임: 스크리닝, 0일차 및 1주차, 2주차, 4주차, 12주차, 및 24주차]
15. A형 입력 설문지와 후속 C형 설문지(1주차, 2주차, 4주차, 12주차, 및 24주차 설문지)의 비교를 기반으로 한 환자 상태의 잠재적 변화 평가(설문지)
이 양식(설문지)은 등록 이후 환자 상태의 변경 사항을 문서화하는 메커니즘을 제공하기 위해 등록 설문지와 동일한 정보를 사용한다.
[시간 프레임: 스크리닝, 0일차 및 1주차, 2주차, 4주차, 12주차, 및 24주차]
16. A형 입력 설문지와 후속 T형 설문지(1주차, 2주차, 4주차, 12주차, 및 24주차 설문지)의 비교를 기반으로 한 환자 상태의 잠재적 변화 평가(설문지)
이 양식(설문지)은 등록 이후 환자 상태의 변경 사항을 문서화하는 메커니즘을 제공하기 위해 등록 설문지와 동일한 정보를 사용한다.
[시간 프레임: 스크리닝, 0일차 및 1주차, 2주차, 4주차, 12주차, 및 24주차]
실시예 8: 후천성 특발성 재생불량성 빈혈 및 저형성 골수이형성 증후군의 치료에서 제대혈 유래 T-조절 세포 투여에 대한 안전성 및 효능 평가
표적 집단
이 연구의 표적 집단은 매치된 형제 공여자 조혈모세포 이식(MSD HSCT)에 부적격하거나 면역억제 요법(IST)에 대한 반응이 좋지 않을 것으로 예상되는 환자이다.
등록
최대 18명의 성인 환자가 등록될 것이다.
투여
ㆍ 용량 수준 1: CK0802.CXCR4 IV 1x108 세포
ㆍ 용량 수준 2: CK0802.CXCR4 IV 3x108 세포
1차 종료점
이 연구의 1차 종료점은 주입 반응; 사이토카인 방출 증후군 및/또는 30일 이내 사망까지의 시간일 것이다.
2차 종료점
이 연구에 대한 2차 종료점은 혈액학적 개선일 것이다.
실시예 9: 근위축성 측삭 경화증 치료에서 제대혈 유래 T-조절 세포 투여의 안전성 및 유효성 평가
표적 집단
ㆍ 후천성 ALS가 있는 성인 ALS 환자(18세 이상)
ㆍ 사전 동의를 제공할 수 있는 능력
ㆍ 발병 2년 이하의 대상체
ㆍ 강제 폐활량 ≥ 60% 예측
ㆍ 대상체는 총 ALSFRS-R 점수가 ≥ 24이고 스케일의 12개 항목 모두에서 2점 이상의 점수를 받았다
ㆍ 발병부터 선별까지 0.3 포인트/월 초과의 진행을 보이는 환자
등록
성인 환자 52명.
연구 약물
CK0802.CD11a (동결보존됨, 다중 용량, CD11a가 풍부한 제대혈 유래 T-조절 세포)
투여
유도: 다음 용량 수준에서 매주 IV CK0802.CD11a 용량 x 4
ㆍ 코호트 1: CK0802.CD11a IV 1x108 Treg 세포
ㆍ 코호트 2: CK0802.CD11a IV 3x108 Treg 세포
유지: 두 코호트에 대해 4주마다 추가 6회 투여
아암 및 개입
Figure pct00041
처리 타임 라인은 도 26에 도시된다.
단계 IB:
1차 목표
o 안전성 및 내약성
Figure pct00042
CTCAE v 4.03(AE, SAE, DLT)에 따른 치료 관련 부정적인 사건
2차 목표
o 효능
Figure pct00043
개정된 ALS 기능 평가 스케일(ALSFRS-R)
Figure pct00044
강제 폐활량(FVC)
Figure pct00045
근력을 위한 휴대용 동력계(HHD)
o 탐색
Figure pct00046
염증성 바이오마커 및 면역 재구성
연구 종료점
임상 반응:
1. 수정된 ALS 기능적 평가 스캐일(ALSFRS-R)가 6개월 동안 6점 개선됨.
2. 기능 상태 변화율
3. 근위축성 측삭 경화증 기능 평가 스캐일(ALSFRS-R) 점수 기울기의 변화
4. 강제 폐활량(FVC)의 변화 및
5. 근력의 변화
ALSFR 응답자 분석(치료 전과 비교하여 치료 후 개선된 대상체의 백분율)
ㆍ 사전 지정된 응답자 분석은 치료 전 기울기와 비교하여 치료 후 ALSFRS-R 기울기에서 월간 백분율 개선 및 절대점 개선을 모두 조사한다.
ㆍ 25%, 50%, 75% 및 100% 개선에 대한 환자 평가.
ㆍ 임상적으로 의미 있음 = 25%
ㆍ 임상적으로 상당히 의미 있음 = 50%
Fisher의 정확한 검정을 사용하여 단측 p 값 <0.05로 정의된 통계적 유의성.
4, 8, 12, 16, 및 24주에 수행된 평가
임상 시험 디자인: Ib상 임상 시험
연구 디자인:
ㆍ 이 연구는 CK0802.CD11a의 I상, 3+3 연구 디자인, 단일 상승 용량, 안전성, 내약성일 것이다.
ㆍ 고정 용량 전략은 2가지 용량 수준을 연구할 것이다:
Figure pct00047
저용량: 1x108 세포;
Figure pct00048
고용량: 3x108 세포;
최소 6명의 환자와 최대 12명의 환자가 이 연구에 등록될 것이다.
총(최소) 환자 = 12명으로 상기 표에 표시된 대로 12명의 대상체의 코호트가 3가지 치료 시퀀스 중 하나로 무작위 배정될 것이다
임상 시험 디자인: 탐색 연구.
ㆍ 말초 혈액
ㆍ T 세포 구획: Treg, 이펙터 T 세포, 항-바이러스 활성
ㆍ 염증성 사이토카인을 위한 혈청: 인터류킨(IL) 1, IL-1베타, IL-2, IL-4, IL-6, IL7, IL-8, IL-10, IL-13, IL-17, IL-18
ㆍ 인터페론 감마, ST2, REG3a, OPN, 폴리스타틴, 엘라핀, TGF-베타, TNF-알파, TNFR-1
ㆍ C-반응성 단백질(CRP)
ㆍ 대식세포 화학주성 단백질-1(MCP-1)
ㆍ 8-하이드록시-2'-데옥시구아노신(8-OHdG)
ㆍ 말론디알데하이드(MDA)
ㆍ 비: 글루타티온 디설파이드, GSSG/환원 글루타티온, GSH 추가 탐색 사이토카인: SCF, G-CSF, GM-CSF, HGF, VEGF, SDF1a, MCP1, MCP2, TARC, MIP3a, TECK, CTACK, CCL28, FGF, PDGF, EGF, TGF-α, TLR
ㆍ 뇌척수액
ㆍ 인산화된 신경섬유 중쇄(pNFH)
ㆍ Chit-1
ㆍ 프로스타글란딘 E2
ㆍ VEGF
ㆍ IL-6
ㆍ GMCSF
ㆍ IL-2, IL-8, IL-15, IL-17
ㆍ MIP-1β
ㆍ FGF
ㆍ G-CSF
ㆍ MIP-1α
ㆍ MCP-1
ㆍ IFN-γ
ㆍ 방사선 사진
ㆍ 생체 내 [11C]-PBR28 PET로 측정한 신경교 활성화는 ALS 환자의 병리학적으로 관련된 영역에서 증가하고 임상 조치와 상관 관계가 있다. (문헌[Alshikho, ANN NEUROL 2018])
ㆍ 통합 PET-MR 및 1H-MRS 이미징은 신경 무결성과 신경 염증에 대한 마커 사이의 연관성을 보여주고 ALS의 질환 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있다. (문헌[Ratai, NeuroImage : Clinical 20 (2018) 357-364])
실시예 10: COVID-19(코로나바이러스 질환) 매개 급성 호흡 곤란 증후군(CoV-ARDS)의 치료에서 제대혈 유래 T 조절 세포 투여의 안전성 및 효능 평가
CoV-ARDS의 치료를 위한 동결보존된 다중 용량 제대혈 유래 T 조절(Treg) 세포(CK0802)의 IB/IIa상 시험을 위한 임상 시험 디자인이 도 27에 도시되어 있다. 3개의 처리 아암이 있을 것이다: 처리 아암 1: 플라시보; 처리 아암 2: 1x108개의 CK0802 세포; 처리 아암 3: 3x108개의 CK0802 세포. 투여 요법은 0일, 3일(+/- 1), 및 7일(+/- 1)에 3회 주입하는 것이다. CK0802는 정맥내 투여될 것이다. 연구 집단은 COVID-19에 의해 유발된 중등도에서 중증 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)을 가진 삽관된 성인이다. 최소 15명의 환자와 최대 45명의 환자가 등록될 것이다.
목표
1차 목표
이 프로토콜의 목표는 은행 제대혈 유닛(CK0802)에서 확장된 규제 T 세포 주입이 COVID-19 감염에 따른 중등도에서 중증 ARDS로 고통받는 삽관된 환자의 이환율과 사망률을 안전하게 감소시킬 수 있는지 확인하는 것이다.
종료점 및 상관 관계
1차 종료점
2개의 공동 1차 결과는 다음과 같을 것이다:
ㆍ 요법 관련, CK0802 주입 후 48시간 이내에 중증 ≥ 3등급 독성(NCI-CTCAE (미국 국립 암 연구소의 부작용에 대한 공통 용어 기준) V4.0)
ㆍ 28일 치료 성공, S28 = [첫 주입 날짜 후 28일 동안 살아 있고 삽관되지 않음]으로 정의됨.
2차 종료점
첫 번째 주입일부터 첫 번째 주입일로부터 28일까지 기록된 2차 결과는 하기를 포함할 것이다:
ㆍ 튜브 제거까지의 시간
ㆍ 0일차와 11일차 사이의 산소 요구량(PaO2:FiO2 비) 변화
ㆍ 산소 호흡기 없는 날
ㆍ 장기 부전 없는 날
ㆍ 처음 28일 동안 ICU 없는 날
ㆍ 28일 동안 모든 원인으로 인한 사망률
계획된 비-종료점 상관 분석
실험실 상관관계 및 일반 평가 0, 3, 7, 11, 21, 및 28일
ㆍ 순차적 장기 부전 평가(SOFA) 점수(문헌[Vincent et al., Intensive Care Med, 1996. 22(7): p. 707-10])
ㆍ 염증성 마커: 혈청 페리틴, 프로칼시토닌, D-이량체 및 C-반응성 단백질(CRP), 인터류킨-6(IL-6)
ㆍ 말초 혈액 림프구 부분집합 분석
ㆍ 산소 호흡기 상태 파라미터(삽관된 경우) 및 ABG(사용 가능한 경우)
연구 생성물
CK0802(동결보존 제대혈 유래 T-조절 세포)는 동결보존되고 ARDS 치료를 위한 정맥내 주입물로 사용할 준비가 된 동종이형 기성품 조절 T 세포를 지칭한다.
소스 및 약리학
Treg는 미리 결정된 선택 기준에 따라 자격을 갖춘 공공, 인가 또는 비인가 미국 CB 은행에서 유래된 동종이형, 혈연관계가 아닌 제대혈(CB) 유닛으로부터 단리될 것이다. CB 유닛은 세척 용액으로 10% 덱스트란 40 및 5% 인간 혈청 알부민을 사용하는 37℃ 수조에서 표준 절차에 따라 해동되고 처리될 것이다. CB 세포는 응집을 방지하기 위해 면역자성 선택 전에 MgCl2/rHuDNAse/시트르산나트륨 칵테일에 재현탁될 것이다. CD25+ Treg 세포의 농축은 직접 접합된 항-CD25 자기 마이크로비드(Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Germany) 및 MACS 분리 장치를 사용한 양성 선택에 의해 달성될 것이다. 선택 후, CD25+ 세포는 GREX 플라스크에서 10% 인간 AB 혈청(열 불활성화; Valley Biomedical Products and Services, Inc., Winchester, VA), L-글루타민(2 mM)이 보충된 X-VIVO 15 배지(Cambrex BioScience, Walkersville, MD)에서 대략 1x106개의 세포/mL의 농도로 현탁될 것이다. CD25+ 세포는 14 ± 1일 동안 1:1 비드 대 세포 비로 항-CD3/항-CD28 단일클론 항체(mAb) 코팅된 Dynabeads(Invitrogen)와 함께 배양될 것이다. 0일차에 배양물에 1000 IU/ml IL-2(Proleukin, Chiron Corporation, Emeryville, CA)를 보충할 것이다. 세포는 1.0x106 생존 유핵 세포/mL의 밀도로 유지되고 14일 동안 5% CO2에서 37℃에서 배양된다.
배양 14일차에 세포를 수확하고, Dynabeads를 자성 분리로 제거하고 Treg 세포를 Plasmalyte +0.5% I 완충액에 재현탁한다. Treg 생성물(CK0802)은 주입을 위해 출하 기준을 통과해야 하며 하기를 포함한다: 7AAD 생존 능력 ≥70%, CD4+CD25+ 세포 순도 ≥60%, CD4-/CD8+ 세포 < 10%, 항-CD3/항-CD28 mAB 비드 카운트 <100(3x106 세포당), '유기체가 없는' 그램 염색, 및 내독소 <5 EU/kg.
그런 다음, 수확된 세포를 임상 크라이오백으로 분취하고 제어 속도 동결기를 사용하여 동결보존하고 세포 용량을 포함하는 CK0802 생성물로 표지할 것이다.
CK0802 주입
CK0802 용량 수준 1 = 1.0x108 세포 및 용량 수준 2: 3.0x108 세포의 주입이 이 시험에서 연구될 것이다. 환자는 CK0802 주입 30분 전에 Benadryl® 50 mg IVPB(IV 피기백)로 사전 투약될 것이다. CK0802는 중력에 의해 적어도 30분에 걸쳐 및 바람직하게는 1시간 이내에 주입되어야 한다. CK0802는 표준 혈액 제품 튜브 및 필터와 호환 가능하다.
플라시보 주입
30 ml 크라이오백에 동결보존된 부형제의 주입. 환자는 플라시보 주입 30분 전에 Benadryl® 50 mg IVPB(IV 피기백)로 사전 투약될 것이다. 플라시보는 중력에 의해 해동의 30분 이내에 및 바람직하게는 1시간 이내에 주입되어야 한다. 플라시보는 표준 혈액 제품 튜브 및 필터와 호환 가능하다.
연구 집단
이 연구는 아래에 설명된 모든 포함/배제 기준을 충족하는 대상체를 모집할 것이다.
포함 기준
1. SARS-CoV-2 감염에 대한 RT-PCR 기반 진단이 있는 것으로 문서화.
2. 베를린 기준 [Force et al., JAMA, 2012. 307(23): p. 2526-33]에 의해 정의된 중등도 내지 중증 ARDS: 200 mmHg 이하의 흡기 산소 분율(FiO2)에 대한 동맥 산소 분압(PaO2)의 비가 > 5 cm H2O의 호기말 양압(PEEP)으로 평가됨.
3. 120시간 미만 동안 삽관
4. 연령≥18
5. 사전 동의를 제공할 수 있는 능력 또는 사전 동의를 제공할 권한이 있는 의료 대리인을 정식으로 임명할 수 있는 능력
배제 기준
1. 조사자의 의견에 따르면, 스크리닝 후 >48시간 동안 생존할 가능성이 낮음.
2. 연구 조사자의 의견에 따라 연구 결과를 혼란스럽게 만들거나 연구 참여로 인해 환자에게 추가적인 위험을 초래할 수 있는 모든 신체 검사 결과 및/또는 질병의 병력.
3. 현재 체외막 산소화 장치(ECMO) 또는 고주파 진동 환기 장치(HFOV)를 받고 있음
4. 임신한 여성
5. 치료 등록 시작 시 활성 균혈증이 있는 환자 또는 조사자가 CK0802 치료의 안전성에 영향을 미칠 수 있는 동시 활성 중등도 내지 중증 기타 감염이 있는 환자.
6. 120시간 넘게 삽관된 환자
7. DMSO 또는 돼지 또는 소 단백질에 대한 알려진 과민증
8. 조사자의 의견에 따라 CK0802 치료의 안전성에 영향을 미칠 수 있는 모든 말기 장기 질환
9. 스테로이드는 림프 용해성이며 주입된 Treg 세포에 해로울 수 있다. 스트레스 용량 이상의 스테로이드 요법은 배제된다: 6시간마다 50 mg 초과의 하이드로코르티손 또는 0.5 mg/kg/일 초과의 메틸프레드니솔론과 동등한 기타 전신 스테로이드를 정맥내 투여하거나 60 mg 초과의 메틸프레드니솔론을 경구로 매일 투여한다.
10. 연구용 세포 치료제 투여
연구 중 평가
임상 평가
할당된 치료 아암: CK0802 또는 플라시보의 첫 번째 용량을 주입한 날의 기준선 평가 및 할당된 치료 아암: CK0802 또는 플라시보의 첫 번째 용량의 주입 후 14일 동안의 후속 일일 평가.
산소 호흡기 파라미터:
범위가 있는 평균 일일 기록(최소 및 최대 값)
ㆍ 고평부 압력
ㆍ 호흡량
ㆍ 평균 기도 압력
ㆍ FiO2
ㆍ PEEP
ㆍ PaO2/FiO2 비
ㆍ C-STAT/컴플라이언스(폐의 정적 컴플라이언스)
동맥혈 가스:
범위가 있는 평균 일일 기록(최소 및 최대 값)
ㆍ 동맥 pH
ㆍ 산소 분압(PaO2)
ㆍ 이산화탄소 분압(PaCO2)
ㆍ 중탄산염(HCO3)
ㆍ 산소 포화도(O2 Sat)
활력 징후:
범위가 있는 평균 일일 기록(최소 및 최대 값)
ㆍ 체온
ㆍ 혈압(BP): 수축기 및 확장기의 BP 측정치
ㆍ 호흡수
ㆍ 심박수
SOFA 점수
순차 장기 부전 평가(SOFA) 점수는 실험실 결과 및 임상 데이터를 기반으로 ICU 사망률을 예측한다.
SOFA 점수
Figure pct00049
실시예 11: 제대혈 유래 T 조절 세포의 세포 억제 활성에 대한 동결보존 효과
동결보존된 제대혈(CB) Treg 세포(CK0802)는 신선한 CB Treg 세포와 비교하여 유사한 억제자 기능을 갖는 것으로 나타났다. Tcon 세포는 양성 대조군 아암에서 CellTrace™ Violet 염료의 연속 희석에 의해 명백한 바와 같이 공동자극 CD3/28 비드의 존재 하에 높은 증식 속도를 나타냈으며(도 5a), 반면 CD3/28 비드의 부재 하에 음성 대조군 아암에서는 이러한 증식이 포착되지 않았다(도 5b). 확장된 CB Treg 세포가 신선한 배양물에서 유래했든(도 5c) 동결보존된 분취물에서 해동되었든(도 5d), 증식하는 Tcon 세포의 유사한 정도의 억제가 CellTrace™ Violet 염료의 희석 부족에 의해 입증되었다.
실시예 12: 제대혈 유래 T 조절 세포의 활성에 대한 룩소리티닙의 효과
룩소리티닙은 시험관내 및 생체 내 둘 모두에서 제대혈 유래 Treg 세포 기능을 개선하였다. 이러한 발견은 이전 보고에서 환자의 Treg 세포에 대한 룩소리티닙의 부정적인 영향을 설명했기 때문에 예상치 못한 것이었다.
도 31에 나타낸 바와 같이, 해동된 동결보존 제대혈(CB) Treg 세포에 룩소리티닙을 첨가하면 시험관 내에서 Treg 세포의 억제 기능이 회복되었다. 해동된 CB Treg 세포를 2차 배양에 넣으면 Treg 세포는 시간이 지남에 따라 억제자 기능을 상실한다. 룩소리티닙을 첨가하면 억제자 기능이 회복될 수 있다.
룩소리티닙과 CB Treg 세포는 병원성 루푸스 세포에서 인터페론-감마(IFNγ)의 방출을 억제하는 데 시너지 효과를 나타낸다. 전신성 홍반성 루푸스(SLE-PBMC)가 있는 대상체에서 유래한 말초 혈액 단핵 세포는 높은 수준의 염증성 사이토카인 IFNγ를 분비한다. IFN-γ의 수준은 룩소리티닙 또는 CB Treg 세포의 첨가에 의해 감소된다. 그러나, 함께 첨가될 때, CB Treg 세포와 룩소리티닙의 조합은 SLE-PBMC로부터의 IFNγ 방출의 상승적 억제를 나타낸다(도 32). 캄토테신은 비특이적 염증성 자극이 CB Treg 세포에서 IFNγ 분비를 증가시키지 않는다는 것을 입증하기 위한 대조군으로 사용된다.
이종 마우스 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 모델을 도 33에 도시된 바와 같이 룩소리티닙 및 활성화된 CB Treg 세포 요법으로 처리하였다. NSG 마우스에 -1일차에 준치사량의 방사선을 조사한 다음 0일차에 1x107 공여자 말초 혈액(PB) 단핵 세포(MNC)를 주입하였다. 매일 1 mg의 경구 룩소리티닙을 +4, +7, +11, +18일차에 투여된, CellTrace™ Violet 염료(ThermoFisher)로 태깅된 1x107개의 CB Treg 세포의 존재 또는 부재 하에 마우스에게 지속적으로 공급하였다. 마우스는 체중, GVHD 점수, 및 생존에 대해 격일로 추적되었다. 세포 구획 및 사이토카인 분석을 분석하기 위해 연속 채혈을 수행하였다.
조합 치료는 마우스 모델에서 GVHD 점수를 감소시키고(도 34a) 생존을 개선시켰다(도 34b). 룩소리티닙은 마우스 모델에서 CB Treg 지속성을 개선하였다(도 35a 내지 도 35c). 룩소리티닙은 단일 제제로서 뿐만 아니라 CB Treg 세포와 조합하여 인간 세포의 수를 감소시켰다(도 35a). 룩소리티닙은 CB Treg 세포와 조합하여 투여될 때 CD4 및 CD25 공동 발현 세포의 백분율을 증가시켰다(도 35b). 룩소리티닙은 단독 투여된 CB Treg 세포와 비교하여 CB Treg 세포와 조합하여 제공될 때 순환 CB Treg 세포의 백분율을 증가시켰다(도 35c).
룩소리티닙은 IL-7 및 IL-15의 생존 신호 경로를 향상시켰고 이종 마우스 GVHD 모델에서 CB Treg 세포에 대한 IL-4의 억제 신호 경로를 약화시켰다. 혈장 IL-7(도 36a) 및 혈장 IL-15(도 36b)의 수준은 룩소리티닙이 CB Treg 세포와 조합으로 투여되었을 때 증가하였다. 증가된 IL-7 가용성은 Treg 생존을 향상시키고, Treg 분자 표지를 안정화하고, 표면 IL-2Rα 발현을 향상시키고, Treg 세포의 IL-2 결합을 개선한다(문헌[Schmaler et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 112(43):13330-5, 2015]). IL-15는 RORγt 및 IL-17 발현의 상향 조절을 손상시키고 Treg 증식을 개선한다(문헌[Tosiek et al. (2016) Nat Commun 7:10888]). 룩소리티닙을 CB Treg 세포와 조합으로 투여한 경우 혈장 IL-4 수준이 감소하였다(도 36c). Th2 세포에 의한 IL-4 생성은 Treg에 의해 억제된다(문헌[Pace et al. J Immunol 2005; 174:7645-7653]).
룩소리티닙과 CB Treg 세포의 조합은 이종 마우스 GVHD 모델에서 염증성 사이토카인의 분비를 감소시켰다. IL-1a(도 37a), IL-17(도 37b) 및 IFNa2(도 37c)의 혈장 수준은 CB Treg 세포에 룩소리티닙을 첨가함으로써 감소되었다. FGF-12(도 37d) 및 대식세포 유래 케모카인(MDC)(도 37e)의 수준은 CB Treg 세포 단독, 룩소리티닙 단독, 및 룩소리티닙과 CB Treg 세포의 조합의 투여에 의해 동등하게 감소되었다.
룩소리티닙과 CB Treg 세포의 조합은 이종 마우스 GVHD 모델에서 항-염증성 사이토카인의 분비를 증가시켰다. IL-1RA(도 38a), IL-1a3(도 38b), 및 IL-12p70(도 38c)의 혈장 수준이 증가하였다. 룩소리티닙과 CB Treg 세포의 조합은 이종 마우스 GVHD 모델에서 혈액학적 파라미터를 개선하였다. 룩소리티닙 및 CB Treg 세포가 모두 투여된 경우 혈소판 수준이 증가하였다(도 39b). 14일차에, CB Treg 세포 + 룩소리티닙 아암에서 증가된 헤모글로빈 수준과 비교하여 룩소리티닙 단독 아암에서 헤모글로빈 수준의 유의한 감소가 명백하다(도 39a).
실시예 13: 키메라 항원 수용체 T 세포에 대한 제대혈 유래 T 조절 세포의 효과
NSG 마우스를 사용하여 이종 림프종 모델을 만들었으며 여기서 모든 마우스에 0.3x106개의 GFP 표지된 Raji 세포를 0일차에 주입한 다음 +5일차에 i) 모의-CAR T, ii) CART 없음, 또는 iii) CD19-CAR T 세포의 0.3x106개의 세포를 주입하였다. +11, +18, +25일차에 1x107개의 CB Treg 세포의 추가 주입을 CAR T가 없는 아암과 CD19-CAR T 아암에 첨가하여 아암당 3마리의 마우스가 있도록 했다. 마우스의 체중, GVHD 점수, 및 생존을 추적했다. 비침습성 생물발광을 사용하여 종양 부하를 평가하기 위한 연속 이미징을 수행하였다. 세포 분석 및 사이토카인 분석을 위해 연속 혈액을 채취하였다.
도 59a에 도시된 바와 같이, GFP-표지된 Raji 세포의 생체 내 증식은 +4일마다 모든 마우스에서 명백하였다. 모의-CAR T 세포 제외 CD19-CAR T는 +11일차에 종양 부담을 감소시켰다. 그러나, +14일차에 CD19-CAR T 세포 수용자를 포함한 모든 마우스는 진행을 보인 반면, CD19-CAR T+CB Treg 세포 수용자는 생물발광의 증거를 나타내지 않았다. CD19-CAR T+CB Treg 세포 수용자에서 우월한 생존은 다른 치료 아암과 비교할 때 명백하였다(도 60a). 안락사 시, CD19-CART 세포의 검출을 위해 상이한 기관을 평가하였고 CD19-CART+CB Treg 세포 수용자에서만 회수하였다(도 60b). CD19-CAR T 수용자는 IFN-감마(도 59b) 및 TNF-알파(도 59c)를 포함하는 +16일차 PB 샘플에서 염증성 사이토카인의 증가를 보여주었지만 CD19-CAR T + CB Treg 아암에서는 감소하였다. 뿐만 아니라, CD19-CAR T 단독에 비해 CD19-CAR T + CB Treg 아암에서 항-염증성 사이토카인 IL-1RA의 상호 증가가 관찰되었다(도 59d).
이종 림프종 모델에서 CD19-CAR T 세포에 CB Treg 세포를 첨가하면 사이토카인 폭풍이 약화되고 CAR T 세포의 표적 효능이 개선되었다.
번호가 매겨진 실시형태
첨부된 청구범위에도 불구하고, 본 개시내용은 하기 번호가 매겨진 실시형태를 제시한다:
1. 다음과 같은 약 1x108개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는 인간 Treg 세포의 집단: (i) ≥ 60% CD4+CD25+; 및 (ii) ≤ 10% CD4-CD8+; 여기서 인간 Treg 세포는 면역억제성임.
2. 다음과 같은 약 1x108개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는 인간 Treg 세포의 집단: (i) ≥ 60% CD4+CD25+; (ii) ≥ 60% CD4+CD25+CXCR4+; 및 (iii) ≤ 10% CD4-CD8+;
여기서 인간 Treg 세포는 면역억제성임.
3. 다음과 같은 약 1x108개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는 인간 Treg 세포의 집단: (i) ≥ 60% CD4+CD25+; (ii) ≥ 60% CD4+CD25+α4β7+; 및 (iii) ≤ 10% CD4-CD8+;
여기서 인간 Treg 세포는 면역억제성임.
4. 다음과 같은 약 1x108개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는 인간 Treg 세포의 집단: (i) ≥ 60% CD4+CD25+; (ii) ≥ 60% CD4+CD25+CD11a+; 및 (iii) ≤ 10% CD4-CD8+; 여기서 인간 Treg 세포는 면역억제성임.
5. 실시형태 1 내지 실시형태 4 중 어느 하나에 있어서, 약 1x109개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는, 인간 Treg 세포의 집단.
6. 실시형태 1 내지 실시형태 5 중 어느 하나에 있어서, 인간 Treg 세포가 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 세포내 염색 염료 또는 CellTrace™ Violet 세포내 염색 염료를 사용하는 검정에 의해 면역억제성인 것으로 결정되는, 인간 Treg 세포의 집단.
7. 적어도 하나의 동결보존된 인간 제대혈 유닛으로부터 활성화된 인간 T 조절(Treg) 세포의 확장된 집단을 생성하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법:
a) 동결보존된 인간 제대혈 유닛을 해동하는 단계;
b) 상기 해동된 제대혈 유닛을 기능적으로 폐쇄된 시스템에서 희석 및 세척하는 단계;
c) CD25+ 세포 표면 발현을 기반으로 하는 이중 선택 방법을 사용하여 자연 발생 Treg 세포를 단리하는 단계;
d) 최대 10일, 최대 12일, 또는 최대 14일 동안, 배양 배지(들)에서, 기체 투과성 배양기에서, 유효량의 인터류킨-2(IL-2)의 존재 하에 그리고 CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약의 존재 하에, 단리된 CD25+ Treg 세포를 생체 외에서 확장하여 활성화된 CD25+ Treg 세포의 집단을 생성하는 단계- 상기 배양 배지는 약 48시간마다 교체됨 -; 및
e) 배양 배지로부터 활성화된 CD25+ 세포를 수확하여, 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 생성하는 단계.
8. 실시형태 7에 있어서, 단일 제대혈 유닛이 사용되는, 방법.
9. 실시형태 7에 있어서, 2 내지 4개의 풀링된 제대혈 유닛이 사용되는, 방법.
10. 실시형태 7 내지 실시형태 9 중 어느 하나에 있어서, CD25에 특이적으로 결합하는 시약이 항-CD25 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 방법.
11. 실시형태 7 내지 실시형태 10 중 어느 하나에 있어서, CD25에 특이적으로 결합하는 시약이 고체 지지체에 접합되는, 방법.
12. 실시형태 11에 있어서, 고체 지지체가 자성 마이크로비드인, 방법.
13. 실시형태 7 내지 실시형태 11 중 어느 하나에 있어서, CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약이 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 항-CD28 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 방법.
14. 실시형태 7 내지 실시형태 12 중 어느 하나에 있어서, CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약이 항-CD3 코팅된 비드 및 항-CD28 코팅된 비드를 포함하는, 방법.
15. 실시형태 14에 있어서, 항-CD3 코팅된 비드 대 항-CD28 코팅된 비드가 1:1 비인, 방법.
16. 실시형태 14 또는 실시형태 15에 있어서, CD25+ 세포 대 항-CD3 및 항-CD28 코팅 비드가 1:1 비인, 방법.
17. 실시형태 7 내지 실시형태 16 중 어느 하나에 있어서, IL-2의 유효량이 약 1000 IU/ml 이하인, 방법.
18. 실시형태 7 내지 실시형태 17 중 어느 하나에 있어서, IL-2의 유효량이 약 1000 IU/ml인, 방법.
19. 실시형태 7 내지 실시형태 18 중 어느 하나에 있어서, 단계 c)에서 단리된 CD25+ Treg 세포가 단계 d)의 바로 시작 시에 IL-2를 포함하는 배양 배지에 현탁되는, 방법.
20. 실시형태 7 내지 실시형태 19 중 어느 하나에 있어서, 단계 e)에서 약 1x106개의 CD25+ 세포/ml가 배양되는, 방법.
21. 실시형태 7 내지 실시형태 20 중 어느 하나에 있어서, 단계 e)에서 세포가 10 cm2의 막 표면적을 갖는 기체 투과성 배양기에서 초기에 배양되는, 방법.
22. 실시형태 21에 있어서, 후속적으로 배양물이 100 cm2의 막 표면적을 갖는 기체 투과성 배양기로 옮겨지는, 방법.
23. 실시형태 7 내지 실시형태 22 중 어느 하나에 있어서, 단계 d)에서 배양물이 혼합 및 재현탁되지 않는, 방법.
24. 실시형태 7 내지 실시형태 23 중 어느 하나에 있어서, 배양 14일 후에 약 1x109 내지 약 2x109개의 활성화된 CD25+ 세포가 수확되는, 방법.
25. 실시형태 7 내지 실시형태 24 중 어느 하나에 있어서, 단계 a)에서 동결보존된 인간 제대혈 유닛이 수조에서 단일 단계로 해동되는, 방법.
26. 실시형태 7 내지 실시형태 25 중 어느 하나에 있어서, 단계 b)가 수동 세척을 포함하지 않는, 방법.
27. 실시형태 7 내지 실시형태 26 중 어느 하나에 있어서, 단계 b)가 PBS, EDTA, 및 약 0.5% 인간 혈청 알부민을 포함하는 용액에서 수행되는, 방법.
28. 실시형태 7 내지 실시형태 27 중 어느 하나에 있어서, 단계 c)에서 이중 강자성 컬럼 방법을 사용하여 CD25+ Treg 세포를 단리하는, 방법.
29. 적어도 하나의 동결보존된 인간 제대혈 유닛으로부터 활성화된 인간 T 조절(Treg) 세포의 확장된 집단을 생성하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법:
a) 동결보존된 인간 제대혈 유닛을 수조에서 단일 단계로 해동하는 단계;
b) 상기 해동된 제대혈 유닛을, 수동 세척 없이 기능적으로 폐쇄된 시스템에서 PBS, EDTA, 및 0.5% 인간 혈청 알부민을 포함하는 용액에서 희석 및 세척하는 단계;
c) 이중 강자성 컬럼 방법을 사용하여 CD25+ 세포 표면 발현을 기반으로 하는 이중 선택 방법을 사용하여 자연 발생 Treg 세포를 단리하는 단계;
d) 최대 10일, 최대 12일, 또는 최대 14일 동안, 배양 배지(들)에서, 기체 투과성 배양기에서, 약 1000 IU/ml의 인터류킨-2(IL-2)의 존재 하에 그리고 항-CD3 및 항-CD28 코팅된 비드의 존재 하에, 단리된 CD25+ Treg 세포를 생체 외에서 확장하여 활성화된 CD25+ Treg 세포의 집단을 생성하는 단계- 상기 배양 배지는 약 48시간마다 교체됨;
CD25+ Treg 세포 대 항-CD3 및 항-CD28 코팅된 비드는 1:1 비로 존재함;
배양물은 혼합 및 재현탁되지 않음 -; 및
e) 배양 배지로부터 활성화된 CD25+ 세포를 수확하여, 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 생성하는 단계.
30. 실시형태 7 내지 실시형태 29 중 어느 하나에 있어서, 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 동결보존하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
31. Treg 세포가 적어도 90% CXCR4+인, 실시형태 7 내지 실시형태 30 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단.
32. 실시형태 1 내지 실시형태 6 중 어느 하나에 있어서, Treg 세포가 적어도 90% CXCR4+인, 인간 Treg 세포의 집단.
33. 실시형태 1 내지 실시형태 6, 실시형태 31 및 실시형태 32 중 어느 하나에 있어서, Treg 세포가 적어도 95% CXCR4+, 적어도 95% CD45RA+, 및 적어도 80% CD45RO+인, 인간 Treg 세포의 집단.
34. 실시형태 1 내지 실시형태 6 및 실시형태 31 내지 실시형태 33 중 어느 하나에 있어서, Treg 세포가 추가로 적어도 95% CD95+, 적어도 95% HLADR+, 적어도 95% 알파4베타7+, 적어도 15% CXCR3hi+, 적어도 95% CCR6+, 적어도 95% CD54+, 적어도 95% CD11A+, 적어도 85% CD45RARO+, 적어도 80% CTLA4+, 적어도 80% GPR83+, 및 적어도 80% CD62L+인, 인간 Treg 세포의 집단.
35. 실시형태 1 내지 실시형태 6 및 실시형태 31 내지 실시형태 34 중 어느 하나에 있어서, Treg 세포가 적어도 95% CXCR4+, 적어도 95% CD45RA+, 적어도 80% CD45RO+, 적어도 95% CD95+, 적어도 95% HLADR+, 적어도 95% 알파4베타7+, 적어도 15% CXCR3hi+, 적어도 95% CCR6+, 적어도 95% CD54+, 적어도 95% CD11A+, 적어도 85% CD45RARO+, 적어도 80% CTLA4+, 적어도 80% GPR83+, 및 적어도 80% CD62L+인, 인간 Treg 세포의 집단.
36. 실시형태 1 내지 실시형태 6 및 실시형태 31 내지 실시형태 35 중 어느 하나에 있어서, Treg 세포가 FOXP3의 높은 발현 및 RORγt의 낮은 발현을 나타내는, 인간 Treg 세포의 집단.
37. 실시형태 1 내지 실시형태 6 및 실시형태 31 내지 실시형태 36 중 어느 하나에 있어서, Treg 세포가 이들의 다클론 T 세포 수용체 Vβ(TCR Vβ) 레퍼토리를 유지하는, 인간 Treg 세포의 집단.
38. 실시형태 1 내지 실시형태 6 및 실시형태 31 내지 실시형태 37 중 어느 하나에 있어서, Treg 세포가 사용 전에 동결보존되는, 인간 Treg 세포의 집단.
39. 적어도 하나의 동결보존된 인간 제대혈 유닛으로부터 생성된 활성화된 인간 T 조절(Treg) 세포의 확장된 집단을 동결보존하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법:
a) 동결보존된 인간 제대혈 유닛을 해동하는 단계;
b) 상기 해동된 제대혈 유닛을 기능적으로 폐쇄된 시스템에서 희석 및 세척하는 단계;
c) CD25+ 세포 표면 발현을 기반으로 하는 이중 선택 방법을 사용하여 자연 발생 Treg 세포를 단리하는 단계;
d) 최대 10일, 최대 12일, 또는 최대 14일 동안, 배양 배지(들)에서, 기체 투과성 배양기에서, 유효량의 인터류킨-2(IL-2)의 존재 하에 그리고 CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약의 존재 하에, 단리된 CD25+ Treg 세포를 생체 외에서 확장하여 활성화된 CD25+ Treg 세포의 집단을 생성하는 단계- 상기 배양 배지는 약 48시간마다 교체됨 -;
e) 배양 배지로부터 활성화된 CD25+ 세포를 수확하여, 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 생성하는 단계; 및
f) 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 동결보존하는 단계.
40. 대상체에서 이식편 대 숙주 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 실시형태 5 내지 실시형태 28 및 실시형태 39 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 실시형태 1 내지 실시형태 6 및 실시형태 31 내지 실시형태 38 중 어느 하나의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
41. 대상체에서 이식편 대 숙주 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, (i) 유효량의 실시형태 7 내지 실시형태 30 및 실시형태 39 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 실시형태 1 내지 실시형태 6 및 실시형태 31 내지 실시형태 38 중 어느 하나의 집단 및 (ii) 룩소리티닙을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
42. 대상체에서 골수 부전 증후군을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 실시형태 7 내지 실시형태 30 및 실시형태 39 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 실시형태 1 내지 실시형태 6 및 실시형태 31 내지 실시형태 38 중 어느 하나의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
43. 실시형태 42에 있어서, 골수 부전 증후군이 재생 불량성 빈혈, 원발성 골수섬유증, 또는 골수이형성 증후군인, 방법.
44. 대상체에서 원발성 골수섬유증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, (i) 유효량의 실시형태 7 내지 실시형태 30 및 실시형태 39 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 실시형태 1 내지 실시형태 6 및 실시형태 31 내지 실시형태 38 중 어느 하나의 집단 및 (ii) 룩소리티닙을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
45. 대상체에서 전신성 홍반성 루푸스(SLE)를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 실시형태 7 내지 실시형태 30 및 실시형태 39 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 실시형태 1 내지 실시형태 6 및 실시형태 31 내지 실시형태 38 중 어느 하나의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
46. 대상체에서 다발성 골수종의 치료 또는 예방 방법으로서, 유효량의 실시형태 7 내지 실시형태 30 및 실시형태 39 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 실시형태 1 내지 실시형태 6 및 실시형태 31 내지 실시형태 38 중 어느 하나의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
47. 대상체에서 신경염증성 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 실시형태 7 내지 실시형태 30 및 실시형태 39 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 실시형태 1 내지 실시형태 6 및 실시형태 31 내지 실시형태 38 중 어느 하나의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
48. 실시형태 47에 있어서, 신경염증 장애가 길랑-바레 증후군, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 또는 탈수초성 신경병증인, 방법.
49. 대상체에서 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염과 관련된 호흡기 질환, 장애, 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 실시형태 7 내지 실시형태 30 및 실시형태 39 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 실시형태 1 내지 실시형태 6 및 실시형태 31 내지 실시형태 38 중 어느 하나의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
50. 실시형태 49에 있어서, 호흡기 질환, 장애, 또는 병태가 COVID-19(코로나바이러스 질환) 매개 급성 호흡 곤란 증후군(CoV-ARDS)인, 방법.
51. 대상체에서 사이토카인 방출 증후군(CRS)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 실시형태 7 내지 실시형태 30 및 실시형태 39 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 실시형태 1 내지 실시형태 6 및 실시형태 31 내지 실시형태 38 중 어느 하나의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
52. 실시형태 51에 있어서, CRS가 키메라 항원 수용체 T-세포 요법과 관련된, 방법.
53. 실시형태 40 내지 실시형태 52 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포의 집단이 대상체에게 정맥내 투여되는, 방법.
54. 실시형태 40 내지 실시형태 53 중 어느 하나 있어서, 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포의 집단이 약 1x106개 내지 약 1x107개의 Treg 세포/대상체의 체중 kg인, 방법.
55. 실시형태 40 내지 실시형태 53 중 어느 하나에 있어서, 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포의 집단이 약 1x108개 Treg 세포 내지 약 3x108개의 Treg 세포인, 방법.
56. 실시형태 40 내지 실시형태 55 중 어느 하나에 있어서, 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포의 집단의 다중 용량이 대상체에게 투여되는, 방법.
57. 실시형태 56에 있어서, 3회 용량 또는 4회 용량이 대상체에게 투여되는, 방법.
58. 실시형태 56 또는 실시형태 57에 있어서, 용량이 약 4 내지 6주마다 대상체에게 투여되는, 방법.
59. 실시형태 40 내지 실시형태 58 중 어느 하나에 있어서, 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포의 집단을 투여한 후, 대상체에서 순환 염증성 사이토카인 수준은 투여 전 대상체에서 순환 염증성 사이토카인 수준에 비해 감소되는, 방법.
60. 실시형태 40 내지 실시형태 59 중 어느 하나에 있어서, 치료 전에, 대상체가 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포의 집단에 반응할지 여부를 결정하기 위해 대상체의 혈청 바이오마커를 검사하는, 방법.
61. 실시형태 40 내지 실시형태 60항 중 어느 하나에 있어서, 치료 후, 임상 반응과의 상관관계를 결정하기 위해 대상체의 혈청 바이오마커를 검사하는, 방법.
62. 실시형태 61에 있어서, 혈청 바이오마커를 연속적으로 검사하여 Treg 세포를 사용한 후속 재치료가 필요한지 여부를 검사하는, 방법.
63. 실시형태 40 내지 실시형태 62 중 어느 하나에 있어서, 활성화된 인간 Treg 세포의 집단이 대상체에 적합한 혈액형의 하나 이상의 제대혈 유닛으로부터 제조되는, 방법.
64. 실시형태 40 내지 실시형태 63 중 어느 하나에 있어서, 활성화된 인간 Treg 세포의 집단이 대상체에 대해 6개 중 3개 이상 HLA(인간 백혈구 항원) 매치인 제대혈 유닛으로부터 제조되는, 방법.
65. 실시형태 40 내지 실시형태 62 중 어느 하나에 있어서, 활성화된 인간 Treg 세포의 집단이 대상체에 대해 HLA 매치가 아닌 제대혈 유닛으로부터 제조되는, 방법.
66. 약제의 제조에서 실시형태 1 내지 실시형태 6 및 실시형태 31 내지 실시형태 38 중 어느 하나의 집단의 용도.

Claims (66)

  1. 다음과 같은 약 1x108개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는 인간 Treg 세포의 집단:
    (i) ≥ 60% CD4+CD25+; 및
    (ii) ≤ 10% CD4-CD8+;
    여기서 인간 Treg 세포는 면역억제성임.
  2. 다음과 같은 약 1x108개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는 인간 Treg 세포의 집단:
    (i) ≥ 60% CD4+CD25+;
    (ii) ≥ 60% CD4+CD25+CXCR4+; 및
    (iii) ≤ 10% CD4-CD8+;
    여기서 인간 Treg 세포는 면역억제성임.
  3. 다음과 같은 약 1x108개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는 인간 Treg 세포의 집단:
    (i) ≥ 60% CD4+CD25+;
    (ii) ≥ 60% CD4+CD25+α4β7+; 및
    (iii) ≤ 10% CD4-CD8+;
    여기서 인간 Treg 세포는 면역억제성임.
  4. 다음과 같은 약 1x108개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는 인간 Treg 세포의 집단:
    (i) ≥ 60% CD4+CD25+;
    (ii) ≥ 60% CD4+CD25+CD11a+; 및
    (iii) ≤ 10% CD4-CD8+;
    여기서 인간 Treg 세포는 면역억제성임.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1x109개 이상의 인간 Treg 세포를 포함하는, 인간 Treg 세포의 집단.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Treg 세포가 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 세포내 염색 염료 또는 CellTrace™ Violet 세포내 염색 염료를 사용하는 검정에 의해 면역억제성인 것으로 결정되는, 인간 Treg 세포의 집단.
  7. 적어도 하나의 동결보존된 인간 제대혈 유닛으로부터 활성화된 인간 T 조절(Treg) 세포의 확장된 집단을 생성하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법:
    a) 동결보존된 인간 제대혈 유닛을 해동하는 단계;
    b) 상기 해동된 제대혈 유닛을 기능적으로 폐쇄된 시스템에서 희석 및 세척하는 단계;
    c) CD25+ 세포 표면 발현을 기반으로 하는 이중 선택 방법을 사용하여 자연 발생 Treg 세포를 단리하는 단계;
    d) 최대 10일, 최대 12일, 또는 최대 14일 동안, 배양 배지(들)에서, 기체 투과성 배양기에서, 유효량의 인터류킨-2(IL-2)의 존재 하에 그리고 CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약의 존재 하에, 단리된 CD25+ Treg 세포를 생체 외에서 확장하여 활성화된 CD25+ Treg 세포의 집단을 생성하는 단계- 상기 배양 배지는 약 48시간마다 교체됨 -; 및
    e) 배양 배지로부터 활성화된 CD25+ 세포를 수확하여, 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 생성하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 단일 제대혈 유닛이 사용되는, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 2 내지 4개의 풀링(pool)된 제대혈 유닛이 사용되는, 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, CD25에 특이적으로 결합하는 시약이 항-CD25 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, CD25에 특이적으로 결합하는 시약이 고체 지지체에 접합되는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 고체 지지체가 자성 마이크로비드인, 방법.
  13. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약이 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 항-CD28 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 방법.
  14. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약이 항-CD3 코팅된 비드 및 항-CD28 코팅된 비드를 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 항-CD3 코팅된 비드 대 항-CD28 코팅된 비드가 1:1 비인, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, CD25+ 세포 대 항-CD3 및 항-CD28 코팅 비드가 1:1 비인, 방법.
  17. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, IL-2의 유효량이 약 1000 IU/ml 이하인, 방법.
  18. 제7항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, IL-2의 유효량이 약 1000 IU/ml인, 방법.
  19. 제7항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 단리된 CD25+ Treg 세포가 단계 d)의 바로 시작 시에 IL-2를 포함하는 배양 배지에 현탁되는, 방법.
  20. 제7항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 e)에서 약 1x106개의 CD25+ 세포/ml가 배양되는, 방법.
  21. 제7항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 e)에서 세포가 10 cm2의 막 표면적을 갖는 기체 투과성 배양기에서 초기에 배양되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 후속적으로 배양물이 100 cm2의 막 표면적을 갖는 기체 투과성 배양기로 옮겨지는, 방법.
  23. 제7항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 배양물이 혼합 및 재현탁되지 않는, 방법.
  24. 제7항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 14일 후에 약 1x109 내지 약 2x109개의 활성화된 CD25+ 세포가 수확되는, 방법.
  25. 제7항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 동결보존된 인간 제대혈 유닛이 수조에서 단일 단계로 해동되는, 방법.
  26. 제7항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 수동 세척을 포함하지 않는, 방법.
  27. 제7항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 PBS, EDTA, 및 약 0.5% 인간 혈청 알부민을 포함하는 용액에서 수행되는, 방법.
  28. 제7항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 이중 강자성 컬럼 방법을 사용하여 CD25+ Treg 세포를 단리하는, 방법.
  29. 적어도 하나의 동결보존된 인간 제대혈 유닛으로부터 활성화된 인간 T 조절(Treg) 세포의 확장된 집단을 생성하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법:
    a) 동결보존된 인간 제대혈 유닛을 수조에서 단일 단계로 해동하는 단계;
    b) 상기 해동된 제대혈 유닛을, 수동 세척 없이 기능적으로 폐쇄된 시스템에서 PBS, EDTA, 및 0.5% 인간 혈청 알부민을 포함하는 용액에서 희석 및 세척하는 단계;
    c) 이중 강자성 컬럼 방법을 사용하여 CD25+ 세포 표면 발현을 기반으로 하는 이중 선택 방법을 사용하여 자연 발생 Treg 세포를 단리하는 단계;
    d) 최대 10일, 최대 12일, 또는 최대 14일 동안, 배양 배지(들)에서, 기체 투과성 배양기에서, 약 1000 IU/ml의 인터류킨-2(IL-2)의 존재 하에 그리고 항-CD3 및 항-CD28 코팅된 비드의 존재 하에, 단리된 CD25+ Treg 세포를 생체 외에서 확장하여 활성화된 CD25+ Treg 세포의 집단을 생성하는 단계- 상기 배양 배지는 약 48시간마다 교체됨;
    CD25+ Treg 세포 대 항-CD3 및 항-CD28 코팅된 비드는 1:1 비로 존재함;
    배양물은 혼합 및 재현탁되지 않음 -; 및
    e) 배양 배지로부터 활성화된 CD25+ 세포를 수확하여, 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 생성하는 단계.
  30. 제7항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 동결보존하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  31. Treg 세포가 적어도 90% CXCR4+인, 제7항 내지 제30항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단.
  32. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Treg 세포가 적어도 90% CXCR4+인, 활성화된 인간 Treg 세포의 집단.
  33. 제1항 내지 제6항, 제31항 및 제32항 중 어느 한 항에 있어서, Treg 세포가 적어도 95% CXCR4+, 적어도 95% CD45RA+, 및 적어도 80% CD45RO+인, 활성화된 인간 Treg 세포의 집단.
  34. 제1항 내지 제6항 및 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, Treg 세포가 추가로 적어도 95% CD95+, 적어도 95% HLADR+, 적어도 95% 알파4베타7+, 적어도 15% CXCR3hi+, 적어도 95% CCR6+, 적어도 95% CD54+, 적어도 95% CD11A+, 적어도 85% CD45RARO+, 적어도 80% CTLA4+, 적어도 80% GPR83+, 및 적어도 80% CD62L+인, 활성화된 인간 Treg 세포의 집단.
  35. 1항 내지 제6항 및 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, Treg 세포가 적어도 95% CXCR4+, 적어도 95% CD45RA+, 적어도 80% CD45RO+, 적어도 95% CD95+, 적어도 95% HLADR+, 적어도 95% 알파4베타7+, 적어도 15% CXCR3hi+, 적어도 95% CCR6+, 적어도 95% CD54+, 적어도 95% CD11A+, 적어도 85% CD45RARO+, 적어도 80% CTLA4+, 적어도 80% GPR83+, 및 적어도 80% CD62L+인, 활성화된 인간 Treg 세포의 집단.
  36. 제1항 내지 제6항 및 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, Treg 세포가 FOXP3의 높은 발현 및 RORγt의 낮은 발현을 나타내는, 활성화된 인간 Treg 세포의 집단.
  37. 제1항 내지 제6항 및 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, Treg 세포가 이들의 다클론 T 세포 수용체 Vβ(TCR Vβ) 레퍼토리를 유지하는, 활성화된 인간 Treg 세포의 집단.
  38. 제1항 내지 제6항 및 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, Treg 세포가 사용 전에 동결보존되는, 활성화된 인간 Treg 세포의 집단.
  39. 적어도 하나의 동결보존된 인간 제대혈 유닛으로부터 생성된 활성화된 인간 T 조절(Treg) 세포의 확장된 집단을 동결보존하는 방법으로서, 하기를 포함하는 방법:
    a) 동결보존된 인간 제대혈 유닛을 해동하는 단계;
    b) 상기 해동된 제대혈 유닛을 기능적으로 폐쇄된 시스템에서 희석 및 세척하는 단계;
    c) CD25+ 세포 표면 발현을 기반으로 하는 이중 선택 방법을 사용하여 자연 발생 Treg 세포를 단리하는 단계;
    d) 최대 10일, 최대 12일, 또는 최대 14일 동안, 배양 배지(들)에서, 기체 투과성 배양기에서, 유효량의 인터류킨-2(IL-2)의 존재 하에 그리고 CD3 및 CD28에 특이적으로 결합하는 시약의 존재 하에, 단리된 CD25+ Treg 세포를 생체 외에서 확장하여 활성화된 CD25+ Treg 세포의 집단을 생성하는 단계- 상기 배양 배지는 약 48시간마다 교체됨 -;
    e) 배양 배지로부터 활성화된 CD25+ 세포를 수확하여, 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 생성하는 단계; 및
    f) 활성화된 인간 Treg 세포의 확장된 집단을 동결보존하는 단계.
  40. 대상체에서 이식편 대 숙주 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 제5항 내지 제28항 및 제39항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 제1항 내지 제6항 및 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  41. 대상체에서 이식편 대 숙주 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, (i) 유효량의 제7항 내지 제30항 및 제39항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 제1항 내지 제6항 및 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항의 집단 및 (ii) 룩소리티닙을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  42. 대상체에서 골수 부전 증후군을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 제7항 내지 제30항 및 제39항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 제1항 내지 제6항 및 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 골수 부전 증후군이 재생 불량성 빈혈, 원발성 골수섬유증, 또는 골수이형성 증후군인, 방법.
  44. 대상체에서 원발성 골수섬유증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, (i) 유효량의 제7항 내지 제30항 및 제39항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 제1항 내지 제6항 및 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항의 집단 및 (ii) 룩소리티닙을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  45. 대상체에서 전신성 홍반성 루푸스(SLE)를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 제7항 내지 제30항 및 제39항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 제1항 내지 제6항 및 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  46. 대상체에서 다발성 골수종의 치료 또는 예방 방법으로서, 유효량의 제7항 내지 제30항 및 제39항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 제1항 내지 제6항 및 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  47. 대상체에서 신경염증성 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 제7항 내지 제30항 및 제39항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 제1항 내지 제6항 및 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 신경염증 장애가 길랑-바레 증후군, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 또는 탈수초성 신경병증인, 방법.
  49. 대상체에서 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염과 관련된 호흡기 질환, 장애, 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 제7항 내지 제30항 및 제39항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 제1항 내지 제6항 및 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 호흡기 질환, 장애, 또는 병태가 COVID-19(코로나바이러스 질환) 매개 급성 호흡 곤란 증후군(CoV-ARDS)인, 방법.
  51. 대상체에서 사이토카인 방출 증후군(CRS)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 제7항 내지 제30항 및 제39항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 활성화된 인간 Treg 세포의 집단 또는 제1항 내지 제6항 및 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, CRS가 키메라 항원 수용체 T-세포 요법과 관련된, 방법.
  53. 제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포의 집단이 대상체에게 정맥내 투여되는, 방법.
  54. 제40항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포의 집단이 약 1x106개 내지 약 1x107개의 Treg 세포/대상체의 체중 kg인, 방법.
  55. 제40항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포의 집단이 약 1x108 Treg 세포 내지 약 3x108 Treg 세포인, 방법.
  56. 제40항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포의 집단의 다중 용량(multiple doses)이 대상체에게 투여되는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 3회 용량 또는 4회 용량이 대상체에게 투여되는, 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 용량이 약 4 내지 6주마다 대상체에게 투여되는, 방법.
  59. 제40항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포의 집단을 투여한 후, 대상체에서 순환 염증성 사이토카인 수준은 투여 전 대상체에서 순환 염증성 사이토카인 수준에 비해 감소되는, 방법.
  60. 제40항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 전에, 대상체가 유효량의 활성화된 인간 Treg 세포의 집단에 반응할지 여부를 결정하기 위해 대상체의 혈청 바이오마커를 검사하는, 방법.
  61. 제40항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 후, 임상 반응과의 상관관계를 결정하기 위해 대상체의 혈청 바이오마커를 검사하는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 혈청 바이오마커를 연속적으로 검사하여 Treg 세포를 사용한 후속 재치료가 필요한지 여부를 검사하는, 방법.
  63. 제40항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 인간 Treg 세포의 집단이 대상체에 적합한 혈액형의 하나 이상의 제대혈 유닛으로부터 제조되는, 방법.
  64. 제40항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 인간 Treg 세포의 집단이 대상체에 대해 6개 중 3개 이상 HLA(인간 백혈구 항원) 매치인 제대혈 유닛으로부터 제조되는, 방법.
  65. 제40항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 인간 Treg 세포의 집단이 대상체에 대해 HLA 매치가 아닌 제대혈 유닛으로부터 제조되는, 방법.
  66. 약제의 제조에서 제1항 내지 제6항 및 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항의 집단의 용도.
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