CN114616324A - 包含调节性t细胞的组合物及其制备和使用方法 - Google Patents

包含调节性t细胞的组合物及其制备和使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114616324A
CN114616324A CN202080075035.5A CN202080075035A CN114616324A CN 114616324 A CN114616324 A CN 114616324A CN 202080075035 A CN202080075035 A CN 202080075035A CN 114616324 A CN114616324 A CN 114616324A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
treg cells
population
subject
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080075035.5A
Other languages
English (en)
Inventor
S.帕尔马
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Selenkos SA
Original Assignee
Selenkos SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Selenkos SA filed Critical Selenkos SA
Publication of CN114616324A publication Critical patent/CN114616324A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/505—CD4; CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1369—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. MSC from umbilical blood

Abstract

本文提供离体扩增的脐带血来源的调节性T细胞群。还提供了生产和使用它们的方法。

Description

包含调节性T细胞的组合物及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月11日提交的美国临时专利申请第63/064,129号、2020年6月12日提交的美国临时专利申请第63/038,345号、2020年3月17日提交的美国临时专利申请第62/990,913号以及2019年9月26日提交的美国临时专利申请第62/906,283号的权益，在此通过引用将其每一个的公开内容并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及免疫调节性T细胞(Treg)的领域。更具体地，本公开提供富集的脐带血来源的Treg群及其制备和使用方法。
背景技术
Treg天然抑制和调节免疫反应。许多自身免疫性疾病、炎性病症和恶性肿瘤直接由Treg缺损/缺陷和/或抑制功能或内源性Treg的总细胞数的耗竭引起或加剧，这让自身反应性细胞毒性T细胞不受限制地增殖，从而导致细胞和组织损伤，其又转化为若干疾病表现。用异基因健康脐带血来源的Treg替换和补充此类有缺陷的Treg可以通过抑制自身反应性细胞毒性T细胞的有害作用而引起稳态的重建，从而使基础疾病的得到临床改善。本领域仍然需要开发针对这些自身免疫疾病、炎性病症和恶性肿瘤的额外治疗。
发明内容
本文提供了一种人Treg细胞群，其包含至少约1×108个人Treg细胞，这些人Treg细胞为：(i)≥60％CD4+CD25+；和(ii)≤10％CD4-CD8+；其中人Treg细胞具有免疫抑制性。本文还提供了一种人Treg细胞群，其包含至少约1×108个人Treg细胞，这些人Treg细胞为：(i)≥60％CD4+CD25+；(ii)≥60％CD4+CD25+CXCR4+；和(iii)≤10％CD4-CD8+；其中人Treg细胞具有免疫抑制性。本文还提供了一种人Treg细胞群，其包含至少约1×108个人Treg细胞，这些人Treg细胞为：(i)≥60％CD4+CD25+；(ii)≥60％CD4+CD25+α4β7+；和(iii)≤10％CD4-CD8+；其中人Treg细胞具有免疫抑制性。本文还提供了一种人Treg细胞群，其包含至少约1×108个人Treg细胞，这些人Treg细胞为：(i)≥60％CD4+CD25+；(ii)≥60％CD4+CD25+CD11a+；和(iii)≤10％CD4-CD8+；其中人Treg细胞具有免疫抑制性。在一些实施例中，人Treg细胞群包含至少约1×109个人Treg细胞。在一些实施例中，人Treg细胞通过使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯细胞内染色染料或CellTraceTMViolet细胞内染色染料的测定确定具有免疫抑制性。
本文还提供了一种用于从至少一个冻存的人脐带血单位产生扩增的活化人调节性T(Treg)细胞群的方法，该方法包含：a)解冻冻存的人脐带血单位；b)在功能封闭的系统中稀释和洗涤解冻的脐带血单位；c)基于CD25+细胞表面表达使用双重选择方法分离天然存在的Treg细胞；d)在气体可渗透性培养器皿内的培养基中，在存在有效量的白介素-2(IL-2)和与CD3和CD28特异性结合的试剂的情况下，离体扩增所分离的CD25+Treg细胞多达10天、多达12天或多达14天，其中培养基约每48小时更换一次，以产生活化CD25+Treg细胞群；和e)从培养基中收集活化CD25+细胞以产生扩增的活化人Treg细胞群。
在一些实施例中，所冻存的人脐带血单位在水浴中一步解冻。
在一些实施例中，稀释和洗涤步骤不包含手动洗涤。在一些实施例中，稀释和洗涤步骤在包含PBS、EDTA和约0.5％人血清白蛋白的溶液中进行。
在一些实施例中，用于所冻存的人脐带血单位的起始材料的选择标准包括供应商资质；有核细胞总计数；冷冻前细胞活力百分比；冻存体积；采集日期；储存条件；巨细胞病毒血清阳性；民族和种族；母体供体史；家族病史；供体母亲传染病概况。在一些实施例中，使用单个脐带血单位。在一些实施例中，使用2至4个汇集的脐带血单位。在一些实施例中，使用超过4个汇集的脐带血单位。
在一些实施例中，与CD25特异性结合的试剂是一种抗CD25抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，与CD25特异性结合的试剂缀合到固体载体。在一些实施例中，固体载体是一种磁微珠。在一些实施例中，使用双铁磁柱法分离CD25+Treg细胞。
在一些实施例中，与CD3和CD28特异性结合的试剂包含抗CD3包被珠和抗CD28包被珠。在一些实施例中，抗CD3包被珠和抗CD28包被珠的比为1:1。在一些实施例中，在本文所述的方法的培养步骤中，CD25+细胞和抗CD3和抗CD28包被珠的比为1:1。在一些实施例中，在本文所述方法的培养步骤中，每毫升培养约1×106个CD25+细胞。
在一些实施例中，IL-2的有效量高达约1000IU/ml。在一些实施例中，IL-2的有效量为约1000IU/ml。在一些实施例中，在本文所述方法的培养步骤刚开始时，将所分离的CD25+Treg细胞悬浮在包含IL-2的培养基中。
在一些实施例中，在本文所述的方法的培养步骤中，CD25+细胞最初在膜表面积为10cm2的气体可渗透性培养器皿中培养。在一些实施例中，随后将培养物转移到膜表面积为100cm2的气体可渗透性培养器皿中。在一些实施例中，在本文所述方法的培养步骤中培养物不进行混合和重新悬浮。
在一些实施例中，在培养10天、12天或14天之后收集约1×109至约10×109个活化CD25+细胞。
本文还提供了一种用于从至少一个冻存的人脐带血单位产生扩增的活化人调节性T(Treg)细胞群的方法，该方法包含：a)在水浴中一步解冻冻存的人脐带血单位；b)在功能封闭的系统中于包含PBS、EDTA和约0.5％人血清白蛋白的溶液中稀释和洗涤解冻的脐带血单位，而无需手动洗涤；c)基于CD25+细胞表面表达使用双重选择方法及使用双铁磁柱法分离天然存在的Treg细胞；d)在气体可渗透性培养器皿内的培养基中，在存在约1000IU/ml白介素-2(IL-2)和抗CD3和抗CD28包被珠的情况下离体扩增所分离的CD25+Treg细胞多达10天、多达12天或多达14天，其中培养基约每48小时更换一次，以产生活化CD25+Treg细胞群；其中CD25+Treg细胞和抗CD3和抗CD28包被珠的比为1:1；其中培养物不进行混合和重新悬浮；和e)从培养基中收集活化CD25+细胞以产生扩增的活化人Treg细胞群。
在一些实施例中，本发明的方法还包含冻存扩增的活化人Treg细胞群。
本文还提供了通过本文所述的方法产生的活化人Treg细胞群。
在一些实施例中，本文公开的群中的任何一个群中的Treg细胞为至少90％CXCR4+。在一些实施例中，本文公开的群中的任何一个群中的Treg细胞为至少95％CXCR4+、至少95％CD45RA+和至少80％CD45RO+。在一些实施例中，Treg细胞为至少95％CXCR4+、95％CD45RA+、至少80％CD45RO+、至少95％CD95+、至少95％HLADR+、至少95％α4β7+、至少15％CXCR3hi+、至少95％CCR6+、至少95％CD54+、至少95％CD11A+、至少85％CD45RARO+、至少80％CTLA4+、至少80％GPR83+和至少80％CD62L+。在一些实施例中，本文公开的群中的任何一个群中的人Treg细胞表现出FOXP3的高表达和RORγt的低表达。在一些实施例中，本文公开的群中的任何一个群中的人Treg细胞保持其多克隆T细胞受体Vβ(TCR Vβ)谱型。在一些实施例中，本文公开的群中的任何一个群中的人Treg细胞在使用之前冻存。
本文还提供了一种用于冻存从至少一个冻存的人脐带血单位产生的扩增的活化人调节性T(Treg)细胞群的方法，该方法包含：a)解冻冻存的人脐带血单位；b)在功能封闭的系统中稀释和洗涤解冻的脐带血单位；c)基于CD25+细胞表面表达使用双重选择方法分离天然存在的Treg细胞；d)在气体可渗透性培养器皿内的培养基中，在存在有效量的白介素-2(IL-2)和与CD3和CD28特异性结合的试剂的情况下，离体扩增所分离的CD25+Treg细胞多达10天、多达12天或多达14天，其中培养基约每48小时更换一次，以产生活化CD25+Treg细胞群；e)从培养基收集活化CD25+细胞以产生扩增的活化人Treg细胞群；f)基于定义的标准释放活化培养的人Treg细胞供临床使用；和g)冻存所释放的具有特征性表型的活化培养的人Treg细胞。
本文还提供了一种用于在受试者中治疗或预防移植物抗宿主疾病的方法，该方法包含向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群。本文还提供了一种用于在受试者中治疗或预防移植物抗宿主疾病的方法，该方法包含向受试者施用(i)有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群和(ii)鲁索替尼(ruxolitinib)。
本文还提供了一种用于在受试者中治疗或预防骨髓衰竭综合征的方法，该方法包含向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群。在一些实施例中，骨髓衰竭综合征是再生障碍性贫血、原发性骨髓纤维化或骨髓增生异常综合征。本文还提供了一种用于在受试者中治疗或预防原发性骨髓纤维化的方法，该方法包含向受试者施用(i)有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群和(ii)鲁索替尼。
本文还提供了一种用于在受试者中治疗或预防系统性红斑狼疮(SLE)的方法，该方法包含向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群。
本文还提供了一种用于在受试者中治疗或预防多发性骨髓瘤的方法，该方法包含向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群。
本文还提供了一种用于在受试者中治疗或预防神经炎性病症的方法，该方法包含向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群。在一些实施例中，神经炎性病症是格林-巴利综合征、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化症或脱髓鞘性神经病。
本文还提供了一种用于在受试者中治疗或预防与严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染相关联的呼吸系统疾病、病症或病状的方法，该方法包含向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群。在一些实施例中，呼吸系统疾病、病症或病状是COVID-19(冠状病毒疾病)介导的急性呼吸窘迫综合征(CoV-ARDS)。
本文还提供了一种用于在受试者中治疗或预防细胞因子释放综合征(CRS)的方法，该方法包含向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群。在一些实施例中，CRS与嵌合抗原受体T细胞疗法相关联。
在一些实施例中，将有效量的人Treg细胞群静脉内施用于受试者。
在一些实施例中，人Treg细胞群的有效量在约1×106和约1×107个Treg细胞/kg受试者体重之间。在一些实施例中，人Treg细胞群的有效量在约1×108个Treg细胞和约3×108个Treg细胞之间。
在一些实施例中，在施用有效量的人Treg细胞群之后，受试者中的循环炎性细胞因子水平与施用前受试者中的循环炎性细胞因子水平相比降低。
在一些实施例中，在治疗之前，检验受试者的血清生物标志物以确定受试者是否将对有效量的人Treg细胞群产生反应。在一些实施例中，在治疗之后，检验受试者的血清生物标志物以确定与临床反应的相关性。在一些实施例中，对血清生物标志物进行连续检验，以诊察是否需要用Treg细胞进行后续再治疗。
在一些实施例中，人Treg细胞群由一个或多个与待通过本文公开的方法治疗的受试者相容的血型的脐带血单位制备。在一些实施例中，人Treg细胞群由脐带血单位制备，该脐带血单位对于待通过本文公开的方法治疗的受试者至少3/6HLA(人白细胞抗原)匹配。在一些实施例中，人Treg细胞群由脐带血单位制备，该脐带血单位对于待用本文公开的方法治疗的受试者HLA不匹配。
本文还提供了本文公开的人Treg细胞群在制备药剂中的用途。
附图说明
图1是示出来自测定在室温(15至30℃)或4℃下储存的新鲜的活化Treg细胞的活力百分比(7AAD)的测定结果的线图。N＝9。
图2A至2B描绘了一系列示出扩增的活化Treg细胞具有免疫抑制性的图。对于抑制测定，按照制造商的说明，将常规T细胞(Tcon)(CD4+CD25-)细胞解冻并用CellTraceTMViolet(赛默飞世尔(ThermoFisher))进行染色。在存在CD3/CD28珠的持续活化的情况下，脐带血Treg和Tcon被置于不同比，并在3天后使用流式细胞术进行分析。图2A示出了当以不同比与Treg共孵育时对增殖的常规T细胞的显著抑制。图2B示出了在HLA匹配对(p＝0.03)和HLA不匹配对(p＝0.03，双侧T检验)方面，与第0天新鲜分离的脐带血Treg相比，第14天收集的活化扩增的脐带血Treg的抑制能力显著增加。(N＝2)
图3是示出活化Treg细胞可穿过HLA屏障而具有免疫抑制性的线图。使用异种移植物抗宿主疾病(GVHD)模型(Parmar等人,《细胞疗法(Cytotherapy)》16(10:90-100(2013))，对非SCIDγ缺失(NSG)小鼠进行亚致死性照射，接着以1×107个细胞的剂量注射来源于HLAA2阳性供体的外周血单核细胞(PBMC)以诱导GVHD。在治疗组中，在PBMC注射前一天，以1×106个细胞的剂量注射来源于HLA A2阴性供体的脐带血Treg。对小鼠进行存活率跟踪。甚至在1个对数更小的剂量下，CB Treg能够挽救GVHD的有害影响并且与仅使用PBMC的组相比导致在第40天统计学上显著的优越存活率(对数序；p＝0.003)。
图4A至4D描绘了一系列示出了扩增的活化Treg细胞继续保持抑制性，不表达RORγt并且显示响应于应激IL-10表达的反增加的图和图表。在存在IL-2和CD3/CD28共表达珠的情况下，脐带血Treg在培养物中扩增。细胞也用0ng/ml、40ng/ml或200ng/ml IL-6进行治疗。细胞每48小时喂食一次，并对RORγt的细胞内染色以及IL-10和IL-17的细胞因子释放测定执行基于流式细胞术的分析。
图5A至5D描绘了示出与新鲜的CB Treg细胞相比，冻存的脐带血(CB)Treg细胞具有相当的抑制功能的图。图5A：阳性对照包括存在CD3/28珠的情况下的Tcon细胞。图5B：阴性对照-不存在CD3/28珠的情况下的Tcon细胞。图5C：新鲜的CB Treg细胞的共培养抑制Tcon细胞增殖。图5D：冻存的CB Treg细胞的共培养抑制Tcon细胞增殖。
图6是一系列示出扩增的脐带血Treg显示T细胞受体Vβ谱型的高斯(多克隆)分布的图。使用商业试剂盒(德克萨斯州弗伦兹伍德的Tel-Test公司(Tel-Test,Friendswood,TX))从Treg中提取总RNA，并使用逆转录(加利福尼亚州福斯特市的美国应用生物系统公司(Applied Biosystems,Foster City,CA))制备cDNA。然后通过聚合酶链反应(PCR)将CDR3区扩增为23个TCR Vβ亚群。对所得PCR产物进行毛细管电泳和定量光密度测定，以评估TCRVβ家族中的每一个家族内的片段长度的多样性。
图7A至7B示出了扩增的脐带血Treg在存在地塞米松(dexamethasone)(称为“Dex”或“类固醇”)的情况下仍然具有抑制性。“Tcon”指常规T细胞。“Treg”是指调节性T细胞。左上图和左下图是类固醇(-)。右上图和右下图有100μg/mL类固醇。
图8A至8C示出了冻存的活化Treg细胞显示一致的表型并具有与新鲜的活化Treg细胞相似的免疫抑制能力。图8A描绘了解冻后冻存的Treg中CD25、CD8和CD127的表达。图8B描绘了冻存的Treg表现出Helios和FoxP3的高表达。图8C描绘了冻存的Treg使用基于CellTraceTMViolet染料的抑制测定抑制增殖的常规T细胞。
图9A至9B示出了使用异种小鼠移植物抗宿主疾病(GVHD)模型的研究结果。使用异种移植物抗宿主疾病(GVHD)模型(Parmar等人,《细胞疗法》16(10:90-100(2013))，在供体外周血单核细胞以1×107个细胞的剂量施用的前一天，新鲜的活化Treg细胞或冻存(冷冻)的活化Treg细胞在GVHD预防中以1×107个细胞的剂量施用。图9A是描绘新鲜的活化Treg细胞或冻存(冷冻)活化Treg细胞对GVHD评分的影响的图。图9B是描述新鲜的活化Treg细胞或冻存(冷冻)的活化Treg细胞对小鼠体重的影响的图。“CB”是指脐带血。“PBMC”是指外周血单核细胞。
图10A至10B示出了使用异种小鼠移植物抗宿主疾病(GVHD)模型的研究设计。图10A描绘了GVHD预防研究设计，其中NSG小鼠在第-1天接受亚致死照射，接着在第0天注射脐带血(CB)Tregs-1×107个细胞并注射PBMC-1×107个细胞。随后，每隔一天对小鼠进行跟踪以测量体重和GVHD评分。在基线时抽取外周血和血清，此后从第+7天开始每隔一周抽取一次。图10B描绘了GVHD治疗研究设计，其中NSG小鼠在第-1天接受亚致死辐射并在第0天注射PBMC-1×107个细胞。在第+4、+11、+18和+25天注射CB Tregs-1×107个细胞。随后，每隔一天对小鼠进行跟踪以测量体重、GVHD评分和存活率。在基线时抽取外周血和血清，此后从第+7天开始每隔一周抽取一次。“PBMC”是指外周血单核细胞。“冷冻的Treg”是指冻存的Treg。“NSG”是指非SCIDγ缺失小鼠。
图11A至11B描绘了在异种小鼠移植物抗宿主疾病(GVHD)模型中施用冻存的活化Treg对体重波动(图11A)和存活率(图11B)的影响。“预防”是指图10A所描绘的研究设计。“治疗”是指图10B所描绘的研究设计。“对照”是指没有施用Treg细胞的阴性对照。
图12A至12F示出了在对照、预防和治疗组的异种小鼠移植物抗宿主疾病(GVHD)模型中在PBMC输注后的基线日、第+7天和第+14天外周血细胞因子分析的结果。图12A：IP-10；图12B：TNFα；图12C：GM-CSF；图12D：MIP-1β；图12E：FLT-3L；图12F：IFN-γ。
图13描绘了用活化Treg(单用脐带血(CB)Treg)或活化Treg和PBMC(CB Tregs+PBMC)治疗的小鼠的图像。输注萤火虫荧光素酶标记的CB Treg后的生物发光扫描显示，到注射后第+1天，无论是否注射PBMC，在所有小鼠的肺、肝脏和脾脏中都检测到了CB Treg。到第+3天，在没有持续存在PBMC的小鼠中不再检测到CB Treg(单用CB Treg)，但是在PBMC受体小鼠中仍旧检测到CB Treg(CB Treg+PBMC)。在PBMC增殖的小鼠中，扫描表明在GVHD靶器官中的持续性甚至增殖。
图14描绘了用活化的reg治疗的小鼠的图像。将GFP标记的HL-60急性髓性白血病(AML)细胞系以3×106个细胞的剂量注射到所有4组中的NSG小鼠中：1)对照小鼠(PBS&AML)：接收了HL60+PBS；2)Treg小鼠(AML+Treg)：接受了HL60+Tregs(1×107个细胞)；3)Tcon小鼠(AML+Tcon)：接受了HL60+Tcons(1×107个细胞)；4)Tcon+Treg小鼠(AML+Tcon+Treg)：接受了HL60+Tcon(1×107个细胞)+Tregs(1×107个细胞)。每周对小鼠成像一次，以了解注射的Tcon和Treg对肿瘤体积负荷的影响。对照组(PBS治疗)和单用CB-Treg治疗的小鼠均死于肿瘤。Tcon的受体小鼠能够消除肿瘤但死于GVHD。Tcon和Treg的受体小鼠能够在肿瘤控制和不存在GVHD的情况下延长存活期。
图15描绘了线图，其示出了单次注射活化Treg细胞在系统性红斑狼疮(SLE)的异种小鼠模型中在SLE-PBMC移植后降低了CD45+效应T细胞的水平持续9周，其中在SLE-PBMC注射后1周，将SLE-PBMC(3×106个细胞)注射到NSG小鼠中，并且注射CB Treg(1×107个细胞)。“PBMC”是指外周血单核细胞。
图16A描绘了示出在注射SLE-PBMC(3×106个细胞)后4周开始每周注射四次活化Treg细胞(1×107个细胞)在系统性红斑狼疮(SLE)的异种小鼠模型中改善了存活率的图。
图16B描绘了示出每周注射四次活化Treg细胞在系统性红斑狼疮(SLE)的异种小鼠模型中降低了抗双链DNA抗体(ds DNA Ig)的水平的条形图。
图17A至17B描绘了示出每周注射四次活化Treg细胞在系统性红斑狼疮(SLE)的异种小鼠模型中降低了尿白蛋白水平(图17A)并降低了尿肌酸酐渗漏(图17B)的图。
图18描绘了一系列示出每周注射四次活化的Treg细胞在系统性红斑狼疮(SLE)异种小鼠模型中改善了肾脏组织学的图像。
图19描绘了示出了施用活化Treg在系统性红斑狼疮(SLE)的异种小鼠模型中降低了人sCD40L的血清浓度的图和统计分析结果。
图20A至20B描述了示出每周注射一次活化冻存的Treg在系统性红斑狼疮(SLE)的异种小鼠模型中导致循环CD8+效应T细胞持续减少(图20A)，以及脾脏、骨髓、肺和肝脏中CD8+效应T细胞浸润减少(图20B)的图。“PBMC”是指外周血单核细胞。
图21A至21D描绘了一系列示出施用Treg在多发性骨髓瘤的异种小鼠模型中的效果的图和图像。图21A是示出随时间对小鼠体重影响的线图。CB Treg受体小鼠的体重保持不变，而“仅骨髓瘤”组的体重下降表明在肿瘤接种后第4周左右体重开始下降。图21B是示出随时间对外周血中循环骨髓瘤细胞的影响的线图。每周进行一次抽血，并分析所分离的细胞中循环的人CD38+细胞。与Treg受体小鼠相比，很明显“仅骨髓瘤”组中循环骨髓瘤细胞显著增加(p＝0.002)。图21C描绘了一系列示出肿瘤负荷可视化的图像。如通过每周生物发光成像所监测的，与“仅骨髓瘤”小鼠中的广泛分布的肿瘤相比，在CB Treg受体小鼠中可见MM1S细胞的痕迹极少。图21D是示出肿瘤负荷定量随时间变化的线图。根据生物发光成像的评定，在第17、24和31天观察到显著较高的信号。三角形指示CB Treg静脉内(i.v.)注射，且箭头指示MM1S细胞静脉内注射。
图22描绘了示出施用活化Treg在多发性骨髓瘤异种小鼠模型中改善存活率的图。在异种骨髓瘤模型中，与“仅骨髓瘤”组相比，在骨髓瘤细胞注射之前注射脐带血(CB)Treg使总存活率得到改善。P＝0.039通过对数秩检验进行确定。
图23描绘了示出施用活化Treg在多发性骨髓瘤的异种小鼠模型中降低血浆IL-6水平的条形图。在异种骨髓瘤小鼠模型中，在注射骨髓瘤细胞前一天注射脐带血(CB)Treg防止了骨髓瘤植入并使与血清炎性细胞因子IL-6水平降低相关的总存活率得到提高。在第28天和第35天，与“仅骨髓瘤”小鼠相比，循环血浆小鼠IL-6水平的测量显示较低水平。平均值±SEM。*P<0.0001，**P<0.001,***P<0.01在每个时间点通过非配对学生T-检验进行确定。
图24A至24B描绘了示出施用活化Treg细胞在多发性骨髓瘤的异种小鼠模型中降低了骨髓(图24A)和脾脏(图24B)中的骨髓瘤负担的条形图。每组有三只小鼠安乐死，并在第25天收集器官。骨髓和脾脏的细胞用CD38抗体进行染色，并通过流式细胞术分析MM.1S细胞群。
图25描绘了当细胞暴露于IL-6时由分离自脐带血的活化Treg细胞分泌细胞因子粒酶B。
图26描绘了如实例9所描述的评价施用脐带血来源的调节性T细胞在治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症中的安全性和有效性的临床试验的时间线。
图27描绘了如实例10所描述的评价施用脐带血来源的调节性T细胞在治疗COVID-19(冠状病毒疾病)介导的急性呼吸窘迫综合征(CoV-ARDS)中的安全性和有效性的临床试验方案的图。
图28描述了评价施用脐带血来源的调节性T细胞在治疗患有骨髓衰竭的受试者中的安全性和功效的1期临床试验的早期结果的总结。
图29是提供包含活化人Treg细胞群的各种产物的脐带血选择标准的表。“AABB”是指美国血库协会。“FACT”是指细胞疗法认证基金会。“CLIA”指实验室改进法案修正案。
图30是提供包含活化人Treg细胞群的各种产物的脐带血选择标准的表。“CK0802.a4b7”是指“CK0802.α4β7”。
图31是描绘在Treg细胞、Tcon细胞和鲁索替尼的共培养开始后96小时，在不存在或存在0.05μM鲁索替尼的情况下活化Treg细胞的抑制百分比的线图。x轴示出Treg细胞与Tcon细胞的比。ruxo＝鲁索替尼。
图32是描绘在存在或不存在(1)活化Treg细胞、(2)鲁索替尼和/或(3)喜树碱(camptothecin)的组合的情况下由致病性狼疮细胞释放的干扰素(IFN)-γ量的条形图。Rux＝鲁索替尼。SLE-PBMC＝来源于系统性红斑狼疮受试者的外周血单核细胞。D6＝第6天。
图33描绘了用鲁索替尼和活化的Treg细胞方案治疗异种小鼠移植物抗宿主疾病(GVHD)模型的示意图。PBMC＝外周血单核细胞。
图34A至34B描绘了示出用(1)活化Treg细胞、(2)鲁索替尼或(3)活化Treg细胞和鲁索替尼治疗在异种小鼠GVHD模型中对GVHD评分(图34A)或存活率百分比(图34B)的影响的图。Rux或R＝鲁索替尼。PBMC＝外周血单核细胞。
图35A至35C描绘了一系列示出用(1)活化Treg细胞、(2)鲁索替尼或(3)活化Treg细胞和鲁索替尼治疗在异种小鼠GVHD模型中对活化Treg细胞的持续性的影响的条形图。图35A示出了人CD45细胞的百分比。图35B示出了共表达CD4和CD45的人CD45细胞的百分比。图35C示出了为标记的CB Treg细胞的人CD45细胞的百分比。Rux或R＝鲁索替尼。
图36A至36C描绘了一系列示出用(1)活化Treg细胞、(2)鲁索替尼或(3)活化Treg细胞和鲁索替尼治疗在异种小鼠GVHD模型中对细胞因子分泌的影响的条形图。图36A示出了血浆IL-7的标准化水平。图36B示出了血浆IL-15的标准化水平。图36C示出了血浆IL-4的标准化水平。ruxo＝鲁索替尼。
图37A至37E描绘了一系列示出用(1)活化Treg细胞、(2)鲁索替尼或(3)活化Treg细胞和鲁索替尼治疗在异种小鼠GVHD模型中对炎性细胞因子分泌的影响的条形图。图37A示出了血浆IL-1a的标准化水平。图37B示出了血浆IL-17的标准化水平。图37C示出了血浆IFNa2的标准化水平。图37D示出了血浆FGF-12的标准化水平。图37E示出了血浆巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)的标准化水平。ruxo＝鲁索替尼。
图38A至38C描绘了一系列示出用(1)活化Treg细胞、(2)鲁索替尼或(3)活化Treg细胞和鲁索替尼治疗在异种小鼠GVHD模型中对抗炎细胞因子分泌的影响的条形图。图38A示出了血浆IL-1RA的标准化水平。图38B示出了血浆IL-1a3的标准化水平。图38C示出了血浆IL-12p70的标准化水平。ruxo＝鲁索替尼。
图39A至39B描绘了一系列示出用(1)活化Treg细胞、(2)鲁索替尼或(3)活化Treg细胞和鲁索替尼治疗在异种小鼠GVHD模型中对血液参数的影响的条形图。图39A示出了血红蛋白水平。图39B示出了血小板水平。Rux或R＝鲁索替尼。
图40A是转板迁移测定的示意图。靶细胞是骨髓瘤细胞或白血病细胞(阴性对照)。作用细胞是CB Treg细胞或Teff细胞。
图40B至40F描绘了一系列示出CB Treg细胞对骨髓瘤和白血病靶细胞迁移的影响的条形图。图40B示出了CB Treg减少并且Teff细胞完全阻断MM1S(骨髓瘤细胞系)迁移(p<0.001)。图40C示出了CB Treg减少并且Teff细胞完全阻断RPMI8226(骨髓瘤细胞系)迁移(p＝0.04)。图40D示出了CB Treg减少U266(骨髓瘤细胞系)迁移，但不显著。Teff细胞阻断U266迁移。图40E示出了CB Treg和Teff细胞对HL-60(急性髓性白血病细胞系)的迁移没有任何影响。图40F示出了CB Treg和Teff细胞对Nalm6(前B细胞白血病细胞系)的迁移没有任何影响。**P<0.05在每个时间点通过非配对学生T-检验进行确定。图40B至40D中的y轴描绘了细胞数×103/μL。
图41描绘了骨髓衰竭(BMF)患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验的设计示意图。
图42描绘了总结来自BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验的临床数据的图。
图43描绘了总结来自BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验的临床数据的表。
图44描绘了总结来自BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验的反应数据的持久性的图。
图45描绘了总结BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验中患者1的治疗史的图。
图46A至46B描绘了在基线时和施用Treg细胞后1个月和4个月时BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验中患者1的临床数据。
图47是一系列描绘BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验中患者1的炎性细胞因子水平的图。x轴示出了施用Treg细胞后的天数。左上图：CXCL-5。右上图：IL-17。左下图：IL-15。右下图：MCP。
图48是一系列描绘BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验中患者1的炎性细胞因子水平的图。x轴示出了施用Treg细胞后的天数。左上图：IL-8。右上图：sCD40L。左下图：MIP-1。右下图：SDF-1α+1β。
图49描绘了示出在基线时和施用Treg细胞后1个月和4个月时BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验中患者1的脾肿大测量值的条形图。
图50描绘了总结BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验中患者2的治疗史的图。
图51是一系列描述BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验中患者2的炎性细胞因子水平的图。x轴示出了施用Treg细胞后的天数。
图52描绘了示出BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验中患者3的TPO水平随时间变化的图。
图53描绘了BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验中患者3随时间推移的血小板(PLT)输注需求。
图54描绘了BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验中患者3随时间推移的压积红细胞(PRBC)输注需求。
图55描绘了BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验中患者4随时间推移的血小板(PLT)输注需求。
图56描绘了BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验中患者4随时间推移的压积红细胞(PRBC)输注需求。
图57描绘了BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验中患者6随时间推移的血小板(PLT)输注需求。
图58描绘了BMF患者中异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验中患者6随时间推移的压积红细胞(PRBC)输注需求。
图59A至59D描述了来自异种淋巴瘤小鼠模型的研究的数据，该异种淋巴瘤小鼠模型接受i)模拟-嵌合抗原受体(CAR)T细胞、ii)脐带血来源的Treg细胞、iii)CD19-CAR T细胞或(iv)脐带血来源的Treg细胞+CD19-CAR T细胞的治疗。
图60A至60B描绘了总结来自异种淋巴瘤小鼠模型的研究的数据的表，该异种淋巴瘤小鼠模型接受i)模拟-嵌合抗原受体(CAR)T细胞、ii)脐带血来源的Treg细胞、iii)CD19-CAR T细胞或(iv)脐带血来源的Treg细胞+CD19-CAR T细胞的治疗。图60A描绘了各组存活时间的比较。图60B描绘了各种器官中CD19-CAR T细胞/μL。
图61A至61H描绘了一系列示出在多发性骨髓瘤的异种小鼠模型中施用多剂量的Treg的效果的图和图像。图61A是示出单用(1)MM.1S骨髓瘤细胞、施用(2)骨髓瘤细胞和CD3+T常规细胞(Tcon)、施用(3)骨髓瘤细胞和脐带血来源的Treg细胞(Treg)或施用(4)骨髓瘤细胞、Tcon细胞和Treg细胞(Tcon Treg)的小鼠随时间对小鼠体重的影响的线图。图61B示出了一系列接受CD3+T常规细胞(Tcon)或Tcon细胞和Treg细胞的组合(Tcon和Treg)治疗的小鼠的非侵入性生物发光成像(BLI)产生的图像。图61C是描绘通过BLI进行的肿瘤负荷定量的线图。图61D是示出接受单用Tcon细胞治疗的小鼠中髓外复发的实例的图像。图61E描绘了用Treg细胞施用针对CD3和BCMA
Figure BDA0003615864090000121
的双特异性T细胞接合器的实验设计。图61F示出了一系列接受
Figure BDA0003615864090000123
和PanT细胞或
Figure BDA0003615864090000122
细胞、PanT细胞和Treg细胞的组合治疗的小鼠的非侵入性BLI产生的图像。图61G是示出施用Treg对
Figure BDA0003615864090000124
介导的体重减轻的影响的线图。图61H是示出施用Treg对GVHD(移植物抗宿主疾病)评分的影响的条形图。
具体实施方式
健康的调节性T细胞(Treg)通过阻止这些逃脱胸腺缺失或识别胸腺外抗原的细胞的活化和增殖来保护身体免受自身反应性细胞毒性T细胞的侵害。因此，Treg对于体内平衡和免疫调节以及保护宿主免受自身免疫的发展至关重要。另外，由于i)产生多余的对于Treg的存活是必不可少的IL-2的增殖效应T细胞和ii)由存在于组织中的受损抗原呈递细胞/树突细胞释放的归巢信号，输注的和先天的Treg都归巢于炎症区域。
尽管已经描述了几种类型的Treg，但最具特征和最有效的亚群表达CD4和高水平的CD25(IL-2Rα)和FoxP3、叉头框P3基因产物和CD127lo。这些CD4+CD25+FoxP3+CD127lo Treg可以进一步细分为在胸腺中发育并经历胸腺选择的天然Treg(nTreg)和在转化生长因子β(TGFβ)等细胞因子的影响下在外周发育的诱导Treg(iTreg)。(参见Ohkura等人,《免疫力(Immunity)》38(3):414-23(2013))。
在它们的天然状态下，Treg细胞通过调节先天和适应性免疫两者在维持免疫稳态和限制自身免疫反应方面发挥重要作用。通过维持外周耐受和抑制自身免疫反应和致病组织损伤，Treg对于免疫稳态是必不可少的。(参见Burrell等人,《免疫学杂志(J.Immunol)》189(10):4705-11(2012)；Schneidawind等人,《血液(Blood)》122(18):3116-21(2013)》；和Tang等人,《冷泉港生物学观点(Col Spring Harb Perspect Biol)》5(11):a015552(2013))。然而，在自身免疫性疾病中，有缺陷的内源性Treg不能有效保护身体免受自身反应性细胞毒性/效应T细胞的攻击。
Treg治疗发展的一个障碍是调节性T细胞的不稳定性，这些调节性T细胞通常“翻转”成炎性效应T细胞表型。例如，Treg细胞可以下调FOXP3的表达，从而允许通过活化E3泛素连接酶Stub1并以Hsp70依赖性方式获得效应T细胞样功能(Chen等人,《免疫力》2013年8月22日；39(2):272-85)
为了解决这个难题，本公开使用脐带血来源的Treg。脐带血的免疫原性较低，在公共和私立脐带血库中都有剩余。脐带血(CB)与外周血(PB)不同，因为它更具抑制性，具有不同的表观遗传特性和不同的血细胞比。此外，脐带血细胞是原始的、免疫反应较低的、原初的，表现出较高的增殖指数，并且可以跨越人白细胞抗原(HLA)边界起作用。脐带血来源是独一无二的，因为来源于脐带血的Treg与其它来源的Treg相比是原初的、更具抑制性并缺乏可塑性。同样地，由于脐带血细胞在分娩应激期间不断受到许多细胞因子的刺激，因此它们对可能的有毒环境物质不太敏感。
Treg疗法发展的另一个障碍是临床上足够的细胞数量，其可以在一段时间内反复输注以缓解进行性炎症。本文公开了用于从至少一个冻存的人脐带血单位产生扩增的活化人调节性T(Treg)细胞群的方法。还公开了通过本文所述的方法产生的活化人Treg细胞群。本文还公开了通过向受试者施用有效量的活化人Treg细胞群来治疗疾病或病症的方法。本文还公开了用于冻存从至少一个冻存的人脐带血单位产生的扩增的活化人Treg细胞群的方法。本文还公开了免疫抑制性Treg细胞群。
定义
除非另外定义，否则本文中所用的所有技术及科学术语均具有与本发明所属领域的一般技术者通常所理解相同的含义。在冲突的情况下，以本说明书，包括定义，为准。在整个说明书和权利要求书中，词语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises或comprising)”的变体将被理解为暗示包含所述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。术语“例如(e.g.)”或“例如(for example)”后面的任何示例并不意味着穷举的或限制的。
除非具体说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“一个/一种(a/an)”和“该/所述”应理解为单数或复数。
除非具体说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“或”应理解为包含性的。
当紧接在数值之前时，术语“约”意指数值的±0％至10％、±0％至10％、±0％至9％、±0％至8％、±0％至7％、±0％至6％、±0％至5％、±0％至4％、±0％至3％、±0％至2％、±0％至1％、±0％至小于1％或其中的任何其它值或值范围。例如，“约40”意指40的±0％至10％(即36至44)。
“活化”Treg细胞群可以定义为同质细胞群，该同质细胞群在存在CD3/28珠刺激T细胞受体(TCR)的情况下在培养条件和本文指定的细胞密度下由于连续暴露于高浓度的白介素-2(IL-2)而产生，这些CD3/28珠让受刺激的Treg细胞引起一致的炎症抑制。如本文所用，“抗体片段”或“抗原结合片段”是指除常规或完整抗体以外的分子，其包括含有至少结合抗原的可变区的常规或完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；和仅含有VH区(VHH)的单域抗体。
如本文所用，术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用，是指任何哺乳动物，包括人类、家畜和农场动物，以及动物园、运动和宠物动物，如狗、马、猫和农业用动物，包括牛、绵羊、猪和山羊。一种优选的哺乳动物是人，包括成人、儿童和老年人。受试者也可以是宠物动物，包括狗、猫和马。农业动物的实例包括猪、牛和山羊。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“治疗(treat、treating、treatment)”等是指逆转、减轻、抑制该术语适用的疾病、病症或病状的过程或预防此类疾病、病症或病状或一种或多种症状，并且包括施用本文所述的任何组合物、药物组合物或剂型，以预防症状或并发症的发生、或减轻症状或并发症、或消除疾病、病症或病状。在一些情况下，治疗是治愈性的或改善性的。
如本文所用，“预防”意指全部或部分预防、或改善或控制、或减少或停止待预防的事物或事件，例如，疾病、病症或病状的产生或发生。
如本文所用，短语“治疗有效量”和“有效量”等表示施用给患者或患者的细胞、组织或器官以达到治疗效果，如改善或替代疗效所必须的量。有效量足以引起研究人员、兽医、医生或临床医师正在寻求的细胞、组织、系统、动物或人类的生物学或医学反应。适当有效量或治疗有效量的确定在本领域技术人员的常规水平内。
如本文所用，术语“施用(administering、administer、administration)”等是指将治疗剂转移、递送、引入或转运至需要用此剂进行治疗的受试者的任何方式。这些方式包括但不限于眼内施用、口腔内施用、局部施用、静脉内施用、腹腔内施用、肌肉内施用、皮内施用、鼻内施用和皮下施用。
用于产生扩增的调节性T细胞群的方法
因为Treg细胞仅以低频率存在于循环血或脐带血中，因此临床相关Treg细胞剂量的产生需要离体富集和扩增具有CD4+CD25+表型的Treg细胞。
在本文所述的方法中的任何一种方法中，脐带血库和供体可以在本文所述方法中使用人脐带血之前进行评定。在一些实施例中，一个单位的人脐带血由美国、欧盟或其它满足供应商评定标准的地区的公共脐带血库提供。脐带血单位的评定可包括基于筛选和检验供体没有相关传染病迹象的证明。可以应用额外的选择标准，包括母体年龄、胎龄、总有核细胞(TNC)计数、冷冻前细胞活力百分比、冻保体积、采集日期、储存条件、种族、民族、母体供体史(例如，传染病史、旅行史)、家族病史、巨细胞病毒血清学阳性、妊娠糖尿病、高血压等中的一种或多种。选择标准可能与确保脐带血单位在使用前的一致性有关。图29和图30提供了包含活化人Treg细胞群的各种产物的脐带血选择标准。
在一些实施例中，使用免疫磁选择将细胞起始材料(CBU)解冻、洗涤并富集CD25+单核细胞(MNC)。将CD25+MNC置于具有白介素-2(IL-2)和抗CD3/抗CD28珠的气体可渗透性培养装置中。将细胞培养扩增多达10天、12天或14天。在一些实施例中，将细胞培养扩增8至10天或10至12天。在第8天、第9天、第10天、第11天、第12天或第14天，将扩增的细胞收集并洗涤，并且通过免疫磁法去除CD3/CD28珠。然后配制和包装去珠细胞。
在一些实施例中，本文公开了一种用于从至少一个冻存的人脐带血单位产生扩增的活化人调节性T(Treg)细胞群的方法，该方法包括：a)解冻冻存的人脐带血单位；b)在功能封闭的系统或封闭系统中稀释和洗涤解冻的脐带血单位；c)基于CD25+细胞表面表达使用双重选择方法分离天然存在的Treg细胞；d)在气体可渗透性培养器皿内的培养基中，在存在有效量的白介素-2(IL-2)和与CD3和CD28特异性结合的试剂的情况下离体扩增所分离的CD25+Treg细胞多达14天，其中培养基约每48小时更换一次，以产生活化CD25+Treg细胞群；和e)从培养基中收集活化CD25+细胞以产生扩增的活化人Treg细胞群。在一些实施例中，活化人Treg细胞具有特定的表型。在一些实施例中，该方法还包含在解冻步骤(即步骤a)前使用算法来选择最佳冻存的脐带血单位。在一些实施例中，该方法还包含，在收集步骤(即步骤f))后，基于定义的标准释放具有特征表型的扩增的活化人Treg细胞群以供临床使用。
在一些实施例中，使用单个脐带血单位(CBU)。在一些实施例中，使用两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)汇集的CBU。在一些实施例中，使用2至4个汇集的CBU。在一些实施例中，从健康供体采集CBU并在使用之前冷冻。
在一些实施例中，将冻存的人脐带血单位在水浴(例如，在37℃+/-1度)中一步解冻。在一些实施例中，解冻冻存的脐带血单位包含在将袋浸没在37℃(+/-1度)水浴中时轻轻地对其进行按摩，直到该袋手感柔软。然后，立即转移细胞进行洗涤过程。
在一些实施例中，使用自动细胞处理系统(例如，功能性封闭系统或封闭系统)对解冻的脐带血单位进行自动洗涤。在一些实施例中，自动细胞处理系统是Sepax系统(生物安全公司(Biosafe))。Sepax系统是一种离心和泵装置，旨在用于需要分离特定血液组分的细胞疗法。其原理基于离心分离，可根据血液颗粒的密度和尺寸进行分离。血液组分被采集在单独的袋中，并可以随时用于输注。自动细胞处理系统可允许高达100ml的起始体积到50至150ml的最终体积。初始体积和稀释体积之间的稀释比在0.5至2.0倍的范围可调。洗涤循环可包括一个循环的标准洗涤或在某些情况下，两个循环的高标准洗涤。自动细胞处理系统被编程为自动执行初始产物的稀释、渗透压恢复、洗涤、离心、上清液提取和细胞重新悬浮。通常，起始体积设置为25ml；最终体积设置为100ml，并且稀释系数为1.0。洗涤试剂包含5％人血清白蛋白(HSA)(杰特贝林公司(CSL Behring))和10％右旋糖酐-40(D-40)(赫士睿公司(Hospira))。洗涤后，将脐带血细胞采集到脐带血洗涤袋中。
在一些实施例中，碱性洗涤介质包含约20ml 25％HSA和约1000ml PBS/EDTA缓冲液。在一些实施例中，工作洗涤介质包含约300ml碱性洗涤缓冲液和约50mg氯化镁(MgCl2)和约2500单位的DNase。在一些实施例中，改良的培养基包含X-Vivo 15培养基(瑞士龙沙基团(Lonza))和约10ml GlutaMAX-1和约100ml解冻的人AB血清。在一些实施例中，洗涤介质包含PBS、EDTA和0.5％HSA。
在一些实施例中，洗涤步骤不包含手动洗涤。
在一些实施例中，自动洗涤的脐带血细胞使用工作洗涤介质进行额外的手动洗涤；其中最终体积为200ml，重组细胞在室温下以300g离心10分钟。最后，将洗涤的细胞以100×106个细胞的浓度重新悬浮于0.09ml中。
在一些实施例中，与CD25特异性结合的试剂是一种抗CD25抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，与CD25特异性结合的试剂缀合到固体载体。在一些实施例中，固体载体是珠、柱或板。在一些实施例中，固体载体是一种磁微珠。在一些实施例中，珠包含纤维素、纤维素衍生物、丙烯酸树脂、玻璃、硅胶、聚苯乙烯、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯和丙烯酰胺的共聚物、与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、胶乳凝胶、聚苯乙烯、葡聚糖、橡胶、硅、塑料、硝酸纤维素、天然海绵、可控多孔玻璃、金属、交联葡聚糖或琼脂糖凝胶。
在一些实施例中，以每100×106细胞0.02ml CD25微珠的比将CD25微珠添加到洗涤的脐带血细胞中。将细胞和微珠在4℃下一起孵育30分钟。在一些实施例中，由铁磁球制成的LS柱(Miltenyi(美天旎公司))与外部磁场联合使用，其中未标记的细胞可自由通过，而磁标记的CD25+细胞悬浮在色谱柱内，实际上不会“结合”色谱柱基质。该悬浮液使对细胞的应激降到最低，并可通过避免细胞聚集来进行有效的无菌洗涤。LS柱使用工作洗涤介质引发，并且让CD25+微珠标记的细胞通过连接到磁场的LS柱。然后将LS柱从磁场中移除，并使用柱塞推出与CD25微珠结合并标记为阳性级分1的松散保留的细胞。在双重选择方法中，阳性级分1此刻充当通过所引发的LS柱的起始溶液，并重复采集阳性级分2，最后将两种阳性级分混合以获得最终选择的CD25+细胞的步骤。在一些实施例中，使用双铁磁柱(例如，LS柱)法分离CD25+细胞。
在一些实施例中，与CD3和CD28特异性结合的试剂包含抗CD3抗体或其抗原结合片段和抗CD28抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，与CD3和CD28特异性结合的试剂包含抗CD3包被珠和抗CD28包被珠(即“抗CD3/抗CD28包被珠”)。在一些实施例中，抗CD3包被珠和抗CD28包被珠在与CD3和CD28特异性结合的试剂中的比为1:1。在一些实施例中，当CD25+细胞在存在与CD3和CD28特异性结合的试剂的情况下培养时，CD25+细胞和抗CD3/抗CD28包被珠的比为1:1。
在一些实施例中，在用于产生扩增的活化人Treg细胞群的方法中使用的IL-2的有效量高达约1000IU/ml。在一些实施例中，IL-2的有效量为约1000IU/ml。在一些实施例中，IL-2是人IL-2。在一些实施例中，在本文所述方法的培养步骤刚开始时，将所分离的CD25+Treg细胞悬浮在包含IL-2的培养基中。
在一些实施例中，在培养步骤期间，培养基约每48小时更换一次，而不干扰细胞。在一些实施例中，在本文所述方法的培养步骤中培养物不进行混合和重新悬浮。
在一些实施例中，在用于产生扩增的活化人Treg细胞群的方法中，在存在与CD3和CD28特异性结合的试剂的情况下培养每毫升约1×106个CD25+细胞。在一些实施例中，CD25+细胞最初在膜表面积为10cm2的气体可渗透性培养器皿中培养。在一些实施例中，随后将培养物转移到膜表面积为100cm2的气体可渗透性培养器皿中。
在一些实施例中，在存在与CD3和CD28特异性结合的试剂的情况下培养14天后收集约0.5×109至约12×109或约1×109至约2×109活化CD25+细胞。在一些实施例中，本文所述的生产方法导致CD4+CD25+Treg群扩增50倍或更多倍。在一些实施例中，扩增的活化人Treg细胞群在收集步骤之后冻存。在一些实施例中，扩增的活化人Treg细胞群在收集步骤之后不冻存而是快速释放用于施用。
本文还提供了一种用于从至少一个冻存的人脐带血单位产生扩增的活化人调节性T(Treg)细胞群的方法，该方法包括：a)在水浴中一步解冻冻存的人脐带血单位；b)在功能封闭的系统中于包含PBS、EDTA和约0.5％人血清白蛋白的溶液中稀释和洗涤解冻的脐带血单位，而无需手动洗涤；c)基于CD25+细胞表面表达使用双重选择方法及使用双铁磁柱法分离天然存在的Treg细胞；d)在气体可渗透性培养器皿内的培养基中，在存在约1000IU/ml白介素-2(IL-2)和抗CD3和抗CD28包被珠的情况下离体扩增所分离的CD25+Treg细胞多达10天、多达12天或多达14天，其中培养基约每48小时更换一次，以产生活化CD25+Treg细胞群；其中CD25+Treg细胞和抗CD3和抗CD28包被珠的比为1:1；其中培养物不进行混合和重新悬浮；和e)从培养基中收集活化CD25+细胞以产生扩增的活化人Treg细胞群。
收集之后，Treg细胞可以进行污染、活力、纯度的检验，可以进行细胞数的计数和/或使用流式细胞术进行检验。
在一些实施例中，活性物质(DS)为一种液体细胞悬浮液，其包含具有调节性T细胞表型(CD4+CD25+)的有核脐带血细胞或由其组成。在一些实施例中，DS为一种液体细胞悬浮液，其包含有核脐带血细胞或由其组成，≥约60％的有核脐带血细胞具有调节性T细胞表型(CD4+CD25+)且<约10％的有核脐带血细胞具有T细胞毒性/抑制细胞表型(CD4-CD8+)。在一些实施例中，最终产物(DP)为一种液体细胞悬浮液，其包含悬浮于赋形剂溶液中的活性物质或由其组成，该赋形剂溶液包含含0.5％人血清白蛋白(HSA)的血浆-电解质A或由其组成，最终体积为50mL。
在一些实施例中，在最终配制之前，如果需要，使用条件性CD8+细胞耗竭步骤以减少活化Treg细胞群中CD4-CD8+细胞毒性/抑制T细胞的含量。在收集之前，可以使用与CD8特异性结合的试剂(即，抗CD8抗体或其抗原结合片段)从培养基中去除CD8+细胞，并去除任何与该试剂结合的细胞。在一些实施例中，该试剂可以缀合至固体载体，例如珠、柱和板。例如，珠可以是包被有抗CD8抗体的磁微珠。珠可由任何本领域常用的材料制成，包括但不限于纤维素、纤维素衍生物、丙烯酸树脂、玻璃、硅胶、聚苯乙烯、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯和丙烯酰胺的共聚物、与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯等、聚丙烯酰胺、胶乳凝胶、聚苯乙烯、葡聚糖、橡胶、硅、塑料、硝酸纤维素、天然海绵、硅胶、可控多孔玻璃、金属、交联葡聚糖和琼脂糖凝胶。
CD8+细胞耗竭后，本文所述的方法还可以涉及分析培养基中剩余的细胞中是否存在CD4-CD8+细胞的步骤。例如，该分析可能涉及确定培养基中剩余的CD4-CD8+细胞数量。当培养基中剩余的≥10％的细胞是CD4-CD8+细胞时，可以进行第二轮CD8+细胞耗竭。
在细胞培养结束时，如果浓度高于3×106个细胞/100，可以执行去除抗CD3/抗CD28包被珠的额外步骤。
释放具有特征性表型的扩增的活化人Treg细胞群供临床使用的标准可以包括：7氨基放线菌素-D(7-AAD)活力≥70％、CD4+CD25+纯度≥60％，革兰氏染色剂“无生物体”并且内毒素<5EU/kg。
在一些实施例中，可以产生具有高达1000倍以上的大规模扩增的大体积产物，其中最终的细胞群是同质的、明确定义的Treg细胞，其细胞数目在大约0.5×109至12×109个Treg细胞的范围内，这些Treg细胞在培养多达14天后收集。在一些实施例中，最终产物在室温下储存时可保持稳定多达8小时，而在4℃下储存时可保持稳定多达96小时。
在一些实施例中，执行额外的步骤以丰富CXCR4、α4β7或CD11a的细胞表面表达。
在一些实施例中，生产工艺包括以下步骤中的一些或全部步骤：
第1步：解冻脐带血单位(CBU)(第0天)
输入：CBU
输出：解冻后CBU
将冷冻的CBU从液氮(LN2)气相储存器中取出，置于塑料外包装袋中以防止解冻期间端口的污染。将外包装的冷冻袋立即置于37℃水浴中并快速解冻，轻轻揉捏该袋以确保均匀解冻。该输出——解冻后CBU进行采样用于：
·有核细胞(NC)计数
·活力百分比(台盼蓝)
检验结果用于过程监测。
步骤2：稀释和洗涤CBU(第0天)
输入：解冻后CBU
输出：洗涤后CBU
快速解冻后，立即将解冻后CBU袋的内容物连接到Sepax(通用电气医疗集团(GEHealthcare))一次性使用套件的输入管线上。在Sepax系统内细胞用含10％低分子量葡聚糖(LMD)的0.9％NaCl稀释和洗涤。Sepax洗涤液(洗涤后CBU)的输出量约为100mL，并进行采样用于：
·有核细胞(NC)计数
·活力百分比(台盼蓝)
检验结果用于过程监测。
第3步：预选择洗涤(第0天)
输入：洗涤后CBU
输出：CB单核细胞(MNC)
洗涤后CBU细胞在室温下以400×g(离心力)离心10分钟。通过温和抽吸去除上清液后，将细胞(CB MNC)重新悬浮于Miltenyi PBS/EDTA缓冲液中至约8至10mL的体积。该输出——CB MNC不进行采样。
第4步：CD25抗体孵育(第0天)
输入：CB MNC
输出：孵育后的CB MNC
将CB单核细胞与Miltenyi抗CD25微珠在4至8℃和间歇手动混合条件下孵育15分钟。孵育之后，将细胞和抗CD25微珠混合物洗涤，并重新悬浮于补充有阿法链道酶(Pulmozyme)和MgCl2的Miltenyi PBS/EDTA缓冲液中至约10mL的体积。该输出——孵育后的CB MNC不进行采样。
第5步：CD25阳性选择(第0天)
输入：孵育后CB MNC
输出：CD25+MNC
在与Miltenyi CD25抗体试剂孵育步骤之后，将孵育后CB MNC转移到与MidiMACS装置连接的Miltenyi LS柱中，该MidiMACS装置通过使用磁体捕获抗CD25标记的细胞。免疫磁选择后，细胞从磁场中释放出来，并且该输出——CD25+MNC进行采样用于：
·有核细胞(NC)计数
·活力百分比(台盼蓝)
·活力百分比(7-AAD流式细胞术)
·％CD4-CD8+(流式细胞术)
·％CD4+CD25+(流式细胞术)
检验结果用于过程监测。
第6步：开始培养-扩增(第0天)
输入：CD25+MNC
输出：第0天培养物
将CD25+选择的MNC洗涤并悬浮于含1％谷氨酰胺和10％人AB血清与白介素-2(IL-2，1000IU/mL)的X-Vivo 15中，然后与CD3/CD28珠以1:1的珠-细胞比进行混合。将细胞+珠混合物转移到表面积为10cm2的气体可渗透性扩增(10M)系统中，并在37℃下用5％CO2进行孵育。没有进行细胞悬浮液的摇动或搅动。在这一步不进行采样。
气体可渗透性扩增(10M)系统由圆柱形无菌、一次性塑料装置组成。将细胞和培养基转移到气体可渗透性扩增系统后，细胞驻留在容器的底部，其中表面是气体可渗透性的。10M系统的气体可渗透性膜的表面积为10cm2。该系统放置在常规培养箱中，但可以根据采样、培养基去除、培养基添加或细胞收集的需要间歇性地取出。
第7步：添加IL-2(第2或3天)
输入：第0天培养物
输出：第2/3天培养物+IL-2
在第2或第3天(自最后一次培养基/IL-2更换后<66小时)，将新鲜的IL-2以1000IU/mL添加到气体可渗透性扩增(10M)系统中的培养细胞中，以补充IL-2，假定IL-2已被消耗。在这一步不进行采样。将表面积为100cm2的气体可渗透性扩增(100M)系统中的细胞返回在37℃下用5％CO2进行孵育。没有进行细胞悬浮液的摇动或搅动。
步骤8：转移和进料(第4、5或6天)
输入：第2/3天培养物+IL-2
输出：第4/5/6天培养物+新鲜培养基+IL-2
在第4、5或6天(自最后一次培养基/IL-2更换后<66小时)，取出气体可渗透性扩增(10M)系统中培养细胞的等分试样，并进行采样用于：
·有核细胞(NC)计数
·活力百分比(台盼蓝)
NC计数和活力百分比用于培养扩增的过程监测。
将气体可渗透性扩增(10M)系统中剩下的培养细胞转移到气体可渗透性扩增(100M)系统中，其中新鲜的培养基添加至1000mL的体积(含1％谷氨酰胺和10％人AB血清与IL-21000IU/mL的X-Vivo 15)。将气体可渗透性扩增(100M)系统中的细胞返回在37℃下用5％CO2进行孵育。没有进行细胞悬浮液的摇动或搅动。
气体可渗透性扩增(100M)系统由圆柱形无菌、一次性塑料装置组成。在将细胞和培养基转移到气体可渗透性扩增系统后，细胞驻留在容器的底部，其中表面是气体可渗透性的。100M系统的气体渗透膜的表面积为100cm2。该系统放置在常规培养箱中，但可以根据采样、培养基去除、培养基添加或细胞收集的需要间歇性地取出。
第9步：添加IL-2(第7或8天)
输入：第4/5/6天培养物+新鲜培养基+IL-2
输出：第7/8天培养物+IL-2
在第7或8天(自最后一次培养基/IL-2更换后<66小时)，将新鲜的IL-2添加到G-Rex100M系统中的培养细胞中，以补充IL-2，假定IL-2已被消耗。在这一步不进行采样。将气体可渗透性(100M)系统中的细胞返回在37℃下用5％CO2进行孵育。没有进行细胞悬浮液的摇动或搅动。
第10步：添加IL-2(第9或10天)
输入：第7/8天培养物+IL-2
输出：第9/10天培养物+IL-2
在第9或10天(自最后一次培养基/IL-2更换后<66小时)，将新鲜的IL-2添加到气体可渗透性扩增(100M)系统中的培养细胞中，以补充IL-2，假定IL-2已被消耗。在这一步不进行采样。将气体可渗透性扩增(100M)系统中的细胞返回在37℃下用5％CO2进行孵育。没有进行细胞悬浮液的摇动或搅动。
第11步：添加IL-2(第11或12天)
输入：第9/10天培养物+IL-2
输出：第11/12天培养物+IL-2
在第11或12天(自最后一次培养基/IL-2更换后<66小时)，对培养细胞进行采样用于：
·支原体
·无菌性
支原体检验结果(最终报告；释放标准为支原体阴性)和无菌性(中期报告；释放标准是在最终配制和批次释放前48至72小时获得的样品上“无生长”的报告)用于第14天的最终产物释放。
采样后，将新鲜的IL-2添加到气体可渗透性扩增(100M)系统中的培养细胞中，以补充IL-2，假定IL-2已被消耗。将气体可渗透性扩增(100M)系统中的细胞返回在37℃下用5％CO2进行孵育。没有进行细胞悬浮液的摇动或搅动。
步骤12：收集前样品(第14天)
输入：第11/12天培养物+IL-2
输出：收集前第14天，采样
在第14天，在收集培养扩增的T-Reg细胞前，对细胞悬浮液进行采样用于：
·支原体
在该时间点重复进行支原体检验，但在产物快速释放之前通常无法获得结果。然而，来自第11/12天的支原体检验结果用于快速释放。
支原体采样后，去除气体可渗透性扩增(100M)系统中1000mL总细胞悬液体积中的750mL，对剩下的培养物进行采样用于：
·有核细胞(NC)计数
·活力百分比(台盼蓝)
·％CD4-CD8+(流式细胞术)
NC计数和活力百分比用于过程监测。使用％CD4-CD8+确定CD8+细胞是否需要进行免疫磁耗竭(条件性步骤S-1)。％CD4-CD8+细胞群代表>10％的培养扩增的细胞。如果需要CD8耗竭，那么在第14天收集后执行条件性步骤S-1(步骤13)。
步骤13：收集(第14天)
输入：收集前第14天，采样
输出：T-Reg收集
采样之后，将气体可渗透性扩增(100M)系统中剩下的250mL体积转移到500mL锥形管中，冲洗气体可渗透性扩增瓶以优化细胞回收，并用输注缓冲液(含0.5％HSA的血浆-电解质A)使体积达到400mL。将500mL锥形管在室温下以400×g离心两次，持续10分钟，以用含0.5％HSA的血浆-电解质A洗涤细胞，并在15mL锥形管中用含有0.5％HSA的血浆-电解质A使细胞悬浮液的体积达到10mL，以去除珠(步骤14)。
条件性步骤S-1：CD8耗竭
输入：收集的T-Reg
输出：CD8耗竭后
如果步骤12采样的％CD4-CD8+流式细胞仪结果指示CD4-CD8+细胞群代表>10％的培养扩增的细胞，则执行CD8耗竭。对于CD8耗竭，将收集的T-Reg与Miltenyi CD8微珠在4至8℃和温和搅拌的条件下孵育15分钟，然后转移到Miltenyi LS柱，然后使用MidiMACS装置进行免疫磁选择。该输出——CD8耗竭后进行采样用于：
·有核细胞(NC)计数
·活力百分比
·％CD4-CD8+(流式细胞术)
第14步：洗涤和去除CD3/CD28珠(第14天)
输入：收集第14天
输出：去珠、收集的T-Reg
将含有收集的T-Reg细胞悬浮液的15mL锥形管置于Dynal MPC-1磁体中2分钟。在释放磁体(“去珠#1”)前，将上清液(含有细胞，无CD3/CD28珠)采集在另一个15mL锥形管中。一旦磁体被释放，将剩下的珠和细胞重新悬浮于2mL含0.5％HSA的血浆-电解质A中，并置于Dynal MPC-1磁体中2分钟；将上清液采集并转移到“去珠#1”管中。然后将“去珠#1”管置于Dynal MPC-1磁体中2分钟，并在释放磁体(“去珠#2”)前将上清液采集在另一个15mL锥形管中。对体积约为17mL的“去珠#2”管中的细胞悬浮液进行采样用于：
·有核细胞(NC)计数
·活力百分比(台盼蓝)
·％CD4-CD8+(流式细胞术)
·％CD4+CD25+(流式细胞术)
·活力百分比(7-AAD，流式细胞术)
·剩余珠
该步骤的输出物——去珠、收集的T-Reg是活性物质(原料药)。有核细胞(NC)计数和活力百分比(台盼蓝)用于过程监测。％CD4-CD8+(流式细胞术；释放标准为≤10％)、％CD4+CD25+(流式细胞术；释放标准为≥60％)、活力百分比(7-AAD染料排除在外)和剩余珠测定(释放标准为每3×106个有核细胞少于100粒珠)用于最终产物的快速释放。
步骤15：配制和包装(第14天)
输入：去珠、收集的T-Reg
输出：T-Reg最终产物
将去珠、收集的T-Reg从15mL锥形管转移到300mL转移包中。锥形管用10mL血浆-电解质A+0.5％HSA冲洗，并将冲洗液添加到300mL转移包中。使转移包中的细胞悬液的体积达到约54mL，并进行采样用于：
·革兰氏染色剂
·内毒素
·无菌性
革兰氏染色剂(用光学显微镜；“无可见生物体”和内毒素(使用安度斯生物有限公司(Endosafe)PTS系统；释放标准<5EU/mL)的结果可用于最终产物的快速释放。此时间点的无菌性检验结果不可用于快速释放，但第11/12天时间点的无菌性检验的中期结果用于快速释放。
在采样后，通过密封移除附接于转移包的转移装置。采样后，最终产物容器中细胞悬浮液(最终产物)的体积为约50mL。
这些生产步骤也总结在下表中，其呈现了生产工艺的流程图(表1)和条件性CD8细胞消耗步骤的流程图(表2)，该生产工艺到最终配制是连续的，而没有为中间(in-process/intermediate)产物或活性物质明确保留步骤。因为该工艺从导致活性物质(DS)的生产到最终产物(DP)的最终配制和包装的步骤是连续的，所以示出了DS和DP两者的生产。
表1
Figure BDA0003615864090000251
Figure BDA0003615864090000261
Figure BDA0003615864090000271
Figure BDA0003615864090000281
*报告快速释放
Figure BDA0003615864090000282
*报告快速释放
用于活化的调节性T细胞冻存的方法
本文提供了用于冻存离体扩增的人Treg细胞群(例如，活化人Treg细胞)的方法。
在一些实施例中，一种用于冻存从至少一个冻存的人脐带血单位产生的扩增的活化人调节性T(Treg)细胞群的方法包含：a)解冻冻存的人脐带血单位；b)在功能封闭的系统中稀释和洗涤解冻的脐带血单位；c)基于CD25+细胞表面表达使用双重选择方法分离天然存在的Treg细胞；d)在气体可渗透性培养器皿内的培养基中，在存在有效量的白介素-2(IL-2)和与CD3和CD28特异性结合的试剂的情况下离体扩增所分离的CD25+Treg细胞多达14天，其中培养基约每48小时更换一次，以产生活化CD25+Treg细胞群；e)从培养基收集活化CD25+细胞以产生扩增的活化人Treg细胞群；和f)冻存扩增的活化人Treg细胞群。
在一些实施例中，该方法还包含基于步骤e)和步骤f)之间定义的标准释放活化培养的人Treg细胞供临床使用。
本领域已知的任何合适的冻存工艺都可用于本文所述的方法。例如，扩增的人Treg细胞群可通过使用包含二甲亚砜(DMSO)的冷冻混合物并随后将其置于具有特定程序的控速冷冻器中来冻存扩增的人Treg细胞群。该冻存产物可以在-180℃下储存至少几个月。如体外细胞抑制测定(图8A至8C)以及不同动物模型中的体内数据(图9A至9B)所证明的，在解冻冻存的产物后，Treg细胞可以保持其细胞表面和具有FOXP3(叉头框P3)和Helios的高表达的细胞内表型，并保留其抑制功能。
在一些实施例中，在每毫升约10×106个细胞的浓度下，每5ml小瓶可冷存多达约50×106个细胞。在一些实施例中，可将约100×106个细胞至约1×108个细胞以高达10ml至100ml的体积冻存在单个冷冻袋中。
在一些实施例中，为了冻存的目的，可以将所收集的扩增的人Treg细胞群在4℃的温度下以400g离心10分钟。总细胞数可以使用自动细胞计数器进行计算，且冷冻管的数量可以通过将总细胞数除以50×106个细胞进行估算。随后，使用冷冻储备溶液每5ml冷冻管可冻存多达50×106个细胞，其中冷冻储备溶液包含含5％或10％二甲亚砜(DMSO)
Figure BDA0003615864090000291
的预配制溶液。当细胞进行离心时，打开控速冷冻器，一旦控速冷冻器达到适当的起始温度，就会出现“程序等待用户-点击此处继续”的指令。一旦与冷冻储备溶液混合，最多容纳50×106个细胞的冷冻管置于使用冷冻算法的控速冷冻器中，以进行细胞的按步冷冻，从而避免细胞死亡并保持细胞功能。在冷冻程序完成后，将冷冻管从控速冷冻器中取出并放置在低至-190℃的液氮低温冷冻器中以进行长期冻存。
扩增的Treg细胞群可以冻存成几个等分试样以产生合适的临床剂量用于治疗性施用。
调节性T细胞群和药物组合物
本文公开了通过本文所述的方法产生的人Treg细胞群。这些群适于异基因细胞疗法用途。在一些方面，人Treg细胞具有免疫抑制性。
在一些实施例中，人Treg细胞群对CD4和CD25呈阳性。在一些实施例中，人Treg细胞群对CD3、CD4和CD25呈阳性。在一些实施例中，人Treg细胞群对CD3、CD4、CD25、CD45RO、CD45RA、CD95和CD28呈阳性。
本文提供了至少约60％CD4+CD25+且小于或等于约10％CD4-CD8+的人Treg细胞群。在一些实施例中，至少约60％CD4+CD25+且小于或等于约10％CD4-CD8+的人Treg细胞群进一步共表达CD45RA和CD45RO。
在一些实施例中，人Treg细胞群为至少约90％CXCR4+。在一些实施例中，人Treg细胞群为至少约95％CXCR4+、至少约95％CD45RA+和至少约80％CD45RO+。在一些实施例中，人Treg细胞群为至少约95％CXCR4+、至少约95％CD45RA+、至少约80％CD45RO+、至少约95％CD95+、至少约95％HLADR+、至少约95％α4β7+、至少约15％CXCR3hi+、至少95％CCR6+、至少约95％CD54+、至少约95％CD11A+、至少约85％CD45RARO+、至少约80％CTLA4+、至少约80％GPR83+和至少约80％CD62L+。在一些实施例中，此类细胞表面标记的表达通过流式细胞术进行测定。在一些实施例中，已对人Treg细胞群离体扩增。
在一些实施例中，人Treg细胞群包含具有CD4+CD25+CD127loFOXP3hi表型并显示CD45RA+CD45RO+的额外共表达的人Treg细胞。在一些实施例中，人Treg细胞群包含具有CD4+CD25+CD127-FoxP3hi和Helios+表型的人Treg细胞。在一些实施例中，活化人Treg的扩展表型为：α4β7hiCCR3loCCR4hiCCR6hiCCR7hiCD103loCD11ahiCD137loCD28hiCD31+CD39loCD54hiCD62LhiCD7hiCD95hiCXCR3loCXCR4hiHLA-ABChiHLADRhiPD1loPD-LIlo和细胞内CD154hiFOXP3hiHelioshiGITRhiRORγtloTbetlo。在一些实施例中，嗜神经性人Treg群具有CD95/CXCR4/CD31/CD39hi/CTLA4/HELIOS/CXCR3/CD28表型。
在一些实施例中，人Treg细胞群的流式细胞术表型≥约60％CD4+CD25+Treg细胞并<约10％CD4-CD8+T细胞毒性/抑制细胞。
在一些实施例中，人Treg细胞群包含表现出FOXP3的高表达和RORγt的低表达的人Treg细胞。在一些实施例中，人Treg细胞群包含在应激条件下不分泌IL-17或表现出RORγT的人Treg细胞。在一些实施例中，人Treg细胞群包含保持其多克隆T细胞受体Vβ(TCR Vβ)谱型的人Treg细胞。在一些实施例中，人Treg细胞群在使用之前冻存。
在一些实施例中，人Treg细胞群表达细胞内Helios。在一些实施例中，通过本文公开的方法产生的人Treg细胞在应激条件下保持其免疫抑制功能和表型。在一些实施例中，通过本文公开的方法产生的人Treg细胞在存在类固醇(例如，地塞米松、强的松(prednisone)或泼尼松龙(prednisolone))的情况下保持其活力和抑制功能。在一些实施例中，通过本文公开的方法产生的人Treg细胞抵抗白介素-17(IL-17)分泌，并且由于它们的表观遗传特征和本文描述的选择/扩增方案的性质，与外周血Treg相比，其“翻转”成促炎TH17细胞的可能性要小得多。
本文所述的群中的Treg细胞的目标生物活性是免疫抑制功能，其可以通过使用CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)的细胞内染色染料或CellTraceTMViolet染料的体外抑制测定来测定。在该测定中，将Treg细胞与正常外周血T反应(Tresp)细胞以各种比共培养，并使用流式细胞术方法检测增殖细胞以检测CFSE的细胞内染料或CellTraceTMViolet的掺入，这能够跟踪多达8次细胞分裂的细胞增殖。Treg细胞对T反应(Tresp)细胞的抑制程度可以关于Treg细胞与Tresp细胞的比和分裂细胞的生成来定量。如果存在Treg细胞的有效抑制，则与Treg与Tresp细胞的较低比相比，在Treg与Tresp细胞的比较高时，第一代分裂反应细胞内的抑制作用更大。在一些实施例中，当Treg：Tcon比为4：1，当Treg细胞抑制至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的增殖常规T(Tcon)细胞时，本文所述群中的Treg细胞被认为具有免疫抑制性。
在一些实施例中，人Treg细胞群表现出旁分泌功能，如增加抑制性细胞因子白介素-10(IL-10)的产生，但不增加转化生长因子β(TGFβ)的产生。在一些实施例中，人Treg细胞群响应于IL-6治疗而分泌粒酶B(参见例如，图25)。
本文提供了一种人Treg细胞群，其包含至少约1×108个人Treg细胞，这些人Treg细胞为：(i)≥60％CD4+CD25+；和(ii)≤10％CD4-CD8+；其中人Treg细胞具有免疫抑制性。本文还提供了一种人Treg细胞群，其包含至少约1×108个人Treg细胞，这些人Treg细胞为：(i)≥60％CD4+CD25+；(ii)≥60％CD4+CD25+CXCR4+；和(iii)≤10％CD4-CD8+；其中人Treg细胞具有免疫抑制性。本文还提供了一种人Treg细胞群，其包含至少约1×108个人Treg细胞，这些人Treg细胞为：(i)≥60％CD4+CD25+；(ii)≥60％CD4+CD25+α4β7+；和(iii)≤10％CD4-CD8+；其中人Treg细胞具有免疫抑制性。本文还提供了一种人Treg细胞群，其包含至少约1×108个人Treg细胞，这些人Treg细胞为：(i)≥60％CD4+CD25+；(ii)≥60％CD4+CD25+CD11a+；和(iii)≤10％CD4-CD8+；其中人Treg细胞具有免疫抑制性。在一些实施例中，本文公开的人Treg细胞群包含至少约1×109个人Treg细胞或至少约1×1010个人Treg细胞。在一些实施例中，本文公开的人Treg细胞群包含约1×108至1×1010、约1×108至1×109或约1×109至1×1010个人Treg细胞。
在一些实施例中，将人Treg细胞群配制为新鲜的单剂量产物(例如，CK0801)。CK0801产物由脐带血产生，该脐带血对于施用该产物的受试者至少3/6HLA(人白细胞抗原)匹配(例如，3/6、4/6、5/6或6/6HLA匹配)。CK0801产物以单次输注的形式以基于受试者体重的剂量施用于受试者。该产物包含免疫抑制性Treg细胞。
在一些实施例中，通过CD25+选择且在培养14天后分离CK0801产物。在一些实施例中，CK0801产物的释放标准为(i)≥60％CD4+CD25+(T调节性表型)；和(ii)≤10％CD4-CD8+(T细胞毒性/抑制表型)。在一些实施例中，将CK0801产物施用于受试者以治疗炎性骨髓疾病或格林-巴利综合征。
在一些实施例中，将人Treg细胞群配制为冻存和/或多剂量产物(例如，CK0802、CK0802.CXCR4、CK0802.α4β7或CK0802.CD11a)。在一些实施例中，将CK0802、CK0802.CXCR4、CK0802.α4β7或CK0802.CD11a在含有10％二甲基亚砜(DMSO)的不溶性冻存培养基中配制。CK0802、CK0802.CXCR4、CK0802.α4β7或CK0802.CD11a对于施用该产物的受试者HLA不匹配。在一些实施例中，这些产物对于施用该产物的受试者2/6、1/6个或0/6HLA匹配。将这些产物中的每一种产物都以固定剂量以多剂量输注的方式施用于受试者。这些产物包含免疫抑制性Treg细胞。
在一些实施例中，通过CD25+选择且在培养14天后分离CK0802产物。在一些实施例中，CK0802产物的释放标准为(i)100×106个Treg/10mL袋(10×106Treg/ml)；(ii)≥60％CD4+CD25+(T调节性表型)；和(iii)≤10％CD4-CD8+(T细胞毒性/抑制表型)。在一些实施例中，将CK0802产物施用于受试者以治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)(例如，CoV-ARDS)或细胞因子释放综合征(CRS)(例如，由于嵌合抗原受体T细胞疗法引起的CRS)。在一些实施例中，将CK0802产物在第0、3和7天施用于受试者。
在一些实施例中，通过CD25+选择和对CXCR4的额外富集在培养10至12天后分离CK0802.CXCR4产物。在一些实施例中，CK0802.CXCR4产物的释放标准为(i)100×106个Treg/10mL袋(10×106个Treg/ml)；(ii)≥60％CD4+CD25+(T调节性表型)；(iii)≥60％CD4+CD25+CXCR4+(骨髓归巢亚型)；和(iv)≤10％CD4-CD8+(T细胞毒性/抑制表型)。在一些实施例中，将CK0802.CXCR4产物施用于受试者以治疗骨髓纤维化、再生障碍性贫血或免疫性血小板减少。在一些实施例中，将CK0802.CXCR4产物每月施用于受试者一次，最多6个月。
在一些实施例中，通过CD25+选择和对α4β7的额外富集在培养8至10天后分离CK0802.α4β7产物。在一些实施例中，CK0802.α4β7产物的释放标准为(i)100×106个Tregs/10mL袋(10×106个Treg/ml)；(ii)≥60％CD4+CD25+(T调节性表型)；(iii)≥60％CD4+CD25+α4β7+(胃肠归巢亚型)；和(iv)≤10％CD4-CD8+(T细胞毒性/抑制表型)。在一些实施例中，将CK0802.α4β7产物施用于受试者以治疗胃肠移植物抗宿主疾病或炎性肠病。
在一些实施例中，CK0802.α4β7产物以以下给药方案施用于受试者：(i)诱导：每周一次，最多4周；和(ii)保持：每月一次，最多6个月。
在一些实施例中，通过CD25+选择和对CD11a的额外富集在培养8至10天后分离CK0802.CD11a产物。在一些实施例中，CK0802.CD11a产物的释放标准为(i)100×106个Tregs/10mL袋(10×106个Treg/ml)；(ii)≥60％CD4+CD25+(T调节性表型)；(iii)≥60％CD4+CD25+CD11a+(神经元归巢亚型)；和(iv)≤10％CD4-CD8+(T细胞毒性/抑制表型)。在一些实施例中，将CK0802.CD11a产物施用于受试者以治疗肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化或脱髓鞘性神经病。在一些实施例中，CK0802.CD11a产物以以下给药方案施用于受试者：(i)诱导：每周一次，最多4周；和(ii)保持：每月一次，最多6个月。
图29和图30提供了各种人Treg细胞群的脐带血单位选择标准。
CK0802的细胞起始材料是来自正常的、健康的非亲缘供体的单个单位的脐带血(CBU)。临床相关Treg细胞剂量的产生包含具有CD4+CD25+表型的Treg细胞的离体富集和扩增。在一些实施例中，14天生产过程会导致CD4+CD25+Treg群扩增50倍或更多倍。可通过单次扩增方法生产旨用于不同受体的多个剂量。在运送到临床试验机构进行输注之前，对Treg细胞进行收集、冻存、检验并释放供临床使用。
CK0802是多克隆的，具有V-β谱型的广泛代表性和细胞内FOXP3染色的高度代表性。CK0802还与TSDR(Treg特异性脱甲基化区)的持续低甲基化相关联，这在天然存在的人Treg中很常见。
在一些实施例中，CK0802活性药物物质(DS)是一种由有核脐带血细胞组成的液体细胞悬浮液，其中≥60％的有核脐带血细胞具有调节性T细胞表型(CD3+CD4+CD25+)，并且<10％的有核脐带血细胞具有T细胞毒性/抑制细胞表型(CD3+CD4-CD8+)。在一些实施例中，CK0802最终药品(DP)是活细胞的悬浮液，其包含以10×106个Treg细胞/mL的细胞浓度悬浮在含有10％二甲亚砜(DMSO)的可输注冻存培养基中的CK0802活性原料药。
表2提供了CK0802药品的组成的实例。
表2
Figure BDA0003615864090000331
Figure BDA0003615864090000341
本文进一步公开了药物组合物，其包含活化的人Treg细胞群和一种或多种药学上或兽医学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或媒介物。
术语“药学上可接受的”和“兽医学上可接受的”是指药学上或兽医学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。在与药物制剂的其它成分相容的意义上，每种组分必须是“药学上可接受的”或“兽医学上可接受的”。它还必须适用于与人和动物的组织或器官接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其它问题或并发症，并与合理的收益/风险比相称。(参见Remington：《药学科学与实践(The Science and Practice of Pharmacy)》第21版；利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)：宾夕法尼亚州费城(Philadelphia,PA)，2005；《药物赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)》，第5版；Rowe等人,编辑，医药出版社和美国医药协会(The Pharmaceutical Press and the AmericanPharmaceutical Association):2005；和《药物添加剂手册(Handbook of PharmaceuticalAdditives)》第3版；Ash和Ash编辑，高尔出版公司(Gower Publishing Company)：2007；《药物预制剂和制剂(Pharmaceutical Pre-formulation and Formulation)》，Gibson编辑，CRC出版社(CRC Press LLC)：佛罗里达州博卡拉顿(Boca Raton,FL)，2004))。
本公开的药物组合物被配制为与其预期的施用途径(即眼内施用、视网膜下施用、肠胃外施用、静脉内施用、动脉内施用、皮内施用、皮下施用、口腔内施用、吸入施用、透皮施用、局部施用、经粘膜施用、腹腔内施用或胸膜内施用和/或直肠施用)相容。
应当理解，根据本公开的治疗实体的施用将与合适的载体、赋形剂和其它剂类一起施用，这些载体、赋形剂和其它剂类被掺入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受性等。许多合适的制剂可以在所有药物化学家已知的处方集中找到：雷明顿药物科学(Remington'spharmaceutical sciences)(第15版,麦克出版公司(Mack Publishing Company),宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,PA)(1975))，特别是在其中由Blaug、Seymour撰写的第87章。这些制剂包括，例如，粉末、糊剂、软膏、胶冻、蜡、油、脂质、含有囊泡(如LipofectinTM)的脂质(阳离子脂质或阴离子脂质)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳液碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。前述混合物中的任一种混合物可能适用于根据本公开的治疗和疗法，条件是制剂中的活性成分没有被制剂灭活并且制剂在生理上与施用途径相容且可耐受。也参见Baldrick P."药物赋形剂开发：临床前指导的必要性(Pharmaceutical excipient development:the need for preclinicalguidance.)"《监管毒理学和药理学(Regul.Toxicol Pharmacol.)》32(2):210-8(2000),Wang W.“固体蛋白质药物的冻干和开发(Lyophilization and development of solidprotein pharmaceuticals.)”《国际制药学杂志(Int.J.Pharm.)》203(1-2):1-60(2000)，Charman WN“脂质、亲脂性药物和口服药物递送——一些新兴概念(Lipids，lipophilicdrugs，and oral drug delivery-some emerging concepts)”。《药物科学杂志(J Pharm Sci.)》89(8):967-78(2000)，Powell等人“肠胃外制剂用赋形剂纲要”《PDA医药科技杂志(PDA J Pharm Sci Technol.)》52:238-311(1998)和其中关于药物化学家熟知的制剂/赋形剂和载体的其它信息的引文。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性)或分散液和用于临时制备细胞的无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述组合物必须为无菌的且流动性应达到存在易注射性的程度。其在制造及存储条件下必须稳定，且必须保藏以防诸如细菌及真菌的微生物的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物。适当流动性可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、通过在分散液的情况下维持所需粒度及通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的预防可通过各种抗菌剂及抗真菌剂实现，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞及其类似物。在一些实施例中，期望在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性物质根据需要与上文列举的成分中的一种成分或其组合一起掺入适当的溶剂中，接着过滤灭菌来制备。一般来说，分散液通过将活性化合物并入含有碱性分散介质及来自以上所列举那些的成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何额外期望成分的粉末。
在一些实施例中，活性物质是用载体制备的，这些载体将保护化合物不被迅速从体内清除，例如控释制剂，包括植入物和微胶囊递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。这些材料也可以从阿尔扎公司(AlzaCorporation)和新星制药有限公司(Nova Pharmaceuticals,Inc.)商购获得。脂质体悬浮液(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些脂质体悬浮液可根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利第4,522,811号中所述。
如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待接受治疗的受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有预定量的活性物质，经计算与所需的药物载体结合产生所期望的治疗效果。本公开的剂量单位形式的规格由活性化合物的独特特性和待实现的特定治疗效果以及混合此类活性化合物用于治疗个体的领域中固有的限制来规定且直接取决于这些独特特性和待实现的特定治疗效果以及固有的限制。
最终产物组合物(其由悬浮于赋形剂中的活性物质组成)的一个实例示于下表中。在一些实施例中，最终剂型的体积为约50mL至约100mL。在一些实施例中，最终产物的细胞组分由脐带血来源的单核细胞组成，这些单核细胞主要是具有CD4+CD25+表型的调节性T细胞，其是从单个脐带血单位或多个汇集的脐带血单位培养扩增而来。
表3
Figure BDA0003615864090000371
*中间产物和最终产物样品中的总有核细胞通过使用血细胞计数器和光学显微镜的常规手动方法计算，并且结果表示为每体积有核细胞，并且使用产物的体积进行计算，以表示产物中总有核细胞的含量。
在一些实施例中，将最终配制产物容纳在密封的300mL聚氯乙烯(PVC)塑料血袋中供使用。该袋具有端口，该端口可以用于患者施用的常规静脉(IV)施用装置的塑料针头进入。
在一些实施例中，用于配制最终产物的赋形剂可包括以下赋形剂：
表4
Figure BDA0003615864090000372
在一些实施例中，组合物包含通过本文所述的方法产生的活化人Treg细胞群和一种或多种其它治疗剂。本文还提供了用于治疗一种或多种自身免疫疾病、病症或病状的试剂盒，其包含本文所述的组合物(例如，在容器、包或分配器中)以及使用或施用说明书。还提供了生产制品，其包括含有本文所述的任何活化的人Treg细胞群的容器和使用说明书。
治疗方法和治疗用途
本文提供了用于在对其有需要受试者中治疗疾病、病症或病状的方法，其包括向受试者施用有效量的通过本文所述的任何方法产生的人Treg细胞(例如，活化人Treg细胞)群。本文还提供了用于在对其有需要的受试者中治疗疾病、病症或病状的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的人Treg细胞群。在一些实施例中，该疾病、病症或病状是自身免疫性疾病、病症或病状。在一些实施例中，该疾病、病症或病状是炎性疾病、病症或病状。该疾病、病症或病状是移植物抗宿主疾病(GVHD)、炎性肠病、骨髓衰竭(例如，再生障碍性贫血、原发性骨髓纤维化或骨髓增生异常综合征)、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性癌症(例如，多发性骨髓瘤或炎性乳腺癌)、神经炎性病症(例如，格林-巴利综合征、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、多发性硬化症或脱髓鞘性神经病)、细胞因子释放综合征(CRS)或免疫缺陷综合征(例如，iPEX(免疫调节多发性内分泌病X-连锁肠病))。在一些实施例中，该疾病、病症或病状是与严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染相关联的呼吸系统疾病、病症或病状。在一些实施例中，该疾病、病症或病状是COVID-19(冠状病毒疾病)介导的急性呼吸窘迫综合征(CoV-ARDS)。
在一些实施例中，人Treg细胞群由一个或多个与预期受体匹配的人白细胞抗原(HLA)的脐带血单位产生。在一些实施例中，人Treg细胞群由一个或多个与预期受体HLA不匹配的脐带血单位产生。在一些实施例中，人Treg细胞群由一个或多个与受试者相容的血型的脐带血单位制备。
在一些实施例中，脐带血来源的Treg可以表现出一种或多种以下特性以产生抗炎作用：1)与受体抗原呈递细胞(APC)直接接合并且阻断与T效应细胞(Teff)的相互作用(即，通过直接相互作用抑制促炎性免疫细胞)；2)抑制细胞因子的释放，包括转化生长因子β(TGFβ)、白介素-10(IL-10)和白介素-35(IL-35)；3)Teff的IL-2供应的耗竭导致其凋亡；和/或4)在颗粒酶/穿孔素产生中起作用(即，通过分泌颗粒酶B或穿孔素，从而导致天然杀伤(NK)细胞和CD8+T细胞死亡)。此外，输注的脐带血来源的Treg在炎症部位的局部增殖可赋予存活优势并产生疾病控制所必需的抗炎作用。
最终产物中的Treg细胞剂量可以表示为每千克受试者体重的细胞数。对用于本文所述的任何方法的合适的细胞剂量的确定在本领域技术人员的常规水平内。在一些实施例中，活化人Treg细胞群的有效量在约1×105和约1×108个Treg细胞/kg受试者体重之间或在约1×106和约1×107个Treg细胞/kg受试者体重之间。在一些实施例中，用于本文所述的任何方法的细胞剂量可以为：
剂量水平1：约1×106个Treg细胞/kg
剂量水平2：约3×106个Treg细胞/kg
剂量水平3：约1×107个Treg细胞/kg
在一些实施例中，可以施用不依赖于受试者体重的固定剂量。在一些实施例中，剂量可以在约1×108个活化人Treg细胞和约3×108个Treg细胞之间。例如，剂量可以是约1×108、约3×108或约1×109个活化人Treg细胞。
在一些实施例中，将有效量的活化人Treg细胞群静脉内施用于受试者。
在一些实施例中，将单剂量的有效量的人Treg细胞群施用于受试者。在一些实施例中，将多剂量有效量的活化人Treg细胞群施用于受试者。在一些实施例中，可以施用高达10次(即2、3、4、5、6、7、8、9或10)或更多次重复剂量的Treg细胞。如果施用多个剂量，则这些剂量可以以规律的间隔施用(即，每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每2周、每3周、每4周、每5周、每6周、每1至2周、每1至3周、每1至4周、每1至5周、每1至6周、每2至3周、每2至4周、每2至5周、每2至6周、每3至4周、每3至5周、每3至6周、每4至5周、每4至6周或每5至6周)。在一些实施例中，约每4至6周将这些剂量施用于受试者。在一些实施例中，Treg细胞可以每周施用一次，持续四周，然后每月施用一次，持续至少6至9(即，6、7、8或9)个月。
在一些实施例中，在施用有效量的活化人Treg细胞群之后，受试者中的循环炎性细胞因子水平与施用前受试者中的循环炎性细胞因子水平相比降低。在一些实施例中，循环炎性细胞因子是白介素-6(IL-6)、干扰素γ(IFNγ)或肿瘤坏死因子-α(TNFα)。
在一些实施例中，在治疗之前，检验受试者的血清生物标志物以确定受试者是否将对有效量的活化人Treg细胞群产生反应。在一些实施例中，在治疗之后，检验受试者的血清生物标志物以确定与临床反应的相关性。在一些实施例中，对血清生物标志物进行连续检验，以诊察是否需要用Treg细胞进行后续再治疗。
在一些实施例中，在施用有效量的活化人Treg细胞群之前，将苯海拉明(diphenhydramine)施用于受试者。在一些实施例中，施用约50mg苯海拉明。在一些实施例中，在施用有效量的活化的人Treg细胞群前约30分钟施用苯海拉明。
本文还提供了本文公开的人Treg细胞群在制备药剂中的用途。该药剂可用于治疗或预防疾病、病症或病状。
移植物抗宿主疾病(GVHD)
本文提供了一种用于在受试者中治疗或预防移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法，该方法包含向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化的人Treg细胞群或本文公开的人Treg细胞群或有效量的人Treg细胞群。
在一些实施例中，本文所述的方法在受试者中改善、减少或预防GVHD的一种或多种症状。在一些实施例中，本文所述的方法延长患有GVHD的受试者的存活期。在一些实施例中，本文所述的方法防止受试者在接受移植物后发生GVHD。
本文还提供了一种用于在受试者中治疗或预防GVHD的方法，该方法包含向受试者施用(i)有效量的通过本文公开的方法产生的活化的人Treg细胞群或本文公开的人Treg细胞群或有效量的人Treg细胞群和(ii)鲁索替尼。在一些实施例中，将鲁索替尼连续施用于受试者，并且每2、3或4周将人Treg细胞施用于受试者。在一些实施例中，鲁索替尼作为5mg、10mg、15mg、20mg或25mg片剂每日口服两次。
异基因造血干细胞移植(HSCT)是许多血液恶性肿瘤唯一的治疗选择。然而，更广泛使用该程序的主要障碍是GVHD的发展，当来自移植物的T细胞将宿主的组织识别为外来组织时发生GVHD，并且GVHD是发病率和死亡率的主要原因。(参见Warren等人,组织抗原(Tissue Antigens)81(4):183-93(2013)；Sung等人,《干细胞转化医学(Stem CellsTransl Med)》2(1):25-32(2013)；和Qian等人,《细胞和分子医学杂志(J Cell Mol Med)》17(8):966-75(2013))。急性GVHD(aGVHD)通常发生在HSCT后的前100天内，并涉及来自活化T细胞的“细胞因子风暴”，这些T细胞会动员其它炎性细胞类型，如NK细胞和巨噬细胞，从而引起如皮肤、肠道和肝脏等组织中的炎性病变。aGVHD引起大约15％的移植患者死亡。(参见Sung等人,《干细胞转化医学》2(1):25-32(2013)；和Qian等人,《细胞和分子医学杂志(JCell Mol Med)》17(8):966-75(2013))。慢性GVHD(cGVHD)发生在移植后的前100天后，其特征是影响多个器官，特别是肠道、肝脏、肺、骨髓、胸腺和皮肤的全身性炎症和组织破坏。cGVHD发生在30至65％的异基因HSCT受体中，引起极端发病率，5年死亡率为30至50％，主要是由于抗感染能力受损。aGVHD被认为主要是Th1/Th17驱动的过程，而cGVHD被认为主要由Th2驱动的反应驱动。在一些实施例中，本文所述的方法在受试者中改善、减少或预防aGVHD的一种或多种症状。在一些实施例中，本文所述的方法在受试者中改善、减少或预防cGVHD的一种或多种症状。在一些实施例中，本文所述的治疗方法可用于抑制GVHD而不丧失移植物抗白血病(GVL)活性的益处，GVL活性是杀死白血病细胞的异基因免疫细胞的有益免疫反应(参见Edinger等人,《自然·医学(Nat Med)》9(9):1144-50(2003))。
目前将GVHD降到最低的策略要求用药物如钙调磷酸酶抑制剂(CNI)、环孢菌素(cyclosporine)和他克莫司(tacrolimus)进行长期免疫抑制治疗。然而，这种延长的免疫抑制会导致免疫功能延迟，从而导致感染性并发症以及移植后淋巴组织增生病症的风险。在一些实施例中，本文提供了一种用于在受试者中治疗或预防GVHD的方法，该方法包括向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化的人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群，而不施用任何其它免疫抑制疗法。
GVHD的异种小鼠模型可用于评估脐带血来源的调节性T细胞在治疗GVHD中的功能。(参见Parmar等人,《细胞疗法》16(10:90-100(2013))。
骨髓衰竭综合征(BMF)
本文提供了一种用于在受试者中治疗或预防骨髓衰竭综合征(BMF)的方法，该方法包括向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群。在一些实施例中，施用有效量的新鲜单剂量Treg细胞产物(例如，CK0801)以治疗或预防BMF。
在一些实施例中，本文所述的方法在受试者中改善、减少或预防BMF的一种或多种症状。在一些实施例中，本文所述的方法延长患有BMF的受试者的存活期。
BMF是指一种或多种主要造血谱系产生的减少，其导致骨髓(BM)中造血前体的减少或缺乏。BMF可分为两类：获得性和遗传性。获得性BMF综合征包括再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征和原发性骨髓纤维化。获得性BMF综合征的发病机理涉及BM微环境以及环境因素。对于这些综合征中的绝大多数综合征，免疫功能障碍的作用被认为在BM缺陷的起源以及维护中都很重要。
再生障碍性贫血(AA)
本文提供了一种用于在受试者中治疗或预防再生障碍性贫血(AA)的方法，该方法包括向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群。
AA的特征在于外周血(PB)中的全血细胞减少和骨髓(BM)发育不全。AA是一种BMF综合征，其特征在于如CD8+细胞毒性T细胞、CD4+Th1细胞和Th17细胞等自身反应性细胞毒性T细胞对BM造血祖细胞的攻击。(参见Brodksy等人,《柳叶刀(Lancet)》365(9471):1647-56(2005)；Li等人,《肿瘤学血液学评述(Crit Rev Oncol Hematol)》75(2):79-93(2010)；Young等人,《血液学当前观点(Curr Opin Hematol)》15(3):162068(2008)；和de Latour等人,《血液(Blood)》116(20):4175-84(2010))。
免疫介导的造血破坏的机制包括给予如干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-2(IL-2)等抑制细胞因子的过量产生的Th1极化反应、T细胞群对自体CD34+细胞的直接毒性和Th17免疫反应。(参见de Latour等人,《血液》116(20):4175-84(2010)；Giannakoulas等人,《英国血液学杂志(Br J Haematol)》124(1):97-105(2004):Sloand等人,《血液》100(4):1185-91(2002)；和Solomou等人,《血液》107(10):3983-91(2006))。从这个意义上说，AA是一种特异性自身免疫性疾病，因为过度活跃的细胞毒性自身反应性T细胞结合有缺陷以及不足的调节性T细胞导致异常T细胞免疫稳态，并且BM是主要的靶器官。
本文还提供了一种在受试者中治疗获得性特发性再生障碍性贫血的方法，其中该受试者不适合进行匹配的同胞供体造血干细胞移植(MSD-HSCT)或被预测是对免疫抑制疗法(IST)的不敏感者。
获得性AA的诊断可基于排除其它可
引起全血细胞减少的病症和众所周知的Camitta标准。(参见Camitta等人,《血液》45(3):355-63(1975))。
如下表所示，AA反应标准(参见Killick等人,《英国血液学杂志》172(2):187-207(2016))可用于确定AA受试者对本文所述治疗方法的反应：
表5
Figure BDA0003615864090000431
骨髓增生异常综合征(MDS)
本文提供了一种用于在受试者中治疗或预防骨髓增生异常综合征(MDS)的方法，该方法包括向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群。
MDS的特征在于无效的造血，其中受损的血细胞产生可能是细胞凋亡增加的结果。逃避细胞凋亡的异常祖细胞的克隆性扩增可引起进化至显性急性白血病。(参见Rosenfeld，《白血病(Leukemia)》14(1):2-8(2000)和Barrett等人,《血液学论文集(SeminHematol)》37(1):15-29(2000))。免疫功能失调是MDS中公认的事实。(参见Fozza等人,《实验血液学(Exp Hematol)》37(8):947-55(2009))。在可能的机制中，T细胞介导的造血抑制已被认为是特别低风险和低细胞MDS的典型特征。(参见Epperson等人,《白血病研究(LeukRes)》25(12):1075-83(2001))。某些类型的MDS中的血细胞减少可能是由于正常和异常骨髓(BM)祖细胞的细胞因子或细胞介导的自身免疫抑制造成的。(参见Barrett等人,《血液学论文集》37(1):15-29(2000))。这些机制可能特别适用于低增生性形式的MDS(HMDS)(参见Tuzuner等人,《英国血液学杂志》91(3):612-17(1995))，其在临床上经常与再生障碍性贫血(AA)——一种具有确定的自身免疫发病机理的疾病同时发生。(参见Young等人,《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》336(19):1365-72(1997))。
MDS患者表现出CD4与CD8的比降低、多个活化CD8+T细胞克隆扩增以及抑制性细胞因子的过度产生。(参见Selleri等人,《癌症(Cancer)》95(9):1911-22(2002))。MDS患者的免疫效应机制可能不仅包括直接杀伤，还包括释放对造血祖细胞具有抑制活性的细胞因子，如干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和Fas-配体(Fas-L)。(参见zang等人,《血液》98(10):3058-65(2001))。与这些病理生理学途径一致，这些细胞因子水平的升高已在MDS患者的血液和骨髓方面进行了描述，并且可能是在这些患者中发现大量凋亡骨髓细胞的原因。(参见Selleri等人,《癌症》95(9):1911-22(2002))。
目前，MDS的诊断(参见Gangat等人,《美国血液学杂志(Am J Hematol)》91(1):76-89(2016))基于(i)持续(持续时间>6个月)且显著的血细胞减少、血红蛋白<10g/dL、绝对嗜中性细胞计数<1.8×109/L、血小板计数<100×109/L，(ii)显著骨髓发育不良或原始细胞过多或典型细胞遗传学异常和(iii)排除鉴别诊断的存在而确立。(参见Barrett等人,《血液学论文集》37(1):15-29(2000))。常见的外周血发现包括巨红细胞性贫血、网状细胞减少、中性粒细胞减少伴分叶过少中性粒细胞(伪Pelger–Huet(佩尔杰异常症血象))、循环未成熟髓样细胞、包括成髓细胞和血小板减少。
如下表所示，国际工作组(IWG)反应标准(参见Cheson等人,《血液》108(2):419-25(2006))可用于确定MDS受试者对本文所述的治疗方法的反应：
表6
Figure BDA0003615864090000451
原发性骨髓纤维化(PMF)
本文提供了一种用于在受试者中治疗或预防原发性骨髓纤维化(PMF)的方法，该方法包括向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群。在一些实施例中，施用于受试者以治疗或预防PMF的人Treg细胞群为至少约90％CXCR4+。
本文还提供了一种用于在受试者中治疗或预防PMF的方法，该方法包括向受试者施用(i)有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群和(ii)鲁索替尼。在一些实施例中，将鲁索替尼连续施用于受试者，并且每2、3或4周将人Treg细胞施用于受试者。在一些实施例中，鲁索替尼作为5mg、10mg、15mg、20mg或25mg片剂每日口服两次。
PMF是一种克隆性造血干细胞病症，其中50％的患者在Janus激酶(JAK)2基因——JAK2V617F中具有组成型激活突变。尽管PMF通常被认为是由突变的干细胞或造血祖细胞引起的，但免疫失调是常见的。例如，有炎性细胞因子的血浆水平升高以及自身免疫的临床和实验室表现。(参见《最新血液恶性肿瘤报告(Barosi Curr Hematol Malig Rep)》9(4):331-39(2014))。这种克隆性骨髓增生特征性地伴有反应性骨髓纤维化(骨髓纤维变性)和脾脏或多个器官中的髓外造血。
已知促炎细胞因子在PMF中处于非常高的水平并且有助于疾病的发病机理。事实上，用鲁索替尼治疗与包括IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α的循环水平的显著降低相关联。
PMF的诊断可以使用表7中列出的标准进行(参见Barbui等人,《血液癌症杂志(Blood Cancer Journal)8(2):15(2018)):
表7
Figure BDA0003615864090000461
如下表所示，修订的国际工作组-骨髓增生性肿瘤研究和治疗(IWG-MRT)和欧洲-白血病网络(ELN)反应标准(参见Tefferi等人,《血液》122(8):1395-98(2013))可用于确定PMF受试者对本文所述的治疗方法的反应：
表8
Figure BDA0003615864090000471
Figure BDA0003615864090000481
系统性红斑狼疮(SLE)
本文提供了一种用于在受试者中治疗或预防系统性红斑狼疮(SLE)的方法，该方法包括向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群。
在一些实施例中，本文所述的方法在受试者中改善、减少或预防SLE的一种或多种症状。在一些实施例中，在向受试者施用活化人Treg细胞后，白蛋白在尿液中的溢出减少；肾小球中SLE细胞浸润减少；和/或毛囊被保存。在一些实施例中，本文所述的方法延长患有SLE的受试者的存活期。
SLE是一种慢性、多系统、炎性自身免疫病症。狼疮会影响身体的许多部位，包括关节、皮肤、肾脏、心脏、肺、血管和/或大脑。例如，SLE可表现为关节痛或关节炎、雷诺现象、颧骨和其它皮疹、胸膜炎或心包炎、肾脏或CNS受累和/或血液学血细胞减少。
炎性癌症
本文提供了一种用于在受试者中治疗或预防炎性癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群。在一些实施例中，炎性癌症是多发性骨髓瘤或炎性乳腺癌。在一些实施例中，多发性骨髓瘤的治疗方案包含施用有效量的人Treg细胞群和施用可用于治疗炎性癌症的双特异性蛋白质(例如，抗体)。在一些实施例中，双特异性蛋白质是一种双特异性T细胞接合器。在一些实施例中，双特异性T细胞接合器与CD3和BCMA结合。
在一些实施例中，本文所述的方法在受试者中改善、减少或预防炎性癌症的一种或多种症状。在一些实施例中，本文所述的方法延长患有炎性癌症的受试者的存活期。
神经炎性病症
本文提供了一种用于在受试者中治疗或预防神经炎性病症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群。在一些实施例中，炎性癌症是格林-巴利综合征或肌萎缩性脊髓侧索硬化症。
在一些实施例中，本文所述的方法在受试者中改善、减少或预防神经炎性病症的一种或多种症状。在一些实施例中，本文所述的方法延长患有神经炎性病症的受试者的存活期。
格林-巴利综合征(GBS)
本文提供了一种用于在受试者中治疗或预防格林-巴利综合征(GBS)的方法，该方法包括向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群。
本文还提供了在受试者中治疗GBS的方法，其中该受试者对用静脉内免疫球蛋白(IVIG)或血浆置换的治疗没有反应。
GBS是一种自身免疫性疾病，其特征在于由于神经炎症引起的肌肉无力的发作。有两种主要亚型：(1)急性发炎性脱髓鞘多神经病(AIDP)和(2)急性轴突性神经病(AMAN)。尽管GBS的确切原因尚不清楚，但有强有力的证据表明，对感染的免疫反应会产生损害神经的自身免疫反应。
实验性自身免疫性神经炎(EAN)是外周神经系统的免疫介导的炎性脱髓鞘病症，其可作为AIDP的动物模型。本文所述的治疗方法可以在该动物模型中进行测试。通常通过用如P0或P2等髓鞘蛋白免疫而在易感动物品系中诱导，这些髓鞘蛋白引起血神经屏障的破坏、自身反应性T细胞和巨噬细胞的浸润和外周神经系统的脱髓鞘(Soliven,B，“自身免疫性神经病：来自动物模型的见解(Autoimmune neuropathies:insights from animalmodels.)”,《周围神经系统杂志(J Peripher Nerv Syst)》,2012。17增刊2：第28至33页)。EAN可用外周神经蛋白P0、P2和外周髓鞘蛋白22(PMP22)(Hughes,R.A.等人,“格林-巴利综合征的发病机制(Pathogenesis of Guillain-Barre syndrome)”《神经免疫学杂志(JNeuroimmunol)》,1999.100(1-2):第74至97页)的神经突生成表位或通过致敏T细胞的过继转移主动引发。
肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)
本文提供了一种用于在受试者中治疗或预防肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的方法，该方法包括向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞群或有效量的本文公开的人Treg细胞群(例如，1×108、3×108或1×109个活化人Treg细胞)。
在一些实施例中，本文提供了一种用于在受试者中治疗或预防神经炎性病症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的人Treg细胞群。
ALS是一种罕见的神经系统疾病，涉及控制随意肌的神经元的死亡。它导致严重的肌肉萎缩，丧失行走和说话的能力。该疾病的特征在于约80％的5年死亡率。自身免疫性神经炎症形成ALS发病机制和进展的基石。事实上，ALS患者表现出脊髓的炎症增强，并且小胶质细胞活化的程度与疾病的严重程度相对应。
在ALS中，Treg功能失调并且在抑制反应T淋巴细胞增殖方面不太有效。此外，晚期ALS的特征在于M1样巨噬细胞/小胶质细胞和促炎效应T细胞的浸润。ALS患者倾向于Treg(CD4+/CD25+)减少，并且进展速率与Treg细胞计数呈负相关。同样，低FoxP3 mRNA水平是快速ALS进展的预测因素。此外，与健康受试者相比，取自ALS患者的Treg的抑制Th17细胞增殖的能力降低。
COVID-19(冠状病毒疾病)介导的急性呼吸窘迫综合征(CoV-ARDS)
本文提供了一种用于在受试者中治疗或预防COVID-19(冠状病毒疾病)介导的急性呼吸窘迫综合征(CoV-ARDS)的方法，该方法包括向受试者施用有效量的通过本文公开的方法产生的活化人Treg细胞或有效量的本文公开的人Treg细胞群(例如，约1×108或约3×108活化的人Treg细胞)。在一些实施例中，在第0天和第3天约1×108或约3×108个活化的人Treg细胞施用于受试者。在一些实施例中，在第0天、第3天和第7天约1×108或约3×108个人Treg细胞施用于受试者。在一些实施例中，人Treg细胞是冻存的异基因、脐带血来源的Treg细胞(CK0802)。在一些实施例中，人Treg细胞作为单一剂施用。
在一些实施例中，受试者感染或疑似感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。
高致病性SARS-CoV-2与病毒快速复制、大量炎性细胞浸润和促炎细胞因子/趋化因子反应升高相关联，造成急性肺损伤，从而导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；肺纤维化和死亡。病毒感染的初始阶段包括强烈的病毒复制和临床症状，包括发烧、咳嗽等。病毒感染的第二阶段包括高烧、低氧血症、进展为肺炎样症状和病毒滴度在末期逐渐下降。病毒感染的第三阶段包括过度的宿主炎症反应、细胞因子和趋化因子的过度产生、先天免疫反应失调和ARDS。临床上，ARDS的特征在于急性低氧性呼吸衰竭和胸部X光片显示双侧肺部浸润。
在一些感染SARS-CoV-2的受试者中，不受控制的细胞因子风暴可能是导致呼吸道并发症的严重程度的原因。在一些实施例中，CoV-ARDS细胞因子风暴包括促炎细胞因子(例如，IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-12或TGFβ)和趋化因子(例如，CCL2、CXCL10、CXCL9和IL-8)的增加。较高的病毒滴度和失调的细胞因子/趋化因子反应协调炎性细胞大量浸润到肺中。在一些实施例中，CoV-ARDS细胞因子风暴包括抗炎细胞因子(例如，IL-10)的减少。在临床前肺损伤模型中，注射CB-Treg细胞导致：i)炎性T细胞减少；ii)肺泡出血减少；iii)肺上皮和肺泡的再生；和iv)炎性细胞因子包括IL-17和IL-6的减少，两者均涉及CoV-ARDS。
除了包括死亡率超过50％的机械通气在内的支持性护理外，不存在特效治疗。迫切需要新的治疗选择。调节性T细胞(Treg)是一种特殊类型的T细胞，其通过多种导致组织修复和再生的机制限制炎症诱导的肺损伤。
在一些实施例中，施用有效量的本文公开的人Treg细胞群可以通过消除炎症来治疗CoV-ARDS或CoV-ARDS的症状。在一些实施例中，施用本文公开的活化人Treg细胞群或有效量的活化人Treg细胞群可诱导抑制性细胞因子(例如，TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17、IL-18或IL-33)的释放。
在一些实施例中，在这些治疗方法中使用的人Treg细胞表达CCR4——一种肺组织的归巢标记，其负责转运至CoV-ARDS相关炎症位点。
所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指示通过引用以其整体并入的程度相同。
本文所述的任何方面和实施例都可与本文发明内容、附图和/或具体实施方式中公开的任何其它方面或实施例组合，包括本发明的以下具体的、非限制性的实例/实施例。
提出以下实例是为了向本领域普通技术人员提供如何制备和评价本文所述和要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，旨在纯粹是说明性的而非旨在限制本发明人视为其发明的范围。已努力确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但本文中应考虑一些误差和偏差。除非另有说明，否则份为重量份，温度为摄氏度或为环境温度，压力为大气压或接近大气压。
实例
实例1：从脐带血产生扩增的活化T-调节性细胞群
冻存的人脐带血单位(CBU)获自有资质的美国公共脐带血库。将CBU快速解冻。使用Sepax装置(生物安全公司)自动洗涤解冻的脐带血单位，起始体积设置为25ml；最终体积设置为100ml，稀释系数为1.0。使用的洗涤试剂是5％人血清白蛋白(HSA)(杰特贝林公司)和10％葡聚糖-40(D-40)(赫士睿公司)。洗涤后，将脐带血细胞采集到脐带血洗涤袋中。
出于洗涤的目的，碱性洗涤介质是20ml 25％HSA至1000ml PBS/EDTA缓冲液；并且工作洗涤介质为300ml碱性洗涤缓冲液，50mg氯化镁(MgCl2)和2500单位的DNase；然后改良的培养基是X-Vivo 15培养基(瑞士龙沙集团)和10ml GlutaMAX-1以及100ml解冻的人AB血清。在完成自动洗涤后，使用工作洗涤介质对洗涤后的脐带血细胞进行额外的手动洗涤；其中最终体积为200ml，重构的细胞在室温下以300g离心10分钟。最后，将洗涤后的细胞重新悬浮于0.09ml中总有核细胞(TNC)计数为100×106个细胞的浓度中。
随后，CD25微珠以每100×106TNC 0.02ml人CD25试剂的比添加。将细胞和微珠在4摄氏度一起孵育30分钟。在孵育步骤之后，将细胞转移到连接至MidiMACS装置的MiltenyiLS柱中，该装置通过使用磁体捕获抗CD25标记的细胞。免疫磁选择后，细胞从磁场中释放出来。
大约1×106个CD25+细胞用1％L-谷氨酰胺、10％人血清白蛋白(HSA)和白介素-2(IL-2，1000IU/mL)进行洗涤并悬浮于X-VIVO中。然后将该溶液与抗CD3/抗CD28珠以1:1的珠-细胞比进行混合。将混合物转移到膜表面积为10cm2的气体可渗透性培养器皿中，随后将培养物转移到膜表面积为100cm2的气体可渗透性培养器皿中，并孵育共14天，其中培养基每48小时更换一次，而不干扰细胞。14天后，收集细胞，并用磁性粒子浓缩器去除抗CD3/抗CD28珠。然后将细胞重新悬浮于最终培养基中。
在生产过程中的各个点对细胞进行采样，并且其特性示于表9中。
表9
Figure BDA0003615864090000521
TNC＝总有核细胞
如图1所示，通过上述方法产生的扩增的活化Treg细胞在室温(15至30℃)或4℃下储存时是稳定的。图1示出了基于流式细胞术的测定的结果，其中7-氨基放线菌素D(7AAD)——一种与DNA结合后会发生光谱偏移的荧光嵌入剂，用于评价活细胞，因为7AAD似乎通常被排除在活细胞之外。在存在1微升7AAD储备溶液的情况下，将细胞在冰上孵育30分钟。在孵育期后，尽快使用紫色和488nm的激发并使用440nm和670nm带通滤波器(或其近似等效物)测量荧光发射通过流式细胞术对染色的细胞进行分析。活细胞仅显示低水平的荧光。
在细胞培养开始时(第0天)以及细胞培养开始后第8天和第14天，通过流式细胞术测定扩增的活化Treg细胞的表型。结果示于表10中。
表10
Figure BDA0003615864090000531
N/A＝未做
扩增的活化Treg细胞具有抑制性，表现出70至96％的抑制，如图2A和图2B所示。如图4A至4D中所示，扩增的活化Treg细胞不表达RORγt并且显示响应于应激的IL-10表达的反增加。图4A示出了IL-6对Treg细胞的抑制活性没有影响。图4B示出了IL-6对Treg细胞的RORγ表达没有影响。图4C示出了IL-6对Treg细胞产生IL-17A没有影响。图4D示出了IL-6诱导Treg细胞产生增加的IL-10。图25示出了IL-6诱导Treg细胞产生粒酶B。此外，扩增的活化Treg细胞可通过HLA屏障而具有免疫抑制性(图3)。扩增的活化Treg显示T细胞受体Vβ谱型的高斯(多克隆)分布(图6)。
扩增的活化Treg细胞在存在类固醇的情况下保持抑制性。图7A和图7B示出了Treg细胞在存在地塞米松的情况下保持抑制性。强的松对Treg和Tcon细胞活力的影响如下所示。
表11
活细胞(无强的松) 活细胞(有强的松100μg/ml，持续72小时)
Treg 95％ 90.3％
Tcon 82％ 64.7％
在存在强的松的清洗下，Treg细胞保持抑制性，如下所示。
表12
Figure BDA0003615864090000541
实例2：来自脐带血的扩增的活化调节性T细胞群的冻存
通过实例1中描述的方法产生的扩增的活化Treg细胞按如下方式冻存。
每5ml小瓶以10×106个细胞/ml的浓度总共冻存50×106个细胞。将收集的扩增的活化人Treg细胞群在4℃的温度下以400g离心10分钟。使用自动细胞计数器计算总细胞数，并且通过将总细胞数除以50×106个细胞来估算冷冻管的数量。随后，使用冷冻储备溶液每5ml冷冻管冻存多达50×106个细胞，其中冷冻储备溶液由含有10％二甲亚砜(DMSO)的预配制溶液(Cryostor公司)组成。在细胞进行离心时，打开控速冷冻器，一旦控速冷冻器达到适当的启动温度，就会出现“程序等待用户-单击此处继续”的指令。一旦与冷冻储备溶液混合，将容纳多达50×106个细胞的冷冻管分别置于使用冷冻算法的控速冷冻器中，以对细胞进行按步冷冻以避免细胞死亡并保持细胞功能。冷冻程序完成后，将冷冻管从控速冷冻器中取出，置于-190℃的液氮低温冷冻器中进行长期冻存。
冻存的活化Treg细胞表现出一致的表型，并具有与新鲜的活化Treg细胞相似的免疫抑制能力(图8A至8C)。冻存的活化Treg细胞表现出Helios的高表达(图8B)和增殖的常规T细胞的抑制(图8C)。如实例3中进一步描述的，冻存和新鲜扩增的活化Treg细胞在预防或治疗移植物抗宿主疾病方面是相当的。
实例3：用脐带血来源的调节性T细胞对移植物抗宿主疾病的预防和治疗
使用移植物抗宿主疾病(GVHD)的异种小鼠模型来评估通过实例1和实例2中所述的方法产生的脐带血来源的调节性T细胞的功能。GVHD的模型描述于Parmar等人,《细胞疗法》16(10:90-100(2013))中。为了研究Treg对GVHD预防的效果，NOD/SCID IL-2Rγ缺失(NSG)小鼠(马萨诸塞州巴尔港的杰克逊实验室(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME))在注射1×107个Treg细胞前1天和静脉内输注1×107个人PBMC前2天接受亚致死全身辐射(300cGy，来自由加利福尼亚州圣费尔南多(San Fernando,CA)的J.L.Shepherd和Associates Mark I-25辐射器一分钟内发出的137Cs源)。使用临床GVHD评分系统对小鼠进行评价。(参见Reddy等人,《移植(Transplantation)》69(4):691-93(2000))。用新鲜脐带血来源的Treg和冻存的Treg治疗产生了的相当的GVHD评分(图9A)和对体重的影响(图9B)。
冻存的Treg的施用在异种小鼠模型中既预防也治疗GVHD。图10A描绘了用于监测单次Treg输注对GVHD预防的影响的研究设计。图10B描绘了用于监测多种Treg输注对GVHD治疗的影响的研究设计。如图11A至11B所示，施用活化Treg既可以预防也可以治疗GVHD。在PBMC输注后第14天，施用活化Treg抑制外周血中炎性细胞因子的水平(图12A至12F)。活化Treg分布到所治疗的小鼠的炎症部位(图13)。此外，活化Treg不干扰常规T细胞介导的抗白血病作用(图14)。
实例4：用冻存的脐带血来源的T细胞对系统性红斑狼疮的治疗
利用系统性红斑狼疮(SLE)的异种小鼠模型(Andrade等人,《关节炎和风湿病(Arthritis Rheum.)》2011年9月；63(9):2764–2773)，其中将来自系统性红斑狼疮的外周血单核细胞移植到非SCIDγ缺失(NSG)小鼠中。雌性Rag2-/-γc-/-小鼠在第0天通过静脉内注射移植了3×106个人SLE外周血单核细胞(PBMC)。让小鼠发生疾病，并且在移植后第30天，将它们分成2组：i)对照组和ii)治疗组。将1×107个离体扩增的、冻存的、异基因、非HLA匹配的CB Treg经尾静脉静脉内注射到SLE异种移植物中，每周一次，持续4周。进行连续抽血用于表型分析，细胞因子测定和抗双链(ds)DNA IgG抗体分析。对尿样进行连续检验以进行肌酸酐和白蛋白定量。在第13周计划安乐死时对所收集的器官进行组织病理学检查。
使用该SLE模型评估通过实例1和实例2中所描述的方法产生的脐带血来源的调节性T细胞的功能。如图15所示，SLE-PBMC移植后，单次注射活化Treg细胞降低了CD45+效应T细胞的水平持续9周。在第0天注射SLE-PBMC，从第+4周开始每周注射脐带血(CB)Treg。每周注射四次活化Treg细胞在SLE小鼠中提高了的存活率(图16A)并降低了抗双链DNA抗体(dsDNA Ig)的水平(图16B)。抗双链DNA抗体的存在是狼疮疾病活动的标志。Treg受体小鼠表现出体重增加和较低的GVHD评分。每周注射四次活化的Treg细胞在SLE小鼠中也降低的尿白蛋白水平(图17A)、降低了尿肌酸酐溢出(图17B)并改善了肾组织学(图18)。如图19所示，施用活化Treg在SLE小鼠中降低人sCD40L的浓度。此外，每周注射活化冻存的Treg导致循环CD8+效应T细胞的持续减少(图20A)以及CD8+效应T细胞在脾脏、骨髓、肺和肝脏中浸润的减少(图20B)。每组两个指数病例的组织病理学结果表明，与对照组相比，Treg受体小鼠在肾脏中显示出T细胞(CD3+)和B细胞(CD20+)的减少，以及肾小球和肾实质中的淋巴浸润的减少。
实例5：用新鲜脐带血来源的T细胞对多发性骨髓瘤的治疗
转板迁移测定
使用6.5mm 24孔转板，其带有8.0μm孔聚碳酸酯膜嵌入体(美国纽约州的康宁公司(Corning,Corning,NY,US))。使用CD3+微珠(美天旎生物科技公司(Miltenyi Biotec))分离T效应细胞(Teff)。萤火虫荧光素酶/GFP标记的MM1.S和野生型RPMI 8226细胞获自Orlowski实验室(MD安德森癌症中心(MDACC))。U266和HL-60细胞购自弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA)的美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection)。Nalm6细胞由血液病理学检验科(MDACC)提供。根据制造商的说明，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)(英杰公司(Invitrogen))对RPMI 8226和Nalm6细胞进行染色。靶细胞：GFP标记的MM1.S(3×105个细胞)；GFP标记的U266(3×105个细胞)；和CFSE染色的RPMI 8226(3×105个细胞)；或阴性对照GFP标记的HL-60(1.5×105个细胞)或CFSE染色的Nalm6(6×105个细胞)，分别重新悬浮于300μL培养基中并接种到转板的上区室中。将作用细胞CB Treg(1×106个细胞)或阳性对照CD3+Teff(1×106个细胞)重新悬浮于750μL培养基中并添加到下区室中。实验的示意图示于图40A中。使用流式细胞仪(BD FACSCantoTM)对迁移的靶细胞进行分析。
为了理解CB Treg细胞对骨髓瘤细胞贩运的影响，建立了转板实验，其中将靶细胞接种在转板的上区室中(图40A)。这些靶细胞是骨髓瘤细胞：GFP-MM1.S、GFP-U266或CFSE-RPMI 8226。此外，两种白血病细胞系用作阴性对照靶细胞：GFP-HL60(急性髓细胞白血病)或CFSE-Nalm6(前B白血病)。将作用细胞接种在下区室中，其为CB Treg细胞或作为阳性对照的Teff细胞。采取此类措施以分离CB Treg的骨髓瘤特异性作用。CB Treg能够阻止MM1.S(图40B；p<0.01)和RPMI 8226的迁移(图40C；p＝0.04)但不能阻止U266的迁移(图40D；p＝0.14)。未观察到CB Treg对包括HL-60(图40E)或Nalm6(图40F)的白血病细胞系的迁移模式的影响。
异种多发性骨髓瘤小鼠模型
使用多发性骨髓瘤的异种小鼠模型评估通过实例1和实例2中所描述的方法产生的脐带血来源的调节性T细胞的功能。非SCIDγ缺失雌性小鼠(马萨诸塞州巴尔港的杰克逊实验室)通过尾静脉静脉内注射萤火虫荧光素酶标记的MM1.S细胞(维吉尼亚州马纳萨斯的ATCC组织(ATCC,Manassas,VA))(3×106个细胞/小鼠)，注射或不注射1×107个离体扩增的CB Treg细胞。在注射MM1.S细胞前一天注射CB Treg细胞。随后如先前所述对小鼠进行成像(Parmar等人,《细胞疗法》,2014.16(1):第90至100页)。小鼠每周抽血一次。将血浆样品送至Eve Technologies(加拿大AB省卡尔加里(Calgary，AB，Canada))以测定小鼠细胞因子水平。用抗人CD45/APC(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))、抗人CD25/PE(美国BD公司(Becton Dickinson))、抗人CD38/APCeFluor780(赛默飞世尔科技公司)和抗小鼠CD45/太平洋蓝(Pacific Blue)(赛默飞世尔科技公司)对溶解的血液进行染色。通过BD FACSCantoTMII获取细胞。在安乐死时，收集骨髓和脾脏。
使用卡普兰一梅尔(Kaplan-Meier)法估算存活率，并且使用对数秩检验对各组进行比较。两组通过非配对学生t检验进行比较，三个或更多个平均值通过单向方差分析(ANOVA)进行比较，接着通过Bonferroni检验进行多重比较。数值表示为平均值和平均值的标准误差。P值<0.05被认为具有统计学显著性。所有统计分析和图的生成均使用GraphPadPrism7.0(加利福尼亚州圣地亚哥(Sandiego，CA))进行。
为了理解CB Treg对阻断骨髓瘤移植的影响，建立一种异种骨髓瘤小鼠模型，其中静脉内注射3×106个MM1.S细胞让肿瘤发展(对照组)。在治疗组中，在注射骨髓瘤细胞前一天注射CB Treg(1×107个细胞)。每周对小鼠称重两次，并且直到肿瘤接种后第3周，当“仅骨髓瘤”小鼠的重量下降可见并且在安乐死时显著差异明显时，两组的重量仍是相当的(图21A)。在外周血中对骨髓瘤负荷进行定量，其中观察到与差异在安乐死时变得统计学显著的Treg受体小鼠相比对照组中在第28天循环CD38+骨髓瘤细胞略微增加的类似的趋势(图21B；仅骨髓瘤：0.8％±0.3与骨髓瘤与Treg：12.4％±2.9，P＝0.002)。
使用非侵入性生物发光，每周对小鼠成像一次，并且在肿瘤接种后约3周在对照组中再次明显吸收了GFP标记的MM1.S细胞，并且到第4周变得广泛，而在CB Treg受体小鼠中检测到最小的发光(图21C)。在观察期间，肿瘤进展迅速，并且与对照组相比，CB Treg受体中通过BLI定量的肿瘤负荷增量显著延迟(图21D)。
由于骨髓瘤细胞在炎性肿瘤微环境中旺盛生长，并且白细胞介素-6(IL-6)已被认为是骨髓瘤疾病进展的主要驱动因素(Harmer等人,《内分泌学前沿(Front Endocrinol)》(洛桑市(Lausanne)),2018,9:第788页)，因此考察了CB Tregs对这种炎性细胞因子的影响。如图23所示，当测量到“仅骨髓瘤”组中血浆IL-6水平的显著升高并继续升高直到第5周时，在肿瘤接种后第4周，2组中的循环IL-6水平是相当的。最后，肿瘤负荷的增加以及炎症负荷的增加转化为“仅骨髓瘤”组中的死亡率，导致Treg受体小鼠的统计学显著存活优势(图22)。安乐死后，在收集的器官中对肿瘤细胞进行测定并在2组之间进行比较。与“仅骨髓瘤”组相比，在Treg受体小鼠的骨髓中几乎检测不到骨髓瘤细胞(图24A；0.6％±0.1与90.0％±2.2，P<0.0001)。在脾脏中也观察到类似的模式(图24B；骨髓瘤+Treg：1.3％±0.4与仅骨髓瘤：12.9％±4.2，P＝0.009)。
该数据支持这样的假设，即在注射骨髓瘤细胞之前单次注射CB Treg细胞给予它们足够的增殖优势，这能够抑制由骨髓瘤细胞在体内产生的炎症信号，如缺乏IL-6的产生所表明的那样，IL-6的产生最终转化为骨髓瘤移植的不利条件。肿瘤负荷与体重减轻的体征以及循环和器官浸润性骨髓瘤细胞的重叠增强了CB Treg细胞的全身抗炎作用。
对已确立的骨髓瘤疾病的影响
方法：将3×106个GFP标记的MM.1S细胞注射到NSG小鼠中，接着在第+14天注射5×106CD3+T常规(Tcon)细胞。在Tcon治疗的小鼠的亚群中，在第+16、第+23和第+30天注射1×107个CB Treg细胞(参见下面的实验设计表)。每隔一天对小鼠进行一次体重和GVHD评分。连续进行非侵入性生物发光成像(BLI)。每周抽血进行细胞分析和细胞因子测定。在安乐死时，收集血液、脾脏和骨髓用于组织病理学和流式分析。在随后的实验中，在存在或不存在CB Treg细胞的情况下，在异种骨髓瘤模型经腹腔内注射施用抗CD3和BCMA的双特异性抗体(
Figure BDA0003615864090000581
(双特异性T细胞接合器))。将全T细胞添加到所有小鼠中以促进
Figure BDA0003615864090000582
的抗肿瘤作用。实验设计如图61E所示。
表13：实验设计：Treg+Tcon
第0天 第+14天 第+16天 第+23天 第+30天
MM1.S X
Tcon X
Treg X X X
结果：与仅骨髓瘤或骨髓瘤+Treg组相比，Tcon和Tcon+Treg受体小鼠均保持了体重(图61A)。Treg的添加不干扰Tcon介导的抗骨髓瘤作用并防止延迟复发(图61B至61D)。与单用
Figure BDA0003615864090000591
治疗的小鼠相比，
Figure BDA0003615864090000594
的添加导致相似程度的肿瘤控制(图61F)。Treg的添加不干扰
Figure BDA0003615864090000592
介导的抗骨髓瘤作用。Treg的添加缓解了
Figure BDA0003615864090000593
诱导的体重减轻(图61G)且降低了相应的高GVHD评分(图61H)。
实例6：在骨髓衰竭综合征和其它自身免疫病症的治疗中施用脐带血来源的调节性T细胞的安全性和功效的评价
研究依据
用脐带血来源的调节性T细胞的过继性治疗可能能够减少循环促炎细胞因子并改善结局。在先前的研究中，已证明输注脐带血来源的调节性T细胞在预防GVHD中是安全且可能有效的，尽管临床前和临床研究中的效果似乎强烈依赖于体内Treg与Tcons的比。目前将GVHD降到最低的策略要求用药物如钙调磷酸酶抑制剂(CNI)、环孢菌素和他克莫司进行长期免疫抑制治疗。然而，这种延长的免疫抑制会导致免疫功能延迟，从而导致感染性并发症以及移植后淋巴组织增生病症的风险。用脐带血来源的调节性T细胞的过继性治疗因此可能是治疗GVHD以及其它自身免疫疾病的有吸引力的替代方案。
脐带血来源的调节性T细胞的细胞产物(CK0801)由来自单个脐带血单位(CBU)并根据本文所述的方法生产的离体扩增的调节性T细胞组成。
本研究的目的是评价给予患者CK0801治疗顽固性骨髓衰竭综合征，包括脊髓发育不良、骨髓纤维化和再生障碍性贫血是否安全和实用。只有复发性/顽固性骨髓衰竭且对标准治疗无反应的患者将被招募加入这些研究。这项研究将确定可以安全给予的最高剂量以及CK0801是否可以改善骨髓衰竭综合征的症状。
有资格参与这项研究的参与者不能或不愿意接受标准治疗或标准治疗失败。
主要目标
主要目标是确定CK0801的剂量限制性毒性，定义为均开始于CK0801输注时的任何事件。
·24小时内出现严重(3级或4级)输注毒性(NCI-CTCAE V4.0)
·30天内与治疗方案相关的死亡
·30天内出现严重(3级或4级)细胞因子释放综合征
次要目标
·疾病特异性反应的初步评估
·疾病特异性反应的持续时间
探索性目标
评估在基线时和治疗后安排的随访中外周血和骨髓免疫重建和炎性细胞因子。在每次输注后的第-10天、第0天、第+3天、第+7天、第+14天、第+21天、第+30天、第+60天、第+90天和第1年进行抽样。
组和干预
表14
Figure BDA0003615864090000601
研究设计
将使用标准3+3I期统计设计，其中三位患者将以剂量水平1：1×106/kg接受治疗。如果未观察到剂量限制性毒性(DLT)，那么将下一群组3位患者的剂量递增至剂量水平2：(范围)>1×106/kg至1×107/kg。如果未观察到DLT，那么将剂量递增至剂量水平3：(范围)>1×107/kg至1.5×107/kg。
如果在一个剂量水平观察到一个DLT，那么另外3位患者将以该水平接受治疗。如果没有额外的DLT，那么将该剂量水平定义为MTD。
如果在剂量水平2或3有≥2个DLT，那么先前剂量水平定义为MTD。如果剂量水平1有≥2个DLT，则数据安全监测委员会(DSMB)将审查并评价研究是否继续进行。
当6位患者以<2个DLT的剂量水平接受治疗时，确定MTD。最多18位患者将接受治疗。
受试者招募加入每个研究群组(3或6位患者)后，群组将封闭，直至最终患者完成第0天(输注CK0801)后30天。只有在DSMB对先前给药的群组进行审查后，才可能出现剂量递增。
倘若符合资格标准，受试者将获得同意并招募加入研究。
试验药品
来源和药理学
CK0801(脐带血来源的调节性T细胞)在Cellenkos GMP设施使用根据预定标准选择并符合生产使用条件的单一异基因非亲缘供体脐带血单位生产。CK0801是使用CD25+Treg的免疫磁选择和14天的培养-扩增过程生产的，收集Treg并进行血浆-电解质A和0.5％人血清白蛋白(HSA)的最终配剂。最终细胞产物只有在正式批次签发流程，包括所有可用检验结果的审查后才能释放。批次签发标准包括7AAD活力≥70％、％CD4+CD25+细胞纯度≥60％，％CD4-/CD8+细胞<10％、抗CD3/抗CD28 Ab珠计数<100/3×106个细胞、革兰氏染色剂“无生物体”、内毒素<5EU/kg，无菌性(在最终配制前48至72小时采样)阴性和支原体阴性。
脐带血搜索、选择和装运至生产设施
提供给Cellenkos公司(Cellenkos，Inc.)用于生成CK0801的脐带血单位将获自从符合细胞疗法认证基金会(FACT)或美国血库协会(AABB)最低认证标准的独立评定和选定的脐带血库(CBB)。合格的CB单位可以被分类为经许可或未经许可的，并且将满足预定的评定标准。
在同意时，受试者将提供血样用于HLA分型。结果将提供给主办方的临床协调员，以促进脐带血搜索和选择过程。主办方将根据在HLA-A、-B和DRB1位点的6种抗原中的3、4、5或6抗原处与受体(受试者)HLA匹配的标准搜索算法确定可用的脐带血单位，并将列表提供给主要研究者(PI)。主办方和PI将基于预定标准选择适当的脐带血单位。
脐带血单位选定后，主办方的临床协调员将安排装运和运输物流，并且该单位将装运至Cellenkos的GMP生产设施。在到达生产设施后，脐带血单位将针对CB供体/受体装运请求进行检查、登记和验证。符合验收标准(包括标识、标签和温度)的脐带血单位将储存在≤-150℃的液氮、气相储存冰箱中，直至第-14天(生产开始)，这将与受试者的计划输注时间表相协调。
输注前，主办方的临床协调员和临床试验机构的临床团队将负责安排CK0801在预定时间点和时间窗口的输注。CK0801必须在最终配制的8小时内施用。
主办方的临床协调员会安排将CK0801运送到临床试验机构。临床试验机构的临床团队负责接收、验收、制备和施用CK0801。
配制和稳定性
CK0801在勃脉力+0.5％人血清白蛋白(HSA)缓冲液中配制成最终细胞剂量。CK0801的输注必须在最终配制的8小时内进行。
储存和处理
CK0801将在经验证能将温度维持在15℃至30℃的运输容器中运输至临床试验机构，并在输注前将温度保持在15℃至30℃。
毒性
脐带血来源的调节性T细胞的输注先前已被证明是安全的，然而在输注CK0801期间应根据临床实践标准对受试者进行监测。每次输注当天生命体征的推荐时间：按照标准临床实践，输注前、输注开始后15分钟、输注开始后30分钟、输注开始后1小时、输注开始后2小时。
生命体征包括体温、呼吸、血压和脉搏。
施用途径
CK0801经中央管线或外周管线施用且速率不超过5ml/分钟。施用后，用生理盐水反复冲洗袋和管线。
CK0801输注
本试验将探索三种不同剂量水平的CK0801输注。将使用标准的3+3I期统计设计。
未对患者进行调理或淋巴耗竭。三位患者将以剂量水平1：1×106/kg IBW接受治疗。如果未观察到剂量限制性毒性(DLT)，那么将下一组群的3位患者的剂量递增至剂量水平2：(范围)3×106/kg IBW。如果未观察到DLT，那么将剂量递增至剂量水平3：(范围)1×107/kg IBW。
如果在一个剂量水平观察到1个DLT，那么另外3位患者将以该水平接受治疗。如果没有额外的DLT，那么将该剂量水平定义为MTD。
如果在剂量水平2或3有≥2个DLT，那么先前剂量水平定义为MTD。如果在剂量水平1有≥2个DLT，那么数据安全监测委员会(DSMB)将审查和评价研究是否继续进行。
当6位患者以<2DLT的剂量水平接受治疗时，将确定MTD。
在输注CK0801前三十(30)分钟，患者会接受苯海拉明
Figure BDA0003615864090000621
50mg背带静脉内注射(IVPB)和对乙酰氨基酚(acetaminophe)650mg(口服)的术前用药。CK0801通过重力流经不得含有0.9％氯化钠(生理盐水)USP以外的任何溶液的IV管线进行输注15至30分钟。CK0801与标准血液制品导管兼容。禁止使用过滤器。
研究人群的选择
入选标准
1.符合骨髓衰竭综合征诊断标准的受试者包括：再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征或骨髓纤维化。
2.可用于CK0801生成的HLA匹配(≥3/6HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1匹配)的脐带血单位。
3.受试者年龄大于18岁。
4.胆红素≤2×ULN和SGPT(ALT)≤2×ULN(除非吉尔伯特综合征被记录在案)。
5.使用科克罗夫特-高尔特(Cockcroft-Gault)公式计算的肌酸酐清除率>50mL/分钟。
6.Zubrod体力状况≤2。
7.有生育潜力的女性受试者(FPCP)的尿或血清妊娠试验必须为阴性。注：FPCP被定义为绝经前且未经手术消毒。FPCP必须同意在整个研究过程中使用最有效的节育措施或避开异性性行为。有效的避孕方法包括子宫内节育器、口服和/或可注射激素；节育术或2种适当的屏障方法(例如，含杀精子剂的宫颈帽、含杀精子剂的隔膜)。
8.受试者已同意遵守所有方案要求的程序，包括研究相关的评估、访视和长期随访。
9.受试者愿意并能够提供知情同意书。
排除标准
1.受试者在输注CK0801前4周内已接受试验剂的治疗。
2.受试者在输注CK0801前21天内已接受放射疗法或化学疗法。
3.受试者已接受脐带血来源的T-调节性细胞疗法。
4.已知HIV血清阳性。
5.受试者感染不受控制，在治疗7天后对适当的抗微生物剂无反应。方案PI是合格性的最终仲裁器。
6.患有不受控的间发病的受试者在研究者看来将使患者处于严重毒性和/或损害CK0801活性的更高风险中。
7.受试者怀孕或哺乳。
8.干细胞移植引起的骨髓衰竭。
9.不能提供同意书或在研究者看来不太可能完全符合方案要求的受试者。
数据采集
与CK0801输注有关的治疗和毒性数据将从第一次输注CK0801之日起至最后一次输注后30天进行采集。
在后续替代治疗中经历研究相关死亡或所记录的疾病进展的受试者将被视为治疗失败，并在事件发生时被视为审查意见，而无需进一步采集数据。撤回知情同意书或因违规而退出研究的受试者也将在此时被审查。
结局指标
主要结局指标：
1.如CTCAE v4.0评估的出现治疗相关不良事件的参与者人数-通过采集不良事件和严重不良事件评价在患有骨髓衰竭的受试者中输注CK0801的安全性
剂量限制性毒性定义为包括均在输注CK0801时开始的任何事件。
·24小时内出现严重(3级或4级)输注毒性(NCI-CTCAE V4.0)
·30天内与治疗方案相关的死亡
·30天内出现严重(3级或4级)细胞因子释放综合征
[时间范围：输注后30天]
次要结局指标：
2.对疗法的疾病特异性反应和反应持续时间的初步评估
[时间范围：12个月]
其它预先规定的结局指标：
3.评估骨髓(BM)免疫重建和炎性细胞因子
在基线时和治疗后安排的随访中进行骨髓抽样，并分析免疫重建和炎性细胞因子
[时间范围：12个月]
4.评估外周血(PB)免疫重建和炎性细胞因子
在基线时和治疗后安排的随访中抽取外周血，并分析免疫重建和炎性细胞因子
[时间范围：12个月]
骨髓衰竭(BMF)患者异基因脐带血来源的Treg细胞的1期临床试验结果
试验设计的示意图示于图41中。相关研究的时间示于下表中。图28描述了CK0801在骨髓衰竭受试者中的1期临床试验显示出早期疗效信号。
表15
Figure BDA0003615864090000641
图42提供了在1期临床试验中进行治疗的受试者的描述。临床数据的总结提供于图43和图44中。
群组I
患者1的治疗史如图45所示。患者为一位63岁男性，被诊断为患有原发性骨髓纤维化。患者接受1×106个Treg细胞/kg(6700万细胞)的治疗，输注17分钟。患者还接受鲁索替尼20mg PO(口服)BID(一天两次)的治疗。患者的临床数据如图46A和图46B所示。炎性细胞因子水平图47和图48所示。患者的JAK2突变负荷减少(图46B)和脾肿大(图49)与SDF1α-CXCR4轴相关(图48)。患者在Treg细胞施用前(PRE)和后(POST)的骨髓评估如下表所示。
表16：外周血
前 后
WBC(K/μL) 8.5 9.7
HB(gm/dL) 12.1 12.7
PLT(K/μL) 73 72
ANC(K/μL) 4.8 5.82
原始细胞(％) 0 1
表17：骨髓
前 后
原始细胞 2 1
前幼粒细胞 1 0
中幼粒细胞 6 2
晚幼粒细胞 10 7
粒细胞 50 62
嗜酸性粒细胞 3 2
淋巴细胞 14 16
浆细胞 0 0
单核细胞 5 2
网状细胞 0 0
原红细胞 0 0
正常红细胞 6 7
M：E比 12.2 10.7
肥大细胞 0 0
骨髓
Figure BDA0003615864090000661
患者2的治疗史如图50所示。患者是一位46岁女性，被诊断为患有青少年和年轻成人(AYA)骨髓增生性肿瘤(MPN)。患者接受1×106个Treg细胞/kg(6000万个细胞)的治疗，输注20分钟。患者还接受鲁索替尼20mg PO(口服)BID(一天两次)的治疗。炎症细胞因子水平如图51所示。患者在Treg细胞施用前(PRE)和后(POST)的骨髓评估如下表所示。
表18：外周血
前 后
WBC(K/μL) 3.7 3.2
HB(gm/dL0 10.8 10
PLT(K/μL) 329 291
ANC(K/μL) 2 2
原始细胞(％) 0 0
表19：骨髓
前 后
原始细胞 1 1
早幼粒细胞 0 1
中幼粒细胞 10 7
晚幼粒细胞 13 11
粒细胞 45 35
嗜酸性粒细胞 1 1
淋巴细胞 18 20
浆细胞 1 1
单核细胞 2 2
网状细胞 0 0
原红细胞 0 2
正常红细胞 10 20
M：E比 6.9 2.5
肥大细胞 0 0
表20：骨髓
Figure BDA0003615864090000681
患者3为一位19岁女性，被诊断为患有获得性再生障碍性贫血且依赖输注。患者接受1×106个Treg细胞/kg(5000万个细胞)的治疗，输注25分钟。患者还接受艾曲波帕(eltrombopag)和环孢菌素(CSA)的治疗。患者的TPO水平随时间的变化如图52所示。患者随时间的血小板输注需求如图53所示。患者随时间的PRBC(压积红细胞)输注需求如图54所示。患者在施用Treg细胞前(PRE)和后(POST)的骨髓评估示于下表中。
表21：外周血
前 后
WBC(K/μL) 3.1 2.1
HB(gm/dL) 9.8 8.2
PLT(K/μL) 10 47
ANC(K/μL) 1.54 1
原始细胞(％) 0 0
表22：骨髓
前 后
原始细胞 2 0
早幼粒细胞 2 1
中幼粒细胞 10 9
晚幼粒细胞 19 8
粒细胞 40 25
嗜酸性粒细胞 0 2
淋巴细胞 6 13
浆细胞 0 2
单核细胞 4 3
网状细胞 0 0
原红细胞 1 1
正常红细胞 15 35
M：E比 4.4 1.3
肥大细胞 0 0
表23：骨髓
前 后
细胞结构(％) 30至80, 70％
诊断 巨核细胞发育不全和粒细胞生成障碍 细胞骨髓伴三系造血
群组II
患者4为一位29岁男性，被诊断为患有特发性重度再生障碍性贫血。患者接受3×106个Treg细胞/kg的治疗。患者还接受hATG+CSA+类固醇+艾曲波帕+培非格司亭(Peg-filgrastim)的治疗。患者随时间推移的血小板输注需求如图55所示。患者随时间的PRBC(压积红细胞)输注需求如图56所示。患者在施用Treg细胞前(PRE)和后(POST)的骨髓评估示于下表中。
表24：外周血
前 后
WBC(K/uL) 6.8 6.0
HB(gm/dL) 8.3 7.8
PLT(K/uL) 9 22
ANC(K/uL) 4.5 3.69
原始细胞(％) 0
表25：骨髓
前 后
原始细胞 2 1％
早幼粒细胞 2 2
中幼粒细胞 8 7
晚幼粒细胞 12 13
粒细胞 31 34
嗜酸性粒细胞 2 1
淋巴细胞 15 14
浆细胞 2 2
单核细胞 3 3
网状细胞 0 0
原红细胞 1 1
正常红细胞 23 21
M：E比 2.3 2.6
肥大细胞 0 0
表26：骨髓
Figure BDA0003615864090000711
患者5是一位62岁女性，被诊断为患有原发性骨髓纤维化(原发性血小板增多症(ET))。患者接受3×106个Treg细胞/kg的治疗。患者在Treg细胞施用前(PRE)和后(POST)的骨髓评估如下表所示。
表27：外周血
前 后
WBC(K/μL) 10.3 12.1
HB(gm/dL) 12.5 12.3
PLT(K/μL) 465 481
ANC(K/μL) 6.69 9.44
原始细胞(％) 0 0
表28：骨髓
前 后
原始细胞 1 1
早幼粒细胞 0 0
中幼粒细胞 10 7
晚幼粒细胞 14 8
粒细胞 40 29
嗜酸性粒细胞 2 3
淋巴细胞 12 12
浆细胞 0 0
单核细胞 3 3
网状细胞 0 0
原红细胞 1 1
正常红细胞 17 37
M：E比 3.7 1.2
肥大细胞 0 0
表29：骨髓
Figure BDA0003615864090000721
患者6是一位74岁男性，被诊断为患有原发性骨髓纤维化(2级，细胞数量过少，依赖输注)。患者用LCL-161(诺华公司(Novartis)，瑞士巴塞尔(Basel，Switzerland))治疗失败。患者接受3×106个Treg细胞/kg的治疗。患者随时间推移的血小板输注需求如图57所示。患者随时间的PRBC(压积红细胞)输注需求如图58所示。患者在施用Treg细胞前(PRE)和后(POST)的骨髓评估示于下表中。
表30：外周血
前 后
WBC(K/μL) 5.8 6.9
HB(gm/dL0 7.9 6.9
PLT(K/μL) 17 22
ANC(K/μL) 3.25 3.9
原始细胞(％) 0 0
表31：骨髓
前 后
原始细胞 1 1
早幼粒细胞 0 0
中幼粒细胞 2 8
晚幼粒细胞 12 24
粒细胞 38 29
嗜酸性粒细胞 0 2
淋巴细胞 22 8
浆细胞 0 0
单核细胞 2 5
网状细胞 0 0
原红细胞 0 1
正常红细胞 22 33
M：E比 2.4 1.6
肥大细胞 0 0
表32：骨髓
Figure BDA0003615864090000741
结论
●在群组1(剂量＝1×106个细胞/kg)和群组2(剂量＝3×106个细胞/kg)中接受治疗的6位患者中未观察到SAE。
●JAK2突变等位基因在患者#1中的改善。反应的持久性＝6个月
●MPN评分在患者#2中的改善。反应的持久性：4个月
●红细胞和血小板输注需求在患者#3中的改善反应的持久性：4周
●红细胞和血小板输注在患者#4中的改善反应的持久性：4周
●慢性疼痛在患者#5中的改善。持久性：4周
●红细胞和血小板输注在患者#6中的改善。4周时进行的评估
●骨髓细胞结构在患者#1、患者#2中的改善
●骨髓发育不良在患者#3、患者#4中的改善
●除患者#4(稳定)以外，所有病例M：E比均下降
实例7：施用脐带血来源的调节性T细胞在治疗难治性格林-巴利综合征中的安全性和有效性的评价
本研究将检验将CK0801(脐带血来源的调节性T细胞产物)给予格林-巴利综合征(GBS)患者是否安全和实用。此外，将确定安全给予的最高可能剂量。同样，本研究还将检验CK0801是否可以改善GBS的症状。
目标人群
本研究的目标人群是对静脉内免疫球蛋白(IVIG)治疗或血浆置换的标准治疗无反应的患者。
招募
将招募多达18位成年患者(18至70岁)。
合格性
入选标准：
1.受试者符合格林-巴利综合征(GBS)的诊断标准。
2.可用于CK0801生成的HLA匹配(≥3/6HLA-A、HLA-B和HLA-DRB1匹配)的脐带血单位。
3.受试者年龄18至70岁。
4.受试者的GBS残疾评分为4，且IVIG或PE治疗后1周未改变。
5.受试者在CK0801输注前已完成≥4周的IVIG/PE治疗。
6.受试者在就诊时已改良Erasmus GBS结局评分(mEGOS评分)为≥7，并且在IVIG或PE治疗后1周未发生变化。
7.胆红素≤2×ULN且ALT≤2×ULN(吉尔伯特综合征除外)。
8.对于18至70岁的成年患者，使用Cockroft-Gault公式计算的肌酸酐清除率>50mL/分钟。
9.有生育潜力的女性受试者(FPCP)的尿或血清妊娠试验必须为阴性。注：FPCP被定义为绝经前且未经手术消毒。FPCP必须同意在整个研究过程中使用最有效的节育措施或避开异性性行为。有效的避孕方法包括子宫内装置、口服和/或可注射激素；节育术或2种适当的屏障方法(例如，含杀精子剂的宫颈帽、含杀精子剂的隔膜)。
10.受试者已同意遵守所有方案要求的程序，包括研究相关的评估、访视和长期随访。
11.受试者愿意并能够提供书面知情同意书。如果受试者因疾病相关并发症(例如，上肢麻痹)暂时无法签署知情同意书，将使用法定授权代表(LAR)。受试者将在他们有能力的情况下
尽快签署同意书。
排除标准：
1.受试者在输注CK0801前4周内已接受免疫疗法、化学疗法、生物或试验剂的治疗。
2.受试者已接受先前的CB Treg疗法。
3.受试者感染不受控制，在治疗7天后对适当的抗微生物剂无反应。方案PI是合格性的最终仲裁器。
4.受试者已接受活病毒(例如麻疹、流行性腮腺炎、风疹、水痘)疫苗接种。
5.受试者怀孕或哺乳。
6.HIV血清阳性
7.不能提供同意书或在研究者看来不太可能完全符合方案要求的受试者。
组和干预
表33
Figure BDA0003615864090000761
给药(I期3+3)
本研究期间给予3剂CK0801。每个剂量水平至少有三位患者接受治疗。患者接受的剂量取决于他们进入研究的时间，因为在每个剂量水平完成后，随后的患者将接受下一个最高剂量水平。
●剂量水平1：CK0801 IV 1×106/kg理想体重
●剂量水平2：CK0801 IV 3×106/kg理想体重
●剂量水平3：CK0801 IV 1×107/kg理想体重
主要终点
本研究的主要终点为剂量限制性毒性：
●24小时内出现严重(3级或4级)输注毒性；
●30天内出现严重(3级或4级)细胞因子释放综合征；
●30天内与治疗方案相关的死亡
结局指标
主要结局指标：
1.将采集不良事件和严重不良事件的数量，以初步评价在静脉内免疫球蛋白标准治疗无效的格林-巴利综合征(GBS)患者中输注CK0801的安全性
[时间范围：输注后30天]
2.剂量限制性毒性定义为包括以下任何事件(均开始于输注CK0801时)。
·24小时内出现严重(3级或4级)输注毒性(NCI-CTCAE V4.0)
·30天内出现与治疗方案相关的死亡，
·30天内出现严重(3或4级)细胞因子释放综合征(CRS)
[时间范围：输注后30天]
其它预先规定的结局指标：
3.输注CK0801后外周血(PB)概况的评估-评价第0天输注CK0801是否导致患者外周血特性发生改变
[时间范围：筛选，第0天和第1、2、4、12和24周]
4.CK0801输注后外周血炎性细胞因子的评估
评价第0天输注CK0801是否导致患者外周血出现炎性细胞因子
[时间范围：筛选，第0天和第1、2、4、12和24周]
5.GBS残疾评分潜在变化的评估(问卷)
评估从健康状态(0)到死亡(6)的7项残疾评分的问卷
[时间范围：筛选，第0天和第1、2、4、12和24周]
6.整体神经病变限制量表(ONLS)的潜在变化的评估(问卷)
总体神经病变限制量表(ONLS)是一份确定患者在进行正常的日常活动时手臂(麻木、刺痛、虚弱)和腿(行走能力、跑步能力、步态变化、是否需要轮椅)的症状的问卷。手臂刻度为0(正常)至5(双臂残疾妨碍所有有目的的运动)，腿部刻度为0(步行/爬楼梯/跑步不受影响)至7(一天的大部分时间限于轮椅或床，不能进行任何有目的腿部运动)。
[时间范围：筛选，第0天和第1、2、4、12和24周]
7.整体残疾量表(问卷)的潜在变化的评估
测量日常活动与患者健康之间关系的问卷。评分为0至2，其中0＝不可能进行活动，2＝容易进行活动。问卷包括诸如在室内或室外散步、清洗上身或下身、穿衣、吃饭、洗碗、购物等活动。总和初步评分从1至48，其与0至100的中心度量相关。
[时间范围：筛选，第0天和第1、2、4、12和24周]
8.MRC(医学研究委员会)总分(问卷)的潜在变化的评估
MRC总分是6个肌肉群，包括肩外展肌、肘屈肌、腕伸肌、膝伸肌和双侧足背屈肌的MRC总分，范围从60(正常)到0(四肢瘫痪)。
[时间范围：筛选，第0天和第1、2、4、12和24周]
9.Rasch建立的MRC模型的潜在变化的评估(问卷)
MRC总分是6个肌肉群，包括肩外展肌、肘屈肌、腕伸肌、膝伸肌和双侧足背屈肌的MRC总分，范围从48(正常)到0(四肢瘫痪)。
[时间范围：筛选，第0天和第1、2、4、12和24周]
10.疲劳严重程度量表(FSS)潜在变化的评估(问卷)
在9分(无疲劳迹象)至63分(最具致残性的疲劳)量表上测量与疲劳相关的活动的问卷
[时间范围：筛选，第0天和第1、2、4、12和24周]
11.Rasch建立的疲劳严重度量表(RFSS)的潜在变化的评估(问卷)
在0分(无疲劳迹象)至21分(最具致残性的疲劳)量表上测量与疲劳相关的活动的问卷
[时间范围：筛选，第0天和第1、2、4、12和24周]
12.EuroQol E-5D健康问卷(问卷)的潜在变化的评估
EuroQol E-5D健康问卷是一份经过验证且简单的健康问卷，用于测试患者的活动能力、进行自我保健活动的能力、其它日常活动(例如，家务、休闲活动)、其疼痛/不适程度以及是否存在焦虑/抑郁。量度为0(患者可以想象的最差健康状况)至100(患者可以想象的最佳健康状况)。
[时间范围：筛选，第0天和第1、2、4、12和24周]
13.基于表格A入组问卷与随访问卷表格B(第1周和第2周问卷)(问卷)的比较对患者病状的潜在变化的评估
入组调查问卷在患者的总体状态中建立筛选水平基线，该总体状态包括影响呼吸或活动能力的合并症、其他患有GBS的家庭成员、既往事件(如普通感冒、肠胃炎)、疼痛类型(如肌肉疼痛、关节痛、神经性疼痛)、疼痛部位、手臂或腿部无力、反射、感觉障碍、共济失调、用力肺活量。该表格能够让用户预测患者是否需要通气或是否能够在6个月内行走。
[时间范围：筛选，第0天和第1周、第2周]
14.基于表格A入组问卷与随访问卷表格B(第4、12和24周问卷)(问卷)的比较对患者病状的潜在变化的评估
该表格(问卷)使用与入组调查表相同的信息，以提供记录自招募以来患者状态变化的机制。
[时间范围：筛选，第0天和第1、2、4、12和24周]
15.基于表格A入组问卷与随访问卷表格C(第1、2、4、12和24周问卷)(问卷)的比较对患者病状的潜在变化的评估
该表格(问卷)使用与入组调查表相同的信息，以提供记录自招募以来患者状态变化的机制。
[时间范围：筛选，第0天和第1、2、4、12和24周]
16.基于表格A入组问卷与随访问卷表格T(第1、2、4、12和24周问卷)(问卷)的比较对患者病状的潜在变化的评估
该表格(问卷)使用与入组调查表相同的信息，以提供记录自招募以来患者状态变化的机制。
[时间范围：筛选，第0天和第1、2、4、12和24周]
实例8：施用脐带血来源的调节性T细胞在治疗获得性特发性再生障碍性贫血和再生障碍性骨髓增生异常综合征中的安全性和功效的评价
目标人群
本研究的目标人群是不适合进行匹配的同胞供体造血干细胞移植(MSD HSCT)或预计对免疫抑制疗法(IST)反应不佳的患者。
招募
将招募多达18位成年患者。
给药
●剂量水平1：CK0802.CXCR4静脉内注射1×108细胞
●剂量水平2：CK0802.CXCR4静脉内注射3×108细胞
主要终点
本研究的主要终点为输注反应的时间；细胞因子释放综合征和/或30天内死亡。
次要终点
本研究的次要终点为血液学改善。
实例9：脐带血来源的调节性T细胞在治疗肌萎缩性侧索硬化中的安全性和有效性的评价
目标人群
·患有获得性ALS的成年ALS患者(≥18岁)
·提供知情同意书的能力
·发病≤2年的受试者
·预测的用力肺活量≥60％
·受试者的ALSFRS-R总评分为≥24，并且在量表的所有12项上评分至少为2分
·从发作到筛选进展大于0.3分/月的患者
招募
52位成年患者。
研究药物
CK0802.CD11a(冻存、多剂量、富含CD11a的脐带血来源的调节性T细胞)
给药
诱导：每周在以下剂量水平以剂量×4静脉内注射CK0802.CD11a
●组群1：CK0802.CD11a静脉内注射1×108个Treg细胞
●组群2：CK0802.CD11a静脉内注射3×108个Treg细胞
维持：两个群组每4周额外给药6次
组和干预
表34
Figure BDA0003615864090000801
治疗时间线在图26中示出。
IB期：
主要目标
○安全性和耐受性
Figure BDA0003615864090000802
按照CTCAE v 4.03的治疗相关不良事件(AE、SAE、DLT)
次要目标
○疗效
Figure BDA0003615864090000803
修订的ALS功能评定量表(ALSFRS-R)
Figure BDA0003615864090000804
用力肺活量(FVC)
Figure BDA0003615864090000811
用于肌肉力量的手持式肌力测定仪(HHD)
○探索性
Figure BDA0003615864090000812
炎性生物标志物和免疫重建
研究终点
临床反应：
1.在6个月期间，将修订的ALS功能评定量表(ALSFRS-R)改善6个点。
2.功能状态变化率
3.肌萎缩性脊髓侧索硬化症功能评定量表(ALSFRS-R)评分斜率的变化
4.用力肺活量(FVC)变化和
5.肌肉力量变化
ALSFR反应者分析(治疗后与治疗前相比改善的受试者的百分比)
·预先指定的反应者分析检验治疗后ALSFRS-R斜率与治疗前斜率相比每月的百分比改善和绝对点改善。
·25％、50％、75％和100％改善的患者评估。
·临床意义＝25％
·临床显著意义＝50％
使用Fisher精确检验将统计学显著性定义为单侧p值<0.05。
在第4周、第8周、第12周、第16周和第24周进行评估
临床试验设计：Ib期临床试验
研究设计：
·本研究将为CK0802.CD11a的I期，3+3研究设计，单次递增剂量，安全性，可吸收性。
·固定剂量策略将研究2个剂量水平：
Figure BDA0003615864090000813
低剂量：1×108个细胞；
Figure BDA0003615864090000814
高剂量：3×108个细胞；
将招募最少6位患者、最多12位患者加入本研究。
12位受试者的群组将被随机分配三种治疗顺序中的一种治疗顺序，每种顺序有3位受试者，如上表所示，患者总数(最少)＝12
临床试验设计：探索性研究。
·外周血
·T细胞区室：Treg、效应T细胞、抗病毒活性
·用于炎性细胞因子的血清：白细胞介素(IL)1、IL-1beta、IL-2、IL-4、IL-6、IL7、IL-8、IL-10、IL-13、IL-17、IL-18
·干扰素-γ、ST2、REG3a、OPN、人卵泡抑素、弹力素、TGF-β，TNF-α，TNFR-1
·C反应蛋白(CRP)
·巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)
·8-羟基-2'-脱氧鸟苷(8-OHdG)
·丙二醛(MDA)
·比：谷胱甘肽二硫化物、GSSG/还原型谷胱甘肽，GSH额外的探索性细胞因子：SCF、G-CSF、GM-CSF、HGF、VEGF、SDF1a、MCP1、MCP2、TARC、MIP3a、TECK、CTACK、CCL28、FGF、PDGF、EGF、TGF-α、TLR
·脑脊液
·磷酸化神经丝重链(pNFH)
·几丁质-1
·前列腺素E2
·VEGF
·IL-6
·GMCSF
·IL-2、IL-8、IL-15、IL-17
·MIP-1β
·FGF
·G-CSF
·MIP-1α
·MCP-1
·IFN-γ
·射线检测
·通过体内[11C]-PBR28 PET测量的胶质细胞活化在患有ALS的人的病理学相关区域中增加并且与临床指标相关。(Alshikho，《神经病学年鉴(ANN NEUROL)》2018)
·综合PET-MR和1H-MRS成像证明了神经元完整性和神经炎症的标记之间的关联，并可能为ALS的疾病机制提供有价值的洞察。(Ratai，《神经影像：临床(NeuroImage：Clinical)》20(2018)357–364)
实例10：施用脐带血来源的调节性T细胞在治疗COVID-19(冠状病毒疾病)介导的急性呼吸窘迫综合征(CoV-ARDS)的安全性和功效的评价
用于治疗CoV-ARDS的冻存的、多剂量脐带血来源的调节性T(Treg)细胞(CK0802)的IB/IIa期临床试验设计描述于图27中。将有三个治疗组：治疗组1：安慰剂；治疗组2：1×108个CK0802细胞；治疗组3：3×108个CK0802细胞。给药方案为在第0天、第3天(+/-1)和第7天(+/-1)输注三个剂量。CK0802将通过静脉内注射施用。研究人群为COVID-19诱导中度至重度急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的插管成人患者。将招募最少15位患者，最多45位患者。
目标
主要目标
本方案的目标是确定从库存脐带血单位(CK0802)扩增的调节性T细胞输注是否可以安全地降低患有继发于COVID-19感染的中度至重度ARDS的插管患者的发病率和死亡率。
终点和相关
主要终点
两个共同主要结局将是：
●与方案相关，CK0802输注48小时内出现严重≥3级毒性(NCI-CTCAE(美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准(U.S.National Cancer Institute Common TerminologyCriteria for Adverse Events))V4.0)
●28天治疗成功，定义为S28＝[第一次输注日起后28天存活且未插管]。
次要终点
从第一次输注之日起至第一次输注之日起28天内记录的次要结局将包括：
●拔管时间
●氧合需求(PaO2：FiO2比率)在第0天和第+11天之间变化
●呼吸机空闲天数
●无器官衰竭天数
●前28天ICU免费天数
●28天全因死亡率
计划性非终点相关性分析
实验室相关性和综合评估第0、3、7、11、21和28天
●序贯器官衰竭估计(SOFA)评分[Vincent等人,《重症监护医学(Intensive CareMed)》,1996.22(7):第707-10页]
●炎症标志物：血清铁蛋白、降钙素原、D-二聚体和C-反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)
●外周血淋巴细胞亚群分析
●呼吸机状态参数(如果插管)和ABG(如果可用)
试验药品
CK0802(冻存的脐带血来源的调节性T细胞)是指异基因、现成的调节性T细胞，其被冻存并准备用作治疗ARDS的静脉内输注物。
来源和药理学
基于预定的选择标准，Treg将分离自从来自有资质的公共的、经许可或未经许可的US CB库的异基因、非亲缘脐带血(CB)单位。根据标准程序，CB单位将使用10％葡聚糖40和5％人血清白蛋白作为洗涤液在37℃水浴中解冻和处理。CB细胞将在免疫磁性选择之前重新悬浮于MgCl2/rHuDNAse/柠檬酸钠混合物中，以防止凝结。CD25+Treg细胞的富集将通过用直接缀合的抗CD25磁性微珠(美天旎生物技术公司，德国贝尔吉施格拉德巴赫的美天旎生物科技公司(miltenyibiotec，bergishgladbach，Germany))和MACS分离装置进行的阳性选择来完成。选择后，将CD25+细胞以大约1×106个细胞/mL的浓度悬浮于GREX培养瓶内的补充有10％人AB血清(热灭活；弗吉尼亚州温切斯特的谷生物医学产品和服务公司(ValleyBiomedical products and Services，Inc，Winchester，VA))和L-谷氨酰胺(2mM)的X-VIVO15培养基((马里兰州沃克斯维尔的Cambrex生物科学公司(Cambrex BioScience,Walkersville,MD)中。将CD25+细胞与抗CD3/抗CD28单克隆抗体(mAb)包被免疫磁珠(Dynabeads)(英杰公司)以1:1的珠-细胞比培养14±1天。在第0天，培养物将补充1000IU/ml IL-2(阿地白介素(Proleukin)，加利福尼亚州埃梅里维尔的希龙公司(Proleukin,Chiron Corporation,Emeryville,CA)。细胞将维持在1.0×106个活有核细胞/mL的密度，并在37℃下在5％CO2中培养14天。
在培养的第14天，细胞将被收集，通过磁分离去除免疫磁珠，并且Treg细胞将重新悬浮于勃脉力+0.5％I缓冲液中。Treg产物(CK0802)必须通过输注的释放标准，包括：7AAD活力≥70％、CD4+CD25+细胞纯度≥60％、CD4-/CD8+细胞<10％、抗CD3/抗CD28 mAB珠计数<100/3×106个细胞、革兰氏染色剂“无生物体”、内毒素<5EU/kg。
然后收集的细胞将等分到临床冷冻袋中，使用控速冷冻器冻存，并标记为CK0802产物，包括细胞剂量。
CK0802输注
本试验将探究CK0802剂量水平1＝1.0×108个细胞和剂量水平2：3.0×108个细胞的输注。在输注CK0802前三十(30)分钟，患者将接受
Figure BDA0003615864090000851
50mg背驮静脉内注射(IVPB)的术前用药。CK0802应通过重力输注至少30分钟，且优选在1小时内。CK0802与标准血液制品导管和过滤器瞎相容。
安慰剂输注
30ml冷冻袋内冻存的赋形剂的输注。在输注安慰剂前三十(30)分钟，患者将接受
Figure BDA0003615864090000852
50mg背驮静脉内注射(IVPB)的术前用药。安慰剂应在30分钟内且优选在解冻后1小时内通过重力输注。安慰剂与标准血液制品导管和过滤器兼容。
研究人群
本研究将招募符合以下所有入选/排除标准的受试者。
入选标准
1.有文件证明对SARS-CoV-2感染有基于RT-PCR的诊断。
2.柏林标准(Berlin Criteria)定义的中度至重度ARDS[Force等人,《美国医学会杂志(JAMA)》,2012.307(23):第2526至33页]:用>5cm H2O的呼气末正压(PEEP)评估的动脉氧分压(PaO2)与吸入氧分数(FiO2)的比为200毫米汞柱(Hg)或更低。
3.插管时间小于120小时
4.年龄≥18
5.能够提供知情同意书或正式任命有权提供知情同意书的医疗保健代理人
排除标准
1.在研究者看来，从筛选开始不太可能存活>48小时。
2.在研究者看来，可能混淆研究结果或因参与研究而对患者造成额外风险的任何身体检查结果和/或任何疾病史。
3.目前正在接受体外膜肺氧合(ECMO)或高频振荡通气(HFOV)
4.怀孕女性
5.在研究者看来，在治疗开始时患有活动性菌血症或同时患有活动性中重度其它感染的患者可能会影响CK0802治疗的安全性。
6.插管时间>120小时的患者
7.已知对DMSO或猪或牛蛋白过敏
8.在研究者看来，可能影响CK0802治疗安全性的任何终末期器官疾病
9.类固醇具有淋巴溶解性并且可能对输注的Treg细胞有害。大于应激剂量的类固醇治疗被排除在外：每6小时大于50mg的氢化可的松或其它相当于静脉内施用的大于0.5mg/kg/天的甲泼尼龙或每天口服的大于60mg的甲泼尼龙的全身类固醇。
10.接受试验细胞治疗剂
研究期间的评价
临床评估
指定治疗组的第1剂输注当天的基线评估：CK0802或安慰剂，然后在输注指定治疗组的第一剂量后14天进行后续每日评估：CK0802或安慰剂。
通气参数：
平均日记录范围(最小值和最大值)
·平台压力
·潮气量
·平均气道压力
·FiO2
·PEEP
·PaO2/FiO2比
·C-STAT/顺应性(肺的静态顺应性)
动脉血气：
平均日记录范围(最小值和最大值)
·动脉血pH
·氧分压(PaO2)
·二氧化碳分压(PaCO2)
·碳酸氢盐(HCO3)
·氧饱和度(O2 Sat)
生命体征：
平均日记录范围(最小值和最大值)
·体温
·血压(BP)：收缩压和舒张压读数
·呼吸频率
·心率
SOFA评分
序贯器官衰竭评估(SOFA)评分基于实验室结果和临床数据预测ICU死亡率。
SOFA评分
表35
Figure BDA0003615864090000871
a施用至少1小时的肾上腺髓素剂(给予的剂量以μg/kg-分钟计)
实施例11：冻存对脐带血来源的调节性T细胞的细胞抑制活性的影响
冻存的脐带血(CB)Treg细胞(CK0802)表现出与新鲜的CB Treg细胞相比具有相当的抑制功能。正如通过CellTraceTMViolet染料在阳性对照组中的连续稀释所明显看到的，Tcon细胞在存在共刺激的CD3/28珠的情况下显示出高增殖速率(图5A)，而在不存在CD3/28珠的阴性对照组中没有捕获到这样的增殖(图5B)。无论扩增的CB Treg细胞来源于新鲜培养物(图5C)还是解冻自冻存的等分试样(图5D)，通过CellTraceTMViolet染料未稀释证明了对增殖的Tcon细胞有类似程度的抑制。
实例12：鲁索替尼对脐带血来源的调节性T细胞的活性的影响
鲁索替尼在体外和体内均改善了脐带血来源的Treg细胞功能。这些发现是出乎意料的，因为先前的报道描述了鲁索替尼在对患者中对Treg细胞的负面影响。
如图31所示，将鲁索替尼添加到解冻的冻存的脐带血(CB)Treg细胞中在体外恢复了Treg细胞的抑制功能。当将解冻的CB Treg细胞置于次级培养物中时，Treg细胞随时间丧失其抑制功能。通过添加鲁索替尼可以恢复抑制功能。
鲁索替尼和CB Treg细胞在抑制致病性狼疮细胞释放干扰素-γ(IFNγ)方面表现出协同作用。来源于系统性红斑狼疮(SLE-PBMC)受试者的外周血单核细胞分泌高水平的炎性细胞因子IFNγ。IFN-γ的水平通过添加鲁索替尼或CB Treg细胞而降低。然而，当一起添加时，CB Treg细胞和鲁索替尼的组合对从SLE-PBMC释放IFNγ发挥协同抑制作用(图32)。喜树碱用作对照以证明非特异性炎性刺激物不增加CB Treg细胞的IFNγ分泌。
如图33所示，异种小鼠移植物抗宿主疾病(GVHD)模型接受鲁索替尼和活化CBTreg细胞方案的治疗。NSG小鼠在第-1天接受亚致死辐射，接着在第0天注射1×107个供体外周血(PB)单核细胞(MNC)。在存在或不存在用CellTraceTMViolet染料(赛默飞世尔)标记并在+4、+7、+11、+18天施用的1×107CB Treg细胞的情况下，给小鼠连续喂食每日1mg的口服鲁索替尼。每隔一天跟踪小鼠的体重、GVHD评分和存活率。进行连续抽血以进行细胞区室分析和细胞因子测定。
联合治疗降低了小鼠模型中的GVHD评分(图34A)并提高了存活率(图34B)。鲁索替尼在小鼠模型改善了CB Treg持续性(图35A至35C)。鲁索替尼作为单一剂以及与CB Treg细胞联合使用减少了人细胞的数量(图35A)。当与CB Treg细胞联合施用时，鲁索替尼增加了CD4和CD25共表达细胞的百分比(图35B)。与单用的CB Treg细胞相比，当与CB Treg细胞联合施用时，鲁索替尼增加了循环CB Treg细胞的百分比(图35C)。
鲁索替尼在异种小鼠GVHD模型中增强了IL-7和IL-15的存活信号通路，并抑制了IL-4对CB-Treg细胞的抑制信号通路。当鲁索替尼与CB Treg细胞联合施用时，血浆IL-7(图36A)和血浆IL-15(图36B)的水平升高。增加的IL-7可用率增强Treg存活率，稳定Treg分子标记，增强表面IL-2Rα表达，并改善Treg细胞的IL-2结合(Schmaler等人《美国科学院院报(Proc Natl Acad Sci U S A.)》112(43):13330-5,2015)。IL-15削弱RORγt和IL-17表达的上调，并改善Treg增殖(Tosiek等人(2016)《自然通信(Nat Commun)》7：10888)。当鲁索替尼与CB Treg细胞联合施用时，血浆IL-4水平降低(图36C)。Th2细胞产生IL-4被Treg抑制(Pace等人《免疫学杂志(J Immunol)》2005；174:7645-7653)。
鲁索替尼与CB Treg细胞的组合在异种小鼠GVHD模型中减少了炎性细胞因子的分泌。IL-1a(图37A)、IL-17(图37B)和IFNa2(图37C)的血浆水平通过向CB Treg细胞添加鲁索替尼而降低。FGF-12(图37D)和巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)(图37E)的水平通过单用CBTreg细胞、单用鲁索替尼以及施用鲁索替尼和CB Treg细胞的组合而同样降低。
鲁索替尼和CB Treg细胞的组合在异种小鼠GVHD模型中增加了抗炎细胞因子的分泌。IL-1RA(图38A)、IL-1a3(图38B)和IL-12p70(图38C)的血浆水平升高。鲁索替尼和CBTreg细胞的组合在异种小鼠GVHD模型中改善了血液参数。当鲁索替尼和CB Treg细胞同时施用时，血小板水平升高(图39B)。在第14天，与CB Treg细胞+鲁索替尼组的血红蛋白水平升高相比，单用鲁索替尼组的血红蛋白水平显著降低(图39A)。
实例13：脐带血来源的调节性T细胞对嵌合抗原受体T细胞的影响
使用NSG小鼠建立异种淋巴瘤模型，其中在第0天在所有小鼠中注射0.3×106个GFP标记的Raji细胞，接着在第+5天注射i)模拟-CAR T组、ii)无CAR T组或iii)CD19-CAR T细胞组的0.3×106细胞。在第+11、+18、+25天无CAR T组和CD19-CAR T组增加1×107个CBTreg细胞的额外注射，使得每个组有3只小鼠。跟踪小鼠的体重、GVHD评分和存活率。使用非侵入性生物发光进行连续成像以评价肿瘤负荷。连续抽血用于细胞分析和细胞因子测定。
如图59A所示，到第+4天，所有小鼠中GFP标记的Raji细胞的体内增殖都很明显。CD19-CAR T细胞而非模拟-CAR T细胞在第+11天降低了肿瘤负荷。然而，在第+14天，包括CD19-CAR T细胞受体小鼠在内的所有小鼠表现出进展，而CD19-CAR T+CB Treg细胞受体没有表现出生物发光的迹象。与其它治疗组相比，CD19-CAR T+CB Treg细胞受体小鼠的优越存活率是显而易见的(图60A)。在安乐死时，对不同器官的CD19-CART细胞检测进行了评价，并且这些不同器官仅在CD19-CART+CB Treg细胞受体小鼠中恢复(图60B)。CD19-CAR T受体小鼠体在第+16天PB样品中显示出炎性细胞因子的增加，包括IFN-γ(图59B)和TNF-α(图59C)，其在CD19-CAR T+CB Treg组中减少。此外，与单用CD19-CAR T组相比，在CD19-CAR T+CB Treg组中观察到抗炎细胞因子IL-1RA的反增加(图59D)。
在异种淋巴瘤模型中将CB Treg细胞添加到CD19-CAR T细胞中导致细胞因子风暴的抑制和CAR T细胞的靶向功效的改善。
编号的实施例
尽管有所附权利要求，本公开阐述了以下编号的实施例：
1.一种人Treg细胞群，其包含至少约1×108个人Treg细胞，所述人Treg细胞为：(i)≥60％CD4+CD25+；和(ii)≤10％CD4-CD8+；其中所述人Treg细胞具有免疫抑制性。
2.一种人Treg细胞群，其包含至少约1×108个人Treg细胞，所述人Treg细胞为：(i)≥60％CD4+CD25+；(ii)≥60％CD4+CD25+CXCR4+；和(iii)≤10％CD4-CD8+；
其中所述人Treg细胞具有免疫抑制性。
3.一种人Treg细胞群，其包含至少约1×108个人Treg细胞，所述人Treg细胞为：(i)≥60％CD4+CD25+；(ii)≥60％CD4+CD25+α4β7+；和(iii)≤10％CD4-CD8+；
其中所述人Treg细胞具有免疫抑制性。
4.一种人Treg细胞群，其包含至少约1×108个人Treg细胞，所述人Treg细胞为：(i)≥60％CD4+CD25+；(ii)≥60％CD4+CD25+CD11a+；和(iii)≤10％CD4-CD8+；其中所述人Treg细胞具有免疫抑制性。
5.根据实施例1至4中任一项所述的群，其包含至少约1×109个人Treg细胞。
6.根据实施例1至5中任一项所述的群，其中所述人Treg细胞通过使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯细胞内染色染料或CellTraceTMViolet细胞内染色染料的测定确定具有免疫抑制性。
7.一种用于从至少一个冻存的人脐带血单位产生扩增的活化人调节性T(Treg)细胞群的方法，所述方法包含：
a)解冻冻存的人脐带血单位；
b)在功能封闭的系统中稀释和洗涤所述解冻的脐带血单位；
c)基于CD25+细胞表面表达使用双重选择方法分离天然存在的Treg细胞；
d)在气体可渗透性培养器皿内的培养基中，在存在有效量的白介素-2(IL-2)和与CD3和CD28特异性结合的试剂的情况下离体扩增所分离的CD25+Treg细胞多达10天、多达12天或多达14天，其中所述培养基约每48小时更换一次，以产生活化CD25+Treg细胞群；和
e)从所述培养基中收集所述活化CD25+细胞以产生扩增的活化人Treg细胞群。
8.根据实施例7所述的方法，其中使用单个脐带血单位。
9.根据实施例7所述的方法，其中使用2至4个汇集的脐带血单位。
10.根据实施例7至9中任一项所述的方法，其中与CD25特异性结合的试剂是一种抗CD25抗体或其抗原结合片段。
11.根据实施例7至10中任一项所述的方法，其中与CD25特异性结合的试剂缀合至固体载体。
12.根据实施例11所述的方法，其中所述固体载体是一种磁微珠。
13.根据实施例7至11中任一项所述的方法，其中与CD3和CD28特异性结合的试剂包含抗CD3抗体或其抗原结合片段和抗CD28抗体或其抗原结合片段。
14.根据实施例7至12中任一项所述的方法，其中与CD3和CD28特异性结合的试剂包含抗CD3包被珠和抗CD28包被珠。
15.根据实施例14所述的方法，其中所述抗CD3包被珠和所述抗CD28包被珠的比为1:1。
16.根据实施例14或15所述的方法，其中所述CD25+细胞和所述抗CD3和抗CD28包被珠的比为1:1。
17.根据实施例7至16中任一项所述的方法，其中，IL-2的有效量多达约1000IU/ml。
18.根据实施例7至17中任一项所述的方法，其中IL-2的有效量为约1000IU/ml。
19.根据实施例7至18中任一项所述的方法，其中在步骤d)刚开始时，将步骤c)中所分离的CD25+Treg细胞悬浮在包含IL-2的培养基中。
20.根据实施例7至19中任一项所述的方法，其中在步骤e)中，培养约1×106个CD25+细胞/mL。
21.根据实施例7至20中任一项所述的方法，其中在步骤e)中，所述细胞最初在膜表面积为10cm2的气体可渗透性培养器皿中培养。
22.根据实施例21所述的方法，其中所述培养物随后转移到膜表面积为100cm2的的气体可渗透性培养器皿中。
23.根据实施例7至22中任一项所述的方法，其中在步骤d)中，所述培养物不进行混合和重新悬浮。
24.根据实施例7至23中任一项所述的方法，其中在培养14天后收集约1×109至约2×109个活化CD25+细胞。
25.根据实施例7至24中任一项所述的方法，其中在步骤a)中，所述冻存的人脐带血单位在水浴中一步解冻。
26.根据实施例7至25中任一项所述的方法，其中步骤b)不包含手动洗涤。
27.根据实施例7至26中任一项所述的方法，其中步骤b)在包含PBS、EDTA和约0.5％人血清白蛋白的溶液中进行。
28.根据实施例7至27中任一项所述的方法，其中在步骤c)中使用双铁磁柱法分离CD25+Treg细胞。
29.一种用于从至少一个冻存的人脐带血单位产生扩增的活化人调节性T(Treg)细胞群的方法，所述方法包含：
a)在水浴中一步解冻所述冻存的人脐带血单位；
b)在功能封闭的系统中于包含PBS、EDTA和0.5％人血清白蛋白的溶液中稀释和洗涤所述解冻的脐带血单位，而无需手动洗涤；
c)基于CD25+细胞表面表达使用双重选择方法及使用双铁磁柱法分离天然存在的Treg细胞；
d)在气体可渗透性培养器皿内的培养基中，在存在约1000IU/ml白介素-2(IL-2)和抗CD3和抗CD28包被珠的情况下离体扩增所分离的CD25+Treg细胞多达10天、多达12天或多达14天，其中所述培养基约每48小时更换一次，以产生活化CD25+Treg细胞群；
其中所述CD25+Treg细胞和所述抗CD3和抗CD28包被珠的比为1:1；
其中培养物不进行混合和重新悬浮；和
e)从所述培养基中收集所述活化CD25+细胞以产生扩增的活化人Treg细胞群。
30.根据实施例7至29中任一项所述的方法，所述方法还包含冻存所述扩增的活化人Treg细胞群。
31.一种通过根据实施例7至30中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群，其中所述Treg细胞为至少90％CXCR4+。
32.根据实施例1至6中任一项所述的群，其中所述Treg细胞为至少90％CXCR4+。
33.根据实施例1至6、31和32中任一项所述的群，其中所述Treg细胞为至少95％CXCR4+、至少95％CD45RA+和至少80％CD45RO+。
34.根据实施例1至6和31至33中任一项所述的群，其中所述Treg细胞进一步为至少95％CD95+、至少95％HLADR+、至少95％α4β7+、至少15％CXCR3hi+、至少95％CCR6+、至少95％CD54+、至少95％CD11A+、至少85％CD45RARO+、至少80％CTLA4+、至少80％GPR83+和至少80％CD62L+。
35.根据实施例1至6和31至34中任一项所述的群，其中所述Treg细胞为至少95％CXCR4+、至少95％CD45RA+、至少80％CD45RO+、至少95％CD95+、至少95％HLADR+、至少95％α4β7+、至少15％CXCR3hi+、至少95％CCR6+、至少95％CD54+、至少95％CD11A+、至少85％CD45RARO+、至少80％CTLA4+、至少80％GPR83+和至少80％CD62L+。
36.根据实施例1至6和31至35中任一项所述的群，其中所述Treg细胞表现出FOXP3的高表达和RORγt的低表达。
37.根据实施例1至6和31至36中任一项所述的群，其中所述Treg细胞维持其多克隆T细胞受体Vβ(TCR Vβ)谱型。
38.根据实施例1至6和31至37中任一项所述的群，其中所述Treg细胞在使用之前冻存。
39.一种用于冻存从至少一个冻存的人脐带血单位产生的扩增的活化人调节性T(Treg)细胞群的方法，所述方法包含：
a)解冻所述冻存的人脐带血单位；
b)在功能封闭的系统中稀释和洗涤解冻的脐带血单位；
c)基于CD25+细胞表面表达使用双重选择方法分离天然存在的Treg细胞；
d)在气体可渗透性培养器皿内的培养基中，在存在有效量的白介素-2(IL-2)和与CD3和CD28特异性结合的试剂的情况下离体扩增所分离的CD25+Treg细胞多达10天、多达12天或多达14天，其中所述培养基约每48小时更换一次，以产生活化CD25+Treg细胞群；
e)从所述培养基收集所述活化CD25+细胞以产生扩增的活化人Treg细胞群；和
f)冻存所述扩增的活化人Treg细胞群。
40.一种用于在受试者中治疗或预防移植物抗宿主疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的通过实施例5至28和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或实施例1至6和31至38中任一项所述的群。
41.一种用于在受试者中治疗或预防移植物抗宿主疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用(i)有效量的通过实施例7至30和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或实施例1至6和31至38中任一项所述的群和(ii)鲁索替尼。
42.一种用于在受试者中治疗或预防骨髓衰竭综合征的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的通过实施例7至30和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或实施例1至6和31至38中任一项所述的群。
43.根据实施例42所述的方法，其中所述骨髓衰竭综合征是再生障碍性贫血、原发性骨髓纤维化或骨髓增生异常综合征。
44.一种用于在受试者中治疗或预防原发性骨髓纤维化的方法，所述方法包含向所述受试者施用(i)有效量的通过实施例7至30和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或实施例1至6和31至38中任一项所述的群和(ii)鲁索替尼。
45.一种用于在受试者中治疗或预防系统性红斑狼疮(SLE)的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的通过实施例7至30和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或实施例1至6和31至38中任一项所述的群。
46.一种用于在受试者中治疗或预防多发性骨髓瘤的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的通过实施例7至30和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或实施例1至6和31至38中任一项所述的群。
47.一种用于在受试者中治疗或预防神经炎性病症的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的通过实施例7-30和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或实施例1至6和31至38中任一项所述的群。
48.根据实施例47所述的方法，其中所述神经炎性病症是格林-巴利综合征、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化或脱髓鞘性神经病。
49.一种用于在受试者中治疗或预防与严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染相关联的呼吸系统疾病、病症或病状的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的通过实施例7至30和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或实施例1至6和31至38中任一项所述的群。
50.根据实施例49所述的方法，其中所述呼吸系统疾病、病症或病状是COVID-19(冠状病毒疾病)介导的急性呼吸窘迫综合征(CoV-ARDS)。
51.一种用于在受试者中治疗或预防细胞因子释放综合征(CRS)的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的通过实施例7至30和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或实施例1至6和31至38中任一项所述的群。
52.根据实施例51所述的方法，其中所述CRS与嵌合抗原受体T-细胞疗法相关联。
53.根据实施例40至52中任一项所述的方法，其中将所述有效量的活化人Treg细胞群静脉内施用于受试者。
54.实施例40至53中任一项所述的方法，其中所述活化人Treg细胞群的有效量在约1×106和约1×107个Treg细胞/kg所述受试者体重之间。
55.根据实施例40至53中任一项所述的方法，其中所述活化人Treg细胞群的有效量在约1×108个Treg细胞和约3×108个Treg细胞之间。
56.根据实施例40至55中任一项所述的方法，其中所述多剂量的有效量的活化人Treg细胞群施用于所述受试者。
57.根据实施例56所述的方法，其中三或四个剂量施用于所述受试者。
58.根据实施例56或57所述的方法，其中所述剂量约每4至6周施用于所述受试者。
59.根据实施例40至58中任一项所述的方法，其中在施用有效量的活化人Treg细胞群后，所述受试者中的循环炎性细胞因子水平与施用前所述受试者中的循环炎性细胞因子水平相比降低。
60.根据实施例40至59中任一项所述的方法，其中在治疗之前，检验所述受试者的血清生物标志物，以确定所述受试者是否将对所述有效量的活化人Treg细胞群产生反应。
61.根据实施例40至60中任一项所述的方法，其中在治疗之后，检验所述受试者的血清生物标志物以确定与临床反应的相关性。
62.根据实施例61所述的方法，其中连续检验所述血清生物标志物以诊察是否需要用Treg细胞进行后续再治疗。
63.根据实施例40至62中任一项所述的方法，其中所述活化人Treg细胞群由与受试者相容的血型的一个或多个脐带血单位制备。
64.根据实施例40至63中任一项所述的方法，其中所述活化人Treg细胞群由对于所述受试者至少3/6HLA(人白细胞抗原)匹配的脐带血单位制备。
65.根据实施例40至62中任一项所述的方法，其中所述活化人Treg细胞群由对于所述受试者HLA不匹配的脐带血单位制备。
66.根据实施例1至6和31至38中任一项所述的群在制备药剂中的用途。

Claims (66)

1.一种人Treg细胞群，其包含至少约1×108个人Treg细胞，所述人Treg细胞为：
(i)≥60％CD4+CD25+；和
(ii)≤10％CD4-CD8+；
其中所述人Treg细胞具有免疫抑制性。
2.一种人Treg细胞群，其包含至少约1×108个人Treg细胞，所述人Treg细胞为：
(i)≥60％CD4+CD25+；
(ii)≥60％CD4+CD25+CXCR4+；和
(iii)≤10％CD4-CD8+；
其中所述人Treg细胞具有免疫抑制性。
3.一种人Treg细胞群，其包含至少约1×108个人Treg细胞，所述人Treg细胞为：
(i)≥60％CD4+CD25+；
(ii)≥60％CD4+CD25+α4β7+；和
(iii)≤10％CD4-CD8+；
其中所述人Treg细胞具有免疫抑制性。
4.一种人Treg细胞群，其包含至少约1×108个人Treg细胞，所述人Treg细胞为：
(i)≥60％CD4+CD25+；
(ii)≥60％CD4+CD25+CD11a+；和
(iii)≤10％CD4-CD8+；
其中所述人Treg细胞具有免疫抑制性。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的群，其包含至少约1×109个人Treg细胞。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的群，其中所述人Treg细胞通过使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯细胞内染色染料或CellTraceTM Violet细胞内染色染料的测定确定具有免疫抑制性。
7.一种用于从至少一个冻存的人脐带血单位产生扩增的活化人调节性T(Treg)细胞群的方法，所述方法包含：
a)解冻所述冻存的人脐带血单位；
b)在功能封闭的系统中稀释和洗涤解冻的脐带血单位；
c)基于CD25+细胞表面表达使用双重选择方法分离天然存在的Treg细胞；
d)在气体可渗透性培养器皿内的培养基中，在存在有效量的白介素-2(IL-2)和与CD3和CD28特异性结合的试剂的情况下离体扩增所分离的CD25+Treg细胞多达10天、多达12天或多达14天，其中所述培养基约每48小时更换一次，以产生活化CD25+Treg细胞群；和
e)从所述培养基中收集活化CD25+细胞以产生扩增的活化人Treg细胞群。
8.根据权利要求7所述的方法，其中使用单个脐带血单位。
9.根据权利要求7所述的方法，其中使用2至4个汇集的脐带血单位。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中与CD25特异性结合的试剂是抗CD25抗体或其抗原结合片段。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述与CD25特异性结合的试剂缀合到固体载体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述固体载体是磁微珠。
13.根据权利要求7至11中任一项所述的方法，其中所述与CD3和CD28特异性结合的试剂包含抗CD3抗体或其抗原结合片段和抗CD28抗体或其抗原结合片段。
14.根据权利要求7至12中任一项所述的方法，其中所述与CD3和CD28特异性结合的试剂包含抗CD3包被珠和抗CD28包被珠。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗CD3包被珠和所述抗CD28包被珠的比为1:1。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述CD25+细胞和所述抗CD3和抗CD28包被珠的比为1:1。
17.根据权利要求7至16中任一项所述的方法，其中所述IL-2的有效量多达约1000IU/ml。
18.根据权利要求7至17中任一项所述的方法，其中所述IL-2的有效量为约1000IU/ml。
19.根据权利要求7至18中任一项所述的方法，其中在步骤d)刚开始时，将步骤c)中所分离的CD25+Treg细胞悬浮在包含IL-2的培养基中。
20.根据权利要求7至19中任一项所述的方法，其中在步骤e)中，培养约1×106个CD25+细胞/mL。
21.根据权利要求7至20中任一项所述的方法，其中在步骤e)中，所述细胞最初在膜表面积为10cm2的气体可渗透性培养器皿中培养。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述培养物随后被转移到膜表面积为100cm2的气体可渗透性培养器皿中。
23.根据权利要求7至22中任一项所述的方法，其中在步骤d)中，所述培养物不进行混合和重新悬浮。
24.根据权利要求7至23中任一项所述的方法，其中在培养14天后收集约1×109至约2×109活化CD25+细胞。
25.根据权利要求7至24中任一项所述的方法，其中在步骤a)中，所述冻存的人脐带血单位在水浴中一步解冻。
26.根据权利要求7至25中任一项所述的方法，其中步骤b)不包含手动洗涤。
27.根据权利要求7至26中任一项所述的方法，其中步骤b)在包含PBS、EDTA和约0.5％人血清白蛋白的溶液中进行。
28.根据权利要求7至27中任一项所述的方法，其中在步骤c)中使用双铁磁柱法分离CD25+Treg细胞。
29.一种用于从至少一个冻存的人脐带血单位产生扩增的活化人调节性T(Treg)细胞群的方法，所述方法包含：
a)在水浴中一步解冻所述冻存的人脐带血单位；
b)在功能封闭的系统中于包含PBS、EDTA和0.5％人血清白蛋白的溶液中稀释和洗涤解冻的脐带血单位，而无需手动洗涤；
c)基于CD25+细胞表面表达使用双重选择方法及使用双铁磁柱法分离天然存在的Treg细胞；
d)在气体可渗透性培养器皿内的培养基中，在存在约1000IU/ml白介素-2(IL-2)和抗CD3和抗CD28包被珠的情况下离体扩增所分离的CD25+Treg细胞多达10天、多达12天或多达14天，其中所述培养基约每48小时更换一次，以产生活化CD25+Treg细胞群；
其中所述CD25+Treg细胞和所述抗CD3和抗CD28包被珠的比为1:1；
其中培养物不进行混合和重新悬浮；和
e)从所述培养基中收集所述活化CD25+细胞以产生扩增的活化人Treg细胞群。
30.根据权利要求7至29中任一项所述的方法，所述方法还包含冻存所述扩增的活化人Treg细胞群。
31.一种通过根据权利要求7至30中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群，其中所述Treg细胞为至少90％CXCR4+。
32.根据权利要求1至6中任一项所述的群，其中所述Treg细胞为至少90％CXCR4+。
33.根据权利要求1至6、31和32中任一项所述的群，其中所述Treg细胞为至少95％CXCR4+、至少95％CD45RA+和至少80％CD45RO+。
34.根据权利要求1至6和31至33中任一项所述的群，其中所述Treg细胞进一步为至少95％CD95+、至少95％HLADR+、至少95％α4β7+、至少15％CXCR3hi+、至少95％CCR6+、至少95％CD54+、至少95％CD11A+、至少85％CD45RARO+、至少80％CTLA4+、至少80％GPR83+和至少80％CD62L+。
35.根据权利要求1至6和31至34中任一项所述的群，其中所述Treg细胞为至少95％CXCR4+、至少95％CD45RA+、至少80％CD45RO+、至少95％CD95+、至少95％HLADR+、至少95％α4β7+、至少15％CXCR3hi+、至少95％CCR6+、至少95％CD54+、至少95％CD11A+、至少85％CD45RARO+、至少80％CTLA4+、至少80％GPR83+和至少80％CD62L+。
36.根据权利要求1至6和31至35中任一项所述的群，其中所述Treg细胞表现出FOXP3的高表达和RORγt的低表达。
37.根据权利要求1至6和31至36中任一项所述的群，其中所述Treg细胞维持其多克隆T细胞受体Vβ(TCR Vβ)谱型。
38.根据权利要求1至6和31至37中任一项所述的群，其中所述Treg细胞在使用之前冻存。
39.一种用于冻存从至少一个冻存的人脐带血单位产生的扩增的活化人调节性T(Treg)细胞群的方法，所述方法包含：
a)解冻所述冻存的人脐带血单位；
b)在功能封闭的系统中稀释和洗涤解冻的脐带血单位；
c)基于CD25+细胞表面表达使用双重选择方法分离天然存在的Treg细胞；
d)在气体可渗透性培养器皿内的培养基中，在存在有效量的白介素-2(IL-2)和与CD3和CD28特异性结合的试剂的情况下离体扩增所分离的CD25+Treg细胞多达10天、多达12天或多达14天，其中所述培养基约每48小时更换一次，以产生活化CD25+Treg细胞群；
e)从所述培养基收集所述活化CD25+细胞以产生扩增的活化人Treg细胞群；和
f)冻存所述扩增的活化人Treg细胞群。
40.一种用于在受试者中治疗或预防移植物抗宿主疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的通过根据权利要求5至28和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或根据权利要求1至6和31至38中任一项所述的群。
41.一种用于在受试者中治疗或预防移植物抗宿主疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用(i)有效量的通过根据权利要求7至30和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或根据权利要求1至6和31至38中任一项所述的群和(ii)鲁索替尼(ruxolitinib)。
42.一种用于在受试者中治疗或预防骨髓衰竭综合征的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的通过根据权利要求7至30和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或根据权利要求1至6和31至38中任一项所述的群。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述骨髓衰竭综合征是再生障碍性贫血、原发性骨髓纤维化或骨髓增生异常综合征。
44.一种用于在受试者中治疗或预防原发性骨髓纤维化的方法，所述方法包含向所述受试者施用(i)有效量的通过根据权利要求7至30和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或根据权利要求1至6和31至38中任一项所述的群和(ii)鲁索替尼。
45.一种用于在受试者中治疗或预防系统性红斑狼疮(SLE)的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的通过根据权利要求7至30和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或根据权利要求1至6和31至38中任一项所述的群。
46.一种用于在受试者中治疗或预防多发性骨髓瘤的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的通过根据权利要求7至30和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或根据权利要求1至6和31至38中任一项所述的群。
47.一种用于在受试者中治疗或预防神经炎性病症的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的通过根据权利要求7至30和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或根据权利要求1至6和31至38中任一项所述的群。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述神经炎性病症是格林-巴利综合征、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化或脱髓鞘性神经病。
49.一种用于在受试者中治疗或预防与严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染相关联的呼吸系统疾病、病症或病状的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的通过根据权利要求7至30和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或根据权利要求1至6和31至38中任一项所述的群。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述呼吸系统疾病、病症或病状是COVID-19(冠状病毒疾病)介导的急性呼吸窘迫综合征(CoV-ARDS)。
51.一种用于在受试者中治疗或预防细胞因子释放综合征(CRS)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的通过根据权利要求7至30和39中任一项所述的方法产生的活化人Treg细胞群或根据权利要求1至6和31至38中任一项所述的群。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述CRS与嵌合抗原受体T细胞疗法相关联。
53.根据权利要求40至52中任一项所述的方法，其中将所述有效量的所述活化人Treg细胞群静脉内施用于所述受试者。
54.根据权利要求40至53中任一项所述的方法，其中所述活化人Treg细胞群的所述有效量在约1×106和约1×107个Treg细胞/kg所述受试者体重之间。
55.根据权利要求40至53中任一项所述的方法，其中所述活化人Treg细胞群的所述有效量在约1×108个Treg细胞和约3×108个Treg细胞之间。
56.根据权利要求40至55中任一项所述的方法，其中多剂量的有效量的所述活化人Treg细胞群施用于所述受试者。
57.根据权利要求56所述的方法，其中三或四个剂量施用于所述受试者。
58.根据权利要求56或57所述的方法，其中所述剂量约每4至6周施用于所述受试者。
59.根据权利要求40至58中任一项所述的方法，其中在施用所述有效量的所述活化人Treg细胞群之后，所述受试者中的循环炎性细胞因子水平与施用前所述受试者中的所述循环炎性细胞因子水平相比降低。
60.根据权利要求40至59中任一项所述的方法，其中在治疗之前，检验所述受试者的血清生物标志物，以确定所述受试者是否将对所述有效量的所述活化人Treg细胞群产生反应。
61.根据权利要求40至60中任一项所述的方法，其中在治疗之后，检查所述受试者的血清生物标志物以确定与临床反应的相关性。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述血清生物标志物进行连续检验以诊察是否需要用Treg细胞进行后续再治疗。
63.根据权利要求40至62中任一项所述的方法，其中所述活化人Treg细胞群由与所述受试者相容的血型的一个或多个脐带血单位制备。
64.根据权利要求40至63中任一项所述的方法，其中所述活化人Treg细胞群由对于所述受试者至少3/6HLA(人白细胞抗原)匹配的脐带血单位制备。
65.根据权利要求40至62中任一项所述的方法，其中所述活化人Treg细胞群由对于所述受试者HLA不匹配的脐带血单位制备。
66.根据权利要求1至6和31至38中任一项所述的群在制备药剂中的用途。
CN202080075035.5A 2019-09-26 2020-09-25 包含调节性t细胞的组合物及其制备和使用方法 Pending CN114616324A (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962906283P 2019-09-26 2019-09-26
US62/906,283 2019-09-26
US202062990913P 2020-03-17 2020-03-17
US62/990,913 2020-03-17
US202063038345P 2020-06-12 2020-06-12
US63/038,345 2020-06-12
US202063064129P 2020-08-11 2020-08-11
US63/064,129 2020-08-11
PCT/US2020/052815 WO2021062221A1 (en) 2019-09-26 2020-09-25 Compositions comprising regulatory t cells and methods of making and using the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114616324A true CN114616324A (zh) 2022-06-10

Family

ID=72812028

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080075035.5A Pending CN114616324A (zh) 2019-09-26 2020-09-25 包含调节性t细胞的组合物及其制备和使用方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20210121500A1 (zh)
EP (1) EP4034639A1 (zh)
JP (1) JP2022550132A (zh)
KR (1) KR20220066165A (zh)
CN (1) CN114616324A (zh)
AU (1) AU2020353154A1 (zh)
CA (1) CA3151724A1 (zh)
IL (1) IL291622A (zh)
WO (1) WO2021062221A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3211823A1 (en) * 2021-03-22 2022-09-29 Board Of Regents, The University Of Texas System A method for selection of cryopreserved cord blood units for the manufacture of engineered natural killer cells with enhanced potency against cancer
CA3211348A1 (en) * 2021-03-22 2022-09-29 Simrit PARMAR Compositions comprising regulatory t cells and methods of using the same
WO2022204523A1 (en) * 2021-03-25 2022-09-29 Cellenkos, Inc. Populations of enriched regulatory t cells and methods for producing same
CN113564117B (zh) * 2021-08-23 2023-12-26 山东省齐鲁干细胞工程有限公司 一种冻存脐带血来源调节性t细胞体外扩增优化方法
AU2022348562A1 (en) * 2021-09-16 2024-04-11 Coya Therapeutics, Inc. Serum immune-based biomarkers for use in als therapy
WO2024020531A1 (en) * 2022-07-21 2024-01-25 Tract Therapeutics, Inc. Immune cell expansion and uses thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US7572631B2 (en) * 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
ES2564789T3 (es) * 2004-09-15 2016-03-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Métodos para el aislamiento y la expansión de células T reguladoras derivadas de sangre de cordón
BR112013033988B1 (pt) * 2011-07-01 2021-10-19 Beckman Coulter, Inc. Métodos de identificação e isolamento de uma ou mais populações de células t regulatórias imunossupressoras

Also Published As

Publication number Publication date
IL291622A (en) 2022-05-01
JP2022550132A (ja) 2022-11-30
CA3151724A1 (en) 2021-04-01
EP4034639A1 (en) 2022-08-03
AU2020353154A1 (en) 2022-03-31
KR20220066165A (ko) 2022-05-23
WO2021062221A1 (en) 2021-04-01
US20210121500A1 (en) 2021-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Copelan et al. Allogeneic hematopoietic cell transplantation; the current renaissance
AU2021203382B2 (en) Therapeutic pooled blood apoptotic cell preparations and uses thereof
CN114616324A (zh) 包含调节性t细胞的组合物及其制备和使用方法
Tang et al. The therapeutic effect of ICAM-1-overexpressing mesenchymal stem cells on acute graft-versus-host disease
US10286049B2 (en) Tumor vaccination in combination with hematopoietic cell transplantation for cancer therapy
Gregoire-Gauthier et al. Therapeutic efficacy of cord blood-derived mesenchymal stromal cells for the prevention of acute graft-versus-host disease in a xenogenic mouse model
US20230066340A1 (en) Populations of enriched regulatory t cells and methods for producing same
US20220298477A1 (en) Compositions comprising regulatory t cells and methods of using the same
Ciomber et al. Immunological properties of bone marrow microenvironment 1 year after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation
Sahdev et al. Hematopoietic Stem Cell Transplantation
Abdel-Azim et al. Hematopoietic stem cell transplantation and cellular therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination