BR112013033988B1 - Métodos de identificação e isolamento de uma ou mais populações de células t regulatórias imunossupressoras - Google Patents
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Abstract
métodos de identificação, uso, kit, composição e método de enriquecimento de células t regulatórias. a presente invenção refere-se a células t regulatórias, a composições incluindo células t regulatórias, a métodos de identificação, ao isolamento, ao enriquecimento, à obtenção e/ou expansão de células t regulatórias, ou populações de subconjunto destes, a kits incluindo componentes úteis para realização de tais métodos, ea métodos de tratamento de um distúrbio à base de imuno em um indivíduo por administração de células t regulatórias, ou composições compreendendo tais células t regulatórias a um indivíduo em necessidade deste.
Description
[0001] As células T ou linfócitos T pertencem a um grupo de células brancas do sangue conhecidas como linfócitos, e desempenham um papel na imunidade mediada por célula. Elas podem ser distinguidas de outros tipos de linfócito, tais como células B, pela presença de um receptor especial em sua superfície de célula denominado receptores de célula T (TCR). Vários subconjuntos diferentes de células T foram descobertos, cada um com uma função distinta incluindo célula auxiliadora T (células TH), Células T Citotóxicas (células TC, ou CTLs), Células T de Memória (células TM) incluindo Células T de memória central (células TCM) e Células T de memória efetuadoras (células TEM), Células T matadoras naturais (Células T NK), Células T gama delta (Células T Yδ), e células T regulatórias (células Treg).
[0002] As células T regulatórias, também conhecidas como células T supressoras, são uma subpopulação especializada de células T que agem para suprimir respostas imunes de outras células. Por exemplo, as células Treg desempenham um papel maior na supressão de imunidade mediada por célula T durante uma reação imune, e na supressão de células T autorreativas que escaparam no processo de seleção negativa no timo. Como tal, as células Treg proporcionam uma importante "autoverificação" para impedir reações imunogênicas excessivas e são, desse modo, cruciais para a manutenção de homeostase do sistema imune, e tolerância a autos antígenos.
[0003] Duas classes maiores de células Treg são as células Treg que ocorrem naturalmente, e as células Treg adaptativas. As células Treg que ocorrem naturalmente (também conhecidas como células CD4+CD25+FoxP3+ Treg) ocorrem no timo, e foram ligadas a interações entre desenvolvimento de células T com ambas células de mieloide (CD11c+) e células dendríticas de plasmacitoide (CD123+) que foram ativadas com TSLP. As células Treg adaptativas (incluindo células Tr1, células Th2, células Th3, e células Th17) parecem se originarem na periferia durante uma resposta imune normal, e parecem promover desenvolvimento de função da célula Treg.
[0004] As células Treg adaptativas compartilham muitos dos atributos de células Treg que ocorrem naturalmente, mas podem diferir nos biomarcadores de superfície de célula críticos e atributos funcionais. Por exemplo, células Tr1 e Th3 foram descritas que produzem IL-10 e TGFβ, respectivamente. Estes resultados têm conduzido a novas abordagens para imunoterapia como a capacidade de isolar, enriquecer, e expandir este subconjunto de célula em camundongos, tem conduzido a novas intervenções terapêuticas em doenças imunológicas.
[0005] A identificação de células Treg que ocorrem naturalmente como um componente importante de autotolerância tem aberto uma área maior de investigação na imunologia e no processo básico que controla a tolerância imune. As células T regulatórias têm um perfil terapêutico unido e robusto. As células requerem ativação mediada por receptor de célula T específica (TCR) para desenvolver atividade regulatória, mas sua função efetuadora parece ser não específica, regulando as respostas inflamatórias locais através de uma combinação de contato célula-célula e produção de citocina supressiva. Numerosos estudos têm demonstrado a influência potente de célula Treg que ocorre naturalmente na supressão de respostas imunes patológicas em doenças autoimune, transplante, e doenças de enxerto vs hospedeiro. Contudo, um obstáculo maior ao estudo e aplicação de células Treg que ocorrem naturalmente na saúde humana tem sido a carência de biomarcadores de superfície de célula específicos para definir e separar células Treg de outros subconjuntos de células T, tais como, por exemplo, células TH, células TC, células TCM, células TEM, bem como para distinguir entre subpopulações diferentes de células Treg.
[0006] Um número de métodos diferentes é empregado na pesquisa para identificar, isolar, enriquecer, ou, de outro modo, explorar células Treg. Os marcadores mais amplamente usados para células Treg que ocorrem naturalmente são grupos de diferenciação 4 (CD4), grupo de diferenciação 25 (CD25), forquilha superior/caixa de fator de transcrição de hélice-alada P3 (FoxP3), antígeno 4 associado a linfócito T 4 (CTLA- 4), gene relacionado a família de receptor de fator de necrose de tumor induzido por glicocorticoide (GITR), gene-3 de ativação de linfócito (LAG-3), e grupo de diferenciação 127 (CD127). Infelizmente, o acúmulo de evidência sugere que os marcadores acima listados não são estritamente específicos de célula Treg. Por exemplo, alta expressão de marcadores de superfície de CD25 e CD4 (células CD4+CD25+) foi originalmente usada para identificar células Treg que ocorrem naturalmente. Contudo, CD4 é também expresso nas células TH, e em uma subpopulação de células TM. CD25 é também expresso em células T não regulatórias no ajuste de ativação imune, tal como durante uma resposta imune a uma patogenia. Desse modo, conforme definido por expressão de CD4 e CD25, as células Treg compreendem cerca de 510% de células TH maturas. A medição adicional de expressão celular de Foxp3 permitiu uma análise mais específica de células Treg que ocorrem naturalmente (células CD4+CD25+FoxP3+). Contudo, Foxp3 é também transientemente expresso em células TEM ativadas, e é agora bem documentado que muitas células T humanas CD4+ e CD8+ transientemente expressam Foxp3 sob ativação, incluindo células T CD4+ CD25 low/-, células TH, células TC, e células T de memória. Além disso, FoxP3 é um marcador nuclear que requer permeabilização de membrana de célula antes do manchamento. Como tal, o uso deste biomarcador evita etapas de processamento subsequentes, tais como separação, isolamento, enriquecimento, ou expansão de células Treg que ocorrem naturalmente viáveis para estudos funcionais ou para uso em uma imunoterapia.
[0007] Foi sugerido que a adição de CD127 pode ser usada para discriminar entre células Treg que ocorrem naturalmente (que exibem um padrão de expressão CD127low/-) e células TH (que exibem um padrão de expressão CD127+) em humanos. Contudo, foi recentemente reportado que muitas células T CD4+ regulam para baixo CD127 após ativação. Além disso, a perda de CD127 é uma característica de células auxiliadoras foliculares T (células TFH), que proporcionam ajuda para células B em tonsilas humanas. O CTLA-4 é um regulador negativo de ativação de célula T, que é regulado para cima em todas as células T CD4+ e CD8+ T, 2-3 dias em seguida a ativação. Similarmente, a expressão de GITR e LAG-3 é induzida nas células TEM após ativação. Desse modo, todos os biomarcadores de célula Treg atualmente usados (CD25, CTLA-4, GITR, CD127, LAG-3, GARP e FoxP3) parecem ser marcadores de ativação de célula T gerais. Como tal, estes biomarcadores não parecem ser específicos de célula Treg e, portanto, não são viáveis para distinguir as células Treg que ocorrem naturalmente de outros subconjuntos de célula T similares às células TH ativadas. Desse modo, é provável que muitas das células T regulatórias naturais e adaptativas estão faltando nos estudos de biomarcador atual, considerando-se em questão as conclusões relacionadas às deficiências ou defeitos em certos ajustes autoimunes.
[0008] Desse modo, existe uma necessidade de desenvolver métodos de identificação aperfeiçoados, isolamento, enriquecimento, e expansão de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, bem como métodos de modulação de uma reação imune em um indivíduo. Adicionalmente, existe uma necessidade de desenvolver composições compreendendo uma população de célula T regulatória imunossupressora, bem como usos de tais compostos para modulação de uma reação imune em um indivíduo. Por último, existe uma necessidade de desenvolver kits compreendendo biomarcadores e/ou outros componentes úteis para conduzir os métodos acima descritos.
[0009] presente revelação se refere a descoberta que um grupo de diferenciação 6 (CD6) é um biomarcador particularmente útil na identificação de células T regulatórias imunossupressoras em geral, bem como identificação de subpopulações distintas de células T regulatórias imunossupressoras quando usadas em conjunto com outro biomarcador.
[00010] Consequentemente, os aspectos do presente relatório descritivo revelam um método de identificação de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6 no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- identifica uma população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. Em um aspecto, um método de identificação de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. Em outro aspecto, um método de identificação de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os pelo menos três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra.
[00011] Em outro aspecto, um método de identificação de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo contatar uma amostra compreendendo uma população de células T com um ligante de biomarcador CD6; e avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; e no qual detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. Em ainda outro aspecto, um método de identificação de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25 e um ligante de biomarcador CD6; e avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; e no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. Em ainda outro aspecto, um método de identificação de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6; e avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; e no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra.
[00012] Uma amostra pode compreender células T obtidas de sangue, tal como, por exemplo, isoladas de célula mononuclear de sangue periférico (PBMC), linfoide, timo, tutano de osso, ou qualquer amostra específica de tecido/órgão de interesse, incluindo, sem limitação, pâncreas, olho, coração, fígado, nervos, intestino, pele, músculo, cartilagem, ligamento, fluido sinovial, e/ou juntas. Outros biomarcadores que podem ser usados incluem um biomarcador CD127, um biomarcador do grupo de diferenciação 49d (CD49d), um biomarcador do grupo de diferenciação 38 (CD38), um biomarcador do grupo de diferenciação 45RA (CD45RA), um biomarcador de tipo de soro DR de leucócito humano (HLA-DR), um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, um biomarcador GITR, um biomarcador LAG-3, um biomarcador ectonucleotidase (CD39), um biomarcador de membro da família Ikaros de proteínas nucleares de garra de zinco (Helios), um biomarcador de orphan receptor FcRL3 (FcRL3), um biomarcador de receptor de citocina 7 (CCR7 ou CD197), um biomarcador de receptor de citocina 4 (CCR4 ou CD194), um receptor de citocina 8 (CCR8 ou CDw198), um biomarcador do grupo de diferenciação CD62L (CD62L), um biomarcador de coestimulador de célula T induzível (ICOS ou CD278), um biomarcador de grupo de diferenciação 103 (CD103), um biomarcador de morte-1 programada (PD-1), um biomarcador do membro da superfamília de receptor de fator de necrose de tumor OX40 (CD134), um biomarcador de repetições de glicoproteína-A predominantes (GARP), um biomarcador do grupo de diferenciação 45RB (CD45RB), um biomarcador do grupo de diferenciação 45RO (CD45RO), um biomarcador do grupo de diferenciação 95 (CD95), um biomarcador do grupo de diferenciação 122 (CD122), um grupo de diferenciação 147 (CD147), um biomarcador do grupo de diferenciação 8 (CD8), ou qualquer combinação destes. O uso destes biomarcadores adicionais é particularmente útil na identificação de subpopulações de células T regulatórias imunossupressoras. O biomarcador revelado pode ser anticorpos ou ligantes, e pode ser etiquetado ou não etiquetado. Se etiquetado, o biomarcador pode ser etiquetado com um fluoróforo, um ponto de quantum, um fósforo, um composto quimioluminescente, um composto bioluminescente, um composto cromogênico, um composto de isótopo similar a um lantanídeo, um radioisótopo, uma enzima, uma biotina ou molécula de avidina, ou qualquer outra etiqueta para detecção de uma célula ligada pelo biomarcador. A etapa de identificação, incluindo as amostras e biomarcadores úteis, é conforme aqui revelada. A etapa de identificação pode ser usar biomarcadores etiquetados com citometria de fluxo, classificador de célula, partículas/contas magnéticas, lises de complemento, alternação de célula, ou outras metodologias conhecidas a um versado na técnica para isolar ou enriquecer células. Em ainda outro aspecto, um método revelado tem a condição que os biomarcadores usados para avaliar uma amostra não incluem um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, ou ambos um biomarcador FoxP3 e um biomarcador CTLA-4. Os métodos aqui revelados podem compreender adicionalmente isolar ou enriquecer a população de células T regulatórias imunossupressoras identificada. Os métodos aqui revelados podem adicionalmente compreender expansão das população de células T regulatórias imunossupressoras identificada, isolada ou enriquecida.
[00013] Outros aspectos da presente relatório descritivo revelam um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, os método compreendendo avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6, conforme aqui revelado, e isolamento de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras. Em um aspecto, um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; e isolamento de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras. Em outro aspecto, um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os pelo menos três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; e isolamento de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras.
[00014] Em outro aspecto, um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo contatar uma amostra compreendendo uma população de células T com um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras. Em ainda outro aspecto, um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo contatar uma amostra compreendendo uma população de células T com pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-, obtendo- se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras. Em ainda outro aspecto, um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras.
[00015] A etapa de identificação, incluindo as amostras e biomarcadores úteis, é conforme aqui revelada. A etapa de isolamento pode usar biomarcadores etiquetados com citometria de fluxo, classificador de célula, partículas/contas magnéticas, ou outras metodologias conhecidas a um versado na técnica para isolamento de células. A identificação e o isolamento pode proceder em qualquer ordem ou simultaneamente pelo uso de biomarcadores múltiplos, distinguíveis, usados para detectar os determinantes comuns. Em ainda outro aspecto, um método revelado tem a condição que os biomarcadores usados para avaliar e/ou isolar uma amostra não incluem um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, ou ambos um biomarcador FoxP3 e um biomarcador CTLA-4. Os métodos aqui revelados podem adicionalmente compreender enriquecimento ou expansão da subpopulação de células T regulatórias imunossupressoras isolada.
[00016] Ainda outros aspectos do presente relatório descritivo revelam um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras expandida, o método compreendendo avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6, conforme aqui revelado, isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-, conforme aqui revelado, e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida. Em um aspecto, um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras expandida, o método compreendendo as etapas de avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida. Em outro aspecto, um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras expandida, o método compreendendo as etapas de avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os pelo menos três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida.
[00017] Em outro aspecto, um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras expandida, o método compreendendo as etapas de contatar uma amostra compreendendo uma população de células T com um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida. Em ainda outro aspecto, um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras expandida, o método compreendendo as etapas de contatar uma amostra compreendendo uma população de células T com pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25 e um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida. Em ainda outro aspecto, um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras expandida, o método compreendendo as etapas de contatar uma amostra compreendendo uma população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida.
[00018] A etapa de identificação, incluindo as amostras e biomarcadores úteis, bem como a etapa de isolamento, incluindo biomarcadores etiquetados e metodologias, são conforme aqui revelados. Uma composição estimulatória compreende um ativador de TCR/CD3 que é específico de antígeno, e pode adicionalmente compreender um ou mais agentes adicionais incluindo um agente coestimulatório, um segundo agente estimulatório de célula T regulatória, ou um agente de sobrevivência ou crescimento de célula T. Alternativamente, a subpopulação de células T com um padrão de expressão desejado pode, primeiro, ser enriquecida ou expandida, e, em seguida, isolada, conforme aqui revelado.
[00019] Ainda outros aspectos do presente relatório descritivo, revelam um método de modulação de uma reação imune em um indivíduo, o método compreendendo obtenção de uma amostra biológica, a amostra biológica compreendendo uma população de células T individuais compatíveis; avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. Em um aspecto, um método de modulação de uma reação imune em um indivíduo, o método compreendendo obtenção de uma amostra biológica, a amostra biológica compreendendo uma população de células T individuais compatíveis; avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD25+ CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. Em outro aspecto, um método de modulação de uma reação imune em um indivíduo, o método compreendendo obtenção de uma amostra biológica, a amostra biológica compreendendo uma população de células T individuais compatíveis; avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os pelo menos três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo.
[00020] Em outro aspecto, um método de modulação de uma reação imune em um indivíduo, o método compreendendo obtenção de uma amostra biológica, a amostra biológica compreendendo uma população de células T individuais compatíveis; contatar uma amostra compreendendo uma população de células T com um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. Em ainda outro aspecto, um método de modulação de uma reação imune em um indivíduo, o método compreendendo obtenção de uma amostra biológica, a amostra biológica compreendendo uma população de células T individuais compatíveis; contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25 e um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD25+ CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. Em ainda outro aspecto, um método de modulação de uma reação imune em um indivíduo, o método compreendendo obtenção de uma amostra biológica, a amostra biológica compreendendo uma população de células T individuais compatíveis; contatar uma amostra compreendendo uma população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo.
[00021] A etapa de identificação, incluindo as amostras e biomarcadores úteis, bem como a etapa de isolamento, incluindo biomarcadores etiquetados e metodologias, é conforme aqui revelado. Os métodos revelados podem adicionalmente compreender enriquecimento ou expansão da subpopulação de células T com um padrão de expressão desejado, conforme aqui revelado antes da administração da subpopulação de células T no indivíduo. Alternativamente, a população de células T individuais compatíveis na amostra biológica pode ser enriquecida ou expandida antes da avaliação da amostra, conforme aqui revelado, e/ou antes do isolamento da subpopulação de células T com um padrão de expressão desejado, conforme aqui revelado.
[00022] Outros aspectos do presente relatório descritivo revelam um kit compreendendo componentes úteis na realização de qualquer dos métodos aqui revelados. Em um aspecto, um kit para identificar e/ou isolar, ou enriquecer, uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreende um ligante de biomarcador CD6. Em outro aspecto, um kit para identificação, isolamento e/ou enriquecimento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreende pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25 e um ligante de biomarcador CD6. Em ainda outro aspecto, um kit para identificação, isolamento e/ou enriquecimento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreende pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6. Tais kits revelados podem adicionalmente incluir um ligante de biomarcador CD127, um ligante de biomarcador CD49d, um ligante de biomarcador CD38, um ligante de biomarcador CD45RA, um ligante de biomarcador HLA-Dr, um ligante de biomarcador FoxP3, um ligante de biomarcador CTLA-4, um ligante de biomarcador GITR, um ligante de biomarcador LAG-3, um ligante de biomarcador CD39, um ligante de biomarcador Helios, um ligante de biomarcador FcRL3, um ligante de biomarcador CCR7, um ligante de biomarcador CCR4, um ligante de biomarcador CCR8, um ligante de biomarcador CD62L, um ligante de biomarcador ICOS, um ligante de biomarcador CD103, um ligante de biomarcador PD-1, um ligante de biomarcador CD-134, um ligante de biomarcador GARP, um ligante de biomarcador CD45RB, um ligante de biomarcador CD45RO, um ligante de biomarcador CD95, um ligante de biomarcador CD122, um ligante de biomarcador CD147, um ligante de biomarcador CD8, ou qualquer combinação destes. Os ligantes de biomarcador revelados podem ser anticorpos ou ligantes, e podem ser etiquetados ou não etiquetados. Se etiquetado, o ligante de biomarcador pode ser etiquetado com um fluoróforo, um ponto de quantum, um fósforo, um composto quimioluminescente, um composto bioluminescente, um composto cromogênico, um composto isótopo similar a um lantanídeo, um radioisótopo, uma enzima, uma biotina, ou molécula de avidina, ou qualquer etiqueta útil para detecção de uma célula ligada pelo biomarcador. Se não etiquetado, o kit pode adicionalmente incluir uma etiqueta e outros reagentes úteis para etiquetação de um ligante de biomarcador. Em ainda outro aspecto, um kit para expansão de uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreende uma composição estimulatória, conforme aqui revelado. Tal kit pode adicionalmente compreender um ligante de biomarcador CD6, ou pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, conforme aqui revelado. Um kit revelado pode adicionalmente compreender controles positivos e/ou negativos. Adicionalmente, um kit revelado pode adicionalmente compreender instruções para identificação, isolamento, enriquecimento, e/ou expansão de uma população de células T regulatórias imunossupressoras pelo uso dos conteúdos do kit.
[00023] Ainda outros aspectos do presente relatório descritivo revelam uma composição compreendendo uma população de células T regulatórias imunossupressoras obtidas por um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, conforme aqui revelado. Em um aspecto, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é obtida por um método compreendendo avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6, conforme aqui revelado, e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras. Em outro aspecto, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é obtida por um método compreendendo avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular dos pelo menos dois biomarcadores diferentes, os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras. Em ainda outro aspecto, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é obtida por um método compreendendo avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os pelo menos três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras.
[00024] Em outro aspecto, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é obtida por um método compreendendo contatar uma amostra compreendendo a população de células T com um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; e isolar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras. Em ainda outro aspecto, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é obtida por um método compreendendo contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25 e um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras. Em ainda outro aspecto, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é obtida por um método compreendendo contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras.
[00025] A etapa de identificação, incluindo as amostras e biomarcadores úteis, é conforme aqui revelado. A etapa de isolamento pode usar biomarcadores etiquetados com citometria de fluxo, classificador de célula, partículas/contas magnéticas, lises de complemento, alternação de célula, ou outras metodologias conhecidas a um versado na técnica para isolamento de células. A identificação e o isolamento pode proceder em qualquer ordem ou simultaneamente pelo uso de biomarcadores múltiplos, distinguíveis, usados para detectar os determinantes comuns. Os métodos aqui revelados podem adicionalmente compreender enriquecimento ou expansão da população de células T regulatórias imunossupressoras identificada.
[00026] Ainda outros aspectos do presente relatório descritivo revelam o uso de uma composição compreendendo uma população de células T regulatórias imunossupressoras, conforme aqui revelado, para tratar uma resposta imune. Uma resposta imune pode ser uma resposta autoimune.
[00027] Outros aspectos do presente relatório descritivo revelam um método de enriquecimento de células T regulatórias imunossupressoras em um indivíduo, o método compreendendo administrar um anticorpo α- CD6 ao indivíduo, no qual a administração torna as células T inoperáveis compreendendo um padrão de expressão CD6hi/+, mas células não T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-, enriquecendo, desse modo, uma população de células T regulatórias imunossupressoras no indivíduo.
[00028] Outros aspectos do presente relatório descritivo revelam um método de identificação de quatro subconjuntos de maturação distintos de populações de célula T regulatória imunossupressoras. Em um aspecto, o método pode compreender a etapa de avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, e um biomarcador adicional, o um biomarcador adicional sendo um biomarcador FoxP3, um biomarcador CD45RA, um biomarcador CCR4, um biomarcador CD39, ou um biomarcador HLA-Dr; no qual a detecção dos quatro subconjuntos de maturação distintos de células T regulatórias imunossupressoras é baseada em um i) padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/- CD45RA+ em conjunto com um padrão de expressão CCR4low, um padrão de expressão CD39low, ou um padrão de expressão HLA-Dr low; ii) um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD45RA+ em conjunto com um padrão de expressão CCR4-, um padrão de expressão CD39-, ou um padrão de expressão HLA-Dr-; iii) um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD6low/- em conjunto com um padrão de expressão CCR4hi/+, um padrão de expressão CD45RA-, um padrão de expressão CD39hi/+, ou um padrão de expressão HLA-Drlow/-; e iv) um padrão de expressão CD4+CD25+CD6+ em conjunto com padrão de expressão CR4hi/+, um padrão de expressão CD45RA-, um padrão de expressão CD39low/-, ou um padrão de expressão HLA-Drlow/-. Em outro aspecto, o método pode compreender a etapa de avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, um biomarcador CD127, e um biomarcador adicional, o um biomarcador adicional sendo um biomarcador FoxP3, um biomarcador CD45RA, um biomarcador CCR4, um biomarcador CD39, ou um biomarcador HLA-Dr; no qual a detecção dos quatro subconjuntos de maturação distintos de células T regulatórias imunossupressoras é baseado em um i) padrão de expressão CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+ em conjunto com um padrão de expressão CCR4low, um padrão de expressão CD39low, ou um padrão de expressão HLA-Dr low; ii) um padrão de expressão CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+ em conjunto com um padrão de expressão CCR4-, um padrão de expressão CD39-, ou um padrão de expressão HLA-Dr-; iii) um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD127low/- em conjunto com um padrão de expressão CCR4hi/+, um padrão de expressão CD45RA-, um padrão de expressão CD39hi/+, ou um padrão de expressão HLA-Drlow/-; e iv) um padrão de expressão CD4+CD25+CD127+ em conjunto com padrão de expressão CR4hi/+, um padrão de expressão CD45RA-, um padrão de expressão CD39low/-, ou um padrão de expressão HLA-Drlow/-. Os quatro subconjuntos de maturação distintos de populações de célula T regulatória imunossupressoras, incluem, sem limitação, um subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora naive ou de repouso, um subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora de memória ou imatura, um subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora efetuadora ou matura, e um subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora diferencial terminal.
[00029] A Figura 1A mostra gráficos de pontos analisando linfócitos de CD4+ para expressão de CD4/FOXP3 e CD25/FOXP3; e a Figura 1B mostra um gráfico de sobreposição de expressão baixa ou negativa de CD6 nas populações de célula de CD4+FOXP3+ e CD25+FOXP3+, conforme comparadas com população de célula de CD4+FOXP3- e CD4+CD25+FOXP3-, respectivamente.
[00030] A Figura 2A mostra gráficos de pontos analisando linfócitos de CD4+; e a FIG 2B mostra gráficos de pontos analisando linfócitos de CD4+ para expressão de CD6/CD25 e a expressão de FOXP3 nos três subconjuntos de célula CD4+ diferentes: CD25+CD6low/-, CD25-CD6low/- e CD25-CD6+.
[00031] A Figura 3 mostra gráficos de pontos analisando linfócitos para expressão de CD6/CD25 e a expressão de FOXP3 nos três subconjuntos de linfócito diferentes: CD25+CD6low/—, CD25-CD6low/— e CD25-CD6+.
[00032] A Figura 4A mostra gráficos de pontos analisando PBMC para expressão de FOXP3 em população de célula CD6low/— e CD6+; e a Figura 4B mostra um gráfico de % de expressão de célula FOXP3+ em PBMC total, populações de célula PBMC CD6low/— e PBMC CD6+.
[00033] A Figura 5A mostra gráficos de pontos analisando linfócitos para expressão de CD25/CD4, expressão de CD25/CD6, e expressão de CD25/CD127, e expressão de FOXP3 nos seguintes subconjuntos de célula CD4+: CD25+, CD25+CD6low/—, e CD25+CD127low/—; e a Figura 5B mostra gráficos de pontos analisando linfócitos de CD4+CD25+ para expressão de CD6 e CD127, e expressão de FOXP3 nos seguintes subconjuntos de célula CD4+CD25+: CD6low/-CD127low/— e CD6+CD127+; e a Figura 5C mostra um gráfico de expressão de FOXP3 em populações de nTreg diferentes definidas por combinações de marcador diferentes. O gráfico de barras mostra a média + SD obtida de PBMCs isolados a partir do sangue periférico de nove doadores saudáveis diferentes. Enriquecimento alto significante de FOXP3+ é observado em células de CD6lo/-CD127lo/- comparado a populações de CD4+CD25hi, CD6-Treg e CD127-Treg (p < 0,009, teste de U-Mann-Whitney).
[00034] A Figura 6A mostra gráficos de pontos de resultados representativos de pureza de célula de pré- e pós-classificação usando esquema de classificação de uma célula CD4+CD25+CD6low/- (CD6- nTreg) e célula CD4+CD25+CD127low/- (CD127-nTreg); e a Figura 6B mostra um ensaio de Treg-supressão demonstrando células T compreendendo um padrão de expressão CD25+CD6low/- CD4+ que tem uma função de supressão de resposta de dose significante (r<0,99) na proliferação de célula CD8+ estimulada com anticorpos monoclonais α-CD3 e α-CD28. A percentagem de supressão de frequência de precursor (pf) (% supressão= pf amostra/ pf controle de proliferação x 100) é mostrada. A média e SD foram calculados de quatro amostras em CD4+CD25+CD6lo/— e como controle positivo das amostras de nove estudos nos experimentos de ensaio CD4+CD25+CD127lo/-nTreg.
[00035] A Figura 7 mostra gráficos de pontos analisando linfócitos de CD6low/- FOXP3+ para expressão de FOXP3/CD45RA.
[00036] A Figura 8 mostra gráficos de pontos analisando linfócitos de CD4+CD25+CD6low/- para expressão de FOXP3, CTLA-4, CD45RA, ou HLA-Dr.
[00037] A Figura 9A mostra gráficos de pontos analisando linfócitos de CD4+CD25+, CD25+/CD6low/-, e CD25+CD127low/— para expressão de GARP e CD39 ou expressão de CD45RA e CCR4; a Figura 9B mostra gráficos de pontos analisando linfócitos de CD4+CD25+, CD25+/CD6low/- , e CD25+CD127lo/— para expressão de CD4 e FOXP3, HLA-Dr e expressão de FOXP3, ou expressão de CTLA-4 e FOXP3; e a Figura 9C mostra um gráfico de expressão de FOXP3, HLA-Dr, ou CTLA-4 em populações de célula de CD4+CD25+, CD25+/CD6low/-, e CD25+CD127lo/— . O gráfico de barras mostra a média + SD obtidos de cinco amostras de controle saudáveis.
[00038] A Figura 10A mostra um gráfico de pontos analisando linfócitos de CD4+CD25+CD6low/-CD127low/— para CD45RA e expressão de CCR4 e a identificação de três subconjuntos de população de célula: CD45RA+CCR4- (naive/repouso, N/R), CD45RA+/CCR4low (imatura/memória, I/Me) e CD45RA-/CCR4hi (matura/efetuadoras, Ma/E); A Figura 10B mostra gráficos de pontos analisando subconjuntos de população de N/R, I/Me, e Ma/E para expressão de HLA-Dr e CD39, com setas mostrando a direção de expressão de marcador; a Figura 10C mostra um gráfico de pontos analisando linfócitos de CD4+CD25hiCD6+CD127+ para expressão de CD45RA e CCR4 e a identificação de subconjunto de população de célula CCR4hiCD39-HLA- DR- (terminalmente diferenciado, TD); A Figura 10D mostra um gráfico de pontos analisando subconjunto de população de TD para expressão de HLA-Dr e C39; a Figura 10E mostra um gráfico da quantidade de expressão de CD25, CD39, HLA-Dr e CD62L em subconjuntos de população de N/R, I/Me, Ma/E, e TD; a Figura 10F mostra gráficos de pontos analisando subconjuntos de população de N/R, I/Me, e Ma/E definidos por análise de bivariato de CD45RA/CCR4 por uma combinação de retro-acoplamento e análise 3-D de marcadores associados de nTreg em CD6lo/-CD127lo/-nTreg e mostrando que a maioria de células de HLA-DR+ coexpressam CCR4 e CD39; a Figura 10G mostra um gráfico de expressão de FOXP3 em HLA-DR-CD45RA+ (2,3 ± 0,3), HLA-DR-CD45RA- (3,2 ± 0,3), e HLA-DR+CD45RA- (5,0 ± 0,7); A FIG 10H mostra gráficos de pontos analisando população de CD4+CD25hiCD6low/-CD127low/-nTreg para expressão de CD45RA e GARP e a identificação de três subconjuntos de população de célula: CD45RA+GARP- (Pop1), CD45RA-GARP- (Pop2) e CD45RA-GARP+ (Pop3), com setas mostrando a direção de expressão de marcador; e a Figura 10I mostra gráficos de pontos analisando população de CD4+CD25hiCD6+CD127+ nTreg para expressão de CD45RA e GARP.
[00039] O presente relatório descritivo se refere a descoberta que CD6 é um biomarcador particularmente útil na identificação de células T regulatórias imunossupressoras em uma amostra. O presente relatório descritivo revela que detecção de expressão baixa ou negativa de CD6 na membrana de superfície de células T humanas aperfeiçoa a definição de células T regulatórias que ocorrem naturalmente. Esta detecção de CD6low/- permite o desenvolvimento de métodos aperfeiçoados de identificação, isolamento, enriquecimento, e/ou expansão de uma população de células T regulatórias imunossupressoras. Em adição, a capacidade de isolar, enriquecer e/ou expandir CD6low/-células T regulatórias imunossupressoras capazes de desenvolverem terapias de célula úteis no tratamento de distúrbios à base de imuno.
[00040] Os aspectos do presente relatório descritivo revelam, em parte, um método de identificação de uma população de células T regulatórias imunossupressoras. Em uma concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra.
[00041] Em outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com um ligante de biomarcador CD6; e avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra.
[00042] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluindo, um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- identifica uma população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra.
[00043] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25 e um ligante de biomarcador CD6; e avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; e no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra.
[00044] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluindo, um biomarcador CD6 e um biomarcador CD127; no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra.
[00045] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD6 e um ligante de biomarcador CD127; e avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD6 e um biomarcador CD127; e no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127|OW/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra.
[00046] Em outra concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os pelo menos três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra.
[00047] Em outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6; e avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; e no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra.
[00048] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os pelo menos três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, e um biomarcador CD127; no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra.
[00049] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25, um ligante de biomarcador CD6, e um ligante de biomarcador CD127; e avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, e um biomarcador CD127; e no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra.
[00050] Conforme aqui usado, o termo "amostra" ou "amostra biológica" se refere a tecidos ou fluidos corpóreos removidos de um mamífero, preferivelmente humano, e que contém células T regulatórias. As amostras podem ser sangue e/ou frações de sangue, incluindo amostra de sangue periférico similar a amostra de célula mononuclear de sangue periférico (PBMC) ou sangue, amostra de célula de tutano de osso. Uma amostra pode também incluir qualquer amostra de tecidos/órgãos específicos de interesse, incluindo, sem limitação, linfoide, timo, pâncreas, olho, coração, fígado, nervos, intestino, pele, músculo, cartilagem, ligamento, fluido sinovial, e/ou juntas. As amostras podem ser tomadas de qualquer indivíduo incluindo um indivíduo saudável, ou um indivíduo tendo células, tecidos, e/ou um órgão afligidos com a resposta imune indesejada. Por exemplo, uma amostra pode ser tomada de um indivíduo tendo uma alergia, uma doença de enxerto vs. hospedeiro, um transplante de célula ou órgão, ou uma doença ou distúrbio autoimune. Os métodos para obtenção de tais amostras são bem conhecidos a um versado na técnica de imunologia e medicina. Eles incluem retirada e processamento de sangue e componentes de sangue usando procedimentos de rotina, ou obtenção de biópsias a partir do tutano de osso, ou outro tecido ou órgão, usando técnicas médicas padrões.
[00051] Conforme aqui usado, o termo "biomarcador" se refere a um epítope, antígeno ou receptor que é expresso nos linfócitos, ou é diferencialmente expresso em subconjuntos diferentes de linfócitos. A expressão de alguns biomarcadores é específica para células de uma linhagem de célula B ou célula T particular, ou trajetória de maturação, e a expressão de outros varia de acordo com o estado de ativação, posição, ou diferenciação das mesmas células. Um biomarcador pode ser um biomarcador de superfície de célula, ou um biomarcador intracelular. Em uma concretização, os biomarcadores usados nos métodos aqui revelados são todos biomarcadores de superfície de célula. Em outra concretização, os biomarcadores usados nos métodos aqui revelados são todos biomarcadores intracelulares. Em ainda outra concretização, os biomarcadores usados nos métodos aqui revelados incluem ambos biomarcadores de superfície de célula e biomarcadores intracelulares. Biomarcadores exemplares incluem, sem limitação, um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, um biomarcador CD127, um biomarcador CD49d, um biomarcador CD38, um biomarcador CD45RA, um biomarcador HLA-Dr, um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, um biomarcador GITR, um biomarcador LAG-3, um biomarcador CD39, um biomarcador Helios, um biomarcador FcRL3, um biomarcador CCR7, um biomarcador CCR4, um biomarcador CCR8, um biomarcador CD62L, um biomarcador ICOS, um biomarcador CD103, um biomarcador PD-1, um biomarcador CD134, um biomarcador GARP, um biomarcador CD45RB, um biomarcador CD45RO, um biomarcador CD95, um biomarcador CD122, um biomarcador CD147 e um biomarcador CD8. Outros biomarcadores úteis para praticar os métodos revelados e compreenderem os kits revelados são conhecidos na técnica.
[00052] Em uma concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, um biomarcador CD127, um biomarcador CD49d, um biomarcador CD38, um biomarcador CD45RA, um biomarcador HLA-Dr, um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, um biomarcador GITR, um biomarcador LAG-3, um biomarcador CD39, um biomarcador Helios, um biomarcador FcRL3, um biomarcador CCR7, um biomarcador CCR4, um biomarcador CCR8, um biomarcador CD62L, um biomarcador ICOS, um biomarcador CD103, um biomarcador PD-1, um biomarcador CD134, um biomarcador GARP, um biomarcador CD45RB, um biomarcador CD45RO, um biomarcador CD95, um biomarcador CD122, um biomarcador CD8, ou qualquer combinação destes. Em um aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6. Em outro aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6. Em outro aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6 e um biomarcador CD127. Em ainda outro aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6. Em outro aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, e um biomarcador CD127. Em ainda outro aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, e um biomarcador CD127.
[00053] Em outra concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, os dois biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, um biomarcador CD127, um biomarcador CD49d, um biomarcador CD38, um biomarcador CD45RA, um biomarcador HLA-Dr, um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, um biomarcador GITR, um biomarcador LAG-3, um biomarcador CD39, um biomarcador Helios, um biomarcador FcRL3, um biomarcador CCR7, um biomarcador CCR4, um biomarcador CCR8, um biomarcador CD62L, um biomarcador ICOS, um biomarcador CD103, um biomarcador PD-1, um biomarcador CD134, um biomarcador GARP, um biomarcador CD45RB, um biomarcador CD45RO, um biomarcador CD95, um biomarcador CD147, um biomarcador CD122, um biomarcador CD8, ou qualquer combinação destes. Em um aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, os dois biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6. Em outro aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, os dois biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD6 e um biomarcador CD127.
[00054] Em outra concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, um biomarcador CD127, um biomarcador CD49d, um biomarcador CD38, um biomarcador CD45RA, um biomarcador HLA-Dr, um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, um biomarcador GITR, um biomarcador LAG-3, um biomarcador CD39, um biomarcador Helios, um biomarcador FcRL3, um biomarcador CCR7, um biomarcador CCR4, um biomarcador CCR8, um biomarcador CD62L, um biomarcador ICOS, um biomarcador CD103, um biomarcador PD-1, um biomarcador CD134, um biomarcador GARP, um biomarcador CD45RB, um biomarcador CD45RO, um biomarcador CD95, um biomarcador CD122, um biomarcador CD147, um biomarcador CD8, ou qualquer combinação destes. Em um aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6. Em outro aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, e um biomarcador CD127.
[00055] Em outra concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, os dois biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6, e um ou mais dos seguintes biomarcadores adicionais, um biomarcador CD4, um biomarcador CD127, um biomarcador CD49d, um biomarcador CD38, um biomarcador CD45RA, um biomarcador HLA-Dr, um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, um biomarcador GITR, um biomarcador LAG-3, um biomarcador CD39, um biomarcador Helios, um biomarcador FcRL3, um biomarcador CCR7, um biomarcador CCR4, um biomarcador CCR8, um biomarcador CD62L, um biomarcador ICOS, um biomarcador CD103, um biomarcador PD-1, um biomarcador CD134, um biomarcador GARP, um biomarcador CD45RB, um biomarcador CD45RO, um biomarcador CD95, um biomarcador CD122, um biomarcador CD147, um biomarcador CD8, ou qualquer combinação destes.
[00056] Em outra concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6, e um ou mais dos seguintes biomarcadores adicionais, um biomarcador CD127, um biomarcador CD49d, um biomarcador CD38, um biomarcador CD45RA, um biomarcador HLA-Dr, um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, um biomarcador GITR, um biomarcador LAG-3, um biomarcador CD39, um biomarcador Helios, um biomarcador FcRL3, um biomarcador CCR7, um biomarcador CCR4, um biomarcador CCR8, um biomarcador CD62L, um biomarcador ICOS, um biomarcador CD103, um biomarcador PD-1, um biomarcador CD134, um biomarcador GARP, um biomarcador CD45RB, um biomarcador CD45RO, um biomarcador CD95, um biomarcador CD122, um biomarcador CD147, um biomarcador CD8, ou qualquer combinação destes.
[00057] Em outra concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, e um biomarcador CD127, e um ou mais dos seguintes biomarcadores adicionais, um biomarcador CD4, um biomarcador CD49d, um biomarcador CD38, um biomarcador CD45RA, um biomarcador HLA-Dr, um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, um biomarcador GITR, um biomarcador LAG-3, um biomarcador CD39, um biomarcador Helios, um biomarcador FcRL3, um biomarcador CCR7, um biomarcador CCR4, um biomarcador CCR8, um biomarcador CD62L, um biomarcador ICOS, um biomarcador CD103, um biomarcador PD-1, um biomarcador CD134, um biomarcador GARP, um biomarcador CD45RB, um biomarcador CD45RO, um biomarcador CD95, um biomarcador CD122, um biomarcador CD147, um biomarcador CD8, ou qualquer combinação destes.
[00058] Em outra concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, com a condição que os pelo menos dois biomarcadores diferentes usados para avaliar uma amostra não incluem um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, ou ambos um biomarcador FoxP3 e um biomarcador CTLA-4. Em um aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, os dois biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6, com a condição que os pelo menos dois biomarcadores diferentes usados para avaliar uma amostra não incluem um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, ou ambos um biomarcador FoxP3 e um biomarcador CTLA-4. Em outro aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, os dois biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD6 e um biomarcador CD127, com a condição que os pelo menos dois biomarcadores diferentes usados para avaliar uma amostra não incluem um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, ou ambos um biomarcador FoxP3 e um biomarcador CTLA-4. Em ainda outro aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, os dois biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD25 e um biomarcador CD127, com a condição que os pelo menos dois biomarcadores diferentes usados para avaliar uma amostra não incluem um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, ou ambos um biomarcador FoxP3 e um biomarcador CTLA-4. Em ainda outro aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, os dois biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD4 e um biomarcador CD25, com a condição que os pelo menos dois biomarcadores diferentes usados para avaliar uma amostra não incluem um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, ou ambos um biomarcador FoxP3 e um biomarcador CTLA-4.
[00059] Em outra concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, com a condição que os pelo menos três biomarcadores diferentes usados para avaliar uma amostra não incluem um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, ou ambos um biomarcador FoxP3 e um biomarcador CTLA-4. Em um aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6, com a condição que os pelo menos três biomarcadores diferentes usados para avaliar uma amostra não incluem um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, ou ambos um biomarcador FoxP3 e um biomarcador CTLA-4. Em outro aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, e um biomarcador CD127, com a condição que os pelo menos três biomarcadores diferentes usados para avaliar uma amostra não incluem um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, ou ambos um biomarcador FoxP3 e um biomarcador CTLA-4. Em ainda outro aspecto desta concretização, um método aqui revelado inclui avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD127, com a condição que os pelo menos três biomarcadores diferentes usados para avaliar uma amostra não incluem um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, ou ambos um biomarcador FoxP3 e um biomarcador CTLA-4.
[00060] Conforme aqui usado, o termo "ligante de biomarcador" se refere a uma molécula que pode especificamente se ligar a um epítope, antígeno ou receptor que é expresso nos linfócitos, ou é diferencialmente expresso em subconjuntos diferentes de linfócitos. Um ligante de biomarcador inclui um anticorpo. Conforme aqui usado, o termo "anticorpo" se refere a uma molécula gerada por um sistema imune, que foi produzida em resposta a um antígeno particular que especificamente se liga àquele antígeno, e inclui ambos anticorpos que ocorrem naturalmente e anticorpos que ocorrem não naturalmente. Por exemplo, um anticorpo pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um dímero, um multímero, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo recombinante, um anticorpo humanizado ou primatizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo bifuncional, um anticorpo associado à célula similar a um receptor Ig, um anticorpo linear, um diacorpo, ou um minicorpo, considerando-se que o fragmento exibe a atividade biológica desejada, e derivados de cadeia simples do mesmo. Um anticorpo pode ser uma molécula de imunoglobulina de comprimento total compreendendo os domínios VH e VL, bem como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3, ou um fragmento imunologicamente ativo de uma molécula de imunoglobulina de comprimento total, tal como, por exemplo, um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fc, um fragmento Fd, um fragmento Fv. Um anticorpo pode ser derivado de qualquer espécie de vertebrado (por exemplo, humano, cabra, cavalo, macaco, murina, rato, coelho, ou galinha), e pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, e IgA), classe (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM) ou subclasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2). Para revelação geral na estrutura de anticorpos que ocorrem naturalmente, anticorpos que ocorrem não naturalmente, e fragmentos de ligação de composto antigênico destes, ver, por exemplo, Pluckthun na Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrabeck, Antibody Engineering, 2d ed. (Oxford University Press 1995), cada uma da qual sendo aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[00061] Ligantes de biomarcadores exemplares incluem, um anticorpo monoclonal α-CD4, um anticorpo monoclonal α-CD25, um anticorpo monoclonal α-CD6, um anticorpo monoclonal α-CD127, um anticorpo monoclonal α-CD49d, um anticorpo monoclonal α-CD38, um anticorpo monoclonal α-CD45RA, um anticorpo monoclonal α-HLA-DR, um anticorpo monoclonal α-FoxP3, um anticorpo monoclonal α-CTLA-4, um anticorpo monoclonal α-GITR, um anticorpo monoclonal α-LAG-3, um anticorpo monoclonal α-CD39, um anticorpo monoclonal α-Helios, um anticorpo monoclonal α-FcRL3, um anticorpo monoclonal α-CCR7, um anticorpo monoclonal α-CCR4, um anticorpo monoclonal α-CCR8, um anticorpo monoclonal α-CD62L, um anticorpo monoclonal α-ICOS, um anticorpo monoclonal α-CD103, um anticorpo monoclonal α-PD-1, um anticorpo monoclonal α-CD134, um anticorpo monoclonal α-GARP, um anticorpo monoclonal α-CD45RB, um anticorpo monoclonal α- CD45RO, um anticorpo monoclonal α-CD95, um anticorpo monoclonal α-CD122, um anticorpo monoclonal α-CD147, e um anticorpo monoclonal α-CD8. Tais anticorpos monoclonais são comercialmente disponíveis e conhecidos a um versado na técnica. Ver, por exemplo, BD Biosciences (San Jose, CA), eBiosciences (San Diego, CA).
[00062] Em outra concretização, um ligante de biomarcador CD6 é um ligante CD166 (ALCAM), ou qualquer sinal coestimulatório de CD6.
[00063] Um ligante de biomarcador pode ser etiquetado ou não etiquetado. Se etiquetado, o biomarcador pode ser covalentemente ou não covalentemente fixado com um fluoróforo, um ponto de quantum, um fósforo, um composto quimioluminescente, um composto bioluminescente, um composto cromogênico, um composto de isótopo similar a um lantanídeo, um radioisótopo, uma biotina ou molécula de avidina, ou qualquer outra etiqueta útil para detectar uma célula ligada pelo biomarcador. Métodos de fixação de etiquetas a anticorpos são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. Etiquetas particularmente preferidas são aquelas que são fixadas ao ligante de biomarcador por um lincador que pode ser prontamente clivado ou separado, ou submetidos à hidrólise por contato com uma enzima predeterminada sob condições fisiológicas. Um ligante de biomarcador pode ser etiquetado antes ou após contato com a amostra, ou antes ou após contato com o biomarcador. Um ligante de biomarcador pode também ser etiquetado por contato com um anticorpo etiquetado que se liga ao ligante de biomarcador. Um ligante de biomarcador pode também ser conjugado com uma partícula magnética, tal como uma nanopartícula paramagnética (Miltenyi Biotec, Germany).
[00064] Uma amostra compreendendo uma população de células T conforme aqui revelada é contatada com um ligante de biomarcador. O contato de uma amostra com um ligante de biomarcador é feito de tal modo a promover ligação específica do ligante de biomarcador a seu biomarcador cognato. Tipicamente isto é feito sob condições fisiológicas. Por exemplo, quando um ligante de biomarcador é um anticorpo, o contato de um anticorpo com uma amostra é feito sob condições que resultam na ligação do anticorpo a seu correspondente biomarcador, resultando, desse modo, em um complexo de anticorpo/biomarcador.
[00065] Uma amostra compreendendo uma população de células T conforme aqui revelada é avaliada para detectar um nível de expressão celular dos biomarcadores. Um biomarcador etiquetado pode ser avaliado usando um método de detecção baseado em fluorescência, bioluminescência, quimiluminescência, meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, químicos, magnéticos, ou outros meios físicos conhecidos a um versado na técnica. Um biomarcador não etiquetado pode ser avaliado usando um método de detecção baseado no tamanho, volume, densidade, opacidade, ou outros meios físicos conhecidos a um versado na técnica.
[00066] Em uma concretização, na avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular, um biomarcador é proporcionado usando um classificador de célula. Os classificadores de células são bem conhecidos aos técnicos no assunto, e geralmente são capazes de separar uma mistura complexa de células em frações de um tipo de célula simples. Tipicamente, as células a serem classificadas são introduzidas como um jato delgado de líquido transportador que emana de um orifício de bocal pequeno. Brevemente após deixar o bocal, a corrente hidrodinamicamente focalizada de fluido passa através da altura da cintura de um ou mais feixes de luz apertadamente focados, usualmente luz de laser. Um número de detectores é objetivado no ponto onde a corrente passa através do feixe de luz: uma em linha com o feixe de luz (Difusor de Avanço ou FSC) e várias perpendiculares a ele (Difusor Lateral ou SSC), e um ou mais detectores fluorescentes. Cada partícula suspensa de 0,2 μm a 150 μm que passa através do feixe difunde o raio, e os químicos fluorescentes encontrados na partícula, ou fixados à partícula, podem ser excitados na emissão de luz em um comprimento de onda mais longo do que a fonte de luz. Esta combinação de luz difundida e fluorescente é captada pelos detectores, e, por análise de flutuações no brilho em cada detector (um para cada pico de emissão fluorescente), é então possível derivar vários tipos de informação sobre a estrutura física e química de cada partícula individual. O dado gerado por citometrias de fluxo pode ser plotado em uma única dimensão, para produzir um histograma, ou em gráficos de pontos bidimensionais, ou ainda em três dimensões. As regiões nestes gráficos podem ser sequencialmente separadas, baseado na intensidade de fluorescência, por criação de uma série de extrações de subconjunto, denominadas "portões". Algumas citometrias de fluxo no mercado eliminaram a necessidade de fluorescência, e usam somente difusor de luz para medição. Outras citometrias de fluxo formam imagens de cada fluorescência de célula, luz difundida, e luz transmitida.
[00067] Em um aspecto desta concretização, na avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular, um biomarcador é proporcionado por citometria de fluxo usando um ligante de biomarcador fluorescentemente etiquetado. A classificação citométrica de fluxo é um tipo especializado de citometria de fluxo. Ela proporciona um método para classificação de uma mistura heterogênea de células biológicas em dois ou mais recipientes, uma célula em um tempo, baseado na difusão de luz específica, e características fluorescentes de cada célula. Ela é um instrumento científico útil, visto que proporciona registro rápido, objetivo e quantitativo de sinais fluorescentes de células individuais, bem como separação física de células de interesse particular. Um classificador citométrico de fluxo pode facilmente analisar células em velocidades maiores do que 200.000 eventos por segundo. Geralmente, as propriedades físicas do fluido transportador, contudo, e as estatísticas de distribuição das células entre as gotículas, limitam as taxas de classificação a cerca de 50.000 células por segundo. Esta combinação de velocidade e separação segura permite que as células individuais sejam isoladas ou enriquecidas para outros usos.
[00068] Em outra concretização, na avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular, um biomarcador é proporcionado por classificação de célula ativada magnética (MACS) usando um ligante de biomarcador magneticamente etiquetado. MACS permitem que as células sejam separadas por incubação com nanopartículas magnéticas revestidas com um ligante de biomarcador para um biomarcador particular. As nanopartículas magnéticas podem compreender nanopartículas super- paramagnéticas compostas de óxido de ferro e um revestimento de polissacarídeo. As nanopartículas magnéticas são preferivelmente pequenas o bastante para permanecerem em suspensão coloidal, que permite ligação rápida e eficiente ao biomarcador de superfície de célula. Nos aspectos desta concretização, as nanopartículas magnéticas estão entre cerca de 1 nm de diâmetro a cerca de 100 nm de diâmetro, tal como, por exemplo, cerca de 25 nm de diâmetro, 50 nm de diâmetro, 75 nm de diâmetro, ou 100 nm de diâmetro. Em outros aspectos desta concretização, as nanopartículas magnéticas têm um volume de, por exemplo, cerca de um milionésimo daquele de uma célula de mamífero típica, cerca de cinco milionésimos daquele de uma célula de mamífero típica, ou cerca de dez milionésimos daquele de uma célula de mamífero típica. As nanopartículas magnéticas preferivelmente não interferem com a citometria de fluxo, são biodegradáveis, e têm efeitos desprezíveis nas funções celulares. O acoplamento do anticorpo às nanopartículas magnéticas pode ser direto ou indireto, via um segundo anticorpo a um ligante, tal como um fluoróforo, um ponto de quantum, um fósforo, um composto quimioluminescente, um composto bioluminescente, um composto cromogênico, um composto de isótopo similar a lantanídeo, um radioisótopo, uma enzima, uma biotina ou molécula de avidina, ou qualquer outra etiqueta útil para detecção de uma célula ligada pelo biomarcador.
[00069] Em outra concretização, na avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular, um biomarcador é proporcionado por fixação de fase sólida. Em um aspecto, a avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular, um biomarcador é proporcionado por alternação ou cromatografia de afinidade de fase sólida usando um ligante de biomarcador conforme aqui revelado. Em um aspecto, na avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular, um biomarcador é proporcionado por contas magnéticas de fase sólida usando um ligante de biomarcador magneticamente etiquetado conforme aqui revelado. Ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos 2005/0186207, que é incorporada por referência em sua totalidade.
[00070] Em outra concretização, na avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular, um biomarcador é proporcionado por lises de célula de complemento. Lises de célula de complemento são usadas para eliminar população de célula indesejada reconhecida pelos anticorpos, e são baseados na função de certos tipos de anticorpos para fixar e ativar uma cascata de moléculas enzimáticas denominadas "Sistema de complemento" na superfície da célula. A reação final resulta na abertura de um furo físico na membrana, e produz lises de célula por osmose. Tipicamente, as células são incubadas durante 30 minutos a 4°C com um anticorpo, e uma fonte de enzimas de complemento é adicionada e incubada a 37°C. Finalmente, as células são lavadas com tampões isotônicos e prontas para serem usadas.
[00071] Uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em um padrão de expressão característico de um ou mais biomarcadores. Geralmente, tais células são identificadas de acordo com os níveis de expressão do biomarcador ou biomarcadores baseado nas diferenças prontamente discerníveis na intensidade de manchamento, como é conhecido a um versado na técnica. Tipicamente, a expressão de um biomarcador é classificada como alta (biomarkerhi), + (biomarcador+), baixa (biomarcador low) e - (biomarcador-).
[00072] As células que mancham intensamente ou brilhantemente quando avaliadas usando um ligante de biomarcador é referida como biomarcador+, e é indicativa de uma célula que exibe um alto nível de expressão de biomarcador. Por exemplo, CD4hi/+, CD25hi/+, CD6hi/+, CD127hi/+, CD49dhi/+, CD38hi/+, CD45RAhi/+, HLA-DRhi/+, FoxP3hi/+, CTLA-4hi/+, GITRhi/+, LAG-3hi/+, CD39hi/+, Helioshi/+, FcRL3hi/+, CCR7hi/+ , CCR4hi/+, CCR8hi/+, CD62Lhi/+, ICOShi/+, CD103hi/+, PD-1hi/+, CD134hi/+, GARPhi/+, CD45RBhi/+, CD45ROhi/+, CD95hi/+, CD122hi/+, CD147hi/+ e CD8hi/+ se referem á células que mancham intensamente ou brilhantemente quando avaliadas usando um ligante de biomarcador etiquetado direcionado a um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, um biomarcador CD127, um biomarcador CD49d, um biomarcador CD38, um biomarcador CD45RA, um biomarcador HLA-Dr, um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, um biomarcador GITR, um biomarcador LAG-3, um biomarcador CD39, um biomarcador Helios, um biomarcador FcRL3, um biomarcador CCR7, um biomarcador CCR4, a CCR8, um biomarcador CD62L, um biomarcador ICOS, um biomarcador CD103, um biomarcador PD-1, um biomarcador CD134, um biomarcador GARP, um biomarcador CD45RB, um biomarcador CD45RO, um biomarcador CD95, um biomarcador CD122, um biomarcador CD147, um biomarcador CD8, respectivamente.
[00073] As células que mancham levemente, devidamente, ou não no todo, quando avaliadas usando um ligante de biomarcador é referida como biomarcadorlow/-, e é indicativa de uma célula que exibe um alto nível de expressão de biomarcador. Por exemplo, CD4|ow/- CD25low/- CD6low/—, CD127low/-+, CD49dlow/- CD38low/—, CD45RAlow/—, HLA-DRlow/—, FoxP3low/- CTLA-4low/—, GITRlow/—, LAG-3low/—, CD39low/—, Helioslow/-, FcRL3low/—, CCR7low/- CCR4low/—, CCR8low/—, CD62Llow/—, ICOSlow/-, CD103low/- PD-1low/- CD134low/- GARPlow/-, CD45RBlow/—, CD45ROlow/—, CD95low/- CD122low/- CD147 low/- e CD8low/— se referem às células que mancham levemente, devidamente, ou não no todo, quando avaliadas usando um ligante de biomarcador etiquetado direcionado a um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, um biomarcador CD127, um biomarcador CD49d, um biomarcador CD38, um biomarcador CD45RA, um biomarcador HLA-Dr, um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, um biomarcador GITR, um biomarcador LAG-3, um biomarcador CD39, um biomarcador Helios, um biomarcador FcRL3, um biomarcador CCR7, um biomarcador CCR4, a CCR8, um biomarcador CD62L, um biomarcador ICOS, um biomarcador CD103, um biomarcador PD-1, um biomarcador CD134, um biomarcador GARP, um biomarcador CD45RB, um biomarcador CD45RO, um biomarcador CD95, um biomarcador CD122, um biomarcador CD147, um biomarcador CD8, respectivamente.
[00074] O corte para designação de uma célula como uma célula de biomarcadorhi pode ser ajustado em termos da distribuição de intensidade fluorescente observada para todas as células com aquelas células no topo 2%, 3%, 5%, 7% ou 10% de intensidade de fluorescência sendo designadas como células de biomarcadorhi. Nos aspectos desta concretização, células CD4hi, células CD25hi, células CD6hi, células CD127hi, células CD49dhi, células CD38hi, células CD45RAhi, células HLA-DRhi, células FoxP3hi, células CTLA-4hi, células GITRhi, células LAG-3hi, células CD39hi, células Helioshi, células FcRL3hi, células CCR7hi+, células CCR4hi, células CCR8hi, células CD62Lv, células ICOShi, células CD103hi, células PD-1hi, células CD134hi, células GARPhi, células CD45RBhi, células CD45ROhi, células CD95hi, células CD122hi, células CD147hi, e/ou células CD8hi exibem 90% ou mais, 93% ou mais, 95% ou mais, 97% ou mais, ou 98% ou mais de intensidade de fluorescência, conforme comparado à intensidade de fluorescência observada para todas as células sendo avaliadas.
[00075] O corte para designação de uma célula como uma célula de biomarcador+ pode ser ajustado em termos da distribuição de intensidade de fluorescente observada para todas as células com aquelas células no topo 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% de intensidade de fluorescência sendo designadas como células de biomarcador+. Nos aspectos desta concretização, células CD4+, células CD25+, células CD6+, células CD127+, células CD49d+, células CD38+, células CD45RA+, células HLA-DR+, células FoxP3+, células CTLA-4+, células GITR+, células LAG-3+, células CD39+, células Helios+, células FcRL3+, células CCR7+, células CCR4+, células CCR8+, células CD62L+, células ICOS+, células CD103+, células PD-1+, células CD134+, células GARP+, células CD45RB+, células CD45RO+, células CD95+, células CD122+, células CD147+, e/ou células CD8+ exibem 10% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, ou 50% ou mais de intensidade de fluorescência, conforme comparado à intensidade de fluorescência observada para todas as células sendo avaliadas.
[00076] O corte para designação de uma célula como uma célula de biomarcadorlow pode ser ajustado em termos da distribuição de intensidade de fluorescente observada para todas as células com aquelas células que caem abaixo de 50%, 40%, 30%, 20%, ou 10% de intensidade de fluorescência sendo designada como células de biomarcadorlow/-. Nos aspectos desta concretização, células CD4low, células CD25low, células CD6low, células CD127low, células CD49dlow, células CD38low, células CD45RAlow, células HLA-DRlow, células FoxP3low, células CTLA-4low, células GITRlow, células LAG-3low, células CD39low, células Helioslow, células FcRL3low, células CCR7low, células CCR4low, células CCR8low, células CD62Llow, células ICOSlow, células CD103low, células PD-1low, células CD134low, células GARPlow, células CD45RBPlow, células CD45ROPlow, células CD95Plow, células CD122low, células CD147low, e/ou células CD8low exibem 50% ou menos, 40% ou menos, 30% ou menos, 20% ou menos, ou 10% ou menos de intensidade de fluorescência, conforme comparado à intensidade de fluorescência observada para todas as células sendo avaliadas.
[00077] O corte para designação de uma célula como uma célula de biomarcador- pode ser ajustado em termos da distribuição de intensidade de fluorescente observada para todas as células com aquelas células que caem abaixo de 10%, 7%, 5%, 3%, ou 2% de intensidade de fluorescência sendo designadas como células de biomarcador-. Nos aspectos desta concretização, células CD4-, células CD25-, células CD6-, células CD127-, células CD49d-, células CD38, células CD45RA-, células HLA-DR-, células FoxP3-, células CTLA- 4-, células GITR-, células LAG-3-, células CD39-, células Helios-, células FcRL3-, células CCR7-, células CCR4-, células CCR8-, células CD62L-, células ICOS-, células CD103-, células PD-1-, células CD134-, células GARP-, células CD45RB-, células CD45RO-, células CD95-, células CD122-, células CD147-, e/ou células CD8- exibem 10% ou menos, 7% ou menos, 5% ou menos, 3% ou menos, ou 2% ou menos de intensidade de fluorescência, conforme comparado à intensidade de fluorescência observada para todas as células sendo avaliadas.
[00078] As células podem também serem distinguidas por obtenção da distribuição de frequência de manchamento de biomarcador para todas as células, e gerando um ajuste de curva de população a uma população de manchamento mais alta e a uma população de manchamento mais baixo. As células individuais são, em seguida, transferidas para a população a qual elas são provavelmente para pertencer, baseado em uma análise estatística das respectivas distribuições de população. Em uma concretização, as células de biomarcadorlow/- exibem uma vez ou menos, duas vezes ou menos, ou três vezes ou menos intensidade de fluorescência do que as células de biomarcador+. Nos aspectos desta concretização, células CD4low/-, células CD25low/-, células CD6low/-, células CD127low/-+, células CD49dlow/-, células CD38low/-, células CD45RAlow/- HLA-DRlow/-, células FoxP3low/-, células CTLA-4low/-, células GITRlow/-, células LAG-3low/-, células CD39low/-, células Helioslow/-, células FcRL3low/-, células CCR7low/-, células CCR4low/-, células CCR8low/-, células CD62Llow/- , células ICOSlow/-, células CD103low/-, células PD-1low/-, células CD134low/-, células GARPlow/-, células CD45RBlow/-, células CD45ROlow/-, células CD95low/-, células CD122low/-, células CD147low/-, e células CD8low/- exibem uma vez ou menos, duas vezes ou menos, ou três vezes menos de intensidade de fluorescência do que células CD4+, células CD25+, células CD6+, células CD127+, células CD49d+, células CD38+, células CD45RA+, células HLA-DR+, células FoxP3+, células CTLA-4+, células GITR+, células LAG-3+, células CD39+, células Helios+, células FcRL3+, células CCR7+, células CCR4+, células CCR8+, células CD62L+, células ICOS+, células CD103+, células PD- 1+, células CD134+, células GARP+, células CD45RB+, células CD45RO+, células CD95+, células CD122+, células CD147+, e células CD8+, respectivamente.
[00079] Em uma concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseada nas células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-. Em um aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD38low/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD49low/-.
[00080] Em outro aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- CD49dlow/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- CD38low/-.
[00081] Em outros aspectos desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD127low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD49dlow/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD38low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD45RAlow/-, um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/- CD49dlow/-, um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/- CD38low/-, ou um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- CD49dlow/- CD38low/-.
[00082] Em outros aspectos desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- HLA-Dr+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- HLA-Drlow/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- FoxP3+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- FoxP3low/- , um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CTLA-4+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CTLA-4low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- GITR+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- GITRlow/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- LAG-3+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- LAG-3low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD39+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD39low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- Helios+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- Helioslow/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- FcRL3+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- FcRL3low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CCR7+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CCR7low/- ,um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CCR4+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CCR4low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CCR8+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CCR8low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— CD62L+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— CD62Llow/—, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— ICOS+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— ICOSlow/—, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— CD103+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— CDl03low/—, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— PD- 1+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— PD—i|ow/- um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— CD134+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— CD134low/—, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— GARP+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— GARPlow-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— CD45RB+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— CD45RBlow/—, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— CD45RO+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— CD45ROlow/—, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— CD95+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD95low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD122+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD122low/- , um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD147low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD8+, ou um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD8ow/-.
[00083] Em outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo CD6low/- e um ou mais dos seguintes padrões de expressão de biomarcador adicional, um padrão de expressão CD4+, um padrão de expressão CD25+, um padrão de expressão CD127low/- , um padrão de expressão CD49dlow/-, um padrão de expressão CD38low/-, um padrão de expressão CD45RAlow/-, um padrão de expressão HLA-Dr+, um padrão de expressão HLA-Drlow/-, um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA-4low/-, um padrão de expressão GITR+, um padrão de expressão GITRlow/-, um padrão de expressão LAG-3+, um padrão de expressão LAG-3low/-, um padrão de expressão CD39+, um padrão de expressão CD39low/-, um padrão de expressão Helios+, um padrão de expressão Helioslow/-, um padrão de expressão FcRL3+, um padrão de expressão FcRL3low/-, um padrão de expressão CCR7+, um padrão de expressão CCR7low/- , um padrão de expressão CCR4+, um padrão de expressão CCR4low/- , um padrão de expressão CCR8+, um padrão de expressão CCR8low/- , um padrão de expressão CD62L+, um padrão de expressão CD62Llow/-, um padrão de expressão ICOS+, um padrão de expressão ICOSlow/-, um padrão de expressão CD103+, um padrão de expressão CD103low/-, um padrão de expressão PD-1+, um padrão de expressão PD-1low/-, um padrão de expressão CD134+, um padrão de expressão CD134low/-, um padrão de expressão GARP+, um padrão de expressão GARPlow/-, um padrão de expressão CD45RB+, um padrão de expressão CD45RBlow/-, um padrão de expressão CD45RO+, um padrão de expressão CD45ROlow/-, um padrão de expressão CD95+, um padrão de expressão CD95low/-, um padrão de expressão CD122+, um padrão de expressão CD122low/-, um padrão de expressão CD147+, um padrão de expressão CD147low/-, um padrão de expressão CD8+, ou um padrão de expressão CD8low/-.
[00084] Em ainda outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um CD25+ CD6low/- e um ou mais dos seguintes um padrões de expressão de biomarcador adicional, um padrão de expressãoCD4+, um padrão de expressão CD127low/-, um padrão de expressão CD49dlow/-, um padrão de expressão CD38low/-, um padrão de expressão CD45RAlow/-, um padrão de expressão HLA-Dr+, um padrão de expressão HLA-Drlow/-, um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA-4low/-, um padrão de expressão GITR+, um padrão de expressão GITRlow/-, um padrão de expressão LAG-3+, um padrão de expressão LAG-3low/-, um padrão de expressão CD39+, um padrão de expressão CD39low/-, um padrão de expressão Helios+, um padrão de expressão Helioslow/-, um padrão de expressão FcRL3+, um padrão de expressão FcRL3low/-, um padrão de expressão CCR7+, um padrão de expressão CCR7low/-, um padrão de expressão CCR4+, um padrão de expressão CCR4low/-, um padrão de expressão CCR8+, um padrão de expressão CCR8low/-, um padrão de expressão CD62L+, um padrão de expressão CD62Llow/-, um padrão de expressão ICOS+, um padrão de expressão ICOSlow/-, um padrão de expressão CD103+, um padrão de expressão CD103low/-, um padrão de expressão PD-1+, um padrão de expressão PD-1low/-, um padrão de expressão CD134+, um padrão de expressão CD134low/-, um padrão de expressão GARP+, um padrão de expressão GARPlow/-, um padrão de expressão CD45RB+, um padrão de expressão CD45RBlow/-, um padrão de expressão CD45RO+, um padrão de expressão CD45ROlow/-, um padrão de expressão CD95+, um padrão de expressão CD95low/-, um padrão de expressão CD122+, um padrão de expressão CD122low/-, um padrão de expressão CD147+, um padrão de expressão CD147low/-, um padrão de expressão CD8+, ou um padrão de expressão CD8low/-.
[00085] Em ainda outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um CD6low/- CD127low/- e um ou mais dos seguintes padrões de expressão de biomarcador adicional, um padrão de expressão CD4+, um padrão de expressão CD25+, um padrão de expressão CD49dlow/-, um padrão de expressão CD38low/-, um padrão de expressão CD45RAlow/-, um padrão de expressão HLA-Dr+, um padrão de expressão HLA-Drlow/-, um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA-4low/-, um padrão de expressão GITR+, um padrão de expressão GITRlow/-, um padrão de expressão LAG-3+, um padrão de expressão LAG-3low/-, um padrão de expressão CD39+, um padrão de expressão CD39low/-, um padrão de expressão Helios+, um padrão de expressão Helioslow/-, um padrão de expressão FcRL3+, um padrão de expressão FcRL3low/-, um padrão de expressão CCR7+, um padrão de expressão CCR7low/-, um padrão de expressão CCR4+, um padrão de expressão CCR4low/-, um padrão de expressão CCR8+, um padrão de expressão CCR8low/-, um padrão de expressão CD62L+, um padrão de expressão CD62Llow/-, um padrão de expressão ICOS+, um padrão de expressão ICOSlow/-, um padrão de expressão CD103+, um padrão de expressão CD103low/-, um padrão de expressão PD-1+, um padrão de expressão PD-1low/-, um padrão de expressão CD134+, um padrão de expressão CD134low/-, um padrão de expressão GARP+, um padrão de expressão GARPlow/-, um padrão de expressão CD45RB+, um padrão de expressão CD45RBlow/-, um padrão de expressão CD45RO+, um padrão de expressão CD45ROlow/-, um padrão de expressão CD95+, um padrão de expressão CD95low/-, um padrão de expressão CD122+, um padrão de expressão CD122low/-, um padrão de expressão CD147+, um padrão de expressão CD147low/-, um padrão de expressão CD8+, ou um padrão de expressão CD8low/-.
[00086] Em outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo a CD4+ CD25+ CD6low/- e um ou mais dos seguintes padrões de expressão de biomarcador adicional, um padrão de expressão CD127low/-, um padrão de expressão CD49dlow/-, um padrão de expressão CD38low/-, um padrão de expressão CD45RAlow/-, um padrão de expressão HLA-Dr+, um padrão de expressão HLA-Drlow/-, um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA-4low/-, um padrão de expressão GITR+, um padrão de expressão GITRlow/-, um padrão de expressão LAG-3+, um padrão de expressão LAG-3low/-, um padrão de expressão CD39+, um padrão de expressão CD39low/-, um padrão de expressão Helios+, um padrão de expressão Helioslow/-, um padrão de expressão FcRL3+, um padrão de expressão FcRL3low/-, um padrão de expressão CCR7+, um padrão de expressão CCR7low/-, um padrão de expressão CCR4+, um padrão de expressão CCR4low/-, um padrão de expressão CCR8+, um padrão de expressão CCR8low/-, um padrão de expressão CD62L+, um padrão de expressão CD62Llow/-, um padrão de expressão ICOS+, um padrão de expressão ICOSlow/-, um padrão de expressão CD103+, um padrão de expressão CD103low/-, um padrão de expressão PD-1+, um padrão de expressão PD-1low/-, um padrão de expressão CD134+, um padrão de expressão CD134low/-, um padrão de expressão GARP+, um padrão de expressão GARPlow/-, um padrão de expressão CD45RB+, um padrão de expressão CD45RBlow/-, um padrão de expressão CD45RO+, um padrão de expressão CD45ROlow/-, um padrão de expressão CD95+, um padrão de expressão CD95low/-, um padrão de expressão CD122+, um padrão de expressão CD147+, um padrão de expressão CD147low/-, um padrão de expressão CD8+, ou um padrão de expressão CD8low/-.
[00087] Em outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo padrão de expressão CD6low/- e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional não é um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA-4low/-, ou qualquer combinação destes.
[00088] Em ainda outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- e one ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional não é um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA-4low/-, ou qualquer combinação destes.
[00089] Em ainda outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional não é um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/- , um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA- 4low/-, ou qualquer combinação destes.
[00090] Em outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD127low/- e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional não é um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA-4low/-, ou qualquer combinação destes.
[00091] Em ainda outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- e uma ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional não é um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/- , um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA- 4low/-, ou qualquer combinação destes.
[00092] Em ainda outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD127low/- e uma ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional não é um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/- , um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA- 4low/-, ou qualquer combinação destes.
[00093] Em outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é identificada baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/- e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional não é um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA-4low/-, ou qualquer combinação destes.
[00094] Em outra concretização, duas ou mais populações distintas de células T regulatórias imunossupressoras são identificadas baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional de um padrão de expressão FoxP3+, ou um padrão de expressão FoxP3low/- , um padrão de expressão CTLA-4+ ou um padrão de expressão CTLA- 4low/-, um padrão de expressão CD45RA+ ou um padrão de expressão CD45RAlow/-, um padrão de expressão HLA-Dr+ ou um padrão de expressão HLA-Drlow/-, ou qualquer combinação destes.
[00095] Em ainda outra concretização, duas ou mais populações distintas de células T regulatórias imunossupressoras são identificadas baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional, um padrão de expressão FoxP3+ ou um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+ ou um padrão de expressão CTLA-4low/-, um padrão de expressão CD45RA+ ou um padrão de expressão CD45RAlow/-, um padrão de expressão HLA-Dr+ ou um padrão de expressão HLA-Drlow/-, ou qualquer combinação destes.
[00096] Em ainda outra concretização, duas ou mais populações distintas de células T regulatórias imunossupressoras são identificadas baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional, um padrão de expressão FoxP3+ ou um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+ ou um padrão de expressão CTLA-4low/-, um padrão de expressão CD45RA+ ou um padrão de expressão CD45RAlow/-, um padrão de expressão HLA-Dr+ ou um padrão de expressão HLA-Drlow/-, ou qualquer combinação destes.
[00097] Em outra concretização, duas ou mais populações distintas de células T regulatórias imunossupressoras são identificadas baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional, um padrão de expressão FoxP3+ ou um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+ ou um padrão de expressão CTLA-4low/-, um padrão de expressão CD45RA+ ou um padrão de expressão CD45RAlow/-, um padrão de expressão HLA-Dr+ ou um padrão de expressão HLA-Drlow/-, ou qualquer combinação destes.
[00098] Em ainda outra concretização, duas ou mais populações distintas de células T regulatórias imunossupressoras são identificadas baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/- e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional, um padrão de expressão FoxP3+ ou um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+ ou um padrão de expressão CTLA-4low/-, um padrão de expressão CD45RA+ ou um padrão de expressão CD45RAlow/-, um padrão de expressão HLA-Dr+ ou um padrão de expressão HLA-Drlow/-, ou qualquer combinação destes.
[00099] Em ainda outra concretização, duas ou mais populações distintas de células T regulatórias imunossupressoras são identificadas baseado em células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD127low/- e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional, um padrão de expressão FoxP3+ ou um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+ ou um padrão de expressão CTLA-4low/-, um padrão de expressão CD45RA+ ou um padrão de expressão CD45RAlow/-, um padrão de expressão HLA-Dr+ ou um padrão de expressão HLA-Drlow/-, ou qualquer combinação destes.
[000100] Os aspectos do presente relatório descritivo revelam, em parte, um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras. Em uma concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6, e isolamento de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras.
[000101] Em outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras.
[000102] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-, obtendo- se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras.
[000103] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25 e um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-, obtendo- se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras.
[000104] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD6 e um biomarcador CD127; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras.
[000105] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD6 e um ligante de biomarcador CD127; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD6 e um biomarcador CD127; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras.
[000106] Em outra concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras.
[000107] Em outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras.
[000108] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, e um biomarcador CD127; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras.
[000109] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25, um ligante de biomarcador CD6, e um ligante de biomarcador CD127; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, e um biomarcador CD127; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras.
[000110] As etapas de avaliação e contato são conforme aqui descrito.
[000111] Uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado em um padrão de expressão característico de um ou mais biomarcadores. Para uma etapa de avaliação aqui revelada, tais células são isoladas ou enriquecidas de acordo com os níveis de expressão do biomarcador ou biomarcadores baseado nas diferenças prontamente discerníveis na intensidade de manchamento conforme é conhecido a um versado na técnica. Tipicamente, a expressão de um padrão de expressão do biomarcador é classificada como alta (biomarcadorhi), + (biomarcador+), baixa (biomarcador low) e - (biomarcador-).
[000112] Uma população de células T regulatórias imunossupressoras pode ser compreendida substancialmente de células compreendendo o padrão de expressão do biomarcador desejado. Conforme aqui usado, o termo "substancialmente", quando usado em referência a uma população de células compreendendo o padrão de expressão do biomarcador desejado, se refere a uma população de células para qual pelo menos 80% do número total de células a partir da população compreende o padrão de expressão do biomarcador desejado. Nos aspectos desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreendendo o padrão de expressão do biomarcador desejado compõe, por exemplo, pelo menos 83%, pelo menos 85%, pelo menos 88%, ou pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, do número total de células a partir da população. Em outros aspectos desta concretização, a população de células T regulatórias imunossupressoras compreendendo o padrão de expressão do biomarcador desejado é composta, por exemplo, pelo menos duas vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos oito vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes, conforme comparado à população de células T fonte a partir da amostra.
[000113] Uma população de células T regulatórias imunossupressoras pode ser isolada ou enriquecida usando seleção positiva ou seleção negativa das células de interesse. Adicionalmente, uma população de células T regulatórias imunossupressoras pode ser isolada ou enriquecida usando ambos seleção positiva e seleção negativa das células de interesse. Conforme aqui usado, o termo "seleção positiva" se refere à seleção de células especificadas de uma mistura ou população de partida de células baseado na expressão alta ou positiva de um biomarcador nas células especificadas. Conforme aqui usado, o termo "seleção negativa" se refere à seleção de células especificadas de uma mistura ou população de partida de células baseado na expressão baixa ou negativa de um biomarcador nas células especificadas. Os biomarcadores usados para seleção positiva ou seleção negativa de células podem ser detectados por, por exemplo, classificador citométrico de fluxo, MACS, fixação de fase sólida, alternação, e cromatografia. A imunoseleção de dois ou mais biomarcadores em células pode ser realizada em uma ou mais etapas, no qual cada etapa positivamente ou negativamente seleciona um ou mais biomarcadores. Quando imunoseleção de dois ou mais biomarcadores é realizada em uma etapa usando classificador citométrico de fluxo, os dois ou mais biomarcadores diferentes podem ser etiquetados com fluoróforos diferentes.
[000114] Nos aspectos desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreendendo o padrão de expressão do biomarcador desejado é enriquecida por, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, conforme comparado ao número total de células a partir da população fonte de células. Em outros aspectos desta concretização, a população de células T regulatórias imunossupressoras compreendendo o padrão de expressão do biomarcador desejado é enriquecida por, por exemplo, pelo menos duas vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos oito vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes, conforme comparada ao o número total de células a partir da população fonte de células.
[000115] Em outros aspectos desta concretização, a população de células T regulatórias imunossupressoras compreendendo o padrão de expressão do biomarcador desejado é enriquecida a, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% do número total de células na amostra. Em ainda outros aspectos desta concretização, a população de células T regulatórias imunossupressoras compreendendo o padrão de expressão do biomarcador desejado é enriquecida a, por exemplo, cerca de 80% a cerca de 85%, cerca de 80% a cerca de 90%, cerca de 80% a cerca de 95%, cerca de 80% a cerca de 98%, cerca de 80% a cerca de 100%, cerca de 85% a cerca de 90%, cerca de 85% a cerca de 95%, cerca de 85% a cerca de 98%, cerca de 85% a cerca de 100%, cerca de 90% a cerca de 95%, cerca de 90% a cerca de 98%, ou cerca de 90% a cerca de 100%, do número total de células na amostra.
[000116] Em outros aspectos desta concretização, uma subpopulação de células T regulatórias imunossupressoras compreendendo o padrão de expressão do biomarcador desejado é isolada a, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98%, a partir do número total de células na amostra. Em ainda outros aspectos desta concretização, uma subpopulação de células T regulatórias imunossupressoras compreendendo o padrão de expressão do biomarcador desejado é isolada a, por exemplo, cerca de 80% a cerca de 85%, cerca de 80% a cerca de 90%, cerca de 80% a cerca de 95%, cerca de 80% a cerca de 98%, cerca de 80% a cerca de 100%, cerca de 85% a cerca de 90%, cerca de 85% a cerca de 95%, cerca de 85% a cerca de 98%, cerca de 85% a cerca de 100%, cerca de 90% a cerca de 95%, cerca de 90% a cerca de 98%, ou cerca de 90% a cerca de 100%, a partir do número total de células na amostra.
[000117] Em outro aspecto, uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreendendo o padrão de expressão do biomarcador desejado é isolada por um esquema de seleção negativa que exaure células de CD6+ a partir das células na amostra. Em ainda outro aspecto, uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreendendo o padrão de expressão do biomarcador desejado é enriquecida por um esquema de seleção negativa que exaure células de CD6+ a partir das células na amostra.
[000118] Uma população de células T regulatórias imunossupressoras é obtida baseada em um padrão de expressão característico de um ou mais biomarcadores. As células compreendendo o padrão de expressão do biomarcador desejado podem ser isoladas ou enriquecidas usando um método de detecção baseado em fluorescência, bioluminescência, quimiluminescência, meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, químicos, magnéticos, tamanho, volume, densidade, opacidade, ou outros meios físicos conhecidos a um versado na técnica.
[000119] Em uma concretização, isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão do biomarcador desejado é proporcionado usando um classificador de célula conforme aqui revelado. Em um aspecto desta concretização, isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão do biomarcador desejado é proporcionado usando classificador citométrico de fluxo conforme aqui revelado. Em outra concretização, isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão do biomarcador desejado é proporcionado usando MACS conforme aqui revelado. Um padrão de expressão do biomarcador pode ser usado para a seleção positiva ou a seleção negativa de células de interesse, conforme aqui revelado. Os fatores de expressão dos biomarcadores usados para seleção positiva ou seleção negativa de células podem ser detectados por, por exemplo, classificador citométrico de fluxo, MACS, alternação, e cromatografia.
[000120] O valor de corte para designação de uma célula como uma célula de biomarcadorhi, uma célula de biomarcador+, uma célula de biomarcadorlow, ou uma célula de biomarcador- é conforme aqui revelado. As células podem também serem distinguidas por obtenção da distribuição de frequência de manchamento de biomarcador para todas as células, e gerando um ajuste de curva de população a uma população de manchamento mais alta e uma população de manchamento mais baixa, conforme aqui revelado.
[000121] Em uma concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células-T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-. Em um aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD38low/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD49low/-.
[000122] Em outro aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- CD49dlow/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- CD38low/-.
[000123] Em outros aspectos desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD127low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD49dlow/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD38low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD45RAlow/-, um padrão de expressão CD25+ CD6low/— CD127low/- CD49dlow/—, um padrão de expressão CD25+ CD6low/— CD127low/- CD38low/—, ou um padrão de expressão CD6low/— CDl27low/— CD49dlow/- CD38low/—.
[000124] Em outros aspectos desta concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- HLA-Dr+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- HLA-Drlow/—, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— FoxP3+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— FoxP3low/—, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CTLA-4+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CTLA-4low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- GITR+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- GITRlow/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- LAG-3+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- LAG-3low/- , um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD39+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD39low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- Helios+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- Helioslow/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- FcRL3+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- FcRL3low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CCR7+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CCR7low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CCR4+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CCR4low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CCR8+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CCR8low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD62L+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD62Llow/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- ICOS+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- ICOSlow/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD103+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD103low/- , um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- PD-1+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- PD-1low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-CD134+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD134low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- GARP+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- GARPlow/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD45RB+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD45RBlow/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD45RO+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD45ROlow/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD95+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD95low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD122+, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD122low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD147low/-, um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD8+, ou um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD8ow/-.
[000125] Em outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- e um ou mais dos seguintes padrões de expressão de biomarcador adicional, um padrão de expressão CD4+, um padrão de expressão CD25+, um padrão de expressão CD127low/-, um padrão de expressão CD49dlow/-, um padrão de expressão CD38low/-, um padrão de expressão CD45RAlow/-, um padrão de expressão HLA-Dr+, um padrão de expressão HLA-Drlow/-, um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA- 4+, um padrão de expressão CTLA-4low/-, um padrão de expressão GITR+, um padrão de expressão GITRlow/-, um padrão de expressão LAG-3+, um padrão de expressão LAG-3low/-, um padrão de expressão CD39+, um padrão de expressão CD39low/-, um padrão de expressão Helios+, um padrão de expressão Helioslow/-, um padrão de expressão FcRL3+, um padrão de expressão FcRL3low/—, um padrão de expressão CCR7+, um padrão de expressão CCR7low/—, um padrão de expressão CCR4+, um padrão de expressão CCR4low/—, um padrão de expressão CCR8+, um padrão de expressão CCR8low/—, um padrão de expressão CD62L+, um padrão de expressão CD62Llow/—, um padrão de expressão ICOS+, um padrão de expressão ICOSlow/—, um padrão de expressão CD103+, um padrão de expressão CD103low/—, um padrão de expressão PD-1+, um padrão de expressão PD-1low/-n, um padrão de expressão CD134+, um padrão de expressão CD134low/—, um padrão de expressão GARP+, um padrão de expressão GARPlow/—, um padrão de expressão CD45RB+, um padrão de expressão CD45RBlow/—, um padrão de expressão CD45RO+, um padrão de expressão CD45ROlow/—, um padrão de expressão CD95+, um padrão de expressão CD95low/—, um padrão de expressão CD122+, um padrão de expressão CD122low/—, um padrão de expressão CD147+, um padrão de expressão CD147low/—, um padrão de expressão CD8+, ou um padrão de expressão CD8low/—.
[000126] Em ainda outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/— e um ou mais dos seguintes padrões de expressão de biomarcador adicional, um padrão de expressão CD4+, um padrão de expressão CD127low/-, um padrão de expressão CD49dlow/—, um padrão de expressão CD38low/—, um padrão de expressão CD45RAlow/—, um padrão de expressão HLA-Dr+, um padrão de expressão HLA-Drlow/—, um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/—, um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA-4low/—, um padrão de expressão GITR+, um padrão de expressão GITRlow/-, um padrão de expressão LAG-3+, um padrão de expressão LAG-3low/-, um padrão de expressão CD39+, um padrão de expressão CD39low/-, um padrão de expressão Helios+, um padrão de expressão Helioslow/-, um padrão de expressão FcRL3+, um padrão de expressão FcRL3low/-, um padrão de expressão CCR7+, um padrão de expressão CCR7low/- , um padrão de expressão CCR4+, um padrão de expressão CCR4low/- , um padrão de expressão CCR8+, um padrão de expressão CCR8low/- , um padrão de expressão CD62L+, um padrão de expressão CD62Llow/-, um padrão de expressão ICOS+, um padrão de expressão ICOSlow/-, um padrão de expressão CD103+, um padrão de expressão CD103low/-, um padrão de expressão PD-1+, um padrão de expressão PD-1low/-, um padrão de expressão CD134+, um padrão de expressão CD134low/-, um padrão de expressão GARP+, um padrão de expressão GARPlow/-, um padrão de expressão CD45RB+, um padrão de expressão CD45RBlow/-, um padrão de expressão CD45RO+, um padrão de expressão CD45ROlow/-, um padrão de expressão CD95+, um padrão de expressão CD95low/-, um padrão de expressão CD122+, um padrão de expressão CD122low/-, um padrão de expressão CD147+, um padrão de expressão CD147low/-, um padrão de expressão CD8+, ou um padrão de expressão CD8low/-.
[000127] Em ainda outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- e um ou mais dos seguintes padrões de expressão de biomarcador adicional, um padrão de expressão CD4+, um padrão de expressão CD25+, um padrão de expressão CD49dlow/-, um padrão de expressão CD38low/-, um padrão de expressão CD45RAlow/-, um padrão de expressão HLA-Dr+, um padrão de expressão HLA-Drlow/-, um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/- , um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA- 4low/-, um padrão de expressão GITR+, um padrão de expressão GITRlow/-, um padrão de expressão LAG-3+, um padrão de expressão LAG-3low/—, um padrão de expressão CD39+, um padrão de expressão CD39low/- um padrão de expressão Helios+, um padrão de expressão Helioslow/-, um padrão de expressão FcRL3+, um padrão de expressão FcRL3low/—, um padrão de expressão CCR7+, um padrão de expressão CCR7low/-, um padrão de expressão CCR4+, um padrão de expressão CCR4low/-, um padrão de expressão CCR8+, um padrão de expressão CCR8low/-, um padrão de expressão CD62L+, um padrão de expressão CD62Llow/—, um padrão de expressão ICOS+, um padrão de expressão ICOSlow/-, um padrão de expressão CD103+, um padrão de expressão CD103low/-, um padrão de expressão PD-1+, um padrão de expressão PD-llow/- um padrão de expressão CD134+, um padrão de expressão CD134low/-, um padrão de expressão GARP+, um padrão de expressão GARPlow/-, um padrão de expressão CD45RB+, um padrão de expressão CD45RBlow/—, um padrão de expressão CD45RO+, um padrão de expressão CD45ROlow/—, um padrão de expressão CD95+, um padrão de expressão CD95low/—, um padrão de expressão CD122+, um padrão de expressão CD122low/—, um padrão de expressão CD147+, um padrão de expressão CD147low/—, um padrão de expressão CD8+, ou um padrão de expressão CD8low/—.
[000128] Em outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- e um ou mais dos seguintes padrões de expressão de biomarcador adicional, um padrão de expressão CD127low/—, um padrão de expressão CD49dlow/—, um padrão de expressão CD38low/—, um padrão de expressão CD45RAlow/—, um padrão de expressão HLA-Dr+, um padrão de expressão HLA-Drlow/-, um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA- 4+, um padrão de expressão CTLA-4low/-, um padrão de expressão GITR+, um padrão de expressão GITRlow/-, um padrão de expressão LAG-3+, um padrão de expressão LAG-3low/-, um padrão de expressão CD39+, um padrão de expressão CD39low/-, um padrão de expressão Helios+, um padrão de expressão Helioslow/-, um padrão de expressão FcRL3+, um padrão de expressão FcRL3low/-, um padrão de expressão CCR7+, um padrão de expressão CCR7low/-, um padrão de expressão CCR4+, um padrão de expressão CCR4low/-, um padrão de expressão CCR8+, um padrão de expressão CCR8low/-, um padrão de expressão CD62L+, um padrão de expressão CD62Llow/-, um padrão de expressão ICOS+, um padrão de expressão ICOSlow/-, um padrão de expressão CD103+, um padrão de expressão CD103low/-, um padrão de expressão PD-1+, um padrão de expressão PD-1low/-, um padrão de expressão CD134+, um padrão de expressão CD134low/-, um padrão de expressão GARP+, um padrão de expressão GARPlow/- , um padrão de expressão CD45RB+, um padrão de expressão CD45RBlow/-, um padrão de expressão CD45RO+, um padrão de expressão CD45ROlow/-, um padrão de expressão CD95+, um padrão de expressão CD95low/-, um padrão de expressão CD122+, um padrão de expressão CD122low/-, um padrão de expressão CD147+, um padrão de expressão CD147low/-, um padrão de expressão CD8+, ou um padrão de expressão CD8low/-.
[000129] Em outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional não é um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA-4low/-, ou qualquer combinação destes.
[000130] Em ainda outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional não é um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA-4low/— , ou qualquer combinação destes.
[000131] Em ainda outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/— CDl27low/— e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional não é um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/- , um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA- 4low/-, ou qualquer combinação destes.
[000132] Em outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD127low/- e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional não é um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/- , um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA- 4low/-, ou qualquer combinação destes.
[000133] Em ainda outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional não é um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA-4low/-, ou qualquer combinação destes.
[000134] Em ainda outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD127low/- e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional não é um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA-4low/-, ou qualquer combinação destes.
[000135] Em outra concretização, uma população de células T regulatórias imunossupressoras é isolada ou enriquecida baseado nas células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/- e um ou mais padrões de expressão de biomarcador adicional, com a condição que o padrão de expressão de biomarcador adicional não é um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA-4+, um padrão de expressão CTLA-4low/-, ou qualquer combinação destes.
[000136] Os aspectos do presente relatório descritivo revelam, em parte, um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras expandida. Em uma concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6, e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-; e expandir a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida.
[000137] Em outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida.
[000138] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular dos pelo menos dois biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/—; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/— com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida.
[000139] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25 e um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular dos pelo menos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida.
[000140] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular dos pelo menos dois biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD6 e um biomarcador CD127; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- com a composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida.
[000141] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD6 e um ligante de biomarcador CD127; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular dos pelo menos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD6 e um biomarcador CD127; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida.
[000142] Em outra concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular dos pelo menos três biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida.
[000143] Em outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular dos pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida.
[000144] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular dos pelo menos três biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/- com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida.
[000145] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25, um ligante de biomarcador CD6, e um ligante de biomarcador CD127; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular dos pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, e um biomarcador CD127; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/- com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida.
[000146] As etapas de avaliação, contato e isolamento são conforme aqui descritas.
[000147] A expansão de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão do biomarcador desejado pode ser proporcionada por contato da subpopulação de células T com uma composição estimulatória usando procedimentos de cultura de célula padrões. Uma composição estimulatória promove crescimento das células T por ligação de antígeno específica e ativação do complexo de receptor de célula T. Uma composição estimulatória compreende uma quantidade efetiva de um ativador de TCR/CD3 que é específico de antígeno. A composição estimulatória pode adicionalmente incluir um ou mais agentes adicionais, por exemplo, um agente coestimulatório, um segundo agente estimulatório de célula T regulatória, ou agentes que geralmente promovem a sobrevivência e/ou crescimento de células T. Uma composição estimulatória pode estar em solução ou suspensão. Para promover ativação e expansão, o ativador de TCR/CD3 e o coestimulador de TCR podem ser tipicamente imobilizados em uma superfície sólida tridimensional, tais como uma célula hospedeira, contas, ou outros substratos. Ver, por exemplo, Thomas et al, Clin. Immunol. 105: 259-272 (2002), que é desse modo incorporado por referência em sua totalidade. As células adequadas para uso como substratos incluem células de apresentação de antígeno artificial (aAPCs). Ver, por exemplo, Kim, et al., Nat. Biotechnol. 22(4):403-410 (2004); e Thomas, et al., Clin. Immunol. 105(3): 259-272 (2002), cada uma da qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade. As contas podem ser plásticas, de vidro, ou qualquer outro material adequado, tipicamente na faixa de diâmetro de 1 μm a 20 μm. Em uma concretização, os ativadores podem ser imobilizados em contas magnéticas providas em uma razão de célula:conta de entre 2:1 e 1:5, preferivelmente entre 1:1 e 1:3. O tamanho ótimo da conta pode ser empiricamente determinado, embora tipicamente o tamanho caia na faixa de 1 μm a 20 μm de diâmetro.
[000148] Um ativador de TCR/CD3 é um anticorpo multivalente ou ligante para TCR/CD3, incluindo ativadores não específicos de antígeno, tais como, por exemplo, um anticorpo α-CD3, e ativadores específicos de antígeno, tais como, por exemplo, um Complexo de Histocompatibilidade Maior (MHC)-multímeros de peptídeo. Ver, por exemplo, Yee, et al., Adoptive T cell therapy using antigen specific CD8+ T cell clones for the treatment of patients with metastatic melanoma: In vivo persistence, migration, and antitumor effect of transferred Cells T, Proc Natl. Acad. Sci. USA 99(25): 16168-16173 (2002); Butterfield, et al., T-Cell responses to HLA-A*0201 immunodominant peptides derived from .alpha.-fetoprotein in patients with hepatocellular cancer, Clin. Cancer Res. 9(16): 5902-5908 (2003); e Yee, et al., Isolation of high avidity melanoma-reactive CTL from heterogeneous populations using peptide-MHC tetramers, J. Immunol. 162: 2227-2230 (1999), cada um do qual é incorporado por referência em sua totalidade. O MHC- multímero de peptídeo pode ser um MHC classe I/complexo de peptídeo antigênico ou um MHC classe II/complexo de peptídeo de antígeno. O peptídeo de antígeno pode ser um peptídeo autoantigênico ou um peptídeo aloantígeno. O peptídeo de antígeno é tipicamente um peptídeo associado a doença autoimune, um peptídeo efetivo na modulação de uma autorreação imune quando administrado a um indivíduo, ou um antígeno que promove uma resposta imune indesejada no indivíduo. Ver, por exemplo, Bluestone, et al., CD127 Expression Inversely Correlates wit FoxP3 and Suppressive Functions of CD4+ Tregs, Publicação de Pedido fr Patente dos Estados Unidos 2008/0131445, cada uma do qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Conforme aqui usado, o termo "peptídeo de autoantígeno"ou "autoantígeno"se refere a um antígeno ou epítope que é nativo ao mamífero, e que é patologicamente imunogênico no mamífero.
[000149] Um peptídeo autoantigênico pode também ser um peptídeo mimotope capaz de complexar com uma molécula de MHC classe II. Os peptídeos mimotope são descritos em, por exemplo, Bluestone, et al., CD127 Expression Inversely Correlates wit FoxP3 and Suppressive Functions of CD4+ Tregs, Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos 2008/0131445, que é, desse modo, incorporado por referência em sua totalidade. Conforme aqui usado, o termo "alopeptídeo de antígeno " se refere a um antígeno ou epítope que é uma parte de um sistema de autorreconhecimento de organismo que, quando injetado em outro indivíduo a partir das mesmas espécies, dispara uma resposta imune objetivada na eliminação do mesmo. Moléculas/complexos de peptídeo de MHC de classe II são descritas em, por exemplo, Bluestone, et al., CD127 Expression Inversely Correlates wit FoxP3 and Suppressive Functions of CD4+ Tregs, Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos 2008/0131445, que é, desse modo, incorporado por referência em sua totalidade.
[000150] Protocolos para uso de ativador de TCR/CD3 para expandir células T regulatórias de, de outro modo, células T convencionais, incluem o uso de tetrâmeros de MHC-peptídeo autoespecífico de antígeno, DCs de peptídeo pulsado (Yamazaki, et al., J. Exp. Med. 198: 235-247, 2003) ou APCs artificiais (Maus, et al., Nat. Biotechnol. 20:143148, 2002) para expandir células T regulatórias de indivíduos, independente do fenótipo de superfície de célula. Em adição, uma combinação de abordagens in vitro e in vivo pode intensificar os efeitos da terapia. Por exemplo, estudos recentes mostraram que a administração de autoantígenos, ligantes de peptídeo alterados e ainda estímulos não específicos, tais como anticorpos monoclonais α-CD3 de não ligação de FcR podem promover atividade de célula T regulatória específica de antígeno. Ver, por exemplo, Apostolou, et al., J. Exp. Med. 199: 1401-1408 (2003); Belghith, et al., Nat. Med. 9: 1202-1208 (2003), cada uma do qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Consequentemente, a combinação in vivo de imunização para induzir as células T regulatórias com expansão ex vivo ou vice-versa pode ser vantajosa.
[000151] Em uma concretização, uma composição estimulatória compreende um complexo de MHC de classe I/peptídeo antigênico, particularmente um agregado de tais complexos de MHC/peptídeo. Nos aspectos desta concretização, uma composição estimulatória compreende um MHC de classe I/complexo de alopeptídeo de antígeno, ou um MHC de classe I/complexo de peptídeo antigênico. Em outra concretização, uma composição estimulatória compreende um MHC de classe II/complexo de peptídeo antigênico, particularmente um agregado de tal MHC/complexos de peptídeo. Nos aspectos desta concretização, uma composição estimulatória compreende um MHC de classe II/complexo de alopeptídeo de antígeno, ou um MHC de classe II/complexo de peptídeo antigênico. Numerosos métodos aplicáveis são conhecidos na técnica para geração de MHC funcional de classe I/complexos de peptídeo de peptídeo e MHC de classe II/complexos de peptídeo.
[000152] Um ativador de coestimulador de TCR é um anticorpo multivalente ou ligante específico para um coestimulador de TCR, tais como, por exemplo, CD28, GITR, B7-1/2, CD5, ICOS, OX40 ou CD40. Ver, por exemplo, Shimizu et al., Stimulation of CD25(+)CD4(+) cells T regulatory through GITR breaks immunological self-tolerance, Nat. Immunol. 3(2): 135-142 (2002); Tone et al., Mouse glucocorticoid- induced tumor necrosis factor receptor ligand is co-stimulatory for Cells T, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100(25): 15059-15064 (2003), cada uma do qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Um agente coestimulatório pode ser um anticorpo agonista, tal como um anticorpo agonista que se a CD28, GITR, B7-1/2, CD5, ICOS, OX40 ou CD40.
[000153] Um segundo agente estimulatório de célula T regulatória é uma citocina, tal como, por exemplo, fator de crescimento de hepatócito, fator de estimulação de colônia de granulócito, interleucinas, tais como, por exemplo, IL-2, IL-6, IL-7, IL-13, e IL-15. Uma quantidade efetiva é tipicamente entre cerca de 200 a cerca de 2500 IU/mL.
[000154] Em uma concretização, a expansão de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão do biomarcador desejado pode ser proporcionada por contato da subpopulação de células T com um antígeno. Em um aspecto desta concretização, uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão do biomarcador desejado pode ser proporcionada por contato da população das células com uma composição estimulatória de célula T regulatória específica de antígeno. Em outro aspecto desta concretização, a composição estimulatória compreende um MHC de classe II/complexo de autopeptídeo antigênico. Em ainda outro aspecto desta concretização, uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão do biomarcador desejado pode ser proporcionada por contato da população de células com uma composição estimulatória de célula T regulatória específica de antígeno e outro agente estimulatório, ou um segundo agente estimulatório de célula T regulatória.
[000155] Em ainda outra concretização, a expansão de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão do biomarcador desejado pode ser proporcionado por contato da subpopulação de células T com um anticorpo agonista. Em um aspecto desta concretização, o anticorpo agonista é um anticorpo α-CD3 ou um anticorpo α-CD28.
[000156] Em ainda outra concretização, a expansão de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão do biomarcador desejado pode ser proporcionado por contato da subpopulação de células T com um anticorpo agonista e um segundo agente de estimulação. Em um aspecto desta concretização, o segundo agente estimulatório é uma citocina. Nos aspectos desta concretização, a citocina é uma interleucina, tal como, por exemplo, uma IL-2. Em um aspecto desta concretização, a expansão de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão do biomarcador desejado pode ser proporcionado por contato da subpopulação de células T com um anticorpo α-CD3 ou um anticorpo α-CD28, e IL-2 na presença de TGFβ ou rapamicina.
[000157] Concentrações ótimas de cada componente das composições estimulatórias, condições de cultura e duração, podem ser determinadas empiricamente usando experimentação de rotina. Expansões máximas são determinadas empiricamente e variarão por, por exemplo, tipo de célula, condições de incubação. Nos aspectos desta concretização, expansão máxima de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão do biomarcador desejado pode ser, por exemplo, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes, pelo menos 500 vezes, ou pelo menos 800 vezes.
[000158] Os aspectos do presente relatório descritivo revelam, em parte, um método de tratamento de um distúrbio à base de imuno em um indivíduo. Em uma concretização, o método aqui revelado é uma imunoterapia celular adotiva.
[000159] Em outra concretização, o método aqui revelado compreende obtenção de uma amostra biológica, a amostra biológica compreendendo uma população de células T individuais compatíveis; avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. Em um aspecto desta concretização, o método compreende adicionalmente expandir a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- antes da administração da subpopulação de células T no indivíduo.
[000160] Em outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. Em um aspecto desta concretização, o método compreende adicionalmente expandir a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- antes da administração da subpopulação de células T no indivíduo.
[000161] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD25+ CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. Em um aspecto desta concretização, o método compreende adicionalmente expandir a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- antes da administração da subpopulação de células T no indivíduo.
[000162] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25 e um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular nos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD25+ CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. Em um aspecto desta concretização, o método compreende adicionalmente expandir a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- antes da administração da subpopulação de células T no indivíduo.
[000163] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD6 e um biomarcador CD127; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. Em um aspecto desta concretização, o método compreende adicionalmente expandir a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- antes da administração da subpopulação de células T no indivíduo.
[000164] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD6 e um ligante de biomarcador CD127; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular dos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD6 e a CD1276 biomarcador; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. Em um aspecto desta concretização, o método compreende adicionalmente expandir a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- antes da administração da subpopulação de células T no indivíduo.
[000165] Em outra concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. Em um aspecto desta concretização, o método compreende adicionalmente expandir a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- antes da administração da subpopulação de células T no indivíduo.
[000166] Em outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. Em um aspecto desta concretização, o método compreende adicionalmente expandir a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- antes da administração da subpopulação de células T no indivíduo.
[000167] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, e um biomarcador CD127; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. Em um aspecto desta concretização, o método compreende adicionalmente expandir a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/- antes da administração da subpopulação de células T no indivíduo.
[000168] Em ainda outra concretização, o método aqui revelado compreende contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25, um ligante de biomarcador CD6, e um ligante de biomarcador CD127; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25, um biomarcador CD6, e um biomarcador CD127; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. Em um aspecto desta concretização, o método compreende adicionalmente expandir a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/- antes da administração da subpopulação de células T no indivíduo.
[000169] As etapas de avaliação, contato, isolamento e expansão são conforme aqui descritas. Uma amostra biológica obtida compreende uma população de células T individuais compatíveis. Conforme aqui usado, o termo "células T compatíveis individuais" se refere a células que podem ser introduzidas no indivíduo, opcionalmente em conjunto com uma terapia imunossupressora, sem resultar em doença de enxerto crônica extensiva versus doença de hospedeiro (GvHD). A população de células T individuais compatíveis obtidas pode compreender células T regulatórias de antígenos ou autoespecíficas de antígeno, e pode ser derivada de qualquer fonte em quaisquer células T regulatórias de antígenos ou autoespecíficas de antígeno, tais como sangue periférico, sangue do cordão umbilical, o timos, os nodos de linfa, baço, e tutano do osso. Uma amostra biológica pode ser obtida de um indivíduo saudável, ou de um indivíduo que sofre ou em remissão de um distúrbio à base de imuno, conforme aqui revelado, sujeito a terapia, conforme aqui descrito.
[000170] Em uma concretização, a amostra biológica compreendendo uma população de células compatíveis individuais é obtida a partir do indivíduo, isto é, células autólogas. Em outra concretização, a amostra biológica compreendendo uma população de células compatíveis individuais é obtida de um doador distinto do indivíduo. O doador é preferivelmente singenêico, mas pode também ser alogênico, ou ainda xenogenêico provido que as células obtidas são compatíveis ao indivíduo em que elas podem ser introduzidas no indivíduo, opcionalmente em conjunto com uma terapia imunossupressora, sem resultar em doença de enxerto crônica extensiva versus doença de hospedeiro (GvHD). As células doadoras alogênicas são preferivelmente antígeno de leucócito humano (HLA)-compatível, e são tipicamente administradas em conjunto com terapia imunossupressora. Para serem tornadas compatíveis ao indivíduo, as células xenogênicas podem ser submetidas a irradiação gama ou tratamento PEN10. Em certas concretizações, a fonte de células T regulatórias pode ser de tecido cadavérico.
[000171] Uma subpopulação de células T com um padrão de expressão do biomarcador desejado é administrada a um indivíduo. Um indivíduo pode ser qualquer mamífero em que a modulação de uma reação imune é desejada. Um indivíduo inclui um humano, e um humano pode ser um paciente. Tipicamente, qualquer indivíduo que é um candidate para um tratamento convencional para um distúrbio à base de imuno é um candidato para um tratamento de distúrbio à base de imuno aqui revelados. Avaliação pré-operatória tipicamente inclui história de rotina e exame físico em adição ao consentimento informado que revela todos os riscos relevantes e benefícios do procedimento.
[000172] Uma subpopulação de células T com um padrão de expressão do biomarcador desejado é uma população de células T regulatórias. Em um aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias compreende um padrão de expressão CD6low/-.
[000173] Em outro aspecto desta concretização, uma população de células T regulatórias compreende um padrão de expressão CD25+ CD6low/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, a população de células T regulatórias compreende um padrão de expressão CD6low/- CD127low/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, a população de células T regulatórias compreende um padrão de expressão CD6low/- CD38low/-. Em outro aspecto desta concretização, a população de células T regulatórias compreende um padrão de expressão CD6low/- CD49low/-.
[000174] Em outro aspecto desta concretização, a população de células T regulatórias compreende um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, a população de células T regulatórias compreende um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, a população de células T regulatórias compreende um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- CD49dlow/-. Em outro aspecto desta concretização, a população de células T regulatórias compreende um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- CD38low/-.
[000175] Em outro aspecto desta concretização, a população de células T regulatórias compreende um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD127low/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, a população de células T regulatórias compreende um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD49dlow/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, a população de células T regulatórias compreende um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD38low/-. Em outro aspecto desta concretização, a população de células T regulatórias compreende um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD45RAlow/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, a população de células T regulatórias compreende um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/- CD49dlow/-. Em ainda outro aspecto desta concretização, a população de células T regulatórias compreende um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/- CD38low/-. Em outro aspecto desta concretização, a população de células T regulatórias compreende um padrão de expressão CD6low/- CD127low/- CD49dlow/- CD38low/-.
[000176] Em outros aspectos desta concretização, a população de células T regulatórias compreende ou um padrão de expressão CD6low/-, um padrão de expressão CD25+ CD6low/-, ou um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- adicionalmente compreende um padrão de expressão CD127low/-, um padrão de expressão CD49dlow/-, um padrão de expressão CD38low/-, um padrão de expressão CD45RAlow/-, um padrão de expressão HLA-Dr+, um padrão de expressão HLA-Drlow/-, um padrão de expressão FoxP3+, um padrão de expressão FoxP3low/-, um padrão de expressão CTLA- 4+, um padrão de expressão CTLA-4low/-, um padrão de expressão GITR+, um padrão de expressão GITRlow/-, um padrão de expressão LAG-3+, um padrão de expressão LAG-3low/-, um padrão de expressão CD39+, um padrão de expressão CD39low/-, um padrão de expressão Helios+, um padrão de expressão Helioslow/-, um padrão de expressão FcRL3+, um padrão de expressão FcRL3low/-, um padrão de expressão CCR7+, um padrão de expressão CCR7low/-, um padrão de expressão CCR4+, um padrão de expressão CCR4low/-, um padrão de expressão CCR8+, um padrão de expressão CCR8low/-, um padrão de expressão CD62L+, um padrão de expressão CD62Llow/-, um padrão de expressão ICOS+, um padrão de expressão ICOSlow/-, um padrão de expressão CD103+, um padrão de expressão CD103low/-, um padrão de expressão PD-1+, um padrão de expressão PD-1low/-, um padrão de expressão CD134+, um padrão de expressão CD134low/-, um padrão de expressão GARP+, um padrão de expressão GARPlow/-, um padrão de expressão CD45RB+, um padrão de expressão CD45RBlow/-, um padrão de expressão CD45RO+, um padrão de expressão CD45ROlow/-, um padrão de expressão CD95+, um padrão de expressão CD95low/-, um padrão de expressão CD122+, um padrão de expressão CD122low/-, um padrão de expressão CD147low/-, um padrão de expressão CD8+, um padrão de expressão CD8low/-, ou qualquer combinação destes.
[000177] As células T regulatórias com um padrão de expressão do biomarcador desejado são administradas a um indivíduo que é tipicamente uma composição compreendendo células T regulatórias de antígenos predeterminados ou células T regulatórias autoespecíficas de antígeno. Tais células T regulatórias de antígenos predeterminados ou células T regulatórias autoespecíficas de antígeno são obtidas e expandidas usando métodos aqui revelados de células preferivelmente específicas para um antígeno predeterminado ou autoantígenos
[000178] pídeo (APS), artrite, anemia hemolítica autoimune, gastrite autoimune, hepatite autoimune, doença do ouvido interna autoimune, síndrome de poliendocrinopatia autoimune, uveorenite autoimune, penfigoide bolhoso, doença celíaca, doença de Chagas, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), colite, doença de Crohn, diabetes mellitus tipo 1 (IDDM), endometriose, fibromialgia, síndrome de Goodpasture, doença de Grave, síndrome de Guillain-Barré (GBS), tiroidite de Hashimoto, hidradenite supurativa, púrpura trombocitopênica idiopática, doença inflamatória do intestino, cistite intersticial, lúpus (incluindo eritematose de lúpus discoide, eritematose de lúpus induzida por fármaco, lúpus nefrite, lúpus neonatal, eritematose de lúpus cutânea subaguda e eritematose de lúpus sistêmica), morfeia, esclerose múltipla (MS), mistenia gravis, miopatias, narcolepsia, neuromiotonia, pemphigus vulgaris, anemia perniciosa, cirrose biliar primária, encefalomielite disseminada recorrente (encefalomielite disseminada multifásica), febre reumática, esquizofrenia, escleroderma, síndrome de Sjogren, tenosinovite, tiroidite, vasculite, e vitiligo. Ver Pamela D. Van Schaack & Kenneth L. Tong, Treatment of Autoimmune Disorder with a Neurotoxin, Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos 2006/138059, que é, desse modo, incorporado por referência em sua totalidade. Existem numerosos modelos de animal estabelecidos para uso de epítopes de célula T de autoantígenos para induzir tolerância, incluindo esclerose múltipla (EAE: encefalomielite autoimune experimental), miastenia gravis (EMG: miastenia gravis experimental), e neurite (EAN: neurite autoimune experimental).
[000179] Os aspectos da presente invenção proporcionam, em parte, uma rejeição de transplante. A rejeição de transplante ocorre quando um órgão ou tecido transplantado não é aceito pelo corpo do recipiente tranassociados com o alérgico alvo ou reação autoimune. As células T regulatórias administradas a um indivíduo podem servir como um "Trojan Horse" para distribuir fatores supressores ou outros fatores biológicos aos locais de inflamação, tais como, por exemplo, IL-4, fatores de crescimento de célula tronco, reguladores de angiogênese, ou deficiências genéticas.
[000180] Um indivíduo é tratado para um distúrbio à base de imuno. Conforme aqui usado, o termo "distúrbio à base de imuno" se refere a uma condição, distúrbio, ou doença em que uma resposta imune aberrante contribui para a patogênese do distúrbio à base de imuno no indivíduo. Uma resposta imune aberrante é qualquer reação imune em um indivíduo caracterizado como uma resposta imune indesejada ou resposta autoimune. Os métodos revelados de tratamento são úteis no tratamento de uma variedade de distúrbio à base de imuno diferente, em que a modulação de uma resposta imune aberrante no hospedeiro é desejada. Um distúrbio à base de imuno inclui, sem limitação, uma condição autoimune, distúrbio ou doença, uma rejeição de transplante, uma doença de enxerto vs. doença de hospedeiro, um câncer, doenças inflamatórias à base de imune, e reações imunes persistentes e progressivas a autoantígenos não infecciosos de organismos bacteriais, virais, fungais, ou parasíticos, que invadem e persistem dentro dos mamíferos e humanos. Tais condições e distúrbios incluem alergias e/ou asma. As alergias e asma podem ser devido à sensibilização com ou não autoantígenos ou antígenos estranhos como pólen, pelo de animal, e proteínas de alimento. A fonte da provocação de antígeno estranho pode ser planta, fungal, bolor, ou outro contaminante ambiental. Por exemplo, um distúrbio à base de imuno pode ser uma resposta autoimune e o antígeno é um autoantígeno, uma resposta imune de enxerto vs. resposta imune de hospedeiro, e o antígeno é um autoantígeno, uma alergia, uma asma, um tecido ou órgão, rejeição de transplante, ou uma resposta imune de enxerto vs. resposta imune de hospedeiro, e o antígeno é um componente purificado ou não purificado do alérgeno ou tecido transplantado, ou órgão que provoca a resposta imune nociva.
[000181] A autoimunidade é definida como reações imunes persistentes e progressivas a autoantígenos não infecciosos, como distintas de autoantígenos não infecciosos de organismos bacteriais, virais, fungais, ou parasíticos, que invadem e persistem dentro de mamíferos e humanos. Uma resposta autoimune ocorre quando o sistema imune de um indivíduo reconhece autoantígenos como estranhos, conduzindo a produção de células imunes efetuadoras autorreativas. As células imunes efetuadoras autorreativas incluem células de uma variedade de linhagens, incluindo, mas não limitadas a, células T citotóxicas, células T auxiliadoras, e células B. Enquanto que os mecanismos precisos diferem, a presença de células imunes efetuadoras autorreativas em um indivíduo que sofre de uma doença autoimune conduz a destruição de tecidos e células do indivíduo, resultando em sintomas patológicos. Um indivíduo com uma doença autoimune pode ser diagnosticado conforme conhecido a um versado na técnica. Tais indivíduos podem ser identificados sintomaticamente e/ou por obtenção de uma amostra do indivíduo, e isolamento das células T autorreativas, e comparando o nível de células T autorreativas no indivíduo para um controle. Ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos 2006/0105336. Numerosos ensaios para determinação da presença de tais células em um indivíduo, e, portanto, da presença de uma doença autoimune, tal como uma doença autoimune específica de antígeno em um indivíduo, são conhecidos aqueles técnicos no assunto, e prontamente empregados nos métodos revelados. Os ensaios de interesse incluem, mas não são limitados a, aqueles descritos em, por exemplo, Autoimmunity 36(6-7): 361-366 (2003); J. Pediatr. Hematol. Oncol. 25(Suppl 1): S57-S61 (2003); Proteomics 3(11): 2077-2084 (2003); Autoimmun. Rev. 2(1): 43-49 (2003).
[000182] Condição autoimune, distúrbio ou doença, podem ser amplamente divididos em condições autoimunes sistêmicas e específicas de órgão, distúrbios ou doenças, dependendo das características clínico-patológicas principais de cada doença. Uma condição autoimune sistêmica, distúrbio ou doença, incluem, sem limitação, eritematose de lúpus sistêmica (SLE), síndrome de Sjogren, Escleroderma, artrite reumatoide e polimiosite. Uma condição autoimune específica de órgão, distúrbio ou doença, podem ser endocrinológica (Diabetes Mellitus Tipo 1, tiroidite de Hashimoto, doença de Addison etc.), dermatológica (pemphigus vulgaris, psoríase, escleroderma), hematológica (anemia hemolítica autoimune), neural (esclerose múltipla), ou podem envolver virtualmente qualquer massa circunscrita de tecido corpóreo. Condição autoimunes, distúrbios ou doenças incluem, sem limitação, encefalomielite disseminada aguda (ADEM), doença de Addison, uma alergia ou sensibilidade, síndrome de anticorpos α-fosfolisplantado porque o sistema imune do recipiente ataca o órgão ou tecido transplantado. Uma resposta imune adaptativa, a rejeição de transplante é mediada através de ambos mecanismos imune mediado por célula T e humoral (anticorpos). O número de alelos desequiparados determina a velocidade e magnitude da resposta de rejeição. Mecanismos diferentes tendem a agirem contra transplantes diferentes.
[000183] Uma rejeição de transplante pode ser classificada como uma rejeição hiperaguda, uma rejeição aguda, ou uma rejeição crônica. A rejeição hiperaguda é uma resposta mediada por complemento em recipientes com anticorpos pré-existentes ao doador (por exemplo, anticorpos de tipo de sangue ABO). A rejeição hiperaguda ocorre dentro de minutos após o transplante, e deve ser imediatamente removida para impedir uma resposta inflamatória sistêmica severa. Aglutinação rápida do sangue ocorre.
[000184] A rejeição aguda pode começar antes de uma semana após transplante (conforme oposta à rejeição hiperaguda, que é imediata). O risco de rejeição aguda é mais alto nos primeiros três meses após transplante. Contudo, a rejeição aguda pode também ocorrer meses a anos após transplante. A razão que a rejeição aguda usualmente começa uma semana após transplante é que as células T são envolvidas no mecanismo de rejeição. Estas células T devem se diferenciar antes da rejeição começar. As células T fazem com que as células no tecido transplantado lisem, ou produzam cicotinas que causam necrose do tecido transplantado. Um episódio simples de rejeição aguda não é uma causa para preocupação, se reconhecida e tratada prontamente, e raramente conduz a falha do órgão. A rejeição aguda ocorre a algum grau em todos os transplantes (exceto aqueles entre gêmeos idênticos), a menos que a resposta imune seja alterada através do uso de fármacos imunossupressores. Ela é causada por HLA desequiparado, que estão presentes em todas as células do corpo. Existe um grande número de alelos diferentes de cada HLA, de modo a se equiparar perfeitamente entre todo HLA no tecido doador, e o corpo do recipiente é extremamente raro.
[000185] A rejeição crônica de um órgão ou tecido transplantado é onde a rejeição é devido a uma resposta imune e inflamatória crônica pobremente compreendida contra o tecido transplantado. A rejeição crônica após transplante de pulmão é a causa condutora de morbidez de longo prazo e mortalidade em pacientes de transplante de pulmão.
[000186] Também incluída no termo "rejeição de transplante"está uma doença de enxerto versus doença de hospedeiro (GVHD). A GVHD é uma complicação comum de transplante de tutano de osso alogenêico em que células imunes funcionais no tutano transplantado reconhecem o recipiente como "estranho", e montam um ataque imunológico. Isto pode também ocorrer em uma transfusão de sangue sob certas circunstâncias. A GVHD é dividida em formas agudas e crônicas. A forma aguda ou fulminante da doença (aGVHD) é normalmente observada dentro dos primeiros 100 dias pós-transplante, e é um desafio maior para transplantes devido a morbidez e mortalidade associadas. A forma crônica de doença de enxerto versus hospedeiro (cGVHD) normalmente ocorre após 100 dias. A aparência dos casos moderados a severos de cGVHD influencia adversamente a sobrevivência de longo prazo. A GVHD aguda e crônica parece envolver subconjuntos de célula imunes diferentes, perfis de citocina diferentes, alvos de hospedeiro um tanto diferentes, e resposta diferentemente a tratamento.
[000187] A GVHD aguda é caracterizada por dano seletivo ao fígado, pele e mucosa, trato gastrointestinal, o próprio sistema imune (o sistema hematopoiético, por exemplo, o tutano do osso e o timo), e os pulmões na forma de pneumonite idiopática. A GVHD aguda do trato GI pode resultar em inflamação intestinal severa, morte da pele da membrana mucosal, diarreia severa, dor abdominal, náusea, e vômito. Isto é tipicamente diagnosticado, via biópsia intestinal. A GVHD do fígado é medida pelo nível de bilirrubina em pacientes agudos. Os resultados da GVHD da pele em uma erupção maculopapular difusa, as vezes em um padrão rendilhado. A GVHD aguda é estagiada conforme segue: grau total (pele-fígado-intestino) com cada órgão estagiado individualmente de um baixo de 1 a um alto de 4. Os pacientes com GVHD de grau IV usualmente têm uma pobre prognose. Se a GVHD é severa e requer imunossupressão intensa envolvendo esteroides e agentes adicionais para ficar sob controle, o paciente pode desenvolver infecções severas como um resultado da imunossupressão, e pode morrer de infecção. A GVHD crônica também ataca os órgãos acima, mas sobre o curso de longo prazo pode também causar dano ao tecido conectivo e glândulas exócrinas.
[000188] As células T regulatórias específicas de antígeno, conforme aqui revelado, podem também ser usadas para tratar doenças infecciosas em que a patogenicidade não é um resultado dos efeitos citopáticos da patogenia, mas preferivelmente, o dano causado pela resposta imunoinflamatória ao agente infeccioso. Por exemplo, células T regulatórias que têm como alvo antígenos virais expressos, conforme aqui revelado, podem tratar uma doença imunoinflamatória induzida viral porque estas células T podem ser usadas para suprimir dano do tecido local causado pela infecção, e reduzir a inflamação que incita desenvolvimento de doença autoimune. Exemplos não limitativos de doenças imunoinflamatórias induzidas viral incluem hepatite C, inflamação corneal induzida por HSV, pancreatite induzida por Coxsackie, e diabetes tipo 1 induzida por Coxsackie.
[000189] Conforme aqui usado, o termo "tratamento" se refere a redução, melhora ou eliminação em um indivíduo de um sintoma clínico de um distúrbio à base de imuno; ou retardo ou prevenção em um indivíduo do começo de um sintoma clínico de um distúrbio à base de imuno. Por exemplo, o termo "tratamento" pode significar redução de um sintoma de uma condição caracterizada por um distúrbio à base de imuno por, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100%. Os sintomas de distúrbios à base de imuno incluem, sem limitação, edema, hiperemia, eritema, contusões, tumefação, rigidez, inchaço, febre, frio, nariz entupido, dificuldades de respiração, retenção de fluido, coágulos sanguíneos, perda de apetite, taxa de coração aumentada, formação de granulomas, pus, fluido seroso não viscoso, úlcera, produção diminuída de células imunes efetuadoras não reativas, inflamação e dor. Os sintomas atuais associados com um distúrbio à base de imuno são bem conhecidos, e podem ser determinados por um versado na técnica levando-se em conta fatores, incluindo, sem limitação, a localização do distúrbio à base de imuno, a causa do distúrbio à base de imuno, a severidade do distúrbio à base de imuno, o tecido ou órgão afetado pelo distúrbio à base de imuno.
[000190] Os aspectos da presente invenção proporcionam, em parte, redução de um sintoma associado com um distúrbio autoimune, ou rejeição de transplante. Em um aspecto desta concretização, o sintoma reduzido é inflamação, fadiga, tontura, mal-estar, febre elevada e alta temperatura do corpo, sensibilidade extrema a frio nas mãos e pés, fraqueza e rigidez nos músculos e juntas, mudanças de peso, problemas digestivos ou gastrointestinais, baixa ou alta pressão sanguínea, irritabilidade, ansiedade, ou depressão, infertilidade ou apetite sexual reduzido (baixa libido), mudanças no açúcar no sangue, e dependendo do tipo de doença autoimune, um aumento no tamanho de um órgão ou tecido ou, a destruição de um órgão ou tecido.
[000191] Os aspectos da presente invenção proporcionam, em parte, redução de um sintoma associado com inflamação. Em um aspecto desta concretização, o sintoma reduzido é edema, hiperemia, eritema, contusão, tumefação, rigidez, inchaço, febre, frio, congestão do trato respiratório incluindo nariz, e brônquios, congestão de um sino, um problema de respiração, retenção de fluido, um coágulo sanguíneo, uma perda de apetite, uma taxa aumentada do coração, uma formação de granulomas, pus, ou fluido seroso não viscoso, uma formação de uma úlcera, ou dor.
[000192] A quantidade de células T regulatórias conforme aqui revelado usada com os métodos de tratamento aqui revelados tipicamente será uma quantidade terapeuticamente efetiva. Conforme aqui usado, o termo "quantidade terapeuticamente efetiva"é sinônimo de "dose terapeuticamente efetiva", e se refere a quantidade de células T regulatórias que induzirá a resposta biológica ou clínica sendo procurada pela técnico em um indivíduo em necessidade deste. Como um exemplo não limitativo, uma quantidade efetiva é uma quantidade para reduzir um sintoma de um distúrbio à base de imuno similar a edema, hiperemia, eritema, contusões, tumefação, rigidez, inchaço, febre, frio, nariz entupido, dificuldades de respiração, retenção de fluido, coágulos sanguíneos, perda de apetite, taxa de coração aumentada, formação de granulomas, pus, fluido seroso não viscoso, úlcera, produção diminuída de células imunes efetuadoras não reativas, inflamação e dor.
[000193] A quantidade efetiva apropriada a ser administrada para uma aplicação particular dos métodos revelados pode ser determinada por aqueles técnicos no assunto, usando a orientação aqui proporcionada. Por exemplo, a eficiência de células T regulatórias aqui reveladas no tratamento de um sintoma de uma condição caracterizada por um distúrbio à base de imuno pode ser determinada por observação de um ou mais sintomas clínicos, e/ou indicadores fisiológicos associados com a condição. A resposta de um indivíduo com um distúrbio à base de imuno ao tratamento pode ser monitorada por determinação da severidade de seus sintomas, ou por determinação da frequência de células T autorreativas em uma amostra de um indivíduo com um distúrbio à base de imuno. A severidade dos sintomas do distúrbio à base de imuno pode se correlacionar com o número de células T autorreativas. Ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos 2006/0105336. Em adição, um aumento no número de células T autorreativas na amostra pode ser usado como uma indicação para aplicar tratamentos pretendidos para minimizar a severidade dos sintomas, e/ou tratar o distúrbio à base de imuno antes dos sintomas aparecerem. Como outro exemplo, a eficiência de células T regulatórias aqui reveladas no tratamento de um sintoma de uma condição caracterizada por um distúrbio à base de imuno pode ser determinada por confiar na experiência clínica com terapias de infusão de célula T existentes. Um aperfeiçoamento em um distúrbio à base de imuno também pode ser indicado por uma necessidade reduzida para uma terapia concorrente. Aqueles técnicos no assunto conhecerão os sintomas ou indicadores associados com um distúrbio à base de imuno específico, e saberão como determinar se um indivíduo é um candidato para tratamento conforme aqui revelado. Um versado na técnica reconhecerá que a condição do indivíduo pode ser monitorada através de todo curso de terapia, e que a quantidade efetiva de um composto ou composição aqui revelados que é administrada pode ser ajustada consequentemente.
[000194] Nos aspectos desta concretização, a quantidade terapeuticamente efetiva de células T regulatórias aqui reveladas reduz um sintoma associado com um distúrbio à base de imuno por, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 100%. Em outros aspectos desta concretização, uma quantidade terapeuticamente efetiva de células T regulatórias aqui revelados reduzem sintoma associado com um distúrbio à base de imuno por, por exemplo, ao menos 10%, ao menos 20%, ao menos 30%, ao menos 40%, ao menos 50%, ao menos 60%, ao menos 70%, ao menos 80%, ao menos 90% ou ao menos 100%. Em ainda outros aspectos desta concretização, uma quantidade terapeuticamente efetiva de células T regulatórias aqui revelada reduz um sintoma associado com um distúrbio à base de imuno por, por exemplo, cerca de 10% a cerca de 100%, cerca de 10% a cerca de 90%, cerca de 10% a cerca de 80%, cerca de 10% a cerca de 70%, cerca de 10% a cerca de 60%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 10% a cerca de 40%, cerca de 20% a cerca de 100%, cerca de 20% a cerca de 90%, cerca de 20% a cerca de 80%, cerca de 20% a cerca de 20%, cerca de 20% a cerca de 60%, cerca de 20% a cerca de 50%, cerca de 20% a cerca de 40%, cerca de 30% a cerca de 100%, cerca de 30% a cerca de 90%, cerca de 30% a cerca de 80%, cerca de 30% a cerca de 70%, cerca de 30% a cerca de 60%, ou cerca de 30% a cerca de 50%. Em ainda outros aspectos desta concretização, uma quantidade terapeuticamente efetiva de células T regulatórias aqui revelada é a dosagem suficiente para reduzir um sintoma associado com um distúrbio à base de imuno por, por exemplo, pelo menos uma semana, pelo menos um mês, pelo menos dois meses, pelo menos três meses, pelo menos quatro meses, pelo menos cinco meses, pelo menos seis meses, pelo menos sete meses, pelo menos oito meses, pelo menos nove meses, pelo menos dez meses, pelo menos onze meses, ou pelo menos doze meses.
[000195] Em outros aspectos desta concretização, uma quantidade terapeuticamente efetiva de células T regulatórias aqui revelada é, por exemplo, cerca de 1 x 107 células, cerca de 1 x 108 células, cerca de 1 x 109 células, cerca de 1 x 1010 células, ou cerca de 1 x 1011 células. Em ainda outros aspectos desta concretização, uma quantidade terapeuticamente efetiva de células T regulatórias aqui revelada é, por exemplo, pelo menos 1 x 107 células, pelo menos 1 x 108 células, pelo menos 1 x 109 células, pelo menos 1 x 1010 células, ou pelo menos 1 x 1011 células. Em ainda outros aspectos desta concretização, uma quantidade terapeuticamente efetiva de células T regulatórias aqui revelada é entre, por exemplo, cerca de 1 x 107 células a cerca de 1 x 1011 células, cerca de 1 x 108 células a cerca de 1 x 1011 células, cerca de 1 x 109 células a cerca de 1 x 1011 células, cerca de 1 x 1010 células a cerca de 1 x 1011 células, cerca de 1 x 107 células a cerca de 1 x 1010 células, cerca de 1 x 108 células a cerca de 1 x 1010 células, cerca de 1 x 109 células a cerca de 1 x 1010 células, ou cerca de 1 x 108 células a cerca de 1 x 109 células.
[000196] As células T regulatórias aqui reveladas podem ser administradas em uma variedade de modos. Por meio de um exemplo não limitativo, as células podem ser distribuídas intravenosamente, ou em uma cavidade do corpo adjacente à localização de uma resposta imune a ser suprimida, tal como a cavidade intraperitoneal, ou injetadas diretamente dentro ou adjacente ao local da reação imune. Administração intravenosa, por exemplo, é vantajosa no tratamento de muitas tais condições.
[000197] As células T regulatórias aqui reveladas podem ser formuladas em medicamentos e composições farmacêuticas usando veículos parenterais aceitáveis farmaceuticamente convencionais para administração por injeção. Estes veículos podem ser não tóxicos e terapêuticos, e um número de formulações é colocado em Remington's Pharmaceutical Sciences. Exemplos não limitativos de excipientes são salina, solução de Ringer, solução de salina-dextrose, e solução de sal equilibrada de Hank. As composições farmacêuticas podem também conter quantidades menores de aditivos, tais como substâncias que mantêm isotonicidade, pH fisiológico, e estabilidade. Os medicamentos e composições compreendendo células T regulatórias aqui reveladas podem ser em um formato de dose unitária. Geralmente, a dose unitária conterá uma quantidade terapeuticamente efetiva de células T regulatórias. A quantidade geralmente dependerá da idade, tamanho, gênero do paciente, a condição a ser tratada, e sua severidade, a condição das células, e suas características originais conforme obtidas do doador da amostra. Os métodos de titulação das dosagens para identificar aqueles que são terapeuticamente efetivos são conhecidos aos técnicos no assunto. Geralmente, uma quantidade terapeuticamente efetiva de células T regulatórias pode ser de cerca de 1 x 107 a cerca de 1 x 1011.
[000198] Os aspectos do presente relatório descritivo revelam, em parte, um kit compreendendo componentes úteis na realização de qualquer dos métodos aqui revelados.
[000199] Em uma concretização, um kit compreende componentes necessários para identificação, isolamento e/ou enriquecimento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras. Em um aspecto desta concretização, um kit para identificação e/ou isolamento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreende um ligante de biomarcador CD6.
[000200] Em outro aspecto desta concretização, um kit para identificação, isolamento e/ou enriquecimento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreende pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25 e um ligante de biomarcador CD6.
[000201] Em ainda outro aspecto desta concretização, um kit para identificação, isolamento e/ou enriquecimento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreende pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD6 e um ligante de biomarcador CD127.
[000202] Em uma concretização, os kits são designados como um protocolo de manchamento de uma etapa usando todo sangue usando três ligantes de biomarcador de superfície de célula diferente. Em um aspecto desta concretização, o kit compreende um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6. Em outro aspecto desta concretização, o kit compreende um ligante de biomarcador CD25, um ligante de biomarcador CD6, e um ligante de biomarcador CD127. Em ainda outro aspecto desta concretização, o kit compreende um ligante de biomarcador CD6, um ligante de biomarcador CD127, e um ligante de biomarcador CD49d. Em ainda outro aspecto desta concretização, o kit compreende um ligante de biomarcador CD6, um ligante de biomarcador CD127, e um ligante de biomarcador CD38. Em outro aspecto desta concretização, o kit compreende um ligante de biomarcador CD6, um ligante de biomarcador CD49d, e um ligante de biomarcador CD38. Em ainda outro aspecto desta concretização, o kit compreende um ligante de biomarcador FOXPS como um controle positivo.
[000203] Em ainda outro aspecto desta concretização, a kit para identificação, isolamento e/ou enriquecimento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreende pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6.
[000204] Em ainda outro aspecto desta concretização, um kit para identificação, isolamento e/ou enriquecimento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreende pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25, um ligante de biomarcador CD6, e um ligante de biomarcador CD127.
[000205] Em outros aspectos desta concretização, um kit para identificação, isolamento e/ou enriquecimento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras conforme aqui revelado pode adicionalmente incluir um ligante de biomarcador CD49d, um ligante de biomarcador CD38, um ligante de biomarcador CD45RA, um ligante de biomarcador HLA-Dr, um ligante de biomarcador FoxP3, um ligante de biomarcador CTLA-4, um ligante de biomarcador GITR, um ligante de biomarcador LAG-3, um ligante de biomarcador CD39, um ligante de biomarcador Helios, um ligante de biomarcador FcRL3, um ligante de biomarcador CCR7, um ligante de biomarcador CCR4, um ligante de biomarcador CCR8, um ligante de biomarcador CD62L, um ligante de biomarcador ICOS, um ligante de biomarcador CD103, um ligante de biomarcador PD-1, um ligante de biomarcador CD-134, um biomarcador GARP, um biomarcador CD45RB, um biomarcador CD45RO, um biomarcador CD95, um biomarcador CD122, um biomarcador CD147, um ligante de biomarcador CD8, ou qualquer combinação destes. Em ainda outros aspectos desta concretização, um kit para identificação, isolamento e/ou enriquecimento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras pode adicionalmente incluir controles positivos e/ou controles negativos e/ou instruções para identificação, isolamento e/ou enriquecimento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras pelo uso dos conteúdos do kit. Em outro aspecto desta concretização, um kit para identificação, isolamento e/ou enriquecimento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras pode adicionalmente incluir componentes necessários para expansão de uma população de células T regulatórias imunossupressoras.
[000206] Em outra concretização, um kit compreende componentes necessários para expansão de uma população de células T regulatórias imunossupressoras. Em um aspecto desta concretização, um kit para expansão de uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreende uma composição estimulatória. Nos aspectos desta concretização, uma composição estimulatória compreende uma quantidade efetiva de um antígeno ou aloantígeno. Em outros aspectos desta concretização, uma composição estimulatória compreende uma quantidade efetiva de um ativador de TCR/CD3. Em ainda outros aspectos desta concretização, uma composição estimulatória compreende adicionalmente um agente coestimulatório, um segundo agente estimulatório de célula T regulatória, agentes que geralmente promovem a sobrevivência e/ou crescimento de células T, ou qualquer combinação destes. Em outro aspecto desta concretização, um kit para expansão de uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreende uma composição estimulatória incluindo um anticorpo α-CD3, um anticorpo α-CD28, IL-2 ou IL-15, e TGFβ ou rapamicina. Em ainda outros aspectos desta concretização, um kit para expansão de uma população de células T regulatórias imunossupressoras pode adicionalmente incluir controles positivos e/ou controles negativos, e/ou instruções para expansão de uma população de células T regulatórias imunossupressoras pelo uso dos conteúdos do kit. Em ainda outros aspectos desta concretização, um kit para expansão de uma população de células T regulatórias imunossupressoras pode adicionalmente incluir recipientes de cultura similares a pratos ou frascos, meio de cultura, ou quaisquer tampões necessários, fatores, úteis para promover crescimento de célula. Em ainda outro aspecto, um kit para expansão de uma população de células T regulatórias imunossupressoras pode compreender adicionalmente um ligante de biomarcador CD6, pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, ou pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, conforme aqui revelado.
[000207] Os ligantes de biomarcadores revelados podem ser anticorpos ou ligantes, e podem ser etiquetados ou não etiquetados. Se etiquetado, o biomarcador pode ser covalentemente ou não covalentemente fixado com um fluoróforo, um ponto de quantum, um fósforo, um composto quimioluminescente, um composto bioluminescente, um composto cromogênico, um composto de isótopo similar a um lantanídeo, um radioisótopo, uma enzima, uma biotina ou molécula de avidina, ou qualquer outra etiqueta útil para detectar uma célula ligada pelo biomarcador. Se não etiquetado, o kit pode incluir adicionalmente uma etiqueta de outros reagentes úteis para etiquetação de um ligante de biomarcador. Os métodos de fixação de etiquetas aos anticorpos são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. Etiquetas particularmente preferidas são aquelas que são fixadas ao ligante de biomarcador por um lincador que pode ser prontamente clivado ou separado ou submetido à hidrólise por contato com uma enzima predeterminada sob condições fisiológicas. Em um aspecto desta concretização, o ligante de biomarcador CD4 é um anticorpo monoclonal anti-CD4 fluorescentemente etiquetado, o ligante de biomarcador CD25 é um anticorpo monoclonal anti-CD25 fluorescentemente etiquetado, o ligante de biomarcador CD6 é a anticorpo monoclonal anti-CD6 fluorescentemente etiquetado, e o ligante de biomarcador CD127 é um anticorpo monoclonal anti-CD127 fluorescentemente etiquetado.
[000208] A composição estimulatória revelada pode compreender uma quantidade efetiva de um ativador de TCR/CD3 que é específico de antígeno. A composição estimulatória pode adicionalmente incluir um ou mais agentes adicionais, por exemplo, um agente coestimulatório, um segundo agente estimulatório de célula T regulatória, ou agentes que geralmente promovem a sobrevivência e/ou crescimento de células T. Uma composição estimulatória pode estar em solução ou suspensão, ou imobilizada em uma superfície sólida, tais como, por exemplo, uma célula hospedeira, contas, ou outro substrato. As células adequadas para uso como substratos incluem células de apresentação de antígeno artificiais (aAPCs). As contas podem ser plásticas, de vidro, magnéticas, ou de qualquer outro material adequado, tipicamente na faixa de diâmetro de 1 μm a 20 μm. As composições estimulatórias, ativadores de TCR/CD3, agentes coestimulatórios, segundo agente estimulatório de célula T regulatórias, e fatores de promoção de sobrevivência e/ou crescimento, são conforme aqui descrito.
[000209] As instruções conforme aqui revelado podem estar presentes nos kits objetos em uma variedade de formas, uma ou mais das quais podem estar presentes no kit. Uma forma em que estas instruções podem estar presentes é como informação impressa em um meio adequado ou substrato, por exemplo, uma peça ou peças de papel na qual a informação é impressa, no acondicionamento do kit, em um inserto de acondicionamento, etc. Ainda outro meio seria um meio de leitura por computador, por exemplo, disquete, fita, ou CD., na qual a informação foi registrada. Ainda outro meio que pode estar presente é um endereço de website que pode ser usado, via a internet, para acessar a informação em um local removido. Qualquer meio conveniente pode estar presente nos kits.
[000210] Os aspectos do presente relatório descritivo revelam, em parte, uma composição compreendendo uma população de células T regulatórias imunossupressoras obtida de acordo com os métodos aqui revelados. Em uma concretização, uma composição compreendendo uma população de células T regulatórias imunossupressoras, conforme aqui revelado, é produzida de acordo com um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, conforme aqui revelado. Em outra concretização, a composição compreendendo uma população de células T regulatórias imunossupressoras, conforme aqui revelado, é produzida de acordo com um método de expansão de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, conforme aqui revelado. Nos aspectos destas concretizações, uma população de células T regulatórias imunossupressoras incluem células T regulatórias imunossupressoras compreendendo um padrão de expressão CD6low/-, células T regulatórias imunossupressoras compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-, células T regulatórias imunossupressoras compreendendo um padrão de expressão CD6low/- CD127low/-, células T regulatórias imunossupressoras compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-, células T regulatórias imunossupressoras compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- CD127low/-, ou células T regulatórias imunossupressoras compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- CD127low/-.
[000211] Em outra concretização, uma composição compreendendo uma população de células T regulatórias imunossupressoras, conforme aqui revelada, é uma composição farmacêutica. As composições farmacêuticas podem ser preparadas por combinação de uma quantidade terapeuticamente efetiva de células T regulatórias imunossupressoras, conforme aqui revelado, com excipientes farmacêuticos aceitáveis convencionais. Uma quantidade terapeuticamente efetiva de células T regulatórias tipicamente é aqui revelada, e é tipicamente entre cerca de 1 x 107 células a cerca de 1 x 1011 células. Preferivelmente, a composição farmacêutica não produz uma reação adversa, alérgica, ou outra reação desfavorável ou indesejada quando administrada a um indivíduo. Uma composição farmacêutica aqui revelada é útil para aplicações médicas e veterinárias. Uma composição farmacêutica pode ser administrada a um indivíduo sozinho, ou em combinação com outros compostos ativos suplementares, agentes, fármacos ou hormônios. As composições farmacêuticas podem ser produzidas usando qualquer de uma variedade de processos, incluindo, sem limitação, mistura convencional, dissolução, granulação, produção de drágeas, levigação, emulsificação, encapsulamento, arraste, e liofilização. A composição farmacêutica pode tomar qualquer de uma variedade de formas incluindo, sem limitação, uma solução estéril, suspensão, ou qualquer outra forma de dosagem adequada para administração.
[000212] Em outra concretização, uma composição compreendendo uma população de células T regulatórias imunossupressora aqui revelada é usada em um método de tratamento de um distúrbio à base de imuno em um indivíduo, conforme aqui revelado. Em ainda outra concretização, uma composição compreendendo uma população de células T regulatórias imunossupressora, conforme aqui revelada, é usada para produzir um medicamento para o tratamento de um distúrbio à base de imuno, conforme aqui revelado.
[000213] Os aspectos do presente relatório descritivo revelam, em parte, um método de enriquecimento de células T regulatórias imunossupressoras em um indivíduo. Em um aspecto, o método revelado compreendendo administrar um anticorpo α-CD6 ao indivíduo, no qual a administração torna inoperáveis as células T compreendendo um padrão de expressão CD6hi/+, mas células não T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-, enriquecendo, desse modo, uma população de células T regulatórias imunossupressoras no indivíduo.
[000214] Anticorpos anti-CD6 úteis para praticar o método revelado são descritos em, por exemplo, Starling, et al., Anticorpos monoclonais para CD6 Humano, US 6.372.215; e Casimiro, et al., Anticorpos Monoclonais Anti-CD6 e Seus Usos, U.S. 6.572.857, cada uma da qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Um anticorpo α- CD6 pode ser qualquer tipo de anticorpo conforme aqui revelado.
[000215] Um anticorpo α-CD6 pode ser administrado usando qualquer formulação de dosagem adequada e rota de administração. Por exemplo, uma composição compreendendo um anticorpo α-CD6 pode ser administrado por injeção.
[000216] A quantidade de anticorpo α-CD6 aqui revelada usada com os métodos de enriquecimento de células T regulatórias imunossupressoras em um indivíduo aqui revelada será tipicamente uma quantidade terapeuticamente efetiva. Com referência ao anticorpo α-CD6 administrado em um indivíduo para enriquecer células T regulatórias imunossupressoras, uma quantidade terapeuticamente efetiva se refere a quantidade de anticorpo α-CD6 que induzirá a resposta biológica ou clínica sendo procurada pelo técnico em um indivíduo em necessidade deste. Como um exemplo não limitativo, uma quantidade efetiva de um anticorpo α-CD6 é uma quantidade suficiente para enriquecer células T regulatórias imunossupressoras em um indivíduo.
[000217] Nos aspectos desta concretização, uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo α-CD6 é uma que torna inoperável uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreendendo um padrão de expressão CD6hi/+ por, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, conforme comparada ao número de células compreendendo um padrão de expressão CD6low/- no indivíduo. Em outros aspectos desta concretização, a quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo α-CD6 é uma que torna inoperável uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreendendo um padrão de expressão CD6hi/+ por, por exemplo, pelo menos duas vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos oito vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes, conforme comparada ao número de células compreendendo um padrão de expressão CD6low/- no indivíduo.
[000218] Nos aspectos desta concretização, uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo α-CD6 é uma que enriquece uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreendendo um padrão de expressão CD6low/- por, por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, conforme comparada ao número de células compreendendo um padrão de expressão CD6hi/+ no indivíduo. Em outros aspectos desta concretização, uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo α-CD6 é uma que enriquece uma população de células T regulatórias imunossupressoras compreendendo um padrão de expressão CD6low/- por, por exemplo, pelo menos duas vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos oito vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes, conforme comparado ao número de células compreendendo um padrão de expressão CD6hi/+ no indivíduo.
[000219] Os aspectos do presente relatório descritivo podem também ser descritos conforme segue: 1. Um método de identificação de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo: avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/— identifica uma população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra . 2. Um método de identificação de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo: contatar uma amostra compreendendo uma população de células T com um Ligante de biomarcador CD6; e avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 3. Um método de identificação de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo: avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 4. Um método de identificação de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo: contatar uma amostra compreendendo uma população de células T com pelo menos dois ligantes de biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25 e um ligante de biomarcador CD6; e avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- identifica uma população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 5. Um método de identificação de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo: avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, no qual o pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- identifica uma população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 6. Um método de identificação de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo: contatar uma amostra compreendendo uma população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6; e avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- identifica uma população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 7. O método, de acordo com as concretizações 1-6, no qual o método compreende adicionalmente isolar ou enriquecer a população de células T regulatórias imunossupressoras. 8. O método, de acordo com a concretização 7, no qual o método compreende adicionalmente expandir a população de células T regulatórias imunossupressoras com uma composição estimulatória. 9. Um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo: avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; e isolamento de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras. 10. Um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo: contatar uma amostra compreendendo uma população de células T com um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/—, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras. 11. Um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo: avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/—, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras. 12. Um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo: contatar uma amostra compreendendo uma população de células T com pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25 e um ligante de biomarcador CD6; avaliar u população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras. 13. Um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo: avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/—, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras. 14. Um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método compreendendo: contatar uma amostra compreendendo uma população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6; avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; e isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras. 15. O método, de acordo com as concretizações 9-14, no qual o método compreende adicionalmente expandir a população de células T regulatórias imunossupressoras. 16. Um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras expandida, o método compreendendo as etapas de: avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; isolamento de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6a CD6low/—; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/— com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida. 17. Um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras expandida, o método compreendendo as etapas de: contatar uma amostra compreendendo uma população de células T com um ligante de biomarcador CD6; e avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/- com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida. 18. Um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras expandida, o método compreendendo as etapas de: avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; isolamento de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida. 19. Um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras expandida, o método compreendendo as etapas de: contatar uma amostra compreendendo uma população de células T com pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25 e um ligante de biomarcador CD6; e avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/- com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida. 20. Um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras expandida, o método compreendendo as etapas de: avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; isolamento de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida. 21. Um método de obtenção de uma população de células T regulatórias imunossupressoras expandida, o método compreendendo as etapas de: contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6; e avaliar uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-; e contatar a subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- com uma composição estimulatória, obtendo-se, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras expandida. 22. Um método de tratamento de um distúrbio à base de imuno em um indivíduo, o método compreendendo: obtenção de uma amostra biológica, a amostra biológica compreendendo uma população de células T individuais compatíveis; avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; isolamento de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. 23. Um método de tratamento de um distúrbio à base de imuno em um indivíduo, o método compreendendo: obtenção de uma amostra biológica, a amostra biológica compreendendo uma população de células T individuais compatíveis; contatar uma amostra compreendendo a população de células T com um ligante de biomarcador CD6; e avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. 24. Um método de tratamento de um distúrbio à base de imuno em um indivíduo, o método compreendendo: obtenção de uma amostra biológica, a amostra biológica compreendendo uma população de células T individuais compatíveis; avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; isolamento de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD25+ CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. 25. Um método de tratamento de um distúrbio à base de imuno em um indivíduo, o método compreendendo: obtenção de uma amostra biológica, a amostra biológica compreendendo uma população de células T individuais compatíveis; contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD25 e um ligante de biomarcador CD6; e avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos dois biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos dois biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+ CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD25+ CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. 26. Um método de tratamento de um distúrbio à base de imuno em um indivíduo, o método compreendendo: obtenção de uma amostra biológica, a amostra biológica compreendendo uma população de células T individuais compatíveis; avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; isolamento de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-; e administração da subpopulação de células T com um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. 27. Um método de tratamento de um distúrbio à base de imuno em um indivíduo, o método compreendendo: obtenção de uma amostra biológica, a amostra biológica compreendendo uma população de células T individuais compatíveis; contatar uma amostra compreendendo a população de células T com pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, no qual os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluem um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6; e avaliar a população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes; no qual os pelo menos três biomarcadores diferentes incluem um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, e um biomarcador CD6; isolar uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/-; e administrar a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- no indivíduo, tratando, desse modo, um distúrbio à base de imuno no indivíduo. 28. O método, de acordo com as concretizações 22 e 23, no qual o método compreende adicionalmente expandir a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD6low/- com uma composição estimulatória antes da administração da subpopulação de células T com um padrão de expressão CD6low/- no indivíduo. 29. O método, de acordo com as concretizações 24 e 25, no qual o método compreende adicionalmente expandir a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD25+ CD6low/- com uma composição estimulatória antes da administração da subpopulação de células T com um padrão de expressão CD25+ CD6low/- no indivíduo. 30. O método, de acordo com as concretizações 26 e 27, no qual o método compreende adicionalmente expandir a subpopulação de células T com um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- com uma composição estimulatória antes da administração da subpopulação de células T com um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/- no indivíduo. 31. O método, de acordo com as concretizações 8, 16-21, e 28-30, no qual a composição estimulatória compreende um ativador de TCR/CD3 que é específico de antígeno. 32. O método, de acordo com a concretização 31, no qual a composição estimulatória compreende adicionalmente um agente coestimulatório, um segundo agente estimulatório de célula T regulatória, ou um Agente de sobrevivência ou crescimento de célula T. 33. O método, de acordo com a concretização 32, no qual a composição estimulatória compreende um anticorpo α-CD3, um anticorpo α-CD28, IL-2 ou IL-15, e TGFβ ou rapamicina. 34. O método, de acordo com as concretizações 1-33, no qual a amostra é uma amostra de PBMC. 35. O método, de acordo com as concretizações 1-33, no qual a amostra é uma amostra de sangue, uma amostra de tecido linfoide, uma amostra de timo, uma amostra de pâncreas, uma amostra de olho, uma amostra de coração, uma amostra de fígado, uma amostra de nervo, uma amostra de intestino, uma amostra de pele, uma amostra de músculo, uma amostra de cartilagem, ou uma amostra de ligamento. 36. O método, de acordo com as concretizações 1, 2, 7, 8, 15-17, 22, 23, 28, e 31-35, no qual o ligante de biomarcador CD6 é um anticorpo monoclonal anti-CD6 fluorescentemente etiquetado. 37. O método, de acordo com as concretizações 3, 4, 7, 8, 15, 18, 19, 24, 25, 29, e 31-35, no qual o ligante de biomarcador CD25 é um anticorpo monoclonal anti-CD25 fluorescentemente etiquetado, e o ligante de biomarcador CD6 é um anticorpo monoclonal anti-CD6 fluorescentemente etiquetado. 38. O método, de acordo com as concretizações 5-8, 15, 20, 21, 26, 27, e 30-35, no qual o ligante de biomarcador CD4 é um anticorpo monoclonal anti-CD4 fluorescentemente etiquetado, o ligante de biomarcador CD25 é um anticorpo monoclonal anti-CD25 fluorescentemente etiquetado, e o ligante de biomarcador CD6 é um anticorpo monoclonal anti-CD6 fluorescentemente etiquetado. 39. O método, de acordo com as concretizações 1-38, no qual os métodos incluem adicionalmente um ligante de biomarcador CD127, um ligante de biomarcador CD49d, um ligante de biomarcador CD38, um ligante de biomarcador CD45RA, um ligante de biomarcador HLA-Dr, um ligante de biomarcador FoxP3, um ligante de biomarcador CTLA-4, um ligante de biomarcador GITR, um ligante de biomarcador LAG-3, um ligante de biomarcador CD39, um ligante de biomarcador Helios, um ligante de biomarcador FcRL3, um ligante de biomarcador CCR7, um ligante de biomarcador CCR4, um ligante de biomarcador CCR8, um ligante de biomarcador CD62L, um ligante de biomarcador ICOS, um ligante de biomarcador CD103, um ligante de biomarcador PD-1, um ligante de biomarcador CD-134, um ligante de biomarcador GARP, um ligante de biomarcador CD45RB, um ligante de biomarcador CD45RO, um ligante de biomarcador CD95, um ligante de biomarcador CD122, um ligante de biomarcador CD147, um ligante de biomarcador CD8, ou qualquer combinação destes. 40. O método, de acordo com as concretizações 1-39, no qual os métodos incluem adicionalmente um biomarcador CD127, um biomarcador CD49d, um biomarcador CD38, um biomarcador CD45RA, um biomarcador HLA-Dr, um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, um biomarcador GITR, um biomarcador LAG-3, um biomarcador CD39, um biomarcador Helios, um biomarcador FcRL3, um biomarcador CCR7, um biomarcador CCR4, um biomarcador CCR8, um biomarcador CD62L, um biomarcador ICOS, um biomarcador CD103, um biomarcador PD-1, um biomarcador CD134, um biomarcador GARP, um biomarcador CD45RB, um biomarcador CD45RO, um biomarcador CD95, um biomarcador CD122, um biomarcador CD147, um biomarcador CD8, ou qualquer combinação destes. 41. O método, de acordo com as concretizações 1-40, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD127, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CD127low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 42. O método, de acordo com as concretizações 1-41, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD49d, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CD49dlow/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 43. O método, de acordo com as concretizações 1-42, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD38, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CD38low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 44. O método, de acordo com as concretizações 1-43, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD45RA, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CD45RAlow/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 45. O método, de acordo com as concretizações 1-44, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador HLA-Dr, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão HLA-Dr+ ou low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 46. O método, de acordo com as concretizações 1-45, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador FoxP3, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão FoxP3+ ou low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 47. O método, de acordo com as concretizações 1-46, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CTLA-4, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CTLA-4+ ou low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 48. O método, de acordo com as concretizações 1-47, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador GITR, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão GITR+ ou low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 49. O método, de acordo com as concretizações 1-48, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador LAG-3, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão LAG-3+ ou low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 50. O método, de acordo com as concretizações 1-49, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD39, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CD39+ ou low/-identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 51. O método, de acordo com as concretizações 1-50, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador Helios, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão Helios+ ou low/-identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 52. O método, de acordo com as concretizações 1-51, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador FcRL3, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão FcRL3+ ou low/-identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 53. O método, de acordo com as concretizações 1-52, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CCR7, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CCR7+ ou low/-identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 54. O método, de acordo com as concretizações 1-53, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CCR4, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CCR4+ ou low/-identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 55. O método, de acordo com as concretizações 1-54, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CCR8, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CCR8+ ou low/-identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 56. O método, de acordo com as concretizações 1-55, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD62L, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CD62L+ ou low/-identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 57. O método, de acordo com as concretizações 1-56, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador ICOS, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão ICOS+ ou low/-identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 58. O método, de acordo com as concretizações 1-57, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD103, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CD103+ ou low/-identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra . 59. O método, de acordo com as concretizações 1-58, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador PD-1, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão PD-1+ ou low/—identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 60. O método, de acordo com as concretizações 1-59, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD134, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CD134+ ou low/--identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 61. O método, de acordo com as concretizações 1-60, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador GARP, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão GARP+ ou low/--identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 62. O método, de acordo com as concretizações 1-61, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD45RB, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CD45RB+ ou low/--identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 63. O método, de acordo com as concretizações 1-62, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD45RO, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CD45RO+ ou low/-- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 64. O método, de acordo com as concretizações 1-63, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD95, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CD95+ ou low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 65. O método, de acordo com as concretizações 1-64, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD122, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CD122+ ou low/-- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 66. O método, de acordo com as concretizações 1-65, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD147, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CD147+ ou low/-- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 67. O método, de acordo com as concretizações 1-66, no qual a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular of um biomarcador CD8, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo adicionalmente um padrão de expressão CD8+ ou low/--identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra. 68. Um kit para identificação, isolamento, e/ou enriquecimento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o kit compreendendo um ligante de biomarcador CD6. 69. O kit, de acordo com a concretização 68, no qual o ligante de biomarcador CD6 é um anticorpo monoclonal anti-CD6 fluorescentemente etiquetado. 70. Um kit para identificação, isolamento, e/ou enriquecimento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o kit compreendendo pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluindo um ligante de biomarcador CD25 e um ligante de biomarcador CD6. 71. O kit, de acordo com a concretização 70, no qual o ligante de biomarcador CD25 é um anticorpo monoclonal anti-CD25 fluorescentemente etiquetado, e o ligante de biomarcador CD6 é um anticorpo monoclonal anti-CD6 fluorescentemente etiquetado. 72. Um kit para identificação, isolamento e/ou enriquecimento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o kit compreendendo pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes, os pelo menos dois ligantes de biomarcador diferentes incluindo um ligante de biomarcador CD6 e um ligante de biomarcador CD127. 73. O kit, de acordo com a concretização 72, no qual o ligante de biomarcador CD6 é um anticorpo monoclonal anti-CD6 fluorescentemente etiquetado, e o ligante de biomarcador CD127 é um anticorpo monoclonal anti-CD127 fluorescentemente etiquetado. 74. Um kit para identificação, isolamento e/ou enriquecimento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o kit compreendendo pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluindo um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6. 75. O kit, de acordo com a concretização 74, no qual o ligante de biomarcador CD4 é um anticorpo monoclonal anti-CD4 fluorescentemente etiquetado, o ligante de biomarcador CD25 é um anticorpo monoclonal anti-CD25 fluorescentemente etiquetado, e o ligante de biomarcador CD6 é um anticorpo monoclonal anti-CD6 fluorescentemente etiquetado. 76. Um kit para identificação, isolamento e/ou enriquecimento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o kit compreendendo pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes, os pelo menos três ligantes de biomarcador diferentes incluindo um ligante de biomarcador CD25, um ligante de biomarcador CD6, e um ligante de biomarcador CD127. 77. O kit, de acordo com a concretização 76, no qual o ligante de biomarcador CD25 é um anticorpo monoclonal anti-CD25 fluorescentemente etiquetado, o ligante de biomarcador CD6 é um anticorpo monoclonal anti-CD6 fluorescentemente etiquetado, e o ligante de biomarcador CD127 é um anticorpo monoclonal anti-CD127 fluorescentemente etiquetado. 78. O kit, de acordo com as concretizações 68-77, no qual o kit inclui adicionalmente um ligante de biomarcador CD49d, um ligante de biomarcador CD38, um ligante de biomarcador CD45RA, um ligante de biomarcador HLA-Dr, um ligante de biomarcador FoxP3, um ligante de biomarcador CTLA-4, um ligante de biomarcador GITR, um ligante de biomarcador LAG-3, um ligante de biomarcador CD39, um ligante de biomarcador Helios, um ligante de biomarcador FcRL3, um ligante de biomarcador CCR7, um ligante de biomarcador CCR4, um ligante de biomarcador CCR8, um ligante de biomarcador CD62L, um ligante de biomarcador ICOS, um ligante de biomarcador CD103, um ligante de biomarcador PD-1, um ligante de biomarcador CD-134, um ligante de biomarcador GARP, um ligante de biomarcador CD45RB, um ligante de biomarcador CD45RO, um ligante de biomarcador CD95, um ligante de biomarcador CD122, um ligante de biomarcador CD147, um ligante de biomarcador CD8, ou qualquer combinação destes. 79. Um kit para expansão de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o kit compreendendo uma composição estimulatória. 80. O kit, de acordo com a concretização 79, no qual a composição estimulatória compreende um ativador de TCR/CD3 que é específico de antígeno. 81. O kit, de acordo com as concretizações 79 e 80, no qual a composição estimulatória compreende adicionalmente um agente coestimulatório, um segundo agente estimulatório de célula T regulatória, ou um agente de sobrevivência ou crescimento de célula T. 82. O kit, de acordo com as concretizações 79, no qual a composição estimulatória compreende um anticorpo α-CD3 anticorpo, um anticorpo α-CD28, IL-2 ou IL-15, e TGFβ, ou rapamicina. 83. O kit, de acordo com a concretização 79-82, no qual o kit compreende adicionalmente um ligante de biomarcador CD6, ou qualquer um do kit de acordo com as concretizações 68-79. 84. O kit, de acordo com a concretização 79-81, no qual o kit compreende adicionalmente um ligante de biomarcador CD25 e um ligante de biomarcador CD6, ou qualquer um do kit de acordo com as concretizações 68-79. 85. O kit, de acordo com a concretização 79-81, no qual o kit compreende adicionalmente um ligante de biomarcador CD6 e um ligante de biomarcador CD127, ou qualquer um do kit de acordo com as concretizações 68-79. 86. O kit, de acordo com a concretização 79-81, no qual o kit compreende adicionalmente um ligante de biomarcador CD4, um ligante de biomarcador CD25, e um ligante de biomarcador CD6, ou qualquer um do kit de acordo com as concretizações 68-79. 87. O kit, de acordo com a concretização 79-81, no qual o kit compreende adicionalmente um ligante de biomarcador CD25, um ligante de biomarcador CD6, e um ligante de biomarcador CD127, ou qualquer um do kit de acordo com as concretizações 68-79. 88. Uma composição compreendendo uma população de células T regulatórias imunossupressoras obtida de acordo com um método de acordo com as concretizações 7-22 ou 31-67. 89. Uma composição, de acordo com a concretização 88, no qual a composição é uma composição farmacêutica. 90. Um método de enriquecimento de células T regulatórias imunossupressoras em um indivíduo, o método compreendendo administrar um anticorpo α-CD6 anticorpo ao the indivíduo, no qual a administração torna as células T inoperáveis compreendendo um padrão de expressão CD6hi/+, mas células não T compreendendo um padrão de expressão CD6low/-, enriquecendo, desse modo, uma população de células T regulatórias imunossupressoras no indivíduo. 91. Um método de identificação de quatro subconjuntos de maturação distintos de populações de célula T regulatória imunossupressoras, o método compreendendo as etapas de avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD4, de um biomarcador CD25, de um biomarcador CD6, e de um biomarcador adicional, o um biomarcador adicional sendo um biomarcador FoxP3, um biomarcador CD45RA, um biomarcador CCR4, um biomarcador CD39, ou um biomarcador HLA-Dr;no qual a detecção dos quatro subconjuntos de maturação distintos de células T regulatórias imunossupressoras é baseada em a i) padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD45RA+ em conjunto com um padrão de expressão CCR4low, um padrão de expressão CD39low, ou um padrão de expressão HLA-Dr low; ii) um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD45RA+ em conjunto com um padrão de expressão CCR4-, um padrão de expressão CD39-, ou um padrão de expressão HLA-Dr-; iii) um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD6low/— em conjunto com um padrão de expressão CCR4hi/+, um padrão de expressão CD45RA-, um padrão de expressão CD39hi/+, ou um padrão de expressão HLA-Drlow/—; e iv) um padrão de expressão CD4+CD25+CD6+ em conjunto com padrão de expressão CR4hi/+, um padrão de expressão CD45RA-, um padrão de expressão CD39low/—, ou um padrão de expressão HLA-Drlow/—. 92. O método, de acordo com a concretização 91, no qual um dos quatro subconjuntos de maturação distintos de populações de célula T regulatória imunossupressoras é um subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora naive ou de repouso, os subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora naive ou de repouso compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD45RA+CCR4- um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD45RA+CD39- ou um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD45RA+HLA-Dr-. 93. O método, de acordo com a concretização 91 ou 92, no qual um dos quatro subconjuntos de maturação distintos de populações de célula T regulatória imunossupressoras é um subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora de memória ou imatura, o subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora de memória ou imatura compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD45RA+CCR4low, um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD45RA+CD39low, ou um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD45RA+HLA-Drlow 94. O método, de acordo com as concretizações 91-93, no qual um dos quatro subconjuntos de maturação distintos de populações de célula T regulatória imunossupressoras é um subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora efetuadora ou matura, o subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora efetuadora ou matura compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD6low/-CCR4hi/+, um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD6low/-CD45RA-, um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD6low/-CD39hi/+, um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD6low/-CCR4hi/+CD45RA-, um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD6low/-CCR4hi/+CD39hi/+, ou um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD6low/-CCR4hi/+HLA-DRlow 95. O método, de acordo com as concretizações 91-94, no qual um dos quatro subconjuntos de maturação distintos de populações de célula T regulatória imunossupressoras é um subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora diferencial terminal, o subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora diferencial terminal compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD6hi/+CCR4hi/+, um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD6hi/+CD45RA- um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD6hi/+CD39low, um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD6hi/+HLA-Drlow, um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD6hi/+CCR4hi/+CD45RA- um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD6hi/+CCR4hi/+CD39low, ou um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD6hi/+CCR4hi/+HLA-DRlow. 96. Um método de identificação de quatro subconjuntos de maturação distintos de populações de célula T regulatória imunossupressoras, o método compreendendo as etapas de avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, um biomarcador CD127, e um biomarcador adicional, o um biomarcador adicional sendo um biomarcador FoxP3, um biomarcador CD45RA, um biomarcador CCR4, um biomarcador CD39, ou um biomarcador HLA-Dr;no qual a detecção dos quatro subconjuntos de maturação distintos de células T regulatórias imunossupressoras é baseada em a i) padrão de expressão CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+ em conjunto com um padrão de expressão CCR4low, um padrão de expressão CD39low, ou um padrão de expressão HLA-Dr low; ii) um padrão de expressão CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+ em conjunto com um padrão de expressão CCR4-, um padrão de expressão CD39-, ou um padrão de expressão HLA-Dr-; iii) um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD127low/— em conjunto com um padrão de expressão CCR4hi/+, um padrão de expressão CD45RA-, um padrão de expressão CD39hi/+, ou um padrão de expressão HLA-Drlow/—; e iv) um padrão de expressão CD4+CD25+CD127+ em conjunto com padrão de expressão CR4hi/+, um padrão de expressão CD45RA-, um padrão de expressão CD39low/—, ou um padrão de expressão HLA-Drlow/—. 97. O método, de acordo com a concretização 96, no qual um dos quatro subconjuntos de maturação distintos de populações de célula T regulatória imunossupressoras é um subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora naive ou de repouso, o um subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora naive ou de repouso compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+CCR4- um padrão de expressão CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+CD39- ou um padrão de expressão CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+HLA-Dr-. 98. O método, de acordo com a concretização 96 ou 97, no qual um dos quatro subconjuntos de maturação distintos de populações de célula T regulatória imunossupressoras é um subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora de memória ou imatura, o subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora de memória ou imatura compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+CCR4low, um padrão de expressão CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+CD39low, ou um padrão de expressão CD4+CD25+CD127low/-CD45RA+HLA-Drlow. 99. O método, de acordo com as concretizações 96-98, no qual um dos quatro subconjuntos de maturação distintos de populações de célula T regulatória imunossupressoras é um subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora efetuadora ou matura, o subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora efetuadora ou matura compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD127low/-CCR4hi/+, um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD127low/-CD45RA-, um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD127low/-CD39hi/+, um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD127low/- CCR4hi/+CD45RA-, ou um padrão de expressão CD4+CD25hi/+ CD127low/-CCR4hi/+CD39hi/+, ou um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD127low/- CCR4hi/+HLA-DRlow. 100. O método, de acordo com as concretizações 96-99, no qual um dos quatro subconjuntos de maturação distintos de populações de célula T regulatória imunossupressoras é um subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora diferencial terminal, o subconjunto de população de célula T regulatória imunossupressora diferencial terminal compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD127hi/+CCR4hi/+, um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD127hi/+CD45RA-, um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD127hi/+CD39low, um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD127hi/+HLA-Drlow, um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD127hi/+CCR4hi/+ CD45RA-, um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD127hi/+CCR4hi/+CD39low, ou um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD127low/-CCR4hi/+HLA-DRlow 101. O método, de acordo com as concretizações 91-100, no qual o método compreende adicionalmente isolar ou enriquecer um ou mais dos quatro subconjuntos de maturação distintos de populações de célula T regulatória imunossupressoras. 102. O método, de acordo com as concretizações 91-101, no qual o método compreende adicionalmente expandir o um ou mais dos quatro subconjuntos de maturação distintos de populações de célula T regulatória imunossupressoras com a composição estimulatória. 103. O método, de acordo com a concretização 102, no qual a composição estimulatória compreende um ativador de TCR/CD3 que é específico de antígeno. 104. O método, de acordo com as concretizações 102 ou 103, no qual a composição estimulatória compreende adicionalmente um agente coestimulatório, um segundo agente estimulatório de célula T regulatória, ou um agente de sobrevivência ou crescimento de célula T. 105. O método, de acordo com a concretização 102, no qual a composição estimulatória compreende um anticorpo α-CD3, um anticorpo α-CD28, IL-2 ou IL-15, e TGFβ, ou rapamicina. 106. O método, de acordo com as concretizações 91-105, no qual a amostra é uma amostra de PBMC. 107. O método, de acordo com as concretizações 91-106, no qual a amostra é uma amostra de sangue, uma amostra de tecido linfoide, uma amostra de timo, uma amostra de pâncreas, uma amostra de olho, uma amostra de coração, uma amostra de fígado, uma amostra de nervo, uma amostra de intestino, uma amostra de pele, uma amostra de músculo, uma amostra de cartilagem, ou uma amostra de ligamento.
[000220] Os seguintes exemplos não limitativos são proporcionados para proposta ilustrativa somente de modo a facilitar uma compreensão mais completa de concretizações representativas agora contempladas. Estes exemplos não devem ser construídos para limitar qualquer das concretizações descritas no presente relatório descritivo, incluindo aquelas pertencentes aos métodos de identificação, obtenção, expansão de células T regulatórias, os kits compreendendo componentes úteis na realização de qualquer dos métodos aqui revelados, e as composições compreendendo células T regulatórias.
[000221] De modo a demonstrar a distribuição de expressão de CD6 em células T regulatórias CD4+FOXP3+, CD25+FOXP3+ e CD4+CD25+FOXP3+, análise de citometria de fluxo multicolor foi realizada para determinar o padrão de expressão CD6 nestes subconjuntos de célula.
[000222] Células mononucleares de sangue periférico coletadas (PBMCc) foram manchadas para expressão de superfície de célula de CD4, CD25, CD6, e, para intracelular, manchadas com FOXP3. Brevemente, PBMCs de controles saudáveis foram isolados de sangue heparinizado por centrifugação de gradiente de Ficoll. Cerca de 1-2 x106 de PBMC/100 μL coletado de 1 x PBS-2% de soro Human AB (HABS)-1% para formaldeído (PFA) foram incubados a 4^C por 20-30 minutos com o seguinte coquetel de manchamento de superfície de célula de anticorpos monoclonais: α-CD6-FITC, α-CD4-PC7, e α-CD25- APC. As células incubadas foram lavadas duas vezes com 1 x PBS-2% HABS-1% PFA, fixadas e permeabilizadas com Tampão Perm/Fix (eBioscience), lavadas duas vezes com Tampão Perm/Wash (eBiocience), e, em seguida, incubadas com IgG humana a 4◦C por 5 minutos. Um coquetel de manchamento intracelular compreendendo α- FOXP3-Pacific blue clone 206D (BioLegend), anticorpos monoclonais foram adicionados a estas células, incubados no escuro por 60 minutos à temperatura ambiente, lavados com Tampão Perm/Wash Buffer, seguido por uma lavagem com 1 x PBS-2% HABS, e resuspensos em 500 μL 1 x PBS-2% de HABS-1% PFA.
[000223] Para análise de citometria de fluxo multicolor, mais do que 500.000 células foram analisadas usando um citômetro de fluxo (Citometria de fluxo GALLIOS™) equipado com laseres de 405 nm, 488- nm, e 633-nm e linfócitos foram fechados baseado na difusão de luz de avanço e lateral. Controles de autofluorescência, isotipo e FMO, foram usados para estabelecer as posições do histograma de eventos fluorescentes negativos e positivos, e os resultados foram expressos como a percentagem de células acima da região negativa para cada anticorpo monoclonal e/ou como a média de intensidade de fluorescência (MFI) de populações discretas. Controles de compensação foram realizados usando manchamento de tubo simples com anticorpos contra marcadores de linfócito humano conjugados com os fluorocromos usados em protocolos de manchamento. O controle negativo para manchamento de FOXP3 foi determinado por uma fluorescência menos um controle, controle de isotipo, e/ou população de célula negativa conhecida. Avaliação representativa dos resultados de duas amostras. A análise de dado coletado foi realizada usando Summit 5.0 ou Kaluza 1.1. Software ModFit para analisar frequência de precursor em ensaio proliferativo foi usado. Para análise estatística, Microsoft Office Excel 2003 e GraphPad Prism 5.01 foram usados.
[000224] Os resultados indicam que populações de linfócito CD4 FOXP3 mostram que expressão de biomarcador CD6 de superfície foi cerca de duas vezes baixa em células compreendendo um padrão de expressão CD4+FOXP3+ conforme comparado com células compreendendo um padrão de expressão CD4+FOXP3- (MFI 6.3 vs. 11.6)(FIG. 1A). Similarmente, a análise de populações de linfócito de CD25 FOXP3 mostra que expressão de biomarcador CD6 foi duas vezes inferior em células compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+FOXP3+ conforme comparado com células compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+FOXP3- (MFI 6.2 vs. 12.5), ou padrão de expressão CD4+CD25-FOXP3- (MFI 6.2 vs. 11.4) (Figura 1B).
[000225] T regulatória humana que ocorre naturalmente (nTreg) foi definida como células de CD4+FOXP3+, CD4+CD25+ ou CD4+CD25+FOXP3+ envolvidas na supressão in vitro dependente de contato. Este resultado indica que células de CD4+CD25+FOXP3+ e/ou CD4+CD25hiFOXP3+ nTreg mostram expressão inferior de um biomarcador CD6. Células T negativas de CD6 foram mostradas carecerem da capacidade de montar respostas aloreativas, e consideradas como célula anérgica. A falta de expressão de CD6 em célula nTreg sugere um mecanismo porque estas células regulatórias são também células anérgicas.
[000226] De modo a avaliar a expressão de marcador FOXP3 nas subpopulações de CD4/CD25/CD6, análise de citometria de fluxo multicolor foi realizada para determinar o padrão de expressão FOXP3 nestes subconjuntos de célula T regulatória.
[000227] PBMCs humanos foram isolados, coletados e manchados para expressão de biomarcador de superfície de célula e biomarcador intracelular, conforme descrito no Exemplo 1. Para análise de citometria de fluxo multicolor, mais do que 500.000 células foram analisadas usando uma citometria de fluxo (Citometria de fluxo GALLIOS™), e linfócitos foram fechados baseado no difusor de luz de avanço e lateral. Os linfócitos de CD4+ foram analisados em um gráfico de pontos para expressão de CD6/CD25. Uma expressão de FOXP3 foi analisada em três subconjuntos de célula CD4+: CD25+CD6low/-, CD25-CD6low/- e CD25-CD6+. O controle negativo para manchamento de FOXP3 foi determinado por uma fluorescência menos um controle, controle de isotipo, e população de célula negativa conhecida. O tamanho da amostra e análise de dado foram conforme descrito no Exemplo 1.
[000228] Os resultados revelam que 94,2% de linfócitos compreendendo um padrão de expressão CD25+CD6low/- CD4+ também expressam FOXP3 (Figura 2B). Contudo, somente 9,5% de linfócitos compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25- CD6low/- expressam FOXP3, e somente 1,8% de linfócitos compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25-CD6+ expressam FOXP3 (Figura 2B). Estes resultados indicam que corroboram que células FOXP3+ são heterogêneas para expressão de biomarcador CD25, mas revelam que as células T regulatórias com um padrão de expressão CD6low/— parecem identificar a maioria de células FOXP3+ nTreg.
[000229] De modo a avaliar a expressão de FOXP3 em uma subpopulação de CD25+CD6low/- de linfócito, a análise de citometria de fluxo multicolor foi realizada para determinar o padrão de expressão FOXP3 nestes subconjuntos de célula T regulatória.
[000230] Os PBMCs humanos foram isolados, coletados e manchados para expressão de biomarcador de superfície de célula e biomarcador intracelular, conforme descrito no Exemplo 1. Para análise de citometria de fluxo multicolor, mais do que 500.000 células foram analisadas usando uma citometria de fluxo (Citometria de fluxo GALLIOS™), e linfócitos foram analisados em um gráfico de pontos para expressão de CD6/CD25. A expressão de FOXP3 foi analisada em três subconjuntos de célula: CD25+CD6low/-, CD25-CD6low/- e CD25- CD6+. O controle negativo para manchamento de FOXP3 foi determinado por uma fluorescência menos um controle, controle de isotipo, e população de célula negativa conhecida. O tamanho da amostra e análise de dado foram conforme descrito no Exemplo 1.
[000231] Os resultados revelam que 89,2% de linfócitos compreendendo um padrão de expressão CD25+CD6low/- também expressam FOXP3 (Figura 3). Contudo, somente 9,0% de linfócitos compreendendo um padrão de expressão CD25-CD6low/-expressam FOXP3, e somente 1,8% de linfócitos compreendendo um padrão de expressão CD25-CD6+ expressam FOXP3 (Figura 3). Esta análise indica que linfócitos compreendendo um padrão de expressão CD25+CD6low/- incluem dois subconjuntos de população, uma população maior tendo um alto nível de expressão para FOXP3 (89,2%), e uma população menor tendo uma expressão de FOXP3 baixa ou ausente (10,7%) (Figura 3). Adicionalmente, estes experimentos indicam que células T compreendendo um padrão de expressão CD25low/-CD6+ não expressam FOXP3, pelo que células tendo um padrão de expressão CD25low/-CD6low/— contido em um subconjunto menor de células também expressam FOXP3 (9,0%) (Figura 3). Estes resultados indicam que células FOXP3+ são heterogêneas para expressão de biomarcador CD25, mas revelam que células T regulatórias com um padrão de expressão CD6low/— parecem identificar a maioria de células FOXP3+ nTreg.
[000232] De modo a avaliar o efeito de depleção de CD6 em células FOXP3+, análise de citometria de fluxo multicolor foi realizada para determinar a expressão de padrão de FOXP3 em subconjuntos de célula CD6+ e CD6low/-.
[000233] Os PBMCs humanos foram isolados, coletados e manchados para expressão de biomarcador de superfície de célula e biomarcador intracelular, conforme descrito mo Exemplo 1. Para análise de citometria de fluxo multicolor, mais do que 500.000 células foram analisadas usando uma citometria de fluxo (Citometria de fluxo GALLIOS™), e linfócitos foram analisados em um para expressão de CD6/CD4. A expressão de FOXP3 foi analisada em dois subconjuntos de célula: PBMC CD6low/- e PBMC CD6+. O controle negativo para manchamento de FOXP3 foi determinado por uma fluorescência menos um controle, controle de isotipo e população de célula negativa conhecida. O tamanho da amostra e análise de dado foram conforme descrito no Exemplo 1.
[000234] Esta análise também mostrou que linfócitos compreendendo um padrão de expressão de PBMC CD6low/-mostrou um nível mais alto de expressão para FOXP3 (41,5%), em seguida linfócitos compreendendo um padrão de expressão de PBMC CD6+ (8,3%)(FIG 4A). Estes resultados demonstraram que depleção de CD6 em PBMCs pode produzir um enriquecimento significante em células FOXP3+ nTreg.
[000235] De modo a identificar população de célula FOXP3 CD4+CD25+ mais homogênea, a análise de citometria de fluxo multicolor foi realizada para determinar o padrão de expressão de CD6 e CD127 nestes subconjuntos de célula T regulatória .
[000236] Os PBMCs humanos foram isolados, coletados e manchados para expressão de biomarcador de superfície de célula, e biomarcador intracelular, conforme descrito no Exemplo 1, exceto que os PBMCs foram obtidos de quatro indivíduos saudáveis e anticorpos monoclonais α-CD127-PE foram adicionados ao coquetel de manchamento de superfície de célula. Para análise de citometria de fluxo multicolor, mais do que 500.000 células foram analisadas usando uma citometria de fluxo (Citometria de fluxo GALLIOS™), e linfócitos foram fechados baseado no difusor de luz de avanço e lateral. Os linfócitos de CD4+ foram analisados em gráficos de pontos para expressão de CD4/CD25, expressão de CD127/CD25, e expressão de CD6/CD25. Os linfócitos CD4+CD25+ foram analisados em um gráfico de pontos para expressão de CD127/CD6. A expressão de FOXP3 foi analisada nos seguintes subconjuntos de célula CD4+: CD25+, CD25+CD127low/-, CD25+CD6low/-, CD25+CD6low/-CD127low/- e CD25+CD6+CD127+. O controle negativo para manchamento de FOXP3 foi determinado por uma fluorescência menos um controle, controle de isotipo, e população de célula negativa conhecida. O tamanho da amostra e análise de dado foram conforme descrito no Exemplo 1.
[000237] Os resultados indicam que não existe diferença significante encontrada na expressão de FOXP3 entre células de CD4+CD25hi (85,1% FOXP3+), CD4+CD6low/- (87,9% FOXP3+), e células de CD4+CD127low/- (88,0% FOXP3+) (Figura 5A). Colidentemente, quando células de CD4+CD25hi foram analisadas para expressão de CD6 e CD127, esta análise revelou que 94,9% de células compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD127low/- CD6low/- expresso FOXP3 (Figura 5B), um nível comparável a células de CD4+CD25+CD127low/- da qual 92,8% expressam FOXP3. Inversamente, o subconjunto de célula de CD4+CD25hiCD6+CD127+ mostrou baixa expressão de FOXP3 (22,6%) (Figura 5B). Tomados juntos, existe um enriquecimento progressivo em células de FOXP3+ de populações de CD4+CD25hi < CD4+CD6low/- = CD4+CD127low/- < CD4+CD25hiCD6lo/-CD127lo/- (Figura 5C). Portanto, a combinação de marcadores de superfície de CD6 e CD127 identifica uma população de CD4+CD25hi com o enriquecimento mais alto em células FOXP3+, e estes resultados indicam que uma população de célula de FOXP3+ homogênea pode ser identificada baseado em um padrão de expressão CD4+CD25+CD127low/-CD6low/—.
[000238] De modo a demonstrar a função de supressão de linfócito compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25 hi/+CD6low/—, um ensaio de supressão com células classificadas foi realizado para avaliar a capacidade de células adicionadas de CD4+CD25 hi/+CD6|ow/— para suprimir a proliferação de células T respondedoras de CD8+ alogênicas usando um ensaio de proliferação à base de carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (CFSE).
[000239] Os PBMCs humanos de controles saudáveis foram isolados de sangue heparinizado por centrifugação de gradiente Ficoll. Cerca de 20-30 x106 de PBMC/500 μL coletado de meio de cultura de célula completo foram incubados a 4^C por 30 minutos com o seguinte coquetel de manchamento de superfície de célula de anticorpos monoclonais: α-CD6-APC, α-CD4-PC7, e α-CD25-PE. As células incubadas foram lavadas duas vezes com 1 x PBS e resuspensas em meio completo a uma densidade de cerca de 10 x106 células/mL.
[000240] Para classificação de célula usando citometria de fluxo, cerca de 60.000 a 100.000 células foram classificados em meio completo usando um classificador de célula (Classificador de célula MOFLO® XDP) baseado em uma definição de portão sequencial. Os linfócitos foram fechados baseados em difusor de luz de avanço e lateral e parelhas foram excluídas por gráficos de pontos SSC-H/SSC-W e FSC-H/FSC-W. Os linfócitos de CD4+ foram analisados em gráficos de pontos para expressão de CD25/CD6. Dois subconjuntos de CD4+ foram selecionados para classificação de célula de alta velocidade: CD25+CD6low/- (células FOXP3+ Treg) e CD25-CD6+ (células FOXP3- non-Treg).
[000241] Os resultados demonstraram que este esquema de classificação resultou no isolamento de uma população de célula de CD4+CD25+CD6low/- que foi 96% pura (Figura 6A).
[000242] Para condução de um ensaio de supressão de Treg, 500 μL de 0,6 μM de CFSE foi adicionado a 500 μL de suspensão de célula compreendendo 1-20 milhões de PBMCs, designadas células respondedoras T (Tresp), isoladas de um indivíduo saudável único. A mistura de suspensão de célula foi incubada a cerca de 20-C por cerca de 5 minutos, cerca de 1 mL de HABS frio foi adicionado, e esta mistura foi incubada por cerca de 1 minuto. Após incubação, cerca de 10 mL de 1 x PBS foi adicionado, e esta mistura foi centrifugada a cerca de 1500 rpm a cerca de 20-C por cerca de 5 minutos. As células foram resuspensas a uma densidade de cerca de 1 x 106 células/mL em meio de cultura de célula completo (RMPI 1640, Glutamax-I, 25 mM de Hepes, 2,5% de soro humano AB, piruvato de sódio, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, mais amino ácidos não essenciais, e 2-mercaptoetanol).
[000243] O ensaio de supressão foi baseado em uma titulação de número de célula Treg. Cerca de 30.000 a 50.000 células totais foram revestidas em uma placa de 96 cavidades na seguinte célula classificada CD4+CD25+CD6low/- Treg a razões de célula de Tresp: 1:1, 1:2, 1:4, e 1:8. As células revestidas foram incubadas a 37°C em 5% de atmosfera de CO2 e 95% de umidade por quatro dias. As células foram, em seguida, estimuladas com 0,5 μg/mL de anticorpos monoclonais solúveis α-CD3 e α-CD28, e incubadas a 37°C em 5% de atmosfera de CO2 e 95% de umidade por quatro dias. Para coleta, as células foram centrifugadas a 750 rpm a cerca de 20^C por 3 minutos, o meio aspirado, e 150 μL de meio de cultura fresco foi adicionado a cada cavidade. Cerca de 4 μL de anticorpo monoclonal α-CD8-APC foi adicionado à cada cavidade, exceto para o controle de "PBMC não manchado", e incubado a 4^C por 30 minutos no escuro. Cerca de 200 μL de 1 x PBS, 10% de HABS foi adicionado a cada cavidade, e a placa de 96 cavidades foi centrifugada a 750 rpm a cerca de 20^C por 3 minutos, o meio aspirado, e cerca de 200 μL de 1 x PBS, 10% de HABS foi adicionado a cada cavidade. Cerca de 5 μL de 7AAD foi adicionado a cada cavidade para identificar células viáveis. Para analisar supressão de célula Treg usando citometria de fluxo, as células foram fechadas baseadas no difusor de luz de avanço e lateral e, em seguida, as células compreendendo um padrão de expressão de 7AAD+ foram excluídas, e as células compreendendo um padrão de expressão de CD8+ foram analisadas por manchamento de CFSE para avaliar a proliferação de célula. Uma população de célula não Treg classificada compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25-CD6+ foi usada como um controle negativo em todos os experimentos. Um histograma de CFSE de células respondedoras não estimuladas define a população original, e a proliferação de respondedores ativados foi determinada por cálculo de frequência precursora (pf) usando software ModFit LT (Verity Software House, v3.0; Topsham ME). O resultado representativo de três amostras é avaliado e é expresso como % de supressão de pf para cada amostra de razão de Treg:Tresp.
[000244] Os resultados mostram que células T compreendendo um padrão de expressão CD25+CD6low/- CD4+ têm uma função de supressão dependente da dose das células T CD8+ estimuladas com anticorpos monoclonais α-CD3 e α-CD28 (Figura 6B.). A supressão máxima (57%) foi observada a uma razão de 1:1 de Treg:Tresp. A atividade de supressão foi similar àquela de células classificadas de CD4+CD25hiCD127lo/- usadas como controle positivo para o ensaio (FIG 6B). Células classificadas CD4+CD25-CD6+ ou CD4+CD25- CD127+ não Treg usadas como um controle negativo não mostraram atividade de supressão (dado não mostrado). Estes resultados indicam que uma população de célula CD4+CD25+CD6low/- contém regulatório supressor. Tomados juntos, a alta expressão de FOXP3, distribuição característica de antígenos associados a Treg (CD4 e CD25), e atividade supressora em um ensaio funcional in vitro concluíram que células supressoras regulatórias T naturais mostram expressão baixa/negativa de superfície de célula de CD6, e que o padrão de expressão CD25+CD6low/- CD4+ identifica células de supressão de célula T regulatória.
[000245] De modo a determinar se um padrão de expressão CD6low/- define uma população de célula homogênea ou heterogênea, análise de citometria de fluxo multicolor foi realizada usando uma variedade de biomarcadores de modo a determinar se padrão de expressão de biomarcador diferente foi observado em células T regulatórias CD25+ CD6low.
[000246] Os PBMCs humanos foram isolados, coletados e manchados para expressão de biomarcador de superfície de célula e biomarcador intracelular, conforme descrito no Exemplo 1, exceto que anticorpos monoclonais α-CD45RA-ECD, e α-HLA-Dr-APCA750 foram adicionados ao coquetel de manchamento de superfície de célula, e anticorpos monoclonais α-CTLA-4-PC5 foram adicionados ao coquetel de manchamento intracelular. Para análise de citometria de fluxo multicolor, mais do que 500.000 células foram analisadas usando uma citometria de fluxo (Citometria de fluxo GALLIOS™), e linfócitos foram fechados baseado no difusor de luz de avanço e lateral, os linfócitos foram analisados em gráficos de pontos para CD6/expressão de FOXP3. O controle negativo para manchamento de FOXP3 foi determinado por uma fluorescência menos um controle e população de célula negativa conhecida. Em uma segunda etapa de análise de citometria de fluxo multicolor, mais do que 500.000 de células foram analisadas. Os linfócitos foram fechados baseado no difusor de luz de avanço e lateral, e analisadas com marcadores associados CD45RA, HLA-Dr e CTLA-4 Treg na base de CD45RA/padrões de expressão de FOXP3. O tamanho da amostra e análise de dado foram conforme descrito no Exemplo 1.
[000247] Os resultados da análise de CD6 e expressão de FOXP3 indicam que três populações distintas de células T regulatórias podem ser discernidos (Figura 7). Cerca de 22,0% de células de CD6low/- são células que compreendem adicionalmente um padrão de expressão CD45RA+FOXP3low/-; cerca de 37,1% de células de CD6low/— são células que compreendem adicionalmente um padrão de expressão CD45RA- FOXP3+; e cerca de 29,2% de células de CD6low/— são células que compreendem adicionalmente um padrão de expressão CD45RA- FOXP3low/—. A análise adicional destas três populações de célula de CD6low/- usando biomarcadores adicionais é mostrada na Tabela 1.
000248] Três subconjuntos de célula fenotípicas e funcionais Treg foram recentemente propostos, incluindo células Treg de repouso CD45RA+FOXP3low e células Treg ativadas CD45RA-FOXP3high, ambas com funções supressoras in vitro, e células Treg não supressoras de secreção de citocina CD45RA-FOXP3low. Os resultados usando um biomarcador CD6 indicam que estes três subtipos podem ser facilmente identificados e isolados.
[000249] De modo a mais totalmente caracterizar os linfócitos compreendendo um padrão de expressão CD25+CD6low/- CD4+, análise de citometria de fluxo multicolor foi realizada para determinar o padrão de expressão de CD127, CD45A, HLA-Dr, e CLTA-4 nestes subconjuntos de célula T regulatória.
[000250] Os PBMCs humanos foram isolados, coletados e manchados para expressão de biomarcador de superfície de célula e biomarcador intracelular, conforme descrito no Exemplo 1, exceto que anticorpos monoclonais α-CD127-PE, α-CD45RA-ECD, e α-HLA-Dr- APCA750 foram adicionados ao coquetel de manchamento de superfície de célula e anticorpos monoclonais α-CTLA-4-PC5 foram adicionados ao coquetel de manchamento intracelular. Para análise de citometria de fluxo multicolor, entre 0,5-1,0 x 106 células foram analisadas usando uma citometria de fluxo (Citometria de fluxo GALLIOS™), e linfócitos foram fechados baseado no difusor de luz de avanço e lateral. Os linfócitos de CD4+ foram analisados em gráficos de pontos para expressão de CD6/CD25. Os linfócitos de CD25+/CD6low/- foram analisados em gráficos de pontos para expressão de FOXP3, CTLA-4, CD45RA, e HLA-Dr. O controle negativo para manchamento de FOXP3 foi determinado por uma fluorescência menos um controle e população de célula negativa conhecida. O tamanho da amostra e análise de dado foram conforme descrito no Exemplo 1.
[000251] Os resultados mostram que células T compreendendo um padrão de expressão CD25+CD6low/- CD4+ expressam níveis diferentes de CTLA-4, CD45RA e HLA-Dr. A vasta maioria de células (84,5%) compreendendo um padrão de expressão CD25+CD6low/- também expressa FOXP3 (Figura 8). Os resultados também revelam que 62,7% de linfócitos compreendendo um padrão de expressão CD25+CD6low/- também expressa CTLA-4 (Figura 8), indicando que duas populações distintas de células T regulatórias CD25+CD6low/— existem, uma maioria de população (62,7%) que expressa CTLA-4 e uma minoria de população (37,3%) que não expressam este biomarcador (Figura 8). Similarmente, duas populações distintas de células T regulatórias CD25+CD6low/-foram identificadas baseado no CD45RA e biomarcador HLA-Drs. Para CD45RA, as duas populações distintas de células T regulatórias CD25+CD6low/-foram uma maioria de população (79,4%) que não expressam CD45RA e uma minoria de população (20,6%) que expressam este biomarcador (Figura 8). Para HLA-Dr, as duas populações distintas de células T regulatórias CD25+CD6low/-foram uma maioria da população (68,0%) que não expressa HLA-Dr e uma minoria da população (32,0%) que expressa este biomarcador (Figura 8). Estes resultados indicam que o uso de biomarcadores adicionais são úteis na identificação de populações de subconjunto distintas de células T regulatórias CD4+CD25+CD6low/— ou CD25+CD6low/—.
[000252] De modo a discernir diferenças entre populações de CD4+CD25hiCD6lo/- e CD4+CD25hiCD127lo/-Treg, a análise de citometria de fluxo multicolor foi realizada usando uma variedade de biomarcadores de modo a determinar se estes subconjuntos de célula T regulatória têm padrão de expressão de biomarcador diferente.
[000253] Os PBMCs humanos foram isolados, coletados e manchados para expressão de biomarcador de superfície de célula e biomarcador intracelular, conforme descrito no Exemplo 1, exceto que PBMCs foram obtidos de cinco indivíduos saudáveis, e as células foram manchadas usando um dois seguintes três painéis de anticorpos monoclonais fluorescentemente etiquetados: 1) Painel 8c (α-CD4-PC7, α-CD25-APC-AF647, α-CD6-FITC, α-CD127-PE, α-CD45RA-ECD, α- HLA-Dr-APC-AF750, α-CTLA-4-PC5, α-FOXP3-Pacific Blue); 2) Painel 10c-1 (α-CD4-Krome Orange, α-CD25-PC7, α-CD6-FITC, α-CD127- APC-CF700, α-CD45RA-APC-AF750, α-CD62L-ECD, α-CD39-APC- AF647, α-CCR4-PE, α-HLA-Dr-Pacific Blue, e α-7AAD; ou 3) Painel 10c- 2 (α-CD4-Krome Orange, α-CD25-PC7, α-CD6-FITC, α-CD127-APC- CF700, α-CD45RA-APC-AF750, α-CD62L-ECD, α-CD39-APC-AF647, α-GARP-PE, α-HLA-Dr-Pacific Blue, e α-7AAD). Para análise de citometria de fluxo multicolor, mais do que 500.000 células foram analisadas usando uma citometria de fluxo (Citometria de fluxo GALLIOS™), e linfócitos foram fechados baseado no difusor de luz de avanço e lateral. Os linfócitos de CD4+CD25+ foram fechados, expressão de CD127 ou CD6 e, em seguida, analisados em um gráfico de pontos para um dos outros biomarcadores. O tamanho da amostra e análise de dado foram conforme descrito no Exemplo 1.
[000254] Os resultados indicam que nenhuma diferença significante foi observada entre populações de CD4+CD25hiCD6lo/- e CD4+CD25hiCD127lo/-Treg com relação aos padrões de expressão de biomarcadores CCR4, CD39, HLA-DR,CD45RA, GARP, e CTLA-4 (Figura 9A, B, & C). Surpreendentemente, contudo, heterogeneidade na distribuição de HLA-Dr, CCR4, GARP, CD39 e expressão de biomarcador CD45RA foi observada dentro das populações de CD4+CD25hiCD6lo/- e CD4+CD25hiCD127lo/-Treg, indicando um potencial para subconjuntos diferentes em nTregs que similarmente representa estágios diferentes de maturação de célula (Figura 9A & B).
[000255] De modo a mais totalmente caracterizar linfócitos compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25hiCD6lo/-CD127lo/-, a análise de citometria de fluxo multicolor foi realizada usando uma variedade de biomarcadores de modo a determinar se estágios diferentes na trajetória de diferenciação/maturação de nTreg podem ser distinguidos.
[000256] Os PBMCs humanos foram isolados, coletados e manchados para expressão de biomarcador de superfície de célula e biomarcador intracelular, conforme descrito no Exemplo 1, exceto que células T foram manchadas usando os seguintes anticorpos monoclonais fluorescentemente etiquetados: α-CD4-Krome Orange, α- CD25-PC7, α-CD6-FITC, α-CD127-APC-CF700, α-CD45RA-APC- AF750, α-CD39-APC-AF647, α-CCR4-PE ou α-GARP-PE, α-HLA-Dr- Pacific Blue ou α-FOXP3-Pacific Blue. Para análise de citometria de fluxo multicolor, mais do que 500.000 células foram analisadas usando uma citometria de fluxo (Citometria de fluxo GALLIOS™), e linfócitos foram fechados baseado no difusor de luz de avanço e lateral. Os linfócitos de CD4+CD25+ foram fechados, expressão de CD127 e CD6 e, em seguida, analisados em um gráfico de pontos para um dos outros biomarcadores. O tamanho da amostra e análise de dado foram conforme descrito no Exemplo 1.
[000257] Inicialmente, células compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25hi/+CD6lo/-CD127lo/- onde examinadas para expressão de CD45RA, de modo a discriminar entre estágios de memória e de célula T de naive, e expressão de CCR4, como marcador de fornecimento de célula necessário para tráfico de célula aos tecidos locais, particularmente a pele. Os resultados identificam três populações de célula: 1) CD45RA+CCR4-, denominado o nTreg subconjunto de naive/repouso (N/R); 2) CD45RA+CCR4lo, denominado a imatura/memória (I/Me); e 3) CD45RA-CCR4hi, denominado a matura/efetuadoras (Ma/E) (Figura 10A). A análise de expressão de CD39 em cada um destes subconjuntos, revelou uma aumento progressivo na expressão de CD39 através do processo de maturação com 7,9% de expressão de CD39 no subconjunto N/R; 31,3% de expressão de CD39 no subconjunto I/Me; e 82,9% de expressão de CD39 no subconjunto Ma/E. A análise de expressão de HLA-Dr indica que expressão foi detectada no subconjunto Ma/E (35,8%). Interessantemente, quase todas das células positivas HLA-DR coexpressam CD39 no estágio Ma/E (Figura 10B). Estes resultados sugerem que expressão de HLA-DR aparecem nos estágios posteriores de maturação de nTreg conforme comparado a CD39.
[000258] A análise de células compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6+CD127+ onde examinado para expressão de CD45RA e CCR4. Os resultados revelam que a maioria de células (60%) foram CD45RA-CCR4hi (Figura 10C) com baixa expressão de CD39 (11,5%) e HLA-Dr (4,8%) (Figura 10D). Esta última população revelou um quarto subconjunto de população de célula na trajetória de diferenciação/maturação de nTreg que parece representar o subconjunto de nTreg terminalmente diferenciado (TD). Os resultados similares foram obtidos analisando MFI para cada marcador em subconjuntos de CD45RA/CCR4 (Figura 10E). Interessantemente, marcador de CD62L é expresso no compartimento complete CD45RA/CCR4 com alta expressão de MFI em subconjunto de nTreg- TD (Figura 10E). Usando uma combinação de retro-acoplamento e análise 3-D de expressão de marcador associado a Treg na população de CD4+CD25+CD6lo/-CD127lo/-, nós observamos que a maioria de células de HLA-Dr+ coexpressam CD39 e CCR4 (Figura 10F).
[000259] Finalmente, o exame de expressão de FOXP3 MFI em subconjuntos diferentes de nTreg demonstram que subconjuntos de HLA-Dr+CD45RA- mostram expressão de FOXP3 mais alta quando comparado às células de HLA-Dr-CD45RA- e HLA-Dr-CD45RA+, enquanto que o subconjunto de HLA-Dr/CD45RA negativo duplo demonstra uma expressão de FOXP3 intermediária (Figura 10G). Tomadas juntas, esta análise de padrão de expressão identifica quatro subconjuntos de população de célula na trajetória de diferenciação/maturação de nTreg conforme mostrado na Tabela 2.
[000260] Nós também analisamos a população de CD4+CD25hi/+CD6lo/-CD127lo/- Treg usando expressão de CD45RA e GARP. Os resultados identificaram três subconjuntos de população de célula CD4+CD25+CD6lo/-CD127lo/-: 1) células de CD45RA+GARP- (Pop1); 2) CD45RA-GARP- (Pop2); e 3) CD45RA-GARP+ (Pop3) (Figura 10H). A análise de expressão de CD39 e HLA-Dr em cada subconjunto de CD45RA/GARP mostrou um aumento na expressão de CD39 de Pop1 a Pop2 e Pop3. Contudo, diferente de um relatório anterior mostrando uma correlação positiva entre expressão de GARP e estado de ativação de células de nTreg (Wang, et al., Expression of GARP Selectively Identifies Activated Human FOXP3+ regulatory células-T, Proc Natl Acad Sci U S A 106: 13439-13444, 2009), expressão de HLA- Dr estava presente em ambas subpopulações de GARP- (Pop2) e GARP+ (Pop3) (Figura 10H). Além disso, expressão de GARP foi também detectada em células de CD4+CD25+CD6+CD127+ (Figura 10I).
[000261] Em resumo, é para ser compreendido que embora os aspectos do presente relatório descritivo sejam esclarecidos por referência às concretizações específicas, um versado na técnica apreciará prontamente que estas concretizações reveladas são somente ilustrativas dos princípios da matéria objeto aqui revelada. Portanto, deve ser compreendido que a matéria objeto revelada não é, de nenhum modo, limitada a uma metodologia, protocolo, e/ou reagente particulares, etc., aqui descritos. Como tal, várias modificações ou mudanças a, ou configurações alternativas da matéria objeto revelada, podem ser feitas de acordo com os ensinamentos aqui sem fugir do espírito do presente relatório descritivo. Por último, a terminologia aqui usada é para a proposta de descrição de concretizações particulares somente, e não é pretendida para limitar o escopo da presente invenção, que é definida somente pelas reivindicações. Consequentemente, a presente invenção não é limitada àquela precisamente conforme mostrada e descrita.
[000262] Certas concretizações da presente invenção são aqui descritas, incluindo o melhor modo conhecido aos inventores para efetuar a invenção. Naturalmente, variações nestas concretizações descritas tornar-se-ão aparentes àqueles técnicos no assunto após leitura da descrição precedente. O inventor espera que os técnicos no assunto empreguem tais variações conforme apropriado, e os inventores pretendem que a presente invenção seja praticada de outro modo do que especificamente aqui descrita. Consequentemente, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes da matéria objeto recitada nas reivindicações em anexo conforme permitidas pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação das concretizações acima descritas em todas as variações possíveis desta está envolvida pela invenção, a menos que de outro modo aqui indicado, ou de outro modo claramente contradito pelo contexto.
[000263] Os agrupamentos de concretizações alternativas, elementos, ou etapas da presente invenção, não são para serem construídos como limitações. Cada membro do grupo pode ser referido e reivindicado individualmente, ou em qualquer combinação com outros membros de grupo aqui revelados. É antecipado que um ou mais membros de um grupo podem ser incluídos em, ou retirados de, um grupo por razões de conveniência e/ou patenteabilidade. Quando qualquer tal inclusão ou anulação ocorre, o relatório descritivo é considerado conter o grupo como modificado, desse modo, preenchendo a descrição escrita de todos os grupos Markush nas reivindicações em anexo.
[000264] A menos que de outro modo indicado, todos os números expressando uma característica, item, quantidade, parâmetro, propriedade, prazo, e assim por diante, usados no presente relatório descritivo e reivindicações, são para serem compreendidos como sendo modificados em todos os exemplos pelo termo "cerca de". Conforme aqui usado, o termo "cerca de" significa que as características, item, quantidade, parâmetro, propriedade, ou prazo assim qualificados envolvem uma faixa de mais ou menos dez por cento acima e abaixo do valor da característica, item, quantidade, parâmetro, propriedade, ou prazo. Consequentemente, a menos que indicado ao contrário, os parâmetros numéricos colocados no relatório descritivo e reivindicações em anexo são aproximações que podem variar. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao escopo das reivindicações, cada indicação numérica deve pelo menos ser construída à luz do número de dígitos reportados significantes, e pela aplicação de técnicas de arredondamento ordinárias. Não obstante que as faixas numéricas e valores que colocam o escopo amplo da invenção são aproximações, as faixas numéricas e valores colocados nos exemplos específicos são reportados o mais precisamente possível. Qualquer faixa ou valor numérico, contudo, inerentemente, contém erros necessariamente resultantes do desvio padrão encontrado em suas respectivas medições de teste. A recitação de faixas e valores numéricos aqui é meramente pretendida para servir como um método abreviado de referência individualmente a cada valor numérico separado que cai dentro da faixa. A menos que de outro modo aqui indicado, cada valor individual de uma faixa numérica é incorporado no presente relatório descritivo como se ele fosse individualmente aqui recitado.
[000265] Os termos "um", "uma", "o", e referentes similares usados no contexto de descrição da presente invenção (especialmente no contexto das seguintes reivindicações) são para serem construídos para cobrir ambos o singular e o plural, a menos que de outro modo aqui indicado, ou claramente contradito pelo contexto. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que de outro modo aqui indicado, ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de quaisquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") aqui providos, são pretendidos meramente para melhor iluminar a presente invenção, e não imporem uma limitação no escopo da invenção de outro modo reivindicada. Nenhuma linguagem no presente relatório descritivo deve ser construída como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial à prática da invenção.
[000266] As concretizações específicas aqui reveladas podem ser adicionalmente limitadas nas reivindicações usando consistindo de ou consistindo essencialmente de linguagem. Quando usado nas reivindicações, se conforme depositado ou adicionado por emenda, o termo de transição "consistindo de" exclui qualquer elemento, etapa, ou ingrediente não especificado nas reivindicações. O termo de transição "consistindo essencialmente de" limita o escopo de uma reivindicação aos materiais especificados ou etapas, e aqueles que não afetam materialmente a(s) característica(s) básica e nova. As concretizações da presente invenção são inerentemente ou expressamente descritas e aqui capacitadas.
[000267] Todas as patentes, pedidos de patente, e outras publicações referenciadas e identificadas no presente relatório descritivo, são individualmente e expressamente aqui incorporados por referência em sua totalidade para a proposta de descrição e revelação, por exemplo, as composições e metodologias descritas em tais publicações que podem ser usadas em conjunto com a presente invenção. Estas publicações são providas somente para sua revelação antes da data de depósito do presente pedido. Nada neste particular deve ser construído como uma admissão que os inventores não são intitulados para preceder tal revelação em virtude da invenção anterior, ou por qualquer razão. Todas as declarações até aqui, ou representação aos conteúdos destes documentos, são baseadas na informação disponível aos requerentes, e não constituem qualquer admissão como para a correção das datas ou conteúdos destes documentos.
Claims (9)
1. Método de identificação e isolamento de uma população de células T regulatórias imunossupressoras, o método caracterizado pelo fato de que compreende: avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os pelo menos três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD4, um biomarcador CD25 e um biomarcador CD6; no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressãoCD4+CD25+CD6low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra e em que a detecção da expressão de CD6low/— compreende uma intensidade fluorescente de menos de 50%, 40%, 30%, 20% ou 10% como comparado à intensidade fluorescente observada para todas as células na amostra, e isolar a subpopulação de células T regulatórias imunossupressoras.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente enriquecer a população de células T regulatórias imunossupressoras.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente contatar a população de células T regulatórias imunossupressoras com uma composição estimulatória expandindo, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras, em que a composição estimulatória compreende um ativador de receptor de célula T específica (TCR)/grupo de diferenciação 3 (CD3) que é antígeno específico para a população de células T regulatórias imunossupressoras.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD127, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD25+CD6low/-CD127low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador HLA-Dr, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-HLA-Drlow/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de avaliação inclui adicionalmente avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD49d, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/— CD49dlow/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD38, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD38low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD45RA, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/— CD45RAlow/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador FoxP3, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-FoxP3+ ou CD4+CD25+CD6low/-FoxP3low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CTLA-4, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CTLA-4+ ou CD4+CD25+CD6low/-CTLA-4low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador GITR, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-GITR+ ou CD4+CD25+CD6low/-GITRlow/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador LAG- 3, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+ CD25+ CD6low/— LAG-3+ ou low/-identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD39, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/ CD39+ ou CD4+CD25+CD6low/ CD39low/- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador Helios, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-Helios+ ou CD4+CD25+CD6low/-Helios low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador FcRL3, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-FcRL3+ ou CD4+CD25+CD6low/-FcRL3low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CCR7, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CCR7+ ou CD4+CD25+CD6low/-CCR7low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CCR4, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CCR4+ ou CD4+CD25+CD6low/-CCR4low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CCR8, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CCR8+ ou CD4+CD25+CD6low/-CCR8low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD62L, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD62L+ ou CD4+CD25+CD6low/-CD62L low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador ICOS, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-ICOS+ ou CD4+CD25+CD6low/-ICOSlow/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD103, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD103+ ou CD4+CD25+CD6low/-CD103low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador PD- 1, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-PD-1 + ou CD4+CD25+CD6low/-PD-1low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD134, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD134+ ou CD4+CD25+CD6low/-CD134low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador GARP, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-GARP+ ou CD4+CD25+CD6low/-GARPlow/-- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD45RB, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/— CD45RB+ou CD4+CD25+CD6low/-CD45RBlow/-- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD45RO, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/— CD45RO+ou CD4+CD25+CD6low/-CD45ROlow/-- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD95, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD95+ ou CD4+CD25+CD6low/-CD95low/-- identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra; avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD122, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD122+ ou CD4+CD25+CD6low/-CD122low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra ; e/ou avaliar a amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de um biomarcador CD8, no qual a detecção de uma subpopulação de células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD8+ ou CD4+CD25+CD6low/-CD8low/— identifica a população de células T regulatórias imunossupressoras na amostra.
7. Método de identificação e isolamento de duas ou mais população de células T regulatórias imunossupressoras, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: avaliação de uma amostra compreendendo uma população de células T para detectar um nível de expressão celular de pelo menos três biomarcadores diferentes, os pelo menos três biomarcadores diferentes incluindo um biomarcador CD4, um biomarcador CD25, um biomarcador CD6 e um biomarcador adicional, o um biomarcador adicional sendo um biomarcador FoxP3, um biomarcador CTLA-4, um biomarcador CD45RA ou um biomarcador HLA-Dr; no qual a detecção de duas população distintas de células T regulatórias imunossupressoras é baseada em i) células T compreendendo um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-FoxP3+ e um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-FoxP3low/—, ii) células T compreendendo um padrão de expressão um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CTLA-4+ e um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CTLA-4low/- iii) células T compreendendo um padrão de expressão um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/— CD45RA+ e um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-CD45RAlow/—, ou iv) células T compreendendo um padrão de expressão um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-HLA-Dr+ e um padrão de expressão CD4+CD25+CD6low/-HLA-Drlow/- em que as células designadas como CD4+, CD25+, FoxP3+, CTLA-4+, CD45RA+ ou HLA-Dr+ exibem 10% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais ou 50% ou mais intensidade fluorescente quando comparado à intensidade fluorescente observada para todas as células sendo avaliadas; células designadas como CD6low, FoxP3low, CTLA-4low, CD45RAlow ou HLA-Drlow exibem 50% ou menos, 40% ou menos, 30% ou menos, 20% ou menos ou 10% ou menos intensidade fluorescente quando comparado à intensidade fluorescente observada para todas as células sendo avaliadas; células designadas como CD6-, FoxP3-, CTLA-4-, CD45RA- ou HLA-Dr- exibem 10% ou menos, 7% ou menos, 5% ou menos, 3% ou menos ou 2% ou menos intensidade fluorescente quando comparado à intensidade fluorescente observada para todas as células sendo avaliadas; e isolar as populações distintas de células T regulatórias imunossupressoras.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente enriquecer uma ou mais dos dois grupos distintos de maturação das populações de células T regulatórias imunossupressoras.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente contatar o um ou mais das populações de grupos distintos de maturação das populações de células T regulatórias imunossupressoras com uma composição estimulatória expandindo, desse modo, a população de células T regulatórias imunossupressoras.
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