WO2023084474A1 - 조절 t세포의 바이오 마커 - Google Patents

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WO2023084474A1
WO2023084474A1 PCT/IB2022/060908 IB2022060908W WO2023084474A1 WO 2023084474 A1 WO2023084474 A1 WO 2023084474A1 IB 2022060908 W IB2022060908 W IB 2022060908W WO 2023084474 A1 WO2023084474 A1 WO 2023084474A1
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cancer
cells
disease
regulatory
protein
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PCT/IB2022/060908
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래경 이크리스티나
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제이알디 사이언스 주식회사
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    • G01N33/57407—Specifically defined cancers

Definitions

  • Biomarkers for regulatory T cells ⁇ Biomarkers for regulatory T cells ⁇
  • Regulatory T cells play an important role in naturally preventing the occurrence of excessive inflammation and immune response, but when autoimmune diseases and chronic inflammatory diseases occur, the function and number of regulatory T cells are significantly reduced. that has been reported Therefore, in the case of patients with immune and inflammatory diseases, it is important that regulatory T cells are produced at normal levels, and this can be one of the treatments for these diseases.
  • regulatory T cells are abundantly distributed in the cancer microenvironment and inhibit the ability of natural killer cells (NK cells) or cancer-specific cytotoxic T lymphocytes to eliminate cancer cells. It has been reported to play an important role in the immune evasion mechanism of cancer along with 1 and CTLA-4.
  • Regulatory T cells are naive regulatory T cells (undifferentiated Treg; nTreg), resting regulatory T cells (resting Treg; rTreg), effector Treg; eTreg), and memory regulatory T cells ( memory Treg; mTreg).
  • the Shimon Sakaguchi group classified non-Treg, nTreg/rTreg, and eTreg based on the expression levels of CD4, CD45RA, Foxp3, and CD25 (CD4+CD25+CD45RA-Foxp3lo; non-Treg, CD4+CD25+CD45RA+Foxp3lo ; nTreg, CD4+CD25+CD45RA-Foxp3hi; eTreg).
  • regulatory T cells action regulatory T cells and memory regulatory T cells are known to have high immunosuppressive ability.
  • TIL tumor infiltrating lymphocytes
  • One object of the present invention is to provide a method for identifying regulatory T cells using an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to a marker specific to regulatory T cells or a fragment thereof.
  • Another object of the present invention is a marker specific to regulatory T cells or a fragment thereof; Or to provide a composition for diagnosis of cancer, immune-related disease or brain nervous system disease comprising an agent for measuring the expression level of a gene encoding the same.
  • Another object of the present invention is a marker specific to regulatory T cells or a fragment thereof; Or to provide a diagnosis kit comprising a composition for diagnosis of cancer, immune-related disease or brain nervous system disease including an agent for measuring the expression level of a gene encoding the same.
  • Another object of the present invention is a marker or fragment thereof specific to regulatory T cells in a biological sample isolated from a subject of interest; Or to provide an information providing method for diagnosing cancer, immune-related disease or brain nervous system disease comprising measuring the expression level of a gene encoding the same.
  • Regulatory T cell or “Treg” of the present invention may be selected from the group consisting of regulatory T cells with high immunosuppressive activity, memory regulatory T cells, and cancer infiltrating lymphocyte regulatory T cells, but are limited thereto It is not.
  • a "nucleic acid molecule" of the present invention includes any nucleic acid molecule in which the amino acid sequence of a polypeptide provided herein is translated into a polynucleotide sequence as known to those skilled in the art. Therefore, various polynucleotide sequences by ORF (open reading frame) can be prepared, and all of them are also included in the nucleic acid molecule of the present invention.
  • ORF open reading frame
  • antibody refers to a substance that specifically binds to an antigen and causes an antigen-antibody reaction.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to a regulatory T cell specific protein or an extracellular domain thereof.
  • the antibodies of the present invention include both polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies. Such antibodies can be readily prepared using techniques well known in the art. For example, polyclonal antibodies can be produced by a method well known in the art, which includes a process of injecting an antigen of the biomarker protein into an animal, collecting blood from the animal, and obtaining serum containing the antibody.
  • polyclonal antibodies can be prepared from any animal, such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow, dog, and the like.
  • monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method well known in the art (see Kohler and Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519), or the phage antibody library technique (Clackson et al, Nature, 352). :624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991).
  • Antibodies prepared by the above methods may be separated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • antibodies of the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full-length light chains and two full-length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule means a fragment having at least an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2, and Fv.
  • immunoglobulin has a heavy chain and a light chain, each of which includes a constant region and a variable region.
  • the light chain and heavy chain variable regions include three variable regions called complementarity determining regions (hereinafter referred to as “CDRs”) and four framework regions.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the CDR mainly serves to bind to the antigenic determinant (Epitope) of the antigen.
  • the CDRs of each chain are typically referred to sequentially starting from the N-terminus as CDR1, CDR2, and CDR3, and are also identified by the chain in which the particular CDR is located.
  • the "complementarity determining region (CDR)" includes three variable regions and four framework regions.
  • the CDR mainly serves to bind to the epitope of the antigen.
  • the CDRs of each chain are typically referred to sequentially starting from the N-terminus as CDR1, CDR2, and CDR3, and are also identified by the chain in which the particular CDR is located.
  • a "full-length antibody” is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, each light chain connected to the heavy chain by a disulfide bond, and IgA, IgD, IgE, IgM , and IgG.
  • the IgG includes IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 as its subtype.
  • antigen-binding fragment refers to a fragment having an antigen-binding function
  • examples of antigen-binding fragments include (i) light chain variable region (VL) and heavy chain variable region (VH) and light chain constant region.
  • the antigen-binding fragment may be a Fab or F(ab') 2 fragment using a proteolytic enzyme, for example, papain or pepsin, and may be prepared through genetic modifications.
  • monoclonal antibody refers to an antibody molecule of a single molecular composition obtained from substantially the same antibody population, and exhibits a single binding specificity and affinity for a specific epitope.
  • binding refers to the affinity of an antibody or antibody composition of the present invention for an antigen.
  • “specific binding” is typically associated with non-specific background binding when the dissociation constant (Kd) is less than 1 x 10 -5 M or less than 1 x 10 -6 M or less than 1 x 10 -7 M can be distinguished.
  • Kd dissociation constant
  • Specific binding can be detected by methods known in the art, such as ELISA, surface plasmon resonance (SPR), immunoprecipitation, coprecipitation, and the like, and non-specific binding and specific binding Include an appropriate control group that can be differentiated.
  • the "antibody or antigen-binding fragment" of the present invention may exist as a multimer such as a dimer, a trimer, a tetramer, or a pentamer, which includes at least a portion of the antigen-binding ability of a monomer. These multimers also include homomultimers or heteromultimers. Since antibody multimers contain multiple antigen-binding sites, they have superior antigen-binding ability compared to monomers. Multimers of antibodies are also easy to construct multifunctional (bifunctional, trifunctional, tetrafunctional) antibodies.
  • prevention may include without limitation any act of blocking disease symptoms, suppressing or delaying disease symptoms using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • treatment and “improvement” may include without limitation any action that improves or benefits the symptoms of a disease by examining the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the "pharmaceutical composition” of the present invention is not limited to these, but is formulated in the form of oral formulations such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, external preparations, suppositories and sterile injection solutions according to conventional methods, respectively.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may include binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, flavors, etc. for oral administration, and buffers, preservatives, and painless agents for injections.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention may be variously prepared by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, for oral administration, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, it can be prepared in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. there is.
  • it may be formulated into solutions, suspensions, tablets, capsules, sustained-release preparations, and the like.
  • examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifiers, preservatives, and the like may be further included.
  • the "administration route" for the pharmaceutical composition includes, but is not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal , topical, sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intracapsular, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also be administered in the form of a suppository for rectal administration.
  • the "use and dose” of the composition of the present invention includes the activity of the specific compound used, age, weight, general health, gender, dosage, administration time, route of administration, excretion rate, drug formulation and severity of the specific disease to be prevented or treated. It can vary widely depending on various factors, and the dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's condition, weight, disease severity, drug type, administration route and period, but can be appropriately selected by those skilled in the art, and can be appropriately selected by a person skilled in the art, 0.0001 per day. to 50 mg/kg or 0.001 to 50 mg/kg. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. The dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated into a pill, dragee, capsule, liquid, gel, syrup, slurry, or suspension.
  • PNA Protein Nucleic Acid
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • DNA has a phosphate-ribose backbone
  • PNA has a repeated N-(2-aminoethyl)-glycine backbone linked by peptide bonds, which greatly increases the binding force and stability to DNA or RNA, and is thus used in molecular biology. , diagnostic assays and antisense therapies.
  • PNA is described by Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254 (5037): 1497-1500.
  • An "aptamer” of the present invention is an oligonucleic acid or peptide molecule, and a general description of aptamers is described in Bock LC et al., Nature 355(6360):5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine”. J Mol Med. 78(8):42630 (2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library”. Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727 (1998).
  • the "primer” of the present invention is a fragment that recognizes a target gene sequence, and includes a forward and reverse primer pair, preferably a primer pair that provides an analysis result having specificity and sensitivity. High specificity can be imparted when the nucleic acid sequence of the primer is a sequence that is inconsistent with the non-target sequence present in the sample, so that the primer amplifies only the target gene sequence containing a complementary primer binding site and does not cause non-specific amplification. .
  • probe of the present invention means a substance capable of specifically binding to a target substance to be detected in a sample, and means a substance capable of specifically confirming the presence of a target substance in a sample through the binding.
  • the type of probe is not limited as a material commonly used in the art, but preferably may be peptide nucleic acid (PNA), locked nucleic acid (LNA), peptide, polypeptide, protein, RNA or DNA, and most preferably Most likely it is PNA.
  • PNA peptide nucleic acid
  • LNA locked nucleic acid
  • the probe is a biomaterial, including one derived from or similar to a living organism or manufactured in vitro, for example, enzymes, proteins, antibodies, microorganisms, animal and plant cells and organs, nerve cells, DNA, and It may be RNA, DNA includes cDNA, genomic DNA, and oligonucleotides, RNA includes genomic RNA, mRNA, and oligonucleotides, and examples of proteins may include antibodies, antigens, enzymes, peptides, and the like.
  • LNA Locked nucleic acids
  • LNA nucleosides contain the common nucleic acid bases of DNA and RNA, and can base pair according to the Watson-Crick base pairing rules. However, due to molecular 'locking' due to the methylene bridge, the LNA does not form an ideal shape in the Watson-Crick bond.
  • LNAs When LNAs are included in DNA or RNA oligonucleotides, they can more rapidly pair with complementary nucleotide chains to increase the stability of the double helix.
  • the "antisense” of the present invention is a sequence of nucleotide bases in which an antisense oligomer hybridizes with a target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing, allowing the formation of typically mRNA and RNA:oligomeric heteroduplexes in the target sequence, and It refers to an oligomer having an inter-subunit backbone. Oligomers may have exact sequence complementarity or near complementarity to the target sequence.
  • the "kit” of the present invention may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, an ELISA kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit, but is not limited thereto.
  • the diagnostic kit may further include one or more other constituent compositions, solutions or devices suitable for the assay method. For example, it may further include essential elements necessary for carrying out the reverse transcription polymerase reaction.
  • the reverse transcription polymerase reaction kit contains a pair of primers specific for a gene encoding a marker protein.
  • the primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of the gene, and may have a length of about 7 bp to 50 bp, more preferably about 10 bp to 30 bp.
  • a primer specific for the nucleic acid sequence of the control gene may be included.
  • Other reverse transcription polymerase reaction kits contain a test tube or other suitable container, reaction buffer (with varying pH and magnesium concentration), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase and RNase inhibitor DEPC. -Water (DEPC-water), sterilized water, etc. may be included.
  • the kit for diagnosis may include essential elements required to perform the DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which cDNA or oligonucleotides corresponding to genes or fragments thereof are attached, and reagents, reagents, enzymes, and the like for producing fluorescently labeled probes.
  • the substrate may include a cDNA or oligonucleotide corresponding to a control gene or a fragment thereof.
  • the diagnostic kit may include essential elements required to perform ELISA.
  • ELISA kits contain antibodies specific for the protein.
  • An antibody is an antibody that has high specificity and affinity for a marker protein and little cross-reactivity to other proteins, and is a monoclonal antibody, polyclonal antibody, or recombinant antibody.
  • ELISA kits may also include antibodies specific for a control protein.
  • Other ELISA kits include reagents capable of detecting bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (eg, conjugated with antibodies) and substrates thereof or those capable of binding the antibody. may contain other substances and the like.
  • the "object of interest" of the present invention refers to an individual whose onset of a disease is uncertain and has a high possibility of developing the disease.
  • the "biological sample” of the present invention means any material, biological fluid, tissue or cell obtained from or derived from an individual, for example, whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear Peripheral blood mononuclear cells, buffy coat, plasma, serum, sputum, tears, mucus, nasal washes, nasal aspirates (nasal aspirate), breath, urine, semen, saliva, peritoneal washings, pelvic fluids, cystic fluid, meningeal fluid (meningeal fluid), amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid, pleural fluid, nipple aspirate, bronchial aspirate , synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cells, cell extracts, or cerebrospinal fluid, but is not limited thereto. .
  • test substance includes any substance, molecule, element, compound, entity, or combination thereof. Examples include, but are not limited to, proteins, polypeptides, small organic molecules, polysaccharides, polynucleotides, and the like. It may also be a natural product, a synthetic compound or a combination of two or more substances.
  • the composition of the present invention may include, in addition to the protein, a buffer or reaction solution stably maintaining the structure or physiological activity of the protein.
  • the composition of the present invention may include, for in vivo experiments, cells expressing the protein, or cells containing a plasmid expressing the protein under a promoter capable of controlling transcription.
  • the test substance may be an individual nucleic acid, protein, other extract or natural product, compound, etc.
  • an immunosuppressant candidate material can be developed by developing an inhibitor for the test substance, and in the latter case, an immunosuppressant candidate material can be made.
  • an immunosuppressant candidate material serves as a leading compound in the subsequent immunosuppressant development process, and by modifying and optimizing its structure so that the lead material can exhibit the effect of inhibiting the function of the gene or the protein expressed therefrom. , can develop new immunosuppressive agents.
  • siRNA small interfering RNA
  • the "siRNA (small interfering RNA)" of the present invention is a short double strand RNA duplex of 19-30 that, when introduced into cells, has the effect of inhibiting only the expression of a specific gene without non-specific inhibition.
  • the mechanism of action of siRNA is that the sense strand of the gene corresponding to the mRNA is cut off by binding to RISC (RNA-induced silencing complex) in the cell, and the antisense stand complementary to the sense strand is in a complex with RISC and then has a complementary base sequence It is known to inhibit the expression of a gene by binding to and degrading mRNA with a target gene.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • the "shRNA (short hairpin RNA)" of the present invention synthesizes an oligo DNA linking a 310 base linker between the sense and complementary nonsense of the target gene siRNA sequence, and then clones it into a plasmid vector or shRNA into a retrovirus When inserted into lentivirus and adenovirus and expressed, shRNA with a looped hairpin structure is created and converted to siRNA by Dicer in the cell to show RNAi effect.
  • shRNA has a relatively long-term RNAi effect It has the advantage of showing .
  • the siRNA of the present invention may be in a chemically modified form to prevent rapid degradation by in vivo nucleases.
  • siRNA Since siRNA has a double helix structure, it is relatively more stable than single helix ribonucleic acid or antisense oligonucleotide, but it is rapidly degraded by nucleases in vivo, so the degradation rate can be reduced through chemical modification. there is.
  • Methods for chemically modifying siRNA to make it stable and resistant to degradation are well known to those skilled in the art. The most commonly used method for chemical modification of siRNA is boranophosphate or phosphorothioate modification. These materials stably form linkages between nucleoside of siRNA, resulting in resistance to nucleic acid degradation.
  • ribonucleic acid modified with boranophosphate is characterized by poor nucleic acid degradation, it is synthesized only in such a way that ranophosphate enters ribonucleic acid by an in vitro transcription reaction rather than being produced by a chemical reaction.
  • the boranophosphate modification method belongs to a relatively easy method, but has a disadvantage in that it is difficult to modify a specific location.
  • the phosphorothioate modification method has the advantage of introducing elemental sulfur to the desired part, but severe phosphorothioation causes reduced efficacy, toxicity, formation of non-specific RISC (RNAinduced silencing complex), etc. problems may appear.
  • siRNA of the present invention may be included in a pharmaceutical composition for cancer treatment in the form of a complex with a nucleic acid delivery system.
  • cancer refers to or refers to a physiological condition typically characterized by unregulated cell growth in mammals.
  • Cancer to be prevented, improved, or treated in the present invention may be a solid tumor formed by the abnormal growth of cells in a solid organ, and depending on the site of the solid organ, gastric cancer, liver cancer, It may be glioblastoma, ovarian cancer, colon cancer, head and neck cancer, bladder cancer, renal cell cancer, breast cancer, metastatic cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, melanoma or lung cancer, but is not limited thereto.
  • immune-related disease may be at least one selected from the group consisting of autoimmune disease, graft-versus-host disease, organ transplant rejection, asthma, atopy, and acute or chronic inflammatory disease, but is limited thereto It is not.
  • the autoimmune disease is rheumatoid arthritis, systemic scleroderma, systemic lupus erythematosus, atopic dermatitis, psoriasis, alopecia areata, asthma, Crohn's disease, Behçetshi's disease, Sjogren's syndrome, Gilia-Barre syndrome, chronic thyroiditis, multiple sclerosis, It may be one or more selected from the group consisting of polymyositis, ankylosing spondylitis, fibromyalgia and polyarteritis nodosa, but is not limited thereto.
  • Cerebral nervous system disease may be a neurodegenerative disease or a neuroinflammatory disease.
  • the "neurodegenerative disease” may refer to a disease caused by reduced or lost function of nerve cells
  • the "neuroinflammatory disease” may refer to a disease caused by an excessive inflammatory response of the nervous system. there is.
  • neurodegenerative disease or neuroinflammatory disease in the present invention include stroke, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Niemann-Pick disease , multiple sclerosis, prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, frontotemporal dementia, Lewy dementia, AlzAmyotrophic lateral sclerosis, paraneoplastic syndrome, corticobasal degeneration multiple system atrophy, progressive supranuclear palsy, autoimmune diseases of the nervous system, spinocerebellar ataxia, inflammatory and neuropathic pain, cerebrovascular disease, spinal cord injury and tauopathy. It may be selected from the group, but is not limited thereto.
  • the term "method for identifying regulatory T cells” refers to amplifying specific markers present in regulatory T cells through reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and performing flow cytometry (fluorescence activated cell reaction). sorting, FACS), etc., to confirm specific markers present in regulatory T cells through fluorescence, thereby identifying or isolating regulatory T cells, but is not limited thereto.
  • reverse transcription polymerase reaction is a modification of the polymerase chain reaction (PCR), an experimental technique commonly used in molecular biology to create a large number of DNA sequences through an amplification process. am.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RNA is first reverse-transcribed by reverse transcriptase to make cDNA, and the produced cDNA is amplified through conventional polymerase chain reaction or real-time polymerase chain reaction, but is not limited thereto.
  • the "fluorescence activated cell sorting (FACS)" refers to the sorting of one or more populations of cells according to the presence, absence or level of selectable polypeptides in one or more FACS expressed by the cells. Means how to separate into sub-populations.
  • the FACS relies on optical properties, including fluorescence, of individual cells to classify cells into subpopulations.
  • the "FACS selectable polypeptide” is a polypeptide that can be directly or indirectly detected by flow cytometry.
  • FACS selectable polypeptides include extracellular domains (eg, CD52 or CD59) that can be linked to a detectable binding partner (eg, a fluorescently labeled antibody) for indirect detection of the polypeptide by flow cytometry.
  • Other examples of FACS selectable polypeptides include polypeptides comprising fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP), red fluorescent protein (RFP), yellow fluorescent protein (YFP), blue fluorescent protein (BFP) and and variants thereof including eGFP, Venus, mCherry, and mTomato, which can be directly detected by the flow cytometry.
  • GFP green fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • One embodiment of the present invention is RGS1; Provided is a method for identifying regulatory T cells with an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to any one protein or fragment thereof selected from the group consisting of F5 and CD27.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for identifying regulatory T cells, wherein the protein is a cell surface protein specifically expressed on the surface of regulatory T cells.
  • Another embodiment of the present invention is a method for identifying regulatory T cells, wherein the regulatory T cells are cell surface proteins including at least one member from the group consisting of functional regulatory T cells, memory regulatory T cells, and cancer infiltrating lymphocyte regulatory T cells.
  • One embodiment of the present invention is RGS1; Any one protein or fragment thereof selected from the group consisting of F5 and CD27; Or it provides a composition for diagnosis of cancer disease comprising an agent for measuring the expression level of the gene encoding it.
  • Another embodiment of the present invention provides a composition for diagnosis, wherein the protein is a cell surface protein specifically expressed on the surface of regulatory T cells.
  • Another embodiment of the present invention provides a diagnostic composition in which the regulatory T cells are cell surface proteins including at least one member from the group consisting of functional regulatory T cells, memory regulatory T cells, and cancer infiltrating lymphocyte regulatory T cells.
  • the agent for measuring the expression level of the protein or fragment thereof is an antibody, oligopeptide, ligand, PNA (peptide nucleic acid) and aptamer that specifically bind to the protein or fragment thereof It provides a diagnostic composition comprising at least one member selected from the group consisting of.
  • the agent for measuring the expression level of the gene encoding the protein or fragment thereof comprises at least one selected from the group consisting of primers, probes, and antisense nucleotides that specifically bind to the gene, A composition for diagnosis is provided.
  • the cancer is ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, liver cancer, breast cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, and non-Hodgkin's lymphoma.
  • Hodgkin's lymphoma Hodgkin's lymphoma, blood cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small intestine Cancer, endocrine adenocarcinoma, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervous system tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma or pituitary gland
  • a composition for diagnosis of an adenoma is provided.
  • Another embodiment of the present invention provides a kit for diagnosing cancer disease comprising the composition for diagnosis.
  • One embodiment of the present invention is RGS1 in a biological sample isolated from a subject of interest; Any one protein or fragment thereof selected from the group consisting of F5 and CD27; Or it provides an information providing method for diagnosing cancer disease comprising measuring the expression level of a gene encoding the same.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for providing information, wherein the protein is a cell surface protein specifically expressed on the surface of regulatory T cells.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for providing information, wherein the regulatory T cells are cell surface proteins including at least one member from the group consisting of functional regulatory T cells, memory regulatory T cells, and cancer infiltrating lymphocyte regulatory T cells.
  • the biological sample is whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear cells, leukocyte buffy coat, plasma, serum, sputum, tears, mucus, nasal washes, nasal aspirate, breath, urine, semen, saliva, Peritoneal washings, pelvic fluids, cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid ( lymph fluid, pleural fluid, nipple aspirate, bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cell ), a cell extract or cerebrospinal fluid is provided.
  • the method for measuring the expression level of the protein or fragment thereof includes protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI -TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, radiation immunoassay, radioimmunodiffusion method, Oukteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, two-dimensional electrophoresis analysis , liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), Western blotting, or ELISA (enzyme linked immunosorbentassay), Provides a way to provide information.
  • MALDI-TOF Microx Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry
  • the method for measuring the expression level of the gene encoding the protein or fragment thereof is reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase Reaction (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA; RNase protection assay), Northern blotting (Northern blotting), or performed by DNA chip, an information providing method is provided.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase reaction
  • Competitive RT-PCR competitive reverse transcription polymerase reaction
  • Real-time RT-PCR real-time reverse transcription polymerase Reaction
  • RNase protection assay RNase protection assay
  • Northern blotting Northern blotting
  • DNA chip an information providing method is provided.
  • the cancer is ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, liver cancer, breast cancer, cervical cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, and non-Hodgkin's lymphoma.
  • Hodgkin's lymphoma Hodgkin's lymphoma, blood cancer, bladder cancer, kidney cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain tumor, perianal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, vaginal cancer, vulvar carcinoma, esophageal cancer, small intestine Cancer, endocrine adenocarcinoma, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS central nervous system tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma or pituitary gland It is a Zen species, and provides a method of providing information.
  • One embodiment of the present invention is RGS1; Any one protein or fragment thereof selected from the group consisting of F5 and CD27; Or it provides a composition for diagnosis of immune-related diseases comprising an agent for measuring the expression level of a gene encoding the same.
  • Another embodiment of the present invention provides a composition for diagnosis, wherein the protein is a cell surface protein specifically expressed on the surface of regulatory T cells.
  • Another embodiment of the present invention provides a diagnostic composition in which the regulatory T cells are cell surface proteins including at least one member from the group consisting of functional regulatory T cells, memory regulatory T cells, and cancer infiltrating lymphocyte regulatory T cells.
  • the agent for measuring the expression level of the protein or fragment thereof is an antibody, oligopeptide, ligand, PNA (peptide nucleic acid) and aptamer that specifically bind to the protein or fragment thereof It provides a diagnostic composition comprising at least one member selected from the group consisting of.
  • the agent for measuring the expression level of the gene encoding the protein or fragment thereof comprises at least one selected from the group consisting of primers, probes, and antisense nucleotides that specifically bind to the gene, A composition for diagnosis is provided.
  • the immune-related disease is an autoimmune disease; graft-versus-host disease; organ transplant rejection; asthma; atopy; Or an acute or chronic inflammatory disease, provides a composition for diagnosis.
  • the autoimmune disease is rheumatoid arthritis, systemic scleroderma, systemic lupus erythematosus, atopic dermatitis, psoriasis, alopecia areata, asthma, Crohn's disease, Bechetsy's disease, Sjogren's syndrome, Guilla-Barre syndrome, chronic Provided is a diagnostic composition selected from the group consisting of thyroiditis, multiple sclerosis, polymyositis, ankylosing spondylitis, fibromyalgia and polyarteritis nodosa.
  • Another embodiment of the present invention provides a kit for diagnosing an immune-related disease comprising the composition for diagnosis.
  • One embodiment of the present invention is RGS1 in a biological sample isolated from a subject of interest; Any one protein or fragment thereof selected from the group consisting of F5 and CD27; Or it provides an information providing method for diagnosing cancer disease comprising measuring the expression level of a gene encoding the same.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for providing information, wherein the protein is a cell surface protein specifically expressed on the surface of regulatory T cells.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for providing information, wherein the regulatory T cells are cell surface proteins including at least one member from the group consisting of functional regulatory T cells, memory regulatory T cells, and cancer infiltrating lymphocyte regulatory T cells.
  • the biological sample is whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear cells, leukocyte buffy coat, plasma, serum, sputum, tears, mucus, nasal washes, nasal aspirate, breath, urine, semen, saliva, Peritoneal washings, pelvic fluids, cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid ( lymph fluid, pleural fluid, nipple aspirate, bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cell ), a cell extract or cerebrospinal fluid is provided.
  • the method for measuring the expression level of the protein or fragment thereof includes protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI -TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, radiation immunoassay, radioimmunodiffusion method, Oukteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, two-dimensional electrophoresis analysis , liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), Western blotting, or ELISA (enzyme linked immunosorbentassay), Provides a way to provide information.
  • MALDI-TOF Microx Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry
  • the method for measuring the expression level of the gene encoding the protein or fragment thereof is reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase Reaction (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA; RNase protection assay), Northern blotting (Northern blotting), or performed by DNA chip, an information providing method is provided.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase reaction
  • Competitive RT-PCR competitive reverse transcription polymerase reaction
  • Real-time RT-PCR real-time reverse transcription polymerase Reaction
  • RNase protection assay RNase protection assay
  • Northern blotting Northern blotting
  • DNA chip an information providing method is provided.
  • the immune-related disease is an autoimmune disease; graft-versus-host disease; organ transplant rejection; asthma; atopy; Or an acute or chronic inflammatory disease, an information providing method is provided.
  • the autoimmune disease is rheumatoid arthritis, systemic scleroderma, systemic lupus erythematosus, atopic dermatitis, psoriasis, alopecia areata, asthma, Crohn's disease, Bechetsy's disease, Sjogren's syndrome, Guilla-Barre syndrome, chronic Provided is an information providing method selected from the group consisting of thyroiditis, multiple sclerosis, polymyositis, ankylosing spondylitis, fibromyalgia and polyarteritis nodosa.
  • One embodiment of the present invention is RGS1; Any one protein or fragment thereof selected from the group consisting of F5 and CD27; Or it provides a composition for diagnosis of a brain nervous system disease comprising an agent for measuring the expression level of the gene encoding it.
  • Another embodiment of the present invention provides a composition for diagnosis, wherein the protein is a cell surface protein specifically expressed on the surface of regulatory T cells.
  • Another embodiment of the present invention provides a diagnostic composition in which the regulatory T cells are cell surface proteins including at least one member from the group consisting of functional regulatory T cells, memory regulatory T cells, and cancer infiltrating lymphocyte regulatory T cells.
  • the agent for measuring the expression level of the protein or fragment thereof is an antibody, oligopeptide, ligand, PNA (peptide nucleic acid) and aptamer that specifically bind to the protein or fragment thereof It provides a diagnostic composition comprising at least one member selected from the group consisting of.
  • the agent for measuring the expression level of the gene encoding the protein or fragment thereof comprises at least one selected from the group consisting of primers, probes, and antisense nucleotides that specifically bind to the gene, A composition for diagnosis is provided.
  • Another embodiment of the present invention provides a composition for diagnosis, wherein the brain nervous system disease is a neurodegenerative disease or a neuroinflammatory disease.
  • the neurodegenerative disease or neuroinflammatory disease is stroke, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Niemann-Pick disease , multiple sclerosis, prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, frontotemporal dementia, Lewy dementia, AlzAmyotrophic lateral sclerosis, paraneoplastic syndrome, corticobasal degeneration multiple system atrophy, progressive supranuclear palsy, autoimmune diseases of the nervous system, spinocerebellar ataxia, inflammatory and neuropathic pain, cerebrovascular disease, spinal cord injury and tauopathy. It provides a diagnostic composition selected from the group.
  • Another embodiment of the present invention provides a kit for diagnosing a brain nervous system disease comprising the composition for diagnosis.
  • One embodiment of the present invention is RGS1 in a biological sample isolated from a subject of interest; Any one protein or fragment thereof selected from the group consisting of F5 and CD27; Or it provides an information providing method for diagnosing a brain nervous system disease comprising the step of measuring the expression level of the gene encoding it.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for providing information, wherein the protein is a cell surface protein specifically expressed on the surface of regulatory T cells.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for providing information, wherein the regulatory T cells are cell surface proteins including at least one member from the group consisting of functional regulatory T cells, memory regulatory T cells, and cancer infiltrating lymphocyte regulatory T cells.
  • the biological sample is whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear cells, leukocyte buffy coat, plasma, serum, sputum, tears, mucus, nasal washes, nasal aspirate, breath, urine, semen, saliva, Peritoneal washings, pelvic fluids, cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid ( lymph fluid, pleural fluid, nipple aspirate, bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cell ), a cell extract or cerebrospinal fluid is provided.
  • the method for measuring the expression level of the protein or fragment thereof includes protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDI -TOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, radiation immunoassay, radioimmunodiffusion method, Oukteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, two-dimensional electrophoresis analysis , liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), Western blotting, or ELISA (enzyme linked immunosorbentassay), Provides a way to provide information.
  • MALDI-TOF Microx Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry
  • the method for measuring the expression level of the gene encoding the protein or fragment thereof is reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase Reaction (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA; RNase protection assay), Northern blotting (Northern blotting), or performed by DNA chip, an information providing method is provided.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase reaction
  • Competitive RT-PCR competitive reverse transcription polymerase reaction
  • Real-time RT-PCR real-time reverse transcription polymerase Reaction
  • RNase protection assay RNase protection assay
  • Northern blotting Northern blotting
  • DNA chip an information providing method is provided.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for providing information, wherein the cranial nervous system disease is a neurodegenerative disease or a neuroinflammatory disease.
  • the neurodegenerative disease or neuroinflammatory disease is stroke, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Niemann-Pick disease , multiple sclerosis, prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, frontotemporal dementia, Lewy dementia, AlzAmyotrophic lateral sclerosis, paraneoplastic syndrome, corticobasal degeneration multiple system atrophy, progressive supranuclear palsy, autoimmune diseases of the nervous system, spinocerebellar ataxia, inflammatory and neuropathic pain, cerebrovascular disease, spinal cord injury and tauopathy.
  • An information providing method selected from the group is provided.
  • Regulatory T cells can be selected using the marker protein specific for regulatory T cells or a fragment thereof of the present invention in that it is a factor that can be distinguished from other immune cells. Also by identifying regulatory T cells that express specific markers for the regulatory T cells, the regulatory T cells affect; cancer; immune related diseases; Alternatively, a cranial nervous system disease may be diagnosed.
  • XGBoost Extreme Gradient Boosting
  • Example 1 T regulatory cell biomarker screening in colorectal cancer (CRC)
  • the disaggregated tissue was passed through a 40 ⁇ m cell-strainer and centrifuged at 400 g for 10 minutes.
  • cDNA was synthesized by reverse transcriptase PCR using the Smart-Seq2 (Nat Protoc. 2014 Jan;9(1):171-81) method, and mRNA expression levels were measured by qPCR.
  • the T cell subsets used in the analysis were tumor Treg, peripheral Treg, Th17, effector memory T cell and naive T cell.
  • the number of cells used in the analysis was 10,805 cells (data for 12,525 genes) out of 11,138 single cells.
  • TPM Transcript per million
  • Tumor Treg 1,319 cells
  • Tumor Treg cells and other cell subsets were distinguished:
  • Tumor Treg cluster 1,319 single cells
  • Non-tumor Treg cluster 1,270 single cells
  • TPM values for all single cells were entered into XGBoost to generate a conditional algorithm that can most efficiently divide tumor Tregs and other T cell subsets.
  • the number of genes used for the condition was 474.
  • Treg-specific markers were selected based on the following detailed strategies.
  • Example 1 Single cell sorting and reverse transcription, amplification and sequencing were performed in the same manner as in Example 1.
  • tumor Tregs tumor Tregs, peripheral Tregs, undifferentiated T cells, cytotoxic CD4, and exhausted T cells were used as the T cell subsets used in the analysis.
  • the number of cells used in the analysis was 5,063 single cells (data for 23,389 genes).
  • Undifferentiated T cells 646 cells;
  • Tumor Treg rankings and different cell subsets were distinguished:
  • Non-tumor Treg cluster 1,220 single cells
  • TPM values for all single cells were entered into XGBoost to generate a conditional algorithm that can most efficiently divide tumor Tregs and other T cell subsets. At this time, the number of genes used for the condition was 281.
  • Treg-specific markers were selected based on the following detailed strategies.
  • T cell subsets used in the analysis were tumor Treg, peripheral Treg, undifferentiated T cell, cytotoxic CD4, exhausted T cell, central memory T cell, and effector memory T cell. Memory T cell) was used.
  • the number of cells used in the analysis was 12,346 single cells (data for 12,394 genes).
  • Undifferentiated T cells 532 cells;
  • Tumor Treg rankings and different cell subsets were distinguished:
  • Non-tumor Treg cluster 2,398 single cells
  • TPM values for all single cells were entered into XGBoost to generate a conditional algorithm that can most efficiently divide tumor Tregs and other T cell subsets.
  • the number of genes used for the condition was 548.
  • Treg-specific markers were selected based on the following detailed strategies.
  • Scenario 1 A gene whose TPM value of tumor Treg cells is higher than that of undifferentiated T cells
  • 2Scenario 2 Genes whose TPM values in peripheral Treg cells are higher than TPM values in undifferentiated T cells

Landscapes

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Abstract

본 발명은 조절 T세포의 바이오 마커에 관한 것이다.

Description

조절 T세포의 바이오 마커
조절 T세포의 바이오 마커{Biomarkers for regulatory T cell}
조절 T 세포(regulatory T cell, Treg)는 과다한 염증과 면역반응의 발생을 자연적으로 방지하는 중요한 역할을 하지만, 자가면역질환과 만성염증질환이 발생하는 경우 조절 T 세포의 기능과 숫자가 현저하게 줄어드는 것이 보고되었다. 따라서, 면역 질환과 염증 질환이 있는 환자의 경우, 조절 T 세포가 정상적인 수준으로 생성되는 것이 중요하며, 이는 상기 질환의 치료법 중 하나가 될 수 있다.
암의 경우, 조절 T 세포는 암 미세환경에 많이 분포하고 있어 자연살해세포 (NK cell)나 암 특이적 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte)의 암세포 제거능을 저해하기 때문에, 면역체크포인트인 PD-1, CTLA-4 등과 더불어 암의 면역회피 기전의 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다.
조절 T 세포는 발생 유래 및 세포의 성질에 따라 나이브 조절 T 세포 (미분화 Treg; nTreg), 휴지기 조절 T 세포 (resting Treg; rTreg), 작용 조절 T 세포 (effector Treg; eTreg) 및 기억 조절 T 세포 (memory Treg; mTreg) 로 나눌 수 있다. 최근 Shimon Sakaguchi 그룹에서 CD4, CD45RA, Foxp3, CD25의 발현양을 기반으로 non-Treg, nTreg/rTreg, eTreg을 구분하였다 (CD4+CD25+CD45RA-Foxp3lo; non-Treg, CD4+CD25+CD45RA+Foxp3lo; nTreg, CD4+CD25+CD45RA-Foxp3hi; eTreg). 상기한 조절 T 세포의 종류 중에서, 작용 조절 T 세포와 기억 조절 T 세포가 높은 면역억제능을 가진 것으로 알려져 있다. 특히, 암 침윤 림프구 (tumor infiltrating lymphocytes; TIL)에서는 작용 조절 T 세포가 많이 분포되어 있으며, 면역체크포인트인 CTLA-4를 높게 발현하고 있어 면역억제능도 높은 것으로 보고되었다. 따라서, 조절 T 세포 중에서도 면역 억제능이 높은 작용 조절 T 세포, 기억 조절 T 세포, 암 침윤 림프구내 조절 T 세포를 특이적으로 조절하는 것은, 효과적인 면역치료법이 될 수 있다.
현재까지 조절 T 세포에 특이적으로 존재하는 유전자 및 단백질에 대한 연구가 진행되어, CD25, CTLA4, CD62L, CD38, CD103, GITR 및 CD45RB 등의 물질이 표지 물질에 해당할 수 있음이 제시되어 왔지만, 아직 조절 T 세포만을 단독으로 표적화 할 수 있는 유전자 및 단백질은 존재하지 않는다.
본 발명의 일 목적은 조절 T 세포에 특이적인 마커 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편으로 조절 T 세포를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 조절 T 세포에 특이적인 마커 또는 이의 단편에; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암, 면역 관련 질환 또는 뇌신경계 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 조절 T 세포에 특이적인 마커 또는 이의 단편에; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암, 면역 관련 질환 또는 뇌신경계 질환의 진단용 조성물을 포함하는 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 조절 T 세포에 특이적인 마커 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암, 면역 관련 질환 또는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 “조절 T 세포(Regulatory T cell)” 또는 “Treg”은 면역억제능이 높은 작용 조절 T 세포, 기억 조절 T 세포, 암 침윤 림프구 조절 T 세포로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 "핵산 분자"는 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.
본 발명에 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 조절 T 세포 특이적 단백질 또는 이의 세포 외 도메인에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 바이오마커 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서 "면역글로불린"은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(Framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원 결정기(Epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명에서 "상보성 결정 영역(CDR)"은 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원 결정기(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명에서 "전장 항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드(Disulfide) 결합으로 연결되어 있으며, IgA, IgD, IgE, IgM, 및 IgG를 포함한다. 상기 IgG는 그 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본 발명에서 "항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 항원 결합 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변역역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변역역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역 (CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) 등을 포함한다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소, 예를 들면 파파인 또는 펩신을 이용하는 경우 Fab 또는 F(ab')2의 단편을 얻을 수 있으며, 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 "단일클론항체"는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 일컫는 말로, 특정 항원 결정기(Epitope)에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본 발명에서 "결합" 또는 "특이적 결합"은 본원 항체 또는 항체 조성물의 항원에 대한 친화도를 나타내는 것이다. 항원 항체 결합에서 "특이적 결합"은 전형적으로 해리상수(dissociation constant, Kd)가 1×10-5M 미만 또는 1×10-6M 미만 또는 1×10-7M 미만인 경우 비특이적인 배경 결합과 구분될 수 있다. 특이적 결합은 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 ELISA, SPR(Surface plasmon resonance), 면역침전(immunoprecipitation), 공침전(coprecipitation) 등의 방법으로 검출될 수 있으며, 비특이적 결합과 특이적 결합을 구분할 수 있는 적절한 대조군을 포함한다.
본 발명의 "항체 또는 항원 결합 단편"은 단량체의 항원 결합능의 적어도 일부를 포함하는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등의 다량체로 존재할 수 있다. 이러한 다량체는 또한 동종다량체, 또는 이종다량체를 포함하는 것이다. 항체 다량체는 다수의 항원 결합 부위를 포함하기 때문에 단량체와 비교하여 항원에 대한 결합능이 우수하다. 항체의 다량체는 또한 다기능성(bifunctional, trifunctional, tetrafunctional) 항체 제작에도 용이하다.
본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환 증상을 차단하거나, 질환 증상의 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서, "치료" 및 "개선"은 본 발명의 약학 조성물을 조사하여 질환 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 "약학 조성물"은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다. 한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서, 약학 조성물에 대한 "투여 경로"는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 "용법 및 용량"은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명의 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254 (5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명의 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명의 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명의 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.
본 발명의 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명의 "키트"는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 암호화하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 상기 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 "목적하는 개체"란 질환의 발병 여부가 불확실한 개체로, 질환의 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다.
본 발명의 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "피검 물질"은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 이들로 한정되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기분자(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한, 천연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.
상기 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다. 이러한 경우 본 발명의 조성물은 상기 단백질 외에도, 단백질의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 생체 내(in vivo) 실험을 위해, 상기 단백질을 발현하는 세포, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 상기 단백질을 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 스크리닝 방법에서, 시험대상물질은 통상적인 선정방식에 따라 암전이 억제제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, 유전자 발현을 증진시키거나 단백질의 기능을 증진시키는 활성을 나타내는 시험대상물질 및 반대로 유전자 발현을 억제시키거나 단백질의 기능을 억제시키는 활성을 나타내는 시험대상 물질은, 전자의 경우, 시험대상물질에 대한 억제제를 개발함으로써 면역억제제 후보물질이 될 수 있고, 후자의 경우는 면역억제제 후보물질이 될 수 있다. 이와 같은 면역억제제 후보물질은 이후의 면역억제제 개발과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 상기 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능 억제효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 면역억제제를 개발할 수 있다.
본 발명의 "siRNA(small interfering RNA)"는 짧은 19-30개의 이중 리보핵산쇄(double strand RNA duplex)로 세포내 도입하면 비특이적 저해(non-specific inhibition) 없이 특정 유전자의 발현만을 억제하는 효과를 나타내는 것으로, siRNA의 작용기작은 세포 내에서 RISC (RNA-induced silencing complex)와 결합하여 mRNA에 해당하는 유전자의 sense strand가 잘려나가고 sense strand에 상보적인 antisense stand는 RISC와 복합체로 있다가 상보적인 염기서열을 가진 mRNA 즉 표적 유전자의 mRNA와 결합하여 이를 분해함으로써 유전자의 발현을 저해하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 "shRNA (short hairpin RNA)"는 타겟유전자 siRNA 염기서열의 sense와 상보적인 nonsense 사이에 310개의 염기linker를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후 프라즈미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스 (lentivirus) 및 아데노바이러스 (adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 loop가 있는 헤어핀 구조의 shRNA가 만들어지고 세포 내의 Dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타내는 것을 말하여, shRNA는 비교적 장기간 RNAi 효과를 나타내도록 하는 장점이 있다. 본 발명의 siRNA는 생체내 핵산 분해효소에 의한 빠른 분해를 막기 위해 화학적으로 변형된 형태일 수 있다. siRNA는 이중나선 구조를 가지므로, 단일나선구조의 리보핵산이나 안티센스 올리고핵산(antisense oligonucleotide)보다는 상대적으로 안정한 구조이지만 생체내 핵산 분해효소에 의해 빠르게 분해되기 때문에 화학적 변형을 통해 분해 속도를 감소시킬 수 있다. siRNA가 쉽게 분해되지 않도록 안정하고 저항적이도록 하기 위한 siRNA의 화학적 변형 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. siRNA의 화학적 변형에 가장 많이 사용되는 방식은 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트 (phosphorothioate) 수식 방법(modification)이다. 이들 물질은 siRNA의 뉴클레오사이드(nucleoside) 간의 연결을 안정하게 형성하여, 결과적으로 핵산 분해에 대한 저항성을 부여한다. 보라노포스페이트로 수식된 리보핵산은 핵산 분해가 잘 되지 않는 특징이 있지만, 화학 반응에 의하여 만들어 지지 않고 in vitro 전사 반응에 의해 라노포스페이트가 리보핵산에 들어가는 방식으로만 합성이 된다. 보라노포스페이트 수식방법은 비교적 손쉬운 방법에 속하지만, 특정 위치에 수식하기 어려운 단점이 있다. 반면 포스포로티오에이트 수식 방법은 원하는 부분에 황(sulfur) 원소를 도입할 수 있는 장점이 있으나, 정도가 심한 포스포티오에이션(phosphothioation)은 효능 감소, 독성, 비특이적 RISC(RNAinduced silencing complex) 형성 등의 문제가 나타날 수 있다. 따라서 최근에는 위의 두 가지 방법 외에 리보핵산의 종결 위치(3'말단 초과부위)에만 화학적 변형을 하여 핵산 분해효소에 저항성을 부여하는 방법이 보다 선호되고 있다. 또한 리보스 환(ribose ring)을 화학적으로 수식하여도 핵산 분해효소에 대한 저항성이 강해지는 것으로 알려져 있는데 특히 본래 세포내 존재하는 리보오스 2'-위치의 변이는 siRNA를 안정화시킨다. 그러나 이 위치에 정확히 메틸기가 들어가야 안정성이 증가되며 너무 많은 메틸기는 반대로 리보핵산 매개 간섭현상이 상실되는 등의 문제도 있다. 이러한 화학적 변형의 이유는 생체 내에서의 약물동력학적(pharmacokinetic)인 체류시간의 증대 및 유효성을 높이기 위한 목적도 있다 (Mark et. al., Molecular Therapy, 13:644-670, 2006). 화학적 수식방법 외에, siRNA의 세포 내 전달 효율을 높이기 위해서는 안전하고 효율적인 전달 시스템이 요구되어진다. 이를 위해, 본 발명의 siRNA는 핵산 전달체 (nucleic acid delivery system)와의 복합체 형태로 암 치료용 의약 조성물 내에 포함될 수 있다.
본 발명에서, "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 예방, 개선 또는 치료의 대상이 되는 암은 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 고형암(solid tumor)일 수 있고, 고형 장기의 부위에 따라 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 또는 폐암 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "면역 관련 질환"은 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 및 급성 또는 만성의 염증 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염 및 결절성 다발성 동맥염으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “뇌신경계 질환”은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환일 수 있다.
본 발명에서 상기 "신경 퇴행성 질환"은 신경 세포들의 기능 감소 또는 소실에 의해 발생되는 질환을 의미할 수 있고, 상기 "신경 염증성 질환"으로는 신경계의 과도한 염증 반응에 의하여 발생되는 질환을 의미할 수 있다.
본 발명에서 상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 구체적인 예시로는 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 다발성 경화증, 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “조절 T 세포를 확인하는 방법”이라 함은 역전사 중합효소반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)를 통하여 조절 T 세포에 존재하는 특이적인 마커를 증폭시키고 유세포 분석(fluorescence activated cell sorting, FACS) 등을 통하여 조절 T 세포에 존재하는 특이적인 마커를 형광을 통해 확인하여 조절 T 세포를 확인 또는 분리하는 방법을 의미하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 “역전사 중합효소반응”이라 함은, 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)의 변형으로, 증폭 과정을 통해 많은 수의 DNA 서열을 만들기 위해 분자생물학에서 일반적으로 사용하는 실험기법이다. 그러나 역전사 중합효소연쇄반응에서는 RNA가 먼저 역전사 효소에 의해 역전사되어 cDNA를 만들고, 만들어진 cDNA가 기존의 중합효소연쇄반응이나 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 증폭되나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 “유세포 분석(fluorescence activated cell sorting, FACS)”, 또는 “FACS”는 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 FACS에서 선택 가능한 폴리펩타이드의 존재, 부재 또는 수준에 따라 세포의 모집단을 하나 이상의 하위 모집단으로 분리하는 방법을 의미한다. 상기 FACS는 세포를 하위 집단으로 분류하기 위해 개별 세포의 형광을 포함한 광학 특성에 의존한다.
본 발명에서 상기 "FACS 선택 가능한 폴리펩타이드"는 유세포 분석에 의해 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있는 폴리펩타이드이다. FACS 선택 가능한 폴리펩티드의 예로는 유세포 분석에 의한 폴리펩티드의 간접적인 검출을 위해 검출 가능한 결합 파트너(예를 들어, 형광 표지된 항체)에 결합될 수 있는 세포외 도메인(예를 들어, CD52 또는 CD59)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, FACS 선택 가능한 폴리펩타이드의 다른 예는 형광 단백질, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청색 형광 단백질(BFP) 및 eGFP, Venus, mCherry, mTomato를 포함하는 이들의 변이체를 등이 있으며, 이는 상기 유세포 분석에 의해 직접 검출될 수 있다. FACS를 통하여 조절 T 세포에 존재하는 특이적인 마커를 확인하고 조절 T 세포를 분리할 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 RGS1; F5 및 CD27 로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편으로 조절 T 세포를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질은 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 세포표면 단백질인, 조절 T 세포를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 조절 T 세포는 작용 조절 T 세포, 기억 조절 T 세포, 암 침윤 림프구 조절 T 세포로 이루어진 군에서 1종 이상이 포함되는 세포표면 단백질인, 조절 T 세포를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예는 RGS1; F5 및 CD27로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질은 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 세포표면 단백질인, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 조절 T 세포는 작용 조절 T 세포, 기억 조절 T 세포, 암 침윤 림프구 조절 T 세포로 이루어진 군에서 1종 이상이 포함되는 세포표면 단백질인, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 암은 난소암, 대장암, 췌장암, 위암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 진단용 조성물을 포함하는 암 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예는 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 RGS1; F5 및 CD27로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질은 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 세포표면 단백질인, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 조절 T 세포는 작용 조절 T 세포, 기억 조절 T 세포, 암 침윤 림프구 조절 T 세포로 이루어진 군에서 1종 이상이 포함되는 세포표면 단백질인, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함하는, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준의 측정 방법은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행되는, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의해 수행되는, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 암은 난소암, 대장암, 췌장암, 위암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예는 RGS1; F5 및 CD27로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 면역 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질은 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 세포표면 단백질인, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 조절 T 세포는 작용 조절 T 세포, 기억 조절 T 세포, 암 침윤 림프구 조절 T 세포로 이루어진 군에서 1종 이상이 포함되는 세포표면 단백질인, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 면역 관련 질환은 자가면역질환; 이식편대숙주 질환; 장기이식거부반응; 천식; 아토피; 또는 급성 또는 만성의 염증 질환인, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염 및 결절성 다발성 동맥염으로 구성된 군으로부터 선택되는, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 진단용 조성물을 포함하는 면역 관련 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예는 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 RGS1; F5 및 CD27로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질은 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 세포표면 단백질인, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 조절 T 세포는 작용 조절 T 세포, 기억 조절 T 세포, 암 침윤 림프구 조절 T 세포로 이루어진 군에서 1종 이상이 포함되는 세포표면 단백질인, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함하는, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준의 측정 방법은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행되는, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의해 수행되는, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 면역 관련 질환은 자가면역질환; 이식편대숙주 질환; 장기이식거부반응; 천식; 아토피; 또는 급성 또는 만성의 염증 질환인, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염 및 결절성 다발성 동맥염으로 구성된 군으로부터 선택되는, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예는 RGS1; F5 및 CD27로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경계 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질은 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 세포표면 단백질인, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 조절 T 세포는 작용 조절 T 세포, 기억 조절 T 세포, 암 침윤 림프구 조절 T 세포로 이루어진 군에서 1종 이상이 포함되는 세포표면 단백질인, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 뇌신경계 질환은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환인, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 다발성 경화증, 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는, 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 진단용 조성물을 포함하는 뇌신경계 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예는 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 RGS1; F5 및 CD27로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질은 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 세포표면 단백질인, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 조절 T 세포는 작용 조절 T 세포, 기억 조절 T 세포, 암 침윤 림프구 조절 T 세포로 이루어진 군에서 1종 이상이 포함되는 세포표면 단백질인, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함하는, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준의 측정 방법은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행되는, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의해 수행되는, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 뇌신경계 질환은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환인, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 다발성 경화증, 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는, 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 조절 T 세포에 대한 특이적 마커 단백질 또는 이의 단편은 다른 면역세포와 구분할 수 있는 요소라는 점에서 이를 이용하여 조절 T 세포를 선별할 수 있다. 또한 상기 조절 T 세포에 대한 특이적 마커를 발현하는 조절 T 세포를 확인함으로써 상기 조절 T 세포가 영향을 미치는, 암; 면역 관련 질환; 또는 뇌신경계 질환을 진단할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
총 3가지 암(대장암, 간세포암, 비소세포폐암) 환자 시료로부터 분석한 단일세포(single cell) mRNA 서열분석 데이타를 이용하여 XGBoost(EXtreme Gradiient Boosting)라는 의사결정나무 기반 알고리즘에 적용하였다. 이때, XGBoost는 TPM 값을 통한 의사결정나무(Decision-based tree)를 이용하여 2개 세트로 계열화하기 위한 최적의 조합을 찾아내 주었다. 이를 이용해 어떠한 유전자가 계열화(classification)에 관련되어 있는지 어떠한 유전자가 종양 Treg 특이적으로 발현되어 있는 지를 1차적으로 분류해낼 수 있었다.
실시예 1. 대장암 (Colorectal cancer: CRC)에서의 T 조절 세포 바이오 마커 선별
환자 시료(총 12명 환자 = 남성 8명, 여성 4명)를 말초혈액, 신선한 암조직 및 채취한 암조직에서 적어도 2cm 정도 근처의 정상조직에서 채취하였다:
다음에 단일세포 분류 분석(Single cell sorting) 및 역전사증폭 및 서열분석(reverse transcription, amplification and sequencing)을 하기와 같이 수행하였다.
i) 수집한 각 조직에서 1 mm3 조각의 조직을 잘라내어 RPMI-1640(FBS 10%)에 담고 Miltenyl Biotec사의 MACS 암 분리(MACS tumor Dissociation) 키트를 이용하여 37도 로터에서 30분간 효소분해반응을 시켰다.
ii) 분해된 조직을 40μm 세포-스트레이너에 통과시켜 400g에서 10분간 원심분리하였다.
iii) 상층액을 버리고, RBC 용해 완충액을 이용해 2분간 적혈구를 용해시켰다.
iv) PBS로 2번 세척한 후, 세포 펠렛을 PBS /w 1% FBS로 재현탁하였다.
v) HISTOPAQUE-1077을 이용해 PBMC 분리하였다.
vi) 인간 CD3, CD4, CD8, CD25 항체로 염색하여, FACS로 단일세포 분류분석을 수행하였다.
vii) 세포독성 T 세포, Th 세포, Treg 세포로 서브셋으로 분리하기 위해 각각 7AAD-CD3+CD8+, 7AAD-CD3+CD4+CD25- 및 7AAD-CD3+CD4+CD25hi로 농축하여 미리 4℃로 냉각된 96 웰 플레이트에 모은 후, 용해 완충액으로 용해시켰다.
viii) 단일 세포 용해물로부터 Smart-Seq2 (Nat Protoc. 2014 Jan;9(1):171-81) 방법을 이용하여 cDNA를 역전사효소 PCR로 합성하고 qPCR로 mRNA 발현양을 측정하였다.
이때, 분석에 사용된 T 세포 서브셋은 종양 Treg, 말초 Treg, Th17, 작용 기억 T 세포(effector memory T cell) 및 미분화(naive) T 세포이었다. 또한, 분석에 사용한 세포수는 11,138 개의 단일세포 중 10,805개 세포(12,525개 유전자에 대한 데이타)를 사용하였다.
분석 지표는 하기와 같다:
TPM (Transcript per million) = Reads / transcript length / kilobase / 1,000,000
분석을 하기와 같은 방법으로 수행하였다.
각 서브셋에서 발현하는 각 유전자에 대한 평균 TPM 값을 산출하였다:
① 종양 Treg: 1,319개 세포;
② 말초 Treg: 365 개 세포;
③ Th17: 229 개 세포;
④ T 작용 기억 세포: 204개 세포; 및
⑤ 미분화 T 세포: 472개 세포
종양 Treg 세포와 다른 세포 서브셋 (말초 Treg, Th17, T 작용 기억, 미분화 T 세포)을 구분하였다:
① 종양 Treg 클러스터: 1,319개 단일 세포; 및
② 비종양 Treg 클러스터: 1,270개 단일 세포;
XGBoost를 이용하여 기계학습과정을 하기와 같이 진행하였다:
① 모든 단일 세포에 대한 TPM 값을 XGBoost에 입력하여 종양 Treg와 다른 T 세포 서브셋을 가장 효율적으로 나눌 수 있는 조건 알고리즘을 생성하였다. 이때, 조건에 사용된 유전자은 474개였다.
② 474개 유전자를 이용한 알고리즘은 종양 Treg과 다른 T 세포 서브셋을 97.5% 정확도로 구분하였다.
선별된 474개 유전자에서 표면 마커를 찾기 위해 세포막(plasma membrane)의 발현정도가 4 내지 5가 되는 유전자만을 재선별하였다. 마지막 단계에 다음과 같은 세부전략을 바탕으로 Treg 특이적 마커를 선별하였다.
① 시나리오1: 종양 Treg 세포 TPM 값이 미분화 T 세포 TPM 값보다 높은 유전자
② 시나리오2: 종양 Treg 세포 TPM 값이 말초 Treg 세포 TPM 값보다 높은 유전자
③ 시나리오3: 말초 Treg 세포 TPM 값이 미분화 T 세포 TPM 값보다 높은 유전자
④ 시나리오4: 말초 Treg 세포 TPM 값이 Th17 세포 TPM 값보다 높은 유전자
상기와 같은 시나리오로 하기와 같은 마커를 선별하였다(표 1 참조):
실시예 2. 간세포암 (Hepatocellular carcinoma: HCC)에서의 조절 T 세포 바이오 마커 선별
환자 시료(총 12명 환자 = 남성 4명, 여성 2명)를 말초혈액, 신선한 암조직 및 채취한 암조직에서 적어도 2cm 정도 근처의 정상조직에서 채취하였다:
다음에 단일세포 분류 분석(Single cell sorting) 및 역전사증폭 및 서열분석(reverse transcription, amplification and sequencing)을 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
다만, 분석에 사용된 T 세포 서브셋은 종양 Treg, 말초 Treg, 미분화 T 세포, 세포독성 CD4 및 지친 T세포 (Exhausted T cell)을 사용하였다.
분석에 사용한 세포수는 5,063개 단일 세포(23,389개 유전자에 대한 데이타)이다.
분석지표와 분석방법은 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 다만, 각 서브셋은 하기 세포로 사용하였다.
① 종양 Treg: 582개 세포;
② 말초 Treg: 261개 세포;
③ 미분화 T 세포: 646개 세포; 및
④ 지친 T 세포 (Exhausted T cell): 146개 세포
종양 Treg 랭킹과 다른 세포 서브셋 (말초 Treg, 지친 T 세포, 세포독성 CD4, 및 미분화 T 세포)으로 구분하였다:
① 종양 Treg 클러스터: 582개 단일 세포
② 비-종양 Treg 클러스터: 1,220개 단일 세포
XGBoost를 이용하여 기계학습과정을 하기와 같이 진행하였다:
① 모든 단일 세포에 대한 TPM 값을 XGBoost에 입력하여 종양 Treg와 다른 T 세포 서브셋을 가장 효율적으로 나눌 수 있는 조건 알고리즘을 생성하였다. 이때, 조건에 사용된 유전자은 281개였다.
② 281개 유전자를 이용한 알고리즘은 종양 Treg과 다른 T 세포 서브셋을 97.78% 정확도로 구분하였다.
선별된 유전자에서 표면 마커를 찾기 위해 세포막(plasma membrane)의 발현정도가 4 내지 5가 되는 유전자만을 재선별하였다. 마지막 단계에 다음과 같은 세부전략을 바탕으로 Treg 특이적 마커를 선별하였다.
① 시나리오1: 종양 Treg 세포 TPM 값이 미분화 T 세포 TPM 값보다 높은 유전자
② 시나리오2: 말초 Treg 세포 TPM 값이 미분화 T 세포 TPM 값보다 높은 유전자
③시나리오3: 종양 Treg 세포 TPM 값이 말초 Treg 세포 TPM 값보다 높은 유전자
상기와 같은 시나리오로 하기와 같은 마커를 선별하였다(표 1 참조):
실시예 3. 비소세포폐암(Non-Small Cell Lung Carcinoma: NSCLC)에서의 조절 T 세포 바이오 마커 선별
환자 시료(선암 11명, 편평세포암 3명)를 말초혈액, 및 신선한 암조직에서 채취하였다:
다음에 단일세포 분류 분석(Single cell sorting) 및 역전사증폭 및 서열분석(reverse transcription, amplification and sequencing)을 실시예 1과 같이 수행하였다. 다만, 분석에 사용된 T 세포 서브셋은 종양 Treg, 말초 Treg, 미분화 T 세포, 세포독성 CD4, 지친 T 세포(Exhausted T cell), 중앙 기억 T 세포(Central Memory T cell), 작용 기억 T 세포(Effector Memory T cell)을 사용하였다.
분석에 사용한 세포수는 12,346개 단일 세포(12,394개 유전자에 대한 데이타)이다.
분석지표와 분석방법은 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 다만, 각 서브셋은 하기 세포로 사용하였다.
① 종양 Treg: 939개 세포;
② 휴지기 Treg(Resting Treg): 428 세포;
③ 미분화 T 세포: 532 세포;
④ 지친 T 세포: 343 세포;
⑤ 중앙 기억 T 세포(Central Memory T cell): 666 세포; 및
⑥ 작용 기억 T 세포(Effector Memory T cell): 434 세포
종양 Treg 랭킹과 다른 세포 서브셋 (말초 Treg, 지친 T 세포, 세포독성 CD4, 및 미분화 T 세포)으로 구분하였다:
① 종양 Treg 클러스터: 939 개 단일 세포
② 비-종양 Treg 클러스터: 2,398개 단일 세포
XGBoost를 이용하여 기계학습과정을 하기와 같이 진행하였다:
① 모든 단일 세포에 대한 TPM 값을 XGBoost에 입력하여 종양 Treg와 다른 T 세포 서브셋을 가장 효율적으로 나눌 수 있는 조건 알고리즘을 생성하였다. 이때, 조건에 사용된 유전자은 548개였다.
② 548개 유전자를 이용한 알고리즘은 종양 Treg과 다른 T 세포 서브셋을 96.71% 정확도로 구분하였다.
선별된 유전자에서 표면 마커를 찾기 위해 세포막(plasma membrane)의 발현정도가 4 내지 5가 되는 유전자만을 재선별하였다. 마지막 단계에 다음과 같은 세부전략을 바탕으로 Treg 특이적 마커를 선별하였다.
①시나리오1: 종양 Treg 세포 TPM 값이 미분화 T 세포 TPM 값보다 높은 유전자
②시나리오2: 말초 Treg 세포 TPM 값이 미분화 T 세포 TPM 값보다 높은 유전자
③시나리오3: 종양 Treg 세포 TPM 값이 말초 Treg 세포 TPM 값보다 높은 유전자
상기와 같은 시나리오로 하기와 같은 마커를 선별하였다 (하기 표 1 참조).
F5 Treg 세포 말초 Treg 지친 T세포 세포독성 CD4 미분화 T 세포
CRC 3.100195011 -0.399058546 -0.914322388 -0.580858528
HCC 76.68346154 7.718967563 13.65846679
NSCLC 2.971520357 -0.737334345 -0.384756266 0.389661106 2.108812156
CD27 Treg 세포 말초 Treg 지친 T세포 세포독성 CD4 미분화 T 세포
CRC 2.499269581 -2.405700303 1.575739572 1.529513703
HCC 1719.785654 516.3749448 761.0570309
NSCLC 3.282889886 -3.151742758 1.350902944 0.484835081 2.482556123
RGS1 Treg 세포 말초 Treg 지친 T세포 세포독성 CD4 미분화 T 세포
CRC 3.517801886 3.540307286 2.20818689 -5.350675572
HCC 3801.927585 5962.456581 84.52466424
NSCLC 3.662258478 -3.686078393 -3.882425395 4.515817357 -0.340774184

Claims (49)

  1. RGS1; F5 및 CD27 로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편으로 조절 T 세포를 확인하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 단백질은 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 세포표면 단백질인, 조절 T 세포를 확인하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 조절 T 세포는 작용 조절 T 세포, 기억 조절 T 세포, 암 침윤 림프구 조절 T 세포로 이루어진 군에서 1종 이상이 포함되는 세포표면 단백질인, 조절 T 세포를 확인하는 방법.
  4. RGS1; F5 및 CD27로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 질환의 진단용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 단백질은 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 세포표면 단백질인, 진단용 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 조절 T 세포는 작용 조절 T 세포, 기억 조절 T 세포, 암 침윤 림프구 조절 T 세포로 이루어진 군에서 1종 이상이 포함되는 세포표면 단백질인, 진단용 조성물.
  7. 제 4항에 있어서,
    상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 진단용 조성물.
  8. 제 4항에 있어서,
    상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 진단용 조성물.
  9. 제 4항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 난소암, 대장암, 췌장암, 위암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 진단용 조성물.
  10. 제 4항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 진단용 조성물을 포함하는 암 질환 진단용 키트.
  11. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 RGS1; F5 및 CD27로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 단백질은 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 세포표면 단백질인, 정보 제공 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 조절 T 세포는 작용 조절 T 세포, 기억 조절 T 세포, 암 침윤 림프구 조절 T 세포로 이루어진 군에서 1종 이상이 포함되는 세포표면 단백질인, 정보 제공 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함하는, 정보 제공 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준의 측정 방법은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행되는, 정보 제공 방법.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의해 수행되는, 정보 제공 방법.
  17. 제 11항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 난소암, 대장암, 췌장암, 위암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 정보 제공 방법.
  18. RGS1; F5 및 CD27로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 면역 관련 질환의 진단용 조성물.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 단백질은 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 세포표면 단백질인, 진단용 조성물.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 조절 T 세포는 작용 조절 T 세포, 기억 조절 T 세포, 암 침윤 림프구 조절 T 세포로 이루어진 군에서 1종 이상이 포함되는 세포표면 단백질인, 진단용 조성물.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 진단용 조성물.
  22. 제 20항에 있어서,
    상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 진단용 조성물.
  23. 제 18항 내지 22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 관련 질환은 자가면역질환; 이식편대숙주 질환; 장기이식거부반응; 천식; 아토피; 또는 급성 또는 만성의 염증 질환인, 진단용 조성물.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염 및 결절성 다발성 동맥염으로 구성된 군으로부터 선택되는, 진단용 조성물.
  25. 제 18항 내지 제 24항 중 어느 한 항의 진단용 조성물을 포함하는 면역 관련 질환 진단용 키트.
  26. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 RGS1; F5 및 CD27로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법.
  27. 제 26항에 있어서,
    상기 단백질은 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 세포표면 단백질인, 정보 제공 방법.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 조절 T 세포는 작용 조절 T 세포, 기억 조절 T 세포, 암 침윤 림프구 조절 T 세포로 이루어진 군에서 1종 이상이 포함되는 세포표면 단백질인, 정보 제공 방법.
  29. 제 28항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함하는, 정보 제공 방법.
  30. 제 29항에 있어서,
    상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준의 측정 방법은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행되는, 정보 제공 방법.
  31. 제 29항에 있어서,
    상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의해 수행되는, 정보 제공 방법.
  32. 제 26항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 관련 질환은 자가면역질환; 이식편대숙주 질환; 장기이식거부반응; 천식; 아토피; 또는 급성 또는 만성의 염증 질환인, 정보 제공 방법.
  33. 제 32항에 있어서,
    상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염 및 결절성 다발성 동맥염으로 구성된 군으로부터 선택되는, 정보 제공 방법.
  34. RGS1; F5 및 CD27로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌신경계 질환의 진단용 조성물.
  35. 제 34항에 있어서,
    상기 단백질은 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 세포표면 단백질인, 진단용 조성물.
  36. 제 35항에 있어서,
    상기 조절 T 세포는 작용 조절 T 세포, 기억 조절 T 세포, 암 침윤 림프구 조절 T 세포로 이루어진 군에서 1종 이상이 포함되는 세포표면 단백질인, 진단용 조성물.
  37. 제 36항에 있어서,
    상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 진단용 조성물.
  38. 제 36항에 있어서,
    상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 진단용 조성물.
  39. 제 34항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌신경계 질환은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환인, 진단용 조성물.
  40. 제 39항에 있어서,
    상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 다발성 경화증, 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는, 진단용 조성물.
  41. 제 34항 내지 제 40항 중 어느 한 항의 진단용 조성물을 포함하는 뇌신경계 질환 진단용 키트.
  42. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 RGS1; F5 및 CD27로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 단백질 또는 이의 단편; 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법.
  43. 제 42항에 있어서,
    상기 단백질은 조절 T 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 세포표면 단백질인, 정보 제공 방법.
  44. 제 43항에 있어서,
    상기 조절 T 세포는 작용 조절 T 세포, 기억 조절 T 세포, 암 침윤 림프구 조절 T 세포로 이루어진 군에서 1종 이상이 포함되는 세포표면 단백질인, 정보 제공 방법.
  45. 제 44항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함하는, 정보 제공 방법.
  46. 제 45항에 있어서,
    상기 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준의 측정 방법은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행되는, 정보 제공 방법.
  47. 제 45항에 있어서,
    상기 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의해 수행되는, 정보 제공 방법.
  48. 제 42항 내지 제 47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌신경계 질환은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환인, 정보 제공 방법.
  49. 제 48항에 있어서,
    상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 다발성 경화증, 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는, 정보 제공 방법.
PCT/IB2022/060908 2021-11-12 2022-11-14 조절 t세포의 바이오 마커 WO2023084474A1 (ko)

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