JP4926966B2 - ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカーＭｓｘ１／２ - Google Patents

ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカーＭｓｘ１／２ Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカーであるＭｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子に関し、詳細には、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出手段、並びに該細胞の検出方法および検出キットに関する。
ドーパミン系は、哺乳動物の脳において重要な運動調節、ホルモン分泌調節、情動調節等に関与する非常に重要な系である。従って、ドーパミン作動性神経伝達における異常は、様々な神経系の障害を引き起こす。例えば、パーキンソン病は、中脳黒質のドーパミン産生ニューロンの特異的な脱落が原因で起こる錐体外路系の神経変性疾患である(HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 第２巻 第２３版，Isselbacher et al.編McGraw-HillInc., NY(1994)pp.2275-7)。
パーキンソン病の治療法としては、産生されるドーパミン量の低下を補うためにＬ−ドーパ（３，４‐ジヒドロキシフェニルアラニン）を経口投与する方法が主に採られているが、効果の持続性が良くないことが知られている。
そこで、失われたドーパミン産生ニューロンを補う方法として、最近では、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含む６〜９週齢の中絶胎児の中脳腹側領域を移植する治療法が試みられている（米国特許第５６９０９２７号；Spencer et al.(1992)N.Engl.J.Med.327:1541-8; Freed et al.(1992)N.Engl.J.Med.327:1549-55; Widner et al.(1992)N.Engl.J.Med.327:1556-63; Kordower et al.(1995)N.Engl.J.Med.332:1118-24; Defer et al.(1996)Brain 119:41-50; Lopez-Lozano et al.(1997)Transp.Proc.29:977-80)。しかし、現在のところ、この方法では細胞の供給面、倫理面（Rosenstain(1995)Exp.Neurol.33:106; Turner et al.(1993)Neurosurg.33:1031-7)で問題があるとともに、感染汚染の危険性、免疫学的な移植片拒絶(Lopez-Lozano et al.(1997)Transp.Proc.29:977-80; Widner and Brudin(1988)Brain Res.Rev.13:287-324)、胎児組織が糖分解よりも脂質代謝に主に依存しているための生存率の低さ(Rosenstein(1995)Exp.Neurol.33:106)等の様々な面で問題が指摘されている。
倫理面や供給不足の問題を解決する方法としては、例えば、ブタ由来の皮質、線条、および中脳細胞を用いる方法等も提案されている（例えば、特表平１０−５０８４８７号公報；特表平１０−５０８４８８号公報；特表平１０−５０９０３４号公報）。しかし、この方法においては、拒絶反応を抑制するため、細胞表面上の抗原（ＭＨＣクラスＩ抗原）を改変するという煩雑な操作が必要とされる。移植片拒絶を解消する方法としては、例えば、セルトーリ細胞を同時に移植することにより、局在的に免疫抑制する方法も提案されている（特表平11-509170号公報；特表平11-501818号公報；Selawly and Cameron(1993)Cell Transplant 2:123-9)。ＭＨＣがマッチする血縁者、他人の骨髄、骨髄バンク、及び臍帯血バンク等から移植細胞を得ることも可能であるが、患者自身の細胞を用いることができれば、余計な操作や手間なしに拒絶反応の問題も解決することができる。
そこで、中絶胎児由来の細胞に代えて、胚性幹細胞(ES)細胞、骨髄間質細胞などの非神経系細胞からのイン・ビトロにおけるドーパミン産生ニューロンの分化系の移植材料としての利用が有望視されている。実際、ラットパーキンソン病モデルの病変線条へのＥＳ細胞移植により機能的なドーパミン産生ニューロンが形成されたとの報告もある(Kimetal.(2002)Nature 418:50-56)。将来的にはＥＳ細胞若しくは患者本人の持つ神経幹細胞からの再生治療の重要性が増してくるものと思われる。
一方で、神経組織の損傷の治療においては脳機能の再構築が必要となり、周囲の細胞と適切なリンクを形成する（ネットワーク形成）ために、成熟した細胞ではなくイン・ビボにおいてニューロンへと分化し得る前駆細胞を移植する必要がある。しかし、ニューロン前駆細胞の移植においては、上述した供給面以外に、前駆細胞が不均一な細胞集団へと分化する可能性があるという問題点がある。例えば、パーキンソン病の治療においては、カテコールアミン含有ニューロンの中でもドーパミン産生ニューロンを選択的に移植することが必要であり、これまでに、パーキンソン病の治療に用いる移植細胞として、線条体(Lindvall et al.(1989)Arch.Neurol.46:615-31; Widner et al.(1992)N.Engl.J.Med.327:1556-63)、ヒト胎児神経由来の不死化セルライン（特表平８−５０９２１５号公報；特表平１１−５０６９３０号公報；特表２００２−５２２０７０号公報）、ＮＴ２Ｚ細胞の有糸分裂後ヒトニューロン（特表平９−５０５０５５４号公報）、ニューロン始原細胞（特表平１１−５０９７２９号公報）、ドーパミン等のカテコールアミンを産生するように外来遺伝子によりトランスフェクトされた細胞、骨髄ストロマ細胞（特表２００２−５０４５０３号公報；特表２００２−５１３５４５号公報）、遺伝子改変されたＥＳ細胞(Kim et al(2002)Nature 418:50-56)等が提案されている。しかしながらいずれも、ドーパミン産生ニューロンまたはドーパミン産生ニューロンへと分化する細胞のみを含むものではない。
未分化な細胞集団からドーパミン産生ニューロンを選択的に濃縮・分離する方法としては、ドーパミン産生ニューロンで発現するチロシンハイドロキシラーゼ（ＴＨ）等の遺伝子のプロモーター／エンハンサーの制御下で蛍光蛋白質を発現するレポーター遺伝子を細胞集団の各細胞に導入し、蛍光を発する細胞を分離することにより、ドーパミン産生ニューロンを生きたまま可視化して濃縮・分離、または同定する方法（特開２００２−５１７７５号公報）が提案されている。しかしこの方法は、外来遺伝子の導入という煩雑な工程を不可欠とするものであり、さらに、遺伝子治療に用いることを日的とする場合、レポーター遺伝子の存在は毒性、免疫原性の面からも問題である。
以上のことから、現時点でのパーキンソン病移植治療における大きな問題の一つは、中絶胎児の中脳腹側領域由来あるいは分化誘導されるドーパミン産生ニューロン前駆細胞が、いずれも多種の細胞の混合物である点である。神経回路形成における安全性を考えると、目的の細胞種のみを分離してから用いるのが望ましい。さらに、細胞の移植先の脳内での生存や、正しくネットワーク形成する能力を考えると、より早期の増殖前駆細胞を分離し、移植することが治療効果の観点から望ましいと言える。
これまでに、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現する遺伝子としてＬｒｐ４（ＷＯ２００４／０６５５９９号公報）が報告されている。その他にも、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞のマーカーがいくつか報告されており（ＷＯ２００４／０３８０１８号公報、ＷＯ２００５／０５２１９０号公報）、そのうちＬｍｘ１ａについてはヒトおよびマウスのドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞、分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞、およびドーパミン産生ニューロンでの発現が確認されている（ＷＯ２００５／０５２１９０号公報）。
ところで、Ｍｓｘ遺伝子は、器官形成に関与するホメオボックス遺伝子であり、マウスではＭｓｘ１、Ｍｓｘ２、Ｍｓｘ３が、ヒトではＭｓｘ１、Ｍｓｘ２が存在することが知られている（Davidson, D. (1995). Trends Genet 11:405-411）。これまでに、Ｍｓｘ１はあらゆる脳胞に発現することが報告されており（Ramos, C., et al. (2004). Dev Dyn 230:446-60）、Ｍｓｘ１／Ｍｓｘ２変異体マウスでは、神経管の背腹方向のパターニングに関与するＷｎｔ１の発現が、間脳の背側中線および吻側中脳において完全に消失することが報告されている（Bach, A., et al. (2003). Development 130:4025-36）。また、Ｍｓｘ１は神経管形成の初期段階における発生に関与していることが報告されている（Liu, Y., et al. (2004). Development 131:1017-28）。
しかしながら、Ｍｓｘ１およびＭｓｘ２がドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現していることは報告されていない。
 発明の概要
本発明者らは、今般、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子（本明細書において、単に「Ｍｓｘ１」および「Ｍｓｘ２」と言うことがある）がドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現していることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
本発明は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出手段、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出方法、およびドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出キットを提供することを目的とする。
本発明はまた、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
本発明はさらに、パーキンソン病の治療に用いられるドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の製造方法を提供することを目的とする。
本発明によれば、Ｍｓｘ１遺伝子もしくはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択に用いられるポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプライマー（以下「本発明によるプローブ」または「本発明によるプライマー」ということがある）が提供される。
本発明によれば、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択に用いられる、Ｍｓｘ１タンパク質もしくはＭｓｘ２タンパク質またはそれらの一部に対する抗体（以下「本発明による抗体」ということがある）が提供される。
本発明によればまた、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出する工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択方法（以下「本発明による検出方法」ということがある）が提供される。
本発明によれば更に、本発明によるプローブ、本発明によるプライマー、または本発明による抗体を少なくとも含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択するためのキットが提供される。
本発明によれば、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出する工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供される。
本発明によれば、パーキンソン病の治療に用いられるドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の製造方法が提供される。
本発明によれば、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択のための、Ｍｓｘ１遺伝子もしくはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの使用が提供される。
本発明によれば、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択のための、Ｍｓｘ１タンパク質もしくはＭｓｘ２タンパク質またはそれらの一部に対する抗体の使用が提供される。
本発明によるプローブ、プライマー、および抗体は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的なマーカーとして利用することができる。したがって、本発明は、移植材料の純度検定やイン・ビトロでのドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞分化誘導法の開発等において極めて有用であり、再生医療の実用化推進に大きく貢献することが期待される。
ドーパミン産生ニューロン関連マーカー遺伝子の発現時期を示した図である。 マウス１２．５日胚の中脳を示した図である。中脳を背腹軸に沿って４領域に分けた（Ｖ：最腹側領域、ＶＬ：腹側側方領域、ＤＬ：背側側方領域、Ｄ：最背側領域）。 中脳の各領域における、Ｍｓｘ１、Ｍｓｘ２、ＤＡＴ、Ｌｍｘ１ａおよびＬｒｐ４のｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示した図である。 マウス１１．５日胚の中脳における、Ｍｓｘ１、Ｎｕｒｒ１およびＴＨのｍＲＮＡ発現をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより解析した結果を示した図である。点線はドーパミン産生ニューロン発生領域を示し、破線はＶＺ（脳室領域）とＭＬ（外套層）の境界を示す。 マウス１１．５日胚の中脳における、Ｍｓｘ１／２、Ｌｍｘ１ａのタンパク質発現およびこれらの共発現（二重染色）を免疫染色法により解析した結果を示した図である。 マウス１１．５日胚の中枢神経系腹側領域における、Ｍｓｘ１／２、Ｌｍｘ１ａおよびＴＨのタンパク質発現を免疫染色法により解析した結果を示した図である。 ＥＳ細胞より分化誘導したドーパミン産生ニューロン前駆細胞における、Ｍｓｘ１、Ｍｓｘ２およびその他ドーパミン産生ニューロンマーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示した図である。 セルソーターによるＬｒｐ４陽性細胞と陰性細胞との分離を示した図である。 マウス１２．５日胚（Ｅ１２．５）の中脳由来細胞およびＳＤＩＡ分化誘導細胞より分離したそれぞれのドーパミン産生ニューロン前駆細胞における、Ｍｓｘ１、Ｍｓｘ２およびその他ドーパミン産生ニューロンマーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示した図である。
発明の具体的な説明
以下、本発明を詳細に説明する。以下の記述は、本発明を説明するための例示であり、本発明を記述された実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本明細書中で使用される全ての技術的用語、科学的用語および専門用語は、本発明が属する技術分野の通常の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有し、単に特定の態様を説明することを目的として用いられ、限定することを意図したものではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。本明細書において引用された全ての先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられ、本発明の実施のために用いることができる。
[ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞]
本発明において検出または選択の対象である「ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞」は、分裂停止前のドーパミン産生ニューロン前駆細胞を意味する。
ドーパミン産生ニューロンは、神経上皮細胞から、増殖前駆細胞、分裂停止後の前駆細胞の分化段階を経て、成熟ドーパミン産生ニューロンに分化する。ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞は、ドーパミン産生ニューロンの最も初期の前駆細胞であるから、移植先の脳内での高い生存率や、高いネットワーク形成能が期待できる。従って、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞は、パーキンソン病等、ドーパミン産生ニューロンの変性脱落によるドーパミン減少に起因する疾患の移植治療に有用である。
本発明によるプローブ、プライマー、または抗体を指標として選択された細胞は、分裂停止前のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞であることから、従来の雑多な細胞集団または外来遺伝子を導入したドーパミン産生ニューロン前駆細胞と比べて、安全性、生存率、ネットワーク形成能の面でパーキンソン病等の神経変性疾患の移植治療に好ましいものである。該細胞は、分裂停止前、すなわち増殖中のドーパミン産生ニューロン前駆細胞であり、脳内の最適な場所で分化成熟していく可能性があり、また、イン・ビボにおいてさらにドーパミン産生ニューロン前駆細胞が増殖する可能性があることから、より長期的な治療効果も期待できる。従って、本発明は、パーキンソン病等の神経変性疾患の効果的な移植治療の実用化に途を拓くものであるといえる。
［ポリヌクレオチドプローブおよびポリヌクレオチドプライマー］
本発明によるプローブおよびプライマーは、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができる。前記のように、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現はドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の指標として有用である。従って、本発明によるプローブおよびプライマーは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞検出用のマーカーとして用いることができる。
本発明によるプローブおよびプライマーは、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出することができればよく、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体を指す。二本鎖ｃＤＮＡも組織ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて利用可能であることが知られており、本発明のプローブおよびプライマーにはそのような二本鎖ｃＤＮＡも含まれる。組織中のＲＮＡの検出において特に好ましいプローブおよびプライマーとしては、ＲＮＡプローブ（リボプローブ）を挙げることができる。
本発明によるプローブおよびプライマーは、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、さらに好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなるものが挙げられる。本発明によるプローブおよびプライマーは、また、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する１０〜５０個または１０〜３０個、１５〜５０個または１５〜３０個、２０〜５０個または２０〜３０個、２５〜５０個または２５〜３０個のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなるものが挙げられる。
本発明によるプローブおよびプライマーは、少なくとも１０塩基長であることができ、好ましくは、少なくとも１５塩基長、より好ましくは、少なくとも２０塩基長、さらに好ましくは、少なくとも２５塩基長である。本発明によるプローブおよびプライマーは、また、１０〜５０塩基長または１０〜３０塩基長、１５〜５０塩基長または１５〜３０塩基長、２０〜５０塩基長または２０〜３０塩基長、２５〜５０塩基長または２５〜３０塩基長である。
本発明によるプローブおよびプライマーの好ましい態様によれば、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個（好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、さらに好ましくは、少なくとも２５個）のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなり、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子にハイブリダイズすることができる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択に用いられる１５〜３０塩基長のプローブおよびプライマーが提供される。
本発明によるプローブおよびプライマーの好ましい態様によればまた、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列のうち、識別性の高い部分にハイブリダイズすることができるプローブおよびプライマーが提供される。このようなプローブおよびプライマーを用いることにより、増殖前駆細胞をより高い精度で検出することが可能となる。このようなプローブおよびプライマーとしては、例えば、配列番号：１で表される塩基配列の１番目〜７１０番目および９６３番目〜１７１３番目、配列番号：３で表される塩基配列の１番目〜６７７番目および９４３番目〜１５４６番目、配列番号：５で表される塩基配列の１番目〜４８４番目および７３６番目〜１３１６番目、配列番号：７で表される塩基配列の１番目〜６１２番目および８６４番目〜１８０１番目、配列番号：９で表される塩基配列の１番目〜７３７番目および９７６番目〜１７２４番目、配列番号：１１で表される塩基配列の１番目〜５２５番目および７７７番目〜１１８９番目、配列番号：１３で表される塩基配列の１番目〜６１２番目および８６４番目〜１８１０番目、配列番号：１５で表される塩基配列の１番目〜７５４番目および９９４番目〜１７５４番目、配列番号：１６で表される塩基配列の１番目〜７４４番目および９９６番目〜１９３５番目、配列番号：１７で表される塩基配列の１番目〜６１０番目および８６４番目〜１８０６番目、配列番号：１９で表される塩基配列の１番目〜６１０番目および８６４番目〜１７８５番目、配列番号：２１で表される塩基配列の１番目〜１４５６番目および１７１０番目〜１９０５番目、配列番号：２３で表される塩基配列の１番目〜６２５番目および８９１番目〜１０６２番目、配列番号：２５で表される塩基配列の１番目〜７０９および９６３番目〜１８９５番目番目、配列番号：２７で表される塩基配列の１番目〜５２０番目および７８６番目〜１３１０番目、配列番号：２９で表される塩基配列の１番目〜５１０番目および７６７番目〜１２５９番目、配列番号：３１で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜２１８０番目、配列番号：３３で表される塩基配列の１番目〜４６８番目および７０７番目〜１１３８番目、配列番号：３５で表される塩基配列の１番目〜４３５番目および６７４番目〜１１４３番目、配列番号：３７で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜１１６４番目、配列番号：３９で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜１１６４番目、配列番号：４１で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜２０４８番目、配列番号：４３で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜２１８２番目、配列番号：４５で表される塩基配列の１番目〜４１３番目および６５１番目〜８０４番目、配列番号：４７で表される塩基配列の１番目〜４３１番目および６７０番目〜２６０５番目、配列番号：４９で表される塩基配列の１番目〜４３５番目および６７４番目〜２１３６番目、配列番号：５１で表される塩基配列の１番目〜７７８番目および１０１５番目〜１４５２番目、配列番号：５３で表される塩基配列の１番目〜７８０番目および１０１７番目〜１４５３番目、配列番号：５５で表される塩基配列の１番目〜３７０番目および６０９番目〜８００番目、配列番号：５７で表される塩基配列の１番目〜２９番目および２６７番目〜４２０番目、配列番号：５９で表される塩基配列の１番目〜１３４０番目および１５７８番目〜１７３１番目、配列番号：６１で表される塩基配列の１番目〜５４１番目および７７８番目〜２２２５番目、配列番号：６３で表される塩基配列の１番目〜４０４番目および６５１番目〜８０４番目、配列番号：６５で表される塩基配列の１番目〜６３２番目、配列番号：６７で表される塩基配列の１番目〜４８９番目および７２８番目〜１１０７番目、並びに配列番号：６９で表される塩基配列の１番目〜４８７番目および７０８番目〜２５６９番目からなる群から選択されるヌクレオチド配列の一部または全部を含んでなるヌクレオチド配列にハイブリダイズするプローブまたはプライマーが挙げられる。
本発明によるプローブは、ノーザンブロット法、サザンブロット法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等の目的遺伝子を検出する公知の方法において、常法に従ってプローブとして使用することができる。
本発明によるプローブは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合成できる。プローブの調製は周知であり、例えば、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press(1989))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987-1997))に従って実施できる。
本発明によるプライマーは、二種以上の該プライマーからなる、プライマーセットとしても使用することができる。
本発明によるプライマーおよびプライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法を利用して目的遺伝子を検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーおよびプライマーセットとして利用することができる。
本発明によるプライマーセットはＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列をＰＣＲ法等の核酸増幅法により増幅できるように選択することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーペアの選択は当業者に自明である。例えば、ＰＣＲ法においては、二つのプライマー（プライマーペア）の一方がＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の二本鎖ＤＮＡのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが二本鎖ＤＮＡのマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＬＡＭＰ法（ＷＯ００／２８０８２号公報）においては、標的遺伝子に対して３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという３つの領域を、５’末端側からＢ１、Ｂ２、Ｂ３という３つの領域を、それぞれ規定し、この６つの領域を用いて４種類のプライマーを設計することができる。
本発明によるプライマーは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合成できる。プライマーの調製は周知であり、例えば、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press(1989))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987-1997))に従って実施できる。
本発明においてドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の存在の指標となる「Ｍｓｘ１遺伝子」は、ヒト、マウス、ラット、チンパンジー、イヌ、ウシ、チキン等において、また「Ｍｓｘ２遺伝子」は、ヒト、マウス、ラット、チンパンジー、イヌ、ウシ、チキン、ウズラ等において公知である。それぞれの配列が開示されているＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は下記の通りである。
Ｍｓｘ１遺伝子
ヒト：ＮＭ＿００２４４８（配列番号：１（塩基配列）、配列番号：２（アミノ酸配列）、以下同様の順に示す）、ＢＣ０２１２８５（配列番号：３、配列番号：４）、Ｍ９７６７６（ＮＭ＿００２４４８と同一）、ＢＣ０６７３５３（配列番号：５、配列番号：６）
マウス：ＮＭ＿０１０８３５（配列番号：７、配列番号：８）、ＢＣ０１６４２６（配列番号：９、配列番号：１０）、ＡＦ３０８５７２（配列番号：１１、配列番号：１２）、Ｘ１４７５９（配列番号：１３、配列番号：１４）、ＡＫ０７８６００（配列番号：１５（塩基配列））、ＡＫ０７７５２４（配列番号：１６（塩基配列））、Ｘ５９２５１（ＮＭ＿０１０８３５と同一）
ラット：ＮＭ＿０３１０５９（配列番号：１７、配列番号：１８）、Ｄ８３０３６（配列番号：１９、配列番号：２０）
チンパンジー：ＸＭ＿５１７０８７（配列番号：２１、配列番号：２２）
イヌ：ＸＭ＿５４５９４６（配列番号：２３、配列番号：２４）
ウシ：ＮＭ＿１７４７９８（配列番号：２５、配列番号：２６）、Ｄ３０７５０（ＮＭ＿１７４７９８と同一）
チキン：ＮＭ＿２０５４８８（配列番号：２７、配列番号：２８）、Ｄ１０３７２（ＮＭ＿２０５４８８と同一）、Ｍ７６９８５（配列番号：２９、配列番号：３０）
Ｍｓｘ２遺伝子
ヒト：ＮＭ＿００２４４９（配列番号：３１、配列番号：３２）、ＣＲ５９２９３８（配列番号：３３、配列番号：３４）、ＢＣ０１５５０９（配列番号：３５、配列番号：３６）、Ｄ３１７７１（配列番号：３７、配列番号：３８）、Ｓ７５３０８（配列番号：３９、配列番号：４０）、Ｓ７５３６１（配列番号：４１、配列番号：４２）、Ｄ８９３７７（配列番号：４３、配列番号：４４）、ＢＴ００９８１４（配列番号：４５、配列番号：４６）、Ｘ６９２９５（配列番号：４７、配列番号：４８）、Ｄ２６１４５（配列番号：４９、配列番号：５０）
マウス：ＮＭ＿０１３６０１（配列番号：５１、配列番号：５２）、Ｘ５９２５２（配列番号：５３、配列番号：５４）
ラット：Ｕ１２５１４（配列番号：５５、配列番号：５６）、ＮＭ＿０１２９８２（配列番号：５７、配列番号：５８）
チンパンジー：ＸＭ＿５２３８０７（配列番号：５９、配列番号：６０）
イヌ：ＮＭ＿００１００３０９８（配列番号：６１、配列番号：６２）、ＡＪ２７７７５３（配列番号：６３、配列番号：６４）
ウシ：ＸＭ＿５９２４８９（配列番号：６５、配列番号：６６）
チキン：ＮＭ＿２０４５５９（配列番号：６７、配列番号：６８）、Ｓ６４４７８（ＮＭ＿２０４５５９と同一）
ウズラ：Ｍ５７６１１（配列番号：６９、配列番号：７０）
上記以外の動物（好ましくは、哺乳動物）についても、当業者であれば、公知のＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の全長配列に基づいて、その動物に内在するＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の配列を特定することができる。例えば、ヒトあるいはマウスのＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子に基づいて相同性検索を行い、その動物のＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子を検索し、特定することができる。相同性検索に当たっては後述するＢＬＡＳＴ等を利用することができる。
Ｍｓｘ１遺伝子の例としては、
配列番号：２、配列番号：４および配列番号：６からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列からなるヒトＭｓｘ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２および配列番号：１４からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列からなるマウスＭｓｘ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：１８および配列番号：２０からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列からなるラットＭｓｘ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：２２のアミノ酸配列からなるチンパンジーＭｓｘ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：２４のアミノ酸配列からなるイヌＭｓｘ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：２６のアミノ酸配列からなるウシＭｓｘ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：２８および配列番号：３０からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列からなるチキンＭｓｘ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド：
が挙げられる。
Ｍｓｘ１遺伝子の例としては、また、
配列番号：１、配列番号：３および配列番号：５からなる群から選択される少なくとも一つに記載のヒトＭｓｘ１遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５および配列番号：１６からなる群から選択される少なくとも一つに記載のマウスＭｓｘ１遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：１７および配列番号：１９からなる群から選択される少なくとも一つに記載のラットＭｓｘ１遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：２１のチンパンジーＭｓｘ１遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：２３のイヌＭｓｘ１遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：２５のウシＭｓｘ１遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：２７および配列番号：２９からなる群から選択される少なくとも一つに記載のチキンＭｓｘ１遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド：
が挙げられる。
Ｍｓｘ２遺伝子の例としては、
配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８および配列番号：５０からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列からなるヒトＭｓｘ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：５２および配列番号：５４からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列からなるマウスＭｓｘ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：５６および配列番号：５８からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列からなるラットＭｓｘ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：６０のアミノ酸配列からなるチンパンジーＭｓｘ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：６２および配列番号：６４からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列からなるイヌＭｓｘ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：６６のアミノ酸配列からなるウシＭｓｘ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：６８のアミノ酸配列からなるチキンＭｓｘ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号：７０のアミノ酸配列からなるウズラＭｓｘ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド：
が挙げられる。
Ｍｓｘ２遺伝子の例としては、また、
配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７および配列番号：４９からなる群から選択される少なくとも一つに記載のヒトＭｓｘ２遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：５１および配列番号：５３からなる群から選択される少なくとも一つに記載のマウスＭｓｘ２遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：５５および配列番号：５７からなる群から選択される少なくとも一つに記載のラットＭｓｘ２遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：５９のチンパンジーＭｓｘ２遺伝子のＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列；
配列番号：６１および配列番号：６３からなる群から選択される少なくとも一つに記載のイヌＭｓｘ２遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：６５のウシＭｓｘ２遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：６７のチキンＭｓｘ２遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド；
配列番号：６９のウズラＭｓｘ２遺伝子のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド：
が挙げられる。
本発明によるＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子には、Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質と機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。ここで「機能的に同等」であるかどうかは、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現と関連する生体現象あるいは機能を評価することにより、例えば、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞において選択的に発現しているか否かを評価することにより決定することができる。
また、Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質と機能的に同等のものとしては、アミノ酸配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列および配列番号３２のアミノ酸配列）をコードする遺伝子が多型である場合、当該多型も含まれる。
Ｍｓｘ１タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子としては下記が挙げられる。
・ Ｍｓｘ１タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列および配列番号８のアミノ酸配列）において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失またはその一方もしくは両末端への付加がなされたアミノ酸配列（改変アミノ酸配列）をコードする遺伝子；
・ Ｍｓｘ１タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列および配列番号８のアミノ酸配列）をコードする遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子；および
・ Ｍｓｘ１タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列および配列番号８のアミノ酸配列）と少なくとも７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
また、Ｍｓｘ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子としては下記が挙げられる。
・ Ｍｓｘ２タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号３２のアミノ酸配列および配列番号５２のアミノ酸配列）において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたアミノ酸配列（改変アミノ酸配列）をコードする遺伝子；
・ Ｍｓｘ２タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号３２のアミノ酸配列および配列番号５２のアミノ酸配列）をコードする遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子；および
・ Ｍｓｘ２タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号３２のアミノ酸配列および配列番号５２のアミノ酸配列）と少なくとも７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
本願明細書において、「アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされた」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、または天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。
Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質の改変アミノ酸配列は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質のアミノ酸配列において１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
本願明細書において「ハイブリダイズする」とは、ストリンジェントな条件下で標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを意味する。具体的には、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ〔Meth. Enzym., 164, 765 (1988)〕などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算したときに、標的ヌクレオチド配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェントな条件下」とは、当業者が通常使用し得るハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０℃〜７０℃、好ましくは６０℃〜６５℃などで反応を行い、塩濃度が１５〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌなどの洗浄液中で洗浄する方法に従って行なうことができる。温度、塩濃度は使用するプローブの長さに応じて適宜調整することが可能である。さらに、ハイブリダイズしたものを洗浄するときの条件は、０．２または２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、温度２０−６８℃で行うことができる。ストリンジェント（high stringency）な条件にするかマイルド（low stringency）な条件にするかは、洗浄時の塩濃度又は温度で差を設けることができる。塩濃度でハイブリダイズの差を設ける場合には、ストリンジェント洗浄バッファー（high stringency wash buffer）として０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、マイルド洗浄バッファー（low stringency wash buffer）として２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで行うことができる。また、温度でハイブリダイズの差を設ける場合には、ストリンジェントの場合は６８℃、中等度（moderate stringency）の場合は４２℃、マイルドの場合は室温（２０−２５℃）でいずれの場合も０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで行えばよい。
通常、プレハイブリダイズを実施する場合にはハイブリダイズと同じ条件で実施するが、ハイブリダイズとプレ（予備）洗浄は同じ条件で行うとは限らない。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
本願明細書において、アミノ酸配列について「同一性」（相同性という場合もある）とは、比較される配列間において、各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いられる。このとき、ギャップの存在及びアミノ酸の性質が考慮される（Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730 (1983)）。相同性の計算には、市販のソフトであるＢＬＡＳＴ（Altschul: J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）、ＦＡＳＴＡ(Peasron: Methods in Enzymology 183:63-69 (1990))等を用いることができる。
Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。
「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。
［抗体］
本発明による抗体は、Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質を特異的に認識することができる。前記のように、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現はドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の指標として有用である。従って、本発明による抗体は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞検出用のマーカーとして用いることができる。
本発明による抗体を得るためのＭｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質は、Ｍｓｘ１またはＭｓｘ２の抗原性を有していればよく、Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が包含される。このようなタンパク質が元のタンパク質と同じ生物学的活性が維持されることは公知である(Mark et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5662-6;Zoller and Smith(1982)Nucleic Acids Res. 10:6487-500;Wang et al.(1984)Science 224:1431-3;Dalbadie-McFarland et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6409-13)。あるタンパク質において、元のタンパク質の抗原性を維持した状態で、１若しくは複数個のアミノ酸を欠失、挿入、置換または付加させる方法は公知である。例えば、部位特異的変異誘発法により変異蛋白質をコードするポリヌクレオチドを調製し、適宜発現させて得ることができる(Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Press(1989);Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,(1987-1997),Section8.1-8.5;Hashimoto-Goto et a1.(1995)Gene 152:271-5;Kinkel(1985)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 82:488-92;Kramer and Fritz(1987)Method.Enzymol 154:350-67;Kunke1(1988)Method.Enzymo1.85:2763-6)。
本発明による抗体には、Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質の一部に対して特異的な抗体も含まれる。即ち、本発明の抗体を得るためのＭｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質には、Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質の全長アミノ酸配列を有するポリペプチドに加えて、Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質の少なくとも６アミノ酸残基以上（例えば、６、８、１０、１２または１５アミノ酸残基以上）と同一の配列を有するポリペプチド断片である。本明細書におけるＭｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質のポリペプチド断片は、Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質の抗原性さえ有すればどのような断片であってもよい。
好ましい断片としては、Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質のアミノ末端、カルボキシル末端等のポリペプチド断片を挙げることができる。ポリペプチドの抗原決定部位は、タンパク質のアミノ酸配列上の疎水性／親水性を解析する方法(Kyte-Doolittle(1982)J.Mol.Biol. 157:105-22)、二次構造を解析する方法(Chou-Fasman(1978)Ann.Rev.Biochem. 47:251-76)により推定し、さらにコンピュータープログラム(Anal.Biochem. 151:540-6(1985))または短いペプチドを合成しその抗原性を確認するＰＥＰＳＣＡＮ法（特表昭６０−５００６８４号公報）等の手法により確認することができる。
Ｍｓｘ１タンパク質に対する抗体の例としては、
配列番号：２、配列番号：４および配列番号：６からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２および配列番号：１４からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：１８および配列番号：２０からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：２２のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：２４のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：２６のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：２８および配列番号：３０からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体：
が挙げられる。
Ｍｓｘ２タンパク質に対する抗体の例としては、
配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８および配列番号：５０からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：５２および配列番号：５４からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：５６および配列番号：５８からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：６０のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：６２および配列番号：６４からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：６６のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：６８のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体；
配列番号：７０のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体：
が挙げられる。
本発明による抗体の好ましい態様によれば、Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質において識別性の高いポリペプチド部分を認識する抗体が提供される。このような抗体を用いることにより、増殖前駆細胞をより高い精度で検出することが可能となる。このような抗体としては、Ｍｓｘ１タンパク質において識別性の高いポリペプチド部分に対する抗体が挙げられ、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：４で表されるアミノ酸配列の１番目〜２１６番目および３１５番目〜３７０番目、配列番号：６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４９番目および２４８番目〜２９９番目、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４９番目および２４８番目〜３０３番目、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜３２３番目、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列の１番目〜４７２番目および５７１番目〜６３４番目、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列の１番目〜２０８番目および２９８番目〜３５３番目、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１３８番目および２３７番目〜２８８番目、並びに配列番号：３０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１００番目および１９９番目〜２４２番目からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残基または全部を含んでなるタンパク質に対する抗体が挙げられる。増殖前駆細胞をより高い精度で検出することができる抗体としては、また、Ｍｓｘ２タンパク質において識別性の高いポリペプチド部分に対する抗体が挙げられ、例えば、配列番号：３２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１８番目〜２６７番目、配列番号：３４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１８番目〜２６８番目、配列番号：３６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１１９番目および２１８番目〜２６６番目、配列番号：５２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２１番目および２２０番目〜２６８番目、配列番号：５４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２１番目および２２０番目〜２６９番目、配列番号：５６で表されるアミノ酸配列の１番目〜９番目および９９番目〜１３９番目、配列番号：５８で表されるアミノ酸配列の１番目〜９番目および９９番目〜１３９番目、配列番号：６０で表されるアミノ酸配列の１番目〜４６６番目および５２７番目〜５７６番目、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：６４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：６６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目、配列番号：６８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１１２番目および２１１番目〜２５９番目、並びに配列番号：７０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１１２番目および２１１番目〜２５９番目からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残基または全部を含んでなるタンパク質に対する抗体が挙げられる。
本発明による抗体は、Developmental studies hybridoma bankのような抗体産生細胞供与機関から入手することができる。
本発明による抗体はまた、当業者に周知方法を用いて得ることができる（例えば、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987))、Antibodies:A Laboratory Manual, Ed.Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)）。
本発明による抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、多特異性抗体、並びに、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｖ等の抗体断片が含まれる。
ポリクローナル抗体であれば、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離し、ポリクローナル抗体を含む血清とすることができる。
必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。
モノクローナル抗体であれば、上記抗原を感作した哺乳動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞を取り出し、骨髄腫細胞などと細胞融合させ、得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。
免疫抗原としては、Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質のフラグメントを用いることができる。あるいは、上記アミノ酸配列に基づき合成したものを用いることができる。抗原はキャリア蛋白質との複合体として用いてもよい。抗原とキャリアタンパク質の複合体の調製には種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が使用できる。キャリアタンパク質は牛血清アルブミン、サイログロブリン、ヘモシアニン等の常用されているものでよく、通常１〜５倍量の割合でカップリングさせる方法が用いられる。
免疫される動物としてはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスターなどが挙げられ、接種方法は皮下、筋肉または腹腔内の投与が挙げられる。投与に際しては完全フロイントアジュバンドや不完全フロイントアジュバンドと混和して投与してもよく、投与は通常２〜５週毎に１回ずつ行われる。
免疫された動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合させ、ハイブリドーマとして単離される。骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ましいが、異種間においても可能な場合もある。
細胞融合の操作は既知の方法、例えば、Nature, 256,495, 1975に従って実施できる。
融合促進剤としてはポリエチレングリコールやセンダイウイルスなどが挙げられ、通常には、２０〜５０％程度の濃度のポリエチレングリコール（平均分子量１０００〜４０００）を用いて２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃の温度下、抗体 産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常１：１〜１０：１程度、約１〜１０分間程度反応させることにより細胞融合を実施することができる。
抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の免疫化学的方法が使用できる。例えば、Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質をコートしたマイクロプレートを用いるＥＬＩＳＡ法、抗免疫グロブリン抗体をコートしたマイクロプレートを用いるＥＩＡ法、Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質を含むサンプルを電気泳動後、ニトロセルロース転写膜を用いるイムノブロット法などが挙げられる。
このようなウェルから更に、例えば限界希釈法によってクローニングを行い、クローンを得ることができる。ハイブリドーマの選別、育種は、通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）で行われる。このようにして得られたクローンはあらかじめプリスタンを投与したＳＣＩＤマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。また、該クローンを培養し、その培養物を抗体精製の原料とすることもできる。
モノクローナル抗体の精製は免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用いればよく、たとえば、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利用、さらにＭｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質を用いるアフィニティクロマトグラフィーなどの手段により容易に達成することができる。
血清からのポリクローナル抗体の精製も同様に行うことができる。
［検出方法］
Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の存在の指標となる。従って、本発明によれば、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出することにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。
ここで、「Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出する」方法としては、被験細胞試料におけるＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出できる方法であれば特に限定されず、例えば、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
ここで、「被験細胞試料」とは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含むと考えられる細胞試料であればよく、中脳腹側領域の細胞を用いることができる。中脳腹側領域の細胞は公知の方法により取得することができる（Studer, L., et al. Nature Neurosci (1998) 1:290-295）。好ましくは、胎児（好ましくは、ヒト中絶胎児）または患者自身の中脳腹側領域の細胞を被験細胞試料として用いることができる。また、イン・ビトロで分化誘導されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含む培養細胞を被験細胞試料として用いることができる。イン・ビトロにおけるドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導は、公知のＥＳ細胞（Kawasaki et al. Neuron(2000)28(1):31-40, Lee, SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579）、骨髄間質細胞、神経由来の不死化セルライン（特表平８−５０９２１５号公報；特表平１１−５０６９３０号公報；特表２００２−５２２０７０号公報）、ニューロン始原細胞（特表平１１−５０９７２９号公報）等の細胞を出発材料として、公知の方法、例えば、ＳＤＩＡ法（Kawasaki et al. Neuron(2000)28(1):31-40）、５−ｓｔａｇｅ法(Lee, SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)等による分化させる処理を行うことにより実施することができる。好ましくは、ＳＤＩＡ法による分化させる処理が行われたＥＳ細胞を被験細胞試料として用いることができる。
ここで「ＳＤＩＡ法」は、無血清培地中で、ＥＳ細胞をストローマ細胞株ＰＡ６と共培養することにより行うことができる（Kawasaki et. al. Neuron. 2000 28(1):31-40）。また、「５−ｓｔａｇｅ法」は、ＥＳ細胞を血清存在下で非付着性培養皿上で培養することによりｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ（ＥＢ）を形成させ、続いてＥＢを付着性培養皿上に付着させることで、神経前駆細胞を選択する。最後に、Ｓｈｈ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８等の成長因子を添加し、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を誘導することにより行うことができる(Lee, SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)。
本発明による検出法の第一の態様によれば、本発明によるプローブを核酸試料（ｍＲＮＡまたはその転写産物）とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体、すなわちヌクレオチド二本鎖、を検出することにより細胞試料におけるＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出することができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press(1989)、特にSection 9.47-9.58)、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987-1997)、特にSection 6.3-6.4)、『DNA Cloning 1:Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University(1995)、条件については特にSection 2.10)を参照することができる。
ハイブリダイゼーション法を利用したＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出は、例えば、下記工程により実施することができる：
（ａ）被験細胞試料由来のポリヌクレオチドと、本発明によるプローブとを接触させる工程；および
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程。
工程（ａ）において、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含むと考えられる被験細胞試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、被験細胞試料由来のポリヌクレオチドとして、プローブと接触させることができる。
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては例えば、放射能活性（例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、および３５Ｓ）、蛍光（例えば、ＦＩＴＣ、ユーロピウム）、化学発色のような酵素反応（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）等を利用した標識が挙げられる。
ハイブリダイゼーション産生物の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。
ハイブリダイゼーション複合体が検出された細胞は、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子を発現している細胞であるので、該細胞を、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と判定することができる。
本発明による検出法の第二の態様によれば、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法により核酸試料（ｍＲＮＡまたはその転写産物）を増幅させ、増幅産物を検出することにより、細胞試料におけるＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出することができる。
核酸増幅法を利用したＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現の検出は、例えば、下記工程により実施することができる：
（ｃ）被験細胞試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施する工程；および
（ｄ）形成された増幅産物を検出する工程。
工程（ｃ）において、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含むと考えられる被験細胞試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を鋳型として用いることができる。
増幅産物の検出は、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法を用いて実施できる。
増幅産物が検出される細胞は、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子を発現している細胞であるので、該細胞を、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と判定することができる。
本発明による検出法の第三の態様によれば、本発明による抗体と細胞試料とを接触させ、抗原抗体反応を検出することにより細胞試料におけるＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出することができる。
抗原抗体反応を利用したＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現の検出は、例えば、下記工程により実施することができる：
（ｅ）被験細胞試料由来のタンパク質と、本発明による抗体とを接触させる工程； および
（ｆ）抗原抗体複合体を測定する工程。
抗原抗体反応の検出方法は当業者に周知であり、例えば、免疫学的方法により、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含むと考えられる被験細胞試料中のＭｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質を検出することができる。免疫学的方法としては、細胞試料を必要に応じて適切な処理、例えば、細胞の分離、抽出操作などをした試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行うことができる。標識化剤としては螢光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質を使用することができる。
抗原抗体複合体が検出される細胞は、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子を発現している細胞であるので、該細胞を、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と判定することができる。
パーキンソン病の治療に用いるためには、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞は純度が高いことが望ましい。
前記の各検出工程は１回のみならず、同工程を繰り返し行うことにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択の精度を高めていくことができる。
従って、本発明による検出方法によれば、前記の工程を２回以上行うことにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞をより高精度に検出または選択することができる。
また、他のマーカー遺伝子、好ましくはＭｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子、を併用することにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の検出または選択の精度を高めていくことができる。
従って、本発明による検出方法によればまた、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子や分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子等を併用し、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現のみならず、前記した他のマーカー遺伝子の発現をも検出することにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞をより高精度に検出または選択することができる。
各分化段階において選択的に発現するドーパミン産生ニューロン関連マーカー遺伝子を図１に示す。
Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出することを特徴とする検出方法においては、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子を併用し、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子のみならず、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現をも検出することにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
具体的には、工程（ａ）、工程（ｃ）、または工程（ｅ）において、被験細胞試料として、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出された細胞を使用することにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この場合、工程（ｂ）においてハイブリダイゼーション複合体が検出された細胞、工程（ｄ）において増幅産物が検出された細胞、または工程（ｆ）において抗原抗体複合体が検出された細胞は、いずれもＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子を発現し、かつ、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子を発現している細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
また、工程（ｂ）においてハイブリダイゼーション複合体が検出された細胞、工程（ｄ）において増幅産物が検出された細胞、または工程（ｆ）において抗原抗体複合体が検出された細胞について、それぞれ、（ｇ−１）Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出する工程を更に実施することにより、高精度にドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。この場合、工程（ｇ−１）において、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出された細胞は、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子を発現し、かつ、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子を発現している細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出することを特徴とする検出方法においてはまた、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子を併用し、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子は発現するが、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出されないことを確認することにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。
具体的には、工程（ａ）、工程（ｃ）、または工程（ｅ）において、被験細胞試料として、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出されなかった細胞を使用することにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を高精度に検出または選択することができる。この場合、工程（ｂ）においてハイブリダイゼーション複合体が検出された細胞、工程（ｄ）において増幅産物が検出された細胞、または工程（ｆ）において抗原抗体複合体が検出された細胞は、いずれもＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子は発現するが、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子は発現しない細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
また、工程（ｂ）においてハイブリダイゼーション複合体が検出された細胞、工程（ｄ）において増幅産物が検出された細胞、または工程（ｆ）において抗原抗体複合体が検出された細胞について、それぞれ、（ｇ−２）分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出する工程を更に実施することにより、高精度にドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。この場合、工程（ｇ−２）において、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出されない細胞は、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子は発現するが、分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子は発現しない細胞であるから、該細胞を、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞と高精度に判定することができる。
「Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子」としては、中脳最腹側脳室領域（ＶＺ領域）に発現しているＭｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子が挙げられ、例えば、Ｌｒｐ４遺伝子、Ｎａｔｏ３遺伝子、Ｍａｓｈ１遺伝子が挙げられる。
Ｌｒｐ４遺伝子については、ＷＯ２００４／０６５５９９号公報に記載されている。Ｍａｓｈ１遺伝子については、Kele J, Simplicio N, Ferri AL, Mira H, Guillemot F, Arenas E, Ang SL.Neurogenin 2 is required for the development of ventral midbrain dopaminergic neurons. Development. 2006 Feb;133(3):495-505に記載されている。Ｎａｔｏ３遺伝子については、本発明者らによってドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現されることが確認されている（データ省略）。
Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の検出は、公知の遺伝子の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定されず、例えば、上記のハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
「分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子」としては、中脳最腹側外套層（ＭＬ領域）に発現している遺伝子が挙げられ、例えば、Ｎｕｒｒ１遺伝子、Ｅｎ１遺伝子、Ｅｎ２遺伝子、Ｐｔｘ３遺伝子、ＴＨ遺伝子が挙げられる。また、中脳最腹側脳室領域（ＶＺ領域）に発現している遺伝子が挙げられ、例えば、６５Ｂ１３遺伝子が挙げられる。
Ｎｕｒｒ１遺伝子については、Science. 1997 11;276(5310):248-50に記載されている。Ｅｎ１遺伝子については、J. Neurosci.2001 21(9): 3126-34に記載されている。Ｅｎ２遺伝子については、J. Neurosci.2001 21(9): 3126-34に記載されている。Ｐｔｘ３遺伝子については、Proc.Natl.Acad.Sci.1997 94: 13305-10に記載されている。ＴＨ遺伝子については、Science. 1997 11;276(5310):248-50に記載されている。６５Ｂ１３遺伝子については、ＷＯ２００４／０３８０１８号公報に記載されている。
分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の検出は、公知の遺伝子の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定されず、例えば、上記のハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
［検出キット］
本発明によれば、本発明による検出方法を実施するための検出キットが提供される。
本発明による検出キットの第一の態様としては、本発明による第一の態様の検出法を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプローブを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。このプローブは、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法によりＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出する。従って第一の態様の検出方法は、所望により、ハイブリッド形成法を実施するための種々の試薬、例えば標識の検出に用いられる基質化合物、ハイブリダイゼーション緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
本発明による第一の態様の検出キットは、精度の高い検出を行うために、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現、または分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現、または分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現を更に検出する。
本発明による検出用キットの第二の態様としては、本発明による第二の態様の検出法を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマーセットを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この検出用キットは核酸増幅法によりＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出する。従って第二の態様の検出方法は、所望により、核酸増幅法を実施するための種々の試薬、例えば緩衝液、ＰＣＲが正常に進行し得ることを示す内部標準、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
本発明による第二の態様の検出キットは、精度の高い検出を行うために、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現、または分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現、または分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現を更に検出する。
本発明による検出キットの第三の態様としては、本発明による第三の態様の検出法を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、Ｍｓｘ１タンパク質またはＭｓｘ２タンパク質を検出するためのキットであって、本発明による抗体を少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットは抗原抗体反応を検出することによりＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出する。
従って第三の態様の検出方法は、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えばＥＬＩＳＡ法等に用いる２次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
本発明による第三の態様の検出キットは、精度の高い検出を行うために、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現、または分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現、または分裂停止後ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー遺伝子の発現を更に検出する。
［スクリーニング方法］
本発明による検出方法は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニングに適用することができる。すなわち、被験物質の添加により、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に分化誘導されたか否かを、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を指標として判定することにより、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞分化誘導に有効な物質をスクリーニングすることができる。
従って、本発明によれば、下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供される：
（ｉ）ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に分化し得る細胞と、被験物質とを接触させる工程；および
（ｉｉ）被験物質を接触させた後の前記細胞におけるＭｓｘ遺伝子１またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出する工程。
工程（ｉ）において、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に分化し得る細胞は、好ましくは、胎児中脳腹側領域、またはＥＳ細胞より分化誘導した神経前駆細胞を含む培養細胞から採取することができる。
工程（ｉ）において、「被験物質を接触させる」とは、例えば、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に分化し得る細胞を含む培養細胞に被験物質を添加することにより行うことができる。
「被験物質」としては、合成低分子化合物、タンパク質、合成ペプチド、精製または部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質（細菌代謝産物を含む）、核酸（アンチセンス、リボザイム、ＲＮＡｉ等）等が挙げられ、好ましくは、化合物もしくはその塩またはそれらの溶媒和物（例えば、水和物）であるが、これらに限定されるものではない。「被験物質」は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
工程（ｉｉ）においては、本発明による検出法に従って、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出することができる。
具体的には、ハイブリダイゼーション法を利用した検出については工程（ａ）および（ｂ）を、核酸増幅法を利用した検出については工程（ｃ）および（ｄ）を、抗原抗体反応を利用した検出については工程（ｅ）および（ｆ）を、それぞれ実施することにより、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出することができる。
工程（ｉｉ）において、被験物質を接触させて、細胞試料においてＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現が検出された場合に、該物質をドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質であると判定することができる。
本発明によるスクリーニング法により特定された物質は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質として用いることができる。
本発明によれば、更に下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供される：
（ｉｉｉ）被験物質を接触させた後の前記細胞における、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出する工程。
工程（ｉｉ）において、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現が検出され、かつ、工程（ｉｉｉ）において、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出された場合に、該物質をドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質であると高精度に判定することができる。
工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉ）の後に行われればよく、工程（ｉｉ）の前でも後でもよい。
「Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子」としては、中脳最腹側脳室領域（ＶＺ領域）に発現しているＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子が挙げられ、例えば、Ｌｒｐ４遺伝子、Ｎａｔｏ３遺伝子、Ｍａｓｈ１遺伝子が挙げられる。
Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の検出は、公知の遺伝子の発現を検出できる方法を用いて行うものであれば特に限定されず、例えば、上記のハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
［製造方法］
本発明による検出方法は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択することができる。ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞はパーキンソン病の治療に用いることができる。従って、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を指標として、検出または選択されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞から、パーキンソン病の治療に用いられるドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を製造することができる。
本発明によれば、下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の製造方法が提供される：
（ｉｖ）ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含み得る細胞を取得する工程；
（ｖ）本発明による検出方法を用いて、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択する工程；および
（ｖｉ）（ｖ）の工程で検出または選択された細胞を培養する工程。
本発明によれば、本発明による検出方法により検出または選択されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞、または本発明による製造方法により製造されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を、ヒトを含む哺乳動物に移植する工程を含んでなる、パーキンソン病の治療方法が提供される。
本発明の治療方法によれば、移植されたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞がドーパミンを産生することによって、パーキンソン病を予防および／または治療することができる。
本発明による治療方法の実施に当たっては、ヒトを含む哺乳動物、好ましくは移植を受ける個体自身または中絶胎児、からドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含み得る細胞を取得することができる。
ここで、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞は脳、好ましくは中脳、に移植することができる。
なお、本願明細書において「検出」には、「識別」も含まれる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、下記実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
[実施例１]Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子の発現解析
（１）ＲＴ−ＰＣＲ法による解析
Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子がドーパミン産生ニューロン系列の細胞に発現することを確認するため、以下のプロトコールによるＲＴ−ＰＣＲ法により、マウス胎児中脳各領域におけるＭｓｘ１、Ｍｓｘ２、ＤＡＴ、Ｌｍｘ１ａ、Ｌｒｐ４のｍＲＮＡの発現を調べた。ここで、ＤＡＴは、ドーパミン産生ニューロンのマーカー遺伝子であり（Development. 2004;131(5):1145-55.）、Ｌｍｘ１ａは、ドーパミン産生ニューロンおよびドーパミン産生ニューロン前駆細胞のマーカー遺伝子であり（ＷＯ２００５／０５２１９０）、Ｌｒｐ４は、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞のマーカー遺伝子である（ＷＯ２００４／０６５５９９）。
マウス（SLCより入手）１２．５日胚より図２に示した中脳の４領域（Ｖ領域：最腹側領域、ＶＬ領域：腹側側方領域、ＤＬ領域：背側側方領域、Ｄ領域：最背側領域）を切り出し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Qiagen）を用いて全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ (TAKARA)を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、合成したｃＤＮＡを制限酵素ＲｓａＩ（TAKARA）で消化したのち、ａｄ２を付加し、ａｄ２Ｓをプライマーとして、ＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを増幅して、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型に用いた。増幅条件は、７２℃で５分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の反応を１５サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。
ａｄ２Ｓ: cagctccacaacctacatcattccgt（配列番号７１）
ａｄ２Ａ: acggaatgatgt（配列番号７２）
次に、増幅したｃＤＮＡ ４ｎｇ、０．４ｎｇ、０．０４ｎｇ相当分のｃＤＮＡを鋳型に用いて、以下の反応系でＰＣＲを行った。
１０×ＥｘＴａｑ １μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ０．８μｌ
ＥｘＴａｑ ０．０５μｌ
１００μＭ プライマー 各０．１μｌ
ｃＤＮＡ １μｌ
蒸留水 ６．９５μｌ
９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の増幅反応を行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。ＰＣＲの増幅は、Ｌｒｐ４、ＤＡＴ、Ｌｍｘ１ａは２６サイクル、Ｍｓｘ１は３２サイクル、Ｍｓｘ２は２７サイクルで行った。
下記プライマーをＰＣＲに使用した。
Ｌｒｐ４：tagtctaccactgctcgactgtaacg（配列番号７３）
cagagtgaacccagtggacatatctg（配列番号７４）
ＤＡＴ ：cagaatcctgtgctcacggtagttgc（配列番号７５）
actaaagtggctgcaagctgaccagg（配列番号７６）
Ｌｍｘ１ａ：tggttcaggtgtggttccagaaccag（配列番号７７）
tctgaggttgccaggaagcagtctcc（配列番号７８）
Ｍｓｘ１ ：tagcctacatgggcggtgtagagtcc（配列番号７９）
caccgagacccaggtgaagatgatgg（配列番号８０）
Ｍｓｘ２ ：atatccaaccggcgtggcatagagtc（配列番号８１）
tggttccagaaccgaagggctaaggc（配列番号８２）
その結果、Ｍｓｘ１およびＭｓｘ２のｍＲＮＡは、ドーパミン産生ニューロンおよびドーパミン産生ニューロン前駆細胞のマーカー遺伝子が発現する中脳のＶ領域およびＤ領域に選択的に発現することが明らかになった（図３）。
（２）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる解析
さらに詳細に発現パターンを調べるために以下のプロトコールによるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、Ｍｓｘ１、Ｎｕｒｒ１及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のｍＲＮＡの発現解析を行った。Ｎｕｒｒ１およびＴＨは、ドーパミン産生ニューロン前駆細胞において、分裂停止後に初めて発現が誘導されることが知られているマーカー遺伝子である（Science. 1997 11;276(5310):248-50.）。
まず、以下の方法でＤＩＧ化プローブを作製した。
マウス（SLCより入手）１２．５日胚より中脳後脳領域を切り出し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Qiagen）を用いて全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ (TAKARA)を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、合成したｃＤＮＡを鋳型に用いて、以下の反応系でＭｓｘ１、Ｎｕｒｒ１、ＴＨのｃＤＮＡを増幅した。
１０×ＥｘＴａｑ ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ 4μｌ
ＥｘＴａｑ ０．２５μｌ
１００μＭ プライマー 各０．５μｌ
ｃＤＮＡ １μｌ
蒸留水 ３８.７５μｌ
増幅条件は、９４℃で５分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、および７２℃で２分の反応を３５サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。
下記プライマーをＰＣＲに使用した。
Ｍｓｘ１ ：gccttcggcctctcttttcctcttgg（配列番号８３）
ttcaaaagggatgcttgagagccacg（配列番号８４）
ＴＨ ：gctgtcacgtccccaaggttcattgg（配列番号８５）
ggagcgcatgcagtagtaagatgtgg（配列番号８６）
Ｎｕｒｒ１：catatgatcgagcagaggaagacacc（配列番号８７）
agtgcgaacaccgtagtgctgacagg（配列番号８８）
増幅したｃＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩ(Invitrogen)にクローニングし、これを鋳型に用いてＤＩＧ化プローブを以下の反応系で合成した（試薬は全てRocheより購入）。
ＲＮＡ ポリメラーゼ バッファー ２μｌ
ＮＴＰ ラベリング ミックス ２μｌ
ＲＮａｓｅ インヒビター １μｌ
ＲＮＡ ポリメラーゼ（Ｔ７またはＳＰ６） ２μｌ
鋳型ＤＮＡ １μｇ
蒸留水 総量２０μｌ
３７℃２時間の後、ＤＮａｓｅＩ（Roche）処理を３７℃で１５分行い、ＤＩＧ化ＲＮＡプローブをエタノール沈殿により回収した。
次に、マウス１１．５日胚を摘出し、４％ＰＦＡ（WAKO）／ＰＢＳ（−）を用いて４℃で２時間固定した後、２０％ショ糖（WAKO）／ＰＢＳ（−）を用いて４℃で一晩置換し、ＯＣＴ（サクラセイキ）で包埋した。厚さ１２μｍの切片を作製し、スライドガラス上で乾燥させた後に４％ＰＦＡを用いて室温で３０分間再固定した。ＰＢＳで洗浄した後、ハイブリダイゼーション（１μｇ／ｍｌ ＤＩＧ化ＲＮＡプローブ、５０％ホルムアミド（ナカライテスク）、５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌ 酵母ＲＮＡ（Sigma）、５０μｇ／ｍｌ ヘパリン）を６８℃で４０時間行った。その後、洗浄（５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ）を６８℃で行い、さらに洗浄（５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ）を６８℃で行った。１ｘＴＢＳＴで、室温で洗浄ののち、ブロッキング（ブロッキング剤: Roche）を行った。アルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（DAKO）を４℃で一晩反応させ、洗浄（１ｘＴＢＳＴ、２ｍＭ レバミソール）の後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ (DAKO)を基質として発色させた。
その結果、ドーパミン産生ニューロンの発生する時期であるマウス１１．５日胚において、Ｍｓｘ１のｍＲＮＡは、ＴＨおよびＮｕｒｒ１のｍＲＮＡと同様にＶ領域に強く発現することが明らかになった（図４）。また、ＴＨおよびＮｕｒｒ１のｍＲＮＡが分裂停止後のニューロンの存在する外套層（mantle layer；ＭＬ）領域のみに発現するのに対して、Ｍｓｘ１のｍＲＮＡは、ＭＬ領域には発現せず、増殖前駆細胞の存在する脳室領域（ventricular zone；ＶＺ）のみに発現することも明らかになった（図４）。以上の結果から、Ｍｓｘ１のｍＲＮＡは、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現することが明らかになった。
[実施例２]Ｍｓｘ１タンパク質およびＭｓｘ２のタンパク質発現解析
次に、抗Ｍｓｘ１／２抗体（Developmental studies hybridoma bank（http://www.uiowa.edu/~dshbwww/））を用いてＭｓｘ１／２タンパク質の発現を検討した。また、抗Ｌｍｘ１ａ抗体を用いた二重染色も行った。
マウス１１．５日胚を摘出し、４％ＰＦＡ／ＰＢＳ（−）を用いて４℃で２時間固定した後、２０％ショ糖／ＰＢＳ（−）を用いて４℃で一晩置換し、ＯＣＴで包埋した。厚さ１２μｍの切片を作製し、スライドガラスに貼り付けた後、室温で３０分乾燥させ、ＰＢＳ（−）で再び湿潤させた。その後、ブロッキング（ブロックエース（大日本製薬））を室温で３０分間行い、一次抗体（Developmental studies hybridoma bank）を室温で１時間反応させた後、さらに４℃で一晩反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（−）を用いて室温で１５分間の洗浄を３回行った。次に、蛍光標識した２次抗体（Jackson）を室温で１時間反応させ、同様に洗浄を行った後、ＰＢＳ（−）によって室温で１０分間洗浄し、封入した。
その結果、Ｍｓｘ１／２は、マウス１１．５日胚の中脳においてｍＲＮＡだけでなくタンパク質としても発現していることが明らかになった（図５）。抗Ｌｍｘ１ａ抗体との二重染色の結果から、Ｍｓｘ１／２タンパク質は、ＶＺ領域において、Ｌｍｘ１ａと同一細胞で共発現することが確認され、発現領域も背−腹方向で完全に一致することが明らかになった（図５）。
また、上記の方法に従って、Ｍｓｘ１／２タンパク質の発現について中枢神経系における領域特異性を調べたところ、Ｍｓｘ１／２タンパク質は、ドーパミン産生ニューロンの産生される中脳の腹側領域、特にＶＺ領域に、選択的に発現することが明らかになった（図６）。
［実施例３］ＥＳ細胞より分化誘導したドーパミン産生ニューロンにおけるＭｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子の発現
ＥＳ細胞をイン・ビトロでドーパミン産生ニューロンに分化誘導させた場合に、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子が発現するか否かを検討した。
まず、ＳＤＩＡ法（Kawasaki et. al. Neuron. 2000 28(1):31-40.）に従い、ＥＳ細胞（理研CDB西川氏から提供されたマウスＣＣＥ株、Kawasaki et. al. Neuron. 2000 28(1):31-40.）よりドーパミン産生ニューロンへの分化誘導を行った。誘導後４、６、８、１０、１２日後に細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Qiagen）を用いて全ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。まず、１μｇの全ＲＮＡに対して、ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ(TAKARA)を用いてｃＤＮＡ合成を行った。このうち１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇ相当分のｃＤＮＡを鋳型に用いて以下の反応系でＰＣＲを行った。
１０×ＥｘＴａｑ ２μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ １．６μｌ
ＥｘＴａｑ ０．１μｌ
１００μＭ プライマー 各０．２μｌ
ｃＤＮＡ １μｌ
蒸留水 １４．９μｌ
９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の反応を３５サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。
下記のプライマーをＰＣＲに使用した。
ＴＨ : gttcccaaggaaagtgtcagagttgg（配列番号８９）
gaagctggaaagcctccaggtgttcc（配列番号９０）
ＤＡＴ : ctccgagcagacaccatgaccttagc（配列番号９１）
aggagtagggcttgtctcccaacctg（配列番号９２）
Ｎｕｒｒ１: cactcctgtgtctagctgccagatgc（配列番号９３）
agtgcgaacaccgtagtgctgacagg（配列番号９４）
Ｐｔｘ３ : tgagccgcaggtctgtggatccatcc（配列番号９５）
tccctgttcctggccttagtcctagg（配列番号９６）
Ｅｎ１ : atcctccgagtggacattcacatagg（配列番号９７）
atgtccagcaaatagagatcgctacac（配列番号９８）
なお、Ｍｓｘ１、Ｍｓｘ２、Ｌｍｘ１ａは実施例１のプライマーを使用した。また、Ｐｔｘ３およびＥｎ１は、分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞のマーカーとして知られている。
その結果、Ｍｓｘ１のｍＲＮＡは、ＥＳ細胞（ＣＣＥ）においては発現が認められなかったが、分化誘導の結果、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞のマーカー遺伝子であるＬｍｘ１ａと同様に、４日目から発現が誘導されることが明らかになった（図７）。一方、Ｍｓｘ２のｍＲＮＡは、ＥＳ細胞（ＣＣＥ）においても発現が認められ、分化誘導後に発現が増加することが明らかになった（図７）。
[実施例４]Ｌｒｐ４によりソーティングしたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞におけるＭｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子の発現
次に、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子がドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に発現することを確認するために、マウス１２．５日胚の中脳由来細胞およびＳＤＩＡ分化誘導細胞より、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に選択的に発現するＬｒｐ４をマーカーとして、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞をそれぞれ分離し、これらの細胞におけるＭｓｘ１のｍＲＮＡおよびＭｓｘ２のｍＲＮＡの発現を調べた。
まず、Ｌｒｐ４遺伝子のうち、細胞外領域（１６１−５０２アミノ酸）をコードする遺伝子配列を２９３Ｅ細胞（ATCC）に遺伝子導入して、Ｌｒｐ４タンパク質の細胞外領域を発現させて回収した。回収したタンパク質をハムスター（SLCより入手）に免疫した後、リンパ球細胞を取り出してミエローマ細胞（ATCC）と細胞融合させ、抗Ｌｒｐ４抗体産生ハイブリドーマを得た。
マウス１２．５日胚中脳由来またはＳＤＩＡ法によりイン・ビトロにおいてＥＳ細胞より分化誘導させたドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含む細胞群を、細胞分散バッファー（Invitrogen）を用いて分散させた後、固定・透過処理せずに、抗Ｌｒｐ４モノクローナル抗体（ハイブリドーマ（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３１５および受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３１６）から産生されたものを使用、培養上清 １／２希釈、１％ウシ胎児血清（JRH）、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＳＤＩＡ分化培地（Kawasaki et al. Neuron(2000)28(1):31-40））を用いて４℃で２０分間染色した。その後、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＳＤＩＡ分化培地を用いて４℃で３分間の洗浄を３回行い、ビオチン標識抗ハムスターＩｇＧ抗体（Jackson、１０μｇ／ｍｌ、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＳＤＩＡ分化培地）を用いて４℃で２０分間染色し、同様に洗浄した。そして、ＰＥ標識ストレプトアビジン（Pharmingen、２０μｇ／ｍｌ、１％ウシ胎児血清、１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＳＤＩＡ分化培地）を用いて４℃で２０分間染色し、同様に洗浄した。染色後、セルソーター（ＦＡＣＳ ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ、 Becton Dickinson）によりＬｒｐ４陽性細胞および陰性細胞を分離した（図８）。分離直後の細胞からＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Qiagen）を用いて全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ (TAKARA)を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。制限酵素ＲｓａＩで消化したのち、ａｄ２を付加し、ａｄ２Ｓをプライマーとして、１５サイクルのＰＣＲでｃＤＮＡを増幅して、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型に用いた。増幅条件は、７２℃で５分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の反応を１５サイクル行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。
次に、増幅したｃＤＮＡ ４ｎｇ、０．４ｎｇ、０．０４ｎｇ相当分のｃＤＮＡを鋳型に用いて以下の反応系でＰＣＲを行った。
１０×ＥｘＴａｑ １μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ０．８μｌ
ＥｘＴａｑ ０．０５μｌ
１００μＭ プライマー 各０．１μｌ
ｃＤＮＡ １μｌ
蒸留水 ６．９５μｌ
プライマーは上記配列を使用した。
９４℃で２分インキュベートした後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で２分の増幅反応を行い、最後に７２℃で２分インキュベートした。ＰＣＲの増幅は、Ｌｍｘ１ａ、Ｎｕｒｒ１は２４サイクル、それ以外は２６サイクルで行った。
その結果、マウス１２．５日胚の中脳由来細胞において、Ｍｓｘ１のｍＲＮＡおよびＭｓｘ２のｍＲＮＡは、Ｌｒｐ４陽性細胞集団（すなわち、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞）で強く発現していた（図９）。また、ＳＤＩＡ分化誘導細胞においても、Ｍｓｘ１のｍＲＮＡおよびＭｓｘ２のｍＲＮＡは、Ｌｒｐ４陽性細胞集団で強く発現していた（図９）。よって、Ｍｓｘ１のｍＲＮＡおよびＭｓｘ２のｍＲＮＡは、マウス胎児中脳由来の細胞ばかりでなく、ＳＤＩＡ分化誘導細胞においても、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞において発現していることが明らかになった。したがって、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子は、胎児中脳由来のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞だけでなく、イン・ビトロでＥＳ細胞より分化誘導したドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を識別するのにも有用なマーカーであることが明らかになった。

Claims (41)

  1. Ｍｓｘ１遺伝子もしくはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプライマーからなる、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出することによりドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択するのに用いるための検出剤。
  2. ポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプライマーが、Ｍｓｘ１遺伝子もしくはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなる、請求項１に記載の検出剤。
  3. Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：１で表される塩基配列の１番目〜７１０番目および９６３番目〜１７１３番目、配列番号：３で表される塩基配列の１番目〜６７７番目および９４３番目〜１５４６番目、配列番号：５で表される塩基配列の１番目〜４８４番目および７３６番目〜１３１６番目、配列番号：７で表される塩基配列の１番目〜６１２番目および８６４番目〜１８０１番目、配列番号：９で表される塩基配列の１番目〜７３７番目および９７６番目〜１７２４番目、配列番号：１１で表される塩基配列の１番目〜５２５番目および７７７番目〜１１８９番目、配列番号：１３で表される塩基配列の１番目〜６１２番目および８６４番目〜１８１０番目、配列番号：１５で表される塩基配列の１番目〜７５４番目および９９４番目〜１７５４番目、配列番号：１６で表される塩基配列の１番目〜７４４番目および９９６番目〜１９３５番目、配列番号：１７で表される塩基配列の１番目〜６１０番目および８６４番目〜１８０６番目、配列番号：１９で表される塩基配列の１番目〜６１０番目および８６４番目〜１７８５番目、配列番号：２１で表される塩基配列の１番目〜１４５６番目および１７１０番目〜１９０５番目、配列番号：２３で表される塩基配列の１番目〜６２５番目および８９１番目〜１０６２番目、配列番号：２５で表される塩基配列の１番目〜７０９および９６３番目〜１８９５番目番目、配列番号：２７で表される塩基配列の１番目〜５２０番目および７８６番目〜１３１０番目、配列番号：２９で表される塩基配列の１番目〜５１０番目および７６７番目〜１２５９番目、配列番号：３１で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜２１８０番目、配列番号：３３で表される塩基配列の１番目〜４６８番目および７０７番目〜１１３８番目、配列番号：３５で表される塩基配列の１番目〜４３５番目および６７４番目〜１１４３番目、配列番号：３７で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜１１６４番目、配列番号：３９で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜１１６４番目、配列番号：４１で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜２０４８番目、配列番号：４３で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜２１８２番目、配列番号：４５で表される塩基配列の１番目〜４１３番目および６５１番目〜８０４番目、配列番号：４７で表される塩基配列の１番目〜４３１番目および６７０番目〜２６０５番目、配列番号：４９で表される塩基配列の１番目〜４３５番目および６７４番目〜２１３６番目、配列番号：５１で表される塩基配列の１番目〜７７８番目および１０１５番目〜１４５２番目、配列番号：５３で表される塩基配列の１番目〜７８０番目および１０１７番目〜１４５３番目、配列番号：５５で表される塩基配列の１番目〜３７０番目および６０９番目〜８００番目、配列番号：５７で表される塩基配列の１番目〜２９番目および２６７番目〜４２０番目、配列番号：５９で表される塩基配列の１番目〜１３４０番目および１５７８番目〜１７３１番目、配列番号：６１で表される塩基配列の１番目〜５４１番目および７７８番目〜２２２５番目、配列番号：６３で表される塩基配列の１番目〜４０４番目および６５１番目〜８０４番目、配列番号：６５で表される塩基配列の１番目〜６３２番目、配列番号：６７で表される塩基配列の１番目〜４８９番目および７２８番目〜１１０７番目、並びに配列番号：６９で表される塩基配列の１番目〜４８７番目および７０８番目〜２５６９番目からなる群から選択されるヌクレオチド配列の一部または全部を含んでなるヌクレオチド配列である、請求項１または２に記載の検出剤。
  4. ポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプライマーが、少なくとも１５塩基長である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出剤。
  5. 二種以上のポリヌクレオチドプライマーからなるポリヌクレオチドプライマーセットである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の検出剤。
  6. Ｍｓｘ１タンパク質もしくはＭｓｘ２タンパク質またはそれらの一部に対する抗体からなる、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出することによりドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択するのに用いるための検出剤。
  7. Ｍｓｘ１タンパク質もしくはＭｓｘ２タンパク質またはそれらの一部が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：４で表されるアミノ酸配列の１番目〜２１６番目および３１５番目〜３７０番目、配列番号：６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４９番目および２４８番目〜２９９番目、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４９番目および２４８番目〜３０３番目、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜３２３番目、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列の１番目〜４７２番目および５７１番目〜６３４番目、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列の１番目〜２０８番目および２９８番目〜３５３番目、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１３８番目および２３７番目〜２８８番目、配列番号：３０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１００番目および１９９番目〜２４２番目、配列番号：３２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１８番目〜２６７番目、配列番号：３４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１８番目〜２６８番目、配列番号：３６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１１９番目および２１８番目〜２６６番目、配列番号：５２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２１番目および２２０番目〜２６８番目、配列番号：５４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２１番目および２２０番目〜２６９番目、配列番号：５６で表されるアミノ酸配列の１番目〜９番目および９９番目〜１３９番目、配列番号：５８で表されるアミノ酸配列の１番目〜９番目および９９番目〜１３９番目、配列番号：６０で表されるアミノ酸配列の１番目〜４６６番目および５２７番目〜５７６番目、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：６４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：６６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目、配列番号：６８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１１２番目および２１１番目〜２５９番目、並びに配列番号：７０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１１２番目および２１１番目〜２５９番目からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残基または全部を含んでなるタンパク質である、請求項６に記載の検出剤。
  8. Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出する工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択する方法。
  9. Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項８に記載の方法：
    （ａ）被験細胞試料由来のポリヌクレオチドと、Ｍｓｘ１遺伝子もしくはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程；および
    （ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程。
  10. 工程（ａ）において、被験細胞試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、ポリヌクレオチドプローブと接触させる、請求項９に記載の方法。
  11. Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項８に記載の方法：
    （ｃ）被験細胞試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、Ｍｓｘ１遺伝子もしくはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプライマー、または二種以上の該ポリヌクレオチドプライマーからなるポリヌクレオチドプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施する工程；および
    （ｄ）形成された増幅産物を検出する工程。
  12. 工程（ｃ）において、被験細胞試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を鋳型として用いる、請求項１１に記載の方法。
  13. ポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプライマーが、Ｍｓｘ１遺伝子もしくはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなる、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：１で表される塩基配列の１番目〜７１０番目および９６３番目〜１７１３番目、配列番号：３で表される塩基配列の１番目〜６７７番目および９４３番目〜１５４６番目、配列番号：５で表される塩基配列の１番目〜４８４番目および７３６番目〜１３１６番目、配列番号：７で表される塩基配列の１番目〜６１２番目および８６４番目〜１８０１番目、配列番号：９で表される塩基配列の１番目〜７３７番目および９７６番目〜１７２４番目、配列番号：１１で表される塩基配列の１番目〜５２５番目および７７７番目〜１１８９番目、配列番号：１３で表される塩基配列の１番目〜６１２番目および８６４番目〜１８１０番目、配列番号：１５で表される塩基配列の１番目〜７５４番目および９９４番目〜１７５４番目、配列番号：１６で表される塩基配列の１番目〜７４４番目および９９６番目〜１９３５番目、配列番号：１７で表される塩基配列の１番目〜６１０番目および８６４番目〜１８０６番目、配列番号：１９で表される塩基配列の１番目〜６１０番目および８６４番目〜１７８５番目、配列番号：２１で表される塩基配列の１番目〜１４５６番目および１７１０番目〜１９０５番目、配列番号：２３で表される塩基配列の１番目〜６２５番目および８９１番目〜１０６２番目、配列番号：２５で表される塩基配列の１番目〜７０９および９６３番目〜１８９５番目番目、配列番号：２７で表される塩基配列の１番目〜５２０番目および７８６番目〜１３１０番目、配列番号：２９で表される塩基配列の１番目〜５１０番目および７６７番目〜１２５９番目、配列番号：３１で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜２１８０番目、配列番号：３３で表される塩基配列の１番目〜４６８番目および７０７番目〜１１３８番目、配列番号：３５で表される塩基配列の１番目〜４３５番目および６７４番目〜１１４３番目、配列番号：３７で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜１１６４番目、配列番号：３９で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜１１６４番目、配列番号：４１で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜２０４８番目、配列番号：４３で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜２１８２番目、配列番号：４５で表される塩基配列の１番目〜４１３番目および６５１番目〜８０４番目、配列番号：４７で表される塩基配列の１番目〜４３１番目および６７０番目〜２６０５番目、配列番号：４９で表される塩基配列の１番目〜４３５番目および６７４番目〜２１３６番目、配列番号：５１で表される塩基配列の１番目〜７７８番目および１０１５番目〜１４５２番目、配列番号：５３で表される塩基配列の１番目〜７８０番目および１０１７番目〜１４５３番目、配列番号：５５で表される塩基配列の１番目〜３７０番目および６０９番目〜８００番目、配列番号：５７で表される塩基配列の１番目〜２９番目および２６７番目〜４２０番目、配列番号：５９で表される塩基配列の１番目〜１３４０番目および１５７８番目〜１７３１番目、配列番号：６１で表される塩基配列の１番目〜５４１番目および７７８番目〜２２２５番目、配列番号：６３で表される塩基配列の１番目〜４０４番目および６５１番目〜８０４番目、配列番号：６５で表される塩基配列の１番目〜６３２番目、配列番号：６７で表される塩基配列の１番目〜４８９番目および７２８番目〜１１０７番目、並びに配列番号：６９で表される塩基配列の１番目〜４８７番目および７０８番目〜２５６９番目からなる群から選択されるヌクレオチド配列の一部または全部を含んでなるヌクレオチド配列である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. ポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプライマーが、少なくとも１５塩基長である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項８に記載の方法：
    （ｅ）Ｍｓｘ１タンパク質もしくはＭｓｘ２タンパク質またはそれらの一部に対する抗体と被験細胞試料由来のタンパク質とを接触させる工程； および
    （ｆ）抗原抗体複合体を検出する工程。
  17. Ｍｓｘ１タンパク質もしくはＭｓｘ２タンパク質またはそれらの一部が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：４で表されるアミノ酸配列の１番目〜２１６番目および３１５番目〜３７０番目、配列番号：６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４９番目および２４８番目〜２９９番目、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４９番目および２４８番目〜３０３番目、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜３２３番目、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列の１番目〜４７２番目および５７１番目〜６３４番目、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列の１番目〜２０８番目および２９８番目〜３５３番目、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１３８番目および２３７番目〜２８８番目、配列番号：３０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１００番目および１９９番目〜２４２番目、配列番号：３２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１８番目〜２６７番目、配列番号：３４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１８番目〜２６８番目、配列番号：３６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１１９番目および２１８番目〜２６６番目、配列番号：５２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２１番目および２２０番目〜２６８番目、配列番号：５４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２１番目および２２０番目〜２６９番目、配列番号：５６で表されるアミノ酸配列の１番目〜９番目および９９番目〜１３９番目、配列番号：５８で表されるアミノ酸配列の１番目〜９番目および９９番目〜１３９番目、配列番号：６０で表されるアミノ酸配列の１番目〜４６６番目および５２７番目〜５７６番目、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：６４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：６６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目、配列番号：６８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１１２番目および２１１番目〜２５９番目、並びに配列番号：７０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１１２番目および２１１番目〜２５９番目からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残基または全部を含んでなるタンパク質である、請求項１６に記載の方法。
  18. 被験細胞試料が、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞へ分化させる処理が行われたＥＳ細胞である、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 分化させる処理が、ＳＤＩＡ法によるものである、請求項１８に記載の方法。
  20. 被験細胞試料が、胎児中脳腹側領域から得られた細胞である、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  21. 工程（ａ）、工程（ｃ）、または工程（ｅ）において、被験細胞試料として、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現が検出された細胞を使用することを特徴とする、請求項９〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 工程（ｂ）、工程（ｄ）、または工程（ｆ）の後に、
    （ｇ）Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出する工程
    を更に含んでなる、請求項９〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. Ｍｓｘ１遺伝子もしくはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプローブを少なくとも含んでなる、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出することによりドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択するためのキット。
  24. Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでなる請求項２３に記載のキット。
  25. Ｍｓｘ１遺伝子もしくはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプライマー、または二種以上の該ポリヌクレオチドプライマーからなるポリヌクレオチドプライマーセットを少なくとも含んでなる、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出することによりドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択するためのキット。
  26. Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでなる請求項２５に記載のキット。
  27. ポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプライマーが、Ｍｓｘ１遺伝子もしくはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなる、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のキット。
  28. Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：１で表される塩基配列の１番目〜７１０番目および９６３番目〜１７１３番目、配列番号：３で表される塩基配列の１番目〜６７７番目および９４３番目〜１５４６番目、配列番号：５で表される塩基配列の１番目〜４８４番目および７３６番目〜１３１６番目、配列番号：７で表される塩基配列の１番目〜６１２番目および８６４番目〜１８０１番目、配列番号：９で表される塩基配列の１番目〜７３７番目および９７６番目〜１７２４番目、配列番号：１１で表される塩基配列の１番目〜５２５番目および７７７番目〜１１８９番目、配列番号：１３で表される塩基配列の１番目〜６１２番目および８６４番目〜１８１０番目、配列番号：１５で表される塩基配列の１番目〜７５４番目および９９４番目〜１７５４番目、配列番号：１６で表される塩基配列の１番目〜７４４番目および９９６番目〜１９３５番目、配列番号：１７で表される塩基配列の１番目〜６１０番目および８６４番目〜１８０６番目、配列番号：１９で表される塩基配列の１番目〜６１０番目および８６４番目〜１７８５番目、配列番号：２１で表される塩基配列の１番目〜１４５６番目および１７１０番目〜１９０５番目、配列番号：２３で表される塩基配列の１番目〜６２５番目および８９１番目〜１０６２番目、配列番号：２５で表される塩基配列の１番目〜７０９および９６３番目〜１８９５番目番目、配列番号：２７で表される塩基配列の１番目〜５２０番目および７８６番目〜１３１０番目、配列番号：２９で表される塩基配列の１番目〜５１０番目および７６７番目〜１２５９番目、配列番号：３１で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜２１８０番目、配列番号：３３で表される塩基配列の１番目〜４６８番目および７０７番目〜１１３８番目、配列番号：３５で表される塩基配列の１番目〜４３５番目および６７４番目〜１１４３番目、配列番号：３７で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜１１６４番目、配列番号：３９で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜１１６４番目、配列番号：４１で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜２０４８番目、配列番号：４３で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜２１８２番目、配列番号：４５で表される塩基配列の１番目〜４１３番目および６５１番目〜８０４番目、配列番号：４７で表される塩基配列の１番目〜４３１番目および６７０番目〜２６０５番目、配列番号：４９で表される塩基配列の１番目〜４３５番目および６７４番目〜２１３６番目、配列番号：５１で表される塩基配列の１番目〜７７８番目および１０１５番目〜１４５２番目、配列番号：５３で表される塩基配列の１番目〜７８０番目および１０１７番目〜１４５３番目、配列番号：５５で表される塩基配列の１番目〜３７０番目および６０９番目〜８００番目、配列番号：５７で表される塩基配列の１番目〜２９番目および２６７番目〜４２０番目、配列番号：５９で表される塩基配列の１番目〜１３４０番目および１５７８番目〜１７３１番目、配列番号：６１で表される塩基配列の１番目〜５４１番目および７７８番目〜２２２５番目、配列番号：６３で表される塩基配列の１番目〜４０４番目および６５１番目〜８０４番目、配列番号：６５で表される塩基配列の１番目〜６３２番目、配列番号：６７で表される塩基配列の１番目〜４８９番目および７２８番目〜１１０７番目、並びに配列番号：６９で表される塩基配列の１番目〜４８７番目および７０８番目〜２５６９番目からなる群から選択されるヌクレオチド配列の一部または全部を含んでなるヌクレオチド配列である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載のキット。
  29. ポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプライマーが、少なくとも１５塩基長である、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載のキット。
  30. Ｍｓｘ１タンパク質もしくはＭｓｘ２タンパク質またはそれらの一部に対する抗体を少なくとも含んでなる、Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出することによりドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択するためのキット。
  31. Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでなる請求項３０に記載のキット。
  32. Ｍｓｘ１タンパク質もしくはＭｓｘ２タンパク質またはそれらの一部が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：４で表されるアミノ酸配列の１番目〜２１６番目および３１５番目〜３７０番目、配列番号：６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４９番目および２４８番目〜２９９番目、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４９番目および２４８番目〜３０３番目、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜３２３番目、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列の１番目〜４７２番目および５７１番目〜６３４番目、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列の１番目〜２０８番目および２９８番目〜３５３番目、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１３８番目および２３７番目〜２８８番目、配列番号：３０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１００番目および１９９番目〜２４２番目、配列番号：３２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１８番目〜２６７番目、配列番号：３４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１８番目〜２６８番目、配列番号：３６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１１９番目および２１８番目〜２６６番目、配列番号：５２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２１番目および２２０番目〜２６８番目、配列番号：５４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２１番目および２２０番目〜２６９番目、配列番号：５６で表されるアミノ酸配列の１番目〜９番目および９９番目〜１３９番目、配列番号：５８で表されるアミノ酸配列の１番目〜９番目および９９番目〜１３９番目、配列番号：６０で表されるアミノ酸配列の１番目〜４６６番目および５２７番目〜５７６番目、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：６４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：６６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目、配列番号：６８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１１２番目および２１１番目〜２５９番目、並びに配列番号：７０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１１２番目および２１１番目〜２５９番目からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残基または全部を含んでなるタンパク質である、請求項３０または３１に記載のキット。
  33. 下記工程を含んでなる、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法：
    （ｉ）ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞に分化し得る細胞と、被験物質とを接触させる工程；および
    （ｉｉ）被験物質を接触させた後の前記細胞におけるＭｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出する工程。
  34. （ｉｉｉ）被験物質を接触させた後の前記細胞における、Ｍｓｘ１遺伝子およびＭｓｘ２遺伝子以外のドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー遺伝子の発現を検出する工程
    を更に含んでなる請求項３３に記載の方法。
  35. ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞の製造方法であって、
    （ｉｖ）ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含み得る細胞を取得する工程；
    （ｖ）請求項８〜２２のいずれか一項に記載の方法を用いて、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択する工程；および
    （ｖｉ）工程（ｖ）で検出または選択された細胞を培養する工程
    を含んでなる、方法。
  36. Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出することによりドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択するための、Ｍｓｘ１遺伝子もしくはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの使用。
  37. ハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドが、Ｍｓｘ１遺伝子もしくはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなる、請求項３６に記載の使用。
  38. Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：１で表される塩基配列の１番目〜７１０番目および９６３番目〜１７１３番目、配列番号：３で表される塩基配列の１番目〜６７７番目および９４３番目〜１５４６番目、配列番号：５で表される塩基配列の１番目〜４８４番目および７３６番目〜１３１６番目、配列番号：７で表される塩基配列の１番目〜６１２番目および８６４番目〜１８０１番目、配列番号：９で表される塩基配列の１番目〜７３７番目および９７６番目〜１７２４番目、配列番号：１１で表される塩基配列の１番目〜５２５番目および７７７番目〜１１８９番目、配列番号：１３で表される塩基配列の１番目〜６１２番目および８６４番目〜１８１０番目、配列番号：１５で表される塩基配列の１番目〜７５４番目および９９４番目〜１７５４番目、配列番号：１６で表される塩基配列の１番目〜７４４番目および９９６番目〜１９３５番目、配列番号：１７で表される塩基配列の１番目〜６１０番目および８６４番目〜１８０６番目、配列番号：１９で表される塩基配列の１番目〜６１０番目および８６４番目〜１７８５番目、配列番号：２１で表される塩基配列の１番目〜１４５６番目および１７１０番目〜１９０５番目、配列番号：２３で表される塩基配列の１番目〜６２５番目および８９１番目〜１０６２番目、配列番号：２５で表される塩基配列の１番目〜７０９および９６３番目〜１８９５番目番目、配列番号：２７で表される塩基配列の１番目〜５２０番目および７８６番目〜１３１０番目、配列番号：２９で表される塩基配列の１番目〜５１０番目および７６７番目〜１２５９番目、配列番号：３１で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜２１８０番目、配列番号：３３で表される塩基配列の１番目〜４６８番目および７０７番目〜１１３８番目、配列番号：３５で表される塩基配列の１番目〜４３５番目および６７４番目〜１１４３番目、配列番号：３７で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜１１６４番目、配列番号：３９で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜１１６４番目、配列番号：４１で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜２０４８番目、配列番号：４３で表される塩基配列の１番目〜４７３番目および７１２番目〜２１８２番目、配列番号：４５で表される塩基配列の１番目〜４１３番目および６５１番目〜８０４番目、配列番号：４７で表される塩基配列の１番目〜４３１番目および６７０番目〜２６０５番目、配列番号：４９で表される塩基配列の１番目〜４３５番目および６７４番目〜２１３６番目、配列番号：５１で表される塩基配列の１番目〜７７８番目および１０１５番目〜１４５２番目、配列番号：５３で表される塩基配列の１番目〜７８０番目および１０１７番目〜１４５３番目、配列番号：５５で表される塩基配列の１番目〜３７０番目および６０９番目〜８００番目、配列番号：５７で表される塩基配列の１番目〜２９番目および２６７番目〜４２０番目、配列番号：５９で表される塩基配列の１番目〜１３４０番目および１５７８番目〜１７３１番目、配列番号：６１で表される塩基配列の１番目〜５４１番目および７７８番目〜２２２５番目、配列番号：６３で表される塩基配列の１番目〜４０４番目および６５１番目〜８０４番目、配列番号：６５で表される塩基配列の１番目〜６３２番目、配列番号：６７で表される塩基配列の１番目〜４８９番目および７２８番目〜１１０７番目、並びに配列番号：６９で表される塩基配列の１番目〜４８７番目および７０８番目〜２５６９番目からなる群から選択されるヌクレオチド配列の一部または全部を含んでなるヌクレオチド配列である、請求項３６または３７に記載の使用。
  39. ハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドが、少なくとも１５塩基長である、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の使用。
  40. Ｍｓｘ１遺伝子またはＭｓｘ２遺伝子の発現を検出することによりドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を検出または選択するための、Ｍｓｘ１タンパク質もしくはＭｓｘ２タンパク質またはそれらの一部に対する抗体の使用。
  41. Ｍｓｘ１タンパク質もしくはＭｓｘ２タンパク質またはそれらの一部が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：４で表されるアミノ酸配列の１番目〜２１６番目および３１５番目〜３７０番目、配列番号：６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４９番目および２４８番目〜２９９番目、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４９番目および２４８番目〜３０３番目、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜３２３番目、配列番号：１８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列の１番目〜４７２番目および５７１番目〜６３４番目、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列の１番目〜２０８番目および２９８番目〜３５３番目、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１４３番目および２４２番目〜２９７番目、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１３８番目および２３７番目〜２８８番目、配列番号：３０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１００番目および１９９番目〜２４２番目、配列番号：３２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１８番目〜２６７番目、配列番号：３４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１８番目〜２６８番目、配列番号：３６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：３８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１１９番目および２１８番目〜２６６番目、配列番号：５２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２１番目および２２０番目〜２６８番目、配列番号：５４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２１番目および２２０番目〜２６９番目、配列番号：５６で表されるアミノ酸配列の１番目〜９番目および９９番目〜１３９番目、配列番号：５８で表されるアミノ酸配列の１番目〜９番目および９９番目〜１３９番目、配列番号：６０で表されるアミノ酸配列の１番目〜４６６番目および５２７番目〜５７６番目、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：６４で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目および２１９番目〜２６７番目、配列番号：６６で表されるアミノ酸配列の１番目〜１２０番目、配列番号：６８で表されるアミノ酸配列の１番目〜１１２番目および２１１番目〜２５９番目、並びに配列番号：７０で表されるアミノ酸配列の１番目〜１１２番目および２１１番目〜２５９番目からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６アミノ酸残基または全部を含んでなるタンパク質である、請求項４０に記載の使用。
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