JP5523346B2 - Neph3を用いた膵臓前駆細胞の取得方法 - Google Patents
Neph3を用いた膵臓前駆細胞の取得方法 Download PDFInfo
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Description
〔2〕 内胚葉系細胞試料が中枢神経除去系細胞試料である、〔1〕に記載の方法、
〔3〕 内胚葉系細胞試料が腹部由来細胞試料である、〔1〕に記載の方法、
〔4〕 Pdx-1 (Pancreatic and duodenal homeobox factor-1)、Ptf1a (pancreas specific transcription factor-1a)、Cpa1 (Carboxypeptidase A1 (pancreatic))、EPPK1(エピプラキン1)のいずれか一つ、またはそれらの任意の組み合わせの遺伝子の翻訳産物および/または転写産物の発現を識別、検出、同定、回収、分離および/または取得する工程をさらに含む、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の方法、
〔5〕 Pdx-1 (Pancreatic and duodenal homeobox factor-1)およびCpa1 (Carboxypeptidase A1 (pancreatic))の組み合わせである、〔4〕に記載の方法、
〔6〕 上記識別、検出および/または同定する工程、および/または回収、分離および/または取得する工程が、免疫化学的方法によってなされる工程である、〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の方法、
〔7〕 〔1〕から〔6〕のいずれかに記載の方法により製造された細胞集団、
〔8〕 内胚葉系細胞試料におけるNeph3遺伝子の翻訳産物の発現を識別、検出および/または同定する工程を含む、膵臓前駆細胞を識別、検出、同定、回収、分離および/または取得する方法、
〔9〕 内胚葉系細胞試料が中枢神経除去系細胞試料である、〔8〕に記載の方法、
〔10〕 内胚葉系細胞試料が腹部由来細胞試料である、〔8〕に記載の方法、
〔11〕 Pdx-1 (Pancreatic and duodenal homeobox factor-1)、Ptf1a (pancreas specific transcription factor-1a)、Cpa1 (Carboxypeptidase A1 (pancreatic))、EPPK1(エピプラキン1)のいずれか一つ、またはそれらの任意の組み合わせの遺伝子の翻訳産物および/または転写産物の発現を識別、検出、同定、回収、分離および/または取得する工程をさらに含む、〔8〕から〔10〕のいずれかに記載の方法、
〔12〕 Pdx-1 (Pancreatic and duodenal homeobox factor-1)およびCpa1 (Carboxypeptidase A1 (pancreatic))の組み合わせである、〔11〕に記載の方法、
〔13〕 膵臓前駆細胞を識別、検出、同定、回収、分離および/または取得する方法が、免疫化学的方法である〔8〕から〔12〕のいずれかに記載の方法。
本発明は、膵臓前駆細胞の選択的マーカー遺伝子Neph3の発現を指標とする膵臓前駆細胞の検出方法を提供する。本発明においてNeph3遺伝子は、一般にNeph3およびそのホモログまたはカウンターパートとして知られる遺伝子が含まれ、65B13遺伝子とも呼ばれる(WO 2004/038018)。Neph3蛋白質とは、Neph3遺伝子にコードされる蛋白質を言う。具体的には、本発明におけるNeph3遺伝子の一例として、該遺伝子のオルタナティブアイソフォームである65B13-a(配列番号:1)及び65B13-b(配列番号:3)と呼ばれる2種の遺伝子を挙げることができる(それぞれの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を配列番号:2および4に示す)。65B13-aのコード領域は、配列番号:1の178番目〜2277番目で700アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そのうち178番目〜228番目の配列にコードされる17アミノ酸残基はシグナル配列、1717番目〜1767番目の配列にコードされる17アミノ酸残基は膜貫通領域であった。それに対し、65B13-bのコード領域は、配列番号:3の127番目〜2076番目で650アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち127番目〜178番目の配列にコードされる17アミノ酸残基はシグナル配列、1516番目〜1566番目の配列にコードされる17アミノ酸残基は膜貫通領域である。膜貫通領域よりN末端側が細胞外領域に相当し、具体的には65B13-aにおいては229〜1716番目にコードされるアミノ酸配列であり、65B13-bにおいては179〜1515番目にコードされるアミノ酸配列である。
(i)配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、または 21のコード配列を含むポリヌクレオチド。
(ii)配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、または22のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、膵臓前駆細胞で発現するポリヌクレオチド。
(iii)配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、または 21のコード配列において、1または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および/または付加(付加とは、例えば一端または両端への付加)がなされた塩基配列を含み、膵臓前駆細胞で発現するポリヌクレオチド。
(iv)配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、または 21がコードするアミノ酸配列(配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、または22のアミノ酸配列)において、1または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および/または付加(付加とは、例えば一端または両端への付加)がなされたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、膵臓前駆細胞で発現するポリヌクレオチド。
(v)配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、または 21のコード配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、膵臓前駆細胞で発現するポリヌクレオチド。
(vi)配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、または 21のコード配列と高い同一性を有する塩基配列を含み、膵臓前駆細胞で発現するポリヌクレオチド。
および
(vii)配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、または 21がコードするアミノ酸配列(配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、または22のアミノ酸配列)と高い同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、膵臓前駆細胞で発現するポリヌクレオチド。
(i)配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、または22のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(ii)配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、または22のアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および/または付加(付加とは、例えば一端または両端への付加)がなされたアミノ酸配列を含み、膵臓前駆細胞で発現するポリペプチド。
(iii)配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、または22のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド(例えば配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、または 21のコード配列からなるポリヌクレオチド)の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、膵臓前駆細胞で発現するポリヌクレオチドがコードするポリペプチド。
および
(iv)配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、または22のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含み、膵臓前駆細胞で発現するポリペプチド。
本発明において膵臓前駆細胞(pancreatic progenitor cells)とは、膵臓細胞を指向した前駆細胞を言う。より具体的には、膵臓前駆細胞は、成熟した膵臓を構成する少なくともいずれかの細胞に分化するよう主として運命付けられた細胞であって、まだ最終分化していない細胞、または該細胞と同等の表現型を有する細胞を言う。このような細胞は内胚葉細胞であってよく、例えば腸管内胚葉系列に属する内胚葉細胞に由来してよい。膵臓前駆細胞は、例えば胚の膵臓原基に含まれる細胞またはその培養物であってもよく、あるいは内胚葉性幹細胞、腸管未分化内胚葉、胚性幹(ES)細胞や他の多能性幹(PS)細胞などから膵臓前駆細胞を分化誘導した細胞であってもよい。ここで、「幹細胞」とは、ある細胞に変化するようにという指示を受けると特定の細胞に変身、すなわち分化する能力を持っている細胞をいう。また、変化を遂げる前の未分化の状態で長期間にわたって自らを複製、再生する能力も備えている。胚からは胚性幹細胞(ES細胞)、成人からは成体幹細胞(iPS細胞)、胎児からは胚生殖細胞を採り出すことができるが、いずれの細胞も本発明で使用する幹細胞に含まれる。ES細胞は、受精卵が分化して胎児に発展するまでの状態である胚の初期段階から採り出されるもので、身体のどのような細胞にも成長できる性質を持っているため多能性幹細胞ともいう。ES細胞は、受精後5、6日目の胚盤胞の内層細胞(内部塊細胞)から取り出して培養することができる。そのほか、皮膚細胞などの体細胞をOct3、Sox2、Klf4などを導入して初期化し、多能性を持たせたiPS細胞(誘導多能性幹細胞)も人工的な多能性幹細胞である。さらに、脂肪細胞から誘導される多能性を有する細胞も幹細胞に含むことができる。これらES細胞、iPS細胞および脂肪細胞から誘導される多能性を有する細胞等の種々の幹細胞も種々の細胞に分化できるものであれば本願発明に使用し得る。
本発明において、「内胚葉系細胞試料」とは、内胚葉系の細胞を主とする細胞試料を意味する。内胚葉は、脊椎動物の初期胚に存在するすべての体細胞へ分化する能力をもった未分化な細胞(全能性細胞)から形成される。受精卵は体細胞分裂により、まず胞胚というボール状の細胞塊になる。この表面の一部がくぼみ(原腸陥入)、陥入した部分は原腸となる。この段階を原腸胚という。こうして細胞の外側と内側(原腸側)の違いができ、外側が外胚葉、内側が内胚葉となる。この内胚葉およびそれに由来する内胚葉系列の細胞(endoderm lineage cells)が内胚葉系の細胞である。また内胚葉系の細胞は、多能性幹細胞などの内胚葉細胞前駆細胞から人工的に分化誘導して作製することもできる。
本発明の「内胚葉系細胞試料」には、内胚葉系細胞を純粋に含む細胞試料であってもいいし、一部に他の細胞を含む試料であってもよい。好ましくは、本発明の内胚葉系細胞試料は、試料に含まれる全細胞に占める内胚葉の細胞の割合が50%以上、より好ましくは60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、または100%である。Neph3遺伝子の翻訳産物又は転写産物を用いて膵臓前駆細胞を取得できる細胞試料であればいずれの細胞試料であっても本発明の「内胚葉系細胞試料」に含まれる。本発明においては、内胚葉をある程度選択または濃縮等の工程を行った後に「内胚葉系細胞試料」とすることが好ましい。
内胚葉系細胞試料は、前記に挙げた文献をはじめとして幹細胞から誘導する公知の方法で取得することができる。また、胎児から取得された試料を使用することもできる。
「中枢神経除去系細胞試料」とは、中枢神経系細胞(central nervus system cells)および中枢神経系細胞に分化し得る細胞を除去した細胞試料を意味する。また「神経除去系細胞試料」とは、神経細胞に分化し得る細胞および神経細胞を除去した細胞試料を意味する。「神経細胞に分化し得る細胞」とは、外胚葉細胞であって神経に分化する前の前駆細胞を意味する。外胚葉は、脊椎動物の初期胚に存在するすべての体細胞へ分化する能力をもった未分化な細胞(全能性細胞)から形成される。受精卵は体細胞分裂により、まず胞胚というボール状の細胞塊になる。この表面の一部がくぼみ(原腸陥入)、陥入した部分は原腸となる。この段階を原腸胚という。こうして細胞の外側と内側(原腸側)の違いができ、外側が外胚葉、内側が内胚葉となる。この外胚葉およびそれに由来する外胚葉系列の細胞(ectoderm lineage cells)が外胚葉系細胞である。また、多能性幹細胞などの外胚葉細胞前駆細胞から人工的に外胚葉系列の細胞を分化誘導して作製された細胞も、外胚葉系細胞に含まれる。本発明においては、中枢神経除去系細胞試料として、好ましくは神経除去系細胞試料、より好ましくは外胚葉系細胞除去細胞試料 (ectoderm-lineage-cell depleted cell sample) が用いられる。神経除去系細胞試料は、例えば神経細胞系譜の細胞を除去した細胞試料、すなわち神経系細胞除去細胞試料 (neuronal-lineage-cell depleted cell sample) であってよく、中枢神経除去系細胞試料は、例えば中枢神経系(CNS)系譜の細胞を除去した細胞試料、すなわちCNS系細胞除去細胞試料 (CNS-lineage-cell depleted cell sample) であってよい。これらの細胞試料は、外胚葉細胞除去細胞試料 (ectodermal cell depleted cell sample) であってもよい。
神経細胞に分化し得る細胞および神経細胞は、幹細胞から誘導される神経に成り得る細胞および神経細胞も含まれる。幹細胞から誘導される神経に成り得る細胞および神経細胞を除去した細胞試料も「神経除去系細胞試料」に含まれる。
この「神経除去系細胞試料」は、神経細胞を純粋に除去した細胞試料であってもいいし、一部に他の細胞を含む試料であってもよい。好ましくは、本発明の神経除去系細胞試料は、神経細胞および神経細胞に分化し得る細胞(但し内胚葉に分化し得る細胞ではないもの)が完全に除去された細胞試料であって、内胚葉系細胞を含む細胞試料である。Neph3遺伝子の翻訳産物又は転写産物を用いて膵臓前駆細胞を取得できる細胞試料であればいずれの細胞試料であっても本発明の「神経除去系細胞試料」に含まれる。本発明においては、神経に成り得る細胞および神経細胞をある程度除去等の工程を行った後に「神経除去系細胞試料」とすることが好ましい。
「神経除去系細胞試料」は、前記に挙げた文献をはじめとして幹細胞から誘導する公知の方法で神経に成り得る細胞を除去することで取得することができる。
「腹部由来細胞試料」とは、腹部から取得することができる細胞試料をいう。この場合、胎児の腹部から取得することができる細胞が好ましい。ここで、「腹部」とは、頭部、上肢(腕)および下肢(脚)を除いた部分をいう。
腹部由来細胞試料は、純粋に腹部の細胞のみからなる細胞試料であってもいいし、一部に他の細胞を含む試料であってもよい。好ましくは、本発明の腹部由来細胞試料は、試料に含まれる全細胞に占める腹部の細胞の割合が50%以上、より好ましくは60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、または95%以上である。Neph3遺伝子の翻訳産物又は転写産物を用いて膵臓前駆細胞を取得できる細胞試料であればいずれの細胞試料であっても本発明の「腹部由来細胞試料」に含まれる。本発明においては、腹部の細胞をある程度選択または濃縮等の工程を行った後に「腹部由来細胞試料」とすることが好ましい。
本発明の方法においては、Neph3遺伝子の発現を検出することにより、膵臓前駆細胞を検出(識別、同定、回収、調製、選択、濃縮、分離、および/または取得等の意味も含む)する。具体的には、本発明の膵臓前駆細胞を検出する方法は、膵臓前駆細胞を含み得る細胞試料におけるNeph3遺伝子の発現を検出する工程を含む。膵臓前駆細胞を含み得る細胞試料とは、膵臓前駆細胞を検出(識別、同定、回収、調製、選択、濃縮、分離、および/または取得等の意味も含む)したい細胞試料であり、例えば膵臓前駆細胞を含むことが知られている細胞試料または含むことが期待される細胞試料であってよい。細胞試料は、好ましくは膵臓前駆細胞を含む細胞試料である。細胞試料において、Neph3の発現が検出されれば、膵臓前駆細胞が含まれることが示唆され、Neph3の発現が検出されなければ、膵臓前駆細胞が含まれないことが示唆される。またNeph3を発現する細胞が検出されれば、その細胞は膵臓前駆細胞であることが示唆される。その細胞を回収することにより、膵臓前駆細胞を単離することができる。
より具体的には、例えば転写産物またはそのcDNAの検出は、本発明のNeph3遺伝子の転写産物またはその相補鎖を特異的に検出する試薬を用いて実施することができる。このような試薬としては、例えば該転写産物またはその相補鎖に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられる。ポリヌクレオチドは、Neph3転写産物の検出ができればその鎖長は特に制限されず、所謂オリゴヌクレオチドと呼ばれる短いポリペプチドであってもよい。長いポリヌクレオチドは、例えばプローブ等として用いることが可能であり、短いポリヌクレオチドはプローブの他、RT-PCR等のプライマーやDNAチップ等として利用することができる。一般的に、転写産物を検出するためのポリヌクレオチドは、Neph3遺伝子の転写産物の配列またはその相補配列の連続する少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり、好ましくは連続する少なくとも16、17、18、19、20、22、25、27、30、35、40、または50ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドは、膵臓前駆細胞を検出するためのプライマーおよびプローブとして有用である。プライマーとして用いる場合、ポリヌクレオチドの長さは、通常200塩基以下、好ましくは150以下、100以下、80以下、60以下、または50以下である。プローブとして用いる場合、ポリヌクレオチドの長さは、通常5000塩基以下、好ましくは4000以下、3000以下、2000以下、1000以下、または800以下である。
(a)被験細胞試料由来のmRNAまたは該mRNAから調製したcDNAを、Neph3遺伝子の転写産物またはその相補鎖に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドとインキュベートする工程、および
(b)該mRNAまたはcDNAと該ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検出する工程。
(a)被験細胞試料由来のmRNAまたは該mRNAから調製したcDNAを鋳型として用いて、Neph3遺伝子の転写産物またはその相補鎖に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプライマーとして用いて遺伝子増幅を行う工程;および
(b)増幅産物を検出する工程
またNeph3遺伝子の発現の検出は、遺伝子の翻訳産物の検出を通して実施することもできる。そのためには、例えばNeph3蛋白質を検出してもよく、あるいはNeph3蛋白質の活性を検出したり、あるいはNeph3蛋白質により誘導される表現型の変化を検出することによって、間接的にNeph3蛋白質の発現を検出してもよい。典型的には、Neph3蛋白質を検出すす工程は、免疫化学的方法により実施することが可能で、例えばNeph3蛋白質に結合する抗体を用いて検出することができる。
(a)被験細胞試料とNeph3蛋白質に結合する抗体とを接触させる工程、および
(b)被験細胞試料と該抗体との結合を検出する工程。
またNeph3遺伝子の発現は、該遺伝子のプロモーター活性の検出を通して検出することもできる。例えばNeph3遺伝子のプロモーター(修飾されたプロモーターを含む)を利用して、そのためのレポーター構築物を作製することができる(例えば、特開2002-51775号公報参照)。さらに、Neph3遺伝子のプロモーターは、膵臓前駆細胞特異的な転写活性を保持する限り、一部を欠失させたり、他のプロモーターの一部又は全部を付加または置換することもできる。レポーター構築物を作製するには、例えばNeph3遺伝子の発現領域解析により得られたプロモーター部分に対し、例えばGFP(green fluorescent protein)等の検出可能なマーカーをコードする遺伝子を連結した構築物を含むベクターを細胞に対してトランスフェクションする。その他、Neph3遺伝子座へマーカーをコードする遺伝子をノックインすることもできる。該構築物の好ましい態様については、例えば文献(WO2008/096817の図10の2〜4)を参照すればよい。プロモーターの活性化が検出された細胞は、膵臓前駆細胞であることを示唆する。ここで「プロモーター部分にマーカーをコードする遺伝子を連結」とは、当該マーカーをコードする遺伝子が発現可能な状態になるように当該遺伝子を繋げることをいい、プロモーターに当該遺伝子が直接結合した状態の他、プロモーターから離れた状態でも当該プロモーターの制御下にある状態のものも含む。
〔1〕 膵臓前駆細胞を識別、検出、同定、回収、分離および/または取得するための試薬であって、Nephrin-like 3(Neph3)遺伝子の発現を検出する下記(a)〜(c)のいずれかを含む試薬、および下記(a)〜(c)の、膵臓前駆細胞を識別、検出、同定、回収、分離および/または取得するための使用。
(a)該遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体。
(b)該遺伝子の転写産物に特異的にハイブリダイズする核酸。
(c)該遺伝子のプロモーターの制御下に異種遺伝子が連結された核酸。
〔2〕 Nephrin-like 3(Neph3)遺伝子のプロモーターを含む、膵臓前駆細胞において遺伝子を発現させるための試薬、およびNephrin-like 3(Neph3)遺伝子のプロモーターの、膵臓前駆細胞において遺伝子を発現させるための使用、
〔3〕 Nephrin-like 3(Neph3)遺伝子のプロモーターの制御下に異種遺伝子が連結された核酸を含む膵臓前駆細胞を提供する工程を含む、該細胞において該異種遺伝子を発現させる方法。
本発明の膵臓前駆細胞の検出(識別、同定、回収、調製、選択、濃縮、分離、および/または取得等の意味も含む)方法は、Neph3遺伝子の翻訳産物および/または転写産物の発現を検出することを通して膵臓前駆細胞が同定される段階を含む所望のプロセスが含まれる。例えば本発明の膵臓前駆細胞の検出方法には、細胞におけるNeph3遺伝子の翻訳産物および/または転写産物の発現を検出し、Neph3を発現する細胞を検出、識別、同定、回収、調製、選択、濃縮、分離、および/または取得することを含む、膵臓前駆細胞を検出、識別、同定、回収、調製、選択、濃縮、分離、および/または取得する方法が含まれる。また本発明は、膵臓前駆細胞を含む細胞集団(または膵臓前駆細胞を含む画分、または膵臓前駆細胞を含む組成物)の製造方法であって、膵臓前駆細胞を含む細胞試料におけるNeph3遺伝子の翻訳産物および/または転写産物の発現を検出、同定、および/または選択等をする工程、および該遺伝子を発現する細胞を選択、分離、および/または回収等をする工程を含む方法に関する。細胞の選択、分離または回収等は、例えばNeph3蛋白質に結合する抗体を用いたフローサイトメトリーにより効率的に行なうことができる。本発明の膵臓前駆細胞を含む細胞集団の製造方法により、膵臓前駆細胞が濃縮された画分を得ることができる。得られた細胞は膵臓の分化機構の解明のために、あるいは膵臓機能の異常に起因する疾患の治療のために利用され得る。
また本発明の膵臓前駆細胞を含む細胞集団の製造方法、ならびに本発明の膵臓前駆細胞の検出(識別、同定、回収、調製、選択、濃縮、分離、および/または取得等の意味も含む)方法は、Neph3遺伝子以外の遺伝子の発現を検出(識別、同定、回収、調製、選択、濃縮、分離、および/または取得等の意味も含む)する工程をさらに含んでもよい。例えば本発明の方法は、Neph3遺伝子以外の膵臓前駆細胞マーカー遺伝子の転写産物及び/または翻訳産物の発現を検出(識別、同定、回収、調製、選択、濃縮、分離、および/または取得等の意味も含む)する工程をさらに含むことができる。このような膵臓前駆細胞マーカー遺伝子としては、例えば Pdx-1 (Pancreatic and duodenal homeobox factor-1)、Ptf1a (pancreas specific transcription factor-1a)、Cpa1 (Carboxypeptidase A1 (pancreatic))、および EPPK1(epiplakin 1) が挙げられる。本発明の方法は、これらを含む膵臓前駆細胞マーカー遺伝子の1つまたは複数の遺伝子の転写産物及び/または翻訳産物の発現を検出する工程を含むことができる。遺伝子の転写産物及び/または翻訳産物の発現の検出は、Neph3遺伝子の転写産物及び/または翻訳産物の発現の検出の前に行っても後に行っても、同時に行ってもよい。例えば異なる蛍光で標識されたプローブや抗体を用いることによって、複数の遺伝子発現を同時に検出することが可能である。本発明の方法は、例えば Pdx-1および/またはPtf1aの転写産物及び/または翻訳産物の発現を検出する工程をさらに含んでよく、例えばEPPK1の転写産物及び/または翻訳産物の発現を検出する工程をさらに含んでよく、例えば Cpa1遺伝子の転写産物及び/または翻訳産物の発現を検出する工程をさらに含んでよい。
(i)本明細書に例示したaccession番号で特定されるPdx-1、Ptf1a、Cpa1、およびEPPK1遺伝子の塩基配列のコード配列(CDS)を含むポリヌクレオチド。
(ii)本明細書に例示したaccession番号で特定されるPdx-1、Ptf1a、Cpa1、およびEPPK1蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、膵臓前駆細胞で発現するポリヌクレオチド。
(iii)本明細書に例示したaccession番号で特定されるPdx-1、Ptf1a、Cpa1、およびEPPK1遺伝子の塩基配列のコード配列において、1または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および/または付加(付加とは、例えば一端または両端への付加)がなされた塩基配列を含み、膵臓前駆細胞で発現するポリヌクレオチド。
(iv)本明細書に例示したaccession番号で特定されるPdx-1、Ptf1a、Cpa1、およびEPPK1遺伝子の塩基配列のコード配列がコードするアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および/または付加(付加とは、例えば一端または両端への付加)がなされたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、膵臓前駆細胞で発現するポリヌクレオチド。
(v)本明細書に例示したaccession番号で特定されるPdx-1、Ptf1a、Cpa1、およびEPPK1遺伝子の塩基配列のコード配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、膵臓前駆細胞で発現するポリヌクレオチド。
(vi)本明細書に例示したaccession番号で特定されるPdx-1、Ptf1a、Cpa1、およびEPPK1遺伝子の塩基配列のコード配列と高い同一性を有する塩基配列を含み、膵臓前駆細胞で発現するポリヌクレオチド。
および
(vii)本明細書に例示したaccession番号で特定されるPdx-1、Ptf1a、Cpa1、およびEPPK1遺伝子の塩基配列のコード配列がコードするアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、膵臓前駆細胞で発現するポリヌクレオチド。
(i)本明細書に例示したaccession番号で特定されるPdx-1、Ptf1a、Cpa1、およびEPPK1蛋白質のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(ii)本明細書に例示したaccession番号で特定されるPdx-1、Ptf1a、Cpa1、およびEPPK1蛋白質のアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および/または付加(付加とは、例えば一端または両端への付加)がなされたアミノ酸配列を含み、膵臓前駆細胞で発現するポリペプチド。
(iii)本明細書に例示したaccession番号で特定されるPdx-1、Ptf1a、Cpa1、およびEPPK1蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、膵臓前駆細胞で発現するポリヌクレオチドがコードするポリペプチド。
および
(iv)本明細書に例示したaccession番号で特定されるPdx-1、Ptf1a、Cpa1、およびEPPK1蛋白質のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含み、膵臓前駆細胞で発現するポリペプチド。
またNeph3遺伝子は膵臓前駆細胞の指標となることから、Neph3遺伝子の翻訳産物および/または転写産物の発現を検出することにより、膵臓前駆細胞の分化誘導または分化調節に有効な物質をアッセイまたはスクリーニングすることが可能である。すなわち本発明は、膵臓前駆細胞の分化調節剤のアッセイまたはスクリーニング方法に関する。本方法によりスクリーニングされる化合物は、膵臓前駆細胞の分化を調節する機能を示すことが期待されることから、膵臓機能の異常に起因する疾患の治療のための候補化合物となる。本スクリーニング方法によって取得される化合物の治療対象となる疾患としては、例えば糖尿病を挙げることができる。
(a)膵臓前駆細胞または該細胞に分化し得る細胞と、被検試料とを接触させる工程;および
(b)該細胞におけるNeph3遺伝子の翻訳産物および/または転写産物の発現を検出する工程。
Neph3遺伝子の翻訳産物および/または転写産物の発現を誘導または上昇させる化合物は、膵臓前駆細胞を分化誘導する候補化合物となる。一方、Neph3遺伝子の翻訳産物および/または転写産物の発現を低下または抑制する化合物は、膵臓前駆細胞としての形質を失わせるための化合物の候補となる。また本発明は、以下の工程をさらに含むスクリーニング方法にも関する。
(c)被検試料の非存在下で検出した場合と比較して、Neph3遺伝子の翻訳産物および/または転写産物の発現を上昇または低下させる化合物を選択する工程。
(a)膵臓前駆細胞または該細胞に分化し得る細胞であって、Neph3遺伝子のプロモーターの制御下に異種遺伝子が連結された核酸を含む細胞と、被検試料とを接触させる工程;および
(b)該細胞における該異種遺伝子の翻訳産物および/または転写産物の発現を検出する工程。
異種遺伝子としては、該プロモーターに対して異種、具体的には、例えばNeph3遺伝子のプロモーターが天然の状態において連結しているNeph3遺伝子以外の所望の遺伝子を用いてよいが、例えば発現を簡便に検出できるものが好ましく、具体的にはGFP、ルシフェラーゼ、その他のマーカー蛋白質、分化誘導因子等をコードする遺伝子が挙げられる。Neph3遺伝子のプロモーター活性を誘導または上昇させる化合物は、膵臓前駆細胞を分化誘導する候補化合物となり、Neph3遺伝子の翻訳産物および/または転写産物の発現を低下または抑制する化合物は、膵臓前駆細胞としての形質を失わせるための化合物の候補となる。また、スクリーニング方法においては、以下の工程をさらに含むことができる。
(c)被検試料の非存在下で検出した場合と比較して、該異種遺伝子の翻訳産物および/または転写産物の発現を上昇または低下させる化合物を選択する工程。
Neph3は胎児期において、中枢神経系ではドーパミンニューロン前駆細胞(WO 2004/038018)、脊髄および小脳のGABA産生神経前駆細胞(WO 2008/096817)に発現しているが、中枢神経系以外での発生・分化における発現は明らかにされていない。そのため、中枢神経系以外での胚発生におけるNeph3発現細胞の同定を試みた。最初に、マウスE12.5日胚におけるNeph3の発現を詳細に解析した。方法は、WO 2004/038018に記載の方法にしたがって実施した。その結果、Neph3は膵臓原基に発現が認められ(図1-A)、膵臓原基内でも一部の細胞に選択的に発現していた(図1-B)。
膵臓多能性前駆細胞におけるNeph3の発現を検証するために、以下のプロトコールによってNeph3陽性細胞を分離し、細胞種の同定を試みた。マウスE12.5日胚の膵臓を摘出し、細胞分散バッファー AccuMaxTM(Innovative Cell Technologies社)を用いて分散させた後、固定、透過処理をせずに、mouse FC-Block (BD)で4℃ 10分間ブロッキングを行い、その後抗Neph3モノクローナル抗体(精製抗体1/100希釈、1%ウシ胎児血清、1mM EDTA / D-MEM:F12培地)で4℃、30分間染色した。その後、1%ウシ胎児血清、1mM EDTA / D-MEM:F12で4℃、3分間の洗浄を3回行い、PE標識抗ハムスターIgG抗体(BD、8μg/ml、1% ウシ胎児血清、1mM EDTA / D-MEM:F12培地)で4℃、30分間染色し、上記と同様に洗浄した。染色後、セルソーターによりNeph3発現細胞を分離した。分離した細胞を4℃、1000rpmで10分間遠心して上精を除去し、poly-L-ornithine(Sigma、0.002% in PBS)、laminin(Invitrogen、2.5μg/ml in PBS)、fibronectin(Sigma、5μg/ml in PBS)コートした8ウェルチャンバースライドガラス(Nunc社)上にスポットした。15分間静置して細胞をスライドガラス上に貼り付けさせた後、N2(Invirtogen x1)、B27(Invitrogen x1)/DMEM:F12培地で37℃、1時間培養した。培養液を除去して500μlのPBS(-) で室温、1回洗浄し、2% PFA / PBS(-)で30分間固定し、0.3% TrintonX-100 / PBS(-)で室温、30分間透過処理を行った。その後、25%ブロックエースでブロッキングを室温、30分間行い、一次抗体(0.1% TritonX-100 / 2.5%ブロックエース / PBS(-))を室温で2時間反応させた。0.1% TrironX-100 / PBS(-)で10分間の洗浄を2回行った。次に蛍光標識した2次抗体(0.1% Triton-X-100 / 2.5% ブロックエース / PBS(-))を室温、40分間反応し、上記と同様に洗浄を行ったあと、核染色を行った。一次抗体は実施例1のPdx1、Ptf1a参照。核染色(左から3つ目のパネル)はSYTOX nucleic acid stain (Molecular probes社 1/100000希釈)を使用した。
次に、Neph3プロモーターを用いることで、外来遺伝子を膵臓前駆細胞特異的に発現させることが可能であるかを調べるために、以下のプロトコールで、トランスジェニックマウスを作製し、外来遺伝子の発現を解析した。
次に、ヒトにおいてもNeph3が膵臓前駆細胞特異的に発現することを調べるために、ヒトNeph3プロモーターが膵臓前駆細胞特異的に活性化されるか否かを検討した。以下のプロトコールで、トランスジェニックマウスを作製し、外来遺伝子の発現を解析した。
Claims (12)
- 膵臓前駆細胞を含む細胞集団の製造方法であって、成熟膵臓β細胞を含まない内胚葉系細胞試料におけるNeph3(Nephrin-like 3)遺伝子の翻訳産物の発現を識別、検出および/または同定する工程、および該遺伝子の翻訳産物を発現する細胞を回収、分離および/または取得する工程を含む方法。
- 内胚葉系細胞試料が中枢神経除去系細胞試料である、請求項1に記載の方法。
- 内胚葉系細胞試料が腹部由来細胞試料である、請求項1に記載の方法。
- Pdx-1 (Pancreatic and duodenal homeobox factor-1)、Ptf1a (pancreas specific transcription factor-1a)、Cpa1 (Carboxypeptidase A1 (pancreatic))、EPPK1(エピプラキン1)のいずれか一つ、またはそれらの組み合わせの遺伝子の翻訳産物および/または転写産物の発現を識別、検出、同定、回収、分離および/または取得する工程をさらに含む、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- Pdx-1 (Pancreatic and duodenal homeobox factor-1)およびCpa1 (Carboxypeptidase A1 (pancreatic))の組み合わせである、請求項4に記載の方法。
- 上記識別、検出および/または同定する工程、および/または回収、分離および/または取得する工程が、免疫化学的方法によってなされる工程である、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 成熟膵臓β細胞を含まない内胚葉系細胞試料におけるNeph3遺伝子の翻訳産物の発現を識別、検出および/または同定する工程を含む、膵臓前駆細胞を識別、検出、同定、回収、分離および/または取得する方法。
- 内胚葉系細胞試料が中枢神経除去系細胞試料である、請求項7に記載の方法。
- 内胚葉系細胞試料が腹部由来細胞試料である、請求項7に記載の方法。
- Pdx-1 (Pancreatic and duodenal homeobox factor-1)、Ptf1a (pancreas specific transcription factor-1a)、Cpa1 (Carboxypeptidase A1 (pancreatic))、EPPK1(エピプラキン1)のいずれか一つ、またはそれらの組み合わせの遺伝子の翻訳産物および/または転写産物の発現を識別、検出、同定、回収、分離および/または取得する工程をさらに含む、請求項7から9のいずれかに記載の方法。
- Pdx-1 (Pancreatic and duodenal homeobox factor-1)およびCpa1 (Carboxypeptidase A1 (pancreatic))の組み合わせである、請求項10に記載の方法。
- 膵臓前駆細胞を識別、検出、同定、回収、分離および/または取得する方法が、免疫化学的方法である請求項7から11のいずれかに記載の方法。
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