JP4731487B2 - Corl1遺伝子を標的とした脊髄神経細胞の種類を識別する方法 - Google Patents
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Description
Wichterle H, Lieberam I, Porter AP and Jessell TM. Directed differentiation of embryonic stem cells into moter neurons. Cell 2002 Aug;110:385-397 Jessell TM. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes. Nat Rev Genetics 2000 Oct;1(1):20-29.(Review) Caspary T, Anderson KV. Patterning cell types in the dorsal spinal cord: what the mouse mutants say. Nat Rev Neurosci. 2003 Apr;4(4):289-97.(Review) Muller T, Brohmann H, Pierani A, Heppenstall PA, Lewin GR, Jessell TM, Birchmeier C. The homeodomain factor lbx1 distinguishes two major programs of neuronal differentiation in the dorsal spinal cord. Neuron. 2002 May 16;34(4):551-62. Gross MK, Dottori M, Goulding M. Lbx1 specifies somatosensory association interneurons in the dorsal spinal cord. Neuron. 2002 May 16;34(4):535-49.
〔2〕配列番号:1、配列番号:3および配列番号:5からなる群より選択される少なくとも一つに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するための試薬。
〔3〕Corl1遺伝子の翻訳産物に結合する抗体を有効成分として含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するための試薬。
〔4〕配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6からなる群より選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体を有効成分として含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するための試薬。
〔5〕識別の対象となる脊髄神経細胞がdI1、dI2、dI3、dI4、dI5、dI6、dILAまたはdILBである、〔1〕〜〔4〕のいずれか一項に記載の試薬。
〔6〕Corl1遺伝子の転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、Brn3a、Pax2、Lbx1、Lim1、Lim2、LH2A、LH2B、Isl1、Lmx1b、Tlx1およびTlx3からなる群より選択される1または複数の遺伝子の転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチドとの組合せを含む、脊髄神経細胞の種類を識別するためのキット。
〔7〕配列番号:1、配列番号:3および配列番号:5からなる群から選択される少なくとも一つに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと、Brn3a、Pax2、Lbx1、Lim1、Lim2、LH2A、LH2B、Isl1、Lmx1b、Tlx1およびTlx3からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとを有効成分として含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するためのキット。
〔8〕Corl1遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、Brn3a、Pax2、Lbx1、Lim1、Lim2、LH2A、LH2B、Isl1、Lmx1b、Tlx1およびTlx3からなる群より選択される1または複数の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体との組合せを含む、脊髄神経細胞の種類を識別するためのキット。
〔9〕配列番号:2、配列番号:4および配列番号:6からなる群より選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体と、Brn3a、Pax2、Lbx1、Lim1、Lim2、LH2A、LH2B、Isl1、Lmx1b、Tlx1およびTlx3からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とを有効成分して含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するためのキット。
〔10〕識別の対象となる脊髄神経細胞がdI1、dI2、dI3、dI4、dI5、dI6、dILAまたはdILBである、〔6〕〜〔9〕のいずれか一項に記載のキット。
〔11〕脊髄神経細胞の種類を識別するための方法であって、脊髄神経細胞におけるCorl1遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出する工程を含む方法。
〔12〕Brn3a、Pax2、Lbx1、Lim1、Lim2、LH2A、LH2B、Isl1、Lmx1b、Tlx1およびTlx3からなる群より選択される1または複数の遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出する工程を含む、〔11〕に記載の方法。
〔13〕識別の対象となる脊髄神経細胞がdI1、dI2、dI3、dI4、dI5、dI6、dILAまたはdILBである、〔11〕または〔12〕に記載の方法。
〔14〕脊髄神経細胞の種類を識別するための方法であって、
(1)配列番号:1、配列番号:3および配列番号:5からなる群より選択される少なくとも一つに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
または
(2)配列番号:2、配列番号:4および配列番号:6からなる群より選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体、
を脊髄神経細胞に接触させる工程を含む方法。
〔15〕(1)Brn3a、Pax2、Lbx1、Lim1、Lim2、LH2A、LH2B、Isl1、Lmx1b、Tlx1およびTlx3からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
または
(2)Brn3a、Pax2、Lbx1、Lim1、Lim2、LH2A、LH2B、Isl1、Lmx1b、Tlx1およびTlx3からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の翻訳産物に結合する抗体、
を脊髄神経細胞に接触させる工程を含む、〔14〕に記載の方法。
〔16〕dI1、dI2、dI3およびdI6からなる群から選択される少なくとも一つの脊髄神経細胞とdI4、dI5、dILAおよびdILBからなる群から選択される少なくとも一つの脊髄神経細胞とを識別する工程を含む、〔14〕または〔15〕に記載の方法。
〔17〕Brn3a、Pax2、Lbx1、Lim1、Lim2、LH2A、LH2B、Isl1、Lmx1b、Tlx1およびTlx3からなる群より選択される1または複数の遺伝子の転写産物を発現する脊髄神経細胞と、Brn3a、Pax2、Lbx1、Lim1、Lim2、LH2A、LH2B、Isl1、Lmx1b、Tlx1およびTlx3からなる群より選択される1または複数の遺伝子の転写産物を発現していない脊髄神経細胞とを識別する工程を含む、〔14〕〜〔16〕のいずれか一項に記載の方法。
〔18〕脊髄神経細胞へ分化する能力のある細胞から脊髄神経細胞への分化を誘導する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)被検試料の存在下で、脊髄神経細胞へ分化する能力のある細胞の脊髄神経細胞への分化を誘導する工程、
(b)分化を誘導した細胞におけるCorl1遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出する工程
(c)被検試料の非存在下で検出した場合と比較して、該転写産物または翻訳産物の量を増大させる化合物を選択する工程、
を含む方法。
〔19〕脊髄神経細胞へ分化する能力のある細胞がES細胞である、〔18〕に記載の方法。
また、本発明は、
〔20〕以下の(a)または(b)の、脊髄神経細胞の種類を識別するための試薬の製造における使用、
(a)Corl1遺伝子の転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチド
(b)Corl1遺伝子の翻訳産物に結合する抗体
に関する。
(1)配列番号:2、4、6のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(2)配列番号:1、3,5のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA、
(3)配列番号:2、4、6のいずれかに記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(4)配列番号:1、3、5のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の脊椎動物のDNA
ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば「2×SSC、0.1%SDS、50℃」、「2×SSC、0.1%SDS、42℃」、「1×SSC、0.1%SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1%SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」及び「0.2×SSC、0.1%SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer (Amersham Life Science)を用いた方法として、68℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後2×SSC、0.1%SDS中、室温で20分間の洗浄を3回行い、続いて1×SSC、0.1%SDS中、37℃で20分間の洗浄を3回行い、最後に1×SSC、0.1%SDS中、50℃で20分間の洗浄を2回行うことができる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution (CLONTECH)中、55℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを添加して37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1%SDS中、室温で20分間の洗浄を3回、1×SSC、0.1%SDS中、37℃で20分間の洗浄を1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや2度目の洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を60℃、さらにストリンジェントな条件としては68℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味し、条件を設定することができる。
(1)配列番号:8、10、12のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(2)配列番号:7、9、11のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA、
(3)配列番号:8、10、12のいずれかに記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(4)配列番号:7、9、11のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の脊椎動物のDNA。
(1)配列番号:14または16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(2)配列番号:13または15に記載の塩基配列からなるDNA、
(3)配列番号:14または16に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(4)配列番号:13または15に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の脊椎動物のDNA。
(1)配列番号:18または20に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(2)配列番号:17または19に記載の塩基配列からなるDNA、
(3)配列番号:18または20に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(4)配列番号:17または19に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の脊椎動物のDNA。
(1)配列番号:22または24に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(2)配列番号:21または23に記載の塩基配列からなるDNA、
(3)配列番号:22または24に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(4)配列番号:21または23に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の脊椎動物のDNA。
(1)配列番号:26、28、30のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(2)配列番号:25、27、29のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA、
(3)配列番号:26、28、30のいずれかに記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(4)配列番号:25、27、29のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の脊椎動物のDNA。
(1)配列番号:32、34、36のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(2)配列番号:31、33、35のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA、
(3)配列番号:32、34、36のいずれかに記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(4)配列番号:31、33、35のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の脊椎動物のDNA。
(1)配列番号:38または40に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(2)配列番号:37または39に記載の塩基配列からなるDNA、
(3)配列番号:38または40に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(4)配列番号:37または39に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の脊椎動物のDNA。
(1)配列番号:42、44、46のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(2)配列番号:41、43、45のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA、
(3)配列番号:42、44、46のいずれかに記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(4)配列番号:41、43、45のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の脊椎動物のDNA。
(1)配列番号:48、50、52のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(2)配列番号:47、49、51のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA、
(3)配列番号:48、50、52のいずれかに記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(4)配列番号:47、49、51のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の脊椎動物のDNA。
(1)配列番号:54または56に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(2)配列番号:53または55に記載の塩基配列からなるDNA、
(3)配列番号:54または56に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(4)配列番号:53または55に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の脊椎動物のDNA。
(1)配列番号:58または60に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(2)配列番号:57または59に記載の塩基配列からなるDNA、
(3)配列番号:58または60に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(4)配列番号:57または59に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の脊椎動物のDNA。
本発明の脊髄神経細胞を識別するための好ましい態様として、以下の工程を含む方法を挙げることができる。
(1)配列番号:1、配列番号:3および配列番号:5からなる群から選択される少なくとも一つに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
または
(2)配列番号:2、配列番号:4および配列番号:6からなる群から選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体、
を脊髄神経細胞に接触させる工程。
(1)Brn3a、Pax2、Lbx1、Lim1、Lim2、LH2A、LH2B、Isl1、Lmx1b、Tlx1およびTlx3からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
または
(2)Brn3a、Pax2、Lbx1、Lim1、Lim2、LH2A、LH2B、Isl1、Lmx1b、Tlx1およびTlx3からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の翻訳産物に結合する抗体、
を脊髄神経細胞に接触させる工程。
(a)被検試料の存在下で、脊髄神経細胞へ分化する能力のある細胞から脊髄神経細胞への分化を誘導する工程、
(b)分化を誘導した細胞におけるCorl1遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出する工程、
(c)被検試料の非存在下で検出した場合と比較して、該転写産物または翻訳産物の量を増大させる化合物を選択する工程。
(a)Corl1遺伝子の転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチド
(b)Corl1遺伝子の翻訳産物に結合する抗体
胎児期脳領域特異的に発現する遺伝子を単離するために、E12.5マウス中脳腹側領域と背側領域で発現の異なる遺伝子をサブトラクション(N-RDA)法により同定した。単離した断片の一つは機能未知なタンパク質をコードするcDNA断片であった。
1-1. アダプターの調製
下記のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、100μMに調製した。
(ad2: ad2S+ad2A、ad3: ad3S+ad3A、ad4: ad4S+ad4A、ad5: ad5S+ad5A、ad13: ad13S+ad13A)
ad2S: cagctccacaacctacatcattccgt(配列番号:61)
ad2A: acggaatgatgt(配列番号:62)
ad3S: gtccatcttctctctgagactctggt(配列番号:63)
ad3A: accagagtctca(配列番号:64)
ad4S: ctgatgggtgtcttctgtgagtgtgt(配列番号:65)
ad4A: acacactcacag(配列番号:66)
ad5S: ccagcatcgagaatcagtgtgacagt(配列番号:67)
ad5A: actgtcacactg(配列番号:68)
ad13S: gtcgatgaacttcgactgtcgatcgt(配列番号:69)
ad13A: acgatcgacagt(配列番号:70)
日本SLCより入手したマウス12.5日胚より中脳腹側および中脳背側領域を切り出した。RNeasy mini kit (Qiagen)を用いて全RNAを調製し、cDNA synthesis kit (TAKARA)を用いて二本鎖cDNAを合成した。制限酵素RsaIで消化したのち、ad2を付加し、ad2Sをプライマーとして、15サイクルのPCRでcDNAを増幅した。増幅条件は72℃で5分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を15サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。N-RDAのPCRはすべて以下の反応液組成で行った。
10×ExTaq 5μl
2.5mM dNTP 4μl
ExTaq 0.25μl
100μM primer 0.5μl
cDNA 2μl
蒸留水 38.25μl
ad2Sで増幅したcDNAをさらに5サイクルのPCRで増幅した。増幅条件は94℃で2分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を5サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。Qiaquick PCR purification kit (Qiagen)を用いてcDNAを精製し、RsaI消化した。1回のサブトラクションに3μgずつ使用した。
ad2Sで増幅したcDNAをさらに5サイクルのPCRで増幅した。増幅条件は94℃で2分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を5サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。Qiaquick PCR purification kit (Qiagen)を用いてcDNAを精製し、RsaI消化した。60ngのRsaI消化cDNAにad3を付加した。
上記3及び4で作製したTesterおよびDriverを混合し、エタノール沈殿した後に、1xPCR buffer 1μlに溶解した。98℃5分の後、1xPCR buffer+1M NaCl 1μlを加えた。さらに98℃5分の後、68℃で16時間ハイブリダイズさせた。
ハイブリダイズさせたcDNAをad3Sをプライマーとして10サイクルのPCRで増幅した後(72℃で5分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を10サイクル行った)、Mung Bean Nuclease (TAKARA)で消化し、Qiaquick PCR purification kitで精製した。さらに13サイクルのPCRで増幅した。増幅条件は94℃で2分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を13サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。
サブトラクション1回目で増幅したcDNA 8ngに2xPCR buffer 1μlを加えた。98℃5分の後、1xPCR buffer+1M NaCl 2μlを加えた。さらに98℃5分の後、68℃で16時間ハイブリダイズさせた。
ハイブリダイズさせたcDNAをRsaIで消化し、Qiaquick PCR purification kitで精製した。これをad3Sをプライマーとして11サイクルのPCRで増幅した後(94℃で2分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を11サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした)RsaIで消化し、ad4を付加した。
上記6でad4を付加したcDNA 20ngをTesterとして、上記3のDriverと混合し、さらに、上記5と同様の方法でサブトラクションを行った。最終的にRsaI消化したcDNAにad5を付加した。
上記7でad5を付加したcDNA 2ngをTesterとして、上記3のDriverと混合し、さらに、上記5と同様の方法でサブトラクションを行った。最終的にRsaI消化したcDNAにad13を付加した。
上記8でad13を付加したcDNA 2ngをTesterとして、上記3のDriverと混合し、以下、上記5と同様の方法でサブトラクションを行った。増幅したcDNAをpCRII (Invitrogen)にクローニングし、ABI3100シーケンスアナライザーを用いて塩基配列を解析した。
N-RDA法で得られたcDNA断片の配列からBlast検索を行った結果、この遺伝子は機能未知なタンパク質をコードする遺伝子(Genbank,accession No.: NM-172446)であることが明らかになった。そこで、登録配列を参考にプライマーを設計し、全長cDNAをRT-PCR法でクローニングした。
10×buffer 5μl
2.5mM dNTP 4μl
Pyrobest polymerase (TAKARA) 0.5μl
100μM primer 0.5μl
cDNA 1μl
DMSO 2.5μl
蒸留水 36μl
プライマー配列
Corl1 F1: GAGGTCGACATGGCATTGCTGTGTGGCCTTGGGAG(配列番号:71)
Corl1 R1: GAGGTCGACCTAGGGCAGCAGCGGAGGCTTGAAGG(配列番号:72)
増幅したcDNAをpCRII (Invitrogen)にクローニングし、ABI3100シーケンスアナライザーを用いて塩基配列を解析した。その結果、936アミノ酸をコードすることが確認され、この遺伝子をCorl1と命名した。
次にCorl1の発現を解析した。まずは、成体マウス組織における発現をRT-PCR法で解析した。
各組織全RNA(Promega)に対して、RNA PCR kit (TAKARA)を用いて1本鎖cDNAを合成し、鋳型に用いた。PCRの増幅条件は、94℃で2分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で30秒の反応を35サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。PCRは以下の反応液組成で行った。
10×buffer 1μl
2.5mM dNTP 0.8μl
ExTaq 0.05μl
100μM primer 0.1μl
cDNA 1μl
蒸留水 7.05μl
プライマー配列
Corl1 F2: ATGCAGAGAGCATCGCTAAGCTCTAC(配列番号:73)
Corl1 R2: AAGCGGTTGGACTCTACGTCCACCTC(配列番号:74)
その結果、Corl1は成体では脳および精巣に特異的に発現していることが明らかになった(図2)。また、脳での発現は成体よりも胎児期の方が高いことも明らかとなった。
まず、マウス12.5日胚をOCTで包埋し、厚さ16μmの新鮮凍結切片を作製した。スライドガラス上で乾燥させた後に4%PFAで室温30分間固定した。PBSで洗浄した後、ハイブリダイゼーション(1μg/mlDIG化RNAプローブ、50%ホルムアミド、5xSSC, 1%SDS, 50μg/ml yeast RNA, 50μg/ml Heparin)を65度で40時間行った。その後、洗浄(50%ホルムアミド、5xSSC, 1%SDS)を65度で行い、RNase処理(5μg/ml RNase)を室温5分間行った。0.2xSSCで65度の洗浄、1xTBSTで室温の洗浄ののち、ブロッキング(Blocking reagent: Roche)を行った。アルカリフォスファターゼ標識抗DIG抗体(DAKO)を反応させ、洗浄(1xTBST、2mM Levamisole)の後、NBT/BCIP (DAKO)を基質として発色させた。
まず免疫に必要な抗原であるCorl1の569-813 アミノ酸にあたる領域とGSTの融合タンパク質発現ベクターを構築した。このベクターをE.coli(JM109株)に導入した後、IPTGによって発現誘導し、グルタチオンビーズを用いて融合タンパク質を回収した。融合タンパク質をウサギに数回免疫した後に採血し、その血清から免疫に用いたGST-Corl1抗原によるaffinity精製を行うことによって、抗Corl1ポリクローナル抗体を得た。
Corl1がin vitroで分化誘導した脊髄神経細胞の識別に使用できるのか調べるために、以下のプロトコールにより、ES細胞より分化誘導した脊髄神経細胞におけるCorl1の発現を解析した。
上記と同様の方法で分化誘導した後、4%PFA/PBS(-)で4℃、2時間固定し、10%ショ糖/PBS(-)で4℃、一晩、その後20%ショ糖/PBS(-)で4℃、6時間置換し、OCTで包埋した。厚さ12μmの切片を作製し、スライドガラスに貼り付けた後、室温で1時間乾燥させ、0.1%TritonX-100/PBS(-)で5分間、PBS(-)で5分間湿潤させた。その後、ブロッキング(25%ブロックエース/PBS(-))を室温、30分間行い、一次抗体を室温、1時間反応させた後、さらに4℃で一晩反応させた。その後、0.1%TritonX-100/PBS(-)で、室温で10分間の洗浄を4回行った。次に蛍光標識した2次抗体を室温、20分間反応させ、同様に洗浄を行った後、PBS(-)によって室温で10分間の洗浄を2回行い、封入した。蛍光シグナルは共焦点顕微鏡で検出した。
Claims (12)
- Corl1遺伝子の転写産物にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するための試薬。
- Corl1遺伝子の翻訳産物に結合する抗体を有効成分として含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するための試薬。
- 識別の対象となる脊髄神経細胞がdI1、dI2、dI3、dI4、dI5、dI6、dILAまたはdILBである、請求項1または2に記載の試薬、ここで脊髄神経細胞は、LH2A、LH2B、およびBrn3a遺伝子が発現しておりCorl1遺伝子が発現していないことを指標としてdI1であると識別され、Lim1、Lim2、およびBrn3a遺伝子が発現しておりCorl1遺伝子が発現していないことを指標としてdI2であると識別され、Isl1およびBrn3a遺伝子が発現しておりCorl1遺伝子が発現していないことを指標としてdI3であると識別され、Lbx1、Pax2、Lim1、Lim2、およびCorl1遺伝子が発現していることを指標としてdI4であると識別され、Lbx1、Lmx1b、Brn3a、およびCorl1遺伝子が発現していることを指標としてdI5であると識別され、Lbx1、Pax2、Lim1、およびLim2遺伝子が発現しておりCorl1遺伝子が発現していないことを指標としてdI6であると識別され、Lbx1、Pax2、Lim1、Lim2、およびCorl1遺伝子が発現していることを指標としてdILAであると識別され、Lbx1、Lmx1b、Brn3a、およびCorl1遺伝子が発現していることを指標としてdILBであると識別される。
- Corl1遺伝子の転写産物にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと、Brn3a、Pax2、Lbx1、Lim1、Lim2、LH2A、LH2B、Isl1、Lmx1b、Tlx1およびTlx3からなる群より選択される1または複数の遺伝子の転写産物にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとの組合せを含む、脊髄神経細胞の種類を識別するためのキット。
- Corl1遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、Brn3a、Pax2、Lbx1、Lim1、Lim2、LH2A、LH2B、Isl1、Lmx1b、Tlx1およびTlx3からなる群より選択される1または複数の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体との組合せを含む、脊髄神経細胞の種類を識別するためのキット。
- 識別の対象となる脊髄神経細胞がdI1、dI2、dI3、dI4、dI5、dI6、dILAまたはdILBである、請求項4または5に記載のキット、ここで脊髄神経細胞は、LH2A、LH2B、およびBrn3a遺伝子が発現しておりCorl1遺伝子が発現していないことを指標としてdI1であると識別され、Lim1、Lim2、およびBrn3a遺伝子が発現しておりCorl1遺伝子が発現していないことを指標としてdI2であると識別され、Isl1およびBrn3a遺伝子が発現しておりCorl1遺伝子が発現していないことを指標としてdI3であると識別され、Lbx1、Pax2、Lim1、Lim2、およびCorl1遺伝子が発現していることを指標としてdI4であると識別され、Lbx1、Lmx1b、Brn3a、およびCorl1遺伝子が発現していることを指標としてdI5であると識別され、Lbx1、Pax2、Lim1、およびLim2遺伝子が発現しておりCorl1遺伝子が発現していないことを指標としてdI6であると識別され、Lbx1、Pax2、Lim1、Lim2、およびCorl1遺伝子が発現していることを指標としてdILAであると識別され、Lbx1、Lmx1b、Brn3a、およびCorl1遺伝子が発現していることを指標としてdILBであると識別される。
- 脊髄神経細胞の種類を識別するための方法であって、脊髄神経細胞におけるCorl1遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出する工程を含む方法。
- Brn3a、Pax2、Lbx1、Lim1、Lim2、LH2A、LH2B、Isl1、Lmx1b、Tlx1およびTlx3からなる群より選択される1または複数の遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出する工程を含む、請求項7に記載の方法。
- 識別の対象となる脊髄神経細胞がdI1、dI2、dI3、dI4、dI5、dI6、dILAまたはdILBである、請求項7または8に記載の方法、ここで脊髄神経細胞は、LH2A、LH2B、およびBrn3a遺伝子が発現しておりCorl1遺伝子が発現していないことを指標としてdI1であると識別され、Lim1、Lim2、およびBrn3a遺伝子が発現しておりCorl1遺伝子が発現していないことを指標としてdI2であると識別され、Isl1およびBrn3a遺伝子が発現しておりCorl1遺伝子が発現していないことを指標としてdI3であると識別され、Lbx1、Pax2、Lim1、Lim2、およびCorl1遺伝子が発現していることを指標としてdI4であると識別され、Lbx1、Lmx1b、Brn3a、およびCorl1遺伝子が発現していることを指標としてdI5であると識別され、Lbx1、Pax2、Lim1、およびLim2遺伝子が発現しておりCorl1遺伝子が発現していないことを指標としてdI6であると識別され、Lbx1、Pax2、Lim1、Lim2、およびCorl1遺伝子が発現していることを指標としてdILAであると識別され、Lbx1、Lmx1b、Brn3a、およびCorl1遺伝子が発現していることを指標としてdILBであると識別される。
- 脊髄神経細胞へ分化する能力のある細胞から脊髄神経細胞への分化を誘導する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)被検試料の存在下で、脊髄神経細胞へ分化する能力のある細胞の脊髄神経細胞への分化を誘導する工程、
(b)分化を誘導した細胞におけるCorl1遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出する工程
(c)被検試料の非存在下で検出した場合と比較して、該転写産物または翻訳産物の量を増大させる化合物を選択する工程、
を含む方法。 - 脊髄神経細胞へ分化する能力のある細胞がES細胞である、請求項10に記載の方法。
- 以下の(a)または(b)の、脊髄神経細胞の種類を識別するための試薬の製造における使用。
(a)Corl1遺伝子の転写産物にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
(b)Corl1遺伝子の翻訳産物に結合する抗体
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