WO2006022243A1 - Corl1遺伝子を標的とした脊髄神経細胞の種類を識別する方法 - Google Patents

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spinal nerve
corll
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Yuichi Ono
Yasuko Nakagawa
Tomoya Nakatani
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Eisai R&D Management Co., Ltd.
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a gene Corll that is specifically expressed in spinal cord interneuron-euron dI4, dI5, dILA, and dILB, and to the use of the gene for identifying the type of spinal nerve cell
  • the spinal nervous system is a central nervous system that plays a very important role in the control of movement and perception.
  • Regenerative therapies are being investigated as treatments for spinal nerve disorders such as spinal cord injury.
  • spinal nerve disorders such as spinal cord injury.
  • it has been considered to transplant spinal nerve cells that have been induced by force in vitro, such as ES cells, or to promote regeneration in vivo from the neural stem cells of patients themselves.
  • Non-patent Document 1 A method for inducing differentiation of spinal motor neurons from ES cells with high efficiency has been developed (Non-patent Document 1).
  • spinal motor neuron progenitor cells can be purified by using ES cells in which GFP is knocked in at the HB9 gene locus specific to motor neuron cells!
  • the developmental mechanism of the fetal period has also been elucidated for spinal neurons other than motor neurons (Non-patent Documents 2-5).
  • Non-patent Documents 2-5 there are about 15 different types of nerve cells in the spinal cord (Non-patent Documents 2-5).
  • spinal nerve cells various homebox transcription factors that are selectively expressed have been identified, and individual spinal nerve cells can be identified by combining these expressions.
  • a marker that is specifically expressed has not yet been identified, and although it is possible to identify the place of development in the fetal period of development, in vitro It is difficult to identify some spinal nerve cell populations in the mixed spinal nerve cell populations that were induced to differentiate in, the spinal nerve cell populations that migrated in vivo after development, and the adult regenerated spinal nerve cell populations. is there.
  • Non-patent document 1 Wichterle H, Lieberam I, Porter AP and Jessell TM. Directed differen tiation of embryonic stem cells into moter neurons. Cell 2002 Aug; 110: 385— 397
  • Non-patent document 2 Jessell TM. Neuronal specification in the spinal Nat Rev Genetics 2000 Oct; l (l): 20— 29. (Review)
  • Non-Patent Document 3 Caspary T, Anderson KV. Patterning cell types in the dorsal spinal cord: what the cord: Inductive signal s and transcriptional codes. mouse mutants say. Nat Rev Neurosci. 2003 Apr; 4 (4): 289-97.
  • Non-Patent Literature 4 Muller T, Brohmann H, Pierani A, Heppenstall PA, Lewin GR, Jessell TM, Birchmeier C.
  • the homeodomain factor lbxl distinguishes two major programs of neuronal differentiation in the dorsal spinal cord. Neuron. 2002 May 16; 34 (4): 551 -62.
  • Non-Patent Document 5 Gross MK, Dottori M, Goulding M. Lbxl specifies somatosensory ass ociation interneurons in the dorsal spinal cord. Neuron. 2002 May 16; 34 (4): 535- 49. Disclosure of the Invention
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to provide a method and a reagent for identifying the type of spinal nerve cells. More specifically, the present invention uses a method for identifying spinal nerve cells dll, dI2, dI3, dI4, dI5, dI6, dILA or dILB using the expression of endogenous CorlKCorepressor for Lbxl) as an index, and It is an object of the present invention to provide a reagent for detecting the expression of endogenous Corll gene in the method.
  • the present inventors selectively express in the mouse fetal brain region. Genes were searched by the subtraction method. As a result, a cDNA fragment encoding Corll was obtained. When the expression of Corll was examined by RT-PCR, in situ hybridization, and immunostaining using polyclonal antibodies, Corll was particularly selectively and strongly expressed in the central nervous system during fetal period. Next, the expression of Corll in the fetal spinal cord was examined in detail. Expression—Comparison with various markers to identify the type of euron revealed that Corll is specifically expressed in spinal cord-exon dI4, dI5, dILA and dILB.
  • a reagent for identifying the types of spinal nerve cells which contains, as an active ingredient, a polynucleotide that hybridizes to a transcript of the Corll gene.
  • a polynucleotide that is hybridized under stringent conditions to a polynucleotide comprising at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5 A reagent for identifying the types of spinal nerve cells, containing as an active ingredient.
  • a reagent for identifying the type of spinal nerve cell comprising as an active ingredient an antibody that binds to the translation product of the Corll gene.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6
  • an antibody that binds to an amino acid sequence described in at least one selected from the group consisting of or a polypeptide having a partial sequence ability is selected.
  • a polynucleotide that hybridizes to the transcript of the Corll gene and Brn3a, Pax2, L a type of spinal nerve cell including a combination with a polynucleotide that hybridizes to a transcript of one or more genes selected from the group consisting of bxl, Liml, Lim2, LH2A, LH2B, Isll, Lmxlb, Tlxl and Tlx3 Kit for identification.
  • a kit for identifying the type of spinal nerve cell, comprising an polynucleotide to be hybridized as an active ingredient.
  • kits according to any one of [6] to [9], wherein the spinal nerve cells to be identified are dll, dI2, dI3, dI4, dI5, dI6, dILA, or dIL B.
  • a method for identifying the type of spinal nerve cell comprising a step of detecting a transcription product or translation product of a Corll gene in the spinal cord nerve cell.
  • a method for identifying types of spinal nerve cells (1) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising at least one base sequence described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5;
  • An antibody that binds to a polypeptide having at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6 or a partial sequence ability thereof, to spinal nerve cells A method comprising the step of contacting.
  • a step of discriminating at least one spinal nerve cell selected from the group force consisting of dll, dI2, dI3 and dI6 and at least one spinal nerve cell selected from the group force consisting of dI4, dI5, dILA and dILB The method according to [14] or [15], comprising:
  • the present invention also provides:
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure and homology of Corll.
  • FIG. 2 is a photograph showing the expression of Corll in adult mouse silkworm tissue and the expression in the hindbrain and spinal cord of E12.5 mice.
  • FIG. 3 is a photograph showing a comparison of the expression of Corll, Pax7 and j8 ⁇ -tubulin in the E13.25 spinal cord.
  • FIG. 4 is a photograph showing a comparison of the expression of Corll, Brn3a, Liml and Isll in the E10.75 spinal cord of Corll.
  • FIG. 5 is a photograph showing comparison of the expression of Corll, Brn3a, and Liml in the E13.25 spinal cord of Corll.
  • FIG. 6 is a diagram schematically showing the expression pattern of Corll in the nascent spinal cord.
  • TFs means transcriptional regulators.
  • FIG. 7 is a photograph showing the expression of Corll in spinal nerve cells induced to differentiate in vitro from ES cells.
  • FIG. 8 is a photograph showing the expression of Corll in spinal nerve cells induced in vitro from ES cells.
  • the present invention provides a reagent for identifying the type of spinal nerve cell, which contains, as an effective component, a polynucleotide that is hybridized to the transcript of the Corll gene.
  • the chain length of the polynucleotide of the present invention is not particularly limited, and so-called “oligonucleotides” are also included in the polynucleotide of the present invention.
  • spinal neurons of the Corll gene force by the present inventors is substantially expressed in dI4, dI5, dILA, and dl LB, but not substantially expressed in dll, dI2, dI3, and dI6 Indicated. Therefore, typical examples of spinal nerve cells that are subject to cell type identification by the reagent of the present invention include dll, dI2, dI3, dI4, dI5, dI6, dILA, or dILB.
  • identifying the type of spinal cord nerve cell refers not only to identifying that the target spinal cord nerve cell is a specific type of spinal cord nerve cell, but also to the spinal cord to be targeted. This includes the case where neuronal cells are identified as sputum in certain types of spinal neurons. For example, if a Corll gene is substantially expressed in a target spinal cord neuron, the spinal cord neuron can be identified as “possibly dI4, dI5, dILA or dILB”. It can also be identified as “not dll, dI2, dI3, and dI6”.
  • the spinal cord neuron if the target spinal cord neuron does not substantially express the Corll gene, the spinal cord neuron is identified as “possibly dll, dI2, dI3, or dI6”. It can also be identified as “not dI4, dI5, dIL A and dILB”.
  • the "Corll gene” that serves as an index for identifying the type of spinal nerve cells is not particularly limited as long as it exhibits the expression specificity in the above spinal nerve cells. Vertebrate Corll genes can be used in the present invention.
  • the mouse Corll gene is known, and its nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the Corll gene of the present invention includes a homologue thereof, for example, human Corll (nucleotide sequence SEQ ID NO: 3 includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4) and rat Corll (base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6).
  • a naturally occurring mutant such as an allelic mutant exists in the Corll gene, and such a mutant is also an index for identifying the type of spinal nerve cell in the present invention. sell.
  • the "Corll gene" used in the present invention can be defined as the endogenous DNA selected from (1) to (4) below.
  • the amino acid level is within 10 amino acids (eg, within 5 amino acids, within 3 amino acids) as compared with the nucleotide sequence of the Corll gene described in any one of 1, 3, and 5.
  • vertebrate DNA corresponding to a specific vertebrate DNA generally has high homology with the DNA of the specific vertebrate.
  • High homology means 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more (e.g., 95% or more, or 96%, 97%, 98% or 99% or higher) homology. This homology is determined by the mBL AST algorithm (Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264—8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873 -It can be determined by 7).
  • vertebrate DNA corresponding to a specific vertebrate DNA is considered to hybridize under stringent conditions with a specific vertebrate DNA when in vivo forces are also isolated.
  • stringent conditions for example, “2 X SSC, 0.1% SDS 50 .C”, “2 X SSC, 0.1% SDS 42 .C”, “1 X SSC 0.1% SDS 37 ⁇ ° C '', and more stringent conditions are ⁇ 2 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C '', ⁇ 0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C '' and ⁇ 0.2 X SSC, 0.1% SDS, 65
  • the condition of “C” can be mentioned.
  • the polynucleotide that is the active ingredient of the reagent of the present invention hybridizes to the transcription product of the endogenous Corll gene.
  • hybridization conditions for example, “2 X SSC, 0.1% SDS, 50 ° C.”, “2 XS SC, 0.1% SDS, 42 ° C '', ⁇ 1 X SSC, 0.1% SDS, 37 ° C '', and more stringent conditions such as ⁇ 2 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C '', ⁇ 0.5 X SSC, Examples include conditions such as “0.1% SDS, 42 ° C.” and “0.2 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”.
  • probe is added for 1 hour or more at 68 ° C. And then allowed to form, and then washed 3 times for 20 minutes at room temperature in 2 X SSC, 0.1% SDS, followed by 20 minutes at 37 ° C in 1 X SSC, 0.1% SDS. This can be done 3 times, and finally it can be washed twice in 1 X SSC, 0.1% SDS at 50 ° C for 20 minutes.
  • Prehybridization Solution CLO NTECH
  • prehybridization at 55 ° C for 30 minutes or more, add labeling probe, and incubate at 37-55 ° C for 1 hour or more.
  • it can be washed 3 times for 20 minutes at room temperature in 2 X SSC, 0.1% SDS, and once for 20 minutes at 37 ° C in 1 X SSC, 0.1% SDS.
  • the temperature at the time of pre-hybridization, hybridization, or the second washing to be higher, more stringent conditions can be obtained.
  • the temperature of the prehybridization and the hybridization can be 60 ° C
  • the stringent condition can be 68 ° C.
  • Those skilled in the art can set conditions by considering other conditions such as probe concentration, probe length, probe base sequence composition, reaction time, etc. in addition to conditions such as buffer salt concentration and temperature. can do.
  • SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5 group strength, which is a stringent condition with respect to the polynucleotide having at least one selected base sequence power
  • the present invention relates to a reagent for identifying the type of spinal nerve cell, which contains a polynucleotide that is noblyzed below as an active ingredient.
  • the polynucleotide in the reagent of the present invention is not particularly limited in its chain length as long as the expression of the Corll gene can be specifically detected, but is generally complementary to the base sequence of the Corll gene. It is a polynucleotide comprising a base sequence comprising at least 15 consecutive bases. Such a polynucleotide having a nucleotide sequence including at least 15 consecutive bases can be a probe for detecting the expression of Corll mRNA, or a primer for amplifying and detecting Corll mRNA. Normally 15 to 10 when used as a probe It is desirable that the polynucleotide is composed of 0, preferably 15 to 35 bases. Further, when used as a primer, a polynucleotide composed of at least 15 bases, preferably about 30 before and after, is desirable.
  • the polynucleotide When used as a probe, the polynucleotide is appropriately labeled with a radioisotope or a non-radioactive compound.
  • the 3 'end region of the polynucleotide When used as a primer, the 3 'end region of the polynucleotide is complementary to the target sequence, and a restriction enzyme recognition sequence, tag, etc. are added to the 5' end side. Can be designed.
  • Such a polynucleotide having at least 15 consecutive base sequences can be hybridized to the CorRNA.
  • Polynucleotides include non-natural bases such as 4-acetylcytidine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uridine, 2, -0-methylcytidine, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxyl.
  • the polynucleotide that is the active ingredient of the reagent of the present invention is based on the known sequence information of Corll. Therefore, it can also be produced by chemical synthesis. In addition, it can be prepared from cells that express the Corll gene using a hybridization method, a PCR method, or the like.
  • the Corll gene can be used in combination with other known markers, whereby the spinal nerve cell type is identified in more detail. It becomes possible. Therefore, the present invention relates to a polynucleotide that hybridizes to the transcription product of the Corll gene, Brn3a, Pax2, Lbxl, Liml, Lim2, LH2A, LH2B, Isll, Lmxlb, Tlxl (Nat Rev Neurosci. 2003 Apr; 4 ( 4): 289- 97 Caspary T, Anderson KV. Patterning cell types in the dorsal spinal cord: what the mouse mutan ts say.) And Tk3 (Nat Rev Neurosci.
  • kits for identifying spinal cord neuron types comprising a combination with a polynucleotide that hybridizes to a transcript of one or more genes selected from the group of others.
  • the polynucleotide is stringent with respect to the polynucleotide having the nucleotide sequence ability described in at least one selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5.
  • the present invention relates to a kit for discriminating the types of spinal nerve cells, which contains a polynucleotide that can be noisy under various conditions as an active ingredient.
  • the nucleotide sequence of mouse Brn3a is SEQ ID NO: 7, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 8, the nucleotide sequence of human Brn3a is SEQ ID NO: 9, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 10, and the nucleotide sequence of rat Brn3a is sequenced.
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
  • the Brn3a gene can be defined as an endogenous DNA that also selects the following (1) to (4) forces, as in the case of the Corll gene described above.
  • DNA encoding a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, 10, or 12 (2) DNA comprising the base sequence described in any one of SEQ ID NOS: 7, 9, and 11,
  • the base sequence of mouse Pax2 is shown in SEQ ID NO: 13, the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 14, the base sequence of human Pax2 is shown in SEQ ID NO: 15, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the Pax2 gene can be defined as endogenous DNA that is selected from the following (1) to (4) forces.
  • the base sequence of mouse Lbxl is shown in SEQ ID NO: 17, the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 18, the base sequence of human Lbxl is shown in SEQ ID NO: 19, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 20.
  • the Lbxl gene can be defined as the endogenous DNA selected from the following (1) to (4).
  • the base sequence of mouse Liml is shown in SEQ ID NO: 21, the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 22, the base sequence of human Liml is shown in SEQ ID NO: 23, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 24.
  • the Liml gene can be defined as endogenous DNA that is selected from the following (1) to (4).
  • the base sequence of mouse Lim2 is SEQ ID NO: 25, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 26, the base sequence of human Lim2 is SEQ ID NO: 27, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 28, and the base sequence of rat Lim2 is sequenced.
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 30.
  • the Lim2 gene can be defined as an endogenous DNA selected from the following (1) to (4) forces.
  • DNA of another vertebrate corresponding to the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 25, 27 and 29.
  • the mouse Isll base sequence is SEQ ID NO: 31, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 32, the human Isll base sequence is SEQ ID NO: 33, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 34, and the Hsll base sequence is Arrangement Column number: 35, the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 36.
  • the Isll gene can be defined as endogenous DNA that is selected from the following (1) to (4) forces.
  • LH2A gene can be defined as endogenous DNA for which the following (1) to (4) forces are also selected.
  • the base sequence of mouse LH2B is SEQ ID NO: 41, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 42, the base sequence of human LH2B is SEQ ID NO: 43, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 44, and the base sequence of rat LH2B is SEQ ID NO: 45, amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 46.
  • the LH2B gene can be defined as endogenous DNA that is selected from the following (1) to (4) forces.
  • Another vertebrate DNA corresponding to the DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 41, 43, and 45.
  • the base sequence of mouse Lmxlb is SEQ ID NO: 47
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 48
  • the base sequence of human Lmx lb is SEQ ID NO: 49
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 50
  • the base sequence of rat Lmxlb is SEQ ID NO: 51
  • amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 52.
  • the Lmxlb gene can be defined as an endogenous DNA selected from the following (1) to (4) forces.
  • SEQ ID NO: 47, 49 DNA comprising the nucleotide sequence according to any one of 51,
  • Tlx 1 gene can be defined as the endogenous DNA that is selected from (1) to (4) below.
  • Tlx3 The base sequence of mouse Tlx3 is shown in SEQ ID NO: 57, the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 58, the base sequence of human Tlx3 is shown in SEQ ID NO: 59, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 60.
  • the Tlx 3 gene can be defined as the endogenous DNA selected from the following (1) to (4) force
  • the kit of the present invention may appropriately contain reagents for detecting the expression of transcripts of Corll and other marker genes, buffers and the like. You can also package instructions that describe how to use the kit.
  • the present invention also provides a reagent for identifying the type of spinal nerve cell, which contains an antibody that binds to the translation product of the Corll gene as an active ingredient. Furthermore, in a preferred embodiment of the present invention, the amino acid sequence according to at least one selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6 is used. The present invention relates to a reagent for identifying the type of spinal nerve cell, which contains a binding antibody as an active ingredient.
  • Antibodies that are active ingredients of the reagent of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies (scFv) (Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83; The Pharmacology of Monoclonal Antibody, Vol. 113, Rosenburg and Moore ed., Springer Verlag (1994) pp. 269-315), humanized antibody, multispecific antibody (LeDous Sal et al. (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7: 58-62; Paulus (1985) Behring Inst. Mitt.
  • the body may be modified with PEG or the like as necessary. It can also be produced as a fusion protein with ⁇ -galatatosidase, maltose binding protein, GST, green fluorescent protein (GFP), etc., so that it can be detected without using a secondary antibody. It can also be modified so that the antibody can be detected and recovered using avidin, streptavidin, or the like by labeling the antibody with piotin or the like.
  • Polyclonal antibodies can be obtained, for example, from serum collected from an immunized animal by immunizing a mammal with a purified Corll polypeptide or a fragment thereof together with an adjuvant as necessary.
  • Mammals used here are not particularly limited, but rodents, rabbits, and primates are common. Examples include rodents such as mice, rats, and hamsters, maggots such as magpies, and primates such as monkeys such as power-quiskeys, monkeys, baboons, and chimpanzees.
  • the sensitizing antigen is appropriately diluted and suspended in Phosphate-Buffered Saline (PBS) or physiological saline, etc., mixed with an adjuvant as necessary, emulsified, and then intraperitoneally or subcutaneously. It is done by injection. Thereafter, a sensitizing antigen preferably mixed with Freund's incomplete adjuvant is administered several times every 4 to 21 days. Antibody production can be confirmed by measuring the desired antibody level in serum by a conventional method. Finally, the serum itself may be used as a polyclonal antibody or may be further purified. As a specific method, for example, “Current Protocols in Molecular Biology” (John Wiley & Sons (1987) Section 11.12-11.13) can be referred to.
  • the spleen is removed from the animal immunized as described above, immune cells are separated from the spleen, and appropriate myeloma cells and polyethylene glycol (PEG) are isolated. ) Etc. to create a no, an hybridoma.
  • Cell fusion can be carried out according to Milstein's method (Galfre and Milstein (1981) Methods Enzymol. 73: 3-46).
  • myeloma cells especially fusion cells can be selected by drugs Prefer cell to do.
  • HAT culture medium a culture medium containing hypoxanthine, aminobreterin, and thymidine that die other than the fused cells.
  • a clone that produces an antibody that binds to the Corll polypeptide or a fragment thereof is selected from the generated hybridoma.
  • the selected clone is transplanted into the abdominal cavity of a mouse or the like, and ascites is collected to obtain a monoclonal antibody.
  • “Current Protocols in Molecular Biology Joohn Wiley & Sons (1987) Section 11.4—11.11) can also be referred to.
  • Ibridoma sensitized human lymphocytes initially infected with EB virus with an immunogen in vitro, and fused the sensitized lymphocytes with human-derived myeloma cells (such as U266). It can also be obtained by a method for obtaining a hyperidoma that produces human antibodies (Japanese Patent Laid-Open No. 63-17688). Human antibodies can also be obtained using antibody-producing cells produced by sensitizing a transgenic animal having a repertoire of human antibody genes (WO92 / 0391 8; WO93 / 02227; WO94 / 02602; W094). WO25 / 34096; Mendez et al. (1997) Nat. Genet. 15: 146-56 etc.). An example of using no hyperidoma is a method in which an oncogene is introduced into immune cells such as antibody-producing lymphocytes and immortalized.
  • Antibodies can also be produced by gene recombination technology (Borrebaeck and Larrick).
  • the gene encoding the antibody is cloned into a hyperidoma or antibody-producing cell (such as sensitized lymphocyte).
  • the obtained gene is incorporated into an appropriate vector, the vector is introduced into a host, and the host is cultured to produce antibodies.
  • a recombinant antibody is also included in the active ingredient of the reagent of the present invention.
  • Typical recombinant antibodies include chimeric antibodies composed of non-human antibody-derived variable regions and human antibody-derived constant regions, non-human antibody-derived complementarity determining regions (CDRs), and human antibody-derived frame regions ( (FR) and constant region and potent human ivy antibody (Jones et al. (1986) Nature 321: 522-5; Reichmann et al. (1988) Nature 332: 323-9; Presta (1992) Curr. O p. Struct. Biol. 2: 593-6; Methods Enzymol. 203: 99-121 (1991)).
  • CDRs non-human antibody-derived complementarity determining regions
  • FR human antibody-derived frame regions
  • the antibody fragment is the above-described polyclonal or monoclonal antibody, papain, pepsin. It can manufacture by processing with enzymes, such as. Alternatively, it can be produced by genetic engineering using a gene encoding an antibody fragment (Co et al. (1994) J. Im ⁇ nol. 152: 2968-76; Better and Horwitz (1989) Methods Enzymol 178: 476-96; Pluc kthun and Skerra (1989) Methods Enzymol. 178: 497-515; Lamoyi (1986) Methods Enzymol. 121: 652-63; Rousseaux et al. (1986) 121: 663-9; Bird and Walker (1991) Trends Biotechnol. 9: 132-7).
  • Multispecific antibodies include bispecific antibodies (BsAb), diabodies (Db), and the like.
  • Multi-characteristic antibodies consist of (1) a method of chemically coupling antibodies of different specificities with a heterobifunctional linker (Paulus (1985) Bohring Inst. Mill. 78: 118-32), (2) different monoclonals. Methods for fusing hybridomas that secrete antibodies (Millstein and Cuello (1983) Nature 3 05: 537-9), (3) Mouse myeloma cells using different monoclonal antibody light and heavy chain genes (4 types of DNA), etc. After transfecting the eukaryotic cell expression system of the gene and isolating the bispecific monovalent moiety (Zimmeremann (1986) Rev. Physio. Biochem.
  • Db is a dimeric antibody fragment composed of two divalent polypeptide chains constructed by gene fusion, and can be prepared by a known method (Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-8; EP404097; W093 / 11161).
  • Recovery and purification of antibodies and antibody fragments can be performed using proteins A and G.
  • it can be purified by the above-described protein purification technique in the same manner as polypeptides other than antibodies (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)).
  • protein A is used for purification of the antibody of the present invention
  • a protein A column such as Hyper D, POROS, or Sepharose F.F. (Pharmacia) is known and can be used.
  • the concentration of the obtained antibody can be determined by measuring its absorbance or by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or the like.
  • the antigen-binding activity of the antibody can be measured by absorbance measurement, fluorescent antibody method, enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), ELISA, or the like. Measure by ELISA
  • the Corll polypeptide or a fragment thereof is immobilized on a carrier such as a plate, and then a sample containing the target antibody is added.
  • a sample containing an antibody a culture supernatant of antibody-producing cells, a purified antibody, and the like can be considered.
  • a secondary antibody that recognizes an antibody that is an active ingredient of the reagent of the present invention is added, and the plate is incubated.
  • the plate is then washed and the label attached to the secondary antibody is detected. That is, when the secondary antibody is labeled with, for example, alkaline phosphatase, the antigen binding activity can be measured by adding an enzyme substrate such as trope-phosphate and measuring the absorbance.
  • an enzyme substrate such as trope-phosphate
  • a commercially available system such as BIAcore (Pharmacia) can also be used for antibody activity evaluation.
  • kits for identifying spinal cord neuron types comprising a combination with an antibody that binds to the translation product of.
  • a group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6 is selected from the group consisting of at least one amino acid sequence or a partial sequence thereof.
  • the present invention relates to a kit for identifying types of spinal nerve cells, which is contained as an active ingredient.
  • the kit of the present invention may appropriately contain a reagent for detecting the binding activity, a buffer solution and the like. You can also package instructions that describe how to use the kit.
  • the present invention also provides a method for discriminating the types of spinal nerve cells, comprising the step of detecting a transcription product or translation product of a Corll gene in the spinal cord nerve cells.
  • the detection of the transcript of the Corll gene in the method of the present invention is performed by the above-described method of the present invention. It can be carried out by contacting a nucleotide with a nucleic acid extract derived from a cell sample considered to contain spinal cord intercalation-euron, and detecting the nucleic acid that hybridizes with the polynucleotide in the nucleic acid extract. .
  • the polynucleotide probe is preferably labeled with a radioisotope or non-radioactive compound.
  • radioisotopes for labeling include 35 S, 3 H, and the like.
  • RNA binding to the marker can be detected by detecting silver particles by emulsion autoradiography.
  • piotin, digoxigenin and the like are known as a conventional non-radioactive isotope for labeling a polynucleotide probe.
  • the detection of the marker for labeling of piotin can be carried out using, for example, fluorescence or avidin labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase or horse radish peroxidase.
  • an enzyme labeled with an enzyme such as fluorescence or alkaline phosphatase or horse radish peroxidase can be used.
  • enzyme labels incubate with enzyme substrate and detect by depositing a stable dye at the marker location.
  • the transcript of the Corll gene is hybridized with the polynucleotide primer by a technique such as RT-PCR. It can be detected by amplifying the nucleic acid.
  • the detection of the translation product of the Corll gene in the method of the present invention comprises contacting the above-described antibody with a protein extract derived from a cell sample that is thought to contain spinal cord-interactive euron, and then detecting the protein binding to the antibody. It can be implemented by detecting.
  • the antibody antigen-binding activity can be measured by absorbance measurement, fluorescent antibody method, enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), ELISA, or the like.
  • a preferred embodiment for identifying spinal nerve cells of the present invention includes a method comprising the following steps.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5 Power of group strength Poly which hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising at least one selected base sequence Nucleotides,
  • At least one spinal nerve cell selected from the group force consisting of dll, dI2, dI3 and dI6 and dI4, dI5, dILA and A method comprising the step of discriminating at least one spinal nerve cell from which a group force consisting of dILB is also selected can be mentioned.
  • the preferred embodiment for identifying spinal cord neurons of the present invention is selected from the group consisting of Brn3a, Pax 2, Lbxl, Liml, Lim2, LH2A, LH2B, Isll, Lmxlb, Tkl, and Tlx3.
  • Spinal neurons expressing transcripts of one or more genes and Brn3a, Pax2 Expresses transcripts of one or more genes selected from the group consisting of Lbxl, Liml, Lim2, LH2A, LH2B, Isll, Lmxlb, Tlxl, and Tlx3.
  • the method including the process which can be mentioned.
  • Corll shows specific expression in differentiation-induced spinal cord interstitial-euron
  • it can be used in screening for spinal nerve cell differentiation-inducing reagents.
  • the present invention provides a screening method for a candidate compound for a spinal nerve subdivision induction reagent using the expression of Corll as an index, comprising the following steps (a) to (c).
  • cells capable of sorting into spinal nerve cells are preferably cell samples containing cells that can be induced to differentiate into spinal nerve cells, such as ES cells that are probably capable of spreading.
  • In vitro differentiation of spinal cord neurons can be achieved by known ES cells, bone marrow stromal cells, and nerve-derived immortalized cell lines (Japanese Patent Publication No. 8-509215; Japanese National Publication No. 11-506930; Japanese National Publication No. 2) No. 002-522070), neuronal progenitor cells (Japanese Patent Publication No. 11-509729), and the like as a starting material.
  • the test sample to be contacted with the cell may be any compound! /, But, for example, an expression product of a gene library, a synthetic low molecular compound library, a synthetic peptide library, an antibody, a bacterial release substance Cell (microbe, plant cell, animal cell) extract, cell (microbe, plant cell, animal cell) culture supernatant, purified or partially purified polypeptide, extract from marine organism, plant or animal, soil, random One phage peptide display library.
  • the transcription product or translation product of the Corll gene can be detected using a polynucleotide that hybridizes to the transcription product of the Corll gene or an antibody that binds to the translation product of the Corll gene.
  • Cell differentiation can be determined by comparison with the level of Corll expression in the absence of the test sample. That is, when the amount of the transcript or translation product of the Corll gene is increased compared to the case where it is detected in the absence of the test sample, the test sample is determined to have the ability to induce the differentiation of spinal cord neurons. it can.
  • “increase” means, for example, 2 times, preferably 5 times, more preferably 10 times or more.
  • test sample screened by this method can be a therapeutic drug candidate for a disease caused by any defect in spinal nerve cells as a spinal nerve cell differentiation-inducing reagent, and is considered useful.
  • the present invention relates to the use of the following (a) or (b) in the manufacture of a reagent for identifying the types of spinal nerve cells.
  • genes with different expression in the ventral and dorsal regions of the E12.5 mouse were identified by the subtraction (N-RDA) method.
  • One of the isolated fragments was a cDNA fragment encoding a protein with unknown function.
  • oligonucleotides were annealed and prepared to 100M.
  • ad2A acggaatgatgt (SEQ ID NO: 62)
  • ad3A accagagtctca (Tatsumi column number: 64)
  • ad4S ctgatgggtgtcttctgtgagtgtgt (SEQ ID NO: 65)
  • ad4A acacactcacag (eyes ti row number: 66)
  • ad5S ccagcatcgagaatcagtgtgacagt (eye C row 3 ⁇ 4 ⁇ No .: 67)
  • adl3A acgatcgacagt (SEQ ID NO: 70)
  • RNA is prepared using RNeasy mini kit (Qiagen) and cDNA synthesis kit (TAKAR
  • the cDNA amplified with ad2S was further amplified with 5 cycles of PCR. Amplification conditions were 94 ° C for 2 minutes, followed by 5 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes. And finally incubated at 72 ° C for 2 minutes. CDNA was purified and digested with Rsal using Qiaquick PCR purification kit (Qiagen). 3 g was used for each subtraction.
  • the cDNA amplified with ad2S was further amplified with 5 cycles of PCR. Amplification was performed at 94 ° C for 2 minutes, followed by 5 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes, and finally 72 ° C for 2 minutes. did.
  • CDNA was purified and digested with Rsal using Qiaquick PCR purification kit (Qiagen).
  • Ad3 was added to 60 ng of Rsal-deleted cDNA.
  • Tester and Driver prepared in 3 and 4 above were mixed, ethanol precipitated, and then dissolved in ⁇ CR buffer 1 ⁇ 1. After 5 minutes at 98 ° C., IxPCR buffer + lM NaCl 1 ⁇ 1 was added. After 98 minutes at 98 ° C, hybridization was performed at 68 ° C for 16 hours.
  • Hybridized cDNA was amplified by ad3S as a primer with 10 cycles of PCR (incubated at 72 ° C for 5 minutes, then 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes) The reaction was repeated 10 cycles), digested with Mung Bean Nuclease (TAKARA), and purified with Qiaquick PCR purification kit. Amplification was performed with 13 cycles of PCR. Amplification was performed at 94 ° C for 2 minutes, followed by 13 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes, and finally 72 ° C for 2 minutes. Incubated.
  • Subtraction 1x 1 of 2xPCR buffer was added to 8ng of cDNA amplified in the first round. After 5 minutes at 98 ° C, IxPCR buffer + 1M NaCl 2 ⁇ 1 was added. After 5 minutes at 98 ° C, hybridization was performed at 68 ° C for 16 hours.
  • the hybridized cDNA was digested with Rsal and purified with the Qiaquick PCR purification kit. This was amplified by 11 cycles of PCR using ad3S as a primer (incubated at 94 ° C for 2 minutes, then reacted at 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes) Eleven cycles were performed, and finally it was incubated at 72 ° C for 2 minutes. Digestion with Rsal was performed and ad4 was added.
  • A was cloned by RT-PCR.
  • TAKARA Pyrobest polymerase
  • Corll Fl GAGGTCGACATGGCATTGCTGTGTGGCCTTGGGAG (SEQ ID NO: 71)
  • Corll Rl GAGGTCGACCTAGGGCAGCAGCGGAGGCTTGAAGG (SEQ ID NO: 72)
  • the amplified cDNA was cloned into pCRII (Invitrogen), and the nucleotide sequence was analyzed using an ABI3100 sequence analyzer. As a result, it was confirmed that 936 amino acids were encoded, and this gene was named Corll.
  • the protein was found to be highly homologous to SnoN and Dach (Fig. 1).
  • a functionally unknown gene having high homology with Cor11 was found and named Corl2.
  • a Drosophila gene (CG11093) with high homology to Corll was also found, suggesting that it has an evolutionarily conserved function.
  • RNA PCR kit (TAKARA) and used in a cage type. PCR amplification was performed at 94 ° C for 2 minutes, followed by 35 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds, and finally at 72 ° C. Incubated for 2 minutes. PCR was performed with the following reaction solution composition.
  • Corll F2 ATGCAGAGAGCATCGCTAAGCTCTAC (SEQ ID NO: 73)
  • Corll R2 AAGCGGTTGGACTCTACGTCCACCTC (SEQ ID NO: 74)
  • Corll is specifically expressed in the brain and testis in adults (Fig. 2). It was also revealed that brain expression is higher in the fetal period than in the adult. [0087] Next, expression analysis by in situ hybridization was performed using the Corll gene according to the following protocol.
  • mice 12.5 day embryos were embedded in OCT, and fresh frozen sections with a thickness of 16 m were prepared. After drying on a slide glass, it was fixed with 4% PFA for 30 minutes at room temperature. After washing with PBS, hybridization (1 ⁇ g / ml DIGized RNA probe, 50% formamide, 5xSSC, 1% SDS, 50 ⁇ g / ml yeast RNA, 50 ⁇ g / ml Heparin) at 65 degrees For 40 hours. Thereafter, washing (50% formamide, 5 ⁇ SSC, 1% SDS) was performed at 65 ° C., and RNase treatment (5 ⁇ g / ml RNase) was performed at room temperature for 5 minutes.
  • Corll As a result of expression analysis by in situ hybridization, in E12.5, Corll showed specific expression in the central nervous system and was selectively expressed in some cells of the hindbrain and spinal cord. (Fig. 2). Furthermore, as a result of analyzing the expression using a cross-section of the spinal cord, it was found that Corll is expressed exclusively in the dorsal region in the developing spinal cord. These results indicate that Corll is selectively expressed in some populations of the fetal central nervous system.
  • a GST fusion protein expression vector was constructed with a region corresponding to amino acids 569-813 of Corll, an antigen required for immunization. After this vector was introduced into E. coli (JM109 strain), expression was induced by IPTG, and the fusion protein was recovered using dartathione beads. The rabbit was immunized several times with the fusion protein and then blood was collected, and the serum was also affinity purified with the GST-Collll antigen used for immunization to obtain an anti-Collll polyclonal antibody.
  • Corll showed only MU expression but not co-expression with Pax7.
  • all Corll positive cells expressed ⁇ -III tubulin, a progenitor cell marker committed to neurons.
  • Corll is specifically expressed in some cells of the spinal cord, and it is considered that Corll is useful as a marker for identifying the type of nerve cell.
  • Corll-expressing cells In the spinal cord on the dorsal side of the mouse, 6 types of interneurons from dll to (! 16 were produced in the early stage of development (E10-E11.5). E12-E13.5) are known to produce two types of intervening-eurons, dILA and dILB, from the same region. These neurons can be distinguished by their time of development and transcription factor markers that are selectively expressed in each. Therefore, the expression of Corll and various markers was compared in the early (E10.75) and late (E13.25).
  • Example 31 Corll expression in spinal nerve cells induced in vitro differentiation from ES cells
  • CCE cells an undifferentiated ES cell line, were added to Glasgow Minimum Essential Medium (Invitrogen), 10% Knockout serum replacement (Invitrogen), 2 mM L-glutmine (Invitrogen), O.lmM Non-essential amino acid (Invitrogen), ImM sodium pyruvate, sigma), 0. ImM 2—mercaptoethanol (sigma), lOOU / ml penicillin (Invitrogen), 100 ⁇ g / ml streptomycin (Invitrogen) Suspended at a rate of 1000 cells, seeded 10 1 on a plastic dish lid, and inverted and cultured for 2 days at 37 ° C, 5% carbon dioxide, 95% humidity.
  • Glasgow Minimum Essential Medium Invitrogen
  • 10% Knockout serum replacement Invitrogen
  • 2 mM L-glutmine Invitrogen
  • O.lmM Non-essential amino acid Invitrogen
  • ImM sodium pyruvate sigma
  • the formed cell mass (EB) was collected in the above medium, and 2 M retinoic acid (RA), sigma), 3; or 2 ⁇ M retinoic acid and 300 nM sonic hedg ehog (Shh) (R & D) And cultured for another 5 days.
  • the gene Corll specifically expressed in spinal cord interneurons dI4, dI5, dILA and dILB has been identified.
  • accurately identifying the type of nerve cells regenerated in the tissue or the type of nerve cells that have been induced to differentiate in vitro as a material to be transplanted is an important issue in terms of both safety and therapeutic efficacy. It becomes.
  • Corll as a cell type identification marker is considered useful.
  • the classification of dI4 and dI6 has been possible only by the location of the occurrence so far, that is, indistinguishable in neurons induced in an in vitro system that is distributed in a random arrangement. It became possible.

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Abstract

　本発明者らは、マウス胎児脳領域で選択的に発現する遺伝子をサブトラクション法で探索した結果、Corl1をコードするcDNA断片を得た。Corl1の発現をRT-PCR法、in situハイブリダイゼーション法およびポリクローナル抗体を用いた免疫染色法で調べたところ、Corl1は特に胎児期の中枢神経系に選択的に強く発現していた。次に、発現するニューロンの種類を同定するために、胎児脊髄でのCorl1の発現を各種マーカーと比較した結果、Corl1は脊髄介在ニューロンdI4, dI5, dILAおよびdILBに特異的に発現することが明らかになった。 　本発明により、これまで発生位置によってのみ分類が可能であったdI4とdI6を、Corl1の発現を指標として識別することが可能になった。

Description

明 細 書
Coril遺伝子を標的とした脊髄神経細胞の種類を識別する方法
技術分野
[0001] 本発明は、脊髄介在-ユーロン dI4, dI5, dILAおよび dILBに特異的に発現する遺伝 子 Corll、並びに、脊髄神経細胞の種類を識別するための該遺伝子の利用に関する 背景技術
[0002] 脊髄神経系は、運動および知覚の制御において非常に重要な役割を果たす中枢 神経系である。脊髄損傷などの脊髄神経系の障害に対する治療法として再生治療 法が検討されている。例えば、 ES細胞など力 in vitroで分ィ匕誘導させた脊髄神経細 胞を移植したり、患者自身の持つ神経幹細胞から in vivoで再生を促したりすることが 考えられている。
[0003] ES細胞から高効率に脊髄運動神経細胞を分化誘導する方法が開発されている（非 特許文献 1)。また、運動神経細胞特異的マーカー HB9遺伝子座に GFPをノックイン した ES細胞を用いることで、脊髄運動神経前駆細胞を純化することも可能となって!/ヽ る（非特許文献 1)。さらに、運動神経細胞以外の脊髄神経細胞についても、胎児期 の発生メカニズムの解明が進んでおり（非特許文献 2— 5)、この知識を応用すること で ES細胞および神経幹細胞力 各種脊髄神経細胞を効率よく作り出すことが可能に なるものと期待される。
[0004] ここで、再生治療の際、移植材料中の細胞集団を詳細に同定することは、治療効 果および安全面において重要となる。また、必要となる神経細胞のみを in vitroおよ び in vivoで分ィ匕誘導することも治療効果向上のために重要と考えられるが、その際 に個々の神経細胞を詳細に同定することは必須である。
[0005] 現在同定されている範囲で、脊髄には、約 15種類ほどの異なる神経細胞が存在し ている（非特許文献 2— 5)。一部の脊髄神経細胞については、選択的に発現する種 々のホメォボックス型転写因子が同定されており、これらの発現の組み合わせにより、 個々の脊髄神経細胞を同定することが出来る。 [0006] しかし、一部の脊髄神経細胞については未だ特異的に発現するマーカーが同定さ れておらず、発生する胎児期においては発生場所力 同定することが可能であるも のの、 in vitroで分化誘導した混在した脊髄神経細胞集団、 in vivoで発生後に移動し た脊髄神経細胞集団、および、成体で再生した脊髄神経細胞集団において、一部 の脊髄神経細胞集団を同定することは困難である。
[0007] なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
非特許文献 1： Wichterle H, Lieberam I, Porter AP and Jessell TM. Directed differen tiation of embryonic stem cells into moter neurons. Cell 2002 Aug; 110:385— 397 非特許文献 2 : Jessell TM. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signal s and transcriptional codes. Nat Rev Genetics 2000 Oct;l(l):20— 29. (Review) 非特許文献 3： Caspary T, Anderson KV. Patterning cell types in the dorsal spinal co rd: what the mouse mutants say. Nat Rev Neurosci. 2003 Apr ;4(4) : 289-97. (Review) 非特許文献 4 : Muller T, Brohmann H, Pierani A, Heppenstall PA, Lewin GR, Jessell TM, Birchmeier C. The homeodomain factor lbxl distinguishes two major programs of neuronal differentiation in the dorsal spinal cord. Neuron. 2002 May 16;34(4):551 -62.
非特許文献 5 : Gross MK, Dottori M, Goulding M. Lbxl specifies somatosensory ass ociation interneurons in the dorsal spinal cord. Neuron. 2002 May 16;34(4):535- 49. 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は脊髄神経細胞 の種類を識別するための方法および試薬を提供することにある。より詳しくは、本発 明は、内在性の CorlKCorepressor for Lbxl)遺伝子の発現を指標として、脊髄神経 細胞 dll、 dI2、 dI3、 dI4、 dI5、 dI6、 dILAまたは dILBを識別するための方法、および該 方法において内在性の Corll遺伝子の発現を検出するための試薬を提供することを 課題とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは上記課題を解決するために、マウス胎児脳領域で選択的に発現する 遺伝子をサブトラクシヨン法で探索した。その結果、 Corllをコードする cDNA断片を得 た。 Corllの発現を RT- PCR法、 in situハイブリダィゼーシヨン法およびポリクローナル 抗体を用いた免疫染色法で調べたところ、 Corllは特に胎児期の中枢神経系に選択 的に強く発現していた。次に、胎児脊髄での Corllの発現を詳細に検討した。発現す る-ユーロンの種類を同定するために各種マーカーと比較した結果、 Corllは脊髄介 在-ユーロン dI4、 dI5、 dILAおよび dILBに特異的に発現することが明らかになった。
[0010] 脊髄の-ユーロンは胎児期に発生し、それぞれがそれぞれの場所に移動して、最 終的な機能組織を構築する。知覚を伝達する介在-ユーロンは脊髄の背側で発生し 、最終的に Dorsal hornと呼ばれる領域に移動する。これらの-ユーロンの種類は、発 生時期および各種マーカーの発現で区別されている力 dI4と dI6を区別するマーカ 一は知られておらず、これまでは発生場所と移動の方向で区別されてきた。本発明 で明ら力となった脊髄神経細胞における Corllの特異的発現は、脊髄介在-ユーロン を識別するためのマーカーとして有用であると考えられる。より詳しくは、本発明は以 下の〔1〕〜〔19〕を提供するものである。
[0011] 〔1〕 Corll遺伝子の転写産物にハイブリダィズするポリヌクレオチドを有効成分として 含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するための試薬。
〔2〕配列番号： 1、配列番号： 3および配列番号： 5からなる群より選択される少なくとも 一つに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジヱントな条件下で ノ、イブリダィズするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、脊髄神経細胞の種類 を識別するための試薬。
〔3〕 Corll遺伝子の翻訳産物に結合する抗体を有効成分として含有する、脊髄神経 細胞の種類を識別するための試薬。
〔4〕配列番号 : 2、配列番号 :4、配列番号 : 6力 なる群より選択される少なくとも一つ に記載のアミノ酸配列またはその一部配列力 なるポリペプチドと結合する抗体を有 効成分として含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するための試薬。
〔5〕識別の対象となる脊髄神経細胞が dll、 dI2、 dI3、 dI4、 dI5、 dI6、 dILAまたは dILB である、〔1〕〜〔4〕のいずれか一項に記載の試薬。
〔6〕 Corll遺伝子の転写産物にハイブリダィズするポリヌクレオチドと、 Brn3a、 Pax2、 L bxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlb、 Tlxlおよび Tlx3からなる群より選択さ れる 1または複数の遺伝子の転写産物にハイブリダィズするポリヌクレオチドとの組合 せを含む、脊髄神経細胞の種類を識別するためのキット。
〔7〕配列番号： 1、配列番号： 3および配列番号： 5からなる群力も選択される少なくと も一つに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下 でハイブリダィズするポリヌクレオチドと、 Brn3a、 Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH 2B、 Isll、 Lmxlb、 Tlxlおよび Tlx3からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子 の転写産物に対してストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズするポリヌクレオチドと を有効成分として含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するためのキット。
〔8〕 Corll遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、 Brn3a、 Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 L H2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlb、 Tlxlおよび Tlx3からなる群より選択される 1または複数の 遺伝子の翻訳産物に結合する抗体との組合せを含む、脊髄神経細胞の種類を識別 するためのキット。
〔9〕配列番号： 2、配列番号： 4および配列番号： 6からなる群より選択される少なくとも 一つに記載のアミノ酸配列またはその一部配列力 なるポリペプチドと結合する抗体 と、 Brn3a、 Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlb, Tklおよび Tk3力 らなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とを有効 成分して含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するためのキット。
〔10〕識別の対象となる脊髄神経細胞が dll、 dI2、 dI3、 dI4、 dI5、 dI6、 dILAまたは dIL Bである、〔6〕〜〔9〕の!、ずれか一項に記載のキット。
〔11〕脊髄神経細胞の種類を識別するための方法であって、脊髄神経細胞における Corll遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出する工程を含む方法。
〔12〕Brn3a、 Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlbゝ Tklおよび Tlx3 力 なる群より選択される 1または複数の遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出 する工程を含む、〔11〕に記載の方法。
〔13〕識別の対象となる脊髄神経細胞が dll、 dI2、 dI3、 dI4、 dI5、 dI6、 dILAまたは dIL
Bである、〔11〕または〔12〕に記載の方法。
〔14〕脊髄神経細胞の種類を識別するための方法であって、 (1)配列番号： 1、配列番号: 3および配列番号： 5力 なる群より選択される少なくとも 一つに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジヱントな条件下で ハイブリダィズするポリヌクレオチド、
または
(2)配列番号： 2、配列番号： 4および配列番号： 6からなる群より選択される少なくとも 一つに記載のアミノ酸配列またはその一部配列力 なるポリペプチドと結合する抗体 を脊髄神経細胞に接触させる工程を含む方法。
〔15〕（l) Brn3a、 Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlbゝ Tklおよび T 1x3力 なる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の転写産物に対してストリンジェ ントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、
または
(2) Brn3aゝ Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlbゝ Tklおよび Tk3か らなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の翻訳産物に結合する抗体、 を脊髄神経細胞に接触させる工程を含む、〔14〕に記載の方法。
〔16〕dll、 dI2、 dI3および dI6からなる群力 選択される少なくとも一つの脊髄神経細 胞と dI4、 dI5、 dILAおよび dILBからなる群力も選択される少なくとも一つの脊髄神経 細胞とを識別する工程を含む、〔14〕または〔15〕に記載の方法。
〔17〕Brn3a、 Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlbゝ Tklおよび Tlx3 からなる群より選択される 1または複数の遺伝子の転写産物を発現する脊髄神経細 胞と、 Brn3aゝ Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlbゝ Tklおよび Tlx3 からなる群より選択される 1または複数の遺伝子の転写産物を発現して!/ヽな!、脊髄神 経細胞とを識別する工程を含む、〔14〕〜〔16〕のいずれか一項に記載の方法。 〔18〕脊髄神経細胞へ分化する能力のある細胞から脊髄神経細胞への分化を誘導 する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)被検試料の存在下で、脊髄神経細胞へ分化する能力のある細胞の脊髄神経細 胞への分化を誘導する工程、
(b)分ィ匕を誘導した細胞における Corll遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出す る工程
(c)被検試料の非存在下で検出した場合と比較して、該転写産物または翻訳産物の 量を増大させる化合物を選択する工程、
を含む方法。
〔19〕脊髄神経細胞へ分ィ匕する能力のある細胞が ES細胞である、〔18〕に記載の方 法。
また、本発明は、
〔20〕以下の (a)または (b)の、脊髄神経細胞の種類を識別するための試薬の製造に おける使用、
(a) Corll遺伝子の転写産物にハイブリダィズするポリヌクレオチド
(b) Corll遺伝子の翻訳産物に結合する抗体
に関する。
図面の簡単な説明
[図 l]Corllの構造および相同性を模式的に示す図である。
[図 2]Corllの成体マウス糸且織における発現、 E12.5マウス後脳及び脊髄における発現 を示す写真である。
[図 3]E13.25脊髄における Corll、 Pax7および j8 ΠΙ-tubulinの発現の比較を示す写真 である。
[図 4]Corllの E10.75脊髄における Corll、 Brn3a、 Limlおよび Isllの発現の比較を示 す写真である。
[図 5]Corllの E13.25脊髄における Corll、 Brn3a、 Limlの発現の比較を示す写真であ る。
[図 6]Corllの発生期脊髄における発現パターンを模式的に示す図である。「TFs」は 、転写調節因子を意味する。
[図 7]ES細胞より in vitroで分化誘導した脊髄神経細胞における Corllの発現を示す 写真である。
[図 8]ES細胞より in vitroで分ィ匕誘導した脊髄神経細胞における Corllの発現を示す 写真である。 発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明は、 Corll遺伝子の転写産物にノ、イブリダィズするポリヌクレオチドを有効成 分として含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するための試薬を提供する。本発明 のポリヌクレオチドは、その鎖長は特に制限されず、所謂「オリゴヌクレオチド」も本発 明のポリヌクレオチドに含まれる。
[0014] 本発明者らによって Corll遺伝子力 脊髄神経細胞のうち、 dI4、 dI5、 dILAおよび dl LBに実質的に発現し、 dll、 dI2、 dI3、および dI6では実質的に発現していないことが 示された。従って、本発明の試薬による細胞種の識別の対象となる脊髄神経細胞と しては、代表的には dll、 dI2、 dI3、 dI4、 dI5、 dI6、 dILAまたは dILBが挙げられる。
[0015] 本発明にお ヽて「脊髄神経細胞の種類を識別する」とは、対象となる脊髄神経細胞 が特定の種類の脊髄神経細胞であると識別する場合のみならず、対象となる脊髄神 経細胞が特定の種類の脊髄神経細胞ではな ヽと識別する場合も含まれる。例えば、 対象となる脊髄神経細胞にぉ ヽて Corll遺伝子が実質的に発現して ヽれば、該脊髄 神経細胞は「dI4、 dI5、 dILAまたは dILBの可能性がある」と識別することができ、また、 「dll、 dI2、 dI3、および dI6ではない」と識別することもできる。一方、対象となる脊髄神 経細胞にぉ 、て Corll遺伝子が実質的に発現して 、なければ、該脊髄神経細胞は「 dll、 dI2、 dI3、または dI6の可能性がある」と識別することができ、また、「dI4、 dI5、 dIL Aおよび dILBではな 、」と識別することもできる。
[0016] 本発明にお 、て脊髄神経細胞の種類を識別するための指標となる「Corll遺伝子」 としては、上記した脊髄神経細胞における発現特異性を示すものであれば特に制限 はなぐ種々の脊椎動物の Corll遺伝子を本発明にお 、て用いることができる。
[0017] マウス Corll遺伝子は公知であり、その塩基配列を配列番号： 1に、アミノ酸配列を 配列番号： 2に示す力 本発明の Corll遺伝子には、そのホモログ、例えば、ヒト Corll (塩基配列を配列番号： 3に、アミノ酸配列を配列番号: 4に示す)やラット Corll (塩基 配列を配列番号： 5に、アミノ酸配列を配列番号: 6に示す）が含まれる。また、 Corll 遺伝子にはァレリック変異体などの自然界にお 、て生じた変異体が存在する可能性 があり、そのような変異体も、本発明において脊髄神経細胞の種類を識別するための 指標となりうる。 [0018] 従って、本発明において用いられる「Corll遺伝子」は、下記 (1)〜(4)力 選択される 内因性の DNAとして定義することができる。
(1)配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコード する DNA、
(2)配列番号： 1、 3, 5のいずれかに記載の塩基配列からなる DNA、
(3)配列番号： 2、 4、 6のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァ ミノ酸が置換、欠失、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質 をコードする DNA、
(4)配列番号： 1、 3、 5のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAに対応する他の脊 椎動物の DNA
[0019] ァレリック変異体などの自然界にお!/、て生じた変異体における変異数は、配列番号
: 1、 3、 5のいずれかに記載の Corll遺伝子の塩基配列と比較して、典型的には、アミ ノ酸レベルで、 10アミノ酸以内（例えば、 5アミノ酸以内、 3アミノ酸以内）である。
[0020] また、特定の脊椎動物の DNAに対応する他の脊椎動物の DNAは、一般的に、特定 の脊椎動物の DNAと高い相同性を有する。高い相同性とは、 50%以上、好ましくは 7 0%以上、さらに好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上 (例えば、 95%以上、さ らには 96%、 97%、 98%または 99%以上)の相同性を意味する。この相同性は、 mBL ASTアルゴリズム (Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264—8; Karli n and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873- 7)によって決定すること ができる。また、特定の脊椎動物の DNAに対応する他の脊椎動物の DNAは、生体内 力も単離した場合、特定の脊椎動物の DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2 X SSC、 0.1% SDSゝ 50。C」、「2 X SSC、 0.1%SDSゝ 42。C」、「1 X SSCゝ 0.1%SDSゝ 37°C」、よりストリン ジェントな条件として「2 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」、「0.5 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」およ び「0.2 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」の条件を挙げることができる。
[0021] 本発明の試薬の有効成分であるポリヌクレオチドは、内在性の Corll遺伝子の転写 産物にハイブリダィズする。
ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば「2 X SSC、 0.1%SDS、 50°C」、「2 X S SC、 0.1%SDS、 42°C」、「1 X SSC、 0.1%SDS、 37°C」、よりストリンジェントな条件として 「2 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」、「0.5 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」及び「0.2 X SSC、 0.1 %S DS、 65°C」等の条件を挙げることができる。より詳細には、 Rapid-hyb buffer (Amersha m Life Science)を用いた方法として、 68°Cで 30分間以上プレハイブリダィゼーシヨンを 行った後、プローブを添加して 1時間以上 68°Cに保ってノ、イブリツド形成させ、その後 2 X SSC、 0.1%SDS中、室温で 20分間の洗浄を 3回行い、続いて 1 X SSC、 0.1%SDS 中、 37°Cで 20分間の洗浄を 3回行い、最後に 1 X SSC、 0.1%SDS中、 50°Cで 20分間の 洗浄を 2回行うことができる。その他、例えば Expresshyb Hybridization Solution (CLO NTECH)中、 55°Cで 30分間以上プレハイブリダィゼーシヨンを行った後、標識プロ一 ブを添カ卩して 37〜55°Cで 1時間以上インキュベートし、 2 X SSC、 0.1%SDS中、室温で 20分間の洗浄を 3回、 1 X SSC、 0.1%SDS中、 37°Cで 20分間の洗浄を 1回行うこともで きる。ここで、例えば、プレハイブリダィゼーシヨン、ハイブリダィゼーシヨンや 2度目の 洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることが できる。例えば、プレハイブリダィゼーシヨン及びハイブリダィゼーシヨンの温度を 60°C 、さらにストリンジヱントな条件としては 68°Cとすることができる。当業者であれば、この ようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ 、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味し、条件を設定する ことができる。
[0022] 本発明の好ましい態様においては、配列番号： 1、配列番号： 3および配列番号： 5 力 なる群力 選択される少なくとも一つに記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチド に対してストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドを有効成分と して含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するための試薬に関する。
[0023] 本発明の試薬におけるポリヌクレオチドは、 Corll遺伝子の発現を特異的に検出す ることができればその鎖長に特に制限はないが、一般的には、 Corll遺伝子の塩基配 列に相補的な少なくとも連続した 15塩基を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドで ある。このような少なくとも連続した 15塩基を含む塩基配列力 なるポリヌクレオチドは 、 Corll mRNAの発現を検出するためのプローブ、または Corll mRNAを増幅して検 出するためのプライマーでありうる。通常、プローブとして使用する場合には、 15〜10 0個、好ましくは 15〜35個の塩基より構成されたポリヌクレオチドであることが望ましい 。また、プライマーとして使用する場合には、少なくとも 15個以上、好ましくは 30個前 後の塩基より構成されるポリヌクレオチドが望ま 、。
[0024] プローブとして使用する場合には、ポリヌクレオチドは、適宜、放射性同位体または 非放射性ィ匕合物などで標識して用いられる。また、プライマーとして使用する場合に は、ポリヌクレオチドの 3'末端側の領域を標的とする配列に対して相補的にし、 5'末 端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加した形態に設計することができる。このよ うな少なくとも連続した 15塩基を含む塩基配列力 なるポリヌクレオチドは、 Corll mR NAに対してハイブリダィズすることができる。
[0025] ポリヌクレオチドは、天然以外の塩基、例えば、 4-ァセチルシチジン、 5- (カルボキシ ヒドロキシメチル)ゥリジン、 2，-0-メチルシチジン、 5-カルボキシメチルァミノメチル -2- チォゥリジン、 5-カルボキシメチルアミノメチルゥリジン、ジヒドロウリジン、 2' -0-メチル プソィドウリジン、 j8 -D-ガラクトシルキユエォシン、 2，-0-メチルグアノシン、イノシン、 N6-イソペンテ-ルアデノシン、 1-メチルアデノシン、 1-メチルプソィドウリジン、 1-メチ ルグアノシン、 1-メチルイノシン、 2,2-ジメチルグアノシン、 2-メチルアデノシン、 2-メチ ルグアノシン、 3-メチルシチジン、 5-メチルシチジン、 N6-メチルアデノシン、 7-メチル グアノシン、 5-メチルアミノメチルゥリジン、 5-メトキシァミノメチル -2-チォゥリジン、 β - D-マンノシルキユエオシン、 5-メトキシカルボ-ルメチル- 2-チォゥリジン、 5-メトキシカ ルポ-ルメチルゥリジン、 5-メトキシゥリジン、 2-メチルチオ- Ν6-イソペンテ-ルアデノ シン、 Ν- ((9- β -D-リボフラノシル- 2-メチルリオプリン- 6-ィル)力ルバモイル)トレオ- ン、 N-((9- j8 - D-リボフラノシルプリン- 6-ィル) Ν-メチルカルバモイル)トレオ-ン、ゥリ ジン- 5_ォキシ酢酸-メチルエステル、ゥリジン- 5-ォキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソ ィドウリジン、キユエォシン、 2-チオシチジン、 5-メチル -2-チォゥリジン、 2-チォゥリジ ン、 4-チォゥリジン、 5-メチルゥリジン、 N-((9- j8 - D-リボフラノシルプリン- 6-ィル)カル バモイル)トレォニン、 2，- 0-メチル -5-メチルゥリジン、 2，- 0-メチルゥリジン、ワイブト シン、 3-(3-ァミノ- 3-カルボキシプロピル)ゥリジン等を必要に応じて含んで!/、てもよ!/ヽ
[0026] 本発明の試薬の有効成分であるポリヌクレオチドは、 Corllの公知の配列情報に基 づいて化学合成により製造することもできる。また、 Corll遺伝子を発現する細胞より ノ、イブリダィゼーシヨン法、 PCR法等を利用して調製することができる。
[0027] 本発明における脊髄神経細胞の種類の識別においては、 Corll遺伝子に、他の公 知のマーカーを組み合わせて用いることができ、これにより、より詳細に脊髄神経細 胞の種類の識別を行うことが可能となる。従って、本発明は、上記 Corll遺伝子の転 写産物にハイブリダィズするポリヌクレオチドと、 Brn3a、 Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH 2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlb、 Tlxl (Nat Rev Neurosci. 2003 Apr;4(4):289- 97 Caspary T, Anderson KV. Patterning cell types in the dorsal spinal cord: what the mouse mutan ts say.)および Tk3 (Nat Rev Neurosci. 2003 Apr;4(4):289— 97 Caspary T, Anderson KV.)力 なる群より選択される 1または複数の遺伝子の転写産物にハイブリダィズす るポリヌクレオチドとの組合せを含む、脊髄神経細胞の種類を識別するためのキットも 提供する。
[0028] 本発明の好ましい態様においては、配列番号： 1、配列番号： 3および配列番号： 5 力 なる群より選択される少なくとも一つに記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチド に対してストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドと、 Brn3a、 Pax 2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlb、 Tlxlおよび Tlx3からなる群より選 択される少なくとも一つの遺伝子の転写産物に対してストリンジヱントな条件下でノヽィ ブリダィズするポリヌクレオチドとを有効成分として含有する、脊髄神経細胞の種類を 識別するためのキットに関する。
[0029] これらマーカー遺伝子の配列は、以下に示すように公知である。また、マーカー遺 伝子の脊髄神経細胞における発現特異性については、図 6を参照のこと。
[0030] マウス Brn3aの塩基配列を配列番号： 7、アミノ酸配列を配列番号： 8に、ヒト Brn3aの 塩基配列を配列番号： 9、アミノ酸配列を配列番号： 10に、ラット Brn3aの塩基配列を 配列番号： 11、アミノ酸配列を配列番号： 12に示す。本発明において Brn3a遺伝子と は、上記した Corll遺伝子の場合と同様に、下記 (1)〜(4)力も選択される内因性の DN Aとして定義することができる。
(1)配列番号： 8、 10、 12のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコー ドする DNA、 (2)配列番号： 7、 9、 11のいずれかに記載の塩基配列からなる DNA、
(3)配列番号： 8、 10、 12のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数の アミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク 質をコードする DNA、
(4)配列番号： 7、 9、 11のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAに対応する他の 脊椎動物の DNA。
[0031] マウス Pax2の塩基配列を配列番号： 13、アミノ酸配列を配列番号： 14に、ヒト Pax2 の塩基配列を配列番号： 15、アミノ酸配列を配列番号： 16に示す。本発明において Pax2遺伝子とは、下記 (1)〜(4)力 選択される内因性の DNAとして定義することがで きる。
(1)配列番号： 14または 16に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DN A、
(2)配列番号： 13または 15に記載の塩基配列力 なる DNA、
(3)配列番号： 14または 16に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、欠失、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコー ドする DNA、
(4)配列番号： 13または 15に記載の塩基配列からなる DNAに対応する他の脊椎動物 の DNA。
[0032] マウス Lbxlの塩基配列を配列番号： 17、アミノ酸配列を配列番号： 18に、ヒト Lbxl の塩基配列を配列番号： 19、アミノ酸配列を配列番号： 20に示す。本発明において Lbxl遺伝子とは、下記 (1)〜(4)力 選択される内因性の DNAとして定義することがで きる。
(1)配列番号： 18または 20に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DN A、
(2)配列番号： 17または 19に記載の塩基配列力 なる DNA、
(3)配列番号： 18または 20に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、欠失、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコー ドする DNA、 (4)配列番号： 17または 19に記載の塩基配列からなる DNAに対応する他の脊椎動物 の DNA。
[0033] マウス Limlの塩基配列を配列番号： 21、アミノ酸配列を配列番号： 22に、ヒト Liml の塩基配列を配列番号： 23、アミノ酸配列を配列番号： 24に示す。本発明にお 、て Liml遺伝子とは、下記 (1)〜(4)力 選択される内因性の DNAとして定義することがで きる。
(1)配列番号： 22または 24に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DN A、
(2)配列番号： 21または 23に記載の塩基配列力もなる DNA、
(3)配列番号： 22または 24に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、欠失、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコー ドする DNA、
(4)配列番号： 21または 23に記載の塩基配列からなる DNAに対応する他の脊椎動物 の DNA。
[0034] マウス Lim2の塩基配列を配列番号： 25、アミノ酸配列を配列番号： 26に、ヒト Lim2 の塩基配列を配列番号： 27、アミノ酸配列を配列番号： 28に、ラット Lim2の塩基配列 を配列番号： 29、アミノ酸配列を配列番号： 30に示す。本発明にお 、て Lim2遺伝子 とは、下記 (1)〜(4)力 選択される内因性の DNAとして定義することができる。
(1)配列番号： 26、 28、 30のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコ ードする DNA、
(2)配列番号： 25、 27、 29のいずれかに記載の塩基配列からなる DNA、
(3)配列番号： 26、 28、 30のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数 のアミノ酸が置換、欠失、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有するタン パク質をコードする DNA、
(4)配列番号： 25、 27、 29のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAに対応する他 の脊椎動物の DNA。
[0035] マウス Isllの塩基配列を配列番号： 31、アミノ酸配列を配列番号： 32に、ヒト Isllの塩 基配列を配列番号： 33、アミノ酸配列を配列番号： 34に、ラッ Hsllの塩基配列を配 列番号： 35、アミノ酸配列を配列番号： 36に示す。本発明において Isll遺伝子とは、 下記 (1)〜(4)力 選択される内因性の DNAとして定義することができる。
(1)配列番号： 32、 34、 36のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコ ードする DNA、
(2)配列番号： 31、 33、 35のいずれかに記載の塩基配列からなる DNA、
(3)配列番号： 32、 34、 36のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数 のアミノ酸が置換、欠失、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有するタン パク質をコードする DNA、
(4)配列番号： 31、 33、 35のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAに対応する他 の脊椎動物の DNA。
[0036] マウス LH2Aの塩基配列を配列番号： 37、アミノ酸配列を配列番号： 38に、ヒト LH2 Aの塩基配列を配列番号： 39、アミノ酸配列を配列番号: 40に示す。本発明におい て LH2A遺伝子とは、下記 (1)〜(4)力も選択される内因性の DNAとして定義することが できる。
(1)配列番号： 38または 40に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DN A、
(2)配列番号： 37または 39に記載の塩基配列力もなる DNA、
(3)配列番号： 38または 40に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、欠失、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコー ドする DNA、
(4)配列番号： 37または 39に記載の塩基配列からなる DNAに対応する他の脊椎動物 の DNA。
[0037] マウス LH2Bの塩基配列を配列番号： 41、アミノ酸配列を配列番号： 42に、ヒト LH2B の塩基配列を配列番号: 43、アミノ酸配列を配列番号: 44に、ラット LH2Bの塩基配 列を配列番号: 45、アミノ酸配列を配列番号: 46に示す。本発明において LH2B遺伝 子とは、下記 (1)〜(4)力 選択される内因性の DNAとして定義することができる。
(1)配列番号: 42、 44、 46のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコ ードする DNA、 (2)配列番号: 41、 43、 45のいずれかに記載の塩基配列からなる DNA、
(3)配列番号: 42、 44、 46のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数 のアミノ酸が置換、欠失、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有するタン パク質をコードする DNA、
(4)配列番号: 41、 43、 45のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAに対応する他 の脊椎動物の DNA。
[0038] マウス Lmxlbの塩基配列を配列番号： 47、アミノ酸配列を配列番号： 48に、ヒト Lmx lbの塩基配列を配列番号: 49、アミノ酸配列を配列番号： 50に、ラット Lmxlbの塩基 配列を配列番号： 51、アミノ酸配列を配列番号： 52に示す。本発明において Lmxlb 遺伝子とは、下記 (1)〜(4)力 選択される内因性の DNAとして定義することができる。
(1)配列番号: 48、 50、 52のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコ ードする DNA、
(2)配列番号: 47、 49、 51のいずれかに記載の塩基配列からなる DNA、
(3)配列番号: 48、 50、 52のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数 のアミノ酸が置換、欠失、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有するタン パク質をコードする DNA、
(4)配列番号: 47、 49、 51のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAに対応する他 の脊椎動物の DNA。
[0039] マウス Tlxlの塩基配列を配列番号： 53、アミノ酸配列を配列番号： 54に、ヒト Tlxlの 塩基配列を配列番号： 55、アミノ酸配列を配列番号： 56に示す。本発明において Tlx 1遺伝子とは、下記 (1)〜(4)力 選択される内因性の DNAとして定義することができる
(1)配列番号： 54または 56に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DN A、
(2)配列番号： 53または 55に記載の塩基配列力もなる DNA、
(3)配列番号： 54または 56に記載のアミノ酸配列にお 、て 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、欠失、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコー ドする DNA、 (4)配列番号： 53または 55に記載の塩基配列からなる DNAに対応する他の脊椎動物 の DNA。
[0040] マウス Tlx3の塩基配列を配列番号： 57、アミノ酸配列を配列番号： 58に、ヒト Tlx3の 塩基配列を配列番号： 59、アミノ酸配列を配列番号： 60に示す。本発明において Tlx 3遺伝子とは、下記 (1)〜(4)力 選択される内因性の DNAとして定義することができる
(1)配列番号： 58または 60に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DN A、
(2)配列番号： 57または 59に記載の塩基配列力もなる DNA、
(3)配列番号： 58または 60に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、欠失、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコー ドする DNA、
(4)配列番号： 57または 59に記載の塩基配列からなる DNAに対応する他の脊椎動物 の DNA。
[0041] 本発明のキットには、上記ポリヌクレオチドの他に、 Corllや他のマーカー遺伝子の 転写産物の発現を検出するための試薬、緩衝液等を、適宜含めることができる。更に はキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
[0042] 脊髄神経細胞における Corll遺伝子の発現特異性は、上記した転写レベルのみな らず、翻訳レベルにおいても認められた。従って、本発明はまた、 Corll遺伝子の翻 訳産物に結合する抗体を有効成分として含有する、脊髄神経細胞の種類を識別す るための試薬を提供する。さらに本発明の好ましい態様においては、配列番号： 2、 配列番号: 4および配列番号: 6力 なる群より選択される少なくとも一つに記載のアミ ノ酸配列またはその一部配列力 なるポリペプチドと結合する抗体を有効成分として 含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するための試薬に関する。
[0043] 本発明の試薬の有効成分である抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗 体、キメラ抗体、一本鎖抗体 (scFv)(Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83; The Pharmacology of Monoclonal Antibody, Vol. 113, Rosenburg and Moore ed., Springer Verlag (1994) pp. 269-315)、ヒト化抗体、多特異'性抗体 (LeDous sal et al. (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7: 58-62; Paulus (1985) Behring Inst. Mitt. 78 ： 118-32; Millstein and Cuello (1983) Nature 305: 537—9; Zimmermann (1986) Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 105: 176-260; VanDijk et al. (1989) Int. J. Cancer 43: 944-9)、並びに、 Fab、 Fab\ F(ab' )、 Fc、 Fv等の抗体断片が含まれる。このような抗
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体は必要に応じ、 PEG等により修飾されていてもよい。また、 β -ガラタトシダーゼ、マ ルトース結合タンパク質、 GST、緑色蛍光タンパク質 (GFP)等との融合タンパク質とし て製造して、二次抗体を用いずに検出できるようにすることもできる。また、ピオチン 等により抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の検 出、回収を行い得るように改変することもできる。
[0044] ポリクローナル抗体は、例えば、精製された Corllポリペプチドまたはその断片を、 必要に応じアジュバントと共に哺乳動物に免疫し、免疫した動物より採取される血清 より得ることができる。ここで用いる哺乳動物は、特に限定されないが、げっ歯目、ゥ サギ目、霊長目の動物が一般的である。マウス、ラット、ハムスター等のげつ歯目、ゥ サギ等のゥサギ目、力-クイザル、ァカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等 の霊長目の動物が挙げられる。動物の免疫化は、感作抗原を Phosphate-Buffered Sa line(PBS)または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混 合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射して行われる。その後、好ましく はフロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を 4〜21日毎に数回投与する。 抗体の産生は、血清中の所望の抗体レベルを慣用の方法により測定することにより 確認することができる。最終的に、血清そのものをポリクローナル抗体として用いても 良いし、さらに精製して用いてもよい。具体的な方法として、例えば『Current Protocol s in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987) Section 11.12- 11.13)を参照するこ とがでさる。
[0045] また、モノクローナル抗体を産生するためには、まず、上述のようにして免疫化した 動物より脾臓を摘出し、該脾臓より免疫細胞を分離し、適当なミエローマ細胞とポリエ チレングリコール (PEG)等と用いて融合してノ、イブリドーマを作成する。細胞の融合は 、 Milsteinの方法（Galfre and Milstein (1981) Methods Enzymol. 73: 3-46)に準じて 行うことができる。ミエローマ細胞としては、特に、薬剤により融合細胞を選択できるよ うにする細胞が好ま 、。このような薬剤による選択が可能なミエローマを使用した場 合、融合された細胞以外は死滅するヒポキサンチン、アミノブレテリンおよびチミジン を含む培養液 (HAT培養液)で培養することにより融合されたハイブリドーマを選択す ることができる。次に、作成されたノヽイブリドーマの中から、 Corllポリペプチドまたは その断片に対して結合する抗体を産生するクローンを選択する。その後、選択したク ローンをマウス等の腹腔内に移植し、腹水を回収してモノクローナル抗体を得る。ま た、具体的な方法として、『Current Protocols in Molecular BiologyJOohn Wiley & So ns (1987) Section 11.4— 11.11)を参照することもできる。
[0046] ノ、イブリドーマは、その他、最初に EBウィルスに感染させたヒトリンパ球を in vitroで 免疫原を用いて感作し、感作リンパ球をヒト由来のミエローマ細胞 (U266等)と融合し、 ヒト抗体を産生するハイプリドーマを得る方法 (特開昭 63— 17688号公報)によっても得 ることができる。また、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジエニック動物を 感作して製造した抗体産生細胞を用いても、ヒト抗体を得ることができる (WO92/0391 8; WO93/02227; WO94/02602; W094/25585; WO96/34096; Mendez et al. (1997) Nat. Genet. 15: 146- 56等）。ハイプリドーマを用いない例としては、抗体を産生するリ ンパ球等の免疫細胞に癌遺伝子を導入して不死化する方法が挙げられる。
[0047] また、遺伝子組換え技術により抗体を製造することもできる（Borrebaeck and Larrick
(1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies, MacMillan Publisheres LTD., UK参照;） 。そのためには、まず、抗体をコードする遺伝子をハイプリドーマまたは抗体産生細 胞 (感作リンパ球等)力 クローユングする。得られた遺伝子を適当なベクターに組み 込み、宿主に該ベクターを導入し、宿主を培養することにより抗体を産生させる。この ような組換え型の抗体も本発明の試薬の有効成分に含まれる。代表的な組換え型の 抗体として、非ヒト抗体由来可変領域およびヒト抗体由来定常領域とからなるキメラ抗 体、並びに非ヒト抗体由来相補性決定領域 (CDR)、およびヒト抗体由来フレームヮー ク領域 (FR)および定常領域と力 なるヒトイ匕抗体が挙げられる (Jones et al. (1986) Na ture 321: 522—5; Reichmann et al. (1988) Nature 332: 323—9; Presta (1992) Curr. O p. Struct. Biol. 2: 593-6; Methods Enzymol. 203: 99-121 (1991))。
[0048] 抗体断片は、上述のポリクローナルまたはモノクローナル抗体をパパイン、ペプシン 等の酵素で処理することにより製造することができる。または、抗体断片をコードする 遺伝子を用いて遺伝子工学的に製造することも可能である（Co et al. (1994) J. Im匪 nol. 152: 2968-76; Better and Horwitz (1989) Methods Enzymol. 178: 476-96; Pluc kthun and Skerra (1989) Methods Enzymol. 178: 497-515; Lamoyi (1986) Methods Enzymol. 121: 652-63; Rousseaux et al. (1986) 121: 663-9; Bird and Walker (1991) Trends Biotechnol. 9: 132- 7参照）。
[0049] 多特異性抗体には、二特異性抗体 (BsAb)、ダイァボディ (Db)等が含まれる。多特性 抗体は、（1)異なる特異性の抗体を異種二機能性リンカ一により化学的にカップリング する方法（Paulus (1985) Bohring Inst. Mill. 78: 118-32)、 （2)異なるモノクローナル 抗体を分泌するハイブリドーマを融合する方法（Millstein and Cuello (1983) Nature 3 05: 537-9)、 （3)異なるモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖遺伝子（4種類の DNA) によりマウス骨髄種細胞等の真核細胞発現系をトランスフ タトした後、二特異性の 一価部分を単離する方法（Zimmeremann (1986) Rev. Physio. Biochem. Pharmacol. 105: 176-260; Van Dijk et al. (1989) Int. J. Cancer 43: 944- 9)等により作製すること ができる。一方、 Dbは遺伝子融合により構築される二価の 2本のポリペプチド鎖から 構成されるダイマーの抗体断片であり、公知の手法により作製することができる（Holli ger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444—8; EP404097; W093/11161 参照)。
[0050] 抗体および抗体断片の回収および精製は、プロテイン Aおよび Gを用いて行うこと ができる。その他、抗体以外のポリペプチドと同様に、上記したタンパク質精製技術 によって精製することもできる（Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow and Da vid Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))。例えば、本発明の抗体の精製に プロテイン Aを利用する場合、 Hyper D、 POROS、 Sepharose F.F.(Pharmacia)等のプ 口ティン Aカラムが公知であり、使用可能である。得られた抗体の濃度は、その吸光度 を測定することにより、または酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA)等により決定するこ とがでさる。
[0051] 抗体の抗原結合活性は、吸光度測定、蛍光抗体法、酵素免疫測定法 (EIA)、放射 免疫測定法 (RIA)、 ELISA法等により測定することができる。 ELISA法により測定する 場合、 Corllポリペプチド又はその断片をプレート等の担体に固相化し、次いで目的 とする抗体を含む試料を添加する。ここで、抗体を含む試料としては、抗体産生細胞 の培養上清、精製抗体等が考えられる。続いて、本発明の試薬の有効成分である抗 体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。その後、プレートを 洗浄し、二次抗体に付加されている標識の検出を行う。すなわち、二次抗体が例え ばアルカリホスファターゼで標識されている場合には、 トロフエ-ルリン酸等の酵 素基質を添加して吸光度を測定することで、抗原結合活性を測定することができる。 また、抗体の活性評価に、 BIAcore (Pharmacia)等の市販の系を使用することもできる
[0052] 本発明の脊髄神経細胞の種類の識別においては、 Corll遺伝子の翻訳産物との組 み合わせにぉ 、て、他の公知のマーカー遺伝子の翻訳産物をも標的とすることがで きる。従って、本発明は、 Corll遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、 Brn3a、 Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlb、 Tlxlおよび Tlx3からなる群より選択さ れる 1または複数の遺伝子の翻訳産物に結合する抗体との組合せを含む、脊髄神経 細胞の種類を識別するためのキットも提供する。
[0053] さらに本発明の好ましい態様においては、配列番号： 2、配列番号: 4および配列番 号: 6からなる群力 選択される少なくとも一つに記載のアミノ酸配列またはその一部 配列からなるポリペプチドと結合する抗体と、 Brn3a、 Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A 、 LH2B、 Isll、 Lmxlb、 Tlxlおよび Tlx3からなる群より選択される少なくとも一つの遺 伝子の翻訳産物に結合する抗体とを有効成分として含有する、脊髄神経細胞の種 類を識別するためのキットに関する。
[0054] 本発明のキットには抗体の他に、結合活性を検出するための試薬、緩衝液等を、適 宜含めることができる。更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージし ておくことちできる。
[0055] 本発明は、また、脊髄神経細胞の種類を識別するための方法であって、脊髄神経 細胞における Corll遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出する工程を含む方法 を提供する。
[0056] 本発明の方法における Corll遺伝子の転写産物の検出は、上記した本発明のポリ ヌクレオチドと脊髄介在-ユーロンを含むと考えられる細胞試料由来の核酸抽出物と を接触させ、核酸抽出物中にお ヽて該ポリヌクレオチドとハイブリダィズする核酸を検 出することにより、実施することができる。
[0057] Corll遺伝子の転写産物を検出するために、ポリヌクレオチドプローブは、好ましく は放射性同位体または非放射性ィ匕合物で標識されたものである。例えば、標識する ための放射性同位体としては、 35S、 3H等を挙げることができる。放射標識したポリヌク レオチドプローブを用いた場合、エマルシヨンオートラジオグラフィ一により銀粒子を 検出することによりマーカーと結合する RNAを検出することができる。また、ポリヌクレ ォチドプローブの標識のため慣用の非放射性同位体としては、ピオチン、ジゴキシゲ ニン等が公知である。ピオチン標識マーカーの検出は、例えば、蛍光、または、アル カリ性ホスファターゼ若しくは西洋ヮサビペルォキシダーゼ等の酵素を標識したアビ ジンを用いて行うことができる。一方、ジゴキシゲニン標識マーカーの検出には、蛍光 、または、アルカリ性ホスファターゼ若しくは西洋ヮサビペルォキシダーゼ等の酵素を 標識した抗ジゴキシゲニン抗体を使用することができる。酵素標識を使用する場合に は、酵素の基質と共にインキュベートし、安定な色素をマーカー位置に沈着させるこ とで検出を行う。
[0058] Corll遺伝子の転写産物を検出するために、ポリヌクレオチドプライマーを用いた場 合には、 Corll遺伝子の転写産物は、例えば、 RT- PCRなどの手法により、該ポリヌク レオチドプライマ一とハイブリダィズする核酸を増幅することによって検出することが できる。
[0059] 本発明の方法における Corll遺伝子の翻訳産物の検出は、上記した抗体と脊髄介 在-ユーロンを含むと考えられる細胞試料由来のタンパク質抽出物とを接触させ、該 抗体と結合するタンパク質を検出することにより、実施することができる。抗体の抗原 結合活性の測定方法については、上述したように、吸光度測定、蛍光抗体法、酵素 免疫測定法 (EIA)、放射免疫測定法 (RIA)、 ELISA法等により測定することができる。
[0060] 本発明の方法においては、 Corll遺伝子の転写産物または翻訳産物にカ卩えて、 Brn 3a、 Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlbゝ Tklおよび Tk3からなる 群より選択される 1または複数の遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出することに より、より詳細な脊髄神経細胞の種類の識別を行うことが可能であり、このような方法 も本発明に含まれる。
本発明の脊髄神経細胞を識別するための好ましい態様として、以下の工程を含む 方法を挙げることができる。
(1)配列番号： 1、配列番号: 3および配列番号： 5力 なる群力 選択される少なくと も一つに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下 でハイブリダィズするポリヌクレオチド、
または
(2)配列番号： 2、配列番号： 4および配列番号： 6からなる群力 選択される少なくと も一つに記載のアミノ酸配列またはその一部配列力 なるポリペプチドと結合する抗 体、
を脊髄神経細胞に接触させる工程。
[0061] また本発明のより好ましい態様としては、上述の工程に加えてさらに以下の工程を 含む方法を挙げることができる。
(1) Brn3aゝ Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlbゝ Tklおよび Tk3か らなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の転写産物に対してストリンジェントな 条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、
または
(2) Brn3aゝ Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlbゝ Tklおよび Tk3か らなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の翻訳産物に結合する抗体、 を脊髄神経細胞に接触させる工程。
[0062] さらに本発明の好ましい態様としては、上述の工程にカ卩えてさらに、 dll、 dI2、 dI3お よび dI6からなる群力も選択される少なくとも一つの脊髄神経細胞と dI4、 dI5、 dILAお よび dILBからなる群力も選択される少なくとも一つの脊髄神経細胞とを識別する工程 を含む方法を挙げることができる。
[0063] また、本発明の脊髄神経細胞を識別するための好ま 、態様としては、 Brn3a、 Pax 2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlb, Tklおよび Tlx3からなる群より選 択される 1または複数の遺伝子の転写産物を発現する脊髄神経細胞と、 Brn3a、 Pax2 、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlb、 Tlxlおよび Tlx3からなる群より選択 される 1または複数の遺伝子の転写産物を発現して!/ヽな!ヽ脊髄神経細胞とを識別す る工程を含む方法を挙げることができる。
[0064] Corllは、分化誘導した脊髄介在-ユーロンにおいて特異的な発現を示すため、脊 髄神経細胞分化誘導試薬のスクリーニングにお ヽて利用することも考えられる。すな わち、被検試料の存在下で、脊髄神経細胞へ分化する能力のある細胞から脊髄神 経細胞への分化を誘導し、分化を誘導した細胞における Corllの発現を検出すること により、該被験試料に脊髄神経細胞の分化を誘導する能力があるか否かを決定する ことができる。従って、本発明は下記 (a)〜（c)の工程を含む、 Corllの発現を指標と する脊髄神経細分化誘導試薬の候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
(a)被検試料の存在下で、脊髄神経細胞へ分化する能力のある細胞から脊髄神経 細胞への分化を誘導する工程、
(b)分ィ匕を誘導した細胞における Corll遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出す る工程、
(c)被検試料の非存在下で検出した場合と比較して、該転写産物または翻訳産物の 量を増大させる化合物を選択する工程。
[0065] ここで「脊髄神経細胞へ分ィ匕する能力のある細胞」としては、好ましくは多分ィ匕能を 有する ES細胞等、脊髄神経細胞へと分化誘導され得る細胞を含む細胞試料である。 in vitroにおける脊髄神経細胞の分化誘導は、公知の ES細胞、骨髄間質細胞、神経 由来の不死化セルライン (特表平 8-509215号公報；特表平 11-506930号公報；特表 2 002-522070号公報)、ニューロン始原細胞 (特表平 11-509729号公報)等の細胞を出 発材料として方法が公知である。
[0066] 細胞と接触させる被験試料はどのような化合物であってもよ!/、が、例えば、遺伝子 ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、合成ペプチドライブラリー 、抗体、細菌放出物質、細胞 (微生物、植物細胞、動物細胞)抽出液、細胞 (微生物、 植物細胞、動物細胞)培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物 または動物等由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリ 一が挙げられる。 [0067] Corll遺伝子の転写産物または翻訳産物の検出は、上記したように、 Corll遺伝子 の転写産物にハイブリダィズするポリヌクレオチドや Corll遺伝子の翻訳産物に結合 する抗体を用いて検出することができる。
[0068] 細胞の分化は、被験試料の非存在下における Corll発現のレベルと比較することに より判定することができる。すなわち、被検試料の非存在下で検出した場合と比較し て、 Corll遺伝子の転写産物または翻訳産物の量を増大させる場合、該被験試料は 脊髄神経細胞の分化を誘導する能力を有すると判定できる。ここで「増大」とは、例え ば、 2倍、好ましくは 5倍、より好ましくは 10倍以上をいう。
[0069] 本方法によりスクリーニングされた被験試料は、脊髄神経細胞分化誘導試薬として 、脊髄神経細胞における何等かの欠陥が病因となって 、る疾病の治療薬候補となり 得、有用と考えられる。
[0070] さらに本発明は、以下の（a)または (b)の脊髄神経細胞の種類を識別するための試 薬の製造における使用に関する。
(a) Corll遺伝子の転写産物にハイブリダィズするポリヌクレオチド
(b) Corll遺伝子の翻訳産物に結合する抗体
[0071] なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0072] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
[0073] 「実施例 llCorllの単離と配列解析
胎児期脳領域特異的に発現する遺伝子を単離するために、 E12.5マウス中脳腹側 領域と背側領域で発現の異なる遺伝子をサブトラクシヨン (N-RDA)法により同定した。 単離した断片の一つは機能未知なタンパク質をコードする cDNA断片であった。
[0074] l.N- RDA法
1-1.アダプターの調製
下記のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、 100 Mに調製した。
(ad2: ad2S+ad2A、 ad3: ad3S+ad3A、 ad4: ad4S+ad4A、 ad5: ad5S+ad5Aゝ adl3: adl3S +adl3A)
ad2S: cagctccacaacctacatcattccgt (酉己列番号 : 61)
ad2A: acggaatgatgt (配列番号： 62)
ad3S: gtccatcttctctctgagactctggt (酉 C列 ¾·号： 6ό)
ad3A: accagagtctca (酉己列番 ： 64)
ad4S: ctgatgggtgtcttctgtgagtgtgt (配列番号： 65)
ad4A: acacactcacag (目 ti列番号： 66)
ad5S: ccagcatcgagaatcagtgtgacagt (目 C列 ¾·号： 67)
ad5A: actgtcacactg (酉己列番 ：68)
adl3S: gtcgatgaacttcgactgtcgatcgt (酉己列 号： o9)
adl3A: acgatcgacagt (配列番号： 70)
[0075] 1- 2.CDNA合成
日本 SLCより入手したマウス 12.5日胚より中脳腹側および中脳背側領域を切り出し た。 RNeasy mini kit (Qiagen)を用いて全 RNAを調製し、 cDNA synthesis kit (TAKAR
A)を用いて二本鎖 cDNAを合成した。制限酵素 Rsalで消化したのち、 ad2を付カ卩し、 a d2Sをプライマーとして、 15サイクルの PCRで cDNAを増幅した。増幅条件は 72°Cで 5 分インキュベートした後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、及び 72°Cで 2分の反応を 15サイ クル行い、最後に 72°Cで 2分インキュベートした。 N- RDAの PCRはすべて以下の反応 液組成で行った。
lO X ExTaq 5 ^ 1
2.5mM dNTP 4 μ 1
ExTaq 0.25 μ 1
100 μ Μ primer 0.5 μ 1
cDNA 2 μ 1
蒸留水 38.25 1
[0076] 1-3. Driverの作製
ad2Sで増幅した cDNAをさらに 5サイクルの PCRで増幅した。増幅条件は 94°Cで 2分 インキュベートした後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、及び 72°Cで 2分の反応を 5サイクル 行い、最後に 72°Cで 2分インキュベートした。 Qiaquick PCR purification kit (Qiagen) を用いて cDNAを精製し、 Rsal消化した。 1回のサブトラクシヨンに 3 gずつ使用した。
[0077] 1- 4.Testerの作製
ad2Sで増幅した cDNAをさらに 5サイクルの PCRで増幅した。増幅条件は 94°Cで 2分 インキュベートした後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、及び 72°Cで 2分の反応を 5サイクル 行い、最後に 72°Cで 2分インキュベートした。 Qiaquick PCR purification kit (Qiagen) を用いて cDNAを精製し、 Rsal消化した。 60ngの Rsal消ィ匕 cDNAに ad3を付カ卩した。
[0078] 1-5.サブトラクシヨン 1回目
上記 3及び 4で作製した Testerおよび Driverを混合し、エタノール沈殿した後に、 ΙχΡ CR buffer 1 μ 1に溶解した。 98°C5分の後、 IxPCR buffer+lM NaCl 1 μ 1を加えた。さら に 98°C5分の後、 68°Cで 16時間ハイブリダィズさせた。
ハイブリダィズさせた cDNAを ad3Sをプライマーとして 10サイクルの PCRで増幅した 後（72°Cで 5分インキュベートした後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、及び 72°Cで 2分の反 応を 10サイクル行った）、 Mung Bean Nuclease (TAKARA)で消化し、 Qiaquick PCR p urification kitで精製した。さらに 13サイクルの PCRで増幅した。増幅条件は 94°Cで 2 分インキュベートした後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、及び 72°Cで 2分の反応を 13サイ クル行い、最後に 72°Cで 2分インキュベートした。
[0079] 1-6.均一化
サブトラクシヨン 1回目で増幅した cDNA 8ngに 2xPCR buffer 1 μ 1をカ卩えた。 98°C5分 の後、 IxPCR buffer+lM NaCl 2 μ 1をカ卩えた。さらに 98°C5分の後、 68°Cで 16時間ハイ ブリダィズさせた。
ハイブリダィズさせた cDNAを Rsalで消化し、 Qiaquick PCR purification kitで精製し た。これを ad3Sをプライマーとして 11サイクルの PCRで増幅した後（94°Cで 2分インキュ ペートした後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、及び 72°Cで 2分の反応を 11サイクル行い、 最後に 72°Cで 2分インキュベートした） Rsalで消化し、 ad4を付カ卩した。
[0080] 1-7.サブトラクシヨン 2回目
上記 6で ad4を付カ卩した cDNA 20ngを Testerとして、上記 3の Driverと混合し、さらに、 上記 5と同様の方法でサブトラクシヨンを行った。最終的に Rsal消化した cDNAに ad5を 付加した。
[0081] 1-8.サブトラクシヨン 3回目
上記 7で ad5を付カ卩した cDNA 2ngを Testerとして、上記 3の Driverと混合し、さらに、 上記 5と同様の方法でサブトラクシヨンを行った。最終的に Rsal消化した cDNAに adl3 を付加した。
[0082] 1-9.サブトラクシヨン 4回目
上記 8で adl3を付カ卩した cDNA 2ngを Testerとして、上記 3の Driverと混合し、以下、 上記 5と同様の方法でサブトラクシヨンを行った。増幅した cDNAを pCRII (Invitrogen) にクロー-ングし、 ABI3100シーケンスアナライザーを用いて塩基配列を解析した。
[0083] 2.CDNA全長配列決定
N-RDA法で得られた cDNA断片の配列から Blast検索を行った結果、この遺伝子は 機能未知なタンパク質をコードする遺伝子（Genbank,accession No.: NM-172446)で あることが明らかになった。そこで、登録配列を参考にプライマーを設計し、全長 cDN
Aを RT- PCR法でクローユングした。
[0084] マウス 12.5日胚より間脳、中脳、後脳を含む脳領域を切り出した。 RNeasy mini kit (
Qiagen)を用いて全 RNAを調製し、 RNA PCR kit (TAKARA)を用いて 1本鎖 cDNAを 合成し、铸型に用いた。 PCRの増幅条件は、 94°Cで 5分インキュベートした後、 94°C で 30秒、 65°Cで 30秒、及び 72°Cで 5分の反応を 35サイクル行い、最後に 72°Cで 2分ィ ンキュペートした。 PCRは以下の反応液組成で行った。
10 X buffer 5
2.5mM dNTP 4 μ 1
Pyrobest polymerase (TAKARA) 0.5 μ i
100 μ M primer 0.5 μ 1
cDNA 1 μ 1
DMSO 2.5 ^ 1
蒸留水 36 1
プライマー配列
Corll Fl : GAGGTCGACATGGCATTGCTGTGTGGCCTTGGGAG (配列番号： 71) Corll Rl : GAGGTCGACCTAGGGCAGCAGCGGAGGCTTGAAGG (配列番号： 72 )
増幅した cDNAを pCRII (Invitrogen)にクローユングし、 ABI3100シーケンスアナライザ 一を用いて塩基配列を解析した。その結果、 936アミノ酸をコードすることが確認され 、この遺伝子を Corllと命名した。
[0085] Corllアミノ酸配列から Blast検索によりホモロジ一サーチを行った結果、 Corllは Ski,
SnoN, Dachと相同性の高いタンパク質であることが明らかになった（図 1)。また、 Cor 11と相同性の高い機能未知遺伝子も見出され、 Corl2と命名した。また、 Corllと相同 性の高いショウジヨウバエの遺伝子 (CG11093)も見出され、進化上保存された機能を 有することが示唆された。
[0086] 「実施例 2lCorllの発現解析
次に Corllの発現を解析した。まずは、成体マウス組織における発現を RT-PCR法 で解析した。
各組織全 RNA(Promega)に対して、 RNA PCR kit (TAKARA)を用いて 1本鎖 cDNAを 合成し、铸型に用いた。 PCRの増幅条件は、 94°Cで 2分インキュベートした後、 94°C で 30秒、 65°Cで 30秒、及び 72°Cで 30秒の反応を 35サイクル行い、最後に 72°Cで 2分 インキュベートした。 PCRは以下の反応液組成で行った。
10 X buffer 1 ^ 1
2.5mM dNTP 0.8 μ 1
ExTaq 0.05 μ 1
100 μ Μ primer 0.1 μ \
cDNA 1 μ 1
蒸留水 7.05 1
プライマー配列
Corll F2: ATGCAGAGAGCATCGCTAAGCTCTAC (配列番号： 73)
Corll R2: AAGCGGTTGGACTCTACGTCCACCTC (配列番号： 74)
その結果、 Corllは成体では脳および精巣に特異的に発現していることが明らかにな つた（図 2)。また、脳での発現は成体よりも胎児期の方が高いことも明らかとなった。 [0087] 次に、 Corll遺伝子を用いて以下のプロトコールにより in situハイブリダィゼーシヨン による発現解析を行った。
まず、マウス 12.5日胚を OCTで包埋し、厚さ 16 mの新鮮凍結切片を作製した。ス ライドガラス上で乾燥させた後に 4%PFAで室温 30分間固定した。 PBSで洗浄した後、 ハイブリダィゼーシヨン（1 μ g/mlDIG化 RNAプローブ、 50%ホルムアミド、 5xSSC, 1%SD S, 50 μ g/ml yeast RNA, 50 μ g/ml Heparin)を 65度で 40時間行った。その後、洗浄（ 50%ホルムアミド、 5xSSC, 1%SDS)を 65度で行い、 RNase処理（5 μ g/ml RNase)を室温 5分間行った。 0.2xSSCで 65度の洗浄、 lxTBSTで室温の洗浄ののち、ブロッキングお locking reagent: Roche)を行った。アルカリフォスファターゼ標識抗 DIG抗体（DAKO) を反応させ、洗浄（lxTBST、 2mM Levamisole)の後、 NBT/BCIP (DAKO)を基質とし て発色させた。
[0088] in situハイブリダィゼーシヨンによる発現解析の結果、 E12.5では、 Corllは中枢神経 系に特異的な発現を示し、後脳および脊髄の一部の細胞に選択的に発現しているこ とが明らかになった (図 2)。さらに脊髄横断切片を用いて発現を解析した結果、発生 期の脊髄では、 Corllは背側領域に限局して発現していることも明らかになった。以 上の結果から、 Corllは、胎児期の中枢神経系の一部の集団に選択的に発現するこ とが明らかになった。
[0089] 次に Corllのタンパク質レベルでの発現を解析した。以下の方法で抗 Corllポリクロ ーナル抗体を作製し、 E12.5脊髄における Corllタンパク質の発現を調べた。
まず免疫に必要な抗原である Corllの 569-813アミノ酸にあたる領域と GSTの融合 タンパク質発現ベクターを構築した。このベクターを E.coli(JM109株)に導入した後、 I PTGによって発現誘導し、ダルタチオンビーズを用いて融合タンパク質を回収した。 融合タンパク質をゥサギに数回免疫した後に採血し、その血清力も免疫に用いた GS T- Corll抗原による affinity精製を行うことによって、抗 Corllポリクローナル抗体を得た
[0090] 免疫染色は以下のプロトコールで行った。マウス E12.5を摘出し、 4%PFA/PBS (-)で 4 。C、 7時間固定したのち、 10%ショ糖/ PBS (-)で 4°C、 8時間、その後 20%ショ糖/ PBS (-) で 4°C、一晩置換し、 OCTで包埋した。厚さ 12 mの切片を作製し、スライドガラスに 貝占り付けた後、室温で 1時間乾燥させ、 0.1%TritonX-100/PBS (-)で 5分間、 PBS (-)で 5 分間湿潤させた。その後、ブロッキング (25%ブロックエース/ PBS (-))を室温、 30分間 行い、一次抗体を室温、 1時間反応させた後、さらに 4°Cで一晩反応させた。その後、 0.1%TritonX- 100/PBS (-)で、室温で 10分間の洗浄を 4回行った。次に蛍光標識した 2 次抗体を室温、 20分間反応させ、同様に洗浄を行った後、 PBS (-)によって室温で 10 分間の洗浄を 2回行い、封入した。蛍光シグナルは共焦点顕微鏡で検出した。
[0091] 抗 Corll抗体を用いた免疫染色の結果、 Corllの核内局在が認められ、また、発現 パターンとしては in situノヽイブリダィゼーシヨンと同様のパターンが観察された。した がって、 Corllは、 E12.5脊髄において mRNAだけでなくタンパク質としても発現してい ることが明らかになり、さらに、 in situ hybridizationおよび免疫染色のシグナルの特異 性が確認された。（図 2)。
[0092] E12.5では、神経管内ではァストロサイトやオリゴデンドロサイトはまだ発生しておら ず、したがって、 Corllは神経前駆細胞に発現すると考えられる。そこで、 Corllの神 経前駆細胞の分化段階における発現様式を検討した。一般に神経細胞は、増殖中 の progenitorが存在する脳室領域 (Ventricular Zone (VZ))で最終分裂を終え、すみ やかに外套層 (mantle layer(ML))に移動し、成熟することが知られている。まずは、 Co rllが増殖 progenitorに発現しているの力 あるいは分裂停止後の neural precursorに 発現しているのかを調べるために、増殖 progenitorマーカー Pax7と neural precursorマ 一力一 j8 -III tubulinの発現と Corllの発現を比較した。その結果、 Corllは MUこのみ 発現が認められ、 Pax7との共発現は認められな力 た。また、 Corll陽性細胞は全て 、神経細胞にコミットした前駆細胞マーカーである β -III tubulinを発現していた。以 上の結果から、 Corllは分裂停止後の neural precursorに特異的に発現していること が明らかになった（図 3)。
[0093] 脊髄の神経細胞は j8 -III tubulinを発現する頃には、その identityがすでに決定され て!、ることが知られて!/、る。 Corllは脊髄の一部の細胞で特異的に発現して 、たことと 合わせて、 Corllは神経細胞の種類を同定するためのマーカーとして有用であると考 えられる。そこで、次に Corll発現細胞の同定を試みた。マウス背側の脊髄では、発 生初期（E10-E11.5)には dll〜(！ 16までの 6種類の介在ニューロンが産生され、後期（ E12-E13.5)には dILA,dILBの 2種類の介在-ユーロンが同領域から産生されることが 知られている。これらの神経細胞は、その発生時期と、それぞれのに選択的に発現 する転写因子マーカーによって区別することができる。そこで、 Corllと各種マーカー の発現を初期（E10.75)および後期（E13.25)で比較した。
[0094] E10.75のマウス脊髄における Corllの発現を dll , dI2 , dI3 , dI5のマーカーである B rn3a、 dI3のマーカーである Isll、そして dI2 , dI4 , dI6のマーカーである Limlと比較し た結果、 dI3と dI6の間に Corll陽性細胞が発生し、 dI4の Liml , dI5の Brn3aと Corllが 共発現していたことから、 Corllは dI4 , dI5に特異的に発現していることが明らかにな つた。（図 4)。一方、 E13.25では、 dlLAマーカーである Limlおよび dlLBマーカーであ る Brn3a陽性細胞双方に Corllの共発現が認められため、 Corllは dlLA , dlLBの両方 に発現していることが明らかになった（図 5)。以上の結果から、 Corllは dI4 , dI5 , dIL A , dlLBに特異的に発現しており、これらを識別するためのマーカーとして有用であ ると考えられる（図 6)。特に、これまで発生場所からし力識別できな力つた dI4と dI6を 区別する初めてのマーカーとして、有用であると考えられる。
[0095] 「実施例 31ES細胞より in vitroで分化誘導した脊髄神経細朐における Corllの発現解 近
Corllが in vitroで分ィ匕誘導した脊髄神経細胞の識別に使用できるの力調べるため に、以下のプロトコールにより、 ES細胞より分ィ匕誘導した脊髄神経細胞における Corll の発現を解析した。
[0096] 未分化な ES細胞株である CCE細胞を、 Glasgow Minimum Essential Medium (Invitro gen)に 10% Knockout serum replacement (Invitrogen)、 2mM L- glutamine (Invitroge n)、 O.lmM Non-essential amino acid (Invitrogen)、 ImM sodium pyruvate、sigma)、 0. ImM 2— mercaptoethanol (sigma)、 lOOU/ml penicillin (Invitrogen)、 100 μ g/ml strept omycin (Invitrogen)を添カ卩したものに 10 μ 1あたり 1000個の細胞の割合で懸濁し、プラ スチックディッシュのふたに 10 1ずつ播き、逆さにして 37°C、二酸化炭素 5%、湿度 9 5%の条件で、 2日間培養した。その後、形成された細胞塊 (EB)を上記培地中に回 収し、 2 M retinoic acid (RA)、sigma)、 3;たは 2 μ M retinoic acidと 300nM sonic hedg ehog (Shh) (R&D)を添カ卩し、さらに 5日間培養した。その後、 PBS - (Sigma)で洗浄し、 4% paraformaldehyde I PBS - (和光）で 4°C、 20分間固定し、 PBS - (Sigma)で洗浄し た後、 0.2% Triton X- 100 / PBS -で透過処理し、 Block- ace (大日本製薬）でブロッ キングし、抗 Corll抗体（1:10希釈）と抗 Lim3抗体（1:50希釈、 Developmental studies h ybridoma bank)を室温で 1時間反応させた後、さらに 4°C、一晩反応させた。その後、 0.05% Tween20 / PBS -で洗浄し、 Cy3標識した抗ゥサギ免疫グロブリン抗体（10 g/ml、 Jackson)と FITC標識した抗マウス免疫グロブリン抗体（10 μ g/ml、 Jackson)を 室温で 1時間反応させた。その後、 0.05% Tween20 / PBS -で洗浄し、 Prolong (Mol ecular Probe)で包埋した。
[0097] その結果、 Shh非存在下での背側脊髄神経細胞を誘導した場合に、高頻度に Corl 1の発現細胞が観察された（図 7)。一方、 Shh存在下で腹側化した場合、 v2および mo terneuron (MN)のマーカーである Lim3陽性細胞が出現し、逆に Corll陽性細胞は減 少した。以上の結果から、 ES細胞より in vitroで分化誘導した脊髄神経細胞でもその 種類に依存して Corllは発現していることが明ら力となり、 Corllを細胞種識別マーカ 一として使用することが可能であることが確認された。
[0098] 次に、 ES細胞より分化誘導した脊髄神経細胞において、 in vivoの発現と同様に Cor 11が dI4, dI5に発現するかどうかを以下のプロトコールで調べた。
上記と同様の方法で分化誘導した後、 4%PFA/PBS (-)で 4°C、 2時間固定し、 10%ショ 糖/ PBS (-)で 4°C、ー晚、その後 20%ショ糖/ PBS (-)で 4°C、 6時間置換し、 OCTで包埋 した。厚さ 12 μ mの切片を作製し、スライドガラスに貼り付けた後、室温で 1時間乾燥さ せ、 0.1%TritonX-100/PBS (-)で 5分間、 PBS (-)で 5分間湿潤させた。その後、ブロッキ ング (25%ブロックエース/ PBS(-))を室温、 30分間行い、一次抗体を室温、 1時間反応 させた後、さらに 4°Cでー晚反応させた。その後、 0.1%TritonX-100/PBS (-)で、室温 で 10分間の洗浄を 4回行った。次に蛍光標識した 2次抗体を室温、 20分間反応させ、 同様に洗浄を行った後、 PBS (-)によって室温で 10分間の洗浄を 2回行い、封入した。 蛍光シグナルは共焦点顕微鏡で検出した。
[0099] その結果、 Corll/Liml共陽性および Corll/Brn3a共陽性細胞が見出され（図 8)、 C orllは ES細胞より in vitroで誘導させた脊髄神経細胞においても、マウス胎児脊髄と 同様の神経細胞における発現を示すことが確認された。 産業上の利用可能性
本発明により、脊髄介在ニューロン dI4、 dI5、 dILAおよび dILBに特異的に発現する 遺伝子 Corllが同定された。脊髄損傷などの再生医療時に、組織内で再生した神経 細胞、あるいは移植する材料として in vitroで分化誘導した神経細胞の種類を正確に 同定することは、安全性、治療効果の両面で重要な課題となる。この問題を克服する ために、細胞種識別マーカーとしての Corllは有用であると考えられる。特にこれまで 発生位置によってのみ分類が可能であった、すなわち、ランダムな配置で分ィ匕する in vitro系で誘導された神経細胞では識別不可能であった、 dI4と dI6の区別が Corllに よって可能になった。

Claims

請求の範囲
[1] Corll遺伝子の転写産物にハイブリダィズするポリヌクレオチドを有効成分として含 有する、脊髄神経細胞の種類を識別するための試薬。
[2] 配列番号： 1、配列番号: 3および配列番号： 5からなる群より選択される少なくとも一 つに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でノ、 イブリダィズするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、脊髄神経細胞の種類を 識別するための試薬。
[3] Corll遺伝子の翻訳産物に結合する抗体を有効成分として含有する、脊髄神経細 胞の種類を識別するための試薬。
[4] 配列番号: 2、配列番号 :4、配列番号 : 6力 なる群より選択される少なくとも一つに 記載のアミノ酸配列またはその一部配列からなるポリペプチドと結合する抗体を有効 成分として含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するための試薬。
[5] 識別の対象となる脊髄神経細胞が dll、 dI2、 dI3、 dI4、 dI5、 dI6、 dILAまたは dILBで ある、請求項 1〜4のいずれか一項に記載の試薬。
[6] Corll遺伝子の転写産物にハイブリダィズするポリヌクレオチドと、 Brn3a、 Pax2、 Lbx
1、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlb、 Tlxlおよび Tlx3からなる群より選択され る 1または複数の遺伝子の転写産物にハイブリダィズするポリヌクレオチドとの組合せ を含む、脊髄神経細胞の種類を識別するためのキット。
[7] 配列番号： 1、配列番号: 3および配列番号： 5からなる群力 選択される少なくとも 一つに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジヱントな条件下で ハイブリダィズするポリヌクレオチドと、 Brn3a、 Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2 B、 Isll、 Lmxlb、 Tlxlおよび Tlx3からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の 転写産物に対してストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドとを 有効成分として含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するためのキット。
[8] Corll遺伝子の翻訳産物に結合する抗体と、 Brn3a、 Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2
A、 LH2B、 Isll、 Lmxlb、 Tlxlおよび Tlx3からなる群より選択される 1または複数の遺 伝子の翻訳産物に結合する抗体との組合せを含む、脊髄神経細胞の種類を識別す るためのキット。
[9] 配列番号： 2、配列番号： 4および配列番号： 6からなる群より選択される少なくとも一 つに記載のアミノ酸配列またはその一部配列力 なるポリペプチドと結合する抗体と 、 Brn3a、 Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlbゝ Tklおよび Tk3から なる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の翻訳産物に結合する抗体とを有効成 分して含有する、脊髄神経細胞の種類を識別するためのキット。
[10] 識別の対象となる脊髄神経細胞が dll、 dI2、 dI3、 dI4、 dI5、 dI6、 dILAまたは dILBで ある、請求項 6〜9の!、ずれか一項に記載のキット。
[11] 脊髄神経細胞の種類を識別するための方法であって、脊髄神経細胞における Corl 1遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出する工程を含む方法。
[12] Brn3a、 Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlbゝ Tklおよび Tk3から なる群より選択される 1または複数の遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出する 工程を含む、請求項 11に記載の方法。
[13] 識別の対象となる脊髄神経細胞が dll、 dI2、 dI3、 dI4、 dI5、 dI6、 dILAまたは dILBで ある、請求項 11または 12に記載の方法。
[14] 脊髄神経細胞の種類を識別するための方法であって、
(1)配列番号： 1、配列番号: 3および配列番号： 5力 なる群より選択される少なくとも 一つに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジヱントな条件下で ハイブリダィズするポリヌクレオチド、
または
(2)配列番号： 2、配列番号： 4および配列番号： 6からなる群より選択される少なくとも 一つに記載のアミノ酸配列またはその一部配列力 なるポリペプチドと結合する抗体 を脊髄神経細胞に接触させる工程を含む方法。
[15] (l) Brn3aゝ Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlbゝ Tklおよび Tlx3 力 なる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の転写産物に対してストリンジェント な条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチド、
または
(2) Brn3aゝ Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlbゝ Tklおよび Tk3か らなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の翻訳産物に結合する抗体、 を脊髄神経細胞に接触させる工程を含む、請求項 14に記載の方法。
[16] dll、 dI2、 dI3および dI6からなる群力も選択される少なくとも一つの脊髄神経細胞と d 14、 dI5、 dILAおよび dILBからなる群力 選択される少なくとも一つの脊髄神経細胞と を識別する工程を含む、請求項 14または 15に記載の方法。
[17] Brn3a、 Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlbゝ Tklおよび Tk3から なる群より選択される 1または複数の遺伝子の転写産物を発現する脊髄神経細胞と、 Brn3a、 Pax2、 Lbxl、 Liml、 Lim2、 LH2A、 LH2B、 Isll、 Lmxlbゝ Tklおよび Tk3からな る群より選択される 1または複数の遺伝子の転写産物を発現して!/ヽな ヽ脊髄神経細 胞とを識別する工程を含む、請求項 14〜16のいずれか一項に記載の方法。
[18] 脊髄神経細胞へ分化する能力のある細胞から脊髄神経細胞への分化を誘導する 化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)被検試料の存在下で、脊髄神経細胞へ分化する能力のある細胞の脊髄神経細 胞への分化を誘導する工程、
(b)分ィ匕を誘導した細胞における Corll遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出す る工程
(c)被検試料の非存在下で検出した場合と比較して、該転写産物または翻訳産物の 量を増大させる化合物を選択する工程、
を含む方法。
[19] 脊髄神経細胞へ分ィ匕する能力のある細胞が ES細胞である、請求項 18に記載の方 法。
[20] 以下の (a)または (b)の、脊髄神経細胞の種類を識別するための試薬の製造にお ける使用。
(a) Corll遺伝子の転写産物にハイブリダィズするポリヌクレオチド
(b) Corll遺伝子の翻訳産物に結合する抗体
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