DE69429721T2

DE69429721T2 - Verwendung von neuronalen fötalen zellinien für transplantationstherapie

Info

Publication number: DE69429721T2
Application number: DE69429721T
Authority: DE
Inventors: Kris Bankiewicz; Eugene O. Major; Carlo S. Tornatore
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1993-04-13
Filing date: 1994-04-11
Publication date: 2002-09-05
Anticipated expiration: 2014-04-12
Also published as: DE69429721D1; US20020110546A1; ES2170096T3; ATE212237T1; EP0696205A1; DK0696205T3; CA2159738A1; AU6531294A; PT696205E; AU690548B2; JPH08509215A; US5690927A; US5869463A; EP0696205B1; WO1994023754A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur Behandlung eines Wirts, wobei man Zellen, die genetisch nicht verwandt sind, in den Wirt implantiert. Insbesondere stellt die Erfindung Zellen der Zelllinie ATCC CRL 8621 oder davon abgeleitete Zellen zur Behandlung eines Wirts durch Implantierung von immortalisierten, menschlichen, fötalen, von Nerven abgeleiteten Zellen bereit.
Die Organtransplantation ist eine erfolgreiche und weithin praktizierte Maßnahme zum Behandeln einer Vielzahl von Erkrankungen geworden. Herz-, Nieren- und sogar Lebertransplantate sind in vielen medizinischen Zentren nahezu Routine. Unglücklicherweise sind Erkrankungen oder Störungen vieler Organe einer Behandlung mit Ganzorgantransplantaten nicht zugänglich. Beispielsweise können Schädigungen des Zentralnervensystems nicht durch Ganzorgantransplantate behandelt werden, um geschädigtes Gewebe zu ersetzen.
Da das Ersetzen von verletztem Gewebe durch eine Ganzorgantransplantat-Therapie für viele Erkrankungen oder Störungen oder sogar für alle Patienten mit geeigneten Erkrankungen oder Störungen nicht möglich ist, sind Versuche unternommen worden, Verfahren zu entwickeln, um Zellen zu transplantieren. Sun et al., Biomat., Art. Cells, Art. Org., 15: 483-496 (1987). Parenchymschädigungen, die zu einem Mangel an einer biologisch aktiven Verbindung führen, können behandelt werden, indem isolierte Zellen oder Zellcluster, die die biologisch aktive Verbindung sezernieren, transplantiert werden. Beispielsweise sind an Diabetes leidende Tiere erfolgreich durch Impiantierung von Langerhans'-Inseln, die aus Spender-Bauchspeicheldrüsen abgetrennt worden sind, behandelt worden. Noel et al., Metabolism, 31: 184 (1982).
Die Zelltransplantat-Therapie ist für eine Behandlung von neurologischen Erkrankungen oder Störungen besonders reizvoll. Die Transplantation von festem Gewebe ist für neurologische Erkrankungen oder Störungen aus mehreren Gründen besonders ungeeignet. Eine im Rahmen eines chirurgischen Eingriffs erfolgende offene Freilegung des Gehirns, wie dies für eine Transplantation von festem Gewebe erforderlich wäre, kann Wegen des Nervensystems irreparablen Schaden zufügen, was zu klinischen neurologischen Defiziten führt. Auch hängen neurologische Funktionen oftmals von komplexen interzellulären Beziehungen ab, die nicht chirurgisch etabliert werden können. Ferner sind Zellen des Zentralnervensystems extrem empfindlich gegenüber Anoxie und Nährstoffentzug. Eine schnelle Vaskularisation von aus festem Gewebe bestehenden Transplantaten ist kritisch, da Zellen im Inneren von aus festem Gewebe bestehenden Transplantaten oftmals eine ausreichende Durchblutung fehlt, um die Lebensfähigkeit beizubehalten. Stenevi et al., Brain Res., 114: 1-20 (1976).
Ein häufiges neurologisches Syndrom, Parkinsonismus, ist Gegenstand von Versuchen hinsichtlich einer Zelltransplantat- Therapie gewesen. Björklund et al., Brain Res. 177: 555-560 (1979); Lindvall et al., Science, 247: 574-577 (1990); Freed, Restor. Neurol. Neurosci., 3: 109-134 (1991). Parkinsonismus wird durch einen Verlust von Dopamin produzierenden Neuronen in der Substantia nigra der basalen Ganglien verursacht. Burns et al., N. Engl. J. Med., 312: 1418-1421 (1985); Wolffet al., Neurobiology, 86: 9011-9014 (1989). Parkinson'-Krankheit, eine Erkrankung unbekannter Ätiologie, die durch die klinischen Manifestationen von Parkinsonismus gekennzeichnet ist, wird durch eine idiopathische Zerstörung dieser Dopamin-produzierenden Neuronen verursacht. Parkinsonismus kann durch verschiedene Arzneimittel, z. B. antipsychotische Mittel oder chemische Mittel, z. B. 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin, verursacht werden. Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4546-4550 (1983) und Bankiewicz et al., Life Sci., 39: 7-16 (1986).
Es sind Versuche unternommen worden, die klinischen Manifestationen von experimentell induziertem Parkinsonismus umzukehren, indem dopaminerge Zellen in das Striatum von betroffenen Tieren transplantiert wurden. Genetisch modifizierte Fibroblasten (mit Tyrosinhydroxylase kodierender DNA transfiziert) sind erfolgreich in Tiere transplantiert worden, die Schädigungen von dopaminergen Wegen aufwiesen. Nach der Implantierung der Dopamin produzierenden Fibroblasten besserten sich motorische Funktionen und Verhalten. Wolffet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 9011-9014 (1989); Fisher et al., Neuron, 6: 371-380 (1991). Das Überleben des Transplantats kann verbessert und folglich die klinische Besserung verlängert werden durch die Transplantation von fötalem Gewebe im Vergleich zu Zellen, die nach der Geburt erhalten worden sind. Gage und Fisher, Neuron, 6: 1-12 (1991). Frische fötale dopaminerge Neuronen sind in den Schweifkern von Affen nach einer chemischen Schädigung des nigrostriatalen Dopaminsystems transplantiert worden. Nach der Transplantation besserten sich die durch die Schädigung induzierten Verhaltensdefizite. Bankiewicz et al., J. Neurosurg., 72: 231-244 (1990) und Taylor et al., Prog. Brain Res., 82: 543-559 (1990).
Unter Parkinsonismus leidende Menschen sind durch Implantierung von dopaminergen Neuronen in das Striatum behandelt worden. Lindvall et al., Arch. Neurol., 46: 615-631 (1989); Widner et al., New Engl. J. Med., 327: 1556-1563 (1992). Die transplantierten Zellen wurden aus Schwangerschaftsabbrüchen erhalten. Vor den Schwangerschaftsabbrüchen wurden die Frauen auf Antikörper gegen mehrere krankheitserregende Viren gescreent.
Nach dem chirurgischen Eingriff zeigten die behandelten Patienten eine Verbesserung der neurologischen Funktionen. Bei den Patienten war jedoch das Fortführen der immunsuppressiven Therapie erforderlich.
Neuere Untersuchungen zeigen, dass trophische Faktoren, die aus Unterstützungszellen des Zentralnervensystems (z. B. Astrozyten und Oligodendrozyten) freigesetzt werden, für das Überleben von Neuronen in der Zellkultur kritisch sind. O'Malley et al., Exp. Neurol., 112: 40-48 (1991). Es ist gezeigt worden, dass implantierte Fibroblasten, die genetisch verändert worden sind, so dass sie Nervenwachstumsfaktor exprimieren, das Überleben von cholinergen Neuronen des basalen Vorderhirns nach einer Schädigung der Fimbria-Fornix, die den Tod von Acetylcholinneuronen im basalen Vorderhirn verursacht, wie er bei der Alzheimer'-Krankheit festgestellt wird, verbessern. Rosenberg et al., Science, 242: 1575-1577 (1988).
Obwohl frühere Versuche hinsichtlich einer Zelltransplantat- Therapie für neurologische Erkrankungen und Störungen ermutigende Ergebnisse geliefert haben, bleiben mehrere signifikante Probleme. Die Versorgung mit fötalem Gewebe für Zelltransplantate ist relativ begrenzt. Um eine maximale Lebensfähigkeit sicherzustellen, müssen die fötalen Zellen vor der Transplantation frisch geerntet werden. Dies erfordert ein Koordinieren des Implantierungsvorgangs mit elektiven Schwangerschaftsabbrüchen. Sogar dann ist in den Vereinigten Staaten fötales Gewebe nicht weithin erhältlich gewesen. Auch beeinflusst das Schwangerschaftsalter des Fötus, aus dem Zellen gewonnen werden, das Transplantatüberleben. Gage und Fisher, a.a.O. Das Gewinnen von fötalem Gewebe von nur bestimmten Schwangerschaftsaltern legt der Verfügbarkeit von fötalen Zellen für ein Transplantat weitere Beschränkungen auf. Ferner machen ethische Bedenken einige potentielle Transplantatempfänger zurückhaltend, sich der Prozedur zu unterziehen, wenn frische fötale Zellen implantiert werden.
Da das fötale Gewebe aus frischen Schwangerschaftsabbrüchen erhalten wird, besteht ein signifikantes Risiko einer infektiösen Kontaminierung. Obwohl Frauen, die sich Schwangerschaftsabbrüchen unterziehen, die fötales Gewebe bereitstellen werden, auf verschiedene Infektionen gescreent werden, sind einige Infektionen, z. B. HIV, möglicherweise klinisch nicht nachweisbar und werden folglich während des Screeningprozesses nicht identifiziert. Dementsprechend würden Transplantate von frischen fötalen Zellen, wenn diese Praxis weithin ausgeübt würde, wahrscheinlich viele Infektions-Folgeerscheinungen verursachen.
Die Verwendung von immortalisierten Zelllinien könnte viele dieser Schwierigkeiten von Erhältlichkeit und Infektion überwinden. Jedoch ist nur über eine immortalisierte, menschliche, fötale, von Nerven abgeleitete Zelllinie berichtet worden. Major et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 1257-1262 (1985) und U.S.-Patent Nr. 4,707,448. Ferner neigen immortalisierte Zelllinien aufgrund ihrer ureigenen Natur dazu, nach einer in vivo-Transplantation Tumorbildung zu verursachen. Dementsprechend tragen therapeutische intrazerebrale Transplantationen von immortalisierten Zellen ein hohes Risiko in sich, intrakraniale Tumore zu verursachen, und sogar Tumore mit einer benignen Histologie können eine schlechte Prognose mit sich bringen, wenn sie innerhalb der Calvaria vorliegen.
Transplantate von genetisch nicht-verwandten Zellen tragen das Risiko von immunologischer Transplantatabstoßung und intrazerebralen Entzündungen in sich. Widner und Brundin, Brain Res. Rev., 13: 287-324 (1988). Alle Transplantate von genetisch nicht-verwandten Zellen tragen dieses Risiko in sich. Dementsprechend war bei Patienten, die durch intrazerebrale Zelltransplantate behandelt worden sind, das Fortführen der Immunsuppression, die, sogar in Abwesenheit von transplantierten immortalisierten Zellen, ein hohes Risiko von Infektionen und malignen Komplikationen in sich trägt, über lange Zeit hinweg erforderlich. Die Transplantation von immortalisierten Zellen erhöht nur das Risiko dieser Komplikationen.
US-A-5032407 beschreibt Gentransferverfahren unter Verwendung von transformierten neodeterminierten embryonalen Zellen. Neugeborenen Mäusen werden immortalisierte embryonale Vorder- und Mittelhirnzellen, die transformiert worden sind, so dass sie einen Neomycinresistenz-Phänotyp zeigen, injiziert.
WO 91/06631 offenbart das Immortalisieren von aktivierten unreifen Ratten-Astrozyten unter Verwendung eines defekten Retrovirus, das das SV40-T-Antigen kodiert, von denen gezeigt worden ist, dass sie das Axonwachstum fördern.
WO 89/09816 offenbart ein Verfahren zum konditionellen Immortalisieren von Zellen aus dem Nervensystem von embryonalen Ratten durch die Verwendung einer temperaturempfindlichen Form des SV40-T-Antigens. Die Zellen werden aus der Unsterblichkeit freigegeben und differenzieren zu Zelltypen, die für Neuronen und Glia charakteristisch sind, wenn die Temperatur erhöht wird.
US-A-4707448 offenbart als ATCC CRL 8621 hinterlegte SVG- Zellen, die für eine Verwendung in dieser Erfindung geeignet sind.
Was in diesem Fachgebiet dringend benötigt wird, sind Verfahren, um immortalisierte, menschliche, fötale, von Nerven abgeleitete Zellen therapeutisch zu implantieren. Idealerweise würden die Verfahren nach einer Transplantation nicht zu Tumorbildung führen oder intensive Entzündungen hervorrufen.
Wünschenswerterweise könnten die Verfahren Zellen einsetzen, die von Zelllinien abgeleitet sind, so dass das Risiko einer infektiösen Kontamination und einer begrenzten Zellverfügbarkeit minimiert würde. Recht überraschend erfüllt die Erfindung diese und andere damit in Zusammenhang stehende Bedürfnisse.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt Zellen der Zelllinie ATCC CRL 8621 oder davon Abgeleitete zur Verwendung in einem Therapieverfahren bereit, welches die Behandlung von Parkinson'-Krankheit, Alzheimer'-Krankheit, Chorea Huntington, amyotrophischer Lateralsklerose oder multipler Sklerose umfasst, wobei man die Zellen in einen Wirt implantiert, der unter einem solchen Leiden leidet.
Die Zellen können von einer Membran, die für Antikörper nicht durchlässig ist, umschlossen sein.
Die Zellen können mit einem Vektor transfiziert worden sein, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein Peptid für eine Expression durch die Zellen, wie ein Enzym oder ein mit einer Erkrankung assoziiertes Antigen, kodiert.
Das Peptid kann Tyrosinhydroxylase sein.
Zu diesem Zweck können die Zellen mit einer Tyrosinhydroxylase kodierenden Nukleinsäuresequenz transfiziert sein, die operativ mit einem Transkriptionspromotor und einem Transkriptionsterminator verknüpft ist.
Die Erfindung umfasst die Verwendung der Zelllinie ATCC CRL 8621 oder von Zellen, die davon abgeleitet sind, für die Herstellung eines Arzneimittels für eine Verwendung zur Behandlung eines Wirts, der unter Parkinson'-Krankheit, Alzheimer'- Krankheit, Chorea Huntington, amyotrophischer Lateralsklerose oder multipler Sklerose leidet, wobei die Zellen in den Wirt implantiert werden.
Die Erfindung stellt ferner Zellen der Zelllinie ATCC CRL 8621 oder davon durch genetische Veränderung Abgeleitete bereit, die mit einem Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz, die ein Peptid kodiert, umfasst, für eine Expression einer therapeutischen Verbindung durch die Zellen transfiziert worden sind. Im allgemeinen wird die Zelllinie von menschlichen fötalen Astrozyten, wie der SVG-Zelllinie, abgeleitet sein. Die Zellen werden oftmals in das Zentralnervensystem des Wirts implantiert werden. Die Zellen können von Membranen umschlossen sein, die für Antikörper des Wirts nicht durchlässig sind.
In einigen Ausführungsformen der Erfindung können die Zellen mit einer ein Peptid kodierenden Nukleinsäuresequenz transfiziert sein. Die Peptide werden im allgemeinen Enzyme, wie Tyrosinhydroxylase, oder Wachstumsfaktoren, wie Nervenwachstumsfaktor, sein. Das Peptid kann auch ein mit einer Erkrankung assoziiertes Antigen sein. Die Zellen können für die Zwecke von Behandlung oder Prophylaxe implantiert werden. In einigen Fällen können die Zellen nach der Transplantation entfernt werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Morphologie von SVG-Zellen in vitro.
Fig. 2 veranschaulicht eine Immunperoxidaseanfärbung eines Antikörpers gegen das SV40-T-Protein in SVG-Zellen.
Fig. 3 zeigt den Weg der Nadel in den basalen Ganglien bei geringer Vergrößerung.
Fig. 4 veranschaulicht eine Ansicht eines Nadelwegs in den basalen Ganglien bei großer Vergrößerung.
Fig. 5 zeigt eine andere Ansicht eines Nadelwegs in den basalen Ganglien bei großer Vergrößerung.
Fig. 6 zeigt ein Nest von SVG-Zellen an der Wand des lateralen Ventrikels.
Fig. 7 veranschaulicht implantierte SVG-Zellen an der Wand des lateralen Ventrikels, die mit einem Antikörper gegen das saure Gliafibrillenprotein angefärbt sind.
Fig. 8 zeigt einen in vivo-Schnitt von implantierten SVG- Zellen, die mit anti-T-Protein-Antikörper angefärbt sind.
Fig. 9 zeigt ein T&sub1;-gewichtetes MRI (mit Gadolinium-Verstärkung) eines Affenhirns 6 Monate nach der Implantierung.
Fig. 10 zeigt das Wachstum eines Tyrosinhydroxylaseneurons an einer Schicht von implantierten SVG-Zellen in vivo.

BESCHREIBUNG DER SPEZIELLEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die Erfindung stellt eine Zelllinie für eine Verwendung in Verfahren zur Behandlung eines Wirts bereit, wobei man immortalisierte, menschliche, fötale Zellen, die von Zellen des Zentralnervensystems abgeleitet sind, implantiert. Transplantatabstoßung, intensive intrazerebrale Entzündungen und Tumorbildung sind nach einer Implantierung solcher Zellen in das Zentralnervensystem nicht beobachtet worden. Ferner ist gezeigt worden, dass die Zellen Neuronenwanderung und Neuritenverlängerung induzieren. Dies zeigt, dass die Zellen erfolgreich trophische Faktoren produzieren, die neuronale Reaktionen stimulieren.
Eine Implantierung von immortalisierten, menschlichen, fötalen Zellen, die von Zellen des Zentralnervensystems abgeleitet sind, stellt ein Mittel zum Behandeln vieler Krankheiten bereit. Beispielsweise kann die Parkinson'-Krankheit durch Implantierung dieser Zellen in die basalen Ganglien eines betroffenen Wirts behandelt werden. Die trophischen Faktoren, die durch die implantierten Zellen produziert werden, können den Tod von dopaminergen Neuronen hemmen und sogar die Regeneration von dopaminergen Neuronen induzieren. Die erhöhte Population von dopaminergen Neuronen kann eine klinische Besserung bei Personen, die unter Parkinsonismus leiden, bedingen. Alternativ können die implantierten Zellen mit DNA, die Tyrosinhydroxylase kodiert, transfiziert sein. Eine Expression von Tyrosinhydroxylase durch die implantierten Zellen ermöglicht es den Zellen, Dopamin zu produzieren und zu sezernieren. Folglich können die implantierten Zellen die Dopaminkonzentration in der Substantia nigra erhöhen und die Auswirkung des Verlusts von dopaminergen Neuronen begrenzen oder umkehren.
Die Zelllinie der Erfindung kann auch verwendet werden, um neurologische Erkrankungen, wie Chorea Huntington, Alzheimer'- Krankheit oder multiple Sklerose, zu behandeln. Da immortalisierte, menschliche, fötale, von Nerven abgeleitete Zellen mit dem Zentralnervensystem (ZNS) verträglich sind, können diese Zellen mit DNA-Sequenzen, die physiologisch aktive Peptide kodieren, transfiziert und in das ZNS implantiert werden. Beispielsweise kann das Peptid bei Chorea Huntington und amyotrophischer Lateralsklerose exzitatorisch wirkende Neurotransmitter, wie Glutamat, blockieren. Bei multipler Sklerose kann das Peptid ein trophischer Stimulator der Myelinisation, wie Plättchenwachstumsfaktor, sein oder kann ein ziliarer trophischer Faktor sein, der den Tod von Oligodendrozyten blockieren kann. Da diese Krankheiten stärker generalisiert sind als lokale Läsionen, können die Zellen auf einer Hirn- und Rückenmarksflüssigkeit ausgesetzten Oberfläche implantiert werden. Nach Expression und Sekretion wird das Peptid über die gesamte Oberfläche des Gehirns durch die natürliche Zirkulation der Hirn- und Rückenmarksflüssigkeit verteilt werden. Geeignete Stellen für eine Implantierung umfassen die lateralen Ventrikel, die Lumbaltheka-Region und ähnliche. Bei der Alzheimer'- Krankheit können die Zellen transfiziert werden, so dass sie Nervenwachstumsfaktor produzieren, um Neuronen des basalen Vorderhirns zu unterstützen, wie von Rosenberg et al., Science, 242: 1575-1578 (1988) beschrieben.
Die Zelllinie der Erfindung kann auch eingesetzt werden, um Wirte zu behandeln, indem man Zellen in extraneurale Stellen implantiert. Diese Ausführungsform der Erfindung ist für eine prophylaktische Behandlung eines Wirts besonders nützlich. Immortalisierte, menschliche, fötale, von Nerven abgeleitete Zellen können mit DNA transfiziert werden, die ein mit einer Krankheit assoziiertes Antigen kodiert, z. B. die HIV-gp120- Polypeptide, die die hauptsächliche neutralisierende Domäne von HIV umfassen, wie z. B. in dem U.S.-Patent Nr. 5,166,050 beschrieben. Die Zellen können dann das von der durch Transfektion eingebrachten DNA kodierte Antigen exprimieren und sezernieren. Das Antigen kann durch die implantierten Zellen kontinuierlich sezerniert werden und eine starke Immunantwort hervorrufen. Nach einem adäquaten Zeitabschnitt, um den Wirt vollständig zu immunisieren, können die Zellen entfernt werden.
Wie hier verwendet, umfasst das "Behandeln eines Wirts" eine prophylaktische, palliative und kurative Intervention in einem Krankheitsprozess. Der Wirt kann ein jegliches warmblütiges Säugetier sein, wie Menschen, nicht-menschliche Primaten, Nager und ähnliches.
Es kann eine große Vielzahl von Krankheiten und Syndromen mit den Zellen der Erfindung behandelt werden. Im allgemeinen wird die Erkrankung eine neurologische Erkrankung, wie Parkinsonismus (einschließlich Parkinson'-Krankheit), Alzheimer'-Krankheit, Chorea Huntington, multiple Sklerose, amyotrophische Lateralsklerose, Gaucher'-Krankheit, Tay-Sachs-Syndrom, Neuropathien, Hirntumore und ähnliches, sein. Die Verfahren der Erfindung können auch bei der Behandlung von nichtneurologischen Erkrankungen eingesetzt werden. Beispielsweise können die Verfahren der Erfindung verwendet werden, um Wirte gegen Infektionskrankheiten, wie Viren, Bakterien, Protozoen und ähnliches, wie oben beschrieben, zu immunisieren. Immortalisierte, menschliche, fötale, von Nerven abgeleitete Zellen können durch DNA transfiziert werden, die physiologisch aktive Peptide oder Peptide, die immunologische Epitope enthalten, kodieren. Die Verfahren der Erfindung können eingesetzt werden, um das Peptid produzierende Zellen zu implantieren und eine kontinuierliche in vivo-Freisetzung von anderen Typen von Peptiden, wie Wachstumshormon, an den Wirt zu ermöglichen.
Die implantierten Zellen sind immortalisierte, menschliche, fötale, von Nerven abgeleitete Zellen. Mit "von Nerven abgeleitet" wird gemeint, dass die Zellen vor der Immortalisierung den Phänotyp einer neurologischen Zelle hatten oder eine embryonale Zelle, die einer Differenzierung zu einem neurologischen Zelltyp gewidmet ist, waren. Neurologische Zelltypen umfassen Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten, Choroid plexus- Epithelzellen und ähnliche.
Fötale Zellen können nach einem elektiven Schwangerschaftsabbruch gesammelt werden. Föten spendende Frauen sollten nach einem Schwangerschaftsabbruch serologisch auf verschiedene Infektionskrankheiten, einschließlich dem "human immunodeficiency virus", Hepatitis B-Virus, Hepatitis C-Virus, Zytomegalievirus und die Herpes-Viren Typ 1 und 2 gescreent werden. Die Föten werden sich im allgemeinen im Schwangerschaftsalter von 9-11 Wochen (7-9 Wochen nach der Empfängnis) befinden. Das Alter der Föten kann durch Ultraschall bestätigt werden. Föten können unter Ultraschallüberwachung extrahiert werden, um ein fötales Hirntrauma zu minimieren.
Nach der Extraktion wird das fötale Gehirn identifiziert und aus dem Abort präpariert. Die Zellen können, wie folgt, hergestellt werden. Hirngewebe wird durch eine 19 Gauge-Nadel angesaugt und zweimal in "Eagles minimum essential media" (E-MEM, Gibco, New York, N.Y.) gewaschen. Zellen werden auf mit Poly- D-lysin (0,1 mg/ml für 5 min) behandelten Kulturschalen ausplattiert. Die Zellen werden auf E-MEM, ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum, 75 ug/ml Streptomycin, 75 Einheiten/ml Penicillin, 1% Dextrose und 2 ug/ml Fungizon (Gibco), vermehrt. Vor der Immortalisierung werden die Zellen bei 37ºC in einer befeuchteten 5% CO&sub2;-Umgebung inkubiert. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird erkennen, dass andere Methoden zum Herstellen von Zellen ebenfalls verwendet werden können.
Die zu implantierenden Zellen können durch verschiedene Techniken immortalisiert werden. Typischerweise werden die Zellen, wie folgt, immortalisiert. Die Zellkulturen werden im allgemeinen neuronale Vorläufer- und Gliazellen wie auch Neuronen erzeugen, wie von Major und Vacante, J. Neuropath. and Exp. Neurol., 48: 425-436 (1989) beschrieben worden ist. Bei regelmäßigem erneutem Füttern werden die Hirnzellen mehrere Monate überleben, aber wenig Zellproliferation zeigen. Zellen werden durch Transfektion mit einer SV40-Deletionsmutante transformiert. Der mutierten DNA fehlt ein Replikationsstartpunkt (ori-) und sie kann sich nicht vermehren. Eine Transfektion mit der DNA wird jedoch Zellen zu unbegrenztem Vermehrungspotential transformieren, wie von Gluzman, Cell, 23: 175-182 (1981) beschrieben. Nach Kultivieren der fötalen Zellkulturen für 3 Wochen können die Zellen mit 100 ug/Kolben Plasmid-DNA (pMK16), die die SV40-(ori-)-Mutante enthält, unter Verwendung der Calciumphosphat-Präzipitationstechnik, wie von Graham et al., Virol., 52: 456-467 (1973) beschrieben, transfiziert werden. Alternativ können die Zellen durch Elektroporation oder andere bekannte Techniken, wie sie in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1988, beschrieben sind, transfiziert werden. Nach der Transfektion werden die Kulturen mit wöchentlichem erneutem Füttern kultiviert. Nach mehreren Wochen wird die Proliferation von Gliazellen in separaten Bereichen der Platten evident. Die Zellen werden dann durch Trypsinisierung (0,025%) zu neuen Kulturen transferiert. Transformierte Zellen können durch Fluoreszenz-Antikörperassays identifiziert werden, um das SV40-T-Protein nachzuweisen, das durch transformierte Zellen exprimiert wird (Fig. 2). Die Zellen werden alle 10 Tage passagiert, bis eine Zunahme bei der Anzahl von T-Proteinpositiven Zellen nachgewiesen wird.
Die transformierten Zellen werden den Phänotyp einer kontinuierlichen Zelllinie zeigen. Speziell werden sich die Zellen bis zu einer hohen Sättigungsdichte mit einer Generationszeit von 18 h vermehren. Die Zellen zeigen jedoch nicht den transformierten Phänotyp oder ein verankerungsunabhängiges Wachstum, das für durch nicht-mutiertes SV40 transformierte Zellen typisch ist. Die Zellmorphologie wird während des Verlaufs der Etablierung der Zelllinie ebenfalls nicht verändert. Foci von Zellen werden im allgemeinen nicht nachgewiesen. Besonders nützlich sind Zellen aus der SVG-Zelllinie, die bei der American Type Culture Collection, Rockwille, MD, hinterlegt worden ist (A.T.C.C. CRL 8621), die in dem U.S.-Patent Nr. 4,707,448 beschrieben ist (Fig. 1). Im Folgenden werden mit "SVG"-Zellen oder "SVG-Zelllinie" Zellen oder eine Zelllinie gemeint, die von der Zelllinie A.T.C.C. CRL 8621 abgeleitet sind. Mit abgeleiteten Zellen oder Derivaten wird ein Subklon, ein Replikationsprodukt oder eine genetisch veränderte Mutante der Zelllinie A.T.C.C. CRL 8621 gemeint.
Alternativ können die Zellen durch andere Techniken, die in diesem Fachgebiet wohlbekannt sind, immortalisiert werden. Beispielsweise kann eine Immortalisierung durch das Epstein- Barr-Virus eingesetzt werden, wie in dem U.S.-Patent Nr. 4,464,465 beschrieben. Epstein-Barr-Virusmutanten, denen die OriP- und OriLyt-Replikationsstartpunkte fehlen, sind besonders nützlich. Ein anderes nützliches Immortalisierungsverfahren ist die Überexpression eines zellulären Gens für die Vermehrungskontrolle, wie c-myc, wie von Bartlett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 3255-3259 (1988) beschrieben. Im allgemeinen werden für eine Implantierung geeignete transformierte Zellen verankerungsabhängig sein, werden sich in Weichagar nicht vermehren und werden keine Focibildung zeigen.
Die Zellen werden keine Immunantwort von dem Empfängerwirt hervorrufen und folglich keine Immunsuppression des Wirts nach einer Implantierung erfordern. Geeigneterweise könnten die Zellen, wie SVG-Zellen, möglicherweise keine MHC-Klasse II- Moleküle oder MHC-Klasse I-Moleküle exprimieren. Zellen, die keine Expression von MHC-Klasse I- oder -Klasse II-Molekülen zeigen, können keine Immunantwort hervorrufen. Zellen, die keine Expression von MHC-Klasse II-Molekülen zeigen, können von SVG-Zellen abgeleitet werden oder durch Rekombinationsmethoden konstruiert werden, wie in dem U.S.-Patent Nr. 4,707,448 beschrieben. Gene für funktionale MHC-Klasse I- oder -Klasse II-Moleküle können auch durch homologe Rekombination mit Vektoren, die nicht-funktionale MHC-Molekül-Sequenzen enthalten, entfernt werden. Die resultierenden Zellen würden keine funktionalen MHC-Klasse I- bzw. -Klasse II-Moleküle produzieren. Alternativ kann die Expression von MHC-Klasse I- oder -Klasse II-Molekülen in anderen Zellen unterdrückt werden. Eine Unterdrückung kann z. B. durch Antisinn-Nukleinsäuresequenzen erreicht werden, so dass die Transkription oder Translation von Nukleinsäuresequenzen (DNA oder RNA), die MHC- Klasse I- bzw. -Klasse II-Moleküle kodieren, blockiert wird. Zellen können mit Expressionsvektoren, die Nukleinsäuresequenzen konstitutiv exprimieren, die zu konservierten Regionen von MHC-Klasse I- oder -Klasse II-Molekül-Genen oder -RNA komplementär sind, transfiziert werden, um die Expression der Gene zu unterdrücken.
Dann kann die histologische Herkunft der transformierten Zellen bestimmt werden. In charakteristischer Weise können Astrozyten durch die Anwesenheit eines intermediären Filaments, das aus saurem Gliafibrillenprotein, GFAP, gebildet wird, erkannt werden. Oligodendrogliazellen sind andererseits Myelin produzierende Zellen und können durch deren Synthese eines Galactocerebrosids, gal C, das eine Komponente von Myelin ist, identifiziert werden.
Nach der Transformation werden die Zellen für die Implantierung vorbereitet werden. Die Zellen werden in einem physiologisch verträglichen Träger, wie Zellkulturmedium (z. B. "Eagle's minimal essential media) oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, suspendiert. Die Zelldichte beträgt im allgemeinen ungefähr 10&sup4; bis 10&sup7; Zellen/ml. Die Zellsuspension wird vor der Implantierung sanft hin- und herbewegt. Das zu implantierende Zellsuspensionsvolumen wird abhängig von der Stelle der Implantierung, dem Behandlungsziel und der Zelldichte in der Lösung variieren. Beispielsweise werden bei der Behandlung von Parkinsonismus 5 ul bis 60 ul Zensuspension bei jeder Injektion verabreicht werden. Bei jedem Wirt können mehrere Injektionen verwendet werden. Fachleute auf diesem Gebiet werden verstehen, wie richtige Zelldosierungen bestimmt werden können.
Die Zellen können in das Parenchym des Gehirns, in einen Raum, der Hirn- und Rückenmarksflüssigkeit enthält, wie den Subarachnoidalraum oder die Ventrikel, oder extraneural implantiert werden. Wie hier verwendet, soll der Begriff "extraneural" Regionen des Wirts, die nicht innerhalb des Zentralnervensystems oder des peripheren Nervengewebes, wie das Ganglion coeliacum oder der Ischiasnerv, liegen, bezeichnen. "Extraneurale" Regionen können periphere Nerven enthalten. "Zentralnervensystem" soll alle Strukturen innerhalb der Dura mater umfassen.
Wenn die Zellen in das Gehirn implantiert werden, werden im allgemeinen stereotaktische Methoden verwendet werden, wie in Leksell und Jernberg, Acta Neurochir., 52: 1-7 (1980) und Leksell et al., J. Neurosurg., 66: 626-629 (1987) beschrieben. Die Lokalisierung der Zielregionen wird im allgemeinen Präimplantations-MRI umfassen, wie in Leksell et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 48: 14-18 (1985) beschrieben. Die Zielkoordinaten werden aus der Präimplantations-MRI bestimmt werden.
Vor der Implantierung kann die Lebensfähigkeit der Zellen bestimmt werden, wie von Brundin et al., Brain Res., 331: 251-259 (1985) beschrieben. Kurz zusammengefasst, werden Proben- Aliquots der Zellsuspension (1-4 ul) auf einem Glas- Objektträger mit 10 ul einer Mischung von Acridinorange und Ethidiumbromid (3,4 ug/ml von jedem Bestandteil in 0,9%-iger Kochsalzlösung; Sigma) gemischt. Die Suspension wird in ein Hämozytometer transferiert und lebensfähige und nichtlebensfähige Zellen wurden visuell unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops unter Auflicht bei 390 nm kombiniert mit Transillumination mit weißem Licht, um das Zählkammerraster sichtbar zu machen, ausgezählt. Acridinorange färbt lebende Kerne grün an, wohingegen Ethidiumbromid in tote Zellen eindringen wird, was zu einer orangeroten Fluoreszenz führt.
Zellsuspensionen sollten im allgemeinen mehr als ungefähr 98~ lebensfähige Zellen enthalten.
Injektionen werden im allgemeinen mit sterilisierten 10 ul- Hamilton-Spritzen mit 23-27 Gauge-Nadeln ausgeführt werden. Die mit Zellen beladene Spritze wird direkt in den Kopf eines stereotaktischen Rahmens montiert. Die Injektionsnadel wird auf die vorher festgelegten Koordinaten durch kleine Bohrlöcher im Schädel abgesenkt, 40-50 ul Suspension werden mit einer Rate von ungefähr 1-2 ul/min abgelagert und es werden weitere 2-5 min für eine Diffusion vor dem langsamen Zurückziehen der Nadel zugegeben. Häufig werden zwei separate, 1-3 mm entfernte Ablagerungen entlang derselben Nadelpenetration vorgenommen werden und es können leicht bis zu 5 über die Zielfläche verteilte Ablagerungen bei derselben Operation ausgeführt werden. Die Injektion kann manuell oder durch eine Infusionspumpe vorgenommen werden. Beim Abschluss des chirurgischen Eingriffs nach dem Zurückziehen der Nadel wird der Wirt aus dem Rahmen entfernt und die Wunde wird genäht. Es können prophylaktische Antibiotika oder eine immunsuppressive Therapie verabreicht werden, soweit benötigt.
Für eine Behandlung von stärker generalisierten Erkrankungen können Zellen transfiziert werden, so dass sie eine therapeutische Verbindung exprimieren, und in die Ventrikel oder die Lumbaltheka implantiert werden. Wenn die therapeutische Verbindung durch die Zellen sezerniert wird, wäscht die natürliche Zirkulation der Hirn- und Rückenmarksflüssigkeit die therapeutische Verbindung durch das gesamte Zentralnervensystem, was ein Mittel einer generalisierten Behandlung bereitstellt. Eine Implantierung in die Ventrikel kann durch eine offene Prozedur bewerkstelligt werden, wie in Madrazo et al., New Engl. J. Med., 316: 831-834 (1987) oder Penn et al., Neurosurgery, 22: 999-1004 (1988) beschrieben. Eine Implantierung von Zellen in die Lumbaltheka wird am geeignetsten durch Standard- Prozeduren ähnlich zu der Instillation von Radiographie- Kontrastmitteln oder einer Antitumor-Medikation über eine Lumbalpunktion bewerkstelligt.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, Zellen gemäß der Erfindung extraneural zu implantieren. Die Zellen können durch eine Nadel oder ein Endoskop oder durch eine offene Prozedur perkutan implantiert werden. Fachleute auf diesem Gebiet werden die am besten geeignete Methode für das Implantieren von Zellen für bestimmte Anwendungen leicht erfassen.
Die Zellen können vor der Implantierung durch Membranen verkapselt oder umschlossen werden. Die Verkapselung stellt eine Barriere für das Immunsystem des Wirts bereit und hemmt Transplantatabstoßung und Entzündungen. Es können mehrere Methoden der Zellverkapselung eingesetzt werden. In einigen Fällen werden Zellen individuell verkapselt. In anderen Fällen werden innerhalb derselben Membran viele Zellen verkapselt. Wenn die Zellen nach einer Implantierung entfernt werden, stellt die relativ große Größe einer Struktur, die viele Zellen innerhalb einer einzelnen Membran verkapselt, ein geeignetes Mittel für das Rückgewinnen der implantierten Zellen bereit. In diesem Fachgebiet sind mehrere Methoden der Zellverkapselung wohlbekannt, wie in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 301,777 oder den U.S.-Patenten Nr. 4,353,888, 4,744,933, 4,749,620, 4,814,274, 5,084,350 oder 5,089,272 beschrieben.
Ein Verfahren zur Zellverkapselung ist, wie folgt. Die transformierten Zellen werden mit Natriumalginat (einem polyanionischen Seegrasextrakt) gemischt und in Calciumchlorid extrudiert, so dass sie Gelkörnchen oder -tröpfchen bilden. Die Gelkörnchen werden mit einer Polyaminosäure, wie Poly-L-lysin, mit hohem Molekulargewicht (MW 60-500 · 10³) Konzentration (0,03-0,1% (Gew./Vol.)) für einen kurzen Zeitraum inkubiert (3-20 min), um eine Membran zu bilden. Das Innere der gebildeten Kapsel wird durch Behandeln mit Natriumcitrat wieder verflüssigt. Die einzelne Membran um die Zellen herum ist hochgradig permeabel (MW-Ausschluss 200-400 · 10³). Die Einzelmembrankapsel, die die Zelle enthält, wird in einer Kochsalzlösung 1-3 h inkubiert, um es eingeschlossenem Natriumalginat zu ermöglichen, aus der Kapsel heraus zu diffundieren und die Kapsel in einen Gleichgewichtszustand zu expandieren. Die resultierende alginatarme Kapsel wird mit einer Polyaminosäure mit geringem Molekulargewicht (MW 10-30 · 10³), wie Poly-L- lysin (PLL), oder Chitosan (desacetyliertes Chitin; MW 240 · 103) umgesetzt, um eine durch Wechselwirkung modifizierte, weniger permeable Membran (MW-Ausschluss 40-80 · 10³) zu erzeugen. Die mit einer Doppelmembran verkapselten Zellen werden dann in E-MEM zwei bis drei Wochen kultiviert, wie oben beschrieben.
Obwohl speziell auf Natriumalginat-Körnchen Bezug genommen worden ist, versteht es sich für die Fachleute auf diesem Gebiet, dass eine jegliche nicht-toxische wasserlösliche Substanz eingesetzt werden kann, die durch eine Veränderung von Bedingungen in dem Medium, in das sie eingebracht wird, in Gelform unter Bildung einer die Form beibehaltenden Masse überführt werden kann. Ein solches gelbildendes Material umfasst im allgemeinen mehrere chemische Gruppierungen, die leicht unter Bildung von anionischen oder kationischen Gruppen ionisiert werden, so dass die Oberflächenschichten unter Bildung einer permanenten Membran vernetzen können, wenn sie entgegengesetzt geladenen Polymeren ausgesetzt werden. Die meisten Polysaccharid-Gummis, sowohl natürliche als auch synthetische, können durch Polymere, die positiv geladene reaktive Gruppen, wie Aminogruppen, enthalten, vernetzt werden. Die vernetzenden, biologisch verträglichen Polymere, die mit dem Natriumalginatgummi umgesetzt werden können, umfassen Polylysin und andere Polyaminosäuren. Das Ausmaß der Permeabilität der gebildeten Membran kann durch sorgfältige Auswahl einer Polyaminosäure mit dem gewünschten Molekulargewicht gesteuert werden. Poly-L-lysin (PLL) ist das bevorzugte polymere Material. aber andere umfassen Chitosan und Polyacrylat. Molekulargewichte variieren typischerweise von ungefähr 10º bis ungefähr 106.
In einigen Ausführungsformen der Erfindung können die zu implantierenden Zellen mit einer DNA-Sequenz, die ein Peptid kodiert, transfiziert werden. Das Peptid kann eine direkt therapeutisch wirkende Verbindung, wie ein Bewegungshemmer bei der Behandlung von Chorea Huntington, sein. Alternativ kann das Peptid ein Enzym sein, das die Produktion einer therapeutischen Verbindung katalysiert, z. B. könnte die DNA Tyrosinhydroxylase kodieren, die die Synthese von Dopamin, das bei der Behandlung von Parkinsonismus wirksam ist, katalysiert. Die DNA könnte auch einen trophischen Faktor, wie einen Nervenwachstumsfaktor, einen inhibitorischen Wachstumsfaktor oder ein Zytokin, das bei der Behandlung von Gehirntumoren wirksam ist, kodieren.
Im allgemeinen wird die DNA-Sequenz operativ mit einem Transkriptionspromotor und einem Transkriptionsterminator verknüpft sein. Die DNA-Sequenz kann auch mit einem Transkriptionsverstärker verknüpft sein. Die Expression der DNA in den implantierten Zellen kann konstitutiv oder induzierbar sein. Verschiedene Expressionsvektoren, die diese Eigenschaften aufweisen, können die DNA für die Transfektion der Zellen tragen, wie die Plasmidvektoren pTK2, pHyg und pRSVneo, Simian-Virus 40-Vektoren, Rinderpapillomavirus-Vektoren oder Epstein-Barr- Virus-Vektoren, wie in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1988, beschrieben. Die Vektoren können in die Zellen durch Standardmethoden, wie Elektroporation, Calciumphosphat-vermittelte Transfektion, Polybren-Transfektion und ähnliches, eingeschleust werden.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung, nicht zur Beschränkung angeboten.

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Vorbereitung von SVG-Zellen (A.T.C.C. CRt, 8621) für eine Implantierung in Rhesus-Affen. Die Zellen wurden auf eine Infektion mit Mycoplasmen, HIV-1, Hepatitis B-Virus, Virus, Simian-Virus 40, Herpes simplex- Virus, Cytomegalie-Virus und JC-Virus gescreent.
SVG-Zellen wurden bis zur Konfluenz kultiviert. Die Zellvermehrung war verankerungsabhängig. Es trat keine Focibildung auf und die Zellmorphologie war homogen. Die Zellen wurden aus Gewebekulturplatten durch Verdau mit 0,05 Trypsin in 0,01 M EDTA (Versene-Puffer) in "Hank's balanced salt solutionº entfernt. Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, dreimal gewaschen und in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung resuspendiert. Die endgültige Zelldichte betrug 106 Zellen/ml. Die Zellsuspension wurde bis zur Transplantation bei 4ºC gelagert.

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt die Implantierung von SVG-Zellen in die basalen Ganglien von sechs Rhesus-Affen. Die Implantierungen wurden durch stereotaktische Methoden ohne chirurgische Komplikationen ausgeführt.
Die Tiere wurden zu Beginn mit Ketamin anästhesiert und wurden während des Verlaufs des operativen Eingriffs unter Isofluoringas-Anästhesie gehalten. Die Tiere wurden in dem stereotaktischen Rahmen (Kopf) angeordnet und die Koordinaten für die Implantierung wurden mit Hilfe der stereotaktischen Koordinaten ermittelt. Der Sinus sagittalis superior wurde freigelegt, um die Mittellinie zu ermitteln. Markierungen wurden auf dem Schädel auf beiden Seiten über den Schweifkern und das Putamen angebracht. Die Koordinaten waren, wie folgt: AP war +24 mm vor dem 0. Die seitlichen Koordinaten waren 5 mm von der Mittellinie für den Schweifkern und 10 mm seitlich von der Mittellinie für das Putamen.
Es wurden fünf Bohrlöcher gemacht. Eines wurde über dem Sinus sagittalis superior, zwei über den Schweifkernen und zwei über den Putamina gemacht. Es wurden zwei unterschiedliche Implantierungstechniken verwendet.
1. Es wurden 10 ul-Hamilton-Spritzen mit einer 26 Gauge-Nadel oder 50 ul-Hamilton-Spritzen mit 23 Gauge-Nadeln verwendet. Auf der rechten Seite des Gehirns wurden SVG-Zellen transplantiert. Unter Verwendung der Spritzen erfolgten zwei Ablagerungen in dem Putamen. Eine Ablagerung erfolgte in dem seitlichen Putamen und die zweite erfolgte in dem mittleren Putamen. Die Nadeln wurden von der Hirnrinde aus 18 mm abgesenkt, dann wurden 10 ul der Zellsuspension unter Verwendung des Kopf- Mikroinjektors injiziert. Nach der ersten Implantierung wurde die Nadel 1 mm pro min für 3 mm entfernt und dann folgte die zweite Injektion von 10 ul der Zellsuspension. Nach der zweiten Injektion wurde die Nadel mit 1 mm pro min entfernt. Eine zweite Implantierung erfolgte in dem gegenüberliegenden Putamen bei den gleichen Koordinaten mit derselben Technik.
Nachdem in das Putamen injiziert worden war, wurde die Implantierung mit derselben Zellsuspension in den Schweifkern ausgeführt. Es erfolgten zwei Injektionen in den Schweifkern, in die seitliche und die mittlere Seite. Die Tiefe der Injektion war 15 mm und es wurden 10 ul implantiert. Die Spritze wurde 1 mm pro min für 3 mm zurückgezogen, dann wurde die zweite Injektion von 10 ul Zensuspension ausgeführt. Nichttransfizierte SVG-Zellen wurden in das Putamen transplantiert und mit dem Tyrosinhydroxylasegen transfizierte SVG-Zellen wurden in den Schweifkern transplantiert. Die Konzentration der Zellen betrug 2 · 10&sup6; Zellen pro ml.
2. Zusätzlich zu einer Verwendung einer Implantierung mittels der Spritzen mit Nadeln wurden Kanülen aus "blue peek"- Schläuchen, die mit 22 Gauge-Nadeln verbunden waren, konstruiert. Die Schläuche wurden mit 1 cm³-Tuberkulin-Spritzen unter Verwendung von Null-Totvolumen-Verbindungsstücken verbunden. Nach dem Einführen in das Ziel ließ man die Nadel vor der Infusion 15 min stehen. Eine die Zellsuspension enthaltende Harvard-Infusionspumpe wurde dann mit 0,2 ul/min gestartet. Nach Infundieren für 15 min bei 0,2 ul/min wurde die Rate auf 0,4 ul/min erhöht und wurde für 100 min fortgesetzt. Nach der Beendigung der Infusion wurden die Nadeln vor dem Zurückziehen 30 min an Ort und Stelle gelassen. Die Nadeln wurden dann sehr langsam aus dem Gehirn entfernt.
Die Wunde wurde gespült und dann in anatomischen Schichten geschlossen. Die Tiere erwachten aus der Anästhesie und wurden 20 min nach dem operativen Eingriff in ihre Heimkäfige überführt.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt das erfolgreiche Einpflanzen der implantierten SVG-Zellen in zwei der Affen, die einen Monat nach der Implantierung getötet wurden. Die transplantierten Zellen waren in histologischer Hinsicht gesund. Es gab kein Anzeichen von Entzündungen oder Tumorbildung.
Das Hirngewebe in dem Bereich der Implantierungen wurde, wie folgt, untersucht:
Für histopathologische Studien wurden Tiere durch eine Überdosis Pentobarbital (460 mg, i.v.) getötet und wurden durch die aufsteigende Aorta mit 15 ml eiskalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), gefolgt von 10% Formalm, perfundiert. Die Gehirne wurden schnell entfernt, in 6 mm dicke koronale Scheiben geschnitten und 30 min in demselben Fixiermittel nachfixiert. Die Gewebescheiben wurden 48 h in 30% Saccharose in PBS gespült und dann schnell bei -70ºC eingefroren. Das Gewebe wurde in einem Gefriermikrotom in koronale 40 um-Schnitte geschnitten und es wurde eine Reihe von Schnitten in PBS gesammelt. Die Schnitte wurden für die Immunhistochemie mit Antikörpern gegen Tyrosinhydroxylase, saures Gliafibrillenprotein und T-Protein weiterverarbeitet. Schnitte, die an jene angrenzten, die auf TH-IR untersucht wurden, wurden mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Einige Blöcke von Implantat enthaltendem Gewebe wurden in 5 um-Paraffinschnitten verarbeitet und angefärbt, wie oben beschrieben.
Fig. 3 veranschaulicht den Nadelweg in einem basalen Ganglion von einem der Affen bei geringer Vergrößerung. Ansichten des Nadelwegs bei größerer Vergrößerung (Fig. 4-5) zeigen lebensfähige SVG-Zellen in dem Weg. Die Zellen werden durch den eine Mehrzahl von Nukleoli enthaltenden großen Zellkern, wie er in vitro von SVG-Zellen gezeigt wird, identifiziert. Die Morphologie der implantierten Zellen unterscheidet sich deutlich von der Morphologie der umgebenden Zellen. Entzündungszellen und Tumorbildung wurden nicht identifiziert.

Beispiel 4

Dieses Beispiel beschreibt die zerebrale MRI-Auswertung einen Monat nach der Implantierung bei den vier restlichen Affen. Bei keinem der Affen war irgendein Anzeichen einer Tumorbildung vorhanden.
Nach der Induktion von Anästhesie wurden die Affen in einen Standard-MRI-Rahmen eingebracht. T&sub1;- und T&sub2;-gewichtete Bilder ohne Kontrast und T&sub1;-gewichtete Bilder mit Gadolinium wurden unter Verwendung eines 1,5 Tesla-Magneten (Signa) aufgenommen. Die Scans ergaben keinen Hinweis auf Tumor- oder Knötchenbildung (Fig. 9).

Beispiel 5

Dieses Beispiel zeigt das Funktionieren der transplantierten SVG-Zellen innerhalb des Zentralnervensystems. Wirtsneuronen wanderten auf die implantierten Zellen, neuronale dopaminerge Körper, zu und dopaminerge Prozesse, die vom Wirt ausgingen, wurden auf die implantierten Zellen ausgedehnt.
Zwei der überlebenden Affen, die SVG-Zellimplantate erhalten hatten, wie in Beispiel 2 oben beschrieben, wurden, wie beschrieben, getötet. Die Gehirne wurden intakt entfernt, wie oben beschrieben, und es wurden davon Schnitte angefertigt.
Jeder Schnitt wurde auf mit Gelatine beschichtete Objektträger gelegt. Repräsentative Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt, um die Anatomie zu charakterisieren (Fig. 6). Die implantierten Zellen zeigten eine charakteristische SVG- Morphologie mit großen Kernen, die eine Mehrzahl von Nukleoli aufwiesen. Benachbarte Schnitte wurden entweder mit monoklonalem Antikörper gegen saures Gliafibrillenprotein (GFAP), SV40- T-Protein oder Tyrosinhydroxylase angefärbt. Die Schnitte wurden dann mit Hämatoxylin allein gegengefärbt. Fig. 7 veranschaulicht einen angrenzenden Schnitt, der mit Antikörper gegen GFAP, ein zytoplasmatisches Protein der Astrozytenlinie, angefärbt worden ist. Der Astrozytenursprung wird durch die dichte zytoplasmatische Anfärbung gezeigt. Der Ursprung der Zellen wird auch in Fig. 8 veranschaulicht, die klar implantierte Zellen, die mit anti-T-Protein-Antikörper angefärbt sind, zeigt.
Die transplantierten Zellen innerhalb des Schweifkerns und des Putamens waren lebensfähig und wurden leicht durch anti- Protein-T-Antikörper, wie oben beschrieben, identifiziert. SVG-Zellen wurden auch an der Wand der lateralen Ventrikel aller Affen identifiziert. Dopaminerge Neuronen zeigten ein Auswachsen von Neuriten in Richtung der implantierten Zellen (Fig. 10 zeigt ein Tyrosinhydroxylase-Neuron, angefärbt mit anti-Tyrosinhydroxylase-Antikörper, in einer Schicht von SVG- Zellen in vivo). Dopaminerge neuronale Körper waren ebenfalls in dem Bereich der implantierten SVG-Zellen vorhanden. Das Auswachsen von Neuriten und die Anwesenheit von neuronalen Körpern zeigen an, dass die SVG-Zellen neurotrophe Faktoren produzierten, die Neuronenwanderung und Ausdehnung von neuronalen Prozessen verursachten.
Es wurde in keinem der Schnitte irgendein Anzeichen von Entzündung, Transplantatabstoßung, Tumor- oder Knötchenbildung gefunden.

Beispiel 6

Dieses Beispiel beschreibt die individuelle Verkapselung von SVG-Zellen und Vorbereitung der Zellen für die Implantierung. Die Zellen werden in einem Natriumalginat-Pellet verkapselt.
SVG-Zellen werden in Kulturschalen bis zur Konfluenz vermehrt. Die Zellen werden aus den Kulturplatten mit 0,05% Trypsin und 1 mM EDTA in Dulbecco's Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) entfernt. Die Zellen werden in PBS, ergänzt mit MgCl&sub2;, CaCl&sub2;, 0,1% Glucose und 5% fötalem Rinderserum, suspendiert. Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt, zweimal in der Suspensionslösung, wie oben beschrieben, gewaschen und 2u einem Pellet zentrifugiert.
Das auf dem Boden des Zentrifugenröhrchens zurückbleibende Pellet wird in 5 ml einer 1,5%-igen (Gew./Vol.) Natriumalginatlösung (Keltone LV® von Kelco, Ltd., Chicago, Illinois) resuspendiert. Die Alginat-Zell-Suspension wird in 50 ml einer 1,5%-igen (Gew./Vol.) CaCl&sub2;-Lösung extrudiert. Kugelförmige Tröpfchen der Suspension werden durch einen Luftstrahl-Spritzenpumpe-Tröpfchenerzeuger gebildet. Mittels dieser Apparatur wird die Zell-Natriumalginat-Suspension durch eine 22 Gauge- Nadel, die sich innerhalb eines ummantelten Röhrchens (3 mm Innendurchmesser), durch welches Luft mit einer kontrollierten Geschwindigkeit (9 l/min) strömt, befindet, extrudiert. Wenn Flüssigkeitströpfchen durch die Spritzenpumpe aus dem Ende der Nadel gedrückt werden (mit 20 cm³/h), werden die Tröpfchen durch die durch den schnell fließenden Luftstrom erzeugten Scherkräfte abgerissen. Die Nadelspitze wird 8 cm oberhalb der Oberfläche der Oberfläche der CaCl&sub2;-Lösung gehalten, um sicherzustellen, dass gleichförmige, kugelförmige Geltröpfchen mit einem Durchmesser von ungefähr 300 bis 1000 Mikrometer gebildet werden.
Eine Probe der gelierten Mikrokörnchen wird auf Konsistenz von Größe und Gestalt unter Verwendung eines mit einem kalibrierten Okular ausgestatteten Seziermikroskops (Wild Heerbrugg, Modell M8) untersucht. Nach dem Transferieren der Calciumalginatgel-Körnchen, die die immobilisierten Zellen enthielten, zu einem 50 ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen mit einem konischen Boden wurden die Körnchen mit jeweils 30 ml 0,1%-iger (Gew./Vol.) CHES- und 1,1%-iger (Gew./Vol.) CaCl&sub2;-Lösung gewaschen. Das Überstandsvolumen wird nach jedem Waschen unter Verwendung eines Vakuumaspirators verringert. Eine semipermeable Kapselmembran wird gebildet, indem die Geltröpfchen mit einer wässrigen 0,05%-igen (Gew./Vol.) PLL-Lösung (M/v von PLL = 22.000) 8 min umgesetzt werden. Nach der Zugabe der PLL- Lösung wird das Zentrifugenröhrchen mit einer Kappe verschlossen und für die Dauer der Umsetzung manuell von einem Ende zu dem anderen hin- und hergeschwenkt, um die Kapseln davon abzuhalten, zusammenzukleben. Die resultierenden Mikrokapseln, 300 -1000 Mikrometer Durchmesser, werden mit jeweils 30 ml 0,1%- iger CHES- und 1,1%-iger CaCl&sub2;-Lösung und mit zwei 30 ml- Aliquots isotonischer Kochsalzlösung gewaschen. Die verkapselten Zellen werden 4 min mit 30 ml 0,03ºs-iger (Gew./Vol.) Natriumalginatlösung in Kontakt gebracht, was eine äußere Schicht auf den Kapseln bildet. Das Innere der Mikrokapseln wird mit 30 ml einer 0,05 M Natriumcitratlösung sechs Minuten verflüssigt. Die Mikrokapseln, 400-1400 Mikrometer Durchmesser, werden mehrere Male in Kochsalzlösung gewaschen, um überschüssiges Citrat zu entfernen, und dann in fünf 1 ml-Aliquots aufgeteilt. Jedes Aliquot wird in 10 ml DMEM-Medium in einem 25 cm³-Kulturkolben bei 37ºC in einem isotemp Series 400 CO&sub2;- Inkubator (Modell 413D, Fisher Scientific Co., Nepean, Ontario) inkubiert.

Beispiel 7

Dieses Beispiel beschreibt das Transfizieren von SVG-Zellen mit Tyrosinhydroxylase kodierender Nukleinsäure. SVG-Zellen, die Tyrosinhydroxylase exprimierten, wurden nach der Transfektion in den Kulturen identifiziert.
Eine nicht-konfluente Monolayer von SVG-Zellen wurde mit einem Plasmid transfiziert, das menschliche Tyrosinhydroxylase-cDNA die operativ mit einem Zytomegalievirus-Promotor verknüpft war, enthielt. Die Zellen wurden durch Calciumphosphat-Präzipitation transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden Zellen aus der Kultur fixiert und mit einem markierten Antikörper gegen Tyrosinhydroxylase angefärbt. Es wurden Tyrosinhydroxylase exprimierende Zellen identifiziert.
Obwohl die vorangehende Erfindung zum Zwecke der Klarheit des Verständnisses durch Veranschaulichungen und Beispiele detaillierter beschrieben worden ist, ist ersichtlich, dass bestimmte Veränderungen und Modifizierungen innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche vorgenommen werden können.

Claims

1. Zellen der Zelllinie ATCC CRL 8621 oder davon abstammende zur Verwendung in einem Therapieverfahren, welches die Behandlung der Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Huntington-Chorea, Amyotropischen Lateralsklerose oder Multiplen Sklerose umfasst, wobei man die Zellen in einem Wirt implantiert, der unter der Störung leidet.

2. Zellen gemäß Anspruch 1, wobei die Zellen von einer Membran umschlossen sind, die für Antikörper nicht durchlässig ist.

3. Zellen gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zellen mit einem Vektor transfiziert wurden, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche für ein Peptid zur Expression durch die Zellen kodiert.

4. Zellen gemäß Anspruch 3, bei denen das Peptid ein Enzym ist.

5. Zellen gemäß Anspruch 3, bei denen das Peptid ein mit einer Erkrankung assoziiertes Antigen ist.

6. Zellen gemäß Anspruch 4, bei denen das Peptid Tyrosinhydroxylase ist.

7. Zellen gemäß Anspruch 6, wobei die Zellen mit einer Nukleinsäuresequenz transfiziert wurden, die für eine Tyrosinhydroxylase kodiert, und die operativ mit einem Transkriptionspromotor und einem Transkriptionsterminator verknüpft ist.

8. Verwendung der Zelllinie ATCC CRL 8621 oder von Zellen, die davon abstammen, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Wirts, der unter Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Huntington-Chorea, Amyotrophischer Lateralsklerose oder Multipler Sklerose leidet, bei der die Zellen in den Wirt implantiert werden.

9. Verwendung gemäß Anspruch 8, bei der die Zellen von einer Membran umschlossen sind, welche für Antikörper nicht durchlässig ist.

10. Verwendung gemäß Anspruch 8 oder 9, bei der die Zellen in das zentrale Nervensystem des Wirts implantiert werden.

11. Verwendung gemäß Anspruch 10, bei der die Zellen in die basalen Ganglia des Wirts implantiert werden.

12. Verwendung gemäß Anspruch 10, bei der die Zellen in die Lumbar theca des Wirts implantiert werden.

13. Verwendung gemäß Anspruch 10, bei der die Zellen in einen lateralen Ventrikel des Wirts implantiert werden.

14. Verwendung gemäß Anspruch 8 oder 9, bei der die Zellen extraneural implantiert werden.

15. Verwendung gemäß Anspruch 14, bei der die Zellen subkutan implantiert werden.

16. Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 8 bis 13, bei der die Zellen mit einem Vektor transfiziert wurden, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche für ein Peptid zur Expression durch die Zellen kodiert.

17. Verwendung gemäß Anspruch 16, bei der das Peptid ein Enzym ist.

18. Verwendung gemäß Anspruch 16, bei der das Peptid ein mit einer Erkrankung assoziiertes Antigen ist.

20. Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 8 bis 18, bei dem die Zellen nach der Implantation entfernt werden.

21. Verwendung gemäß Anspruch 17, bei der die Zellen mit einer Nukleinsäuresequenz transfiziert werden, die für Tyrosinhydroxylase kodiert, und die operativ mit einem Transkriptionspromotor und einem Transkriptionsterminator verknüpft ist.

22. Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 8 bis 20, bei der der Wirt keine immunsuppressive Therapie nach Implantation der Zellen benötigt.

23. Zellen der Zelllinie ATCC CRL 8621 oder davon durch genetische Veränderung abstammende, die mit einem Vektor transfiziert wurden, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche für ein Peptid einer therapeutischen Verbindung zur Expression durch die Zellen kodiert.

24. Zellen gemäß Anspruch 23, bei dem die Verbindung in Bezug auf Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Huntington- Chorea, Amyotropische Lateralsklerose oder Multiple Sklerose therapeutisch ist.

25. Zellen gemäß Anspruch 23, bei dem die Verbindung Tyrosinhydroxylase ist.

26. Zellen gemäß irgendeinem der Ansprüche 23 bis 24, die durch eine Membran umschlossen sind, welche für Antikörper nicht durchlässig ist.