DE69233061T3

DE69233061T3 - Auf wachstumsfaktoren reagierende neurale vorläuferzellen, die in vitro vermehrt werden können.

Info

Publication number: DE69233061T3
Application number: DE69233061T
Authority: DE
Inventors: Samuel Weiss; A. Brent REYNOLDS
Original assignee: Neurospheres Holdings Ltd
Current assignee: Neurospheres Holdings Ltd
Priority date: 1991-07-08
Filing date: 1992-07-07
Publication date: 2008-07-10
Anticipated expiration: 2012-07-08
Also published as: DK0594669T3; CA2113118C; EP0594669A1; CA2113118A1; WO1993001275A1; NO940056D0; EP0594669B2; EP1329499A3; DE69233061D1; AU2242592A; EP1329499A2; ES2198404T3; EP0594669B9; FI935929A; JPH06509225A; ATE240389T1; JP4416837B2; FI935929A0; AU665012B2; EP0594669B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die in vitro-Kultur neuraler Vorläuferzellen und die Verwendung dieser Zellen als Gewebetransplantate. In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung und in vitro-Bewahrung einer großen Zahl nicht-tumorbildender neuraler Vorläuferzellen, die induziert werden können, sich zu differenzieren, und die für eine Neurotransplantation in ein Lebewesen eingesetzt werden können, um die Symptome einer neurologischen Erkrankung, Neurodegeneration und Verletzung des zentralen Nervensystems (ZNS) zu lindern. In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bildung von Nervenzellen zum Zweck der Wirkstoff-Durchmusterung mutmaßlicher Arzneimittel, die das Nervensystem ansteuern. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Bildung von Zellen für eine autologe Transplantation. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur in situ-Proliferation und Differenzierung der Vorläuferzellen im Wirt.
Die Entwicklung des Nervensystems beginnt in einem frühen Stadium der Fötalentwicklung. Die Neurogenese, die Bildung neuer Neuronen, ist in der frühen Nachgeburtsperiode bereits vollständig abgelaufen. Jedoch werden die synaptischen Verbindungen, die an den neuralen Kreisläufen beteiligt sind, aufgrund der Plastizität der Synapsen und des Absterbens von Zellen während des ganzen Lebens eines Individuums kontinuierlich verändert.
Der erste Schritt in der Nervenentwicklung ist das Entstehen von Zellen, hierbei handelt es sich um den genauen zeitlichen und örtlichen Ablauf, bei dem Präkursor- oder Vorläuferzellen proliferieren und sich differenzieren. Aus den proliferierenden Zellen gehen dann die Neuroblasten, Glioblasten und Stammzellen hervor.
Der zweite Schritt ist eine Periode der Differenzierung in Zelltypen und Migration, wenn die Vorläuferzellen zu Neuronen und Gliazellen werden und zu ihren endgültigen Positionen wandern. Zellen, die vom Neuralrohr stammen, bringen Neuronen und Glia des Zentralnervensystems (ZNS) hervor, während Zellen, die von der Neuralleiste stammen, die Zellen des peripheren Nervensystems (PNS) hervorbringen. Bestimmte Faktoren, die während der Entwicklung vorliegen, wie der Nervenwachstumsfaktor (NGF), fördern das Wachstum neuraler Zellen. Der NGF wird durch Zellen der Neuralleiste ausgeschieden und stimuliert das Aussprossen und das Wachstum der neuronalen Axons.
Der dritte Schritt in der Entwicklung läuft ab, wenn die Zellen spezifische phänotypische Merkmale annehmen, wie die Expression bestimmter Neurotransmitter. Zu diesem Zeitpunkt bilden die Neuronen auch Fortsätze, die auf ihren Zielen Synapsen bilden. Neuronen teilen sich nach der Differenzierung nicht mehr.
Schließlich kommt es zu einem selektiven Absterben von Zellen, wobei die Degeneration und das Absterben spezifischer Zellen, Fasern und synaptischer Verbindungen zur „Feineinstellung" des komplexen Kreislaufs des Nervensystems dienen. Diese „Feineinstellung" setzt sich während des ganzen Lebens des Wirtes fort. Später im Leben kann eine selektive Degeneration aufgrund von Alterung, Infektion und anderen unbekannten Ursachen zu neurodegenerativen Erkrankungen führen.
Die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen wurde in den letzten Jahren zu einem sehr wichtigen Anliegen, da die Population älterer Menschen ständig zunimmt, bei denen ein großes Risiko für dieses Erkrankungen vorliegt. Diese Erkrankungen, welche die Alzheimer-Krankheit, Chorea Huntington und Parkinson-Krankheit umfassen, wurden mit einer Degeneration von Neuronen an spezifischen Stellen im Gehirn in Zusammenhang gebracht, diese Degeneration führt zur Unfähigkeit der Gehirnregion, Neurotransmitter zu synthetisieren und freizusetzen, die für die neuronale Signalgebung entscheidend sind. Eine weitere Erkrankung, von der man annimmt, dass sie durch das Fehlen von Neurotransmittern zustande kommt, ist die Schizophrenie.
Zur Neurodegeneration zählen auch solche Zustände und Erkrankungen, die einen Verlust von Neuronen zur Folge haben. Diese Zustände können Leiden umfassen, die die Folgen eines ZNS-Traumas sind, einschließlich Schlaganfall und Epilepsie. Auch andere Erkrankungen, wie die amyotrophe Lateralsklerose und Zerebralparese, führen zu einem Verlust von Neuronen. Da noch nicht aufgeklärt werden konnte, wie die spezifischen Bereiche des Gehirns miteinander interagieren und wie durch diese Wechselwirkungen die nach außen gerichteten Manifestationen ihrer Funktionen zustande kommen, ist die Behandlung einer Degeneration des ZNS schwierig. Die Untersuchungen der komplizierten zellulären Wechselwirkungen und ihres Effekts auf das Verhalten und die kognitive Funktion werden auch noch dadurch erschwert, dass eine große Zahl von Zellen vorliegt und die neuralen Kreisläufe, die sie ausbilden, komplex sind.
Das Ziel der meisten ZNS-Therapien besteht darin, die bestimmte chemische Funktion oder enzymatische Aktivität wiederherzustellen, die aufgrund der zellulären Degeneration verloren gegangen ist.
Die Degeneration in einer Gehirnregion, die als Stammganglien bekannt ist, kann, abhängig von der genauen Lage, zu Erkrankungen mit verschiedenen kognitiven und motorischen Symptomen führen. Die Stammganglien bestehen aus vielen einzelnen Regionen, umfassend Striatum (das aus Nucleus caudatus und Putamen besteht), Globus pallidus, Substantia nigra, Substantia innominata, ventrales Pallidum, Meynert-Kern, ventralen Tegmentumbereich und Nucleus subthalamicus.
Im Fall der Alzheimer-Krankheit liegt eine starke zelluläre Degeneration des Vorderhirns und der Hirnrinde vor. Außerdem zeigt sich bei genauerer Untersuchung eine lokalisierte Degeneration in einem Bereich der Stammganglien, dem Meynert-Kern, der selektiv degeneriert ist. Dieser Nucleus sendet normalerweise cholinerge Projektionen zur Hirnrinde aus, die vermutlich an kognitiven Funktionen, einschließlich Gedächtnis, beteiligt sind.
Viele motorische Defizite kommen durch eine Degeneration in den Stammganglien zustande. Die Chorea Huntington ist mit der Degeneration von Neuronen im Striatum assoziiert, die beim Patienten zu unwillkürlichen zuckenden Bewegungen führt. Die Degeneration einer kleinen Region, die Nucleus subthalamicus genannt wird, geht mit einem Leiden einher, das mit Ballismus bezeichnet wird und sich in heftigen Schleuderbewegungen der Extremitäten äußert, während die Degeneration im Putamen und Globus pallidus mit einem Zustand von langsamen, bizarr geschraubten Bewegungen oder der Athetose assoziiert ist. Im Fall der Parkinson-Krankheit zeigt sich eine Degeneration in einem anderen Bereich der Stammganglien, der Substantia nigra par compacta. Dieser Bereich sendet normalerweise dopaminerge Verbindungen zum dorsalen Striatum aus, die für die Steuerung der Bewegung wichtig sind. In der Therapie der Parkinson-Krankheit hat man sich inzwischen darauf konzentriert, die dopaminerge Aktivität in diesem Kreislauf wiederherzustellen.
Andere Formen einer neurologischen Schädigung können auftreten und die Folge einer neuralen Degeneration, wie bei der amyotrophen Lateralsklerose und Zerebralparese, oder die Folge eines ZNS-Traumas sein, wie beim Schlaganfall und der Epilepsie.
Bisher bestand die Behandlung einer Funktionsstörung des ZNS hauptsächlich in der Verabreichung von Arzneimitteln. Leider war diese Behandlungsart mit vielen Komplikationen behaftet, einschließlich der eingeschränkten Fähigkeit, Arzneistoffe durch die Blut-Hirn-Schranke zu transportieren, und der Arzneistoff-Toleranz, die bei Patienten auftritt, denen diese Arzneistoffe langfristig verabreicht werden. Z. B. wurde bei Parkinson-Patienten eine teilweise Wiederherstellung der dopaminergen Aktivität mit Levodopa erreicht, das ein Dopamin-Vorläufer ist, der die Blut-Hirn-Schranke durchdringen kann. Jedoch gewöhnen sich die Patienten an die Wirkung von Levodopa, weshalb ständig steigende Dosierungen erforderlich sind, um die Wirkung des Arzneistoffs aufrechtzuerhalten. Für die Alzheimer-Krankheit gibt es zurzeit keine wirksamen pharmazeutischen Behandlungen.
Kürzlich wurde das Konzept der Transplantation von neurologischem Gewebe zur Behandlung neurologischer Erkrankungen, wie der Parkinson-Krankheit, angewendet. Durch neurale Transplantate könnte nicht nur verhindert werden, dass kontinuierlich Arzneistoffe verabreicht werden müssen, sondern auch, dass die komplizierten Freisetzungssysteme für Arzneistoffe eingesetzt werden müssen, die aufgrund der Blut-Hirn-Schranke erforderlich sind. Jedoch gibt es auch für dieses Verfahren Einschränkungen. Zunächst können die für die Transplantation eingesetzten Zellen, die Zelloberflächenmoleküle einer differenzierten Zelle aus einem anderen Wirt enthalten, im Wirt eine Immunreaktion auslösen. Außerdem müssen die Zellen in einem Entwicklungsstadium vorliegen, in dem sie in der Lage sind, normale neurale Verbindungen mit Nachbarzellen auszubilden. Aus diesen Gründen konzentrierte man sich in den anfänglichen Studien über die Neurotransplantation auf die Verwendung fötaler Zellen. Perlow et al. beschreiben in: „Brain grafts reduce motor abnormalities produced by destruction of nigrostriatal dopamine system", Science 204: 643–647 (1979), die Transplantation von fötalen dopaminergen Neuronen in erwachsene Ratten mit chemisch induzierten Nigrostriatum-Läsionen. Diese Transplantate zeigten eine gute Lebensfähigkeit und den Auswuchs von Axons, außerdem reduzierten sie signifikant die motorischen Störungen in den Wirten. Lindvall et al. zeigten in: „Grafts of fötal dopamine neurons survive and improve motor function in Parkinson's Disease", Science 247: 574–577 (1990), dass eine neurale Transplantation menschlicher fötaler Dopamin-Neuronen aus dem Mittelhirn die Dopamin-Synthese und Speicherung wiederherstellen kann und bei Patienten, die an der Parkinson-Krankheit leiden, die Steifheit und die verlangsamten Bewegungen lindert. Freed et al. zeigen in „Transplantation of human fötal dopamine cells for Parkinson's Disease", Arch. Neurol. 47: 505–512 (1990), auch eine Verbesserung bei einem Patienten, der ein fötales Transplantat erhielt.
Die vorstehenden Referenzen beschreiben, dass fötales Gehirngewebe aus Säugern bei einer unmittelbaren Transplantation gute Überlebenseigenschaften aufweist. Man nimmt an, dass die bessere Lebensfähigkeit fötaler Neuronen im Vergleich zu erwachsenen Neuronen auf der geringeren Empfindlichkeit fötaler Neuronen gegenüber einer Anoxie und außerdem auf dem Fehlen von Zelloberflächenmarkern auf fötalen Zellen beruht, deren Vorliegen möglicherweise zur Abstoßung des transplantierten Gewebes aus Erwachsenen führt. Obwohl das Gehirn als ein immunologisch privilegierter Ort anzusehen ist, kann trotzdem eine gewisse Abstoßung eines fötalen Gewebes erfolgen. Deshalb ist die Möglichkeit zur Verwendung eines fötalen Gewebes begrenzt, und zwar nicht nur aufgrund der Gewebeabstoßung des fötalen Gewebes, das aus einem anderen Wirt isoliert wurde, und wegen der daraus resultierenden Notwendigkeit von Immunsuppressiva, sondern auch aufgrund von ethischen Problemen bei der Gewinnung eines fötalen Gewebes. Das Hirngewebe von Neugeborenen besitzt dagegen nur eine begrenzte Lebensfähigkeit, und ZNS-Neuronen von erwachsenen Säugern überleben eine Transplantation in das Gehirn im Allgemeinen nicht.
Obwohl erwachsene ZNS-Neuronen keine guten Kandidaten für eine Neurotransplantation sind, wurde für Neuronen aus dem peripheren Nervensystem (PNS) von Erwachsenen gezeigt, dass sie eine Transplantation überleben und im Wirt unter Entwicklung eines neuralen Gewebes neurotrophe und gliotrophe Effekte zeigen. Eine Quelle von neuralem Gewebe, das nicht aus dem ZNS stammt, für die Transplantation ist das Nebennierenmark. Chromaffine Nebennierenzellen stammen wie PNS-Neuronen aus der Neuralleiste, und sie nehmen Synapsen auf und erzeugen Träger- und Enzymproteine, ähnlich wie PNS-Neuronen. Obwohl diese Zellen im intakten Nebennierenmark in endokriner Weise funktionieren, verlieren sie in der Kultur ihren drüsenartigen Phänotyp und entwickeln in Gegenwart bestimmter Wachstumsfaktoren und Hormone in der Kultur neurale Eigenschaften (Notter et al., „Neuronal properties of monkey adrenal medulla in vitro", Cell Tissue Research 244: 69–76 [1986]). Wenn diese Zellen in das ZNS eines Säugers transplantiert werden, überleben sie und synthetisieren signifikante Mengen von Dopamin, das mit Dopamin-Rezeptoren in benachbarten Regionen des ZNS interagieren kann.
Im US-Patent Nr. 4,980,174 führte die Transplantation von Monoamin-enthaltenden Zellen, die aus der Zirbeldrüse und dem Nebennierenmark der erwachsenen Ratte isoliert wurden, in den frontalen Cortex der Ratte im Wirt zu einer Besserung der erlernten Hilflosigkeit, einer Form der Depression. Im US-Patent Nr. 4 753 635 wurden chromaffine Zellen und Nebennierengewebe, isoliert aus Ochsen, in den Hirnstamm oder das Rückenmark von Ratten implantiert, hierdurch wurde eine Analgesie erzeugt, wenn im implantierten Gewebe oder in den implantierten Zellen die Freisetzung von Substanzen induziert wurde, die mit dem Schmerzrezeptor interagieren (d. h. Katecholamine, wie Dopamin). Nebennierenrindenzellen wurden in Menschen autolog transplantiert und haben überlebt, wodurch eine schwache bis mittlere Besserung von Symptomen erreicht wurde (Watts et al., „Adrenal-caudate transplantation in patients with Parkinson's Disease (PD): 1-year follow-up", Neurology 39, Suppl. 1: 127 [1989]; Hurtig et al., „Post-mortem analysis of adrenal-medulla-to-caudate autograft in a patient with Parkinson's Disease", Annals of Neurology 25: 607–614 [1989]). Jedoch nehmen Nebennierenzellen keinen normalen neuralen Phänotyp an und sind deshalb möglicherweise nur von begrenztem Nutzen für Transplantate, bei denen synaptische Verbindungen geknüpft werden müssen.
Eine weitere Quelle von Gewebe für eine Neurotransplantation besteht aus Zelllinien. Zelllinien sind sich unbegrenzt vermehrende Zellen, die entweder durch die Transformation normaler Zellen mit einem Onkogen (Cepko, „Immortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction", Ann. Rev. Neurosci. 12: 47–65 [1989]) oder durch das Züchten von Zellen mit veränderten Wachstumseigenschaften in vitro hergeleitet wurden (Ronnett et al., „Human cortical neuronal cell line: Establishment from a patient with unilateral megalencephaly", Science 248: 603–605 [1990]). Solche Zellen können in Kultur in großen Mengen gezüchtet werden, so dass sie für mehrere Transplantationen eingesetzt werden können. Bei einigen Zelllinien wurde gezeigt, dass sie sich durch eine chemische Behandlung differenzieren, so dass sie verschiedene neuronale Eigenschaften besitzen, wie die Bildung von Neuriten, erregbare Membranen und die Synthese von Neurotransmittern und ihren Rezeptoren. Weiterhin wird deutlich, dass diese Zellen durch die Differenzierung amitotisch werden und deshalb nicht bösartig sind. Jedoch sind verschiedene Punkte für eine verbreitete Verwendung von Zelllinien nicht optimal, nämlich das Potential, dass diese Zellen ungünstige Immunreaktionen auslösen können, die Verwendung von Retroviren zum Immortalisieren von Zellen, die Möglichkeit, dass diese Zellen wieder in ein amitotisches Stadium übergehen, und die Tatsache, dass diese Zellen keine Reaktion auf normale wachstumshemmende Signale zeigen.
Reynolds et al., Soc. Neurosci. Abstracts, Bd. 15, Okt./Nov. 1990, Abstr. Nr. 474.2, beschreiben die Wirkungen von EGF oder TGF-α in einer Primärkultur von embryonalen ZNS-Vorläuferzellen.
Eine weitere Vorgehensweise der Neurotransplantation umfasst die Verwendung von gentechnisch veränderten Zelltypen oder die Gentherapie. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann ein fremdes Gen oder Transgen in eine Zelle eingeführt werden, der eine bestimmte enzymatische Aktivität fehlt, wodurch die Aktivität wiederhergestellt wird. Zellen, die nun das übertragene Gen enthalten, können an den Ort der Neurodegeneration transplantiert werden und stellen dann die entsprechenden Produkte bereit, wie Neurotransmitter und Wachstumsfaktoren (Rosenberg et al., „Grafting genetically modified cells to the damaged brain: Restorative effect of NGF expression", Science 242: 1575–1578 [1988]), die möglicherweise so funktionieren, dass einige Symptome der Degeneration gelindert werden. Jedoch besteht noch das Risiko, dass mit diesen Zellen eine Immunreaktion ausgelöst wird, außerdem kann die durch Retroviren vermittelte Übertragung zu anderen Störungen in der Zelle führen. Ferner wurde gezeigt, dass Zelllinien, die durch einen Retrovirus-vermittelten Gentransfer hergestellt wurden, ihre übertragenen Gene nach der Transplantation nach und nach inaktivieren (Palmer et al., „Genetically modified skin fibroblasts persist lang after transplantation but gradually inactivate introduced genes", Proc. Natl. Acad. Sci. 88: S. 1330–1334 [1991]). Außerdem kann es sein, dass diese Zellen keine normalen neuronalen Verbindungen zu dem Wirtsgewebe ausbilden.
Die größten Einschränkungen einer Neurotransplantation bestehen vielleicht in den folgenden zwei Punkten, nämlich der Unfähigkeit des Transplantats nach dem bisherigen Stand der Technik, sich vollständig in das Wirtsgewebe zu integrieren, und der Tatsache, dass Zellen nicht in unbegrenzten Mengen aus einer verlässlichen Quelle zum Transplantieren verfügbar sind.
Deshalb sollte es hinsichtlich der vorstehend erwähnten Nachteile, die bei den Verfahren nach dem Stand der Technik zum Züchten und Transplantieren neuraler Zellen auftreten, offensichtlich sein, dass immer noch ein Bedarf für eine verlässliche Quelle einer unbegrenzten Zahl von Zellen für eine Neurotransplantation besteht, die in der Lage sind, sich in Neuronen zu differenzieren. Weiterhin besteht angesichts der Tatsache, dass heterologe Donorzellen immunologisch abgestoßen werden können, ein Bedarf für die Isolierung, Fortdauer und Transplantation von autologen Vorläufern aus dem jugendlichen oder erwachsenen Gehirn, die in der Lage sind, sich in Neuronen zu differenzieren. Außerdem besteht ein Bedarf für die Wiederherstellung eines beschädigten neuronalen Gewebes in einer relativ nicht-invasiven Art und Weise, d. h. indem Vorläuferzellen induziert werden, in situ zu proliferieren und sich in Neuronen zu differenzieren.
Demgemäß ist eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung einer verlässlichen Quelle einer unbegrenzten Zahl von Zellen für eine Neurotransplantation, die in der Lage sind, sich in Neuronen zu differenzieren.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur in vitro-Proliferation neuraler Vorläuferzellen aus jugendlichem und erwachsenem Gehirn für die Differenzierung dieser Vorläufer in Neuronen und für eine Neurotransplantation der Vorläuferzellen in einen heterologen oder autologen Wirt. Vorläuferzellen können auch induziert werden, in situ zu proliferieren und sich zu differenzieren, wodurch die Notwendigkeit einer Transplantation vermieden wird.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bildung von Nervenzellen für den Zweck der Durchmusterung mutmaßlicher Wirkstoffe, die das Nervensystem ansteuern.
Wie hier offenbart, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur in vitro-Herstellung einer Zellkultur multipotenter neuraler Stammzellen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Zubereiten oder Bereitstellen eines anfänglichen Kulturmediums, das einen oder mehrere Wachstumsfaktoren umfasst, die die Proliferation multipotenter neuraler Stammzellen induzieren können; wobei der/die eine oder mehreren Wachstumsfaktor(en) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe bestehend aus saurem Fibroblastenwachstumsfaktor, basischem Fibroblastenwachstums-faktor, epidermalem Wachstumsfaktor, einem EGF-ähnlichen Liganden, Amphiregulin und transformierendem Wachstumsfaktor alpha; (b) Zubereiten einer Zellkultur durch Zugabe von Zellen zu dem Kulturmedium von Schritt (a), wobei die Zellen von einem neuralen Gewebe eines Säugers stammen, wobei das Säugergewebe nicht von einem menschlichen Embryo stammt, und mindestens eine multipotente neurale Stammzelle enthalten, die sich unbegrenzt teilen und Nachkommen erzeugen kann, die sich in Neuronen und Glia differenzieren können; (c) Proliferieren der multipotenten neuralen Stammzelle in dem Zellkulturmedium zur Herstellung neuraler Stammzellennachkommen, einschließlich multipotenter neuraler Tochterstammzellen und Tochterzellen, die sich in Neuronen und Glia differenzieren können; und (d) Transferieren der neuralen Stammzellennachkommen in ein frisches Kulturmedium, das einen oder mehrere Wachstumsfaktoren enthält, die die Proliferation multipotenter neuraler Stammzellen induzieren können, um die multipotenten neuralen Tochterstammzellen zu proliferieren und um weitere neurale Stammzellennachkommen zu erzeugen, wobei der/die eine oder mehreren Wachstumsfaktor(en) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe bestehend aus saurem Fibroblastenwachstumsfaktor, basischem Fibroblastenwachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor, einem EGF-ähnlichen Liganden, Amphiregulin und transformierendem Wachstumsfaktor alpha.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur in vitro-Herstellung einer Zellkultur multipotenter neuraler Stammzellen wie vorstehend beschrieben bereit, wobei die Proliferation der multipotenten neuralen Stammzelle in Schritt (c) oder der multipotenten neuralen Tochterstammzelle in Schritt (d) in einer Suspensionskultur oder in einer substratgebundenen Kultur stattfindet.
Weiterhin stellt die Erfindung ein Verfahren wie vorstehend beschrieben bereit, wobei das Verfahren die Fortdauer multipotenter neuraler Stammzellen durch Wiederbeginnen der Proliferation der multipotenten neuralen Tochterstammzellen in Schritt (d) durch Wiederholen von Schritt (d) umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung stammt das neurale Gewebe eines Säugers von einem Menschen, aber wird nicht von einem menschlichen Embryo erhalten. Am stärksten bevorzugt stammt das neurale Gewebe eines Säugers von einem Fötus, Neugeborenen, Jugendlichen oder Erwachsenen.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur in vitro-Herstellung differenzierter neuraler Zellen bereit, die aus den mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend beschrieben hergestellten neuralen Stammzellennachkommen stammen, wobei das Verfahren das Induzieren der Differenzierung der Tochterzellen, die sich differenzieren können, durch Ausplattieren der Tochterzellen auf ein gebundenes Substrat oder durch Ermöglichen der Differenzierung der Tochterzellen, die sich differenzieren können, in Suspension ohne Wiederbeginnen der Proliferation umfasst.
Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren zum Durchmustern eines Wirkstoffs eines mutmaßlichen Arzneimittels bereit, umfassend das Anwenden des Mittels auf die durch das hier vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Verfahren produzierte Zellkultur und Überwachen der Antwort der Zellkultur.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine durch das hier beschriebene Verfahren hergestellten Zellkultur für die Verwendung zur Behandlung einer neurologischen oder neurodegenerativen Erkrankung oder eines ZNS-Traumas, wobei die Zellkultur von einer Quelle stammt, die zu dem vorgesehenen Empfänger autolog ist.
Ferner stellt die Erfindung die Verwendung einer durch das hier beschriebene erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Zellkultur für die Herstellung eines Medikaments zum Behandeln einer neurologischen oder neurodegenerativen Erkrankung oder eines ZNS-Traumas bereit.
Vorzugsweise stammt die Zellkultur aus einer Quelle, die zu dem vorgesehenen Empfänger autolog ist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen und vorstehend beschriebenen Zellkultur, wobei die neurologische oder neurodegenerative Erkrankung die Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Chorea Huntington, Schizophrenie, amyotrophe Lateralsklerose, Epilepsie, Zerebralparese oder ein Schlaganfall oder die neurodegenerative Erkrankung ist, die Ballismus oder Athetose verursacht.
Die Erfindung offenbart ein Verfahren zur in vitro-Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Isolieren der Zelle aus einem Säuger, (b) Inkontaktbringen der Zelle mit einem Kulturmedium, das einen Wachstumsfaktor enthält, (c) Induzieren der Zellen zur Proliferation und (d) Induzieren der Zelle zur Differenzierung. Die Proliferation und Fortdauer der Vorläuferzelle kann entweder in Suspensionskulturen erfolgen oder sie kann durchgeführt werden, indem zugelassen wird, dass die Zellen sich an ein gebundenes Substrat anlagern. Die Proliferation und Differenzierung kann vor oder nach der Transplantation und in verschiedenen Kombinationen von in vitro- oder in vivo-Bedingungen durchgeführt werden, umfassend (1) Proliferation und Differenzierung in vitro, anschließend Transplantation, (2) Proliferation in vitro, Transplantation, anschließend weitere Proliferation und Differenzierung in vivo, und (3) Proliferation in vitro, Transplantation und Differenzierung in vivo. Die Erfindung offenbart außerdem die Proliferation und Differenzierung der Vorläuferzellen in situ, die im Wirt direkt durchgeführt werden kann, ohne dass eine Transplantation erforderlich ist.
Ferner offenbart die Erfindung die Konservierung von Vorläuferzellen durch eine Kältebehandlung.
Die Erfindung offenbart auch ein Verfahren zur in vivo-Transplantation einer Vorläuferzelle, die wie in einem der vorstehenden Schritte (1) bis (3) behandelt wurde, umfassend das Implantieren dieser Zellen, die mit mindestens einem Wachstumsfaktor behandelt wurden, in einen Säuger.
Weiterhin offenbart die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, umfassend das Verabreichen von Vorläuferzellen, die wie in einem der vorstehenden Schritte (1) bis (3) behandelt wurden, die mit einem Wachstumsfaktor behandelt wurden und die zur Differenzierung in Neuronen induziert wurden, an einen Säuger. Ferner beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung, umfassend das in situ-Stimulieren von Vorläuferzellen des ZNS eines Säugers zur Proliferation und Differenzierung in Neuronen.
Die Erfindung offenbart weiterhin ein Verfahren zur Transfektion dieser Vorläuferzellen mit Vektoren, die die Genprodukte für Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktor-Rezeptoren und Peptid-Neurotransmitter exprimieren können oder die Enzyme exprimieren können, die an der Synthese von Neurotransmittern beteiligt sind, einschließlich solcher für Aminosäuren, biogene Amine und Neuropeptide, und für die Transplantation dieser transfizierten Zellen in Regionen der Neurodegeneration.
Weiterhin offenbart die Erfindung ein Verfahren zum Durchmustern möglicher neurologisch wirksamer Arzneimittel.
Zusammen mit den vorstehenden und anderen Aufgaben, Vorteilen und Merkmalen der Erfindung, die nachstehend deutlich werden, lässt sich die Natur der Erfindung noch besser anhand der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung und der beiliegenden Patentansprüche verstehen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: EGF-induzierte Entwicklung eines Clusters von undifferenzierten Zellen aus einer Einzelzelle: Einzelzellen wurden anhand der Grenzwert-Verdünnung der Zellsuspension plattiert und an der Basis von Platten mit 96 Vertiefungen identifiziert. (A–D): Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen einer Einzelzelle, (A) nach drei Tagen in vitro („days in vitro", DIV). Die gleiche Zelle begann sich nach fünf DIV zu teilen (B) und erzeugte ein Cluster von Zellen, das nach sieben (C) und zehn (D) DIV festgestellt wurde. Das Feld lässt sich anhand von Kratzern im Kunststoff (Pfeilkopf) identifizieren. Balken: 10 μm. (E–F): Phasenkontrastmikroskopische Aufnahme (E) eines 10-DIV-Zellclusters, das als Antwort auf EGF erzeugt wurde. Der größte Teil der Zellen in diesem Cluster enthielt Nestin-IR (F). Balken: 10 μm.
2: NSE-IR-Zellen in EGF- und TGFα-induzierten proliferierenden Zellclustern: Das Vorliegen von NSE-IR-Zellen in EGF- und TGFα-induzierten proliferierenden Clustern wurde nach 20 und 25 DIV untersucht. In kürzer als 15 DIV inkubierten Präparaten wurden keine NSE-IR-Zellen nachgewiesen. NSE-IR-Zellen traten nach 16 bis 18 DIV auf und waren zuerst im proliferierenden Kern zu sehen. (A, B): Nach 20 DIV wurden zahlreiche NSE-IR-Zellen sowohl in den mit EGF (A) als auch in den mit TGFα (B) behandelten Zellen identifiziert. Wenige NSE-IR-Zellen wurden außerhalb des proliferierenden Kerns gefunden, und keine Unterschiede zeigten sich zwischen den NSE-IR-Zellen in den mit EGF und in den mit TGFα behandelten Kulturen. (C, D): Nach 25 DIV wurden Hunderte von NSE-IR-Zellen festgestellt. Zusätzlich zu großen Mengen von NSE-IR-Zellen im proliferierenden Kern waren viele IR-Zellen abgewandert. In diesem Stadium wurden einige Unterschiede in der Morphologie der Neuronen zwischen den mit EGF (C) und den mit TGFα (D) behandelten Zellen deutlich. Während die mit EGF behandelten Zellen kurze Neuriten aufwiesen, hatten einige der NSE-IR-Zellen in den mit TGFα behandelten Kulturen ziemlich lange Fortsätze entwickelt (Pfeile). Balken: 20 μm.
3: Auftreten von GFAP-IR-Zellen in den mit EGF und in den mit TGFα behandelten Kulturen: GFAP-IR traten erstmals nach 16 bis 18 DIV auf. Nach 20 DIV wurden wenige GFAP-IR-Zellen beobachtet, die aus dem proliferierenden Kern auswanderten. Es bestand kein offensichtlicher Unterschied zwischen den mit EGF und den mit TGFα behandelten Kulturen. Nach 25 DIV bestand die Mehrzahl der Zellen, die aus dem zentralen Kern abgewandert waren, aus GFAP-IR. In diesem Stadium hatten alle GFAP-IR-Zellen in den mit EGF behandelten Kulturen eine sternförmige Morphologie, während viele der GFAP-IR in den mit TGFα behandelten Kulturen die Morphologie von unreifen protoplasmatischen Astrocyten annahmen (einige sternförmige Zellen waren noch zu sehen). Nach 30 DIV zeigten alle GFAP- IR-Zellen in den mit EGF behandelten Kulturen eine sternförmige Morphologie. Im Gegensatz dazu waren fast alle GFAP-IR-Zellen in den mit TGFα behandelten Kulturen protoplasmatisch. Balken: 20 μm.
4: Phänotyp der Neuronen, die durch eine EGF-induzierte Proliferation erwachsener sternförmiger Vorläuferzellen erzeugt wurden: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Zellen mit einer neuronalen Morphologie in 21-DIV-Kulturen einer einzelnen, durch EGF erzeugten Sphäre, plattiert auf ein gebundenes Substrat, nach Färben auf GABA (a) und auf Substanz P (b).
5: Transplantierte Maus-Neurosphären differenzieren sich im ZNS der Ratte in Neuronen: Ein monoclonaler Antikörper, M6, der ein Oberflächenprotein erkennt, das nur auf Neuronen der Maus zu finden ist, wurde verwendet, um transplantierte Maus-Vorläuferzellen zu markieren, die sich im Rattenwirt in Neuronen differenziert hatten. Positiv markierte Zellkörper (große Pfeile) und Neuriten (kleine Pfeile) sind zu sehen.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit zur Isolierung neuraler Vorläuferzellen aus einem Lebewesen, zur Bewahrung dieser Zellen in vitro und in vivo in Gegenwart von Wachstumsfaktoren, zur Differenzierung dieser Zellen in Neuronen und Glia, zur Kältebehandlung von Vorläuferzellen und zur Verwendung dieser Zellen für eine Neurotransplantation in einen Wirt, um eine neurodegenerative Erkrankung und ein neurologisches Trauma zu behandeln, und für Anwendungen zum Durchmustern von Wirkstoffen. Die Induktion von Proliferation und Differenzierung in diesen Vorläuferzellen kann entweder durch Züchten von adhärenten Zellen oder Zellen in Suspension in Gewebekultur oder, unter geeigneten Bedingungen, im Wirt in den folgenden Kombinationen erfolgen: (1) Proliferation und Differenzierung in vitro, anschließend Transplantation; (2) Proliferation in vitro, Transplantation, danach weitere Proliferation und Differenzierung in vivo; (3) Proliferation in vitro, Transplantation und Differenzierung in vivo; und (4) Proliferation und Differenzierung in situ. Eine Proliferation und Differenzierung in situ stellt eine nicht-operative Vorgehensweise dar, die Vorläuferzellen anhand einer pharmazeutischen Manipulation dazu bringt, in situ zu proliferieren.
Von Vorläuferzellen wird angenommen, dass sie unter einem tonischen hemmenden Einfluss stehen, wodurch die Vorläufer solange in einem unterdrückten Zustand gehalten werden, bis ihre Differenzierung erforderlich ist. Dieser tonische hemmende Einfluss ist möglicherweise ein löslicher Faktor, da Fraktionen von neuralen Lysaten, die zu den Vorläuferzellen wieder zugegeben werden, ihre Proliferation in vitro hemmen können. In Kultur kann es sein, dass diese Vorläuferzellen nicht diesem gleichen hemmenden Einfluss unterliegen. Diese Zellen sind nun in der Lage, zu proliferieren, und sie können, anders als Neuronen, die endgültig differenziert sind und sich deshalb nicht teilen, in unbegrenzter Zahl produziert werden, weshalb sie sehr gut geeignet sind für eine Transplantation in heterologe und autologe Wirte, die an neurodegenerativen Erkrankungen leiden.
Mit Vorläufer ist eine oligopotente oder multipotente Stammzelle gemeint, die in der Lage ist, sich ohne Begrenzung zu teilen, und die unter spezifischen Bedingungen Tochterzellen produzieren kann, die sich endgültig in Neuronen und Glia differenzieren. Diese Zellen können für eine Transplantation in einen heterologen oder autologen Wirt verwendet werden. Mit heterolog ist ein Wirt gemeint, der nicht das Lebewesen ist, aus dem die Vorläuferzellen ursprünglich hergeleitet wurden. Mit autolog ist der identische Wirt gemeint, aus dem die Zellen ursprünglich stammen.
Zellen können aus postnatalem, jugendlichem oder erwachsenem neuralen Gewebe aus einem beliebigen Lebewesen erhalten werden. Mit einem beliebigen Lebewesen ist ein beliebiges mehrzelliges Lebewesen gemeint, das Nervengewebe enthält. Insbesondere ist ein Insekt, ein Fisch, ein Reptil, ein Vogel, eine Amphibie oder ein Säuger und dergleichen gemeint. Am stärksten bevorzugte Spender sind Säuger, insbesondere Mäuse und Menschen.
Im Fall eines heterologen Spenders kann das Lebewesen eingeschläfert und das Gehirn und ein spezifischer Bereich von Interesse durch ein steriles Verfahren entnommen werden. Hirnbereiche von besonderem Interesse umfassen jeden beliebigen Bereich, aus dem Vorläuferzellen erhalten werden können, die dann dazu dienen, die Funktion eines degenerierten Bereichs im Gehirn des Wirts wiederherzustellen. Diese Regionen umfassen Bereiche des zentralen Nervensystems (ZNS), einschließlich der Großhirnrinde, des Kleinhirns, Mittelhirns, Hirnstamms, Rückenmarks und des Hirnkammergewebes, sowie Bereiche des peripheren Nervensystems (PNS), einschließlich des Karotiskörpers und des Nebennierenmarks. Insbesondere umfassen diese Bereiche Regionen in den Stammganglien, vorzugsweise das Striatum, das aus dem Nucleus caudatus und dem Putamen besteht, oder verschiedene Zellgruppen, wie Globus pallidus, Nucleus subthalamicus, Nucleus basalis, der bei Alzheimer-Patienten in degenerierter Form gefunden wurde, oder Substantia nigra pars compacta, die, wie gefunden wurde, bei Parkinson-Patienten in degenerierter Form vorliegt. Diese letztere Zellgruppe ist nach ihrer dunkeln Farbe aufgrund des Vorliegens von hohen Spiegeln des Pigments Melanin benannt und lässt sich dadurch identifizieren. Melanin wird aus dem Tyrosin oder Dopa durch die Wirkung der Tyrosinase hergeleitet.
Menschliche heterologe neurale Vorläuferzellen können aus fötalem Gewebe, das aus einem elektiven Abort stammt, oder aus einem postnatalen, jugendlichen oder erwachsenen Organspender gewonnen werden. Autologes neurales Gewebe kann durch Biopsie erhalten oder aus Patienten isoliert werden, die sich einer neurochirurgischen Behandlung unterziehen müssen, bei der neurales Gewebe entfernt wird, insbesondere während einer Epilepsieoperation und stärker bevorzugt während Temporallappenektomien und Hippocampusektomien.
Zellen können aus Spendergewebe erhalten werden, indem einzelne Zellen aus der verbindenden extrazellulären Matrix des Gewebes dissoziiert werden. Die Dissoziation kann anhand eines beliebigen bekannten Verfahrens erfolgen, einschließlich der Behandlung mit Enzymen, wie Trypsin, Collagenase und dergleichen, oder durch Verwendung physikalischer Dissoziationsmethoden, etwa anhand eines stumpfen Instruments. Die Dissoziation von fötalen Zellen kann in Gewebekulturmedium durchgeführt werden, während ein bevorzugtes Medium für die Dissoziation von jugendlichen und erwachsenen Zellen eine künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) darstellt. Eine übliche aCSF enthält 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 26 mM NaHCO₃ und 10 mM D-Glucose. Eine aCSF mit niedrigem Ca⁺⁺-Gehalt umfasst die gleichen Bestandteile mit der Ausnahme, dass MgCl₂ bei einer Konzentration von 3,2 mM und CaCl₂ bei einer Konzentration von 0,1 mM vorliegt.
Die dissoziierten Zellen können in ein beliebiges bekanntes Kulturmedium gegeben werden, welches in der Lage ist, das Zellwachstum zu unterhalten, umfassend MEM, DMEM, RPMI, F-12 und dergleichen, wobei es Zusatzstoffe enthält, die für den Metabolismus der Zellen erforderlich sind, wie Glutamin und andere Aminosäuren, Vitamine, Mineralien und geeignete Proteine, wie Transferrin und dergleichen. Das Medium kann außerdem Antibiotika enthalten, um eine Verunreinigung mit Hefen, Bakterien und Pilzen zu verhindern, wie Penicillin, Streptomycin, Gentamicin und dergleichen. In einigen Fällen kann das Medium ein Serum enthalten, das vom Rind, Pferd, Huhn und dergleichen stammt. Ein besonders bevorzugtes Medium für Zellen ist ein Gemisch aus DMEM und F-12.
Die Kulturbedingungen sollten nahe bei den physiologischen Bedingungen liegen. Der pH-Wert der Kulturmedien sollte in der Nähe des physiologischen pH-Werts liegen, vorzugsweise zwischen pH 6 und 8, stärker bevorzugt nahe pH 7 und noch stärker bevorzugt bei etwa pH 7,4. Die Zellen sollten bei einer Temperatur in der Nähe der physiologischen Temperatur gezüchtet werden, vorzugsweise zwischen 30 und 40°C, stärker bevorzugt zwischen 32 und 38°C und am stärksten bevorzugt zwischen 35 und 37°C.
Die Zellen können in Suspension oder auf einem gebundenen Substrat gezüchtet werden, wobei jedoch die Proliferation der Vorläufer vorzugsweise in Suspension durchgeführt wird, um eine große Menge von Zellen herzustellen. Im Fall von Zellen in Suspension werden die Kolben gut geschüttelt, anschließend lässt man die Neurosphären sich in der Ecke des Bodens der Kolben absetzen. Danach werden die Sphären in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei einer niedrigen Geschwindigkeit abzentrifugiert. Das Medium wird abgesaugt, die Zellen in einer kleinen Menge Medium mit Wachstumsfaktor resuspendiert und die Zellen mechanisch dissoziiert. Anschließend werden die Zellen gezählt und erneut plattiert.
Das Züchten von Zellen auf einem gebundenen Substrat kann dazu führen, dass sich der Vorläufer in eine endgültig differenzierte Zelle differenziert, die nicht mehr in der Lage ist, sich zu teilen, die jedoch zur Transplantation eingesetzt werden kann, wobei sie Verbindungen mit anderen neuralen Zielen ausbildet. Die Differenzierung kann auch in Suspension induziert werden, wenn die Zellen einen bestimmten Zeitraum ohne Dissoziation und Wiederbeginnen der Proliferation gezüchtet werden.
Wachstumsfaktoren, die eingesetzt werden können, um die Proliferation zu induzieren, umfassen einen beliebigen trophischen Faktor, der die Proliferation von Vorläuferzellen zulässt, einschließlich eines beliebigen Moleküls, das an einen Rezeptor auf der Oberfläche der Zelle bindet, so dass auf der Zelle ein trophischer oder wachstumsinduzierender Effekt bewirkt wird. Solche Faktoren umfassen den sauren und den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (aFGF, bFGF), den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), einem EGF-ählichen Liganden, Amphiregulin und den transformierenden Wachstumsfaktor-alpha (TGFα).
Die am stärksten bevorzugten Faktoren sind EGF und TGFα. Diese Wachstumsfaktoren sind einzelsträngige Polypeptide mit 53 bzw. 50 Aminosäuren, die um die Bindung an den EGF-Rezeptor (EGFR) kompetieren. Für EGF und TGFα wurde gezeigt, dass sie die zelluläre Differenzierung beeinflussen. Eine TGFα-Immunreaktivität (IR), eine EGF-IR und eine EGFR-IR und außerdem TGFα- und EGF-mRNAs wurden im ZNS von Nagern und Menschen festgestellt. Die Ergebnisse von Ligandbindungs-Untersuchungen haben gezeigt, dass die Anzahl der Bindungsstellen für [¹²⁵I]-EGF im Gehirn von Nagern während der Trächtigkeit zunimmt und in der ersten Woche nach der Geburt höher ist als beim Erwachsenen, dies stimmt mit der Rolle dieses Faktors in der Entwicklung des ZNS überein. EGF induziert die Proliferation einer multipotenten Vorläuferzelle aus dem Striatum, aus der sternförmige Astrocyten und Neuronen mit kurzen Fortsätzen entstehen, und TGFα induziert die Proliferation einer multipotenten Vorläuferzellen, die protoplasmatische Astrocyten und Neuronen mit langen, gut entwickelten Neuriten hervorbringt. Die Konzentration der eingesetzten Wachstumsfaktoren beträgt 1 fg/ml bis 1 mg/ml, vorzugsweise 20 ng/ml.
Neuronale Zellen und Gliazellen können nach der Differenzierung der multipotenten Vorläuferzellen hergeleitet werden. Die Differenzierung der Zellen kann durch ein beliebiges Verfahren induziert werden, das dem Fachmann bekannt ist, welches die Kaskade biologischer Ereignisse induziert, die zum Wachstum führen, umfassend die Freisetzung von Inosittriphosphat und intrazellulärem Ca⁺⁺, die Freisetzung von Diacylglycerin und die Aktivierung von Proteinkinase C und anderen zellulären Kinasen und dergleichen. Die Differenzierung kann induziert werden durch die Behandlung mit Phorbolestern, Wachstumsfaktoren und anderen chemischen Signalen sowie durch das Wachstum auf einem gebundenen Substrat, z. B. einer durch Ionen geladenen Oberfläche, wie Poly-L-lysin und Poly-L-ornithin, und dergleichen. Außerdem kann eine Differenzierung induziert werden, indem die Zellen in Suspension weiterhin in Gegenwart eines Wachstumsfaktors belassen werden, ohne dass eine Wiederbeginnen der Proliferation erfolgt.
Die Zellen aus der bestimmten neuralen Region werden aus dem Lebewesen anhand eines sterilen Verfahrens entnommen und mechanisch dissoziiert, wobei ein Verfahren verwendet wird, das dem Fachmann bekannt ist. Frühes postnatales Hirngewebe wird direkt in einem Kulturmedium dissoziiert, während jugendliches oder erwachsenes Hirngewebe in einer künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) dissoziiert wird. Die dissoziierten Zellen werden bei einer niedrigen Geschwindigkeit zwischen 200 und 2000 UpM und stärker bevorzugt zwischen 400 und 800 UpM abzentrifugiert und danach in Kulturmedium resuspendiert. Die Zellen werden bei etwa 5 × 10⁴ bis 2 × 10⁵ Zellen/ml, vorzugsweise 1 × 10⁵ Zellen/ml, resuspendiert. Wenn die Zellen auf ein gebundenes Substrat plattiert werden sollen, erfolgt dies bei etwa 2 bis 3 × 10³ Zellen/cm², vorzugsweise 2,5 × 10³ Zellen/cm².
Die Zellsuspensionen in Kulturmedium werden mit einem beliebigen Wachstumsfaktor, der die Proliferation von Vorläuferzellen erlaubt, angereichert und in einer beliebigen Vorrichtung ausgesät, die sich zum Aufrechterhalten von Zellen eignet, insbesondere in Kulturkolben, Kulturplatten oder Rollerflaschen, und stärker bevorzugt in kleinen Kulturkolben, wie 25-cm²-Kulturkolben. Die Zellen proliferieren in einem Inkubator bei 37°C innerhalb von drei bis vier Tagen, und die Proliferation kann zu einem beliebigen Zeitpunkt danach durch Dissoziieren der Zellen und Resuspendieren in einem frischen Medium, das Wachstumsfaktoren enthält, wiederbegonnen werden.
In Abwesenheit von Substrat lösen sich die Zellen vom Boden des Kolbens und proliferieren weiterhin in Suspension, wobei sie ein hohles Kügelchen („Sphäre") aus undifferenzierten Zellen bilden. Nach etwa drei bis zehn Tagen in vitro, und insbesondere nach etwa sechs bis sieben Tagen in vitro, werden die proliferierenden Cluster (Neurosphären) alle zwei bis sieben Tage, und stärker bevorzugt alle zwei bis vier Tage gefüttert, indem sie leicht abzentrifugiert und in einem Medium resuspendiert werden, das einen Wachstumsfaktor enthält.
Nach sechs bis sieben Tagen in vitro können einzelne Zellen in den Neurosphären durch eine physikalische Dissoziation der Neurosphären mit einem stumpfen instrument abgetrennt werden, stärker bevorzugt durch Digerieren der Neurosphären mit einer Pipette, insbesondere einer Pasteurpipette mit Feuerpolitur. Einzelne Zellen aus den dissoziierten Neurosphären werden in einem Kulturmedium suspendiert, das einen Wachstumsfaktor enthält, und ein Teil dieser Zellen proliferiert und bildet neue Neurosphären, die größtenteils aus undifferenzierten Zellen bestehen. Die Differenzierung der Zellen kann induziert werden, indem die Zellen auf ein gebundenes Substrat plattiert werden, umfassend mit Poly-L-lysin oder mit Poly-L-ornithin beschichtete Kolben, Platten oder Deckgläschen, wobei kontinuierlich EGF, TGFα oder ein beliebiger Faktor vorliegt, der die Differenzierung bewirken kann, wie der basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und dergleichen. Außerdem kann die Differenzierung induziert werden, indem die Zellen in Suspension in Gegenwart eines Wachstumsfaktors, einschließlich EGF oder TGFα, belassen werden, ohne dass die Proliferation wieder in Gang gesetzt wird.
Um zelluläre Moleküle auf den zwei Typen von Zellen zu identifizieren, die bei der Wachstumsfaktor-induzierten Differenzierung entstehen, nämlich Neuronen und Glia, wird eine immuncytochemische Untersuchung anhand von Antikörpern durchgeführt, die für bekannte zelluläre Marker spezifisch sind. Diejenigen Antikörper, die für bestimmte Neuronen- oder Glia-Proteine spezifisch sind, können eingesetzt werden, um die zellulären Merkmale oder die phänotypischen Eigenschaften von Neuronen von denen von Glia zu unterscheiden. Insbesondere umfassen diese zellulären Marker für Neuronen die Neuronen-spezifische Enolase (NSE) und das Neurofilament und für Glia das gliafibrilläre saure Protein (GFAP), Galactocerebrosid und dergleichen.
Außerdem können zum Identifizieren neuronaler Zellen Antikörper gegen Neurotransmitter eingesetzt werden. Diese umfassen Antikörper gegen Acetylcholin (ACh), Dopamin (DA), Epinephrin (E), Norepinephrin (NE), Histamin (H), Serotonin oder 5-Hydroxytryptamin (5-HT), Neuropeptide, wie Substranz P (SP), adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Vasopressin oder antidiuretisches Hormon (ADH), Oxytocin, Somatostatin, Angiotensin II, Neurotensin und Bombesin, Hypothalamus-Freisetzungshormone wie Thyreotropin-Freisetzungshormon (TRH) und Freisetzungshormon des Luteinisierungshormons (LHRH), gastrointestinale Peptide, wie vasoaktives intestinales Peptid (VIP) und Cholecystokinin (CCK) und CCK-artiges Peptid, Opioid-Peptide, wie Endorphine, z. B. β-Endorphin, und Enkephaline, wie Met- und Leu-Enkephalin, Prostaglandine, Aminosäuren, wie γ-Aminobuttersäure (GABA), Glycin, Glutamat, Cystein, Taurin und Aspartat, und Dipeptide, wie Carnosin.
Außerdem können Antikörper gegen Neurotransmitter-synthetisierende Enzyme eingesetzt werden, wie Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD), die an der Synthese von GABA beteiligt ist, Cholin-Acetyltransferase (CAT) für die ACh-Synthese, Dopa-Carboxylase (DDC) für Dopamin, Dopamin-β-Hydroxylase (DBH) für NE und Aminosäure-Decarboxylase (AADC) für 5-HT.
Auch können Antikörper gegen Enzyme geeignet sein, die an der Inaktivierung von Neurotransmittern beteiligt sind, wie Acetylcholinesterase (AChE), die ACh inaktiviert. Außerdem können Neuronen durch Antikörper gegen Enzyme identifiziert werden, die an der Wiederaufnahme von Neurotransmittern in Neuronenendigungen beteiligt sind, wie Monoaminoxidase (MAO) und Catechol-O-Methyltransferase (COMT) für DA, MAO für 5-HT und GABA-Transferase (GABA-T) für GABA.
Andere Marker für Neuronen umfassen Antikörper gegen Neurotransmitter-Rezeptoren, wie die nicotinischen und muscarinischen AChE-Rezeptoren, die adrenergen Rezeptoren α₁, α₂, β₁ und β₂, den Dopamin-Rezeptor und dergleichen.
Zellen, die einen hohen Melaninspiegel enthalten, wie diejenigen, die in der Substantia nigra vorliegen, könnten anhand eines Antikörpers gegen Melanin identifiziert werden.
Vorläuferzellen können mit Antikörpern identifiziert werden, die spezifisch an Proteine binden, die nur in Vorläuferzellen vorkommen und nicht in Zellen, die sich differenziert haben. Besonders geeignet sind Antikörper gegen ein intermediäres Filamentprotein und insbesondere ein Rat401 genannter Antikörper, der gegen Nestin gerichtet ist, ein intermediäres Filamentprotein, das spezifisch in neurepithelialen Stammzellen zu finden ist.
Ein beliebiger sekundärer Antikörper oder heterologes Anti-Immunglobulin kann eingesetzt werden, der/das an den primären Antikörper bindet und seinen Nachweis möglich macht, indem er/es mit einem bestimmten Enzym, Isotop, Teilchen oder Farbstoff konjugiert wird. Solche Antikörper können in einem beliebigen Lebewesen induziert werden, z. B. in Ziegen, Schafen, Kaninchen, Schweinen, Pferden, Mäusen, Ratten und dergleichen, und sie können gegen einen primären Antikörper gerichtet sein, der in einem beliebigen heterologen Lebewesen des gleichen Vertreters dieser Varietäten induziert wurde. Sekundäre Antikörper können an Farbstoffe konjugiert sein, wie Fluorescein, Rhodamin oder andere Farbstoffe, sie können mit einem beliebigen Isotop, wie ¹²⁵I, radioaktiv markiert sein oder an ein radiomarkiertes Protein, wie Digoxin, konjugiert sein, oder sie können an Partikel gebunden sein, die im Mikroskop zu sehen sind, wie Immuno-Gold-Partikel und dergleichen. Sekundäre Antikörper können außerdem an beliebige Enzyme konjugiert sein, die mit einem Substrat reagieren, so dass ein sichtbares oder nachweisbares Reaktionsprodukt entsteht, wie Meerrettich-Peroxidase und alkalische Phosphatase. Besonders geeignete Antikörper sind sekundäre Antikörper, die aus Fluorescein-konjugiertem affinitätsreinem Ziegen-Anti-Maus-IgG und Rhodamin-konjugiertem affinitätsreinem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG bestehen.
Die Züchtung der Zellen erfolgt auf einem beliebigen Substrat, auf dem Zellen wachsen und sich differenzieren können, und das anhand eines Mikroskops analysiert werden kann, wie Kulturplatten, Glasobjektträger, Deckgläschen und dergleichen. Die Zellen werden bis zu sechs Wochen, stärker bevorzugt 14 bis 30 Tage in vitro gezüchtet und können in einer beliebigen Dehydratisierungslösung, wie Alkohol oder Aceton, oder in einer Lösung von Aldehyden als Vernetzungsmittel fixiert werden. Danach werden die Zellen gefärbt, indem primäre Antikörper eingesetzt werden, die gegen ein beliebiges zelluläres Merkmal gerichtet sind, das identifiziert werden soll, worauf die Umsetzung mit den sekundären konjugierten Antikörpern folgt, die zum Nachweis dienen.
Transplantierte Zellen können an ein beliebiges Lebewesen mit abnormen neurologischen oder neurodegenerativen Symptomen verabreicht werden, die auf eine beliebige Art und Weise erworben werden, umfassend Symptome, die eine Folge von chemischen oder elektrolytischen Läsionen sind, die eine Folge einer experimentellen Aspiration neuraler Bereiche sind oder die eine Folge von Alterungsprozessen sind. Besonders bevorzugte Läsionen in Nicht-Mensch-Lebewesen lassen sich mit 6-Hydroxydopamin (6-OHDA), 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), Ibotensäure und dergleichen auslösen.
Bei Immunsuppressiva besteht aufgrund von Infektionen, die auftreten können, ein gewisses Risiko für Morbidität und Mortalität, jedoch kann auf diese Arzneistoffe nur dann verzichtet werden, wenn eine autologe Transplantation oder eine heterologe Transplantation unter Verwendung eines Gewebes aus Eltern oder Geschwistern durchgeführt wird. Eine Transplantation kann bilateral erfolgen, oder sie kann im Fall eines Patienten, der an der Parkinson-Krankheit leidet, kontralateral zu der am stärksten betroffenen Seite durchgeführt werden. Die Operation erfolgt in einer Weise, wobei sich bestimmte Gehirnregionen lokalisieren lassen, z. B. in Bezug auf die Schädelnähte, insbesondere unter einer stereotaktischen Führung. Die Zellen werden in einen beliebigen betroffenen neuralen Bereich, insbesondere in die Stammganglien und vorzugsweise in den Nucleus caudatus und das Putamen, den Nucleus basalis oder die Substantia nigra, verabreicht. Die Zellen werden an eine bestimmte Region appliziert, wobei ein beliebiges Verfahren eingesetzt werden kann, bei dem die Integrität der umgebenden Bereiche des Gehirns erhalten bleibt, vorzugsweise durch eine Injektionskanüle.
Die Zellen, die an die bestimmte neurale Region verabreicht wurden, bilden vorzugsweise ein neurales Transplantat, in dem die Zellen normale neuronale oder synaptische Verbindungen mit benachbarten Neuronen ausbilden und den Kontakt mit Gliazellen aufrechterhalten, die Myelinscheiden um die Axons der Neuronen herum entwickeln können und auf diese Weise einen trophischen Einfluss auf die Neuronen ausüben können. Da diese transplantierten Zellen Verbindungen ausbilden, stellen sie die neuronalen Netzwerke wieder her, die aufgrund einer Erkrankung oder durch das Altern beschädigt waren.
Vorläuferzellen können induziert werden, in situ zu proliferieren und sich zu differenzieren, indem an den Wirt ein beliebiger Wachstumsfaktor oder ein beliebiges Arzneimittel verabreicht wird, der/das die Proliferation und Differenzierung der Zellen induziert. Diese Wachstumsfaktoren umfassen einen beliebigen Wachstumsfaktor, der dem Fachmann bekannt ist, einschließlich der Faktoren, die vorstehend für die in vitro-Proliferation und Differenzierung beschrieben sind, insbesondere EGF und TGFα. Arzneimittel enthalten eine beliebige Substanz, die den hemmenden Einfluss blockiert, und/oder sie stimulieren den Vorläufer, zu proliferieren und sich endgültig zu differenzieren. Die Wachstumshormone können durch ein beliebiges Verfahren verabreicht werden, umfassend eine Injektionskanüle, Transfektion von Zellen mit Wachstumshormon-exprimierenden Vektoren, Injektion, Vorrichtungen mit zeitlich gesteuerter Freisetzung, mit denen Substanzen an die gewünschte Stelle appliziert werden können, und dergleichen. Arzneimittel können durch ein beliebiges Verfahren verabreicht werden, umfassend eine Injektionskanüle, Injektion, orale Verabreichung, Vorrichtungen mit zeitlich gesteuerter Freisetzung und dergleichen.
Die Lebensfähigkeit des Transplantats im lebenden Wirt kann anhand verschiedener nicht-invasiver Verfahren untersucht werden, wie Computer-Achsentomogramm (CAT- oder CT-Bild), Kernspinresonanz- oder Magnetresonanz-Aufnahmen (NMR oder MRI) oder stärker bevorzugt Positronenemissionstomogramme (PET). Postmortal kann die Lebensfähigkeit eines Transplantats untersucht werden, indem das neurale Gewebe entfernt wird und der betroffene Bereich makroskopisch oder stärker bevorzugt unter Verwendung eines Mikroskops begutachtet wird. Die Zellen können mit beliebigen Färbemitteln angefärbt werden, die unter licht- oder elektronenmikroskopischen Bedingungen sichtbar sind, insbesondere mit Färbemitteln, die für Neuronen und Glia spezifisch sind. Besonders geeignet sind monoclonale Antikörper, die Oberflächenmarker von Neuronen identifizieren, wie der Antikörper M6, der Maus-Neuronen identifiziert. Am stärksten bevorzugt sind Antikörper, die beliebige Neurotransmitter identifizieren, insbesondere diejenigen, die gegen γ-Aminobuttersäure (GABA) und Substanz P sowie gegen Enzyme gerichtet sind, die an der Synthese von Neurotransmittern beteiligt sind, insbesondere Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD). Transplantierte Zellen können auch identifiziert werden, indem vorher Indikatorfarbstoffe eingebaut werden, wie Rhodamin- und Fluorescein-markierte Mikrokügelchen, Echtblau, Bisbenzamid oder Retrovirus-induzierte histochemische Marker, wie das lac-Z-Gen, das β-Galactosidase produziert.
Der funktionelle Einbau des Transplantats in das neurale Gewebe des Wirts kann festgestellt werden, indem die Wirksamkeit von Transplantaten untersucht wird, verschiedene Funktionen wiederherzustellen, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf Tests auf endokrine, motorische, kognitive und sensorische Funktionen. Motorische Tests, die eingesetzt werden können, umfassen Tests, mit denen die Rotationsbewegung von der degenerierten Stelle des Gehirns weg quantitativ bestimmt werden kann, und Tests, mit denen die Langsamkeit der Bewegung, die Balance, Koordination, Akinese oder das Fehlen einer Bewegung, die Steifheit und der Tremor quantitativ bestimmt werden können. Kognitive Tests umfassen verschiedene Tests auf die Fähigkeit, die Aufgaben des täglichen Lebens zu erfüllen, und verschiedene Gedächtnistests, einschließlich des Verhaltens im Labyrinth.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Vorläuferzellen in einen Wirt transplantiert und dazu induziert, in diesem Wirt zu proliferieren und/oder sich zu differenzieren, und zwar entweder durch (1) Proliferation und Differenzierung in vitro, anschließend Transplantation, (2) Proliferation in vitro, Transplantation, anschließend weitere Proliferation und Differenzierung in vivo, oder (3) Proliferation in vitro, Transplantation und Differenzierung in vivo. Andererseits können die Zellen auch induziert werden, in situ zu proliferieren und sich zu differenzieren, wobei die Induktion mit bestimmten Wachstumsfaktoren oder Arzneimitteln erfolgt, welche ihre Proliferation und Differenzierung induzieren. Somit handelt es sich bei der letzteren Methode um eine nicht-operative Vorgehensweise, so dass die Probleme vermieden werden, die mit einem operativen Eingriff und den Immunreaktionen gegen fremde Zellen zusammenhängen. Ein beliebiger Wachstumsfaktor kann verwendet werden, insbesondere EGF, TGFα, aFGF und bFGF. Diese Wachstumsfaktoren können in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise verabreicht werden, mit der ermöglicht wird, dass die Faktoren durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB) passieren oder diese umgehen.
Verfahren, mit denen die Faktoren in die Lage versetzt werden, durch die Blut-Hirn-Schranke zu passieren, umfassen das Minimieren der Größe des Faktors oder das Bereitstellen von hydrophoben Faktoren, die möglicherweise einfacher durch sie passieren können.
Verfahren zum Umgehen der Blut-Hirn-Schranke umfassen die Transfektion der Vorläuferzellen mit Expressionsvektoren, welche die Gene enthalten, die für Wachstumsfaktoren codieren, so dass die Zellen selbst den Faktor produzieren. Zellen können durch beliebige Verfahren transfiziert werden, die dem Fachmann bekannt sind, umfassend CaPO₄-Transfektion, DEAE-Dextran-Transfektion, Polybrene-Transfektion, durch Protoplastenfusion, Elektroporation, Lipofektion und dergleichen.
Jeder beliebige Expressionsvektor, der dem Fachmann bekannt ist, kann verwendet werden, um den Wachstumsfaktor zu exprimieren, so lange er einen Promotor, der in der Zelle aktiv ist, und geeignete Terminations- und Polyadenylierungssignale aufweist. Diese Expressionsvektoren umfassen rekombinante Vacciniavirus-Vektoren, einschließlich pSC11, oder Vektoren, die von verschiedenen Viren stammen, z. B. vom Simian Virus 40 (SV40, d. h. pSV2-dhfr, pSV2neo, pko-neo, pSV2gpt, pSVT7 und pBABY), vom Rous-Sarkom-Virus (RSV, d. h. pRSVneo), vom Mammatumorvirus der Maus (MMTV, d. h. pMSG), vom Adenovirus (pMT2), vom Herpes-simplex-Virus (HSV, d. h. pPK2 und pHyg), vom Rinder-Pappilomavirus (BPV, d. h. pdBPV und pBV-1MTHA), vom Epstein-Barr-Virus (EBV, d. h. p205 und pHEBo), oder einen beliebigen anderen eukaryotischen Expressionsvektor, der dem Fachmann bekannt ist.
Beliebige Wachstumsfaktoren, von denen bekannt ist, dass sie die Proliferation, das Wachstum oder die Differenzierung der Vorläuferzellen induzieren, können zur Expression in den Vorläuferzellen eingesetzt werden, umfassend FGF, EGF und TGFα. Außerdem können Zellen mit Rezeptoren für einen beliebigen Wachstumsfaktor, wie für bFGF und EGF, transformiert werden. Weiterhin können Zellen mit einem beliebigen Gen transfiziert werden, das einen Neurotransmitter oder ein Neurotransmitter-synthetisierendes Enzym codiert, der/das vorstehend angegeben ist, oder ein beliebiger/s anderer/s, dessen Expression im Wirt gewünscht ist.
Andere Verfahren, mit denen Wachstumsfaktoren im Bereich der Transplantation bereitgestellt werden können, umfassen die Implantation einer Vorrichtung ins Gehirn in der Nähe des Transplantats, wobei mit der Vorrichtung der der Faktor in die umgebenden Zellen infundiert werden kann.
Vorläuferzellen können durch ein Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, kältekonserviert werden, indem die Zellen in einer isotonischen Lösung suspendiert werden, vorzugsweise in einem Zellkulturmedium, das ein bestimmtes Kältekonservierungsmittel enthält. Solche Kältekonservierungsmittel umfassen Dimethylsulfid (DMSO), Glycerin und dergleichen. Diese Kältekonservierungsmittel werden bei einer Konzentration von 5 bis 15%, vorzugsweise 8 bis 10%, eingesetzt. Die Zellen werden nach und nach bis zu einer Temperatur von –10°C bis –150°C, vorzugsweise –20°C bis –100°C, und stärker bevorzugt –70°C bis –80°C, eingefroren.
Die in vitro gezüchteten Vorläuferzellen können zum Durchmustern möglicher neurologisch wirksamer Arzneimittel eingesetzt werden. Diese Mittel können zu den Zellen in Kultur in verschiedenen Dosierungen zugegeben werden, und anschließend kann die Antwort der Zellen nach verschiedenen Zeiträumen überwacht werden. Die physischen Eigenschaften der Zellen können analysiert werden, indem das Zell- und Neurit-Wachstum unter dem Mikroskop verfolgt wird. Die Induktion der Expression von neuen oder erhöhten Spiegeln von Proteinen, wie Enzymen, Rezeptoren und anderen Zelloberflächenmolekülen, oder von Neurotransmittern, Aminosäuren, Neuropeptiden und biogenen Aminen, kann mit einem beliebigen Verfahren analysiert werden, das dem Fachmann bekannt ist, wodurch die Veränderung im Spiegel solcher Moleküle identifiziert werden kann. Diese Verfahren umfassen immunhistochemische Verfahren unter Verwendung von Antikörpern gegen solche Moleküle oder eine biochemische Analyse. Eine solche biochemische Analyse umfasst Proteintests, enzymatische Tests, Rezeptorbindungstests, Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA), eine elektrophoretische Analyse, Analyse mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), Western-Blots und Radioimmuntests (RIA). Anhand einer Nucleinsäureanalyse, wie Northern-Blots, können die Spiegel der mRNA bestimmt werden, die diese Moleküle oder die Enzyme codiert, welche diese Moleküle synthetisieren. Andererseits können die Zellen, die mit diesen Arzneimitteln behandelt wurden, in ein Lebewesen transplantiert werden, und anschließend können ihre Lebensfähigkeit, ihre Fähigkeit, neuronale Verbindungen auszubilden, und ihre biochemischen und immunologischen Eigenschaften wie vorstehend beschrieben untersucht werden.
Die folgenden Beispiele sollen der ausführlicheren Erläuterung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung dienen. Sie sollen jedoch in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken, der in den beiliegenden Patentansprüchen definiert ist.
Beispiel 1
14 Tage alte CD₁-Albinomäuseembryos (Charles River) wurden geköpft und Hirn und Striatum unter sterilen Bedingungen entnommen. Das Gewebe wurde in einem serumfreien Medium, das aus einem 1:1-Gemisch aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und F-12-Nährsubstanz (Gibco) bestand, mit einer Pasteurpipette mit Feuerpolitur mechanisch dissoziiert. Die dissoziierten Zellen wurden fünf Minuten bei 800 UpM abzentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Zellen in DMEM/F-12-Medium für die Zählung resuspendiert.
BEISPIEL 2
Hirngewebe wurde aus dem Hirn jugendlicher und erwachsener Mäuse entnommen, in 500-μm-Schnitte geschnitten und unmittelbar danach in eine sauerstoffangereicherte künstliche Zerebrospinalflüssigkeit mit niedrigem Calciumgehalt (aCSF mit niedrigem Ca⁺⁺-Gehalt) überführt, die 1,33 mg/ml Trypsin, 0,67 mg/ml Hyaluronidase und 0,2 mg/ml Kynurensäure enthielt. Das Gewebe wurde in dieser Lösung 90 Minuten bei 32 bis 35°C gerührt. Die aCSF wurde abgegossen und für fünf Minuten durch eine frische sauerstoffangereicherte aCSF ersetzt. Danach wurde das Gewebe in eine Lösung aus DMEM, F-12 und 10% Hormon, enthaltend 0,7 mg/ml Ovomucoid, überführt und anhand einer Pasteurpipette mit Feuerpolitur digeriert. Die Zellen wurden fünf Minuten bei 400 UpM abzentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die sedimentierten Zellen in einem Gemisch aus DMEM, F-12 und 10% Hormon resuspendiert.
BEISPIEL 3
Die wie in den Beispielen 1 und 2 hergestellten dissoziierten Zellen wurden in einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen (100 μl/Vertiefung) auf etwa eine Zelle pro Vertiefung verdünnt, um die clonale Natur der durch EGF induzierten Proliferation zu untersuchen. Das Vorliegen einer Einzelzelle in einer Vertiefung wurde mit einem Phasenkontrastmikroskop bestätigt.
BEISPIEL 4
2500 Zellen/cm², die wie in Beispiel 1 hergestellt wurden, wurden auf mit Poly-L-ornithin beschichtete (15 μg/ml; Sigma) Deckgläschen aus Glas in Nunclon-Kulturschalen mit 24 Vertiefungen (0,5 ml/Vertiefung) plattiert. Das Kulturmedium war ein serumfreies Medium, das aus DMEM/F12 (1:1) bestand und Glucose (0,6%), Glutamin (2 μM), Natriumbicarbonat (3 mM) und HEPES (4-[2-Hydroxyethyl]-1-piperazinethansulfonsäure)-Puffer (5 mM) enthielt (alle von Sigma, außer Glutamin [Gibco]). Ein definiertes Hormongemisch und Salzgemisch (Sigma), das Insulin (25 μg/ml), Transferrin (100 μg/ml), Progesteron (20 nM), Putrescin (60 μM) und Selenchlorid (30 nM) enthielt, wurde anstelle des Serums verwendet. Die Kulturen enthielten das vorstehende Medium zusammen mit 16 bis 20 ng/ml EGF (gereinigt aus dem submandibulären Bereich der Maus, Collaborative Research) oder TGFα (menschlich, rekombinant, Gibco). Nach zehn bis 14 Tagen in vitro wurden die Medien (nur DMEM plus Hormongemisch) und Wachstumsfaktoren ersetzt. Dieser Austausch des Mediums wurde alle zwei bis vier Tage wiederholt. Die Anzahl der überlebenden Zellen wurde nach fünf Tagen in vitro bestimmt, indem die Deckgläschen zwei Minuten in 0,4% Trypanblau (Gibco) inkubiert, mit Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,3) gewaschen und sodann die Zellen, die den Farbstoff ausschlossen, mit einem umgekehrten Diaphot-Mikroskop von Nikon gezählt wurden.
BEISPIEL 5
Dissoziierte Zellen aus dem Hirn der Maus, die wie in den Beispielen 1 und 2 hergestellt wurden (bei 1 × 10⁵ Zellen/ml), wurden in dem in Beispiel 4 beschriebenen Kulturmedium zusammen mit 20 ng/ml EGF oder TGFα suspendiert. Die Zellen wurden in einen T25-Kulturkolben gesät und in einem Inkubator bei 37°C und 100% Luftfeuchtigkeit, 95% Luft/5% CO₂, inkubiert. Die Zellen begannen innerhalb von drei bis vier Tagen zu proliferieren und lösten sich aufgrund eines Mangels an Substrat vom Boden des Kolbens ab und proliferierten weiterhin in Suspension, wobei sie hohle Kügelchen aus undifferenzierten Zellen bildeten. Nach sechs bis sieben Tagen in vitro wurden die proliferierenden Cluster (Neurosphären) alle zwei bis vier Tage gefüttert, indem sie leicht abzentrifugiert und in DMEM mit den vorstehend angegebenen Zusätzen resuspendiert wurden.
BEISPIEL 6
Nach sechs bis sieben Tagen in vitro wurden einzelne Zellen in den Neurosphären aus Beispiel 5 abgetrennt, indem die Neurosphären mithilfe einer Pasteurpipette mit Feuerpolitur digeriert wurden. Die Einzelzellen aus den dissoziierten Neurosphären wurden in Gewebekulturkolben in einem Gemisch aus DMEM, F-12 und 10% Hormon zusammen mit 20 ng/ml EGF suspendiert. Ein Teil der dissoziierten Zellen begann zu proliferieren und bildete neue Neurosphären, die größtenteils aus undifferenzierten Zeilen bestanden. Die Kolben wurden gut geschüttelt, danach ließ man die Neurosphären in der Ecke des Bodens des Kolbens sich absetzen. Die Neurosphären wurden sodann in 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und fünf Minuten bei 300 UpM zentrifugiert. Das Medium wurde abgesaugt und die Neurosphären in 1 ml EGF-enthaltendem Medium resuspendiert. Die Zellen wurden mit einer feuerverengten Pasteurpipette dissoziiert und 40-mal digeriert. 20 μl der Zellen wurden für die Zählung entnommen und zu 20 μl Trypanblau, 1:2 verdünnt, zugegeben. Die Zellen wurden gezählt und mit 50 000 Zellen pro ml wieder plattiert. Die Differenzierung der Zellen wurde induziert, indem die Zellen in den Kulturkolben in Gegenwart von EGF oder TGFα bei 20 ng/ml gehalten wurden, ohne dass die Proliferation durch Dissoziation der Neurosphären oder durch Plattieren auf Polyornithin unter fortwährendem Vorliegen von EGF oder TGFα wieder in Gang gesetzt wurde.
BEISPIEL 7
Ein indirektes immuncytochemisches Verfahren wurde mit den wie in den Beispielen 1 und 2 hergestellten Zellen durchgeführt, die 14 bis 30 Tage in vitro auf Deckgläschen aus Glas gezüchtet worden waren. Für ein gegen NSE (oder gegen Nestin) gerichtetes und ein gegen GFAP gerichtetes immuncytochemisches Verfahren wurden die Zellen mit 4% Paraformaldehyd in PBS bzw. 95% Ethanol und 5% Essigsäure fixiert. Nach einer 30-minütigen Fixierung wurden die Deckgläschen dreimal (jeweils zehn Minuten) in PBS (pH 7,3) gewaschen und danach in dem primären Antiserum (NSE 1:300, Nestin 1:1500 oder GFAP 1:100) in PBS, 10% normalem Ziegenserum und 0,3% Triton-X-100 zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Die Deckgläschen wurden dreimal (jeweils zehn Minuten) in PBS gewaschen und mit sekundären Antikörpern (Ziegen-Anti-Kaninchen-Rhodamin für Anti-NSE oder Anti-Nestin, und Ziegen-Anti-Maus-Fluorescein für Anti-GFAP, beide mit 1:50) 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Deckgläschen dreimal (jeweils zehn Minuten) in PBS gewaschen, mit Wasser gespült, auf Glasobjektträger gelegt und mit Fluorsave überdeckt, einem Deckmedium, das vorzugsweise zusammen mit Fluorescein-konjugierten Antikörpern eingesetzt wird. Die Fluoreszenz wurde nachgewiesen und mit einem Optiphot-Photomikroskop von Nikon fotografiert.
BEISPIEL 8
Ratten wurden mit Nembutal (25 mg/kg i. p.) anästhesiert und erhielten Atropinsulfat-Injektionen (2 mg/kg i. p.). Den Tieren wurde eine Ibotenat-Läsion des Striatums zugefügt. Sieben Tage nach der Läsion erhielten die Tiere unter stereotaktischer Kontrolle eine Injektion der Zellen, die wie in Beispiel 1 oder Beispiel 2 hergestellt worden waren. Die Injektionen erfolgten in den Bereich der Läsion über eine 21-Gauge-Kanüle, die über einen Teflon-Katheter mit einem Mikroinjektor verbunden war. Die injizierten Zellen waren mit Fluorescein-markierten Mikrokügelchen markiert. Mit den Tieren wurden vor der Läsion, nach der Läsion und in verschiedenen Intervallen nach der Transplantation Verhaltenstests durchgeführt, wobei die Funktionalität der transplantierten Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Operation bestimmt wurde, anschließend wurden die Tiere getötet und mit einer Lösung aus 4% gepuffertem Paraformaldehyd, 0,1% Glutaraldehyd und 5% Saccharose bei 4°C transkardial perfundiert. Die Hirne wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Verwendung bei –20°C aufbewahrt. Hirnschnitte zu je 25 μm wurden mit Hilfe eines Kryostaten hergestellt, in 4% Paraformaldehyd fixiert und mit dem monoclonalen Antikörper M6 gefärbt, mit dem die Maus-Neuronen angefärbt werden, und anschließend mit einem sekundären Fluorescein-konjugierten Anti-Ratte-Antikörper umgesetzt. Der Neuronen- und der Glia-Phänotyp wurden durch eine doppelte Markierung der Zellen mit einem Antikörper gegen NSE und GFAP identifiziert.
BEISPIEL 9
Zellen, die gemäß Beispiel 2 hergestellt worden waren, wurden 14 bis 30 Tage in vitro auf Deckgläschen aus Glas gezüchtet und danach mit 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert. Nach einer 30-minütigen Fixierung wurden die Deckgläschen dreimal (jeweils zehn Minuten) in PBS (pH 7,3) gewaschen und sodann in dem primären Antiserum (Anti-GABA 1:3000, Anti-Glutamin-Decarboxylase 1:500, und Anti-Substanz P 1:100, in PBS, enthaltend 10% normales Ziegenserum/0,3% Triton-X-100) zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Die Deckgläschen wurden dreimal (jeweils zehn Minuten) in PBS. gewaschen und mit sekundären Antikörpern (Ziegen-Anti-Kaninchen oder Ziegen-Anti-Schaf, konjugiert mit Fluorescein oder Rhodamin bei 1:50) 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Deckgläschen dreimal (jeweils zehn Minuten) in PBS gewaschen, mit Wasser gespült, auf Glasobjektträger gelegt und mit Fluorsave als Deckmedium abgedeckt. Die Fluoreszenz wurde nachgewiesen und mit einem Optiphot-Photomikroskop von Nikon fotografiert.
BEISPIEL 10
Zellen, die wie in Beispiel 2 hergestellt worden waren, wurden drei Minuten bei 300 UpM zentrifugiert, das Medium abgesaugt und anschließend die Zellen in einem warmen DMEM/F-12-Medium, das 10% Glycerin enthielt, bei einer Konzentration von etwa 1 × 10⁵ Zellen pro ml resuspendiert und langsam für zwei Stunden in einer vorgekühlten Styropor-Box mit offenem Deckel auf –20°C eingefroren. Sobald die Zellen gefroren waren, wurden sie in –80°C überführt. Die Zellen wurden aufgetaut, indem das Gefrierfläschchen in ein 37°C warmes Wasserbad gestellt und das Ganze durch vorsichtiges Bewegen gemischt wurde, sodann wurde ein gleiches Volumen warmes Medium zu den Zellen alle fünf Minuten 15 Minuten lang zugegeben und das Volumen anschließend auf 10 ml gebracht. Danach wurden die Zellen drei Minuten bei 300 UpM zentrifugiert und der Überstand verworfen. 10 μl Zellen wurden entnommen, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen, und 10 μl Zellen wurden entnommen und mit Trypanblau gefärbt und sodann auf einem Hämocytometer gezählt. Die Zellen wurden in einer Lösung aus DMEM, F-12 und 10% Hormon mit 100 000 Zellen pro Kolben resuspendiert und drei bis vier Tage bei 37°C in T25-Kulturkolben gezüchtet.
BEISPIEL 11
Zellen werden aus dem ventralen Mittelhirngewebe eines acht Wochen alten menschlichen Fötus gewonnen, der nach einem Routine-Abort mittels Saugkürettage in ein steriles Gefäß überführt wurde. Ein Gewebestück zu 2 × 4 × 1 mm wird herausgeschnitten und wie in Beispiel 1 dissoziiert. Danach werden die Zellen wie in Beispiel 5 gezüchtet.
BEISPIEL 12
Zellen, die wie in Beispiel 11 zubereitet wurden, werden für eine Neurotransplantation in einen an einer neurodegenerativen Erkrankung leidenden Wirt mit einer passenden Blutgruppe eingesetzt. Die Operation erfolgt unter Verwendung einer BRW computertomographischen (CT) stereotatischen Führung. Der Patient erhält eine örtliche Betäubung, außerdem wird ihm Midazolam intravenös verabreicht. Vom Patienten wird ein CT-Bild angefertigt, um die Koordinaten der Region festzulegen, in die das Transplantat eingebracht werden soll. Die Injektionskanüle besteht aus einer äußeren 17-Gauge-Kanüle aus rostfreiem Stahl mit einer inneren 19-Gauge-Sonde. Diese Vorrichtung wird in das Gehirn an den korrekten Koordinaten eingeführt, anschließend wird sie entfernt und durch eine 19-Gauge-Infusionskanüle ersetzt, die vorher mit 30 μl einer Gewebesuspension gefüllt worden war. Die Zellen werden langsam mit einer Rate von 3 μl/Min. infundiert, während die Kanüle zurückgezogen wird. Im Bereich von Interesse werden mehrere stereotaktische Nadelvorstöße mit einem Abstand von etwa 4 mm gesetzt. Nach der Operation wird der Patient anhand eines CT untersucht, ob eine Blutung oder ein Ödem vorliegt. Neurologische Untersuchungen werden in bestimmten Abständen nach der Operation durchgeführt, außerdem erfolgen PET-Aufnahmen, um die metabolische Aktivität der implantierten Zellen zu bestimmen.
BEISPIEL 13
Neurales Gewebe wird aus dem Ventrikelbereich eines Menschen durch Biopsie entnommen und wie in Beispiel 5 gezüchtet.
BEISPIEL 14
Zellen, die wie in Beispiel 1 oder Beispiel 2 proliferiert wurden, werden mit Expressionsvektoren transfiziert, die die Gene für den bFGF-Rezeptor oder den NGF-Rezeptor enthalten. Die Vektor-DNA-Proben, die die Gene enthalten, werden in 0,1 × TE (1 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) auf eine Konzentration von 40 μg/ml verdünnt. 220 μl der DNA werden zu 250 μl von 2 × HBS (280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 12 mM Dextrose, 50 mM HEPES) in einem sterilen 5-ml-Einmalröhrchen aus Kunststoff gegeben. 31 μl von 2 M CaCl₂ werden langsam zugefügt und das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieser 30-minütigen Inkubation werden die Zellen fünf Minuten bei 4°C bei 800 × g zentrifugiert. Die Zellen werden in 20 Volumina eiskalter PBS resuspendiert und in Aliquots von 1 × 10⁷ Zellen aufgeteilt, die erneut zentrifugiert werden. Jedes Aliquot von Zellen wird in 1 ml der DNA-CaCl₂-Suspension resuspendiert und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden die Zellen in Wachstumsmedium verdünnt und sechs bis 24 Stunden bei 37°C in 5 bis 7% CO₂ inkubiert. Anschließend werden die Zellen erneut zentrifugiert, in PBS gewaschen und erneut für 48 Stunden in 10 ml Wachstumsmedium gegeben.
BEISPIEL 15
Zellen, die wie in Beispiel 14 transfiziert wurden, werden wie in Beispiel 12 in einen menschlichen Patienten transplantiert.

Claims

Verfahren zur in-vitro-Herstellung einer Zellkultur multipotenter neuraler Stammzellen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Zubereiten oder Bereitstellen eines anfänglichen Kulturmediums, umfassend einen oder mehrere Wachstumsfaktoren, die die Proliferation multipotenter neuraler Stammzellen induzieren können, wobei der/die eine oder mehreren Wachstumsfaktor(en) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe bestehend aus saurem Fibroblastenwachstumsfaktor, basischem Fibroblastenwachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor, einem EGF-ähnlichen Liganden, Amphiregulin und transformierendem Wachstumsfaktor alpha; (b) Zubereiten einer Zellkultur durch Zugabe von Zellen zu dem Kulturmedium von Schritt (a), wobei die Zellen von neuralem Gewebe eines Säugers stammen, wobei das Säugergewebe nicht von einem menschlichen Embryo stammt, und wobei die Zellen mindestens eine multipotente neurale Stammzelle enthalten, die sich unbegrenzt teilen und Nachkommen produzieren kann, die in Neuronen und Glia differenzieren können; (c) Proliferieren der multipotenten neuralen Stammzelle in dem Zellkulturmedium zur Herstellung neuraler Stammzellnachkommen, einschließlich multipotenter neuraler Tochterstammzellen und Tochterzellen, die in Neuronen und Glia differenzieren können; und (d) Dissoziieren der neuralen Stammzellnachkommen und Transferieren der neuralen Stammzellnachkommen in ein frisches Kulturmedium, das einen oder mehrere Wachstumsfaktoren enthält, die die Proliferation multipotenter neuraler Stammzellen induzieren können, um die multipotenten neuralen Tochterstammzellen zu proliferieren und um weitere neurale Stammzellnachkommen zu produzieren, wobei der/die eine oder mehreren Wachstumsfaktor(en) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe bestehend aus saurem Fibroblastenwachstumsfaktor, basischem Fibroblastenwachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor, einem EGF-ähnlichen Liganden, Amphiregulin und transformierendem Wachstumsfaktor alpha.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proliferation der multipotenten neuralen Stammzelle in Schritt (c) oder der multipontenten neuralen Tochterstammzellen in Schritt (d) in einer Suspensionskultur stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proliferation der multipotenten neuralen Stammzelle in Schritt (c) oder der multipotenten neuralen Tochterstammzellen in Schritt (d) in einer substratgebundenen Kultur stattfindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die Aufrechterhaltung der multipotenten neuralen Stammzellen durch Wiederbeginnen der Proliferation der multipotenten neuralen Tochterstammzellen in Schritt (d) durch Wiederholen von Schritt (d).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das neurale Gewebe eines Säugers von einem Menschen stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das neurale Gewebe eines Säugers von einem Fötus, Neugeborenen, Jugendlichen oder Erwachsenen stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die in den Schritten (a) und (d) verwendete Kulturmedien ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus MEM, DMEM, RPMI, F-12 und einem Gemisch aus DMEM und F-12.
Verfahren zur in-vitro-Herstellung von differenzierten neuralen Zellen, die aus den mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 produzierten neuralen Stammzellnachkommen stammen, umfassend das Induzieren der Differenzierung der Tochterzellen, die sich differenzieren können, durch Ausplattieren der Tochterzellen auf ein gebundenes Substrat oder durch Ermöglichen der Differenzierung der Tochterzellen, die sich differenzieren können, in Suspension ohne Wiederbeginnen der Proliferation.
Verfahren zum Durchmustern eines Wirkstoffs eines mutmaßlichen therapeutischen Mittels, umfassend das Anwenden des Mittels auf die durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 produzierte Zellkultur und Überwachen der Antwort der Zellkultur.
Zellkultur, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 für die Verwendung zur Behandlung einer neurologischen oder neurodegenerativen Erkrankung oder eines ZNS-Traumas, wobei die Zellkultur von einer Quelle stammt, die autolog für den vorgesehenen Empfänger ist.
Verwendung einer durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 hergestellten Zellkultur oder der Zellkultur nach Anspruch 10 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer neurologischen oder neurodegenerativen Erkrankung oder eines ZNS-Traumas.
Verwendung einer Zellkultur nach Anspruch 11, die von einer Quelle stammt, die autolog für den vorgesehenen Empfänger ist.
Verwendung einer Zellkultur nach Anspruch 11 oder 12, wobei die neurologische oder neurodegenerative Krankheit Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Chorea Huntington, Schizophrenie, amyotropische Lateralsklerose, Epilepsie, Cerebralparese oder Schlaganfall oder die neurogenerative Erkrankung ist, die Ballismus oder Athetose verursacht.