ES2198404T3

ES2198404T3 - Celulas progenitoras neurales que responden a factor de crecimiento y que se pueden hacer proliferar in vitro.

Info

Publication number: ES2198404T3
Application number: ES92914286T
Authority: ES
Inventors: Samuel Weiss; Brent A. Reynolds
Original assignee: Neurospheres Holdings Ltd
Current assignee: Neurospheres Holdings Ltd
Priority date: 1991-07-08
Filing date: 1992-07-07
Publication date: 2004-02-01
Anticipated expiration: 2012-07-07
Also published as: DE69233061D1; DE69233061T3; EP1329499A2; FI935929A; EP0594669B9; DK0594669T4; EP1329499A3; JPH06509225A; ATE240389T1; CA2113118A1; NO940056L; WO1993001275A1; NO940056D0; EP0594669B1; DK0594669T3; AU2242592A; JP4416837B2; FI935929A0; DE69233061T2; AU665012B2

Abstract

UN SISTEMA DE CULTIVO IN VITRO PARA LA PERPETUACION DE UN NUMERO ILIMITADO DE CELULAS PROGENITORAS NEURALES. LAS CELULAS PROGENITORAS SON AISLADAS DE REGIONES NEURALES PARTICULARES Y PROLIFERADAS EN CULTIVOS EN SUSPENSION EN PRESENCIA DE FACTORES DE CRECIMIENTO. LAS CELULAS PROGENITORAS PUEDEN SER INDUCIDAS PARA DIFERENCIARSE DENTRO DE NEURONAS Y CELULAS GLIALES.LA CAPACIDAD PARA PERPETUAR CELULAS PROGENITORAS FETALES PERMITE LA PRODUCCION DE UNA AMPLIA OFERTA DE TEJIDOS DE UN MINIMO NUMERO DE FETOS PARA TRASPLANTE DENTRO DE UN ANIMAL CON NEURODEGENERACION. EL USO DE CELULAS JUVENILES Y ADULTAS PARA GENERAR PROGENITORAS ELIMINARIA LA NECESIDAD DE OBTENER TEJIDOS FETALES Y PODRIA PERMITIR QUE EL PACIENTE SUMINISTRARA SU PROPIAS PROGENITORAS. TALES ACERCAMIENTO ELIMINARIA LOS PROBLEMAS ETICOS DE OBTENER TEJIDO NEURONAL FETAL ASI COMO EL PROBLEMA DE RECHAZO DE TEJIDOS Y EL USO REQUERIDO DE MEDICAMENTOS INMUNODEPRESORES.

Description

Células progenitoras neurales que responden a factor de crecimiento y que se pueden hacer proliferar in vitro.

Esta invención se refiere a un método para el cultivo in vitro de células progenitoras neurales, y al uso de estas células como injertos de tejidos. En un aspecto, esta invención se refiere a un método para el aislamiento y la perpetuación in vitro de grandes números de células progenitoras neurales no tumorales, que se pueden inducir a diferenciarse y que se pueden utilizar para neurotransplantes en un animal para aliviar los síntomas de enfermedades neurológicas, neurodegeneración y traumas del sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés). En otro aspecto, esta invención se refiere a un método de generar células nerviosas con el objeto de buscar entre diversos medicamentos agentes terapéuticos supuestos dirigidos al sistema nervioso. En otro aspecto, esta invención se refiere también a un método de generar células para transplantes autólogos. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para la proliferación y diferenciación in situ de las células progenitoras en el receptor.

El desarrollo del sistema nervioso comienza en un estado temprano del desarrollo fetal. La neurogénesis, la generación de nuevas neuronas, se completa de manera temprana en el periodo post-natal. Sin embargo, se alteran continuamente las conexiones sinápticas implicadas en los circuitos neurales durante la vida del individuo, debido a la plasticidad sináptica y a la muerte celular.

La primera etapa en el desarrollo neural es el nacimiento de la célula, que es la secuencia precisa temporal y espacial, en la cual las células precursoras o progenitoras proliferan y se diferencian. Las células proliferantes darán origen a los neuroblastos, glioblastos y células madre.

La segunda etapa es un periodo de diferenciación del tipo celular y migración cuando las células progenitoras se hacen neuronas y células gliales y migran a sus posiciones finales. Las células que se derivan del tubo neural dan origen a neuronas y glia del sistema nervioso central (CNS), mientras que las células derivadas de la cresta neural dan origen a las células del sistema nervioso periférico (PNS, por sus siglas en inglés). Ciertos factores presentes durante el desarrollo, tales como el factor del crecimiento de los nervios (NGF, por sus siglas en inglés), promueven el crecimiento de las células neurales. Se segrega NGF por células de la cresta neural y estimula la ramificación y crecimiento de los axones neurales.

La tercera etapa en el desarrollo sucede cuando las células adquieren cualidades fenotípicas específicas, tales como la expresión de neurotransmisores particulares. En este momento, las neuronas extienden también ramificaciones que se unen por sinapsis a sus dianas. Las neuronas no se dividen después de la diferenciación.

Finalmente, ocurre la muerte celular selectiva, en la que la degeneración y muerte de células específicas, fibras y conexiones sinápticas "ajustan finamente" los circuitos complejos del sistema nervioso. Este "ajuste fino" continúa durante toda la vida del receptor. Más tarde en la vida, la degeneración selectiva debida al envejecimiento, infecciones y otras etiologías desconocidas pueden llevar a enfermedades neurodegenerativas.

El tratamiento de enfermedades degenerativas ha llegado a ser un asunto principal en los últimos años, debido a la creciente población mayor, que se encuentra en el mayor riesgo de estas enfermedades. Estas enfermedades, que comprenden la enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington y la enfermedad de Parkinson, se han relacionado con la degeneración de neuronas en lugares específicos del cerebro, que lleva a la incapacidad de la región cerebral para sintetizar y liberar neurotransmisores, que son vitales para las señales neuronales. La esquizofrenia es otra enfermedad que se piensa que ocurre debido a la falta de neurotransmisores.

La neurodegeneración también comprende esos estados y enfermedades que dan como resultado pérdida neuronal. Estos estados pueden comprender aquellos que se originan como resultado de traumas del CNS, incluyendo apoplejía y epilepsia. Otras enfermedades, tales como esclerosis lateral amiotrófica y parálisis cerebral pueden dar también como resultado pérdida neuronal. A causa de la falta de entendimiento de las interacciones entre áreas específicas del cerebro, y de cómo estas interacciones generan las manifestaciones externas de sus funciones, es difícil el tratamiento de la degeneración del CNS. Se han hecho más difíciles los estudios de las interacciones celulares internas y su efecto en la conducta y funciones cognoscitivas, debido al gran número de células y a los circuitos neurales complejos que ellas forman.

El objetivo de la mayoría de las terapias del CNS es recuperar la función química particular o la actividad enzimática que se pierde debido a la degeneración celular.

La degeneración en una región cerebral conocida como los ganglios basales puede llevar a enfermedades con diferentes síntomas cognoscitivos y motores, dependiendo de la exacta localización. Los ganglios basales consisten en muchas regiones separadas, comprendiendo el cuerpo estriado (que consiste en el caudado y el putamen), el globus pallidus, la sustancia negra, sustancia innominada, pallidum ventral, núcleo basal de Meynert, área tegmental ventral y el núcleo subtalámico.

En el caso de la enfermedad de Alzheimer, existe una degeneración celular profunda del prosencéfalo y de la corteza cerebral. Además, después de una inspección más detallada, una degeneración localizada en un área de los ganglios basales, el núcleo basal de Meynert, parece que está degenerado de manera selectiva. Normalmente, este núcleo envía proyecciones colinérgicas a la corteza cerebral, que se piensa que participan en funciones cognoscitivas incluyendo la memoria.

Muchas deficiencias motoras son un resultado de la degeneración en los ganglios basales. El corea de Huntington está asociado con la degeneración de las neuronas en el cuerpo estriado, lo que lleva a movimientos involuntarios espasmódicos en el paciente. La degeneración de una pequeña región llamada el núcleo subtalámico se asocia con movimientos violentos en saltos de las extremidades en un estado llamado balismo, mientras que la degeneración en el putamen y en el globus pallidus se asocian con un estado de movimientos lentos de retorcimiento o atetosis. En el caso de la enfermedad de Parkinson, se ve la degeneración en otra área de los ganglios basales, la par compacta de la sustancia negra. Normalmente, esta área envía conexiones dopaminérgicas al cuerpo estriado dorsal, que son importantes para regular el movimiento. La terapia de la enfermedad de Parkinson se ha centrado en restablecer la actividad dopaminérgica en este circuito.

Pueden ocurrir otras formas de lesión neurológica como un resultado de la degeneración neural, tal como esclerosis lateral amiotrófica y parálisis cerebral, o como un resultado de traumas del CNS, tal como apoplejía y epilepsia.

Actualmente, el tratamiento de la disfunción del CNS se ha hecho principalmente mediante la administración de composiciones farmacéuticas. Desgraciadamente, este tipo de tratamiento lleva consigo muchas complicaciones incluyendo la capacidad limitada de transportar medicamentos a través de la barrera sangre-cerebro, y la tolerancia a los medicamentos que se adquiere por pacientes a los cuales se les ha administrado estos medicamentos durante largo tiempo. Por ejemplo, el restablecimiento parcial de la actividad dopaminérgica en los pacientes con Parkinson se ha conseguido con levodopa, que es un precursor de dopamina capaz de cruzar la barrera sangre-cerebro. Sin embargo, los pacientes se hacen tolerantes a los efectos de levodopa, y por tanto, se necesitan dosis constantemente crecientes para mantener sus efectos. Actualmente no existen tratamientos farmacéuticos eficaces contra la enfermedad de Alzheimer.

Recientemente, se ha aplicado el concepto de injerto de tejido neurológico al tratamiento de enfermedades neurológicas, tal como la enfermedad de Parkinson. Los injertos neurales pueden evitar la necesidad no solamente de la administración constante de medicamentos, sino también los sistemas complicados de suministro de medicamentos, que se realizan debido a la barrera sangre-cerebro. Sin embargo, también hay limitaciones a esta técnica. Primero, las células utilizadas para el transplante, que llevan moléculas de la superficie celular de una célula diferenciada de otra persona, pueden inducir una reacción inmune en el paciente. Además, las células deben estar en un estado de desarrollo que sean capaces de formar conexiones neurales normales con las células vecinas. Por estas razones, los estudios iniciales sobre neurotransplantes se centraron en el uso de células fetales. Perlow, et al. Describen el transplante de neuronas dopaminérgicas fetales en ratas adultas con lesiones químicamente inducidas en la sustancia negra y en el cuerpo estriado en "Brain grafts reduce motor abnormalities produced by destruction of nigrostriatal dopamine system", Science 204: 643-647 (1979). Estos injertos mostraron buena supervivencia, desarrollo axónico y reducían significativamente las anormalidades motoras en los animales hospedadores. Lindvall, et al., en "Grafts of fetal dopamine neurons survive and improve motor function in Parkinson's Disease", Science 247: 574-577 (1990), mostraban que el transplante neural de neuronas de dopamina mesencefálicas fetales humanas puede restaurar la síntesis y el almacenamiento de dopamina, y reducir la rigidez y bradiquinesia en pacientes que sufren de la enfermedad de Parkinson. Freed, et al. en "Transplantation of human fetal dopamine cells for Parkinson's Disease" Arch. Neurol. 47: 505-512 (1990) mostraban también una mejora en un paciente que recibió un transplante fetal.

Las referencias anteriores describen que el tejido cerebral fetal de mamíferos tiene buenas características de supervivencia después del transplante inmediato. Se piensa que la capacidad aumentada de supervivencia de las neuronas fetales es debida a la susceptibilidad reducida de las neuronas fetales a la anoxia con respecto a las neuronas adultas, y también a la falta de marcadores de la superficie celular en las células fetales, cuya presencia puede conducir al rechazo del tejido injertado procedente de adultos. Sin embargo, aunque se considera que el cerebro un lugar inmunológicamente privilegiado, pueden suceder algunos rechazos del tejido fetal. Por tanto, está limitada la capacidad de utilizar tejido fetal, no solamente debido al rechazo por el tejido del tejido fetal aislado de otro paciente, y a causa de la necesidad resultante de medicamentos inmunosupresores, sino también debido a los problemas éticos de obtener tejido fetal. Sin embargo, el tejido de cerebro de neonato posee una capacidad limitada de supervivencia y las neuronas del CNS del mamífero adulto generalmente no sobreviven al transplante en el cerebro.

Aunque las neuronas del CNS adulto no son buenas candidatas para el neurotransplante, se ha visto que las neuronas del sistema periférico adulto (PNS) sobreviven al transplante, y que ejercen efectos neurotróficos y gliotróficos en el desarrollo del tejido neural del receptor. Un origen del tejido neural que no sea de CNS para transplantes es la médula adrenal. Las células cromafines adrenales se originan de la cresta neural como las neuronas del PNS, y reciben sinapsis y producen proteínas portadoras y enzimáticas similares a las neuronas del PNS. Aunque estas células funcionan de una manera endocrina en la médula adrenal intacta, en cultivo estas células pierden su fenotipo glandular y desarrollan características neurales en cultivo en presencia de ciertos factores y hormonas de crecimiento (Notter, et al., "Neuronal properties of monkey adrenal medulla in vitro", Cell Tissue Research 244: 69-76 [1986]). Cuando se injertan en el CNS de mamíferos, estas células sobreviven y sintetizan cantidades significativas de dopamina que pueden interactuar con los receptores de dopamina de las áreas próximas del CNS.

En la patente de EE.UU. Nº 4.980.174, el transplante de células conteniendo monoamina aisladas de la glándula pineal y médula adrenal de ratas adultas en corteza frontal de rata llevaba a la mejora del desvalimiento aprendido, una forma de depresión en el receptor. En la patente de EE.UU. Nº 4.753.635, se implantaron células cromafines y tejido medular adrenal derivado de bueyes en la base del cerebro o médula espinal de ratas y produjeron analgesia cuando se indujo al tejido o célula implantada a que liberara sustancias interactivas nociceptoras (p. ej. catecolaminas, tales como dopamina). Se han implantado de forma autóloga células medulares adrenales en seres humanos, y han sobrevivido, causando mejoras de suaves a moderadas en los síntomas (Watts, et al., "Adrenal-caudate transplantation in patients with Parkinson's Disease (PD): 1-year follow-up", Neurology 39 Suppl 1: 127 [1989], Hurtig, et al.. "Post-mortem analysis of adrenal-medulla-to-caudate autograft in a patient with Parkinson's Disease", Annals of Neurology 25: 607-614 [1989]). Sin embargo, las células adrenales no obtienen un fenotipo neural normal, y son probablemente, por tanto, de uso limitado para transplantes donde se deban formar conexiones sinápticas.

Otro origen de tejidos para neurotransplantes es el procedente de líneas celulares. Las líneas celulares son células inmortalizadas que se derivan o por transformación de células normales con un oncogen (Cepko, "Inmortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction", Ann. Rev. Neurosci. 12: 47-65 [1989]) o mediante el cultivo de células con características alteradas de crecimiento in vitro (Ronnett, et al., "Human cortical neuronal cell lline: Establishment from a patient with unilateral megalencephaly", Science 248: 603-605 [1990]). Se pueden hacer crecer tales células en cultivo en grandes cantidades para utilizarse para transplantes múltiples. Se ha visto que algunas líneas celulares se diferencian después de tratamiento químico para expresar una variedad de propiedades neuronales, tales como formación de la neurita, membranas excitables y síntesis de neurotransmisores y sus receptores. Aún más, después de la diferenciación, estas células parece que son amitóticas, y, por tanto, no cancerosas. Sin embargo, el potencial de estas células de inducir respuestas inmunes adversas, el uso de retrovirus para inmortalizar células, el potencial para la reversión de estas células a un estado amitótico, y la falta de respuesta de estas células a las señales normales de inhibición del crecimiento, hacen a estas líneas celulares menos que óptimas para su uso extendido.

Reynolds et al., Soc. Neurosci. Abstracts, vol 15, oct./nov. 1990, Abstr. Nº 474.2 describe los efectos de EGF o TGF-\alpha en un cultivo primario de células progenitoras de CNS embrionario.

Otra aproximación al neurotransplante implica el uso de tipos de células genéticamente modificadas o terapia génica. Utilizando este método, se puede introducir un gen extraño o transgénico en una célula que es deficiente con respecto a una actividad enzimática en particular, restableciendo por tanto la actividad. Las células que contienen entonces el gen transferido se pueden transplantar al lugar de la neurodegeneración, y proporcionar productos, tales como neurotransmisores y factores de crecimiento (Rosenberg, et al., "Grafting genetically modified cells to the damaged brain: Restorative effects on NGF Expresión", Science 242: 1575-1578, [1988]), que pueden funcionar para aliviar algunos de los síntomas de la degeneración. Sin embargo, sigue existiendo el riesgo de inducir una reacción inmune con estas células y la transferencia mediada por retrovirus puede dar como resultado otras anormalidades celulares. Se ha visto también, que las líneas celulares producidas por transferencia génica mediada por retrovirus inactivan gradualmente sus genes transferidos después del transplante (Palmer, et al. "Genetically modified skin fibroblasts persist long after transplantation but gradually inactivate introduced genes", Proc. Natl. Acad. Sci. 88: páginas 1330-1334 [1991]). Además, estas células puede que no consigan las conexiones neuronales normales con el tejido receptor.

La incapacidad en el estado anterior de la técnica de los transplantes de integrarse totalmente en el tejido del receptor, y la falta de disponibilidad de células en cantidades ilimitadas de un origen seguro para injertos son, quizás, la limitación mayor de los neurotransplantes.

Por tanto, en vista de las deficiencias antes mencionadas con respecto a los métodos del estado anterior de la técnica del cultivo y transplante de células neurales, debería ser aparente de que todavía existe una necesidad en la técnica de un origen seguro de números ilimitados de células para neurotransplantes, que sean capaces de diferenciarse en neuronas. Aún más, dado que se pueden rechazar inmunológicamente células de donante heterólogo, existe ahí una necesidad de aislamiento, perpetuación y transplante de progenitores autólogos a partir del cerebro juvenil o adulto, que sean capaces de diferenciarse en neuronas. Además, existe una necesidad de reparación de tejido neuronal dañado de una manera relativamente no invasiva, es decir, mediante la inducción de células progenitoras para proliferar y diferenciarse en neuronas in situ.

Por tanto, un objeto principal de la presente invención es proporcionar un origen seguro de un número ilimitado de células para neurotransplantes, que sean capaces de diferenciarse en neuronas.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para la proliferación in vitro de células progenitoras neurales a partir de cerebro juvenil y adulto, para diferenciación de estos progenitores en neuronas, y para neurotransplante de las células progenitoras en un receptor heterólogo o autólogo. Se puede inducir también a las células progenitoras para que proliferen y se diferencien in situ evitando de esta manera la necesidad de un transplante.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método de generar células nerviosas con el propósito de buscar agentes terapéuticos supuestos dirigidos al sistema nervioso.

Tal como aquí se describe, la presente invención se refiere a un método para la producción in vitro de un cultivo celular de células madre neurales pluripotentes, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) preparar o proporcionar un medio de cultivo inicial que comprende uno o más factores de crecimiento capaces de inducir la proliferación de células madre neurales pluripotentes; (b) preparar un cultivo celular mediante la adición al medio de cultivo de la etapa (a) de células derivadas de tejido neural de mamíferos y conteniendo al menos una célula madre neural pluripotente capaz de dividirse sin límite y producir progenie que es capaz de diferenciarse en neuronas y glia; (c) hacer proliferar dicha célula madre neural pluripotente en dicho medio de cultivo celular para producir progenie de células madre neurales que comprenda células madre neurales pluripotentes hijas y células hijas que son capaces de diferenciarse en neuronas y glia; y (d) transferir dicha progenie de células madre neurales a un medio de cultivo nuevo que contiene uno o más factores de crecimiento capaces de inducir la proliferación de las células madre neurales pluripotentes para hacer que proliferen dichas células madre neurales pluripotentes hijas y para producir más progenie de células madre neurales.

En una realización preferida, la invención proporciona un método para la producción in vitro de un cultivo celular de células madre neurales pluripotentes, tal como se describe anteriormente, en el que la proliferación de dicha célula madre neural pluripotente en la etapa (c) o dichas células madre neurales pluripotentes hijas en la etapa (d) sucede en un cultivo en suspensión o en un cultivo fijado a un sustrato.

Además, la invención proporciona un método tal como se describe anteriormente, en el que dicho método comprende la perpetuación de células madre neurales pluripotentes mediante el reinicio de la proliferación de las células madre neurales pluripotentes hijas en la etapa (d) mediante la repetición de la etapa (d).

En una realización preferida del método de la invención, dicho tejido neural de mamífero proviene de un ser humano. Lo más preferiblemente, dicho tejido neural de mamífero proviene de un feto, neonato, juvenil o adulto.

Se prefiere que los métodos de cultivo utilizados en las etapas (a) y (d) del método de la invención estén sin suero.

En la realización más preferida del método de la invención, dichos uno o más factores de crecimiento se seleccionan del grupo que consiste en factor ácido de crecimiento de fibroblastos, factor básico de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, un ligando similar a EGF, anfirregulina y factor alfa de crecimiento de transformación.

Preferiblemente, dicho medio de cultivo inicial de la etapa (a) y dicho medio de cultivo reciente de la etapa (d) del método de la invención contienen el mismo o mismos factores de crecimiento.

Se prefiere también en el método de la invención que dicho medio de cultivo nuevo de la etapa (d) contenga uno o más factores de crecimiento diferentes de dicho uno o más factores de crecimiento de dicho medio de cultivo inicial de la etapa (a).

En otra realización, la presente invención proporciona un método para producir in vitro células neurales diferenciadas derivadas de la progenie de células madre neurales producida mediante el método inventivo, tal como se describe anteriormente, que comprende inducir dichas células hijas, que son capaces de diferenciarse, para que se diferencien mediante siembra en placas de dichas células hijas sobre un sustrato fijo o dejando que dichas células hijas, que son capaces de diferenciarse, se diferencien en suspensión sin reiniciar la proliferación.

La invención proporciona también un método para la búsqueda entre diversos medicamentos de una agente terapéutico supuesto que comprende aplicar dicho agente al cultivo celular producido mediante el método inventivo descrito anteriormente y vigilar la respuesta de dicho cultivo celular.

Además, la invención se refiere a un cultivo celular producido por el método aquí descrito para su uso en el tratamiento de enfermedades neurológicas o neurodegenerativas o traumas del CNS, en el que dicho cultivo celular se deriva de una fuente autóloga con respecto al receptor previsto.

La invención también proporciona el uso de un cultivo celular producido mediante el método inventivo aquí descrito en la fabricación de un medicamento para tratar enfermedades neurológicas o neurodegenerativas o traumas del CNS. Preferiblemente, dicho cultivo celular se deriva de una fuente autóloga con respecto al receptor previsto.

En otra realización, la presente invención se refiere al uso de un cultivo celular de la invención y descrito anteriormente en el que dicha enfermedad neurológica o neurodegenerativa es la enfermedad de Parkinson , enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, esquizofrenia, esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia, parálisis cerebral o apoplejía o la enfermedad neurodegenerativa que causa balismo o atetosis.

La invención describe un método para la proliferación y diferenciación in vitro de células progenitoras, que comprende las etapas de (a) aislar la célula de un mamífero, (b) exponer la célula a un medio de cultivo que contiene un factor de crecimiento, (c) inducir a la célula a que prolifere, y (d) inducir a la célula a que se diferencie. Se puede llevar a cabo la proliferación y perpetuación de la célula progenitora o en cultivos en suspensión, o dejando a las células que se adhieran a un sustrato fijo. Se puede realizar la proliferación y diferenciación antes o después del transplante, y en diferentes combinaciones de estados in vitro o in vivo, comprendiendo (1) proliferación y diferenciación in vitro, a continuación transplante, (2) proliferación in vitro, transplante, seguidamente más proliferación y diferenciación in vivo, y (3) proliferación in vitro, transplante y diferenciación in vivo. La invención describe también la proliferación y diferenciación de las células progenitoras in situ, que se puede hacer directamente en el receptor sin la necesidad de transplante.

La invención también describe la conservación de las células progenitoras mediante criogénesis.

La invención también describe un método para el transplante in vivo de una célula progenitora, tratada según cualquiera de (1) a (3) anteriores, que comprende implantar, en un mamífero, estas células que se han tratado con al menos un factor de crecimiento.

Además, la invención describe un método para tratar las enfermedades neurodegenerativas que comprende administrar a un mamífero células progenitoras que se han tratado según cualquiera de (1) a (3), se han tratado con un factor de crecimiento y se ha inducido para que se diferencien en neuronas. La invención describe también un método para tratar enfermedades neurodegenerativas que comprenden estimular in situ células progenitoras del CNS de mamíferos para que proliferen y se diferencien en neuronas.

La invención también describe un método para la transfección de estas células progenitoras con vectores que puedan expresar los productos génicos para factores de crecimiento, receptores de factores de crecimiento, y neurotransmisores peptídicos, o expresar enzimas que están implicadas en la síntesis de neurotransmisores, incluyendo los de para aminoácidos, aminas biogénicas y neuropéptidos, y para el transplante de estas células transfectadas en las regiones de neurodegeneración.

La invención describe también un método para la búsqueda de compuestos farmacéuticos potenciales neurológicamente terapéuticos.

Con lo anterior y otros objetos, ventajas y características de la invención que serán aquí aparentes a continuación, se puede entender más claramente la naturaleza de la invención mediante referencia a la siguiente descripción detallada de la invención y a las reivindicaciones anejas.

Breve descripción de los dibujos Figura 1 Desarrollo inducido mediante EGF de un conjunto de células indiferenciadas procedentes de una única célula

Con dilución limitada de la suspensión celular, se sembraron e identificaron células aisladas en la base de placas de 96 pocillos. (A-D). Microfotografías de contraste de fases de una célula (A) después de 3 días in vitro (DIV). La misma célula empezó a dividirse después de 5 DIV (B) y generó un conjunto de células observadas después de 7 (C) y 10 (D) DIV. Los arañazos en el plástico (cabeza de la flecha) sirvieron para identificar el campo. Barra, 10 \mum. (E-F). Microfotografía de contraste de fases (E) del conjunto de células de 10 DIV, generado en respuesta a EGF. La mayoría de las células en este conjunto contenían nestina-IR (F). Barra, 10 \mum.

Figura 2 Células NSE-IR en conjuntos proliferantes de células inducidos con EGF y TGF\alpha

Se examinó la presencia de células NSE-IR en conjuntos de proliferación de células inducidos con EGF y TGF\alpha a los 20 y 25 DIV. Antes de 15 DIV no se detectaron células NSE-IR. Las células NSE-IR aparecieron después de 16-18 DIV y se vieron inicialmente en el núcleo de la proliferación. (A, B). Después de 20 DIV, se identificaron numerosas células NSE-IR en las células tratadas con EGF (A) y con TGF\alpha (B). Se hallaron pocas células NSE-IR fuera del núcleo de proliferación y no había diferencias aparentes entre las células NSE-IR en los cultivos tratados con EGF y con TGF\alpha. (C, D). Después de 25 DIV, se observaron cientos de células NSE-IR. Además de grandes números de células NSE-IR en el núcleo de proliferación, habían migrado muchas células IR. En este estado, se hicieron aparentes algunas diferencias en la morfología neuronal entre (C) células tratadas con EGF y (D) células tratadas con TGF\alpha. Mientras que las células tratadas con EGF tenían neuritas cortas, algunas de las células NSE-IR en los cultivos tratados con TGF\alpha habían desarrollado procesos bastante largos (flechas). Barra, 20 \mum.

Figura 3 Aparición de células GFAP-IR en cultivos tratados con EGF y TGF\alpha

GFAP-IR aparecieron primero a los 16-18 DIV. En el DIV 20 se observaron unas pocas células GFAP-IR emigrando fuera del núcleo de proliferación. No había diferencias aparentes entre cultivos tratados con EGF y con TGF\alpha. En el DIV 25, una gran mayoría de las células que habían emigrado del núcleo central eran GFAP-IR. En este estado todas las células GFAP-IR en cultivos tratados con EGF tenían una morfología estrellada, mientras que muchas de las GFAP-IR en los cultivos tratados con TGF\alpha tomaban una morfología de astrocitos protoplasmáticos inmaduros (todavía se veían algunas células estrelladas). En el DIV 30, todas las células GFAP-IR en los cultivos tratados con EGF exhibían una morfología estrellada. Al contrario, casi todas las células GFAP-IR en los cultivos tratados con TGF\alpha eran protoplasmáticas. Barra, 20 \mum.

Figura 4 Fenotipo de neuronas generadas mediante proliferación inducida con EGF de células progenitoras estriadas adultas

Microfotografías de fluorescencia de células con morfología neuronal, en cultivos de 21 DIV de una única esfera generada con EGF cultivada en un sustrato fijo, después de teñir para GABA (a) y sustancia P (b).

Figura 5 Neuroesferas de ratón transplantadas se diferencian en neuronas en el CNS de rata

Se utilizó un anticuerpo monoclonal, M6, que reconoce una proteína superficial hallada solamente en neuronas de ratón para marcar los progenitores de ratón transplantados que se habían diferenciado en neuronas en la rata receptora. Se identifican cuerpos celulares marcados positivamente (grandes flechas) y neuritas (pequeñas flechas).

La presente invención proporciona el aislamiento de células progenitoras neurales de un animal, la perpetuación estas células in vitro o in vivo en presencia de factores de crecimiento, la diferenciación de estas células en neuronas y glia, para la criogénesis de células progenitoras, y el uso de estas células para neurotransplantes en un receptor para tratar enfermedades neurodegenerativas y traumas neurológicos, y para aplicaciones de búsqueda de medicamentos. La inducción de la proliferación y diferenciación en estas células progenitoras se puede hacer o mediante el crecimiento de células en adherencia o en suspensión en cultivo tisular, o, bajo condiciones adecuadas, en el receptor en las siguientes combinaciones: (1) proliferación y diferenciación in vitro, a continuación transplante, (2) proliferación in vitro, transplante, seguidamente más proliferación y diferenciación in vivo, (3) proliferación in vitro, transplante y diferenciación in vivo, y (4) proliferación y diferenciación in situ. La proliferación y diferenciación in situ implica una acción no quirúrgica que ayuda a las células progenitoras a proliferar in situ con manipulación farmacéutica.

Se piensa que las células progenitoras están bajo una influencia inhibidora tónica que mantiene a los progenitores en un estado de supresión hasta que sea necesaria su diferenciación. Esta influencia inhibidora tónica puede ser un factor soluble, puesto que fracciones de lisados neurales vueltos a añadir a las células progenitoras pueden inhibir su proliferación in vitro. En cultivo, estas células progenitoras pueden no ser sujetos de la misma influencia inhibidora. Estas células son ahora capaces de proliferar, y, a diferencia de las neuronas que están diferenciadas de una manera terminal y por tanto no se dividen, se pueden producir en número ilimitado y son por tanto muy apropiadas para el transplante en receptores heterólogos y autólogos con enfermedades neurodegenerativas.

Por progenitor se quiere decir una célula madre oligopotente o pluripotente que es capaz de dividirse sin límite y bajo condiciones específicas puede producir células hijas que se diferencian al final en neuronas y glia. Estas células se pueden utilizar para transplantes en un receptor heterólogo o autólogo. Por heterólogo se quiere decir un receptor diferente del animal del cual se derivaron originalmente las células progenitoras. Por autólogo se quiere decir el receptor idéntico del cual se derivaron originalmente las células.

Se pueden obtener las células de tejido neural post-natal, juvenil o adulto de cualquier animal. Por cualquier animal se quiere decir cualquier animal multicelular que contenga tejido nervioso. Más particularmente, se quiere decir cualquier insecto, pez, reptil, ave, anfibio o mamífero y similares. Los donantes más preferidos son mamíferos, especialmente ratones y humanos.

En el caso de animal donante heterólogo, se le puede aplicar la eutanasia al animal, y retirarle el cerebro y el área específica interesada utilizando un procedimiento estéril. Las áreas del cerebro de particular interés comprenden cualquier área de las cuales se puedan obtener las células progenitoras que servirán para restablecer la función de una zona regenerada del cerebro del receptor. Estas regiones comprenden áreas del sistema nervioso central (CNS) incluyendo la corteza cerebral, cerebelo, mesencéfalo, base del cerebro, médula espinal y tejido ventricular, y áreas del sistema nervioso periférico (PNS) incluyendo el cuerpo carotídeo y la médula adrenal. Más particularmente, estas áreas incluyen regiones de los ganglios basales, preferiblemente el cuerpo estriado que consiste en el caudado y el putamen, o diferentes grupos celulares, tales como el globus pallidus, el núcleo subtalámico, el núcleo basal que se halla degenerado en pacientes con la enfermedad de Alzheimer, o la pars compacta de la sustancia negra que se encuentra degenerada en pacientes con la enfermedad de Parkinson. Este último grupo celular se nombra así y se identifica por su color oscuro debido a la presencia de elevados niveles del pigmento melanina. La melanina se deriva de la tirosina o dopa mediante la acción de la tirosinasa.

Se pueden derivar las células progenitoras neurales heterólogas humanas de tejido fetal obtenido por aborto voluntario, o de un donante de órganos post-natal, juvenil o adulto. Se puede obtener el tejido neural autólogo mediante biopsia, o de pacientes que sufren neurocirugía en la cual se elimina tejido neural, en particular durante la cirugía por epilepsia, y más particularmente durante lobectomías temporales e hipocampolectomías.

Se pueden obtener células de tejido donante mediante disociación de células individuales de la matriz extracelular conjuntiva del tejido. Se puede obtener la disociación utilizando cualquier procedimiento conocido, incluyendo tratamiento con enzimas, tales como tripsina, colagenasa y similares, o utilizando métodos físicos de disociación , tales como un instrumento romo. Se puede llevar a cabo la disociación de las células fetales en medio de cultivo tisular, mientras que un medio preferible para la disociación de células juveniles o adultas es fluido espinal cerebral artificial (aCSF, por sus siglas en inglés). ACSF regular contiene NaCl 124 mM, KCl 5mM, MgCl_{2} 1,3 mM, CaCl_{2} 2 mM, NaHCO_{3} 26 mM, y D-glucosa 10 mM. ACSF con bajo Ca^{++} contiene los mismos ingredientes excepto MgCl_{2}, con una concentración 3,2 mM y CaCl_{2} con una concentración de 0,1 mM.

Se pueden colocar las células disociadas en cualquier medio de cultivo capaz de soportar crecimiento celular, comprendiendo MEM, DMEM, RPMI, F-12, y similares, conteniendo complementos que se necesitan para el metabolismo celular, tales como glutamina y otros aminoácidos, vitaminas, minerales y proteínas útiles, tales como transferrina y similares. El medio puede contener también antibióticos para evitar la contaminación con levaduras, bacterias y hongos, tales como penicilina, estreptomicina, gentamicina y similares. En algunos casos, el medio puede contener suero derivado de bovinos, equinos, pollos y similares. Un medio particularmente preferido para células es una mezcla de DMEM y F-12.

Las condiciones del cultivo deben ser lo más próximas a las condiciones fisiológicas. El pH de los medios de cultivo debe ser lo más próximo al pH fisiológico, preferiblemente entre pH 6-8, más preferiblemente cercano a pH 7, incluso más particularmente pH 7,4 aproximadamente. Las células se deben cultivar a una temperatura cercana a la temperatura fisiológica, preferiblemente entre 30ºC-40ºC, más preferiblemente entre 32ºC-38ºC, y lo más preferido entre 35ºC-37ºC.

Se pueden hacer crecer las células en suspensión o sobre un sustrato fijo, pero la proliferación de los progenitores se hace preferiblemente en suspensión para generar grandes números de células. En el caso de células en suspensión, se agitan bien los matraces y se dejan a las neuroesferas que se sedimenten en el fondo del matraz. A continuación se transfieren las esferas a un tubo de centrifugadora de 50 ml y se centrifugan a baja velocidad. Se aspira el medio, se vuelven a suspender las células en una pequeña cantidad de medio con factor de crecimiento, y se disocian mecánicamente las células. A continuación se cuentan las células y se vuelven a sembrar.

El cultivo de células sobre un sustrato fijo puede llevar a la diferenciación del progenitor en una célula terminalmente diferenciada que ya no es capaz de dividirse, pero que se puede utilizar para transplantes para formar conexiones con otras dianas neurales. Se puede inducir también la diferenciación en suspensión si las células se cultivan durante un periodo de tiempo sin disociación y reinicio de la proliferación.

Los factores de crecimiento que se pueden utilizar para inducir la proliferación comprenden cualquier factor trófico que permita proliferar a las células progenitoras, incluyendo cualquier molécula que se una a un receptor sobre la superficie de la célula para ejercer un efecto trófico o inductor del crecimiento sobre la célula. Tales factores comprenden factor de crecimiento de los nervios (NGF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento ácido y básico de fibroblastos (aFGF, bFGF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por sus siglas en inglés), hormona liberadora de la tirotropina (TRH, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés), un ligando similar a EGF, anfirregulina, factor alfa y beta de crecimiento transformante (TGF\alpha, TGF\beta, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF_{-1}, por sus siglas en inglés) y similares.

Los factores más preferidos son EGF y TGF\alpha. Estos factores de crecimiento son polipéptidos de cadena simple de 53 y 50 aminoácidos respectivamente, que compiten para unirse al receptor de EGF

\hbox{(EGFR).}

Se ha demostrado que EGF y TGF\alpha influyen en la diferenciación celular. Se ha observado en el CNS de roedores y humanos inmunorreactividad (IR) a TGF\alpha, EGF-IR y EGF-IR, así como a mRNAs de TGF\alpha y EGF. Los resultados de estudios de unión de ligandos han demostrado que el número de sitios de unión de [^{125}I]EGF en el cerebro de roedores aumenta durante la gestación y son más elevados en la primera semana después del nacimiento que en el adulto, de acuerdo con el papel de este factor en el desarrollo del CNS. EGF induce la proliferación de una célula progenitora multipotente a partir del cuerpo estriado que da origen a los astrocitos estrellados y neuronas con ramificaciones cortas, y TGF\alpha induce la proliferación de una célula progenitora pluripotente que da origen a astrocitos protoplasmáticos y neuronas con neuritas largas y bien desarrolladas. La concentración utilizada de factores de crecimiento es 1 fg/ml - 1 mg/ml, preferiblemente 20 ng/ml.

Las células neuronales y gliales se pueden derivar después de la diferenciación de las células progenitoras pluripotentes. Se puede inducir la diferenciación de las células por cualquier método conocido en la técnica que active la cascada de sucesos biológicos que llevan al crecimiento, que comprende la liberación de trifosfato de inositol y Ca^{++} intracelular, liberación de diacil-glicerol y la activación de la proteína quinasa C y otras quinasas celulares, y similares. El tratamiento con ésteres de forbol, factores de crecimiento y otras señales químicas, así como el crecimiento sobre un sustrato fijo, tal como una superficie cargada iónicamente, tal como poli-L-lisina y poli-L-ornitina y similares puede inducir la diferenciación. Se puede inducir también la diferenciación dejando las células en suspensión en la presencia continuada de factor de crecimiento, en ausencia de reinicio de proliferación.

Se retiran del animal células de la región neural particular utilizando un procedimiento estéril, y se disocian mecánicamente utilizando cualquier método conocido en la técnica. Se disocia directamente tejido del cerebro justo después del nacimiento en el medio de cultivo, mientras que tejidos cerebrales juveniles o adultos se disocian en fluido espinal cerebral artificial (CSF). Se centrifugan las células disociadas a baja velocidad, entre 200 y 2000 rpm, y más particularmente entre 400 y 800 rpm, y seguidamente se vuelven a suspender en medio de cultivo. Las células se vuelven a suspender a aproximadamente 5 x 10^{4} a

\break

2 x 10^{5} células/ml, preferiblemente 1 x 10^{5} células/ml. Las células sembradas sobre un sustrato fijo se siembran con una concentración aproximada de 2-3 x 10^{3} células/ml, preferiblemente 2,5 x 10^{3} células/ml.

Se complementan las suspensiones celulares en el medio de cultivo con cualquier factor de crecimiento que permita la proliferación de células progenitoras y cultivo en cualquier receptáculo capaz de mantener células, particularmente matraces de cultivo, placas de cultivo o botellas cilíndricas, y más particularmente en pequeños matraces de cultivo, tales como matraces de cultivo de 25 cm^{2}. Las células proliferan en 3-4 días en una incubadora a 37ºC, y se puede reiniciar la proliferación en cualquier momento después de eso mediante disociación de las células y resuspensión en medio de cultivo nuevo que contenga factores de crecimiento.

En ausencia de sustrato, las células se despegan del fondo del matraz y siguen proliferando en suspensión formando una esfera hueca de células indiferenciadas. Después de aproximadamente 3-10 días in vitro, y más particularmente aproximadamente 6-7 días in vitro, se alimentan los conjuntos proliferantes (neuroesferas) cada 2-7 días, y más particularmente cada 2-4 días mediante suave centrifugación y resuspensión en el medio que contiene factor de crecimiento.

Después de 6-7 días in vitro, se pueden separar las células individuales de las neuroesferas mediante disociación física de las neuroesferas con un instrumento romo, más particularmente mediante trituración de las neuroesferas con una pipeta, especialmente una pipeta pasteur pulida al fuego. Las células aisladas de las neuroesferas disociadas se suspenden en medio de cultivo conteniendo factor de crecimiento, y un porcentaje de estas células proliferan y forman nuevas neuroesferas compuestas principalmente de células indiferenciadas. Se puede inducir la diferenciación de las células mediante siembra de las células sobre un sustrato fijo, comprendiendo matraces, placas o cubres recubiertos de poli-L-lisina y poli-L-ornitina en la presencia continuada de EGF, TGF\alpha o cualquier factor capaz de mantener la diferenciación, tal como factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) y similares. La diferenciación se puede inducir también dejando a las células en suspensión en presencia de un factor de crecimiento, incluyendo EGF o TGF\alpha, sin reinicio de la proliferación.

Para identificar moléculas celulares en los dos tipos de células que se forman después de la diferenciación inducida por factor de crecimiento, es decir neuronas y glia, se lleva a cabo una inmunocitoquímica utilizando anticuerpos específicos para marcadores celulares conocidos. Se pueden utilizar anticuerpos específicos para cualquier proteína neuronal o glial para distinguir las características celulares o propiedades fenotípicas de neuronas de glia. En particular, estos marcadores celulares comprenden , para neuronas, enolasa específica de neuronas (NSE, por sus siglas en inglés) y neurofilamento, y para glia, proteína glio-fibrilar ácida (GFAP, por sus siglas en inglés), galactocerebrósido y similares.

También útiles para identificar células neuronales son anticuerpos contra neurotransmisores. Éstos comprenden anticuerpos contra la acetilcolina (ACh), dopamina (DA), epinefrina (E), norepinefrina (NE), histamina (H), serotonina o 5-hidroxitriptamina (5-HT), neuropéptidos, tales como sustancia P (SP), hormona adrenocorticotrópica (ACTH), vasopresina u hormona antidiurética (ADH), oxitocina, somatostatina, angiotensina II, neurotensina, y bombesina, hormonas liberadoras hipotalámicas, tales como hormona liberadora tirotrópica (TRH) y hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH), péptidos gastrointestinales, tales como péptido intestinal vasoactivo (VIP) y colecistoquinina (CCK) y péptidos similares a CCK, péptidos opioides, tales como \beta-endorfina similar a endorfinas y encefalinas, tales como met- y leu-encefalina, prostaglandinas, aminoácidos tales como ácido gamma-aminobutírico (GABA), glicina, glutamato, cisteína, taurina y aspartato y dipéptidos, tales como carnosina.

Son también útiles anticuerpos contra enzimas sintetizadoras de neurotransmisores, tales como descarboxilasa del ácido glutámico (GAD), que está implicada en la síntesis de GABA, acetil-colina-transferasa (CAT) para la síntesis de ACh, dopa-descarbixilasa (DDC) para dopamina, dopamina-\beta-hidroxilasa (DBH) para NE, y aminoácido-descarboxilasa para

\hbox{5-HT.}

Pueden ser también útiles anticuerpos contra enzimas que están implicadas en la desactivación de neurotransmisores, tales como acetil-colinesterasa (AChE) que desactiva ACh. Anticuerpos contra enzimas implicadas en la retoma de neurotransmisores en los terminales neuronales, tales como monoamina-oxidasa (MAO) y catecol-o-metil-transferasa (COMT) para DA, MAO para 5-HT, y GABA-transferasa (GABA-T) para GABA pueden también identificar neuronas.

Otros marcadores para neuronas comprenden anticuerpos contra receptores de neurotransmisores, tales como los receptores nicotínicos y muscarínicos de AChE, receptores adrenérgicos \alpha_{1}, \alpha_{2}, \beta_{1} y \beta_{2}, el receptor de dopamina y similares.

Las células que contienen un elevado nivel de melanina, tales como las que se encuentran en la sustancia negra, se podrían identificar utilizando un anticuerpo para la melanina.

Se pueden identificar células progenitoras con anticuerpos que se unen específicamente a proteínas halladas solamente en células progenitoras, y no en células que se han diferenciado. En particular son anticuerpos para una proteína de filamento intermedia, y más particularmente un anticuerpo llamado Rat401, que se dirige a la nestina, una proteína intermedia de filamento hallada específicamente en células madre neuroepiteliales.

Se puede utilizar cualquier anticuerpo secundario o anti-inmunoglobulina heteróloga que se una al anticuerpo primario, y que permita su detección al estar conjugado a una enzima particular, isótopo, partícula o tinción. Se pueden originar tales anticuerpos en cualquier animal, tales como cabras, ovejas, conejos, cerdos, caballos, ratones, ratas y similares. Y estar dirigidos contra un anticuerpo primario formado en cualquier animal heterólogo de las mismas variedades. Se pueden conjugar los anticuerpos secundarios a las tinciones, tales como fluoresceína, rodamina u otra tinción, se pueden marcar con cualquier isótopo, tal como ^{125}I o conjugar a una proteína radiomarcada, tal como digoxina, o se pueden conjugar con partículas que se puedan ver al microscopio, tales como partículas inmuno-oro o similares. Se pueden también conjugar los anticuerpos secundarios a cualquier enzima que pueda reaccionar con un sustrato para formar un producto de reacción visible o detectable, tales como peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina. Anticuerpos particularmente útiles son anticuerpos secundarios que consisten en IgG anti-ratón de cabra purificada por cromatografía de afinidad conjugada con fluoresceína e IgG anti-conejo de cabra purificada por cromatografía de afinidad conjugada con rodamina.

Se cultivan las células sobre cualquier sustrato sobre el cual las células puedan crecer y diferenciarse, y que se pueda analizar utilizando microscopía, tales como placas de cultivo, portas de vidrio, cubres y similares. Se cultivan las células hasta 6 semanas, y más preferiblemente durante 14-30 días in vitro, y se pueden fijar en cualquier solución deshidratante, tal como un alcohol o acetona, o en una solución de aldehídos reticulantes. A continuación se tiñen las células utilizando anticuerpos primarios dirigidos a cualquier característica celular particular que se va a identificar, seguido de la reacción con anticuerpos conjugados secundarios para su detección.

Se pueden administrar las células transplantadas a cualquier animal con síntomas anormales neurológicos o neurodegenerativos obtenidos de cualquier manera, incluidos los obtenidos como un resultado de lesiones químicas o electrolíticas, como un resultado de aspiración experimental de áreas neurales, o como un resultado de procesos de envejecimiento. Lesiones particularmente preferibles en animales no humanos se obtienen con 6-hidroxi-dopamina (6-OHDA),

\hbox{1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina}

(MPTP), ácido iboténico y similares.

A causa de que los inmunosupresores tienen algo de riesgo de morbilidad y mortalidad como resultado de infecciones que pueden ocurrir, solamente se puede hacer en ausencia de estos medicamentos transplantes autólogos o transplantes heterólogos utilizando tejido de padres o parientes. Se puede hacer el transplante de forma bilateral, o, en el caso de un paciente que sufre enfermedad de Parkinson, de manera contralateral con respecto al lado más afectado. Se realiza la cirugía de una manera en la cual las regiones particulares del cerebro se puedan localizar, tales como en relación con las suturas del cráneo, particularmente con una guía estereotáctica. Se suministran las células en toda área neural afectada, en particular en los ganglios basales, y preferiblemente al caudado y putamen, al núcleo basal y a la sustancia negra. Se administran las células a la región particular utilizando cualquier método que mantenga la integridad de las áreas circundantes del cerebro, preferiblemente mediante cánula de inyección.

Las células administradas a la región neural particular forman preferiblemente un injerto neural, en el que las células forman conexiones neuronales o sinápticas normales con las neuronas vecinas, y mantienen contacto con las células gliales que pueden formar vainas de mielina alrededor del axón de la neurona, y proporcionan una influencia trófica a las neuronas. Cuando estas células transplantadas forman conexiones, restablecen las redes neuronales que se han dañado debido a la enfermedad y el envejecimiento.

Se puede inducir a las células progenitoras a que proliferen y se diferencien in situ administrando al receptor cualquier factor de crecimiento o composición farmacéutica que inducirá la proliferación y diferenciación a las células. Estos factores de crecimiento comprenden cualquier factor de crecimiento conocido en la técnica, incluyendo los factores de crecimiento descritos anteriormente para la proliferación y diferenciación in vitro, y en particular EGF y TGF\alpha. Las composiciones farmacéuticas comprenden cualquier sustancia que bloquee la influencia inhibidora y/o estimulen al progenitor a que prolifere y se diferencie finalmente. Se puede hacer la administración de hormonas de crecimiento mediante cualquier método, incluyendo cánula de inyección, transfección de células con vectores que expresen hormonas de crecimiento, inyección, aparatos de liberación controlada que pueden administrar sustancias al lugar deseado, y similares. Se pueden administrar las composiciones farmacéuticas mediante cualquier método, incluyendo cánula de inyección, inyección, administración oral, aparatos de liberación controlada y similares.

Se puede examinar la supervivencia del injerto en el receptor vivo utilizando diferentes escaners no invasivos, tales como tomografía axial computerizada (TAC o escáner TC), resonancia magnética nuclear o imagen por resonancia magnética (RMN o IMR) o más preferiblemente escaners de tomografía de emisión de positrones (TEP). Se puede realizar el examen post-mortem de supervivencia del injerto retirando el tejido neural, y examinando macroscópicamente la región afectada, o más preferiblemente utilizando microscopía. Se pueden teñir las células con cualquier tinción visible en las condiciones del microscopio óptico o electrónico, más particularmente con tinciones que sean específicas para neuronas y glia. Particularmente útiles son los anticuerpos monoclonales que identifican marcadores superficiales de las células neuronales, tales como el anticuerpo M6, que identifica las neuronas de ratón. Los más preferibles son los anticuerpos que identifican cualquier neurotransmisor, particularmente los dirigidos al ácido gamma-amino-butírico (GABA) y a la sustancia P, y a las enzimas implicadas en la síntesis de neurotransmisores, en particular, descarboxilasa del ácido glutámico (GAD). Se pueden también identificar las células transplantadas mediante incorporación anterior de tinciones trazadoras, tales como microesferas marcadas con rodamina o fluoresceína, azul rápido, bis-benzamida o marcadores histoquímicos introducidos retroviralmente, tales como el gen lac Z, que produce beta-galactosidasa.

La integración funcional del injerto en el tejido neural del receptor se puede asegurar mediante examen de la efectividad de los injertos en la restauración de diferentes funciones, comprendiendo, pero no limitado, a ensayos de las funciones endocrina, motora, cognoscitiva y sensorial. Los ensayos motores que se pueden utilizar comprenden aquellos que cuantifican el movimiento rotacional lejos del lugar degenerado del cerebro, y aquellos que cuantifican la lentitud de movimientos, equilibrio, coordinación, aquinesia o falta de movimientos, rigidez y temblores. Los ensayos cognoscitivos comprenden diferentes ensayos de capacidad para realizar las tareas diarias, así como diferentes ensayos de memoria, incluyendo resolución de laberintos.

En otra realización de la invención, se transplantan las células progenitoras a un receptor, y se induce que proliferen y/o se diferencien en ese receptor, ya sea por (1) proliferación y diferenciación in vitro, seguidamente transplante, (2) proliferación in vitro, transplante in vivo, o (3) proliferación in vitro, transplante y diferenciación in vivo. De manera alternativa, se pueden inducir a las células que proliferen y se diferencien in situ mediante inducción con factores de crecimiento particulares o composiciones farmacéuticas que inducirán su proliferación y diferenciación. Por tanto, este último método no es quirúrgico, y por ello evita los problemas asociados con la intervención médica y las reacciones inmunes a células extrañas. Se puede utilizar cualquier factor de crecimiento, particularmente EGF, TGF\alpha, aFGF, bFGF y NGF. Se pueden administrar estos factores de crecimiento de cualquier manera conocida en la técnica en la cual los factores o puedan pasar a través de o eviten la barrera sangre-cerebro (BBB, por sus siglas en inglés).

Los métodos para permitir que los factores pasen a través de la barrera sangre-cerebro comprenden minimizar el tamaño del factor, o proporcionar factores hidrofóbicos que permitan pasarla más fácilmente.

Los métodos para evitar la barrera sangre-cerebro comprenden transfección de las células progenitoras con vectores de expresión conteniendo genes que codifican los factores de crecimiento, de tal manera que las mismas células producen el factor. Se pueden transfectar las células mediante cualquier método conocido en la técnica, comprendiendo transfección de CaPO_{4}, transfección de DEAE-dextrano, transfección por polibreno, mediante fusión de protoplastos, electroporación, lipofección, y similares.

Se puede utilizar cualquier vector de expresión conocido en la técnica para expresar el factor de crecimiento, siempre que tenga un promotor que sea activo en la célula, y terminación apropiada y señales de poliadenilación. Estos vectores de expresión comprenden vectores de virus de vacunas recombinantes incluyendo pSC11, o diferentes virus derivados de vectores, tales como virus 40 de simios (SV40, es decir pSV2-dhfr, pSV2neo, pko-neo, pSV2gpt, psVT7 y pBABY), del virus de sarcoma de Rous (RSV, es decir pRSVneo), de virus tumorales de las mamas de ratón (MMTV, es decir pMSG), de adenovirus (pMT2), de virus de herpes simples (HSV, es decir pTK2 y pHyg), del papilomavirus bovino (BPV, es decir pdBPV y pBV-1MTHA), del virus de Epstein-Barr (EBV, es decir p205 y pHEBo) o cualquier otro vector de expresión eucariótico conocido en la técnica.

Se puede utilizar para la expresión en las células progenitoras cualquier factor de crecimiento para inducir proliferación, crecimiento o diferenciación de las células progenitoras, comprendiendo NGF, FGF, EGF, TGF\alpha y similares. Se pueden transformar también las células con receptores para cualquier factor de crecimiento, tal como para bFGF, NGF, EFG y similares. Además, se pueden transfectar las células con cualquier gen que codifique un neurotransmisor o enzima sintetizadora de neurotransmisor, que se listó anteriormente o cualquier otra para la cual se desea la expresión en el receptor.

Otros métodos para proporcionar factores de crecimiento al área del transplante comprenden el implante en el cerebro en proximidad con el injerto de cualquier dispositivo que pueda proporcionar una infusión del factor a las células circundantes.

Se pueden criopreservar las células progenitoras mediante cualquier método conocido en la técnica, suspendiendo las células en una solución isotónica, preferiblemente un medio de cultivo celular, conteniendo un crioconservante particular. Tales crioconservantes comprenden sulfóxido de dimetilo

\hbox{(DMSO),}

glicerol y similares. Estos crioconservantes se utilizan con una concentración de 5-15%, preferiblemente 8-10%. Se congelan las células gradualmente a una temperatura de -10ºC a -150ºC, preferiblemente -20ºC a - 100ºC, y más preferiblemente -70ºC a -80ºC.

Se pueden utilizar las células progenitoras cultivadas in vitro para la búsqueda de composiciones potenciales neurológicamente terapéuticas. Se pueden aplicar estas composiciones a células en cultivo con diferentes dosis, y controlar la respuesta de las células para diferentes periodos de tiempo. Se pueden analizar las características físicas de las células mediante la observación del crecimiento de la célula y de la neurita con microscopía. La inducción de la expresión de niveles nuevos o aumentados de proteínas, tales como enzimas, receptores y otras moléculas de la superficie celular, o de neurotransmisores, aminoácidos, neuropéptidos y aminas biogénicas, se puede analizar con cualquier técnica conocida en la técnica que pueda identificar la alteración de los niveles de tales moléculas. Estas técnicas comprenden la inmunohistoquímica utilizando anticuerpos contra tales moléculas, o análisis bioquímico. Tal análisis bioquímico comprende ensayos de proteínas, ensayos enzimáticos, ensayos de unión a receptores, ensayos inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), análisis electroforéticos, análisis con cromatografía líquida de elevada resolución (HPLC), western blots, y radioinmunoensayos (RIA). Los análisis de ácido nucleico, tales como northern blots, se pueden utilizar para examinar los niveles de mRNA que codifica estas moléculas, y para enzimas que sintetizan estas moléculas.

De manera alternativa, las células tratadas con estas composiciones farmacéuticas se pueden transplantar a un animal, y examinar, tal como se ha descrito anteriormente su supervivencia, capacidad para formar conexiones neuronales, y características bioquímicas e inmunológicas.

Los siguientes ejemplos se presentarán para aclarar más detalladamente las realizaciones preferidas de la invención. Sin embargo no se deben considerar de ninguna manera como limitación del alcance de la invención, tal como se define en las reivindicaciones que se acompañan.

Ejemplo 1

Se decapitaron embriones de ratón albino CD_{1} (Charles River) de 14 días de edad y se les quitó el cerebro y los cuerpos estriados utilizando un procedimiento estéril. Se disoció mecánicamente el tejido con un pipeta Pasteur pulida al fuego en un medio sin suero compuesto de una mezcla 1:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y nutriente

\hbox{F-12}

(Gibco). Se centrifugaron las células disociadas a 800 r. p. m. durante 5 minutos, se aspiró el sobrenadante, y se volvieron a suspender las células en medio DMEM/F-12 para el recuento. Ejemplo 2

Se quitó tejido cerebral de tejido cerebral de ratón joven y adulto y se cortó en secciones de 500 \mum y se transfirió inmediatamente a fluido cerebroespinal artificial oxigenado con bajo contenido en calcio (aCSF con bajo Ca^{++}) conteniendo 1,33 mg/ml de tripsina, 0,67 mg/ml de hialuronidasa, y 0,2 mg/ml de ácido quinurénico. Se agitó el tejido en esta solución durante 90 minutos a 32ºC-35ºC. Se eliminó el aCSF y se sustituyó con aCSF oxigenado nuevo durante 5 minutos. Se transfirió el tejido a solución DMEM/F-12/hormona al 10% conteniendo 0,7 mg/ml de ovomucoide y se trituró con una pipeta pasteur pulida al fuego. Se centrifugaron las células a 400 r. p. m. durante 5 minutos, se aspiró el sobrenadante y se volvieron a suspender las células peletizadas en mezcla DMEM/F-12/hormona al 10%.

Ejemplo 3

Se diluyeron células disociadas preparadas como en los Ejemplos 1 y 2 aproximadamente 1 célula/pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos (100 \mul/pocillo) para examinar la naturaleza clonal de la proliferación inducida mediante EGF. Se confirmó la presencia de una única célula por pocillo con microscopía de contraste de fases.

Ejemplo 4

Se sembraron 2500 células/cm^{2} preparadas como en el Ejemplo 1 sobre cubres de vidrio recubiertos de poli-L-ornitina (15 \mug/ml; Sigma) en placas de cultivo Nunclon de 24 pocillos (0,5 ml/pocillo). El medio de cultivo era un medio sin suero compuesto de DMEM/F-12 (1:1) comprendiendo glucosa (0,6%), glutamina (2 \muM), bicarbonato sódico (3 mM), y tampón HEPES (ácido 4-[2-hidroxietil]-1-piperazín-etanosulfónico) (5 mM) (todos de Sigma excepto la glutamina [Gibco]). Se utilizó en lugar de suero una mezcla hormonal definida y mezcla de sales (Sigma) que comprendía insulina (25 \mug/ml), transferrina (100 \mug/ml), progesterona (20 nM), putrescina (60 \muM), y cloruro de selenio (30 nM). Los cultivos contenían el medio anterior junto con 16-20 ng/ml de EGF (purificado de submaxilar de ratón, Collaborative Research) o TGF\alpha (recombinante humano, Gibco). Después de 10-14 días in vitro, se reemplazaron los medios (DMEM sólo más mezcla de hormonas) y los factores de crecimiento. Este cambio de medio se repitió cada dos a cuatro días. Se determinó el número de células supervivientes in vitro a los 5 días mediante incubación de los cubres en azul tripano al 0,4% (Gibco) durante dos minutos, lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,3) y recuento del número de células que no se teñían con un microscopio invertido Nikon Diaphot.

Ejemplo 5

Se suspendieron en el medio de cultivo descrito en el Ejemplo 4 células disociadas de cerebro de ratón preparadas como en los Ejemplo 1 y 2 (1 x 10^{5} células/ml), junto con 20 ng/ml de EGF y TGF\alpha. Se sembraron las células en un matraz de cultivo T25 y se guardaron en una incubadora a 37ºC, 100% de humedad, 95% de aire/5% de CO_{2}. Las células empezaron a proliferar en 3-4 días y, debido a la falta de sustrato, se separaron del fondo del matraz y continuaron proliferando en suspensión formando una esfera hueca de células indiferenciadas. Después de 6-7 días in vitro, se alimentaron los conjuntos proliferantes (neuroesferas) cada 2-4 días mediante suave centrifugación y resuspensión en DMEM con los aditivos descritos anteriormente.

Ejemplo 6

Después de 6-7 días in vitro, se separaron las células individuales de las neuroesferas del Ejemplo 5 mediante trituración de las neuroesferas con un pipeta pasteur pulida al fuego. Se suspendieron células aisladas de las neuroesferas disociadas en matraces de cultivo celular en mezcla de DMEM/F-12/hormona al 10% junto con 20 ng/ml de EGF. Un porcentaje de las células disociadas empezó a proliferar y formaron nuevas neuroesferas compuestas principalmente de células indiferenciadas. Se agitaron bien los matraces y se dejó a las neuroesferas que se sedimentaran en el fondo del matraz. A continuación se transfirieron las neuroesferas a tubos de centrifugadora de 50 ml y se centrifugaron a 300 rpm durante 5 minutos. Se eliminó el medio mediante aspiración, y se resuspendieron las neuroesferas en 1 ml de medio conteniendo EGF. Se disociaron las células con una pipeta pasteur estirada al fuego y se trituraron cuarenta veces. Se retiraron 20 microlitros de las células para el recuento y se añadieron a 20 microlitros de azul tripano diluido 1:2. Se contaron las células y se volvieron a sembrar con una concentración de 50.000 células/ml. Se indujo la diferenciación de las células manteniendo las células en los matraces de cultivo en presencia de EGF o TGF\alpha con una concentración de 20 ng/ml sin reiniciar las proliferación mediante disociación de las neuroesferas o mediante sembrado sobre poli-ornitina en la presencia continua de EGF o TGF\alpha.

Ejemplo 7

Se llevó a cabo inmunocitoquímica indirecta con células preparadas como en los Ejemplos 1 y 2 que se habían cultivado durante 14-30 días in vitro sobre cubres. Para la inmunocitoquímica anti-NSE (o anti-nestina) y anti-GFAP, se fijaron las células con paraformaldehído al 4% en PBS y etanol 95%/ ácido acético 5%, respectivamente. Después de un periodo de fijación de 30 minutos, se lavaron los cubres tres veces (cada uno durante 10 minutos) en PBS (pH = 7,3) y seguidamente se incubaron en el antisuero primario (NSE 1:300, nestina 1:1500 o GFAP 1:100) en PBS/suero normal de cabra al 10%/ Triton-X100 al 0,3% durante dos horas a 37ºC. Se lavaron tres veces los cubres (10 minutos cada vez) en PBS y se incubaron con anticuerpos secundarios (anti-conejo de cabra-rodamina para anti-NSE o anti-nestina y anti-ratón de cabra-fluoeresceína para anti-GFAP, ambos con una concentración 1:50) durante 30 minutos a 37ºC. Seguidamente se lavaron tres veces los cubres (10 minutos cada vez) en PBS, se enjuagaron con agua, se colocaron sobre portas de vidrio y se colocaron cubres encima utilizando Fluorsave, un medio de montaje para utilizarse preferiblemente con anticuerpos conjugados con fluoresceína. Se detectó la fluorescencia y se fotografió con un fotomicroscopio Nikon Optiphot.

Ejemplo 8

Se anestesiaron ratas con nembutal (25 mg/kg intraperitonealmente) y se les inyectó sulfato de atropina (2 mg/kg intraperitonealmente). Los animales tenían una lesión por ibotenato del cuerpo estriado. 7 días después de la lesión, los animales recibieron una inyección de células preparadas como en los Ejemplos 1 o 2 bajo control estereotáctico. Se pusieron las inyecciones en el área lesionada mediante una cánula de calibre 21 provista de un catéter de teflón en el microinyector. Se marcaron las células inyectadas con microesferas marcadas con fluoresceína. Se les hizo a los animales análisis de conducta antes de la lesión, después de la lesión, y en diferentes intervalos después del transplante para determinar la funcionalidad de las células injertadas en diferentes momentos post-operativos, seguidamente se sacrificaron y se les perfundió transcardialmente con paraformaldehido al 4% tamponado, glutaraldehído al 0,1% y solución de sacarosa al 5% a 4ºC. Se congelaron los cerebros en nitrógeno líquido y se almacenaron a -20ºC hasta su utilización. Se cortaron secciones del cerebro de 26 \mum en un criostato, se fijaron en paraformaldehído al 4% y se tiñeron utilizando el anticuerpo monoclonal M6 para teñir las neuronas de ratón, y a continuación se hicieron reaccionar con un anticuerpo secundario conjugado con fluoresceína anti-rata. Se identificaron los fenotipos neuronales y gliales mediante marcaje dual de las células con anticuerpo para NSE y GFAP.

Ejemplo 9

Se cultivaron células preparadas según el Ejemplo 2 durante 14-30 días in vitro sobre cubres de vidrio y seguidamente se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS. Después de un tiempo de fijación de 30 minutos, se lavaron los cubres tres veces (10 minutos cada vez) en PBS (pH 7,3) y a continuación se incubaron en el antisuero primario (anti-GABA 1:3000, descarboxilasa anti-glutamina 1:500, y anti-sustancia P 1:100, en PBS conteniendo suero normal de cabra al 10%/ Triton-X-100 al 0,3% durante dos horas a 37ºC. Se lavaron tres veces los cubres (10 minutos cada vez) en PBS y se incubaron con anticuerpos secundarios (de cabra anti-conejo o de cabra anti-oveja conjugados con fluoresceína o rodamina a una concentración 1:50) durante 30 minutos a 37ºC. Seguidamente se lavaron tres veces los cubres (10 minutos cada vez) en PBS, se enjuagaron con agua, se colocaron sobre portas de vidrio y se colocaron cubres encima utilizando Fluorsave, como medio de montaje. Se detectó la fluorescencia y se fotografió con un fotomicroscopio Nikon Optiphot.

Ejemplo 10

Se centrifugaron a 300 r. p. m. durante 3 minutos células preparadas como en el Ejemplo 2, se aspiró el medio y seguidamente se volvieron a suspender las células en medio caliente DMEM/F-12 conteniendo glicerol al 10% con una concentración de aproximadamente 1 x 10^{5} células/ml, y se congelaron lentamente a -20ºC durante 2 horas en un caja de espuma de estireno pre-enfriada con la tapa abierta. Una vez congeladas, se transfirieron las células a -80ºC. Se descongelaron las células colocando el criovial en un baño de agua a 37ºC, se mezclaron mediante agitación suave, se añadió un volumen igual de medio calentado a las células cada 5 minutos durante 15 minutos, y seguidamente se llevó el volumen hasta 10 ml. A continuación se centrifugaron las células durante 3 minutos a 300 rpm y se descargó el sobrenadante. Se cogieron 10 microlitros de células para determinar la viabilidad y se cogieron 10 microlitros de células y se tiñeron con azul tripáno y se contaron en un hemocitómetro. Se volvieron a suspender las células en solución de DMEM/F-12/hormona al 10% en una concentración de 100.000 células/matraz y se cultivaron 3-4 días a 37ºC en matraces de cultivo T25.

Ejemplo 11

Se obtuvieron las células de tejido mesencefálico ventral de un feto humano de 8 semanas de edad después de un aborto de rutina mediante succión que se recoge en un aparato colector estéril. Se cortó un trozo de 2 x 4 x 1 mm de tejido y se disoció como en el Ejemplo 1. A continuación se cultivaron las células como en el Ejemplo 5.

Ejemplo 12

Se utilizan células preparadas como en el Ejemplo 11 para neurotransplante en un receptor de grupo sanguíneo compatible con una enfermedad neurodegenerativa. La cirugía se realiza utilizando una guía estereotáctica tomográfica (CT) controlada con un ordenador BRW. Se le da al paciente anestesia local complementada con midazolamo administrado por vía intravenosa. Se le hace al paciente un escáner TC para establecer las coordenadas de la región que va a recibir el transplante. La cánula de inyección consiste en una cánula externa de acero inoxidable de calibre 17 con un estilete interno de calibre 19. Éste se inserta en el cerebro en las coordenadas correctas, seguidamente se quita y se reemplaza por una cánula de infusión de calibre 19, que se ha cargado inicialmente con 30 \mul de suspensión tisular. Se infunden lentamente las células con un caudal de 3 \mul/min, se retira la cánula. Se realizan múltiples pasos de agujas estereotácticas por toda el área de interés, aproximadamente a 4 mm. Se examina al paciente mediante escáner TC post-operativamente para buscar hemorragias o edemas. Se realizan evaluaciones neurológicas a diferentes intervalos después de la operación, así como escaneos PET para determinar la actividad metabólica de las células implantadas.

Ejemplo 13

Se obtiene tejido neural del área ventricular mediante biopsia de un sujeto humano y se cultiva como en el Ejemplo 5.

Ejemplo 14

Se transfectan con vectores de expresión que contienen los genes del receptor de bFGF o del receptor NGF células que han proliferado como en los Ejemplo 1 o 2. El DNA del vector conteniendo los genes se diluyen en 0,1 X TE (Tris 1 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM) con una concentración de 40 \mug/ml. Se añadieron 220 \mul del DNA a 250 \mul de 2X HBS (NaCl 280 mM, KCl 10 mM, Na_{2}HPO_{4}2H_{2}O 1,5 mM, dextrosa 12 mM, HEPES 50 mM) en un tubo de plástico estéril desechable de 5 ml, Se añaden lentamente 31 \mul de CaCl_{2} 2M y se incuba la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente. Durante esta incubación de 30 minutos, se centrifugan las células a 800 g durante 5 minutos a 4ºC. Se vuelven a suspender las células en 20 volúmenes de PBS enfriado con hielo y se dividen en partes alícuotas de 1 x 10^{7} células, que se centrifugan de nuevo. Se vuelve a suspender cada parte alícuota de células en 10 ml de suspensión de DNA-CaCl_{2}, y se incuban durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación se diluyen las células en medio de crecimiento y se incuban durante 6-24 horas a 37ºC en CO_{2} al 5%-7%. Se vuelven a centrifugar las células, se lavan en PBS y se devuelven a 10 ml de medio de crecimiento durante 48 horas.

Ejemplo 15

Se transplantan células transfectadas como en el Ejemplo 14 a un paciente humano como en el Ejemplo 12.

Claims

1. Un método para la producción in vitro de un cultivo celular de células madre neurales pluripotentes, comprendiendo dicho método las etapas de

(a): preparar o proporcionar un medio de cultivo inicial que comprende uno o más factores de crecimiento capaces de inducir la proliferación de células madre neurales pluripotentes;

(b): preparar un cultivo celular mediante la adición al medio de cultivo de la etapa (a) de células derivadas de tejido neural de mamíferos y conteniendo al menos una célula madre neural pluripotente capaz de dividirse sin límite y producir progenie que sea capaz de diferenciarse en neuronas y glia;

(c): proliferar dicha célula madre neural pluripotente en dicho medio de cultivo celular para producir progenie de células madre neurales que comprende células madre neurales pluripotentes hijas y células hijas que son capaces de diferenciarse en neuronas y glia; y

(d): transferir dicha progenie de células madre neurales a medio de cultivo nuevo que contiene uno o más factores de crecimiento capaces de inducir la proliferación de las células madre neurales pluripotentes para hacer que proliferen dichas células madre neurales pluripotentes hijas y para producir más progenie de células madre neurales.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la proliferación de dicha célula madre neural pluripotente en la etapa (c) o dichas células madre neurales pluripotentes hijas en la etapa (d) ocurre en un cultivo en suspensión.

3. El método según la reivindicación 1, en el que la proliferación de dicha célula madre neural pluripotente en la etapa (c) o dichas células madre neurales pluripotentes hijas en la etapa (d) ocurre en un cultivo unido a un sustrato.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende la perpetuación de células madre neurales pluripotentes mediante el reinicio de la proliferación de las células madre neurales pluripotentes hijas en la etapa (d) mediante la repetición de la etapa (d).

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho tejido neural de mamífero procede de un ser humano.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho tejido neural de mamífero procede de un feto, neonato, joven o adulto.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el medio de cultivo utilizado en las etapas (a) y (d) está sin suero.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho uno o más factores de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en factor ácido de crecimiento de fibroblastos, factor básico de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, un ligando similar a EGF, anfirregulina y factor alfa de crecimiento transformante.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho medio de cultivo inicial de la etapa (a) y dicho medio de cultivo nuevo de la etapa (d) contienen el mismo o mismos factores de crecimiento.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho medio de cultivo nuevo de la etapa (d) contiene uno o más factores de crecimiento diferentes que dicho uno o más factores de crecimiento de dicho medio de cultivo inicial de la etapa (a).

11. Un método para producir in vitro células neurales diferenciadas derivadas de la progenie de células madre neurales producida mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende inducir dichas células hijas que son capaces de diferenciarse a que se diferencien mediante la siembra de dichas células hijas sobre un sustrato fijo o dejando que dichas células hijas que son capaces de diferenciarse se diferencien en suspensión sin reiniciar la proliferación.

12. Un método para la búsqueda entre diversos medicamentos de un agente terapéutico supuesto que comprende aplicar dicho agente al cultivo celular producido mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y vigilar la respuesta de dicho cultivo celular.

13. Un cultivo celular obtenible mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para usarse en tratar enfermedades neurológicas o neurodegenerativas o traumas del CNS, en el que dicho cultivo celular se deriva de un origen autólogo con respecto al receptor previsto.

14. Uso de un cultivo celular producido mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o el cultivo celular según la reivindicación 13 en la producción de un medicamento para tratar enfermedades neurológicas o neurodegenerativas o traumas del CNS.

15. Uso de un cultivo celular según la reivindicación 14 que se deriva de un origen autólogo con respecto al receptor previsto.

16. Uso de un cultivo celular según la reivindicación 14 ó 15, en el que la enfermedad neurológica o neurodegenerativa es la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, esquizofrenia, esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia, parálisis cerebral o apoplejía o la enfermedad neurodegenerativa que causa balismo o atetosis.