JP2008501356A - 神経幹細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)EGFファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター;および
(b)FGFレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む培地で、該細胞を培養する工程
を含む。
「神経幹細胞」
本明細書中で使用される用語「神経幹細胞」とは、ニューロンおよび神経膠の両方を生成する潜在能を維持しながら20〜30よりも多くの細胞分裂を受け得る細胞を記載している。好ましくは、該細胞は、40より多くの、より好ましくは50より多くの、最も好ましくは無制限のこのような細胞分裂を受け得る。
広範な種々の供給源から本発明の神経幹細胞を誘導することができる。例えば、神経幹細胞は、胚から直接、成体組織から、胎児組織から、または胚性幹(ES)細胞(野生型または遺伝子改変ES細胞のいずれか)から誘導され得る。好ましくは、本発明の神経幹細胞は、マウスもしくはヒトのES細胞から誘導されるか、またはマウスもしくはヒトの胎児細胞から誘導される。
本明細書中で使用される用語「EGFレセプターファミリー」は、EGFシグナル伝達因子のファミリーによって活性化され得るレセプター(通常、ホモダイマーもしくはヘテロダイマーレセプター)のファミリーを記載している。レセプターは、4つの非常に相同性の高い膜貫通糖タンパク質ErbB−1(EGF−Rとしても知られる)、ErbB−2、ErbB−3、およびErbB−4のファミリーで構成される。
本明細書中で使用される用語「FGFレセプター」は、膜貫通FGFレセプターチロシンキナーゼのファミリーの任意のメンバーを記載している。これらのレセプターの4つの主要なイソ型FGFR1、2、3、および4が存在し、そしてそれらは、ヘパリンおよびヘパラン硫酸(HS)系と密に関連して作用することが知られている。FGFレセプターというときは、FGFレセプターファミリーの任意のモノマーまたはダイマー(ホモもしくはヘテロダイマー)複合体を含む。
本発明で使用される培養培地は、好ましくは、必要に応じて付加成分が添加された基本培地を含む。
本発明の全ての局面における神経幹細胞の培養のための代表的な表面は、細胞培養に有用であると当該分野で認識されている培養表面であり、そしてこれらには、プラスチック製表面、金属製表面、複合材製表面が含まれるが、通常は、広く市販されているプラスチック製組織培養プレートのような表面が用いられる。このようなプレートは、しばしば、直径数センチメートルである。スケールアップのために、このタイプのプレートは、ずっとより大きい直径で用いられ得、そして多くの繰り返しプレートユニットが用いられ得る。
(a)EGFファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター;および
(b)FGFレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む培地で、該細胞を培養する工程
を含む。
(1)神経幹細胞を含む細胞の混合集団を得る工程;
(2)(a)EGFファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター;および(b)FGFレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターを含む培地に該細胞を再播種する工程;
(3)該細胞を培養する工程;
(4)細胞の凝集体を回収する工程;
(5)(a)EGFファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター;および(b)FGFレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターを含む培地に該細胞を再播種する工程;
(6)該細胞を培養する工程;
(7)(a)EGFファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター;および(b)FGFレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターを含む培地に、単一細胞として細胞を再播種する工程。
神経幹細胞;
EGFファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター;および
FGFレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む。
神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン;
Sox−2;
放射神経膠細胞特異的マーカーのRC2、3CB2、GLAST、BLBP、もしくはPax−6;
ルイスX抗原;
ムサシ−1;および
プロミニン
の少なくとも1つの発現に対して陽性であり、そして
Oct4、および
Nanog
の少なくとも1つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている。
(i)神経幹細胞に分化し得る多分化能性もしくは分化多能性幹細胞を得る工程、
(ii)(i)の細胞を、分化多能性細胞に対して非許容性である培地でそして(a)EGFファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアゴニストおよび(b)FGFファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアゴニストの存在下で培養する工程
を含む。
(a)単一の神経幹細胞を得る工程、
(b)前記の方法のいずれかに従って神経幹細胞を培養する工程
を含み、それによって、神経幹細胞のクローン集団を得る。
神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン;
Sox−2;
放射神経膠細胞特異的マーカーであるRC2、3CB2、GLAST、BLBP、もしくはPax−6;
ルイスX抗原;
ムサシ−1;および
プロミニン
の少なくとも1つの発現に対して陽性であり、そしてそれらが、
Oct4、および
Nanog
の少なくとも1つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている。
(a)選択マーカーAをコードする構築物でES細胞をトランスフェクトする工程であって、使用に際して、該選択マーカーが、神経前駆細胞特異的プロモーターの制御下で発現される、工程;
(b)該ES細胞の神経前駆細胞への分化を促進する工程;
(c)該選択マーカーAを発現している神経前駆細胞について選択する工程;および
(d)該選択された細胞を、前に記載の方法のいずれかに従って培養する工程
を含む。
(a)選択マーカーBおよびポリペプチドをコードする構築物で神経幹細胞をトランスフェクトする工程;および
(b)該選択マーカーBを発現する神経幹細胞について選択する工程
を含む。
ドナー細胞を得る工程;
レシピエント細胞を得る工程;
該ドナー細胞の核を該レシピエント細胞に移入する工程であって、該ドナー細胞が、(i)神経幹細胞、または(ii)本発明の方法に従って得られた細胞である、工程;および
該細胞を培養して該ドナー細胞の核を再プログラミングし、それによって再プログラミングされた細胞を得る工程
を含む。
図2は、NS細胞が種々のES細胞株および胎児前脳から誘導され得ることを示す;
図3は、NS細胞が成体脳内に取り込まれ分化することを示す;
図4は、ヒトES細胞または胎児由来NS細胞を示す;および
図5は、分化培地中で培養したNS細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動を示す。
(NS細胞のバルク集団の単離および培養)
接着単層培養での50〜70%の間のSox1陽性神経前駆体の効率的かつ一貫した生成を可能にするES細胞分化プロトコルが、近年確立された。これらの培養物内の神経前駆体(マウス由来)を単離し増殖しそして特徴付けるために、Sox1遺伝子座にターゲティングしたGFP−IRES−ピューロマイシンレポーターカセットを含む以前に生成された細胞株(46C細胞)を使用した(Yingら, 2003b)。ピューロマイシンを7日後に分化培養物に添加し、そして3日以内に、残りの細胞の95%より多くがGFP+神経前駆体となった。この時点で、細胞を、(ピューロマイシンなしで)EGF/FGF−2を添加したN2B27培地に再播種した。これらの細胞は迅速に増殖し、数継代内で均質な形態をとった。
(細胞株の培養)
クローン細胞株を単離するために、46C−NP細胞の5継代目バルク培養物からの単一の細胞を、マイクロウェルプレートの別々のウェル中に播種した。スコア付けした95の単一の細胞のうち15がコロニーに増殖し、そしてこれらのうち4株が10継代より多くにわたって継続して増殖し続けた。1つの株(NP5)は、バルク集団で観察されたのと同一である均質な形態を有する特徴的な二極性の細胞を示した。このNP5株は、無期限に培養物中で維持された(NP5 41継代目;5ヶ月以上)。
(NS細胞の特徴づけ)
バルク細胞集団およびクローン株の両方ともを特徴付けるために、種々のマーカーについて免疫細胞化学を用いた。予期されるように、細胞株の各々は、神経前駆体マーカーであるネスチンもしくはビメンチンに対して陽性であることが判明した。重要なことに、これらの細胞はまた、放射神経膠特異的マーカーであるRC2、3CB2および星状細胞特異的グルタミン酸輸送因子(GLAST)に対しても陽性であった。細胞の1%未満がGFAPまたはβIIIチューブリンのいずれかに対して陽性であった。このことは、これらの細胞の継代の間に、星状細胞またはニューロンへの自発的分化がほとんど生じていないことを示唆している。霊長類/ヒト細胞とは異なり、げっ歯類放射神経膠は、GFAPに対して陰性である。さらに、これらの細胞は、成体神経幹細胞に対して富化するために以前に使用されたSSEA−1、ルイスX抗原を認識する抗体に対して免疫反応性である。
(ニューロンおよび神経膠へのNS細胞株分化)
NS細胞株により発現された分子マーカーは、それらが神経前駆細胞の型であることを確証している。これらの細胞が真の多分化能性幹細胞である(すなわち、ニューロンまたは神経膠のいずれかとして分化し得る)ことを確認するために、細胞の潜在能を試験するために設計した種々の条件を試験した。
(遺伝子選抜ストラテジーを用いない任意のES細胞株からのNS細胞の単離)
NP5を単離するために用いられるN2B27培地は、ES細胞の神経前駆体への変換に対してもともと最適化されており、このため、ES細胞および神経前駆体の両方の良好な生存が可能になった。したがって、ピューロマイシン選択がなければ、ES細胞および非神経細胞型のキャリーオーバーのために、EGFおよびFGF−2を用いて46C−NP細胞を効率的に増殖することができなかった(データは示さず)。これを克服しそして他のターゲティングされないES株からの放射神経膠細胞の生成を可能にするために、神経前駆体を生存および増殖させるが他の細胞型はそうではない他の基本培地の組合せを試験した。
(NS細胞の移植)
インビボでNS細胞の能力を試験するために、それらを、胚性および成体CNSの両方へ、ならびに腎臓嚢移植片に移植した。
(実施例2−1)
(方法)
(マウス細胞の培養および分化)
ES細胞および神経分化は、YingおよびSmith, 2003によって詳述されている。LC1と命名したNS細胞および他のES細胞由来NS細胞を、N2および10ng/mlのEGFおよびFGF−2の両方を添加したNS−A培地(Euroclone)(NS増殖培地)においてコーティングされていないプラスチック上で7日目の神経分化単層培養物を再播種することにより、通常通りに生成した。細胞は凝集体を形成し、引き続いて付着しそしてNS細胞を大きくした。7日目に0.5μg/mlのピューロマイシンを分化接着培養物に添加した後に生成された細胞を、46C−NS細胞と命名した。3日後に、細胞を、ピューロマイシンのない10ng/mLのEGFおよびFGF−2(Peprotech)の両方を含むN2B27培地において、コーティングされていないT75フラスコ中に再播種した。クローン株NS−5を、限定希釈によって96ウェルマイクロウェルプレート(Nunc)中に単一の細胞を播種することにより生成した(播種1時間後に単一の細胞をスコア付けした)。一次培養物を、E16.5マウス胚の皮質/線条体から標準プロトコルを用いて生成し、そして0.1%ゼラチンで処理したフラスコ上に付着させた。次いで、Cor−1およびStr−1細胞を、NS増殖培地を用いてゼラチン上で増殖させた。星状細胞分化のために、NS細胞を、1%ウシ胎児血清または10ng/ml BMP4(R&D System)を添加したNS−A培地中に1×105細胞/ウェルで、4ウェルプレート上に再播種した。ニューロン分化のために、5×104NS細胞を、FGF−2単独を添加したNS−Aにおいてポリオルニチン/ラミニン処理ウェル中に播種した。7日後、培地を、増殖因子を含まないB27(Gibco)を添加したNS−Aに切り替えた。クローン分化のために、NS−5またはCor−1培養物からの1000細胞を、ラミニンで前処理した10cmプレートに播種し、EGF/FGF−2中で12日間増殖させ、そして上記のようにインサイチュで分化させた。
免疫細胞化学を、適切なTRITCまたはFITC二次結合体とDAPIでの核対比染色とを用いて実施した。以下の希釈で一次抗体を用いた:ネスチン(1:10)、ビメンチン(1:50)、Pax6(1:5)、3CB2(1:20)、RC2(1:50)(DSHB);TuJ(1:200)(Covance);GFAP(1:300)(ポリおよびモノ、Sigma)、MAP2(1:200)(ChemiconおよびBecton Dickinson);NeuN(1:200)、GABA(1:200)、Gad65/67(1:200)(Chemicon);シナプトフィシン(1:200)(Sigma);Olig2(1:5000)(H. Takebayashi);Emx2(1:2000)(A. Corte);BLBP(1:500)(N. Heintz);プロミニン/mAb13A4(1:200)(W. Huttner)。陰性コントロールはES細胞、分化したNS細胞または二次単独であった。RT−PCRのために、全RNAをRNeasyキット(Qiagen)を用いて抽出し、そしてcDNAをSuperscript II(Invitrogen)を用いて生成した。β−アクチン(25サイクル)を除いて、全てのマーカーについてPCRを30サイクル実施した。中期広がりのために、細胞を5mlの0.56% KClで20分間処理し、氷上でメタノール:酢酸(3:1)中に15分間固定し、スライドガラス上に広げ、そしてTOPRO−3(Molecular probes)で染色した。
インフォームドコンセントのもとでのヒト組織に関する研究は、Research Ethics Committee of Lothian Health Boardによって認可された。凍結した余剰のヒト胚が、Human Fertilisation and Embryology Authorityにより発行されたライセンスR0132下での研究のために贈与された。Polkinghorneガイドライン下の研究のために同意のもとに選択中絶したカーネギー19/20期の胎児からヒト皮質を切り出した。
Magrassiら, 1998に記載により胎児手術を実施した。ガラスキャピラリーを用いて、1μLのHBSSの容量中に5×104個の細胞を、透照下で曝露したE14.5 Sprague Dawleyラット胎児の終脳小胞に注入した。注入された胎児を、満期まで発生のために腹腔内に戻した。分娩後、移植後7日目(出生後日数(P)1、n=16)および5週目(P30、n=8)で動物を屠殺した。成体移植のために、129またはCD1マウスをKopf定位枠内に置き、そして5μLのHBSS中に懸濁した2×105個のNS細胞を線条体(n=22)または海馬(n=21)に注入した。移植されたマウスを2週後(n=16)および4週後(n=10)に屠殺し、そして4%パラホルムアルデヒドを経心臓にて灌流した。低温切片(16μm)を以下の抗体で染色した:(マウス):NeuN(1:100)およびKi67(1:10)(Chemicon)、MAP2(1:200;Becton Dickinson)、ネスチン(1:5;Ron McKay);(ウサギ):βIIIチューブリン(1:500;Covance);GFAP(1:200;Dako);二次抗体、Texas Red(Vector)(Jackson ImmunoResearch)およびAlexaFluor 488(Molecular Probes)。切片を変退色防止溶液中で保存し、そしてNikon TE2000-S ECLIPSEおよびBiorad Radiance 2100共焦点顕微鏡で分析した。
本発明者らは、ES細胞の単層分化を7日間誘導し、次いでEGFおよびFGF−2を添加した基本培地(NS−A+N2)に再播種した。これらの最少条件(ES細胞生存に対して非許容)下で生存している細胞が主として結合して浮遊塊となる。3〜5日後、これらの凝集体を採取し、そして新鮮な培地に再播種した。それらは、2〜3日以内に付着し、そして二極細胞の形態的に均質な集団に大きくなった(LC1と命名)。継代に際して、LC1細胞は、接着培養物として増殖し続け、しばしば、格子状網を形成した。それらは、連続的かつ迅速に増殖され得、倍加時間は約24時間である。LC1細胞は、神経前駆マーカーのネスチンおよびRC2を提示するが、星状細胞分化マーカーのGFAPまたはニューロン抗原の発現は無視し得る程度である(図1A)。血清またはBMPへの曝露に際して、LC1細胞は、48時間以内に代表的な星状細胞形態をとり、そして引き続き、GFAPを均一に発現する(図1A,e)。対照的に、ニューロン突起を有する細胞は、EGFなしで5〜7日間ラミニン上に再播種しそしてFGF−2を除去した後に出現する。これらの細胞は、ニューロンマーカーのIII型β−チューブリン、MAP2(図1A,f,g)およびneuN(示さず)を発現している。ほとんどのニューロンは、GAD67(図1A,g)およびGABA(示さず)に対して染色し、そして7日目まで、亜集団が、成熟マーカーのシナプトフィシンの発現を示す(図1A,h)。115継代後でさえも、多数のニューロン(>35%)が生成される(図1A,i)。LC1細胞が後期継代で二倍体染色体内容物を保持しているという所見(示さず)とともに、このことは、自己再生神経幹(NS)細胞の存在を確証している。
細胞凝集がNS細胞の生成に必須であるか否かを決定するために、本発明者らは、誘導プロセスを通して細胞付着を維持した。このために、本発明者らは、GFPirespacレポーター/選択カセットがSox1遺伝子(神経分化の特異的マーカー(Aubertら, 2003)である)に組み込まれている46C ES細胞を用いる系統選択(Liら, 1998)を利用した。分化誘導後の一過性のピューロマイシン選択により、残余ES細胞のない神経前駆体の精製された集団を得た(Stavridisら, 2003)(図1B a,b)。次いで、FGF−2およびEGFを、富化培地中でSox1発現神経前駆体に与えた。この条件で細胞は接着したままであった。細胞異質性は3〜4継代にわたって減少した。二極細胞の数が累進的に増大し、広範囲に格子を形成し始めたからである。興味深いことに、Sox1の発現はこの段階で喪失したが(図1B c,d)、細胞は、Sox2およびネスチンに対してなお陽性であった。神経幹(NS)細胞の存在を確立するために、単一の細胞をTerasakiウェルに単離し、そして接着培養として増殖させた(図1B,e,f)。まず、同様の形態および増殖特性の5つのクローン株を、バルクLC1集団に誘導した。これらの細胞は、分化多能性因子のOct4およびNanog、ならびにまた初期神経マーカーのSox1の検出可能な発現を欠いていたが、汎神経上皮マーカーのSox2およびネスチンを保持していた(図1C)。したがって、NS細胞は、連続接着培養によってSox1陽性初期神経外胚葉前駆体から生成された。
クローンNS−5をさらに詳細に試験し、そしてPax6、Glast、およびBLBPのmRNAを発現していること、および、RC2、ビメンチン、3CB2、SSEA1/Lex1、およびプロミニンに対して免疫陽性であることを見出した(図1D)。このマーカーセットは、神経原性放射神経膠に対する診断に有用であるとみなされており、神経系の発生の間のニューロンおよび星状細胞の両方の前駆体である(Campbellら, 2002; Hartfussら, 2001)。クローン化されていないLC1細胞と同様に、NS−5細胞は、星状細胞およびニューロン分化に対してコンピテントであった(図1E)。EGF+FGF−2にクローン密度で播種したNS−5細胞は、二極細胞のコロニーを生じた。全てのコロニーが、事実上全ての細胞でのRC2およびBLBPの発現、ならびにGFAPの不在を示した(図1F,c,d)。これらのサブクローンを選抜し、そして連続して増殖させた。NS培養内でのニューロン分化可能な細胞の頻度を決定するために、本発明者らは、再度、NS−5細胞をクローン密度で播種し、EGF/FGF−2中で12日間、次いでFGF−2単独で5日間、次いでさらに7日間増殖因子なしで増殖させた。全てのコロニー(126/126)が、TuJ陽性細胞を生成した(図1F,b)。これらのデータは、NS培養物中の全てのコロニー形成細胞が、ニューロン分化に対してコンピテントであったことを示した。最終的に、LC1と同様に、NS−5細胞は、二倍体染色体相補体を維持しており(図1G)、そして複雑な細胞微細環境の必要なく自己再生する非形質転換クローン神経幹(NS)細胞株であることを表していた。
無血清単層誘導プロトコルがNS細胞生成に予め必要であるか否かを評価するために、ES細胞を、胚様体形成および血清含有培地中のレチン酸への曝露によって分化を誘導した(Bainら, 1995)。凝集体を、G418を用いるSox2系統選択(Liら, 1998; Billonら, 2002)に48時間供し、次いで血清なしでFGF−2およびEGFの存在下で再播種した。付着した後、Sox2陽性、ネスチン陽性の細胞が増殖した。これらの細胞は、NS細胞に代表的な二極性の形態および格子状の増殖を提示し、さらに多重継代後に星状細胞およびニューロン分化能を有した(データは示さず)。このように、NS細胞が、胚様体から誘導された。
3つの独立したES細胞単離株E14TG2a、CGR8、およびR1から、LC1について記載したような系統選択を行わずに単層誘導を用いてNS細胞を誘導した。試験したNS株は全てが、細胞の少なくとも95%においてネスチンおよびRC2を発現した。CGR8およびE14TG2a由来NS細胞のより詳細な研究により、フルパネルの放射神経膠マーカー(図2A)、神経前駆体マーカーSox2およびSox3、ならびにbHLH転写因子Olig2およびMash1(図2B)を示した。Sox1がダウンレギュレートされたがSox2は維持されたことは、これらの転写因子の推定の決定的機能(Pevnyら, 1998)を考慮して、これらのNS細胞の顕著な特徴であった。このように、Sox1は、全ての神経外胚葉前駆体をマークしているが、Sox2が重要な役割を果たしていると考えられる幹細胞においては、これは保持されなかった。NS細胞はまた、Emx2を発現していた。Emx2は、神経前駆細胞の増殖に関与している(Heinら, 2001; Galliら, 2002)。試験した全てのNS培養物は、形態学および免疫染色の両方によって評価される星状細胞およびニューロンの分化を受けた(図2C)。
それらの放射神経膠への明らかな関係を考慮して、本発明者らは、NS細胞が、エクスビボ増殖へのES細胞の前適応から生じるか、または胎児神経組織から誘導され得るかを調べた。E16.5胎児脳からの一次胎児CNS細胞は、増殖因子を添加した基本培地ではプラスチックへの接着はわずかであり、自発的に凝集体を形成した。6〜7日後、これらの凝集体は、ゼラチンコーティングしたプラスチック上に定着した。14日後、成長体をトリプシン処理し、そしてゼラチンコーティングしたプラスチック上に播種した。3つの別個の実験において、NS細胞と形態学的に同定可能な細胞が増殖し、そして引き続き増殖させて、連続細胞株になった。これらの胎児脳誘導物は、ES細胞由来NS細胞と同じ放射神経膠および神経原性マーカーを発現し(図2A、B)、そして一致したmRNAプロフィールを示した。それらは、同様に、星状細胞およびニューロン分化に対してコンピテントであった(図2C)。NS−5について記載したように、皮質誘導Cor−1細胞を単一の細胞として播種し、次いでコロニーを引き続く増殖因子除去に供した。全てのコロニーが、TuJ陽性ニューロンを生成していた。このことは、Cor1培養物中の全てのクローン原性細胞が神経原性であることを示していた。Cor−1細胞もまた、個々の細胞から容易にサブクローン化されそして連続的に増殖された。これは、自己再生を示す。このように、NS細胞が胎児脳から誘導され、そしてこれは、ES細胞由来NS細胞の重要な特性を共有していた。
凍結/融解した40継代目のマウス神経球を、NS増殖培地中でゼラチンコーティングしたプラスチックに付着させた。NS細胞と区別不能な二極細胞が生じた。これらの細胞は、均一なRC2陽性GFAP陰性の集団として連続的に増殖され得、次いで星状細胞またはニューロンへの分化が誘導され得る。
本発明者らは、マウス脳への移植の際のNS細胞の挙動を調べた。レンチウイルスeGFP発現ベクターを用いて形質導入したES細胞由来LC1細胞を、E14.5での子宮内注入により発生中の脳に導入した(Magrassiら, 1998)。出生後、動物を屠殺し、そして脳切片のeGFP陽性細胞の存在を調べた。NS細胞子孫は、種々の脳領域に遊走していた。免疫組織化学分析により、eGFPと、前駆体マーカーネスチン、ニューロンマーカーTuJ、NeuN、およびMAP2と、ならびに数は少なくなるがGFAPとが共発現していることが明らかになった。NS細胞を成体マウス線条体にも注入した。この場合、GFP陽性細胞は、注入部位の近辺に局在したままであった。移植4週間後、GFP発現細胞の44.4±5.7%がニューロン形態を有しそしてMAP2に対して免疫陽性であり、37.4±6.1%がGFAPを発現し、そして4.2±1.9%がネスチンの発現を保持していた(図3)。増殖マーカーKi67は、GFP陽性細胞の1.0±0.6%でのみ検出された。このことは、NS細胞がインビボで細胞周期から回収されたことを示している。このことと一致して、本発明者らは、移植の1ヵ月後に調べた全部で35の脳において、制御されない増殖または腫瘍形成の組織学的証拠がないことを認めた。さらに、マウス腎臓嚢に移植されたNS細胞は、増殖せず、奇形腫も生じなかった。これらのデータは、NS細胞が胎児脳および成体脳の両環境において生存しそして分化し得ること、およびES細胞(Brustleら, 1997)とは異なり、それらは奇形腫を生じないことを示していた。さらに、この比較的高い頻度でのニューロン分化は、継代した神経球の移植片(Rossiら, 2002)とは非常に対照的である。
最後に、本発明者らは、同様のNS細胞が、ヒト供給源から単離され得るか否かを調べた。贈与された余剰胚からヒトES細胞を誘導する過程において、本発明者らは、培養5〜6週後に、神経上皮細胞に代表的であるロゼット状構造への広範な分化を認めた。これらの細胞をNS増殖培地に移した。さらに3〜4週後、NS細胞に類似の二極細胞がこれらの培養物から出現し(図4A)、そして5ヶ月間連続的に培養した。本発明者らはまた、選択中絶からカーネギー19〜20期のヒト胎児皮質組織を確保した。解離した細胞はまず浮遊凝集体を形成した。マウス胎児脳からのNS細胞の誘導と同様に、その7日後に再播種し、そしてゼラチンコーティングしたプラスチックに付着させた。増殖している培養物が樹立された(図4B)。ES細胞および胎児組織の両方からのヒトNS培養物は、二極細胞が付随した扁平状の細胞の存在によって特徴付けられた。しかし、全ての細胞が、未熟前駆体マーカーであるネスチン、ビメンチン、および3CB2を発現していた(図4B)。時間差モニタリングによって、2つの細胞形態が形成されかつこれらは互換性であることが確証された。これらのヒト細胞はまた、低レベルのGFAPを提示し、これは、放射神経膠中のヒトGFAPプロモーターの活性(Rakic, 2003; Malatestaら, 2000)と一致した。それらは、マウス細胞よりもゆっくりと増殖した。倍加時間は数日間であった。EGFおよびFGF−2を引き続き除去した後、それらは、未熟なニューロン細胞を生成しているようであった(図4C)。強いGFAP免疫反応性を有する代表的な星状細胞形態の細胞が、血清中の継代後に生成された(図4C)。
特定の処理後、これらの細胞が、成熟した機能的なニューロンに効率的に転換し得るか否かを電気生理学的観点から知るために、インビトロでの分化の間、培養物におけるNS細胞の電気生理学特性を、パッチクランプ技術のホールセル改変型を用いることにより調べた。
電極と細胞との間のシールを、以下からなるバス溶液中で確立した(ミリモル/lで表す):155 NaCl、1.0 CaCl2、1 MgCl2、3.0 KCl、10 グルコース、10 HEPES/NaOH(pH7.4)。ホールセルコンフィギュレーションを確立した後、電流クランプ記録および電圧クランプ中の総電流記録のために、ピペット充填溶液は以下を含んだ(ミリモル/lで表す):128 KCl、10 NaCl、11 EGTA、4 Mg−ATP、10 HEPES/KOH(pH7.4)。電圧クランプ条件下での電圧ゲートNa+チャネルの研究のために、パッチピペットを以下で満たした(ミリモル/lで表す):130 CsCl、10 NaCl、20 TEA−Cl、10 EGTA、2 MgCl2、4 Mg−ATP、10 HEPES/CsOH(pH7.4)。そして細胞外溶液は以下を含んだ(ミリモル/lで表す):130 NaCl、2 CaC12、2 MgCl2、10 グルコース、5 テトラエチルアンモニウム−Cl、CdCl2 0.2、10 HEPES/NaOH(pH7.4)。電圧ゲートCa2+チャネルの研究のために、パッチピペットを以下で満たした(ミリモル/lで表す):120 CsCl、20 TEA−Cl、10 EGTA、2 MgCl2、4 Mg−ATP、10 HEPES/CsOH(pH7.4)。そして細胞外溶液は以下を含んだ(ミリモル/lで表す):130 NaCl、10 BaCl2、10 グルコース、5 テトラエチルアンモニウム−Cl、10 4−AP 1、TTX 10−3、HEPES/NaOH(pH7.4)。
イオン電流を、Axopatch 200Bパッチクランプ増幅器(Axon Instruments Inc., Burlingame, CA)によって室温(20〜24℃)でパッチクランプホールセル配置(19)を用いて電圧クランプ条件下で記録し、そしてIBM互換PCとインターフェースしたDigidata 1322A A/D変換器(Axon Instruments Inc., Burlingame, CA)を用いて、26〜100μsecのサンプリング間隔でデジタル化した。刺激、データの取得、およびデータ分析は、以下のソフトウェアパッケージを用いて実施した:pClamp 9(Axon Instruments Inc., Burlingame, CA)およびORIGIN 6(Microcal Software Inc., Northampton, MA)。電圧クランプ実験のために、まず、漏洩および容量の電流の線形成分をアナログサーキットリによって減少させ、次いでP/N法でほぼ完全にキャンセルした。パッチピペットをホウケイ酸ガラス管から作製し、火入れした。ピペットは、内部溶液で満たしたときに3〜4MΩの最終抵抗を有していた。電流は5KHzでフィルタリングした。
以下のプロトコルを用いて、NS細胞を、マウスES細胞および胎児皮質から得た。誘導されたNS細胞は、放射神経膠マーカーを均一に発現していた。CGR8 ES細胞またはE16胎児皮質(内部参照:Cor−1およびクローン誘導体Cor−1.3)から特異的に誘導されたNS細胞を、免疫化学により指示マーカーの発現について分析した。ハイパワーでの試験は、放射神経膠マーカーが、ほとんど全ての細胞において各々発現されており、一方、均一にGFAPに対して陰性であったことを示した。
以下のプロトコルを用いて、NS細胞を、増殖させたマウス胎児前脳神経球から誘導した。長期胎児神経球培養物(40継代)由来のNS株は、ES由来NS株と同一の形態を示し、神経前駆細胞/放射神経膠マーカー免疫反応性を発現し、そしてニューロンおよび星状細胞に分化し得た。これは、新鮮な胎児神経球から得られたNS細胞が、凍結し次いで長期間神経球として増殖した神経球から得られたものと同じであることを示した。
LC1マウスNS細胞を胎児ラット脳に移植した。eGFPを用いてレンチウイルス形質導入したNS細胞の共焦点像を、E14.5ラットの脳室への移植1週間後に撮影した。ドナー細胞は、塊状でおよび単一の細胞として、脳室から柔組織に移動した。移植された細胞は、eGFPとニューロンマーカーMAP2、星状膠マーカーGFAPまたは前駆細胞マーカーネスチンとの共局在を示した。したがって、NS細胞は、胎児ラット脳における移植後、移動しそして分化した。
(NS細胞株の誘導および操作のためのプロトコル)
本発明者らは、NS細胞株の誘導および操作のために、以下のプロトコルを案出した。
ES細胞は、接着単層培養においてSox1発現神経前駆体に効率的に変換され得る[P1]。このES細胞分化に関する詳細なプロトコルおよびトラブルシューティングは他にも記載される[P2]。簡潔には、ES細胞を、ゼラチンコーティングした組織培養プラスチック上で10%ウシ胎児血清および100U/ml組換え白血病阻害因子(LIF)を添加した培地中にフィーダーを与えない条件下で通常通りに培養する[P3]。未分化のES細胞を、T75フラスコ(Iwaki)中で約80%コンフルエンスまで増殖させ、トリプシン処理し、そしてN2B27培地中に再懸濁する[P2]。細胞を、少なくとも10分間0.1%ゼラチン溶液(Sigma)でコーティングし次いで乾燥させておいた9cmプレート(Iwaki)上に播種する。初期播種密度は、効率的な神経誘導にとって重大なパラメーターであり、そしてES細胞株間で変動し得るので、本発明者らは、プレート当たりいくつかの異なる細胞密度(0.8×106、1×106、および1.2×106)で、通常通りに播種する。脱着または死亡した細胞を除去する過程で、毎日、培養培地を入れ替える。これらの条件下では、50〜80%の細胞が4〜5日以内に神経系統分化を受け、そして5日目から先では明白なニューロン分化が検出可能となる。
細胞クラスターは、NS細胞増殖培地中での胎児E16.5皮質および一次培養物の解離の際に懸濁液中で形成される。これらの一次凝集体は、増殖培地中でゼラチンコーティング基材上に播種することにより、接着NS細胞株に容易に変換され得る。付着を促進するために、まず破片/死細胞を沈降によって有効に除去し、そして培地を完全に交換することが重要である。細胞凝集体が付着し、そして2〜5日にわたって増殖する。引き続き、増殖している細胞をトリプシン処理して単一の細胞にし、再播種し、そしてNS細胞増殖培地中で増殖させ得る。継代した胎児神経球[P5]から、NS細胞は、便宜的には、解離およびNS増殖培地中でのゼラチンコーティングしたプラスチック上への直接播種によって樹立され得る。初期の数継代の間、誘導されたNS株は、特に細胞密度が高くなる場合には、凝集する傾向を有し、フラスコから脱着し、そして神経球を再形成する。したがって、培養物は、50%以下のコンフルエンスで継代されるべきである。自発的に凝集する傾向は、可変性であるが、一般には、さらなる継代の際にまたはクローン細胞株の樹立を通して減少される。
一旦樹立されると、NS細胞をNS増殖培地で増殖させる。NS細胞を、ゼラチンコーティングしたプラスチック/フラスコ上で増殖させ、そして1/2から1/5に通常通りに分割する。NS細胞は、約25時間の倍加時間を有する。トリプシン/EDTAを用いて、またはカルシウムマグネシウム非含有PBS(Sigma)とのインキュベーションによって、細胞を継代させる。クローン株の樹立のために、単一の細胞を、増殖培地中でゼラチンコーティングしたマイクロウェル中に堆積させ得る。より厳格ではないが、細胞は、非常に低い密度で播種し得る(9cmディッシュ当たり1000細胞)。コロニーが、2週間以内に出現し、そして選抜され増殖され得る。
NS細胞は、凍結/融解後に容易に回収される。通常通りに、本発明者らは、60〜90%のコンフルエンスであるT75フラスコをトリプシン処理し、そして1.5ml NS増殖培地+10% DMSO中にペレットを再懸濁する。次いで、これを3つの1ml凍結管(Nunc)に分け、そして−80℃で貯蔵する。NS細胞は、これらの条件では6ヶ月より長い貯蔵後でも回収可能である。長期貯蔵のために、凍結バイアルを液体窒素に移す。バイアルを急速に37℃にし、続いて10mlの予温NS増殖培地に移すことにより、NS細胞を融解する。細胞をペレット化し、次いで新鮮な増殖培地中に再懸濁してDMSOを除去する。凍結保存後の細胞回収率は、NS細胞については95%を超える。
NS細胞のGFAP陽性星状細胞への迅速な分化は、ゼラチンコーティングしたフラスコ/プレート上でNS−A(N2あり、EGF/FGFなし)中でBMP4(10ng/ml)または1% FCSにNS細胞を曝露してから2日以内に生じる。細胞密度は、星状細胞分化にとって重要なパラメーターではない。
100U/ml組換えヒト白血病阻害因子(LIF)をさらに添加したマウスNS細胞と同様の増殖培地中で、ヒトNS細胞を、0.1%ゼラチン(Sigma)でコーティングしたフラスコ/プレート上で増殖させる。細胞は、約1週の倍加時間を有する。それらを、約30%のコンフルエンスに達するとトリプシンで継代させ、そして1/2に分ける。単層培養を維持しそして凝集および脱着を防ぐために、過剰増殖は避けるべきである。
1.Reynolds, B. A.およびWeiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science 255, 1707-10 (1992).
2.Garcion, E., Halilagic, A., Faissner, A.およびffrench-Constant, C. Generation of an environmental niche for neural stem cell development by the extracellular matrix molecule tenascin C. Development 131, 3423-32 (2004).
3.Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N.およびvan der Kooy, D. Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations. Nat Med 8, 268-73 (2002).
4.Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N.およびSteindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 14506-11 (2002).
5.Malatesta, P.ら Neuronal or glial progeny: regional differences in radial glia fate. Neuron 37, 751-64 (2003).
6.Anthony, T. E., Klein, C., Fishell, G.およびHeintz, N. Radial glia serve as neuronal progenitors in all regions of the central nervous system. Neuron 41, 881-90 (2004).
7.Ying, Q. -L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M.およびSmith, A. Conversion of embryonic stem cells to neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology 21, 183-186 (2003).
8.Bain, G.,.Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E.およびGottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol 168, 342-57. (1995).
9.Li, M., Pevny, L., Lovell-Badge, R.およびSmith, A. Generation of purified neural precursors from embryonic stem cells by lineage selection. Curr Biol 8, 971-4 (1998).
10.Aubert, J.ら Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 100 Suppl 1, 11836-41 (2003).
11.Stavridis, M. P.およびSmith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans 31, 45-9. (2003).
12.Campbell, K.およびGotz, M. Radial glia: multi-purpose cells for vertebrate brain development. Trends Neurosci 25, 235-8 (2002).
13.Hartfuss, E., Galli, R., Heins, N.およびGotz, M. Characterization of CNS precursor subtypes and radial glia. Dev Biol 229, 15-30 (2001).
14.Billon, N., Jolicoeur, C., Ying, Q. L., Smith, A.およびRaff, M. Normal timing of oligodendrocyte development from genetically engineered, lineage-selectable mouse ES cells. J Cell Sci 115, 3657-65. (2002).
15.Bibel, M.ら Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nat Neurosci 7, 1003-9 (2004).
16.Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L.およびAnderson, D. J. Deregulation ofdorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron 40, 485-99 (2003).
17.Hack, M. A., Sugimori, M., Lundberg, C., Nakafuku, M.およびGotz, M. Regionalization and fate specification in neurospheres: the role of Olig2 and Pax6.Mol Cell Neurosci 25, 664-78 (2004).
18.Pevny, L. H., Sockanathan, S., Placzek, M.およびLovell-Badge, R. A role for SOX1 in neural determination. Development 125, 1967-78. (1998).
19.Heins, N.ら Emx2 promotes symmetric cell divisions and a multipotential fate in precursors from the cerebral cortex. Mol Cell Neurosci 18, 485-502 (2001).
20.Galli, R.ら Emx2 regulates the proliferation of stem cells of the adult mammalian central nervous system. Development 129, 1633-44 (2002).
21.Rakic, P. Elusive radial glial cells: historical and evolutionary perspective. Glia 43, 19-32 (2003).
22.Gregg, C.およびWeiss, S. Generation of functional radial glial cells by embryonic and adult forebrain neural stem cells. J Neurosci 23, 11587-601 (2003).
23.Magrassi, L.ら Basal ganglia precursors found in aggregates following embryonic transplantation adopt a striatal phenotype in heterotopic locations. Development 125, 2847-55 (1998).
24.Brustle, O.ら In vitro-generated neural precursors participate in mammalian brain development. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 14809-14 (1997).
25.Rossi, F.およびCattaneo, E. Opinion: neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nat Rev Neurosci 3, 401-9 (2002).
26.Malatesta, P., Hartfuss, E.およびGotz, M. Isolation of radial glial cells by fluorescent-activated cell sorting reveals a neuronal lineage. Development 127, 5253-63 (2000).
27.Gottlieb, D. I. Large-scale sources of neural stem cells. Annu Rev Neurosci 25, 381-407 (2002).
28.Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature 340, 471-3 (1989).
29.Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M.およびMcKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev 10, 3129-40 (1996).
30.Frederiksen, K., Jat, P. S., Valtz, N., Levy, D.およびMcKay, R. Immortalization of precursor cells from the mammalian CNS. Neuron 1, 439-48 (1988).
31.Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M.およびTramontin, A. D. A unified hypothesis on the lineage of neural stem cells. Nat Rev Neurosci 2, 287-93 (2001).
32.Palmer, T. D., Takahashi, J.およびGage, F. H. The adult hippocampus contains primordial stem cells. Mol. Cell. Neurosci. 8, 389-404 (1997).
33.Ying, Q. -L.およびSmith, A. G. Differentiation of Embryonic Stem Cells (Wassarman, P.およびKeller, G.編) 327-341 (Elsevier, 2003).
34.Carbone EおよびLux HD (1987) Kinetics and selectivity of a low voltage activated calcium current in chick and rat sensory neurons. J Physiol (Lond) 386:547-570.
(プロトコル参考文献)
P1. Ying Q-L, Stavridis M, Griffiths D, Li M, Smith A (2003) Conversion of embryonic stem cells to neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology 21: 183-186.
P2. Ying QL, Smith AG (2003) Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol 365: 327-341.
P3. Smith AG (1991) Culture and differentiation of embryonic stem cells. J Tiss Cult Meth 13: 89-94.
P4. Stavridis MP, Smith AG (2003) Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans 31: 45-49.
P5. Reynolds BA, Weiss S (1996) Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev Biol 175: 1-13.
Claims (87)
- 神経幹(NS)細胞の対称分裂を促進する方法であって、
(a)EGFファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター;および
(b)FGFレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む培地で、基材に付着した該細胞を培養する工程
を含む、方法。 - 前記EGFファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターが、EGFレセプターのアゴニストである、請求項1に記載の方法。
- 前記アゴニストが、EGF、TGF−α、アンフィレグリン、ヘパリン結合EGF、エピレグリン、ベータセルリン、ニューレグリン1、2、3もしくは4、およびCripto−1からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記FGFレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターが、FGFレセプターのアゴニストである、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 前記アゴニストが、FGF−2である、請求項4に記載の方法。
- 組成物であって、
神経幹細胞;
EGFファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター;および
FGFレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む、組成物。 - 前記神経幹細胞の少なくとも80%が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項6に記載の組成物。
- 前記神経幹細胞が、それらがRC2、3CB2、BLBP、およびSox−2の発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項6または7に記載の組成物。
- 前記神経幹細胞がさらに、それらが
GLAST、Pax−6、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスX抗原、ムサシ−1、またはプロミニン
の少なくとも1つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項8に記載の組成物。 - 前記神経幹細胞がさらに、それらが
Oct4またはNanog
の少なくとも1つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項8または9に記載の組成物。 - 前記神経幹細胞が、Sox−2の発現に対して陽性であり、そしてSox−1の発現に対して陰性である、請求項6から10のいずれかに記載の組成物。
- 前記神経幹細胞が、オンコジーンをコードする外因性核酸を含まないか、または該神経幹細胞が、不死化幹細胞ではない、請求項6から11のいずれかに記載の組成物。
- 前記組成物中の細胞の1%以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、または乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、請求項6から12のいずれかに記載の組成物。
- 請求項1から5のいずれかに記載の方法により得られ得る神経細胞の集団であって、該細胞の少なくとも80%が、対称的に分裂している神経幹細胞である、集団。
- 請求項1から5のいずれかに記載の方法により得られ得る神経細胞の集団であって、該集団中の神経幹細胞が、それらがマーカーRC2、3CB2、およびBLBPの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、集団。
- 前記集団中の神経幹細胞がさらに、それらが
GLAST、Pax−6、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスX抗原、ムサシ−1、またはプロミニン
の少なくとも1つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項15に記載の神経細胞の集団。 - 前記集団中の神経幹細胞がさらに、それらが
Oct4またはNanog
の少なくとも1つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項15または16に記載の神経細胞の集団。 - 前記集団中の神経幹細胞が、Sox−2の発現に対して陽性であり、そしてSox−1の発現に対して陰性である、請求項14から17のいずれかに記載の神経細胞の集団。
- 前記集団中の神経幹細胞が、オンコジーンをコードする外因性核酸を含まないか、または該神経幹細胞が、不死化幹細胞ではない、請求項14から18のいずれかに記載の神経細胞の集団。
- 前記細胞の1%以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、請求項14から19のいずれかに記載の神経細胞の集団。
- 神経幹細胞を調製する方法であって、
請求項1から5のいずれかに記載の方法に従って神経幹細胞を培養し、それによって神経幹細胞の培養物を得る工程、および
該培養物から神経幹細胞を単離する工程
を含む、方法。 - 請求項21に記載の方法により得られ得る神経幹細胞。
- 請求項21に記載の方法により得られ得る神経幹細胞であって、該細胞が、それがマーカーRC2、3CB2、およびBLBPの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、神経幹細胞。
- 前記細胞がさらに、それが
GLAST、Pax−6、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスX抗原、ムサシ−1、またはプロミニン
の少なくとも1つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項23に記載の神経幹細胞。 - 前記細胞がさらに、それが
Oct4またはNanog
の少なくとも1つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項23または24に記載の神経幹細胞。 - 前記細胞が、Sox−2の発現に対して陽性であり、そしてSox−1の発現に対して陰性である、請求項22から25のいずれかに記載の神経幹細胞。
- 前記細胞が、オンコジーンをコードする外因性核酸を含まないか、または該細胞が、不死化幹細胞ではない、請求項22から26のいずれかに記載の神経幹細胞。
- 神経幹細胞株を樹立する方法であって、
(a)単一の神経幹細胞を得る工程、
(b)請求項1から5のいずれかに記載の方法に従って該神経幹細胞を培養する工程
を含み、
それによって神経幹細胞の集団を得る、方法。 - 前記神経幹細胞の集団が、クローン集団であり、そして該細胞の全てが、単一の神経幹細胞の子孫である、請求項28に記載の方法。
- 前記単一の神経幹細胞が、請求項21に記載の方法に従って得られる、請求項28または29に記載の方法。
- 細胞が、EGFレセプターファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアクチベーター、およびFGFレセプターの下流のシグナル伝達経路のアクチベーターの存在下で維持されている、細胞株。
- 前記細胞株がクローン原性である、請求項31に記載の細胞株。
- 請求項28から30のいずれかに記載の方法によって得られ得る細胞株であって、該細胞が、それらがマーカーRC2、3CB2、Sox−2、およびBLBPの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、細胞株。
- 前記細胞がさらに、それらが
GLAST、Pax−6、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスX抗原、ムサシ−1、またはプロミニン
の少なくとも1つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項33に記載の細胞株。 - 前記細胞がさらに、それらが
Oct4またはNanog
の少なくとも1つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項33または34に記載の細胞株。 - 細胞が、それらがマーカーRC2、3CB2、Sox−2、およびBLBPの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、細胞株。
- 前記細胞がさらに、それらが
GLAST、Pax−6、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスX抗原、ムサシ−1、またはプロミニン
の少なくとも1つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項36に記載の細胞株。 - 前記細胞がさらに、それらが
Oct4またはNanog
の少なくとも1つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項36または37に記載の細胞株。 - 前記細胞が、Sox−2の発現に対して陽性であり、そしてSox−1の発現に対して陰性である、請求項36から38のいずれかに記載の細胞株。
- 前記細胞の1%以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、または乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、請求項36から39のいずれかに記載の細胞株。
- 前記細胞が、オンコジーンをコードする外因性核酸を含まないか、または該細胞が、不死化細胞ではない、請求項36から40のいずれかに記載の細胞株。
- 前記細胞株が神経幹細胞株である、請求項31から41のいずれかに記載の細胞株。
- 培養中の神経幹細胞の対称分裂を促進するための、EGFファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターの使用。
- 接着性の無血清培養中の神経幹細胞の対称分裂を促進するための、
(a)EGFファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター;および
(b)FGFレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
の組合せの使用。 - 対称的に分裂している神経幹細胞のトランスフェクトされた集団を得てこれを維持する方法であって、
(a)選択マーカーAをコードする構築物でES細胞をトランスフェクトする工程であって、該選択マーカーAが、神経前駆細胞特異的プロモーターの制御下で発現され得る、工程;
(b)該ES細胞の神経前駆細胞への分化を促進する工程;
(c)該選択マーカーAを発現する神経幹細胞について選択する工程;および
(d)該選択された細胞を、請求項1から5のいずれかに記載の方法に従って培養する工程
を含む、方法。 - 前記選択マーカーAが、抗生物質耐性または細胞表面マーカーをコードする、請求項45に記載の方法。
- 前記神経前駆細胞特異的プロモーターが、Sox−1、Sox−2、Sox−3、およびBLBPからなる群から選択される、請求項45または46に記載の方法。
- 前記方法の工程が、(a)、(b)、(c)、(d)の順に実施される、請求項45から47のいずれかに記載の方法。
- ES細胞の神経前駆細胞への分化を促進する方法であって、
(1)単層培養または(2)胚様体分化により、ES細胞を神経前駆体に転換する工程、および
NSA培地で該神経前駆体を培養する工程
を含む、方法。 - 前記NSA培地が、グルコースおよびHEPESを含む、請求項49に記載の方法。
- 対称的に分裂している神経幹細胞の集団を調製し維持する方法であって、
請求項49または50に記載の方法に従って神経前駆細胞の集団を得る工程;および
該集団を、請求項1から5のいずれかに記載の方法に従って培養する工程
を含む、方法。 - 神経前駆細胞へのES細胞の分化に関して因子の効果をアッセイするためのインビトロでの方法であって、
該因子の存在下で、請求項49から51のいずれかに記載の方法に従ってES細胞を培養する工程
を含む、方法。 - 神経幹細胞の分化に関して因子の効果をアッセイするためのインビトロでの方法であって、
請求項6から13に記載の組成物、請求項14から20に記載の集団、請求項31から42に記載の細胞株中に存在する神経幹細胞または請求項22から27に記載の単一の神経幹細胞と、該因子とを接触させる工程
を含む、方法。 - 前記因子が、誘導因子またはブロッキング因子のいずれかであり得る、請求項52または53に記載のインビトロでの方法。
- 神経変性疾患および脳損傷の治療用調製物の製造のための、請求項6から13に記載の組成物、請求項14から20に記載の集団、請求項31から42に記載の細胞株中に存在する神経幹細胞または請求項22から27に記載の単一の神経幹細胞の使用。
- 神経変性疾患および脳損傷の治療方法であって、請求項6から13に記載の組成物、請求項14から20に記載の集団、請求項31から42に記載の細胞株中に存在する神経幹細胞または請求項22から27に記載の単一の神経幹細胞の患者への移植を含む、方法。
- 請求項6から13に記載の組成物、請求項14から20に記載の集団、請求項31から42に記載の細胞株中に存在する神経幹細胞または請求項22から27に記載の単一の神経幹細胞をトランスフェクトする方法であって、
(a)選択マーカーBをコードする構築物で該神経幹細胞をトランスフェクトする工程であって、該選択マーカーBが、組織特異的プロモーターの制御下で発現され得る、工程;および
(b)該選択マーカーBを発現する神経幹細胞について選択する工程
を含む、方法。 - 前記選択マーカーBが、抗生物質耐性または細胞表面マーカーをコードする、請求項57に記載の方法。
- 請求項6から13に記載の組成物、請求項14から20に記載の集団、請求項31から42に記載の細胞株中に存在する神経幹細胞または請求項22から27に記載の単一の神経幹細胞であって、選択マーカーBをさらに含む、細胞。
- 神経幹細胞を含む組成物であって、該神経幹細胞が接着培養中にあり、そして該組成物中の細胞の少なくとも80%が神経幹細胞である、組成物。
- 前記組成物中の細胞の少なくとも90%が神経幹細胞である、請求項60に記載の組成物。
- 前記神経幹細胞が、少なくとも30回継代されている、請求項60または61に記載の組成物。
- 前記神経幹細胞が、少なくとも60回継代されている、請求項62に記載の組成物。
- 神経幹細胞を得る方法であって、
(i)神経幹細胞に分化し得る多分化能性もしくは分化多能性幹細胞を得る工程、
(ii)(i)の細胞を、分化多能性細胞に非許容性である培地でそして(a)EGFファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアゴニストおよび(b)FGFファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアゴニストの存在下で培養する工程
を含む、方法。 - 前記幹細胞が分化多能性幹細胞である、請求項64に記載の方法。
- 前記分化多能性幹細胞がES細胞またはEG細胞である、請求項65に記載の方法。
- 前記細胞をEGFレセプターのアゴニストおよびFGFレセプターのアゴニストの存在下で培養する工程を含む、請求項64から66のいずれかに記載の方法。
- 前記神経幹細胞からニューロン、星状細胞、または乏突起膠細胞を得る工程をさらに含む、請求項64から67のいずれかに記載の方法。
- 核再プログラミング方法であって、ドナー核が、請求項22から27、31から42、59、および60から63のいずれかに記載の神経幹細胞または請求項1から5、21、28から30、45から51、および64から68のいずれかに記載の方法に従って得られた細胞に由来する、方法。
- 核再プログラミング方法であって、
ドナー細胞を得る工程;
レシピエント細胞を得る工程;
該ドナー細胞の核を該レシピエント細胞に移入する工程であって、該ドナー細胞が、(i)請求項22から27、31から42、59、および60から63のいずれかに記載の神経幹細胞、または、(ii)請求項1から5、21、28から30、45から51、および64から68のいずれかに記載の方法に従って得られた細胞である、工程;および
該細胞を培養して該ドナー細胞の核を再プログラミングし、それによって再プログラミングされた細胞を得る工程
を含む、方法。 - 必要に応じて前記ドナー細胞の核の移入前におよび必要に応じて該ドナー細胞の核の移入後に、前記レシピエント細胞の核を除去する工程を含む、請求項70に記載の方法。
- 前記ドナー細胞の核を遺伝子操作する工程を含む、請求項70または71に記載の方法。
- 疾患原因遺伝子配列または推定疾患原因遺伝子配列を前記ドナー細胞の核に導入する工程を含む、請求項72に記載の方法。
- 請求項73に記載の方法であって、
前記再プログラミングされた細胞を培養して該再プログラミングされた細胞に由来する複数の細胞を得る工程;および
アッセイに該複数の細胞を用いる工程
を含む、方法。 - 請求項70から74のいずれかに記載の方法であって、
前記再プログラミングされた細胞に由来する組織を含む動物を得る工程;および
該組織を用いてアッセイを実施する工程
を含む、方法。 - 前記レシピエント細胞が卵母細胞である、請求項70から75のいずれかに記載の方法。
- 細胞を再プログラミングする方法であって、
細胞の混合集団を提供する工程;
該混合集団から、請求項22から27、31から42、59、および60から63のいずれかに記載の細胞を単離する工程;および
該単離された細胞の核をレシピエント細胞に移入する工程
を含む、方法。 - 前記単離された細胞を、その核を前記レシピエント細胞に移入する前に遺伝子操作する工程を含む、請求項77に記載の方法。
- 請求項77または78に記載の方法であって、
前記単離された細胞を培養して細胞のクローン集団を得る工程;および
前記集団中の1つの細胞の核を前記レシピエント細胞に移入する工程
を含む、方法。 - 非ヒト動物をクローン化する方法であって
(i)該非ヒト動物から神経幹細胞を得る工程;
(ii)該非ヒト動物と同じ種の卵母細胞を得る工程;
(iii)該神経幹細胞の核を該卵母細胞に移入する工程;
(iv)(iii)で得られた細胞を該同じ種の雌に移植する工程
を含む、方法。 - 前記神経幹細胞が、(i)請求項22から27、31から42、59、および60から63のいずれかに記載の神経幹細胞、または、(ii)請求項1から5、21、28から30、45から51、および64から68のいずれかに記載の方法に従って得られた細胞である、請求項80に記載の方法。
- 実施例のいずれかを参照して本明細書中に実質的に記載される、神経幹(NS)細胞の対称分裂を促進する方法。
- 実施例のいずれかを参照して本明細書中に実質的に記載される、細胞株。
- ニューロンを得る方法であって、(a)FGFレセプターのアゴニストの存在下でかつEGFレセプターのアゴニストの不在下で、神経幹細胞を培養する工程;および(b)その後、FGFレセプターのアゴニストの不在下でかつEGFレセプターのアゴニストの不在下で、該細胞を培養する工程を含む、方法。
- 単層培養に細胞を播種する工程を含む、請求項84に記載の方法。
- EGFを含まないがFGF−2を含む培地にNS細胞を移す工程、および少なくとも2日間それらを培養する工程、および次いで該培地からFGF−2を除去する工程を含む、請求項84または85に記載の方法。
- 前記神経幹細胞が、請求項1から5、21、28から30、45から51、および64から68のいずれかに記載の方法に従って得られる、請求項84から86のいずれかに記載の方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016540521A (ja) * | 2013-11-01 | 2016-12-28 | ビービーエイチシー シーオー.,エルティーディー. | 間葉系幹細胞から誘導された万能幹細胞を利用して神経細胞に分化させる方法 |
Families Citing this family (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2414995B (en) | 2004-06-09 | 2006-11-15 | Univ Edinburgh | Neural stem cells |
WO2006090882A1 (ja) * | 2005-02-23 | 2006-08-31 | Foundation For Biomedical Research And Innovation | 血管内皮前駆細胞の生体外増幅方法 |
KR100838013B1 (ko) * | 2006-06-07 | 2008-06-12 | 제일약품주식회사 | 인간배아줄기세포로부터 단계적 선별법을 통해 고수율로신경전구세포, 신경세포 및 기능성 도파민신경세포를생성하는 방법 |
WO2008031451A1 (en) * | 2006-09-11 | 2008-03-20 | Institut Für Molekulare Diagnostik Und Innovative Therapie - Molthera - Gmbh | A post-natal periodontal-derived neural stem cell |
EP1930412A1 (en) * | 2006-12-05 | 2008-06-11 | Dialectica s.r.l. | Neural stem cell medium and differentiation method |
WO2008068589A2 (en) * | 2006-12-05 | 2008-06-12 | Dialectica S.R.L. | Neural stem cell medium and differentiation method |
EP2128245A1 (en) * | 2008-05-27 | 2009-12-02 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Generation of induced pluripotent stem (iPS) cells |
WO2010075500A1 (en) | 2008-12-23 | 2010-07-01 | Stemcells California, Inc | Target populations of oligodendrocyte precursor cells and methods of making and using same |
EP2270043A1 (en) * | 2009-07-03 | 2011-01-05 | Sanofi-Aventis | Extracellular allosteric inhibitor binding domain from a tyrosine kinase receptor |
EP2531594B1 (en) | 2010-02-03 | 2016-11-16 | Samsung Life Public Welfare Foundation | Method for proliferating stem cells by activating c-met/hgf signaling and notch signaling |
EP2634195B1 (en) * | 2012-03-01 | 2017-02-01 | Miltenyi Biotec GmbH | Separation of living untouched neurons |
GB201302468D0 (en) | 2013-02-12 | 2013-03-27 | Reneuron Ltd | Stem cell product |
US20150079046A1 (en) | 2012-04-03 | 2015-03-19 | Reneuron Limited | Stem cell microparticles |
EP2877187B1 (en) | 2012-07-19 | 2019-06-12 | Reneuron Limited | Stem cell microparticles |
US9566310B2 (en) | 2012-09-10 | 2017-02-14 | Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Education On Behalf Of The University Of Nevada, Reno | Methods of treating muscular dystrophy |
EP2956147B1 (en) | 2013-02-12 | 2022-08-24 | Reneuron Limited | Method of producing microparticles |
US9738925B2 (en) * | 2013-03-15 | 2017-08-22 | Lyle J. Arnold | Methods for immobilizing target nucleic acids utilizing combinatorial capture probes |
JP2016516051A (ja) | 2013-03-15 | 2016-06-02 | ボード オブ リージェンツ オブ ザ ネヴァダ システム オブ ハイヤー エデュケーション オン ビハーフ オブ ザ ユニヴァーシティー オブ ネヴァダ リノ | 筋ジストロフィーを治療する方法 |
US9820933B2 (en) * | 2013-04-19 | 2017-11-21 | Korea University Research And Business Foundation | Composition for stimulating hair growth or preventing hair loss which includes extract neural stem cell and method for producing same |
GB201317887D0 (en) | 2013-10-09 | 2013-11-20 | Reneuron Ltd | Product |
GB201317889D0 (en) | 2013-10-09 | 2013-11-20 | Reneuron Ltd | Product and use |
CN105624116B (zh) * | 2014-11-07 | 2020-04-07 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 利用多能干细胞制备神经前体细胞的方法 |
EP3244831B1 (en) | 2015-01-12 | 2024-03-06 | Wake Forest University Health Sciences | Multi-layer skin substitute products and methods of making and using the same |
WO2016160918A1 (en) | 2015-03-31 | 2016-10-06 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Delivery vehicles for stem cells and uses thereof |
US20190249147A1 (en) * | 2016-06-20 | 2019-08-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Biologically relevant in vitro screening of human neurons |
GB201919021D0 (en) | 2019-12-20 | 2020-02-05 | Reneuron Ltd | Nucleic acid constructs for delivering polynucleotides into exosomes |
GB202114441D0 (en) | 2021-10-08 | 2021-11-24 | Reneuron Ltd | Proteins and extracellular vesicles |
US20230377685A1 (en) | 2022-04-15 | 2023-11-23 | Aspen Neuroscience, Inc. | Methods of classifying the differentiation state of cells and related compositions of differentiated cells |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10509592A (ja) * | 1994-11-14 | 1998-09-22 | ニューロスフィアーズ ホウルディングス リミテッド | 神経幹細胞増殖調節 |
JP2001526884A (ja) * | 1997-12-19 | 2001-12-25 | オリヴァー・ブリュストル | 神経前駆細胞、その製造方法および神経性欠陥治療におけるその使用 |
JP2002034580A (ja) * | 2000-01-05 | 2002-02-05 | Japan Science & Technology Corp | 多能性神経系前駆細胞を分離し、精製するための方法および多能性神経系前駆細胞 |
US20020164791A1 (en) * | 2000-09-29 | 2002-11-07 | Van Der Kooy Derek | Primitive neural stem cells and method for differentiation of stem cells to neural cells |
US20030032181A1 (en) * | 2001-07-20 | 2003-02-13 | Stem Cell Therapeutics Inc. | Production of radial glial cells |
US20030059414A1 (en) * | 2001-09-21 | 2003-03-27 | Ho Tony W. | Cell populations which co-express CD49c and CD90 |
WO2003097812A2 (en) * | 2002-05-17 | 2003-11-27 | Hematech, Llc | Transgenic ungulates capable of human antibody production |
Family Cites Families (57)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0233838A3 (en) | 1986-02-04 | 1990-01-31 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Neurite-promoting factor and process for the manufacture thereof |
US4753635A (en) * | 1986-05-23 | 1988-06-28 | Jacqueline Sagen | Inducing analgesia by implantation of cells releasing neuroactive substances |
NZ226750A (en) | 1987-10-29 | 1990-09-26 | Amrad Corp Ltd | Immortalisation of neural precursor cells by introducing a retrovirus vector containing a myc-oncogene |
US5182111A (en) * | 1987-11-17 | 1993-01-26 | Boston University Research Foundation | In vivo delivery of active factors by co-cultured cell implants |
WO1990001541A1 (en) * | 1988-08-04 | 1990-02-22 | Amrad Corporation Limited | In vitro propagation of embryonic stem cells |
US5082670A (en) * | 1988-12-15 | 1992-01-21 | The Regents Of The University Of California | Method of grafting genetically modified cells to treat defects, disease or damage or the central nervous system |
US4980174A (en) * | 1988-12-23 | 1990-12-25 | Jacqueline Sagen | Method for alleviating depression |
WO1991002003A1 (en) | 1989-08-04 | 1991-02-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions; purified preparation of neural progenitor regulatory factor |
WO1991009936A1 (en) | 1989-12-26 | 1991-07-11 | Hana Biologics, Inc. | Proliferated neuron progenitor cell product and process |
US5411883A (en) * | 1989-12-26 | 1995-05-02 | Somatix Therapy Corporation | Proliferated neuron progenitor cell product and process |
GB9003791D0 (en) * | 1990-02-20 | 1990-04-18 | Ludwig Inst Cancer Res | Transgenic animals,cell lines therefrom,and their use |
US5196315A (en) | 1990-05-01 | 1993-03-23 | The Johns Hopkins University | Human neuronal cell line |
US5612211A (en) * | 1990-06-08 | 1997-03-18 | New York University | Stimulation, production and culturing of hematopoietic progenitor cells by fibroblast growth factors |
US5980885A (en) * | 1991-07-08 | 1999-11-09 | Neurospheres Holdings Ltd. | Growth factor-induced proliferation of neural precursor cells in vivo |
US5851832A (en) * | 1991-07-08 | 1998-12-22 | Neurospheres, Ltd. | In vitro growth and proliferation of multipotent neural stem cells and their progeny |
US5750376A (en) * | 1991-07-08 | 1998-05-12 | Neurospheres Holdings Ltd. | In vitro growth and proliferation of genetically modified multipotent neural stem cells and their progeny |
US6294346B1 (en) * | 1991-07-08 | 2001-09-25 | Neurospheres Holdings, Ltd. | Use of multipotent neural stem cells and their progeny for the screening of drugs and other biological agents |
US6497872B1 (en) * | 1991-07-08 | 2002-12-24 | Neurospheres Holdings Ltd. | Neural transplantation using proliferated multipotent neural stem cells and their progeny |
EP0594669B9 (en) | 1991-07-08 | 2008-03-19 | NeuroSpheres Holdings Ltd. | Growth factor-responsive neural progenitor cells which can be proliferated in vitro. |
US5175103A (en) * | 1991-10-21 | 1992-12-29 | Trustees Of University Of Pennsylvania | Preparation of pure cultures of post-mitotic human neurons |
ES2133333T3 (es) | 1991-11-22 | 1999-09-16 | Genentech Inc | Tgf-beta para mejorar la recuperacion de las neuronas. |
US5589376A (en) * | 1992-07-27 | 1996-12-31 | California Institute Of Technology | Mammalian neural crest stem cells |
US5928947A (en) * | 1992-07-27 | 1999-07-27 | California Institute Of Technology | Mammalian multipotent neural stem cells |
AU4995193A (en) | 1992-08-04 | 1994-03-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of enhancing differentiation and survival of neuronal precursor cells |
US5356807A (en) * | 1992-09-08 | 1994-10-18 | Cornell Research Foundation | Cultured cell line of adult diploid cells from human brain and meningeal tissue |
US5690926A (en) * | 1992-10-08 | 1997-11-25 | Vanderbilt University | Pluripotential embryonic cells and methods of making same |
US7153684B1 (en) * | 1992-10-08 | 2006-12-26 | Vanderbilt University | Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same |
US5453357A (en) * | 1992-10-08 | 1995-09-26 | Vanderbilt University | Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same |
JP3583778B2 (ja) * | 1993-01-29 | 2004-11-04 | ニューロスフィアーズ ホウルディングス リミテッド | 神経幹細胞の遺伝子修飾 |
GB9308271D0 (en) | 1993-04-21 | 1993-06-02 | Univ Edinburgh | Method of isolating and/or enriching and/or selectively propagating pluripotential animal cells and animals for use in said method |
GB9417831D0 (en) | 1994-09-05 | 1994-10-26 | Biotech & Biolog Scien Res | Biological manipulation |
US5843780A (en) * | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
US5753505A (en) * | 1995-07-06 | 1998-05-19 | Emory University | Neuronal progenitor cells and uses thereof |
US7544511B2 (en) * | 1996-09-25 | 2009-06-09 | Neuralstem Biopharmaceuticals Ltd. | Stable neural stem cell line methods |
US5753506A (en) * | 1996-05-23 | 1998-05-19 | Cns Stem Cell Technology, Inc. | Isolation propagation and directed differentiation of stem cells from embryonic and adult central nervous system of mammals |
US6361996B1 (en) * | 1997-05-07 | 2002-03-26 | University Of Utah Research Foundation | Neuroepithelial stem cells and glial-restricted intermediate precursors |
US6734015B1 (en) * | 1997-07-04 | 2004-05-11 | University Of Utah Research Foundation | Isolation of lineage-restricted neuronal precursors |
US5968829A (en) * | 1997-09-05 | 1999-10-19 | Cytotherapeutics, Inc. | Human CNS neural stem cells |
AU729377B2 (en) * | 1997-10-23 | 2001-02-01 | Asterias Biotherapeutics, Inc. | Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture |
US6812027B2 (en) | 1998-03-25 | 2004-11-02 | Cornell Research Foundation, Inc. | Discovery, localization, harvest, and propagation of an FGF2 and BDNF-responsive population of neural and neuronal progenitor cells in the adult human forebrain |
WO2000017323A1 (en) * | 1998-09-22 | 2000-03-30 | Neuralstem Biopharmaceuticals, Ltd. | Stable neural stem cell lines |
US6667176B1 (en) * | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
US6878543B1 (en) | 1999-10-25 | 2005-04-12 | Nsgene Sa | Cultures of GFAP+ nestin+ cells that differentiate to neurons |
JP2003516141A (ja) * | 1999-12-07 | 2003-05-13 | モナシュ・ユニヴァーシティ | 長期細胞培養組成物とそれから誘導される遺伝的に修飾された動物 |
US7785882B2 (en) * | 2000-01-18 | 2010-08-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Neuronal progenitor cells from hippocampal tissue and a method for isolating and purifying them |
WO2001068815A1 (en) * | 2000-03-14 | 2001-09-20 | Es Cell International Pte Ltd | Embryonic stem cells and neural progenitor cells derived therefrom |
JP5943533B2 (ja) | 2000-05-17 | 2016-07-06 | アステリアス バイオセラピューティクス インコーポレイテッド | 神経前駆細胞の集団 |
US6812017B2 (en) * | 2000-10-11 | 2004-11-02 | Centre National De La Recherche Scientique - Cnrs | Mammalian secreted group IIF phospholipase A2 |
CN1128217C (zh) * | 2000-12-22 | 2003-11-19 | 复旦大学医学院附属华山医院 | 可表达外源性基因的人神经干细胞及其制备方法 |
US6852532B2 (en) * | 2001-03-21 | 2005-02-08 | University Of Utah Research Foundation | Method of isolating human neuroepithelial precursor cells from human fetal tissue |
JP3984959B2 (ja) | 2002-03-27 | 2007-10-03 | 株式会社Gbs研究所 | 神経幹細胞の増殖誘導方法 |
GB2407821B (en) * | 2002-06-05 | 2007-03-21 | Es Cell Int Pte Ltd | Stem Cells |
US7371922B2 (en) * | 2002-07-31 | 2008-05-13 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Nuclear transfer with porcine embryonic stem cells |
CA2507395A1 (en) | 2002-12-02 | 2004-06-17 | Anges Mg, Inc. | Method for culturing neural stem cells using hepatocyte growth factor |
GB2414995B (en) | 2004-06-09 | 2006-11-15 | Univ Edinburgh | Neural stem cells |
GB0505510D0 (en) * | 2004-06-09 | 2005-04-27 | Univ Edinburgh | Neural stem cells |
WO2006044204A2 (en) | 2004-10-05 | 2006-04-27 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Neuronal progenitors from feeder-free human embryonic stem cell culture |
-
2005
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-
2011
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-
2014
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Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10509592A (ja) * | 1994-11-14 | 1998-09-22 | ニューロスフィアーズ ホウルディングス リミテッド | 神経幹細胞増殖調節 |
JP2001526884A (ja) * | 1997-12-19 | 2001-12-25 | オリヴァー・ブリュストル | 神経前駆細胞、その製造方法および神経性欠陥治療におけるその使用 |
JP2002034580A (ja) * | 2000-01-05 | 2002-02-05 | Japan Science & Technology Corp | 多能性神経系前駆細胞を分離し、精製するための方法および多能性神経系前駆細胞 |
US20020164791A1 (en) * | 2000-09-29 | 2002-11-07 | Van Der Kooy Derek | Primitive neural stem cells and method for differentiation of stem cells to neural cells |
US20030032181A1 (en) * | 2001-07-20 | 2003-02-13 | Stem Cell Therapeutics Inc. | Production of radial glial cells |
US20030059414A1 (en) * | 2001-09-21 | 2003-03-27 | Ho Tony W. | Cell populations which co-express CD49c and CD90 |
WO2003097812A2 (en) * | 2002-05-17 | 2003-11-27 | Hematech, Llc | Transgenic ungulates capable of human antibody production |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
JPN6011004252; Methods Enzymol.(2003),Vol.365,p,327-341 * |
JPN6011004253; Molecular and Cellular Neuroscience(2003),Vol.24,p.198-213 * |
JPN6014016377; Developmental Neuroscience Vol.15,No.3, 20040301, 487-491 |
JPN6014016378; Experimental Neurology Vol.156, 1999, 71-83 |
JPN6014034696; The Journal of Neuroscience Vol.19,No.9, 19990501, 3287-3297 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016540521A (ja) * | 2013-11-01 | 2016-12-28 | ビービーエイチシー シーオー.,エルティーディー. | 間葉系幹細胞から誘導された万能幹細胞を利用して神経細胞に分化させる方法 |
Also Published As
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