JP2002034580A - 多能性神経系前駆細胞を分離し、精製するための方法および多能性神経系前駆細胞 - Google Patents
多能性神経系前駆細胞を分離し、精製するための方法および多能性神経系前駆細胞Info
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- JP2002034580A JP2002034580A JP2001000868A JP2001000868A JP2002034580A JP 2002034580 A JP2002034580 A JP 2002034580A JP 2001000868 A JP2001000868 A JP 2001000868A JP 2001000868 A JP2001000868 A JP 2001000868A JP 2002034580 A JP2002034580 A JP 2002034580A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 細胞型の混合集団から多能性神経系前駆細胞
の分離方法の提供。 【解決手段】 神経系前駆細胞において選択的に機能す
るプロモーターを選択し、細胞型混合集団のすべての細
胞型に、上記プロモーターの支配下で蛍光タンパク質を
コードする核酸分子を導入し、混合集団内の神経系前駆
細胞のみに上記蛍光タンパク質を発現させ、他の細胞型
には発現させず、細胞型混合集団の細胞の中から蛍光を
発する細胞として神経系前駆細胞を同定し、細胞型の混
合集団から蛍光を発する細胞を分離し、その際分離した
細胞が神経系前駆細胞に限定されることを含む。更に、
単離されたヒトmusashiプロモーター及び単離された多
能性神経系前駆細胞の濃縮或いは精製された製剤。
の分離方法の提供。 【解決手段】 神経系前駆細胞において選択的に機能す
るプロモーターを選択し、細胞型混合集団のすべての細
胞型に、上記プロモーターの支配下で蛍光タンパク質を
コードする核酸分子を導入し、混合集団内の神経系前駆
細胞のみに上記蛍光タンパク質を発現させ、他の細胞型
には発現させず、細胞型混合集団の細胞の中から蛍光を
発する細胞として神経系前駆細胞を同定し、細胞型の混
合集団から蛍光を発する細胞を分離し、その際分離した
細胞が神経系前駆細胞に限定されることを含む。更に、
単離されたヒトmusashiプロモーター及び単離された多
能性神経系前駆細胞の濃縮或いは精製された製剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般に対象とする
細胞、特に多能性神経系前駆細胞を分離する方法に関す
る。
細胞、特に多能性神経系前駆細胞を分離する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術とその課題】この出願全体を通して種々の
公表文献が引用され、その多くが括弧書きで示されてい
る。これらの公表文献についての全リストを、
公表文献が引用され、その多くが括弧書きで示されてい
る。これらの公表文献についての全リストを、
【発明の詳細な説明】の最後に示す。これらの公表文献
の開示内容は全て、この出願において参考として組み込
まれている。
の開示内容は全て、この出願において参考として組み込
まれている。
【０００３】損傷した脳は、機能的に重要な構造の自己
修復がほとんど不可能である。これは一部には、成熟脳
が見掛け上新しいニューロンを発生させることができな
いことによる（Korr,1980;Sturrock,1982）。しかし、
成体脊椎動物の前脳でニューロンが産生されないこと
は、適切なニューロン前駆体が存在しないためではな
く、むしろそれらの持続的抑制および／あるいは細胞分
裂後の栄養と移動のサポートがないことを反映している
と思われる。現在一連の証拠を合わせると、ニューロン
およびグリア前駆細胞は成体脊椎動物前脳の脳室上衣下
全体に広く分布しており、広範囲の種のグループにわた
って存続しているという主張が裏付けられる（Goldman
and Nottebohm,1983; Reynolds and Weiss,1992;Richar
ds et al.,1992; Kirschenbaum et al.,1994; Kirschen
baum and Goldman,1995a; Goldman,1995における考察;G
oldman,1997;Goldman,1998;Goldman and Luskin,1998;
およびGage et al.,1995）。分化能のある神経系前駆細
胞は実質部分でも得られているが（Richards et al.,19
92; Paler et al.,1995; Pincus et al.,1998）、これ
らの前駆細胞の主要なソースは脳室帯にあることがほと
んどの試験で認められている（Goldman and Nottebohm,
1983; Goldman,1990; Goldman et al.,1992; Lois and
Alvarez-Buylla,1993; Morshead et al.,1994; Kirsche
nbaum et al.,1994; Kirschenbaum and Goldman,199
5）。一般に、成体前駆細胞は、表皮成長因子（EGF）お
よび塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）に応答して増殖
を拡大し（Reynolds and Weiss,1992; Kilpatrick and
Bartlett,1995; Kuhn et al.,1997）、多能性であると
考えられ（Vescovi et al.,1993;Goldman et al.,199
6）、生存期間を通じて存続する（Goldman et al.,199
6）。げっ歯動物とヒトにおいては、その娘細胞である
ニューロンは、鳥類の場合と同じように（Goldman and
Nedergaard,1992）、脳由来の神経栄養因子（BDNF）に
養われて（Kirschenbaum andGoldman,1995a）in vitro
で十分に機能性となることができる。
修復がほとんど不可能である。これは一部には、成熟脳
が見掛け上新しいニューロンを発生させることができな
いことによる（Korr,1980;Sturrock,1982）。しかし、
成体脊椎動物の前脳でニューロンが産生されないこと
は、適切なニューロン前駆体が存在しないためではな
く、むしろそれらの持続的抑制および／あるいは細胞分
裂後の栄養と移動のサポートがないことを反映している
と思われる。現在一連の証拠を合わせると、ニューロン
およびグリア前駆細胞は成体脊椎動物前脳の脳室上衣下
全体に広く分布しており、広範囲の種のグループにわた
って存続しているという主張が裏付けられる（Goldman
and Nottebohm,1983; Reynolds and Weiss,1992;Richar
ds et al.,1992; Kirschenbaum et al.,1994; Kirschen
baum and Goldman,1995a; Goldman,1995における考察;G
oldman,1997;Goldman,1998;Goldman and Luskin,1998;
およびGage et al.,1995）。分化能のある神経系前駆細
胞は実質部分でも得られているが（Richards et al.,19
92; Paler et al.,1995; Pincus et al.,1998）、これ
らの前駆細胞の主要なソースは脳室帯にあることがほと
んどの試験で認められている（Goldman and Nottebohm,
1983; Goldman,1990; Goldman et al.,1992; Lois and
Alvarez-Buylla,1993; Morshead et al.,1994; Kirsche
nbaum et al.,1994; Kirschenbaum and Goldman,199
5）。一般に、成体前駆細胞は、表皮成長因子（EGF）お
よび塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）に応答して増殖
を拡大し（Reynolds and Weiss,1992; Kilpatrick and
Bartlett,1995; Kuhn et al.,1997）、多能性であると
考えられ（Vescovi et al.,1993;Goldman et al.,199
6）、生存期間を通じて存続する（Goldman et al.,199
6）。げっ歯動物とヒトにおいては、その娘細胞である
ニューロンは、鳥類の場合と同じように（Goldman and
Nedergaard,1992）、脳由来の神経栄養因子（BDNF）に
養われて（Kirschenbaum andGoldman,1995a）in vitro
で十分に機能性となることができる。
【０００４】成体神経系前駆細胞の生物学的分析とそれ
らを移植試験で使用することの両方にとっての重大な障
害は、それらが成体の脳組織では比較的希少であり、酵
素的解離と精製の手法によって分離したときの収率が低
いことであった。その結果として、代替治療のために単
一成体由来の前駆細胞を操作するあるいはそれらを濃縮
するという試みは困難であった。鳥類（Goldman et a
l.,1992;1996c）、マウス（Reynolds and Weiss,1992）
あるいはヒト（Kirschenbaum et al.,1994）組織を使用
して、成体脳の解離物からこれらの細胞の採取に成功し
た少数の報告があるが、すべて細胞の生存率は１％未満
と報告されている。そこでいくつかのグループは、無血
清懸濁培地で分裂促進因子に連続暴露した、分離された
単一の前駆細胞に由来する細胞株を樹立する方法を採用
している（Reynolds and Weiss,1992; Morshead et a
l.,1994; Palmer et al.,1995）。しかしながら、結果
的に神経系前駆細胞集団における分化と増殖についての
基本的試験の多くが、一定の分裂促進因子による刺激下
で長期にわたって何度も継代させた少数の創始細胞に基
づくものとなった。これらの細胞がどのような表現型を
とるか、それらの形質転換の状態および核型はすべて不
明である；継代を繰り返したあとに、そのような前駆細
胞株が依然として生物学的にもとの前駆細胞と同じ性質
を示すものであるかどうか、あるいは増殖と系統の制御
に乱れを生じた形質転換体となっているかは明らかでな
い。
らを移植試験で使用することの両方にとっての重大な障
害は、それらが成体の脳組織では比較的希少であり、酵
素的解離と精製の手法によって分離したときの収率が低
いことであった。その結果として、代替治療のために単
一成体由来の前駆細胞を操作するあるいはそれらを濃縮
するという試みは困難であった。鳥類（Goldman et a
l.,1992;1996c）、マウス（Reynolds and Weiss,1992）
あるいはヒト（Kirschenbaum et al.,1994）組織を使用
して、成体脳の解離物からこれらの細胞の採取に成功し
た少数の報告があるが、すべて細胞の生存率は１％未満
と報告されている。そこでいくつかのグループは、無血
清懸濁培地で分裂促進因子に連続暴露した、分離された
単一の前駆細胞に由来する細胞株を樹立する方法を採用
している（Reynolds and Weiss,1992; Morshead et a
l.,1994; Palmer et al.,1995）。しかしながら、結果
的に神経系前駆細胞集団における分化と増殖についての
基本的試験の多くが、一定の分裂促進因子による刺激下
で長期にわたって何度も継代させた少数の創始細胞に基
づくものとなった。これらの細胞がどのような表現型を
とるか、それらの形質転換の状態および核型はすべて不
明である；継代を繰り返したあとに、そのような前駆細
胞株が依然として生物学的にもとの前駆細胞と同じ性質
を示すものであるかどうか、あるいは増殖と系統の制御
に乱れを生じた形質転換体となっているかは明らかでな
い。
【０００５】脳組織から本来の、継代を経ていない非形
質転換前駆細胞をより効率的に分離する手段を案出する
ために、脳細胞を脳組織から自由に解離し、神経系前駆
細胞型特異的プロモーターの支配下に蛍光レポーター遺
伝子を保持するプラスミドDNAを用いてin vitroで形質
導入することができる方法が開発された（Wang et al.,
1998）。これにより、神経系前駆細胞と幼若ニューロン
においてのみ発現される調節配列、Tα1チューブリン
（tubulin）プロモーターを用いて、あいまいではある
が、CNSの神経系前駆細胞と思われる細胞集団を単離す
ることが可能となった。
質転換前駆細胞をより効率的に分離する手段を案出する
ために、脳細胞を脳組織から自由に解離し、神経系前駆
細胞型特異的プロモーターの支配下に蛍光レポーター遺
伝子を保持するプラスミドDNAを用いてin vitroで形質
導入することができる方法が開発された（Wang et al.,
1998）。これにより、神経系前駆細胞と幼若ニューロン
においてのみ発現される調節配列、Tα1チューブリン
（tubulin）プロモーターを用いて、あいまいではある
が、CNSの神経系前駆細胞と思われる細胞集団を単離す
ることが可能となった。
【０００６】しかしながら、Tα1チューブリンに基づく
分離には、それらが、ニューロン、オリゴデンドロサイ
ト（希突起神経膠細胞）および星状細胞を生じさせう
る、成体脳の神経幹細胞のようなより多能性の神経系前
駆細胞ではなく、運命づけられた（committed）ニュー
ロン前駆細胞を生じるという制限がある。これらの神経
幹細胞の存在はげっ歯動物の数多くの試験で報告されて
おり（Weiss et al.,1996（総説論文））、ニューロン
とオリゴデンドロサイトの両方を発生させる能力を備え
た前駆細胞がヒト成体で明らかにされた（Kirschenbaum
et al.,1994;Goldman,1997（総説論文））。げっ歯動
物では、上述したように、反復継代と分裂促進による刺
激を用いてこれらの細胞がクローナルに増殖されてい
る。それにもかかわらず、ネイティブな成体神経幹細胞
それ自体は、げっ歯動物あるいはヒトにおいて単離さ
れ、精製されたことはかつてない。
分離には、それらが、ニューロン、オリゴデンドロサイ
ト（希突起神経膠細胞）および星状細胞を生じさせう
る、成体脳の神経幹細胞のようなより多能性の神経系前
駆細胞ではなく、運命づけられた（committed）ニュー
ロン前駆細胞を生じるという制限がある。これらの神経
幹細胞の存在はげっ歯動物の数多くの試験で報告されて
おり（Weiss et al.,1996（総説論文））、ニューロン
とオリゴデンドロサイトの両方を発生させる能力を備え
た前駆細胞がヒト成体で明らかにされた（Kirschenbaum
et al.,1994;Goldman,1997（総説論文））。げっ歯動
物では、上述したように、反復継代と分裂促進による刺
激を用いてこれらの細胞がクローナルに増殖されてい
る。それにもかかわらず、ネイティブな成体神経幹細胞
それ自体は、げっ歯動物あるいはヒトにおいて単離さ
れ、精製されたことはかつてない。
【０００７】それ故、脳組織からネイティブな多能性神
経系前駆細胞を同定し、分離し、単離し、そして精製す
るための新しい戦略が強く求められている。
経系前駆細胞を同定し、分離し、単離し、そして精製す
るための新しい戦略が強く求められている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】このために、本発明は、
細胞特異的プロモーターの細胞型選択的発現に基づく、
細胞型混合集団から多能性神経系前駆細胞を分離する方
法を提供する。この方法は、神経系前駆細胞において選
択的に機能するプロモーターを選択し、上記プロモータ
ーの支配下で蛍光タンパク質をコードする核酸分子を細
胞型混合集団のすべての細胞型に導入することを含む。
混合集団内の神経系前駆細胞だけに蛍光タンパク質を発
現させ、他の細胞型には発現させない。蛍光を発する細
胞型混合集団の細胞は神経系前駆細胞に限定されるの
で、そのような細胞を同定し、細胞型混合集団から蛍光
を発する細胞を分離する。結果として、分離した細胞は
神経系前駆細胞に限定される。
細胞特異的プロモーターの細胞型選択的発現に基づく、
細胞型混合集団から多能性神経系前駆細胞を分離する方
法を提供する。この方法は、神経系前駆細胞において選
択的に機能するプロモーターを選択し、上記プロモータ
ーの支配下で蛍光タンパク質をコードする核酸分子を細
胞型混合集団のすべての細胞型に導入することを含む。
混合集団内の神経系前駆細胞だけに蛍光タンパク質を発
現させ、他の細胞型には発現させない。蛍光を発する細
胞型混合集団の細胞は神経系前駆細胞に限定されるの
で、そのような細胞を同定し、細胞型混合集団から蛍光
を発する細胞を分離する。結果として、分離した細胞は
神経系前駆細胞に限定される。
【０００９】本発明はまた、単離したヒトmusashiプロ
モーターに関する。
モーターに関する。
【００１０】本発明のもうひとつの態様は、単離した多
能性神経系前駆細胞の濃縮あるいは精製製剤である。
能性神経系前駆細胞の濃縮あるいは精製製剤である。
【００１１】多能性神経系前駆細胞における発現を特異
的に推進し、神経系の他の細胞における発現は推進しな
いプロモーターを選択する。従って蛍光タンパク質は、
プロモーターが機能する細胞、すなわちプロモーターが
特異的である細胞においてのみ発現され、検出される。
的に推進し、神経系の他の細胞における発現は推進しな
いプロモーターを選択する。従って蛍光タンパク質は、
プロモーターが機能する細胞、すなわちプロモーターが
特異的である細胞においてのみ発現され、検出される。
【００１２】このような方法は、細胞特異的プロモータ
ーの支配下で、蛍光タンパク質をコードする核酸を複数
の細胞に導入することを含む。導入方法としては、ウイ
ルスを介した形質転換（たとえばアデノウイルスを介し
た形質転換）、電気穿孔およびリポソームを介した形質
転換を含めて（ただしこれらに限定されない）、当業者
に既知の様々な方法が使用できる。
ーの支配下で、蛍光タンパク質をコードする核酸を複数
の細胞に導入することを含む。導入方法としては、ウイ
ルスを介した形質転換（たとえばアデノウイルスを介し
た形質転換）、電気穿孔およびリポソームを介した形質
転換を含めて（ただしこれらに限定されない）、当業者
に既知の様々な方法が使用できる。
【００１３】緑色蛍光タンパク質（GFP）のような蛍光
タンパク質を細胞特異的に発現させた後、適当な手段に
よって蛍光タンパク質を発現する細胞を分離する。特
に、蛍光活性化細胞選別（fluorescence activated cel
l sorting）によって細胞を分離することができる。従
って本発明の方法は、多能性神経系前駆細胞の濃縮およ
び分離のための方法を提供する。
タンパク質を細胞特異的に発現させた後、適当な手段に
よって蛍光タンパク質を発現する細胞を分離する。特
に、蛍光活性化細胞選別（fluorescence activated cel
l sorting）によって細胞を分離することができる。従
って本発明の方法は、多能性神経系前駆細胞の濃縮およ
び分離のための方法を提供する。
【００１４】神経系前駆細胞の使用に対する近年のアプ
ローチは、単一前駆細胞由来のクローン系統の確立に焦
点をあててきた。しかしそのような増殖系統は、in vit
roでの時間経過と継代と共に、次第にそれらのもとの前
駆細胞の性質を代表するものではなくなっていくと考え
られる。これらの問題を回避するために、本発明の方法
は、多能性神経系前駆細胞特異的musashiプロモーター
あるいはnestinエンハンサーによってもたらされる、蛍
光タンパク質でトランスフェクションしたヒト脳室帯細
胞の蛍光活性化細胞選別によってネイティブな多能性神
経系前駆細胞の生存する細胞を同定し、単離し、濃縮す
るための方法を提供する。このアプローチを用いて、鳥
類、哺乳動物およびヒト由来の胚および成体脳を含め
て、多様なサンプルから多能性神経系前駆細胞を同定
し、選択的に採取することができる。このアプローチ
は、選択的解離と分画遠心分離の標準的手法を通して得
られるよりも実質的に高い収率で、成体と胚の両方から
神経系前駆細胞を濃縮することを可能にする。musashi
タンパク質は、脳室帯および脳室下帯の細胞周期進行細
胞を含めて、神経系前駆細胞によって発現されるRNA結
合タンパク質である（Sakakibara et al.,1996）。発生
時に、musashiタンパク質は脳室帯の神経およびニュー
ロン前駆細胞によって発現されるので、細胞がニューロ
ンとしての表現型へと運命づけられるときには、musash
iの発現は検出不能のレベルまで急激に低下し、その時
点で関連Huタンパク質の発現が上昇する（Sakakibara e
t al.,1997）。nestinは、神経幹細胞および神経系前駆
細胞によって発現される中間フィラメントである；nest
inの第２イントロンのエンハンサーは、胎児神経上皮の
神経系前駆細胞における転写を指令する。結果として、
導入遺伝子の発現を多能性神経系前駆細胞に標的する能
力のゆえに、musashiプロモーターとnestinエンハンサ
ーをこの試験のために選択した。
ローチは、単一前駆細胞由来のクローン系統の確立に焦
点をあててきた。しかしそのような増殖系統は、in vit
roでの時間経過と継代と共に、次第にそれらのもとの前
駆細胞の性質を代表するものではなくなっていくと考え
られる。これらの問題を回避するために、本発明の方法
は、多能性神経系前駆細胞特異的musashiプロモーター
あるいはnestinエンハンサーによってもたらされる、蛍
光タンパク質でトランスフェクションしたヒト脳室帯細
胞の蛍光活性化細胞選別によってネイティブな多能性神
経系前駆細胞の生存する細胞を同定し、単離し、濃縮す
るための方法を提供する。このアプローチを用いて、鳥
類、哺乳動物およびヒト由来の胚および成体脳を含め
て、多様なサンプルから多能性神経系前駆細胞を同定
し、選択的に採取することができる。このアプローチ
は、選択的解離と分画遠心分離の標準的手法を通して得
られるよりも実質的に高い収率で、成体と胚の両方から
神経系前駆細胞を濃縮することを可能にする。musashi
タンパク質は、脳室帯および脳室下帯の細胞周期進行細
胞を含めて、神経系前駆細胞によって発現されるRNA結
合タンパク質である（Sakakibara et al.,1996）。発生
時に、musashiタンパク質は脳室帯の神経およびニュー
ロン前駆細胞によって発現されるので、細胞がニューロ
ンとしての表現型へと運命づけられるときには、musash
iの発現は検出不能のレベルまで急激に低下し、その時
点で関連Huタンパク質の発現が上昇する（Sakakibara e
t al.,1997）。nestinは、神経幹細胞および神経系前駆
細胞によって発現される中間フィラメントである；nest
inの第２イントロンのエンハンサーは、胎児神経上皮の
神経系前駆細胞における転写を指令する。結果として、
導入遺伝子の発現を多能性神経系前駆細胞に標的する能
力のゆえに、musashiプロモーターとnestinエンハンサ
ーをこの試験のために選択した。
【００１５】発生期および表現型特異的プロモーター
（どちらも、本文中では「細胞特異的」プロモーターの
表現で網羅される）の支配下で蛍光トランスジーンを含
むようにこのアプローチを拡大することにより、より一
層特異的な分離、たとえば一連の発生段階にわたる多能
性神経系前駆細胞の分離が実施できる。この方法は、表
現型の規定と発生制御のin vitro分析と同様に、規定
し、分離した前駆細胞プールをin vivoで移植するため
の十分な濃縮を可能にする。
（どちらも、本文中では「細胞特異的」プロモーターの
表現で網羅される）の支配下で蛍光トランスジーンを含
むようにこのアプローチを拡大することにより、より一
層特異的な分離、たとえば一連の発生段階にわたる多能
性神経系前駆細胞の分離が実施できる。この方法は、表
現型の規定と発生制御のin vitro分析と同様に、規定
し、分離した前駆細胞プールをin vivoで移植するため
の十分な濃縮を可能にする。
【００１６】多能性神経系前駆細胞を、それらが混合集
団の中に少数存在する場合でも、生存した状態で同定す
る手段を提供することにより、musashiプロモーターやn
estinエンハンサーのような細胞型選択的プロモーター
によってもたらされる蛍光導入遺伝子を使用して、これ
までは大きな集団に関してしか実施できなかったアプロ
ーチである、表現型の規定を単一細胞レベルで検討し、
それに干渉することが可能となるであろう。実際に、ト
ランスフェクション後の蛍光活性化セルソーター（FAC
S）と組み合わせて使用すると、この方法は、発生期あ
るいは表現型特異的プロモーターが使用できるあらゆる
細胞型の濃縮を可能にすると考えられる。たとえば、T
α1チューブリン（Wang et al.,1998）のような初期ニ
ューロンプロモーターに基づく同様のGFP構築物も、同
様に成体脳組織由来の多能性神経系前駆細胞に加えてニ
ューロンおよびオリゴデンドロサイト前駆細胞の濃縮も
可能にすると考えられる。結果として、各々異なる細胞
特異的プロモーターによってもたらされる、重複しない
発光スペクトルを持ったスペクトル的に異なるGFP変異
体は、in vitroでニューロン前駆細胞、オリゴデンドロ
サイト前駆細胞および多能性神経系前駆細胞を同時に同
定することを可能にするであろう。Ar-KとHe-Neのよう
なオーバーラップしない励起系統を有するいくつかのレ
ーザーの同時使用に基づいたマルチチャネル細胞選別
は、所与の脳サンプルからいくつかの別個の表現型を有
する前駆細胞を分離し、同時に同定することができるは
ずである。
団の中に少数存在する場合でも、生存した状態で同定す
る手段を提供することにより、musashiプロモーターやn
estinエンハンサーのような細胞型選択的プロモーター
によってもたらされる蛍光導入遺伝子を使用して、これ
までは大きな集団に関してしか実施できなかったアプロ
ーチである、表現型の規定を単一細胞レベルで検討し、
それに干渉することが可能となるであろう。実際に、ト
ランスフェクション後の蛍光活性化セルソーター（FAC
S）と組み合わせて使用すると、この方法は、発生期あ
るいは表現型特異的プロモーターが使用できるあらゆる
細胞型の濃縮を可能にすると考えられる。たとえば、T
α1チューブリン（Wang et al.,1998）のような初期ニ
ューロンプロモーターに基づく同様のGFP構築物も、同
様に成体脳組織由来の多能性神経系前駆細胞に加えてニ
ューロンおよびオリゴデンドロサイト前駆細胞の濃縮も
可能にすると考えられる。結果として、各々異なる細胞
特異的プロモーターによってもたらされる、重複しない
発光スペクトルを持ったスペクトル的に異なるGFP変異
体は、in vitroでニューロン前駆細胞、オリゴデンドロ
サイト前駆細胞および多能性神経系前駆細胞を同時に同
定することを可能にするであろう。Ar-KとHe-Neのよう
なオーバーラップしない励起系統を有するいくつかのレ
ーザーの同時使用に基づいたマルチチャネル細胞選別
は、所与の脳サンプルからいくつかの別個の表現型を有
する前駆細胞を分離し、同時に同定することができるは
ずである。
【００１７】本発明の方法は、成体脳から多能性神経系
前駆細胞、特に神経幹細胞を単離し、精製するための新
しい戦略を提供する。これらの細胞は、前駆細胞と幹細
胞の発生制御についての基礎分析、ならびにそれらの移
植の可能性と移植片特性に関するより応用性の高い試験
の両方において使用しうる。一般に、成体脳から神経系
前駆細胞を同定し、濃縮するための手段を提供すること
により、この戦略は、前駆細胞と幹細胞の生物学的検討
を有意に促進し、移植試験に十分な数のネイティブな継
代していない成体前駆細胞を提供することができると考
えられる。このアプローチ自体が、脳あるいは脊髄にお
いて、損傷した中枢神経系の構造修復のための生存可能
な治療様式として、成体神経発生の誘導の開発に拍車を
かけるものと考えられる。
前駆細胞、特に神経幹細胞を単離し、精製するための新
しい戦略を提供する。これらの細胞は、前駆細胞と幹細
胞の発生制御についての基礎分析、ならびにそれらの移
植の可能性と移植片特性に関するより応用性の高い試験
の両方において使用しうる。一般に、成体脳から神経系
前駆細胞を同定し、濃縮するための手段を提供すること
により、この戦略は、前駆細胞と幹細胞の生物学的検討
を有意に促進し、移植試験に十分な数のネイティブな継
代していない成体前駆細胞を提供することができると考
えられる。このアプローチ自体が、脳あるいは脊髄にお
いて、損傷した中枢神経系の構造修復のための生存可能
な治療様式として、成体神経発生の誘導の開発に拍車を
かけるものと考えられる。
【００１８】
【発明の実施の形態】特許手続上の微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約の規定に従い、且つこれ
を満たして、pMsi:hGFPと命名したプラスミドを2000年1
2月22日にAmerican Type Culture Collection（ATCC）,
10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20
110-2209に寄託した。
的承認に関するブダペスト条約の規定に従い、且つこれ
を満たして、pMsi:hGFPと命名したプラスミドを2000年1
2月22日にAmerican Type Culture Collection（ATCC）,
10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20
110-2209に寄託した。
【００１９】特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に
関するブダペスト条約の規定に従い、且つこれを満たし
て、pE/nestin:EGFPと命名したプラスミドを2000年12月
22日にAmerican Type Culture Collection（ATCC）, 10
801 University Boulevard,Manassas, Virginia 20110-
2209に寄託した。
関するブダペスト条約の規定に従い、且つこれを満たし
て、pE/nestin:EGFPと命名したプラスミドを2000年12月
22日にAmerican Type Culture Collection（ATCC）, 10
801 University Boulevard,Manassas, Virginia 20110-
2209に寄託した。
【００２０】本文中で使用する場合、核酸分子に関連し
て用いたとき「単離」という用語は: 1）ある生物から
実質的に精製された形態で分離された（すなわちその生
物に由来する他の物質を実質的に含まない）核酸分子、
あるいは2）同じヌクレオチド配列を持つが、必ずしも
その生物から分離されたのではない核酸分子（すなわち
合成された、あるいは組換えによって産生された核酸分
子）をさす。
て用いたとき「単離」という用語は: 1）ある生物から
実質的に精製された形態で分離された（すなわちその生
物に由来する他の物質を実質的に含まない）核酸分子、
あるいは2）同じヌクレオチド配列を持つが、必ずしも
その生物から分離されたのではない核酸分子（すなわち
合成された、あるいは組換えによって産生された核酸分
子）をさす。
【００２１】本発明は、細胞特異的プロモーターの細胞
型選択的発現に基づき、細胞型の混合集団から多能性神
経系前駆細胞を分離する方法を提供する。この方法は、
神経系前駆細胞において選択的に機能するプロモーター
を選択し、細胞型混合集団のすべての細胞型に、上記プ
ロモーターの支配下で蛍光タンパク質をコードする核酸
分子を導入し、混合集団内の神経系前駆細胞のみに上記
蛍光タンパク質を発現させ、他の細胞型には発現させ
ず、細胞型混合集団の細胞の中から蛍光を発する細胞と
して神経系前駆細胞を同定し、そして細胞型の混合集団
から蛍光を発する細胞を分離し、その際分離した細胞が
神経系前駆細胞に限定されることを含む。
型選択的発現に基づき、細胞型の混合集団から多能性神
経系前駆細胞を分離する方法を提供する。この方法は、
神経系前駆細胞において選択的に機能するプロモーター
を選択し、細胞型混合集団のすべての細胞型に、上記プ
ロモーターの支配下で蛍光タンパク質をコードする核酸
分子を導入し、混合集団内の神経系前駆細胞のみに上記
蛍光タンパク質を発現させ、他の細胞型には発現させ
ず、細胞型混合集団の細胞の中から蛍光を発する細胞と
して神経系前駆細胞を同定し、そして細胞型の混合集団
から蛍光を発する細胞を分離し、その際分離した細胞が
神経系前駆細胞に限定されることを含む。
【００２２】本発明に従って特に対象となる細胞は多能
性神経系前駆細胞である。プロモーターを説明するため
に本文中で使用するとき、「特異的」という用語は、プ
ロモーターが選択された細胞型においてのみ機能するこ
とを意味する。選択された細胞型とは、細胞の発生周期
における種々の段階を表しうる。
性神経系前駆細胞である。プロモーターを説明するため
に本文中で使用するとき、「特異的」という用語は、プ
ロモーターが選択された細胞型においてのみ機能するこ
とを意味する。選択された細胞型とは、細胞の発生周期
における種々の段階を表しうる。
【００２３】細胞型の混合集団は、たとえば脳室帯、海
馬、脊髄、骨髄、たとえば骨髄支質又は間葉、あるいは
胚性幹細胞から誘導しうる。細胞型の混合集団は、組織
中、たとえば脳組織又は脊髄組織中、あるいは細胞培養
中に存在しうる。
馬、脊髄、骨髄、たとえば骨髄支質又は間葉、あるいは
胚性幹細胞から誘導しうる。細胞型の混合集団は、組織
中、たとえば脳組織又は脊髄組織中、あるいは細胞培養
中に存在しうる。
【００２４】多能性神経系前駆細胞のためのプロモータ
ーの例としては、musashiプロモーターおよびnestinエ
ンハンサーを含む。
ーの例としては、musashiプロモーターおよびnestinエ
ンハンサーを含む。
【００２５】本発明のひとつの実施態様に従えば、ヒト
musashiプロモーターは配列番号１に示すヌクレオチド
配列を有する。
musashiプロモーターは配列番号１に示すヌクレオチド
配列を有する。
【００２６】本発明のもうひとつの実施態様に従えば、
ヒトnestinエンハンサーは配列番号２に示すヌクレオチ
ド配列を有する。
ヒトnestinエンハンサーは配列番号２に示すヌクレオチ
ド配列を有する。
【００２７】対象とする細胞を決定し、対象とする細胞
に特異的なプロモーターを選択したあと、プロモーター
の支配下で蛍光タンパク質、好ましくは緑色蛍光タンパ
ク質をコードする核酸を、選別する複数の細胞に導入す
る。
に特異的なプロモーターを選択したあと、プロモーター
の支配下で蛍光タンパク質、好ましくは緑色蛍光タンパ
ク質をコードする核酸を、選別する複数の細胞に導入す
る。
【００２８】緑色蛍光タンパク質をコードし、単離され
た核酸分子は、ゲノムあるいは組換えの、生物学的に単
離されたあるいは合成の、デオキシリボ核酸（DNA）あ
るいはリボ核酸（メッセンジャーRNA又はmRNAを含め
た、RNA）とすることができる。。DNA分子は、GFPをコ
ードするメッセンジャーRNA（mRNA）のDNAコピーであ
る、cDNA分子とすることができる。ひとつの実施態様で
は、GFPはAequorea victoria（米国特許第5,491,084
号）由来のもと使用することができる。Aequoria victo
riaのGFPをコードするプラスミドは、受諾番号75547と
してATCCから入手できる。pRSGFP-C1と命名されたこのG
FPの突然変異形態（赤色シフト突然変異体）は、Clonte
ch Laboratories,Inc.（Palo Alto,California）から市
販されている。
た核酸分子は、ゲノムあるいは組換えの、生物学的に単
離されたあるいは合成の、デオキシリボ核酸（DNA）あ
るいはリボ核酸（メッセンジャーRNA又はmRNAを含め
た、RNA）とすることができる。。DNA分子は、GFPをコ
ードするメッセンジャーRNA（mRNA）のDNAコピーであ
る、cDNA分子とすることができる。ひとつの実施態様で
は、GFPはAequorea victoria（米国特許第5,491,084
号）由来のもと使用することができる。Aequoria victo
riaのGFPをコードするプラスミドは、受諾番号75547と
してATCCから入手できる。pRSGFP-C1と命名されたこのG
FPの突然変異形態（赤色シフト突然変異体）は、Clonte
ch Laboratories,Inc.（Palo Alto,California）から市
販されている。
【００２９】現在、天然タンパク質よりも強く発光する
突然変異形態のGFPならびに高等脊椎動物において安定
な翻訳を生じることが可能なGFPが入手可能であり、同
目的のために使用できる。pTα1-GFPh（ATCC受諾番号98
229）と命名されたプラスミドは、ヒト化形態のGFPを含
む。実際には、蛍光形態のGFPをコードするどのような
核酸分子も本発明に従って使用できる。さらに、蛍光発
生基質が発蛍光団（flurorophone）に転換するのを触媒
しうる酵素をコードするどのような核酸分子も本発明に
従って使用できる。１つの例は、lacZの発現を推進する
ための細胞特異的プロモーターの使用であり、これには
蛍光発生基質FDG（フルオレセイン-β-D-ガラクトピラ
ノシド）あるいはCMFDG（クロロメチル-FDG）とのイン
キュベーションによるlacZ発現細胞の検出と選別を伴
う。
突然変異形態のGFPならびに高等脊椎動物において安定
な翻訳を生じることが可能なGFPが入手可能であり、同
目的のために使用できる。pTα1-GFPh（ATCC受諾番号98
229）と命名されたプラスミドは、ヒト化形態のGFPを含
む。実際には、蛍光形態のGFPをコードするどのような
核酸分子も本発明に従って使用できる。さらに、蛍光発
生基質が発蛍光団（flurorophone）に転換するのを触媒
しうる酵素をコードするどのような核酸分子も本発明に
従って使用できる。１つの例は、lacZの発現を推進する
ための細胞特異的プロモーターの使用であり、これには
蛍光発生基質FDG（フルオレセイン-β-D-ガラクトピラ
ノシド）あるいはCMFDG（クロロメチル-FDG）とのイン
キュベーションによるlacZ発現細胞の検出と選別を伴
う。
【００３０】次に標準的な手法を使用して、GFPをコー
ドする核酸分子を、選択した細胞特異的プロモーターの
支配下におく。一般に、これは制限酵素およびライゲー
ション（連結）の使用を含む（下記参照）。
ドする核酸分子を、選択した細胞特異的プロモーターの
支配下におく。一般に、これは制限酵素およびライゲー
ション（連結）の使用を含む（下記参照）。
【００３１】上記の操作により生じた構築物（コンスト
ラクト）は、選択したプロモーター（それ自体が核酸分
子である）の支配下でGFPをコードする核酸分子を（所
望する場合には他の適当な調節因子と共に）含み、選別
する複数の細胞にこの構築物を導入する。構築物の核酸
分子を複数の細胞に導入するためには、核酸分子を含む
発現ベクターを用いるなどの方法に用いることができ
る。次にこれらの発現ベクター（プラスミドやウイルス
など）を使用して、核酸分子を複数の細胞に導入するこ
とができる。
ラクト）は、選択したプロモーター（それ自体が核酸分
子である）の支配下でGFPをコードする核酸分子を（所
望する場合には他の適当な調節因子と共に）含み、選別
する複数の細胞にこの構築物を導入する。構築物の核酸
分子を複数の細胞に導入するためには、核酸分子を含む
発現ベクターを用いるなどの方法に用いることができ
る。次にこれらの発現ベクター（プラスミドやウイルス
など）を使用して、核酸分子を複数の細胞に導入するこ
とができる。
【００３２】核酸分子を宿主に導入するための様々な方
法が当該技術で知られている。これらは、以下の方法を
含む。1）微細なガラス針を通してDNAを細胞の核に直接
注入する、マイクロインジェクション。2）正に荷電し
た化学基（ジエチルアミノエチルについては、DEAE）が
結合されている不活性炭水化物ポリマー（デキストラ
ン）と共にDNAをインキュベーションする、デキストラ
ンインキュベーション。DNAは、その負に荷電したリン
酸基によってDEAE−デキストランに接着する。次にこれ
らの大きなDNA含有粒子が細胞の表面に付着し、エンド
サイトーシスとして知られる過程によってその中に取り
込まれると考えられる。DNAの一部は、細胞質での破壊
を免れて核へと逃れ、そこで細胞内の他の遺伝子と同様
にRNAへと転写されうる。3）細胞がリン酸カルシウムと
共に沈殿物の形態でDNAを効率的に取り込む、リン酸カ
ルシウム共沈。4）DNAを含む溶液に細胞を入れて、それ
らの膜に一過性に小孔を生じさせる短い電気パルスをか
ける、エレクトロポレーション。DNAは小孔を通って直
接細胞質に入り、DEAE−デキストラン法やリン酸カルシ
ウム法の場合に細胞が通過するエンドサイトーシス小胞
（これらの小胞の通過は時としてDNAを破壊したり、損
傷することがある）を回避する。5）DNAが人工的な脂質
小胞であるリポソームに組み込まれ、リポソームが細胞
膜と融合して、その内容物を直接細胞質内へと導入す
る、リポソームを介した形質転換。6）DNAを金粒子の表
面に吸着させ、発射装置を用いて高圧下で細胞内へと発
射する、バイオリスティック（biolistic）形質転換。
ならびに7）ウイルスベクターを使用して核酸分子を細
胞内に導入する、ウイルスを介した形質転換。ウイルス
の増殖はウイルスゲノムが細胞内に入り込む能力に依存
するので、ウイルスは形質転換のための効率的な手段と
なりうる。これらのウイルスには、レトロウイルスとレ
ンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、お
よびアデノ関連ウイルスが含まれる。
法が当該技術で知られている。これらは、以下の方法を
含む。1）微細なガラス針を通してDNAを細胞の核に直接
注入する、マイクロインジェクション。2）正に荷電し
た化学基（ジエチルアミノエチルについては、DEAE）が
結合されている不活性炭水化物ポリマー（デキストラ
ン）と共にDNAをインキュベーションする、デキストラ
ンインキュベーション。DNAは、その負に荷電したリン
酸基によってDEAE−デキストランに接着する。次にこれ
らの大きなDNA含有粒子が細胞の表面に付着し、エンド
サイトーシスとして知られる過程によってその中に取り
込まれると考えられる。DNAの一部は、細胞質での破壊
を免れて核へと逃れ、そこで細胞内の他の遺伝子と同様
にRNAへと転写されうる。3）細胞がリン酸カルシウムと
共に沈殿物の形態でDNAを効率的に取り込む、リン酸カ
ルシウム共沈。4）DNAを含む溶液に細胞を入れて、それ
らの膜に一過性に小孔を生じさせる短い電気パルスをか
ける、エレクトロポレーション。DNAは小孔を通って直
接細胞質に入り、DEAE−デキストラン法やリン酸カルシ
ウム法の場合に細胞が通過するエンドサイトーシス小胞
（これらの小胞の通過は時としてDNAを破壊したり、損
傷することがある）を回避する。5）DNAが人工的な脂質
小胞であるリポソームに組み込まれ、リポソームが細胞
膜と融合して、その内容物を直接細胞質内へと導入す
る、リポソームを介した形質転換。6）DNAを金粒子の表
面に吸着させ、発射装置を用いて高圧下で細胞内へと発
射する、バイオリスティック（biolistic）形質転換。
ならびに7）ウイルスベクターを使用して核酸分子を細
胞内に導入する、ウイルスを介した形質転換。ウイルス
の増殖はウイルスゲノムが細胞内に入り込む能力に依存
するので、ウイルスは形質転換のための効率的な手段と
なりうる。これらのウイルスには、レトロウイルスとレ
ンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、お
よびアデノ関連ウイルスが含まれる。
【００３３】上述したように、細胞を形質転換するこれ
らの方法のいくつかは、中間プラスミドベクターを使用
する必要がある。CohenとBoyerの米国特許第4,237,224
号は、制限酵素による開裂とDNAリガーゼによるライゲ
ーションを用いた、組換えプラスミドの形態による発現
系の作製を記載している。次にこれらの組換えプラスミ
ドを形質転換によって導入し、組織培養で増殖させた原
核生物および真核細胞を含めた単細胞培養において複製
させる。Sambrook et al.（1989）が記載するような当
該技術において既知の標準クローニング手法を用いて、
DNA配列をプラスミドベクターにクローニングする。
らの方法のいくつかは、中間プラスミドベクターを使用
する必要がある。CohenとBoyerの米国特許第4,237,224
号は、制限酵素による開裂とDNAリガーゼによるライゲ
ーションを用いた、組換えプラスミドの形態による発現
系の作製を記載している。次にこれらの組換えプラスミ
ドを形質転換によって導入し、組織培養で増殖させた原
核生物および真核細胞を含めた単細胞培養において複製
させる。Sambrook et al.（1989）が記載するような当
該技術において既知の標準クローニング手法を用いて、
DNA配列をプラスミドベクターにクローニングする。
【００３４】上述した方法のいずれかに従って、GFPを
コードする核酸分子を複数の細胞に導入する。しかし、
GFPの発現を支配するプロモーターは、対象とする細胞
型（すなわち多能性神経系前駆細胞）においてのみ機能
する。それ故、GFPは対象細胞型においてのみ発現され
る。GFPは蛍光タンパク質であるので、GFPの蛍光によっ
て複数の細胞の中から対象とする細胞を同定することが
できる。
コードする核酸分子を複数の細胞に導入する。しかし、
GFPの発現を支配するプロモーターは、対象とする細胞
型（すなわち多能性神経系前駆細胞）においてのみ機能
する。それ故、GFPは対象細胞型においてのみ発現され
る。GFPは蛍光タンパク質であるので、GFPの蛍光によっ
て複数の細胞の中から対象とする細胞を同定することが
できる。
【００３５】蛍光を発する細胞を検出する適当ないかな
る手段も使用できる。エピ蛍光光学系を用いて細胞を同
定し、物理的に採取して、Laser Tweezers（Cell Robot
icsInc., Albuquerque, New Mexico）によって収集する
ことができる。それらの細胞は、蛍光細胞を非蛍光細胞
から有効に分離する方法である、蛍光活性化セルソータ
ーによっておおまかに分離することができる（たとえば
Wang et al.,1998）。
る手段も使用できる。エピ蛍光光学系を用いて細胞を同
定し、物理的に採取して、Laser Tweezers（Cell Robot
icsInc., Albuquerque, New Mexico）によって収集する
ことができる。それらの細胞は、蛍光細胞を非蛍光細胞
から有効に分離する方法である、蛍光活性化セルソータ
ーによっておおまかに分離することができる（たとえば
Wang et al.,1998）。
【００３６】本発明の方法は、胎児および成体のげっ歯
動物およびヒト由来の胚および成体脳からの多能性神経
系前駆細胞の単離と濃縮を提供する。詳細には、musash
iプロモーターあるいはnestinエンハンサーによっても
たらされる緑色蛍光タンパク質でトランスフェクション
した成人脳室帯、成体海馬、および胎児ヒト脳室上皮細
胞の蛍光活性化細胞選別を提供する。特に、在胎齢14-2
3週の胎児からの組織標本を得た。いくつかの在胎齢に
わたる組織切片標本をmusashiおよびnestinタンパク質
に関して免疫染色した。musashiプロモーターの支配下
にhGFPを保持する△E1アデノウイルス（AdP/Musash
i）、あるいはnestin第２イントロンエンハンサーの調
節支配下に熱ショックタンパク質-68基本プロモーター
の3’側においたEGFPをコードするアデノウイルス（AdE
/Nestin）で脳室帯の解離物を形質導入した。トランス
フェクションの効率を高めるため、P/Musashi.hGFPおよ
びE/Nestin.EGFPの両者についてプラスミドの代わりに
アデノウイルスベクターを使用した。各々の選択構築
物、E/Nestin.EGFPおよびP/Musashi.hGFPの表現型特異
性をアデノウイルスならびにプラスミドにおいて確認し
た。GFPの発現後、GFP+細胞をFACSによって抽出した。
ネイティブで、予測的に同定して直接採集した、形質転
換していない多能性神経系前駆細胞は、自己複製し、in
vitroおよび被移植者の脳への移植時に、ニューロン、
星状細胞およびオリゴデンドロサイトを生じる。他の推
定上の神経幹細胞系と異なって、これらは、どちらも誘
導される神経およびグリア前駆細胞の表現型安定性およ
び機能的適格性を乱しうる、最初の表皮細胞成長因子に
よる増殖あるいは癌遺伝子による不死化を必要とせず
に、ヒト胎児脳室上皮から直接抽出されたものである。
動物およびヒト由来の胚および成体脳からの多能性神経
系前駆細胞の単離と濃縮を提供する。詳細には、musash
iプロモーターあるいはnestinエンハンサーによっても
たらされる緑色蛍光タンパク質でトランスフェクション
した成人脳室帯、成体海馬、および胎児ヒト脳室上皮細
胞の蛍光活性化細胞選別を提供する。特に、在胎齢14-2
3週の胎児からの組織標本を得た。いくつかの在胎齢に
わたる組織切片標本をmusashiおよびnestinタンパク質
に関して免疫染色した。musashiプロモーターの支配下
にhGFPを保持する△E1アデノウイルス（AdP/Musash
i）、あるいはnestin第２イントロンエンハンサーの調
節支配下に熱ショックタンパク質-68基本プロモーター
の3’側においたEGFPをコードするアデノウイルス（AdE
/Nestin）で脳室帯の解離物を形質導入した。トランス
フェクションの効率を高めるため、P/Musashi.hGFPおよ
びE/Nestin.EGFPの両者についてプラスミドの代わりに
アデノウイルスベクターを使用した。各々の選択構築
物、E/Nestin.EGFPおよびP/Musashi.hGFPの表現型特異
性をアデノウイルスならびにプラスミドにおいて確認し
た。GFPの発現後、GFP+細胞をFACSによって抽出した。
ネイティブで、予測的に同定して直接採集した、形質転
換していない多能性神経系前駆細胞は、自己複製し、in
vitroおよび被移植者の脳への移植時に、ニューロン、
星状細胞およびオリゴデンドロサイトを生じる。他の推
定上の神経幹細胞系と異なって、これらは、どちらも誘
導される神経およびグリア前駆細胞の表現型安定性およ
び機能的適格性を乱しうる、最初の表皮細胞成長因子に
よる増殖あるいは癌遺伝子による不死化を必要とせず
に、ヒト胎児脳室上皮から直接抽出されたものである。
【００３７】本発明の方法によって分離された細胞は、
前駆細胞および幹細胞の成長制御の基本的分析、ならび
にそれらの移植可能性と移植片特性の直接応用試験の両
方において使用しうる。同様に細胞は、損傷を受けた
脳、あるいは歪曲、損傷、あるいは離断を生じた脊髄な
どにおいて、損傷した中枢神経系の構造的修復を助ける
ために使用できる。
前駆細胞および幹細胞の成長制御の基本的分析、ならび
にそれらの移植可能性と移植片特性の直接応用試験の両
方において使用しうる。同様に細胞は、損傷を受けた
脳、あるいは歪曲、損傷、あるいは離断を生じた脊髄な
どにおいて、損傷した中枢神経系の構造的修復を助ける
ために使用できる。
【００３８】
【実施例】実施例１−材料および方法 ヒト胎児培養 前置胎盤、早期破裂（premature rupture）、音波検査
で明らかにされた孤立性の内臓あるいは心臓発生異常、
あるいは核型分析で同定されたトリソミー18又は21のい
ずれかのために典型的に実施される第二トリメスターの
治療的流産の際に、ヒト胎児脳を採取した。これらの脳
をCa/Mg不含のハンクス平衡塩類溶液（HBSS）にとり、
解剖して、最初に脳幹から終脳を分離し、次に非脳室実
質から終脳脳室上皮を分離した。終脳脳室帯をPIPES液
（NaCl 120mM、KCl 5mM、グルコース25mM、PIPES 20m
M）中で小片に切断し、次いで5%CO2中37℃で1時間穏や
かに振とうしながら、PIPES液中でパパイン（11.4ユニ
ット/mlパパイン、WorthingtonBiochemical Corporatio
n）およびDNアーゼI（10ユニット/ml、Sigma,St.Louis,
MI）によって消化した。インキュベーション後、IEC Ce
ntra-4B遠心分離機で5分間200gで遠心して組織を採集
し、DNアーゼI（10ユニット/ml）を含むDMEM/F12/N2に
再懸濁して、37℃/5%CO2で15分間インキュベーションし
た。試料を遠心し、ペレットをDMEM/F12/N2の2mlに再懸
濁して、その後3種類の順次細くしたガラス製パスツー
ルピペットを通して20、10および5回にわたって連続的
に摩砕することにより解離させた。解離した細胞は、40
μM Cell Strainer（Becton Dickinson）を通過させて
精製し、20%胎児ウシ血清FBS（Cocalico）を含むDMEM/F
12/N2で洗浄して、5%FBSを含むDMEM/F12/N2中に4×106
細胞/mlで再懸濁した。細胞を、マウスのラミニン（2μ
g/cm2、Gibco）で前被覆した35mm Flacon Primaria平板
に0.5ml/培養皿で塗布し、5%CO2中37℃でインキュベー
ションした。1日後、2%血小板枯渇FBS（PD-FBS）を含む
DMEM/F12/N2 0.5mlを付加的に各平板に加えた。一部の
培養物については、分裂過程の細胞を標識するため、30
μMブロモデオキシウリジン（BrdU;Luskin et al.,199
7）を培地に添加した。 E/nestin:EGFPおよびAdE/nestin:EGFPの構築 神経系前駆細胞を同定するために、nestinエンハンサー
（Zimmerman DEAE etal.,1994; GenBank受諾番号AF0043
34）の支配下においたEGFPを用いて、緑色蛍光タンパク
質発現ベクターを構築した。後者すなわち、ラットnest
in遺伝子の塩基1162と1798との間の637bp領域であるnes
tinエンハンサーは、ヒトとラットの間で進化的に保存
されており、遺伝子発現を中枢神経系の神経上皮前駆細
胞に標的するのに十分である（Lothian,1997）。nestin
エンハンサーを熱ショックタンパク質68（hsp68）（Ros
sant,1991）の最小プロモーターの上流に位置させ、E/n
estin:hsp68を生成した（Lothian,1997）。次に、文献
（Roy et al., 2000a）に従い、これをEGFPポリA（Clon
tech,Palo Alto,CA）に融合して、E/nestin:EGFPを作製
した。この導入遺伝子の神経上皮細胞特異的発現をトラ
ンスジェニックマウス試験によって確認した。 P/musashi:hGFPおよびAdP/musashi:GFPの構築 hGFPを駆動するマウスmusashiプロモーターを保持する
アデノウイルスベクターを構築した。シャトルベクター
pAdCMV-H（）SgD（Dr.Neil Hackett/Gene Therapy Core
Facility of Weill Medical Collegeの好意による）を
NotI平滑末端とXhoIで消化して、既存の直前のサイトメ
ガロウイルス（CMVie）プロモーターを取り除いた。次
いでBstXI/平滑末端とSalIを用いてpCMV-hGFPから発現
カセットCMVie-SD/SA-hGFP-ポリAを除去した。生じた発
現カセットをシャトルベクターにライゲーションした。
これをpAdCMV-hGFPと称し、このベクターにおいてはXba
IがCMVieに隣接した。pAdCMV-hGFPをXbaIで消化し、脱
リン酸化して、マウスmusashiプロモーターに相当する
4.5KbのXbaI-XbaI断片にライゲーションした。SacIIに
よってプロモーターの方向を決定し、プロモーターの
3’末端とhGFP内でそれぞれ１回切断した。その後、確
立された方法を用いて、E1A欠失5型アデノウイルスを含
むプラスミドpJ17を使用した相同的組換えにより、複製
欠損組換えアデノウイルスを構築した。pAdMsi-hGFPをp
JM17と共にHEK293細胞にコトランスフェクションし、2
週間でウイルスプラークが発現した。CsClでの二重遠心
分離を用いてウイルスを精製した。精製したウイルスの
力価は1011-1012pfu/mlであった。 トランスフェクション pE/nestin:EGFPおよびpE/nestin:lacZを含む、2つのE/n
estinを保持するプラスミドを使用した。カチオン性リ
ポソーム、Effectene（Qiagen, Germany）を使用して、
次のようにこれらのプラスミドを培養成体VZ/SVZ細胞に
トランスフェクションした。in vitroでの1日後に、5%F
BSを含むDMEM/F12/N2 1mlを各培養物に加えた。合計0.4
μgのプラスミドDNAをEffectene DNA-縮合緩衝液100μl
で希釈し、製造者の指示に従ってEnhancer 3.2μlと混
合した。次にリポソーム：DNA複合体を室温で５分間イ
ンキュベーションした。その後Effectene 10μlをDNA/E
nhancer溶液に加え、混合物を25℃で10分間インキュベ
ーションした。5%FBSを含むDMEM/F12/N2 0.6mlをこの溶
液に加え、混合して培養物に適用した。6時間のトラン
スフェクション後、細胞を採集して遠心分離した。生じ
たペレットを、5%FBSを含むDMEM/F12/N2に再懸濁し、ラ
ミニンで被覆した35mm Primaria平板に塗布した。GFP
は、トランスフェクションの2日以内に適切な標的細胞
により典型的に発現した。 フローサイトメトリーおよび選別 hGFP+細胞のフローサイトメトリーと選別をFACS Vantag
e（Becton-Dickinson）で実施した。細胞をCa++、Mg++
不含HBSSで2回洗浄し、その後37℃で5分間0.05%トリプ
シン-EDTAにより解離した。解離反応は、10%FBSを含むD
MEM/F12/N2により終結させた。細胞（2×106/ml）を光
前方および直角（側方）散乱により、またCoherent INN
OVA Enterprise II Ion Laser（488nm、100mW）のビー
ムを横切るときの、510±20nm帯域通過フィルターを介
したGFP蛍光により解析した。精製モードアルゴリズム
を用いて選別を行った。E/nestin:lacZトランスフェク
ション細胞を、バックグラウンド蛍光を決める対照とし
て用い、十分な収量を確保するように0.1-0.3%の偽陽性
率を設定した。E/nestin:EGFPを用いてトランスフェク
ションしたこれらの試料に関して、バックグラウンドよ
りも大きな蛍光を示すものとして検出した細胞を1000-3
000細胞／秒で選別した。選別したGFP+細胞を、ラミニ
ン被覆した24穴平板の5%FBSおよびBrdUを含むDMEM/F12/
N2に分注した。FACSの2日および7日後に、選別した培養
物を固定し、TuJ1/βIIIチューブリン、Hu、MAP2、O4、
あるいはGFAと共にBrdUに対して免疫染色した。 経子宮胎児異種移植 キメラ脳構築物に関する経子宮注入は、文献（Brustle
et al.,1998）に記載されている方法に従った。6匹の妊
娠雌性ラットをケタミンとキシラジンで麻酔し、腹膜を
切開して、羊膜を露出させ、呈示した。個々のラット胎
児を冷光ファイバーによって透視し、脳室の輪郭を視覚
的に描いた。次いで羊膜と頭蓋冠を通して30gの針を直
接脳室に挿入し、5×104細胞/μlを1μl注射として注入
した。すべての胚に注入したあと、羊膜を交換し、腹腔
と皮膚をそれぞれ2-0と3-0の絹糸で2層として閉じた。
雌性ラットが覚醒すれば飼料と水を自由に摂取させ、4-
5日後正常に同腹子を分娩させた。子は母親から自由に
摂食させ、生後17日又は35日目に過量のペントバルビタ
ールによって犠牲剖検した。冷PBS、次いで4%パラホル
ムアルデヒドによって子ラットを潅流固定し、その後Ha
cker低温槽で脳を前頭面で連続的な12μmの切片に切断
した。 免疫染色および画像化 in vitro 2、7あるいは14日間培養した後、培養物を免疫細胞化学
的解析のために固定した。これらを最初にHBSSで洗浄
し、その後室温で5分間4%パラホルムアルデヒドで固定
した。平板をβIIIチューブリン（MAb TuJ1、1:500;Dr.
A.Frankfurterの好意による）、Huタンパク質（Mab 16A
11、50μg/ml;Dr.H.Furneaux）、あるいはnestin（MAb
Rat-401、1:500;Developmental Studies Hybridoma Ban
k）のいずれかに関して染色した；これらはすべて神経
系細胞（nestin）あるいはニューロン（βIIIチューブ
リンおよびHuタンパク質）の抗原性発現のマーカーであ
る（Frederiksen,1988;Menezes,1994;Barami,1995）。
これまでに確立されているプロトコール（Kirschenbau
m,1994）を用いて、オリゴデンドロサイトに関する抗オ
リゴデンドロサイトO4 IgM（1:100;Boehringer Mannhei
m）あるいは抗星状細胞グリア原線維酸性タンパク質（G
FAP、クローンGA-5、1:100;Sigma,St.Louis,MI）のいずれか
で、付加的な平板をグリア細胞マーカーに関して染色し
た。付加の平板を14DIV後に固定し、より成熟したニュ
ーロンを検出するためにMAP-2タンパク質に関して染色
した（1:500、ウサギ抗MAP2;Dr.S.Halpain）。その後文
献（Wang,1988）に記載されているようにBrdUに関する
免疫細胞化学的分析を実施した。
で明らかにされた孤立性の内臓あるいは心臓発生異常、
あるいは核型分析で同定されたトリソミー18又は21のい
ずれかのために典型的に実施される第二トリメスターの
治療的流産の際に、ヒト胎児脳を採取した。これらの脳
をCa/Mg不含のハンクス平衡塩類溶液（HBSS）にとり、
解剖して、最初に脳幹から終脳を分離し、次に非脳室実
質から終脳脳室上皮を分離した。終脳脳室帯をPIPES液
（NaCl 120mM、KCl 5mM、グルコース25mM、PIPES 20m
M）中で小片に切断し、次いで5%CO2中37℃で1時間穏や
かに振とうしながら、PIPES液中でパパイン（11.4ユニ
ット/mlパパイン、WorthingtonBiochemical Corporatio
n）およびDNアーゼI（10ユニット/ml、Sigma,St.Louis,
MI）によって消化した。インキュベーション後、IEC Ce
ntra-4B遠心分離機で5分間200gで遠心して組織を採集
し、DNアーゼI（10ユニット/ml）を含むDMEM/F12/N2に
再懸濁して、37℃/5%CO2で15分間インキュベーションし
た。試料を遠心し、ペレットをDMEM/F12/N2の2mlに再懸
濁して、その後3種類の順次細くしたガラス製パスツー
ルピペットを通して20、10および5回にわたって連続的
に摩砕することにより解離させた。解離した細胞は、40
μM Cell Strainer（Becton Dickinson）を通過させて
精製し、20%胎児ウシ血清FBS（Cocalico）を含むDMEM/F
12/N2で洗浄して、5%FBSを含むDMEM/F12/N2中に4×106
細胞/mlで再懸濁した。細胞を、マウスのラミニン（2μ
g/cm2、Gibco）で前被覆した35mm Flacon Primaria平板
に0.5ml/培養皿で塗布し、5%CO2中37℃でインキュベー
ションした。1日後、2%血小板枯渇FBS（PD-FBS）を含む
DMEM/F12/N2 0.5mlを付加的に各平板に加えた。一部の
培養物については、分裂過程の細胞を標識するため、30
μMブロモデオキシウリジン（BrdU;Luskin et al.,199
7）を培地に添加した。 E/nestin:EGFPおよびAdE/nestin:EGFPの構築 神経系前駆細胞を同定するために、nestinエンハンサー
（Zimmerman DEAE etal.,1994; GenBank受諾番号AF0043
34）の支配下においたEGFPを用いて、緑色蛍光タンパク
質発現ベクターを構築した。後者すなわち、ラットnest
in遺伝子の塩基1162と1798との間の637bp領域であるnes
tinエンハンサーは、ヒトとラットの間で進化的に保存
されており、遺伝子発現を中枢神経系の神経上皮前駆細
胞に標的するのに十分である（Lothian,1997）。nestin
エンハンサーを熱ショックタンパク質68（hsp68）（Ros
sant,1991）の最小プロモーターの上流に位置させ、E/n
estin:hsp68を生成した（Lothian,1997）。次に、文献
（Roy et al., 2000a）に従い、これをEGFPポリA（Clon
tech,Palo Alto,CA）に融合して、E/nestin:EGFPを作製
した。この導入遺伝子の神経上皮細胞特異的発現をトラ
ンスジェニックマウス試験によって確認した。 P/musashi:hGFPおよびAdP/musashi:GFPの構築 hGFPを駆動するマウスmusashiプロモーターを保持する
アデノウイルスベクターを構築した。シャトルベクター
pAdCMV-H（）SgD（Dr.Neil Hackett/Gene Therapy Core
Facility of Weill Medical Collegeの好意による）を
NotI平滑末端とXhoIで消化して、既存の直前のサイトメ
ガロウイルス（CMVie）プロモーターを取り除いた。次
いでBstXI/平滑末端とSalIを用いてpCMV-hGFPから発現
カセットCMVie-SD/SA-hGFP-ポリAを除去した。生じた発
現カセットをシャトルベクターにライゲーションした。
これをpAdCMV-hGFPと称し、このベクターにおいてはXba
IがCMVieに隣接した。pAdCMV-hGFPをXbaIで消化し、脱
リン酸化して、マウスmusashiプロモーターに相当する
4.5KbのXbaI-XbaI断片にライゲーションした。SacIIに
よってプロモーターの方向を決定し、プロモーターの
3’末端とhGFP内でそれぞれ１回切断した。その後、確
立された方法を用いて、E1A欠失5型アデノウイルスを含
むプラスミドpJ17を使用した相同的組換えにより、複製
欠損組換えアデノウイルスを構築した。pAdMsi-hGFPをp
JM17と共にHEK293細胞にコトランスフェクションし、2
週間でウイルスプラークが発現した。CsClでの二重遠心
分離を用いてウイルスを精製した。精製したウイルスの
力価は1011-1012pfu/mlであった。 トランスフェクション pE/nestin:EGFPおよびpE/nestin:lacZを含む、2つのE/n
estinを保持するプラスミドを使用した。カチオン性リ
ポソーム、Effectene（Qiagen, Germany）を使用して、
次のようにこれらのプラスミドを培養成体VZ/SVZ細胞に
トランスフェクションした。in vitroでの1日後に、5%F
BSを含むDMEM/F12/N2 1mlを各培養物に加えた。合計0.4
μgのプラスミドDNAをEffectene DNA-縮合緩衝液100μl
で希釈し、製造者の指示に従ってEnhancer 3.2μlと混
合した。次にリポソーム：DNA複合体を室温で５分間イ
ンキュベーションした。その後Effectene 10μlをDNA/E
nhancer溶液に加え、混合物を25℃で10分間インキュベ
ーションした。5%FBSを含むDMEM/F12/N2 0.6mlをこの溶
液に加え、混合して培養物に適用した。6時間のトラン
スフェクション後、細胞を採集して遠心分離した。生じ
たペレットを、5%FBSを含むDMEM/F12/N2に再懸濁し、ラ
ミニンで被覆した35mm Primaria平板に塗布した。GFP
は、トランスフェクションの2日以内に適切な標的細胞
により典型的に発現した。 フローサイトメトリーおよび選別 hGFP+細胞のフローサイトメトリーと選別をFACS Vantag
e（Becton-Dickinson）で実施した。細胞をCa++、Mg++
不含HBSSで2回洗浄し、その後37℃で5分間0.05%トリプ
シン-EDTAにより解離した。解離反応は、10%FBSを含むD
MEM/F12/N2により終結させた。細胞（2×106/ml）を光
前方および直角（側方）散乱により、またCoherent INN
OVA Enterprise II Ion Laser（488nm、100mW）のビー
ムを横切るときの、510±20nm帯域通過フィルターを介
したGFP蛍光により解析した。精製モードアルゴリズム
を用いて選別を行った。E/nestin:lacZトランスフェク
ション細胞を、バックグラウンド蛍光を決める対照とし
て用い、十分な収量を確保するように0.1-0.3%の偽陽性
率を設定した。E/nestin:EGFPを用いてトランスフェク
ションしたこれらの試料に関して、バックグラウンドよ
りも大きな蛍光を示すものとして検出した細胞を1000-3
000細胞／秒で選別した。選別したGFP+細胞を、ラミニ
ン被覆した24穴平板の5%FBSおよびBrdUを含むDMEM/F12/
N2に分注した。FACSの2日および7日後に、選別した培養
物を固定し、TuJ1/βIIIチューブリン、Hu、MAP2、O4、
あるいはGFAと共にBrdUに対して免疫染色した。 経子宮胎児異種移植 キメラ脳構築物に関する経子宮注入は、文献（Brustle
et al.,1998）に記載されている方法に従った。6匹の妊
娠雌性ラットをケタミンとキシラジンで麻酔し、腹膜を
切開して、羊膜を露出させ、呈示した。個々のラット胎
児を冷光ファイバーによって透視し、脳室の輪郭を視覚
的に描いた。次いで羊膜と頭蓋冠を通して30gの針を直
接脳室に挿入し、5×104細胞/μlを1μl注射として注入
した。すべての胚に注入したあと、羊膜を交換し、腹腔
と皮膚をそれぞれ2-0と3-0の絹糸で2層として閉じた。
雌性ラットが覚醒すれば飼料と水を自由に摂取させ、4-
5日後正常に同腹子を分娩させた。子は母親から自由に
摂食させ、生後17日又は35日目に過量のペントバルビタ
ールによって犠牲剖検した。冷PBS、次いで4%パラホル
ムアルデヒドによって子ラットを潅流固定し、その後Ha
cker低温槽で脳を前頭面で連続的な12μmの切片に切断
した。 免疫染色および画像化 in vitro 2、7あるいは14日間培養した後、培養物を免疫細胞化学
的解析のために固定した。これらを最初にHBSSで洗浄
し、その後室温で5分間4%パラホルムアルデヒドで固定
した。平板をβIIIチューブリン（MAb TuJ1、1:500;Dr.
A.Frankfurterの好意による）、Huタンパク質（Mab 16A
11、50μg/ml;Dr.H.Furneaux）、あるいはnestin（MAb
Rat-401、1:500;Developmental Studies Hybridoma Ban
k）のいずれかに関して染色した；これらはすべて神経
系細胞（nestin）あるいはニューロン（βIIIチューブ
リンおよびHuタンパク質）の抗原性発現のマーカーであ
る（Frederiksen,1988;Menezes,1994;Barami,1995）。
これまでに確立されているプロトコール（Kirschenbau
m,1994）を用いて、オリゴデンドロサイトに関する抗オ
リゴデンドロサイトO4 IgM（1:100;Boehringer Mannhei
m）あるいは抗星状細胞グリア原線維酸性タンパク質（G
FAP、クローンGA-5、1:100;Sigma,St.Louis,MI）のいずれか
で、付加的な平板をグリア細胞マーカーに関して染色し
た。付加の平板を14DIV後に固定し、より成熟したニュ
ーロンを検出するためにMAP-2タンパク質に関して染色
した（1:500、ウサギ抗MAP2;Dr.S.Halpain）。その後文
献（Wang,1988）に記載されているようにBrdUに関する
免疫細胞化学的分析を実施した。
【００３９】in vivo 細胞を注入した子ラットをE17日又はP1日のいずれかに
犠牲剖検し、潅流固定して、生後14日又は21日目に脳を
切除した。0.1Mリン酸緩衝液（PB;pH7.4）中4%パラホル
ムアルデヒドを用いて固定を行い、固定の90分後にPB中
30%スクロースに液浸し、沈潜た。すべての脳を15μmの
冠状切断切片に切り分けた。その後一部を2N HCl中で1
時間変性し、ラット抗BrdU抗体を1:200で使用して（Har
lan）、またその後1:150のフルオレセイン複合抗ラット
IgG（Jackson Labs）により連続的に、BrdUに関して染
色した。他の切片は抗ヒト核タンパク質抗体（Chemico
n;1:100;Vescovi et al.,1999）で染色した。また別の
切片はその代わりに、ジゴキシゲニン標識Aluプローブ
を使用してヒトAluDNAに関するin situハイブリダイゼ
ーションに供し、その後記述されているようにビオチニ
ル化抗ジゴキシゲニンIgGおよびフルオレセイン複合ア
ビジンを用いて検出した。
犠牲剖検し、潅流固定して、生後14日又は21日目に脳を
切除した。0.1Mリン酸緩衝液（PB;pH7.4）中4%パラホル
ムアルデヒドを用いて固定を行い、固定の90分後にPB中
30%スクロースに液浸し、沈潜た。すべての脳を15μmの
冠状切断切片に切り分けた。その後一部を2N HCl中で1
時間変性し、ラット抗BrdU抗体を1:200で使用して（Har
lan）、またその後1:150のフルオレセイン複合抗ラット
IgG（Jackson Labs）により連続的に、BrdUに関して染
色した。他の切片は抗ヒト核タンパク質抗体（Chemico
n;1:100;Vescovi et al.,1999）で染色した。また別の
切片はその代わりに、ジゴキシゲニン標識Aluプローブ
を使用してヒトAluDNAに関するin situハイブリダイゼ
ーションに供し、その後記述されているようにビオチニ
ル化抗ジゴキシゲニンIgGおよびフルオレセイン複合ア
ビジンを用いて検出した。
【００４０】次に切片を洗浄し、ニューロンあるいはグ
リア細胞マーカーに関して染色した。ニューロンのマー
カーは、各々文献に記述されているように、モノクロー
ナル抗体TuJ1（Menezes and Luskin,1994;Roy et al.,2
000）（Dr.A.Frankfurterから贈られた）によって検出
されるβIII−チューブリン;NeuN（Eriksson et al.,19
98）（Chemicon）;あるいはHu（Marusich et al.,1994;
Barami et al.,1995）を含んだ。グリア細胞は、オリゴ
デンドロサイトCNPタンパク質（Roy et al.,1999）ある
いは星状細胞GFAPに対する抗体を用いて局在決定した。
すべての抗マウス二次抗体は、非特異的染色を避けるた
めラットIgGに前吸収させた。 共焦点画像化 βIII−チューブリン、NeuN、GFAPあるいはCNPのいずれ
かと共にbRDuあるいは抗ヒト核タンパク質に関して二重
染色した切片において、ヒトおよび細胞特異的マーカー
について共標識されていると思われるBrdU+単細胞を、
共焦点画像化によってさらに評価した。Zeiss LSM510共
焦点顕微鏡を用いて、アルゴン−クリプトンレーザーを
使用して赤色および緑色発光チャネルの両方で画像を得
た。次いで画像を一連の単一0.9μm光学切片として、な
らびにその取り込まれた画像として、層積（stacked）z
次元画像によって検討した。ニューロンあるいはグリア
細胞マーカーで二重標識したあらゆるBrdU+あるいはANA
+ヒト細胞が、垂直面と水平面の両方で直交して観察さ
れ、z次元再構築はすべての側面像で観察された。二重
標識されているとみなすためには、いずれの光学切片に
おいても、また各々の取り込まれた複合物においても、
すべての観察角度でニューロンあるいはグリア細胞免疫
反応性で取り巻かれたBrdUあるいはANA免疫反応性が中
心に存在することが必要であった。 レトロウイルスの調製およびEGFP標識化 NITレトロウイルス（T.Palmer and F.Gageの好意によ
る）を以前に述べられているように（Sakurada et al.,
1999）調製した。簡単に述べると、HEK293gag/pol細胞
を、LINXレトロウイルス（Hoshimaru et al.,1996）の
誘導体であるNIT.EGFPレトロウイルスを発現するように
安定に形質導入した。次に、ヒト細胞を高い効率で両向
性感染できるように、水疱性口内炎ウイルスコートタン
パク質（VSV-G）をコードするpMD.Gでこれらの細胞をト
ランスフェクションした。2日後にウイルス上清を採取
し、アリコートを使用時まで80℃で貯蔵した。レトロウ
イルス感染させた選別細胞を、FACSを実施した後の午前
中から合計12時間、ポリブレン（8μg/ml）の存在下で
ウイルス上清に暴露した。250μlの増加量のウイルス上
清を4時間ごとに3回連続的に、250μlの培地中の10,000
個の選別細胞から成る初期試料に加えた。合計12時間ウ
イルス上清中においたあと、各々の穴の細胞を新鮮培地
中で洗浄し、遠心分離して、新鮮24穴平板に10,000細胞
/300μl/穴で再び分注した。ウイルスに反復暴露するこ
のプロトコールを用いて、クローン分析に使用できる、
ウイルスによって形質導入した神経系前駆細胞の収量を
最大にした。 ヒト神経幹細胞の増殖と遺伝的標識化 AdE/nestin:EGFP+およびAdP/msi:hGFP+細胞をそれぞれF
ACSによって抽出した。その時点で、GFP+細胞を10,000/
穴で24穴平板に分配し、20ng/ml FGF2を補足した無血清
培地中で増殖させた。翌日、細胞をNIT.EGFPレトロウイ
ルス（上記参照）で感染させ、それによって選別細胞を
EGFPを発現するように安定に形質導入した。4週間後、
レトロウイルスNIT.EGFPに暴露しなかった選別培養物は
nestinおよびmusashiがもたらすGFPの発現をすべて喪失
したため、アデノウイルス関連GFPの発現は検出不能の
レベルに低下した。その後一部の選別培養物をGFP発現
に基づいて再選別し、レトロウイルスGFP標識神経幹細
胞の特異的抽出を行った。他の平板にはネオマイシンを
補足し、これはレトロウイルス構築物中の選択性neo耐
性遺伝子によってレトロウイルスで形質導入された系統
のために選択した。各々の方法は、in vitroで6週間目
にGFP+の均一な培養物を生じた。in vitroでしばしば早
くも2週間目にこれらの培養物中にスフェアを認め、6週
間目にこれらのスフェアを2-3スフェア／穴で24穴平板
内の新しい穴に移した。次いでこれらのスフェアを新た
に2週間生育させ、その後弱トリプシン処理によって解
離し、新しい穴に接種した。これらの細胞をさらに2週
間保持し、その時点で、最初に解離した一次スフェア由
来の単一細胞の多くから二次細胞が生じたことが認めら
れた。FGFを含む懸濁培養物中での分裂能を有するスフ
ェアの展開、それに続くスフェアの穏やかな解離、解離
した細胞の継代、およびスフェアの再生と再展開を伴う
再平板培養というこの手順を、その後１ヵ月に１回の間
隔で繰り返した。神経幹細胞のアリコートを、実験的移
植およびそれらの分化した子孫の表現型解析のために概
ね2週間に１回の間隔で採取した。それによって安定なG
FP標識AdE/nestinおよびAdP/musashiによって規定され
る神経幹細胞を８ヵ月間にわたって継続的に増殖させ
た；前脳と脊髄の両方から、そして各々第二トリメスタ
ーにわたるいくつかの異なる在胎齢から、別個の系統を
確立した。 実施例２−musashiおよびnestinタンパク質の発現は胎
児ヒト脳室帯内の異なるが重複する領域を特徴付ける 妊娠中期のいくつかの段階でのnestinおよびmusashiタ
ンパク質に関する免疫染色は、これらの初期神経タンパ
ク質が胎児ヒト終脳壁内の異なるが重複する領域を占め
ることを明らかにした。発生の第二トリメスターの12-2
1週にわたる在胎齢で、musashiタンパク質は、密に充填
された脳室感覚上皮内で遍在的に発現され、発生期の脳
室下帯内での発現率は低く、中間帯および皮質実質では
実質的に全く発現されない（図２Ａ−Ｅ）。nestinの発
現も同様に脳室帯内で認められ、そこでは多くの二重標
識細胞を認めた。しかしながら、脳室帯内でのnestin+
細胞の密度はmusashi+細胞の密度よりも著明に低く、多
くのmusashi+VZ細胞が検出可能なnestinを発現しなかっ
た。これに対し、脳室下帯内では多くのnestin+細胞がm
usashiを発現しないことが認められた。中間帯では、ne
stin+放射誘導細胞の密な列を認め、それらはmusashiを
発現しなかったが、しばしばmusashiおよびnestin+の移
動細胞が認められた。
リア細胞マーカーに関して染色した。ニューロンのマー
カーは、各々文献に記述されているように、モノクロー
ナル抗体TuJ1（Menezes and Luskin,1994;Roy et al.,2
000）（Dr.A.Frankfurterから贈られた）によって検出
されるβIII−チューブリン;NeuN（Eriksson et al.,19
98）（Chemicon）;あるいはHu（Marusich et al.,1994;
Barami et al.,1995）を含んだ。グリア細胞は、オリゴ
デンドロサイトCNPタンパク質（Roy et al.,1999）ある
いは星状細胞GFAPに対する抗体を用いて局在決定した。
すべての抗マウス二次抗体は、非特異的染色を避けるた
めラットIgGに前吸収させた。 共焦点画像化 βIII−チューブリン、NeuN、GFAPあるいはCNPのいずれ
かと共にbRDuあるいは抗ヒト核タンパク質に関して二重
染色した切片において、ヒトおよび細胞特異的マーカー
について共標識されていると思われるBrdU+単細胞を、
共焦点画像化によってさらに評価した。Zeiss LSM510共
焦点顕微鏡を用いて、アルゴン−クリプトンレーザーを
使用して赤色および緑色発光チャネルの両方で画像を得
た。次いで画像を一連の単一0.9μm光学切片として、な
らびにその取り込まれた画像として、層積（stacked）z
次元画像によって検討した。ニューロンあるいはグリア
細胞マーカーで二重標識したあらゆるBrdU+あるいはANA
+ヒト細胞が、垂直面と水平面の両方で直交して観察さ
れ、z次元再構築はすべての側面像で観察された。二重
標識されているとみなすためには、いずれの光学切片に
おいても、また各々の取り込まれた複合物においても、
すべての観察角度でニューロンあるいはグリア細胞免疫
反応性で取り巻かれたBrdUあるいはANA免疫反応性が中
心に存在することが必要であった。 レトロウイルスの調製およびEGFP標識化 NITレトロウイルス（T.Palmer and F.Gageの好意によ
る）を以前に述べられているように（Sakurada et al.,
1999）調製した。簡単に述べると、HEK293gag/pol細胞
を、LINXレトロウイルス（Hoshimaru et al.,1996）の
誘導体であるNIT.EGFPレトロウイルスを発現するように
安定に形質導入した。次に、ヒト細胞を高い効率で両向
性感染できるように、水疱性口内炎ウイルスコートタン
パク質（VSV-G）をコードするpMD.Gでこれらの細胞をト
ランスフェクションした。2日後にウイルス上清を採取
し、アリコートを使用時まで80℃で貯蔵した。レトロウ
イルス感染させた選別細胞を、FACSを実施した後の午前
中から合計12時間、ポリブレン（8μg/ml）の存在下で
ウイルス上清に暴露した。250μlの増加量のウイルス上
清を4時間ごとに3回連続的に、250μlの培地中の10,000
個の選別細胞から成る初期試料に加えた。合計12時間ウ
イルス上清中においたあと、各々の穴の細胞を新鮮培地
中で洗浄し、遠心分離して、新鮮24穴平板に10,000細胞
/300μl/穴で再び分注した。ウイルスに反復暴露するこ
のプロトコールを用いて、クローン分析に使用できる、
ウイルスによって形質導入した神経系前駆細胞の収量を
最大にした。 ヒト神経幹細胞の増殖と遺伝的標識化 AdE/nestin:EGFP+およびAdP/msi:hGFP+細胞をそれぞれF
ACSによって抽出した。その時点で、GFP+細胞を10,000/
穴で24穴平板に分配し、20ng/ml FGF2を補足した無血清
培地中で増殖させた。翌日、細胞をNIT.EGFPレトロウイ
ルス（上記参照）で感染させ、それによって選別細胞を
EGFPを発現するように安定に形質導入した。4週間後、
レトロウイルスNIT.EGFPに暴露しなかった選別培養物は
nestinおよびmusashiがもたらすGFPの発現をすべて喪失
したため、アデノウイルス関連GFPの発現は検出不能の
レベルに低下した。その後一部の選別培養物をGFP発現
に基づいて再選別し、レトロウイルスGFP標識神経幹細
胞の特異的抽出を行った。他の平板にはネオマイシンを
補足し、これはレトロウイルス構築物中の選択性neo耐
性遺伝子によってレトロウイルスで形質導入された系統
のために選択した。各々の方法は、in vitroで6週間目
にGFP+の均一な培養物を生じた。in vitroでしばしば早
くも2週間目にこれらの培養物中にスフェアを認め、6週
間目にこれらのスフェアを2-3スフェア／穴で24穴平板
内の新しい穴に移した。次いでこれらのスフェアを新た
に2週間生育させ、その後弱トリプシン処理によって解
離し、新しい穴に接種した。これらの細胞をさらに2週
間保持し、その時点で、最初に解離した一次スフェア由
来の単一細胞の多くから二次細胞が生じたことが認めら
れた。FGFを含む懸濁培養物中での分裂能を有するスフ
ェアの展開、それに続くスフェアの穏やかな解離、解離
した細胞の継代、およびスフェアの再生と再展開を伴う
再平板培養というこの手順を、その後１ヵ月に１回の間
隔で繰り返した。神経幹細胞のアリコートを、実験的移
植およびそれらの分化した子孫の表現型解析のために概
ね2週間に１回の間隔で採取した。それによって安定なG
FP標識AdE/nestinおよびAdP/musashiによって規定され
る神経幹細胞を８ヵ月間にわたって継続的に増殖させ
た；前脳と脊髄の両方から、そして各々第二トリメスタ
ーにわたるいくつかの異なる在胎齢から、別個の系統を
確立した。 実施例２−musashiおよびnestinタンパク質の発現は胎
児ヒト脳室帯内の異なるが重複する領域を特徴付ける 妊娠中期のいくつかの段階でのnestinおよびmusashiタ
ンパク質に関する免疫染色は、これらの初期神経タンパ
ク質が胎児ヒト終脳壁内の異なるが重複する領域を占め
ることを明らかにした。発生の第二トリメスターの12-2
1週にわたる在胎齢で、musashiタンパク質は、密に充填
された脳室感覚上皮内で遍在的に発現され、発生期の脳
室下帯内での発現率は低く、中間帯および皮質実質では
実質的に全く発現されない（図２Ａ−Ｅ）。nestinの発
現も同様に脳室帯内で認められ、そこでは多くの二重標
識細胞を認めた。しかしながら、脳室帯内でのnestin+
細胞の密度はmusashi+細胞の密度よりも著明に低く、多
くのmusashi+VZ細胞が検出可能なnestinを発現しなかっ
た。これに対し、脳室下帯内では多くのnestin+細胞がm
usashiを発現しないことが認められた。中間帯では、ne
stin+放射誘導細胞の密な列を認め、それらはmusashiを
発現しなかったが、しばしばmusashiおよびnestin+の移
動細胞が認められた。
【００４１】二重免疫染色した14週の吻側終脳脳室帯の
高倍率共焦点顕微鏡を用いて、musashiタンパク質を発
現する脳室帯細胞の72%がnestinタンパク質を共発現す
ることを認めた。これに対し、21週では、musashi発現
細胞の93%がnestinを共発現した。従って、吻側終脳脳
室帯内でのmusashi+/nestin-細胞の発現率は、妊娠発生
の14週から21週までの間に27%から5%に低下した。IR細
胞。
高倍率共焦点顕微鏡を用いて、musashiタンパク質を発
現する脳室帯細胞の72%がnestinタンパク質を共発現す
ることを認めた。これに対し、21週では、musashi発現
細胞の93%がnestinを共発現した。従って、吻側終脳脳
室帯内でのmusashi+/nestin-細胞の発現率は、妊娠発生
の14週から21週までの間に27%から5%に低下した。IR細
胞。
【００４２】従って、大きな割合のVZ細胞が両方のタン
パク質を発現したことから、musashiおよびnestin免疫
反応性細胞の間にはかなりの度合の重複が認められた。
しかし興味深いことに、かかる所見はまた、脳室感覚上
皮内にmusashi+/nestin−表現型が存在することを示唆
している。脳室感覚上皮の腔付近表面でのその相対的発
生率により、このmusashi+/nestin-表現型は、nestinに
よって規定されるものよりも個体発生的に早期の細胞集
団を構成すると考えられる（図２Ａ−Ｅ）。 実施例３−nestinエンハンサーはin vitroでGFPの発現
を神経系前駆細胞を標的した。
パク質を発現したことから、musashiおよびnestin免疫
反応性細胞の間にはかなりの度合の重複が認められた。
しかし興味深いことに、かかる所見はまた、脳室感覚上
皮内にmusashi+/nestin−表現型が存在することを示唆
している。脳室感覚上皮の腔付近表面でのその相対的発
生率により、このmusashi+/nestin-表現型は、nestinに
よって規定されるものよりも個体発生的に早期の細胞集
団を構成すると考えられる（図２Ａ−Ｅ）。 実施例３−nestinエンハンサーはin vitroでGFPの発現
を神経系前駆細胞を標的した。
【００４３】nestinおよびmusashi調節要素が転写的に
活性である、生存する神経系前駆細胞を標識するため
に、在胎齢14-23週にわたる胎児脳室帯標本由来の細胞
を、nestinエンハンサー（E/nestin:EGFP）あるいはmus
ashiプロモーター（P/musashi:hGFP）のいずれかの調節
制御下でEGFPを保持するアデノウイルスに感染させた
（図９Ａ−Ｄ）。このために、切開した脳室壁のパパイ
ン解離物を25名の胎児から得た；これらは、在胎齢14-1
9週が9名、在胎齢20-23週が16名であった。次にこれら
の解離物を、20ng/ml FGF2を補足したDMEM/F12/N2中の
懸濁培養物として調製した;一部については2%PD-FBSも
補足した。
活性である、生存する神経系前駆細胞を標識するため
に、在胎齢14-23週にわたる胎児脳室帯標本由来の細胞
を、nestinエンハンサー（E/nestin:EGFP）あるいはmus
ashiプロモーター（P/musashi:hGFP）のいずれかの調節
制御下でEGFPを保持するアデノウイルスに感染させた
（図９Ａ−Ｄ）。このために、切開した脳室壁のパパイ
ン解離物を25名の胎児から得た；これらは、在胎齢14-1
9週が9名、在胎齢20-23週が16名であった。次にこれら
の解離物を、20ng/ml FGF2を補足したDMEM/F12/N2中の
懸濁培養物として調製した;一部については2%PD-FBSも
補足した。
【００４４】E/nestin:EGFP選択カセットをこれらの脳
室帯細胞に導入しうる効率を改善し、トランスフェクシ
ョン産物中の導入遺伝子のコピー数を増加するために、
E/nestin:EGFPを保持するアデノウイルスを構築した。
このAdE/nestin：EGFPウイルスを用いて、ヒト胎児脳室
帯懸濁培養物をin vitroでの初日に1-25moiの範囲にわ
たって感染させた。感染の4日以内に、扁平細胞の比較
的初期の集団においてnestinがもたらすGFP発現を認め
た。これらのE/nestin:EGFP+細胞の中で、98.9±1.2%が
nestinタンパク質を発現した。61.6±7.6%がBrdUを取り
込み、in vitroでのそれらの有糸分裂能を示唆した。し
かし、3.1±0.6%だけがβIII−チューブリン免疫反応性
を発現し、8.9±1.6%が星状細胞GFAPを発現した（図３
Ａ−Ｆ）。従って、nestinエンハンサーは、胎児ヒト脳
室帯の混合解離物中の、有糸分裂上活性な細胞の比較的
未分化な集団に対してGFPの発現を指令した。 実施例４−musashiプロモーターは神経系前駆細胞の重
複する集団にGFPの発現を標的する げっ歯動物（Sakakibara et al.,1997）およびヒト脳室
帯（Pincus et al.,1998）の両者において、運命付けら
れていない前駆細胞によってmusashiが強く且つ比較的
選択的に発現されることから、musashiプロモーターの
支配下に置いたGFP導入遺伝子は、nestinエンハンサー
がもたらすGFPのように、神経系前駆細胞を特異的に認
識するであろうと推論された。そのために、ヒトmusash
iプロモーターに対する4.6kbプロモーターをhGFPに連結
し、それによってP/musashi:hGFP選択カセットを確立し
た。次にP/musashi:hGFP選択カセットを保持する5型△E
1アデノウイルスを構築し、これをAdP/msi:hGFPと称し
た。このベクターを使用すると、ヒト脳室帯細胞の培養
物における形質導入効率は、P/musashi：GFPプラスミド
DNAでトランスフェクションした培養物に比べて実質的
に上昇し（データは示さず）、このウイルスを使用した
10-25cfu/細胞の範囲で細胞の生存度への明らかな影響
を伴わないことを認めた。AdP/musashi：GFPで選別され
た細胞においてはβIII−チューブリン+ニューロンを認
めなかったが、96.1±2.0%がnestinタンパク質を発現し
た（図４Ａ−Ｆ）。AdP/musashi：GFP+細胞の93.3±3.4
%がBrdUを取り込み、in vitroでのそれらの永続的な分
裂を示した。
室帯細胞に導入しうる効率を改善し、トランスフェクシ
ョン産物中の導入遺伝子のコピー数を増加するために、
E/nestin:EGFPを保持するアデノウイルスを構築した。
このAdE/nestin：EGFPウイルスを用いて、ヒト胎児脳室
帯懸濁培養物をin vitroでの初日に1-25moiの範囲にわ
たって感染させた。感染の4日以内に、扁平細胞の比較
的初期の集団においてnestinがもたらすGFP発現を認め
た。これらのE/nestin:EGFP+細胞の中で、98.9±1.2%が
nestinタンパク質を発現した。61.6±7.6%がBrdUを取り
込み、in vitroでのそれらの有糸分裂能を示唆した。し
かし、3.1±0.6%だけがβIII−チューブリン免疫反応性
を発現し、8.9±1.6%が星状細胞GFAPを発現した（図３
Ａ−Ｆ）。従って、nestinエンハンサーは、胎児ヒト脳
室帯の混合解離物中の、有糸分裂上活性な細胞の比較的
未分化な集団に対してGFPの発現を指令した。 実施例４−musashiプロモーターは神経系前駆細胞の重
複する集団にGFPの発現を標的する げっ歯動物（Sakakibara et al.,1997）およびヒト脳室
帯（Pincus et al.,1998）の両者において、運命付けら
れていない前駆細胞によってmusashiが強く且つ比較的
選択的に発現されることから、musashiプロモーターの
支配下に置いたGFP導入遺伝子は、nestinエンハンサー
がもたらすGFPのように、神経系前駆細胞を特異的に認
識するであろうと推論された。そのために、ヒトmusash
iプロモーターに対する4.6kbプロモーターをhGFPに連結
し、それによってP/musashi:hGFP選択カセットを確立し
た。次にP/musashi:hGFP選択カセットを保持する5型△E
1アデノウイルスを構築し、これをAdP/msi:hGFPと称し
た。このベクターを使用すると、ヒト脳室帯細胞の培養
物における形質導入効率は、P/musashi：GFPプラスミド
DNAでトランスフェクションした培養物に比べて実質的
に上昇し（データは示さず）、このウイルスを使用した
10-25cfu/細胞の範囲で細胞の生存度への明らかな影響
を伴わないことを認めた。AdP/musashi：GFPで選別され
た細胞においてはβIII−チューブリン+ニューロンを認
めなかったが、96.1±2.0%がnestinタンパク質を発現し
た（図４Ａ−Ｆ）。AdP/musashi：GFP+細胞の93.3±3.4
%がBrdUを取り込み、in vitroでのそれらの永続的な分
裂を示した。
【００４５】従って、AdE/nestin：EGFPおよびAdP/musa
shi:hGFPウイルスはいずれも、それらが取り込んだプロ
モーターがもたらすGFPの表現型発現パターンを保持し
ていた；どちらも運命付けられていない前駆細胞によっ
て発現されたが、より分化したニューロンによっては発
現されなかった。合わせて考えると、これらのデータ
は、nestinエンハンサーおよびmusashiプロモーターの
調節制御下でGFPを保持するアデノウイルスは、ニュー
ロンへと運命付けられる前に、神経系前駆細胞を特異的
且つ選択的に同定するために使用しうることを示唆して
いる。 実施例５−nestinおよびmusashiが駆動するGFP発現に基
づくFACSはヒト神経系前駆細胞の単離と選択を可能にす
る 胎児VZ/SVZをAdE/nestin：EGFPおよびAdP/musashi:hGFP
で感染させたあと、それらの神経系前駆細胞と娘細胞を
FACSによって単離し、抽出した（図１）。細胞型特異的
に精製することを意図した高ストリンジェンシーのFACS
判定基準により（Wang,1998）、17-19週の在胎齢の脳室
帯から調製した細胞の10.6±2.6%（平均±SE;n=3選別）
が、nestinが推進するGFPを発現することが認められ
た。20-23週の脳室帯由来の解離物中のAdE/nestin：EGF
P+細胞の割合に関して、7.4±1.5%への小さいが統計的
に有意の低下（n=11選別）を認めた（post hoc Bonefer
roni t検定に関する1方向ANOVAによりp<0.05）。同じ選
別基準（sort acceptance criteria）を使用して、非蛍
光AdCMV:lacZに感染した細胞の0.05%だけが同様に認識
された。
shi:hGFPウイルスはいずれも、それらが取り込んだプロ
モーターがもたらすGFPの表現型発現パターンを保持し
ていた；どちらも運命付けられていない前駆細胞によっ
て発現されたが、より分化したニューロンによっては発
現されなかった。合わせて考えると、これらのデータ
は、nestinエンハンサーおよびmusashiプロモーターの
調節制御下でGFPを保持するアデノウイルスは、ニュー
ロンへと運命付けられる前に、神経系前駆細胞を特異的
且つ選択的に同定するために使用しうることを示唆して
いる。 実施例５−nestinおよびmusashiが駆動するGFP発現に基
づくFACSはヒト神経系前駆細胞の単離と選択を可能にす
る 胎児VZ/SVZをAdE/nestin：EGFPおよびAdP/musashi:hGFP
で感染させたあと、それらの神経系前駆細胞と娘細胞を
FACSによって単離し、抽出した（図１）。細胞型特異的
に精製することを意図した高ストリンジェンシーのFACS
判定基準により（Wang,1998）、17-19週の在胎齢の脳室
帯から調製した細胞の10.6±2.6%（平均±SE;n=3選別）
が、nestinが推進するGFPを発現することが認められ
た。20-23週の脳室帯由来の解離物中のAdE/nestin：EGF
P+細胞の割合に関して、7.4±1.5%への小さいが統計的
に有意の低下（n=11選別）を認めた（post hoc Bonefer
roni t検定に関する1方向ANOVAによりp<0.05）。同じ選
別基準（sort acceptance criteria）を使用して、非蛍
光AdCMV:lacZに感染した細胞の0.05%だけが同様に認識
された。
【００４６】AdP/musashi:hGFPが規定するVZ細胞の発現
頻度は、17-19週（2.4±0.6%;n=6種類）および20-23週
（3.2±0.4%;n=11）の両方で、E/nestinが規定する細胞
の頻度よりも一貫して低かった。前方および側方散乱終
点を用いて、AdE/nestinとAdP/musashiが規定する前駆
細胞は大部分が重複するプールを構成すると思われた
（図５Ａ−Ｄ）。
頻度は、17-19週（2.4±0.6%;n=6種類）および20-23週
（3.2±0.4%;n=11）の両方で、E/nestinが規定する細胞
の頻度よりも一貫して低かった。前方および側方散乱終
点を用いて、AdE/nestinとAdP/musashiが規定する前駆
細胞は大部分が重複するプールを構成すると思われた
（図５Ａ−Ｄ）。
【００４７】E/nestin:EGFPで選別された実質的にすべ
ての細胞が、FACSの直後にnestinタンパク質を発現し
た；83.7±7.7%（n=3選別細胞）が無血清培地において1
週間後にnestinタンパク質を発現した。初期ニューロン
タンパク質HuおよびTuJ1/βIII-チューブリンを発現す
る細胞は、E/nestinｇ：EGFPに基づくFACS後1週間目で
も、これらの培養物中でほとんど検出されなかった。し
かし興味深いことに、36.3±8.2%（n=3）だけが2%PD-FB
S中でnestinタンパク質を発現し、血清関連成熟因子に
暴露するとE/ｎｅｔｉｎ：EGFP+細胞が速やかに分化す
ることを示唆した。従って、PD-FBS中で増殖した選別前
駆細胞の大半は、FACS後1週間以内にβIII−チューブリ
ン+ニューロンおよびGFAP+グリア細胞として成熟した
（図６Ａ−Ｂ）。 実施例６−E/nestin:EGFPおよびP/musashiで同定した細
胞は有糸分裂能を有し且つ多能性であった これらの細胞がin vitroでどのような系譜をたどるかを
調べるため、集団に基づく方法と単一細胞のクローンに
よる方法を、各々独立して、およびレトロウイルス系統
分析と同時に平行して用いた。最初に、ニューロスフェ
アが出現するように、精製したE/nestin:EGFPおよびP/m
usashi:hGFPで選別された細胞の低密度培養物を調製し
た。このあと、これらのスフェアを解離し、それらの子
孫を二次スフェアとして制限的希釈増殖を行って、それ
らのクローナルに関連する成分を平板培養し、免疫標識
したあと表現型分類した。さらに、一次スフェア中の単
一のE/nestinおよびP/musashiで選別された細胞をレト
ロウイルスで標識し、続いて再解離して、さらに二次ス
フェアとしてクローナルに展開することを伴うこれらの
標識細胞の分散は、クローナルに関連する娘細胞の抗原
表現型を確立することを可能にした。このアプローチ
は、各々レトロウイルスGFPで標識した単一のE/nestin
およびP/musashi選別細胞に由来するクローナルな個々
の二次および三次スフェアが、実際にニューロンおよび
グリア娘細胞の両方を発生させることを明らかにした
（図７および８Ａ−Ｈ）。従って、E/nestin:EGFPおよ
びP/musashi:hGFPの両方で選別された細胞はin vitroで
分裂を続け、各々の表現型が個々にニューロンとグリア
細胞の両方を生じた。 実施例７−E/nestin：GFPおよびP/musashi：GFPの両方
で選別された前駆細胞はニューロスフェアを生じた AdP/Msi:hGFPおよびE/nestin:EGFPの両方で選別された
細胞の制限希釈分析も実施し、選別されたGFP+細胞を懸
濁培養で増殖させた。これらの選別細胞を、ニューロス
フェア懸濁培養に関する確立されたプロトコール（Grit
ti,1996,Vescovi,1999）に従って、最初に10ng/mlのFGF
2を補足したDMEM/F12/N2の無血清基礎培地で増殖させ
た。2週間後に、単クローン性の増殖をするための適切
な条件下で生育させた二次スフェアの調製を行った。単
一の凝集塊を24穴平板の個々の穴にとり、次いで静かに
解離して、それらのE/nestin:EGFP+陽性の子孫細胞を30
0μl/穴として低密度（1000細胞/ml）で24穴平板に塗布
した。さらに、一部の細胞を10/mlで、1.4%メチルセル
ロースを補足した基礎培地を含む35mm平板に分配した。
このより粘稠な試料は、非常に低い平板培養密度と共
に、潜在的にクローンでない近隣細胞間での凝集の可能
性を低下させながら、単一細胞のクローン性の増殖を可
能にした。各々の場合に、培地内での単細胞の初期分散
を各々の平板の高性能位相差顕微鏡検査によって確認
し、解離していない凝集物をマイクロピペットで取り除
いた。拡大しているクラスターの位置にマークを記し、
これらの手順をその後毎日実施して、自己拡大と単一ク
ラスターの共誘導を確保した。
ての細胞が、FACSの直後にnestinタンパク質を発現し
た；83.7±7.7%（n=3選別細胞）が無血清培地において1
週間後にnestinタンパク質を発現した。初期ニューロン
タンパク質HuおよびTuJ1/βIII-チューブリンを発現す
る細胞は、E/nestinｇ：EGFPに基づくFACS後1週間目で
も、これらの培養物中でほとんど検出されなかった。し
かし興味深いことに、36.3±8.2%（n=3）だけが2%PD-FB
S中でnestinタンパク質を発現し、血清関連成熟因子に
暴露するとE/ｎｅｔｉｎ：EGFP+細胞が速やかに分化す
ることを示唆した。従って、PD-FBS中で増殖した選別前
駆細胞の大半は、FACS後1週間以内にβIII−チューブリ
ン+ニューロンおよびGFAP+グリア細胞として成熟した
（図６Ａ−Ｂ）。 実施例６−E/nestin:EGFPおよびP/musashiで同定した細
胞は有糸分裂能を有し且つ多能性であった これらの細胞がin vitroでどのような系譜をたどるかを
調べるため、集団に基づく方法と単一細胞のクローンに
よる方法を、各々独立して、およびレトロウイルス系統
分析と同時に平行して用いた。最初に、ニューロスフェ
アが出現するように、精製したE/nestin:EGFPおよびP/m
usashi:hGFPで選別された細胞の低密度培養物を調製し
た。このあと、これらのスフェアを解離し、それらの子
孫を二次スフェアとして制限的希釈増殖を行って、それ
らのクローナルに関連する成分を平板培養し、免疫標識
したあと表現型分類した。さらに、一次スフェア中の単
一のE/nestinおよびP/musashiで選別された細胞をレト
ロウイルスで標識し、続いて再解離して、さらに二次ス
フェアとしてクローナルに展開することを伴うこれらの
標識細胞の分散は、クローナルに関連する娘細胞の抗原
表現型を確立することを可能にした。このアプローチ
は、各々レトロウイルスGFPで標識した単一のE/nestin
およびP/musashi選別細胞に由来するクローナルな個々
の二次および三次スフェアが、実際にニューロンおよび
グリア娘細胞の両方を発生させることを明らかにした
（図７および８Ａ−Ｈ）。従って、E/nestin:EGFPおよ
びP/musashi:hGFPの両方で選別された細胞はin vitroで
分裂を続け、各々の表現型が個々にニューロンとグリア
細胞の両方を生じた。 実施例７−E/nestin：GFPおよびP/musashi：GFPの両方
で選別された前駆細胞はニューロスフェアを生じた AdP/Msi:hGFPおよびE/nestin:EGFPの両方で選別された
細胞の制限希釈分析も実施し、選別されたGFP+細胞を懸
濁培養で増殖させた。これらの選別細胞を、ニューロス
フェア懸濁培養に関する確立されたプロトコール（Grit
ti,1996,Vescovi,1999）に従って、最初に10ng/mlのFGF
2を補足したDMEM/F12/N2の無血清基礎培地で増殖させ
た。2週間後に、単クローン性の増殖をするための適切
な条件下で生育させた二次スフェアの調製を行った。単
一の凝集塊を24穴平板の個々の穴にとり、次いで静かに
解離して、それらのE/nestin:EGFP+陽性の子孫細胞を30
0μl/穴として低密度（1000細胞/ml）で24穴平板に塗布
した。さらに、一部の細胞を10/mlで、1.4%メチルセル
ロースを補足した基礎培地を含む35mm平板に分配した。
このより粘稠な試料は、非常に低い平板培養密度と共
に、潜在的にクローンでない近隣細胞間での凝集の可能
性を低下させながら、単一細胞のクローン性の増殖を可
能にした。各々の場合に、培地内での単細胞の初期分散
を各々の平板の高性能位相差顕微鏡検査によって確認
し、解離していない凝集物をマイクロピペットで取り除
いた。拡大しているクラスターの位置にマークを記し、
これらの手順をその後毎日実施して、自己拡大と単一ク
ラスターの共誘導を確保した。
【００４８】在胎齢20-22週の4名の胎児由来の前脳脳室
帯標本において、AdP/msi:hGFPで選別された細胞につい
ては平均13.4±1.0スフェア/穴を認め、AdE/nestin：EGFPで
選別された細胞については11.5±1.2スフェア/穴を認めた
（図８Ａ−Ｈ）。核穴内でスフェアを生じる細胞の相対
的割合は在胎齢と平板培養の密度に依存し、在胎齢が早
く、また培養密度が高ければ、不相応に高い割合のスフ
ェア生成クローンを生じた（データは示さず）。従っ
て、このアプローチはE/nestinあるいはP/musashiによ
り選別された細胞集団における幹細胞の発生率を推定す
る根拠としては使用できないと考えられる。実際に、容
易に取り扱うことができ、その後単一スフェアの解離か
ら得た細胞を確実にクローン誘導できるように、およそ
10クローン／穴を達成するため、1,000選別細胞／穴密
度になるように初期の細胞を置くことを維持した。初期
脳室神経上皮においてnestinおよびmusashi発現細胞が
支配的であること、そしてそれらがしばしば多能性であ
り、分裂指数が高いことを考慮すると、P/musashiおよ
びE/nestinで選別されたプール内にスフェア生成細胞が
少ないことは、単クローン性に増殖しうる幹細胞が、選
別された標本の中では細胞増殖を続けている多能性神経
系前駆細胞の少数部分にすぎないであろうことを証拠づ
けるものである。 実施例８−レトロウイルスの系統分析はE/nestin：GFP
およびP/musashi：GFPで選別された前駆細胞の多能性を
確認した レトロウイルスの系統分析は、E/nestin：GFPおよびP/m
usashi：GFPで選別された個々の細胞が、それぞれニュ
ーロンとグリア細胞の両方の系統を生じることを確認し
た。選別細胞の両集団を、FACSの直後に構成性RSVプロ
モーターの支配下にEGFPをコードするVSV偽表現型両向
性ベクターで感染させた。FACS後数週間にわたって、E/
nestinおよびP/musashiで選別された細胞は、それらの
子孫が多様化し、nestinとmusashiの両方の転写が低下
したため、さらにエピソーム導入遺伝子が下方調節され
たかあるいは放棄されたため、典型的にGFP発現を喪失
した。これに対し、レトロウイルスで標識した細胞とそ
れらの子孫は、高いレベルのGFP発現を保持した；E/nes
tin:EGFPに基づく選別後1週間以内で、レトロウイルス
標識細胞は標識していない細胞から容易に識別すること
ができた。E/nestin：GFPで選別された細胞を10-20病原
体／穴の比較的低い密度で感染させることにより、FACS
後数週間にわたって単一細胞のクローン由来の子孫を追
跡することができた。
帯標本において、AdP/msi:hGFPで選別された細胞につい
ては平均13.4±1.0スフェア/穴を認め、AdE/nestin：EGFPで
選別された細胞については11.5±1.2スフェア/穴を認めた
（図８Ａ−Ｈ）。核穴内でスフェアを生じる細胞の相対
的割合は在胎齢と平板培養の密度に依存し、在胎齢が早
く、また培養密度が高ければ、不相応に高い割合のスフ
ェア生成クローンを生じた（データは示さず）。従っ
て、このアプローチはE/nestinあるいはP/musashiによ
り選別された細胞集団における幹細胞の発生率を推定す
る根拠としては使用できないと考えられる。実際に、容
易に取り扱うことができ、その後単一スフェアの解離か
ら得た細胞を確実にクローン誘導できるように、およそ
10クローン／穴を達成するため、1,000選別細胞／穴密
度になるように初期の細胞を置くことを維持した。初期
脳室神経上皮においてnestinおよびmusashi発現細胞が
支配的であること、そしてそれらがしばしば多能性であ
り、分裂指数が高いことを考慮すると、P/musashiおよ
びE/nestinで選別されたプール内にスフェア生成細胞が
少ないことは、単クローン性に増殖しうる幹細胞が、選
別された標本の中では細胞増殖を続けている多能性神経
系前駆細胞の少数部分にすぎないであろうことを証拠づ
けるものである。 実施例８−レトロウイルスの系統分析はE/nestin：GFP
およびP/musashi：GFPで選別された前駆細胞の多能性を
確認した レトロウイルスの系統分析は、E/nestin：GFPおよびP/m
usashi：GFPで選別された個々の細胞が、それぞれニュ
ーロンとグリア細胞の両方の系統を生じることを確認し
た。選別細胞の両集団を、FACSの直後に構成性RSVプロ
モーターの支配下にEGFPをコードするVSV偽表現型両向
性ベクターで感染させた。FACS後数週間にわたって、E/
nestinおよびP/musashiで選別された細胞は、それらの
子孫が多様化し、nestinとmusashiの両方の転写が低下
したため、さらにエピソーム導入遺伝子が下方調節され
たかあるいは放棄されたため、典型的にGFP発現を喪失
した。これに対し、レトロウイルスで標識した細胞とそ
れらの子孫は、高いレベルのGFP発現を保持した；E/nes
tin:EGFPに基づく選別後1週間以内で、レトロウイルス
標識細胞は標識していない細胞から容易に識別すること
ができた。E/nestin：GFPで選別された細胞を10-20病原
体／穴の比較的低い密度で感染させることにより、FACS
後数週間にわたって単一細胞のクローン由来の子孫を追
跡することができた。
【００４９】レトロウイルスで標識したクローン後代の
展開後、個々のスフェアを解離し、それらの成分をラミ
ニン基質に移して、そこに10%PD-FBSと20ng/ml BDNFを
補足した基礎培地を加えた。これらの分化促進条件下
で、細胞をさらに1-2週間付着させ、成熟させた。次に
細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、ニューロン
（TuJ1）、星状細胞（GFAP）あるいはオリゴデンドロサ
イト（O4）抗原のいずれかについて免疫染色した。この
方法を用いて、E/nestinおよびP/musashiで選別された
個々の細胞がそれぞれニューロンとグリア細胞を発生さ
せる能力を有することが認められた。 実施例９−E/nestin：GFPおよびP/musashi：GFPの両方
で選別された前駆細胞は胎児および新生ラット脳への異
種移植時にすべての神経表現型を発生させることができ
た E/nestin:EGFPが規定する細胞の、脳実質内の環境にお
ける分化指令に対する応答性を評価するため、以前に報
告された手法（Brustle et al.,1998）を応用して、胎
児VZ細胞をE17ラット前脳脳室に異種移植した。簡単に
述べると、E17妊娠雌性ラットを麻酔して開腹し、胎盤
嚢を通して各々の胎児の前脳と脳室腔が直接見えるよう
に子宮を透視した。平均で1×105のE/nestin:EGFP-FACS
により選別した胎児ヒトVZ細胞を各々の胚の側脳室腔に
注入し、母ラットを縫合して、4-5日後に出産させた。3
週間後、子ラットを犠牲剖検し、脳を固定して、12μm
クロスタット切片として切り分けた。次いでそれらの切
片を抗ヒト核抗原に関して免疫標識し、移植したヒト胎
児細胞、そして神経ニューロンマーカーβIII−チュー
ブリン、およびオリゴデンドロサイトマーカー環状ヌク
レオチドホスホジエステラーゼ（CNP）又は星状細胞マ
ーカーGFAPの発現を同定した。
展開後、個々のスフェアを解離し、それらの成分をラミ
ニン基質に移して、そこに10%PD-FBSと20ng/ml BDNFを
補足した基礎培地を加えた。これらの分化促進条件下
で、細胞をさらに1-2週間付着させ、成熟させた。次に
細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、ニューロン
（TuJ1）、星状細胞（GFAP）あるいはオリゴデンドロサ
イト（O4）抗原のいずれかについて免疫染色した。この
方法を用いて、E/nestinおよびP/musashiで選別された
個々の細胞がそれぞれニューロンとグリア細胞を発生さ
せる能力を有することが認められた。 実施例９−E/nestin：GFPおよびP/musashi：GFPの両方
で選別された前駆細胞は胎児および新生ラット脳への異
種移植時にすべての神経表現型を発生させることができ
た E/nestin:EGFPが規定する細胞の、脳実質内の環境にお
ける分化指令に対する応答性を評価するため、以前に報
告された手法（Brustle et al.,1998）を応用して、胎
児VZ細胞をE17ラット前脳脳室に異種移植した。簡単に
述べると、E17妊娠雌性ラットを麻酔して開腹し、胎盤
嚢を通して各々の胎児の前脳と脳室腔が直接見えるよう
に子宮を透視した。平均で1×105のE/nestin:EGFP-FACS
により選別した胎児ヒトVZ細胞を各々の胚の側脳室腔に
注入し、母ラットを縫合して、4-5日後に出産させた。3
週間後、子ラットを犠牲剖検し、脳を固定して、12μm
クロスタット切片として切り分けた。次いでそれらの切
片を抗ヒト核抗原に関して免疫標識し、移植したヒト胎
児細胞、そして神経ニューロンマーカーβIII−チュー
ブリン、およびオリゴデンドロサイトマーカー環状ヌク
レオチドホスホジエステラーゼ（CNP）又は星状細胞マ
ーカーGFAPの発現を同定した。
【００５０】ヒト由来の細胞は移植した子ラットにおい
て豊富に存在し、そのままで容易に同定されることを認
めた。実際に、胎児ラット前脳に異種移植したとき、ヒ
トE/nestin:EGFP+細胞の大部分がニューロンとして組織
内に組み込まれており、キメラヒト−ラット新皮質の形
成をもたらした。E17の異種移植の時点―主として脳室
神経上皮による皮質神経発生を特徴とする期間―で、大
部分のヒト細胞が皮質板に移動しており、グリア細胞で
はなくニューロンとして分化していることが認められた
（図１０Ａ−Ｆ）。
て豊富に存在し、そのままで容易に同定されることを認
めた。実際に、胎児ラット前脳に異種移植したとき、ヒ
トE/nestin:EGFP+細胞の大部分がニューロンとして組織
内に組み込まれており、キメラヒト−ラット新皮質の形
成をもたらした。E17の異種移植の時点―主として脳室
神経上皮による皮質神経発生を特徴とする期間―で、大
部分のヒト細胞が皮質板に移動しており、グリア細胞で
はなくニューロンとして分化していることが認められた
（図１０Ａ−Ｆ）。
【００５１】これに対し、P１新生児宿主に脳室内注入
として異種移植したときには、大部分のヒト細胞が皮質
下部にだけ入り、ほとんどがそこでグリア細胞として分
化することが認められた。皮質下部の白質内では、28日
齢で評価したとき、GFAPによって規定したヒトオリゴデ
ンドロサイトと星状細胞の両方が豊富に存在することが
認められたのに対し（（図１０Ａ−Ｆ）、ヒトニューロ
ンはほとんど認められず、吻側の終脳、側脳室側からの
嗅球にかけての移動流および嗅球においてのみ存在し
た。
として異種移植したときには、大部分のヒト細胞が皮質
下部にだけ入り、ほとんどがそこでグリア細胞として分
化することが認められた。皮質下部の白質内では、28日
齢で評価したとき、GFAPによって規定したヒトオリゴデ
ンドロサイトと星状細胞の両方が豊富に存在することが
認められたのに対し（（図１０Ａ−Ｆ）、ヒトニューロ
ンはほとんど認められず、吻側の終脳、側脳室側からの
嗅球にかけての移動流および嗅球においてのみ存在し
た。
【００５２】実施例１０−胎児ヒト前脳からの多能性神
経系前駆細胞の予測的同定と表現型特異的精製 ヒト神経系前駆細胞はこれまでに流産胎児の第一トリメ
スター終脳脳室から採取され、増殖されている（Fricke
r,1999）。これらの細胞は、ニューロスフェアの培養物
において生育させ（Svendsen,1997,Fricker,1999,Vesco
vi,1999）、不死化することができ（Flax,1998）、神経
系前駆細胞集団のin vitroでの増殖を可能にする。それ
にもかかわらず、第一トリメスターの脳の小さな組織標
本中の細胞数が比較的少ないことは、神経幹あるいは前
駆細胞の特異的選択を欠くことと合わせて、このアプロ
ーチを通して分離しうるネイティブな前駆細胞の数を制
限してきた。その結果、これらの細胞を移植に必要な数
まで増殖するためには、しばしば核型異常や発育制御の
混乱を導く、絶え間ない分裂刺激条件下での長期的な展
開、あるいは形質転換能のあるオンコジーン（Flax,199
8）による明白な不死化が必要であった。上述したよう
に、プロモーターに基づくGFP選択を用いて、多能性前
駆細胞の特異的選択、獲得および精製を高い収率で達成
した。これらの細胞は、明らかに自己再生的に分裂し、
培養条件下でニューロンとグリア細胞の両方を生じ、神
経幹細胞に関する基本的基準を満たした。プロモーター
に基づく選択を、神経系前駆細胞の特に豊富なソースで
ある第二トリメスターVZと組み合わせることにより、長
期的な増殖と不死化の必要性が回避された。
経系前駆細胞の予測的同定と表現型特異的精製 ヒト神経系前駆細胞はこれまでに流産胎児の第一トリメ
スター終脳脳室から採取され、増殖されている（Fricke
r,1999）。これらの細胞は、ニューロスフェアの培養物
において生育させ（Svendsen,1997,Fricker,1999,Vesco
vi,1999）、不死化することができ（Flax,1998）、神経
系前駆細胞集団のin vitroでの増殖を可能にする。それ
にもかかわらず、第一トリメスターの脳の小さな組織標
本中の細胞数が比較的少ないことは、神経幹あるいは前
駆細胞の特異的選択を欠くことと合わせて、このアプロ
ーチを通して分離しうるネイティブな前駆細胞の数を制
限してきた。その結果、これらの細胞を移植に必要な数
まで増殖するためには、しばしば核型異常や発育制御の
混乱を導く、絶え間ない分裂刺激条件下での長期的な展
開、あるいは形質転換能のあるオンコジーン（Flax,199
8）による明白な不死化が必要であった。上述したよう
に、プロモーターに基づくGFP選択を用いて、多能性前
駆細胞の特異的選択、獲得および精製を高い収率で達成
した。これらの細胞は、明らかに自己再生的に分裂し、
培養条件下でニューロンとグリア細胞の両方を生じ、神
経幹細胞に関する基本的基準を満たした。プロモーター
に基づく選択を、神経系前駆細胞の特に豊富なソースで
ある第二トリメスターVZと組み合わせることにより、長
期的な増殖と不死化の必要性が回避された。
【００５３】従って、プロモーターがもたらすGFPに基
づく分離方法を用いた、胎児ヒト前脳からの多能性神経
系前駆細胞の予測的同定と表現型特異的精製を報告す
る。nestinエンハンサーの調節制御下においた、hGFPを
コードするプラスミドベクターをヒト脳室帯の解離物へ
とトランスフェクションすることにより、別個の前駆細
胞型を選択した。これらの細胞は有糸分裂能力を有し、
同時に、試験条件下ではニューロン発生に偏っていた
が、多能性であった。これらの細胞は、FACSに供するこ
とにより、高い収率と比例する純度で濃縮された。E/ne
stin:EGFPで選別された実質的にすべての細胞が、分離
の時点で初期神経あるいはニューロン表現型マーカーの
いずれかを発現し、さらにin vitroでBrdUを取り込ん
だ。胎児ラット前脳に異種移植したとき、生じたキメラ
脳において大部分の細胞がニューロンとして脳組織に組
み込まれていた。in vitroで、細胞は培養条件下で多能
性を保持しており、単一細胞がニューロン、星状細胞、
そして頻度は低いがオリゴデンドロサイトを生じた。こ
れらの細胞はFGF２を含む無血清培地で増殖させること
ができ、in vitroで10週間後に、ニューロンを生じる有
糸分裂細胞を培地から回収することができた。従って、
第二トリメスターの胎児ヒト前脳脳室帯から、分裂能を
有する神経系前駆細胞を特異的に同定し、単離して、そ
のまま濃縮することが可能である。これらの細胞は、実
質的な精製後そのまま増殖させることができ、それらの
親創始細胞の最初の採取から数ヵ月間にわたって、in v
ivoならびにin vitroでニューロンを発生させる能力を
持つ。
づく分離方法を用いた、胎児ヒト前脳からの多能性神経
系前駆細胞の予測的同定と表現型特異的精製を報告す
る。nestinエンハンサーの調節制御下においた、hGFPを
コードするプラスミドベクターをヒト脳室帯の解離物へ
とトランスフェクションすることにより、別個の前駆細
胞型を選択した。これらの細胞は有糸分裂能力を有し、
同時に、試験条件下ではニューロン発生に偏っていた
が、多能性であった。これらの細胞は、FACSに供するこ
とにより、高い収率と比例する純度で濃縮された。E/ne
stin:EGFPで選別された実質的にすべての細胞が、分離
の時点で初期神経あるいはニューロン表現型マーカーの
いずれかを発現し、さらにin vitroでBrdUを取り込ん
だ。胎児ラット前脳に異種移植したとき、生じたキメラ
脳において大部分の細胞がニューロンとして脳組織に組
み込まれていた。in vitroで、細胞は培養条件下で多能
性を保持しており、単一細胞がニューロン、星状細胞、
そして頻度は低いがオリゴデンドロサイトを生じた。こ
れらの細胞はFGF２を含む無血清培地で増殖させること
ができ、in vitroで10週間後に、ニューロンを生じる有
糸分裂細胞を培地から回収することができた。従って、
第二トリメスターの胎児ヒト前脳脳室帯から、分裂能を
有する神経系前駆細胞を特異的に同定し、単離して、そ
のまま濃縮することが可能である。これらの細胞は、実
質的な精製後そのまま増殖させることができ、それらの
親創始細胞の最初の採取から数ヵ月間にわたって、in v
ivoならびにin vitroでニューロンを発生させる能力を
持つ。
【００５４】本文中で好ましい実施態様を詳細に示し、
説明したが、様々な修正、追加、置き換え等が本発明の
精神から逸脱することなく行いうること、従ってそれら
は下記の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲内と
みなされることは、当業者には明白であろう。 参考文献 下記は、本出願において引用した参考文献のリストであ
る。これらの引用はすべて参照してここに組み込まれ
る。 Barami, K., et al., J Neurobiol 28:82-101 (1995). Brustle, O., et al., Nature Biotech 16:1040-1044
(1998). Eriksson et al., Nature Med 4:1313-1317 (1998). Flax, J., et al., Nature Biotech 16:1033-1039 (199
8). Frederiksen, K., et al., J Neurosci 8: 1144-51 (19
88). Fricker, R., et al., J Neurosci 19:5990-6005 (199
9). Gage, F., et al., Ann Rev Neurosci 18:159192 (1995
a). Gage, F., et al., Proc Natl Acad Sci USA 92:118791
1883 (1995b). Goldman and Luskin, Trends in Neurosci. 21(3): 107
-14 (1998). Goldman, J. Neurobiol. 36: 267-86 (1998). Goldman, et al., J. Neurobiol. 30(4): 505-20 (199
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217223 (1992). Goldman, S., and Nottebohm, F., Proc Natl Acad Sci
USA 80:23902394 (1983). Gritti, A., et al., J Neurosci 16:1091-1100 (199
6). Heim, R., and Tsien, R., Current biology 6:178183
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633661 (1995). Kirschenbaum, B., et al., Cerebral Cortex 4:576589
(1994). Kirschenbaum, B., and Goldman, S., Soc Neurosci Ab
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ci USA 90:2074-2077 (1993). Lothian C., et al., Eur J Neurosci 9:452-462 (199
7). Luskin, et al., Molec. & Cell. Neurosci. 8:351-66
(1997). Marusich, M., et al., J Neurobiol 25:143155 (199
4). Menezes, et al., J.Neurosci. 14(9):5399-416 (199
4). Morshead, C., et al., Neuron 13:10711082 (1994). Palmer, T., et al., Mol Cell Neurosci 6:474486 (19
95). Pincus, et al., Neurosurgery 42:858-68 (1998a). Pincus, et al., Ann Neurol. 43:576-85 (1998b). Reynolds, B., and Weiss, S., Science 255:17071710
(1992). Richards, L., et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:85
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000a). Roy, N., et al., Nature Medicine 6:271-277 (2000
b). Sakakibara, S., et al., Developmental Biology 176:
230-242 (1996). Sakakibara, S., et al., J Neurosci 17:8300-8312 (1
997). Sakurada et al., Development 126:4017-4026 (1999). Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Sturrock, R., Adv Cell Neurobiol, vol.3, Academic
Press, New York, p. 133 (1982). Svendsen, C., et al., Exp Neurol 148:135-146 (199
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説明したが、様々な修正、追加、置き換え等が本発明の
精神から逸脱することなく行いうること、従ってそれら
は下記の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲内と
みなされることは、当業者には明白であろう。 参考文献 下記は、本出願において引用した参考文献のリストであ
る。これらの引用はすべて参照してここに組み込まれ
る。 Barami, K., et al., J Neurobiol 28:82-101 (1995). Brustle, O., et al., Nature Biotech 16:1040-1044
(1998). Eriksson et al., Nature Med 4:1313-1317 (1998). Flax, J., et al., Nature Biotech 16:1033-1039 (199
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【００５５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation and Cornell Research Foundation Inc. <120> A method for isolating and purifying multipotential neural proge nitor cells and multipotential neural progenitor cells <130> NP01001-YS <140> JP2000-5307 <141> 2000-01-05 <160> 2 <210> 1 <211> 52216 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gatccgcccg cctcagcctc ccaaagtgct gggattacag gcatgagtca cggctcccag 60 tagtttattt tttgagacag agtctcactg tgttgcccag gctggagagc agtggcagat 120 cttggctcac tgcaacctcc gcctcccagg ttcaagcaat tctcctgtct cagcatcccg 180 agtagctggg attacaggca cccgccacca tgcccggcca agttttgtat ttttagtaga 240 gatgaggttt cactatgttg gccaggctgg tctcaaactc ctgacctcag gtgatgcacc 300 cacctcagcc tcccaaagtg ctgggattac aggcaggaac caccgcacct ggcttctttt 360 ctttttaatt aagctttatt ggccaggcat ggtggctcat gcctgtaatc ctagcacttt 420 gggaggccaa ggcaggagga ttgcttgagc ccgggaggtc aagatcagcc tgggcaacat 480 agtgagaccc acgtctctac aaaaaataca aaagttagcc aggcatggtg gtgcacacct 540 gtagtctcag ctactcggaa ggtggaggca ggaggatcac aggagctcag gaggtcaatg 600 ctgaataagc catgattgcg tcactgcact ccagcctgga caacagagtg agaccctgtc 660 tttttttttt tttttttttt ttgagacgga gtctcgctct gttgccgagg cttgagtgca 720 gtggcgcgat ctcggctcac tgcaagctcc gccttccggg ttcacaccat tctcctgcct 780 cagcctcccg agtagctggg actacaggcg cccgccacca cgcctgacta attttgtttt 840 tgtattttta gtagagatgg ggtttcaccg tgttagccag gatggtctcc atctcctgac 900 cttgggatcc gcccacctca gtctcccaaa gtactgggat tacaggcgtg agccaccatg 960 cccagccgag accctgtctt aataaacaaa caagcaaaca aaaactttat tttttggagc 1020 agttttaggt tcacagcaat attaagcaga aggtacagag atttcctata tatctctctc 1080 ctctccagac acaggcacag cttcccccat tatcaacgta ccctacatga gtggtgtttt 1140 gtttgtttgt ttgtttttga ggcagagttc tgctcctgtt gcccaggctg gagtgcagtg 1200 gcgtgatctc ggctcaccgc aacctccgac tcccgggttt aagcgcttct cctgcctcag 1260 cctcacaagt agctgggact acaggcacgt gccaccacac tcagctaatt tttatatttt 1320 ttcttttttt gttttttgag acagagtttc gctcttgtct cccaggctag agtgcaacgg 1380 tgcgatctca gctccctgaa acctctgcct cccaggttca agcaattctc ctgcctcagc 1440 ctcccgagta gctgggatta caggcacttg aacttctgac ctcaggtgat ccacctgcct 1500 cgacctccta aagtgctggg attatacgca tgagccaccg cgcccagcct gtatttttag 1560 tagagacaga gtttcaccat tttggccagg atggtctcta tcttctgacc tcatgatccg 1620 ccctccttgg cctctcagag tgttgggatt acaggcgtga gccaccgcac ccagcttgta 1680 tttttagtag agacggggtt tcaccatttt ggccaggatg gtctctatct tctgatgtca 1740 tgatgcgccc gcctcggcct ctcaaaatgt tgggattaca ggcgtgagcc accgcgccca 1800 gctatggctc actcttgatg ctgcacattc tgtgggtttg gacagatgta taatgatatg 1860 taccaactaa ctttttggag tctttccaaa gcattcaact gcattcatag aaacatccgt 1920 cttcttttcc gactcatatt ttatcagttt gtcctatata attataagat ttaattacaa 1980 gagtaactga tggccgggcg cagcggctca tgcctgtaat cccagcgctt tgggaggccg 2040 aggcaggcag attacttgaa gtcaggagtt cgagaccagc ctggccaaca tggtgaaaca 2100 ttgtctctac taaaaataca aaaattagcc aggcatggtg gtatgtgccc gtaatcccag 2160 ctactccgga ggctgaggca caagaatcgc ttgaagctgg gaggtgaagg ttgcagtgag 2220 ccgagattat gccactgtac tccacccttg gcaacggagt gagactccgt ctcaaaaaaa 2280 ggagtaactg atgggagaac caacccccct gactcttgat aaccacatgg tcacatcttc 2340 actcaacagg agttagtggc ttgtcacact agaaatgaac ccaccagctg ctgtgggcct 2400 cacattgttc tagattttat agcaggcaaa gcgagcattt gttaagctag tgagccaatt 2460 ccagggattt tttttttttt ttttttggta gagacggggt cttgccaagt tgcccaggct 2520 gcttctgaac tcttggcctc aagcaatcct cctaccttgg cctctcaagt cgctgggatt 2580 acaggaatga gccaccacgt ctggcctccc atgaattttt aatccagtga gttggtttat 2640 ccagaaagct ttccctatac aaccataaac aaaaagtata acaaaaagtg atctcactgg 2700 agtaattgaa gtgaccaggg ttgattctgt cctttttact catttatatt ttccagcttt 2760 ttgtaccttt aatgtagatg aaagttggga tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt ttgaagactt 2820 aattaagact atagggtcat atatgcctag ggctgaatga actatactag acttcaaatt 2880 ccttgaatcg agcgtattgt aaaaggctgg acttgacata acatgcctaa ttgggataat 2940 gacagtggaa aaatcttggt attaggccat gtttctcaaa gtgtgcccca ggactggcag 3000 cagcaacatc gcctgggaac ttgctagaaa tgtaaattct tgggagccgc cccagaactg 3060 ctgcatcaga tactttggga tggggttcag aaatctgtgt ttgaacaagc cctccaaagg 3120 attctggtgt tccctcaaat taacagatgg ctcacctcac aggtttacca ctcagaggct 3180 gtgtgatctc agacaagtca ctgcacctct ctgaacctat ttcttctctg ataagaataa 3240 tagcagacct accttacaga atgattgtga aggttaaatt aaataatatg tgtaggcaca 3300 gtgcctgaca cacagaagac actcactaaa tgttaggaaa gctaatatta tttttaggaa 3360 ttcatgagtg gcagctctaa ttagggtgaa aaacatggga gtagggtgtg gtagctcaca 3420 cctgtaatcc cagcactttg ggagactgag gtgggagcat cacttgagtc caggagttgg 3480 agaccagtct ggggaatata gtgaaactcc tgtctccaca aaaaatttta aattagctgc 3540 atgtggtagt atgtgcctgt agttccagct actcaggagg ctgagctggg aggatggctt 3600 gagctcagga gattgaagcc gtagtgagcc gtgattgtgc cactgtactc cagcttgggc 3660 aactgagtga gactttgtct caaaggaaaa aaaaaaggaa gaaagaaaaa catttgggag 3720 aaaagaggaa aagatgttat ggagtttaaa atatttctgg tggggaacag tggctcatgc 3780 ctgtaatcac agcactctgg gaggcctgag gcaggaggat tgcttgagtc caggagttca 3840 agaccagcct gggcaacata gtaggacccc atctctataa aaataaataa gtacctataa 3900 tcccagtact ttgggaggct gaggtgggcg aatcacttga ggtcaggagt tcaagtccag 3960 cctggccaac attgtgaaac cccgtctcta ctaaaaatat aaaaattacc cgggtgtggt 4020 ggtgggcacc tgtaatccca gctactcggg aggctgagac aggagaatca cttgaaccca 4080 ggaggtggag tctgcagtga gcagagatcg caccactgca ctccagcctg ggcaacagaa 4140 tgagactcag tctctaaata aataaattac aaactatttc tgactaggca ctttgacctt 4200 attatgtacc ttcaccctcc gaataaacat gttaaagtag aagcaggtat cattatattc 4260 cctgcccatt tcacagatat ggagactgag ggttggtggg gctgaatgat agctaagaag 4320 tagcagagct gggacctaac catatccatg tgccccacct cactctcagc ctcaaacaga 4380 tgcaggcaga ttgcccactc accagagcct ccccccttcc ccaaaccatc tgcccctctg 4440 attgttttct tggggctcta gaagtcaggc ctttcagctc atctttactg cacagggatt 4500 tctccattgg ccggtttctg ctgcctgaga cccttgccca gccccagcca acaccagcat 4560 gattcacttt ctgttttttt gagatggagt ttccctctcg ttgcccaggc tggagtgcag 4620 tgacgtaatc tcggctcact gcaacctctg cctcccagat tcaagcaatt ctcctacctc 4680 agcctcccaa atagctggga ctacaggagt gcaccaccac acctggctaa ttttggtact 4740 tttagtagag acagggtttc gccatgttgt ccaggctggt ctccaactcc tgacctcagg 4800 tgatgcaccc tcctcggtct cccaaagtgc tgggattaca ggtgtgagcc accgcgccca 4860 gccatgattc acatttgaac ctgagaccag agctcataaa tgcattaatt cattaatttc 4920 tcaaacattc tacatgctat gggataggta cttggggtac agagaggagc aaaatggaca 4980 ttggccctac tgcaaagaac ctgaatattc acgtggagta tttcccatca ctttctaggc 5040 ctagccttga tttttgctga acccgggcca aggcagaggc acaggtgcct ccacagagca 5100 gaaccagaca aatattgtac actatagtca gtgcagggat gggaacacaa cctggctctg 5160 taagaggcca gaagaggccc ttgatcaatc tgcgggtgga agggaatcca tgaagacttc 5220 ctgcaggtgg tgacctctga ggctgattag gaggtgtttg ccatagtgtt tcatcatttt 5280 ctcattttat agatggcaaa atgagtccag agagaatgac ttagcccatg tattcaatca 5340 attgagcaaa catttcccta atatctacat tccccattat tgagccctga gcctggggat 5400 acagaggtga ataaggttaa caggcctgct agagggaatg gtatagagag gcctcaagta 5460 tccaggatac ctcaccaatc actgcccatt ggcctctgtt tttttgtatg tattttattt 5520 tattattatt attttgtaaa ttttgagaca tggtctcact ccgttgtcca ggctggagtg 5580 cagtggtgga aatataactc actgcagcct caattcccta gcctcaagca atcctcccat 5640 ctcagcctcc ccactagcaa ggactacagg catgtgccac tgtgcccagt taattttttt 5700 tttttttttg gtagagatag gatcttgcca tgttgcccag gctggtcttg aactcctgag 5760 atcaagagct cctcccacct cggcttccaa agtgctggga ttacagacgt gagccaccac 5820 acctggccta ttttatttta cctttttaaa agtcaggatt ggccgggcac ggtggctcac 5880 acctgtaatc ccagtactct gggaggccga ggcaggtgaa tcacctgagg tcaggagatt 5940 gagaccagcc tgcccaatat ggcaaaaccc catctctact aaaaaataca aaaattagct 6000 gggcatggtg gtgcacacct gtagtcccag ctactcagga ggctgaggta ggagaattgc 6060 ttgaacctgg gaggtggagg ttgtagtgag ctcagaccgt gccactgtag tctagcctgg 6120 gcaacagagc gagactcttt ctcaaaaata aatacataaa taaaattaaa aatgataaaa 6180 gtcatggtta ttgcagtata catacagtaa aattctccct ttttagtaca tatgtggcaa 6240 atgcatagtc ctgtaatcat catcacaatc aagacacaaa gacacaggtc atcatttgaa 6300 tctttttttt tttttttgag tcggaacctt gcccttttac cgaggctgga gtgcagtggc 6360 gtgatcttgg ctcactgcaa cctctgcttc ccaggttcaa gcaattatcc tgcctcagcc 6420 tccggagtag cagggaccac aggcacgcac 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attttttttc ttccttgatt ctgcattaaa 8160 ggaaatcaaa gaaaaacact tttaatattt aagtatatgg ccatagatga tttatttctt 8220 ggctaagtag ttcattttta ttttatgttc attttgcata cttatactgc acaaacactt 8280 tgggtacaac ttaacacact gaggttttct ttttttttct tttattcttt ttatttattt 8340 atttattttg agtcggggtg cagtggtgtg accttggctc actgcctcct ctgcctcctg 8400 ggttcaagcg attctcctgc ctcaacctcc tgagtagctg ggattacaag cacgcgccac 8460 cacacctggc taatttttgt atttttagta gagaccgggt ttcaccatgt tggccacgct 8520 ggtctcgaac tcctgacctg gtgatccacc cgccttagcc tcccaaagtg ctgctgggat 8580 cacaggcgtg agccatggca tctggcctca cactgaggtt tttttcttcc attcatcttt 8640 tctcttcttg tgctttatat acagtcgtca ttcagtgtcc ctgggggatt agttctggca 8700 cctccctcag ataccaaaat ccacagatgt tcaagtccct gatataaaat ggcatagtat 8760 ttgcatatta tctatgcata ccctcctgta tactctaagt catttctaga ttacttatga 8820 tccctaatac aatgtcaatg cccggtaaat cattgttata ctgtgttttt tagggaataa 8880 tgataaggaa aaaagtctgt ctatgttcaa tacagatgca gggttttttc ccaaatattt 8940 tccatcaagg ttggtggagt ccagggatgt ggaatgaata aatacagagg accacctata 9000 tatatgtatg ttactggatg gcattatttt gaaatatgaa atacacaagc ccttggggtc 9060 cagcaattcc acatctaaaa ttctattcat gtgagtagga gtaggtaaat agtagaaaca 9120 aatttgttca ttttgaaggt gtttataaaa gcaaaggcta gcaacaaact tgatggtcat 9180 cagtaggaaa ttaagtaagt aaatcatcat gtaactttac agtgaaatgt tttgtagtca 9240 ttataagagt atatcggctg ggcgtggtgg ctcaggcctg taatcccagc actttgggaa 9300 gccgaggcgg gtggatcacg aggtcaggag ttcaggatca gcctagccaa tatggtgaaa 9360 ccctgcctct actaaaaata caaaaattag ccaggcgtgg tggtgcgcac ctgtaatccc 9420 agctactagg gaggctgagg caggagaatc actcgaaccc gggaggcaga ggttgcagtg 9480 agccaagatc gtgccactgc actccagcct gggcgacaga gcaaggctcc atctcaaaaa 9540 aaaaaaaaaa aaagaaagaa agaaaaagaa aaaaagagta tatcaggcca ggtgcagcga 9600 ctcacgcctg taatcccagc catttgggag gctgaggcgg gtgtatcact tgaggccagg 9660 agttggagac cagcctggcc aacatagtga aaccctgtct ctactaaaaa tacaaaaatt 9720 agccgggcat ggtggccctc acccataatc ccagttactc gggaggctga ggcatgagaa 9780 ttgcttgaat ctgggaggca gaggttgcag tgagccaaga tcacgtcact gcattccagc 9840 ctgggtgaca gtgagactcc gtctcaaaaa aaaaaaaaaa agagtatatc atacatgcaa 9900 agatatccaa aaatctgtac tatagtaaat aactaagcaa gttccaaaat catttggatt 9960 gtgtgattct atatctattt ttgttttgtt ttgtttgaga cggtctcact ctgttgccca 10020 gactagagtg caatggcgtg attatacctc actgcagcct cgacctcttg ggctcaagtg 10080 atcctcccat ctcagcctcc caagtagcct atatctattt tttaaaatat aataatcata 10140 tctaagtata taggcatgga acatttttgg aaggatatac atgaaattgg taacagttac 10200 atttagggaa ggagtctaag gggtaaagaa cttttacttt ttcatcttat acctttgtgt 10260 actgacgcat ttttttcttt taatgtgagc acatgttaca tttgtaattt ttaaaaacta 10320 gctaatagaa atgtggttta gggctggatg cagtggctca tgcctgtaat ccctacacat 10380 tgggaggctg aggtgggtgg atcacctaag gtcaggagtt caggacaagc ctggccaaca 10440 tggtgaaact ctatctctac taaaaataca aaaattagcc gggggtggtg gcaggcgcct 10500 gtcatcccag ctgcttggga ggctgaggca ggagaattgt ttgaacccgg aaggcagagg 10560 ttgcagtgag cagagatcat gccactgcat atcagcctgg gtgacagagc aagactctgt 10620 ctcaaaaaca aaacaaaaca aaagaaatgt ggttttgcta tatataattc taatatatat 10680 ttattaaaga aaatacaggc cgggcacgga ggctcacacc tgtaatccaa catggtgaaa 10740 ccctgtctct actaaaaata taaaaattag ctgggcatgg tgaggcgcac ctgtagtccc 10800 agctactcag gaggctgagg caggagaatc gcttgaactt tggaggcgga ggttgcagtg 10860 agcagagatc tcgccactgc actccagttt ggcaacagag caagactcca tctcaaaaaa 10920 aaaccaaaaa aacaaaaaat gtccattaaa taaacacagt ttcttaaaga aatagtgttg 10980 attaaataaa atataatccc ccatattatt caaggcaacc atattaacat tttaatttat 11040 ttccttctag ttttctctat atatatattt atacattttt aatattttac aaattttttt 11100 ttgagacaga gttttgccct gttgcccagg ctggagtgca gtggtgcagt cttagctcac 11160 tgcaacctct gcctcctggg ttcaagtgat tctcttacct cagcctctgg agcagctggg 11220 actacaggca cacgccacca tgcccaacta agttttgtgt ttttagtaga gacggagttt 11280 cactatattg ggtaggctgg tcttgaactc ctgatctcat gatccaccca ccttggcctc 11340 tcaaagtgct gggattacgg gcgtcagcca ccgcaccagg accttttttt tttttttttt 11400 ttttttttga gacaaagtct tgctctgtca cccaggctgg agtgcagtgg catgatcttg 11460 gctcaccaca acctcttcct cccgggttca agcaattctc ttgcctcagc ctcccaagta 11520 gctgggacta taggcacaca ccaccatgcc cagctaattt ttatattttt agtagagaca 11580 ggggtttcac catgttagcc aggatggtct cgatctcctg acctcgtgat ccacccgcct 11640 cggcctccca aagtgctggg attacaggca tgagacaccg tgcccggcga caccctacaa 11700 ttctttaaac tcccaacaac tcaaaggaac agatattatt attactccca tttgcagatg 11760 ggtaagtaga ggcacagaaa gatgagagga tttgcccaaa gacttggctg gtatttggca 11820 gaaccaggat tcaaacccaa caggcaagag cagagttgta cacttgacct agctattctg 11880 ctattctgcc taatgaggtt cttttttctt ttcttttctt ttttttaaat ttttttttat 11940 tttttgagac agagtctcac tctgttgccc aggctggaat gcagtggtgc gatctcggct 12000 cactgcaacc tccagctcct gagttcaagc aattctcctg cctcagcctc ttgagtagct 12060 gggattacag gtgtgcacca ccacacccgg ctaatttttg tatttttagt agagatgggg 12120 tttcaccatg ttggccaggc tggtctcaaa ctcctgacct caagtgatct gcctgccttg 12180 gcctcccaaa gtgctgggat taccaggcgt gagccaccgc gcccggccct aatggggttc 12240 tgacaaaatc caggaattca gtgcagggtg ggcggacctg tgagtgtgtg agtgagggat 12300 atgcgtactt gtggagccac agatatgcac atgtgtactc acgtgttcac cgtgagtctg 12360 acggcgtggg tgcatgcatg tgttaaccag tgctctgctg acatcatggt gcccaagcac 12420 gtagagatgt atgtgcccat ggattcccct gtccaggctc ccacaggacc tatctccttg 12480 gtttctccac cttccccttg gtacacagga ggcatgagtg tccaggaggg gccagggttt 12540 ggattccaaa gcccagctgc cacttcctta ttcccaccat gtctcccaag agtagttagg 12600 gtctggactc ttaaaacatc aagctgggtg ggaggcggtg gctcacaccc ttaatcccag 12660 cactttggga ggccgaggtg ggtggatcac ttaaggtcag gagttcggga ccaacctggc 12720 caacaaggca aaactccgtc tctactaaaa atacaaaaat tagctgggca tggtggcaca 12780 cgcctgtggt cccagctact tgggaggctg aggcaggaga attgcttgaa ccccggaggc 12840 ggaggttgca gtgagctgac atcatgccat tgcactctag tatgggcaac agagccagat 12900 tctgtctcaa acaaacaaaa aaacctcatc aagctggcca ggcacaatgg cttacacttg 12960 taatcccagc actttgagag gctgaggcag gaggatcact taagcccaaa agtttgaggc 13020 tgcagtgagc tatgatcaca ccactacact ctagccgggg tgacagagca agaccttgtc 13080 tctataaaaa ataacaaaat aaaacattag ctcttgcagg gcgcggtggc 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ccagctactt gggaggctga ggcaggagaa tggcatgaac ccaggaggcg 41400 gagcttgcag tgagacaaga tcgtgccact gcactccagc ttgggcaaca gagcaagact 41460 ccgtctcaaa aaaaaaaaaa aaagccagct acagctgtaa accatatatg taatttaaaa 41520 attttctagg aaccacatta aaaagacata aaggccgggc gcggtggctc actcctgtaa 41580 tcccagcact ttgggaggcc gaggcaagtg gatcacctga ggtcaggagt tggagaccag 41640 cctggccaac agggtgaaac catgtctcta ctaaaaatac aaaaattagc tgggtgtggt 41700 ggtgggtgct tgtaatcgca gctactcggg aggctgaggc agaagaatca tttgaacgaa 41760 ggaggtggag gttgcaatga gccaagattg cgccactgca ctccagcctg ggtgaaagag 41820 taagactcca tctcaaaaaa ataaaaataa ataaataaat aaataaaaat aaaaagacat 41880 aaaatgaaac aggtgaaatt tattttaata atatattcaa aaattacgtt tcaacatgta 41940 atcaatgtaa aattattatc actgtatttt acattcattt tctgcattct ttgatatcca 42000 atgtatattt tgcacttaca gcactggtta gtttgggcca gctgcatctc aagtgctcag 42060 tagccacacg tggtgagtgg tcacttttat ggatctgtat cttaatctgg gttttagcta 42120 tatataaaaa tttatatata aaacttggga ggcactccag cctgggtgac agagcaagac 42180 tttgtttcaa aaaaaaaaga aagaaagaaa ttcatttgta ttgttatatg tatctgtcat 42240 ttgtgtgttt tttttttttt tttttgagat ggagttttgt tctgttgccc aggctggagt 42300 gcagtggcac gatctcgatc ttggcttact ccaatctctg cttcctggat tcaggcaatt 42360 ctcctgcctc agcctcccca gtagctggga ccacaggctc acaccaccac acctggctaa 42420 tttttgtatt tttagtagag acagtctcac gatgttggcc aggctggtct tgaactcctg 42480 gcctcaagca atctgaccac ctcagcctcc caaagtgctg ggattacaag cgtgagccac 42540 caagcatggt ctttttttct ttttcttttt tttttttctt tttttttgag atggaatctc 42600 tgtcacccag gctggagtgc agttgcgtga tcttggagtg atcttggcac actgcaacct 42660 ccacctcccg ggttcaagtg attctcctgt ctcagcctcc caagtagctg ggattacagg 42720 cctgtgccac tacacccagc taatttttgt atttttagta aagatggggt ttcaccatgt 42780 tggcaaggct ggtcctgaac tcctggcctc aagtgatcca cccgccttgg cctcccaaag 42840 tgttgggcgc ccggcccttt tcattttaca tagtattcca ttgtacgaat atatcatagt 42900 ttatccattc tcctgttgat ggacgtttgg attacttcca atttctgctt attatgaata 42960 atgctgctat cagtgttctt gaacagtctt taaatagact catttaaatt 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cacagtgatg gtttctaggc aagcacaact 44700 agtgaggccg ggcatggtga ctcatgcctg taatcccagc acctggggag gctgaggcag 44760 gcagatcact tgagctcagg aattcgagac cagcctgggc aacatagcaa aactctgtct 44820 ctataaaaaa tacaaaaact agctgagtgt ggtggcttga gcctgtagtc gcagctattt 44880 ggggggctga ggtgggagga tcctttgagc ccaggaggca gaggttgcag tgagccgaga 44940 tcatgccact gcattccagc ctgagtgaca gagtgagacc ctgtctcaaa aacaaacaaa 45000 caaacaaaca aaaaccaact attgagtact tagtgtaagg tatggtcctg aggataaggg 45060 gtggtggagg agaatgcaaa gaggtttaag ggactttccc ttagagagct cccattccag 45120 cataacagac attccagaac catctgtaat aataggtgca ttgtgtgtgc attaaatagg 45180 tagataacat aaaattatgt tcatgatgaa gtgcatgatg ggaattctgg tatcagactt 45240 gaattcaaat ctcagccccc tcacttacca cccgtcttat ctttattagc aagttgacct 45300 ctcaatgctt tcatttcctg atctgtaaaa tagcgacctg cctcagagag ctgttgcaag 45360 gattgaatga gtttcccaac gcaaagtgcc tgagacacaa taattgctca gagtctgact 45420 ctgttgccca ggcgggagtg cagtggcagg atctcggctc gctgcagcct ctgcctcctg 45480 ggttcaagtg attctcccac ctcagcctcc ccagtagctg ggattacagg catgtgccac 45540 cacgcctggt caatttttgt atttttcgta gagacggggt tttgccatgt tggccaggct 45600 ggtctcaaac tcctaacctc aagtgatctg tccacctcag cctcccaaaa tgctaggatt 45660 acaggcgtga gtcagcacac ccggcacccc catagtgctt ttgatggact acctttactt 45720 tcccatagtg ctttagagtg tctaaggtgc tttcaaatac atgatctcac ttaagtcttg 45780 cagcaactcc gaaagtaaat ggaagctcag aaggctaagt ggtgtatccc tagaaccacc 45840 cgaccagaaa cagtggtagt cccaagacca gcatatggat ctttggactc tcagtcaagt 45900 gctttcatta ctccagctca tagccttctg gttgagtcca gaaatctgag agaaggaaaa 45960 aaaaagagag aaaaattagg acaaaaaagt gagggactga agacctatgt ccacacaaaa 46020 acctgagctt taatcataat tgccagaact tgaaggcaac caagatgtct ttcaggaggt 46080 gaagggatgc ataaaccgtg gtacatctag agcacagact attatgcagc actaaaaaca 46140 gacaagctat caagctatgg aaagacatag acggggtcag gcgaggtggc tcacacctgt 46200 aatcccagca ctttgagagg ctgaggcagg tggatcactt gaagctagga gttccagacc 46260 agcctgggca acatggtgca accctgtctc tacaaaaaat acaaaaatta gccaggggcg 46320 gtggtgtgtg cctgtagtcc cagctattct gtagtcccag ctgttgggga ggctgaggtg 46380 ggaggattgc ttgagcctga gaggttgagg ctgcagtgag cctgaacatg ccactgcact 46440 ctagcctggg cgacagagtg aaaccttgtc tcaaacaaac aaacaaacaa acgaaacaaa 46500 cgagcaaaaa aacccaggaa acaaaaaaat aaaacccaca cacaaaaaaa gccaccatag 46560 aggaatctta actgtgtgtt actaagtgaa agaagccaat ctgaaacagc tactactgta 46620 tgattcaagc tatacgacgt tctttttttt ttgagacgaa gtcttgctct gttgcccagg 46680 ctggagcgca acggggcgat cttggctcac tgcaagctct gcctcctggg ttcacgccat 46740 tctcctgcct cagcctcccg agtagctgga actaaaagcg cccgctacca tgcccagcta 46800 attttttgta tttttagtag agacggggtt tcatcatgtt agccaggatg ggctcgatct 46860 cctgacctcg tgatccgcct gcctcggcct cccaaagtac tgggattaca ggcgtgagcc 46920 accgcgtccg gcctatatga cattcttgaa aagagaaaac tatggagagt gaaagatcag 46980 gggttgtcag gggttggggg aggggagaac aaataggtgg agcacagaga atgtttagga 47040 cagtgaaact actctgtatg acagtataat gggagataca tgtccttata catttgccca 47100 aacccataga atgtataaaa ccaagagtga actctaaact atggactctg ggtgataaca 47160 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accatgttgg 48000 ccaggtggtc tcgaactcct gacctcgtga tctacccacc tcggcctccc aaagtgctgg 48060 gattacaggc gtgaatcact gcgcccggcc aatattgcat tttcaaagaa tgagaacact 48120 gtgaaatact ctgcacgcta aaaccacatg gactataatt taatctttaa ttttgttgtt 48180 gtcattctca aaggctcttc aatatatctt aaagctgtgt ttctccaaga gtggccaagg 48240 aaaaccctca gctctcagcc ttctcatctg atagaggtgt ctgttcaaaa actgccattt 48300 tctgagcccc catccacccc tagtccactt gacctacagt tttagagtag tgaaagtcaa 48360 aatatgaacg ttaattatca ttgtacttaa gagatgcaga cattctgctt aaatgagagt 48420 tctgtatcat agagtagact catttacctc atctccttca agtctttgct aaaacgtctc 48480 cctccccatg agaatgttgt tgatttaaaa ttgcatctca ggccaggtgt ggtggctcac 48540 gcctgtaatc ccaacacttt caagggcaga ggtgggcaga tcacctgagg tcaggcgttc 48600 aagaccagcc tggccaacac ggcgaaaccc catctctact aaaaatacaa aaaattagtc 48660 aggagtgatg gtggatgcct gtaaccccag ctactgggga ggctgaggca ggagaatcac 48720 ttgaatccaa gaggcagaga ttgcagtgag ccgagatcat gccactgcac tgcagcctgg 48780 gtgacagagc aagactccat ctcaaaaata tatatatata taaaatttca tctcaccttc 48840 ttcccaatag tacccaccct ccctatcacc cttccttctc tgtggcacct acaacatcta 48900 actgaacaca ccatttattt atctattgtt tattcattca ttcactcatt cattcattga 48960 ctcattcatt cattcattta cttgtatgac tctcatctct agaatgcaag ctttacaaag 49020 gcagctgctg ggactacaac acctaggaca gtgtctagta catagaagat gttcggtaaa 49080 tacctgtgcc aagttgcata atatcatttg cccactgtct ttctcaagag gattttttaa 49140 aaactataaa gcaaattctt cttttattct ttgagtgatg ttctgtgtgt gtagtaccag 49200 agaaaaagag ctggaaccac atcctctaat ctcttaattc tgaagtctgg gcctgttgct 49260 ctaaagatca tttttcctta ataccactga gatcctcaat ttactatgag gatcatgagt 49320 ttacaactgc attgtcctgt gagggctacc tctagaaggg cttgtcgccc ctattgtgaa 49380 caaagtggac tgaagctgct gcagctgaga tacacctgca ctgaaagagg atttgtctaa 49440 gtctaaccca tgttactgtg atacaaacaa gctactgacc aaaagaggta gacgcttcct 49500 cctcagattc tgaatgaata tgctaataca tggatcctat ctcaagctac ttcttacaca 49560 gcattggctg actctgaaca gatgccttta cccatttcct tttttttttt taatccaaaa 49620 tgtgtttatt gagatggttt cccactcatc ttgattcaga gtgctttggg tgctgcttcc 49680 tcctgaagga acatccttct gtagccttcc ttttcctcct gtaggctggc agagaacagt 49740 ggagcaggca acacacaaaa ctaccgtttg tgcatggcta cagaccatgg tgattttata 49800 gcatcctggg catgtcatat ccatgaagta ggaatcggga ctctgcacca ggcgtttctt 49860 cttctgtttc ctcttctctt ctggagaagg atgaaggaga tccctgtcga gaggcatgtt 49920 ctcgtgggta ggtcgccact gccggaaagg acccatttcc tatccttcaa gctcatctgc 49980 ccagcagcac cagcacacaa accaaagtcc aggaacactg gaagatccct actccccgca 50040 cctctccaat gacccttttt aagttcagac ctaagaagag tcacctccct aataccgcag 50100 aggctacctg ctcaccctca tctgtgtctc tgctacaaca caaactggaa tgcttttgtg 50160 tcggaatggt aagaaatgcc ttgtgtgggt ggccctccag tccccagtcc aggggatgct 50220 gagaaactgt ggggcagagt aggggacaca aacaggaaaa agcaagtttg tttctagtgt 50280 tatgctcaca gggtggcagg atatacctgc tgagcattcc cagaaggtcc ccaaggaaac 50340 cattactgta agtctctcac tttcttctct gcctgatggt tggggtgggg agagggaagg 50400 agggctatca agagggggat gggcaccctt ccagaggtca gagttatgat gcccaggaat 50460 aaaaggtgtt gaattcagga 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gagaacccgg gcttggggcg cgggattttc tcaacagacc atagggtcca 51360 ctaatgtgga cggcagggat ttggggaaac taagggggac tctcactttg gacaccaagg 51420 gctgaggacg gattggggaa gaggatacgg tttctactgg ggtgctgatg gaggttcccc 51480 actcgggacg cgaggcactg agtgggtccc ccaaactgga tatgggatcc tgggaacgga 51540 gcgagggctc taaattagag ccctggggtg ggggtggggg gctgtaaatt aggttgggag 51600 gaaactgggg gctctgaggg cggcttctcg ctccgactgg ggaaatggag catgtgggga 51660 ctggggagca ctagggctat ctcccgcccg acccgaggag attggggttc tcttcaattc 51720 tggacagcag ggacctgaga gggaagaccg ggggggttcc cgatccggaa ccgagctacc 51780 ttgaaggcac cgggaagcgc ttcattccgg gagggcgttc ccgcggccgg gcccccgcgc 51840 cggggtgggt ggggggtgcg gccgcgccct ggtcccggcc cgcaccggga ttcgggggtc 51900 tcgctcggcc ccggagaccc aggagccccg cgggaagggg gtcccggcgc cgccgcctcc 51960 gcgggcgccc gggctcgcgg gcgagcgcgg ggctttatgc gcgcagggcg gcggggggag 52020 gagccggcag gtcggccccc ggcgggccct cccctcggcc gtccccgccc gcccgcccga 52080 gcggggtcgg gggagggggc agcatggcct gtccgtccgg cccccttcgc cgcgctcctc 52140 atctgccccg cgccgagcgc cgccgccgcc gccgccgccg ccgctccgct gcccgcgccg 52200 cccgcggctc ccgatg 52216 <210> 2 <211> 1850 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gatcctggaa ggtgggcagc aactggcaca cctcaagatg tcccttagtc tggaggtggc 60 tacatacagg tacacagtgc tgactgtcct cggcttcttc tgcggcccag aaacttggct 120 ttgtactttc tgtgactgtc agctatcgct ttgtaaaact gtcctattta tgtgtatttg 180 tgtatgtacc acatgtgtac aggtgtccta agagcccaga ggaaggcaat gggttgtgtg 240 cagctccaca ctggtgctgt gaaccaaacc cctgttctca gcaaaaagca gcaagcattc 300 ttaaccactg agccgtctgt ccagccctcg gagtcactta aaacgtttta taacatttac 360 ttatgtaatg tatttgtctg ggatggaggc ttatgagtcc cagaggtgga acaggtctgg 420 cttggcagct tggcccaccc aggttcagga ccagaagaga cggtgatgct taaaaagaca 480 gctcagtctt cagggaggag accagacaga tgagttcttt ggaaggcagg caatctccag 540 tgtctatgcc aacatcctgg ggacacctgg gcagtctcag aagagaggcc ttgcaggttt 600 gcctgatcat gctaacctgc cacctcgcct gggcctcagg tgttttgggt aagagctggc 660 ctcctagctt ttttgcttcc tttcaagccc tcatgtcact ggtcctgccc cagttctctg 720 cccttttctt ggctgcctca ggacggctga gtggaacggc tctggtggta tgttcacagc 780 ctctgtctgt gtctcttgtg ggaaaaggcc ccagttggag tcccacggtt gagggctgag 840 gatatcactc cagagtatgg ggctaggaca ggatgccccc cttttccaga atccagcggt 900 aaagaggaaa gacagagaca ggtctaggag aggagctgga gggcccagag aaggacagcc 960 agtgagtgtc taggaaagac tgaatgcata aggcaggatg ccgcatgagg acagaggaaa 1020 gggtactttg agaaccagat gtgctcagag gccatgaatg gaaacagact agttccgaat 1080 cccatgtgaa ctgatttccc tcatctcctt caatcagctc cataggccac tgaggcaggg 1140 ccatgaacgt taagacctct gccctgaaga gtttgtgatc ctgagatgag ggctttagcc 1200 ccagtcagtc ctctgagggg aagggtccag gcagctctga ggaatgtaac cactggcgtt 1260 tgaggtctga aaaggatttg gagaagggga gctgaattca tttgcttttg tctgttacca 1320 gctctggggg cagagagaga gccatcccct gggaacagcc tgagaattcc cacttcccct 1380 gaggagccct cccttcttag gccctccaga tggtagtgtg gacaaaaggc aataattagc 1440 atgagaatcg gcctccctcc cagaggatga ggtcatcggc cttggccttg ggtggggagg 1500 cggagactga tctgaggagt ctgatataag tgttagcaat tcatttggcc ctgcctccga 1560 ctgtgggaat ctgcatgtgg ggtctccctg tgtctcaaat atgggttggc taagtatata 1620 tctgtgggta tatgactgtg tggcttttat atgacaatgg tcacaataga gattgatcct 1680 gcagtggcag gacatgctac ctcagctgga gctgacccta tctccccact ccccaccagg 1740 actctgctgg aggctgagaa ctctcggttg cagacacctg gacgaggttc ccaggcttct 1800 cttggctttc tgggtaagag gcggagccaa ctgctctcct tggaagatcc 1850
【図１】図１は、AdE/Nest：EGFPおよびAdP/Msi:hGFPに
基づく蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて胎児ヒト前
脳から神経幹細胞を抽出する方法を略述した概要図を示
す。単離した細胞を、in vitroでそれらがたどる細胞系
譜の可能性によって特徴づけた。さらに、in vivoでE17
およびP2ラットの終脳胞に異種移植して、それらの表現
型の潜在的可能性も評価した。
基づく蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて胎児ヒト前
脳から神経幹細胞を抽出する方法を略述した概要図を示
す。単離した細胞を、in vitroでそれらがたどる細胞系
譜の可能性によって特徴づけた。さらに、in vivoでE17
およびP2ラットの終脳胞に異種移植して、それらの表現
型の潜在的可能性も評価した。
【図２】図２Ａ−Ｅは、抗ヒトnestin（赤色）およびmu
sashi-1（緑色）抗体によって標識した神経系前駆細胞
を含む在胎齢21週の胎児ヒト脳切片を示す。図２Ｄ−Ｅ
は、それぞれ脳室帯および脳室下帯と中間帯の辺縁の４
０倍の拡大写真である。図２ＤとＥにおいて、矢じり
は、特に脳室帯腔表面で発現頻度の高いmusashi陽性/ne
stin陰性細胞を示し、矢印は、脳室帯と発生期の脳室下
帯の深層においてより一般的な二重標識細胞を示す。こ
の在胎齢時点では、musashi-1の免疫反応性は脳室帯の
実質的にすべての細胞によって発現され、一方nestinは
それほど遍在的には発現されなかった。これに対し、ne
stinの発現は脳室帯の基底面内および脳室下帯全体で最
も支配的であった。これら２層の界面では、多数の明ら
かな移動細胞と共に、musashi陽性/nestin陽性の二重標
識細胞が優勢であった。これらの二重標識細胞は脳室壁
から離れるほど少なくなり、nestin陽性/musahi陰性細
胞が優勢になり始めた。
sashi-1（緑色）抗体によって標識した神経系前駆細胞
を含む在胎齢21週の胎児ヒト脳切片を示す。図２Ｄ−Ｅ
は、それぞれ脳室帯および脳室下帯と中間帯の辺縁の４
０倍の拡大写真である。図２ＤとＥにおいて、矢じり
は、特に脳室帯腔表面で発現頻度の高いmusashi陽性/ne
stin陰性細胞を示し、矢印は、脳室帯と発生期の脳室下
帯の深層においてより一般的な二重標識細胞を示す。こ
の在胎齢時点では、musashi-1の免疫反応性は脳室帯の
実質的にすべての細胞によって発現され、一方nestinは
それほど遍在的には発現されなかった。これに対し、ne
stinの発現は脳室帯の基底面内および脳室下帯全体で最
も支配的であった。これら２層の界面では、多数の明ら
かな移動細胞と共に、musashi陽性/nestin陽性の二重標
識細胞が優勢であった。これらの二重標識細胞は脳室壁
から離れるほど少なくなり、nestin陽性/musahi陰性細
胞が優勢になり始めた。
【図３】図３Ａ−Ｆは、有糸分裂能を有し、表現型が運
命付けられていないAdP/Musashi.hGFP+細胞を示す。図
３Ａは、8DIV（in vitroで8日）の時点で、96.1%のAdP/
Msi:hGFP+（緑色）細胞がnestin抗体（赤色）で共標識
されていることを示す。図３Ｂは、いずれのAdP/Msi:hG
FP+（緑色）細胞もTUJ-1タンパク質（赤色）の初期ニュ
ーロンマーカーを発現しないことを示す。図３Ｃは、Ad
P/Msi:hGFP+（緑色）細胞の約39%がGFAP（赤色）を共発
現し、細胞の93.25%が、BrdU（青色）の取り込みによっ
て示されるように、活発に分裂していることを示す。図
３Ｄ−Ｆは、それぞれ図Ａ−Ｃに対応する位相差顕微鏡
像である。
命付けられていないAdP/Musashi.hGFP+細胞を示す。図
３Ａは、8DIV（in vitroで8日）の時点で、96.1%のAdP/
Msi:hGFP+（緑色）細胞がnestin抗体（赤色）で共標識
されていることを示す。図３Ｂは、いずれのAdP/Msi:hG
FP+（緑色）細胞もTUJ-1タンパク質（赤色）の初期ニュ
ーロンマーカーを発現しないことを示す。図３Ｃは、Ad
P/Msi:hGFP+（緑色）細胞の約39%がGFAP（赤色）を共発
現し、細胞の93.25%が、BrdU（青色）の取り込みによっ
て示されるように、活発に分裂していることを示す。図
３Ｄ−Ｆは、それぞれ図Ａ−Ｃに対応する位相差顕微鏡
像である。
【図４】図４Ａ−Ｆは、有糸分裂能を有し、表現型が運
命付けられていないAdE/Nest.EGFP+細胞を示す。図４Ａ
は、4DIVの時点で、Ad.E/Nestin:EGFP+（緑色）細胞の9
8.95%がnestin抗体（赤色）で共標識されていることを
示す。図４Ｂは、Ad.E/Nestin:EGFP+（緑色）細胞の約
8.93%がGFAP（青色）で、また3.12%がTUJ-1抗体（赤
色）で共標識されていることを示す。図４Ｃは、Ad.E/N
estin:EGFP+（緑色）細胞の約61.6%がBrdU（青）を組み
込んでいることを示している。図４Ａ−Ｃは、それぞれ
図Ａ−Ｃに対応する位相差顕微鏡像である。
命付けられていないAdE/Nest.EGFP+細胞を示す。図４Ａ
は、4DIVの時点で、Ad.E/Nestin:EGFP+（緑色）細胞の9
8.95%がnestin抗体（赤色）で共標識されていることを
示す。図４Ｂは、Ad.E/Nestin:EGFP+（緑色）細胞の約
8.93%がGFAP（青色）で、また3.12%がTUJ-1抗体（赤
色）で共標識されていることを示す。図４Ｃは、Ad.E/N
estin:EGFP+（緑色）細胞の約61.6%がBrdU（青）を組み
込んでいることを示している。図４Ａ−Ｃは、それぞれ
図Ａ−Ｃに対応する位相差顕微鏡像である。
【図５】図５Ａ−Ｄは、AdP/Msi:hGFP+およびAdE/Nest.
EGFP+幹細胞がFACSによって濃縮されることを示すグラ
フである。図５Ａ−Ｂは、それぞれAdCMV.LacZ感染非蛍
光対照細胞とAdP/Msi.hGFP感染細胞のGFP蛍光強度（FL
1）に対する細胞サイズの選別プロフィール（FSC）を示
す。選別された集団の約3.95%がAdP/Msi.hGFP+細胞につ
いて任意の閾値の蛍光強度を達成した。図５Ｃ−Ｄは、
それぞれAdCMV.LacZに感染した非蛍光性の対照細胞とAd
E/Nestin.EGFPに感染した細胞の選別プロフィールを示
す。この代表的標本中の細胞の約8.1%が、対照に対して
検定した閾値のAdE/Nestin.EGFP+に関する蛍光強度を実
現した。
EGFP+幹細胞がFACSによって濃縮されることを示すグラ
フである。図５Ａ−Ｂは、それぞれAdCMV.LacZ感染非蛍
光対照細胞とAdP/Msi.hGFP感染細胞のGFP蛍光強度（FL
1）に対する細胞サイズの選別プロフィール（FSC）を示
す。選別された集団の約3.95%がAdP/Msi.hGFP+細胞につ
いて任意の閾値の蛍光強度を達成した。図５Ｃ−Ｄは、
それぞれAdCMV.LacZに感染した非蛍光性の対照細胞とAd
E/Nestin.EGFPに感染した細胞の選別プロフィールを示
す。この代表的標本中の細胞の約8.1%が、対照に対して
検定した閾値のAdE/Nestin.EGFP+に関する蛍光強度を実
現した。
【図６】図６Ａ−Ｂは、AdP/Msi.hGFP+およびAdE/Nest.
EGFP+細胞の選別直後の特徴を示す。精製したAdP/Msi.h
GFP+およびAdE/Nest.EGFP+細胞は、2%胎児ウシ血清を含
む培地でフィブロネクチンに接種したとき、それぞれニ
ューロンと星状細胞を生じた。図６Ａは、FACSの5日後
に、AdP/Msi.hGFP+細胞から生じたGFAP+星状細胞（緑
色）とTuJ1+ニューロン（赤色）を示す。この時まで
に、AdP/Msi.hGFP+で選別された細胞はもはやmusashiが
もたらすGFPを発現しなかった。図５Ｂは、選別の5日後
にAdE/Nest.EGFP+細胞から生じたGFAP（青色）および+T
uJ1（赤色）細胞の存在を示す。musashiプロモーターが
もたらすGFPが比較的速やかに転写不活性化するのに対
し、これらのAdE/Nest.EGFP+で選別された細胞はまだGF
Pを発現し、in vitroでほとんど2週間にわたって発現を
続けた。
EGFP+細胞の選別直後の特徴を示す。精製したAdP/Msi.h
GFP+およびAdE/Nest.EGFP+細胞は、2%胎児ウシ血清を含
む培地でフィブロネクチンに接種したとき、それぞれニ
ューロンと星状細胞を生じた。図６Ａは、FACSの5日後
に、AdP/Msi.hGFP+細胞から生じたGFAP+星状細胞（緑
色）とTuJ1+ニューロン（赤色）を示す。この時まで
に、AdP/Msi.hGFP+で選別された細胞はもはやmusashiが
もたらすGFPを発現しなかった。図５Ｂは、選別の5日後
にAdE/Nest.EGFP+細胞から生じたGFAP（青色）および+T
uJ1（赤色）細胞の存在を示す。musashiプロモーターが
もたらすGFPが比較的速やかに転写不活性化するのに対
し、これらのAdE/Nest.EGFP+で選別された細胞はまだGF
Pを発現し、in vitroでほとんど2週間にわたって発現を
続けた。
【図７】図７は、ヒト神経幹細胞の増殖と遺伝的標識化
のための方法を示す概要図である。
のための方法を示す概要図である。
【図８】図８Ａ−Ｈは、レトロウイルスのEGFPで標識し
たAdE/Nest.EGFPおよびAdP/Musashi.hGFPで選別された
細胞が、クローン由来の二次スフェアを生成し、それが
次にニューロンとグリア細胞を発生させることを示す。
たAdE/Nest.EGFPおよびAdP/Musashi.hGFPで選別された
細胞が、クローン由来の二次スフェアを生成し、それが
次にニューロンとグリア細胞を発生させることを示す。
【図９】図９Ａ−Ｄは、AdE/nestin：EGFPおよびAdP/mu
sashiベクターを示す概要図である。図９Ａでは、プラ
スミド分離カセットにおいて、EGFPを熱ショックタンパ
ク質−68の基礎プロモーターの3’側に置き、これをnes
tin第二イントロンエンハンサーの調節制御下に置い
た。図９Ｂでは、△E1アデノウイルス中にE/nestin:hsp
68:EGFP含むようにアデノウイルスE/nestin:EGFPを構築
した。図９Ｃでは、プラスミド分離カセットP/musashi:
hGFPにおいて、hGFPをnestin第二イントロンエンハンサ
ーの調節制御下で3’側に置いた。図９Ｄでは、△E1ア
デノウイルス中にP/musashi:hGFP含むようにアデノウイ
ルスAdP/musashi:hGFPを構築した。
sashiベクターを示す概要図である。図９Ａでは、プラ
スミド分離カセットにおいて、EGFPを熱ショックタンパ
ク質−68の基礎プロモーターの3’側に置き、これをnes
tin第二イントロンエンハンサーの調節制御下に置い
た。図９Ｂでは、△E1アデノウイルス中にE/nestin:hsp
68:EGFP含むようにアデノウイルスE/nestin:EGFPを構築
した。図９Ｃでは、プラスミド分離カセットP/musashi:
hGFPにおいて、hGFPをnestin第二イントロンエンハンサ
ーの調節制御下で3’側に置いた。図９Ｄでは、△E1ア
デノウイルス中にP/musashi:hGFP含むようにアデノウイ
ルスAdP/musashi:hGFPを構築した。
【図１０】図１０Ａ−Ｆは、胎児ラット脳に移植したヒ
トAdE/Nest.EGFP+およびAdP/Musashi.hGFP+細胞がニュ
ーロン、星状細胞およびオリゴデンドロサイトに分化す
ることを示す。図１０Ａ−Ｃは、抗ヒト抗体（AVA）
（緑色）によって同定されるヒトAdE/Nest.EGFP+移植細
胞を示す。矢じりは二重標識した細胞を示す。図１０Ａ
では、ニューロンは抗Hu抗体（赤色）で標識されてお
り、ヒトAdE/Nest.EGFP由来の細胞はANA（緑色）で標識
されている。二重標識されているもの（黄色）は、ラッ
ト新皮質実質中のAdE/Nest.EGFP由来のヒトニューロン
を示す。図１０Ｂでは、オリゴデンドロサイトがCNPase
（赤色）で標識されており、AdE/Nest.EGFP由来のヒト
オリゴデンドロサイト（黄色）を同定することができ
る。図１０Ｃでは、星状細胞がGFAP標識されている（赤
色）。図１０Ｄ−Ｆでは、ヒトAdP/Msi.hGFP+移植細胞
が抗ヒト抗体あるいはBrdU（緑色）によって同定され
る。矢じりは二重標識された細胞を示す。図１０Ｄで
は、ニューロンは抗Hu抗体（赤色）で標識され、ヒトAd
P/Msi.hGFP+から生じたニューロンはANA（矢じり）で共
標識されている。図１０Ｅでは、オリゴデンドロサイト
がCNPase（赤色）で標識されている。図１０Ｆでは、星
状細胞がGFAP標識されている（赤色）。
トAdE/Nest.EGFP+およびAdP/Musashi.hGFP+細胞がニュ
ーロン、星状細胞およびオリゴデンドロサイトに分化す
ることを示す。図１０Ａ−Ｃは、抗ヒト抗体（AVA）
（緑色）によって同定されるヒトAdE/Nest.EGFP+移植細
胞を示す。矢じりは二重標識した細胞を示す。図１０Ａ
では、ニューロンは抗Hu抗体（赤色）で標識されてお
り、ヒトAdE/Nest.EGFP由来の細胞はANA（緑色）で標識
されている。二重標識されているもの（黄色）は、ラッ
ト新皮質実質中のAdE/Nest.EGFP由来のヒトニューロン
を示す。図１０Ｂでは、オリゴデンドロサイトがCNPase
（赤色）で標識されており、AdE/Nest.EGFP由来のヒト
オリゴデンドロサイト（黄色）を同定することができ
る。図１０Ｃでは、星状細胞がGFAP標識されている（赤
色）。図１０Ｄ−Ｆでは、ヒトAdP/Msi.hGFP+移植細胞
が抗ヒト抗体あるいはBrdU（緑色）によって同定され
る。矢じりは二重標識された細胞を示す。図１０Ｄで
は、ニューロンは抗Hu抗体（赤色）で標識され、ヒトAd
P/Msi.hGFP+から生じたニューロンはANA（矢じり）で共
標識されている。図１０Ｅでは、オリゴデンドロサイト
がCNPase（赤色）で標識されている。図１０Ｆでは、星
状細胞がGFAP標識されている（赤色）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 岡野 栄之 大阪府吹田市桃山台４−３−10−113 (72)発明者 スティーブン ゴールドマン エヌワイ 10021 アメリカ ニューヨー ク ヨーク アベニュー 1300 コーネル ユニバーシティー メディカル センタ ー デプト． オブ ニューロロジー ア ンド ニューロサイエンス／Ｅ−607内 Ｆターム(参考） 4B024 BA80 CA04 DA02 DA03 EA02 FA02 FA06 GA13 GA14 HA17 4B065 AA93X AA93Y AA95X BA03 BA05 CA44 CA46 CA60 4C087 AA04 AA05 BB45 CA04 NA14 ZA02
Claims (38)
- 【請求項１】 細胞型の混合集団から多能性神経系前駆
細胞を分離する方法であって、上記方法は、 神経系前駆細胞において選択的に機能するプロモーター
を選択し；細胞型混合集団のすべての細胞型に、上記プ
ロモーターの支配下で蛍光タンパク質をコードする核酸
分子を導入し；混合集団内の神経系前駆細胞のみに上記
蛍光タンパク質を発現させ、他の細胞型には発現させ
ず；細胞型混合集団の細胞の中から蛍光を発する細胞と
して神経系前駆細胞を同定し；そして細胞型の混合集団
から蛍光を発する細胞を分離し、その際分離した細胞が
神経系前駆細胞に限定される；ことを含む方法。 - 【請求項２】 細胞型の混合集団が中枢神経系に存在す
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 中枢神経系における細胞型の混合集団が
脳室帯由来である、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 中枢神経系における細胞型の混合集団が
海馬由来である、請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】 中枢神経系における細胞型の混合集団が
脊髄由来である、請求項２に記載の方法。 - 【請求項６】 細胞型の混合集団が骨髄由来である、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 細胞型の混合集団が骨髄支質あるいは間
葉由来である、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 細胞型の混合集団が胚性幹細胞由来であ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 細胞型の混合集団が哺乳動物である、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 細胞型の混合集団がヒトである、請求
項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 プロモーターがmusashiプロモーター
である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 musashiプロモーターが配列番号１の
ヌクレオチド配列を持つ、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 プロモーターがnestinエンハンサーで
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】 nestinエンハンサーが配列番号２のヌ
クレオチド配列を持つ、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 上記の導入が細胞型混合集団のウイル
スを介した形質転換を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１６】 上記のウイルス仲介形質転換がアデノ
ウイルスを介した形質転換を含む、請求項１５に記載の
方法。 - 【請求項１７】 上記の導入が電気穿孔を含む、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項１８】 上記の導入が上記の複数の細胞のリポ
ソームを介した形質転換を含む、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項１９】 上記の分離が蛍光活性化細胞の選別を
含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２０】 細胞型の混合集団が組織中にある、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項２１】 組織が脳組織である、請求項２０に記
載の方法。 - 【請求項２２】 組織が脊髄組織である、請求項２０に
記載の方法。 - 【請求項２３】 細胞型の混合集団が細胞培養中に存在
する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２４】 細胞型の混合集団が胎児ヒト脳由来で
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２５】 細胞型の混合集団が成体ヒト脳由来で
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２６】 多能性神経系前駆細胞が神経幹細胞で
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２７】 分離した細胞を被験者に移植すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２８】 単離したヒトmusashiプロモーター。
- 【請求項２９】 musashiプロモーターが配列番号１の
ヌクレオチド配列を持つ、請求項２８に記載の単離ヒト
musashiプロモーター。 - 【請求項３０】 単離した多能性神経系前駆細胞の濃縮
あるいは精製製剤。 - 【請求項３１】 ヒト由来の、請求項３０に記載の単離
した多能性神経系前駆細胞の濃縮あるいは精製製剤。 - 【請求項３２】 多能性神経系前駆細胞が神経幹細胞で
ある、請求項３０に記載の単離多能性神経系前駆細胞の
濃縮あるいは精製製剤。 - 【請求項３３】 多能性神経系前駆細胞が脳室帯由来で
ある、請求項３０に記載の単離多能性神経系前駆細胞の
濃縮あるいは精製製剤。 - 【請求項３４】 多能性神経系前駆細胞が海馬由来であ
る、請求項３０に記載の単離多能性神経系前駆細胞の濃
縮あるいは精製製剤。 - 【請求項３５】 多能性神経系前駆細胞が脊髄由来であ
る、請求項３０に記載の単離多能性神経系前駆細胞の濃
縮あるいは精製製剤。 - 【請求項３６】 多能性神経系前駆細胞が骨髄由来であ
る、請求項３０に記載の単離多能性神経系前駆細胞の濃
縮あるいは精製製剤。 - 【請求項３７】 多能性神経系前駆細胞が骨髄支質ある
いは間葉由来である、請求項３６に記載の単離多能性神
経系前駆細胞の濃縮あるいは精製製剤。 - 【請求項３８】 多能性神経系前駆細胞が胚性幹細胞由
来である、請求項３０に記載の単離多能性神経系前駆細
胞の濃縮あるいは精製製剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001000868A JP2002034580A (ja) | 2000-01-05 | 2001-01-05 | 多能性神経系前駆細胞を分離し、精製するための方法および多能性神経系前駆細胞 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000005307A JP2001292768A (ja) | 2000-01-05 | 2000-01-05 | 胎児および成体からの、中枢神経系由来の神経幹細胞の単離および濃縮 |
| JP2000-5307 | 2000-01-05 | ||
| JP2001000868A JP2002034580A (ja) | 2000-01-05 | 2001-01-05 | 多能性神経系前駆細胞を分離し、精製するための方法および多能性神経系前駆細胞 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002034580A true JP2002034580A (ja) | 2002-02-05 |
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ID=26583480
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|---|---|---|---|
| JP2001000868A Pending JP2002034580A (ja) | 2000-01-05 | 2001-01-05 | 多能性神経系前駆細胞を分離し、精製するための方法および多能性神経系前駆細胞 |
Country Status (1)
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|---|---|
| JP (1) | JP2002034580A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2003106673A1 (ja) * | 2002-06-17 | 2005-10-20 | 財団法人名古屋産業科学研究所 | 胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法及び単離又は可視化用キット |
| JP2008501356A (ja) * | 2004-06-09 | 2008-01-24 | ザ・ユニバーシティ・コート・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・エディンバラ | 神経幹細胞 |
| WO2008029790A1 (fr) | 2006-09-04 | 2008-03-13 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Nouvel acide nucléique |
| WO2008084319A2 (ja) | 2006-12-18 | 2008-07-17 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | 新規核酸 |
| US10400214B2 (en) | 2008-12-23 | 2019-09-03 | Boco Silicon Valley, Inc. | Target populations of oligodendrocyte precursor cells and methods of making and using same |
-
2001
- 2001-01-05 JP JP2001000868A patent/JP2002034580A/ja active Pending
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|---|---|---|---|---|
| JPWO2003106673A1 (ja) * | 2002-06-17 | 2005-10-20 | 財団法人名古屋産業科学研究所 | 胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法及び単離又は可視化用キット |
| JP4624100B2 (ja) * | 2002-06-17 | 2011-02-02 | 健一郎 小財 | 胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法及び単離又は可視化用キット |
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| JP2012034706A (ja) * | 2004-06-09 | 2012-02-23 | Univ Court Of The Univ Of Edinburgh | 神経幹細胞 |
| US8785187B2 (en) | 2004-06-09 | 2014-07-22 | The University Court Of The University Of Edinburgh | Neural stem cells |
| US9309495B2 (en) | 2004-06-09 | 2016-04-12 | The University Court Of The University Of Edinburgh | Neural stem cells |
| WO2008029790A1 (fr) | 2006-09-04 | 2008-03-13 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Nouvel acide nucléique |
| EP2374884A2 (en) | 2006-09-04 | 2011-10-12 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Human miRNAs isolated from mesenchymal stem cells |
| WO2008084319A2 (ja) | 2006-12-18 | 2008-07-17 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | 新規核酸 |
| US10400214B2 (en) | 2008-12-23 | 2019-09-03 | Boco Silicon Valley, Inc. | Target populations of oligodendrocyte precursor cells and methods of making and using same |
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