JP4624100B2 - 胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法及び単離又は可視化用キット - Google Patents
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ところで、従来、分化した目的細胞が特異的な膜蛋白を発現する場合は、その膜蛋白を指標にフローサイトメトリーで目的の細胞を単離することが行われている(非特許文献1、穂特許文献2参照)
しかし、この方法が適応できるのは、細胞特異的な分子が膜蛋白として細胞外に発現している場合に限られるため、血球系や血管系などの一部の細胞、臓器に応用が限定されるのが実情であった。
このため心筋細胞のように特異的な膜蛋白が知られていない多くの細胞に対する方策としては、目的の細胞に特異的に発現する分子(遺伝子)のプロモーター領域下にマーカー遺伝子をつないだ組換え遺伝子をES細胞に安定導入し、分化した細胞で特異的に発現するそのマーカーを指標に細胞を選別し、単離する方法が報告されている(非特許文献3参照)。この方法は、組織特異的に発現する遺伝子のプロモーターを使うことにより、薬剤耐性遺伝子を細胞特異的に発現させてその薬剤を用いて目的細胞のみを選別する方法、あるいは特異的な波長の励起光で発色する分子を細胞特異的に発現させることによりフローサイトメトリーで目的の細胞を選別して単離する方法である。
ES細胞の取扱いの標準的な方法は、Brigid Hogan他著、山内一也他訳、「マウス胚の操作マニュアル」、近代出版(1997)、あるいは相沢慎一著、「ジンターゲッティング:ES細胞を用いた変異マウスの作製」、実験医学別冊、バイオマニュアルシリーズ8、羊土社(1995)などに記載されている。
リコンビナーゼ発現遺伝子は、リコンビナーゼを発現する遺伝子で、loxPを認識するバクテリオファージP1由来のリコンビナーゼCre(Sternberg et al. J. Mol. Boil. Vol. 150, 467-486 (1981))、FRTを認識する酵母(Saccharomyces cerevisiae)由来のリコンビナーゼFLP (Babineau et al., J. Biol. Chem. Vol.260, 12313-12319 (1985))、チゴサッカロマイセス・ルーイのpSR1プラスミド由来のR(Matsuzaki et al., Mol. Cell. Biol. Vol.8, 955-962 (1988)を発現する遺伝子などを代表例として挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
以下、従来の胚性幹細胞の単離方法を比較例として記載する。
Nkx2.5遺伝子プロモーターは、Yutzey氏より供与を受けたものを使用した。Yutzeyらは、Nkx2.5遺伝子の5’上流のゲノム解析により、Nkx2.5遺伝子の心筋特異的な発現調節を可能とするプロモーター領域について詳しい検討を行っている(詳細は、Development. Vol.125, 4461-4470 (1998)に記載)。これによると転写開始点より5’上流の-3059bpまで含む領域が、Nkx2.5遺伝子の心筋特異的に十分な発現レベルで発現するための最適なプロモーター領域として働くことが確認されている。ちなみに、これより短い領域、つまり転写開始点より5’上流-959bpまで、あるいは逆にこれより長い領域、つまり転写開始点より5’上流-9000bpでも、心筋特異的に十分な発現レベルでこの下流の遺伝子を発現させることはできないことが上記の論文で示されている。このNkx2.5遺伝子の転写開始点より5’上流の-3059bpの領域、マーカー遺伝子の大腸菌のlacZ遺伝子、SV40 small t-intronとpolyA signalがプラスミド pBlueScript SKに挿入されたpNkx2.5-IA-LacZプラスミドをYutzey氏より供与を受けた(詳細は上記Development. Vol.125, 4461-4470 (1998)に記載)。pNkx2.5-IA-LacZ(論文での記載名は-3059Nkx2.5lacZ)は心筋細胞特異的にLacZ遺伝子を発現することが確認されている。
尚、ES細胞用培地は、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(high glucose条件, L-glutamine, 110mg/L sodium pyruvateが含有:シグマ社)に、NaHCO3、125μM 2-mercaptoethanol(ナカライ社)、非必須アミノ酸(Invitrogen社)、核酸、20%胎児牛血清(Invitrogen社)、ストレプトマイシン、ペニシリンを加えたものである。なお、ES細胞の未分化能を維持する際はこのES細胞用培地に103 U/mLでLIFを加えて培養し、ES細胞の分化誘導の際はこのES細胞用培地単独でLIFは添加しないで培養する。
5’側より、CMVプロモーター(human cytomegalovirus immediate early promoter)あるいはCAプロモーター(cytomegarovirus enhancer+chicken β-actin promoter)、その下流に2つのloxP配列で囲まれたNeo遺伝子、さらにその下流のマーカー遺伝子にEGFP遺伝子を配置した第1の組換えDNAを含むプラスミドpCMV-loxP-Neo-EGFPならびにpCA-loxP-Neo-EGFPを作成したが、その作成過程を以下に記載する。
このAd.Nkx2.5-Creはヒト5型アデノウイルスベクターで、細胞に感染、遺伝子導入後はNkx2.5遺伝子プロモーターの制御下にCre遺伝子を発現する。
このフローサイトメトリーの解析では、Ad.Nkx2.5-Creを感染させた群の陽性率、つまりNkx2.5発現細胞は約2%であった(第5図参照)。一方これに対し、陽性コントロールとしてAd.Nkx2.5-Creの代わりにAd.CA-Creを感染させた群での陽性率は(則ちこれはアデノウイルスが感染しCre遺伝子を導入した細胞の割合を表すものである)、約60%であった(第5図参照)。また一方陰性コントロールとしてAd.Nkx2.5-Creの代わりにAd.CMV-LacZを感染させた群、あるいはアデノウイルスベクターを全く感染させなかった群での陽性率は(則ちこれはpCA-loxP-Neo-EGFPの遺伝子が安定導入されているES細胞での、Cre酵素によるloxPが切りだされていない状態でのEGFP発現の漏れ、バックグラウンド)0-0.2%であった(第4図a、第5図参照)。すなわちこの実験系では、非常に高率に約60%の細胞に正しく目的の遺伝子が導入されており、またバックグラウンドがなく、正しく目的のNkx2.5発現細胞を可視化し、さらに単離できるということで、従来不可能だったこれらの技術を解決した非常にすぐれた実験系であることが分かった。
本発明に用いる第2のプロモーターは、Nkx2.5遺伝子プロモーターに限られるものではなく、その他の心筋特異的遺伝子を指標にしたES細胞由来の心筋細胞、あるいはES細胞由来の他の細胞や組織を蛍光顕微鏡下で可視化し、さらに単離する目的で一般化することに広く用いることが可能である。つまり第2のプロモーターさえ目的のものに置換する事で、いかなるES細胞由来の目的細胞をも可視化し単離できる。このような本発明の広い一般的な有用性をさらに確認するために、第2のプロモーターにマウスのαMHC遺伝子プロモーターを用いたアデノウイルスベクターAd.αMHC-Cre、つまりこれはαMHCが発現する心筋細胞に特異的にCre酵素を発現するような組換え遺伝子を導入するアデノウイルスベクターであるが、これを実施例1と同様の方法で作成して同様の実験を行った。
実施例1では第1の組換えDNAが安定導入できたES細胞クローンを最初に取り、そのES細胞に分化誘導過程で第2の組換えDNAをアデノウイルスベクターにより遺伝子導入するという方法を用いたが、実施例3ではES細胞クローンを取るといった作業をすることなしに、第1の組換えDNAも第2の組換えDNAも分化誘導過程のES細胞にアデノウイルスベクターを使って直接遺伝子導入した。
まず実施例1で作成したpCA-loxP-Neo-EGFP、pCMV-loxP-Neo-EGFPからSalI酵素処理により、5’側よりCAプロモーター、リコンビナーゼ認識配列のloxP配列で囲まれたneo遺伝子、ポリA配列、EGFP遺伝子、ポリA配列が繋がった目的のDNA断片を切り出した。一方、アデノウイルスを作成するシャトルベクターのpHM5プラスミド(Mark Kay氏より供与:プラスミドの詳細はH. Mizuguchi and M. Kay: Human Gene Ther vol.10: 2013-2017 (1999)に記載、マルチクローニングサイトの両端にそれぞれI-CeuIとPI-SceIの制限酵素認識配列を有する)は、マルチクローニングサイトのSalI認識配列をSalI酵素で切断し、CIP酵素で末端脱リン酸化処理し、これと上記の切り出された目的のDNA断片とを、T4 DNAリガーゼ酵素でライゲーションすることにより、目的の第1の組換えDNAが挿入されたシャトルベクタープラスミッドpHM-CA-loxP-Neo-EGFP、pHM-pCMV-loxP-Neo-EGFPを各々得た。
実施例1及び実施例2で示したように、従来の技術で第1の組換えDNAを安定発現するES細胞を作成し、良好なクローンを選んでおいて、これに第2の組換えDNAをアデノウイルスで遺伝子導入するという方法と、実施例3のように両方のDNAをアデノウイルスを使って遺伝子導入する方法は、いずれも本発明における意義において本質的な差はない一方、それぞれの利点は目的によって使い分けが有用と考えられる。 二つのDNAの遺伝子導入にアデノウイルスベクターを用いる利点をまとめると以下のようになる。
(1)第1、第2の組換えDNAが安定導入され恒常発現するクローンを取る煩わしい作業の労力、時間を必要としない:つまり実施例1、2で示したように、従来の方法で第1の組換えDNAを導入し安定的に恒常発現するクローンを選んで取るには、労力も時間も必要とする。さらに全くアデノウイルスベクターを使用せず従来の技術だけで遺伝子導入して、第1と第2の組換えDNAの両方を安定的に恒常発現するクローンを選んで取るとすると、さらなる時間と労力を要することになる。この場合それに加え、2種類の異なる薬剤耐性遺伝子を必要とすることになり、これらの多重薬剤耐性遺伝子発現、またそのクローンを選択する煩雑な作業や長期の薬剤使用によるES細胞への影響、つまり細胞の性格の変化など、問題となる可能性があり、またこのような種々の影響で目的のクローンがとれない場合さえもある。
(2)アデノウイルスベクターは分化段階の任意な時期に高率に簡単に目的遺伝子を導入できる:これは従来の技術では不可能なことであったが、アデノウイルスを使えば簡単にできることを、本発明で示した。この利点として、(1)で記載したこととも関連するが、ES細胞に不要な遺伝子や薬剤の長期間の暴露などの、不要な影響を与えない。
(3)アデノウイルスベクターは、宿主細胞(この場合ES細胞)に導入遺伝子をepisomal(染色体に組み込まれることなく核内に存在)の形で安定して長期間発現させるため、安定した結果が得られる:従来の方法で、染色体に目的の遺伝子が組み込まれたES細胞クローンを薬剤耐性遺伝子を利用して取って来る方法の場合、これらの導入遺伝子が染色体にランダムに組み込まれるため染色体上で組み込まれた場所の影響、クロマチン構造の影響などを受ける。このため必ずしも組み込まれた遺伝子が全て安定して発現するわけではないため、(1)に記載したように導入遺伝子を安定発現する良好なクローンを選択してくるのに時間と労力を要する。さらにES細胞では、他の癌細胞株や初代正常培養細胞などを用いた場合に比べ、染色体に組み込まれた導入遺伝子の発現が不安定になりやすいこと、例えば導入遺伝子の発現がシャットオフされる場合もあることが知られている。これに対しアデノウイルスベクターで遺伝子を導入した場合、episomalであるため、このような染色体やクロマチンの影響をうけにくく、安定した発現が得られ、再現性のある安定した結果がいつも得られる。
(4)任意のES細胞株を用いることができる:ES細胞株の種類、またそのクローンやサブクローンによって分化能、性格が異なっている。この場合、ある細胞の単離には、よりその細胞へ分化しやすいことが同定されているES細胞株のクローンを特に指定して使用したい場合が考えられる。実施例3の第1と第2の組換えDNAを遺伝子導入できるアデノウイルスベクターを用いれば、それぞのES細胞株やクローンについて安定細胞株を作成する必要がなく、自由に望みのES細胞を使用して行うことができる。
(5)ES細胞以外にも簡単に遺伝子導入できるため、作成した第1の組換えDNAの特異性を他の細胞で直接的に確認することができる。また他の細胞での実験へも、この遺伝子構築したものが簡単に応用できる。
前述したように、実施例で使用したNkx2.5遺伝子プロモーター及びαMHC遺伝子プロモーターの特異性は既に確認されており、また実際の実験結果でも心筋細胞を単離できることは明らかとなったが、さらに上記の(5)の観点から、実施例3の二つのアデノウイルスで導入したDNAが正しく目的の心筋細胞を特異的に可視化できていることを直接的に証明する目的で、この二つのアデノウイルスをマウスの初代心筋培養細胞に感染させてみた。出生1日目の新生児マウスより心筋を取り出し、これをコラゲナーゼで消化して心筋細胞を単一細胞に分離した後、培養皿に巻いて培養した。この初代心筋細胞培養の手技は、Khalid MA et al. Circ. Res. 72, p725-736 (1993)、ならびにWang L et al. Circ. Res. 79, p79-85 (1996) に記載された方法に基本的に従って行った。このように培養して2日目の心筋細胞に、Ad.Nkx2.5-CreとAd.CA-loxP-Neo-EGFPをそれぞれ5MOIで感染させて、感染72時間後に蛍光顕微鏡下で観察したところ、遺伝子が導入された心筋細胞がEGFP陽性として可視された。同様のプロトコールで、Ad.αMHC-CreとAd.CA-loxP-Neo-EGFPを同じように感染させても、遺伝子導入された心筋細胞はEGFP陽性として可視された。これらの二つのアデノウイルスベクターを他の心筋以外の数種類の培養細胞(Helaヒト子宮頚癌細胞、MKN28ヒト胃癌細胞、LL2マウス肺癌細胞、LM8マウス骨肉腫細胞など)に感染させて、その特異性を検証したが、いずれの細胞でもこのようなEGFPの発現は蛍光顕微鏡でみられなかった。このように実施例1、2、3で用いた第1の組換えDNAと第2の組換えDNAは、遺伝子導入されると明らかに心筋細胞のみを標的化してEGFPで可視化できていることが直接的に証明された。
Claims (11)
- 恒常的強発現プロモーターである第1のプロモーター、リコンビナーゼ認識配列を両端に有する遺伝子、胚性幹細胞から分化する目的細胞の選択マーカー遺伝子の順に5'側から配置され、第1のプロモーターが前記選択マーカー遺伝子を発現させる第1の組換えDNAが導入されたベクターを未分化状態の胚性幹細胞に導入し、得られた第1の組換えDNAが安定導入された胚性幹細胞を分化誘導し、この分化誘導過程の胚性幹細胞に、胚性幹細胞から分化する目的細胞に対して特異的に発現する第2のプロモーター、リコンビナーゼ発現遺伝子の順に5'側から配置された第2の組換えDNAが導入されたアデノウイルスベクターを導入することを特徴とする胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
- 恒常的強発現プロモーターである第1のプロモーター、リコンビナーゼ認識配列を両端に有する遺伝子、胚性幹細胞から分化する目的細胞の選択マーカー遺伝子の順に5'側から配置され、第1のプロモーターが前記選択マーカー遺伝子を発現させる第1の組換えDNAが導入されたアデノウイルスベクターと、胚性幹細胞から分化する目的細胞に対して特異的に発現する第2のプロモーター、リコンビナーゼ発現遺伝子の順に5'側から配置された第2の組換えDNAが導入されたアデノウイルスベクターとを、分化誘導過程の胚性幹細胞に各々導入することを特徴とする胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
- リコンビナーゼ認識配列が、loxPで、リコンビナーゼ発現遺伝子が、リコンビナーゼCre発現遺伝子ある請求項1又は請求項2に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
- 恒常的強発現プロモーターが、CMVプロモーター又はCAプロモーターである請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
- 選択マーカー遺伝子が、蛍光蛋白遺伝子である請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
- 第2のプロモーターが、Nkx2.5遺伝子プロモーター又はαMHC遺伝子プロモーターである請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法。
- 第1の組換えDNAが導入されたベクターが導入された未分化状態の胚性幹細胞と、第2の組換えDNAが導入されたアデノウイルスベクターとを備えた請求項1に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法に用いる単離又は可視化用キット。
- 第1の組換えDNAが導入されたアデノウイルスベクターと、第2の組換えDNAが導入されたアデノウイルスベクターとを備えた請求項2に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法に用いる単離又は可視化用キット。
- 請求項1又は請求項2に記載の胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法により得られる細胞。
- 細胞が、第2のプロモーターとしてNkx2.5遺伝子プロモ−ターを用いて得られる心筋細胞である請求項9記載の細胞。
- 細胞が、第2のプロモーターとしてαMHC遺伝子プロモーターを用いて得られる心筋細胞である請求項9記載の細胞。
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