KR101242114B1 - 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술 및 리포터 유전자를 이용한 생체 내 영상에 의한 형질전환 동물의 선별 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 초음파 영상 기반의 유전자 전달(Ultrasound Image-guided Gene Delivery, UIGD) 기술을 이용한 형질전환 동물의 선별 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 초음파 영상을 기반으로 유전자를 전달함으로써 ED 8.5 내지 9.5일의 초기 발생 단계의 마우스 배아의 뇌실에 유전자를 주입할 수 있고, 마우스 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus, MLV) 기반 레트로바이러스 벡터, 또는 이의 3'LTR이 마우스 줄기세포 바이러스(Murine Stem Cell Virus, MSCV)의 3'LTR로 치환된 레트로바이러스 벡터는 바이러스 역가가 향상되어 고농도로 생산 가능하며, MLV 또는 MSCV의 3'LTR을 사용하고 목적 단백질 및 리포터 유전자가 포함된 레트로바이러스 벡터와 함께, 수포성 구내염 바이러스-G(vescular stomatitis virus, VSV-G) 단백질을 외피 단백질로서 사용하여 제조한 레트로바이러스를 마우스 배아의 뇌실에 주입함으로써, 상기 목적 단백질이 초기 발생 단계의 마우스 배아 및 성체의 뇌세포에서 안정적으로 발현됨을 확인하였고, 한편, 목적 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 마우스 배아의 뇌실에 주입하여, 상기 목적 단백질이 마우스 배아의 뇌세포에서 발현됨을 확인하였다. 이러한 유전자 전달 기술에 있어서 리포터 유전자를 함께 전달하여 그 발현을 확인함으로써 살아있는 상태에서도 목적 유전자가 전달된 형질전환 동물을 간편하게 구별하였으므로, 최적화된 UIGD 기술 및 리포터 유전자를 포함하는 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 유래의 유전자 전달체는 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 선별에 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술 및 리포터 유전자를 이용한 생체 내 영상에 의한 형질전환 동물을 선별하는 방법에 관한 것이다.
형질전환 동물(transgenic animals)은 인위적으로 외부의 유전자를 삽입하거나 또는 유전자를 제거하여 의도하는 유전형질을 발현시킨 동물을 말하며, 생명체에서의 특정 유전자의 역할을 파악하는 기초연구에 유용하게 쓰일 수 있다. 즉, 그 기능이 의심되는 유전자를 삽입 또는 결실시키고, 그 영향이 어떻게 나타나는지를 관찰하여 상기 유전자가 매개하는 생리적 기능을 유추할 수 있다. 뿐만 아니라, 형질전환 동물은 사람 질병의 모델로서 사용할 수 있고, 질병의 원인이나 질병의 진행과정 등을 파악하거나 잠재적 치료약품의 효과나 부작용을 알아보는데 매우 유용하다. 현재 치매, 암, 심장병, 유전병 등의 질병에 걸린 형질전환 마우스들이 개발되고 있다.
형질전환 마우스의 제작이 1980년에 최초로 성공하였는데, 형질전환 동물을 제조하는 방법에는 바이러스 벡터에 원하는 DNA를 삽입하여 숙주세포에 감염시키는 방법, 특정 DNA를 직접 동물의 수정란에 주입하는 방법, 또는 특정 DNA를 먼저 줄기 세포에 주입한 다음 이를 발생중인 수정란에 도입하는 방법 등이 있다. 이러한 형질전환 동물을 제작하는 과정은 실제로 많은 시간과 노력이 요구되고, 외부에서 넣어준 유전자는 염색체의 특정한 부위가 아닌 임의의 부위에 들어가게 되는데, 유전자가 들어간 부위와 세포의 환경에 따라 유전자 발현 효율에 차이가 난다. 이러한 한계를 극복하기 위하여 마우스 태아 뇌의 빈 공간에 플라스미드 DNA를 주입한 후 전기자극을 주어 유전자를 전달하는 In utero electoporation법이 개발되었다(Saito, T. & Nakatsuji, N, 2001, Dev . Biol, 240, 237~246; Tabata, H. & Nakajima, K, 2001, Neuroscience, 103, 865~872). 이는, 특정 유전자를 시간 및 부위 특이적으로 발현하게 하였고, 기존의 방법에 비해 쉽고 빠르게 이용가능함을 확인하였으나, 플라스미드는 유전자를 지속적으로 발현시키기 어렵고 육안으로 관찰하여 유전자를 주입해야 하므로, 수정 후 13 내지 14일 이후에나 유전자 도입이 가능하다는 단점이 있다.
현재, 초음파 영상을 통하여 자궁 내의 태아로 유전자를 주입하는 기술(Ultrasound Image-guided Gene Delivery, UIGD)이 개발되고 있고, 이를 이용하면 수정 후 8 내지 9일의 마우스 태아에게도 유전자를 도입할 수 있게 됨으로써, 기존의 육안에 의한 유전자 주입 기술에 비해 더 작은 태아에게도 원하는 유전자를 특정부위에 도입할 수 있다는 장점이 있다. 특히, 신경으로 분화되기 시작하는 시점이 수정 후 10일(E10)인 것을 고려하면, 신경으로 분화되기 전에 유전자를 도입하여 유전자의 효율적인 국소 발현을 유도할 수 있다는 장점이 있다.
외래 유전자를 개체에 도입할 수 있는 전달체로서 바이러스가 주로 사용되고 있고, 주요 바이러스 벡터로는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 및 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 등이 있으며, 그 밖에 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus, HSV) 또는 폭스바이러스 등이 사용되고 있다. 특히, 레트로바이러스 벡터(Retroviral vector)를 이용하면 원하는 세포 내로 효과적으로 유전자를 전달할 수 있다. 원래 레트로바이러스가 복제될 때에는 자신의 RNA를 역전사효소(reverse transcriptase)를 사용하여 DNA로 만든 다음(유전정보가 거꾸로 흐름으로서 retro라 명명됨), 숙주세포의 염색체 내로 안정적으로 삽입되는 특성이 있다. 이에, 주입하고자 하는 유전자를 레트로바이러스 벡터에 연결한 다음, 이를 숙주세포에 처리하면 세포의 염색체에 원하는 유전자가 삽입된 개체를 얻을 수 있다.
모로니 마우스 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus, MoMLV)에 기초한 레트로바이러스 벡터의 특징을 살펴보면, MoMLV 게놈은 모든 레트로바이러스와 마찬가지로 캡시드 단백질(nucleocapsid protein, gag), 역전사효소(reverse transcriptase, pol) 및 외피 단백질(envelope protein, env) 코딩 부위가 5'LTR(long terminal repeat)과 3'LTR 사이에 포함되어 있다. 상기 gag 유전자는 MA(matrix), CA(capsid) 및 NC(nucleocapsid)의 단백질로 프로세싱되고, pol 유전자는 역전사 효소 및 인터그레이즈(integrase) 유전자 등 복제에 필요한 효소를 코딩하고 있다. env 유전자는 바이러스 외피의 표면 당단백질을 코딩하고 있다. env 당단백질은 숙주세포의 세포 수용체 단백질과 상호작용하여 바이러스 막과 세포막의 융합이 유도되고 이에 의해 바이러스 감염이 일어나게 한다. 상기 3'LTR의 U3은 역전사 과정을 통해 5'LTR로 복제되어 이식유전자 발현을 조절하는 프로모터로서 작용한다. 레트로바이러스 벡터는 이러한 야생형 레트로바이러스를 조작하여 유전자 전달 기능을 수행할 수 있도록 제작한 것으로서, 5' 및 3' LTR을 제외한 부분을 이식유전자로 치환할 수 있다.
레트로바이러스의 숙주범위는 외피 단백질과 그에 상응하는 세포 표면 수용체와의 상호작용에 의해 결정되는데, 숙주세포의 범위를 넓히거나 또는 제한하기 위해 레트로바이러스 본래의 외피 단백질 외의 다른 바이러스의 외막 단백질을 사용하여 슈도타이핑(pseudotyping)하는 것이 가능하다. 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus, GaLV)의 외피 단백질은 사람 조혈모세포로의 감염에 효율적이고, 수포성 구내염 바이러스(vescular stomatitis virus, VSV)의 G 단백질을 이용할 경우 바이러스 스톡(stock)의 농축에 있어 보다 안정적이고 다양한 세포로의 유전자 전달이 가능하다. 따라서, 레트로바이러스 막에 존재하는 외피 단백질은 바이러스의 친화성(tropism)을 결정짓는 중요한 역할을 하기 때문에, 표적 세포 및 개체에 가장 접합한 외피 단백질을 선정하는 것이 중요하다.
한편, 아데노바이러스는 80 내지 90 ㎚의 외피가 없는 바이러스로서, 정20면체 캡시드(icosahedral capsid) 내에 약 36 kb 길이의 선형이중쇄 DNA(linear double-stranded DNA)의 유전자를 포함하고 있다. 아데노바이러스가 유전자 전달을 위한 좋은 벡터로 사용될 수 있는 이유로는, 이들 유전자로부터 조기 서열 E1을 제거하여 복제능력이 없어 지속적인 감염력이 없고, 고역가(1012 입자/㎖ 이상)의 재조합 아데노바이러스 생산이 가능하며, 비교적 큰 cDNA 삽입이 가능하며(최대 7.5 kb), 레트로바이러스와 달리 유전자의 발현을 위해 세포증식을 필요로 하지 않으며, 전달된 유전자가 숙주 염색체에 삽입되지 않아 일시적인 재조합 유전자 발현만 있으므로 유전자 삽입으로 인한 비정상적인 변이를 초래할 위험이 없다. 아데노바이러스는 세포의 특이 수용체에 결합하여 세포 내로 이입됨으로써 에도솜(endosome)을 파괴하고 세포질로 나와 핵으로 이동하여 바이러스 단백질을 합성하며, 자신의 DNA를 복제하여 104∼105개의 자손(progeny)을 방출한다. DNA 복제가 일어나기 전에 4개의 초기발현 유전자(E1~E4)가 먼저 발현되는데, 이 중 E1의 결손이 있으면 거의 모든 세포에서 바이러스 증식이 억제되나, 인간의 배아 신세포에서 유도된 293 세포에서는 증식이 가능하다. E1 및 E3 유전자 부위가 제거되고 외부 유전자가 삽입된 아데노바이러스를 293 세포에 이입하여 증식 불능 재조합 아데노바이러스(replication-defective recombinant adenovirus) 벡터를 대량으로 얻을 수 있다(Ilan Y et al., Semin Liver Dis, 1999;19:49-59). 이러한 재조합 아데노바이러스 벡터는 생체 내에서의 유전자 발현의 영향을 연구하는데 이용되고 있다.
현재, 이러한 초음파 영상 기반의 유전자 전달(Ultra Image guided gene delivery, UIGD) 기술 및 레트로바이러스 시스템을 이용하여 마우스 배아의 뇌에 유전자를 도입하여 형질전환 동물을 제조함에 있어서, 유전자 도입 후 성체 단계까지 이식유전자의 발현이 유지되는 형질전환 개체를 제작한 보고가 없다. 또한, 초음파 영상을 통해 배아의 뇌에 특정 유전자를 도입하는 기술에 있어서, 최적의 레트로바이러스 벡터, 벡터 내 프로모터 및 재조합 레트로바이러스의 확립이 요구되며, 초음파 영상화 및 유전자 주입의 기술을 최적화할 필요가 있다.
한편, 형질전환 동물의 제조에는 형질전환 여부를 확인하는 작업이 수반되어야한다. 표적 유전자가 형질전환된 개체의 선별은, 형질전환된 개체에 있어서 원하는 유전자가 형질전환되었는지 우선 유전자를 검사하고, 발현검사도 실시한다. 일반적으로 개체의 생검(biopsy)을 시행하여 지노믹 DNA(genomic DNA)를 추출하고 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction) 또는 서던 블랏팅(Southern blotting)으로 DNA를 분석함으로써 형질전환된 개체를 선별하고 있고, 면역학적인 방법으로 단백질의 발현 유무를 검사한다. 그러나, UIGD 기술 기반의 형질전환 동물을 제조함에 있어서, 유전자 도입 후 성체 단계에서의 간편한 형질전환 여부 확인 방법을 구축함으로써 원하는 특정 부위로의 유전자 전달을 쉽게 확인할 수 있는 방법이 아직까지 전무하여, 효과적인 연구 수행을 위해 UIGD 기술에 의한 부위 특이적인 유전자 형질전환 여부를 확인할 수 있는 간편하고 쉬운 방법을 도입할 필요가 있다.
이에, 특정 부위에서만 목적 유전자가 국소발현할 수 있는 형질전환 동물 제조에 있어서, 형질전환된 마우스를 희생시키지 않고 살아있는 상태에서 형질전환 여부를 확인할 수 있는 방법을 개발하기 위해 연구한 결과, 초음파 영상 이미지를 이용함으로써 배자기(embryonic day) 8.5 내지 9.5일의 초기 발생 단계의 마우스 배아에 유전자를 주입할 수 있는 시스템을 확립하였고, 리포터 유전자가 포함된 마우스 백혈병 바이러스(Murine Leukemia virus, MLV) 기반 레트로바이러스 벡터, 또는 상기 벡터의 3'LTR 전장이 마우스 줄기세포 바이러스(murine stem cell virus, MSCV)의 3'LTR 부분으로 치환된 레트로바이러스 벡터에 외피 단백질로서 수포성 구내염 바이러스-G(vescular stomatitis virus, VSV-G) 단백질을 사용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 리포터 유전자가 형질전환된 마우스의 뇌세포에서 특이적으로 발현되는 것으로 나타남으로써, 목적 단백질이 살아 있는 상태의 형질전환 마우스의 뇌세포에서 안정적으로 발현됨을 간편하고 쉬운 방법으로 확인하였으므로, UIGD 기술의 최적화된 시스템을 통한 뇌 특이적인 UIGD 유전자 전달체의 확립과 더불어, 리포터 유전자에 의해 형질전환된 마우스를 신속하고 간단하게 선별할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술 및 리포터 유전자를 이용한 생체 내 영상에 의한 형질전환 동물의 선별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 캡시드 단백질(nucleocapsid protein, gag), 역전사효소(reverse transcriptase, pol) 및 외피 단백질(envelope protein, env)을 코딩하는 유전자가 포함되지 않은 마우스 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus, MLV) 유래의 복제-결핍 레트로바이러스 벡터에 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 리포터 유전자가 5' 긴 말단 반복부(long terminal repeat, LTR)와 3'LTR 사이에 포함되고 상기 3'LTR의 유전자 전장이 마우스 줄기세포 바이러스(Murine Stem Cell Virus, MSCV) 유래의 3'LTR 유전자로 치환된 재조합 레트로바이러스 벡터를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조한 재조합 레트로바이러스 벡터, 및 수포성 구내염 바이러스 G(vescular stomatitis virus, VSV-G) 당단백질 발현벡터를 이용하여 레트로바이러스 입자를 제조하는 단계;
3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 레트로바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계;
4) 단계 3)에서 레트로바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계; 및
5) 단계 4)에서 발생시킨 배아 또는 성체에서 리포터 유전자가 발현되는 개체를 선별하는 단계를 포함하는, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 선별 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 캡시드 단백질(nucleocapsid protein, gag), 역전사효소(reverse transcriptase, pol) 및 외피 단백질(envelope protein, env)을 코딩하는 유전자가 포함되지 않은 마우스 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus, MLV) 유래의 복제-결핍 레트로바이러스 벡터에 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 리포터 유전자가 5' 긴 말단 반복부(long terminal repeat, LTR)와 3'LTR 사이에 포함된 재조합 레트로바이러스 벡터를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조한 재조합 레트로바이러스 벡터, 및 수포성 구내염 바이러스 G(vescular stomatitis virus, VSV-G) 당단백질 발현벡터를 이용하여 레트로바이러스 입자를 제조하는 단계;
3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 레트로바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계;
4) 단계 3)에서 레트로바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계; 및
5) 단계 4)에서 발생시킨 배아 또는 성체에서 리포터 유전자가 발현되는 개체를 선별하는 단계를 포함하는, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 선별 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 프로모터, 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자 및 리포터 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 재조합 아데노바이러스 벡터를 아데노바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 재조합 아데노바이러스 입자를 제조하는 단계; 및
3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 재조합 아데노바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계;
4) 단계 3)에서 아데노바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계; 및
5) 단계 4)에서 발생시킨 배아 또는 성체에서 리포터 유전자가 발현되는 개체를 선별하는 단계를 포함하는, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 선별 방법을 제공한다.
최적화된 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술을 이용하여 초기 발생 단계에 있는 미세한 배아의 뇌실 부위로 유전자 전달체를 주입할 수 있고, 목적 단백질의 발현을 위한 프로모터로써, 마우스 백혈병 바이러스(murine leukemia virus, MLV) 또는 마우스 줄기세포 바이러스(Murine Stem Cell Virus, MSCV)의 3'LTR을 사용하고 형질전환된 마우스의 선별을 위한 리포터 유전자가 포함된 레트로바이러스 벡터와, 외피 단백질로서 수포성 구내염 바이러스-G(vescular stomatitis virus-G, VSV-G) 단백질을 사용하여 제조한 레트로바이러스는 높은 바이러스 역가를 나타내며, 뇌세포에서 목적 단백질의 안정적인 발현을 유도하였다. 한편, 아데노바이러스 벡터를 사용하여 목적 단백질 및 리포터 유전자를 암화화하는 유전자를 배아의 뇌세포에 도입하였다. 이때, 상기 리포터 유전자의 발현을 확인함으로써 유전자가 전달된 개체를 쉽고 간단하게 구별하였다. 따라서, 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 무작위적으로 삽입 또는 제거되는 기존의 형질전환 동물과 달리 뇌 부위에서만 발현될 수 있게 하였고, 시간과 비용 절감의 효과를 확인함으로써, 최적화된 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술 및 이를 위한 레트로바이러스 유전자 전달체는 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 제조에 유용하게 사용될 수 있으며, 이러한 유전자 전달 기술에 있어서 리포터 유전자를 함께 전달하여 그 발현을 확인함으로써 살아있는 상태에서도 목적 유전자가 전달된 동물을 간편하게 구별할 수 있으므로, 이는 목적 유전자가 형질전환된 동물의 선별에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 레트로바이러스 벡터의 구조를 나타낸 그림이다.
MT: 모로니 마우스 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia virus, MoMLV)를 근간으로 하여 MoMLV 5'과 3'LTR을 가진 벡터;
MS: MT 벡터의 3'LTR 부위가 마우스 줄기세포 바이러스(Murine Stem Cell Virus, MSCV)의 3'LTR 부위로 치환된 벡터;
MP: MT 벡터의 3'LTR 부위가 골수증식성 육종 바이러스(Myeloproliferative Sarcoma Virus, MPSV)의 3'LTR 부위로 치환된 벡터; 및
MF: MT 벡터의 3'LTR 부위가 비장 포커스-형성 바이러스(Spleen Forcus-Forming Virus, SFFV)의 3'LTR 부위로 치환된 벡터.
도 2는 레트로바이러스 외피 단백질에 따른 일차 신경줄기세포(primary neural stem cell, primary NSC)에서의 유전자 전달효율을 나타낸 그래프이다.
Eco: Ecotropic;
Ampho: Amphotropic;
VSV-G: 수포성 구내염 바이러스(vescular stomatitis virus, VSV)의 G 단백질; 및
Rabies G: 광견병 G 단백질.
도 3은 레트로바이러스 벡터의 역가(titier)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 레트로바이러스 벡터의 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP)의 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 신경줄기세포에서 레트로바이러스 벡터의 비활성화 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 마우스 뇌에서 CE 및 MS 벡터의 발현 양상을 나타낸 그림이다:
LV: 측뇌실(lateral ventricle).
도 7은 다양한 단계의 마우스 신경계에서 레트로바이러스 벡터의 발현 양상을 나타낸 그림이다.
A: 뇌;
B: 척수; 및
C: 뇌의 다양한 세포에서 MS 벡터의 발현 확인.
도 8은 아데노바이러스 벡터의 구조를 나타낸 그림이다.
도 9는 아데노바이러스 벡터(pAxCAwtit2)의 구조를 상세하게 나타낸 그림이다.
도 10은 ED 14.5 시기의 배아에 대하여 항-GFP 항체 및 항-class Ⅲ β-tubulin 항체로 공염색한 결과를 나타낸 그림이다:
LV: 측뇌실(lateral ventricle);
VZ: 뇌실영역(ventricular zone);
녹색: 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP); 및
적색: 항-class Ⅲ β-tubulin.
도 11은 루시퍼라제 이미징 기술을 통한 유전자 전달 여부 및 유전자 발현 키네틱스 분석을 나타낸 그림이다.
MT: 모로니 마우스 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia virus, MoMLV)를 근간으로 하여 MoMLV 5'과 3'LTR을 가진 벡터;
MS: MT 벡터의 3'LTR 부위가 마우스 줄기세포 바이러스(Murine Stem Cell Virus, MSCV)의 3'LTR 부위로 치환된 벡터;
MP: MT 벡터의 3'LTR 부위가 골수증식성 육종 바이러스(Myeloproliferative Sarcoma Virus, MPSV)의 3'LTR 부위로 치환된 벡터; 및
MF: MT 벡터의 3'LTR 부위가 비장 포커스-형성 바이러스(Spleen Forcus-Forming Virus, SFFV)의 3'LTR 부위로 치환된 벡터.
도 2는 레트로바이러스 외피 단백질에 따른 일차 신경줄기세포(primary neural stem cell, primary NSC)에서의 유전자 전달효율을 나타낸 그래프이다.
Eco: Ecotropic;
Ampho: Amphotropic;
VSV-G: 수포성 구내염 바이러스(vescular stomatitis virus, VSV)의 G 단백질; 및
Rabies G: 광견병 G 단백질.
도 3은 레트로바이러스 벡터의 역가(titier)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 레트로바이러스 벡터의 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP)의 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 신경줄기세포에서 레트로바이러스 벡터의 비활성화 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 마우스 뇌에서 CE 및 MS 벡터의 발현 양상을 나타낸 그림이다:
LV: 측뇌실(lateral ventricle).
도 7은 다양한 단계의 마우스 신경계에서 레트로바이러스 벡터의 발현 양상을 나타낸 그림이다.
A: 뇌;
B: 척수; 및
C: 뇌의 다양한 세포에서 MS 벡터의 발현 확인.
도 8은 아데노바이러스 벡터의 구조를 나타낸 그림이다.
도 9는 아데노바이러스 벡터(pAxCAwtit2)의 구조를 상세하게 나타낸 그림이다.
도 10은 ED 14.5 시기의 배아에 대하여 항-GFP 항체 및 항-class Ⅲ β-tubulin 항체로 공염색한 결과를 나타낸 그림이다:
LV: 측뇌실(lateral ventricle);
VZ: 뇌실영역(ventricular zone);
녹색: 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP); 및
적색: 항-class Ⅲ β-tubulin.
도 11은 루시퍼라제 이미징 기술을 통한 유전자 전달 여부 및 유전자 발현 키네틱스 분석을 나타낸 그림이다.
하기, 본 발명에서 사용한 용어를 정의한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "목적 단백질"은 숙주세포에서 발현하고자 하는 또는 발현할 수 있는 모든 단백질을 포함한다. 예를 들면, 성장속도 등을 조절하는 단백질, 상업적 가치를 가지는 외부 단백질, 바이러스 또는 다른 미생물에 대한 질병 저항성을 주는 단백질, 치료하고자 하는 질병과 관련된 효소 또는 단백질, 및 세포 내 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "역가(titer)"는 숙주세포로 도입하기 위한 바이러스 입자의 수를 말하며, 일반적으로 높은 역가의 레트로바이러스일 때 감염 효율도 높고, 특히 많은 수의 세포를 감염시키고자 할 때는 높은 역가의 바이러스가 요구된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "슈도타이핑(pseudotyping)"은 바이러스 게놈의 env 유전자 전체 또는 일부분을 이종의 다른 유전자로 교체 또는 치환되는 것을 의미하며, 이러한 경우 원래의 바이러스가 가지는 숙주 범위가 확장되거나 변할 수 있고 감염성을 증가시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "형질전환(transfection)"은 플라스미드 형태의 DNA를 세포에 물리화학적으로 직접 도입하거나 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 외래 유전자를 발현시키는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술(ultrasound image-guided gene delivery, UIGD)을 통하여 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 선별 방법을 제공한다.
상기 선별 방법은 구체적으로,
1) 캡시드 단백질(nucleocapsid protein, gag), 역전사효소(reverse transcriptase, pol) 및 외피 단백질(envelope protein, env)을 코딩하는 유전자가 포함되지 않은 마우스 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus, MLV) 유래의 복제-결핍 레트로바이러스 벡터에 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 리포터 유전자가 5' 긴 말단 반복부(long terminal repeat, LTR)와 3'LTR 사이에 포함되고 상기 3'LTR의 유전자 전장이 마우스 줄기세포 바이러스(Murine Stem Cell Virus, MSCV) 유래의 3'LTR 유전자로 치환된 재조합 레트로바이러스 벡터를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조한 재조합 레트로바이러스 벡터, 및 수포성 구내염 바이러스 G(vescular stomatitis virus, VSV-G) 당단백질 발현벡터를 이용하여 레트로바이러스 입자를 제조하는 단계;
3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 레트로바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계;
4) 단계 3)에서 레트로바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계; 및
5) 단계 4)에서 발생시킨 배아 또는 성체에서 리포터 유전자가 발현되는 개체를 선별하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 선별 방법은,
1) 캡시드 단백질(nucleocapsid protein, gag), 역전사효소(reverse transcriptase, pol) 및 외피 단백질(envelope protein, env)을 코딩하는 유전자가 포함되지 않은 마우스 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus, MLV) 유래의 복제-결핍 레트로바이러스 벡터에 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 리포터 유전자가 5' 긴 말단 반복부(long terminal repeat, LTR)와 3'LTR 사이에 포함된 재조합 레트로바이러스 벡터를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조한 재조합 레트로바이러스 벡터, 및 수포성 구내염 바이러스 G(vescular stomatitis virus, VSV-G) 당단백질 발현벡터를 이용하여 레트로바이러스 입자를 제조하는 단계;
3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 레트로바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계;
4) 단계 3)에서 레트로바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계; 및
5) 단계 4)에서 발생시킨 배아 또는 성체에서 리포터 유전자가 발현되는 개체를 선별하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 형질전환 동물은 뇌세포의 게놈 DNA 내로 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 안정적으로 삽입되어 기관, 조직 및 세포에서 목적하는 단백질이 안정적으로 발현되는 동물인 것이 바람직하다.
상기 레트로바이러스 벡터는 마우스 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus, MoMLV)-기반 시스템을 사용할 수 있으며, 감염된 세포 내에서 자유롭게 복제 및 재생산되어 다른 세포를 감염시키는 문제를 방지하기 위하여 입자 형성과 복제에 관여하는 gag, pol 및 env 유전자가 제거된 복제-결핍 레트로바이러스 시스템을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 단계 1)의 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 특별하게 한정되지 않고, 뇌세포에서 발현시키기 위한 임의의 유전자를 삽입할 수 있고, 예를 들면, 효소, 성장인자, 사이토카인, 수용체 및 구조 단백질과 같은 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 사용될 수 있다.
상기 단계 1)의 리포터 유전자는 목적 유전자가 도입된 세포의 선택을 가능하게 하는 적당한 리포터 유전자가 LTR 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고, 상기 리포터 유전자는 약제 내성 유전자, 형광 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 리포터로서 기능할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자가 포함될 수 있으며, 루시퍼라아제(luciferase), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 증강된 적색 형광 단백질(enhanced red fluorescent protein, ERFP), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 퍼록시다아제(peroxidase) 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyltransferase)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 암호화하는 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 리포터 유전자는 레트로바이러스 벡터 중에 존재하는 LTR의 프로모터에 의해 발현이 제어되도록, 재조합 레트로바이러스 벡터 내에 삽입하여 사용할 수 있다. 또한 상기 유전자의 전사를 위해서 프로모터 및 전사 개시부위와 공동하는 다른 조절요소, 예를 들면 인핸서 서열이 벡터 내에 존재할 수도 있고, 도입된 유전자는 그 하류에 터미네이터 서열을 함유할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 레트로바이러스 입자는 단계 1)의 재조합 레트로바이러스 벡터, 레트로바이러스 유래의 gag-pol 발현벡터, 및 수포성 구내염 바이러스 G(vescular stomatitis virus, VSV-G) 당단백질 발현벡터를 숙주세포에 공형질전환(cotransfection)하는, 3-플라스미드 형질전환 방법에 의해 제조하는 것이 바람직하고, 상기 단계 1)의 레트로바이러스 벡터, 및 VSV-G 외피 단백질 발현벡터를, 레트로바이러스의 구조 단백질(gag, pol 또는 env)을 코딩하는 유전자가 미리 도입된 레트로바이러스 패키징 세포에 형질전환시킴으로써 제조할 수도 있다.
상기 공형질전환하는 숙주세포는 소, 돼지 또는 쥐와 같은 포유류의 동물세포인 것이 바람직하고, 보다 구체적으로는 소의 배아섬유아세포, 마우스의 배아섬유아세포, 또는 HeLa 세포인 것이 바람직하며, 293T 세포인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 공형질전환은 리포펙타민 매개된 방법, 인산 칼슘(CaPO4) 침전법, 염화 칼슘(CaCl2) 침전법, DEAE-덱스트란-매개된 방법, 폴리브렌-매개된 방법, 전기천공법(electroporation), 미세주입(microinjection), 리포좀 융합, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염 및 바이오리스틱스(biolistics)를 사용하여 전달하는 방법을 사용하여 수행할 수 있고, 리포펙타민 매개된 방법을 사용하여 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, 핵산을 세포에 도입하는 어떠한 방법도 포함하며, 유전자를 전이하고자 하는 세포의 종류에 따라 당업계에 공지된 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.
상기 단계 2)의 레트로바이러스 입자는 MLV-유래의 복제-결핍 레트로바이러스 벡터를 gag-pol 및 VSV-G 발현 벡터와 공형질전환시켜 수득한 VSV-G 슈도타입의 레트로바이러스(VSV-G pseudotyped retrovirus) 입자인 것이 바람직하다.
상기 단계 2)에서 수득한 레트로바이러스 입자에는 바이러스를 숙주세포에 높은 효율로 감염시키기 위한 폴리양이온 폴리머인 폴리브렌(polybrene), 또는 레트로바이러스 입자의 결합활성을 유도하는 물질인 리포펙타민(lipofectamince) 또는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)을 처리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하고, 상기 폴리브렌은 최종농도 60 ~ 100 ㎍/㎖로 처리하거나 바람직하게는 80 ㎍/㎖로 처리할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 3)의 포유동물은 마우스, 랫드, 돼지, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이, 소 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 마우스인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 3)의 배아는 배자기(embryonic day) 6 내지 14일인 것이 바람직하고, 8 내지 12일인 것이 더욱 바람직하고, 8.5 내지 9.5일인 초기 발생 단계의 배아인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 3)의 미세주입은 그 말단이 10° 내지 50° 각도로 연마된 마이크로피펫(micropipette)을 사용하여 수행되는 것이 바람직하고 20° 내지 30°로 연마된 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하며, 25°로 연마된 것을 사용하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 5)의 리포터 단백질의 발현은 형질전환 동물을 살아있는 상태로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, gag, pol 및 env 유전자가 제거되고 외래의 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 형태의 MoMLV 기반의 레트로바이러스 벡터(MT)를 바탕으로 하여, 양쪽 말단에 위치한 LTR 중 3'LTR 부분을 다른 레트로바이러스{마우스 줄기세포 바이러스(murine stem cell virus, MSCV)(MS), 골수증식성 육종 바이러스(myeloproliferative sarcoma virus, MPSV)(MP) 및 비장 포커스-형성 바이러스(spleen forcus-forming virus, SFFV)(MF)}의 3'LTR로 치환함으로써 목적 단백질의 발현을 유도하는 프로모터를 교환한 형태의 레트로바이러스 벡터들을 제조하였다(도 1 참조). 상기 제조한 레트로바이러스 벡터, gag-pol 발현벡터 및 env 발현 벡터를 293T 세포에 형질전환시켜 세포의 상층액으로부터 레트로바이러스를 수득하였다.
상기 레트로바이러스 벡터의 표적세포에 대한 감염은 바이러스 외피(env) 단백질과 세포 수용체 간의 특이적 상호작용을 통하여 일어나고 이러한 상호작용이 숙주 범위(host range)와 감염 효율(efficiency of infection)을 결정한다. 현재까지, 외피 단백질을 다른 외피 단백질로 치환하여 캡슐화(encapsidated) 할 수 있고(Zavadam et al., 1972, J. Gen. Virol. 15, 183-191), 숙주 범위는 바이러스의 외피 단백질의 치환에 의하여 변할 수 있다고 알려져 있다(Weissm et al., 1977, Virology, 76, 808-825; Miller et al., 1991, J. Virol. 65, 2220-2224; Wilson et al., 1989, J. Virol. 63, 2374-2378; Emi et al., 1991, J. Virol. 65, 1202-1207). 이에, 본 발명자들은 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술을 이용하여 초기 발생 단계의 배아의 뇌에 외래 유전자를 효과적으로 도입할 수 있는 레트로바이러스 시스템을 구축하고자 최적의 외피 단백질을 선별하고자 하였다. Ecotropic, Amphotropic, VSV-G, 및 Rabies G 외피 단백질을 이용하여, GFP를 발현하는 레트로바이러스를 제조하여 이를 일차 신경줄기세포에 형질전환한 결과, Ecotropic, Amphotropic, VSV-G, 및 Rabies G 외피 단백질 중 VSV-G 외피 단백질을 사용한 경우 형질전환 효율이 약 92%로 가장 높게 나타났다. 이로써, 본 발명의 레트로바이러스 벡터가 일차 신경줄기세포에 가장 효율적으로 도입되어 발현될 수 있게 하는 최적 외피 단백질이 VSV-G임을 입증하였다(도 2 참조).
본 발명자들은 신경줄기세포에 대하여 높은 역가를 나타내는 레트로바이러스 벡터를 확인하기 위하여, 서로 다른 레트로바이러스의 3'LTR에 따른 4 종류의 레트로바이러스 벡터{MoMLV(MT), MSCV(MS), MPSV(MP) 또는 SFFV(MF)}로 제조한 레트로바이러스의 역가를 비교하였다. 그 결과, MT 및 MS 벡터의 형질전환 효율이 각각 38.47% 및 42.90%로 가장 높았으며, MP 및 MF 벡터는 대조군인 CE 벡터와 유사한 수준으로 확인되었고, 바이러스 역가는 MT 또는 MS 벡터 모두 2.0×107을 나타내어 다른 벡터의 역가 보다 현저히 높은 것으로 나타났다. 이에, MoMLV 또는 MSCV의 3'LTR이 다른 바이러스의 3'LTR에 비해 바이러스 역가 측면에서 더욱 우수하다는 것을 알 수 있었다(도 3 참조).
본 발명자들은 레트로바이러스 벡터의 유전자 발현량을 확인함으로써 신경줄기세포에서의 효율성을 확인하기 위하여, 상기 4 종류의 레트로바이러스 벡터를 이용하여 제조한 레트로바이러스를 마우스 배아섬유아세포(NIH3T3) 또는 일차 신경줄기세포에 형질전환시킨 결과, NIH3T3에 있어서, MS 및 MT 벡터는 각각 CE 벡터보다 약 3배 및 약 1.5배 높은 GFP 발현량 나타냈고, MP 및 MF 벡터는 CE 벡터보다 약 30% 낮은 GFP 발현량을 나타냈다. 일차 신경줄기세포에 있어서는, MS 벡터가 CE 벡터에 비해 1.5배 높은 GFP 발현량을 나타냄으로써 가장 효과적인 벡터로 확인되었다. 이에, MSCV 3'LTR의 프로모터 활성이 신경줄기세포에 있어서 가장 효과적인 것으로 확인되었다(도 4 참조).
MoMVL LTR 근간 레트로바이러스 벡터의 프로모터는 줄기세포 특성을 갖는 세포에서는 종종 침묵(silencing) 되는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 MoMLV 3'LTR 부위를 다른 레트로바이러스의 3'LTR로 치환함으로써, 각각의 레트로바이러스 벡터의 신경줄기세포에 대한 유전자 침묵 여부를 확인하기 위하여, 일차 신경줄기세포에서 레트로바이러스 벡터들의 유전자 발현이 시간이 지남에 따라 어떻게 변하는지를 시험관 내(in vitro)에서 GFP+ 세포 비율(GFP+ cell%)의 변화를 비교하였다. 그 결과, 일차 뉴로스피어에서 GFP+ cell%를 100이라고 하였을 때, CE 벡터는 삼차 뉴로스피어에서 약 50% 정도 GFP+ cell%가 감소하였으나, MT, MS 및 MP 벡터는 약 20% 정도 감소하였고, MF 벡터는 약 70%정도가 감소하였다. 이에, MoMLV, MSCV 및 MPSV 3'LTR은 신경줄기세포에 있어서 프로모터의 활성을 비교적 안정적으로 유지한다는 것을 알 수 있었다(도 5 참조).
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 상기와 같이 UIGD 기술에 가장 적합한 레트로바이러스 벡터로 확인된 MT 및 MS 벡터 중 MS 벡터를 선택하여, 이와 VSV-G 외피 단백질 발현 벡터를 사용하여 레트로바이러스를 제조한 후, 최종농도 80 ㎍/㎖의 폴리브렌(polybrene)을 첨가하였다. 그런 다음, 가늘게 뽑은 모세관(capillary) 끝을 25° 각도로 연마하여 주입 바늘로써 사용하여, 배자기(embryonic day) 8.5일 내지 9.5일의 배아를 임신한 ICR 마우스의 자궁을 꺼내서 Vevo 660TM High-Resolution Imaging System(Visual Sonic Inc., Toronto, Canada)을 사용한 자궁 속 배아의 초음파 영상하에서, 배아의 뇌실(ventricle)에 상기 레트로바이러스 0.5 ㎕를 주입하였다. 그리고 나서, 자궁을 모체 복부의 원래 위치에 옮겨놓은 후 배아를 발생시켰다.
본 발명자들은 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술을 사용하여 배아 뇌실에 주입한 레트로바이러스 벡터의 발현 양상을 확인하기 위하여, 상기와 같이, mCherry 단백질을 발현하는 레트로바이러스를 주입한 후, E14.5 및 P22 시점에 mCherry 단백질의 발현양상을 비교하였다. 그 결과, E14.5에서는 신경전구세포(neural progenitor cell) 및 분화하는 뉴런들이 존재하는 부위에서 MS 벡터가 발현하는 것을 확인하였고, P22에는 뇌 발생이 거의 끝난 마우스 뇌에서도 mcherry를 발현하는 세포을 확인하였다. 이에, MS 벡터는 마우스 뇌에서 EF1a 프로모터를 가지는 CE 벡터와 비슷한 수준의 유전자 발현 양상을 보인다는 것을 확인함으로써, MSCV의 3'LTR의 프로모터 활성이 효과적으로 작용하는 것을 알 수 있었다(도 6 참조).
본 발명자들은 다양한 발생 단계의 마우스 중추신경계(central nervous system, CNS)에서 레트로바이러스 벡터의 발현 양상을 확인하기 위하여, E9.5 태아 뇌실에 MS-GFP 벡터로 제조된 레트로바이러스를 전달한 후, E14.5 및 생후(P0, P28, 및 P42)에 마우스 뇌와 척수의 GFP 단백질 발현 양상을 분석하였다. 그 결과, E14.5 태아 뇌에서 있어서, 측뇌실(lateral ventricle) 주변에 방사형 신경교시원세포(glial progenitor cell)의 형태를 보이는 GFP+ 세포가 존재하였고, 뉴런(neuron)들이 위치하는 피질판(cortical plate)에도 다수의 GFP+ 세포를 관찰할 수 있었다. 생후에도 뇌실 영역(ventricle zone) 및 다양한 뇌 부위에 GFP+ 세포가 널리 퍼져 분포되어 있는 양상을 보여주었으며, P28 및 P42 마우스 뇌에는 완전히 분화된 형태를 갖는 세포들이 확인되었다(도 7A 참조). 또한, 각 시기의 척수에서도 GFP가 잘 발현되는 것으로 확인되었다(도 7B 참조). 아울러, 완전히 분화된 뉴런 및 성상교세포(astrocyte)에서도 성숙한 뉴런 마커인 NeuN, 또는 성상교세포 마커인 GFAP와 공위치하는 GFP+ 세포를 관찰할 수 있었다(도 7c 참조). 이에, MS 벡터는 마우스 배아의 뇌와 척수에 효과적으로 전달되어 다양한 발생 단계의 마우스 CNS, 성숙한 뉴런 및 성상교세포에서 유전자를 안정적으로 발현한다는 것을 알 수 있었다.
본 발명자들은 초음파 영상을 이용하여 태아 뇌실에 레트로바이러스를 전달할 경우, 생체 내 루시퍼라제 이미징 기술을 사용하여 유전자 발현 여부를 관찰할 수 있는지 확인하기 위하여, MS 벡터의 발현 키네틱스를 분석하였다. 분석 결과, 유전자가 전달된 배아에서 루시퍼라제 활성이 관찰되었고(도 8a 참조), 생후 4주, 12주, 17주의 성체 마우스에서도 신호가 관찰되었으며, 생후 17주까지 유전자가 효과적으로 발현되는 것을 확인하였다(도 8b 참조). 이에, 생체 내 루시퍼라제 이미징 기술을 이용하면 마우스를 희생할 필요 없이 유전자가 전달된 개체를 쉽게 구별할 수 있음을 알 수 있었다.
또 다른, 상기 선별 방법은 구체적으로,
1) 프로모터, 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자 및 리포터 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 재조합 아데노바이러스 벡터를 아데노바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 재조합 아데노바이러스 입자를 제조하는 단계; 및
3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 재조합 아데노바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계;
4) 단계 3)에서 아데노바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계; 및
5) 단계 4)에서 발생시킨 배아 또는 성체에서 리포터 유전자가 발현되는 개체를 선별하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 프로모터는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter)를 사용할 수 있으며, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), SRα 프로모터(Molecular and Cellular Biology, 8: 466-472, 1991), EF-1α 프로모터(Gene 91: 217-223, 1990), 또는 CMV 프로모터 (Foecking M.K. 등, Gene 45: 101-105 (1986))인 것이 바람직하며, CAG 프로모터인 것이 가장 바람직하나, 생체 내에서 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있는 프로모터는 모두 사용가능하다.
상기 CAG 프로모터는 시토메갈로바이러스 인헨서(cytomegalovirus enhancer), 닭 β-액틴 프로모터(chicken β-actin promoter), 및 토끼 β-글로빈 폴리 A 시그날(rabbit β-globin poly A signal)로 구성될 수 있다.
상기 단계 1)의 목적 단백질을 암호화하는 유전자는 특별하게 한정되지 않고, 뇌세포에서 발현시키기 위한 임의의 유전자를 삽입할 수 있고, 예를 들면, 효소, 성장인자, 사이토카인, 수용체 및 구조 단백질과 같은 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 사용될 수 있다. 상기 유전자는 아데노바이러스 벡터 중에 존재하는 프로모터에 의해 발현이 제어되도록, 재조합 아데노바이러스 벡터 내에 삽입하여 사용할 수 있다. 또한 상기 유전자의 전사를 위해서 프로모터 및 전사 개시부위와 공동하는 다른 조절요소, 예를 들면 인핸서 서열이 벡터 내에 존재할 수도 있고, 도입된 유전자는 그 하류에 터미네이터 서열을 함유할 수 있다.
상기 단계 1)의 재조합 아데노바이러스 벡터는 하기 도 8에 도시된 개열지도를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 아데노바이러스 생산 세포주는 아데노바이러스를 생산하는 세포주를 사용할 수 있으며, 아데노바이러스 생산 세포주인 293 세포를 사용하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 3)의 포유동물은 마우스, 랫드, 돼지, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이, 소 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 마우스인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 3)의 배아는 배자기(embryonic day) 6 내지 14일인 것이 바람직하고, 8 내지 12일인 것이 더욱 바람직하고, 8.5 내지 9.5일인 초기 발생 단계의 배아인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 3)의 미세주입은 그 말단이 10° 내지 50° 각도로 연마된 마이크로피펫(micropipette)을 사용하여 수행되는 것이 바람직하고 20° 내지 30°로 연마된 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하며, 25°로 연마된 것을 사용하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 5)의 리포터 단백질의 발현은 형질전환 동물을 살아있는 상태로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 상용벡터(pAxCAwtit2, TaKaRa, Osaka, Japan)에 목적 유전자로서 GFP 유전자를 이와 작용가능하게 연결하여, 아데노바이러스 제작에 적합하도록 재조합 아데노바이러스 벡터 및 재조합 아데노바이러스 입자를 제조하였다(도 8 및 9 참조).
본 발명자들은 가늘게 뽑은 모세관(capillary) 끝을 25° 각도로 연마하여 주입 바늘로써 사용하여, 배자기 8.5 내지 9.5일의 배아를 임신한 ICR 마우스의 자궁을 꺼내어 Vevo 660TM High-Resolution Imaging System(Visual Sonic Inc., Toronto, Canada)을 사용한 자궁 속 배아의 초음파 영상하에서, 배아의 뇌실(ventricle)에 상기 제조한 아데노바이러스를 주입하였다. 그리고 나서, 자궁을 모체 복부의 원래 위치에 옮겨놓은 후 배아를 발생시켰다.
본 발명자들은 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술을 사용하여 배아 뇌실에 주입한 아데노바이러스 벡터의 발현 양상을 확인하기 위하여, 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP)을 발현하는 아데노바이러스를 주입한 후, ED 14.5일 시점에 GFP 단백질 및 신경세포 마커 단백질(class Ⅲ β-tubulin, TuJ1)의 발현양상을 비교하였다. 그 결과, ED 14.5일의 배아에서 신경전구세포(neural progenitor cell) 및 분화하는 뉴런들이 존재하는 부위에서 GFP 단백질이 발현하는 것을 확인하였다(도 10 참조).
따라서, 마우스 배아에 대한 목적 유전자 미세주입 시 초음파 영상을 이용함으로써, ED 8.5 내지 9.5일의 초기 발생 단계 배아의 뇌 부위에 유전자를 효과적으로 주입할 수 있는 시스템을 확립하였고, 목적 단백질이 초기 발생 단계의 포유동물 배아의 뇌세포에서 안정적으로 발현될 뿐만 아니라 성체의 뇌세포에서도 안정적으로 발현되는 최적의 유전자 전달체 및 외피 단백질을 확인하였고, 상기 유전자 전달체에 리포터 유전자가 포함됨으로써 최적화된 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술을 이용한 형질전환 동물을 희생할 필요없이 살아있는 상태에서도 간단하게 선별할 수 있는 시스템을 구축하였으므로, 목적 유전자 및 리포터 유전자가 포함된 상기 유전자 전달체는, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 선별에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
레트로바이러스(
retrovirus
) 벡터 플라스미드의 제조
초음파 영상 기반의 유전자 전달(Ultrasound Image-guided Gene Delivery, UIGD) 기술에서 유전자 전달체로 주로 사용된 CE 레트로바이러스 벡터는 모로니 마우스 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus, MoMLV) 기반 벡터로써, MoMLV의 LTR(long terminal repeat)을 양쪽 말단에 가지고 있으며, 바이러스 역가를 올리기 위해 5'LTR에 CMV 프로모터가 삽입된 형태이다. 또한, 내부 프로모터로서 EF1α(Xenopus elongation factor-α enhancer/promoter) 프로모터를 갖는다(도 1). 4 종류의 서로 다른 레트로바이러스의 LTR을 가진 벡터들은 상기 MoMLV 기반의 레트로바이러스 벡터인 MT를 골격(backbone)으로 하여, MT의 3'LTR을 마우스 줄기세포 바이러스(murine stem cell virus, MSCV), 골수증식성 육종 바이러스(myeloproliferative sarcoma virus, MPSV) 또는 비장 포커스-형성 바이러스(spleen forcus-forming virus, SFFV)의 3'LTR로 치환한 형태로 제조하였다(도 1). 이때, 상기 벡터들에서는 MoMLV 5'LTR의 U3가 패키징 세포(packaging cell)에서 바이러스를 생산하는 프로모터 역할을 하며, 형질도입된 세포에서는 역전사 과정을 통해 3'LTR의 U3가 5'LTR로 복제되어 이식유전자(transgene)를 발현하는 프로모터로서 작용한다.
레트로바이러스의 제조
상기 실시예 <1-1>에서 준비한 레트로바이러스 벡터 플라스미드 4 ㎍, pCA-gag-pol 4 ㎍, 외피 단백질을 암호화하는 벡터(예를 들면, pCA-Ecotropic, pCA-amphotropic, pCA-VSVG, 또는 pCA-Rabies G 등) 2 ㎍을, 100 ㎜ 배양 접시 당 5 × 106 세포수의 농도로 하룻밤 배양한 293T 세포에 리포펙타민(lipofectamin)(Invitrogen, Karlsruhe, Germany) 및 plus reagent(Invitrogen)을 사용하여 형질전환하였다. 형질전환 후 3시간 뒤 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)(Gibco, Carlsbad, CA)이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지로 교환하였다. 48시간 동안 배양한 후 배양액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하여, 여과한 30 ㎖의 배양액을 원심분리 튜브(Beckman, Palo Alto, CA)에 넣고 SW32 rotor(Beckman)로 25,000 rpm에서 1시간 30분간 초원심분리(ultracentrifugation) 하였다. 원심분리 후 상층액을 제거한 후 펠릿(pellet)을 50 ㎕의 PBS에 녹여 4℃에서 하룻밤 동안 방치하고, 하룻밤 뒤 이를 -80℃에 보관하였다.
일차
NSC
에 적합한 레트로바이러스 외피 단백질(
env
)의 확인
레트로바이러스의 막에 존재하는 외피 단백질은 바이러스의 친화성(tropism)을 결정하는데 중요한 역할을 한다. 이에, 일차 NSC에 가장 적합한 바이러스 외피를 선정하기 위해, 마우스 세포에 감염이 가능하다고 알려진 Ecotropic, amphotropic, VSV-G, 및 Rabies G env를 비교하였다. NIH3T3 또는 일차 NSC를 표적세포로 하여 상기 4 종류의 외피 단백질을 비교하였다. NLS가 부착된 AcGFP1 유전자를 발현하는 CE-GN 벡터를 각각의 외피 발현벡터와 293T에 3-플라스미드 형질도입 방법으로 전달한 뒤 2일 후에 레트로바이러스를 수득하였다. qRT-PCR을 통해 4 종류의 바이러스를 적정(titeration)한 후, 동일한 역가로 NIH3T3 또는 일차 NSC에 형질도입하였다.
그 결과, NIH3T3에서는 Ecotropic 외피로 슈도타입화(pseudotyping)된 벡터의 형질도입 효율이 81.59%로 가장 높았으며, VSV-G 또는 Rabies G로 슈도타입화된 벡터는 각각 13.10% 및 11.50%로 낮은 형질도입 효율을 보였다. 그러나, NIH3T3과는 달리, 일차 NSC에 형질도입한 결과, VSV-G로 슈도타입화된 바이러스가 92.01%로 가장 높은 형질도입 효율을 보였으며, Rabies G가 그 다음으로 높은 수치를 나타내었다. NIH3T3에서 2번째로 높은 형질도입 효율을 보인 amphotropic env의 경우 일차 NSC에는 거의 형질도입되지 못하는 것을 알 수 있었다(도 2).
이러한 결과를 바탕으로, 레트로바이러스 벡터를 이용하여 일차 NSC에 유전자를 전달하고자 할 때는 VSV-G env로 슈도타입화한 벡터를 사용하는 것이 가장 효율적이라는 것을 확인하였다.
레트로바이러스의
역가
(
titer
) 비교
UIGD 기술을 이용하여 태아 뇌에 레트로바이러스 벡터를 전달할 때 주입할 수 있는 바이러스의 부피가 한정적이기 때문에 최대한 많은 세포를 감염시키기 위해서는 높은 역가의 바이러스가 필수적이다. 높은 역가의 바이러스 스톡(High titer viral stock)을 제조하기 위해, 초원심분리(ultracentrifugation)를 통해 농축하지만, 농축할 수 있는 비율에도 한계가 있기 때문에 농축 전 바이러스 상층액에서의 바이러스 역가가 매우 중요하다.
이에, 기존의 CE 레트로바이러스 벡터를 대조군으로 하여 상기 <실시예 1>에서 제조한 4 종류의 서로 다른 3'LTR을 가진 레트로바이러스 벡터에 대한 레트로바이러스 역가를 비교하였다. 상기 <실시예 2>에 기재한 방법에 따라, 이식유전자(transgene)로서 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP)를 발현하는 레트로바이러스 벡터를 293T에 3-플라스미드 형질도입(3-plasmid transfection) 방법을 통해 전달하고, 2일 후에 바이러스를 수득하였다. 동일한 부피의 각각의 바이러스 상층액을 NIH3T3 세포에 형질도입(transduction)한 후, 유세포분석기(Flow cytometry, FACS)를 통해 형질도입 정도를 분석하였다.
그 결과, MT 및 MS 벡터의 형질도입 효율은 각각 38.47% 및 42.90%로 가장 높게 나타났고, MP 및 MF는 CE와 비슷한 수준을 보였다. 또한, FACS를 통해 레트로바이러스의 역가를 측정한 결과, CE, MT, MS, MP 및 MF의 역가는 각각 9.6 × 106, 2.0 × 107, 2.0 × 107, 9.8 × 106 및 9.5 × 106 TU/㎖로 나타났다(도 3). 이러한 결과를 통해, 상기 <실시예 1>에서 제조한 레트로바이러스 벡터 중, MT 및 MS 벡터가 CE 벡터나 다른 벡터에 비해 바이러스 역가 측면에서 가장 우수하다는 것을 확인하였다.
레트로바이러스 벡터의 유전자 발현량 비교
레트로바이러스 역가와 더불어 레트로바이러스 벡터의 효율성을 결정하는 또 다른 중요한 요소인 유전자 발현량을 마우스 배아섬유세포주(embryonic fibroblast cell line)인 NIH3T3 세포 또는 일차(primary) 마우스 신경줄기세포(neural stem cell, NSC)에서 비교하였다.
<5-1>
NIH3T3
에서 레트로바이러스 벡터의 유전자 발현량 비교
상기 <실시예 2>와 같이, 상기 CE, MT, MS, MP 및 MF 레트로바이러스 벡터를 이용하여 3-플라스미드 형질도입 방법을 통해 293T 세포에서 각각 레트로바이러스를 제조한 후, 동일한 역가로 NIH3T3 세포에 형질도입하였다. 형질도입 2일 후, FACS를 통해 GFP 유전자의 발현량을 분석하였다.
그 결과, MSCV 3'LTR을 가진 MS 벡터는 CE 벡터보다 약 3배 정도 높은 GFP 발현량을 보였고, MoMLV 3'LTR을 가진 MT 벡터는 약 1.5배 높은 발현량을 나타냈다. MP 및 MF 벡터는 CE 벡터보다 약 30%정도 낮은 GFP 유전자 발현량을 나타냈다(도 4).
<5-2> 일차 신경줄기세포에서 레트로바이러스 벡터의 유전자 발현량 비교
UIGD 기술을 이용하여 유전자를 전달하고자 하는 표적 세포는 뇌실(brain ventricle) 주변에 위치하는 신경 줄기/전구 세포(neural stem/progenitor cell)이기 때문에, 상기 세포에서 어떠한 레트로바이러스 벡터가 가장 높은 유전자 발현량을 보이는지 비교하였다. 일차 NSC를 시험관 내(in vitro) 배양하기 위하여, E14.5 태아의 뇌에서 신경절 융기(ganglionic eminence) 부위를 절개하여 단일 세포(single cell)로 분리한 후, FGF와 EGF가 포함된 배지에 배양하였다. 레트로바이러스를 동일한 역가로 상기 배양한 신경줄기세포에 형질도입하고 2일 후에 FACS를 통해 GFP 유전자 발현량을 분석하였다.
그 결과, MLV 3'LTR을 가진 MT 벡터, 또는 MSCV 3'LTR을 가진 MS 벡터가 가장 높은 유전자 발현량을 보였고, 대조군으로 사용한 CE 벡터보다 약 1.5배 높았다. 반면에, 조혈세포(Hematopoietic cell)에서 높은 활성을 보인다고 알려진 SFFV 3'LTR의 경우 NIH3T3에서는 비교적 유전자를 잘 발현하였으나, 일차 NSC에서는 그 활성이 매우 낮은 것으로 나타났다(도 4).
신경줄기세포에서 레트로바이러스 벡터의 비활성화(
inactivation
) 정도 비교
MoMVL LTR 근간 레트로바이러스 벡터의 프로모터는 대부분의 세포에서는 유전자 발현이 강하게 유도되지만, 마우스 배아줄기세포(embryonic stem cell) 또는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)와 같은 줄기세포 특성을 갖는 세포에서는 종종 침묵(silencing) 되는 것으로 알려져 있다. 이를 확인하기 위해, 일차 NSC에서 레트로바이러스 벡터들의 유전자 발현이 시간이 지남에 따라 어떻게 변하는지를 시험관 내(in vitro)에서 비교하였다. 상기 <실시예 2>에서 제조한 동일한 역가의 4 종류의 레트로바이러스로 형질도입한 후, 일차, 이차, 또는 삼차 뉴로스피어(neurophere)에서 GFP+ 세포 비율(GFP+ cell%)의 변화를 비교하였다.
그 결과, 실험에 사용한 모든 레트로바이러스 벡터들은 시험관 내 배양기간이 길어짐에 따라 GFP+ cell%가 줄어드는 경향을 보였다. 일차 뉴로스피어에서 GFP+ cell%를 100이라고 하였을 때, MT, MS 및 MP 벡터는 삼차 뉴로스피어에서 약 20% 정도 GFP+ cell%가 감소하였으나, CE 벡터는 약 50%정도 감소하였다. primary NSC에서 GFP 유전자 발현량이 매우 낮았던 MF 벡터의 경우 약 70%정도 GFP+ cell%가 감소하였다. 이러한 결과를 통하여, SFFV 3'LTR은 primary NSC에서 쉽게 비활성화되는 반면, MoMLV, MSCV 및 MPSV 3'LTR은 그 활성을 비교적 잘 유지한다는 것을 알 수 있었다(도 5).
초음파 영상을 이용한 마우스 태아 뇌로의 유전자 전달
<7-1> 태아에 주입할 바이러스의 제조
상기의 결과를 통하여 UIGD 기술에 적합한 레트로바이러스 벡터로 확인된 MT 및 MS 벡터 중 MS 벡터를 선택하여, 상기 MS 벡터와 VSV-G 외피 단백질 발현 벡터를 사용하여, 상기 <실시예 2>의 방법에 따라, 레트로바이러스를 제조한 후 10 ㎕의 바이러스를 녹여 DNase Ⅰ(Takara Bio, Tokyo, Japan) 0.5 ㎕를 37℃에서 5분간 처리하였다. 그런 다음 3,000 rpm에서 2분간 원심분리하여 상층액을 새로운 튜브에 옮기고, 상기 튜브에, 최종농도 80 ㎍/㎖인 폴리브렌(polybrene)(Sigma, St Louis, MO)과 0.1% fast green(Sigma)를 첨가하였다.
<7-2> 주입 바늘의 제조
모세관(capillary)(World Precision Instruments, Sarasota, FL)을 Flaming/Brown micropipette puller P-87(Sutter Instrument co., San Francisco, CA)을 이용하여 가늘게 만든 후, micropipette grinder EG-44(Narishige, Japan)를 이용하여 25° 각도로 연마하여 주입 바늘을 제조하였다.
<7-3> 마우스 태아 뇌에 유전자 주사
배자기(embryonic day) 8.5, 9.5, 또는 10.5일이 된 태아를 임신한 ICR 마우스에, 틸레타민-졸라제팜(tiletamine-zolazepam)(Zoletil) 20 ㎎/㎏과 자일라진(xylazine) 10 ㎎/㎏으로 구성된 마취제를 복강내 주사(intraPeritoneal injection)한 후, 39℃의 발열판(Heating plate) 위에 마우스를 올려놓고 발 부분을 테이프로 고정하였다. 면도기를 사용하여 복부를 제모하고 개복한 뒤, 자궁을 꺼내서 깨끗한 페트리 접시(petri plate) 위에 올려놓은 후 초음파 검사용 겔을(Ultrasound transmission gel)(Sanipia, Korea)로 자궁 위를 덮어주었다. 그런 다음, Vevo 660TM High-Resolution Imaging System(Visual Sonic Inc., Toronto, Canada)을 사용하여 자궁 속의 태아 영상을 보면서, 태아의 뇌실(ventricle)에 상기 실시예 <7-2>에서 제조한 주입바늘인 마이크로파이펫(micropipette)으로 상기 <실시예 2>에서 제조한 레트로바이러스 0.5 ㎕를 주사하여 전달하였다. 그리고나서, 꺼낸 자궁을 모체 복부의 원래 위치에 옮겨놓은 후 개복한 부위를 비흡수성 봉합사 Black silk 5-0, 50 ㎝(아이리, Korea)를 사용하여 봉합하였다.
마우스 뇌에서 레트로바이러스 벡터의 발현 양상 비교
상기 결과를 통해 4 종류의 레트로바이러스 3'LTR을 가진 벡터들 중에서 가장 높은 바이러스 역사와 유전자 발현량을 보이며, NSC에서 상대적으로 지속적인 유전자 발현 양상을 나타낸 MS 벡터를 선택하여, 상기 MS 벡터를 마우스 뇌에 주입하여 CE 벡터를 사용한 경우와 비교하였다. MS 및 CE 두 벡터를 동시에 비교하기 위하여, 두 종류의 바이러스를 공형질도입(cotransduction)하는 방법을 사용하였다. GFP를 발현하는 CE 벡터와 진한 적색의 형광 단백질인 mcherry를 발현하는 MS 벡터를 제조한 후, 상기 <실시예 2>의 방법과 같이, 293T에서 3-플라스미드 형질도입 방법으로 바이러스를 만들었다. 상기 두 레트로바이러스 벡터를 동일한 역가로 혼합한 후, 상기 <실시예 7>의 방법에 따라 초음파 영상을 이용하여 마우스 태아의 뇌에 주입하고 E14.5 및 P22에 유전자 발현을 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, E14.5에는 두 벡터 모두 신경전구세포(neural progenitor cell)가 존재하는 VZ, 및 분화하는 뉴런들이 존재하는 IZ/CP에서 발현하는 것을 확인하였고, 전체적으로 비슷한 수의 세포에서 발현되는 것을 관찰하였다. 뇌 발생이 거의 끝난 마우스 뇌에서 두 벡터의 발현 양상을 비교하기 위해 P22에 분석한 결과, E14.5에서의 결과와 마찬가지로 GFP와 mcherry를 발현하는 세포의 수가 비슷한 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, MS 벡터는 마우스 뇌에서 EF1a 프로모터를 가지는 CE 벡터와 비슷한 유전자 발현양상을 보인다는 것을 확인하였다.
다양한 발생 단계의 마우스 중추신경계(
central
nervous
system
,
CNS
)에서 레트로바이러스 벡터의 발현 양상 확인
상기 <실시예 7>과 같이, E9.5 태아 뇌실에 MS-GFP 벡터를 전달한 후, E14.5(embryonic day 14.5), P0(postnatal day 0), P28, P42 시점에 마우스 뇌와 척수의 GFP 단백질 발현 양상을 분석하였다.
그 결과, E14.5 태아 뇌에서 있어서, 측뇌실(lateral ventricle) 주변에 방사형 신경교시원세포(glial progenitor cell)의 형태를 보이는 GFP+ 세포가 존재하였고, 뉴런(neuron)들이 위치하는 피질판(cortical plate)에도 다수의 GFP+ 세포를 관찰할 수 있었다. 출생 후(postnatal) 시기에도 뇌실 영역(ventricle zone) 및 다양한 뇌 부위에 GFP+ 세포가 널리 퍼져 분포되어 있는 양상을 보여주었고, P28과 P42 마우스 뇌에는 완전히 분화된 형태를 갖는 세포들을 볼 수 있었다(도 7a). 또한, 각 시기의 척수에서도 GFP가 잘 발현되는 것으로 확인되었다(도 7b).
한편, MS 벡터가 완전히 분화된 뉴런 및 성상교세포(astrocyte)에서 발현되는지를 확인하기 위하여, P28 마우스 뇌를 GFP와 세포 특이적 마커로 이중염색(double staining) 하였다. 그 결과, 성숙한 뉴런 마커인 NeuN, 또는 성상교세포 마커인 GFAP와 공위치하는 GFP+ 세포를 관찰할 수 있었다(도 7c).
이를 통해, MS 벡터는 뇌와 척수에 효과적으로 감염하며, 다양한 발생 단계의 마우스 CNS에서 유전자를 잘 발현한다는 것을 알 수 있었다. 또한, 세포 특이적 마커와의 이중염색을 통해 MS 벡터가 성숙한 뉴런 및 성상교세포에서도 유전자 발현이 이루어짐을 확인하였다.
재조합
아데노바이러스(adenovirus)의
제조
<10-1>
아데노바이러스
벡터의 제조
초음파 영상 기반의 유전자 전달(Ultrasound Image-guided Gene Delivery, UIGD) 기술에서 유전자 전달체로 적합한 아데노바이러스 벡터를 제조하기 위하여, TaKaRa(Osaka, Japan)의 Adenovirus Expression Vector Kit(Dual Version)Ver.2 (Cat.#6170 v0904)의 pAxCAwtit2 벡터를 사용하였다. 상기 pAxCAwtit2 벡터의 다중 클로닝 부위(multi-cloning site)에 존재하는 SwaⅠ 인식서열(Klenow-blunted)을 SwaⅠ 제한효소로 처리하고 eGFP 서열을 삽입하여 재조합 아데노-GFP 벡터를 제조하였다(도 8 및 9). 이때, 상기 벡터는 고효율의 CAG 프로모터를 포함하였고, 상기 CAG 프로모터는 포유동물 세포에서 작용할 수 있는, 시토메갈로바이러스 인헨서(cytomegalovirus enhancer), 닭 β-액틴 프로모터(chicken β-actin promoter), 및 토끼 β-글로빈 폴리 A 시그날(rabbit β-globin poly A signal)로 구성되어 있었다.
<10-2> 재조합
아데노바이러스의
제조
상기 실시예 <10-1>에서 제조한 아데노바이러스 벡터를 293 세포에 도입하고 Adenovirus Expression Vector Kit(Dual Version)Ver.2(Cat.#6170 v0904, TaKaRa, Osaka, Japan)를 사용하여, 제조사가 지시한 프로토콜에 따라 재조합 아데노바이러스를 제조 및 정제하였다.
초음파 영상을 이용한 마우스 배아 뇌실로의 유전자 전달
상기 <실시예 7>의 방법에 따라, 상기 <실시예 10>에서 제조한 아데노바이러스(2.7×1010 pfu/㎖) 0.5 ㎕를 ED 9.5일의 배아에 주입하였다.
마우스 뇌에서
아데노바이러스
벡터의 발현 양상 확인
ED 14.5일의 배아 뇌를 동결절단(cryosectioning)한 후, 항-GFP 항체(Invitrogen) 및 항-class Ⅲ β-tubulin 항체(TuJ1)(Covance)로 공염색하여 뇌 특이적인 목적 유전자의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 목적 유전자인 GFP, 및 신경세포 마커인 class Ⅲ β-tubulin이 공동발현되는 것으로 나타남으로써, 발생중인 뉴런 또는 신경세포에 아데노바이러스 벡터를 통한 목적유전자가 도입되어 안정적으로 발현되는 것을 확인하였다(도 10).
이를 통해, GFP 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터는 뇌 부위에 효과적으로 감염되며, 마우스 신경세포에서 유전자를 안정적으로 잘 발현한다는 것을 알 수 있었다.
루시퍼라제
이미징
(
Luciferase
imaging
) 기술을 통한 유전자 전달 여부, 유전자 발현 및
키네틱스
(
kinetics
) 분석
생체 내 루시퍼라제 이미징(In vivo luciferase imaging) 기술을 사용하면 동물모델을 희생하지 않고 유전자 전달 여부 및 발현 키네틱스(kinetics)를 분석할 수 있다. 초음파 영상을 이용하여 태아 뇌실에 레트로바이러스를 전달할 경우, 생체 내 루시퍼라제 이미징 기술을 사용하여 유전자 발현 여부를 관찰할 수 있는지 확인하기 위하여, MS 벡터의 발현 키네틱스를 분석하였다. GFP와 루시퍼라제가 바이시스트로닉(bicitronic) 방식으로 발현되는 MS 벡터를 제조한 후, 상기 <실시예 7>과 같이, 초음파 영상을 이용하여 ED 10.5일의 배아 뇌에 레트로바이러스를 전달하였다. 상기 태아가 태어난 후 14주령에 마우스의 복강에 150 ㎎/㎏의 루시페린(luciferin)을 주입하였고, IVIS-100 (Xenogen)으로 인 비보 이미징을 실시하였다.
그 결과, 유전자가 전달된 성체 마우스 뇌에서 루시퍼라게 활성이 관찰되었다(도 11). 이러한 결과를 통해, 상기 생체 내 루시퍼라제 이미징 기술을 이용하면 마우스를 희생할 필요 없이 유전자가 마우스 뇌에 전달된 개체를 살아있는 상태에서 쉽게 선별할 수 있음을 알 수 있었다.
Claims (17)
1) 캡시드 단백질(nucleocapsid protein, gag), 역전사효소(reverse transcriptase, pol) 및 외피 단백질(envelope protein, env)을 코딩하는 유전자가 포함되지 않은 마우스 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus, MLV) 유래의 복제-결핍 레트로바이러스 벡터에 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 리포터 유전자가 5' 긴 말단 반복부(long terminal repeat, LTR)와 3'LTR 사이에 포함되고, 상기 3'LTR의 유전자 전장이 마우스 줄기세포 바이러스(Murine Stem Cell Virus, MSCV) 유래의 3'LTR 유전자로 치환된 재조합 레트로바이러스 벡터를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조한 재조합 레트로바이러스 벡터, 및 수포성 구내염 바이러스 G(vescular stomatitis virus, VSV-G) 당단백질 발현벡터를 이용하여 레트로바이러스 입자를 제조하는 단계;
3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 레트로바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계;
4) 단계 3)에서 레트로바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계; 및
5) 단계 4)에서 발생시킨 배아 또는 성체에서 리포터 유전자가 발현되는 개체를 선별하는 단계를 포함하고,
상기 단계 2)의 레트로바이러스 입자는 VSV-G 슈도타입의 레트로바이러스(VSV-G pseudotyped retrovirus) 입자인, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 선별 방법.
2) 단계 1)에서 제조한 재조합 레트로바이러스 벡터, 및 수포성 구내염 바이러스 G(vescular stomatitis virus, VSV-G) 당단백질 발현벡터를 이용하여 레트로바이러스 입자를 제조하는 단계;
3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 레트로바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계;
4) 단계 3)에서 레트로바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계; 및
5) 단계 4)에서 발생시킨 배아 또는 성체에서 리포터 유전자가 발현되는 개체를 선별하는 단계를 포함하고,
상기 단계 2)의 레트로바이러스 입자는 VSV-G 슈도타입의 레트로바이러스(VSV-G pseudotyped retrovirus) 입자인, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 선별 방법.
1) 캡시드 단백질(nucleocapsid protein, gag), 역전사효소(reverse transcriptase, pol) 및 외피 단백질(envelope protein, env)을 코딩하는 유전자가 포함되지 않은 마우스 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus, MLV) 유래의 복제-결핍 레트로바이러스 벡터에 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 리포터 유전자가 5' 긴 말단 반복부(long terminal repeat, LTR)와 3'LTR 사이에 포함된 재조합 레트로바이러스 벡터를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조한 재조합 레트로바이러스 벡터, 및 수포성 구내염 바이러스 G(vescular stomatitis virus, VSV-G) 당단백질 발현벡터를 이용하여 레트로바이러스 입자를 제조하는 단계;
3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 레트로바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계;
4) 단계 3)에서 레트로바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계; 및
5) 단계 4)에서 발생시킨 배아 또는 성체에서 리포터 유전자가 발현되는 개체를 선별하는 단계를 포함하고,
상기 단계 2)의 레트로바이러스 입자는 VSV-G 슈도타입의 레트로바이러스(VSV-G pseudotyped retrovirus) 입자인, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 선별 방법.
2) 단계 1)에서 제조한 재조합 레트로바이러스 벡터, 및 수포성 구내염 바이러스 G(vescular stomatitis virus, VSV-G) 당단백질 발현벡터를 이용하여 레트로바이러스 입자를 제조하는 단계;
3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 레트로바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계;
4) 단계 3)에서 레트로바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계; 및
5) 단계 4)에서 발생시킨 배아 또는 성체에서 리포터 유전자가 발현되는 개체를 선별하는 단계를 포함하고,
상기 단계 2)의 레트로바이러스 입자는 VSV-G 슈도타입의 레트로바이러스(VSV-G pseudotyped retrovirus) 입자인, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 선별 방법.
1) 프로모터, 이와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자 및 리포터 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 재조합 아데노바이러스 벡터를 아데노바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 재조합 아데노바이러스 입자를 제조하는 단계; 및
3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 재조합 아데노바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계;
4) 단계 3)에서 아데노바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계; 및
5) 단계 4)에서 발생시킨 배아 또는 성체에서 리포터 유전자가 발현되는 개체를 선별하는 단계를 포함하고,
상기 단계 1)의 프로모터는 CAG, CMV, SRα 및 EF-1α로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 선별 방법.
2) 상기 재조합 아데노바이러스 벡터를 아데노바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 재조합 아데노바이러스 입자를 제조하는 단계; 및
3) 배아(embryo)가 존재하는 인간을 제외한 포유동물 모체의 자궁을 초음파에 노출시켜 초음파 영상(ultrasound image)을 통해 상기 단계 2)에서 수득한 재조합 아데노바이러스 입자를 배아의 뇌실(ventricle) 부위에 미세주입(microinjection)하는 단계;
4) 단계 3)에서 아데노바이러스 입자가 미세주입된 배아를 모체 내에서 발생시키는 단계; 및
5) 단계 4)에서 발생시킨 배아 또는 성체에서 리포터 유전자가 발현되는 개체를 선별하는 단계를 포함하고,
상기 단계 1)의 프로모터는 CAG, CMV, SRα 및 EF-1α로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 목적 단백질이 뇌세포 특이적으로 발현하는 형질전환 동물의 선별 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 1)의 리포터 유전자는 루시퍼라아제(luciferase), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 증강된 적색 형광 단백질(enhanced red fluorescent protein, ERFP), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 퍼록시다아제(peroxidase) 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyltransferase)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 암호화하는 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 2)의 레트로바이러스 입자는 단계 1)의 재조합 레트로바이러스 벡터, 레트로바이러스 유래의 gag-pol 발현벡터, 및 수포성 구내염 바이러스 G(vescular stomatitis virus, VSV-G) 당단백질 발현벡터를 숙주세포에 공형질전환(cotransfection)하여 제조하는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법.
제 5항에 있어서, 상기 숙주세포는 293T 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법.
제 5항에 있어서, 상기 공형질전환은 리포펙타민 매개된 방법, 인산 칼슘(CaPO4) 침전법, 염화 칼슘(CaCl2) 침전법, DEAE-덱스트란-매개된 방법, 폴리브렌-매개된 방법, 전기천공법(electroporation), 미세주입(microinjection), 리포좀 융합, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염 및 바이오리스틱스(biolistics)를 사용하여 전달하는 방법으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법.
삭제
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 단계 2)에서 수득한 레트로바이러스 입자에, 숙주세포에 대한 레트로바이러스 입자의 결합활성을 유도하는 물질인 폴리브렌(polybrene), 리포펙타민(lipofectamince) 또는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)을 처리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법.
제 9항에 있어서, 상기 폴리브렌(polybrene)은 최종농도 60 ~ 100 ㎍/㎖로 처리하는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법.
삭제
제 3항에 있어서, 상기 단계 1)의 재조합 아데노바이러스 벡터는 도 8에 도시된 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법.
제 3항에 있어서, 상기 단계 2)의 아데노바이러스 생산 세포주는 293 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 3)의 포유동물은 마우스, 랫드, 돼지, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이, 소 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 3)의 배아는 배자기(embryonic day) 8 내지 12일의 배아인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 3)의 미세주입은 말단이 20° 내지 30°로 연마된 마이크로피펫(micropipette)을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 5)의 리포터 단백질의 발현은 형질전환 동물을 살아있는 상태로 측정하는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물의 선별 방법.
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| KR1020100139051A KR101242114B1 (ko) | 2010-12-30 | 2010-12-30 | 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술 및 리포터 유전자를 이용한 생체 내 영상에 의한 형질전환 동물의 선별 방법 |
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| KR20120077183A KR20120077183A (ko) | 2012-07-10 |
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| KR1020100139051A KR101242114B1 (ko) | 2010-12-30 | 2010-12-30 | 초음파 영상 기반의 유전자 전달 기술 및 리포터 유전자를 이용한 생체 내 영상에 의한 형질전환 동물의 선별 방법 |
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|---|---|---|---|---|
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| Nature Neuroscience, Vol. 2, No. 9, p 812-819 (1999) * |
| Nature Neuroscience, Vol. 2, No. 9, p 812-819 (1999)* |
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