CN109072220A

CN109072220A - 由成纤维细胞直接制造心脏祖细胞和心肌细胞的方法

Info

Publication number: CN109072220A
Application number: CN201780017266.9A
Authority: CN
Inventors: 家田真树; 贞广威太郎; 礒见真理; 五岛直树
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Keio University
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; University of Tsukuba NUC
Priority date: 2016-03-15
Filing date: 2017-03-07
Publication date: 2018-12-21
Also published as: WO2017159463A1; EP3431593A4; EP3431593A1; JPWO2017159463A1; JP6853538B2; US20190071641A1

Abstract

本发明提供由成纤维细胞诱导心脏祖细胞或心肌细胞的方法。本发明提供：包括向成纤维细胞中导入1个心肌重编程因子的、心脏祖细胞的制作方法：或、包括向成纤维细胞中导入3个心肌重编程因子的、心肌细胞的制作方法。

Description

由成纤维细胞直接制造心脏祖细胞和心肌细胞的方法

技术领域

本发明涉及用于由成纤维细胞制造心脏祖细胞和心肌细胞的方法、以及利用该方法制造的源自成纤维细胞的心脏祖细胞和心肌细胞。

背景技术

心脏疾病随着老龄化的增加而逐渐增加，80岁以上男性的心力衰竭发生率高达14.7％。心脏由心肌细胞、成纤维细胞等细胞构成，承担搏动功能的心肌细胞几乎不具有再生能力或完全不具有再生能力，因此迄今为止心脏疾病的治疗方法受到限制。

迄今为止，发现了：通过导入3个心肌重编程因子(Gata4、Mef2c、Tbx5、以下也称为GMT)，而由成纤维细胞在不经由iPS细胞的情况下直接制作心肌样细胞的方法(非专利文献1)。在该方法中，证实了：在培养细胞和小鼠活体内均可以通过3因子GMT由成纤维细胞直接制作心肌(专利文献1)。另外，报道了：通过使用转录因子(Mesp1、Ets2)和多种体液因子，从而能够由成纤维细胞经由心脏祖细胞来功能性地制作未成熟的心肌样细胞(非专利文献2)。另外，报道了：使用体液因子由ES细胞、iPS细胞等多能干细胞诱导心脏祖细胞、心肌细胞的方法(非专利文献3)；在使用血清、特殊的培养条件下使用转录因子由小鼠ES细胞诱导心脏祖细胞的方法(非专利文献4)。

另一方面，如前所述心肌细胞不具有增殖能力，因此在由成纤维细胞、多能干细胞直接诱导心肌细胞时有可能无法充分地得到再生医疗所需的细胞数。因此，首先制作具有增殖能力的心脏祖细胞，并由该心脏祖细胞制作心肌细胞的方法是有用的。

然而，在前述的使用转录因子(Mesp1、Ets2)和多种体液因子来由成纤维细胞制作心脏祖细胞的方法中，存在无法维持心脏祖细胞的状态而只能制作功能性未成熟的心肌样细胞这样的问题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2011/139688

非专利文献

非专利文献1：Ieda,M.,Fu,J.D.,Delgado-Olguin,P.,Vedantham,V.,Hayashi,Y.,Bruneau,B.G.,and Srivastava,D.Direct Reprogramming of Fibroblasts intoFunctional Cardiomyocytes by Defined Factors.Cell142:375-386.2010.

非专利文献2：Islas JF,Liu Y,Weng KC,et al.Transcription factorsETS2and MESP1transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiacprogenitors.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 2012；109(32):13016-21.

非专利文献3：Kattman SJ,Witty AD,Gagliardi M,et al.Stage-specificoptimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiacdifferentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.Cell stem cell2011；8(2):228-40.

非专利文献4：van den Ameele J,Tiberi L,Bondue A,et al.Eomesodermininduces Mesp1expression and cardiac differentiation from embryonic stem cellsin the absence of Activin.EMBO reports 2012；13(4):355-62.

发明内容

发明要解决的问题

在这样的情况下，要求开发出由成纤维细胞诱导心脏祖细胞且可使被诱导的心脏祖细胞维持一定期间的方法；以及、用于由诱导的心脏祖细胞制作功能性成熟的心肌细胞的方法。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：使用逆转录酶病毒载体和逆转录酶病毒在成纤维细胞中导入1个因子(Tbx6)时，可诱导表达作为心脏祖细胞标记物的Mesp1的心脏祖细胞，进行增殖而形成集落。另外，发现了：在所诱导的心脏祖细胞中，多个心脏祖细胞基因标记物的表达即使一个月后也在继续维持。

进而，本发明人等发现：使用逆转录酶病毒载体和逆转录酶病毒将3个因子(Tbx6、SRF、Myocd)基因导入成纤维细胞中时，可诱导搏动的心肌细胞；以及、得到的细胞表达作为心肌细胞标记物的Nxk2.5和肌钙蛋白。

另外，本发明人等发现：使用逆转录酶病毒载体和逆转录酶病毒将3个因子(Tbx6、SRF、Myocd)基因导入成纤维细胞中时，得到的细胞表达作为平滑肌细胞标记物的Myh11；以及、表达作为血管内皮细胞标记物的Pecam1。

本发明是基于这样的见解而完成的。

即，本发明如下。

[1]一种心脏祖细胞的制造方法，其包括将Tbx6基因导入成纤维细胞中的工序。

[2]一种心肌细胞的制造方法，其包括将Tbx6基因、SRF基因和心肌素(Myocardin)基因导入成纤维细胞中的工序。

所述成纤维细胞例如为小鼠细胞或人细胞。

[3]一种心脏祖细胞，其源自包含外源性的Tbx6基因的成纤维细胞。

[4]一种心肌细胞，其源自包含外源性的Tbx6基因、SRF基因和心肌素基因的成纤维细胞。

[5]一种由成纤维细胞诱导心脏祖细胞的诱导剂，其含有Tbx6基因。

[6]一种由成纤维细胞诱导心肌细胞的诱导剂，其含有Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因。

[7]一种由成纤维细胞诱导平滑肌细胞的诱导剂，其含有Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因。

[8]一种由成纤维细胞诱导血管内皮细胞的诱导剂，其含有Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因。

发明的效果

根据本发明，可提供由成纤维细胞直接制造心脏祖细胞的方法及由成纤维细胞直接制造心肌细胞的方法。另外，可以提供利用本发明的方法制造的心脏祖细胞和心肌细胞。根据本发明由成纤维细胞诱导的心脏祖细胞使多种心脏祖细胞基因的表达得以持续，因此本发明可以提供比现有方法更稳定的心脏祖细胞的制造方法和心脏祖细胞。心脏祖细胞具有增殖能力，因此根据本发明制作的心脏祖细胞可以适宜地用于医疗用途。

另外，确认了利用本发明诱导的心肌细胞是搏动的，另外，确认了心肌特异性的基因表达、结构蛋白质的表达。因此，本发明的心肌制造方法可以提供功能性成熟的心肌细胞。

附图说明

图1是将Tbx6基因导入成纤维细胞中来诱导心脏祖细胞的示意图。

图2是在基因导入了Tbx6的细胞中的、GFP(Mesp1表达)的免疫染色(MespCre-GFP)、DAPI(核)的免疫染色和重叠了它们的(Merged)图像。

图3是在基因诱导Tbx6 1个月后的细胞中的、Mesp1、T、KDR、Nkx2.5和TnnT2的各心脏分化的标记物的mRNA表达量的图。

图4是将Tbx6、SRF、Myocd(TSM)基因导入成纤维细胞中来诱导搏动心肌细胞的示意图。

图5是表示基因导入了Tbx6、SRF、Myocd的细胞呈横纹结构(明视野(BF))及表达心脏肌钙蛋白T的图。

图6是表示在基因导入了Tbx6、SRF、Myocd的细胞整体的、Mesp1、T、KDR、Nkx2.5和TnnT2的各心脏分化标记物的mRNA表达量的图。

图7是表示在基因导入了Tbx6、SRF、Myocd的细胞中的、作为平滑肌细胞标记物的Myh11的mRNA表达量以及作为血管内皮细胞标记物的Pecam1的mRNA表达量的图。

图8是显示出基因导入了Tbx6、SRF、Myocd的细胞表达平滑肌肌球蛋白重链(Smooth muscle myosin heavy chain)的免疫染色荧光显微镜图像。

具体实施方式

本发明涉及包括将Tbx6基因导入至成纤维细胞中的心脏祖细胞的制造方法；以及源自包含外源性的Tbx6基因的成纤维细胞的心脏祖细胞。

通过逆转录酶病毒使Tbx6基因导入至成纤维细胞中时，可诱导表达心脏祖细胞特异性标记物Mesp1的细胞。即使在Tbx6导入30天之后心脏祖细胞相关基因还在表达并且维持心脏祖细胞的状态。在成纤维细胞中可表达Tbx6多肽，其结果，导入了Tbx6基因的成纤维细胞可直接重编程成分化的心脏祖细胞而不会成为干细胞、先祖细胞。

即，本发明的心脏祖细胞的制作方法包括将Tbx6基因导入成纤维细胞中的工序。若根据本发明的心脏祖细胞的制作方法，则由于仅导入1个因子而能够有效地制作心脏祖细胞。另外，即使在Tbx6导入1个月后也维持了心脏祖细胞的标记物基因的表达，因此根据本发明能够稳定地制造具有增殖能力的心脏祖细胞。

另外，本发明涉及：包括将Tbx6、SRF和心肌素(Myocardin)(Myocd)基因导入成纤维细胞中的心肌细胞的制造方法；以及源自包含外源性的Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因的成纤维细胞的心肌细胞。

通过逆转录酶病毒将Tbx6、以及将加入了在分化的心肌细胞中高表达的SRF、Myocd这3个因子(TSM)导入成纤维细胞中时，可诱导搏动的成熟心肌细胞。另外，确认了在所诱导的心肌细胞中，作为心肌特异性的基因的Nkx2.5、肌钙蛋白的表达及横纹结构的形成。在成纤维细胞中表达Tbx6、SRF和Myocd多肽，其结果，导入了Tbx6、SRF和Myocd基因的成纤维细胞可直接重编程成分化的心肌细胞而不会成为干细胞、先祖细胞。

另外，将Tbx6、SRF和Myocd基因导入成纤维细胞中时，不仅诱导心肌细胞特异性的基因的表达，而且还可诱导心脏祖细胞基因(Mesp1、T、KDR)。因此，由于根据本发明经由心脏祖细胞，所以能够制造心肌细胞、平滑肌细胞或血管内皮细胞。

即，本发明的心肌细胞的制造方法包括将Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因导入成纤维细胞中的工序。若根据本发明的心肌细胞的制造方法，则能够制作功能性成熟的心肌细胞。

由此，本发明可提供：源自基因导入了Tbx6基因的成纤维细胞的心脏祖细胞；或源自基因导入了Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因的成纤维细胞的心肌细胞。另外，还可提供包含Tbx6基因的心脏祖细胞的诱导剂、或包含Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因的心肌细胞的诱导剂。另外，通过将Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因导入成纤维细胞中，从而不仅可诱导心肌细胞而且还可诱导平滑肌细胞、内皮细胞，由此根据本发明可提供包含Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因的平滑肌细胞诱导剂或内皮细胞诱导剂。

[直接重编程]

在本发明中，导入了Tbx6基因的成纤维细胞或导入了Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因的成纤维细胞可直接重编程为分化的心脏祖细胞或心肌细胞而不会成为干细胞、先祖细胞。

[重编程因子的导入]

在本发明的一个方式中，Tbx6基因、或Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因的组合(set)可以在体外导入成纤维细胞中。另外，该成纤维细胞可在体外诱导为心脏祖细胞或心肌细胞。所诱导的心脏祖细胞或心肌细胞可以导入个体内。

在本发明的另一方式中，Tbx6基因、或Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因的组合可以在体内例如在个体的心脏患部组织中导入成纤维细胞中。另外，该成纤维细胞可在体内诱导为心脏祖细胞或心肌细胞。

在本发明的另一方式中，Tbx6基因、或Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因的组合可以在体外导入成纤维细胞中。另外，该成纤维细胞可导入个体内，并在体内诱导为心脏祖细胞或心肌细胞。

对于重编程因子基因(Tbx6基因、SRF基因或Myocd基因)向成纤维细胞中的导入，可以通过如下方式进行：将包含编码Tbx6的核苷酸序列的核酸、包含编码SRF的核苷酸序列的核酸、或包含编码Myocd的核苷酸序列的核酸导入成纤维细胞中。所导入的成纤维细胞通过表达Tbx6、SRF或Myocd而诱导为心脏祖细胞或心肌细胞。因此，将Tbx6基因导入成纤维细胞中的工序可以包括：将Tbx6多肽导入成纤维细胞中。另外，将Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因导入成纤维细胞中的工序可以包括：将Tbx6多肽、SRF多肽和Myocd多肽导入成纤维细胞中。

另外，本发明的心脏祖细胞制造方法或心肌细胞制造方法可以包括：使用Tbx6基因对成纤维细胞进行转化的工序；或、使用Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因对成纤维细胞进行转化的工序。另外，本发明的心脏祖细胞制造方法或心肌细胞制造方法可以包括：在成纤维细胞中表达Tbx6基因的工序；或、在成纤维细胞中表达Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因的工序。

导入了Tbx6基因的成纤维细胞、或导入了Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因的成纤维细胞在例如7～14天、优选为7天的期间的一定期间内可被诱导为心脏祖细胞或心肌细胞。例如，成纤维细胞的细胞群在导入了Tbx6基因、或Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因的组合的情况下，细胞群的至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少50％、至少70％、至少90％在例如7～14天、优选7天的期间内重编程为心脏祖细胞或心肌细胞。

对于本发明的心脏祖细胞制造方法或心肌细胞制造方法，在进行向成纤维细胞中导入Tbx6基因、或Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因的组合的导入工序的一定期间(例如，7～14天、优选为7天)之后，通过对该成纤维细胞的细胞群进行分选的工序，从而能够提高心脏祖细胞或心肌细胞的比例。关于成纤维细胞特异性标记物例如：波形蛋白、聚1,4-羟化酶、成纤维细胞特异性蛋白质、成纤维细胞表面抗原、1型胶原蛋白等的表达阳性，通过进行分选工序，从而在残留有成纤维细胞的情况下能将其去除。另外，关于心脏祖细胞或心肌细胞特异性标记物的表达，通过进行分选，从而能够充实各自的细胞的比例。

另外，对于本发明的心脏祖细胞制造方法或心肌细胞制造方法，由于包括将包含编码能检测出的标记物的核苷酸序列的核酸导入成纤维细胞中的工序，从而能够提供分选工序的手段、或者能够提供对心脏祖细胞或心肌细胞的诱导进行确认的手段。编码能检测出的标记物的核苷酸序列与心脏祖细胞特异性启动子或心肌细胞特异性启动子可动地连接、或者与编码心脏祖细胞特异性标记物的核苷酸序列或编码心肌细胞特异性标记物的核苷酸序列连接。能检测出的标记物例如包含：直接产生能检测出的信号的多肽例如GFP、YEP、BFP等荧光蛋白；对基质发挥作用时产生能检测出的信号的酶例如荧光素酶、碱性磷酸酶等。作为心脏祖细胞特异性启动子，包含例如Mesp1、T、Flk1(KDR)的启动子。另外，对心肌细胞特异性的启动子包含例如α-肌球蛋白重链启动子、cTnT启动子等。能检测出的标记物的表达能够检测出心脏祖细胞或心肌细胞，其结果，能够确认心脏祖细胞或心肌细胞的诱导，或者能够提供分选诱导心脏祖细胞或诱导心肌细胞的手段。

在本说明书中，“可动地连接”是指能够赋予转录、翻译等这样期望功能的核酸间的功能性连接。例如包括启动子、信号序列等核酸表达控制序列与第二多聚核苷酸之间的功能性连接。表达控制序列对第2多聚核苷酸的转录和/或翻译产生影响。

[成纤维细胞]

在本发明中，成纤维细胞可以使用哺乳类的成纤维细胞，例如人、或小鼠、大鼠、猪、猴、马、牛、羊、山羊、狗等除人以外的哺乳动物的成纤维细胞。优选的成纤维细胞为人成纤维细胞。在其它实施方式中，成纤维细胞为小鼠成纤维细胞。成纤维细胞是由哺乳动物得到的成纤维细胞、或由哺乳动物得到的成纤维细胞的子孙，还可以是经分离的细胞，另外，可以是其传代培养细胞。作为成纤维细胞，例如可以使用胎儿成纤维细胞、源自尾前端部的成纤维细胞、心脏成纤维细胞、包皮成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、肺成纤维细胞等。

用于培养成纤维细胞的培养基为MEM、DMEM、IMDM培养基等，只要是本领域技术人员就能够适宜选择或制备。成纤维细胞可以在血清存在下或没有血清存在下进行培养。培养只要是适于培养成纤维细胞的条件就没有特别限制，通常在25℃～37℃的范围内、5％CO₂条件下进行。

[重编程因子]

在本发明的心脏祖细胞或心肌细胞的制造方法中，成纤维细胞可以导入1个以上包含编码1个以上重编程因子的核苷酸序列的核酸。或者在本发明的心脏祖细胞或心肌细胞的制造方法中，成纤维细胞可以将1个以上的、重编程因子多肽本身导入成纤维细胞内。在本发明中，重编程因子在制造心脏祖细胞时是Tbx6，在制造心肌细胞时是Tbx6、SRF和Myocd(TSM)。可以将Tbx6、SRF和Myocd一次性或依次导入细胞中。一次性导入细胞中是指，在1次细胞导入工序中将多个重编程因子导入细胞中；依次导入是指，在同一天或非同一天、在多个细胞导入工序中、将多个重编程因子导入细胞中。从细胞导入效率的观点出发，优选将多个重编程因子一次性导入细胞中。另外，本发明的重编程因子的氨基酸序列和编码氨基酸序列的核苷酸序列在本领域中是公知的。

[Tbx6]

Tbx6多肽(Tbox转录因子6)是与一部分基因的启动子区域中的T盒结合来对其进行识别的转录因子。已知有：源自各种种属的Tbx6多肽所涉及的氨基酸序列以及编码Tbx6多肽的核苷酸序列。例如可以参照：Genbank注册号NM_004608.3(人、核苷酸序列、序列号1、CDS 61..1371)、NP_004599.2(人、氨基酸序列、序列号2)、NM_011538.2(小鼠、核苷酸序列、序列号3、CDS 25..1335)、NP_035668.2(小鼠、氨基酸序列、序列号4)等。

另外，在本发明的一个方式中，Tbx6多肽包括：具有与序列号2或序列号4所示的氨基酸序列的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％具有序列同源性的氨基酸序列、并且在导入成纤维细胞中时具有诱导为心脏祖细胞的功能的多肽。

另外，在本发明的一个方式中，Tbx6多肽包括：具有在序列号2或序列号4所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1～50个、优选为1～40个、更优选为1～20个、进一步优选为1～10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸或组合了它们的氨基酸序列、并且在导入成纤维细胞中时具有诱导为心脏祖细胞功能的多肽。

另外，在本发明的一个方式中，Tbx6多肽包括：具有由与序列号1或序列号3所示的核苷酸序列的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％具有序列同源性的核苷酸序列编码的氨基酸序列、并且在导入成纤维细胞中时具有诱导为心脏祖细胞功能的多肽。

另外，在本发明的一个方式中，Tbx6基因(核酸)包括：具有与序列号1或序列号3所示的核苷酸序列的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％具有序列同源性的核苷酸序列、并且所编码的多肽在导入成纤维细胞中时具有诱导为心脏祖细胞的功能的核酸。

[SRF]

已知有：源自各种种属的SRF多肽所涉及的氨基酸序列、以及编码SRF多肽的核苷酸序列。例如可以参照：Genbank注册号NM_003131.3(人、核苷酸序列、序列号5、CDS363..1889)、NP_003122.1(人、氨基酸序列、序列号6)、NM_020493.2(小鼠、核苷酸序列、序列号7、CDS 335..1849)、NP_065239.1(小鼠、氨基酸序列、序列号8)等。

另外，在本发明的一个方式中，SRF多肽包括：具有与由序列号6或序列号8所示的氨基酸序列的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％具有序列同源性的氨基酸序列、并且在与Tbx6、心肌素一起导入成纤维细胞中时具有诱导为心肌细胞的功能的多肽。

另外，在本发明的一个方式中，SRF多肽包括：具有在序列号6或序列号8所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1～60个、优选为1～50个、更优选为1～25个、进一步优选为1～13个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个)氨基酸或组合了它们的氨基酸序列、并且在与Tbx6、心肌素一起导入成纤维细胞中时具有诱导为心肌细胞的功能的多肽。

另外，在本发明的一个方式中，SRF多肽包括：具有由与序列号5或序列号7所示的核苷酸序列的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％具有序列同源性的核苷酸序列编码的氨基酸序列、并且在与Tbx6、心肌素一起被导入成纤维细胞中时具有诱导为心肌细胞的功能的多肽。

另外，在本发明的一个方式中，SRF核酸包括：具有与序列号5或序列号7所示的核苷酸序列的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％具有序列同源性的核苷酸序列、并且所编码的多肽在与Tbx6、心肌素一起导入成纤维细胞中时具有诱导为心肌细胞的功能的核酸。

[心肌素](Myocd)

已知有：源自各种种属的心肌素多肽所涉及的氨基酸序列、以及编码心肌素多肽的核苷酸序列。例如可以参照：Genbank注册号NM_001146312.2(人、核苷酸序列、序列号9、CDS 300..3260)、NP_001139784.1(人、氨基酸序列、序列号10)、NM_145136.4(小鼠、核苷酸序列、序列号11、CDS 292..3243)、NP_660118.3(小鼠、氨基酸序列、序列号12)等。

另外，在本发明的一个方式中，心肌素多肽包括：具有与序列号10或序列号12所示的氨基酸序列的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％具有序列同源性的氨基酸序列、并且在与Tbx6、SRF一起导入成纤维细胞中时具有诱导为心肌细胞的功能的多肽。

另外，在本发明的一个方式中，心肌素多肽包括：具有在序列号10或序列号12所示的氨基酸序列中置换、插入或添加1～100个、优选为1～50个、更优选为1～30个、进一步优选为1～20个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸或组合了它们的氨基酸序列、并且在与Tbx6、SRF一起导入成纤维细胞中时具有诱导为心肌细胞的功能的多肽。

另外，在本发明的一个方式中，心肌素多肽包括：具有由与序列号9或序列号11所示的核苷酸序列的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％具有序列同源性的核苷酸序列编码的氨基酸序列、并且在与Tbx6、SRF一起导入成纤维细胞中时具有诱导为心肌细胞的功能的多肽。

另外，在本发明的一个方式中，心肌素基因(核酸)包括：具有与序列号9或序列号11所示的核苷酸序列的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％具有序列同源性的核苷酸序列、并且在将所编码的多肽与Tbx6、SRF一起导入成纤维细胞中时具有诱导为心肌细胞的功能的核酸。

迄今为止报道了：通过使用转录因子(Mesp1、Ets2)和多个体液因子，从而能由成纤维细胞经由心脏祖细胞来制作功能性未成熟的心肌样细胞(非专利文献2)。在本发明中，无需将这样的转录因子导入成纤维细胞中，而且也无需组合这样的转录因子和体液因子。

[心脏祖细胞]

在本发明中“心脏祖细胞”是可通过表达心脏祖细胞特异性标记物来表征的细胞。心脏祖细胞特异性标记物是针对心脏祖细胞特异性地表达的因子(心脏祖细胞相关因子)，包含T、Mesp1、Flk1(KDR)、Pdgfrα、Isl1等。心脏祖细胞表达心脏祖细胞特异性标记物中的至少1个、更优选为至少2个、进一步优选为至少3个。心脏祖细胞优选为表达T、Mesp1和Flk1(KDR)的细胞。标记物表达可以通过基因水平或蛋白质水平加以确认。

另外，在本发明中，心脏祖细胞是由成纤维细胞诱导而得到，因此有时也称为诱导心脏祖细胞。

[心肌细胞]

在本发明中“心肌细胞”是可通过表达心肌细胞特异性标记物来表征的细胞。心肌细胞特异性标记物是针对心肌细胞特异性地表达的因子(心肌细胞相关因子)，包含心肌钙蛋白(cTnT)、Nkx2.5、Actn2等。心肌细胞表达心肌细胞特异性标记物中的至少1个、更优选为至少2个、进一步优选为至少3个。心肌细胞优选为表达cTnT和Nkx2.5的细胞。

另外，在本发明中“心肌细胞”可以通过搏动来表征。进而，在本发明中“心肌细胞”可以通过形成横纹结构来表征。

另外，在本发明中心肌细胞是由成纤维细胞诱导而得到，因而有时也称为诱导心肌细胞。

心脏祖细胞或心肌细胞特异性的各种标记物的表达可以利用生化学或免疫化学方法(例如，酶联免疫吸附试验、免疫组织化学试验等)进行检测。或者还可以通过测定编码对心脏祖细胞或心肌细胞特异性的各种标记物的核酸的表达来检测。编码对心脏祖细胞或心肌细胞特异性的各种标记物的核酸的表达可以利用RT-PCR、杂交分析法等分子生物学方法加以确认。这些方法中所使用的引物、探针通过使用可以由Genbank等数据库获得的信息，由本领域技术人员就可以进行适宜设计来制造。

另外，心肌细胞的搏动可以通过目视或明视野像加以确认。另外，还可以利用膜片钳等标准的电生理学方法对自发性收缩进行确认。

另外，心肌细胞的横纹结构形成可以通过目视或明视野像加以确认。另外，还可以通过肌钙蛋白等有助于心肌结构的蛋白质的免疫染色加以确认。

[外源性重编程因子多肽向成纤维细胞中的导入]

在本说明书中“外源性”是指，导入该细胞中的(例如，通过电穿孔、感染、脂质体、显微注射或将核酸导入细胞内中任意的其它手段来进行)核酸或多肽。

在本发明的一个方式中，外源性重编程因子还可以通过使Tbx6、SRF和/或Myocd的多肽与成纤维细胞接触来导入。Tbx6、SRF、Myocd的多肽可以分别基于公知的数据库的氨基酸序列和核苷酸序列的信息，基因工程、分子生物学地制造。

[外源性重编程因子基因向成纤维细胞中的导入]

对于外源性重编程因子(Tbx6、SRF、Myocd)基因的导入、即编码这些多肽的多聚核苷酸、或具有与该核苷酸序列互补的核苷酸序列的多聚核苷酸的导入，例如可以利用使用了逆转录酶病毒载体、腺病毒载体等病毒载体的病毒感染、脂质体转染法、电穿孔法、显微注射法、磷酸钙法等公知的转化方法来进行。

在本发明的另一实施方式中，外源性重编程因子多肽(Tbx6或Tbx6、SRF、Myocd的组合)向成纤维细胞内的导入可通过将包含编码该重编程因子多肽的核苷酸序列的外源性核酸导入成纤维细胞中来实现。源自外源性重编程因子的种属与源自成纤维细胞的种属优选一致例如人与人、小鼠与小鼠等。

本发明中的包含编码外源性重编程因子多肽的核苷酸序列的外源性核酸可以是包含表达盒的重组表达载体的形态，此时，适合的载体包含例如重组逆转录酶病毒、慢病毒和腺病毒；逆转录酶病毒表达载体、慢病毒表达载体、核酸表达载体和质粒表达载体。在本发明的另一方式中，外源性核酸可组入成纤维细胞及其子孙的基因组内。

在本发明的实施方式中，成纤维细胞通过各自包含分别编码Tbx6、SRF、或Myocd的核苷酸序列的、各个的表达构建体(表达载体)而被转化。在本发明的另一实施方式中，表达构建体还可以包含对2个以上的Tbx6、SRF、或Myocd进行编码的核苷酸序列。在本发明的实施方式中，表达构建体包含编码Tbx6、SRF和Myocd的核苷酸序列。

在本发明中，包含编码Tbx6多肽的核苷酸序列的外源性核酸、或包含编码Tbx6、SRF和Myocd多肽的1个以上的核苷酸序列的外源性核酸在体外被导入单一的成纤维细胞或成纤维细胞的细胞群中，或者，在体内被导入单一的成纤维细胞中或成纤维细胞的细胞群中。

在本发明的另一实施方式中，包含编码Tbx6多肽或者Tbx6、SRF和Myocd多肽的1个以上的核苷酸序列的核酸可以是成纤维细胞中的能产生重编程因子多肽的表达构建体。在本发明的另一实施方式中，表达构建体例如重组腺相关病毒构建体(例如参照美国专利第7,078,387)、重组腺病毒构建体、重组慢病毒构建体等病毒构建体。

适合的表达载体包含：病毒载体(例如，牛痘病毒系病毒载体；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参照例如Li等、Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994；Borras等、GeneTher 6:515 524,1999；Li and Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等、H GeneTher 5:1088 1097,1999；国际专利申请公开94/12649，国际专利申请公开93/03769；国际专利申请公开93/19191；国际专利申请公开94/28938；国际专利申请公开95/11984和国际专利申请公开95/00655)；腺相关病毒(参照例如Ali等、Hum Gene Ther 9:81 86,1998,Flannery等、PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等、Invest Opthalmol Vis Sci38:2857-2863,1997；Jomary等、Gene Ther4:683-690,1997,Rolling等、Hum Gene Ther 10:641648,1999；Ali等、Hum Mol Genet 5:591-594,1996；Srivastava、国际专利申请公开93/09239、Samulski等、J.Vir.(1989)63:3822 3828；Mendelson等、Virol.(1988)166:154165；和Flotte等、PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人类免疫缺陷病毒(例如参照Miyoshi等、PNAS94:10319-23,1997；Takahashi等、J Virol73:78127816,1999)；逆转录酶病毒载体(例如，由小鼠白血病病毒、脾坏死病毒和逆转录酶病毒衍生的载体、例如Rous肌节病毒、Harvey肌节病毒、鸡白血病病毒、慢病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髄增殖性肌节病毒、乳癌病毒)等，但不限定于这些。

在该领域中已知有大量适合的表达载体，并且大多数的载体可以通过商业渠道获得。为了示例而揭示出以下载体，关于真核生物宿主细胞可列举出：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(Pharmacia)。然而，对于任意的其它载体而言，只要适合宿主细胞就可以使用。

根据使用的宿主/载体系，可以在表达载体中使用大多数适合转录和翻译的控制单元中的任意者例如：组成和诱导启动子、转录增强子单元、转录终止子等(参照例如BITTER等人、(1987)METHODS IN ENZYMOLOGY,153:516-544)。

在本发明的另一实施方式中，编码重编程因子的核苷酸序列(例如，Tbx6CDR序列、SRF CDR序列、Myocd CDR序列)还可以与控制单元例如转录控制、例如启动子单元可动地连接。转录控制单元在真核生物细胞、例如哺乳类细胞中发挥作用。适合的转录控制单元包含启动子和增强子。在本发明的另一实施方式中，启动子是组成上具有活性的。在其它实施方式中，启动子是诱导性的。

适合的真核生物启动子(在真核生物细胞中发挥作用的启动子)的非限定性的例子包括：CMV最初期、HSV胸苷激酶、初期和后期SV40、源自逆转录酶病毒的长末端重复序列(LTR)和小鼠金属硫蛋白-1。

在本发明的另一实施方式中，编码重编程因子的核苷酸序列与心特异性转录控制单元(TRE)可动地连接，在此情况下TRE可以包含启动子和增强子。适合的TRE包含以下的基因，即：肌球蛋白轻链-2、α-肌球蛋白重链、AE3、心肌钙蛋白C和由心肌动蛋白衍生的TRE，但不限定于这些(Franz等人、(1997)Cardiovasc.Res.35:560-566；Robbins等人、(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.752:492-505；Linn等人、(1995)Circ.Res.76:584-591；Parmacek等人、(1994)Mol.Cell.Biol.14:1870-1885；Hunter等人、(1993)Hypertension 22:608-617；和Sartorelli等人、(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4047-4051.)。

适合的载体和启动子的选择在该领域中是熟知的。表达载体可以含有用于翻译起始和转录起始的核糖体结合位点。表达载体可以包含用于扩增表达的适合的序列。

适合的哺乳类表达载体(适用于哺乳类宿主细胞的表达载体)的例子包括：重组病毒、核酸载体、例如质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、人类人工染色体、cDNA、cRNA和聚合酶链式反应(PCR)产物表达盒，但不限定于这些。用于驱动编码Tbx6、SRF、Myocd的核苷酸序列表达的适合的启动子的例子包含：逆转录酶病毒长末端重复序列(LTR)单元；组成型启动子、例如CMV、HSV1-TK、SV40、EF-1α、β-肌动蛋白；磷酸甘油激酶(PGK)、及诱导启动子、例如含有Tet-操纵子单元的诱导启动子，但不限定于这些。在一些情况下，哺乳类表达载体除了外源性的Tbx6、SRF、Myocd多肽之外，还可以编码使识别或选择被转染或感染的细胞容易进行的标记物基因。标记物基因的例子包含：编码荧光蛋白、例如增强绿色荧光蛋白、Ds-Red(DsRed：Discosomasp.红色荧光蛋白(RFP)；Bevis and Glick(2002)Nat.Biotechnol.20:83)、黄色荧光蛋白和氰基荧光蛋白的基因；以及、编码赋予对选择剂的耐性的蛋白的基因例如新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因等，但不限定于这些。

适合的病毒载体的例子包含：逆转录酶病毒系的病毒载体(包含慢病毒)；腺病毒；和腺相关病毒，但不限定于这些。适合的逆转录酶病毒系载体的例子是小鼠莫洛尼氏白血病病毒(MMLV)系的载体；但也可以使用其它重组逆转录酶病毒，例如可列举出：鸡白血病病毒、牛白血病病毒、小鼠白血病病毒(MLV)、貂致细胞灶病毒、小鼠肌节病毒、网状内皮组织增殖病毒、长臂猿白血病病毒、Mason Pfizer猴病毒、或Rous肌节病毒，例如可以参照美国专利6,333,195。

在另外一些情况下，逆转录酶病毒系载体为慢病毒系载体(例如，人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)；猴免疫缺陷病毒(SIV)；或猫免疫缺陷病毒(FIV))，例如可以参照Johnston等人、(1999),Journal of Virology,73(6):4991-5000(FIV)；Negre D等人、(2002),CurrentTopics in Microbiology and Immunology,261:53-74(SIV)；Naldini等人、(1996),Science,272:263-267(HIV)。

为了辅助进入靶细胞内，重组逆转录酶病毒可以包含病毒多肽(例如逆转录酶病毒env)。在该领域中已经全面建立了这样的病毒多肽，可以参照例如美国专利5,449,614。病毒多肽可以是双噬性病毒多肽、例如双噬性env，该病毒多肽辅助进入由包含除原始的宿主种类之外的细胞的多个宿主种类衍生的细胞内。病毒多肽可以是辅助进入除原始的宿主种类之外的细胞内的异养性病毒多肽。在本发明的另一实施方式中，病毒多肽为例如亲嗜性env等亲嗜性病毒多肽，该病毒多肽辅助进入原始的宿主种类的细胞内。

能够辅助逆转录酶病毒进入细胞内的病毒多肽的例子包含MMLV双噬性env、MMLV亲嗜性env、MMLV异养性env、水痘性口炎病毒-g蛋白(VSV-g)、HIV-1env、长臂猿白血病病毒(GALV)env、RD114、FeLV-C、FeLV-B、MLV10A1env基因和它们的突变体、例如嵌合体，但不限定于这些。例如可以参照Yee等人(1994),Methods Cell Biol.,PtA:99-112(VSV-G)；美国专利5,449,614。在一些情况下，对病毒多肽进行基因性修饰以促进表达或增强与受体的结合。

通常，重组病毒通过在生产细胞内导入病毒DNA或RNA构建体而产生。在一些情况下，生产细胞不表达外源性基因。在另外一些情况下，生产细胞是包含编码1个以上的外源性基因例如1个以上的gag、pol、或env多肽和/或1个以上的逆转录酶病毒gag、pol、或env多肽的基因的“包装细胞”。逆转录酶病毒包装细胞可以包含编码病毒多肽的基因、例如辅助进入靶细胞内的VSV-g。在一些情况下，包装细胞包含编码1个以上慢病毒蛋白质例如gag、pol、env、vpr、vpu、vpx、vif、tat、rev、或nef的基因。在一些情况下，包装细胞包含编码腺病毒蛋白质例如E1A或E1B或其它腺病毒蛋白质的基因。例如，由包装细胞供给的蛋白质可以是逆转录酶病毒衍生蛋白质例如gag、pol和env；慢病毒衍生蛋白质例如gag、pol、env、vpr、vpu、vpx、vif、tat、rev和nef；以及腺病毒衍生蛋白质例如E1A和E1B。在多个例子中，包装细胞供给由与病毒载体的衍生源不同的病毒的蛋白质。

包装细胞系统包含任意的能容易地转染的细胞系统，但不限定于这些。包装细胞系统可以以293T细胞、NIH3T3、COS或HeLa细胞系统为基础。包装细胞频繁地用于包装病毒载体质粒，前述病毒载体质粒缺失至少1个编码用于病毒包装所需的蛋白质的基因。可以使用能够供给由这样的病毒载体质粒编码的蛋白质缺失的蛋白质或多肽的任意者的细胞作为包装细胞。包装细胞系统的例子包含Platinum-E(Plat-E)；Platinum-A(Plat-A)；BOSC23(ATCCCRL11554)；和Bing(ATCC CRL 11270)，但不限定于这些，例如可以参照Morita等人、(2000),Gene Therapy,7:1063-1066；Onishi等人、(1996)、Experimental Hematology,24:324-329；美国专利6,995,009。市售的包装细胞系统也是有用的，例如可列举出：Ampho-Pak293细胞系统、Eco-Pak2-293细胞系统、RetroPackPT67细胞系统和Retro-XUniversalPackagingSystem(全部由Clontech供应)。

逆转录酶病毒构建体还可以由某些范围的逆转录酶病毒例如MMLV、HIV-1、SIV、FIV、或本说明书中记载的其它逆转录酶病毒衍生。逆转录酶病毒构建体可以对用于将特定的病毒复制超过1个循环所需的全部病毒多肽进行编码。在一些情况下，病毒进入的效率通过追加其它因子或其它病毒多肽来改善。在另外一些情况下，由逆转录酶病毒构建体编码的病毒多肽如美国专利6,872,528中记载所述，不会辅助多于1个循环的复制。在这样的情况下，通过追加其它因子或其它病毒多肽而能够辅助促进病毒进入。在所示例的实施方式中，重组逆转录酶病毒是包含VSV-g多肽但不包含HIV-1env多肽的HIV-1病毒。

逆转录酶病毒构建体可以包含启动子、多克隆位点和/或抗性基因。启动子的例子包含CMV、SV40、EF1α,β-肌动蛋白；逆转录酶病毒LTR启动子和诱导启动子，但不限定于这些。逆转录酶病毒构建体还可以包含包装信号(例如由MFG载体衍生的包装信号；psi包装信号)。在该领域中已知的一部分逆转录酶病毒构建体的例子包含pMX、pBabeX或它们的衍生物，但不限定于这些。例如可以参照Onishi等人、(1996),Experimental Hematology,24:324-329。在一些情况下，逆转录酶病毒构建体是自身失活型慢病毒载体(SIN lentivirusvector)载体，例如可以参照Miyoshi等人、(1998),J.Virol.,72(10):8150-8157。在一些情况下，逆转录酶病毒构建体是LL-CG、LS-CG、CL-CG、CS-CG、CLG或MFG。可以参照Miyoshi等人、(1998),J.Virol.,72(10):8150-8157；Onishi等人、(1996),ExperimentalHematology,24:324-329；Riviere等人、(1995),PNAS,92:6733-6737。病毒载体质粒(或构建体)包含pMXs、pMxs-IB、pMXs-puro、pMXs-neo(pMXs-IB是负载了杀稻瘟菌素抗性基因代替pMXs-puro的嘌呤霉素抗性基因而成的载体)Kimatura等人、(2003),ExperimentalHematology,31:1007-1014；MFG Riviere等人、(1995),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,92:6733-6737；pBabePuro；Morgenstern等人、(1990),Nucleic Acids Research,18:3587-3596；LL-CG,CL-CG,CS-CG,CLG Miyoshi等人、(1998),Journal of Virology,72:8150-8157等作为逆转录酶病毒系，此外包含pAdex1；Kanegae等人、(1995),Nucleic AcidsResearch,23:3816-3821等作为腺病毒系。所示例的实施方式中，逆转录酶病毒构建体包含杀稻瘟菌素(例如，pMXs-IB)、嘌呤霉素(例如，pMXs-puro、pBabePuro)；或新霉素(例如，pMXs-neo)。例如可以参照Morgenstern等人、(1990),Nucleic Acids Research、8:3587-3596。

由包装细胞生产重组病毒的方法及它们的应用已经足够完善；例如可以参照美国专利5,834,256；6,910,434；5,591,624；5,817,491；7,070,994；和6,995,009。大部分方法起始于将病毒构建体导入包装细胞系统中。病毒构建体包括磷酸钙法、脂质体转染法(Felgner等人、(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413-7417)、电穿孔法、显微注射法、FuGENETM转染等和本说明书中记载的任意的方法，但不限定于这些。可以利用任意的该领域中已知的方法导入作为宿主的成纤维细胞中。

核酸构建体可以使用细胞的非病毒系转染之类的各种熟知的方法导入宿主细胞内。在所示例的一个方面，构建体被转入载体内，接着被导入宿主细胞内。导入细胞中的方法包括电穿孔、磷酸钙介质转移、核转染、声孔效应、热冲击、放大倍率、脂质体介质转移、显微注射、微粒介质转移(纳米颗粒)、阳离子聚合物介质转移(DEAE葡聚糖、聚亚乙基亚胺、聚乙二醇(PEG)等)或细胞融合，但不限定于这些。可以利用在该领域中已知的任意的非病毒系转染来实施。转染的其它方法包括转染试剂例如Lipofectamine、Dojindo Hilymax、Fugene、jetPEI、Effectene和DreamFect。

[包含外源性基因的成纤维细胞]

本发明包含含有外源性的Tbx6基因的成纤维细胞。另外，本发明包含含有外源性的Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因的成纤维细胞。在本发明的另一实施方式中，本发明的包含外源性基因的成纤维细胞处于体外的状态。在本发明的另一实施方式中，本发明的包含外源性基因的成纤维细胞是哺乳动物细胞例如人细胞或由人细胞诱导的细胞。

[源自包含外源性基因的成纤维细胞的心脏祖细胞或心肌细胞]

本发明还涉及利用上述心脏祖细胞或心肌细胞的制造方法制造的、源自成纤维细胞的心脏祖细胞(诱导心脏祖细胞、心脏祖细胞样细胞)或心肌细胞(诱导心肌细胞、心肌样细胞)。本发明中“源自成纤维细胞”的心脏祖细胞或心肌细胞是指由成纤维细胞诱导的心脏祖细胞或心肌细胞。本发明的诱导心脏祖细胞或诱导心肌细胞由包含外源性基因的成纤维细胞诱导，因此本发明的诱导心脏祖细胞或诱导心肌细胞也还包含外源性的Tbx6基因、或外源性的Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因。在本发明的另一实施方式中，本发明的诱导心脏祖细胞或诱导心肌细胞处于体外的形态。在本发明的另一实施方式中，本发明的诱导心脏祖细胞或诱导心肌细胞是例如人细胞等哺乳动物的细胞，或是由人细胞等哺乳动物衍生的细胞。

对于由成纤维细胞诱导的细胞为心脏祖细胞的情况，如前所述可以通过心脏祖细胞特异性标记物的表达来加以确认。由此也将确认了心脏祖细胞特异性标记物的表达的细胞称为心脏祖细胞样细胞。

同样地，对于由成纤维细胞诱导的细胞为心肌细胞的情况，如前述可以通过心肌细胞特异性标记物的表达加以确认。由此也将确认了心脏祖细胞特异性标记物的表达的细胞称为心肌样细胞。

标记物表达可以通过基因水平或蛋白质水平加以确认。

本发明的诱导心脏祖细胞可以在由成纤维细胞诱导之后以心脏祖细胞的形式维持一定期间以上。即，利用本发明的方法诱导的心脏祖细胞的特征之一在于，将Tbx6基因导入成纤维细胞中后，在一定期间(例如，3周、4周、5周)以上表达例如T、Mesp1、或Flk1(KDR)等心脏祖细胞特异性标记物。

本发明还提供包含含有外源性基因的成纤维细胞或含有外源性基因的、包含源自成纤维细胞的心脏祖细胞或心肌细胞的组合物。本发明的组合物包含上述成纤维细胞或诱导心脏祖细胞或诱导心肌细胞，进而，作为适合的成分还可以包含：盐；缓冲剂；稳定化剂；蛋白酶抑制剂；细胞膜和/或细胞壁保存化合物、例如甘油、二甲基亚砜等；适于细胞的营养培养基等。

[诱导剂]

本发明还提供由成纤维细胞诱导心脏祖细胞的诱导剂、或由成纤维细胞诱导心肌细胞的诱导剂。另外，通过将Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因导入成纤维细胞中，从而还可诱导平滑肌细胞、内皮细胞，因此本发明还提供由成纤维细胞诱导平滑肌细胞的诱导剂或诱导血管内皮细胞的诱导剂。

在本发明的另一实施方式中，本发明的心脏祖细胞的诱导剂至少包含：1)Tbx6多肽或2)包含编码Tbx6多肽的核苷酸序列的核酸中的任意者。在本发明的另一实施方式中，本发明的心肌细胞的诱导剂、平滑肌细胞的诱导剂或血管内皮细胞的诱导剂至少包含：1)Tbx6多肽、SRF多肽、Myocd多肽的混合物或2)包含编码Tbx6多肽的核苷酸序列的核酸、包含编码SRF多肽的核苷酸序列的核酸、包含编码Myocd多肽的核苷酸序列的核酸的混合物中的任意者。

对于本发明的诱导剂，除了上述多肽或核酸之外，还可以包含盐例如NaCl、MgCl、KCl、MgSO₄等；缓冲剂、例如Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙烷磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)；等、增溶剂；例如Tween-20等非离子系清洗剂等清洗剂；等、蛋白酶抑制剂；甘油；等的1种以上。另外，本发明的诱导剂可以包含用于将重编程因子的多肽或核酸导入成纤维细胞中的试剂。

本发明的诱导剂可以对个体(例如，心脏组织内)进行直接给药。本发明的诱导剂对于将成纤维细胞诱导为心脏祖细胞或心肌细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞是有用的，该诱导可以在体外或在体内实施。将成纤维细胞诱导为心脏祖细胞或心肌细胞可以用于治疗各种心脏疾病。

因此，本发明的诱导剂还可以包含药学上可接受的赋形剂。适合的赋形剂例如为水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等和它们的组合。进而，根据期望可以含有少量的辅助性物质、例如水合剂、或乳化剂、或缓冲剂。制备这样的剂型的实际方法是已知的。例如可以参照Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvania、17th edition、1985。

药学上可接受的赋形剂例如载色剂、佐剂、载体或稀释剂等可以容易地获得。进而，药学上可接受的辅助性物质例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定化剂、水合剂等也可以容易地购买到。

[使用了细胞的治疗方法]

本发明的包含外源性基因的成纤维细胞可以用于在需要治疗的个体中应用这样的治疗。同样地，本发明的诱导心脏祖细胞或诱导心肌细胞可以用于在需要治疗的个体中应用这样的治疗。本发明的包含外源性的基因的成纤维细胞、或本发明的诱导心脏祖细胞或诱导心肌细胞可以导入至受体个体(需要治疗的个体)中，在此情况下，本发明的包含外源性基因的成纤维细胞、或本发明的诱导心脏祖细胞或诱导心肌细胞的向受体个体中的导入治疗在个体中的症状或疾病。因此，本发明涉及包括对个体给予本发明的包含外源性基因的多能干细、或本发明的诱导心脏祖细胞或诱导心肌细胞的治疗方法。

例如，在一些实施方式中，本发明的治疗方法包括：i)在体外产生诱导心脏祖细胞或诱导心肌细胞；和ii)将诱导心脏祖细胞或诱导心肌细胞导入需要其的个体中。

另外，本发明提供在体内、心脏组织内对成纤维细胞进行重编程的方法。该方法能用于个体的治疗。在一些实施方式中，本发明的治疗方法包括使包含诱导剂或重编程因子的组合物在体内与个体的成纤维细胞接触。对于接触而言，包括对个体将本发明的诱导剂或重编程组合物给药至治疗部位或其附近、例如心脏中或周围。作为给药的方法，例如可列举出如下方法：将插入至末端动脉的导管导入心脏患部附近，从导管的前端向纤维化了的患部组织中注入本发明的包含诱导剂或重编程因子的组合物来使其接触。

本发明的治疗方法用于治疗具有心脏或心血管的疾病或障碍的个体，前述疾病或障碍有例如：心血管疾病、动脉瘤、心绞痛、心律不齐、动脉粥样硬化、脑血管意外(脑中风)、心脏血管疾病、先天性心脏病、充血性心力衰竭、心肌炎、冠状动脉瓣膜疾病、舒张性动脉疾病、舒张期功能障碍、心内膜炎、高血压、心肌病、肥厚性心肌病、局限性心肌病、作为结果导致缺血性心肌病的冠心病、二尖瓣脱垂综合征、心肌梗塞(心脏发作)、或静脉血栓塞栓。

诱导心肌细胞细胞群、成纤维细胞、诱导心脏祖细胞、或诱导心肌细胞的细胞群的单位剂型可以含有约为10³个～约10⁹个、例如约10³个～约10⁴个、约10⁴个～约10⁵个、约10⁵个～约10⁶个、约10⁶个～约10⁷个、约10⁷个～约10⁸个、或约10⁸个～约10⁹个细胞。

实施例

[实施例1]小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)的制作

(1)小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)的制作

让出生后7周～10周的雌ICR小鼠(CLEA Japan,Inc.)与经Mesp1-GFP转基因的小鼠(雄)(Development 126,3437-3447(1999),“MesP1is expressed in the heartprecursor cells and required for the formation of a single heart tube”)交配。将确认受精之日作为妊娠0天，在确认妊娠后第12天从妊娠的ICR小鼠身上摘取了胎儿。从胎儿中摘取心脏，通过倒置显微镜(Olympus Corporation、IX71)利用荧光对心脏进行投影，并选择发出GFP荧光的胎儿。

从选择的胎儿上摘取四肢和头部1/2～2/3、肺、肝脏、肾脏、肠道等实质器官，用磷酸盐缓冲液(PBS：phosphate buffered saline)(-)(WAKO公司、045-29795)清洗剩余的躯干部的组织，充分地去除了血细胞成分。然后，利用经灭菌的手术用剪将组织尽可能细地剪断。对剪断的组织片加入以1：1混合了0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco公司、25200-072)和PBS(-)(WAKO公司、045-29795)的溶液(15mL/6～7只胎儿)，在37℃下进行15分钟边在水浴中振荡边孵育。添加FBS(胎牛血清，Fetal Bovine Serum)(Thermo Scientific公司、SV30014.03)原液15mL，使其充分悬浮。将相同悬浮液以1500rpm/5分钟/4℃进行离心分离，去除了上清液。

将细胞沉淀物和悬浮物再悬浮于MEF用培养基(10％FBS/DMEM/PSA)(表1)30mL中，以胎儿每2～3只为1个10cm培养皿的方式接种在10cm组织培养用培养皿(ThermoScientific公司、172958)中。在37℃/5％CO₂条件下进行培养，第二天用MEF用培养基进行了培养基更换。之后，持续每3～4天进行培养基更换。

[表1]

(表1)MEF用培养基

FBS(胎牛血清)(Thermo Scientific公司，SV30014.03)	50mL
		DMEM(WAKO公司、044-29765)	440mL
PSA	5mL
		丙酮酸钠(Sigma公司S8636)	5mL
GlutaMAX(gibco公司、35050-061)	5mL
		非必需氨基酸溶液100x(Sigma公司M7145)	5mL

(2)通过流式细胞仪进行的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)的分类

在诱导为心脏祖细胞的情况下，如下所述通过流式细胞仪(FACS)进行分类，使用了GFP(-)的细胞。

吸出培养基，用PBS(-)对细胞进行清洗，针对各培养皿添加0.25％胰蛋白酶-EDTA2mL，在37℃/5％CO₂条件下静置5分钟。确认细胞在培养液中浮起后，用MEF用培养基(10％FBS/DMEM/PSA)(表1)8mL进行中和，将细胞回收至15mL管(Corning公司、430791)中。以1500rpm/5分钟/4℃将回收的细胞离心分离。吸出上清液后，加入施行FACS用的溶液(5％FBS/PBS)(表2)350μL并进行充分地混合。通过带细胞滤网盖的5mL聚苯乙烯圆底管(FALCON公司、REF 353335)对该悬浮液进行过滤，作为FACS用试样。使用FACS(日本Becton andDickinson Company、FACS AriaIII)时，使上述试样中的GFP阳性细胞和阴性细胞分离，将阴性细胞用于心脏祖细胞诱导。

[表2]

(表2)施行FACS用溶液

FBS(胎牛血清)(Thermo scientific公司，SV30014.03)	10mL
		PBS(-)(WAKO公司、045-29795)	190mL

[实施例2]诱导心脏祖细胞的制作和细胞培养

在涂布了明胶涂层的10cm组织培养用培养皿(Thermo Scientific公司、172958)中以3.6×10⁶个细胞的浓度接种平板E包装(Plat-E packaging)细胞，在37℃/5％CO₂条件下静置(第一天)。

在第二天(day2)，在300μL Opti-MEM(Gibco公司、31985-070)中混合了27μL的FuGENE 6转染试剂(Promega公司、E2691)。静置5分钟后，在上述混合液中混注pMx-Tbx6的逆转录酶病毒质粒(参照Cell 142，375-386，August 6，2010，“Direct Reprogramming ofFibroblasts into Functional Cardiomyocytes by Defined Factors”)9000ng量并进行剧烈敲击，然后在室温下静置15分钟。对在前一天(第一天)准备的Plat-E细胞整体滴加上述溶液，在37℃/5％CO₂条件下静置(转染)。

24小时后(第三天)，将培养基更换为Plat-E培养液(DMEM/10％FBS/PSA)(表3)，进而在37℃/5％CO₂条件下静置24小时。

[表3]

(表3)Plat-E用培养基

FBS(胎牛血清)(Thermo Scientific公司，SV30014.03)	50mL
		DMEM(WAKO公司、044-29765)	440mL
PSA	5mL
		丙酮酸钠(Sigma公司S8636)	5mL
GlutaMAX(gibco公司、35050-061)	5mL
		非必需氨基酸溶液100×(sigma公司M7145)	5mL

另外，在12孔细胞培养用多孔板(FALCON公司、353043)中以0.5×10⁵个细胞/孔的浓度接种实施例1的MEF，使用MEF用培养基在37℃/5％CO₂条件下进行培养。

48小时后(第四天)，用0.45μm孔径Minisart过滤器(Sartorius Stedim Biotech公司、17598)对各培养上清液进行过滤，然后回收至50mL管(Corning公司、430829)中。相对于回收的上清液10mL混注了4μL凝聚胺转染试剂(Polybrene Transfection Reagent)(10mg/mL)(Millipore公司、#TR-1003-G)。将其作为针对Tbx6基因的逆转录酶病毒溶液。

将在前一天(第三天)接种于12孔细胞培养用多孔板的实施例1的MEF的培养基吸出，然后通过Tbx6逆转录酶病毒溶液进行培养基更换，使其感染病毒(infection)。

在导入基因的第二天，将培养基更换为心脏祖细胞重编程用培养基(表4)，在37℃/5％CO₂条件下培养了细胞。之后每3～4天更换培养基并进行了细胞培养。

[表4]

(表4)心脏祖细胞重编程用培养基

FBS(胎牛血清)(Thermo Scientific公司，SV30014.03)	50mL
		DMEM(WAKO公司、044-29765)	440mL
PSA	5mL

[实施例3]通过Tbx6、SRF、Myocd进行的诱导心肌细胞的制作和细胞培养

(1)通过逆转录酶病毒进行的Tbx6、SRF、Myocd的基因导入法

与实施例2的“诱导心脏祖细胞的制作”同样地制作了病毒溶液。其中，在该实施例中导入了3个基因。在第一天，利用与实施例2同样的方法在3个10cm组织培养用培养皿中准备了Plat-E细胞。在第二天，在300μL Opti-MEM(Gibco公司、31985-070)中混合了27μLFuGENE 6转染试剂(Promega公司、E2691)。静置5分钟后，在上述混合液中分别混注pMx-Tbx6、pMx-SRF和pMx-Myocd(制造方法参照Cell 142,375-386,August 6,2010,“DirectReprogramming of Fibroblasts into Functional Cardiomyocytes by DefinedFactors”)的逆转录酶病毒质粒9000ng量并进行剧烈敲击，然后在室温下静置15分钟。对在前一天(第一天)准备的Plat-E细胞整体滴加上述溶液，在37℃/5％CO₂条件下静置(转染)。

24小时后(第三天)，将培养基更换为Plat-E培养液(DMEM/10％FBS/PSA)(表3)，进而在37℃/5％CO₂条件下静置24小时。48小时后(第四天)用0.45μm孔径Minisart过滤器(Sartorius Stedim Biotech公司、17598)对各培养上清液进行过滤，然后回收至50mL管(Corning公司、430829)中。对于回收的上清液10mL混注了4μL凝聚胺转染试剂(10mg/mL)(Millipore公司、#TR-1003-G)。将其作为对于各基因(Tbx6、SRF、Myocd)的逆转录酶病毒溶液。

进而在第三天，在12孔细胞培养用多孔板(FALCON公司、353043)的各孔中分别加入将0.25mL诱导基质生长因子(Matrigel Growth Factor Reduced)(Corning公司、354230)用28.2mL DMEM稀释而成的Matrigel溶液(70.4μg/mL)0.25mL，在37℃下静置1小时，用Matrigel对多孔板进行了涂布。去除溶液后，以0.5×10⁵个细胞/孔的浓度接种了MEF(实施例1)，用MEF用培养基(表1)继续进行了培养。

在第四天从在第三天准备的多孔板中吸出MEF用培养基，然后将培养基更换为分别以相同量混合了Tbx6、SRF、Myocd而得到的逆转录酶病毒溶液，使MEF感染病毒(infection)。

(2)通过心肌细胞诱导培养基的细胞培养

在基因导入第二天(第五天)，变更为FFV培养基(表5)，在37℃/5％CO₂条件下进行了培养。以后每3～4天更换培养基并进行了细胞培养。

[表5]

(表5)FFV培养基

含营养补充剂的StemPro(R)34SFM(gibco公司、10639-011)	10mL
		GlutaMAX(gibco公司、35050-061)	100μL
5mg/ml抗坏血酸(Sigma公司A4544)	200μL
		5ng/μl重组人VEGF165(R&D Systems公司，293-VE-050)	10μL
10ng/μl重组人FGF基础146aa(R&D Systems公司，233-FB-025)	10μL
		50ng/μl重组人FGF10(R&D Systems公司，345-FG-025)	5μL

[实施例4]由小鼠成纤维细胞进行的心脏祖细胞的诱导

将Tbx6基因导入小鼠成纤维细胞(MEF)中，诱导了心脏祖细胞(图1、实施例2)。

将Tbx6基因导入在表达了作为心脏祖细胞特异性的转录因子Mesp1的细胞中表达GFP的Mesp1-Cre GFP flox小鼠成纤维细胞中(实施例2)，确认了通过表达了Mesp1的GFP阳性细胞而形成集落(图2)。

接着，测定了导入了Tbx6基因的细胞中的、分化标记物基因的mRNA表达。在诱导1个月后，维持了作为心脏祖细胞特异性的基因的Mesp1和T(brachyury)、进而KDR的表达，另一方面未观察到在分化的心肌细胞中所表达的Nkx2.5、肌钙蛋白T的表达(图3)。

由实施例2和实施例4示出：通过将Tbx6导入成纤维细胞中而可诱导心脏祖细胞。

[实施例5]由小鼠成纤维细胞进行的心肌细胞的诱导

将Tbx6、SRF、Myocd基因导入至小鼠成纤维细胞(MEF)中而诱导了心肌细胞(图4、实施例3)。

所诱导的心肌细胞的形态发生变化，显示出横纹结构(图5)。另外，观察到作为心肌的结构蛋白质的肌钙蛋白T(cTnT)、作为平滑肌细胞的蛋白质的SM-MHC的表达(图5)。

对所诱导的细胞整体的mRNA表达进行了研究，显示出：除了诱导心脏祖细胞基因(Mesp1、T、KDR)之外，还诱导了在单独使用Tbx6时未诱导的Nkx2.5、肌钙蛋白T(Tnnt2)之类的心肌细胞特异性的基因表达。

由实施例3和实施例5显示出：通过将Tbx6、SRF、Myocd基因导入成纤维细胞中而可诱导心肌细胞。

[实施例6]由小鼠成纤维细胞进行的平滑肌细胞的诱导和血管内皮细胞的诱导

利用与实施例3同样的方法将Tbx6、SRF、Myocd基因导入小鼠成纤维细胞(MEF)中。

在基因导入14天后，进行了基于抗平滑肌肌球蛋白重链(Smooth muscle myosinheavy chain)(肌球蛋白-11或SMMHC)抗体的免疫染色。

其结果，由于基因导入了Tbx6、SRF、Myocd的细胞对该抗体呈阳性，因此可知表达了作为平滑肌的特征的肌球蛋白重链(图8)。

另外，在基因导入14天后，通过qRT-PCR测定了肌球蛋白重链11(myosin heavypolypeptide 11：Myh11)和血小板内皮细胞黏附分子-1(Platelet/endothelial celladhesion molecule 1：Pecam1)的表达量。Myh11是平滑肌特异性地表达的蛋白质，Pecam1是血管内皮细胞特异性地表达的蛋白质。

其结果，在基因导入了Tbx6、SRF、Myocd的细胞(TSM)中，确认诱导了Myh11和Pecam1的表达(图7)。

通过该实施例显示出：通过将Tbx6、SRF、Myocd基因导入成纤维细胞(MEF)中，从而能够诱导平滑肌细胞或血管内皮细胞。

产业上的可利用性

根据本发明，可提供由成纤维细胞直接制造心脏祖细胞的方法和由成纤维细胞直接制造心肌细胞的方法。另外，本发明可以提供利用本发明的方法制造的心脏祖细胞和心肌细胞。根据本发明由成纤维细胞诱导的心脏祖细胞持续了多个心脏祖细胞基因的表达，因此本发明可以提供与现有方法相比更稳定的心脏祖细胞的制造方法和心脏祖细胞。心脏祖细胞具有增殖能力，因此根据本发明制作的心脏祖细胞可以适宜地用于医疗用途。

另外，确认了根据本发明诱导的心肌细胞是搏动的，而且确认了心肌特异性的基因表达、结构蛋白质的表达。因此，本发明的心肌制造方法可以提供功能性成熟的心肌细胞。

序列号1：人Tbx6的核苷酸序列。

序列号2：人Tbx6的氨基酸序列。

序列号3：小鼠Tbx6的核苷酸序列。

序列号4：小鼠Tbx6的氨基酸序列。

序列号5：人SRF的核苷酸序列。

序列号6：人SRF的氨基酸序列。

序列号7：小鼠SRF的核苷酸序列。

序列号8：小鼠SRF的氨基酸序列。

序列号9：人Myocd的核苷酸序列。

序列号10：人Myocd的氨基酸序列。

序列号11：小鼠Myocd的核苷酸序列。

序列号12：小鼠Myocd的氨基酸序列。

序列表

<110> 学校法人庆应义塾（Keio University）

国立研究开发法人产业技术综合研究所（National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology）

<120> 由成纤维细胞直接制造心脏祖细胞和心肌细胞的方法

<130> G1521WO

<140> JP2016-051407

<141> 2016-03-15

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1830

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

agctgtcgga ctcaccgggg gccctaagca gcgagacctg aggccagacg gaactacaac 60

atgtaccatc cacgagaatt gtacccgtcc ctgggggccg gctaccgcct ggggcccgcc 120

caacctgggg ccgactccag cttcccaccc gccctagcgg agggctaccg ctaccccgaa 180

ctggacaccc ctaaactgga ttgcttcctc tccgggatgg aggctgctcc ccgcaccctg 240

gccgcgcacc cacctctgcc ccttctgccc cctgccatgg gcactgagcc ggccccatca 300

gctccagagg ccctccattc cctcccgggg gtcagcctga gcctggagaa ccgggagcta 360

tggaaggagt tcagctctgt gggaacagaa atgatcatca ccaaagctgg gaggcgcatg 420

ttccctgcct gccgagtgtc agtcactggc ctggaccccg aggcccgcta cttgtttctt 480

ctggatgtga ttccggtgga tggggctcgc taccgctggc agggccggcg ctgggagccc 540

agcggcaagg cagagccccg cctgcctgac cgtgtctaca ttcaccccga ctctcctgcc 600

actggtgcac attggatgcg gcagcctgtg tctttccatc gtgtcaagct caccaacagc 660

acgctggacc cccacggcca cctgatcctg cactccatgc acaagtacca accccgcata 720

cacctagttc gggcagccca gctctgcagc cagcactggg ggggcatggc ctccttccgc 780

ttccccgaga ccacattcat ctccgtgaca gcctaccaga acccacagat cacacaactg 840

aagattgcag ccaatccctt tgccaaaggc ttccgggaga acggcagaaa ctgtaagagg 900

gagcgagacg cccgtgtgaa gaggaaactg cggggcccag agccagcagc cacagaggcc 960

tatgggagcg gagacacacc aggtggtccc tgcgactcca ccctgggtgg agacattcgt 1020

gaatcagatc cagaacaggc cccagccccc ggggaagcca ccgctgcccc ggcacctctg 1080

tgtggtggcc ccagtgctga ggcctacctc ctgcaccctg cggctttcca tggggccccc 1140

agtcaccttc ccaccaggag ccccagcttc ccggaggctc cagactccgg gcgctcagcc 1200

ccctactcgg ctgcatttct ggagctgccg cacgggtcag ggggctccgg gtacccagcg 1260

gctccaccgg cggtaccctt tgccccgcac tttctccaag ggggcccctt ccctctacca 1320

tacaccgcgc ctgggggcta tctggatgtg ggctccaaac ccatgtactg aaccactgct 1380

gggcccctct gcctccatca caaacctccc gctcccttcc cccagccctg gagccccctc 1440

acctccaccg gccccatccc ccacaccaaa tggccgcctt gggcctgccc acccaccccc 1500

tcaacttcac accttgattt cactcccacc cccctctggc ttcaaagcct aaccaaggct 1560

gctgggagtc cagctggggc cggcttcccc ttcccggctc tcacctccgt gtgaatggaa 1620

ggggctctgc ctggccaaat ggggccacag accagcatcc ccacttacca ggcctcccca 1680

tgggctctgg aggggctcaa tccccacccc cccacacaca ctggtgcagg ccacaccagt 1740

ctgttgttct gggaccagag tatttttgtt aataaaactc aaaagccatc catgctcagg 1800

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1830

<210> 2

<211> 436

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Tyr His Pro Arg Glu Leu Tyr Pro Ser Leu Gly Ala Gly Tyr Arg

1 5 10 15

Leu Gly Pro Ala Gln Pro Gly Ala Asp Ser Ser Phe Pro Pro Ala Leu

20 25 30

Ala Glu Gly Tyr Arg Tyr Pro Glu Leu Asp Thr Pro Lys Leu Asp Cys

35 40 45

Phe Leu Ser Gly Met Glu Ala Ala Pro Arg Thr Leu Ala Ala His Pro

50 55 60

Pro Leu Pro Leu Leu Pro Pro Ala Met Gly Thr Glu Pro Ala Pro Ser

65 70 75 80

Ala Pro Glu Ala Leu His Ser Leu Pro Gly Val Ser Leu Ser Leu Glu

85 90 95

Asn Arg Glu Leu Trp Lys Glu Phe Ser Ser Val Gly Thr Glu Met Ile

100 105 110

Ile Thr Lys Ala Gly Arg Arg Met Phe Pro Ala Cys Arg Val Ser Val

115 120 125

Thr Gly Leu Asp Pro Glu Ala Arg Tyr Leu Phe Leu Leu Asp Val Ile

130 135 140

Pro Val Asp Gly Ala Arg Tyr Arg Trp Gln Gly Arg Arg Trp Glu Pro

145 150 155 160

Ser Gly Lys Ala Glu Pro Arg Leu Pro Asp Arg Val Tyr Ile His Pro

165 170 175

Asp Ser Pro Ala Thr Gly Ala His Trp Met Arg Gln Pro Val Ser Phe

180 185 190

His Arg Val Lys Leu Thr Asn Ser Thr Leu Asp Pro His Gly His Leu

195 200 205

Ile Leu His Ser Met His Lys Tyr Gln Pro Arg Ile His Leu Val Arg

210 215 220

Ala Ala Gln Leu Cys Ser Gln His Trp Gly Gly Met Ala Ser Phe Arg

225 230 235 240

Phe Pro Glu Thr Thr Phe Ile Ser Val Thr Ala Tyr Gln Asn Pro Gln

245 250 255

Ile Thr Gln Leu Lys Ile Ala Ala Asn Pro Phe Ala Lys Gly Phe Arg

260 265 270

Glu Asn Gly Arg Asn Cys Lys Arg Glu Arg Asp Ala Arg Val Lys Arg

275 280 285

Lys Leu Arg Gly Pro Glu Pro Ala Ala Thr Glu Ala Tyr Gly Ser Gly

290 295 300

Asp Thr Pro Gly Gly Pro Cys Asp Ser Thr Leu Gly Gly Asp Ile Arg

305 310 315 320

Glu Ser Asp Pro Glu Gln Ala Pro Ala Pro Gly Glu Ala Thr Ala Ala

325 330 335

Pro Ala Pro Leu Cys Gly Gly Pro Ser Ala Glu Ala Tyr Leu Leu His

340 345 350

Pro Ala Ala Phe His Gly Ala Pro Ser His Leu Pro Thr Arg Ser Pro

355 360 365

Ser Phe Pro Glu Ala Pro Asp Ser Gly Arg Ser Ala Pro Tyr Ser Ala

370 375 380

Ala Phe Leu Glu Leu Pro His Gly Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Pro Ala

385 390 395 400

Ala Pro Pro Ala Val Pro Phe Ala Pro His Phe Leu Gln Gly Gly Pro

405 410 415

Phe Pro Leu Pro Tyr Thr Ala Pro Gly Gly Tyr Leu Asp Val Gly Ser

420 425 430

Lys Pro Met Tyr

435

<210> 3

<211> 1731

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 3

cacaaggcca gaagaaacta caacatgtac catccacgag agttgtaccc ctccctgggg 60

actggctacc gtctgggaca cccccagcct ggggcagact ccaccttccc acctgccctg 120

acagagggtt accgctaccc tgatttggat acttctaaac tggattgctt cctctctggg 180

atcgaggcag ctccccacac tctggctgca gccgctcctt tgccccttct cccatctgct 240

ctgggccccg agacagcacc gccaccccca gaggcccttc actcgcttcc tggggtcagc 300

ctgagcttgg agaaccagga actgtggaag gaattcagcg ctgtggggac agagatgatc 360

atcaccaagg ctggcaggcg catgttccct gcttgccgag tatcagtcac tggcctggac 420

ccagaggccc gctacttgtt tcttctggat gtggttccag tggatggggc ccgataccgc 480

tggcagggcc agcactggga gccaagtggc aaggctgaac cccgcctacc cgaccgtgtc 540

tacattcacc ctgactctcc tgccactggt gcccactgga tgcggcagcc cgtatccttc 600

catcgtgtta agctcaccaa cagcacactg gacccccatg gccacctgat cttgcactcg 660

atgcacaagt accagcctcg catccacctg gtgagagcca cccaactatg cagccaacac 720

tgggggggtg tggcctcctt ccgatttcct gagaccacat tcatctctgt gacagcctac 780

cagaacccta ggatcacaca gctgaagatc gcagccaatc cctttgccaa aggtttccga 840

gaaaatggca gaaactgtaa gagggagcgg gatgcccgtg tgaagaggaa acttcggggc 900

ccagagccag tggccacaga ggcctgtggg agtggggata caccaggggg tccctgtgac 960

tccaccctgg gtggggacat tcgggactca gatccagagc aggccccaac cccccaggaa 1020

gctgcttctg cctcagctcc tccatgtggg ggccccagtg ctgaggccta ccttctacac 1080

cctgccgctt ttcatggcgc ccccagtcac ctaccagcca ggacccccag cttcgctgag 1140

gctccagacc ctgggcgccc agccccctac tcagctgcat ttctggacct acagcctgga 1200

ccagggggct ctgcctatca ggcagctcca tctgtaccat cctttgcccc acacttcatc 1260

caagggggtc ccttccctct accgtaccca ggacctggag gttatctgga catgggatcc 1320

aagccaatgt actgagcctc ggtgtagtaa ccctatgcca tcttcccttg atcctccagc 1380

tcccttcccc cagcctggta gcatccgcat tgaagtggta tccccctccc ccccaccaaa 1440

tggctggctt gggcctctct tccacccttt agttcacacc ttgatttcac tccaccccct 1500

ctggcttcaa agctcaggca aggcagctct gagtccagct ggggcctgct tcccctcagc 1560

tctcacctta gtgcgaatgg agggagcctc tgcctggcca aatggggctc ccagcccagt 1620

acccccacct cctgggggcc ttgttactag tgcaagccat gccaatttgt tctcaggatc 1680

agagtatttt tgttaataaa actccaaaga cattaaaaaa aaaaaaaaaa a 1731

<210> 4

<211> 436

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 4

Met Tyr His Pro Arg Glu Leu Tyr Pro Ser Leu Gly Thr Gly Tyr Arg

1 5 10 15

Leu Gly His Pro Gln Pro Gly Ala Asp Ser Thr Phe Pro Pro Ala Leu

20 25 30

Thr Glu Gly Tyr Arg Tyr Pro Asp Leu Asp Thr Ser Lys Leu Asp Cys

35 40 45

Phe Leu Ser Gly Ile Glu Ala Ala Pro His Thr Leu Ala Ala Ala Ala

50 55 60

Pro Leu Pro Leu Leu Pro Ser Ala Leu Gly Pro Glu Thr Ala Pro Pro

65 70 75 80

Pro Pro Glu Ala Leu His Ser Leu Pro Gly Val Ser Leu Ser Leu Glu

85 90 95

Asn Gln Glu Leu Trp Lys Glu Phe Ser Ala Val Gly Thr Glu Met Ile

100 105 110

Ile Thr Lys Ala Gly Arg Arg Met Phe Pro Ala Cys Arg Val Ser Val

115 120 125

Thr Gly Leu Asp Pro Glu Ala Arg Tyr Leu Phe Leu Leu Asp Val Val

130 135 140

Pro Val Asp Gly Ala Arg Tyr Arg Trp Gln Gly Gln His Trp Glu Pro

145 150 155 160

Ser Gly Lys Ala Glu Pro Arg Leu Pro Asp Arg Val Tyr Ile His Pro

165 170 175

Asp Ser Pro Ala Thr Gly Ala His Trp Met Arg Gln Pro Val Ser Phe

180 185 190

His Arg Val Lys Leu Thr Asn Ser Thr Leu Asp Pro His Gly His Leu

195 200 205

Ile Leu His Ser Met His Lys Tyr Gln Pro Arg Ile His Leu Val Arg

210 215 220

Ala Thr Gln Leu Cys Ser Gln His Trp Gly Gly Val Ala Ser Phe Arg

225 230 235 240

Phe Pro Glu Thr Thr Phe Ile Ser Val Thr Ala Tyr Gln Asn Pro Arg

245 250 255

Ile Thr Gln Leu Lys Ile Ala Ala Asn Pro Phe Ala Lys Gly Phe Arg

260 265 270

Glu Asn Gly Arg Asn Cys Lys Arg Glu Arg Asp Ala Arg Val Lys Arg

275 280 285

Lys Leu Arg Gly Pro Glu Pro Val Ala Thr Glu Ala Cys Gly Ser Gly

290 295 300

Asp Thr Pro Gly Gly Pro Cys Asp Ser Thr Leu Gly Gly Asp Ile Arg

305 310 315 320

Asp Ser Asp Pro Glu Gln Ala Pro Thr Pro Gln Glu Ala Ala Ser Ala

325 330 335

Ser Ala Pro Pro Cys Gly Gly Pro Ser Ala Glu Ala Tyr Leu Leu His

340 345 350

Pro Ala Ala Phe His Gly Ala Pro Ser His Leu Pro Ala Arg Thr Pro

355 360 365

Ser Phe Ala Glu Ala Pro Asp Pro Gly Arg Pro Ala Pro Tyr Ser Ala

370 375 380

Ala Phe Leu Asp Leu Gln Pro Gly Pro Gly Gly Ser Ala Tyr Gln Ala

385 390 395 400

Ala Pro Ser Val Pro Ser Phe Ala Pro His Phe Ile Gln Gly Gly Pro

405 410 415

Phe Pro Leu Pro Tyr Pro Gly Pro Gly Gly Tyr Leu Asp Met Gly Ser

420 425 430

Lys Pro Met Tyr

435

<210> 5

<211> 4230

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

gaagggtcgg gggatccctc cgccgccagc gcgtggtccc ggccccctcc acccgccgtc 60

tcggccgcgg ccagcagccc ctgccccccg ggggacgctg acggccgccc ggcgcgccgc 120

cctagcagac ggacaggggg cgctgcgcgc ggcctggggc aacccgggcc acaggggcag 180

gaaagtgagg gcccaggtcg gcccgggcgt gcaggggccc cgggttcgca gcggcggccg 240

cggcagcgat agcggcacta gcagcagcgg gagtgccggg ttgagccggg aagccgatgg 300

cggcggctgc ggcggctccg attcctcgct gactgcccgt ccgccctcct gcatcgagcg 360

ccatgttacc gacccaagct ggggccgcgg cggctctggg ccggggctcg gccctggggg 420

gcagcctgaa ccggaccccg acggggcggc cgggcggcgg cggcgggaca cgcggggcta 480

acgggggccg ggtccccggg aatggcgcgg ggctcgggcc cggccgcctg gagcgggagg 540

ctgcggcagc ggcggcaacc accccggcgc ccaccgcggg ggccctctac agcggcagcg 600

agggcgactc ggagtcgggc gaggaggagg agctgggcgc cgagcggcgc ggcctgaagc 660

ggagcctgag cgagatggag atcggtatgg tggtcggtgg gcccgaggcg tcggcagcgg 720

ccaccggggg ctacgggccg gtgagcggcg cggtgagcgg ggccaagccg ggtaagaaga 780

cccggggccg cgtgaagatc aagatggagt tcatcgacaa caagctgcgg cgctacacga 840

ccttcagcaa gaggaagacg ggcatcatga agaaggccta tgagctgtcc acgctgacag 900

ggacacaggt gctgttgctg gtggccagtg agacaggcca tgtgtatacc tttgccaccc 960

gaaaactgca gcccatgatc accagtgaga ccggcaaggc actgattcag acctgcctca 1020

actcgccaga ctctccaccc cgttcagacc ccacaacaga ccagagaatg agtgccactg 1080

gctttgaaga gacagatctc acctaccagg tgtcggagtc tgacagcagt ggggagacca 1140

aggacacact gaagccggcg ttcacagtca ccaacctgcc gggtacaacc tccaccatcc 1200

aaacagcacc tagcacctct accaccatgc aagtcagcag cggcccctcc tttcccatca 1260

ccaactacct ggcaccagtg tctgctagtg tcagccccag tgctgtcagc agtgccaatg 1320

ggactgtgct gaagagtaca ggcagcggcc ctgtctcctc tgggggcctt atgcagctgc 1380

ctaccagctt caccctcatg cctggtgggg cagtggccca gcaggtccca gtgcaggcca 1440

ttcaagtgca ccaggcccca cagcaagcgt ctccctcccg tgacagcagc acagacctca 1500

cgcagacctc ctccagcggg acagtgacgc tgcccgccac catcatgacg tcatccgtgc 1560

ccacaactgt gggtggccac atgatgtacc ctagcccgca tgcggtgatg tatgccccca 1620

cctcgggcct gggtgatggc agcctcaccg tgctgaatgc cttctcccag gcaccatcca 1680

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cagcatcatc tgggacagtg cagatccctg tttcagcagt tcagctccac cagatggctg 1800

tgatagggca gcaggccggg agcagcagca acctcaccga gctacaggtg gtgaacctgg 1860

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Pro Val Ser Ala Ser Val Ser Pro Ser Ala Val Ser Ser Ala Asn Gly

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<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

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Gly Gly Gly Thr Arg Gly Ala Asn Gly Gly Arg Val Pro Gly Asn Gly

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Ser Gly Glu Glu Glu Glu Leu Gly Ala Glu Arg Arg Gly Leu Lys Arg

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Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Val Ser Gly Ala Val Ser

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agaccagtat attttctagc ccataatttt tctcaggcat tgttggggca taagctcaca 3600

ctgtaagctt ttctcatgaa ttcactagac ataacgtgga aggaaaacgt agtcttttgg 3660

gagtacaggg aagccagccc ctcaaagctt atggaagaca tacctgcaat ggaagctgtt 3720

gcccaatgtc tccattacta tctttcaaaa gagaagccag acccagcttc agatcaaaag 3780

ttcttgagac agaggaacaa aaccaatcga tttccaggga agctaatcaa ctctcttttc 3840

cctctaccac aaaactgccc tgctggagtg gttctgaacc tgtacccagg actcgatgtg 3900

gtcactaata acaattaacc tgaactgagt ccacagaact ccactcggaa ctttcttctt 3960

ttttaactag tggcccaatc attcccacca tctctgtgct gataagtacg tgtcctagat 4020

gagaaccctg aagaatgcag accttcttcc cccgaaggag atgccacaag ctctccaaca 4080

cagccccctt tagttccaaa gactagagat gaccacattg gtagaagtat atctcgaggc 4140

acaggaaggg agccccacca gggataattc agacaggact agagaataac atcatttcac 4200

ataccctggg ataaacaccc tgggttccta tagaaggact attacttatg ggagtccaac 4260

ttctcctttt gttttgttat tatcagttta tctttctccc actccacttt tccttcaagg 4320

taccaatcct ttcctgttcc tcgtttggcc atctttcttt ttctgcctcc acattgggag 4380

gggaggactt ctcagttcta acaagctgcc atactcctaa gaaagccatt tttgaaaaat 4440

ttaacaatcc aggttcttct ggagaactca ttctccacac gcacagtttg ctgcaaaagg 4500

aagttgcaag aatttcttga ggaagaaact ggtgacttgg tccatcagtc acgaagttct 4560

ttctattctc gtttagtttt caagaaatta ttggtttgtg ttgctctggg gaaattggaa 4620

atcattacat tgtaaagaca aatatggatg atatttacaa gagagaattt cagatctggg 4680

tttttgaaag aaaacagaat tgcgcattga aaacgatgga aggaaaaaga caatggtcta 4740

atgtgcattc ctcattacct ctcgtggctt tggctgggag ttggaaaaag ctaaaatttc 4800

agaacagtct ctgtaaggct ctctgtggct ccagttcacc attttatatt gttgcatgct 4860

gtagaaagga gctattgctg ttgttttgtt tttttattta aatcactaag gcactgtttt 4920

tatcttttgt aaaaaaaaaa aaaaagttgt tcactgtgca cttatagaaa aaataatcaa 4980

aaatgttggg attttagaag ctctcttttt gataaaccaa agatttagaa gtcattccat 5040

tgttaacttg taaaaatgtg tgaacacaga gagtttttgg tgattgctac tctgaaagct 5100

gccagatctt attctggggg tgggatgtgg aggaatacac atacacacac aaacatacat 5160

gtatgtataa tagatatata catatgtgta tattatatct gtgtgtgcat gtatctccaa 5220

aagcggcgtt acagagttct acaccaaaag cctttaaccc ttaatctgct gtgaatgata 5280

cctggccttt ctcactatga atttctgatt aaccaaccag actacacgtt gcctctctgt 5340

gtatgactaa cggctccaac ccgatgactc acagctactt gcttatcgtg aacaagctca 5400

tcttggcaat gaatatggat gtgaaaagac agaacagctt caccattagt agctggaaat 5460

ggtatcacag tctcttatag aggaatatga aaggaacaag aaaatcattt tacattcctt 5520

ttatctgtat tgtgctttaa aagatccaca tggtaaattt tttattttgc ttttatgtca 5580

gtcatcagaa ccaaaaaaat ccagaagaaa aaattgccag tgtttccttt gaagatgaag 5640

ctactgggga agaaaacctt attaatacac tccacacatt tgttcattcc tcagctgttg 5700

gtgttttctt ggggtcttga caaagcttgc tggtcagtgc acttttcagg tgtcacgttt 5760

tgctgtttgt atgttttttc ttccccttac ttcctttgga aaacaaactc acacagtgcc 5820

cctactctga gacctgggac tgagtgttaa ttattttttc cttgggtatt tctatctgag 5880

agactagacc tagttaggag gcctctgtac ttctccagat tgtacctttt tatggggatc 5940

tttgaggcta tgacccagga ctgatagata tgccttacgg aagacaaaag ataaaatggt 6000

tcctatatcc taatgcaaac caacacagtt aaaagagcag atctctggat aactgctctc 6060

aacctgcttc tacagtctcc acaaaccgca ttcaccctct ctcttcatag ctcagacatg 6120

aaatttgagg gagaaaactg gagataattg ggagaaaatt gatgaagttg gctgcttcca 6180

gtagatcaga taatccatga atttgtctcc cattgagaat tttattttaa attcttttaa 6240

actcttcgtt gtgtcttttg tgatgacaaa tcaggcatga ctaaaagatg tacagagact 6300

tacgaagatg gtcacattca agttccctaa tgctcttaga acctgaagat gaccatgtgt 6360

agttttctta agacctctga acccccatgg tgatgaagac ttgaagacat ttgcagctat 6420

ctgctgcagt ctggtagatt catacttatc taaagaagtc aaaaaattta ttcgtgcaag 6480

tgcttgcagg aagccagtgc ttattagtag tgaccctgct tctatcaacg ttattgagac 6540

aacacatatt ctattctaag ggagaaagag ggaggaagag agggagggag ggaggaagaa 6600

gagggaggga gcgaggaagg aagataggag atgggtaggg gggtaaagag aaaaggaggg 6660

agaagggaag gaaggaaaga agagaggaaa gaaaggaggg aaggaaaaaa gggccaaact 6720

ttctgatcta tgaacttctc agttcagctg tcacattatg agaagtaaat cagaattttt 6780

ttaaggagaa gtcattctta gcactacaat aattgtacca gtaattgagg aaaccaagac 6840

aatcttcacc tgaataatag agggtctgag aactgtcagc cttttgccat tcaaaaacat 6900

ttatgtccaa cctgaaaaaa aagcatcaat aaaacctatc ccaagcattc aaaatagtcc 6960

tttccaaatg ttatttattt taaagtcaat cagctctttt agaaacagat tctggtctgg 7020

ctgaaaactc ccacaacaaa tttactcatc cagtggctaa tatttaatgc ccaccatggg 7080

cagagcacac aaatcttcag ataaacaata ctgaattgat tcagcacaga ttgttcagat 7140

ttgaatgacc agggagttgt atttgcacat gcaagaacac taagaatctc ccagtcctca 7200

aactagaaac ctttcagcta cgatgaaaaa aaaaaagggg tcttcatttt tccaagaggg 7260

ggtggaggtg gggatcactt tttagctaaa agctatctct cacttcaaaa ttcttgtctt 7320

tttctttgtg gacaaacacc agtagtctat cacttggaga tcttttaata tctcccatca 7380

tttaaaacat ccacgagagt ttgaagattt gtgttgattg ccagatacag aagccccttg 7440

aaaataagga aagggtggag gaagcatttt tgtgtcctat ccctacttat cgtagcagct 7500

ctatagacaa aagggacact tactggtgag cctctggccc ttaaaagaaa atcatctaag 7560

aatatgaagg caatttgatt tccccccaca gccctcagct gccttcctca cagaaggaag 7620

ttcccaaaat tgctggtaca cagtttgcaa tcaaatatca gatatgagaa aacctgtagt 7680

gaagagtctg ggttcttggt tttctcataa atccaatata aatttgtagg ttggttcagg 7740

gtcaaaattg ccagtgcttt attagacaga tgatactgat agacacacag agcccaggtc 7800

ctggaacaag acaatcctgt agtgccaaga tctggtcagt tgcgttaagg agctgggttt 7860

gattctagag tccaggttta tagagaaacc ctggctagat tgagcctacc catggggaga 7920

cgatttcaag acaggatgag atctgggaag aattttgttg tcatctgcca gggaaattat 7980

cacaggactc attgaatgca ataacatgtg agtaagttcc cttttgattc tgggaatcag 8040

cgattttccc tgtggattaa gacaaaccaa cgccagaagg tctcctgtgc ttattttaac 8100

catctgctcc catcgtgaac cctggagcat gcatttccta gaagtggttt catagctcct 8160

gtgtgttcat ggaaaagggg agtataatga tggggatgct ggaagctttt ttaatgtttt 8220

ccaaaggaaa ggaacccaca ctgctcccca gagttccttt ccaatggccc tgcagtaaga 8280

acggaggaca atgtattgct gggtgcttaa aatcctccct cagtgaagca caaagagaca 8340

ctttgtaaag aaaaaaagag caagcatagg ttctctgtgg gaccttgtgg agtggtgttt 8400

tcacgttggt ctctttggct caattgagca taatcagaaa gaaatgtggg ttattgggaa 8460

gagacaaaaa gcagtggcta aaataccaaa gttggcatgt gttctttttt aaaaaaaaaa 8520

aaaaatgcat atatttttaa ataaaatgtt tattttaaaa agaaaaaaaa aaaaaaaaaa 8580

<210> 10

<211> 986

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

Met Thr Leu Leu Gly Ser Glu His Ser Leu Leu Ile Arg Ser Lys Phe

1 5 10 15

Arg Ser Val Leu Gln Leu Arg Leu Gln Gln Arg Arg Thr Gln Glu Gln

20 25 30

Leu Ala Asn Gln Gly Ile Ile Pro Pro Leu Lys Arg Pro Ala Glu Phe

35 40 45

His Glu Gln Arg Lys His Leu Asp Ser Asp Lys Ala Lys Asn Ser Leu

50 55 60

Lys Arg Lys Ala Arg Asn Arg Cys Asn Ser Ala Asp Leu Val Asn Met

65 70 75 80

His Ile Leu Gln Ala Ser Thr Ala Glu Arg Ser Ile Pro Thr Ala Gln

85 90 95

Met Lys Leu Lys Arg Ala Arg Leu Ala Asp Asp Leu Asn Glu Lys Ile

100 105 110

Ala Leu Arg Pro Gly Pro Leu Glu Leu Val Glu Lys Asn Ile Leu Pro

115 120 125

Val Asp Ser Ala Val Lys Glu Ala Ile Lys Gly Asn Gln Val Ser Phe

130 135 140

Ser Lys Ser Thr Asp Ala Phe Ala Phe Glu Glu Asp Ser Ser Ser Asp

145 150 155 160

Gly Leu Ser Pro Asp Gln Thr Arg Ser Glu Asp Pro Gln Asn Ser Ala

165 170 175

Gly Ser Pro Pro Asp Ala Lys Ala Ser Asp Thr Pro Ser Thr Gly Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Asn Gln Asp Leu Ala Ser Gly Ser Glu Asn Asp Arg Asn

195 200 205

Asp Ser Ala Ser Gln Pro Ser His Gln Ser Asp Ala Gly Lys Gln Gly

210 215 220

Leu Gly Pro Pro Ser Thr Pro Ile Ala Val His Ala Ala Val Lys Ser

225 230 235 240

Lys Ser Leu Gly Asp Ser Lys Asn Arg His Lys Lys Pro Lys Asp Pro

245 250 255

Lys Pro Lys Val Lys Lys Leu Lys Tyr His Gln Tyr Ile Pro Pro Asp

260 265 270

Gln Lys Ala Glu Lys Ser Pro Pro Pro Met Asp Ser Ala Tyr Ala Arg

275 280 285

Leu Leu Gln Gln Gln Gln Leu Phe Leu Gln Leu Gln Ile Leu Ser Gln

290 295 300

Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Arg Phe Ser Tyr Leu Gly Met His Gln

305 310 315 320

Ala Gln Leu Lys Glu Pro Asn Glu Gln Met Val Arg Asn Pro Asn Ser

325 330 335

Ser Ser Thr Pro Leu Ser Asn Thr Pro Leu Ser Pro Val Lys Asn Ser

340 345 350

Phe Ser Gly Gln Thr Gly Val Ser Ser Phe Lys Pro Gly Pro Leu Pro

355 360 365

Pro Asn Leu Asp Asp Leu Lys Val Ser Glu Leu Arg Gln Gln Leu Arg

370 375 380

Ile Arg Gly Leu Pro Val Ser Gly Thr Lys Thr Ala Leu Met Asp Arg

385 390 395 400

Leu Arg Pro Phe Gln Asp Cys Ser Gly Asn Pro Val Pro Asn Phe Gly

405 410 415

Asp Ile Thr Thr Val Thr Phe Pro Val Thr Pro Asn Thr Leu Pro Asn

420 425 430

Tyr Gln Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ala Leu Ser Asn Gly Phe Tyr His

435 440 445

Phe Gly Ser Thr Ser Ser Ser Pro Pro Ile Ser Pro Ala Ser Ser Asp

450 455 460

Leu Ser Val Ala Gly Ser Leu Pro Asp Thr Phe Asn Asp Ala Ser Pro

465 470 475 480

Ser Phe Gly Leu His Pro Ser Pro Val His Val Cys Thr Glu Glu Ser

485 490 495

Leu Met Ser Ser Leu Asn Gly Gly Ser Val Pro Ser Glu Leu Asp Gly

500 505 510

Leu Asp Ser Glu Lys Asp Lys Met Leu Val Glu Lys Gln Lys Val Ile

515 520 525

Asn Glu Leu Thr Trp Lys Leu Gln Gln Glu Gln Arg Gln Val Glu Glu

530 535 540

Leu Arg Met Gln Leu Gln Lys Gln Lys Arg Asn Asn Cys Ser Glu Lys

545 550 555 560

Lys Pro Leu Pro Phe Leu Ala Ala Ser Ile Lys Gln Glu Glu Ala Val

565 570 575

Ser Ser Cys Pro Phe Ala Ser Gln Val Pro Val Lys Arg Gln Ser Ser

580 585 590

Ser Ser Glu Cys His Pro Pro Ala Cys Glu Ala Ala Gln Leu Gln Pro

595 600 605

Leu Gly Asn Ala His Cys Val Glu Ser Ser Asp Gln Thr Asn Val Leu

610 615 620

Ser Ser Thr Phe Leu Ser Pro Gln Cys Ser Pro Gln His Ser Pro Leu

625 630 635 640

Gly Ala Val Lys Ser Pro Gln His Ile Ser Leu Pro Pro Ser Pro Asn

645 650 655

Asn Pro His Phe Leu Pro Ser Ser Ser Gly Ala Gln Gly Glu Gly His

660 665 670

Arg Val Ser Ser Pro Ile Ser Ser Gln Val Cys Thr Ala Gln Asn Ser

675 680 685

Gly Ala His Asp Gly His Pro Pro Ser Phe Ser Pro His Ser Ser Ser

690 695 700

Leu His Pro Pro Phe Ser Gly Ala Gln Ala Asp Ser Ser His Gly Ala

705 710 715 720

Gly Gly Asn Pro Cys Pro Lys Ser Pro Cys Val Gln Gln Lys Met Ala

725 730 735

Gly Leu His Ser Ser Asp Lys Val Gly Pro Lys Phe Ser Ile Pro Ser

740 745 750

Pro Thr Phe Ser Lys Ser Ser Ser Ala Ile Ser Glu Val Thr Gln Pro

755 760 765

Pro Ser Tyr Glu Asp Ala Val Lys Gln Gln Met Thr Arg Ser Gln Gln

770 775 780

Met Asp Glu Leu Leu Asp Val Leu Ile Glu Ser Gly Glu Met Pro Ala

785 790 795 800

Asp Ala Arg Glu Asp His Ser Cys Leu Gln Lys Val Pro Lys Ile Pro

805 810 815

Arg Ser Ser Arg Ser Pro Thr Ala Val Leu Thr Lys Pro Ser Ala Ser

820 825 830

Phe Glu Gln Ala Ser Ser Gly Ser Gln Ile Pro Phe Asp Pro Tyr Ala

835 840 845

Thr Asp Ser Asp Glu His Leu Glu Val Leu Leu Asn Ser Gln Ser Pro

850 855 860

Leu Gly Lys Met Ser Asp Val Thr Leu Leu Lys Ile Gly Ser Glu Glu

865 870 875 880

Pro His Phe Asp Gly Ile Met Asp Gly Phe Ser Gly Lys Ala Ala Glu

885 890 895

Asp Leu Phe Asn Ala His Glu Ile Leu Pro Gly Pro Leu Ser Pro Met

900 905 910

Gln Thr Gln Phe Ser Pro Ser Ser Val Asp Ser Asn Gly Leu Gln Leu

915 920 925

Ser Phe Thr Glu Ser Pro Trp Glu Thr Met Glu Trp Leu Asp Leu Thr

930 935 940

Pro Pro Asn Ser Thr Pro Gly Phe Ser Ala Leu Thr Thr Ser Ser Pro

945 950 955 960

Ser Ile Phe Asn Ile Asp Phe Leu Asp Val Thr Asp Leu Asn Leu Asn

965 970 975

Ser Ser Met Asp Leu His Leu Gln Gln Trp

980 985

<210> 11

<211> 5127

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 11

tggcagccta tgacatcagc caggaacgcc taggatgcgg ctgttcccgg ccaccctcag 60

aggaggaggg tcctgcctgc tgggagttaa ttagcctcgc gagcggcgag gggggaggcg 120

ccagttttct ggggacactg gcggccactg tgcgtcctcc tacccaaggg agctccccaa 180

gagttggatg aattctgggt tgttagctgc tgtcctctgg gctcccggga gccagtttct 240

ggtggaaagc ggggcgcctg gccaacgacc agcggcttgc tgagactcac catgacactc 300

ctggggtctg aacactcttt gctgattaga aggaagttcc gatcagtctt acagttacgg 360

cttcaacaga gaaggaccca ggagcagctg gctaaccaag gcttaatacc gccactgaaa 420

ggtccaactg aattccatga cccgagaaaa caattggata gtgccaagac tgaagattcc 480

ctgaggcgca agggcagaaa caggtccgac cgtgccagcc tggttactat gcacattctc 540

caagcctcca cggcagaaag gtccattcca actgctcaga tgaagctcaa aagagcccgc 600

cttgcagatg acctcaatga gaagatcgct ctccgcccag ggcccttgga actggtggag 660

aagaacattc tgccgatgga ttcttccgtg aaagaggcta taaaaggtac tgaggtgagc 720

ctctccaagg cagcagatgc attcgccttt gaggatgaca gcagtagaga tgggctctct 780

ccagatcagg ctaggagcga ggacccccag ggctctacag gatccacccc agacatcaaa 840

tccactgagg ctcctctgga cacaatccag gatctcactc ctggctcaga aagtgacaag 900

aatgatgcag cctcccagcc aggcaaccag tcagaccctg ggaagcaggt tctcggcccc 960

ctcagcaccc cgattcctgt gcacactgct gtaaagtcca agtctttggg tgacagtaag 1020

aaccgccaca aaaagcccaa agaccccaaa ccaaaggtga agaagctcaa ataccatcag 1080

tacatccccc cagaccagaa ggcagagaag tctcccccac ccatggactc tgcctatgcc 1140

cggctgctcc agcaacagca gctattcctg cagctacaga tcctcagcca gcagcagcaa 1200

cagcagcagc aacagcagca gcagcaacag cagcagcagc agcagcagca gcggttcagc 1260

taccctggga tgcaccaaac acacctcaaa gaaccaaatg aacagatggc cagaaatccg 1320

aatccttctt caacaccact gagcaatacc cctctatccc ctgtcaaaaa tagcatttct 1380

ggacaaactg gtgtttcttc tctcaaacca ggccccctcc cacccaacct ggatgatctc 1440

aaggtgtcag agttaagaca acagcttcga atccggggct tgccagtgtc aggcaccaag 1500

acagcgctgg tggaccggct tcgtcccttc caggattgtg ctggcaaccc tgtgcccaac 1560

tttggggaca tcacaactgt cacctttcct gtcacgccca acaccttgcc cagttatcag 1620

tcctccccga caggcttcta ccactttggc agcacaagct ccagcccacc catctccccc 1680

gcctcatctg acttgtccgc tgcagggtcc ctgccagaca ccttcaccga tgcgtcacct 1740

ggcttcggcc tgcacgcatc tccggtgccc gcctgcacgg acgagagtct gctgagcagc 1800

ctgaatgggg gctcgggccc ctccgagcct gatgggctag actctgagaa ggacaagatg 1860

ctggtggaga agcagaaagt gatcaaccag ctcacctgga agctgcggca agagcagcgg 1920

caggtggaag agctgagaat gcaactgcag aagcagaaga gcagctgcag cgaccagaag 1980

ccactgccct tcttggccac caccatcaaa caggaagatg tctccagctg ccccttcgca 2040

ccccagcagg cgtctgggaa gggacagggc cacagctctg acagtccccc tccggcttgt 2100

gagacggctc agctgctgcc tcactgtgtg gagtcctcag gtcaaaccca tgtactctcg 2160

tccacgtttc tcagccccca gtgctcccct cagcactcgc ccctgggggg cctgaagagc 2220

ccgcagcaca tcagcctgcc tccatcaccc aacaaccatt acttcctggc ttcctcttcg 2280

ggagctcaga gagagaacca tggggtctct tcacccagca gcagccaagg gtgcgcacag 2340

aactcagggg cacacgaagg ccattcttct agcttctctt ccccagcttc cagcctccat 2400

cagcctttct ctggcaccca agcagacagc agtcacagtg ctgggctcaa cccttgtccc 2460

aaaagcccaa gtattcatcc aaagatgact ggtttacaat cttctgacaa ggtggggcca 2520

acgttttcaa ttccatcccc aactttttct aagtcaagtt cagcagtttc agatatcacc 2580

cagcccccat cctatgaaga tgcagtgaag cagcaaatga ctcggagtca gcagatggac 2640

gaactcctgg atgtcctcat tgaaagtgga gaaatgccag ccgatgccag ggaagatcat 2700

tcatgtcttc agaaaattcc aaagatccct gggtcctcct gcagcccaac tgccatcccc 2760

ccgaagccct cggcttcctt tgagcaggca tcttcgggag gccagatggc cttcgatcac 2820

tacgccaacg acagtgacga acacctggaa gtcttattga attctcacag ccccatcgga 2880

aaggtgagcg atgttaccct cctcaaaatc ggaagcgagg agcctccttt tgacagcatc 2940

atggatggct tcccagggaa ggctgcggaa gatctcttca gtgctcacga gctcttgcct 3000

gggcccctct ccccgatgca tgcacagttg tcacctcctt ctgtggacag cagtggtctg 3060

cagctgagct tcacggaatc tccttgggaa acaatggaat ggctggacct cactccacct 3120

agttccacgc caggcttcag caaccttacc tccagtgggc ccagcatttt caacatcgat 3180

tttctggatg ttacagatct taatctgaat tcccctatgg atctccactt acagcagtgg 3240

taaacacccg aggtacaaga gctacgagag ctcagtggga attcaatgga ggaaagcacg 3300

ataccggaaa tgtgtgttcc aaaagatgaa gtggggaaaa tggggaggga aaaaaaaaaa 3360

cagcaacgga ggtttttgtg acaactaacc agaacaaaca gaagtcagct attaaaatat 3420

gtctaaatgt aatatctacc agcattcagt aactgttaat aacttcagtg atgcattcaa 3480

aaatgtgctt tgtcagaata agaatgccaa aaatgttttt tcgctgcctt atctcatacc 3540

agtttttttg gggttttttt tgtttgtttg ttttttggtt tttttttttt ttgtgttgtt 3600

atttggtttt ctttttgccc acagtttgtc tcaggcaata ctgggacata gactgacccc 3660

attagctttt gttatgaatt tactaaactt tctgtggaag gagaacagag cctctgccgc 3720

gggtgtgggg aagccatcct gtgcttgagg cagcacacgt gtgtccatca tcatcagtca 3780

gaagagcagg gcctgtctca cccaatcgag tccttaagac agaataatca gaatggtcag 3840

agggacagac caatcaattc ccaggaaagc aaaagtgact caatgtccct tgactcccaa 3900

atggtcccac tggactggtg atcactggtg acaactaact agctttgtcc agagaatcca 3960

cccagaacac ggtgcttttt agccagtagt ccacctctat gtgcatcagc aatgcatagc 4020

aggtgagaac ttgaatcaca gaaacttcat gccatggatg gagactcctg aggcgctcaa 4080

atactactac ctctagttcc aaagactaga gctagatgat cagaaaggca actggaggcc 4140

cagggagccg tactgggaca agttagaatt agagaacgat gtcatttaac attccgagaa 4200

agaaataacc atgaattgct attacaggag taacacacag ggccagcttc tttttcttct 4260

tttttatttt tcttttctta ttgtgagcag agggaattca cctcagttca tctttctctc 4320

agtacttttc tttcaagata tcaatccttt atgactcttt tgcttttaat tctctctctc 4380

tctctctctc tctctctttc tctcaaagga gaggtttcag ttctaacaag ctaccatact 4440

cctattaaag ccattttttt ttttagaata ttaaaagtcc aaactctctt gccaaactct 4500

ttcttcacat gcgcattggc tgaaaacaga atttacaaga atttctttag gaagaaactg 4560

gggatgtggc ccattggtca caaagttttt ttgtttgttt ttgtttttgt ttcaattctt 4620

gtttgattta tggacaatct ttggtttgta ttgctctgga gaaattggaa atcattgcag 4680

agtgaagata aatcagggca ccatgtatag tagagaatat ttcagtagtt ttccaaacga 4740

gaacacaatt gcacactgta aacaacagga gtgtgaagga ccacagtctt gaggagttct 4800

tgttgccctg cgtttggtga aggcgttggg gaccgaggaa gacaacatac agtttggcca 4860

aggctctcag aggcttgctg tggcgccaat tcaagtatta caatgttgca tgctgtagaa 4920

agtagctgtt gctgttgttt tgttttgttt taatttaagt caccaaggca ctgttttatt 4980

cttttgtaaa aaaaaaaaaa agttcactgt gcacttatag agaaaataat caacaatgtt 5040

gtgaattttt gagaagactt tttttttttt tttgataaac caaagattta gaaatcattc 5100

cattgtcaac ttgtaaaaaa aaaaaaa 5127

<210> 12

<211> 983

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 12

Met Thr Leu Leu Gly Ser Glu His Ser Leu Leu Ile Arg Arg Lys Phe

1 5 10 15

Arg Ser Val Leu Gln Leu Arg Leu Gln Gln Arg Arg Thr Gln Glu Gln

20 25 30

Leu Ala Asn Gln Gly Leu Ile Pro Pro Leu Lys Gly Pro Thr Glu Phe

35 40 45

His Asp Pro Arg Lys Gln Leu Asp Ser Ala Lys Thr Glu Asp Ser Leu

50 55 60

Arg Arg Lys Gly Arg Asn Arg Ser Asp Arg Ala Ser Leu Val Thr Met

65 70 75 80

His Ile Leu Gln Ala Ser Thr Ala Glu Arg Ser Ile Pro Thr Ala Gln

85 90 95

Met Lys Leu Lys Arg Ala Arg Leu Ala Asp Asp Leu Asn Glu Lys Ile

100 105 110

Ala Leu Arg Pro Gly Pro Leu Glu Leu Val Glu Lys Asn Ile Leu Pro

115 120 125

Met Asp Ser Ser Val Lys Glu Ala Ile Lys Gly Thr Glu Val Ser Leu

130 135 140

Ser Lys Ala Ala Asp Ala Phe Ala Phe Glu Asp Asp Ser Ser Arg Asp

145 150 155 160

Gly Leu Ser Pro Asp Gln Ala Arg Ser Glu Asp Pro Gln Gly Ser Thr

165 170 175

Gly Ser Thr Pro Asp Ile Lys Ser Thr Glu Ala Pro Leu Asp Thr Ile

180 185 190

Gln Asp Leu Thr Pro Gly Ser Glu Ser Asp Lys Asn Asp Ala Ala Ser

195 200 205

Gln Pro Gly Asn Gln Ser Asp Pro Gly Lys Gln Val Leu Gly Pro Leu

210 215 220

Ser Thr Pro Ile Pro Val His Thr Ala Val Lys Ser Lys Ser Leu Gly

225 230 235 240

Asp Ser Lys Asn Arg His Lys Lys Pro Lys Asp Pro Lys Pro Lys Val

245 250 255

Lys Lys Leu Lys Tyr His Gln Tyr Ile Pro Pro Asp Gln Lys Ala Glu

260 265 270

Lys Ser Pro Pro Pro Met Asp Ser Ala Tyr Ala Arg Leu Leu Gln Gln

275 280 285

Gln Gln Leu Phe Leu Gln Leu Gln Ile Leu Ser Gln Gln Gln Gln Gln

290 295 300

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

305 310 315 320

Arg Phe Ser Tyr Pro Gly Met His Gln Thr His Leu Lys Glu Pro Asn

325 330 335

Glu Gln Met Ala Arg Asn Pro Asn Pro Ser Ser Thr Pro Leu Ser Asn

340 345 350

Thr Pro Leu Ser Pro Val Lys Asn Ser Ile Ser Gly Gln Thr Gly Val

355 360 365

Ser Ser Leu Lys Pro Gly Pro Leu Pro Pro Asn Leu Asp Asp Leu Lys

370 375 380

Val Ser Glu Leu Arg Gln Gln Leu Arg Ile Arg Gly Leu Pro Val Ser

385 390 395 400

Gly Thr Lys Thr Ala Leu Val Asp Arg Leu Arg Pro Phe Gln Asp Cys

405 410 415

Ala Gly Asn Pro Val Pro Asn Phe Gly Asp Ile Thr Thr Val Thr Phe

420 425 430

Pro Val Thr Pro Asn Thr Leu Pro Ser Tyr Gln Ser Ser Pro Thr Gly

435 440 445

Phe Tyr His Phe Gly Ser Thr Ser Ser Ser Pro Pro Ile Ser Pro Ala

450 455 460

Ser Ser Asp Leu Ser Ala Ala Gly Ser Leu Pro Asp Thr Phe Thr Asp

465 470 475 480

Ala Ser Pro Gly Phe Gly Leu His Ala Ser Pro Val Pro Ala Cys Thr

485 490 495

Asp Glu Ser Leu Leu Ser Ser Leu Asn Gly Gly Ser Gly Pro Ser Glu

500 505 510

Pro Asp Gly Leu Asp Ser Glu Lys Asp Lys Met Leu Val Glu Lys Gln

515 520 525

Lys Val Ile Asn Gln Leu Thr Trp Lys Leu Arg Gln Glu Gln Arg Gln

530 535 540

Val Glu Glu Leu Arg Met Gln Leu Gln Lys Gln Lys Ser Ser Cys Ser

545 550 555 560

Asp Gln Lys Pro Leu Pro Phe Leu Ala Thr Thr Ile Lys Gln Glu Asp

565 570 575

Val Ser Ser Cys Pro Phe Ala Pro Gln Gln Ala Ser Gly Lys Gly Gln

580 585 590

Gly His Ser Ser Asp Ser Pro Pro Pro Ala Cys Glu Thr Ala Gln Leu

595 600 605

Leu Pro His Cys Val Glu Ser Ser Gly Gln Thr His Val Leu Ser Ser

610 615 620

Thr Phe Leu Ser Pro Gln Cys Ser Pro Gln His Ser Pro Leu Gly Gly

625 630 635 640

Leu Lys Ser Pro Gln His Ile Ser Leu Pro Pro Ser Pro Asn Asn His

645 650 655

Tyr Phe Leu Ala Ser Ser Ser Gly Ala Gln Arg Glu Asn His Gly Val

660 665 670

Ser Ser Pro Ser Ser Ser Gln Gly Cys Ala Gln Asn Ser Gly Ala His

675 680 685

Glu Gly His Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ala Ser Ser Leu His Gln

690 695 700

Pro Phe Ser Gly Thr Gln Ala Asp Ser Ser His Ser Ala Gly Leu Asn

705 710 715 720

Pro Cys Pro Lys Ser Pro Ser Ile His Pro Lys Met Thr Gly Leu Gln

725 730 735

Ser Ser Asp Lys Val Gly Pro Thr Phe Ser Ile Pro Ser Pro Thr Phe

740 745 750

Ser Lys Ser Ser Ser Ala Val Ser Asp Ile Thr Gln Pro Pro Ser Tyr

755 760 765

Glu Asp Ala Val Lys Gln Gln Met Thr Arg Ser Gln Gln Met Asp Glu

770 775 780

Leu Leu Asp Val Leu Ile Glu Ser Gly Glu Met Pro Ala Asp Ala Arg

785 790 795 800

Glu Asp His Ser Cys Leu Gln Lys Ile Pro Lys Ile Pro Gly Ser Ser

805 810 815

Cys Ser Pro Thr Ala Ile Pro Pro Lys Pro Ser Ala Ser Phe Glu Gln

820 825 830

Ala Ser Ser Gly Gly Gln Met Ala Phe Asp His Tyr Ala Asn Asp Ser

835 840 845

Asp Glu His Leu Glu Val Leu Leu Asn Ser His Ser Pro Ile Gly Lys

850 855 860

Val Ser Asp Val Thr Leu Leu Lys Ile Gly Ser Glu Glu Pro Pro Phe

865 870 875 880

Asp Ser Ile Met Asp Gly Phe Pro Gly Lys Ala Ala Glu Asp Leu Phe

885 890 895

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900 905 910

Leu Ser Pro Pro Ser Val Asp Ser Ser Gly Leu Gln Leu Ser Phe Thr

915 920 925

Glu Ser Pro Trp Glu Thr Met Glu Trp Leu Asp Leu Thr Pro Pro Ser

930 935 940

Ser Thr Pro Gly Phe Ser Asn Leu Thr Ser Ser Gly Pro Ser Ile Phe

945 950 955 960

Asn Ile Asp Phe Leu Asp Val Thr Asp Leu Asn Leu Asn Ser Pro Met

965 970 975

Asp Leu His Leu Gln Gln Trp

980

Claims

1.一种心脏祖细胞的制造方法，其包括将Tbx6基因导入成纤维细胞中的工序。

2.一种心肌细胞的制造方法，其包括将Tbx6基因、SRF基因和心肌素(Myocardin)基因导入成纤维细胞中的工序。

3.一种心脏祖细胞，其源自包含外源性的Tbx6基因的成纤维细胞。

4.一种心肌细胞，其源自包含外源性的Tbx6基因、SRF基因和心肌素基因的成纤维细胞。

5.一种由成纤维细胞诱导心脏祖细胞的诱导剂，其含有Tbx6基因。

6.一种由成纤维细胞诱导心肌细胞的诱导剂，其含有Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因。

7.一种由成纤维细胞诱导平滑肌细胞的诱导剂，其含有Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因。

8.一种由成纤维细胞诱导血管内皮细胞的诱导剂，其含有Tbx6基因、SRF基因和Myocd基因。