JP2024023294A - 遺伝子編集のためのｃｐｆ１関連方法及び組成物 - Google Patents

遺伝子編集のためのｃｐｆ１関連方法及び組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP2024023294A
JP2024023294A JP2023193282A JP2023193282A JP2024023294A JP 2024023294 A JP2024023294 A JP 2024023294A JP 2023193282 A JP2023193282 A JP 2023193282A JP 2023193282 A JP2023193282 A JP 2023193282A JP 2024023294 A JP2024023294 A JP 2024023294A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
certain embodiments
cpf1
sequence
cells
crispr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023193282A
Other languages
English (en)
Inventor
ジェニファー ゴリ，
ジョン ズーリス，
ハリハラン ジャヤラム，
Original Assignee
エディタス・メディシン、インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by エディタス・メディシン、インコーポレイテッド filed Critical エディタス・メディシン、インコーポレイテッド
Publication of JP2024023294A publication Critical patent/JP2024023294A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Abstract

【課題】標的核酸配列を編集し、且つ／又は標的核酸配列の発現を調整するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法及び構成要素並びにこのような編集及び／又は発現の調整を評価するための方法及び組成物を提供する。【解決手段】一態様では、本開示は、治療に関連する細胞集団における、治療に関連する標的部位のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集の使用に関する。例えば、本開示は、治療に関連する標的部位の修飾を含む単離された細胞を提供する。特定の実施形態では、細胞は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞等である。また、特定の実施形態では、本開示は、例えば、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、例えばＨＢＧ遺伝子の調節領域を含むＨＢＧ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ分子とを含むＲＮＰ複合体の送達によって生成される、例えばＨＢＧ遺伝子座の破壊などの修飾を含む単離された細胞又は細胞集団を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれの優先権が主張され、そのそれぞれの内容が全体として本明細書に援用される、２０１７年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／５９７，１１８号、２０１８年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／６２３，５０１号、２０１８年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／６６４，９０５号及び２０１８年１０月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／７４６，４９４号に対する優先権を主張する。
配列リスト
本明細書には、２０１８年１２月１１日にＥＦＳを介して提出された配列リストが参照によりさらに組み込まれる。３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）に従い、０８４１７７０２１０ＳＬ．ｔｘｔとして同定される配列リストのテキストファイルは、４４４，０３２バイトであり、２０１８年１２月１１日に作成された。配列表の内容全体は、本明細書に参照により援用される。配列リストは、本明細書の範囲を超えて拡張されず、したがって新しい事項は含まない。
本開示は、標的核酸配列を編集し、且つ／又は標的核酸配列の発現を調整するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法及び構成要素並びにこのような編集及び／又は発現の調整を評価するための方法及び組成物に関する。
ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）は、細菌及び古細菌において、ウイルスの攻撃から防御するための適応性免疫系として発達した。ウイルスへの曝露に際して、ウイルスＤＮＡの短いセグメントがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。ウイルス配列を含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一部からＲＮＡが転写される。ウイルスゲノムに相補的な配列を含有するそのＲＮＡは、ウイルスゲノム中の標的配列へのＣｐｆ１タンパク質の標的化を媒介する。Ｃａｓ１２ａとしても知られるＣｐｆ１タンパク質（「プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）からのＣＲＩＳＰＲ１」）は、次に切断し、それによってウイルス標的を発現停止する。
最近、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムが真核細胞内のゲノム編集のために応用されている。部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入は、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同指向修復（ＨＤＲ）などの内因性ＤＮＡ修復機構を通じた標的配列改変を可能にする。
本開示は、例えば、治療に関連する細胞株における及び治療に関連する標的配列に関して、標的核酸配列を編集し、且つ／又は標的核酸配列の発現を調整するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法及び構成要素の改善並びにこのような標的編集及び／又は発現の調整の効率を評価するためのストラテジーを提供する。
一態様では、本開示は、治療に関連する細胞集団における、治療に関連する標的部位のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集の使用に関する。例えば、限定されるものではないが、本開示は、治療に関連する標的部位の修飾を含む単離された細胞を提供する。特定の実施形態では、細胞は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ８＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ８＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞、ＴＨ１７ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ１ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ２ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ９ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞などのＴ細胞である。特定の実施形態では、細胞は、リンパ系前駆細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ヒト臍帯血誘導赤血球系前駆（ＨＵＤＥＰ）細胞、ナチュラルキラー細胞又は樹状細胞である。特定の実施形態では、細胞は、ＨＳＣ又はＨＵＤＥＰ細胞である。
特定の実施形態では、本開示は、例えば、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、例えばＨＢＧ遺伝子の調節領域を含むＨＢＧ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ分子とを含むＲＮＰ複合体の送達によって生成される、例えばＨＢＧ遺伝子座の破壊などの修飾を含む単離された細胞又は細胞集団を提供する。特定の実施形態では、ＲＮＰ複合体は、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとｇＲＮＡ分子との間の複合体を含む。特定の実施形態では、ＨＢＧ遺伝子座の任意の領域が標的化され得る。特定の実施形態では、ＨＢＧ遺伝子のシス調節領域が標的化される。特定の実施形態では、本開示は、例えば、ＨＢＧ遺伝子座のプロモーター領域の破壊などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集の使用に関する。特定の実施形態では、本開示は、例えば、－１１０ｎｔプロモーター領域などのＨＢＧ遺伝子座の－８００～－６０ｎｔプロモーター領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集の使用に関する。特定の実施形態では、ＨＢＧ遺伝子座のシス調節領域は、例えば、破壊されるなど、編集され得る。例えば、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集を用いて、ＨＢＧ遺伝子座のシス調節領域に存在するＣＡＡＴボックスが破壊され得る。一般に、ＨＢＧプロモーター領域の破壊及びＣＡＡＴボックスの破壊は、これらの配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの送達を介して達成され得る。ＨＢＧ遺伝子座のこれらの配列を標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムで使用するためのｇＲＮＡ分子の非限定的例は、図６、９及び１１並びに表１９に特定される。特定の実施形態では、ＨＢＧ遺伝子配列を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＨＢＧ１－１と称されるｇＲＮＡ分子の配列を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧ遺伝子座の－１１０ｎｔプロモーター領域が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、ＨＢＧ遺伝子座の－１１０ｎｔプロモーター領域を標的とするガイドＲＮＡとを含む複合体を使用して破壊されている、単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞に関する。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含み得る。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞は、このような構成要素を検知するために使用される適切な方法を使用した判定でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含まない。特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧ遺伝子座の－１１０ｎｔプロモーター領域が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、ＨＢＧ遺伝子座の－１１０ｎｔプロモーター領域を標的とするガイドＲＮＡとを含む複合体を使用して破壊されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団に関する。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む細胞を含み得る。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団は、このような構成要素を検知するために使用される適切な方法を使用した判定でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含まない。特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧプロモーター領域に存在するＣＡＡＴボックスが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、ＨＢＧ遺伝子座のプロモーター領域に存在するＣＡＡＴボックスを標的とするガイドＲＮＡとを含む複合体を使用して破壊されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞に関する。特定の実施形態では、このような細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞は、このような構成要素を検知するために使用される適切な方法を使用した判定でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含まない。特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧプロモーター領域に存在するＣＡＡＴボックスが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、ＨＢＧ遺伝子座のプロモーター領域に存在するＣＡＡＴボックスを標的とするガイドＲＮＡとを含む複合体を使用して破壊されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団に関する。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む細胞を含み得る。
特定の実施形態では、本開示は、例えば、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、ＢＣＬ１１ａ遺伝子配列を標的とするｇＲＮＡ分子とを含む複合体の送達によって生成される、例えば転写リプレッサーＢＣＬ１１ａの赤血球系細胞特定発現の妨害などの修飾をはじめとするＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１を使用して編集されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞又は細胞集団を提供する。特定の実施形態では、ＢＣＬ１１ａ遺伝子配列の任意の領域が標的化され得る。例えば、限定されるものではないが、例えば転写開始部位（ＴＳＳ）から＋５５ｋｂ～＋６２ｋｂの赤血球系エンハンサー領域などのＢＣＬ１１ａ遺伝子の赤血球系エンハンサー領域が標的化され得る。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集を用いて、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域に存在するＢＣＬ１１ａのＧＡＴＡ１結合モチーフが破壊され得る。ＢＣＬ１１ａのＧＡＴＡ１結合モチーフの破壊は、そのモチーフを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの送達を介して達成され得る。ＢＣＬ１１ａのＧＡＴＡ１モチーフを標的とする、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムで使用するためのｇＲＮＡ分子の非限定的例は、図７、１０及び１２で特定される。
特定の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域が破壊されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞に関する。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含み得る。特定の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域が破壊されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団に関する。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む細胞を含み得る。特定の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のＧＡＴＡ１モチーフが破壊されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞に関する。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含み得る。特定の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のＧＡＴＡ１モチーフが破壊されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団に関する。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む細胞を含み得る。特定の実施形態では、細胞内又は細胞集団内でＢＣＬ１１ａ遺伝子を修飾又は破壊するのに使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの１つ又は複数の構成要素は、このような構成要素を検出するために使用される適切な手段を使用して検出不能である。
特定の実施形態では、本開示は、例えば、Ｔ細胞の１つ又は複数の内因性遺伝子の破壊などの修飾を含む単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、Ｔ細胞の内因性遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集の使用に関する。例えば、限定されるものではないが、修飾は、例えば、ＦＡＳ遺伝子配列の一部、ＢＩＤ遺伝子配列の一部、ＣＴＬＡ４遺伝子配列の一部、ＰＤＣＤ１遺伝子配列の一部、ＣＢＬＢ遺伝子配列の一部、ＰＴＰＮ６遺伝子配列の一部、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部又はそれらの組み合わせを標的とする、ＲＮＰ複合体などのＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとｇＲＮＡ分子とを含む１つ又は複数の複合体の送達によって生成される。例えば、限定されるものではないが、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上又は１０の複合体、例えばＲＮＰ複合体が送達され得、複合体のそれぞれは、異なる遺伝子を標的とする。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的化される遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、標的化される遺伝子の調節領域、イントロン又はエクソンを標的とし得る。
特定の実施形態では、本明細書の開示に包含されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とし、例えばＴＲＡＣ遺伝子の破壊などの修飾を含む例えば単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団が生成される。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、ＴＲＡＣ遺伝子のコード配列内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、エクソン内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、イントロン内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、遺伝子の調節領域内にある。特定の実施形態では、２つ以上の配列が標的化され、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン、１つ若しくは複数の調節領域又は１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン及び１つ若しくは複数の調節領域内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、表２及び３に列挙される標的化ドメイン配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書の開示に包含されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＴＲＢＣ遺伝子を標的とし、例えばＴＲＢＣ遺伝子の破壊などの修飾を含む例えば単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団が生成される。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＲＢＣ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、ＴＲＢＣ遺伝子のコード配列内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、エクソン内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、イントロン内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、遺伝子の調節領域内にある。特定の実施形態では、２つ以上の配列が標的化され、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン、１つ若しくは複数の調節領域又は１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン及び１つ若しくは複数の調節領域内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、表４及び５に列挙される標的化ドメイン配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書の開示に包含されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とし、例えばＢ２Ｍ遺伝子の破壊などの修飾を含む例えば単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団が生成される。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、エクソン内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、イントロン内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、遺伝子の調節領域内にある。特定の実施形態では、２つ以上の配列が標的化され、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン、１つ若しくは複数の調節領域又は１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン及び１つ若しくは複数の調節領域内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、表６、７及び８に列挙される標的化ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、核酸配列ＡＧＵＧＧＧＧＧＵＧＡＡＵＵＣＡＧＵＧＵを含む。
特定の実施形態では、本明細書の開示に包含されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とし、例えばＣＩＩＴＡ遺伝子の破壊などの修飾を含む例えば単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団が生成される。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＩＩＴＡ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のコード配列内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、エクソン内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、イントロン内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、遺伝子の調節領域内にある。特定の実施形態では、２つ以上の配列が標的化され、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン、１つ若しくは複数の調節領域又は１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン及び１つ若しくは複数の調節領域内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、表９に列挙される標的化ドメイン配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書の開示に包含されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、これらの遺伝子の２つ以上の１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン又は１つ若しくは複数の調節領域を標的とするｇＲＮＡを使用して、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ及びＢ２Ｍ遺伝子の２つ以上の組み合わせを標的とし、例えばＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ及びＢ２Ｍ遺伝子の２つ以上の破壊などの修飾を含む単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団が生成する。特定の実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、例えば、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される遺伝子の１つ又は複数を標的とする、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとｇＲＮＡ分子とを含む１つ又は複数の複合体を含み得る。例えば、限定されるものではないが、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、（ａ）第１の遺伝子の標的配列に相補的な第１の標的ドメインを含む第１のｇＲＮＡと、第１のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第１のＲＮＰ複合体；及び（ｂ）第２の遺伝子の標的配列に相補的な第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子と、第２のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第２のＲＮＰ複合体を含み得る。特定の実施形態では、第１の遺伝子及び第２の遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、１つ又は複数の追加的な遺伝子を標的とする追加的なＲＮＰ複合体をさらに含み得る。例えば、限定されるものではないが、多重化の場合、各ＲＮＰ複合体は、同一のＣｐｆ１タンパク質を含有し得るか、又は各ＲＮＰ複合体は、例えば、Ｃｐｆ１タンパク質変異型などの異なるＣｐｆ１タンパク質を含み得る。
特定の実施形態では、例えば、単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集ＨＳＣ若しくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団などの単離された細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含まない。特定の実施形態では、このような構成要素を検知する適切な手段を使用した判定で、細胞集団内のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞の約１０％未満、約５％未満又は約１％未満がＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。特定の実施形態では、細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％が編集及び／又は修飾され、例えばＢＣＬ１１ａ遺伝子の破壊、ＨＢＧ遺伝子座の破壊及び／又はＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣから選択される１つ又は複数の遺伝子の破壊を有する。特定の実施形態では、細胞集団は、約１５％を超える編集、約２０％を超える編集、約２５％を超える編集、約３０％を超える編集、約３５％を超える編集、約４０％を超える編集、約４５％を超える編集、約５０％を超える編集、約５５％を超える編集又は約６０％を超える編集を有する。特定の実施形態では、細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％は、生産的インデルを有する。
別の態様では、本開示は、修飾Ｃｐｆ１タンパク質と、標的核酸配列を編集し、且つ／又は標的核酸配列の発現を調整するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法におけるそれらの使用とに関する。本開示は、修飾Ｃｐｆ１タンパク質をコードする核酸をさらに提供する。
特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種株ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１タンパク質（ＡｓＣｐｆ１）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７（ＭｂＣｐｆ１）、カンジダツス・メタノメチルフィルス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｐｈｉｌｕｓ）ａｌｖｕｓ Ｍｘ１２０１（ＣＭａＣｐｆ１）、スネアチア・アムニイ（Ｓｎｅａｔｈｉａ ａｍｎｉｉ）（ＳａＣｐｆｑ）、モラクセラ・ラクナータ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｌａｃｕｎａｔａ）（ＭｌＣｐｆ１）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）ＡＡＸ０８＿００２０５（Ｍｂ２Ｃｐｆ１）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）ＡＡＸ１１＿００２０５（Ｍｂ３Ｃｐｆ１）、ラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１タンパク質（ＬｂＣｐｆ１）、ラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０（Ｌｂ５Ｃｐｆ１）、ラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７（Ｌｂ４Ｃｐｆ１）、フラボバクテリウム・ブランキオフィルム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＦＬ－１５（ＦｂＣｐｆ１）、チオミクロスピラ属（Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ）種ＸＳ５（ＴｓＣｐｆ１）、パルキュバクテリア（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ）群菌ＧＷ２０１１（ＰｇＣｐｆ１）、カンジダツス・ロイズマンバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｒｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａ）菌ＧＷ２０１１（ＣＲｂＣｐｆ１）、カンジダツス・ペレグリンバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｅｒｅｇｒｉｎｂａｃｔｅｒｉａ）菌ＧＷ２０１１（ＣＰｂＣｐｆ１）、ブチリビブリオ属（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）種ＮＣ３００５（ＢｓＣｐｆ１）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）（ＢｆＣｐｆ１）、プレボテラ・ブライアンチイ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｒｙａｎｔｉｉ）Ｂ１４（Ｐｂ２Ｃｐｆ１）及びバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）口腔分類群２７４（ＢｏＣｐｆ１）からなる群から選択されるＣｐｆ１タンパク質に由来する（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＺｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ １３４０１５；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１３４０１５を参照されたい）。
特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。例えば、限定されるものではないが、このようなＮＬＳ配列は、ヌクレオプラスミンＮＬＳ（ｎＮＬＳ）（配列番号１）及びシミアンウイルス４０「ＳＶ４０」ＮＬＳ（ｓＮＬＳ）（配列番号２）からなる群から選択される。
特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質のＮＬＳ配列は、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＣ末端又はその近傍に配置される。例えば、限定されるものではないが、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｈｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｎＮＬＳ（配列番号３）；Ｈｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮｓｔａｎｅｙＬＳ（配列番号４）；及びＨｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ（配列番号５）から選択され得る。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質のＮＬＳ配列は、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＮ末端又はその近傍に配置される。例えば、限定されるものではないが、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｈｉｓ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１（配列番号６）、Ｈｉｓ－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１（配列番号７）及びｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１（配列番号８）から選択され得る。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＮ末端及びＣ末端の両方又はその近傍に位置するＮＬＳ配列を含む。例えば、限定されるものではないが、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｈｉｓ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ（配列番号９）及びＨｉｓ－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ（配列番号１０）から選択され得る。例えば、２つ以上のｎＮＬＳ配列又はｎＮＬＳ及びｓＮＬＳ配列（又は他のＮＬＳ配列）の組み合わせ並びに例えば６－ヒスチジン配列などの精製配列あり又はなしの配列を付加することなどのＮＬＳ配列の同一性及びＮ末端／Ｃ末端位置の追加的な順列は、現在開示されている主題の範囲内である。
特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質配列の１つ又は複数のシステイン残基に改変（例えば、欠失又は置換）を含む。例えば、限定されるものではないが、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ６５、Ｃ２０５、Ｃ３３４、Ｃ３７９、Ｃ６０８、Ｃ６７４、Ｃ１０２５及びＣ１２４８からなる群から選択される位置に改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、セリン又はアラニンの１つ又は複数のシステイン残基の置換を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ６５Ｓ、Ｃ２０５Ｓ、Ｃ３３４Ｓ、Ｃ３７９Ｓ、Ｃ６０８Ｓ、Ｃ６７４Ｓ、Ｃ１０２５Ｓ及びＣ１２４８Ｓからなる群から選択される改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ６５Ａ、Ｃ２０５Ａ、Ｃ３３４Ａ、Ｃ３７９Ａ、Ｃ６０８Ａ、Ｃ６７４Ａ、Ｃ１０２５Ａ及びＣ１２４８Ａからなる群から選択される改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、位置Ｃ３３４及びＣ６７４又はＣ３３４、Ｃ３７９及びＣ６７４に改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ３３４Ｓ及びＣ６７４Ｓ又はＣ３３４Ｓ、Ｃ３７９Ｓ及びＣ６７４Ｓに改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ３３４Ａ及びＣ６７４Ａ又はＣ３３４Ａ、Ｃ３７９Ａ及びＣ６７４Ａに改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、例えば、Ｈｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｎＮＬＳ Ｃｙｓ－ｌｅｓｓ（配列番号１１）又はＨｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｎＮＬＳ Ｃｙｓ－ｌｏｗ（配列番号１２）などの１つ又は複数のシステイン残基改変並びに１つ又は複数のＮＬＳ配列の導入の両方を含む。特定の実施形態では、１つ又は複数のシステイン残基の欠失又は置換を含むＣｐｆ１タンパク質は、凝集の減少を示す。
さらなる態様では、本開示は、細胞内で１つ又は複数の標的配列を修飾する方法を提供する。特定の実施形態では、このような方法は、細胞又は細胞集団を、（ａ）関心のある標的配列に相補的なｇＲＮＡ分子；及び（ｂ）Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼに接触させることを含む。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、細胞又は細胞集団中の関心のある標的配列を修飾する。特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）又はヒト臍帯血誘導赤血球系前駆（ＨＵＤＥＰ）細胞である。特定の実施形態では、細胞集団内の細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％が修飾される。特定の実施形態では、関心のある標的配列は、例えば、プロモーター領域などのＨＢＧ１遺伝子配列であり、ｇＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡ分子ＨＢＧ１－１の配列を含む。特定の実施形態では、関心のある標的配列は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子配列である。代わりに、標的核酸配列は、ＦＡＳ遺伝子配列の一部、ＢＩＤ遺伝子配列の一部、ＣＴＬＡ４遺伝子配列の一部、ＰＤＣＤ１遺伝子配列の一部、ＣＢＬＢ遺伝子配列の一部、ＰＴＰＮ６遺伝子配列の一部、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本開示は、例えば、細胞を、（ａ）第１の遺伝子の標的配列に相補的な第１の標的ドメインを含む第１のｇＲＮＡと、第１のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第１のＲＮＰ複合体；及び（ｂ）第２の遺伝子の標的配列に相補的な第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子と、第２のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第２のＲＮＰ複合体に接触させることを含む、細胞内で２つ以上、３つ以上又は４つ以上などの１つ又は複数の遺伝子を修飾する方法をさらに提供する。特定の実施形態では、方法は、（ｃ）第３の遺伝子の標的配列に相補的な第３の標的化ドメインを含む第３のｇＲＮＡ分子と、第３のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第３のＲＮＰ複合体、及び／又は（ｄ）第４の遺伝子の標的配列に相補的な第４の標的化ドメインを含む第４のｇＲＮＡ分子と、第４のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第４のＲＮＰ複合体をさらに含み得る。特定の実施形態では、各ＲＮＰ複合体は、同一のＣｐｆ１タンパク質を含み得るか、又は各ＲＮＰ複合体は、例えば、Ｃｐｆ１タンパク質変異型などの異なるＣｐｆ１タンパク質を含み得る。特定の実施形態では、細胞内で例えば２つ以上、３つ以上又は４つ以上などの１つ又は複数の遺伝子を修飾する方法は、細胞を、（ａ）第１の遺伝子の標的配列に相補的な第１の標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ；（ｂ）第２の遺伝子の標的配列に相補的な第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；及び（ｃ）本明細書で開示されるＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又は開示されるＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸によってコードされるＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼに接触させることを含み得る。特定の実施形態では、方法は、（ｄ）第３の遺伝子の標的配列に相補的な第３の標的化ドメインを含む第３のｇＲＮＡ分子、及び／又は（ｅ）第４の遺伝子の標的配列に相補的な第４の標的化ドメインを含む第４のｇＲＮＡ分子をさらに含み得る。Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、第１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の遺伝子及び／又は第４の遺伝子を修飾する。特定の実施形態では、第１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の遺伝子及び第４の遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される。特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。
別の態様では、本開示は、本開示に包含されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを用いて修飾された１つ又は複数の細胞を対象に投与することにより、対象を治療する方法に関する。特定の実施形態では、１つ又は複数の細胞は、エクスビボ又はインビトロで修飾され、次に対象に投与される。特定の実施形態では、対象を治療するための方法は、（ａ）標的核酸の標的配列に相補的なｇＲＮＡ分子；及び（ｂ）本明細書で開示されるＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを有する対象から得られた細胞を接触させることを含む。特定の実施形態では、本開示は、ドナーから得られ、対象への投与前に本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを用いてエクスビボ又はインビトロで遺伝子改変された１つ又は複数の細胞を対象に投与することにより、それを必要とする対象を治療する方法に関する。特定の実施形態では、対象は、例えば、鎌状赤血球症又はβサラセミアなどの異常ヘモグロビン症に罹患している。特定の実施形態では、対象は、がん又は自己免疫障害に罹患している。
特定の実施形態では、本開示は、異常ヘモグロビン症に罹患している対象に細胞集団を投与する方法をさらに提供し、細胞集団は、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、ＨＢＧ遺伝子配列又はＢＣＬ１１ａ遺伝子配列を標的とするｇＲＮＡ分子とを含む複合体の送達によって生成される、ＨＢＧ遺伝子配列又はＢＣＬ１１ａ遺伝子配列における修飾を含む。特定の実施形態では、細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％が修飾される。特定の実施形態では、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）又はヒト臍帯血誘導赤血球系前駆（ＨＵＤＥＰ）細胞である。
さらなる態様では、本開示は、関心のある核酸配列を標的とし、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞などの修飾細胞を生成するためのｇＲＮＡ分子を提供する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、標的配列に相補的な第１の標的化ドメインを含み、標的配列は、ＨＢＧ遺伝子配列又はＢＣＬ１１ａ遺伝子配列である。このようなｇＲＮＡの非限定的例は、図６～１２及び４６並びに表１９で提供される。特定の実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを提供し、それが細胞に導入されると、ｇＲＮＡ分子の第１の標的化ドメインに相補的な標的配列又はその近傍にインデルが形成され、且つ／又はｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムが細胞に導入されると、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター領域内のｇＲＮＡの第１の標的化ドメインに相補的な配列に欠失が生じる。特定の実施形態では、本開示のｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、細胞内に導入されると、胎児型ヘモグロビンの増加した発現をもたらす。特定の実施形態では、本開示のｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、例えば、鎌状赤血球症又はβサラセミアなど、異常ヘモグロビン症の症状を部分的に又は完全に緩和するのに適した量で胎児型ヘモグロビンの発現の増加をもたらす。例えば、限定されるものではないが、胎児型ヘモグロビンの発現は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子又はＨＢＧ遺伝子座及び／若しくは遺伝子に破壊のない細胞又は細胞集団における胎児型ヘモグロビンの発現のレベルと比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％増加し得る。特定の実施形態では、胎児型ヘモグロビンの発現の増加は、約１ピコグラム（ｐｇ）を超え、約２ｐｇを超え、約３ｐｇを超え、約４ｐｇを超え、約５ｐｇを超え、約６ｐｇを超え、約７ｐｇを超え、約８ｐｇを超え、約９ｐｇを超え、又は約１０ｐｇを超え得る。
本開示は、標的配列に相補的な第１の標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子をさらに提供し、標的配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。このようなｇＲＮＡの非限定的例は、表２～９で提供される。
本開示は、本明細書で開示されるｇＲＮＡ分子を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、表２～９及び１９並びに図６～１２で開示されるｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、表１８で提供される染色体の位置（例えば、ゲノム座標）を標的とする。特定の実施形態では、組成物は、例えば、ＲＮＰ複合体を生成するためにＣｐｆ１タンパク質をさらに含み得る。特定の実施形態では、本開示は、例えば、ＲＮＰ複合体集団などの１つ又は複数のＲＮＰ複合体を含む組成物を提供し、各ＲＮＰ複合体は、異なる遺伝子又は遺伝子領域を標的とする。特定の実施形態では、組成物を使用して、例えばがん、自己免疫障害又は異常ヘモグロビン症に罹患している対象など、それを必要とする対象が治療され得る。
別の態様では、本開示は、標的核酸配列を修飾するためのゲノム編集システムに関する。特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、ｇＲＮＡ分子；及び本明細書で開示されるＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含み得る。本開示は、例えば、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される２つ以上の遺伝子を編集するための多重ゲノム編集システムをさらに提供する。
さらなる態様では、本開示は、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を評価するための方法並びにそれを達成するための構成要素に関する。
特定の実施形態では、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を評価する方法は、標的核酸配列に関して、試験Ｃｐｆ１タンパク質の活性を対照Ｃｐｆ１タンパク質と比較することを含む。特定の実施形態では、試験Ｃｐｆ１タンパク質は、例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質などの対照と比較して１つ又は複数の修飾を含む。このような修飾の例としては、１つ又は複数のＮＬＳ配列の組み込み、６－ヒスチジン精製配列の組み込み及びＣｐｆ１タンパク質システインアミノ酸の改変並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を評価する方法は、「一致部位」標的核酸配列に関して、試験Ｃｐｆ１タンパク質の活性を対照Ｃａｓ９タンパク質と比較することを含む。本明細書の用法では、一致部位標的核酸配列は、例えば、ＴＴＴＶ ＡｓＣｐｆ１野生型プロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）及びＮＧＧ ＳｐＣａｓ９野生型ＰＡＭなどのＣｐｆ１及びＣａｓ９によって編集されるという要件の両方を組み込んでいる。上述したように、試験Ｃｐｆ１タンパク質は、野生型Ｃｐｆ１タンパク質と比較して１つ又は複数の修飾を含み得る。このような修飾の例としては、１つ又は複数のＮＬＳ配列を組み込むための前述の修飾、６－ヒスチジン精製配列を組み込むための前述の修飾及びＣｐｆ１タンパク質システインアミノ酸の改変並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本開示は、試験ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集システムによる標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼゲノム編集システムと比較するためのアッセイに関する。例えば、限定されるものではないが、試験及び対照ゲノム編集システムは、次の側面のいずれか１つ又は複数が異なり得る：ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの配列；例えばゲノム編集システムの構成要素の製造方法などの供給源；ゲノム編集システムの１つ又は複数の構成要素の配合；及び例えば細胞型又は細胞の調製方法など、その中にゲノム編集システムが導入される細胞の同一性。特定の実施形態では、本明細書に記載のアッセイは、試験ゲノム編集システムの品質管理分析を可能にする。特定の実施形態では、本開示のアッセイは、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を評価し、標的は、一致部位配列を含む。
特定の実施形態では、一致部位標的核酸の使用は、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介編集（又は別のＣＲＩＳＰＲベースのシステムによる編集）及び／又は標的核酸配列の発現の調整と対比したＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集のアッセイ及び／又は評価を可能にする。
特定の実施形態では、一致部位標的核酸の使用は、特定の細胞型における、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介編集（又は別のＣＲＩＳＰＲベースのシステムによる編集）及び／又は標的核酸配列の発現の調整と対比したＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集のアッセイ及び／又は評価を可能にする。例えば、限定されるものではないが、このような方法を使用して、いくつかの細胞型中で特に、Ｔ細胞、造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＨＳＣをはじめとするが、これに限定されるものではないＨＳＣ）及びヒト臍帯血誘導赤血球系前駆（ＨＵＤＥＰ）細胞における、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整と対比してＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集が評価され得る。
特定の実施形態では、一致部位標的核酸の使用は、用いられるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集システムの特定の属性に関して、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介編集（又は別のＣＲＩＳＰＲベースのシステムによる編集）及び／又は標的核酸配列の発現の調整と対比してＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集のアッセイ及び／又は評価を可能にする。例えば、限定されるものではないが、このような方法を使用して、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整と対比してＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集が評価され、異なる製造プロセスによって調製されたＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡの活性の差異が同定され得る。このような方法は、異なる調合物に存在し、且つ異なる送達ストラテジーを用いるＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡの活性の差異も同定し得る。
特定の実施形態では、一致部位標的核酸配列は、一致部位１（「ＭＳ１」；配列番号１３）、一致部位５（「ＭＳ５」；配列番号１４）、一致部位１１（「ＭＳ１１」；配列番号１５）及び一致部位１８（「ＭＳ１８」；配列番号１６）からなる群から選択される。特定の実施形態では、一致部位標的核酸配列は、ＭＳ５である。
様々なストラテジーを用いて、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムが細胞に送達され得る。例えば、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの構成要素をコードする、例えばＡＡＶ又は他のウイルスベクターなどのベクターを使用して、細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの構成要素の発現が誘導され得る。代わりに、例えばＲＮＰ複合体を細胞に送達するために使用され得る電気穿孔又は任意の他の適切な方法により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの様々な構成要素を含むＲＮＰ複合体が細胞に送達され得る。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子を使用して、ＲＮＰ複合体が細胞に送達され得る。
添付の図面は、本開示の特定の態様及び実施形態の包括的ではなく、むしろ例示的で概略的な例を提供することを意図している。図面は、任意の特定の理論又はモデルを制限することも又はそれに拘束されることも意図されず、必ずしも縮尺通りに描かれていない。上記を限定することなく、核酸及びポリペプチドは線状配列として又は概略的な二次元若しくは三次元構造として描写され得；これらの描写は、それらの構造に関する任意の特定のモデル又は理論を制限することも又はそれに拘束されることもなく、むしろ例示的であることを意図している。
操作されたＣｐｆ１変異型がどのようにＰＡＭ標的化空間を拡大するかの概要を提供する。 Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３４（８）：８６９－７４ Ａｕｇ．２０１６からの４つの一致部位の配列（ＭＳ１、ＭＳ５、ＭＳ１１及びＭＳ１８）の概要及びこれらの一致部位標的配列に関連して、Ｃｐｆ１及びＣａｓ９の性能を評価するのに使用された細胞型を提供する。 ２つの一致部位遺伝子座（ＭＳ１及びＭＳ５）で、Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡ ＲＮＰの増加する濃度をＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰと比較する用量反応実験の結果（図３Ａ）並びに一致部位標的ＭＳ１、ＭＳ５、ＭＳ１１及びＭＳ１８に対するＡｓＣｐｆ１及びＳｐＣａｓ９の活性を比較するアッセイの結果を描写し、Ｃｐｆ１は、特定の標的部位をＣａｓ９よりも効率的に編集する（図３Ｂ）。 ２つの一致部位遺伝子座（ＭＳ１及びＭＳ５）で、Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡ ＲＮＰの増加する濃度をＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰと比較する用量反応実験の結果（図３Ａ）並びに一致部位標的ＭＳ１、ＭＳ５、ＭＳ１１及びＭＳ１８に対するＡｓＣｐｆ１及びＳｐＣａｓ９の活性を比較するアッセイの結果を描写し、Ｃｐｆ１は、特定の標的部位をＣａｓ９よりも効率的に編集する（図３Ｂ）。 一致部位５ガイドを用いた、固定４．４μＭ ＲＮＰ用量での複数の細胞型にわたる様々なＡｓＣｐｆ１ ＮＬＳ変異型の比較を示す。データは、各細胞型について最大編集を提示する変異型に対して正規化される。 初代Ｔ細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ ＧＷＥＤ５４５を用いた、４．４μＭ ＲＮＰ用量での様々な２つの最適なＡｓＣｐｆ１ ＮＬＳ変異型の比較（図５Ａ）及び初代Ｔ細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ Ｂ２Ｍ－１２を用いた、４．４μＭ ＲＮＰ用量でのＨｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ変異型の比較（図５Ｂ）を示す。いずれの場合も、データは、最大の編集を提示する変異型に対して正規化される。 初代Ｔ細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ ＧＷＥＤ５４５を用いた、４．４μＭ ＲＮＰ用量での様々な２つの最適なＡｓＣｐｆ１ ＮＬＳ変異型の比較（図５Ａ）及び初代Ｔ細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ Ｂ２Ｍ－１２を用いた、４．４μＭ ＲＮＰ用量でのＨｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ変異型の比較（図５Ｂ）を示す。いずれの場合も、データは、最大の編集を提示する変異型に対して正規化される。 ＨＳＣ及びＨＵＤＥＰにおけるＨＢＧ１アッセイで用いられるｇＲＮＡ配列を示す。 ＨＳＣ及びＨＵＤＥＰにおけるＢＣＬ１１ａアッセイで用いられるｇＲＮＡ配列を示す。 ＨＳＣ又はＨＵＤＥＰのいずれかにおけるＨＢＧ１又はＢＣＬ１１ａの特定の配列及びそれらの対応する％編集を示す。ＨＢＢを標的とすると提案されたｇＲＮＡも提供される。 ＣＡＡＴボックスモチーフにｇＲＮＡ ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ ＨＢＧ１－１が結合しているＨＢＧ１プロモーター領域を示す。 ＧＡＴＡ１モチーフにｇＲＮＡ ＢＣＬ１１ａ ＡｓＣｐｆ１ ＲＲ－８が結合しているＢＣＬ１１ａエンハンサー領域の一部を示す。 図６で同定されたｇＲＮＡを使用してスクリーニングされたＨＢＧ１プロモーターの領域を示す。この領域は、約１５０ｂｐに及ぶ。ＨＢＧ１－１は、ＣＡＡＴボックスモチーフと重なって示される。 図７で同定されたｇＲＮＡを使用してスクリーニングされたＢＣＬ１１ａ赤血球エンハンサーの領域を示す。この領域は、およそ６００塩基対に及び、ＢＣＬ１１ａ ＲＲ－８は、ＧＡＴＡ１モチーフと重複して示される。 ＡｓＣｐｆ１低システインコンストラクトが同定されたシステイン変異体を示す。 ＡｓＣｐｆ１ Ｃ３３４Ｓ Ｃ３７９Ｓ Ｃ６７４Ｓ中のシステイン残基の有意に低下したアクセス性を実証するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒマレイミドアッセイの結果を示す。 ＭＳ５基質ＤＮＡに対する、ＷＴ ＡｓＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１システインなし及び２つの低システイン変異型の同等のエンドヌクレアーゼ活性の実証を描写する。 ＨＵＤＥＰ及びＨＳＣにおける、ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ及びＲＲ ＰＡＭ変異型によるＨＢＧ１プロモーター領域の標的化を示す。ＨＵＤＥＰ実験は、最適なＣＡ－１３７パルスプログラムとＬｏｎｚａ溶液ＳＥとを使用して実施された。ＨＳＣスクリーニングは、製造業者によって推奨されるように、パルスコードＥＯ－１００とＬｏｎｚａ溶液Ｐ３とを用いて実行された。用量は、全てのガイドに対して、２：１のガイド：タンパク質比率で４．４μＭ ＲＮＰであった。１条件当たり５万個のＨＳＣが処理された。ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ及びＲＲタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。 ＨＵＤＥＰ及びＨＳＣにおける１つのＷＴ ＦｎＣｐｆ１標的と共に、ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ及びＲＲ及びＲＶＲ ＰＡＭ変異型によるＢＣＬ１１ａエンハンサー領域のスクリーニングを示す。ＨＵＤＥＰスクリーニング実行は、最適なＣＡ－１３７パルスプログラムを、Ｌｏｎｚａ溶液ＳＥを用いて実施された。ＨＳＣスクリーニングは、製造業者によって推奨されるように、パルスコードＥＯ－１００及びＬｏｎｚａ溶液Ｐ３を用いて実行された。ＢＣＬ１１ａ（ＫＯＢＥＨと命名される）の対照ガイドも示される。用量は、全てのガイドに対して、２：１のガイド：タンパク質比率で４．４μＭ ＲＮＰであった。１条件当たり５万個のＨＳＣが処理された。ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ、ＲＲ及びＲＶＲタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。 ＨＵＤＥＰにおけるＡｓＣｐｆ１のヌクレオフェクションスクリーニングを示す。用量は、２：１のガイド：タンパク質で一致部位５（ＭＳ５）ガイドＲＮＡを使用して、２．２μＭ ＡｓＣｐｆ１ ＲＮＰであった。ＡｓＣｐｆ１ ＷＴタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。Ｌｏｎｚａ溶液ＳＥ、ＳＦ及びＳＧは、異なるパルスプログラムを使用して、１条件当たり５万個のＨＵＤＥＰで試験された。溶液ＳＥでのパルスコードＣＡ－１３７及びＣＡ－１３８は、最適な編集を実証した。 ＨＳＣにおけるＡｓＣｐｆ１のヌクレオフェクションスクリーニングを示す。用量は、２：１のガイド：タンパク質で一致部位５（ＭＳ５）ガイドＲＮＡを使用して、２．２μＭ ＡｓＣｐｆ１ ＲＮＰであった。ＡｓＣｐｆ１ ＷＴタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。Ｌｏｎｚａ溶液Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４及びＰ５は、異なるパルスプログラムを使用して、１条件当たり５万個のＨＳＣで試験された。溶液Ｐ２でのパルスコードＣＡ－１３７及びＣＡ－１３８は、最適な編集を実証し、ＦＦ－１００及びＦＦ－１０４も同様であった。 Ｌｏｎｚａ Ａｍａｘａにおける特定のパルスコードの使用が標的及びＰＡＭ変異型全体にわたりＨＳＣの編集を増加させることを示す。用量は、全てのガイドに対して、２：１のガイド：タンパク質比率で４．４μＭ ＲＮＰであった。１条件当たり５万個のＨＳＣが処理された。ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ、ＲＲ及びＲＶＲタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。 ＴＲＢＣ、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子座における、ＡｓＣｐｆ１並びにそのＲＲ及びＲＶＲ ＰＡＭ変異型によるＴ細胞治療標的のスクリーニングを示す。予備スクリーニングでは約３０％のｇＲＮＡが５０％を超える編集を示し、これは、一般に観察されるＳｐＣａｓ９ヒット率と同レベルであり、Ｃｐｆ１が、例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ及び／又はＢ２Ｍをはじめとするが、これに限定されるものではない、治療遺伝子座における患者のＴ細胞に対する遺伝子編集のために潜在的に使用され得ることが実証される。 電気穿孔パルスコードの変更が複数の治療標的遺伝子座におけるＴ細胞の最大編集を有意に改善することを示す。 Ｃｐｆ１ ＲＮＰによる、疾患関連遺伝子座における初代Ｔ細胞の効率的なノックアウト編集を示す。図２３Ａは、エクスビボ細胞療法のＲＮＰワークフローを示す。図２３Ｂは、ＡｓＣｐｆ１又は操作されたＰＡＭ変異型を使用した、複数の治療的に関連するＴ細胞遺伝子座における効率的な単一ノックアウトを示す。 Ｃｐｆ１ ＲＮＰによる、疾患関連遺伝子座における初代Ｔ細胞の効率的なノックアウト編集を示す。図２３Ａは、エクスビボ細胞療法のＲＮＰワークフローを示す。図２３Ｂは、ＡｓＣｐｆ１又は操作されたＰＡＭ変異型を使用した、複数の治療的に関連するＴ細胞遺伝子座における効率的な単一ノックアウトを示す。 フローサイトメトリーによって測定された、Ｃｐｆ１ ＲＮＰで処理されたＴ細胞における２つの治療標的の高効率二重ノックアウトを示す。 ＴＲＢＣ、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子座における、ＡｓＣｐｆ１並びにそのＲＲ及びＲＶＲ ＰＡＭ変異型によるＴ細胞治療標的のスクリーニングを示す。 ３つの同種異系Ｔ細胞標的上のＴ細胞におけるＡｓＣｐｆ１ ＷＴ、ＲＲ及びＲＶＲの高い編集効率を要約する。 ヒト初代Ｔ細胞における、Ｃｐｆ１又はＣａｓ９による２つのＴ細胞標的の二重ノックアウトを図示する。 ＣＩＩＴＡ遺伝子座における、Ｃｐｆ１によるＴ細胞治療標的のスクリーニングを示す。 ＳｐＣａｓ９と比較した、３つの同種異系Ｔ細胞標的、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＢ２Ｍ上のＴ細胞におけるＣｐｆ１の高い編集効率を要約する。 Ｔ細胞における、Ｃｐｆ１ ＲＮＰによる３つのＴ細胞標的の三重ノックアウトの効率を図示する。 図３１Ａは、３つのＴ細胞標的、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍに対する上位のＣｐｆ１候補ガイドの特異性を要約し、検出されたオフターゲットの数を示す。図３１Ｂは、標的化アンプリコン配列決定により、検出可能なオフターゲットが見いだされなかったことを示す。 図３１Ａは、３つのＴ細胞標的、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍに対する上位のＣｐｆ１候補ガイドの特異性を要約し、検出されたオフターゲットの数を示す。図３１Ｂは、標的化アンプリコン配列決定により、検出可能なオフターゲットが見いだされなかったことを示す。 Ｔ細胞における最大編集を改善する電気穿孔条件の同定を示す。条件１は、ＤＳ－１３０であり、条件２は、ＣＡ－１３７であった。 Ｔ細胞における遺伝子編集の効力を改善するＮＬＳ構成の同定を示す。ＮＬＳ ｖ１は、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１）を表し、ＮＬＳ ｖ２は、配列２ｘＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２）を表す。 ＡｓＣｐｆ１とＨＢＧ１－１ガイドを用いた、ＨＳＣのＨＢＧ－１遺伝子座における編集効率を示す。 ＭＳ５ガイドＲＮＡを使用した、一致部位５におけるＴ細胞のＮＬＳ変異型の編集効率を示す。 フローサイトメトリーで測定された、ＣＩＩＴＡ遺伝子座で編集されたＴ細胞におけるＭＨＣ ＩＩの減少を示す。 ＣＩＩＴＡ遺伝子座で編集されたＴ細胞における編集効率を示す。 ＣＩＩＴＡ ｇＲＮＡ、ＣＩＩＴＡ－３４、ＣＩＩＴＡ－４１、ＣＩＩＴＡ－４５及びＣＩＩＴＡ－１０によって標的化されるゲノム位置を示す。 ＣＩＩＴＡ遺伝子座で編集されたＴ細胞におけるＭＨＣ ＩＩの減少百分率を要約する。 Ｃｐｆ１ ＣＩＩＴＡ ｇＲＮＡの編集効率を示し、ｇＲＮＡで検出されたオフターゲットの数を示す。 ＡｓｐＣｐｆ１ ＲＲ及びＷＴ ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＢ２Ｍ ｇＲＮＡの編集効率を示す。 異なる長さのＡｓｐＣｐｆ１ ＲＲ及びＷＴ Ｂ２Ｍ ｇＲＮＡの編集効率を示す。 異なる長さのＡｓｐＣｐｆ１ ＲＲ及びＷＴ ＴＲＡＣ ｇＲＮＡの編集効率を示す。 異なる長さのＡｓｐＣｐｆ１ ＲＲ及びＷＴ ＣＩＩＴＡ ｇＲＮＡの編集効率を示す。 未編集ゲノムＤＮＡ標的化部位、標的化組み込みのための例示的なＤＮＡドナー鋳型、潜在的な挿入結果（すなわち切断部位における非標的化組み込み又は切断部位における標的化組み込み）及びＰ１プライミング部位及びＰ２プライマー部位を標的とするプライマー対（アンプリコンＸ）、Ｐ１プライマー部位及びＰ２’プライミング部位を標的とするプライマー対（アンプリコンＹ）又はＰ１’プライマー部位及びＰ２プライマー部位を標的とするプライマー対（アンプリコンＺ）の使用から得られた３つの潜在的なＰＣＲアンプリコンの概略図である。描写される例示的なＤＮＡドナー鋳型は、組み込まれたプライマー部位（Ｐ１’及びＰ２’）及びスタッファー配列（Ｓ１及びＳ２）を含有する。Ａ１／Ａ２：ドナー相同性アーム、Ｓ１／Ｓ２：ドナースタッファー配列、Ｐ１／Ｐ２：ゲノムプライマー部位、Ｐ１’／Ｐ２’：組み込まれたプライマー部位、Ｈ１／Ｈ２：ゲノム相同性アーム、Ｎ：カーゴ、Ｘ：切断部位。 未編集ゲノムＤＮＡ標的化部位、標的化組み込みのための例示的なＤＮＡドナー鋳型、潜在的な挿入結果（すなわち切断部位における非標的化組み込み又は切断部位における標的化組み込み）及びＰ１プライマー部位及びＰ２プライマー部位を標的とするプライマー対（アンプリコンＸ）又はＰ１’プライマー部位及びＰ２プライマー部位を標的とするプライマー対（アンプリコンＹ）の使用から得られた２つの潜在的なＰＣＲアンプリコンの概略図である。例示的なＤＮＡドナー鋳型は、組み込まれたプライマー部位（Ｐ１’）及びスタッファー配列（Ｓ２）を含有する。Ａ１／Ａ２：ドナー相同性アーム、Ｓ１／Ｓ２：ドナースタッファー配列、Ｐ１／Ｐ２：ゲノムプライマー部位、Ｐ１’：組み込まれたプライマー部位、Ｈ１／Ｈ２：ゲノム相同性アーム、Ｎ：カーゴ、Ｘ：切断部位。 未編集ゲノムＤＮＡ標的化部位、標的化組み込みのための例示的なＤＮＡドナー鋳型、潜在的な挿入結果（すなわち切断部位における非標的化組み込み又は切断部位における標的化組み込み）及びＰ１プライマー部位及びＰ２プライマー部位を標的とするプライマー対（アンプリコンＸ）又はＰ１プライマー部位及びＰ２’プライマー部位を標的とするプライマー対（アンプリコンＹ）の使用から得られた２つの潜在的なＰＣＲアンプリコンの概略図である。例示的なＤＮＡドナー鋳型は、組み込まれたプライマー部位（Ｐ２’）及びスタッファー配列（Ｓ１）を含有する。Ａ１／Ａ２：ドナー相同性アーム、Ｓ１／Ｓ２：ドナースタッファー配列、Ｐ１／Ｐ２：ゲノムプライマー部位、Ｐ２’：組み込まれたプライマー部位、Ｈ１／Ｈ２：ゲノム相同性アーム、Ｎ：カーゴ、Ｘ：切断部位。 Ｔ細胞受容体α定数（ＴＲＡＣ）遺伝子座のｇＲＮＡ標的化のために設計された例示的なＤＮＡドナー鋳型を示す。 ＨＢＧ１及びＨＢＧ２のプロモーター領域のスクリーニングから同定されたｇＲＮＡを示す。
定義及び略語
別段の指定がない限り、以下の各用語は、このセクションでそれに関連した意味を有する。
不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、関連した名詞の少なくとも１つを指し、「少なくとも１つ」及び「１つ又は複数」という用語と互換的に使用される。例えば、「モジュール」は少なくとも１つのモジュール又は１つ又は複数のモジュールを意味する。
接続詞「又は」及び「及び／又は」は、非排他的選言肢として同義的に使用される。
「約」又は「およそ」という用語は、本明細書の用法では、当業者による判定で特定の値の許容誤差範囲内を意味し得、これは、例えば、測定システムの制限など、値がどのように測定又は判定されるかに部分的に依存するであろう。例えば、「約」は、所与の値の慣行に従って１標準偏差又内は１標準偏差を超えることを意味し得る。特定の値が本出願本及び特許請求の範囲に記載されている場合、別段の記載がない限り、「約」という用語は、例えば、「約」という用語によって修飾された値の±１０％などの特定の値の許容誤差範囲を意味し得る。
「から本質的になる」という語句は、列挙された化学種が優勢な種であるが、他の化学種が対象組成物の構造、機能又は挙動に影響を及ぼさない微量又は量で存在し得ることを意味する。例えば、特定の化学種から本質的になる組成物は、一般的に、その化学種を９０％、９５％、９６％又はそれを超えて含む。
「ドメイン」は、タンパク質又は核酸のセグメントを表すために使用される。特に断りのない限り、ドメインは、いかなる特定の機能特性も有する必要はない。
「インデル」は、核酸配列中の挿入及び／又は欠失である。インデルは、本開示のゲノム編集システムによって形成された二本鎖切断などのＤＮＡ二本鎖切断の修復の産物であり得る。インデルは、最も一般的には、下述したＮＨＥＪ経路などの「誤りがちな」修復経路によって中断が修復された場合に形成される。
ＨＳＣに関する「生産的インデル」とは、ＨｂＦ発現をもたらすインデル（欠失及び／又は挿入）を指す。特定の実施形態では、ＨＳＣの生産的インデルは、ＨｂＦ発現を誘導し得る。特定の実施形態では、ＨＳＣ中の生産的インデルは、ＨｂＦ発現のレベルの増加をもたらし得る。Ｔ細胞に関する「生産的インデル」は、例えば、内因性Ｔ細胞遺伝子などのＴ細胞における標的遺伝子の発現を低下させるインデル（欠失及び／又は挿入）を指す。特定の実施形態では、Ｔ細胞内の「生産的インデル」は、Ｔ細胞上の細胞表面タンパク質又はマーカーの発現の減少又は除去をもたらす。
「遺伝子変換」とは、内因性相同配列（例えば、遺伝子アレイ内の相同配列）の組み込みによるＤＮＡ配列の改変を指す。「遺伝子修正」とは、外因性一本鎖又は二本鎖ドナー鋳型ＤＮＡなどの外因性相同配列の組み込みによるＤＮＡ配列の改変を指す。遺伝子変換及び遺伝子修正は、下述したものなどのＨＤＲ経路によるＤＮＡ二本鎖切断の修復の産物である。
インデル、遺伝子変換、遺伝子修正及び他のゲノム編集結果は、典型的には配列決定によって（最も一般的には「次世代」又は「合成による配列決定」法により、ただしサンガー配列決定も依然として使用され得る）評価され、全ての配列決定読み取りにおける数値変化の相対頻度（例えば、±１、±２又はそれを超える塩基）によって定量化される。配列決定のためのＤＮＡサンプルは、当該技術分野で公知の多様な方法によって調製され得、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による目的部位の増幅、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４（５）：４８３（２０１６）、参照により本明細書に援用される）に記載されるＧＵＩＤＥｓｅｑプロセスにおけるような二本鎖切断によって生じるＤＮＡ末端の捕捉を伴い得るか、又は当該技術分野で周知の別の手段によって調製され得る。ゲノム編集結果は、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｖｉｓｉｏｎ（Ｂａｇｎｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）によって製品化されているＦｉｂｅｒＣｏｍｂ（商標）システムなどの原位置ハイブリダイゼーション法及び当該技術分野で公知任意の他の適切な方法によっても評価され得る。
本明細書の用法では、「標的配列における修飾」という語句並びにその均等物は、欠失、挿入、遺伝子変換、遺伝子修正及び／又はインデルの標的配列への導入を包含するが、これらに限定されない。標的配列における修飾は、標的配列の発現の変化をもたらし得、例えば、コード配列における修飾は、その配列によってコードされるタンパク質の発現を妨害し得る一方、調節配列における修飾は、調節配列がタンパク質の発現を活性化するか又は阻害するかに応じて、その調節配列の制御下にあるタンパク質の発現の増加又は減少をもたらし得る。
「Ａｌｔ－ＨＤＲ」、「代替相同指向修復」又は「代替ＨＤＲ」は同義的に使用されて、相同核酸（例えば、姉妹染色分体などの内因性相同配列又は例えば鋳型核酸などの外因性核酸）を使用して、ＤＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。Ａｌｔ－ＨＤＲは、プロセスが、標準ＨＤＲとは異なる経路を利用し、標準ＨＤＲ媒介物であるＲＡＤ５１及びＢＲＣＡ２によって阻害され得るという点で、標準ＨＤＲと異なる。Ａｌｔ－ＨＤＲは一本鎖又はニックの入った相同核酸鋳型の関与によっても区別されるのに対し、標準ＨＤＲは一般に二本鎖相同鋳型を伴う。
「標準ＨＤＲ」、「標準相同指向修復」又は「ｃＨＤＲ」は、相同核酸（例えば、姉妹染色分体などの内因性相同配列又は例えば鋳型核酸などの外因性核酸）を使用したＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。標準ＨＤＲは、二本鎖切断で顕著な切除があって、少なくとも１つのＤＮＡの一本鎖部分が形成する場合に典型的に機能する。正常細胞では、ｃＨＤＲは、典型的に、切断の認識、切断の安定化、切除、一本鎖ＤＮＡの安定化、ＤＮＡクロスオーバー中間体の形成、クロスオーバー中間体の分解及びライゲーションなどの一連の工程を伴う。プロセスはＲＡＤ５１及びＢＲＣＡ２を必要とし、相同核酸は典型的に二本鎖である。
特に断りのない限り、「ＨＤＲ」という用語は、本明細書の用法では標準ＨＤＲ及びａｌｔ－ＨＤＲの両方を包含する。
「非相同末端結合」又は「ＮＨＥＪ」は、標準ＮＨＥＪ（ｃＮＨＥＪ）及び代替ＮＨＥＪ（ａｌｔＮＨＥＪ）などのライゲーション媒介修復及び／又は非鋳型媒介修復を指し、これは次に、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）及び合成依存性マイクロホモロジー媒介末端結合（ＳＤ－ＭＭＥＪ）を含む。
「置換」又は「置換された」は、分子（例えば、核酸又はタンパク質）の修飾に関して使用される場合、プロセス制限を必要とせず、単に置換実体が存在することを示す。
「対象」は、ヒト又は非ヒト動物を意味する。ヒト対象は、任意の年齢（例えば、乳児、子供、若年成人又は成人）であり得、疾患に罹患し得るか又は遺伝子の修飾を必要とし得る。代わりに、対象は、動物であり得、上記用語には、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、両生類及びより特に非ヒト霊長類、齧歯類（マウス、ラット、ハムスターなど）、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコなどが含まれるが、これに限定されるものではない。本開示の特定の実施形態では、対象は、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ又はヤギなどの家畜である。特定の実施形態では、対象は家禽である。特定の実施形態では、対象は、植物である。
「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、疾病を抑制すること、すなわち、その発症又は進行を阻止又は防止すること；疾病を緩和し、すなわち、疾病状態の退縮を引き起こすこと；疾病の１つ又は複数の症状を緩和すること；疾病を治癒させることの１つ又は複数をはじめとする、対象（例えば、ヒト対象）における疾病の治療を意味する。
「予防する」、「予防すること」及び「予防」は、（ａ）疾病を回避又は排除すること；（ｂ）疾病に対する素因に影響を及ぼすこと；又は（ｃ）疾病の少なくとも１つの症状の発症を予防又は遅延させることをはじめとする、例えばヒトなどの哺乳類における疾病の予防を指す。
「キット」とは、特定の目的のために使用され得る機能単位を一緒に構成する、２つ以上の構成要素の任意の集合を指す。例証として（且つ限定ではなく）、本開示による１つのキットは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと複合体化した又は複合体化できるガイドＲＮＡを含み得、（例えば、その中に懸濁された又は懸濁可能な）薬学的に許容可能な担体を伴う。例えば、細胞又は対象において所望のゲノムの改変を引き起こす目的で、キットを使用して、このような細胞又は対象に複合体を導入し得る。キットの構成要素は一緒に包装され得るか、又はそれらは別々に包装され得る。本開示によるキットは、例えば、本開示の方法によるキットの使用を説明する使用説明書（ＤＦＵ）も任意選択的に含む。ＤＦＵは、キットと共に物理的に包装され得るか、又はそれは、例えば、電子的手段によってキット使用者に提供され得る。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡ中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも称される）を指し、２つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、核酸などは、一本鎖若しくは二本鎖のキメラ混合物又はそれらの誘導体若しくは修飾バージョンであり得る。それらは、例えば、塩基部分、糖部分又はリン酸骨格で修飾されて、分子の安定性、そのハイブリダイゼーションパラメーターなどが改善され得る。ヌクレオチド配列は、典型的には、タンパク質及び酵素を製造するために細胞機構によって使用される情報をはじめとするが、これに限定されるものではない、遺伝情報を保有する。これらの用語は、二本鎖又は一本鎖のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成及び遺伝子操作ポリヌクレオチド並びにセンス及びアンチセンスポリヌクレオチドの両方を含む。これらの用語は、修飾塩基を含有する核酸も含む。
下記の表１に示されるように、慣用的なＩＵＰＡＣ表記法が、本明細書で提示されるヌクレオチド配列において使用される（参照により本明細書に援用されるＣｏｒｎｉｓｈ－Ｂｏｗｄｅｎ Ａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８５ Ｍａｙ １０；１３（９）：３０２１－３０も参照されたい）。しかし、配列がＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかにより、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインにおいてコードされ得る場合、「Ｔ」は「チミン又はウラシル」を示すことに留意すべきである。
Figure 2024023294000001
「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は同義的に使用され、ペプチド結合を介して共に連結するアミノ酸の連続鎖を指す。この用語は、個々のタンパク質、共に結合するタンパク質の群又は複合体並びにそのようなタンパク質の断片又は部分、変異型、誘導体及び類似体を含む。ペプチド配列は、左側のアミノ又はＮ末端から開始して、右側のカルボキシル又はＣ末端に進む、慣用的な表記法を用いて本明細書に提示される。標準的な一文字又は三文字略語が使用され得る。
「変異型」という用語は、参照実体（例えば、野生型又は天然に存在する実体）と有意な構造的同一性を示すが、例えば参照実体と比較した、ポリペプチドに関連してアミノ酸又はポリヌクレオチドに関連してヌクレオチドなど、１つ又は複数の化学的部分の存在又はレベルが参照実体と構造的に異なる、ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は小分子などの実体を指す。変異型という用語は、本明細書の用法では、このような実体に付随する１つ又は複数の特性において、参照実体よりも機能的により良い又は優れたポリペプチド、ポリヌクレオチド又は小分子などの実体も包含する。多くの実施形態では、変異型は、その参照実体と機能的にも異なる。例えば、限定することなく、「変異型Ｃｐｆ１ポリペプチド」は、Ｓ５４２Ｒ／Ｋ６０７Ｒ置換を含み、ＴＹＣＶ ＰＡＭを認識するＡｓＣｐｆ１変異型並びにＳ５４２Ｒ／Ｋ５４８Ｖ／Ｎ５５２Ｒ置換を含み、ＴＡＴＶ ＰＡＭを認識するＡｓＣｐｆ１変異型を包含する。
本明細書の用法では、「切断事象」という用語は、核酸分子の切断を指す。切断事象は、一本鎖切断事象又は二本鎖切断事象であり得る。一本鎖切断事象は、５’オーバーハング又は３’オーバーハングをもたらし得る。二本鎖切断事象は、平滑末端、２つの５’オーバーハング又は２つの３’オーバーハングをもたらし得る。
本明細書において標的核酸配列上の部位に関して使用される「切断部位」という用語は、そこで二本鎖切断が発生する、標的核酸の２つのヌクレオチド残基間の標的位置又は代わりにそこでＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ依存性プロセスによって媒介される２つの一本鎖切断が発生する、標的核酸のいくつかのヌクレオチド残基のスパン内の標的位置を指す。切断部位は、例えば、平滑型の二本鎖切断の標的位置であり得る。代わりに、切断部位は、例えば、二本鎖切断を形成し、例えば約１０塩基対によって隔てられた、２つの一本鎖切断又はニックのための、標的核酸のいくつかのヌクレオチド残基のスパン内の標的部位であり得る。二本鎖切断又は対の２つの一本鎖ニックのより近い方は、理想的には、標的位置の０～５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０又は２５ｂｐ以下）にある。デュアルニッカーゼが使用される場合、対内の２つのニックは、互いに２５～５５ｂｐ以内であり（例えば、２５～５０、２５～４５、２５～４０、２５～３５、２５～３０、５０～５５、４５～５５、４０～５５、３５～５５、３０～５５、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、３５～４５又は４０～４５ｂｐ）、互いに１００ｂｐ以上離れていない（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０又は１０ｂｐ以下）。
本開示は、標的核酸配列を編集し、且つ／又は標的核酸配列の発現を調整するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法及び構成要素を提供する。例えば、本開示は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の増殖、生存、持続性及び／又は機能に影響を与える核酸配列を標的化するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法を提供する。特定の非限定的実施形態において、本開示は、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによる、ＣＤ３４＋細胞における標的核酸配列の効率的な編集の最初の証拠を提供する。さらに、本開示は、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによる、胎児型ヘモグロビン（本明細書では「ＨＰＦＨ」と称される）の遺伝性持続性に関連する遺伝子である、ＢＣＬ１１ａ及びＨＢＧ１の効率的な編集の最初の証拠を提供する。本開示は、Ｔ細胞の増殖、生存、持続性及び／又は機能に影響を及ぼす核酸配列を標的化するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法も提供する。本開示は、有意な編集効率を示し且つ改善された特性を示す修飾Ｃｐｆ１タンパク質と、このような修飾Ｃｐｆ１タンパク質の効率を評価するためのストラテジーとをさらに提供する。
修飾Ｃｐｆ１タンパク質
一態様では、本開示は、修飾Ｃｐｆ１タンパク質と、標的核酸配列を編集し、且つ／又は標的核酸配列の発現を調整するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法におけるそれらの使用とに関する。
特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種株ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１タンパク質（ＡｓＣｐｆ１）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７（ＭｂＣｐｆ１）、カンジダツス・メタノメチルフィルス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｐｈｉｌｕｓ）ａｌｖｕｓ Ｍｘ１２０１（ＣＭａＣｐｆ１）、スネアチア・アムニイ（Ｓｎｅａｔｈｉａ ａｍｎｉｉ）（ＳａＣｐｆｑ）、モラクセラ・ラクナータ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｌａｃｕｎａｔａ）（ＭｌＣｐｆ１）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）ＡＡＸ０８＿００２０５（Ｍｂ２Ｃｐｆ１）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）ＡＡＸ１１＿００２０５（Ｍｂ３Ｃｐｆ１）、ラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１タンパク質（ＬｂＣｐｆ１）、ラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０（Ｌｂ５Ｃｐｆ１）、ラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７（Ｌｂ４Ｃｐｆ１）、フラボバクテリウム・ブランキオフィルム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＦＬ－１５（ＦｂＣｐｆ１）、チオミクロスピラ属（Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ）種ＸＳ５（ＴｓＣｐｆ１）、パルキュバクテリア（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ）群菌ＧＷ２０１１（ＰｇＣｐｆ１）、カンジダツス・ロイズマンバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｒｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａ）菌ＧＷ２０１１（ＣＲｂＣｐｆ１）、カンジダツス・ペレグリンバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｅｒｅｇｒｉｎｂａｃｔｅｒｉａ）菌ＧＷ２０１１（ＣＰｂＣｐｆ１）、ブチリビブリオ属（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）種ＮＣ３００５（ＢｓＣｐｆ１）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）（ＢｆＣｐｆ１）、プレボテラ・ブライアンチイ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｒｙａｎｔｉｉ）Ｂ１４（Ｐｂ２Ｃｐｆ１）及びバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）口腔分類群２７４（ＢｏＣｐｆ１）からなる群から選択されるＣｐｆ１タンパク質に由来する（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＺｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ １３４０１５；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１３４０１５を参照されたい）。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、それぞれ配列番号２０～２２のコドン最適化核酸配列を有する、配列番号１７～１９からなる群から選択される配列を含む。
Ｃｐｆ１核局在化シグナル（ＮＬＳ）変異型
特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（本明細書では「Ｃｐｆ１ＮＬＳ変異型」とも称される）を含む。例えば、限定されるものではないが、本明細書で開示される方法及び組成物に関連して有用なＮＬＳ配列は、細胞核へのタンパク質移入を促進できるアミノ酸配列を含むであろう。本明細書で開示される方法及び組成物に関連して有用なＮＬＳ配列は、当該技術分野で公知である。このようなＮＬＳ配列の非限定的例としては、アミノ酸配列：ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１）を有するヌクレオプラスミンＮＬＳ及びアミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２）を有するシミアンウイルス４０「ＳＶ４０」ＮＬＳが挙げられる。
特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、例えば、２つ以上、３つ以上又は４つ以上などの１つ又は複数のＮＬＳ配列を有し得る。例えば、限定されるものではないが、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、２つのＮＬＳ配列、３つのＮＬＳ配列又は４つのＮＬＳ配列を有し得る。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、２つのＮＬＳ配列を有し得る。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質のＮＬＳ配列は、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＣ末端又はその近傍に配置される。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質のＮＬＳ配列は、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＮ末端又はその近傍に配置される。特定の実施形態では、本開示の修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＮ末端又はその近傍に位置する１つ又は複数のＮＬＳ配列及びＣｐｆ１タンパク質配列のＣ末端又はその近傍に位置する１つ又は複数のＮＬＳ配列を有し得、例えば、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＮ末端及びＣ末端の両方又はその近傍に位置するＮＬＳ配列を含む。
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＣ末端又はその近傍に位置するＮＬＳ配列を有する修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｈｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｎＮＬＳ（本明細書では「Ａｓｐ Ｃｐｆ１ ＮＬＳ ｖ１」とも称される）（配列番号３）；Ｈｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ（配列番号４）；及びＨｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ（本明細書では「Ａｓｐ Ｃｐｆ１ ＮＬＳ ｖ２」とも称される）（配列番号５）（式中、「Ｈｉｓ」は、６－ヒスチジン精製配列を指し、「ＡｓＣｐｆ１」は、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種Ｃｐｆ１タンパク質配列を指し、「ｎＮＬＳ」は、ヌクレオプラスミンＮＬＳを指し、「ｓＮＬＳ」は、ＳＶ４０ ＮＬＳを指す）から選択され得る。例えば、２つ以上のｎＮＬＳ配列の付加又はｎＮＬＳ及びｓＮＬＳ配列の組み合わせ（又は他のＮＬＳ配列）の付加並びに例えば６－ヒスチジン配列などの精製配列を含む又は含まない配列の付加などのＮＬＳ配列の同一性及びＣ末端位置の追加的な順列は、現在開示されている主題の範囲内である。
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＮ末端又はその近傍に位置するＮＬＳ配列を有する修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｈｉｓ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１（配列番号６）、Ｈｉｓ－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１（配列番号７）及びｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１（配列番号８）から選択され得る。例えば、２つ以上のｎＮＬＳ配列の付加又はｎＮＬＳ及びｓＮＬＳ配列の組み合わせ（又は他のＮＬＳ配列）の付加並びに例えば６－ヒスチジン配列などの精製配列を含む又は含まない配列の付加などのＮＬＳ配列の同一性及びＮ末端位置の追加的な順列は、現在開示されている主題の範囲内である。
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＮ末端及びＣ末端の両方又はその近傍に位置するＮＬＳ配列を有する修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｈｉｓ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ（配列番号９）及びＨｉｓ－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ（配列番号１０）から選択され得る。例えば、２つ以上のｎＮＬＳ配列又はｎＮＬＳ及びｓＮＬＳ配列の組み合わせ（又は他のＮＬＳ配列）のＮ末端／Ｃ末端位置いずれかへの付加並びに例えば６－ヒスチジン配列などの精製配列を含む又は含まない配列の付加などのＮＬＳ配列の同一性及びＮ末端／Ｃ末端位置の追加的な順列は、現在開示されている主題の範囲内である。
ＣＤ３４＋細胞及びＴ細胞における編集に有利なＮＬＳ修飾などのＣｐｆ１タンパク質修飾を判定するために、異なる位置とタイプのＮＬＳ配列を含有するＡｓＣｐｆ１タンパク質が合成された。タンパク質変異型は、ｇＲＮＡを標的とする一致部位５に複合体化され、ＣＤ３４＋細胞、Ｔ細胞及びＨＵＤＥＰ（４．４μＭのＲＮＰ）内に電気穿孔された。図４では、各細胞型の最大編集を提示する変異型に正規化された％編集として結果が描写される。データは、ヌクレアーゼの異なる種がＣＤ３４＋細胞及びＴ細胞（他の細胞の中で特に）の同一標的部位で様々な活性を有すること、並びにＡｓＣｐｆ１による効率的な編集がＣＤ３４＋細胞及びＴ細胞（他の細胞の中で特に）で達成できることを示す。
システイン修飾Ｃｐｆ１タンパク質及びＲＮＰ
ジスルフィド結合形成は、タンパク質凝集を促進することが知られている。したがって、このようなジスルフィド結合形成の可能性を低減するために改変させ得るシステインを同定する努力の一環として、Ｃｐｆ１結晶構造及び既知のＣｐｆ１一次アミノ酸配列が分析された（図１３）。
本開示の修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質配列の１つ又は複数のシステイン残基における改変（例えば、欠失又は置換）を含み得る。このような修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、凝集の減少を示し、これは、タンパク質の製造を拡大するときに特に有用である。例えば、限定されるものではないが、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ６５、Ｃ２０５、Ｃ３３４、Ｃ３７９、Ｃ６０８、Ｃ６７４、Ｃ１０２５及びＣ１２４８からなる群から選択される、例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上又は８つの位置などの１つ又は複数の位置に改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、セリン又はアラニンの１つ又は複数のシステイン残基の置換を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、例えば、Ｃ６５Ｓ、Ｃ２０５Ｓ、Ｃ３３４Ｓ、Ｃ３７９Ｓ、Ｃ６０８Ｓ、Ｃ６７４Ｓ、Ｃ１０２５Ｓ及びＣ１２４８Ｓからなる群から選択される置換などの１つ又は複数の改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ６５Ａ、Ｃ２０５Ａ、Ｃ３３４Ａ、Ｃ３７９Ａ、Ｃ６０８Ａ、Ｃ６７４Ａ、Ｃ１０２５Ａ及びＣ１２４８Ａからなる群から選択される１つ又は複数の改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、位置Ｃ３３４及びＣ６７４又はＣ３３４、Ｃ３７９及びＣ６７４に改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ３３４Ｓ及びＣ６７４Ｓ又はＣ３３４Ｓ、Ｃ３７９Ｓ及びＣ６７４Ｓに改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ３３４Ａ及びＣ６７４Ａ又はＣ３３４Ａ、Ｃ３７９Ａ及びＣ６７４Ａに改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、例えば、本明細書に記載されるようなＨｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｎＮＬＳ Ｃｙｓ－ｌｅｓｓ（配列番号１１）又はＨｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｎＮＬＳ Ｃｙｓ－ｌｏｗ（配列番号１２）などの１つ又は複数のシステイン残基改変並びに１つ又は複数のＮＬＳ配列の導入の両方を含む。
異常ヘモグロビン症に関連した標的部位におけるＣＤ３４＋ＨＳＣのＣｐｆ１編集
本開示は、例えば、βサラセミア及び鎌状赤血球症などの異常ヘモグロビン症治療するために標的核酸配列を編集するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法をさらに提供する。例えば、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法は、胎児型ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現を調節するＣＤ３４＋細胞における１つ又は複数の遺伝子の破壊をもたらす。
異常ヘモグロビン症を治療するための１つの治療ストラテジーは、ＨｂＦの発現の増加を伴う。ＨｂＦ発現は、転写リプレッサーＢＣＬ１１ａの赤血球系細胞特異的発現の標的化された破壊を介して誘導され得る（Ｃａｎｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５２７（１２）：１９２－１９７）。ＨｂＦ発現を増加させる１つのストラテジーは、遺伝子編集を用いてＢＣＬ１１ａ発現を妨害することである。例えば、限定されるものではないが、例えば、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼなどのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＢＣＬ１１ａ遺伝子の発現に影響を与える特定の標的配列を標的とし得る。特定の実施形態では、ＢＣＬ１１ａ遺伝子の任意の領域が標的化され得る。
本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子に修飾を含む細胞又は細胞集団を提供し、例えばＢＣＬ１１ａ発現を妨害、ノックダウン又はノックアウトする。例えば、限定されるものではないが、細胞又は細胞集団は、例えば、ＢＣＬ１１ａ遺伝子配列を標的とするＲＮＰ複合体など、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ分子を含む複合体の送達によって生成され得る。特定の実施形態では、細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％が修飾される。特定の実施形態では、細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％は、生産的インデルを有する。
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２を標的とし得る。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域にあるＢＣＬ１１ａの赤血球特異的エンハンサーのＧＡＴＡ１結合モチーフを破壊するように標的化されるであろう。ＢＣＬ１１ａを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムで使用するための例示的なｇＲＮＡ分子は、図７、１０及び１２で特定される。
特定の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子が破壊されている細胞に関する。特定の実施形態では、例えば、転写開始部位（ＴＳＳ）から＋５５ｋｂ～＋６２ｋｂの赤血球エンハンサー領域など、ＢＣＬ１１ａ遺伝子の赤血球エンハンサー領域が標的化され得る。例えば、限定されるものではないが、本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域が破壊されている細胞に関する。特定の実施形態では、このような細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含み得る。特定の実施形態では、本開示は、例えば、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域が破壊されているなどのＢＣＬ１１ａ遺伝子が破壊されている細胞集団に関する。特定の実施形態では、このような細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む細胞を含む。特定の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のＧＡＴＡ１モチーフが破壊されている細胞に関する。特定の実施形態では、このような細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含み得る。特定の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のＧＡＴＡ１モチーフが破壊されている細胞集団に関する。特定の実施形態では、このような細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む細胞を含み得る。
以下の実施例３で概説されるように、ＡｓＣｐｆ１は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域内の標的部位の編集を問題なく媒介した。最初に、異なるＰＡＭを有するいくつかのＡｓＣｐｆ１変異型ガイドＲＮＡ（図１）がＨＵＤＥＰ２細胞でスクリーニングされ、次に最も効率的なガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼ変異型がｍＰＢ ＣＤ３４＋細胞内で試験された（図１７）。特に、図１７は、ＨＵＤＥＰ及びＨＳＣにおける１つのＷＴ ＦｎＣｐｆ１標的と共に、ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ及びＲＲ及びＲＶＲ ＰＡＭ変異型によるＢＣＬ１１ａエンハンサー領域のスクリーニングを示す。
例えば、βサラセミア及び鎌状赤血球症などの異常ヘモグロビン症の治療に関連して、胎児型ヘモグロビンの発現を誘導する別のストラテジーは、ＨＢＧ遺伝子座の発現、特にＨＧＢ１及び／又はＨＧＢ２の発現を妨害することである。
特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧ遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集の使用に関する。特定の実施形態では、ＨＢＧ遺伝子座の任意の領域が標的化され得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集を用いて、ＨＢＧ遺伝子座の非コード領域が破壊され得る（例えば、表１８を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集を用いて、ＨＢＧ遺伝子座のイントロンが破壊され得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集を用いて、標的化されるＨＢＧ遺伝子のシス調節領域が破壊され得る。例えば、限定されるものではないが、シス調節領域は、プロモーター及び／又はエンハンサーを含み得る。特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧ遺伝子座のプロモーター領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集の使用に関する。特定の実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集を用いて、ＨＢＧ遺伝子座のプロモーター領域の－８００～－６０ｎｔの領域が破壊され得る。例えば、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集を用いて、ＨＢＧプロモーター領域の－１１０ｎｔプロモーター領域及び／又はＨＢＧプロモーター領域内に存在するＣＡＡＴボックスが破壊され得る。一般に、ＨＢＧプロモーター領域の破壊及びＣＡＡＴボックスの破壊は、これらの配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの送達を介して達成され得る。ＨＢＧ遺伝子座のこれらの配列を標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムで使用するための例示的なｇＲＮＡ分子は、図６、９及び１１並びに表１９に特定される。ＨＢＧ遺伝子座を破壊するために標的化され得る染色体の領域（例えば、ゲノム座標）は、表１８で提供される。特定の実施形態では、ＨＢＧ１遺伝子座を破壊するのに使用されるｇＲＮＡ分子は、ＨＢＧ１－１である。
本開示は、ＨＢＧ遺伝子座に修飾を含む細胞又は細胞集団を提供し、例えばＨＢＧ発現を妨害、ノックダウン又はノックアウトする。例えば、限定されるものではないが、細胞又は細胞集団は、例えば、ＨＢＧ遺伝子座を標的とするＲＮＰ複合体など、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ分子を含む複合体の送達によって生成され得る。特定の実施形態では、細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％が修飾される。特定の実施形態では、細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％は、生産的インデルを有する。
特定の実施形態では、本開示は、例えば、ＨＢＧ遺伝子座が破壊されているＣＤ３４＋造血幹及び前駆細胞などの細胞に関する。例えば、限定されるものではないが、本開示は、ＨＢＧ遺伝子座のプロモーター領域が破壊されている細胞に関する。特定の実施形態では、ＨＢＧ遺伝子座の－１１０ｎｔプロモーター領域が破壊される。特定の実施形態では、このような細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含み得る。特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧ遺伝子座の－１１０ｎｔプロモーター領域が破壊されている細胞集団に関する。特定の実施形態では、このような細胞集団は、このような構成要素を検出する適切な方法を使用した判定でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む細胞を含み得る。特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧプロモーター領域に存在するＣＡＡＴボックスが破壊されている細胞に関する。特定の実施形態では、このような細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧプロモーター領域に存在するＣＡＡＴボックスが破壊されている細胞集団に関する。特定の実施形態では、このような細胞集団は、このような構成要素を検出する適切な方法を使用した判定でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む細胞を含み得る。特定の実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡ ＨＢＧ１－１を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの使用によってＨＢＧ１遺伝子座が破壊されている細胞集団を提供する。
特定の実施形態では、ＨＢＧ遺伝子座又はＢＣＬ１１ａ遺伝子に修飾を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団は、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの構成要素を検知する適切な方法を使用した判定で１つ又は複数の構成要素を含まない。特定の実施形態では、このような構成要素を検知する適切な方法を使用した判定で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満の細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象に投与されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団を提供し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満の細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。
特定の実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムによる細胞内のＢＣＬ１１ａ遺伝子又はＨＢＧ遺伝子の破壊は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子又はＨＢＧ遺伝子の破壊がない細胞と比較して細胞における胎児型ヘモグロビンの発現の増加をもたらし得る。例えば、限定されるものではないが、ＢＣＬ１１ａ遺伝子又はＨＢＧ遺伝子座及び／又は遺伝子の破壊がない細胞における胎児型ヘモグロビンの発現レベルと比較して、胎児型ヘモグロビンの発現は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％増加され得る。
特定の実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムによる細胞におけるＢＣＬ１１ａ遺伝子又はＨＢＧ遺伝子の破壊は、例えば、鎌状赤血球症又はβサラセミアなどの異常ヘモグロビン症の症状を部分的に又は完全に緩和するのに適した量で胎児型ヘモグロビンの発現の増加をもたらし得る。例えば、限定されるものではないが、胎児型ヘモグロビンの発現の増加は、約１ピコグラム（ｐｇ）を超え、約２ｐｇを超え、約３ｐｇを超え、約４ｐｇを超え、約５ｐｇを超え、約６ｐｇを超え、約７ｐｇを超え、約８ｐｇを超え、約９ｐｇを超え、約１０ｐｇを超え、約１１ｐｇを超え、約１２ｐｇを超え、約１３ｐｇを超え、約１４ｐｇを超え、又は約１５ｐｇを超え得る。
特定の実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムによる細胞におけるＢＣＬ１１ａ遺伝子又はＨＢＧ遺伝子の破壊は、１細胞当たり少なくとも約１ピコグラム、少なくとも約２ピコグラム、少なくとも約３ピコグラム、少なくとも約４ピコグラム、少なくとも約５ピコグラム、少なくとも約６ピコグラム、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム又は約８～約９ピコグラム若しくは約９～約１０ピコグラムの胎児型ヘモグロビンの産生をもたらし得る。
本開示は、ゲノム編集システムによって修飾されていない細胞集団と比較してより高い百分率の細胞集団が、ＨｂＦを発現する赤血球系統の細胞集団に分化できる、上記のゲノム編集システムによって修飾された細胞集団にも関する。特定の実施形態では、より高い百分率は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％又は少なくとも約４０％高いことができる。特定の実施形態では、細胞は、造血幹細胞であり得る。特定の実施形態では、細胞は、赤芽球、赤血球又は赤血球前駆体又は赤芽球に分化でき得る。
特定の実施形態では、例えば、ＨｂＦの相対的発現レベル（例えば、β様グロビン鎖全体に対する）などの発現レベルは、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）によって測定され得る。
様々なストラテジーを用いて、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムが細胞に送達され得る。例えば、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの構成要素をコードする、例えばＡＡＶ又は他のウイルスベクターなどのベクターを使用して、細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの構成要素の発現が誘導され得る。代わりに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの構成要素を含むＲＮＰ複合体は、例えば、電気穿孔を通じて細胞に導入され得る。特定の実施形態では、ＲＮＰ複合体は、脂質ナノ粒子によって細胞に送達され得る。
以下の実施例３で概説されるように、図１６は、ＨＵＤＥＰ及びＨＳＣにおける、ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ及びＲＲ ＰＡＭ変異型によるＨＢＧ１プロモーター領域の成功裏の標的化を示す。
合わせて、ＢＣＬ１１ａ遺伝子及びＨＢＧ遺伝子座の破壊に関するこれらのデータは、臨床的に関連する遺伝子座（すなわち既知のＨＰＦＨ標的部位）のＣＤ３４＋細胞における、ＡｓＣｐｆ１変異型による効率的な編集を示す。
Ｔ細胞の増殖、生存及び／又は機能に関連する標的部位におけるＴ細胞のＣｐｆ１編集
がんを治療するために提案された１つの治療ストラテジーは、養子Ｔ細胞移入を伴う。遺伝子改変されたＴ細胞のがん治療薬としての有効性を制限する要因としては、（１）例えば、養子免疫伝達に続くＴ細胞の限定的増殖などのＴ細胞増殖；（２）例えば、腫瘍環境内因子によるＴ細胞アポトーシス誘導などのＴ細胞生存；及び（３）例えば、宿主免疫細胞及びがん細胞によって分泌される阻害因子による、細胞毒性Ｔ細胞機能の阻害などのＴ細胞機能が挙げられる。有効性を高める１つのストラテジーは、遺伝子編集を用いて、Ｔ細胞の増殖、生存及び／又は機能に関連するＴ細胞遺伝子を修飾又は破壊することである。例えば、限定されるものではないが、例えば、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼなどのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｔ細胞遺伝子の発現に影響を与える特定の配列を標的とし得る。
本開示に包含される方法及び組成物を使用して、例えばＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子の１つ又は複数などの１つ又は複数のＴ細胞発現遺伝子を改変することにより、Ｔ細胞の増殖、生存、持続性及び／又は機能に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法及び組成物を使用して、例えばＣＢＬＢ及び／又はＰＴＰＮ６遺伝子などの１つ又は複数のＴ細胞発現遺伝子を修飾することにより、Ｔ細胞増殖に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法及び組成物を使用して、例えばＦＡＳ及び／又はＢＩＤ遺伝子などの１つ又は複数のＴ細胞発現遺伝子を修飾することにより、Ｔ細胞の生存に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法及び組成物を使用して、例えばＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ遺伝子などの１つ又は複数のＴ細胞発現遺伝子を修飾することにより、Ｔ細胞機能に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法及び組成物を使用して、Ｂ２Ｍ遺伝子を修飾することによってＴ細胞の持続性が改善され得る。
特定の実施形態では、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子をはじめとするが、これに限定されるものではない１つ又は複数のＴ細胞発現遺伝子は、標的化ノックアウトとして独立して標的化され、例えばＴ細胞の増殖、生存、持続性及び／又は機能に影響を及ぼす。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、１つのＴ細胞発現遺伝子（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される１つ）をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、２つのＴ細胞発現遺伝子（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される２つ）を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される３つなどの３つのＴ細胞発現遺伝子を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される４つなどの４つのＴ細胞発現遺伝子を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される５つなどの５つのＴ細胞発現遺伝子を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される６つなどの６つのＴ細胞発現遺伝子を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される７つなどの７つのＴ細胞発現遺伝子を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子から選択される８つのＴ細胞発現遺伝子を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子から選択される９つのＴ細胞発現遺伝子を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子など、９つのＴ細胞発現遺伝子を独立してノックアウトすることを含む。
上に記載される遺伝子に加えて、遺伝子操作Ｔ細胞の有効性に影響を及ぼすために、いくつかの他のＴ細胞発現遺伝子が標的化され得る。これらの遺伝子としては、ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ及びＴＧＦＢＲＩＩＩが挙げられるが、これに限定されるものではない（Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ １３，５２５－５４１）。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法を使用して、ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ及びＴＧＦＢＲＩＩＩ遺伝子の１つ又は複数が個々に又は組み合わせてのいずれかで修飾され得る。特定の実施形態では、本明細書で開示された方法を使用して、ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ及びＴＧＦＢＲＩＩＩ遺伝子の１つ又は複数が個々に又は上記の８つの遺伝子（すなわちＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子）のいずれか１つ又は複数との組み合わせてのいずれかで修飾され得る。
特定の実施形態では、本明細書で開示される方法及び組成物は、例えば、非コード領域（例えば、プロモーター領域又は調節領域）内の位置又はコード領域内の位置などの遺伝子の位置（例えば、ノックアウト位置）を標的とすることにより、又は例えばイントロンの配列又はエクソンの配列などの遺伝子の転写配列を標的とすることにより、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ遺伝子を修飾する。特定の実施形態では、コード配列、例えばコード領域、例えば遺伝子の初期コード領域（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ遺伝子）は、発現の修飾及びノックアウトの標的になる。特定の実施形態では、Ｔ細胞発現遺伝子の非コード領域内の位置（例えば、プロモーター領域又は調節領域）（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ遺伝子）は、Ｔ細胞発現遺伝子の発現の修飾及びノックアウトの標的になる。
特定の実施形態では、本明細書で開示される方法及び組成物は、遺伝子のコード配列を標的とすることにより、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ遺伝子を修飾する。特定の実施形態では、コード配列は、初期コード配列である。特定の実施形態では、遺伝子のコード配列は、Ｔ細胞発現遺伝子の発現のノックアウトを標的とする。
特定の実施形態では、本明細書で開示される方法及び組成物は、遺伝子の非コード配列を標的とすることにより、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ遺伝子を修飾する。特定の実施形態では、非コード配列は、プロモーター領域内の配列、エンハンサー配列、イントロン配列、３’ＵＴＲ内の配列、ポリアデニル化シグナル配列又はそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、遺伝子の非コード配列は、遺伝子の発現のノックアウトの標的になる。
特定の実施形態では、現在開示される方法は、例えば、遺伝子の修飾を誘導することにより、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ遺伝子の１つ又は２つの対立遺伝子をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、修飾は、挿入、欠失、変異又はそれらの組み合わせを含む。
特定の実施形態では、標的化ノックアウトアプローチは、Ｃｐｆ１酵素を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを使用して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって媒介される。
特定の実施形態では、本明細書で開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、ＴＲＡＣ遺伝子のコード配列内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、エクソン内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、イントロン内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、遺伝子の調節領域内にある。特定の実施形態では、２つ以上の配列が標的化され、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン、１つ若しくは複数の調節領域又は１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン及び１つ若しくは複数の調節領域内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部は、ＴＲＡＣ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、表２及び３に列挙される標的化ドメイン配列を含む。本開示は、表２及び３で提供されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含む組成物を提供する。本開示は、表２及び３で提供されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含む１つ又は複数のＲＮＰ複合体を含む組成物をさらに提供する。
特定の実施形態では、本明細書で開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＴＲＢＣ遺伝子を標的とする。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＲＢＣ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、ＴＲＢＣ遺伝子のコード配列内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、エクソン内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、イントロン内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、遺伝子の調節領域内にある。特定の実施形態では、２つ以上の配列が標的化され、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン、１つ若しくは複数の調節領域又は１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン及び１つ若しくは複数の調節領域内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部は、ＴＲＢＣ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、表４及び５に列挙される標的化ドメイン配列を含む。本開示は、表４及び５で提供されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含む組成物を提供する。本開示は、表４及び５で提供されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含む１つ又は複数のＲＮＰ複合体を含む組成物をさらに提供する。
特定の実施形態では、本明細書で開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、エクソン内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、イントロン内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、遺伝子の調節領域内にある。特定の実施形態では、２つ以上の配列が標的化され、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン、１つ若しくは複数の調節領域又は１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン及び１つ若しくは複数の調節領域内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列の５０１番目のヌクレオチドと最後のヌクレオチドとの間にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、表６、７及び８に列挙される標的化ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、ＡＧＵＧＧＧＧＧＵＧＡＡＵＵＣＡＧＵＧＵを含む。本開示は、表６、７及び８で提供されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含む組成物を提供する。本開示は、表６、７及び８で提供されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含む１つ又は複数のＲＮＰ複合体を含む組成物をさらに提供する。
特定の実施形態では、本明細書で開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＩＩＴＡ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のコード配列内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、エクソン内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、イントロン内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、遺伝子の調節領域内にある。特定の実施形態では、２つ以上の配列が標的化され、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン、１つ若しくは複数の調節領域又は１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン及び１つ若しくは複数の調節領域内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、表９に列挙される標的化ドメイン配列を含む。本開示は、表９で提供されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含む組成物を提供する。本開示は、表９で提供されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含む１つ又は複数のＲＮＰ複合体を含む組成物をさらに提供する。
Figure 2024023294000002
Figure 2024023294000003
Figure 2024023294000004
Figure 2024023294000005
Figure 2024023294000006
Figure 2024023294000007
Figure 2024023294000008
Figure 2024023294000009
Figure 2024023294000010
Figure 2024023294000011
Figure 2024023294000012
Figure 2024023294000013
Figure 2024023294000014
Figure 2024023294000015
Figure 2024023294000016
Figure 2024023294000017
Figure 2024023294000018
Figure 2024023294000019
Figure 2024023294000020
Figure 2024023294000021
Figure 2024023294000022
Figure 2024023294000023
Figure 2024023294000024
Figure 2024023294000025
Figure 2024023294000026
ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣのノックアウト及び／又はノックダウンは、限定することなく、がん及び例えば自己免疫障害などの非がん疾患を治療するための養子免疫療法に関連するものをはじめとする様々な状況において有用であり得る。本開示の特定の実施形態によれば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣは、治療で使用されるＴ細胞などの免疫細胞においてノックアウトされる。非限定的な一例として、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）などの操作された受容体を発現し得、その受容体は、腫瘍細胞などの病理に関与するとされる、細胞又は組織上の抗原を認識するように構成され得る。それらが操作された受容体を発現するかどうかにかかわらず、本開示によるＴＣＲ、ＭＨＣ Ｉ及び／又はＭＨＣ ＩＩノックアウトＴ細胞を用いて、その中でＧｖＨ又はＨｖＧ応答が安全性又は有効性の懸念を提示することもある組織又は器官が標的化され得る。
ＴＣＲ、ＭＨＣ Ｉ及び／又はＭＨＣ ＩＩノックアウト及び／又はノックダウン細胞は、「同種異系」細胞療法で用いられ得、その中で細胞が対象から採取され、修飾されて、例えばＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ発現の妨害など、ノックアウト又はノックダウンされ、次に異なる対象に戻され得る。いずれのアプローチでも、採取と投与との間において、本開示のＴＣＲ、ＭＨＣ Ｉ及び／又はＭＨＣ ＩＩノックアウト及び／又はノックダウン細胞は、増殖、刺激、精製又は選別、導入遺伝子による形質導入、凍結及び／又は解凍などの様々な方法で操作され得る。
本明細書に記載されるようなＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト又はノックダウンすることは、（１）ＧｖＨ応答を防げ；（２）ＨｖＧ応答を防げ；及び／又は（３）Ｔ細胞の安全性及び有効性を改善し得る。本明細書に記載されるようなＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣタンパク質の発現をノックダウンすることは、同様に、（１）ＧｖＨ応答を防げ；（２）ＨｖＧ応答を防げ；及び／又は（３）Ｔ細胞の安全性及び有効性を改善し得る。
特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞において、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子を独立してノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞において、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される２つの遺伝子を独立してノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞において、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される３つの遺伝子を独立してノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞において、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣの全ての４つの遺伝子を独立してノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。
特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＢ２Ｍ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＴＲＡＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＢ２Ｍ及びＴＲＡＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＢ２Ｍ及びＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＴＲＡＣ及びＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ及びＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。
特定の実施形態では、Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子、２つ以上の遺伝子、３つ以上の遺伝子又は４つ以上の遺伝子のノックアウト及び／又はノックダウンは、（１）ＧｖＨ応答を防止し；（２）ＨｖＧ応答を防止し；及び／又は（３）Ｔ細胞の安全性及び有効性を改善し得る。例えば、限定されるものではないが、Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子のノックアウト及び／又はノックダウンを使用して、例えば同種異系Ｔ細胞などの「同種異系」細胞が生成され得る。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子のノックアウト及び／又はノックダウンは、「同種異系」細胞療法で用いられ得、その中で細胞が対象から採取され、修飾されて、例えばＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ発現の妨害など、ノックアウト又はノックダウンされ、次に異なる対象に戻される。
特定の実施形態では、Ｔ細胞における、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子、２つ以上の遺伝子、３つ以上の遺伝子又は４つ以上の遺伝子ノックアウト及び／又はノックダウンは、修飾されていないＴ細胞と比較して、Ｔ細胞におけるＭＨＣ ＩＩ受容体発現の減少をもたらす。特定の実施形態では、修飾されて、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子がノックアウト及び／又はノックダウンされている細胞集団は、修飾されていない細胞集団におけるＭＨＣ ＩＩ受容体、ＴＣＲ又はＢ２Ｍ発現の量と比較して、ＭＨＣ ＩＩ受容体、ＴＣＲ又はＢ２Ｍの発現の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％の減少を示す。
特定の実施形態では、２つ以上の遺伝子のノックアウト及び／又はノックダウンは、各標的遺伝子の編集のための異なるヌクレアーゼの使用を伴い得る。例えば、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムを使用して、１つの標的遺伝子がノックアウト及び／又はノックダウンされ得、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集システムを使用して、第２の標的遺伝子がノックアウト及び／又はノックダウンされ得る。
本開示は、本明細書で開示されるＴ細胞の１つ又は複数の内因性遺伝子に１つ又は複数の修飾を含む単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団を提供する。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。代わりに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含まない。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満の細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ８＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ８＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞、ＴＨ１７ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ１ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ２ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ９ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞である。
特定の実施形態では、本開示は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、Ｔ細胞の内因性遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集の使用に関する。例えば、限定されるものではないが、修飾は、例えば、ＦＡＳ遺伝子配列の一部、ＢＩＤ遺伝子配列の一部、ＣＴＬＡ４遺伝子配列の一部、ＰＤＣＤ１遺伝子配列の一部、ＣＢＬＢ遺伝子配列の一部、ＰＴＰＮ６遺伝子配列の一部、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部又はそれらの組み合わせを標的とする、例えばＲＮＰ複合体などのＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ分子を含む１つ又は複数の複合体の送達によって生成される。特定の実施形態では、例えば、ＲＮＰ複合体などの２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上又は１０の複合体が送達され得、複合体のそれぞれは、異なる遺伝子を標的とする。特定の実施形態では、Ｔ細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％が編集及び／又は修飾される。特定の実施形態では、Ｔ細胞集団の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される少なくとも１つの内因性Ｔ細胞遺伝子に生産的インデルを有する。
Ｃｐｆ１変異型、異なる細胞型及び調合物についてのベンチマーキングアッセイ
標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整は、例えば、「一致部位」標的核酸配列などの標的核酸配列に関して、対照ＣＲＩＳＰＲ／ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ編集システムと、試験ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの活性とを比較することによって評価され得る。
一致部位標的核酸配列は、Ｃｐｆ１と、例えばＣａｓ９などの第２のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとによって編集されるという要件の両方を組み込んでいる。例えば、ＴＴＴＶ ＡｓＣｐｆ１野生型プロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）及びＮＧＧＳｐＣａｓ９野生型ＰＡＭが本例で用いられ得る。上述したように、試験Ｃｐｆ１タンパク質は、野生型Ｃｐｆ１タンパク質と比較して１つ又は複数の修飾を含み得る。このような修飾の例としては、１つ又は複数のＮＬＳ配列を組み込むための前述の修飾、６－ヒスチジン精製配列を組み込むための前述の修飾及びＣｐｆ１タンパク質システインアミノ酸の改変並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本例で用いられ得る例示的な一致部位標的核酸配列としては、一致部位１（「ＭＳ１」；配列番号１３）、一致部位５（「ＭＳ５」；配列番号１４）、一致部位１１（「ＭＳ１１」；配列番号１５）及び一致部位１８（「ＭＳ１８」；配列番号１６）が挙げられる。
例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣなどの特定の細胞型における、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介と対比して評価するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集システム、すなわちＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、一致部位標的を含む標的核酸の少なくとも一部に相補的なｇＲＮＡとを含むシステムが、例えば、ＲＮＰとして又はシステムの構成要素をコードするベクターの使用を介して、関心のある細胞型の細胞に導入される。標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整は、本明細書で開示されるように検出され得る。次に、検出された標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整は、同一の一致部位標的及び同一の細胞型に対してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムを用いた場合に検出された標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整と比較され得る。
標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介編集（又は別のＣＲＩＳＰＲベースのシステムによる編集）及び／又は標的核酸配列の発現の調整と対比して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介を比較する上記の方法は、用いられるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集システムの特定の属性の評価を可能にする。例えば、限定されるものではないが、このような方法を使用して、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整と対比してＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集が評価され、異なる製造プロセスによって調製されたＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡの活性の差異が同定され得る。このような方法は、異なる調合物に存在し、且つ異なる送達ストラテジーを用いるＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡの活性の差異も同定し得る。
特定の実施形態では、本開示は、試験ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集システムによる標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼゲノム編集システムと比較するためのアッセイに関する。より具体的には、本開示は、一致部位における編集のレベル又は効率が、遺伝子編集システムが任意の他の部位における編集においてどの程度効率的であるかの指標となるように、それに対して遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１又はその変異型と、一致部位に相補的なｇＲＮＡ）が標的化される、一致部位（例えば、一致部位５を含有する細胞）を用いるアッセイを提供する。換言すれば、遺伝子編集システムの様々な構成要素を変化させ、一致部位（例えば、一致部位５）で達成される編集のレベル又は効率を測定することにより、編集効率が評価され得る。
例えば、限定されるものではないが、試験及び対照遺伝子又はゲノム編集システムは、次の側面のいずれか１つ又は複数が異なり得る：ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの配列；例えばゲノム編集システムの構成要素の製造方法などの供給源；ゲノム編集システムの１つ又は複数の構成要素の配合；及び例えば細胞型などのゲノム編集システムが導入される細胞の同一性又は細胞の調製方法。特定の実施形態では、本明細書に記載のアッセイは、試験ゲノム編集システムの品質管理分析を可能にする。特定の実施形態では、本開示のアッセイは、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を評価し、標的は、一致部位配列を含む。
電気穿孔パルスコードスクリーニング
本開示は、標的部位におけるより高度な編集をもたらす電気穿孔パルスコードをさらに提供する。実施例に示されるように、電気穿孔パルスコードのスクリーニングは、本開示のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによる、より高度な効率編集をもたらすコードの同定を可能にする。例えば、限定されるものではないが、図１８は、一連の特定のパルスコード及び溶液を用いた、ＨＵＤＥＰにおけるＡｓＣｐｆ１のヌクレオフェクションスクリーニングを示す。同様に、図１９は、ＨＳＣにおけるＡｓＣｐｆ１の例示的ヌクレオフェクションスクリーニングを示す。特定の実施形態では、パルスコードＣＡ－１３７及びＣＡ－１３８を使用して、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによるより高効率の編集が促進され得る。例えば、限定されるものではないが、図２０及び図２３Ｃは、ＣＡ－１３７パルスコードの効率の向上を立証する。
治療方法
本開示は、開示されたゲノム編集方法使用して編集されている細胞を投与することにより、疾患及び／又は障害を治療する方法をさらに提供する。特定の実施形態では、本開示は、対象の１つ又は複数の細胞を修飾することにより、対象を治療する方法に関する。特定の実施形態では、１つ又は複数の細胞がエクスビボで修飾され、次に対象に投与される。例えば、限定されるものではないが、対象を治療するための方法は、対象からの細胞を、例えばエクスビボで、（ａ）標的核酸の標的配列に相補的なｇＲＮＡ分子；及び（ｂ）本明細書で開示されるＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼに接触させることを含み得る。特定の実施形態では、本開示は、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムによって修飾された１つ又は複数の細胞を対象に投与することを含む、対象を治療するための方法を提供する。特定の実施形態では、１つ又は複数の細胞がドナーから得られ、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを使用して遺伝子改変され、次に対象に投与される。
特定の実施形態では、本開示の方法は、例えば、同種異系Ｔ細胞を産生するために、開示されたゲノム編集方法を使用して編集されているＴ細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み得る。例えば、限定されるものではないが、本開示の方法は、編集されて、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣの発現がノックアウト又はノックダウンされている１つ又は複数のＴ細胞の投与を含み得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞は編集されて、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ発現がノックアウト又はノックダウンされている。特定の実施形態では、１つ又は複数のＴ細胞は、エクスビボで編集されており、次に対象に投与される。特定の実施形態では、１つ又は複数の細胞は、ドナーから得られる。特定の実施形態では、このようなＴ細胞を使用して、がん又は自己免疫障害を有する対象が治療され得る。特定の実施形態では、対象に投与されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団の細胞の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満がＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。
特定の実施形態では、本開示の方法は、開示されたゲノム編集方法を使用して編集されているＣＤ３４＋造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を、それを必要とする対象に投与することを含み得る。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、編集されて、ＢＣＬ１１ａ又はＨＢＧ発現がノックアウト又はノックダウンされ得る。例えば、限定されるものではないが、本明細書で開示されるゲノム編集方法を使用して編集されているＣＤ３４＋造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、それを必要とする対象における異常ヘモグロビン症の治療のために使用され得る。特定の実施形態では、異常ヘモグロビン症は、重篤な鎌状赤血球症（ＳＣＤ）又はβサラセミア、δサラセミア又はβ／δ－サラセミアなどのサラセミアであり得る。特定の実施形態では、異常ヘモグロビン症の治療の例示的プロトコルは、それを必要とする対象からＣＤ３４＋ＨＳＰＣ採取すること、本明細書で開示されるゲノム編集方法を使用して自己由来ＣＤ３４＋ＨＳＰＣをエクスビボで編集すること、それに続いて、編集された自己由来ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを対象に再輸液することを含み得る。特定の実施形態では、編集された自己由来ＣＤ３４＋ＨＳＰＣによる治療は、ＨｂＦ誘導の増加をもたらし得る。
特定の実施形態では、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの採取前に、対象は、適用可能な場合にはヒドロキシ尿素による治療を中止し、十分なヘモグロビン（Ｈｂ）レベルを維持するために輸血を受け得る。特定の実施形態では、骨髄から末梢血中にＣＤ３４＋ＨＳＰＣを動員するために、対象にプレリキサホル（例えば、０．２４ｍｇ／ｋｇ）が静脈内投与され得る。特定の実施形態では、対象は、１回又は複数回の白血球アフェレーシスサイクルを受け得る（例えば、サイクル間がおよそ１ヶ月間で、１サイクルは、連日実施される２回のプレリキサホル動員白血球アフェレーシス採取として定義される）。特定の実施形態では、対象に実施される白血球アフェレーシスサイクルの回数は、バックアップ保存のための未編集の自己由来ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ／ｋｇの用量と共に、対象に再輸液するための（例えば、≧１．５×１０６細胞／ｋｇ）、編集された自己由来ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの用量（例えば、≧２×１０６細胞／ｋｇ、≧３×１０６細胞／ｋｇ、≧４×１０６細胞／ｋｇ、≧５×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ～３×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ～４×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ～５×１０６細胞／ｋｇ）を達成するのに必要な回数であり得る。特定の実施形態では、対象から採取されたＣＤ３４＋ＨＳＰＣは、本明細書で考察されるゲノム編集方法のいずれかを使用して編集され得る。特定の実施形態では、本明細書で開示される、ｇＲＮＡの任意の１つ又は複数及びＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの１つ又は複数がゲノム編集方法で使用され得る。
特定の実施形態では、治療は、自己由来幹細胞移植を含み得る。特定の実施形態では、対象は、ブスルファン馴化による骨髄破壊的馴化を受け得る（例えば、１ｍｇ／ｋｇの試験用量で、初回用量薬物動態分析に基づいて用量調整される）。特定の実施形態では、馴化は、４日間連続して行われ得る。特定の実施形態では、３日間のブスルファン休薬期間後、編集された自己由来ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（例えば、≧２×１０６細胞／ｋｇ、≧３×１０６細胞／ｋｇ、≧４×１０６細胞／ｋｇ、≧５×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ～３×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ～４×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ～５×１０６細胞／ｋｇ）が対象に再輸液され得る（例えば、末梢血中に）。特定の実施形態では、編集された自己由来ＣＤ３４＋ＨＳＰＣは、特定の対象のために製造され、凍結保存され得る。特定の実施形態では、対象は、連続的な骨髄破壊的馴化レジメン及び編集された自己由来ＣＤ３４＋細胞の輸液に続いて、好中球の移植を達成し得る。好中球移植は、≧０．５×１０９／ＬのＡＮＣの３回の連続測定として定義され得る。特定の実施形態では、対象に投与されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ集団において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ集団の細胞の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満の細胞がＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。
特定の実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集システムは、約１０％以上の臨床的に関連するか又は治療的に関連する編集効率をもたらし得る。例えば、限定されるものではないが、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集システムは、約５％以上、約１０以上、１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上又は約９９％以上の臨床的に関連するか又は治療的に関連する編集効率をもたらし得る。
特定の実施形態では、本明細書で開示される治療方法で投与される細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％が修飾される。
特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団内の細胞の約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満又は約０．１％未満がＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。
ゲノム編集システム
「ゲノム編集システム」又は「遺伝子編集システム」という用語は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ編集活性を有する任意のシステムを指す。本開示のゲノム編集システムは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムから適合された、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの少なくとも２つの構成要素を含む。これらの２つの構成要素は、特定の核酸配列と結合して、例えば１つ又は複数の一本鎖切断（ＳＳＢ又はニック）、二重鎖切断（ＤＳＣ）及び／又は点変異を生成することにより、核酸配列中又はその周囲のＤＮＡを編集できる複合体を形成する。
天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムは、進化的に２つのクラスと５つの型に組織化され（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１ Ｊｕｎ；９（６）：４６７－４７７（Ｍａｋａｒｏｖａ）、参照により本明細書に援用される）、本開示のゲノム編集システムは、任意の型又はクラスの天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素を適合させ得る一方、本明細書に提示される実施形態は、一般にクラス２及びＩＩ型又はＶ型のＣＲＩＳＰＲシステムから適合される。ＩＩ型及びＶ型を包含するクラス２システムは、相対的に大型の多ドメインＲＮＡ誘導ヌクレアーゼタンパク質（例えば、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１）と、１つ又は複数のガイドＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ、任意選択的にｔｒａｃｒＲＮＡ）とによって特徴付けられ、それは、ｃｒＲＮＡの標的（又はスペーサー）配列に相補的な特定の遺伝子座と会合（標的化）して切断する、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。本開示によるゲノム編集システムは、細胞ＤＮＡ配列を同様に標的化して編集するが、天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムとは著しく異なる。例えば、本明細書に記載の単分子ガイドＲＮＡは自然界に存在せず、且つ本開示によるガイドＲＮＡ及びＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、いずれも天然に存在しない任意の数の修飾を組み込み得る。
ゲノム編集システムは、様々な方法で実装され得（例えば、細胞又は対象に投与又は送達され得る）、異なる実装が異なる用途に適し得る。例えば、ゲノム編集システムは、特定の実施形態では、タンパク質／ＲＮＡ複合体（リボ核タンパク質又はＲＮＰ）として実装され、それは、脂質又はポリマーの微粒子又はナノ粒子、ミセル、リポソームなどの薬学的に許容可能な担体及び／又は封入剤を任意選択的に含む医薬組成物に含まれ得る。特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、上述したＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ構成要素をコードする１つ又は複数の核酸として（任意選択的に、１つ又は複数の追加的な構成要素と共に）実装され；特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、このような核酸を含む１つ又は複数のベクター、例えばアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターとして実装され；特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、前述のいずれかの組み合わせとして実装される。本明細書に記載の原理に従って動作する追加的な又は修正された実装は、当業者に明らかであり、本開示の範囲内である。
本開示のゲノム編集システムは、単一の特定のヌクレオチド配列を標的化し得るか又は標的化し得、２つ以上のガイドＲＮＡの使用により、２つ以上の特定のヌクレオチド配列を並行して編集できることに留意すべきである。複数のｇＲＮＡの使用は、本開示を通して「多重化」と称され、関心のある複数の無関係の標的配列を標的化するため又は単一の標的ドメイン内に複数のＳＳＢ若しくはＤＳＢを形成するため、場合によりこのような標的ドメイン内で特定の編集をするために用いられ得る。例えば、参照により本明細書に援用される、Ｍａｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｍａｅｄｅｒ）による国際公開第２０１５／１３８５１０号パンフレットは、潜在的なスプライス部位の生成をもたらし、その結果として遺伝子の機能を低下させ又は排除する、ヒトＣＥＰ２９０遺伝子における点変異を修正する（Ｃ．２９９１＋１６５５ＡからＧへ）ためのゲノム編集システムを記載する。Ｍａｅｄｅｒのゲノム編集システムは、点変異の両側の（すなわちそれを挟む）配列を標的化する２つのガイドＲＮＡを利用して、変異側面に位置するＤＳＢを形成する。これは次に、変異を含む介在配列の欠失を促進し、それによって潜在的スプライス部位を除去し正常な遺伝子機能を回復させる。
別の例とし、参照によりその全体が本明細書に援用される、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏら（「Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏら」）による国際公開第２０１６／０７３９９０号パンフレットは、「二重ニッカーゼシステム」と称される配置である、Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｄ１０Ａなどの一本鎖ニックを生じるＣａｓ９）と組み合わせて、２つのｇＲＮＡを利用するゲノム編集システムを記載する。Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏらの二重ニッカーゼシステムは、１つ又は複数のヌクレオチドでオフセットされている目的の配列の逆ストランドに、２つのニックを生じるように構成され、上記ニックが組み合わされて、オーバーハングを有する二本鎖切断を作り出す（Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎらｏの場合には５’であるが３’オーバーハングも可能である）。オーバーハングは、次に、いくつかの状況において相同指向修復事象を促進し得る。また、別の例として、Ｐａｌｅｓｔｒａｎｔらによる国際公開第２０１５／０７００８３号パンフレット（「Ｐａｌｅｓｔｒａｎｔ」、参照によりその全体が本明細書に援用される）は、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列を標的化するｇＲＮＡ（「支配ＲＮＡ」と称される）を記載し、それは、例えば、いくつかのウイルス形質導入細胞において、さもなければ構成的に発現され得るＣａｓ９の一過性発現を可能にするために、１つ又は複数の追加的なｇＲＮＡを含むゲノム編集システムに含まれ得る。これらの多重化用途は限定的ではなく、むしろ例示的であること意図しており、当業者は、他の多重化用途が一般に、本明細書に記載のゲノム編集システムと適合性があることを理解するであろう。
ゲノム編集システムは、場合により、ＮＨＥＪ又はＨＤＲなどの細胞ＤＮＡ二本鎖切機序断によって修復される二本鎖切断を形成し得る。これらの機序は、例えば、Ｄａｖｉｓ＆Ｍａｉｚｅｌｓ，ＰＮＡＳ，１１１（１０）：Ｅ９２４－９３２，Ｍａｒｃｈ １１，２０１４（Ｄａｖｉｓ）（Ａｌｔ－ＨＤＲについて記載する）；Ｆｒｉｔ ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ １７（２０１４）８１－９７（Ｆｒｉｔ）（Ａｌｔ－ＮＨＥＪについて記載する）；及びＩｙａｍａ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ ＩＩＩ，ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ．）２０１３－Ａｕｇ；１２（８）：６２０－６３６（Ｉｙａｍａ）（標準ＨＤＲ及びＮＨＥＪ経路について一般的に記載する）などの文献にわたり記載されている。
ゲノム編集システムがＤＳＢを形成することによって機能する場合、このようなシステムは任意選択的に、特定の様式の二本鎖切断修復又は特定の修復結果を促進し又は容易にする、１つ又は複数の構成要素を含む。例えば、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏらは、その中に一本鎖オリゴヌクレオチド「ドナー鋳型」が付加されているゲノム編集システムも記載しており；ドナー鋳型は、ゲノム編集システムによって切断される細胞ＤＮＡの標的領域に組み込まれ、標的配列の変化をもたらし得る。
特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、一本鎖又は二本鎖の切断を引き起こすことなく、標的配列を改変するか、又は標的配列中又はその付近の遺伝子の発現を改変する。例えば、ゲノム編集システムは、ＤＮＡに作用する機能ドメインに融合したＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含み得、それによって標的配列又はその発現を改変する。一例として、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、シチジンデアミナーゼ機能ドメインに結合（例えば、融合）し得、標的化されたＣからＡへの置換を生成することによって機能し得る。例示的なヌクレアーゼ／デアミナーゼ融合体は、参照により援用される、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４２０－４２４（１９ Ｍａｙ ２０１６）（「Ｋｏｍｏｒ」）に記載される。代わりに、ゲノム編集システムは、デッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）などの切断不活性化（すなわち「デッド」）ヌクレアーゼを利用し得、細胞ＤＮＡの１つ又は複数の標的化領域上に安定な複合体を形成し、それにより、限定されるものではないが、ｍＲＮＡ転写、クロマチンリモデリングなどをはじめとする、標的領域が関与する機能を妨害することによって機能し得る。
特定の実施形態では、本開示に包含されるゲノム編集システムは、標準アッセイにおいて特定の最小限の編集百分率を示すであろう。例えば、限定されるものではないが、本開示に包含される特定のゲノム編集システムは、特定の標準アッセイにおいて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の編集を示すであろう。当該技術分野で公知の１つ若しくは複数のアッセイ又は例えば後述の実施例１に記載されるものなどの本明細書に記載されるアッセイは、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集を評価するために使用され得る。一例として、後述の実施例１では、例えばＣＤ３４＋ＨＳＣなどの特定の細胞型における、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介と対比した評価が記載され、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集システム、すなわちＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、一致部位標的を含む標的核酸の少なくとも一部に相補的なｇＲＮＡとを含むシステムが、例えば、ＲＮＰとして又はシステムの構成要素をコードするベクターの使用を介して、関心のある細胞型の細胞に導入される。標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整は、本明細書で開示されるように検出される。次に、検出された標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整は、同一の一致部位標的及び同一の細胞型に対してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムを用いた場合に検出された標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整と比較され得る。
特定の実施形態では、本開示のゲノム編集システムは、細胞集団内で同時に、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される１つ又は複数、２つ以上、３つ以上又は４つ以上の遺伝子をノックアウト又はノックダウンし得る。特定の実施形態では、本開示のゲノム編集システムは、１つ又は複数、２つ以上、３つ以上又は４つ以上のｇＲＮＡ分子を含み得、各ｇＲＮＡ分子は、例えば、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子から選択される遺伝子などの異なる遺伝子に対する標的化ドメインを含む。例えば、限定されるものではないが、本開示の多重ゲノム編集システムは、（ｉ）第１の遺伝子の標的配列に相補的な第１の標的化ドメインを含む第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、第１のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第１のＲＮＰ複合体、（ｉｉ）第２の遺伝子の標的配列に相補的な第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子と、第２のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第２のＲＮＰ複合体、（ｉｉｉ）第３の遺伝子の標的配列に相補的な第３の標的化ドメインを含む第３のｇＲＮＡ分子と、第４のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第３のＲＮＰ複合体、及び／又は（ｉｖ）第４の遺伝子の標的配列に相補的な第４の標的化ドメインを含む第４のｇＲＮＡ分子と、第４のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第４のＲＮＰ複合体を含み得る。特定の実施形態では、第１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の遺伝子及び第４の遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍを標的化するためのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、表６、７及び８に列挙される標的化ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、ＴＲＡＣを標的化するためのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、表２及び３に列挙される標的化ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡを標的化するためのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、表９に列挙される標的化ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、ＴＲＢＣを標的化するためのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、表４及び５に列挙される標的化ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、編集効率は、全ての標的遺伝子について＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％又は＞９９％であり得る。特定の実施形態では、細胞集団は、Ｔ細胞集団であり得る。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子
「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」という用語は、細胞内のゲノム又はエピソーム配列などの標的配列に対する、Ｃｐｆ１などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの特定の結合（又は「標的化」）を促進する、任意の核酸を指す。ｇＲＮＡは、単分子（単一のＲＮＡ分子を含むか又はキメラとも称される）又はモジュール型（例えば、二重化によって通常互いに結合する、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡなどの２つ以上、典型的には２つの別々のＲＮＡ分子を含む）であり得る。ｇＲＮＡ及びそれらの構成部分は、例えば、Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ５６（２），３３３－３３９，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２３，２０１４（Ｂｒｉｎｅｒ）、参照により援用される）及びＣｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏなどの文献にわたり記載される。
細菌及び古細菌では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは一般に、Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼタンパク質；外来配列に相補的な５’領域を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；及びｃｒＲＮＡの３’領域に相補的でありそれと二重鎖を形成する、５’領域を含むトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。いかなる理論にも拘束されることは意図されないが、この二重鎖はＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の形成を促進し、その活性に必要であると考えられる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを遺伝子編集における使用に適合させる間、１つの非限定的例において、ｃｒＲＮＡ（その３’末端）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（その５’末端）の相補的領域を架橋する、４ヌクレオチド（例えば、ＧＡＡＡ）「テトラループ」又は「リンカー」配列により、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが単一の単分子又はキメラガイドＲＮＡに連結され得ることが発見された。（それらの全てが参照により本明細書に援用される、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８２３－８２６（「Ｍａｌｉ」）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｍａｒ；３１（３）：２３３－２３９（「Ｊｉａｎｇ」）；及びＪｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｕｇ．１７；３３７（６０９６）：８１６－８２１（「Ｊｉｎｅｋ」））。
ガイドＲＮＡは、単分又はモジュラー型を問わず、編集が望まれる細胞のゲノム中のＤＮＡ配列などの標的配列中の標的ドメインに完全に又は部分的に相補的な「標的化ドメイン」を含む。標的化ドメインは、限定されるものではないが、「ガイド配列」（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｓｅｐ；３１（９）：８２７－８３２，（「Ｈｓｕ」）、参照により本明細書に援用される）、「相補的領域」（Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏら）、「スペーサー」（Ｂｒｉｎｅｒ）及び包括的に「ｃｒＲＮＡ」（Ｊｉａｎｇ）をはじめとする文献において、様々な名称で呼ばれている。それらに与えられた名称とはかかわりなく、標的化ドメインは、典型的には１０～３０ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では１６～２４ヌクレオチド長（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチド長）であり、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡの場合には５’末端又はその付近にあり、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡの場合には３’末端又はその付近にある。
標的化ドメインに加えて、ｇＲＮＡは、典型的には（以下で考察されるように必ずしもそうとは限らないが）、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ／Ｃｐｆ１複合体の形成又は活性に影響を及ぼし得る複数のドメインを含む。例えば、上記のように、ｇＲＮＡの第１及び第２の相補的ドメイン（リピート：アンチリピート二重鎖とも称される）によって形成される二重鎖構造は、Ｃａｓ９の認識（ＲＥＣ）ローブと相互作用して、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の形成を媒介し得る。（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５６，９３５－９４９，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２７、２０１４（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１４）及びＮｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６２，１１１３－１１２６，Ａｕｇｕｓｔ ２７，２０１５（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１５）、いずれも参照により本明細書に援用される）。第１及び／又は第２の相補的ドメインは、ＲＮＡポリメラーゼによって終結シグナルとして認識され得る、１つ又は複数のポリＡ鎖を含有し得ることに留意すべきである。そのため、第１及び第２の相補的ドメインの配列は、例えば、Ｂｒｉｎｅｒに記載されるようなＡ－Ｇスワップの使用又はＡ－Ｕスワップの使用を通じて任意選択的に修飾され、これらの区域が除去されてｇＲＮＡの完全なインビトロ転写が促進される。第１及び第２の相補的ドメインに対するこれらの及び他の類似の改変は、本開示の範囲内である。
第１及び第２の相補的ドメインと共に、Ｃａｓ９ｇ ＲＮＡは典型的には、インビボでヌクレアーゼ活性に関与するが、インビトロでは必ずしも関与しない、２つ以上の追加的な二重鎖領域を含む。（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１５）。第二の相補的ドメインの３’部分の付近にある第１のステムループ１は、「近位ドメイン」（Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏ）、「ステムループ１」（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１４及び２０１５）及び「ｎｅｘｕｓ」（Ｂｒｉｎｅｒ）など様々に呼ばれる。１つ又は複数の追加的なステムループ構造は、一般に、ｇＲＮＡの３’末端の付近に存在し、数は種によって異なり、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡが典型的に２つの３’ステムループ（リピート：アンチリピート二重鎖を含む合計４つのステムループ構造：アンチリピート二重鎖）を含む一方で、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及び他の種は、単に１つのみ有する（合計３つのステムループ構造）。種毎にまとめられた、保存的ステムループ構造（及びより一般的にはｇＲＮＡ構造）の説明は、Ｂｒｉｎｅｒに提供されている。
前述の説明は、Ｃａｓ９と共に使用するためのｇＲＮＡに焦点を当ててきたが、ここまでに記載されたものといくつかの点で異なるｇＲＮＡを利用する、他のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが発見され又は発明されている（又は将来的に発見される可能性がある）ことを理解されたい。例えば、Ｃｐｆ１（「プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｃｅｌｌａ）１」由来のＣＲＩＳＰＲ）は最近発見されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼであり、機能するためにｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ １６３，７５９－７７１ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２２，２０１５（Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｉ）、参照により本明細書に援用される）。Ｃｐｆ１ゲノム編集システムにおいて使用するためのｇＲＮＡは、一般に、標的化ドメイン及び相補的ドメイン（交互に「ハンドル」と称される）を含む。Ｃｐｆ１と共に使用するためのｇＲＮＡにおいて、標的化ドメインは通常、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡに関して上述したように、５’末端ではなくむしろ３’末端又はその付近に存在する（ハンドルはＣｐｆ１ ｇＲＮＡの５’末端又はその付近にある）ことにも留意すべきである。
当業者は、異なる原核生物種由来のｇＲＮＡ間又はＣｐｆ１とＣａｓ９のｇＲＮＡ間に構造上の相違が存在し得るが、ｇＲＮＡが作用する原理は概して一貫していることを理解するであろう。この動作の一貫性のために、ｇＲＮＡは、広い意味で、それらの標的化ドメイン配列によって定義され得、当業者は、所与の標的化ドメイン配列が、単分子若しくはキメラｇＲＮＡ又は１つ若しくは複数の化学修飾及び／若しくは配列修飾（置換、追加のヌクレオチド、切断など）を含むｇＲＮＡをはじめとする、任意の適切なｇＲＮＡに組み込まれ得ることを理解するであろう。したがって、本開示における提示の経済性のために、ｇＲＮＡはそれらの標的化ドメイン配列の観点のみから記載され得る。
より一般的には、当業者は、本開示のいくつかの態様が、複数のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを使用して実装され得るシステム、方法及び組成物に関することを理解するであろう。この理由から、別段の指定がない限り、ｇＲＮＡという用語は、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１の特定の種と適合性のｇＲＮＡだけでなく、任意のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと共に使用され得る任意の適切なｇＲＮＡを包含するものと理解されるべきである。例として、ｇＲＮＡという用語は、特定の実施形態では、ＩＩ型又はＶ型などのクラス２ ＣＲＩＳＰＲシステム又はＣＲＩＳＰＲシステムに存在する任意のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと共に、又はそれに由来するか、又はそれから適合化されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと共に、使用するためのｇＲＮＡを含み得る。
本開示は、表２～９及び１９で提供されるｇＲＮＡのいずれか１つの配列を含むｇＲＮＡ分子及びその組成物を提供する。本開示は、表２～９及び１９に記載されるｇＲＮＡの配列を含む１つ又は複数のｇＲＮＡを含む組成物及びその組成物をさらに提供する。本開示は、表１８で提供される染色体領域（例えば、ゲノム座標）を標的とするｇＲＮＡ及びその組成物を提供する。
本開示は、例えば、細胞集団において、標的部位に約１０％を超える編集をもたらすｇＲＮＡを提供する。例えば、限定されるものではないが、本開示のｇＲＮＡは、例えば、細胞集団において標的部位において、約１５％を超える編集、約２０％を超える編集、約２５％を超える編集、約３０％を超える編集、約３５％を超える編集、約４０％を超える編集、約４５％を超える編集、約５０％を超える編集、約５５％を超える編集、約６０％を超える編集、約６５％を超える編集、約７０％を超える編集、約７５％を超える編集、約８０％を超える編集、約８５％を超える編集、約９０％を超える編集、約９５％を超える編集、約９６％を超える編集、約９７％を超える編集、約９８％を超える編集又は約９９％を超える編集をもたらす。
ｇＲＮＡ設計
標的配列の選択及び検証並びにオフターゲット分析の方法は、例えば、Ｍａｌｉ；Ｈｓｕ；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｎａｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２（３）：２７９－８４，Ｈｅｉｇｗｅｒ ｅｔａｌ．，２０１４ Ｎａｔ ｍｅｔｈｏｄｓ １１（２）：１２２－３；Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０（１０）：１４７３－５；及びＸｉａｏ Ａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０（８）：１１８０－１１８２に以前記載されている。これらの参考文献のそれぞれは、参照により本明細書に援用される。非限定的例として、ｇＲＮＡ設計は、例えば、ゲノム全体にわたる総オフターゲット活性を最小化するために、使用者の標的配列に対応する潜在的な標的配列の選択を最適化するためのソフトウェアツールの使用を伴い得る。オフターゲット活性は切断に限定されないものの、各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験的に導出された重み付けスキームを用いて予測され得る。これらの及び他のガイド選択方法は、Ｍａｅｄｅｒ及びＣｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏらに詳細に記載されている。
ｇＲＮＡ修飾
ｇＲＮＡの活性、安定性又は他の特徴は、特定の修飾を組み込むことによって改変され得る。一例として、一過性に発現又は送達された核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を起こし易くあり得る。したがって、本明細書に記載のｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対して安定性を導入する、１つ又は複数の修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドを含み得る。理論による拘束は望まないが、本明細書に記載の特定の修飾ｇＲＮＡは、細胞に導入された際に、先天性免疫応答の低下を示し得るとも考えられている。当業者は、外因性核酸、特にウイルス又は細菌起源のものに応答して、例えば哺乳類細胞などの細胞において一般的に観察される特定の細胞応答を承知している。サイトカインの発現及び放出の誘導並びに細胞死を含み得るそのような応答は、本明細書に提示される修飾によって低下し又は完全に排除され得る。
このセクションで論じられる特定の例示的な修飾は、限定されるものではないが、５’末端又はその付近（例えば、５’末端の１～１０、１～５又は１～２ヌクレオチド以内）及び／又は３’末端又はその付近（例えば、３’末端の１～１０、１～５又は１～２ヌクレオチド以内）などのｇＲＮＡ配列中の任意の位置に含まれ得る。場合により、修飾は、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡのリピート：アンチリピート二重鎖、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１ ｇＲＮＡのステムループ構造及び／又はｇＲＮＡの標的化ドメインなどの機能的モチーフ内に位置する。
一例として、ｇＲＮＡの５’末端は、以下で示されるような、真核生物のｍＲＮＡキャップ構造又はＧキャップ類似体（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体又は３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ抗キャップ類似体（ＡＲＣＡ））を含み得る。
Figure 2024023294000027
キャップ又はキャップ類似体は、ｇＲＮＡの化学合成又はインビトロ転写中に含まれ得る。
似たような路線で、ｇＲＮＡの５’末端には５’三リン酸基が欠如し得る。例えば、インビトロ転写ｇＲＮＡを（例えば、仔ウシ腸アルカリホスファターゼを使用することで）ホスファターゼ処理して、５’三リン酸基が除去され得る。
別の一般的な修飾は、ｇＲＮＡの３’末端に、ポリＡトラクトと称される複数の（例えば、１～１０、１０～２０又は２５～２００個の）アデニン（Ａ）残基を付加することを伴う。ポリＡ配列は、ポリアデノシンポリメラーゼ（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）を使用したインビトロ転写に続く化学合成中に又はＭａｅｄｅｒに記載されるようにインビボでポリアデニル化配列によってｇＲＮＡに付加され得る。
本明細書に記載の修飾は任意の適切な方法で組み合わされ得、例えばインビボでＤＮＡベクターから転写されるか、又はインビトロで転写されたｇＲＮＡは、５’キャップ構造又はキャップ類似体のいずれか又は両方と、３’ポリＡ配列とを含み得ることに留意すべきである。
ガイドＲＮＡは、３’末端Ｕリボースで修飾され得る。例えば、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基が、アルデヒド基に酸化され得、同時のリボース環の開環が、下に示される修飾ヌクレオシドをもたらし、
Figure 2024023294000028
式中、「Ｕ」は、未修飾又は修飾ウリジンであり得る。
３’末端Ｕリボースは、以下で示されるように２’３’環状リン酸エステルで修飾され得、
Figure 2024023294000029
式中、「Ｕ」は、未修飾又は修飾ウリジンであり得る。
ガイドＲＮＡは、例えば、本明細書に記載の修飾ヌクレオチドの１つ又は複数を組み込むことによって分解に対して安定化され得る、３’ヌクレオチドを含有し得る。特定の実施形態では、ウリジンは、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン及び５－ブロモウリジン又は本明細書に記載されるいずれかの修飾ウリジンなどの修飾ウリジンで置換され得；アデノシン及びグアノシンは、例えば、８－ブロモグアノシンなどの例えば８位が修飾された修飾アデノシン及びグアノシン又は本明細書に記載されるいずれかの修飾アデノシン又はグアノシンによって置換され得る。
特定の実施形態では、糖修飾リボヌクレオチドがｇＲＮＡに組み込まれ得、例えば、２’ＯＨ基が、Ｈ、－ＯＲ、－Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であり得る）、ハロ、－ＳＨ、－ＳＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であり得る）、アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ又はアミノ酸であり得る）；又はシアノ（－ＣＮ）から選択される基によって置換される。特定の実施形態では、リン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート（ＰｈＴｘ）基で、本明細書に記載されるように修飾され得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡのヌクレオチドの１つ又は複数は、それぞれ独立して、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチルなどの２’－糖修飾又は例えば２’－Ｆ若しくは２’－Ｏ－メチル、アデノシン（Ａ）、２’－Ｆ若しくは２’－Ｏ－メチル、シチジン（Ｃ）、２’－Ｆ若しくは２’－Ｏ－メチル、ウリジン（Ｕ）、２’－Ｆ若しくは２’－Ｏ－メチル、チミジン（Ｔ）１，２’－Ｆ若しくは２’－Ｏ－メチル、グアノシン（Ｇ）をはじめとする２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅ０）及びそれらの任意の組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、修飾又は未修飾ヌクレオチドであり得る。
ガイドｇＲＮＡは、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）も含み得、その中で、２’ＯＨ基は、例えば、同一リボース糖の４’炭素へのＣ１～６アルキレン又はＣ１～６ヘテロアルキレン架橋によって結合され得る。このような架橋を提供するために、限定されるものではないが、メチレン、プロピレン、エーテル又はアミノ架橋；Ｏ－アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン又はポリアミノであり得る）及びアミノアルコキシ又はＯ（ＣＨ２）ｎ－アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン又はポリアミノであり得る）をはじめとする任意の適切な部分が使用され得る。
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、多環である修飾ヌクレオチド（例えば、トリシクロ；及びグリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態（例えば、その中でリボースがリン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位で置換される、Ｒ－ＧＮＡ又はＳ－ＧＮＡ）又はトレオース核酸（その中でリボースがα－Ｌ－トレオフラノシル－（３’→２’）で置換される、ＴＮＡ）を含み得る。
一般に、ｇＲＮＡは、酸素を有する５員環の糖類であるリボースを含む。代表的な修飾ｇＲＮＡとしては、限定されるものではないが、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）又は例えばメチレン又はエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニル又はシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタン又はオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル及びホスホロアミダート骨格も有するモルホリノなどの追加的な炭素又はヘテロ原子を有する６又は７員環を形成する）が挙げられる。糖類似体改変の大部分は２’位に局在するが、４’位をはじめとする他の部位も修飾を受け入れやすい。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、４’－Ｓ、４’－Ｓｅ又は４’－Ｃ－アミノメチル－２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。
特定の実施形態では、例えば、７－デアザ－アデノシンなどのデアザヌクレオチドがｇＲＮＡに組み込まれ得る。特定の実施形態では、例えば、Ｎ６－メチルアデノシンなどのＯ－及びＮ－アルキル化ヌクレオチドがｇＲＮＡに組み込まれ得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中の１つ又は複数の又は全てのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである。
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、その内容全体が参照により本明細書に援用される整理番号ＰＣＴ／米国特許出願公開第１７／６９０１９号明細書を有する国際特許出願に記載されるものから選択される１つ又は複数のリンカー及び／又はｇＲＮＡ合成のプロセスを含むであろう。
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
本開示によるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとしては、Ｃｐｆ１などの天然に存在するクラス２ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ並びに例えば変異型などのそれから誘導されるか又はそれから得られる他のヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、機能的にも定義され得る。例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、（ａ）ｇＲＮＡと相互作用し（例えば、複合体形成し）；及び（ｂ）ｇＲＮＡと一緒に、（ｉ）ｇＲＮＡの標的化ドメインに相補的な配列、及び任意選択的に（ｉｉ）下でより詳細に記載される、「プロトスペーサー隣接モチーフ」又は「ＰＡＭ」と称される追加的な配列を含むＤＮＡの標的領域と結合し、任意選択的に切断又は修飾するヌクレアーゼとして定義される。以下の実施例が例証するように、たとえ同一ＰＡＭ特異性又は切断活性を共有する個々のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ間に変動が存在し得るとしても、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、広い意味で、それらのＰＡＭ特異性及び切断活性によって定義され得る。当業者は、本開示のいくつかの態様が、特定のＰＡＭ特異性及び／又は切断活性を有する任意の適切なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを使用して実装され得るシステム、方法及び組成物に関することを理解するであろう。この理由から、別段の指定がない限り、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼという用語は総称として理解されるべきであり、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼのいかなる特定の型（例えば、Ｃａｓ９と対比したＣｐｆ１）、種（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）と対比したＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））又はバリエーション（例えば、完全長と対比した短縮型又は分割；天然ＰＡＭ特異性と対比した操作されたＰＡＭ特異性など）にも限定されない。
ＰＡＭ配列は、ｇＲＮＡ標的化ドメイン（又は「スペーサー」）に相補的な「プロトスペーサー」配列とのその配列関係からその名称を取っている。プロトスペーサー配列と共に、ＰＡＭ配列は、特定のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡの組み合わせのための標的領域又は配列を規定する。
様々なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＰＡＭとプロトスペーサーとの間の異なる配列関係を必要とし得る。一般に、Ｃａｓ９は、プロトスペーサーの３’であるＰＡＭ配列を認識する。他方、Ｃｐｆ１は、一般にプロトスペーサーの５’であるＰＡＭ配列を認識する。
ＰＡＭ及びプロトスペーサーの特定の配列の向きを認識することに加えて、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、特定のＰＡＭ配列も認識し得る。例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９は、ＮＮＧＲＲＴ又はＮＮＧＲＲＶのＰＡＭ配列を認識し、その中ではＮ残基が、ｇＲＮＡ標的化ドメインによって認識される領域の３’に隣接する。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は、ＮＧＧ ＰＡＭ配列を認識する。また、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃｐｆ１は、ＴＴＮ ＰＡＭ配列を認識する。ＰＡＭ配列は様々なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼについて同定されており、新規ＰＡＭ配列を同定するためのストラテジーは、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６０，３８５－３９７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ５，２０１５によって記載されている。操作されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、参照分子のＰＡＭ特異性とは異なるＰＡＭ特異性を有し得ることにも留意すべきである（例えば、操作されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの場合、参照分子はＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがそれに由来する天然に存在する変異型であり得るか、又は操作されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとの最大アミノ酸配列相同性を有する天然に存在する変異型であり得る）。
それらのＰＡＭ特異性に加えて、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、それらのＤＮＡ切断活性によって特徴付けられ得、天然ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、典型的には標的核酸中でＤＳＢを形成するが、ＳＳＢのみを生じるか又は全く切断しない、操作された変異型が生成されている（上で論じた）Ｒａｎ＆Ｈｓｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５４（６），１３８０－１３８９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １２，２０１３（Ｒａｎ）、参照により本明細書に援用される）。
Ｃｐｆ１
ｃｒＲＮＡと、ＴＴＴＮ ＰＡＭ配列などの二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ標的と複合体形成したアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種Ｃｐｆ１の結晶構造が、Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ．２０１６ Ｍａｙ ５；１６５（４）：９４９－９６２（Ｙａｍａｎｏ）、参照により本明細書に援用される）によって解析されている。Ｃａｓ９と同様に、Ｃｐｆ１には、ＲＥＣ（認識）ローブとＮＵＣ（ヌクレアーゼ）ローブの２つのローブがある。ＲＥＣローブはＲＥＣ１及びＲＥＣ２ドメインを含み、これらはいかなる既知のタンパク質構造とも類似性がない。その一方で、ＮＵＣローブは、３つのＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ－Ｉ、－ＩＩ及び－ＩＩＩ）と１つのＢＨドメインとを含む。しかし、Ｃａｓ９とは対照的に、Ｃｐｆ１ ＲＥＣローブはＨＮＨドメインを欠いており、既知のタンパク質構造との類似性を欠く他のドメイである、構造的にユニークなＰＩドメインと、３つのウェッジ（ＷＥＤ）ドメイン（ＷＥＤ－Ｉ、－ＩＩ及び－ＩＩＩ）と、ヌクレアーゼ（Ｎｕｃ）ドメインとを含む。
Ｃａｓ９及びＣｐｆ１が構造及び機能において類似性を共有する一方で、特定のＣｐｆ１活性はいずれのＣａｓ９ドメインにも類似していない、構造ドメインによって媒介されることを理解すべきである。例えば、標的ＤＮＡの相補鎖の切断は、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインとは配列的及び空間的に異なる、Ｎｕｃドメインによって媒介されるようである。さらに、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡの非標的化部分（ハンドル）は、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ中のリピート：アンチリピート二重鎖によって形成されるステムループ構造ではなく、むしろ偽結び目構造を取る。
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの修飾
上述したＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、様々な用途に有用であり得る活性及び特性を有するが、当業者は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼも場合により修飾されて、切断活性、ＰＡＭ特異性又は他の構造的若しくは機能的特徴が改変され得ることを認識するであろう。
まず、切断活性を改変する修飾に目を向けると、ＮＵＣローブ内のドメインの活性を低減又は排除する変異が上に記載されている。ＲｕｖＣドメイン、Ｃａｓ９ ＨＮＨドメイン又はＣｐｆ１ Ｎｕｃドメインに生成され得る例示的な変異は、Ｒａｎ ａｎｄ Ｙａｍａｎｏ及びＣｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載されている。一般に、２つのヌクレアーゼドメインの１つの活性を低減又は排除する変異は、ニッカーゼ活性を有するＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをもたらすが、ニッカーゼ活性の種類は、いずれのドメインが不活性化されるかによって変化することに留意すべきである。一例として、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインの不活性化は、相補鎖又は上部鎖を切断するニッカーゼをもたらす。他方、Ｃａｓ９ ＨＮＨドメインの不活性化は、下部鎖又は非相補鎖を切断するニッカーゼをもたらす。
天然に存在するＣａｓ９参照分子と比較したＰＡＭ特異性の修飾は、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．により、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｊｕｌ ２３；５２３（７５６１）：４８１－５（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ Ｉ）及びＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｄｅｃ；３３（１２）：１２９３－１２９８（Ｋｌｉｅｎｓｔｉｖｅｒ ＩＩ））の両方について記載されている。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．は、Ｃａｓ９の標的化忠実度を改善する修飾についても記載している（Ｎａｔｕｒｅ，２０１６ Ｊａｎｕａｒｙ ２８；５２９，４９０－４９５（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ＩＩＩ））。天然に存在するＣａｓ９参照分子と比較したＰＡＭ特異性の修飾は、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．により、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｊｕｌ ２３；５２３（７５６１）：４８１－５（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ Ｉ）の両方について記載されている。これらの参考文献のそれぞれは、参照により本明細書に援用される。
天然に存在するＣｐｆ１参照分子と比較したＰＡＭ特異性の修飾は、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．によって記載されている（参照により本明細書に援用されるＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７ Ａｕｇ；３５（８）：７８９－７９２）。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、例えば、ＡｓＣｐｆ１変異型などのＣｐｆ１変異型であり得る。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１変異型は、Ｓ５４２Ｒ／Ｋ６０７Ｒバリエーションを含むＡｓＣｐｆ１変異型であり、それは、ＴＹＣＶ ＰＡＭを認識する。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１変異型は、Ｓ５４２Ｒ／Ｋ５４８Ｖ／Ｎ５５２Ｒバリエーションを含むＡｓＣｐｆ１変異型であり、それは、ＴＡＴＶ ＰＡＭを認識する。
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５Ｆｅｂ；３３（２）：１３９－４２（Ｚｅｔｓｃｈｅ ＩＩ）、参照により援用される）及びＦｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５ Ｊｕｌ１；５：１０７７７（Ｆｉｎｅ）、参照により援用される）によって記載されるように、２つ以上の部分に分割される。
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、特定の実施形態では、例えば、ｇＲＮＡ結合、標的及びＰＡＭ認識並びに切断活性をなおも維持しながら、ヌクレアーゼのサイズを低下させる１つ又は複数の欠失を通じて、サイズ最適化又は短縮され得る。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、任意選択でリンカーにより、別のポリペプチド、ヌクレオチド又は他の構造に共有結合的に又は非共有結合的に結合する。例示的な結合ヌクレアーゼ及びリンカーは、本明細書におけるあらゆる目的のために参照により援用される、Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，５７７－５８２（２０１４）によって記載される。
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、任意選択的に、核局在化シグナルをはじめとするが、これに限定されるものではない標識を含んで、核内へのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼタンパク質の移動も容易にする。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｃ末端及び／又はＮ末端の核局在化シグナルを組み込み得る。核局在化配列は、当該技術分野で公知であり、Ｍａｅｄｅｒ及び他の箇所に記載される。
前述の修飾のリストは、本質的に例示的であることを意図しており、当業者は、本開示に鑑みて、他の修正が特定の用途において可能であるか、又は望ましいことがあり得ることを理解するであろう。したがって、簡潔さのために、本開示の例示的なシステム、方法及び組成物は、特定のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを参照して提示されるが、使用されるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはそれらの動作原理を変えない様式で改変され得るものと理解されるべきである。このような改変は、本開示の範囲内である。
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸
例えば、Ｃｐｆ１又はその機能性断片などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸が、本明細書で提供される。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする例示的な核酸が、以前記載されている（例えば、Ｃｏｎｇ ２０１３；Ｗａｎｇ ２０１３；Ｍａｌｉ ２０１３；Ｊｉｎｅｋ ２０１２を参照されたい）。
場合により、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸は、合成核酸配列であり得る。例えば、合成核酸分子は化学修飾され得る。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、以下の特性の１つ又は複数の（例えば、全て）を有するであろう：それはキャップされ得；ポリアデニル化され得；５－メチルシチジン及び／又はプソイドウリジンで置換され得る。
合成核酸配列もコドン最適化され得、例えば、少なくとも１つの一般的でないコドン又はそれほど一般的でないコドンが、一般的なコドンによって置き換えられる。例えば、合成核酸は、例えば、本明細書に記載される哺乳類発現系内での発現のために最適化された、最適化メッセンジャーｍＲＮＡの合成を誘導し得る。コドン最適化されたＣａｓ９コード配列の例は、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏに提示されている。
さらに又は代わりに、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。核局在化配列は、当該技術分野で公知である。
候補分子の機能解析
候補ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ及びそれらの複合体は、当該技術分野で公知の標準法によって評価され得る。例えば、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏらを参照されたい。ＲＮＰ複合体の安定性は、下述される示差走査型蛍光定量法によって評価され得る。
示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）
ｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の熱安定性は、ＤＳＦによって測定され得る。ＤＳＦ技術は、例えば、ｇＲＮＡなどの結合ＲＮＡ分子の添加などの好ましい条件下で増加し得る、タンパク質の熱安定性を測定する。
ＤＳＦアッセイは、任意の適切なプロトコルに従って実施され得、限定されるものではないが、（ａ）異なる条件（例えば、異なる化学量論比のｇＲＮＡ：ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼタンパク質、異なる緩衝液など）を試験して、ＲＮＰ形成のための最適条件を同定すること；及び（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡの修飾（例えば、化学修飾、配列改変など）を試験して、ＲＮＰ形成又は安定性を改善する修飾を同定することをはじめとする、任意の適切な設定で使用され得る。ＤＳＦアッセイの１つの読み取りは、ＲＮＰ複合体の融解温度の変化であり；比較的高い変化は、ＲＮＰ複合体が、より低い変化によって特徴付けられる標準ＲＮＰ複合体と比較して、より安定している（したがってより大きい活性又はより好ましい形成動態、分解動態又は別の機能特性を有し得る）ことを示唆する。ＤＳＦアッセイがスクリーニングツールとして展開される場合、閾値融解温度変化が特定され得、それにより、結果は、閾値以上の融解温度変化を有する１つ又は複数のＲＮＰである。例えば、閾値は、５～１０°Ｃ（例えば、５℃°、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃）又はそれを超えるものであり得、結果は、閾値以上の融解温度変化によって特徴付けられる１つ又は複数のＲＮＰであり得る。
ＤＳＦアッセイ条件の２つの非限定的例は、下記の通りである（条件は、Ｃａｓ９の使用を参照する一方、Ｃｐｆ１に関しても同様の条件を用い得る）。
ＲＮＰ複合体を形成するための最良の溶液を判定するために、水中の固定濃度（例えば、２μＭ）のＣａｓ９＋１０×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ－６６５０）を３８４ウェルプレート内に分注する。次に、様々なｐＨ及び塩を有する溶液中に希釈された、等モル量のｇＲＮＡを添加する。室温で１０分間インキュベートし、短時間遠心分離してあらゆる気泡を除去した後、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸマネージャーソフトウエアと共に、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステムＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、２０℃から９０℃まで、１０秒毎に１℃の増分で勾配を実行する。
第２のアッセイは、様々な濃度のｇＲＮＡを、上記のアッセイ１からの最適緩衝液中の固定濃度（例えば、２μＭ）のＣａｓ９ｉに混合し、３８４ウェルプレート内で（例えば、室温で１０分間）インキュベートすることからなる。等容積の最適緩衝液＋１０×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ－６６５０）を添加し、プレートをＭｉｃｒｏｓｅａｌ（登録商標）Ｂ接着剤（ＭＳＢ－１００１）で密封する。短時間遠心分離してあらゆる気泡を除去した後、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸマネージャーソフトウエアと共に、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステムＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、２０℃から９０℃まで、１０秒毎に１℃の増分で勾配を実行する。
ゲノム編集ストラテジー
上述したゲノム編集システムを使用して、本開示の様々な実施形態において、細胞内で又は細胞から得られたＤＮＡの標的領域内で編集する（すなわち修飾する）。特定の編集をするための様々なストラテジーが本明細書に記載され、これらのストラテジーは、一般に所望の修復結果、個々の編集（例えば、ＳＳＢ又はＤＳＢ）の数と位置及びこのような編集の標的部位によって記述される。
ＳＳＢ又はＤＳＢの形成を伴うゲノム編集ストラテジーは、（ａ）標的領域の全部又は一部の欠失；（ｂ）標的領域の全部又は一部内への挿入又はその置換；又は（ｃ）標的領域の全部又は一部の中断をはじめとする修復結果によって特徴付けられる。このグループ分けは、任意の特定の理論又はモデルを制限することも又はそれに拘束されることも意図されず、提示の経済性のためにのみ提供される。当業者は、列挙される結果が相互に排他的でなく、いくつかの修復が他の結果をもたらし得ることを理解するであろう。特定の編集ストラテジー又は方法の説明は、別段の指定がない限り、特定の修復結果を必要とすると理解されるべきではない。
標的領域の置換は、例えば、ＨＤＲ経路によって媒介される２つの修復結果である、遺伝子修正又は遺伝子変換を通じた、相同配列による、標的領域内に存在する配列の全部又は一部の置換を一般に伴う。ＨＤＲは、以下でより詳細に記載されるように、一本鎖又は二本鎖であり得るドナー鋳型の使用によって促進される。一本鎖又は二本鎖鋳型は外因性であり得、その場合、それらは遺伝子修正を促進するか、又はそれらは内因性（例えば、細胞ゲノム中の相同配列）であり得、遺伝子変換を促進する。外因性鋳型は、例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４，３３９－３４４（２０１６）、（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）、参照により援用される）によって記載されるように、非対称オーバーハングを有することができる（すなわち、ＤＳＢの部位に相補的な鋳型の部分は、鋳型内の中心に位置するのではなく、むしろ３’又は５’方向にオフセットされ得る）。鋳型が一本鎖である場合、それは標的領域の相補的（上部）又は非相補的（下部）鎖のいずれかに対応し得る。
Ｒａｎ及びＣｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏらに記載されるように、遺伝子変換及び遺伝子修正は、場合により、標的領域内又はその周囲に、１つ又は複数のニックを形成することによって促進される。場合により、二重ニッカーゼストラテジーを使用して、２つのオフセットＳＳＢが形成され、次に、オーバーハング（例えば、５’オーバーハング）を有する単一のＤＳＢが形成される。
標的配列の全部又は一部の中断及び／又は欠失は、様々な修復結果によって達成され得る。一例として、ＬＣＡ１０変異についてＭａｅｄｅｒに記載されているように、標的領域を挟む２つ以上のＤＳＢを同時に生成することによって配列を欠失させ得、次にそれはＤＳＢが修復される際に切除される。別の例として、配列は、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖切断の形成と、それに続く修復前のオーバーハングのヌクレオチド末端加水分解プロセシングによって生成される欠失によって中断され得る。
標的配列中断の１つの特定のサブセットは、標的配列中のインデルの形成によって媒介され、その中では修復結果は典型的にはＮＨＥＪ経路（Ａｌｔ－ＮＨＥＪをはじめとする）によって媒介される。ＮＨＥＪは、そのインデル変異との関連のために「誤りがちな」修復経路と称される。しかし、場合により、ＤＳＢはその周囲の配列の改変なしにＮＨＥＪによって修復され（いわゆる「完璧」又は「無瘢痕」修復）；これは一般に、ＤＳＢの両端が完全にライゲートされることを必要とする。その一方で、インデルは、それらがライゲートされる前の遊離ＤＮＡ末端の酵素的プロセシングから生じると考えられ、それは、片方又は両方の遊離末端の片方又は両方の鎖にヌクレオチドを付加し及び／又はそれから除去する。
遊離ＤＳＢ末端の酵素的プロセシングは、本質的に確率論的であり得るため、インデル変異は変動する傾向があり、分布に沿って発生し、特定の標的部位、使用される細胞型、使用されるゲノム編集ストラテジーをはじめとする、様々な要因によって影響され得る。それでもなお、インデル形成について限定的に一般化することは可能であり：単一のＤＳＢの修復によって形成される欠失は、最も一般的には１～５０ｂｐの範囲であるが、１００～２００ｂｐを超えることもあり得る。単一のＤＳＢの修復によって形成された挿入はより短くなる傾向があり、多くの場合に切断部位を直接取り囲む配列の短い重複を含む。しかし、大きい挿入を得ることが可能であり、これらの場合、挿入配列は、多くの場合、ゲノムの他の領域又は細胞内に存在するプラスミドＤＮＡに由来が突き止められている。
インデル変異及びインデルを生成するように構成されたゲノム編集システムは、例えば、特定の最終配列の生成が必要でない場合及び／又はフレームシフト変異が耐容される場合、標的配列を中断するのに有用である。それらは、所望の特定の配列が所与の部位におけるＳＳＢ又はＤＳＢの修復から優先的に生じる傾向がある限り、特定の配列が好ましい状況でも有用であり得る。インデル変異は、特定のゲノム編集システム及びそれらの構成要素の活性を評価又はスクリーニングするための有用なツールでもある。これらの及び他の設定では、インデルは、（ａ）ゲノム編集システムと接触される細胞のゲノムにおけるそれらの相対的及び絶対的頻度、及び（ｂ）例えば、未編集の配列に対する±１、±２、±３などの数値的な差の分布によって特徴付けられ得る。一例として、リード発見設定では、複数のｇＲＮＡをスクリーニングして、制御された条件下でのインデル読み取りに基づいて、標的部位での切断を最も効率的に推進するｇＲＮＡが同定され得る。閾値頻度以上のインデルを生成するガイド又はインデルの特定の分布を生成するガイドが、さらなる研究及び開発のために選択され得る。インデルの頻度及び分布は、例えば、ｇＲＮＡを一定に保ち、他の特定の反応条件又は送達方法を変化させることにより、異なるゲノム編集システムの実装又は製剤化及び送達方法を評価するための読み取りとしても有用であり得る。
多重ストラテジー
上記の例示的なストラテジーは、単一のＤＳＢによって媒介される修復結果に焦点を合わせている一方で、本開示によるゲノム編集システムを使用して、同一遺伝子座又は異なる遺伝子座のいずれかで２つ以上のＤＳＢが生成され得る。複数のＤＳＢ又はＳＳＢの形成を含む編集ストラテジーは、例えば、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏらに記載される。本明細書に記載されるように、本開示に包含される方法及び組成物を使用して、例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上又は１０以上のＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子などの２つ以上のＴ細胞発現遺伝子を修飾することにより、Ｔ細胞の増殖、生存、持続性及び／又は機能に影響を及ぼし得る。
ドナー鋳型設計
ドナー鋳型設計は、例えば、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏなどの文献に詳細に記載される。一本鎖（ｓｓＯＤＮ）又は二本鎖（ｄｓＯＤＮ）であり得るＤＮＡオリゴマードナー鋳型（オリゴデオキシヌクレオチド又はＯＤＮ）が、ＤＳＢのＨＤＲに基づく修復を容易にするために使用され得、それは、標的ＤＮＡ配列に修飾を導入し、新しい配列を標的配列に挿入するか、又は標的配列を完全に置換するのに特に有用である。
一本鎖であるか又は二本鎖であるかにかかわらず、ドナー鋳型は、切断される標的配列中の又はその付近の（例えば、側方の又は隣接している）ＤＮＡ領域と相同的な領域を一般に含む。これらの相同領域は、本明細書「相同性アーム」と称され、下に概略的に示される。
［５’相同性アーム］－－［置換配列］－－［３’相同性アーム］
相同性アームは任意の適切な長さ（１つの相同性アームのみが使用される場合には皆無のヌクレオチドを含む）を有し得、３’及び５’相同性アームは、同じ長さを有し得るか又は長さが異なり得る。適切な相同性アーム長の選択は、Ａｌｕ反復配列又は他の非常に一般的な要素などの特定の配列との相同性又はミクロ相同性を回避したいという願望などの様々な要因によって影響を受け得る。例えば、５’相同性アームが短縮されて配列反復要素が回避され得る。他の実施形態では、３’相同性アームが短縮されて配列反復要素が回避され得る。特定の実施形態では、５’及び３’相同性アームの両方が短縮されて、特定の配列反復要素の包含が回避され得る。さらに、いくつかの相同性アームデザインは、編集効率を改善し又は所望の修復結果の頻度を増加させ得る。例えば、参照により援用されるＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４，３３９－３４４（２０１６）（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）は、一本鎖ドナー鋳型の３’及び５’相同性アームの相対的非対称性が、修復率及び／又は結果に影響を及ぼすことを見いだした。
ドナー鋳型中の置換配列は、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏらをはじめとする他の箇所に記載されている。置換配列は、任意の適切な長さ（所望の修復結果が欠失である場合には皆無のヌクレオチドを含む）であり得、典型的には、編集が所望される細胞内の天然配列に対して１、２、３個又はそれを超える配列修飾を含む。１つの一般的な配列修飾は、処置が所望される疾患又は病状に関連する変異を修復するための天然配列の改変を伴う。別の一般的な配列修飾は、ＳＳＢ若しくはＤＳＢを生成するために使用される、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼのＰＡＭ配列又はｇＲＮＡの標的化ドメインに、相補的であり又はそれをコードする１つ又は複数の配列を改変し、置換配列が標的部位に組み込まれた後に標的部位の反復切断を低減又は排除することを伴う。
直鎖ｓｓＯＤＮが使用される場合、それは（ｉ）標的核酸のニックの入った鎖にアニールされ、（ｉｉ）無傷の標的核酸鎖にアニールされ、（ｉｉｉ）標的核酸のプラス鎖にアニールされ、及び／又は（ｉｖ）標的核酸のマイナス鎖にアニールされるように構成され得る。ｓｓＯＤＮは、例えば、約若しくは少なくとも１５０～２００ヌクレオチド又はそれ以下（例えば、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ヌクレオチド）などの任意の適切な長さを有し得る。
鋳型核酸は、ウイルスゲノムなどの核酸ベクター又は例えばプラスミドなどの環状二本鎖ＤＮＡでもあり得ることに留意すべきである。ドナー鋳型を含む核酸ベクターは、他のコーディング又は非コード要素を含み得る。例えば、鋳型核酸は、特定のゲノム骨格要素（例えば、ＡＡＶゲノムの場合には逆方向末端反復）を含み、任意選択的に、ｇＲＮＡ及び／又はＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする追加の配列を含むウイルスゲノムの一部として（例えばＡＡＶ又はレンチウイルスゲノム中で）送達され得る。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、１つ又は複数のｇＲＮＡによって認識される標的部位に隣接するか又はそれに挟まれ、ドナー鋳型の一端又は両端における遊離ＤＳＢの形成を容易にし得、それは、同一ｇＲＮＡを使用して細胞ＤＮＡ中に形成された対応するＳＳＢ又はＤＳＢの修復に関与し得る。ドナー鋳型として使用するのに適した例示的な核酸ベクターは、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏ ｅｔ ａｌ．に記載される。
どのような形態が使用されても、鋳型核酸は、望ましくない配列を回避するように設計され得る。特定の実施形態では、片方又は両方の相同性アームが短縮され、例えばＡｌｕ反復、ＬＩＮＥ要素などの特定の配列反復要素との重複が回避され得る。
標的化組み込み
本開示は、細胞内の標的核酸の切断部位における切断分離事象時に生じる遺伝子編集事象の定量的評価を可能にするように特別に設計されたドナー鋳型を含むゲノム編集システムをさらに提供する。本明細書に記載のゲノム編集システムのドナー鋳型は、ＤＮＡオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）であり、それは、一本鎖（ｓｓＯＤＮ）又は二本鎖（ｄｓＯＤＮ）であり得、二本鎖破断のＨＤＲベースの修復を促進するために使用され得る。ドナー鋳型は、特に、標的ＤＮＡ配列に修飾を導入するか、標的配列に新規配列を挿入するか、又は標的配列全体を置換するのに有用である。本開示は、カーゴ、１つ又は２つの相同性アーム及び１つ又は複数のプライミング部位を含むドナー鋳型を提供する。ドナー鋳型のプライミング部位は、標的核酸へのドナー鋳型の一部の組み込み頻度が容易に評価及び定量化され得るような様式で空間的に配置される。
図４４Ａ、４４Ｂ及び４４Ｃは、代表的なドナー鋳型と、これらのドナー鋳型の使用から得られた潜在的な標的化組み込み結果とを図解する概略図である。本明細書に記載の例示的ドナー鋳型の使用は、標的化核酸中の少なくとも１つのプライミング部位の標的化組み込みをもたらし、これは、標的細胞内の標的化核酸へのカーゴ（例えば、導入遺伝子）の標的化組み込みの頻度を判定するために配列決定され得るアンプリコンを生成するために使用され得る。
例えば、図４４Ａは、５’から３’方向に、第１の相同性アーム（Ａ１）、第１のスタッファー配列（Ｓ１）、第２のプライミング部位（Ｐ２’）、カーゴ、第１のプライミング部位、第２のスタッファー配列及び第２の相同性アームを含む例示的ドナー鋳型を図示する。ドナー鋳型の第１の相同性アーム（Ａ１）は、標的核酸の第１の相同性アームと実質的に同一である一方、ドナー鋳型の第２の相同性アーム（Ａ２）は、標的核酸の第２の相同性アームと実質的に同一である。ドナー鋳型は、第２のプライミング部位（Ｐ２’）が標的核酸の第１のプライミング部位（Ｐ１）と実質的に同一であるように、且つ第１のプライミング部位（Ｐ１’）が標的核酸の第２のプライミング部位（Ｐ２）と実質的に同一であるように設計される。本明細書に記載のヌクレアーゼを使用した標的核酸の切断分離事象時、単一のプライマー対セットを使用して、標的核酸の切断部位周囲の核酸配列（すなわちＰ１及びＰ２間、Ｐ１及びＰ２’間並びにＰ１’及びＰ２間に存在する核酸）を増幅させ得る。有利には、標的化組み込みなし又は標的化組み込みありの切断分離事象から得られるアンプリコン（アンプリコンＸ、Ｙ及びＺとして示される）のサイズは、ほぼ同じである。アンプリコンは、次に、例えば配列決定又はプローブ配列へのハイブリダイゼーションによって評価され、標的化組み込みの頻度が判定され得る。
代わりに、図４４Ｂ及び４４Ｃは、カーゴ核酸配列から３’（図４４Ｂ）又は５’（図４４Ｃ）のいずれかに位置する単一プライミング部位を含む例示的ドナー鋳型を描写する。この場合も、本明細書に記載のヌクレアーゼを使用した標的核酸の切断分離事象時、これらの例示的ドナー鋳型は、ほぼ同じサイズの２つのアンプリコンが得られるように、単一のプライマー対を使用して、標的核酸の切断部位周囲の核酸配列が増幅され得るように設計される。ドナー鋳型のプライミング部位がカーゴ核酸から３’に位置する場合、非標的化組み込み事象に対応するアンプリコン又は標的化組み込み部位の５’接合部に対応するアンプリコンが増幅され得る。ドナー鋳型のプライミング部位がカーゴ核酸から５’に位置する場合、非標的化組み込み事象に対応するアンプリコン又は標的化組み込み部位の３’接合部に対応するアンプリコンが増幅され得る。これらのアンプリコンを配列決定して、標的化組み込みの頻度が判定され得る。
本開示によるドナー鋳型は、限定することなく、直線又は環状、裸の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡをはじめとする任意の適切な様式で実装され得るか若しくはベクター内に含まれ得、且つ／又は（例えば、直接ハイブリダイゼーション若しくはスプリントハイブリダイゼーションによって）ガイドＲＮＡと共有結合的若しくは非共有結合的に結合し得る。特定の実施形態では、ドナー鋳型はｓｓＯＤＮである。直鎖ｓｓＯＤＮが使用される場合、それは、（ｉ）標的核酸のニックの入った鎖にアニールされ、（ｉｉ）無傷の標的核酸鎖にアニールされ、（ｉｉｉ）標的核酸のプラス鎖にアニールされ、且つ／又は（ｉｖ）標的核酸のマイナス鎖にアニールされるように構成され得る。ｓｓＯＤＮは、例えば、約１５０～２００ヌクレオチド又はそれを下回るもの（例えば、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ヌクレオチド）などの任意の適切な長さを有し得る。他の実施形態では、ドナー鋳型は、ｄｓＯＤＮである。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、第１の鎖を含む。別の実施形態では、ドナー鋳型は、第１の鎖及び第２の鎖を含む。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、例えば、細胞に天然に存在しないオリゴヌクレオチドなどの外因性オリゴヌクレオチドである。
ドナー鋳型は、ウイルスゲノム又は例えばプラスミドなどの環状二本鎖ＤＮＡなどの核酸ベクター内にも含まれ得ることに留意すべきである。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、犬用の骨の形状のＤＮＡであり得る（例えば、米国特許第９，４９９，８４７号明細書を参照されたい）。ドナー鋳型を含む核酸ベクターは、他のコーディング又は非コード要素を含み得る。例えば、ドナー鋳型核酸は、特定のゲノム骨格要素（例えば、ＡＡＶゲノムの場合には逆方向末端反復）を含み、任意選択的に、ｇＲＮＡ及び／又はＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする追加の配列を含むウイルスゲノムの一部として（例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルスゲノム中で）送達され得る。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、１つ又は複数のｇＲＮＡによって認識される標的部位に隣接するか又はそれに挟まれ、ドナー鋳型の一端又は両端における遊離ＤＳＢの形成を容易にし得、それは、同一ｇＲＮＡを使用して細胞ＤＮＡ中に形成された対応するＳＳＢ又はＤＳＢの修復に関与し得る。ドナー鋳型として使用するのに適した例示的な核酸ベクターは、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏ ｅｔ ａｌ．に記載される。
相同性アーム
一本鎖又は二本鎖を問わず、ドナー鋳型は、一般に、例えば、例えば切断部位などの切断される標的配列内の又はその近傍の（例えば、それを挟むか又はそれに隣接している）標的核酸などのＤＮＡの領域と相同的な１つ又は複数の領域を含む。これらの相同領域は、本明細書では「相同性アーム」と称され、下に概略的に示される。
［５’相同性アーム］－［置換配列］－［３’相同性アーム］
本明細書に記載のドナー鋳型の相同性アームは、ドナー鋳型を必要とするＤＮＡ修復プロセスによる標的核酸の切断部位の効率的な分離を可能にするのに十分な長さである限り、任意の適切な長さであり得る。例えば、ＰＣＲによる相同性アーム増幅が望まれる特定の実施形態では、相同性アームは、増幅が実施され得るような長さである。相同性アームの配列決定が望まれる特定の実施形態では、相同性アームは、配列決定が実施され得るような長さである。アンプリコンの定量的評価が望まれる特定の実施形態では、相同性アームは、例えば、同様のＧ／Ｃ含有量、増幅温度などを有することにより、各アンプリコンの同様の増幅回数が達成されるような長さである。特定の実施形態では、相同性アームは、二本鎖である。特定の実施形態では、二本鎖相同性アームは、一本鎖である。
特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０～２５０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０～２０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０～１５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０～１０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０～５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１５０～２５０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２０００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１５００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１０００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが７００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが６５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが６００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが４００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが３００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１００ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも４０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも５０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも７０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも１００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも２００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも３００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも４００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも６００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも７００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも１０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも１５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも２０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約４０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約１００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約２００ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０～２５０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０～２０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０～１５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０～１０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０～５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１５０～２５０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２０００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１５００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１０００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが７００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが６５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが６００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが４００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが３００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも４０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも５０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも７０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも１００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも２００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも３００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも４００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも６００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも７００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも１０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも１５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも２０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約４０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約１００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約２００ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０～２５０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０～２０００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０～１５００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０～１０００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０～５００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１５０～２５０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２０００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１５００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１０００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが７００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが６５０塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが６００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５５０塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが４００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが３００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２５０塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１５０塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１００塩基対未満である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも２０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも４０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも５０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも７０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも１００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも２００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも３００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも４００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも５００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも６００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも７００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも１０００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも１５００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも２０００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約２０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約４０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２５０塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約１００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約２００塩基対である。
特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０～２５０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０～２０００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０～１５００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０～１０００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０～５００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１５０～２５０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２０００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１５００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１０００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが７００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが６５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが６００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが４００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが３００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１００塩基対未満である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも２０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも４０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも５０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも７０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも１００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも２００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも３００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも４００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも５００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも６００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも７００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも１０００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも１５００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも２０００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約２０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約４０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約１００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約２００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが４０塩基対である。
５’及び３’相同性アームは、同じ長さであり得るか又は長さが異なり得る。特定の実施形態では、５’及び３’相同性アームは、増幅されて、標的核酸における標的化組み込みなどの遺伝子編集事象の定量的評価を可能にする。特定の実施形態では、遺伝子編集事象の定量的評価は、単一増幅反応で一対のＰＣＲプライマー対を使用して、相同性アームの全体又は一部を増幅させることによる、標的化組み込み部位における５’接合部及び３’接合部の両方の増幅に依存し得る。したがって、５’及び３’相同性アームの長さは、異なり得るが、各相同性アームの長さは、必要に応じて、（例えば、ＰＣＲを使用して）増幅可能でなければならない。さらに、単一ＰＣＲ反応において、５’相同性アームの増幅と、５’及び３’相同性アームの長さの差との両方が望まれる場合、５’及び３’相同性アームの長さの差は、一対のＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ増幅可能でなければならない。
特定の実施形態では、５’及び３’相同性アームの長さには、７５ヌクレオチドを超える差がない。したがって、特定の実施形態では、５’及び３’相同性アームの長さが異なる場合、相同性アーム間の長さの差は、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１ヌクレオチド又は塩基対よりも小さい。特定の実施形態では、５’及び３’相同性アームは、長さが少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４又は７５ヌクレオチドだけ異なる。特定の実施形態では、５’及び３’相同性アーム間の長さの差は、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１塩基対未満である。特定の実施形態では、５’及び３’相同性アームは、長さが少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４又は７５塩基対だけ異なる。
本開示のドナー鋳型は、切断部位を有する標的核酸との相同組換えを促進するように設計され、標的核酸は、５’から３’方向にＰ１－－Ｈ１－－Ｘ－－Ｈ２－－Ｐ２を含み、
ここで、Ｐ１は、第１のプライミング部位であり；Ｈ１は、第１の相同性アームであり；Ｘは、切断部位であり；Ｈ２は、第２の相同性アームであり；Ｐ２は、第２のプライミング部位であり；ドナー鋳型は、５’から３’方向にＡ１－－Ｐ２’－－Ｎ－－Ａ２又はＡ１－－Ｎ－－Ｐ１’－－Ａ２を含み、
ここで、Ａ１は、Ｈ１と実質的に同一の相同性アームであり；Ｐ２’は、Ｐ２と実質的に同一のプライミング部位であり；Ｎは、カーゴであり；Ｐ１’は、Ｐ１と実質的に同一のプライミング部位であり；Ａ２は、Ｈ２と実質的に同一の相同性アームである。特定の実施形態では、標的核酸は、二本鎖である。特定の実施形態では、標的核酸は、第１の鎖及び第２の鎖を含む。別の実施形態では、標的核酸は、一本鎖である。特定の実施形態では、標的核酸は、第１の鎖を含む。
特定の実施形態では、ドナー鋳型は、５’から３’方向にＡ１－－Ｐ２’－－Ｎ－－Ａ２を含む。
特定の実施形態では、ドナー鋳型は、５’から３’方向にＡ１－－Ｐ２’－－Ｎ－－Ｐ１’－－Ａ２を含む。
特定の実施形態では、標的核酸は、５’から３’方向にＰ１－－Ｈ１－－Ｘ－－Ｈ２－－Ｐ２を含み、
ここで、Ｐ１は、第１のプライミング部位であり；Ｈ１は、第１の相同性アームであり；Ｘは、切断部位であり；Ｈ２は、第２の相同性アームであり；Ｐ２は、第２のプライミング部位であり；ドナー鋳型の第１の鎖は、５’から３’方向にＡ１－－Ｐ２’－－Ｎ－－Ａ２又はＡ１－－Ｎ－－Ｐ１’－－Ａ２を含み、
ここで、Ａ１は、Ｈ１と実質的に同一の相同性アームであり；Ｐ２’は、Ｐ２と実質的に同一のプライミング部位であり；Ｎは、カーゴであり；Ｐ１’は、Ｐ１と実質的に同一のプライミング部位であり；Ａ２は、Ｈ２と実質的に同一の相同性アームである。
特定の実施形態では、ドナー鋳型の第１の鎖は、５’から３’方向にＡ１－－Ｐ２’－－Ｎ－－Ｐ１’－－Ａ２を含む。
特定の実施形態では、ドナー鋳型の第１の鎖は、５’から３’方向にＡ１－－Ｎ－－Ｐ１’－－Ａ２を含む。
特定の実施形態では、Ａ１は、長さが７００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが６５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが６００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが５５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが５００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが４００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが３００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが２５０塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが２００塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが１５０塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが１００塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが５０塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが４０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが３０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが２０塩基対である。
特定の実施形態では、Ａ２は、長さが７００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが６５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが６００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが５５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが５００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが４００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが３００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが２５０塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが２００塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが１５０塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが１００塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが５０塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが４０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが３０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが２０塩基対である。
特定の実施形態では、Ａ１は、長さが７００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが６５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが６００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが５５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが５００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが４００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが３００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが２５０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが２００ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが１５０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが１００ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが５０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが少なくとも４０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが少なくとも３０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、Ａ２は、長さが７００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが６５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが６００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが５５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが５００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが４００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが３００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが２５０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが２００ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが１５０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが１００ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが５０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが少なくとも４０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが少なくとも３０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、Ａ１の核酸配列は、Ｈ１の核酸配列と実質的に同一である。特定の実施形態では、Ａ１は、Ｈ１と同一であるか、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０ヌクレオチド以下だけ異なる配列を有する。特定の実施形態では、Ａ１は、Ｈ１と同一であるか、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０塩基対以下だけ異なる配列を有する。
特定の実施形態では、Ａ２の核酸配列は、Ｈ２の核酸配列と実質的に同一である。特定の実施形態では、Ａ２は、Ｈ２と同一であるか、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０ヌクレオチド以下だけ異なる配列を有する。特定の実施形態では、Ａ２は、Ｈ２と同一であるか、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０塩基対以下だけ異なる配列を有する。
どのような形式であれ、ドナー鋳型は、望ましくない配列を回避するように設計され得る。特定の実施形態では、片方又は両方の相同性アームが短縮され、例えばＡｌｕ反復、ＬＩＮＥ要素などの特定の配列反復要素との重複が回避され得る。
プライミング部位
本明細書に記載のドナー鋳型は、標的核酸内のプライミング部位の配列と実質的に類似するか又はそれと同一であるが、ドナー鋳型内の相同性配列／相同性アームに対して異なる空間的順序又は配向にある配列を有する少なくとも１つのプライミング部位を含む。ドナー鋳型が標的核酸と相同的に組換えされる場合、プライミング部位は、有利には標的核酸に組み込まれ、その結果、組換え事象によって生じる修飾核酸配列の一部の増幅を可能にする。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、少なくとも１つのプライミング部位を含む。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、第１及び第２のプライミング部位を含む。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、３つ以上のプライミング部位を含む。
特定の実施形態では、ドナー鋳型は、標的核酸内において、プライミング部位Ｐと実質的に同様であるか又は同一のプライミング部位Ｐ１’を含み、ドナー鋳型が標的核酸に組み込まれると、Ｐ１’は、Ｐ１の下流に組み込まれる。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、第１のプライミング部位Ｐ１’及び第２のプライミング部位Ｐ２’を含み；Ｐ１’は、標的核酸内で第１のプライミング部位Ｐ１と実質的に同様であるか又は同一であり；Ｐ２’は、標的核酸内で第２のプライミング部位Ｐ２と実質的に同様であるか又は同一であり；Ｐ１及びＰ２は、実質的に同様でないか又は同一でない。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、第１のプライミング部位Ｐ１’及び第２のプライミング部位Ｐ２’を含み；Ｐ１’は、標的核酸内で第１のプライミング部位Ｐ１と実質的に同様であるか又は同一であり；Ｐ２’は、標的核酸内で第２のプライミング部位Ｐ２と実質的に同様であるか又は同一であり；Ｐ２は、標的核酸上でＰ１の下流に位置し；Ｐ１及びＰ２は、実質的に同様でないか又は同一でなく；ドナー鋳型が標的核酸に組み込まれると、Ｐ１’は、Ｐ１の下流に組み込まれる。Ｐ２’は、Ｐ２の上流に組み込まれ、Ｐ２’は、Ｐ１の上流に組み込まれる。
特定の実施形態では、標的核酸は、第１のプライミング部位（Ｐ１）及び第２のプライミング部位（Ｐ２）を含む。標的核酸の第１のプライミング部位は、第１の相同性アーム内にあり得る。代わりに、標的核酸の第１のプライミング部位は、５’にあり、第１の相同性アームに隣接し得る。標的核酸の第２のプライミング部位は、第２の相同性アーム内にあり得る。代わりに、標的核酸の第２のプライミング部位は、３’にあり、第２の相同性アームに隣接し得る。
ドナー鋳型は、カーゴ配列、第１のプライミング部位（Ｐ１’）及び第２のプライミング部位（Ｐ２’）を含み得、Ｐ２’は、カーゴ配列の５’に位置し、Ｐ１’は、カーゴ配列の３’に位置し（すなわちＡ１－－Ｐ２’－－Ｎ－－Ｐ１’－－Ａ２）、Ｐ１’は、Ｐ１と実質的に同一であり、Ｐ２’は、Ｐ２と実質的に同一である。このシナリオにおいて、Ｐ１’及びＰ１を標的とするオリゴヌクレオチドを含むプライマー対並びにＰ２’及びＰ２を含むオリゴヌクレオチドを使用して、標的化される遺伝子座が増幅され得、それにより同様のサイズの３つのアンプリコンが生成され、これを配列決定して標的化組み込みが生じたかどうかが判定され得る。第１のアンプリコン、アンプリコンＸは、標的核酸における非標的化組み込みの結果として、Ｐ１及びＰ２間の核酸配列の増幅によって生じる。第２のアンプリコン、アンプリコンＹは、標的核酸の標的化組み込み事象後にＰ１及びＰ２’間の核酸配列の増幅によって生じ、それによって５’接合部を増幅させる。第３のアンプリコン、アンプリコンＺは、標的核酸の標的化組み込み事象後にＰ１’及びＰ２間の核酸配列の増幅によって生じ、それによって３’接合部を増幅させる。他の実施形態では、Ｐ１’は、Ｐ１と同一であり得る。さらに、Ｐ２’は、Ｐ２と同一であり得る。
特定の実施形態では、ドナー鋳型は、カーゴ及びプライミング部位（Ｐ１’）を含み、Ｐ１’は、カーゴ核酸配列の３’に位置し（ｒｎｐＡ１－－Ｎ－－Ｐ１’－－Ａ２）、Ｐ１’は、Ｐ１と実質的に同一である。このシナリオにおいて、Ｐ１’及びＰ１を標的とするオリゴヌクレオチドを含むプライマー対及びＰ２を標的とするオリゴヌクレオチドを使用して、標的化される遺伝子座が増幅され得、それにより同様のサイズの２つのアンプリコンが生成され、これを配列決定して標的化組み込みが生じたかどうかが判定され得る。第１のアンプリコン、アンプリコンＸは、標的核酸における非標的化組み込みの結果として、Ｐ１及びＰ２間の核酸配列の増幅によって生じる。第２のアンプリコン、アンプリコンＺは、標的核酸の標的化組み込み事象後にＰ１’及びＰ２間の核酸配列の増幅によって生じ、それによって３’接合部を増幅させる。他の実施形態では、Ｐ１’は、Ｐ１と同一であり得る。さらに、Ｐ２’は、Ｐ２と同一であり得る。
特定の実施形態では、標的核酸は、第１のプライミング部位（Ｐ１）及び第２のプライミング部位（Ｐ２）を含み、ドナー鋳型は、プライミング部位Ｐ２’を含み、Ｐ２’は、カーゴ核酸配列の５’に位置し（すなわちＡ１－－Ｐ２’－－Ｎ－－Ａ２）、Ｐ２’は、Ｐ２と実質的に同一である。このシナリオにおいて、Ｐ２’及びＰ２を標的とするオリゴヌクレオチドを含むプライマー対及びＰ１を標的とするオリゴヌクレオチドを使用して、標的化される遺伝子座が増幅され得、それにより同様のサイズの２つのアンプリコンが生成され、これを配列決定して標的化組み込みが生じたかどうかが判定され得る。第１のアンプリコン、アンプリコンＸは、標的核酸における非標的化組み込みの結果として、Ｐ１及びＰ２間の核酸配列の増幅によって生じる。第２のアンプリコン、アンプリコンＹは、標的核酸の標的化組み込み事象後にＰ１及びＰ２’間の核酸配列の増幅によって生じ、それによって５’接合部を増幅させる。他の実施形態では、Ｐ１’は、Ｐ１と同一であり得る。さらに、Ｐ２’は、Ｐ２と同一であり得る。
ドナー鋳型のプライミング部位は、標的核酸の一部の増幅及び／又は配列決定による、標的核酸における遺伝子編集事象の定量的評価が可能になる任意の長さであり得る。例えば、特定の実施形態では、標的核酸は、第１のプライミング部位（Ｐ１）を含み、ドナー鋳型は、プライミング部位（Ｐ１’）を含む。これらの実施形態では、Ｐ１’プライミング部位及びＰ１プライマー部位の長さは、単一のプライマーが両方のプライミング部位に特異的にアニールし得るような長さである（例えば、特定の実施形態では、Ｐ１’プライミング部位及びＰ１プライミング部位の長さは、いずれも同一の又は非常に良く類似したＧＣ含有量を有するような長さである）。
特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが６０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが６０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが５０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが４０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが３０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが６０塩基対である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが６０塩基対未満である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが５０塩基対未満である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが４０塩基対未満である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが３０塩基対未満である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０塩基対である。
特定の実施形態では、標的核酸の切断部位における切断分離事象及び標的核酸によるドナー鋳型の相同組換えに際して、標的核酸の第１のプライミング部位（Ｐ１）と現在組み込まれたＰ２’プライミング部位との間の距離は、６００塩基対以下である。特定の実施形態では、標的核酸の切断部位における切断分離事象及び標的核酸によるドナー鋳型の相同組換えに際して、標的核酸の第１のプライミング部位（Ｐ１）と現在組み込まれたＰ２’プライミング部位との間の距離は、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０塩基対以下である。特定の実施形態では、標的核酸における切断分離事象及び標的核酸によるドナー鋳型の相同組換えに際して、標的核酸の第１のプライミング部位（Ｐ１）と現在組み込まれたＰ２’プライミング部位との間の距離は、６００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、標的核酸における切断分離事象及び標的核酸によるドナー鋳型の相同組換えに際して、標的核酸の第１のプライミング部位（Ｐ１）と現在組み込まれたＰ２’プライミング部位との間の距離は、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０ヌクレオチド以下である。
特定の実施形態では、標的核酸は、第２のプライミング部位（Ｐ２）を含み、ドナー鋳型は、Ｐ２と実質的に同一のプライミング部位（Ｐ２’）を含む。特定の実施形態では、標的核酸における切断分離事象及び標的核酸によるドナー鋳型の相同組換えに際して、標的核酸の第２のプライミング部位（Ｐ２）と現在組み込まれたＰ１’プライミング部位との間の距離は、６００塩基対以下である。特定の実施形態では、標的核酸における切断分離事象及び標的核酸によるドナー鋳型の相同組換えに際して、標的核酸の第２のプライミング部位（Ｐ２）と現在組み込まれたＰ１’プライミング部位との間の距離は、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０塩基対以下である。特定の実施形態では、標的核酸における切断分離事象及び標的核酸によるドナー鋳型の相同組換えに際して、標的核酸の第２のプライミング部位（Ｐ２）と現在組み込まれたＰ１’プライミング部位との間の距離は、６００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、標的核酸における切断分離事象及び標的核酸によるドナー鋳型の相同組換えに際して、標的核酸の第２のプライミング部位（Ｐ２）と現在組み込まれたＰ１’プライミング部位との間の距離は、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０ヌクレオチド以下である。
特定の実施形態では、Ｐ２’の核酸配列は、Ａ１の核酸配列内に含まれる。特定の実施形態では、Ｐ２’の核酸配列は、Ａ１の核酸配列に直接隣接する。特定の実施形態では、Ｐ２’の核酸配列は、Ｎの核酸配列に直接隣接する。特定の実施形態では、Ｐ２’の核酸配列は、Ｎの核酸配列内に含まれる。
特定の実施形態では、Ｐ１’の核酸配列は、Ａ２の核酸配列内に含まれる。特定の実施形態では、Ｐ１’の核酸配列は、Ａ２の核酸配列に直接隣接する。特定の実施形態では、Ｐ１’の核酸配列は、Ｎの核酸配列に直接隣接する。特定の実施形態では、Ｐ１’の核酸配列は、Ｎの核酸配列内に含まれる。
特定の実施形態では、Ｐ２’の核酸配列は、Ｓ１の核酸配列内に含まれる。特定の実施形態では、Ｐ２’の核酸配列は、Ｓ１の核酸配列に直接隣接する。特定の実施形態では、Ｐ１’の核酸配列は、Ｓ２の核酸配列内に含まれる。特定の実施形態では、Ｐ１’の核酸配列は、Ｓ２の核酸配列に直接隣接する。
カーゴ
本明細書に記載の遺伝子編集システムのドナー鋳型は、カーゴ（Ｎ）を含む。カーゴは、所望の結果を達成するために必要な任意の長さであり得る。例えば、カーゴ配列は、長さが２５００塩基対未満又は２５００ヌクレオチド未満であり得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、１２ｋｂ以下であり得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、１０ｋｂ以下であり得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、７ｋｂ以下であり得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、５ｋｂ以下であり得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、４ｋｂ以下であり得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、３ｋｂ以下であり得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、２ｋｂ以下であり得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、１ｋｂ以下であり得る。特定の実施形態では、カーゴは、長さが約５～１０ｋｂであり得る。別の実施形態では、カーゴは、長さが約１～５ｋｂであり得る。別の実施形態では、カーゴは、長さが約０～１ｋｂであり得る。例えば、例示的な実施形態では、カーゴは、長さが約１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００又は１００塩基対又はヌクレオチドであり得る。他の例示的実施形態では、カーゴは、長さが約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０塩基対又はヌクレオチドであり得る。当業者は、サイズ制限がある送達ビヒクル（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、組み込み欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）送達ビヒクルなどのウイルス送達ビヒクル）を使用してドナー鋳型を送達する際、カーゴを含めたドナー鋳型のサイズが送達システムのサイズ制限を超えてはならないことを容易に確認するであろう。
特定の実施形態では、カーゴは、置換配列を含む。特定の実施形態では、カーゴは、遺伝子配列のエクソンを含む。特定の実施形態では、カーゴは、遺伝子配列のイントロンを含む。特定の実施形態では、カーゴは、ｃＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、カーゴは、転写調節エレメントを含む。特定の実施形態では、カーゴは、置換配列の逆相補体、遺伝子配列のエクソン、遺伝子配列のイントロン、ｃＤＮＡ配列又は転写調節エレメントを含む。特定の実施形態では、カーゴは、置換配列の一部、遺伝子配列のエクソン、遺伝子配列のイントロン、ｃＤＮＡ配列又は転写調節エレメントを含む。特定の実施形態では、カーゴは、導入遺伝子配列である。特定の実施形態では、カーゴは、標的核酸に欠失を導入する。特定の実施形態では、カーゴは、外因性配列を含む。他の実施形態では、カーゴは、内因性配列を含む。
ドナー鋳型中の置換配列は、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏ ｅｔ ａｌ．をはじめとする他の箇所に記載されている。置換配列は、任意の適切な長さ（所望の修復結果が欠失である場合には皆無のヌクレオチドを含む）であり得、典型的には、編集が所望される細胞内の天然配列に対して１つ、２つ、３つ又はそれを超える配列修飾を含む。１つの一般的な配列修飾は、治療が所望される疾患又は病状に関連する変異を修復するための天然配列の改変を伴う。別の一般的な配列修飾は、ＳＳＢ又はＤＳＢを生成するために使用される、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼのＰＡＭ配列又はｇＲＮＡの標的化ドメインに相補的であるか又はそれをコードする１つ又は複数の配列を改変し、置換配列が標的部位に組み込まれた後に標的部位の反復切断を低減又は排除することを伴う。
編集される細胞型、標的核酸及び達成すべき効果に基づいて、所与の用途のために特定のカーゴが選択され得る。
例えば、特定の実施形態では、標的細胞内の選択された染色体遺伝子座で所望の遺伝子配列を「ノックイン」することが望ましい場合がある。このような場合、カーゴは、所望の遺伝子配列を含み得る。特定の実施形態では、遺伝子配列は、例えば、外因性タンパク質、オルソロガスタンパク質若しくは内因性タンパク質又はそれらの組み合わせなどの所望のタンパク質をコードする。
特定の実施形態では、カーゴは、野生型配列又は野生型配列に関して１つ又は複数の修飾を含む配列を含有し得る。例えば、細胞内の標的遺伝子の変異を修正することが望ましいいくつかの実施形態では、カーゴは、野生型配列を標的タンパク質に復元するように設計され得る。
他の実施形態では、標的細胞内の選択された染色体遺伝子座で、遺伝子配列を「ノックアウト」することも望ましいことがあり得る。このような場合、カーゴは、例えば、標的遺伝子配列のコード領域又は例えば標的遺伝子配列のプロモーター若しくはエンハンサーなどの標的遺伝子配列の発現制御領域などの標的遺伝子配列の発現を妨害する部位に組み込まれるように設計され得る。他の実施形態では、カーゴは、標的遺伝子配列を破壊するように設計され得る。例えば、特定の実施形態では、カーゴは、欠失、挿入、停止コドン又はフレームシフト変異を標的核酸に導入し得る。
特定の実施形態では、ドナーは、標的核酸配列の全部又は一部を欠失させるように設計される。特定の実施形態では、ドナーの相同性アームは、所望の欠失部位を挟むように設計され得る。特定の実施形態では、ドナーは、相同性アーム間にカーゴ配列を含有せず、ドナーの標的化組み込みに続いて、相同性アーム間に位置する標的核酸の一部の欠失をもたらす。他の実施形態では、ドナーは、標的核酸に相同的なカーゴ配列を含み、標的核酸配列の１つ又は複数のヌクレオチドがカーゴに存在しない。ドナーの標的組込みに続いて、標的核酸は、カーゴ配列に存在しない残基に欠失を含むであろう。欠失のサイズは、標的核酸のサイズと所望の効果に基づいて選択され得る。特定の実施形態では、ドナーは、標的組込みに続いて標的核酸に１～２０００ヌクレオチドの欠失を導入するように設計される。他の実施形態では、ドナーは、標的組込みに続いて標的核酸に１～１０００ヌクレオチドの欠失を導入するように設計される。他の実施形態では、ドナーは、標的組込みに続いて標的核酸に１～５００ヌクレオチドの欠失を導入するように設計される。他の実施形態では、ドナーは、標的組込みに続いて標的核酸に１～１００ヌクレオチドの欠失を導入するように設計される。例示的な実施形態では、ドナーは、標的組込みに続いて、標的核酸に約２０００、１５００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ヌクレオチドの欠失を導入するように設計される。他の実施形態では、ドナーは、標的組込みに続いて、標的核酸から例えば約２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００ヌクレオチド以上の欠失などの２０００ヌクレオチドを超える欠失を導入するように設計される。
特定の実施形態では、カーゴは、プロモーター配列を含み得る。他の実施形態では、カーゴは、標的細胞に内因性のプロモーターの制御下にある部位に組み込まれるように設計される。
特定の実施形態では、染色体配列は、不活性化されるが、外因性配列が発現されるように、外因性又はオルソロガスタンパク質又はポリペプチドをコードするカーゴが、タンパク質をコードする染色体配列に組み込まれ得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、染色体配列の発現を変化させることなく、染色体配列に組み込まれ得る。これは、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、ＨＰＲＴ遺伝子座又はＡＡＶ遺伝子座などの「セーフハーバー」遺伝子座にカーゴを組み込むことによって達成され得る。
特定の実施形態では、カーゴは、疾患又は障害に関連するタンパク質をコードする。特定の実施形態では、カーゴは、タンパク質の野生型形態をコードし得るか、又は疾患又障害に罹患した対象においてタンパク質が欠損している場合、タンパク質の野生型形態の発現を回復するように設計される。他の実施形態では、カーゴは、疾患又は障害に関連するタンパク質をコードし、カーゴによってコードされるタンパク質は、タンパク質の改変バージョンが疾患又は障害の発症から保護するように少なくとも１つの修飾を含む。他の実施形態では、カーゴは、タンパク質の改変バージョンが疾患又は障害を引き起こすか又は増強するように、少なくとも１つの修飾を含むタンパク質をコードする。
特定の実施形態では、カーゴを使用して、１つの種からの遺伝子が異なる種のゲノムに挿入され得る。例えば、「ヒト化」動物モデル及び／又は「ヒト化」動物細胞は、例えば、マウス、ラット又は非ヒト霊長類種などの非ヒト動物種のゲノムへのヒト遺伝子の標的化組み込みを通じて生成され得る。特定の実施形態では、このようなヒト化動物モデル及び動物細胞は、１つ又は複数のヒトタンパク質をコードする組み込まれた配列を含有する。
別の実施形態では、カーゴは、穀物、果物又は野菜などの作物をはじめとする植物種に利益を与えるタンパク質をコードする。例えば、カーゴは、植物をより高い温度で栽培することを可能にするタンパク質をコードし得、収穫に続く貯蔵寿命の延長又は耐病性を付与し得る。特定の実施形態では、カーゴは、病気及び害虫への耐性を与えるタンパク質をコードし得る（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７８９（クラドスポリウム クラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍ）耐性のためのトマトＣｆ－９遺伝子のクローニング）；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４３２；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７８：１０８９（シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）に対する耐性のためのＲＳＰ２遺伝子）；国際公開第９６／３０５１７号パンフレット（大豆嚢胞線虫への耐性）参照されたい）。他の実施形態では、その内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１３／０３２６６４５Ａ１号明細書に記載されるように、カーゴは、除草剤への耐性をコードするタンパク質をコードし得る。別の実施形態では、カーゴは、例えば、限定することなく、例えばデンプンの分岐パターンを変化させる酵素をコードする遺伝子で植物を形質転換することによってもたらされる、脂肪酸代謝の改変、フィチン酸塩含有量の低下及び炭水化物組成の変化などの付加価値のある形質を植物細胞に与えるタンパク質をコードする（例えば、Ｓｈｉｒｏｚａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｌ．１７０：８１０（ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）変異体フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）；Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０：２２０（レバンスクラーゼ遺伝子）；Ｐｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：２９２（α－アミラーゼ）；Ｅｌｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：５１５（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）；Ｓｏｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２４８０（大麦α－アミラーゼ遺伝子）；及びＦｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０４５（トウモロコシ内胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ）を参照されたい）。植物細胞における標的化組み込みに有用な他の例示的なカーゴは、その内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１３／０３２６６４５Ａ１号明細書に記載されている。
追加的なカーゴは、編集される細胞型、標的核酸及び達成すべき効果に基づいて、所与の用途のために当業者によって選択され得る。
スタッファー
特定の実施形態では、ドナー鋳型は、任意選択的に１つ又は複数のスタッファー配列を含み得る。一般に、スタッファー配列は、（ａ）本開示のドナー鋳型の標的部位への標的化組み込み及び本開示の特定の方法によるスタッファー配列を含むアンプリコンの引き続く増幅を促進する（又は阻害しない）が、（ｂ）ドナー鋳型の別の部位への組み込みを推進することを回避するように選択されている異種又はランダムな核酸配列である。スタッファー配列は、例えば、相同性アームＡ１とプライマー部位Ｐ２’との間に配置され、ドナー鋳型配列が標的部位に組み込まれたときに生成されるアンプリコンのサイズが調節され得る。このようなサイズ調節を用いて、一例として、組み込まれた標的及び組み込まれていない標的部位によって生成されるアンプリコンのサイズの平衡が保たれ、その結果、各アンプリコンが単一のＰＣＲ反応で生成される効率の平衡が保たれ；続いて、これは、反応混合物中の２つのアンプリコンの相対存在量に基づいて、標的化組み込みの定量的評価を容易にし得る。
標的化組み込み及び増幅を容易にするために、スタッファー配列を選択して、ＤＮＡ修復機構（例えば、相同組換えを介した）によって断部位の分離を妨げ得るか又は増幅を妨げ得る二次構造の形成が最小化され得る。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、５’から３’方向にＡ１－－Ｓ１－－Ｐ２’－－Ｎ－－Ａ２又はＡ１－－Ｎ－－Ｐ１’－－Ｓ２－－Ａ２を含み；
ここで、Ｓ１は、第１のスタッファー配列であり、Ｓ２は、第２のスタッファー配列である。
特定の実施形態では、ドナー鋳型は、５’から３’方向にＡ１－－Ｓ１－－Ｐ２’－－Ｎ－－Ｐ１’－－Ｓ２－－Ａ２を含み、
ここで、Ｓ１は、第１のスタッファー配列であり、Ｓ２は、第２のスタッファー配列である。
特定の実施形態では、スタッファー配列は、細胞全体のゲノムとほぼ同じグアニン－シトシン含有量（「ＧＣ含有量」）を含む。特定の実施形態では、スタッファー配列は、標的化される遺伝子座とほぼ同じＧＣ含有量を含む。例えば、標的細胞がヒト細胞である場合、スタッファー配列は、約４０％のＧＣ含有量を含む。特定の実施形態では、スタッファー配列は、所望のＧＣ含有量を含むランダム核酸配列を作成することによって設計され得る。例えば、４０％のＧＣ含有量を含むスタッファー配列を生成するために、次のヌクレオチドの分布を有する核酸配列が設計され得る：Ａ＝３０％、Ｔ＝３０％、Ｇ＝２０％、Ｃ＝２０％。ゲノムのＧＣ含有量又は標的遺伝子座のＧＣ含有量を判定するための方法は、当業者に知られている。したがって、特定の実施形態では、スタッファー配列は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％６０％、６５％、７０％又は７５％のＧＣ含有量を含む。４０±５％のＧＣ含有量を有する例示的な２．０キロベーススタッファー配列が配列番号２３～１２３として本明細書で提供される。
特定の実施形態では、第１のスタッファーは、配列番号２３～１２３に記載される配列の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１０５、少なくとも１１０、少なくとも１１５、少なくとも１２０、少なくとも１２５、少なくとも１３０、少なくとも１３５、少なくとも１４０、少なくとも１４５、少なくとも１５０、少なくとも１５５、少なくとも１６０、少なくとも１６５、少なくとも１７０、少なくとも１７５、少なくとも１８０、少なくとも１８５、少なくとも１９０、少なくとも１９５、少なくとも２００、少なくとも２０５、少なくとも２１０、少なくとも２１５、少なくとも２２０、少なくとも２２５、少なくとも２３０、少なくとも２３５、少なくとも２４０、少なくとも２４５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５又は少なくとも５００ヌクレオチドを含む配列を有する。別の実施形態では、第２のスタッファーは、配列番号２３～１２３に記載される配列の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１０５、少なくとも１１０、少なくとも１１５、少なくとも１２０、少なくとも１２５、少なくとも１３０、少なくとも１３５、少なくとも１４０、少なくとも１４５、少なくとも１５０、少なくとも１５５、少なくとも１６０、少なくとも１６５、少なくとも１７０、少なくとも１７５、少なくとも１８０、少なくとも１８５、少なくとも１９０、少なくとも１９５、少なくとも２００、少なくとも２０５、少なくとも２１０、少なくとも２１５、少なくとも２２０、少なくとも２２５、少なくとも２３０、少なくとも２３５、少なくとも２４０、少なくとも２４５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５又は少なくとも５００ヌクレオチドを含む配列を有する。
スタッファー配列は、標的核酸における切断部位の分離を妨害しないことが好ましい。したがって、スタッファー配列は、標的核酸の切断部位において、核酸配列との最小の配列同一性を有するべきである。特定の実施形態では、スタッファー配列は、標的核酸の切断部位から５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０ヌクレオチド以内の任意の核酸配列と８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％未満が同一である。特定の実施形態では、スタッファー配列は、標的核酸の切断部位から５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０塩基対以内の任意の核酸配列と８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％未満が同一である。
オフターゲット分子組換え事象を回避するために、スタッファー配列は、標的細胞のゲノム中の核酸配列に対して最小の相同性を有することが好ましい。特定の実施形態では、スタッファー配列は、標的細胞のゲノム中の核酸に対して最小の配列同一性を有する。特定の実施形態では、スタッファー配列は、標的細胞のゲノム内の（塩基対又はヌクレオチドでの測定で）同一長さの任意の核酸配列と８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％未満が同一である。特定の実施形態では、スタッファー配列の２０塩基対のストレッチは、標的細胞ゲノムの核酸の任意の少なくとも２０塩基対のストレッチと８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％未満が同一である。特定の実施形態では、スタッファー配列の２０ヌクレオチドのストレッチは、標的細胞ゲノムの核酸の任意の少なくとも２０ヌクレオチドのストレッチと６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％未満が同一である。
特定の実施形態では、スタッファー配列は、ドナー鋳型中の核酸配列（例えば、カーゴの核酸配列又はドナー鋳型に存在するプライミング部位の核酸配列）との最小の配列同一性を有する。特定の実施形態では、スタッファー配列は、ドナー鋳型内の（塩基対又はヌクレオチドでの測定で）同一長さの任意の核酸配列と８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％未満が同一である。特定の実施形態では、スタッファー配列の２０塩基対のストレッチは、ドナー鋳型の核酸の任意の２０塩基対のストレッチと８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％未満が同一である。特定の実施形態では、スタッファー配列の２０ヌクレオチドのストレッチは、ドナー鋳型の核酸の任意の２０ヌクレオチドのストレッチと８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％未満が同一である。
特定の実施形態では、第１の相同性アーム及びその隣接するスタッファー配列（すなわちＡ１＋Ｓ１）の長さは、第２の相同性アーム及びその隣接するスタッファー配列（すなわちＡ２＋Ｓ２）の長さにほぼ等しい。例えば、特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ａ２＋Ｓ２の長さと同じである（塩基対又はヌクレオチドでの判定による）。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ａ２＋Ｓ２の長さと２５ヌクレオチド以下だけ異なる。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ａ２＋Ｓ２の長さと２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２ヌクレオチド以下だけ異なる。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ａ２＋Ｓ２の長さと２５塩基対以下だけ異なる。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ａ２＋Ｓ２の長さと２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２塩基対以下だけ異なる。
特定の実施形態では、Ａ１＋Ｈ１の長さは、２５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｈ１の長さは、２００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｈ１の長さは、１５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｈ１の長さは、１００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｈ１の長さは、５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｈ１の長さは、２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｈ１の長さは、４０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｈ２の長さは、２５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｈ２の長さは、２００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｈ２の長さは、１５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｈ２の長さは、１００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｈ２の長さは、５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｈ２の長さは、２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｈ２の長さは、４０塩基対である。
特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２の長さと同じである（ヌクレオチド又は塩基対での判定による）。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２の長さと２５ヌクレオチド未満だけ異なる。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２の長さと２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２ヌクレオチドだけ異なる。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２の長さと２５塩基対未満だけ異なる。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２長さと２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２塩基対だけ異なる。
特定の実施形態では、Ａ２＋Ｓ２の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２の長さと同じである（ヌクレオチド又は塩基対での判定による）。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｓ２の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２の長さと２５ヌクレオチド未満だけ異なる。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｓ２の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２の長さと２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２ヌクレオチドだけ異なる。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｓ２の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２の長さと２５塩基対未満だけ異なる。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｓ２の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２長さと２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２塩基対だけ異なる。
標的細胞
本開示によるゲノム編集システムを使用して、細胞が操作又は修飾され、例えば標的核酸が編集又は修飾され得る。操作は、様々な実施形態において、インビボ又はエクスビボで行われ得る。
本開示の実施形態に従って様々な細胞型が操作又は修飾され得、インビボ用途などの場合、例えば本開示によるゲノム編集システムを複数の細胞型に送達することにより、複数の細胞型が修飾又は操作され得る。しかし、他の場合、操作又は修飾を特定の細胞型に限定することが望ましいことがあり得る。例えば、いくつかの例では、遺伝子型の修飾が細胞表現型の変化をもたらすと予想される、Ｍａｅｄｅｒの例における光受容細胞などの、限定された分化能を有する細胞又は最終分化細胞を編集することが望ましくあり得る。しかし、他の場合、低分化型、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）又は多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、幹細胞又は前駆細胞を編集することが望ましいことがある。例として、細胞は、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）又は所与の用途又は適応症に関連する細胞型に分化する他の幹細胞又は前駆細胞型であり得る。
特定の実施形態では、操作される細胞は、真核細胞である。例えば、限定されるものではないが、細胞は、脊椎動物、哺乳類、齧歯類、ヤギ、豚、鳥、鶏、七面鳥、ウシ、ウマ、ヒツジ、魚類、霊長類又はヒト細胞である。特定の実施形態では、操作される細胞は、体細胞、胚芽細胞又は出生前細胞である。特定の実施形態では、操作される細胞は、接合体細胞、胚盤胞細胞、胎芽細胞、幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞又は減数分裂コンピテント細胞である。特定の実施形態では、操作される細胞は、ヒト胚の一部でない。特定の実施形態では、操作される細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ８＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ８＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞、ＴＨ１７ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ１ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ２ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ９ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞である。特定の実施形態では、操作される細胞は、長期造血幹細胞、短期造血幹細胞、多能性前駆細胞、系統限定前駆細胞、リンパ系前駆細胞、骨髄系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、赤血球前駆細胞、巨核球赤血球前駆細胞、レチナール細胞、光受容体細胞、棒細胞、円錐細胞、網膜色素上皮細胞、小柱網細胞、蝸牛毛細胞、外有毛細胞、内有毛細胞、肺上皮細胞、気管支上皮細胞、肺胞上皮細胞、肺上皮前駆細胞、横紋筋細胞、心筋細胞、筋肉衛星細胞、ニューロン、神経細胞幹細胞、間葉系幹細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞、単球、巨核球、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、網状赤血球、Ｂ細胞（例えば、前駆細胞Ｂ細胞、プレＢ細胞、プロＢ細胞、記憶Ｂ細胞、血漿Ｂ細胞など）、胃腸上皮細胞、胆管上皮細胞、膵管上皮細胞、腸管幹細胞、肝実質細胞、肝臓星細胞、クッパー細胞、骨芽細胞、破骨細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、膵島細胞（例えば、β細胞、α細胞、δ細胞）、膵臓外分泌細胞、シュワン細胞又は乏突起膠細胞である。特定の実施形態では、操作される細胞は、例えば、単子葉植物又は双子葉植物細胞などの植物細胞である。
特定の実施形態では、標的細胞は、例えば、網状赤血球、巨核球赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）細胞、骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ／ＧＭＰ）、リンパ系前駆細胞（ＬＰ）細胞、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）又は内皮細胞（ＥＣ）などの循環血液細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は、骨髄細胞（例えば、網状赤血球、赤血球系細胞（例えば、赤芽球）、ＭＥＰ細胞、骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ／ＧＭＰ）、ＬＰ細胞、赤血球前駆（ＥＰ）細胞、ＨＳＣ、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）細胞、内皮細胞（ＥＣ）、造血内皮（ＨＥ）細胞又は間葉系幹細胞）である。特定の実施形態では、標的細胞は、骨髄系前駆細胞（例えば、共通骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ）細胞又は顆粒球マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）細胞）である。特定の実施形態では、標的細胞は、例えば、共通リンパ系前駆（ＣＬＰ）細胞などのリンパ系前駆細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は赤血球前駆細胞（例えば、ＭＥＰ細胞）である。特定の実施形態では、標的細胞は、造血幹／前駆細胞（例えば、長期ＨＳＣ（ＬＴ－ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ－ＨＳＣ）、ＭＰＰ細胞又は系統制限前駆（ＬＲＰ）細胞）である。特定の実施形態では、標的細胞は、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－細胞、ＣＤ１０５＋細胞、ＣＤ３１＋若しくはＣＤ１３３＋細胞又はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１３３＋細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は、臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、臍帯静脈内皮細胞、臍帯動脈内皮細胞、羊水ＣＤ３４＋細胞、羊水内皮細胞、胎盤内皮細胞又は胎盤造血ＣＤ３４＋細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は、動員された末梢血造血ＣＤ３４＋細胞である（患者が例えばＧ－ＣＳＦ又はプレリキサホルなどの動員剤で治療された後）。特定の実施形態では、標的細胞は、末梢血内皮細胞である。
当然ながら、修飾又は操作される細胞は、標的化される細胞型及び／又は所望の編集結果に応じて、様々に、分裂細胞又は非分裂細胞である。
細胞がエクスビボで操作又は修飾される場合、細胞は直ちに使用され得る（例えば、対照に投与され得る）か、又はそれらは後で使用するために維持又は保存され得る。当業者は、当該技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して、細胞が培養物中で維持又は保存され得る（例えば、液体窒素中で凍結される）ことを理解するであろう。
ゲノム編集システムの実装：送達、配合及び投与経路
上で考察されるように、本開示のゲノム編集システムは、任意の適切な方法で実装され得、これは、限定されるものではないが、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、任意のドナー鋳型核酸をはじめとするシステムの構成要素が、ゲノム編集システムの形質導入、発現又は導入をもたらすような、且つ／又は細胞、組織又は対象において所望の修復結果を引き起こすような、任意の適切な形態又は形態の組み合わせで、送達、配合又は投与され得ることを意味する。ゲノム編集システム実装のいくつかの非限定的例が、表１０及び１１に記載される。しかし、当業者は、これらの一覧が包括的でなく、他の実装が可能であることを理解するであろう。特に表１０を参照すると、この表は、単一のｇＲＮＡ及び任意のドナー鋳型を含むゲノム編集システムのいくつかの例示的実装を列挙する。しかし、本開示によるゲノム編集システムには、複数のｇＲＮＡ、複数のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及びタンパク質などの他の構成要素が組み込まれ得、当業者には、表に示された原理に基づいて様々な実装が明らかになるであろう。表中、［Ｎ／Ａ］は、ゲノム編集システムが、示された構成要素を含まないことを示す。
Figure 2024023294000030
表１１は、本明細書に記載されるようなゲノム編集システムの構成要素のための様々な送達方法を要約する。この場合も、一覧は、限定的ではなく、むしろ例示的であることが意図される。
Figure 2024023294000031
ゲノム編集システムの核酸ベースの送達
本開示によるゲノム編集システムの様々な要素をコードする核酸は、当該技術分野で公知の方法によって又は本明細書に記載されるようにして、対象に投与され又は細胞内に送達され得る。例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードするＤＮＡ及び／又はｇＲＮＡをコードするＤＮＡ並びにドナー鋳型核酸は、例えば、ベクター（例えば、ウイルスベクター又は非ウイルスベクター）、非ベクターベースの方法（例えば、裸のＤＮＡ又はＤＮＡ複合体を使用する）又はそれらの組み合わせによって送達され得る。
ゲノム編集システムをコードする核酸又はその構成要素は、例えば、形質移入若しくは電気穿孔によって裸のＤＮＡ若しくはＲＮＡとして細胞に直接送達され得るか、又は標的細胞（例えば、赤血球、ＨＳＣ）による取り込みを促進する分子（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン）にコンジュゲートされ得る。表１１に要約されるベクターなどの核酸ベクターも使用され得る。
核酸ベクターは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ及び／又はドナー鋳型などのゲノム編集システム構成要素をコードする、１つ又は複数の配列を含み得る。ベクターは、タンパク質をコードする配列と結合する（例えば、その中に挿入され又はそれに融合する）シグナルペプチド（例えば、核局在化、核小体局在化又はミトコンドリア局在化のための）をコードする配列も含み得る。一例として、核酸ベクターは、１つ又は複数の核局在化配列（例えば、ＳＶ４０由来の核局在化配列）を含むＣｐｆ１コード配列を含み得る。
核酸ベクターは、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列又は内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）などの任意の適切な数の調節／制御要素も含み得る。これらの要素は当該技術分野で周知であり、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏらに記載される。
本開示による核酸ベクターは、組換えウイルスベクターを含む。例示的なウイルスベクターは表１１に記載され、追加的な適切なウイルスベクター及びそれらの使用と製造は、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏらに記載される。当該技術分野で公知の他のウイルスベクターも使用され得る。さらに、ウイルス粒子を使用して、ゲノム編集システムの構成要素が、核酸及び／又はペプチドの形態で送達され得る。例えば、「空の」ウイルス粒子が、任意の適切な積荷を含有するように組み立てられ得る。ウイルスベクター及びウイルス粒子は、標的化リガンドを組み込んで、標的組織特異性が改変されるようにも操作され得る。
ウイルスベクターに加えて、非ウイルスベクターが、本開示によるゲノム編集システムをコードする核酸を送達するために使用され得る。非ウイルス核酸ベクターの１つの重要なカテゴリーはナノ粒子であり、これは有機又は無機であり得る。ナノ粒子は当該技術分野で周知であり、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏらに要約される。任意の適切なナノ粒子設計を用いて、ゲノム編集システム構成要素又はこのような構成要素をコードする核酸を、送達し得る。例えば、有機（例えば、脂質及び／又はポリマー）ナノ粒子は、本開示の特定の実施形において送達ビヒクルとして使用するのに適し得る。ナノ粒子製剤及び／又は遺伝子移入で使用するための例示的な脂質が表１２に示され、表１３は遺伝子移入及び／又はナノ粒子製剤で使用するための例示的ポリマーを列挙する。
Figure 2024023294000032
Figure 2024023294000033
Figure 2024023294000034
非ウイルスベクターは標的化修飾を任意選択的に含み、取り込みを改善し及び／又は特定の細胞型を選択的に標的化する。これらの標的化修飾としては、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ））及び細胞透過性ペプチドが挙げられる。このようなベクターはまた、任意選択的に、融合誘導性及びエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを使用し、（例えば、積荷のエンドソーム漏出を促進するための）酸誘発立体構造変化を受け、且つ／又は例えば細胞区画への放出のための刺激切断可能ポリマーを組み込む。例えば、還元性細胞環境内で切断されるジスルフィドベースのカチオン性ポリマーが、使用され得る。
特定の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ構成要素及び／又はｇＲＮＡ構成要素などの、ゲノム編集システムの構成要素以外の１つ又は複数の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）が送達される。特定の実施形態では、核酸分子は、ゲノム編集システムの構成要素の１つ又は複数と同時に送達される。特定の実施形態では、核酸分子は、ゲノム編集システムの構成要素の１つ又は複数が送達される（例えば、約３０分間、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日間、３日間、１週間、２週間又は４週間未満）前又は後に送達される。特定の実施形態では、核酸分子は、例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ構成要素及び／又はｇＲＮＡ構成要素などのゲノム編集システムの１つ又は複数の構成要素が送達されるのとは、異なる手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによって送達され得る。例えば、核酸分子は、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ）によって引き起こされる毒性が低下され得るように、例えば組み込み欠損レンチウイルスなどのウイルスベクターによって送達され得、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子構成要素及び／又はｇＲＮＡ構成要素は、電気穿孔によって送達され得る。特定の実施形態では、核酸分子は、例えば、本明細書に記載されるタンパク質などの治療用タンパク質をコードする。特定の実施形態では、核酸分子は、例えば、本明細書に記載されるＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子をコードする。
ＲＮＰ及び／又はＲＮＡをコードするゲノム編集システム構成要素の送達
ＲＮＰ（ｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの複合体）及び／又はＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、そのいくつかがＣｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏらに記載される当該技術分野で公知の方法により、細胞に送達されるか又は対象に投与され得る。インビトロでは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードし及び／又はｇＲＮＡをコードするＲＮＡが、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮又は圧搾によって送達され得る（例えば、Ｌｅｅ ２０１２を参照されたい）。脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、ＧａｌＮＡｃ又は他のコンジュゲート媒介送達及びそれらの組み合わせもインビトロ及びインビボ送達のために使用され得る。
インビトロでは、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバー又はキュベット内において、ドナー鋳型核酸分子の存在下又は非存在下で細胞をＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡをコードするＲＮＡと混合するステップと、１回又は複数回の規定の長さ及び振幅の電気インパルスを適用するステップとを含む。電気穿孔のシステム及びプロトコルは、当該技術分野で公知であり、本開示の様々な実施形態に関連して、任意の適切な電気穿孔ツール及び／又はプロトコルが使用され得る。例示的なシステムとしては、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｌｏｎｚａ）、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（商標）（ＢｉｏＲａｄ）、Ｆｌｏｗ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（商標）形質移入システム（ＭａｘＣｙｔｅ）及びＮｅｏｎ（商標）形質移入システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。
投与経路
ゲノム編集システム又はそのようなシステムを用いて修飾又は操作された細胞は、局所的又は全身的を問わず、任意の適切な様式又は経路によって対象に投与され得る。全身性の投与法としては、経口及び非経口経路が挙げられる。非経口経路としては、例として、静脈内、骨髄内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内及び腹腔内経路が挙げられる。全身投与される構成要素は、例えば、ＨＳＣ、造血幹／前駆細胞又は赤血球前駆体若しくは前駆細胞を標的化するように修飾又は配合され得る。
局所投与様式としては、例として、骨梁への骨髄内注射又は骨髄腔への大腿内注射及び門脈への注入が挙げられる。特定の実施形態では、全身投与（例えば、静脈内）と比較して、局所的に（例えば、骨髄内に直接）投与された場合、（全身的アプローチと比較して）有意により少量の構成要素が効果を発揮し得る。局所投与法は、治療有効量の構成要素が全身投与された場合に起こることもある、潜在的に毒性の副作用の発生を低減又は排除し得る。
投与は、周期的ボーラス（例えば、静脈内）として又は内部リザーバー若しくは外部リザーバーからの持続注入（例えば、静注バッグ又は植込み型ポンプから）として提供され得る。構成要素は、例えば、持続放出薬物送達デバイスからの連続放出により、局所的に投与され得る。
加えて、構成要素は、長時間にわたって放出されるように調合され得る。放出系は、生分解性材料又は拡散によって組み込まれた構成要素を放出する材料のマトリックスを含み得る。構成要素は、放出系内で均一に又は不均一に分布し得る。多様な放出系が有用であり得るが、適切なシステムの選択は、特定の用途によって要求される放出速度に左右される。非分解性及び分解性放出系の両方が使用され得る。適切な放出系としては、ポリマー及びポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックス又は炭酸カルシウム及び糖（例えば、トレハロース）などであるが、これに限定されるものではない、無機及び有機賦形剤及び希釈剤が挙げられる。放出系は、天然又は合成であり得る。しかし、通常、より信頼でき、より再現可であり、より画定された放出プロファイルを生じることから、合成放出系が好ましい。放出系材料は、異なる分子量を有する構成要素が、材料を通じた又は材料の分解による、拡散によって放出されるように選択され得る。
典型的な合成生分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ（アミノ酸）及びポリ（ペプチド）などのポリアミド；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）及びポリ（カプロラクトン）などのポリエステル；ポリ（無水物）；ポリオルトエステル；ポリカーボネート；及びその化学誘導体（例えば、アルキル及びアルキレンなどの化学基の置換及び付加、ヒドロキシル化、酸化及び当業者によって日常的に行われる他の修飾）、共重合体及びそれらの混合物が挙げられる。典型的な合成非分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（エチレングリコール）及びポリ（テトラメチレンオキシド）などのポリエーテル；メチル、エチル、他のアルキル、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリル及びメタクリル酸及びポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）及びポリ（酢酸ビニル）などのビニルポリマー－ポリアクリレート及びポリメタクリレート；ポリ（ウレタン）；セルロースと、アルキル、ヒドロキシアルキル、エーテル、エステル、ニトロセルロース及び様々な酢酸セルロースなどのその誘導体；ポリシロキサン；任意のその化学的誘導体（例えば、アルキル、アルキレンなどの化学基の置換、付加、ヒドロキシル化、酸化及び当業者によって慣例的に加えられる他の修飾）、共重合体及びそれらの混合物が挙げられる。
ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）微小球も使用され得る。典型的に、微小球は、中空球を形成するように構造化された、乳酸及びグリコール酸ポリマーから構成される。球は直径がおよそ１５～３０ミクロンであり得、本明細書に記載される構成要素が負荷され得る。
構成要素の多峰性又は差動送達
当業者は、本開示に鑑みて、本明細書で開示されるゲノム編集システムの異なる構成要素が、一緒に又は別々に且つ同時に又は非同時に送達され得ることを理解するであろう。ゲノム編集システム構成要素の別々の及び／又は非同期の送達は、ゲノム編集システムの機能に対する時間的又は空間的制御を提供し、それらの活性によって引き起こされる特定の効果を制限するために、特に望ましくあり得る。
異なる又は差動様式は、本明細書の用法では、例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子、ｇＲＮＡ、鋳型核酸又はペイロードなどの対象構成要素分子に、異なる薬力学的又は薬物動態特性を付与する送達様式を指す。例えば、送達様式は、例えば、選択された区画、組織又は臓器に、異なる組織分布、異なる半減期又は異なる時間的分布をもたらし得る。
例えば、自律複製又は細胞核酸内への挿入により、細胞内又は細胞子孫内に残留する核酸ベクターによる送達などのいくつかの送達様式は、構成要素のより持続性の発現及び存在をもたらす。例としては、例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルス性などのウイルス性送達が挙げられる。
例として、例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡなどのゲノム編集システムの構成要素は、その結果生じる、体内、特定の区画、組織又は臓器に送達された構成要素の半減期又は持続性に関して異なる様式によって送達され得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡはこのような様式によって送達され得る。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子構成要素は、身体又は特定の区画、若しくは組織、若しくは臓器に対して、より低い持続性又はより少ない曝露をもたらす様式によって送達され得る。
より一般的には、特定の実施形態では、第１の送達様式が使用されて第１の構成要素が送達され、且つ第２の送達様式が使用されて第２の構成要素が送達される。第１の送達様式は、第１の薬力学的又は薬物動態学的特性を与える。第１の薬力学的特性は、例えば、身体、区画、組織又は臓器内における、構成要素又は構成要素をコードする核酸の、分布、持続性又は曝露であり得る。第２の送達様式は、第２の薬力学又は薬物動態学的特性を与える。第２の薬力学的特性は、例えば、身体、区画、組織又は臓器内における、構成要素又は構成要素をコードする核酸の、分布、持続性又は曝露であり得る。
特定の実施形態では、例えば、分布、持続性又は曝露などの第１の薬力学的又は薬物動態学的特性は、第２の薬力学的又は薬物動態学的特性よりも限定的である。
特定の実施形態では、第１の送達様式は、例えば、分布、持続性又は曝露などの薬力学的又は薬物動態学的特性を最適化するように、例えば最小化するように選択される。
特定の実施形態では、第２の送達様式は、例えば、分布、持続性又は曝露などの薬力学的又は薬物動態学的特性を最適化するように、例えば最大化するように選択される。
特定の実施形態では、第１の送達様式は、例えば、核酸、例えばプラスミド又はウイルスベクター、例えばＡＡＶ又はレンチウイルスなどの相対的に持続性の要素の使用を含む。このようなベクターは比較的持続性であるため、それらから転写される生成物は、比較的持続性になる。
特定の実施形態では、第２の送達様式は、例えば、ＲＮＡ又はタンパク質などの比較的一過性の要素を含む。
特定の実施形態では、第１の構成要素はｇＲＮＡを含み、送達様式は比較的持続性であり、例えばｇＲＮＡは、例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルスなどのプラスミド又はウイルスベクターから転写される。これらの遺伝子はタンパク質生成物をコードせず、ｇＲＮＡは単独で作用できないため、これらの遺伝子の転写は、生理学的に重要でない。第２の構成要素であるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子は、例えば、ｍＲＮＡとして又はタンパク質として一過性様式で送達され、完全ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子／ｇＲＮＡ複合体のみが存在し、短期間活性であることを確実にする。
さらに、構成要素は、互いに補完して安全性及び組織特異性を高める異なる分子形態又は異なる送達ベクターで送達され得る。
差動送達様式の使用は、性能、安全性及び／又は有効性を高め得、例えば最終的なオフターゲット修飾の可能性を低減し得る。細菌由来Ｃａｓ酵素からのペプチドはＭＨＣ分子によって細胞表面に提示されるため、例えば、Ｃａｓ９分子などの免疫原性構成要素のより低持続性様式による送達は、免疫原性を低下させ得る。二部送達系は、これらの欠点を軽減し得る。
差動送達様式を使用して、異なるが重複する標的領域に、構成要素が送達され得る。形成活性複合体は、標的領域の重なりの外で最小化される。したがって、特定の実施形態では、例えば、ｇＲＮＡなどの第１の構成要素は、第１の送達様式によって送達され、例えば組織分布などの第１の空間的分布がもたらされる。例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子などの第２の構成要素は、第２の送達様式によって送達され、例えば組織分布などの第２の空間的分布がもたらされる。特定の実施形態では、第１の様式は、リポソーム、例えばポリマーナノ粒子などのナノ粒子及び例えばウイルスベクターなどの核酸から選択された第１の要素を含む。第２の様式は、群から選択された第２の要素を含む。特定の実施形態では、第１の送達様式は、例えば、細胞特異的受容体又は抗体などの第１の標的化要素を含み、第２の送達様式はその要素を含まない。特定の実施形態では、第２の送達様式は、例えば、第２の細胞特異的受容体又は第２の抗体などの第２の標的化要素を含む。
ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子が、ウイルス送達ベクター、リポソーム又はポリマーナノ粒子中で送達される場合、単一組織のみを標的化することが望ましいことがあり得る場合、複数組織への送達とその中での治療活性の可能性がある。二部送達系はこの難題を解決し、組織特異性を高め得る。ｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子が、別個であるが重複する組織向性がある別々の送達ビヒクルにパッケージされれば、完全に機能的な複合体は、両方のベクターによって標的化される組織内のみに形成される。
例示的な非限定的実施形態
Ａ．特定の非限定的な実施形態では、本明細書で開示された主題は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからの単離されたＣＲＩＳＰＲを提供する。
Ａ１．Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼのＮ末端又はその近傍にＮＬＳを含む、前述のＡのＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。
Ａ２．Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼのＣ末端又はその近傍にＮＬＳを含む、前述のＡのＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。
Ａ３．Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼのＮ末端又はその近傍に２つのＮＬＳ配列を含む、前述のＡ１のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。
Ａ４．Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼのＣ末端又はその近傍に２つのＮＬＳ配列を含む、前述のＡ２のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。
Ａ５．Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼのＮ末端及びＣ末端の両方又はその近傍にＮＬＳを含む、前述のＡのＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。
Ａ６．Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが２つ以上のＮＬＳ配列を含む場合、ＮＬＳ配列は、同一であるか又は異なる、前述のＡのＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。
Ａ７．ＮＬＳ配列又は配列群は、ヌクレオプラスミンＮＬＳ（ｎＮＬＳ）（配列番号１）及びシミアンウイルス４０「ＳＶ４０」ＮＬＳ（ｓＮＬＳ）（配列番号２）からなる群から選択される、前述のＡのＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。
Ａ８．Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの配列は、ＮＬＳ（配列番号３）；Ｈｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ（配列番号４；Ｈｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ（配列番号５）；Ｈｉｓ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１（配列番号６）；Ｈｉｓ－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１（配列番号７）；ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１（配列番号８）；Ｈｉｓ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ（配列番号９）；及びＨｉｓ－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ（配列番号１０）からなる群から選択される、前述のＡのＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。
Ｂ．特定の非限定的実施形態では、本明細書で開示された主題は、システインアミノ酸の欠失又は置換を含む単離されたＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを提供する。
Ｂ１．Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、野生型ＡｓＣｐｆ１アミノ酸配列のＣ６５、Ｃ２０５、Ｃ３３４、Ｃ３７９、Ｃ６０８、Ｃ６７４、Ｃ１０２５又はＣ１２４８に欠失又は置換を含む、前述のＢのＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。
Ｂ２．Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、野生型ＡｓＣｐｆ１アミノ酸配列と比較して、Ｃ６５Ｓ／Ａ、Ｃ２０５Ｓ／Ａ、Ｃ３３４Ｓ／Ａ、Ｃ３７９Ｓ／Ａ、Ｃ６０８Ｓ／Ａ、Ｃ６７４Ｓ／Ａ及びＣ１０２５Ｓ／Ａからなる群から選択される置換を含む、前述のＢ１のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。
Ｂ３．Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、野生型ＡｓＣｐｆ１アミノ酸配列のＣ３３４及びＣ６７４又はＣ３３４、Ｃ３７９及びＣ６７４のいずれかに欠失又は置換を含む、前述のＢ１のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。
Ｂ４．Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、野生型ＡｓＣｐｆ１アミノ酸配列と比較して、（１）Ｃ３３４Ｓ／Ａ及びＣ６７４Ｓ／Ａ；及び（２）Ｃ３３４Ｓ／Ａ、Ｃ３７９Ｓ／Ａ及びＣ６７４Ｓ／Ａからなる群から選択される置換を含む、前述のＢ３のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。
Ｂ５．Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＮＬＳをさらに含む、前述のＢのＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。
Ｂ６．Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの配列は、Ｈｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｎＮＬＳＣｙｓ－ｌｅｓｓ（配列番号１１）及びＨｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｎＮＬＳＣｙｓ－ｌｏｗ（配列番号１２）から選択される、前述のＢ５のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。
Ｃ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、Ａ～Ａ８及びＢ～Ｂ８のいずれかの前述のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする単離された核酸を提供する。
Ｄ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び
Ａ～Ａ８及びＢ～Ｂ８のいずれかの前述のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又は前述のＣの核酸によってコードされるＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
を含むゲノム編集システムを提供する。
Ｅ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、細胞内において、関心のある標的配列を修飾する方法であって、細胞を、
関心のある標的配列と相補的なｇＲＮＡ；及び
Ａ～Ａ８及びＢ～Ｂ８のいずれかの前述のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又は前述のＣの核酸によってコードされるＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
に接触させることを含み、前記Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、関心のある標的配列を修飾する、方法を提供する。
Ｅ１．細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）又はヒト臍帯血誘導赤血球前駆細胞（ＨＵＤＥＰ細胞）である、前述のＥの方法。
Ｅ２．ＨＳＣは、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－細胞、ＣＤ１０５＋細胞、ＣＤ３１＋若しくはＣＤ１３３＋細胞又はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１３３＋細胞である、前述のＥ１の方法。
Ｅ３．Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ８＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ８＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞、ＴＨ１７ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ１ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ２ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ９ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞である、前述のＥ１の方法。
Ｅ４．Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、関心のある標的配列を修飾して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の編集を達成する、前述のＥの方法。
Ｅ５．関心のある第２の標的配列と相補的な第２のｇＲＮＡさらに含む、前述のＥの方法。
Ｅ６．第２のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをさらに含む、前述のＥの方法。
Ｅ７．関心のある標的配列は、ＨＢＧ１遺伝子配列の一部；及びＢＣＬ１１ａ遺伝子配列の一部からなる群から選択される、前述のＥの方法。
Ｅ８．ＨＢＧ１遺伝子配列の一部は、ＨＢＧ遺伝子の－１１０ｎｔプロモーター領域である、前述のＥ７の方法。
Ｅ９．ＨＢＧ１遺伝子配列の一部は、ＨＢＧ遺伝子の－１１０ｎｔプロモーター領域のＣＡＡＴボックスである、前述のＥ８の方法。
Ｅ１０．Ｂｃｌ１１ａ遺伝子配列の一部は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域である、前述のＥ７の方法。
Ｅ１１．Ｂｃｌ１１ａ遺伝子配列の一部は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域のＧＡＴＡ１モチーフである、前述のＥ１０の方法。
Ｅ１２．関心のある標的配列は、ＦＡＳ遺伝子配列の一部；ＢＩＤ遺伝子配列の一部；ＣＴＬＡ４遺伝子配列の一部；ＰＤＣＤ１遺伝子配列の一部；ＣＢＬＢ遺伝子配列の一部；ＰＴＰＮ６遺伝子配列の一部；Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部；ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部；及びＴＲＢＣ遺伝子配列の一部からなる群から選択される、前述のＥの方法。
Ｅ１３．関心のある標的配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部；ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部；及びＴＲＢＣ遺伝子配列の一部からなる群から選択される、前述のＥ１２の方法。
Ｅ１４．Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある、前述のＥ１３の方法。
Ｅ１５．Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列の５０１番目のヌクレオチドと最後のヌクレオチドとの間にある、前述のＥ１３の方法。
Ｅ１６．ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部は、ＴＲＡＣ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある、前述のＥ１２の細胞。
Ｅ１７．ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部は、ＴＲＢＣ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある、前述のＥ１２の細胞。
Ｆ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、対象を治療する方法であって、対象からの細胞を、
標的核酸の標的配列に相補的なｇＲＮＡ；及び
Ａ～Ａ８及びＢ～Ｂ８のいずれかの前述のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
に接触させることを含む方法を提供する。
Ｆ１．Ｃｐｆ１分子は、標的核酸における二本鎖切断を形成する、前述のＦの方法。
Ｆ２．Ｃｐｆ１分子は、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種株ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１分子（ＡｓＣｐｆ１）、ラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１分子（ＬｂＣｐｆ１）及びラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）からなる群から選択される、前述のＦ又はＦ１の方法。
Ｆ３．対象は、異常ヘモグロビン症に罹患している、前述のＦ～Ｆ２のいずれか１つの方法。
Ｆ４．異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球症又はβサラセミアである、前述のＦ３の方法。
Ｆ５．細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）又はヒト臍帯血誘導赤血球前駆細胞（ＨＵＤＥＰ細胞）である、前述のＦ～Ｆ４のいずれか１つの方法。
Ｆ６．Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ８＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ８＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞、ＴＨ１７ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ１ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ２ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ９ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞である、前述のＦ５の方法。
Ｆ７．ＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－細胞、ＣＤ１０５＋細胞、ＣＤ３１＋若しくはＣＤ１３３＋細胞又はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１３３＋細胞である、前述のＦ５の方法。
Ｆ８．接触は、エクスビボで実施される、前述のＦ～Ｆ７のいずれか１つの方法。
Ｆ９．接触細胞は、対象の身体に戻される、前述のＦ～Ｆ８のいずれか１つの方法。
Ｇ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、
（ａ）Ａ～Ａ８及びＢ～Ｂ８のいずれかの前述のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、
（ｂ）標的核酸の標的配列に相補的なｇＲＮＡ；及び
（ｃ）標的核酸の１つ又は複数の修正から利益を得るであろう対象からの細胞
を含む反応液混合物を提供する。
Ｈ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、
（ａ）Ａ～Ａ８及びＢ～Ｂ８のいずれか１つの前述のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又はＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸組成物、及び
（ｂ）標的核酸の標的配列又はｇＲＮＡの核酸組成物に相補的なｇＲＮＡ
を含むキットを提供する。
Ｉ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、前述のＤのゲノム編集システムを通じて導入された、標的核酸配列における修飾を含む細胞を提供する。
Ｉ１．修飾は、ＨＢＧ１遺伝子配列又はＢｃｌ１１ａ遺伝子配列に対するものである、前述のＩの細胞。
Ｉ２．修飾ＨＢＧ１遺伝子配列は、ＨＢＧ遺伝子の－１１０ｎｔプロモーター領域である、前述のＩ１の細胞。
Ｉ３．修飾ＨＢＧ１遺伝子配列は、ＨＢＧ遺伝子の－１１０ｎｔプロモーター領域のＣＡＡＴボックスである、前述の請求項Ｉ１に記載の細胞。
Ｉ４．修飾Ｂｃｌ１１ａ遺伝子配列は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域である、前述の請求項Ｉ１に記載の細胞。
Ｉ５．修飾Ｂｃｌ１１ａ遺伝子配列は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域のＧＡＴＡ１モチーフである、前述の請求項Ｉ１に記載の細胞。
Ｊ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによる標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を評価する方法であって、
（ａ）一致部位標的核酸配列を含む標的核酸配列の編集及び／又は発現の調整に関して、試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性を判定すること；
（ｂ）一致部位標的核酸配列を含む標的核酸配列の編集及び／又は発現の調整に関して、試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性を対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性と比較すること
を含む方法を提供する。
Ｊ１．一致側標的核酸配列は、一致部位１（配列番号１３）、一致部位５（配列番号１４）、一致部位１１（配列番号１５）及び一致部位１８（配列番号１６）からなる群から選択される、前述のＪの方法。
Ｊ２．試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なる細胞型で活性についてアッセイされる、前述のＪの方法。
Ｊ３．試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なる調合物中の活性についてアッセイされる、前述のＪの方法。
Ｊ４．試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なる濃度における活性についてアッセイされる、前述のＪの方法。
Ｊ５．試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なるプロセスを介して製造された後に活性についてアッセイされる、前述のＪの方法。
Ｊ６．試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なるプロセスを介して細胞に送達された後に活性についてアッセイされる、前述のＪの方法。
Ｊ７．試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、異なるアミノ酸配列を含む、前述のＪの方法。
Ｋ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、ＢＣ１１ａ及びＨＢＧ１からなる群から選択される、内因性遺伝子の遺伝子発現を下方制御できるＣＲＩＳＰＲシステムを含む細胞を提供する。
Ｋ１．ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＢＣ１１ａ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む、前述のＫの細胞。
Ｋ２．ＢＣ１１ａ遺伝子配列の一部は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域である、前述のＫ１の細胞。
Ｋ３．ＢＣ１１ａ遺伝子配列の一部は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域のＧＡＴＡ１モチーフである、前述のＫ１の細胞。
Ｋ４．ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＨＢＧ１遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む、前述のＫの細胞。
Ｋ５．ＨＢＧ１遺伝子配列の一部は、ＨＢＧ１遺伝子の－１１０ｎｔプロモーター領域である、前述のＫ４の細胞。
Ｋ６．ＨＢＧ１遺伝子配列の一部は、ＨＢＧ１遺伝子の－１１０ｎｔプロモーター領域のＣＡＡＴボックスである、前述のＫ４の細胞。
Ｋ７．細胞は、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８－細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－細胞、ＣＤ１０５＋細胞、ＣＤ３１＋若しくはＣＤ１３３＋細胞又はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１３３＋細胞である、前述のＫの細胞。
Ｌ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される、少なくとも１つの内因性遺伝子の遺伝子発現を下方制御できるＣＲＩＳＰＲシステムを含む、細胞を提供する。
Ｌ１．ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む、前述のＬの細胞。
Ｌ２．Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある、前述のＬ１の細胞。
Ｌ３．Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列の５０１番目のヌクレオチドと最後のヌクレオチドとの間にある、前述のＬ１の細胞の方法。
Ｌ４．ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む、前述のＬ～Ｌ３のいずれかの細胞。
Ｌ５．ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部は、ＴＲＡＣ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある、前述のＬ４の細胞。
Ｌ６．ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む、前述のＬ～Ｌ５のいずれかの細胞。
Ｌ７．ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部は、ＴＲＢＣ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある、前述のＬ６の細胞。
Ｌ８．ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む、前述のＬ～Ｌ７のいずれかの細胞。
Ｌ９．ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある、前述のＬ８の細胞。
Ｌ１０．ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ及びＣＩＩＴＡからなる群の遺伝子発現を下方制御できる、前述のＬの細胞。
Ｌ１１．ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ及びＣＩＩＴＡからなる群の遺伝子発現を下方制御できる、前述のＬの細胞。
Ｌ１２．細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ８＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ８＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞、ＴＨ１７ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ１ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ２ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ９ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞である、Ｌ～Ｌ１１のいずれか１つの前述の細胞。
Ｍ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによる標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を評価するためのアッセイであって、
（ａ）一致部位標的核酸配列を含む標的核酸配列の編集及び／又は発現の調整に関して、試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性を判定すること；
（ｂ）一致部位標的核酸配列を含む標的核酸配列の編集及び／又は発現の調整に関して、試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性を対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性と比較すること
を含むアッセイを提供する。
Ｍ１．一致側標的核酸配列は、一致部位１（配列番号１３）、一致部位５（配列番号１４）、一致部位１１（配列番号１５）及び一致部位１８（配列番号１６）からなる群から選択される、前述のＭのアッセイ。
Ｍ２．試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なる細胞型で活性についてアッセイされる、前述のＭ１のアッセイ。
Ｍ３．試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なる調合物中の活性についてアッセイされる、前述のＭ２のアッセイ。
Ｍ４．試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なる濃度における活性についてアッセイされる、前述のＭのアッセイ。
Ｍ５．試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なるプロセスを介して製造された後に活性についてアッセイされる、前述のＭのアッセイ。
Ｍ６．試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なるプロセスを介して細胞に送達された後に活性についてアッセイされる、前述のＭのアッセイ。
Ｎ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、
第１の遺伝子の標的配列に相補的な第１の標的化ドメインを含む第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；
第２の遺伝子の標的配列に相補的な第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；及び
Ａ～Ａ８及びＢ～Ｂ８のいずれかの前述のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又は前述のＣの核酸によってコードされるＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
を含む多重ゲノム編集システムを提供する。
Ｎ１．第１の遺伝子及び第２の遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される、前述のＮの多重ゲノム編集システム。
Ｎ２．第３の遺伝子の標的配列に相補的な第３の標的化ドメインを含む第３のｇＲＮＡ分子をさらに含む、前述のＮの多重ゲノム編集システム。
Ｎ３．第１の遺伝子、第２の遺伝子及び第３の遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される、前述のＮ２の多重ゲノム編集システム。
Ｎ４．第４の遺伝子の標的配列に相補的な第４の標的化ドメインを含む第４のｇＲＮＡ分子をさらに含む、前述のＮ２の多重ゲノム編集システム。
Ｎ５．第１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の遺伝子及び第４の遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される、前述のＮ４の多重ゲノム編集システム。
Ｏ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、細胞内において複数の遺伝子を修飾する方法であって、細胞を、
第１の遺伝子の標的配列に相補的な第１の標的化ドメインを含む第１の（ｇＲＮＡ）；
第２の遺伝子の標的配列に相補的な第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；及び
Ａ～Ａ８及びＢ～Ｂ８のいずれかの前述のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又は前述のＣの核酸によってコードされるＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
に接触させることを含み、前記Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、第１の遺伝子及び第２の遺伝子を修飾する、方法を提供する。
Ｏ１．第３の遺伝子の標的配列に相補的な第３の標的化ドメインを含む第３のｇＲＮＡ分子をさらに含み、前記Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、第１の遺伝子、第２の遺伝子及び第３の遺伝子を修飾する、前述のＯの方法。
Ｏ２．第４の遺伝子の標的配列に相補的な第４の標的化ドメインを含む第４のｇＲＮＡ分子をさらに含み、前記Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、第１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の遺伝子及び第４の遺伝子を修飾する、前述のＯ１の方法。
Ｏ３．第１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の遺伝子及び第４の遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される、前述のＯ２の方法。
Ｏ４．細胞は、Ｔ細胞である、前述のＯの方法。
以下の実施例は、単なる例示であり、決して本発明の範囲又は内容を限定することを意図されない。
実施例１ － 一致部位を使用したベンチマーキングアッセイによって評価される、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９及びＡｓＣｐｆ１変異型による成人ヒトＣＤ３４＋細胞の効率的な編集
標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整は、例えば、「一致部位」標的核酸配列などの標的核酸配列に関して、対照ＣＲＩＳＰＲ／ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ編集システムと、試験ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの活性とを比較することによって評価され得る。
一致部位標的核酸配列は、Ｃｐｆ１と、例えばＣａｓ９などの第２のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとによって編集されるという要件の両方を組み込んでいる。例えば、ＴＴＴＶ ＡｓＣｐｆ１野生型プロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）及びＮＧＧＳｐＣａｓ９野生型ＰＡＭを本例で用いた。上述したように、試験Ｃｐｆ１タンパク質は、野生型Ｃｐｆ１タンパク質と比較して１つ又は複数の修飾を含み得る。このような修飾の例としては、１つ又は複数のＮＬＳ配列を組み込むための前述の修飾、６－ヒスチジン精製配列を組み込むための前述の修飾及びＣｐｆ１タンパク質システインアミノ酸の改変並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本例で用いられた例示的な一致部位標的核酸配列としては、一致部位１（「ＭＳ１」；配列番号１３）、一致部位５（「ＭＳ５」；配列番号１４）、一致部位１１（「ＭＳ１１」；配列番号１５）及び一致部位１８（「ＭＳ１８」；配列番号１８）が挙げられる（図２）。
例えば、ＣＤ３４＋ＨＳＣなどの特定の細胞型における、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介と対比して評価するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集システム、すなわちＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、一致部位標的を含む標的核酸の少なくとも一部に相補的なｇＲＮＡとを含むシステムが、例えば、ＲＮＰとして又はシステムの構成要素をコードするベクターの使用を介して、関心のある細胞型の細胞に導入される。標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整は、本明細書で開示されるように検出される。検出された標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整は、同一の一致部位標的及び同一の細胞型に対してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムを用いた場合に検出された標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整と比較される。
標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介編集（又は別のＣＲＩＳＰＲベースのシステムによる編集）及び／又は標的核酸配列の発現の調整と対比して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介を比較する上記の方法は、用いられるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集システムの特定の属性の評価を可能にする。例えば、限定されるものではないが、このような方法を使用して、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整と対比してＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集が評価され、異なる製造プロセスによって調製されたＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡの活性の差異が同定され得る。このような方法は、異なる調合物に存在し、且つ異なる送達ストラテジーを用いるＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡの活性の差異も同定し得る。
この実施例では、成人ヒト動員末梢血ＣＤ３４＋造血幹／前駆細胞において、野生型（ＷＴ）Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐ）Ｃａｓ９及びＡｓＣｐｆ１ヌクレアーゼの編集のベースラインレベルを比較した。これらのＣＤ３４＋細胞は、病的表現型がヌクレアーゼ修飾遺伝子型によって修正され得る血液学的障害（例えば、β異常ヘモグロビン症）の治療のための臨床標的である。ＣＤ３４＋細胞におけるＳｐＣａｓ９及びＡｓＣｐｆ１によるベースライン編集を判定するために、細胞を解凍してサイトカインで予備刺激し、次にヒトゲノム中の一致部位（ＭＳ）を標的とするガイドＲＮＡに複合体化されたＡｓＣｐｆ１又はＳｐＣａｓ９タンパク質で電気穿孔した（図２）。「一致部位」という用語は、ヌクレアーゼによって標的化される部位が、異なるＰＡＭ配列（それぞれＮＧＧ及びＴＴＴＶ）を利用しているにもかかわらず、ＡｓＣｐｆ１及びＳｐＣａｓ９の両方について同一であるという事実を指す。ＣＤ３４＋細胞における効率的な編集に必要なリボ核酸（ＲＮＰ）の最小有効濃度を判定するために、ＣＤ３４＋細胞において、いくつかの一致部位についてＲＮＰ用量反応を実施したが、そのうちの２つが図３Ａに描写される。標的部位における編集の百分率を判定するために、ＡｓＣｐｆ１又はＳｐＣａｓ９電気穿孔細胞からゲノム（ｇ）ＤＮＡを抽出し、標的部位でアンプリコンＰＣＲを実施し、ＤＮＡ配列決定分析がそれに続いた。
図３Ａは、ＡｓＣｐｆ１が同一標的部位の編集においてＳｐＣａｓ９よりも実質的に効率的である１つの事例（ＭＳ５）及びＳｐＣａｓ９が同一標的部位の編集においてＡｓＣｐｆ１と比較してより効率的である１つの事例（ＭＳ１）の結果を図示する。ＭＳ５を標的とするために使用したｇＲＮＡは、ＭＳ５ガイドＲＮＡであった。この例では、約４μＭのＣｐｆ１ ＲＮＰは、一致部位５において効率的な（約６０％）編集をサポートし、この編集は、その部位を標的とする同一用量のＳｐＣａｓ９ ＲＮＰによって達成された編集と比較してより高かった（図３Ａ）。
図３Ｂは、電気穿孔後に複数の一致部位を４．４μＭ ＲＮＰで比較した結果を示す。これらの結果は、部位において編集が生じたことを確立し、その中では、ａ）ＳｐＣａｓ９は、ＡｓＣｐｆ１よりも効率的であり、ｂ）ＡｓＣｐｆ１は、ＳｐＣａｓ９よりも効率的であり、ｃ）編集のレベルは、ＳｐＣａｓ９とＡｓＣｐｆ１との間で同様であった。
ＣＤ３４＋細胞における編集のための最適なタンパク質構成を判定するために、例えばＡｓＣｐｆ１タンパク質のＣ末端又はＮ末端などの異なる位置に位置する、異なるタイプのＮＬＳ配列を含有するＡｓＣｐｆ１タンパク質を合成した。本明細書に記載されるように、ｎＮＬＳは、ヌクレオプラスミンＮＬＳを表し、ｓＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳを指す（図４）。この実施例では、次のＮＬＳ構成を分析した：Ｈｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｎＮＬＳ（配列番号３）、Ｈｉｓ－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１（配列番号７）、Ｈｉｓ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１（配列番号６）、Ｈｉｓ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ（配列番号９）、Ｈｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ（配列番号５）及びＨｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ（配列番号４）。異なるタンパク質変異型をＭＳ５ ｇＲＮＡと複合体化させ、次にＣＤ３４＋細胞、Ｔ細胞及びＨＵＤＥＰ内に電気穿孔した（４．４μＭ ＲＮＰ）。図４では、各細胞型の最大編集を提示する変異型に正規化された％編集として結果が描写される。総合して、これらのデータは、異なる種のヌクレアーゼがＣＤ３４＋細胞（他の細胞の中で特に）の同一標的部位において様々な活性を有していること及び効率的な編集が（他の細胞の中で特に）ＣＤ３４＋細胞においてＡｓＣｐｆ１によって達成され得ることを示す。特に、図４に示されるように、ＮＬＳ構成Ｈｉｓ－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１、Ｈｉｓ－ｓＮＬＳ－ＡｓＣｐｆ１及びＨｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳを有するタンパク質変異型は、全ての細胞型にわたりＭＳ５における高い編集を示した。
実施例２ － 電気穿孔パルスコードスクリーニング
本開示のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによるより高効率の編集可能にする電気穿孔パルスコードを同定するために、可能なパルスコードのスクリーニングを実施した。図１８は、ＨＵＤＥＰにおけるＡｓＣｐｆ１のヌクレオフェクションスクリーニングを示す。用量は、２：１のガイド：タンパク質で一致部位５ガイドＲＮＡを使用して２．２μＭ ＡｓＣｐｆ１ ＲＮＰであった。ＡｓＣｐｆ１ ＷＴタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。Ｌｏｎｚａ溶液ＳＥ、ＳＦ及びＳＧは、異なるパルスプログラムを使用して、１条件当たり５万個のＨＵＤＥＰで試験した。溶液ＳＥでのパルスコードＣＡ－１３７及びＣＡ－１３８は、最適な編集を実証した。
図１９は、ＨＳＣにおけるＡｓＣｐｆ１のヌクレオフェクションスクリーニングを示す。用量は、２：１のガイド：タンパク質で一致部位５（ＭＳ５）ガイドＲＮＡを使用して２．２μＭ ＡｓＣｐｆ１ ＲＮＰであった。ＡｓＣｐｆ１ ＷＴタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。Ｌｏｎｚａ溶液Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４及びＰ５は、異なるパルスプログラムを使用して、１条件当たり５万個のＨＳＣで試験した。溶液Ｐ２でのパルスコードＣＡ－１３７（本明細書では「条件２」とも称される）及びＣＡ－１３８は、最適な編集を実証し、ＦＦ－１００及びＦＦ－１０４も同様であった。
図２０は、上記のスクリーニングで同定されたパルスコードの効率の向上を確認する。具体的には、図２０は、Ｌｏｎｚａ Ａｍａｘａにおける特定のパルスコードの使用が、様々なｇＲＮＡ及びＰＡＭ変異型を使用したＨＳＣ中のＢＣＬ１１ａ遺伝子座における編集を増加させることを示す。用量は、全てのガイドに対して、２：１のガイド：タンパク質比率で４．４μＭ ＲＮＰであった。１条件当たり５万個のＨＳＣを処理した。ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ、ＲＲ及びＲＶＲタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。
実施例３ － 胎児型ヘモグロビンの産生の増加に関連するヒトゲノム中の標的部位におけるＣＤ３４＋細胞のＡｓＣｐｆ１指向編集
胎児型ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現は、転写リプレッサー、ＢＣＬ１１Ａの赤血球細胞特異的発現の標的化された破壊を通じて誘導される（Ｃａｎｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５２７（１２）：１９２－１９７）。遺伝子編集ストラテジーを通じてＨｂＦ発現を増加させる１つの潜在的なストラテジーは、Ｃｐｆ１が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域にあるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球特異的エンハンサーのＧＡＴＡ１結合モチーフを破壊するように誘導することである。この例では、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域にある標的部位のＡｓＣｐｆ１媒介編集を評価した。
最初に、異なるＰＡＭを有するＡｓＣｐｆ１変異型ガイドＲＮＡ（図１）をＨＵＤＥＰ２細胞でスクリーニングし、次に最も効率的なガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼ変異型をｍＰＢ ＣＤ３４＋細胞内で試験した（図１７）。図１７で試験されたガイドＲＮＡの配列は、図７に提供される。特に、図１７は、ＨＵＤＥＰ及びＨＳＣにおける１つのＷＴ ＦｎＣｐｆ１標的と共に、ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ及びＲＲ及びＲＶＲ ＰＡＭ変異型によるＢＣＬ１１ａエンハンサー領域のスクリーニングを示す。ＨＵＤＥＰスクリーニングは、ＣＡ－１３７パルスプログラム及びＬｏｎｚａ溶液ＳＥを用いて実施した。ＨＳＣスクリーニングは、パルスコードＥＯ－１００とＬｏｎｚａ溶液Ｐ３とを用いて実施した。ＢＣＬ１１ａ（図１７ではＫＯＢＥＨと命名される）の対照ガイドも示される。用量は、全てのガイドに対して、２：１のガイド：タンパク質比率で４．４μＭ ＲＮＰであった。１条件当たりおよそ５万個のＨＳＣを処理した。ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ、ＲＲ及びＲＶＲタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬ）の内毒素レベルを有した。
ＨｂＦ発現を増加させる別の潜在的なストラテジーは、例えば、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２などのＨＢＧ遺伝子の標的化された破壊を介したものである。図１６は、ＨＵＤＥＰ及びＨＳＣにおける、ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ及びＲＲ ＰＡＭ変異型によるＨＢＧ１プロモーター領域の標的化を示す。図１６で試験されたガイドＲＮＡの配列は、図６に提供される。モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）ＡＡＸ１１＿００２０５（Ｍｂ３Ｃｐｆ１）も試験したが、それは、図６でＭｂＣｐｆ１と称される。ＨＵＤＥＰ実験は、ＣＡ－１３７パルスプログラムとＬｏｎｚａ溶液ＳＥとを用いて実施した。ＨＳＣスクリーニングは、パルスコードＥＯ－１００とＬｏｎｚａ溶液Ｐ３とを用いて実施した。用量は、全てのガイドに対して、２：１のガイド：タンパク質比率で４．４μＭ ＲＮＰであった。１条件当たりおよそ５万個のＨＳＣを処理した。ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ及びＲＲタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。図３４は、ＨＢＧ１－１ｇＲＮＡを使用したＨＢＧ１遺伝子座の編集を示す。ＡｓＣｐｆ１は、細胞内で８μＭの最終ＲＮＰ用量のために、１：４のタンパク質：ガイド比でｇＲＮＡと複合体化させた。ＲＮＰは、複合体形成のために室温で３０分間インキュベートした。図３４に示されるように、ＨＢＧ１－１ｇＲＮＡの使用は、ＨＳＣに６０％を超える編集をもたらした。図１６及び図３４で示される編集効率間の差異は、例えば、電気穿孔パルスコードなどのその下で実験が実施された異なる条件を反映する。
総合して、これらのデータは、臨床的に関連する遺伝子座におけるＣＤ３４＋細胞のＡｓＣｐｆ１変異型による効率的な編集を示す（すなわち既知のＨＰＦＨ標的部位）。
実施例４ － システイン修飾Ｃｐｆ１タンパク質及びＲＮＰの生成
ジスルフィド結合形成は、タンパク質凝集を促進することが知られていることから、改変されて、ジスルフィド結合形成の可能性を減少させ得るシステインを同定する努力の一環として、Ｃｐｆ１結晶構造及び既知のＣｐｆ１一次アミノ酸配列を分析した（図１３）。Ｃｐｆ１に存在する８つのシステインのいくつかは、溶媒に曝露されているようであった一方、他のものは、埋没され、他の分子間システインから隔絶されているようであり、したがってジスルフィド結合形成のリスクは、高くなかった（図１３）。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ Ｃ５マレイミド（パーツ番号Ａ１０２５４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるシステイン標識アッセイを使用して、４８時間のインキュベーション後における、野生型及び残基Ｃ３７９がセリンに変異していない変異型と比較した、ＡｓＣｐｆ１ Ｃ３３４Ｓ Ｃ３７９Ｓ Ｃ６７４Ｓ中のシステイン残基の有意に低下したアクセス性を実証した（図１４）。「ＡｓＣｐｆ１システインなし」サンプルは、マレイミド試薬による標識を示さない。Ｃ３７９で変異していない変異型であるＡｓＣｐｆ１ Ｃ３３４Ｓ Ｃ６７４Ｓサンプルは、野生型とほぼ同等の標識を示し、結晶構造内で部分的に曝露しているようであるＣ３７９がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ Ｃ５マレイミド試薬に容易にアクセス可能であることが示唆された。全ての標識反応は、製造業者の推奨事項に従って実施した。簡潔に述べると、これは、Ｈ１５０緩衝液及び１０％ＤＭＳＯ中で最低２４時間にわたり４°Ｃでインキュベートされる、１０μＭのタンパク質を有するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ Ｃ５マレイミド染料の２０倍のモル過剰量を必要とする。
上述した野生型及び３つの変異型の編集能力は、図１５で比較された。Ｃｙｓ－ｌｅｓｓ ＡｓＣｐｆ１では編集の減少が観察される一方、ＡｓＣｐｆ１－Ｃ３３４Ｓ－Ｃ６７４Ｓ及びＡｓＣｐｆ１－Ｃ３３４Ｓ－Ｃ３７９Ｓ－Ｃ６７４Ｓ変異型では、ＡｓＣｐｆ１野生型と同様の編集レベルが達成された（図１５）。
実施例５ － 初代Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１による高効率編集
序論
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）システムは、エクスビボゲノム編集治療において、他のヌクレアーゼに比べて、容易に合成され得るより小さい単一ｃｒＲＮＡ、野生型タンパク質及び操作されたＰＡＭ変異型によってＴ及びＣに富むＰＡＭを標的とする能力及び異なる修復結果をもたらし得る５’ねじれ型カットをはじめとする、いくつかの潜在的な利点を提供し得る。
エクスビボ送達のために、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の使用は、多くの場合、プラスミドＤＮＡなどの核酸ベースの送達よりも好ましくあり得る。本明細書では、いくつかのＣｐｆ１オルソログをＲＮＰとして生成し、複数の細胞型においてＳｐＣａｓ９により、標的化可能な複数のゲノム遺伝子座で堅固に編集した。ＡｓＣｐｆ１及びその遺伝子操作されたＲＲ及びＲＶＲＰＡＭ変異型による、Ｔ細胞における９０％を超える編集が実証された。
タンパク質レベル及びガイドレベルの両方におけるＣｐｆ１ ＲＮＰ複合体の活性の改善が実証され、それは、細胞型全体にわたり効性を改善した。集合的に、知見は、ゲノム編集治療のための、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼのＲＮＰ送達の有望性を強調した。
結果
いくつかの試験Ｃｐｆ１オルソログからＡｓＣｐｆ１を選択した。初代Ｔ細胞におけるＡｓＣｐｆ１スクリーニングは、いくつかの適切な標的部位を産生した。図２１及び図２５は、ＴＲＢＣ、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子座における、ＡｓＣｐｆ１及びそのＲＲ及びＲＶＲ ＰＡＭ変異型によるＴ細胞治療標的のスクリーニングを示す。図２１で試験されたガイドＲＮＡの配列は、表４に提供される。各標的について、パルスコードＣＡ－１３７及び緩衝液Ｐ２を用いてＡｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、２μＬの５０μＭ Ｃａｓ９又はＣｐｆ１ ＴＲＡＣガイド（２：１のタンパク質：ガイド比率）の最終濃度４．４μＭで５０万個のＴ細胞を電気穿孔した。タンパク質のノックアウト百分率は、フローサイトメトリーによって測定した。予備スクリーニングで、約３０％のｇＲＮＡが５０％を超える編集を示し、これは、一般に観察されたＳｐＣａｓ９ヒット率と同レベルであり、Ｃｐｆ１が、重要な治療遺伝子座又は複数の治療遺伝子座において遺患者のＴ細胞を遺伝子編集するために潜在的に使用され得ることが示された。図２１、図２５及び図２８に概説された結果は、４つの同種異系Ｔ細胞標的（ＴＲＢＣ、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ）上のＴ細胞における、ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ、ＲＲ及びＲＶＲの高い編集効率を示し、これは、図２６に要約される。特に、３７～４３％のガイドが＞５０％の編集を与え、ヒットに分類される。
Ｔ細胞における効率的な編集は、ＮＬＳの構成及び電気穿孔条件を変更することで達成した。ＣＡＲ及びＴＣＲ操作されたＴ細胞療法は、免疫腫瘍学の展望に変革的付加価値をもたらす可能性を有する。図３２に示されるように、特定の電気穿孔条件は、Ｔ細胞における最大編集を改善する。図３２でＲＲ－２５と標識されるガイドＲＮＡは、本明細書において、「Ｂ２Ｍ－２」、「Ｂ２Ｍ－２９」及び「Ｂ２Ｍ２９－ＲＲ」とも本明細書で称される。図３２でＷＴ－１１と標識されるガイドＲＮＡは、本明細書において、「Ｂ２Ｍ－１」、「Ｂ２Ｍ－１２」及び「Ｂ２Ｍ１２－ＷＴ」とも本明細書で称される。さらに、電気穿孔パルスコードの変更も、図２２に示されるように、複数の治療標的遺伝子座におけるＴ細胞の最大編集を有意に改善した。標的番号２は、ＴＲＢＣであり、標的番号３は、Ｂ２Ｍであった。パルスコード番号１は、ＤＳ－１３０であり（本明細書では「条件１」とも称される）、パルスコード番号２は、ＣＡ－１３７であった（本明細書では「条件２」とも称される）。各標的について、パルスコードＤＳ－１３０と、緩衝液Ｐ２又はパルスコードＣＡ－１３７と、緩衝液Ｐ２とを用いてＡｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、各ＲＮＰについて、２μＬの５０μＭ Ｃａｓ９又はＣｐｆ１ ＲＮＰと、ＴＲＢＣ又はＢ２Ｍを標的とするガイド（２：１のガイド：タンパク質の比率）の４．４μＭの最終濃度で５０万個のＴ細胞を電気穿孔した。タンパク質のノックアウト百分率は、４日後にフローサイトメトリーによって測定した。図３３に示されるように、ＮＬＳの構成を変更することは、Ｔ細胞における効力も改善した。ＡｓｐＣｐｆ１ ＮＬＳ ｖ２（本明細書では「Ｈｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ－ｓＮＬＳ」とも称される）は、ＡｓｐＣｐｆ１ ＮＬＳ ｖ１（本明細書では「Ｈｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ｓＮＬＳ」とも称される」）より優れた編集効率を示した。
効率的な単一及び複数のノックアウト編集は、Ｃｐｆ１ ＲＮＰを用いて、疾患関連遺伝子座の初代Ｔ細胞で達成された。図２３Ａは、エクスビボ細胞療法のＲＮＰワークフローを示す。ＡｓＣｐｆ１又は操作されたＰＡＭ変異型を使用した、治療に関連する複数のＴ細胞座（ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ及びＢ２Ｍ）における効率的な単一ノックアウトを図２３Ｂに示す。３つのＴ細胞標的（ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ及びＢ２Ｍ）における単一ノックアウトで比較を行った。各標的について、パルスコードＤＳ－１３０及び緩衝液Ｐ２を用いてＡｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、２μＬの５０μＭ Ｃａｓ９又はＣｐｆ１ ＲＮＰ（２：１のタンパク質：ガイド比率）の最終濃度４．４μＭで５０万個のＴ細胞を電気穿孔した。タンパク質のノックアウト百分率は、４日後にフローサイトメトリーによって測定した。ＴＲＡＣガイドは、ＡｓＣｐｆ１ ＲＲ酵素を有するＴＲＡＣ－１４０であった（本明細書では「ＴＲＡＣ－２」及び「ＴＲＡＣ－１４０ＲＲ」とも称される）。ＴＲＢＣガイドは、ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ酵素を有するＴＲＢＣ－４であった。Ｂ２Ｍガイドは、ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ酵素を有するＢ２Ｍ－１２であった。図２９は、ＳｐＣａｓ９と比較した、Ｃｐｆ１ ＲＮＰを使用した複数の治療的に関連するＴ細胞座における単一ノックアウトの効率を示す。
Ｃｐｆ１ ＲＮＰで処理されたＴ細胞における２つの治療標的（ＴＣＲ及びＢ２Ｍ）の高効率な二重ノックアウトは、図２４に示すようにフローサイトメトリーによって測定した。図２４は、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍが効果的にノックダウンされたＴ細胞の分布を示す。各標的について、パルスコードＤＳ－１３０と緩衝液Ｐ２とを用いてＡｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、各ＲＮＰについて、１μＬの１００μＭ Ｃａｓ９又はＣｐｆ１ ＲＮＰと、Ｂ２Ｍを標的とするガイドと並んで、１μＬの１００μＭ Ｃａｓ９又はＣｐｆ１ ＲＮＰと、ＴＲＡＣを標的とするガイド（２：１のタンパク質：ガイド比率）の最終濃度４．４μＭで５０万個のＴ細胞を電気穿孔した。タンパク質％ノックアウトは、４日後にフローサイトメトリーによって測定した。ＴＲＡＣガイドは、ＡｓＣｐｆ１ ＲＲ酵素を有するＴＲＡＣ－１４０であった。Ｂ２Ｍガイドは、ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ酵素を有するＢ２Ｍ－１２であった。
図２７は、ヒト初代Ｔ細胞における、Ｃｐｆ１又はＣａｓ９による２つのＴ細胞標的、Ｂ２Ｍ及びＴＲＡＣの二重ノックアウトを図示する。各標的について、パルスコードＣＡ－１３７と緩衝液Ｐ２とを用いてＡｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、ＴＲＡＣ又はＢ２Ｍ Ｃａｓ９又はＣｐｆ１ガイドのいずれかと複合体化した（４：１のタンパク質：ガイド比率）２μＬの５０μＭ Ｃａｓ９又はＣｐｆ１タンパク質の最終ＲＮＰ濃度４．４μＭで５０万個のＴ細胞を電気穿孔した。タンパク質のノックアウト百分率は、フローサイトメトリーによって測定した。図２７に示されるように、ほとんどのＴ細胞は、Ｂ２ＭとＴＲＡＣとの両方をノックダウンするように問題なく編集された。また、これらの結果は、それぞれのＴ細胞標的に対して異なるヌクレアーゼを使用し得ることを示す。使用したＣｐｆ１ ＴＲＡＣガイドは、ＴＲＡＣ－１４０であり、Ｃｐｆ１ Ｂ２Ｍガイドは、Ｂ２Ｍ－１２であった。
図３０は、ヒト初代Ｔ細胞におけるＣｐｆ１ ＲＮＰによる３つのＴ細胞標的（ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ）の三重ノックアウトを図示する。タンパク質のノックアウト百分率は、フローサイトメトリーによって測定した。図３０に示されるように、全ての３つのＴ細胞標的で効率的な編集が観察された。この実験は、ＴＲＡＣガイドＴＲＡＣ－１４０に複合体化したＡｓＣｐｆ１ ＲＲ（ＰＲＯ２８２）を有する２．９μＭのＲＮＰの、Ｂ２ＭガイドＢ２Ｍ－１２に複合体化したＡｓＣｐｆ１ ＷＴ（ＰＲＯ２８１）を有する２．９μＭのＲＮＰ、ＣＩＩＴＡガイドＣＩＩＴＡ－３４に複合体化したＡｓＣｐｆ１ ＷＴ（ＰＲＯ２８１）を有する２．９μＭのＲＮＰを合計ＲＮＰ濃度８．７μＭで一緒に送達して実施した。各ＲＮＰについて、ガイド：タンパク質比率は、２：１であった。ＲＮＰは、Ｌｏｎｚａシステム上でパルスコードＣＡ－１３７と緩衝液Ｐ２を使用して５０万個のＴ細胞に送達した。編集は、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍではフローサイトメトリー及びＮＧＳにより、ＣＩＩＴＡではＮＧＳのみで評価した。同様の結果は、ＴＲＡＣガイドＴＲＡＣ－１３、Ｂ２ＭガイドＢ２Ｍ－２９及びＣＩＩＴＡガイドＣＩＩＴＡ－４５、ＣＩＩＴＡ－４１及びＣＩＩＴＡ－１０を同一条件下で使用しても得られた。
図３１Ａは、潜在的なオフターゲットを同定し検証するために使用したワークフローを図示する。図３１Ｂは、３つのＴ細胞標的、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍに対するトップＣｐｆ１候補ガイドの特異性を要約する。図３１Ａ及び図３１Ｂに示されるように、コンピュータを用いたＤｉｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑ及びＧＵＩＤＥ－ｓｅｑオフターゲットアッセイからの潜在的なオフターゲット部位の標的化アンプリコン配列決定により、検出可能なオフターゲットは、見いだされず、試験した全てのガイドＲＮＡは、高い編集効率をもたらした。
図４０は、Ｔ細胞標的ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡについて、ＷＴ ＡｓＣｐｆ１及びＲＲ ＡｓＣｐｆ１変異型のＴ細胞におけるトップ同種異系ガイドＲＮＡの用量反応を示す。最高用量のＲＮＰで処理された細胞からのゲノムＤＮＡは、標的化アンプリコン配列決定に送って、ガイドのそれぞれの標的部位のインデルを評価した。この実験は、Ｌｏｎｚａ電気穿孔装置及びパルスコードＣＡ－１３７を使用してＴ細胞において実施した。
実施例６ － ＣＩＩＴＡのＣｐｆ１媒介性ノックアウトの表現型解析
Ｔ細胞におけるＣＩＩＴＡのノックアウトが主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）受容体の発現に及ぼす影響を判定するために、ＣＩＩＴＡ遺伝子のエクソンを標的とするように操作されたＲＮＰで細胞を形質移入した。この遺伝子は、ＭＨＣ ＩＩ受容体の表面発現に関与している。エクソン中のインデルは、ＣＩＩＴＡを不活性化するトランケーションをもたらし、Ｔ細胞表面上のＭＨＣ ＩＩ（ＨＬＡ ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ）受容体の発現を妨げる。
ＡｓＣｐｆ１変異型とガイドＲＮＡとを１：２の比率で組み合わせることにより、ＡｓＣｐｆ１ ＲＮＰを複合体化した。使用したｇＲＮＡは、ＣＩＩＴＡ－３４（エクソン１を標的とする）、ＣＩＩＴＡ－４１（エクソン２を標的とする）、ＣＩＩＴＡ－４５（エクソン３を標的とする）及びＣＩＩＴＡ－１０（エクソン６を標的とする）であった（図３７Ｂ）。ｇＲＮＡ ＣＩＩＴＡ－４５は、本明細書では「ＣＩＩＴＡ－４５ ＲＲ」及び「ＣＩＩＴＡ－２」とも称される。ｇＲＮＡ ＣＩＩＴＡ－４１は、本明細書では「ＣＩＩＴＡ－４１ ＲＲ」とも称される。ｇＲＮＡ ＣＩＩＴＡ－３４は、本明細書では「ＣＩＩＴＡ－３４ ＷＴ」とも称される。ｇＲＮＡ ＣＩＩＴＡ－１０は、本明細書では「ＣＩＩＴＡ－１」及び「ＣＩＩＴＡ－１０ＷＴ」とも称される。次に、サンプルを室温で３０分間インキュベートした後、チューブを液体窒素に浸し、ヌクレオフェクションまで－８０℃で保存した。３μＬのＲＮＰを９６ウェルＬｏｎｚａヌクレオフェクションプレートの各ウェルに移した。１条件当たり、５０万個のＴ細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットを１サンプル当たり２０μＬのＬｏｎｚａＰ２ヌクレオフェクション緩衝液に再懸濁し、次に２０μＬの再懸濁Ｔ細胞をＬｏｎｚａ９６ウェルプレートの各ウェルに入れた。パルスコードＣＡ－１３７を用いて、細胞を速やかにヌクレオフェクションした。次に、８０μＬの予熱した（３７℃）増殖培地を各ウェルに混合した。１００μＬの増殖培地を有する予熱した９６ウェルの非ＴＣ処理プレートに全量（３μＬのＲＮＰ、Ｐ２バッファー中の２０μＬのＴ細胞及び８０μＬの培地）を移した。細胞は、分析まで５％ＣＯ２で３７℃においてインキュベートした。ヌクレオフェクション後４日目に細胞のサブセットを溶解し、ゲノムＤＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定のために提出した。残りの細胞をヌクレオフェクションの６日後に増殖させ、刺激培地（高ＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５）内でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して活性化し、ＭＨＣ ＩＩの表面発現を刺激した。７日目に細胞をビーズから洗い落とし、ＭＨＣ ＩＩ（ＨＬＡ ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ）受容体を標的とするモノクローナル抗体で染色して、ＣＩＩＴＡのノックアウトを表現型で評価した。この結合は、フローサイトメトリーを介して定量化した。
図３６に提供される画像は、フローサイトメーターによるｍＡｂ（細胞表面）上のＦＩＴＣ－Ａフルオロフォアの検出を描写する。蛍光強度は、細胞表面上のＭＨＣ ＩＩ受容体へのｍＡｂ結合の有無に直接相関する。高い蛍光がＭＨＣ ＩＩ受容体の表面発現が高いことを示す一方、シグナルの不在は、これらの受容体の成功裏のノックアウトを示す。Ｘ軸は、対数目盛上の蛍光強度の増加（左から右）を示す。Ｙ軸は、事象（細胞）の発生率を直線的に表す。１０３の閾値は、ノックアウト集団と未編集団を離てる点として判定された。１０３の左側の細胞は、ノックアウト細胞として分類され、この閾値の右側の細胞は、未編集と見なされる。図３６に示されるように、Ｃｐｆ１ガイドＣＩＩＴＡ－４５は、ＭＨＣ ＩＩ陽性細胞の明らかな減少を示し、これは、未処理の細胞では見られない。Ｔ細胞は、パルスコードＣＡ－１３７でＬｏｎｚａシステムを使用して、ＣＩＩＴＡ－４５と複合体化したＡｓＣｐｆ１ ＲＲで処理した。さらに、ガイドは、ＣＩＩＴＡ遺伝子座で高い編集効率を有した（図３７Ａ）。
ガイドＣＩＩＴＡ－４１、ＣＩＩＴＡ－１０及びＣＩＩＴＡ－３４は、ＣＩＨＣ－４５と同様のＭＨＣ ＩＩの減少を示した（図３８）。このデータは、これら４つのガイドのそれぞれがＣＩＩＴＡを効率的に編集するだけでなく、望ましい表現型の効果も示すことを検証した。ＣＩＩＴＡを高効率で編集することが知られているＳｐＣａｓ９ガイドは、陽性対照として示される。全てのＣｐｆ１又はＳｐＣａｓ９ ＣＩＩＴＡガイドは、パルスコードＣＡ－１３７でＬｏｎｚａシステムを使用して、Ｔ細胞で４μＭのＲＮＰ用量で試験した。最高用量のＲＮＰで処理された細胞からのゲノムＤＮＡは、標的化アンプリコン配列決定に送って、オフターゲット部位のインデルを評価した。ＣＩＩＴＡ－４５及びＣＩＩＴＡ－１０の予測オフターゲット部位における検出の閾値を超えるインデル形成が観察されなかった一方、ＣＩＩＴＡ－３４は、１つのオフターゲットを有した（図３９）。
実施例７ － 編集効率に関するプロトスペーサーの長さ
ガイドＲＮＡの標準プロトスペーサーは、２０ヌクレオチド長であり、この配列は、標的ＤＮＡ配列に相補的である。標的配列に相補的なヌクレオチドの数を増減することにより、ガイドＲＮＡのその標的ＤＮＡへの結合エネルギーを変化させ得、形成されたインデルの百分率を変化させ得る。長さを１８及び１９に調節することで、ガイドＢ２Ｍ－１２、Ｂ２Ｍ－２９、ＴＲＡＣ－１３（本明細書では「ＴＲＡＣ－１３ＷＴ」及び「ＴＲＡＣ－１」とも称される）、ＣＩＩＴＡ－１０及びＣＩＩＴＡ－４５のインデル形成が減少する（図４１、図４２及び図４３）。さらに、図４１、図４２及び図４３に示されるように、長さを２０から２１、２２又は２３ヌクレオチドに増やすことは、ＴＲＡＣ－１４０などのいくつかのガイドに対する最小限の影響を有し、ＴＲＡＣ－１３、Ｂ２Ｍ－１２、Ｂ２Ｍ－２９、ＣＩＩＴＡ－１０及びＣＩＩＴＡ－４５などの他のほとんどものの効力を向上させる。Ｌｏｎｚａ電気穿孔装置及びパルスコードＣＡ－１３７を使用して、ＡｓＣｐｆ１ ＷＴ又はＡｓＣｐｆ１ ＲＲのいずれかにより、Ｔ細胞における用量反応の実験を実施した。
実施例８ － ＴＲＡＣ遺伝子座における標的化組み込み
図４５に示されるように、Ｔ細胞受容体α定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座を標的とするｇＲＮＡのために、例示的なＤＮＡドナー鋳型を設計した。各ドナーは、同一カーゴ（ｈＰＧＫ－ＧＦＰ－ｐｏｌｙＡ配列）を含有したが、５’及び３’オーバーハング領域をはじめとする異なる相同性アーム配列を有した（表１４）。各ドナーの相同性アーム長及びアーム配列は、それぞれ表Ｙ及びＺに示される。ドナー１は、両方のドナーの長さを同様に保つためのスタッファー配列（表１６）を有する。適切なｇＲＮＡ及び関連するＡＡＶドナー鋳型を有するＡｓＣｐｆ１ＲＲリボ核タンパク質を用いて、２つのドナー濃度で初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて標的化組み込み実験を実施した。実験後、細胞を７日目まで増殖させ、フローサイトメトリーを行って、ＧＦＰ発現による標的化組み込み率を調べた。
使用したｇＲＮＡは、ＴＲＡＣ－１４０：ＧＵＧＡＣＡＡＧＵＣＵＧＵＣＵＧＣＣＵＡ（ＲＮＡ配列）；ＧＴＧＡＣＡＡＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＡ（ＤＮＡ配列）である。
Figure 2024023294000035
Figure 2024023294000036
Figure 2024023294000037
より高いＡＡＶドナー濃度を使用した、ＴＲＡＣ遺伝子座における標的化組み込み効率は、表１７に示される。
Figure 2024023294000038
表１７に示されるように、長い相同性アーム（５００ｂｐ）を含有するドナー鋳型は、より短い相同性アームを含有するドナーよりもわずかに高いレベルの標的化組み込みを有した。
実施例９：ＨＢＧプロモーター領域を標的とするＣｐｆ１ ｇＲＮＡのスクリーニング
単一ＲＮＰの構成要素として又は「ブースター要素」と組み合わせて、ＣＤ３４＋細胞におけるＨＢＧプロモーター領域の編集を増加させ、修飾細胞の赤血球子孫における胎児型グロビン発現を誘導するために使用し得る他のＡｓＣｐｆ１ ｇＲＮＡを同定するために、ＨＢＧプロモーターのいくつかのドメインを標的とするＨｉｓ－ＡｓＣｐｆ１－ＮＬＳ－ＮＬＳ（「ＡｓＣｐｆ１」）；ＡｓＣｐｆ１ Ｓ５４２Ｒ／Ｋ６０７Ｒ（「ＡｓＣｐｆ１ ＲＲ」）；又はＡｓＣｐｆ１ Ｓ５４２Ｒ／Ｋ５４８Ｖ／Ｎ５５２Ｒ（「ＡｓＣｐｆ１ ＲＶＲ」）ｇＲＮＡ配列（表１８）を設計した（表１９及び図４６に列挙される）。ＡｓＣｐｆ１ ＲＲ及びＡｓＣｐｆ１ ＲＶＲは、それぞれＴＹＣＶ／ＡＣＣＣ／ＣＣＣＣ及びＴＡＴＶ／ＲＡＴＲ ＰＡＭを認識する操作されたＡｓＣｐｆ１変異型である（Ｇａｏ ２０１７）。
Figure 2024023294000039
Figure 2024023294000040
Figure 2024023294000041
Figure 2024023294000042
Figure 2024023294000043
Figure 2024023294000044
Figure 2024023294000045
Figure 2024023294000046
Ａｍａｘａ電気穿孔装置（Ｌｏｎｚａ）を使用して、ＲＮＰ（５μＭ）含有ＡｓＣｐｆ１タンパク質、ＡｓＣｐｆ１ ＲＲタンパク質又は表１９の単一ｇＲＮＡと複合体化したＡｓＣｐｆ１ ＲＶＲ（使用した特定のＣｐｆ１分子についてはｇＲＮＡ ＩＤ名称を参照されたい；図４６は、ｇＲＮＡの登録簿識別番号を提供する）を動員された末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞に送達した。７２時間後、細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、次にＰＣＲ増幅された標的部位のＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定（ＮＧＳ）により、挿入／欠失のレベルを分析した。各ｇＲＮＡの編集の百分率（インデル＝欠失及び挿入）が上記の表１９に示される。特定の実施形態では、表１９（及び図４６）に記載されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含むＣｐｆ１ ＲＮＰを使用して、表１８に列挙される領域を標的とし、ＨｂＦ発現を誘導し得る。
ＲＮＰ複合体を生成するために、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡを１ｘＨ１５０＋マグネシウム（１０ｎｍｏｌｅｓに対して２８．４μｌ）中で３５２μＭに希釈し、ＡＢ１４００ ＰＣＲプレートに移し、スローアニールプロトコル（９０℃～２５℃で２％ランプとそれに続く４℃）で稼働するＰＣＲ装置に入れた。ＡＢ１４００Ｌ ＰＣＲプレートに５μｌの３５２ｕＭアニールガイドを添加し、Ｃｐｆ１を１ｘＨＧ３００で１７６μＭに希釈し、５μｌの３５２μＭアニールガイドに５μｌの１７６μＭ Ｃｐｆ１を添加して、１０μｌの８８μＭ ＲＮＰを得た。
ＬｏｎｚａヌクレオフェクションによってＲＮＰを成人体ＨＳＣに導入するために、必要な増殖因を有する１３０μｌの完全ＨＳＣ培地をＣｅｌｌＳｔａｒプレート１３０μｌに添加し、必要になるまで３７°Ｃのインキュベーターに入れた。成人ＨＳＣをＣｏｕｎｔｅｓｓ上で係数し、５０Ｋ細胞／ウェル：２．５０ｅ６細胞／ｍｌ（２プレートのバイオレップスでは１０．５ｅ６細胞）の処方に基づいて、２つのバイオレップス（２プレート）をカバーするのに十分な細胞を１５ｍｌ又は５０ｍｌの円錐管にピペットで移した。次に、１本の管（２プレートバイオレップス相当）をＢｅｃｋｍａｎ遠心分離機内において１０００ｒｐｍで５分間遠心沈殿させた。培地を除去し、細胞をＰ２溶液（全プレートでは４．２ｍｌ）に再懸濁した。大容量分注スチップを備えたＭａｎｔｉｓを使用して、Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅプレートの１ウェル当たり２０μｌの細胞溶液を分注した。Ｐ５０チップを備えたＢｉｏｍｅｋを使用して、細胞を含有するＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅプレートに２μｌのＲＮＰを移し、ピペットで上下させることによって混合した。次に、プレートをＡｍａｘａシャトルに入れて、ＣＡ－１３７／溶液Ｐ２のプログラムＣｐｆ１を実行した。Ｐ５０チップを備えたＢｉｏｍｅｋを使用して、細胞を培地と共にＮｕｃｌｅｃｏｃｕｖｅｔｔｅプレートから余熱したＣｅｌｌＳｔａｒプレートに移し、３７℃で７２時間インキュベートした。製造業者の使用説明に従ってＤＮＡｄｖａｎｃｅキットを使用して、ゲノムＤＮＡを細胞から抽出した。ｈｇ３８参照ゲノムに対する挿入／欠失は、標的部位のＮＧＳ分析を使用して定量化した。
参照による援用
全本明細書で言及される全ての文献、特許及び特許出願は、あたかも個々の出版物、特許又は特許出願が、具体的に且つ個別に、参照により援用されると示されるかのように、その内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾する場合、本明細書の任意の定義をはじめとして、本出願が優先される。
均等物
当業者は、日常的実験のみを用いて、本明細書に記載される特定の実施形態の多数の均等物を認識するか又は見極めることができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

SEQUENCE LISTING

<110> EDITAS MEDICINE, INC.

<120> CPF1-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS FOR GENE EDITING

<130> 084177.0233

<150> PCT/US2018/065032
<151> 2018-12-11

<150> US 62/597,118
<151> 2017-12-11

<150> US 62/623,501
<151> 2018-01-29

<150> US 62/664,905
<151> 2018-04-30

<150> US 62/746,494
<151> 2018-10-16

<160> 1299

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> the nucleoplasmin NLS (nNLS)

<400> 1

Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15


<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> simian virus 40 "SV40" NLS

<400> 2

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5


<210> 3
<211> 1332
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Asp Cpf1 NLS v1

<400> 3

Met Lys His His His His His His Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr
1 5 10 15


Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln
20 25 30


Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp
35 40 45


Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg
50 55 60


Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp
65 70 75 80


Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr
85 90 95


Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn
100 105 110


Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala
115 120 125


Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu
130 135 140


Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr
145 150 155 160


Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr
165 170 175


Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp
180 185 190


Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys
195 200 205


Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro
210 215 220


Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe
225 230 235 240


Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln
245 250 255


Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly
260 265 270


Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val
275 280 285


Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala
290 295 300


Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp
305 310 315 320


Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu
325 330 335


Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn
340 345 350


Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp
355 360 365


Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser
370 375 380


Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg
385 390 395 400


Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys
405 410 415


Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile
420 425 430


Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser
435 440 445


Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr
450 455 460


Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp
465 470 475 480


Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu
485 490 495


Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys
500 505 510


Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr
515 520 525


Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln
530 535 540


Met Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn
545 550 555 560


Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met
565 570 575


Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu
580 585 590


Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp
595 600 605


Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr
610 615 620


Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe
625 630 635 640


Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro
645 650 655


Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly
660 665 670


Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr
675 680 685


Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser
690 695 700


Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala
705 710 715 720


Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu
725 730 735


Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln
740 745 750


Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu
755 760 765


His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys
770 775 780


Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys
785 790 795 800


Ser Arg Met Lys Arg Met Ala His Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn
805 810 815


Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln
820 825 830


Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp
835 840 845


Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His
850 855 860


Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His
865 870 875 880


Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe
885 890 895


Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile
900 905 910


Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile
915 920 925


Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln
930 935 940


Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val
945 950 955 960


Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys
965 970 975


Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile
980 985 990


His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys
995 1000 1005


Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe
1010 1015 1020


Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp
1025 1030 1035


Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu
1040 1045 1050


Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly
1055 1060 1065


Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro
1070 1075 1080


Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn
1085 1090 1095


His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu Glu Gly Phe Asp Phe Leu His
1100 1105 1110


Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe Ile Leu His Phe Lys Met Asn
1115 1120 1125


Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala
1130 1135 1140


Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys
1145 1150 1155


Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys Arg Ile Val Pro Val Ile Glu
1160 1165 1170


Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn
1175 1180 1185


Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp
1190 1195 1200


Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu Leu Glu Asn Asp Asp Ser His
1205 1210 1215


Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu Ile Arg Ser Val Leu Gln Met
1220 1225 1230


Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro
1235 1240 1245


Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn
1250 1255 1260


Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile
1265 1270 1275


Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu Asn His Leu Lys Glu Ser Lys
1280 1285 1290


Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala
1295 1300 1305


Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys
1310 1315 1320


Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly
1325 1330


<210> 4
<211> 1324
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> His-AsCpf1-sNLS

<400> 4

Met Lys His His His His His His Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr
1 5 10 15


Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln
20 25 30


Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp
35 40 45


Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg
50 55 60


Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp
65 70 75 80


Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr
85 90 95


Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn
100 105 110


Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala
115 120 125


Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu
130 135 140


Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr
145 150 155 160


Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr
165 170 175


Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp
180 185 190


Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys
195 200 205


Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro
210 215 220


Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe
225 230 235 240


Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln
245 250 255


Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly
260 265 270


Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val
275 280 285


Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala
290 295 300


Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp
305 310 315 320


Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu
325 330 335


Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn
340 345 350


Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp
355 360 365


Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser
370 375 380


Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg
385 390 395 400


Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys
405 410 415


Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile
420 425 430


Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser
435 440 445


Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr
450 455 460


Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp
465 470 475 480


Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu
485 490 495


Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys
500 505 510


Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr
515 520 525


Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln
530 535 540


Met Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn
545 550 555 560


Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met
565 570 575


Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu
580 585 590


Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp
595 600 605


Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr
610 615 620


Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe
625 630 635 640


Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro
645 650 655


Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly
660 665 670


Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr
675 680 685


Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser
690 695 700


Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala
705 710 715 720


Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu
725 730 735


Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln
740 745 750


Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu
755 760 765


His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys
770 775 780


Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys
785 790 795 800


Ser Arg Met Lys Arg Met Ala His Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn
805 810 815


Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln
820 825 830


Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp
835 840 845


Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His
850 855 860


Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His
865 870 875 880


Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe
885 890 895


Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile
900 905 910


Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile
915 920 925


Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln
930 935 940


Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val
945 950 955 960


Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys
965 970 975


Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile
980 985 990


His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys
995 1000 1005


Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe
1010 1015 1020


Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp
1025 1030 1035


Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu
1040 1045 1050


Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly
1055 1060 1065


Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro
1070 1075 1080


Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn
1085 1090 1095


His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu Glu Gly Phe Asp Phe Leu His
1100 1105 1110


Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe Ile Leu His Phe Lys Met Asn
1115 1120 1125


Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala
1130 1135 1140


Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys
1145 1150 1155


Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys Arg Ile Val Pro Val Ile Glu
1160 1165 1170


Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn
1175 1180 1185


Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp
1190 1195 1200


Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu Leu Glu Asn Asp Asp Ser His
1205 1210 1215


Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu Ile Arg Ser Val Leu Gln Met
1220 1225 1230


Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro
1235 1240 1245


Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn
1250 1255 1260


Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile
1265 1270 1275


Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu Asn His Leu Lys Glu Ser Lys
1280 1285 1290


Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala
1295 1300 1305


Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys
1310 1315 1320


Val



<210> 5
<211> 1333
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> His-AsCpf1-sNLS-sNLS

<400> 5

Met Lys His His His His His His Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr
1 5 10 15


Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln
20 25 30


Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp
35 40 45


Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg
50 55 60


Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp
65 70 75 80


Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr
85 90 95


Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn
100 105 110


Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala
115 120 125


Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu
130 135 140


Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr
145 150 155 160


Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr
165 170 175


Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp
180 185 190


Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys
195 200 205


Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro
210 215 220


Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe
225 230 235 240


Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln
245 250 255


Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly
260 265 270


Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val
275 280 285


Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala
290 295 300


Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp
305 310 315 320


Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu
325 330 335


Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn
340 345 350


Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp
355 360 365


Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser
370 375 380


Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg
385 390 395 400


Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys
405 410 415


Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile
420 425 430


Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser
435 440 445


Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr
450 455 460


Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp
465 470 475 480


Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu
485 490 495


Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys
500 505 510


Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr
515 520 525


Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln
530 535 540


Met Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn
545 550 555 560


Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met
565 570 575


Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu
580 585 590


Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp
595 600 605


Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr
610 615 620


Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe
625 630 635 640


Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro
645 650 655


Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly
660 665 670


Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr
675 680 685


Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser
690 695 700


Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala
705 710 715 720


Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu
725 730 735


Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln
740 745 750


Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu
755 760 765


His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys
770 775 780


Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys
785 790 795 800


Ser Arg Met Lys Arg Met Ala His Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn
805 810 815


Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln
820 825 830


Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp
835 840 845


Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His
850 855 860


Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His
865 870 875 880


Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe
885 890 895


Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile
900 905 910


Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile
915 920 925


Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln
930 935 940


Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val
945 950 955 960


Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys
965 970 975


Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile
980 985 990


His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys
995 1000 1005


Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe
1010 1015 1020


Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp
1025 1030 1035


Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu
1040 1045 1050


Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly
1055 1060 1065


Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro
1070 1075 1080


Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn
1085 1090 1095


His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu Glu Gly Phe Asp Phe Leu His
1100 1105 1110


Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe Ile Leu His Phe Lys Met Asn
1115 1120 1125


Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala
1130 1135 1140


Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys
1145 1150 1155


Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys Arg Ile Val Pro Val Ile Glu
1160 1165 1170


Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn
1175 1180 1185


Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp
1190 1195 1200


Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu Leu Glu Asn Asp Asp Ser His
1205 1210 1215


Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu Ile Arg Ser Val Leu Gln Met
1220 1225 1230


Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro
1235 1240 1245


Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn
1250 1255 1260


Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile
1265 1270 1275


Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu Asn His Leu Lys Glu Ser Lys
1280 1285 1290


Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala
1295 1300 1305


Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys
1310 1315 1320


Val Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1325 1330


<210> 6
<211> 1326
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> His-sNLS-AsCpf1

<400> 6

Met Lys His His His His His His Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys
1 5 10 15


Val Gly Ser Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val
20 25 30


Ser Lys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys
35 40 45


His Ile Gln Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp
50 55 60


His Tyr Lys Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr
65 70 75 80


Ala Asp Gln Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser
85 90 95


Ala Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn
100 105 110


Ala Leu Ile Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr
115 120 125


Phe Ile Gly Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His
130 135 140


Ala Glu Ile Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys
145 150 155 160


Val Leu Lys Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala
165 170 175


Leu Leu Arg Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr
180 185 190


Glu Asn Arg Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile
195 200 205


Pro His Arg Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys
210 215 220


His Ile Phe Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro Ser Leu Arg Glu His
225 230 235 240


Phe Glu Asn Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe Val Ser Thr Ser Ile
245 250 255


Glu Glu Val Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr
260 265 270


Gln Ile Asp Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala
275 280 285


Gly Thr Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile
290 295 300


Gln Lys Asn Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser Leu Pro His Arg
305 310 315 320


Phe Ile Pro Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ser
325 330 335


Phe Ile Leu Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe
340 345 350


Cys Lys Tyr Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn Val Leu Glu Thr Ala
355 360 365


Glu Ala Leu Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Leu Thr His Ile Phe
370 375 380


Ile Ser His Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser Ala Leu Cys Asp His
385 390 395 400


Trp Asp Thr Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg Arg Ile Ser Glu Leu
405 410 415


Thr Gly Lys Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys Val Gln Arg Ser Leu
420 425 430


Lys His Glu Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys
435 440 445


Glu Leu Ser Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser Glu Ile Leu Ser His
450 455 460


Ala His Ala Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Thr Leu Lys Lys Gln
465 470 475 480


Glu Glu Lys Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp Ser Leu Leu Gly Leu
485 490 495


Tyr His Leu Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu Ser Asn Glu Val Asp
500 505 510


Pro Glu Phe Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys Leu Glu Met Glu Pro
515 520 525


Ser Leu Ser Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr Ala Thr Lys Lys Pro
530 535 540


Tyr Ser Val Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln Met Pro Thr Leu Ala
545 550 555 560


Ser Gly Trp Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn Gly Ala Ile Leu Phe
565 570 575


Val Lys Asn Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Pro Lys Gln Lys Gly
580 585 590


Arg Tyr Lys Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu Lys Thr Ser Glu Gly
595 600 605


Phe Asp Lys Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp Ala Ala Lys Met Ile
610 615 620


Pro Lys Cys Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr Ala His Phe Gln Thr
625 630 635 640


His Thr Thr Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe Ile Glu Pro Leu Glu
645 650 655


Ile Thr Lys Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Glu Lys Glu Pro Lys
660 665 670


Lys Phe Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly Asp Gln Lys Gly Tyr
675 680 685


Arg Glu Ala Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr Arg Asp Phe Leu Ser
690 695 700


Lys Tyr Thr Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser
705 710 715 720


Ser Gln Tyr Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala Glu Leu Asn Pro Leu
725 730 735


Leu Tyr His Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu Lys Glu Ile Met Asp
740 745 750


Ala Val Glu Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp
755 760 765


Phe Ala Lys Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp
770 775 780


Thr Gly Leu Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys Thr Ser Ile Lys Leu
785 790 795 800


Asn Gly Gln Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser Arg Met Lys Arg
805 810 815


Met Ala His Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn Lys Lys Leu Lys Asp
820 825 830


Gln Lys Thr Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr
835 840 845


Val Asn His Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu
850 855 860


Leu Pro Asn Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu Ile Ile Lys Asp
865 870 875 880


Arg Arg Phe Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His Val Pro Ile Thr Leu
885 890 895


Asn Tyr Gln Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn
900 905 910


Ala Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg
915 920 925


Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys
930 935 940


Ile Leu Glu Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln
945 950 955 960


Lys Lys Leu Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala
965 970 975


Trp Ser Val Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser
980 985 990


Gln Val Ile His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His Tyr Gln Ala Val
995 1000 1005


Val Val Leu Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr
1010 1015 1020


Gly Ile Ala Glu Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu
1025 1030 1035


Ile Asp Lys Leu Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu
1040 1045 1050


Lys Val Gly Gly Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe
1055 1060 1065


Thr Ser Phe Ala Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr
1070 1075 1080


Val Pro Ala Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe
1085 1090 1095


Val Asp Pro Phe Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg
1100 1105 1110


Lys His Phe Leu Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys
1115 1120 1125


Thr Gly Asp Phe Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser
1130 1135 1140


Phe Gln Arg Gly Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val
1145 1150 1155


Phe Glu Lys Asn Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe
1160 1165 1170


Ile Ala Gly Lys Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe
1175 1180 1185


Thr Gly Arg Tyr Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala
1190 1195 1200


Leu Leu Glu Glu Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile
1205 1210 1215


Leu Pro Lys Leu Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr
1220 1225 1230


Met Val Ala Leu Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn
1235 1240 1245


Ala Ala Thr Gly Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu
1250 1255 1260


Asn Gly Val Cys Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro
1265 1270 1275


Met Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly
1280 1285 1290


Gln Leu Leu Leu Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu
1295 1300 1305


Gln Asn Gly Ile Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu
1310 1315 1320


Leu Arg Asn
1325


<210> 7
<211> 1333
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> His-sNLS-sNLS-AsCpf1

<400> 7

Met Lys His His His His His His Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys
1 5 10 15


Val Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Met Thr Gln Phe Glu Gly
20 25 30


Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Ile
35 40 45


Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln Glu Gln Gly Phe Ile Glu
50 55 60


Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys Glu Leu Lys Pro Ile Ile
65 70 75 80


Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln Cys Leu Gln Leu Val Gln
85 90 95


Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Lys Glu
100 105 110


Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile Glu Glu Gln Ala Thr Tyr
115 120 125


Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly Arg Thr Asp Asn Leu Thr
130 135 140


Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile Tyr Lys Gly Leu Phe Lys
145 150 155 160


Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys Gln Leu Gly Thr Val Thr
165 170 175


Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg Ser Phe Asp Lys Phe Thr
180 185 190


Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg Lys Asn Val Phe Ser Ala
195 200 205


Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg Ile Val Gln Asp Asn Phe
210 215 220


Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe Thr Arg Leu Ile Thr Ala
225 230 235 240


Val Pro Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn Val Lys Lys Ala Ile Gly
245 250 255


Ile Phe Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val Phe Ser Phe Pro Phe Tyr
260 265 270


Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp Leu Tyr Asn Gln Leu Leu
275 280 285


Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn
290 295 300


Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn Asp Glu Thr Ala His Ile
305 310 315 320


Ile Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro Leu Phe Lys Gln Ile Leu
325 330 335


Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu Glu Glu Phe Lys Ser Asp
340 345 350


Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr Lys Thr Leu Leu Arg Asn
355 360 365


Glu Asn Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu Phe Asn Glu Leu Asn Ser
370 375 380


Ile Asp Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His Lys Lys Leu Glu Thr Ile
385 390 395 400


Ser Ser Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr Leu Arg Asn Ala Leu Tyr
405 410 415


Glu Arg Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys Ile Thr Lys Ser Ala Lys
420 425 430


Glu Lys Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu Asp Ile Asn Leu Gln Glu
435 440 445


Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser Glu Ala Phe Lys Gln Lys
450 455 460


Thr Ser Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala Ala Leu Asp Gln Pro Leu
465 470 475 480


Pro Thr Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys Glu Ile Leu Lys Ser Gln
485 490 495


Leu Asp Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu Leu Asp Trp Phe Ala Val
500 505 510


Asp Glu Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe Ser Ala Arg Leu Thr Gly
515 520 525


Ile Lys Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser Phe Tyr Asn Lys Ala Arg
530 535 540


Asn Tyr Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val Glu Lys Phe Lys Leu Asn
545 550 555 560


Phe Gln Met Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp Asp Val Asn Lys Glu Lys
565 570 575


Asn Asn Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly
580 585 590


Ile Met Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys Ala Leu Ser Phe Glu Pro
595 600 605


Thr Glu Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe
610 615 620


Pro Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys Ser Thr Gln Leu Lys Ala
625 630 635 640


Val Thr Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr Pro Ile Leu Leu Ser Asn
645 650 655


Asn Phe Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys Glu Ile Tyr Asp Leu Asn
660 665 670


Asn Pro Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Lys
675 680 685


Thr Gly Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala Leu Cys Lys Trp Ile Asp
690 695 700


Phe Thr Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr Lys Thr Thr Ser Ile Asp
705 710 715 720


Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr Lys Asp Leu Gly Glu Tyr
725 730 735


Tyr Ala Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His Ile Ser Phe Gln Arg Ile
740 745 750


Ala Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu Thr Gly Lys Leu Tyr Leu
755 760 765


Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys Gly His His Gly Lys Pro
770 775 780


Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu Phe Ser Pro Glu Asn Leu
785 790 795 800


Ala Lys Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln Ala Glu Leu Phe Tyr Arg
805 810 815


Pro Lys Ser Arg Met Lys Arg Met Ala His Arg Leu Gly Glu Lys Met
820 825 830


Leu Asn Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr Pro Ile Pro Asp Thr Leu
835 840 845


Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His Arg Leu Ser His Asp Leu
850 855 860


Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn Val Ile Thr Lys Glu Val
865 870 875 880


Ser His Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe Thr Ser Asp Lys Phe Phe
885 890 895


Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln Ala Ala Asn Ser Pro Ser
900 905 910


Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu Thr
915 920 925


Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Thr
930 935 940


Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu Gln Arg Ser Leu Asn Thr
945 950 955 960


Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu Asp Asn Arg Glu Lys Glu
965 970 975


Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val Val Gly Thr Ile Lys Asp
980 985 990


Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile His Glu Ile Val Asp Leu
995 1000 1005


Met Ile His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu Glu Asn Leu Asn Phe
1010 1015 1020


Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu Lys Ala Val Tyr
1025 1030 1035


Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Cys Leu Val
1040 1045 1050


Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly Val Leu Asn Pro
1055 1060 1065


Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala Lys Met Gly Thr
1070 1075 1080


Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro Tyr Thr Ser Lys
1085 1090 1095


Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe Val Trp Lys Thr
1100 1105 1110


Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu Glu Gly Phe Asp
1115 1120 1125


Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe Ile Leu His Phe
1130 1135 1140


Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly Leu Pro Gly Phe
1145 1150 1155


Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn Glu Thr Gln Phe
1160 1165 1170


Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys Arg Ile Val Pro
1175 1180 1185


Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr Arg Asp Leu Tyr
1190 1195 1200


Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu Lys Gly Ile Val
1205 1210 1215


Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu Leu Glu Asn Asp
1220 1225 1230


Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu Ile Arg Ser Val
1235 1240 1245


Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly Glu Asp Tyr Ile
1250 1255 1260


Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys Phe Asp Ser Arg
1265 1270 1275


Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala
1280 1285 1290


Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu Asn His Leu Lys
1295 1300 1305


Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile Ser Asn Gln Asp
1310 1315 1320


Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn
1325 1330


<210> 8
<211> 1327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> sNLS-sNLS-AsCpf1

<400> 8

Met Lys Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ser Pro Lys Lys
1 5 10 15


Lys Arg Lys Val Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln
20 25 30


Val Ser Lys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu
35 40 45


Lys His Ile Gln Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn
50 55 60


Asp His Tyr Lys Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr
65 70 75 80


Tyr Ala Asp Gln Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu
85 90 95


Ser Ala Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg
100 105 110


Asn Ala Leu Ile Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp
115 120 125


Tyr Phe Ile Gly Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg
130 135 140


His Ala Glu Ile Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly
145 150 155 160


Lys Val Leu Lys Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn
165 170 175


Ala Leu Leu Arg Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe
180 185 190


Tyr Glu Asn Arg Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala
195 200 205


Ile Pro His Arg Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn
210 215 220


Cys His Ile Phe Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro Ser Leu Arg Glu
225 230 235 240


His Phe Glu Asn Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe Val Ser Thr Ser
245 250 255


Ile Glu Glu Val Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln
260 265 270


Thr Gln Ile Asp Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu
275 280 285


Ala Gly Thr Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala
290 295 300


Ile Gln Lys Asn Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser Leu Pro His
305 310 315 320


Arg Phe Ile Pro Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Asn Thr Leu
325 330 335


Ser Phe Ile Leu Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser
340 345 350


Phe Cys Lys Tyr Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn Val Leu Glu Thr
355 360 365


Ala Glu Ala Leu Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Leu Thr His Ile
370 375 380


Phe Ile Ser His Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser Ala Leu Cys Asp
385 390 395 400


His Trp Asp Thr Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg Arg Ile Ser Glu
405 410 415


Leu Thr Gly Lys Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys Val Gln Arg Ser
420 425 430


Leu Lys His Glu Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ala Gly
435 440 445


Lys Glu Leu Ser Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser Glu Ile Leu Ser
450 455 460


His Ala His Ala Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Thr Leu Lys Lys
465 470 475 480


Gln Glu Glu Lys Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp Ser Leu Leu Gly
485 490 495


Leu Tyr His Leu Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu Ser Asn Glu Val
500 505 510


Asp Pro Glu Phe Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys Leu Glu Met Glu
515 520 525


Pro Ser Leu Ser Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr Ala Thr Lys Lys
530 535 540


Pro Tyr Ser Val Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln Met Pro Thr Leu
545 550 555 560


Ala Ser Gly Trp Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn Gly Ala Ile Leu
565 570 575


Phe Val Lys Asn Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Pro Lys Gln Lys
580 585 590


Gly Arg Tyr Lys Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu Lys Thr Ser Glu
595 600 605


Gly Phe Asp Lys Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp Ala Ala Lys Met
610 615 620


Ile Pro Lys Cys Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr Ala His Phe Gln
625 630 635 640


Thr His Thr Thr Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe Ile Glu Pro Leu
645 650 655


Glu Ile Thr Lys Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Glu Lys Glu Pro
660 665 670


Lys Lys Phe Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly Asp Gln Lys Gly
675 680 685


Tyr Arg Glu Ala Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr Arg Asp Phe Leu
690 695 700


Ser Lys Tyr Thr Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser Ser Leu Arg Pro
705 710 715 720


Ser Ser Gln Tyr Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala Glu Leu Asn Pro
725 730 735


Leu Leu Tyr His Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu Lys Glu Ile Met
740 745 750


Asp Ala Val Glu Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys
755 760 765


Asp Phe Ala Lys Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr
770 775 780


Trp Thr Gly Leu Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys Thr Ser Ile Lys
785 790 795 800


Leu Asn Gly Gln Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser Arg Met Lys
805 810 815


Arg Met Ala His Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn Lys Lys Leu Lys
820 825 830


Asp Gln Lys Thr Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp
835 840 845


Tyr Val Asn His Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala
850 855 860


Leu Leu Pro Asn Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu Ile Ile Lys
865 870 875 880


Asp Arg Arg Phe Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His Val Pro Ile Thr
885 890 895


Leu Asn Tyr Gln Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val
900 905 910


Asn Ala Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp
915 920 925


Arg Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly
930 935 940


Lys Ile Leu Glu Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr
945 950 955 960


Gln Lys Lys Leu Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln
965 970 975


Ala Trp Ser Val Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu
980 985 990


Ser Gln Val Ile His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His Tyr Gln Ala
995 1000 1005


Val Val Val Leu Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg
1010 1015 1020


Thr Gly Ile Ala Glu Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met
1025 1030 1035


Leu Ile Asp Lys Leu Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala
1040 1045 1050


Glu Lys Val Gly Gly Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln
1055 1060 1065


Phe Thr Ser Phe Ala Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe
1070 1075 1080


Tyr Val Pro Ala Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly
1085 1090 1095


Phe Val Asp Pro Phe Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser
1100 1105 1110


Arg Lys His Phe Leu Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val
1115 1120 1125


Lys Thr Gly Asp Phe Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu
1130 1135 1140


Ser Phe Gln Arg Gly Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile
1145 1150 1155


Val Phe Glu Lys Asn Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro
1160 1165 1170


Phe Ile Ala Gly Lys Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg
1175 1180 1185


Phe Thr Gly Arg Tyr Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile
1190 1195 1200


Ala Leu Leu Glu Glu Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn
1205 1210 1215


Ile Leu Pro Lys Leu Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp
1220 1225 1230


Thr Met Val Ala Leu Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser
1235 1240 1245


Asn Ala Ala Thr Gly Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp
1250 1255 1260


Leu Asn Gly Val Cys Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp
1265 1270 1275


Pro Met Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys
1280 1285 1290


Gly Gln Leu Leu Leu Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys
1295 1300 1305


Leu Gln Asn Gly Ile Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln
1310 1315 1320


Glu Leu Arg Asn
1325


<210> 9
<211> 1332
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> His-sNLS-AsCpf1-sNLS

<400> 9

Met Lys His His His His His His Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5 10 15


Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr
20 25 30


Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln
35 40 45


Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys
50 55 60


Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln
65 70 75 80


Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile
85 90 95


Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile
100 105 110


Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly
115 120 125


Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile
130 135 140


Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys
145 150 155 160


Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg
165 170 175


Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg
180 185 190


Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg
195 200 205


Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe
210 215 220


Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn
225 230 235 240


Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val
245 250 255


Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp
260 265 270


Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu
275 280 285


Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn
290 295 300


Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro
305 310 315 320


Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu
325 330 335


Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr
340 345 350


Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu
355 360 365


Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His
370 375 380


Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr
385 390 395 400


Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys
405 410 415


Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu
420 425 430


Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser
435 440 445


Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala
450 455 460


Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys
465 470 475 480


Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu
485 490 495


Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe
500 505 510


Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser
515 520 525


Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val
530 535 540


Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln Met Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp
545 550 555 560


Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn
565 570 575


Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys
580 585 590


Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys
595 600 605


Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys
610 615 620


Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr
625 630 635 640


Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys
645 650 655


Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln
660 665 670


Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala
675 680 685


Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr
690 695 700


Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr
705 710 715 720


Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His
725 730 735


Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu
740 745 750


Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys
755 760 765


Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu
770 775 780


Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln
785 790 795 800


Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser Arg Met Lys Arg Met Ala His
805 810 815


Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr
820 825 830


Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His
835 840 845


Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn
850 855 860


Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe
865 870 875 880


Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln
885 890 895


Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu
900 905 910


Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg
915 920 925


Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu
930 935 940


Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu
945 950 955 960


Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val
965 970 975


Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile
980 985 990


His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu
995 1000 1005


Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala
1010 1015 1020


Glu Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys
1025 1030 1035


Leu Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly
1040 1045 1050


Gly Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe
1055 1060 1065


Ala Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala
1070 1075 1080


Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro
1085 1090 1095


Phe Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe
1100 1105 1110


Leu Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp
1115 1120 1125


Phe Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg
1130 1135 1140


Gly Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys
1145 1150 1155


Asn Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly
1160 1165 1170


Lys Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg
1175 1180 1185


Tyr Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu
1190 1195 1200


Glu Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys
1205 1210 1215


Leu Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala
1220 1225 1230


Leu Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr
1235 1240 1245


Gly Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val
1250 1255 1260


Cys Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala
1265 1270 1275


Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu
1280 1285 1290


Leu Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly
1295 1300 1305


Ile Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn
1310 1315 1320


Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly
1325 1330


<210> 10
<211> 1352
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> His-sNLS-sNLS-AsCpf1-sNLS-sNLS

<400> 10

Met Gly His His His His His His Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys
1 5 10 15


Val Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ser Thr Gln Phe Glu
20 25 30


Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr Leu Arg Phe Glu Leu
35 40 45


Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln Glu Gln Gly Phe Ile
50 55 60


Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys Glu Leu Lys Pro Ile
65 70 75 80


Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln Cys Leu Gln Leu Val
85 90 95


Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Lys
100 105 110


Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile Glu Glu Gln Ala Thr
115 120 125


Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly Arg Thr Asp Asn Leu
130 135 140


Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile Tyr Lys Gly Leu Phe
145 150 155 160


Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys Gln Leu Gly Thr Val
165 170 175


Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg Ser Phe Asp Lys Phe
180 185 190


Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg Lys Asn Val Phe Ser
195 200 205


Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg Ile Val Gln Asp Asn
210 215 220


Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe Thr Arg Leu Ile Thr
225 230 235 240


Ala Val Pro Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn Val Lys Lys Ala Ile
245 250 255


Gly Ile Phe Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val Phe Ser Phe Pro Phe
260 265 270


Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp Leu Tyr Asn Gln Leu
275 280 285


Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu Lys Ile Lys Gly Leu
290 295 300


Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn Asp Glu Thr Ala His
305 310 315 320


Ile Ile Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro Leu Phe Lys Gln Ile
325 330 335


Leu Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu Glu Glu Phe Lys Ser
340 345 350


Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr Lys Thr Leu Leu Arg
355 360 365


Asn Glu Asn Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu Phe Asn Glu Leu Asn
370 375 380


Ser Ile Asp Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His Lys Lys Leu Glu Thr
385 390 395 400


Ile Ser Ser Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr Leu Arg Asn Ala Leu
405 410 415


Tyr Glu Arg Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys Ile Thr Lys Ser Ala
420 425 430


Lys Glu Lys Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu Asp Ile Asn Leu Gln
435 440 445


Glu Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser Glu Ala Phe Lys Gln
450 455 460


Lys Thr Ser Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala Ala Leu Asp Gln Pro
465 470 475 480


Leu Pro Thr Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys Glu Ile Leu Lys Ser
485 490 495


Gln Leu Asp Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu Leu Asp Trp Phe Ala
500 505 510


Val Asp Glu Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe Ser Ala Arg Leu Thr
515 520 525


Gly Ile Lys Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser Phe Tyr Asn Lys Ala
530 535 540


Arg Asn Tyr Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val Glu Lys Phe Lys Leu
545 550 555 560


Asn Phe Gln Met Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp Asp Val Asn Lys Glu
565 570 575


Lys Asn Asn Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn Gly Leu Tyr Tyr Leu
580 585 590


Gly Ile Met Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys Ala Leu Ser Phe Glu
595 600 605


Pro Thr Glu Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys Met Tyr Tyr Asp Tyr
610 615 620


Phe Pro Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys Ser Thr Gln Leu Lys
625 630 635 640


Ala Val Thr Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr Pro Ile Leu Leu Ser
645 650 655


Asn Asn Phe Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys Glu Ile Tyr Asp Leu
660 665 670


Asn Asn Pro Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln Thr Ala Tyr Ala Lys
675 680 685


Lys Thr Gly Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala Leu Cys Lys Trp Ile
690 695 700


Asp Phe Thr Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr Lys Thr Thr Ser Ile
705 710 715 720


Asp Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr Lys Asp Leu Gly Glu
725 730 735


Tyr Tyr Ala Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His Ile Ser Phe Gln Arg
740 745 750


Ile Ala Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu Thr Gly Lys Leu Tyr
755 760 765


Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys Gly His His Gly Lys
770 775 780


Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu Phe Ser Pro Glu Asn
785 790 795 800


Leu Ala Lys Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln Ala Glu Leu Phe Tyr
805 810 815


Arg Pro Lys Ser Arg Met Lys Arg Met Ala Ala Arg Leu Gly Glu Lys
820 825 830


Met Leu Asn Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr Pro Ile Pro Asp Thr
835 840 845


Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His Arg Leu Ser His Asp
850 855 860


Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn Val Ile Thr Lys Glu
865 870 875 880


Val Ser His Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe Thr Ser Asp Lys Phe
885 890 895


Phe Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln Ala Ala Asn Ser Pro
900 905 910


Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu
915 920 925


Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile
930 935 940


Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu Gln Arg Ser Leu Asn
945 950 955 960


Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu Asp Asn Arg Glu Lys
965 970 975


Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val Val Gly Thr Ile Lys
980 985 990


Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile His Glu Ile Val Asp
995 1000 1005


Leu Met Ile His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu Glu Asn Leu Asn
1010 1015 1020


Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu Lys Ala Val
1025 1030 1035


Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Cys Leu
1040 1045 1050


Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly Val Leu Asn
1055 1060 1065


Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala Lys Met Gly
1070 1075 1080


Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro Tyr Thr Ser
1085 1090 1095


Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe Val Trp Lys
1100 1105 1110


Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu Glu Gly Phe
1115 1120 1125


Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe Ile Leu His
1130 1135 1140


Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly Leu Pro Gly
1145 1150 1155


Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn Glu Thr Gln
1160 1165 1170


Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys Arg Ile Val
1175 1180 1185


Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr Arg Asp Leu
1190 1195 1200


Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu Lys Gly Ile
1205 1210 1215


Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu Leu Glu Asn
1220 1225 1230


Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu Ile Arg Ser
1235 1240 1245


Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly Glu Asp Tyr
1250 1255 1260


Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys Phe Asp Ser
1265 1270 1275


Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp Ala Asn Gly
1280 1285 1290


Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu Asn His Leu
1295 1300 1305


Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile Ser Asn Gln
1310 1315 1320


Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn Gly Ser Pro Lys
1325 1330 1335


Lys Lys Arg Lys Val Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1340 1345 1350


<210> 11
<211> 1332
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> His-AsCpf1-nNLS Cys-less

<400> 11

Met Lys His His His His His His Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr
1 5 10 15


Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln
20 25 30


Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp
35 40 45


Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg
50 55 60


Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln Ser Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp
65 70 75 80


Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr
85 90 95


Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn
100 105 110


Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala
115 120 125


Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu
130 135 140


Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr
145 150 155 160


Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr
165 170 175


Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp
180 185 190


Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys
195 200 205


Phe Lys Glu Asn Ser His Ile Phe Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro
210 215 220


Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe
225 230 235 240


Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln
245 250 255


Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly
260 265 270


Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val
275 280 285


Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala
290 295 300


Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp
305 310 315 320


Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu
325 330 335


Val Ile Gln Ser Phe Ser Lys Tyr Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn
340 345 350


Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp
355 360 365


Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser
370 375 380


Ala Leu Ser Asp His Trp Asp Thr Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg
385 390 395 400


Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys
405 410 415


Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile
420 425 430


Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser
435 440 445


Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr
450 455 460


Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp
465 470 475 480


Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu
485 490 495


Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys
500 505 510


Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr
515 520 525


Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln
530 535 540


Met Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn
545 550 555 560


Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met
565 570 575


Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu
580 585 590


Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp
595 600 605


Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Ser Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr
610 615 620


Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe
625 630 635 640


Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro
645 650 655


Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly
660 665 670


Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala Leu Ser Lys Trp Ile Asp Phe Thr
675 680 685


Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser
690 695 700


Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala
705 710 715 720


Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu
725 730 735


Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln
740 745 750


Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu
755 760 765


His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys
770 775 780


Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys
785 790 795 800


Ser Arg Met Lys Arg Met Ala His Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn
805 810 815


Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln
820 825 830


Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp
835 840 845


Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His
850 855 860


Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His
865 870 875 880


Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe
885 890 895


Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile
900 905 910


Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile
915 920 925


Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln
930 935 940


Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val
945 950 955 960


Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys
965 970 975


Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile
980 985 990


His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys
995 1000 1005


Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe
1010 1015 1020


Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Ser Leu Val Leu Lys Asp
1025 1030 1035


Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu
1040 1045 1050


Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly
1055 1060 1065


Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro
1070 1075 1080


Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn
1085 1090 1095


His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu Glu Gly Phe Asp Phe Leu His
1100 1105 1110


Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe Ile Leu His Phe Lys Met Asn
1115 1120 1125


Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala
1130 1135 1140


Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys
1145 1150 1155


Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys Arg Ile Val Pro Val Ile Glu
1160 1165 1170


Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn
1175 1180 1185


Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp
1190 1195 1200


Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu Leu Glu Asn Asp Asp Ser His
1205 1210 1215


Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu Ile Arg Ser Val Leu Gln Met
1220 1225 1230


Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro
1235 1240 1245


Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Ser Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn
1250 1255 1260


Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile
1265 1270 1275


Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu Asn His Leu Lys Glu Ser Lys
1280 1285 1290


Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala
1295 1300 1305


Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys
1310 1315 1320


Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly
1325 1330


<210> 12
<211> 1332
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> His-AsCpf1-nNLS Cys-low

<400> 12

Met Lys His His His His His His Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr
1 5 10 15


Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln
20 25 30


Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp
35 40 45


Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg
50 55 60


Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp
65 70 75 80


Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr
85 90 95


Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn
100 105 110


Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala
115 120 125


Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu
130 135 140


Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr
145 150 155 160


Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr
165 170 175


Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp
180 185 190


Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys
195 200 205


Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro
210 215 220


Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe
225 230 235 240


Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln
245 250 255


Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly
260 265 270


Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val
275 280 285


Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala
290 295 300


Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp
305 310 315 320


Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu
325 330 335


Val Ile Gln Ser Phe Ser Lys Tyr Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn
340 345 350


Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp
355 360 365


Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser
370 375 380


Ala Leu Ser Asp His Trp Asp Thr Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg
385 390 395 400


Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys
405 410 415


Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile
420 425 430


Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser
435 440 445


Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr
450 455 460


Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp
465 470 475 480


Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu
485 490 495


Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys
500 505 510


Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr
515 520 525


Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln
530 535 540


Met Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn
545 550 555 560


Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met
565 570 575


Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu
580 585 590


Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp
595 600 605


Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr
610 615 620


Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe
625 630 635 640


Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro
645 650 655


Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly
660 665 670


Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala Leu Ser Lys Trp Ile Asp Phe Thr
675 680 685


Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser
690 695 700


Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala
705 710 715 720


Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu
725 730 735


Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln
740 745 750


Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu
755 760 765


His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys
770 775 780


Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys
785 790 795 800


Ser Arg Met Lys Arg Met Ala His Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn
805 810 815


Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln
820 825 830


Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp
835 840 845


Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His
850 855 860


Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His
865 870 875 880


Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe
885 890 895


Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile
900 905 910


Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile
915 920 925


Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln
930 935 940


Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val
945 950 955 960


Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys
965 970 975


Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile
980 985 990


His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys
995 1000 1005


Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe
1010 1015 1020


Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp
1025 1030 1035


Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu
1040 1045 1050


Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly
1055 1060 1065


Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro
1070 1075 1080


Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn
1085 1090 1095


His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu Glu Gly Phe Asp Phe Leu His
1100 1105 1110


Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe Ile Leu His Phe Lys Met Asn
1115 1120 1125


Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala
1130 1135 1140


Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys
1145 1150 1155


Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys Arg Ile Val Pro Val Ile Glu
1160 1165 1170


Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn
1175 1180 1185


Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp
1190 1195 1200


Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu Leu Glu Asn Asp Asp Ser His
1205 1210 1215


Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu Ile Arg Ser Val Leu Gln Met
1220 1225 1230


Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro
1235 1240 1245


Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn
1250 1255 1260


Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile
1265 1270 1275


Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu Asn His Leu Lys Glu Ser Lys
1280 1285 1290


Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala
1295 1300 1305


Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys
1310 1315 1320


Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly
1325 1330


<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Matched Site 1

<400> 13
gattgaagga aaagttacaa 20


<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Matched Site 5

<400> 14
ggatgccact aaaagggaaa 20


<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Matched Site 11

<400> 15
gctatcactg ccatgtctgg 20


<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Matched Site 18

<400> 16
ggggaggtga caccactgaa 20


<210> 17
<211> 1307
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 17

Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr
1 5 10 15


Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln
20 25 30


Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys
35 40 45


Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln
50 55 60


Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile
65 70 75 80


Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile
85 90 95


Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly
100 105 110


Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile
115 120 125


Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys
130 135 140


Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg
145 150 155 160


Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg
165 170 175


Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg
180 185 190


Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe
195 200 205


Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro Ser Leu Arg Glu His Phe Glu Asn
210 215 220


Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe Val Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val
225 230 235 240


Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp
245 250 255


Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu
260 265 270


Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn
275 280 285


Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser Leu Pro His Arg Phe Ile Pro
290 295 300


Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu
305 310 315 320


Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr
325 330 335


Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn Val Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu
340 345 350


Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Leu Thr His Ile Phe Ile Ser His
355 360 365


Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser Ala Leu Cys Asp His Trp Asp Thr
370 375 380


Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg Arg Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys
385 390 395 400


Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys Val Gln Arg Ser Leu Lys His Glu
405 410 415


Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser
420 425 430


Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser Glu Ile Leu Ser His Ala His Ala
435 440 445


Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Thr Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys
450 455 460


Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp Ser Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu
465 470 475 480


Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu Ser Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe
485 490 495


Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys Leu Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser
500 505 510


Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr Ala Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val
515 520 525


Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln Met Pro Thr Leu Ala Ser Gly Trp
530 535 540


Asp Val Asn Lys Glu Lys Asn Asn Gly Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn
545 550 555 560


Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Pro Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys
565 570 575


Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu Lys Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys
580 585 590


Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys
595 600 605


Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr Ala His Phe Gln Thr His Thr Thr
610 615 620


Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe Ile Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys
625 630 635 640


Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Glu Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln
645 650 655


Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly Asp Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala
660 665 670


Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr Arg Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr
675 680 685


Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr
690 695 700


Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala Glu Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His
705 710 715 720


Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu Lys Glu Ile Met Asp Ala Val Glu
725 730 735


Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys
740 745 750


Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu
755 760 765


Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys Thr Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln
770 775 780


Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser Arg Met Lys Arg Met Ala His
785 790 795 800


Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn Lys Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr
805 810 815


Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His
820 825 830


Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn
835 840 845


Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe
850 855 860


Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln
865 870 875 880


Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu
885 890 895


Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg
900 905 910


Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu
915 920 925


Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu
930 935 940


Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val
945 950 955 960


Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile
965 970 975


His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu
980 985 990


Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu
995 1000 1005


Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu
1010 1015 1020


Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly
1025 1030 1035


Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala
1040 1045 1050


Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro
1055 1060 1065


Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe
1070 1075 1080


Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu
1085 1090 1095


Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe
1100 1105 1110


Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly
1115 1120 1125


Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn
1130 1135 1140


Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys
1145 1150 1155


Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr
1160 1165 1170


Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu
1175 1180 1185


Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu
1190 1195 1200


Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu
1205 1210 1215


Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly
1220 1225 1230


Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys
1235 1240 1245


Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp
1250 1255 1260


Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu
1265 1270 1275


Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile
1280 1285 1290


Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn
1295 1300 1305


<210> 18
<211> 1228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 18

Met Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr
1 5 10 15


Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile Asp
20 25 30


Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Lys
35 40 45


Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn Asp
50 55 60


Val Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu Asn Asn Tyr Ile Ser Leu
65 70 75 80


Phe Arg Lys Lys Thr Arg Thr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
85 90 95


Leu Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys Gly Asn
100 105 110


Glu Gly Tyr Lys Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Ile Glu Thr Ile Leu
115 120 125


Pro Glu Phe Leu Asp Asp Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Asn Ser Phe
130 135 140


Asn Gly Phe Thr Thr Ala Phe Thr Gly Phe Phe Asp Asn Arg Glu Asn
145 150 155 160


Met Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala Phe Arg Cys Ile
165 170 175


Asn Glu Asn Leu Thr Arg Tyr Ile Ser Asn Met Asp Ile Phe Glu Lys
180 185 190


Val Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu Lys
195 200 205


Ile Leu Asn Ser Asp Tyr Asp Val Glu Asp Phe Phe Glu Gly Glu Phe
210 215 220


Phe Asn Phe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn Ala Ile
225 230 235 240


Ile Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn
245 250 255


Glu Tyr Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys Thr Lys Gln Lys Leu Pro Lys
260 265 270


Phe Lys Pro Leu Tyr Lys Gln Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Leu Ser
275 280 285


Phe Tyr Gly Glu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val Phe
290 295 300


Arg Asn Thr Leu Asn Lys Asn Ser Glu Ile Phe Ser Ser Ile Lys Lys
305 310 315 320


Leu Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly Ile
325 330 335


Phe Val Lys Asn Gly Pro Ala Ile Ser Thr Ile Ser Lys Asp Ile Phe
340 345 350


Gly Glu Trp Asn Val Ile Arg Asp Lys Trp Asn Ala Glu Tyr Asp Asp
355 360 365


Ile His Leu Lys Lys Lys Ala Val Val Thr Glu Lys Tyr Glu Asp Asp
370 375 380


Arg Arg Lys Ser Phe Lys Lys Ile Gly Ser Phe Ser Leu Glu Gln Leu
385 390 395 400


Gln Glu Tyr Ala Asp Ala Asp Leu Ser Val Val Glu Lys Leu Lys Glu
405 410 415


Ile Ile Ile Gln Lys Val Asp Glu Ile Tyr Lys Val Tyr Gly Ser Ser
420 425 430


Glu Lys Leu Phe Asp Ala Asp Phe Val Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys
435 440 445


Asn Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser Val Lys
450 455 460


Ser Phe Glu Asn Tyr Ile Lys Ala Phe Phe Gly Glu Gly Lys Glu Thr
465 470 475 480


Asn Arg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr Asp Ile
485 490 495


Leu Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile Arg Asn Tyr Val Thr
500 505 510


Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Leu Tyr Phe Gln Asn Pro
515 520 525


Gln Phe Met Gly Gly Trp Asp Lys Asp Lys Glu Thr Asp Tyr Arg Ala
530 535 540


Thr Ile Leu Arg Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile Met Asp Lys
545 550 555 560


Lys Tyr Ala Lys Cys Leu Gln Lys Ile Asp Lys Asp Asp Val Asn Gly
565 570 575


Asn Tyr Glu Lys Ile Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met
580 585 590


Leu Pro Lys Val Phe Phe Ser Lys Lys Trp Met Ala Tyr Tyr Asn Pro
595 600 605


Ser Glu Asp Ile Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys Gly
610 615 620


Asp Met Phe Asn Leu Asn Asp Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe Lys
625 630 635 640


Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Pro Lys Trp Ser Asn Ala Tyr Asp Phe Asn
645 650 655


Phe Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Lys Asp Ile Ala Gly Phe Tyr Arg Glu
660 665 670


Val Glu Glu Gln Gly Tyr Lys Val Ser Phe Glu Ser Ala Ser Lys Lys
675 680 685


Glu Val Asp Lys Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr Met Phe Gln Ile
690 695 700


Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His Gly Thr Pro Asn Leu His
705 710 715 720


Thr Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly Gln Ile
725 730 735


Arg Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser Leu Lys
740 745 750


Lys Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala Asn Lys
755 760 765


Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Val Tyr
770 775 780


Lys Asp Lys Arg Phe Ser Glu Asp Gln Tyr Glu Leu His Ile Pro Ile
785 790 795 800


Ala Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile Asn Thr Glu Val
805 810 815


Arg Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly Ile Asp
820 825 830


Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly Lys Gly
835 840 845


Asn Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile Ile Asn Asn Phe Asn
850 855 860


Gly Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys Glu
865 870 875 880


Lys Glu Arg Phe Glu Ala Arg Gln Asn Trp Thr Ser Ile Glu Asn Ile
885 890 895


Lys Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys Ile Cys
900 905 910


Glu Leu Val Glu Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Glu Asp Leu Asn
915 920 925


Ser Gly Phe Lys Asn Ser Arg Val Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln
930 935 940


Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Met Val Asp Lys
945 950 955 960


Lys Ser Asn Pro Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Lys Gly Tyr Gln Ile
965 970 975


Thr Asn Lys Phe Glu Ser Phe Lys Ser Met Ser Thr Gln Asn Gly Phe
980 985 990


Ile Phe Tyr Ile Pro Ala Trp Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser Thr
995 1000 1005


Gly Phe Val Asn Leu Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ser Ile Ala Asp
1010 1015 1020


Ser Lys Lys Phe Ile Ser Ser Phe Asp Arg Ile Met Tyr Val Pro
1025 1030 1035


Glu Glu Asp Leu Phe Glu Phe Ala Leu Asp Tyr Lys Asn Phe Ser
1040 1045 1050


Arg Thr Asp Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Tyr
1055 1060 1065


Gly Asn Arg Ile Arg Ile Phe Arg Asn Pro Lys Lys Asn Asn Val
1070 1075 1080


Phe Asp Trp Glu Glu Val Cys Leu Thr Ser Ala Tyr Lys Glu Leu
1085 1090 1095


Phe Asn Lys Tyr Gly Ile Asn Tyr Gln Gln Gly Asp Ile Arg Ala
1100 1105 1110


Leu Leu Cys Glu Gln Ser Asp Lys Ala Phe Tyr Ser Ser Phe Met
1115 1120 1125


Ala Leu Met Ser Leu Met Leu Gln Met Arg Asn Ser Ile Thr Gly
1130 1135 1140


Arg Thr Asp Val Asp Phe Leu Ile Ser Pro Val Lys Asn Ser Asp
1145 1150 1155


Gly Ile Phe Tyr Asp Ser Arg Asn Tyr Glu Ala Gln Glu Asn Ala
1160 1165 1170


Ile Leu Pro Lys Asn Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Ile Ala
1175 1180 1185


Arg Lys Val Leu Trp Ala Ile Gly Gln Phe Lys Lys Ala Glu Asp
1190 1195 1200


Glu Lys Leu Asp Lys Val Lys Ile Ala Ile Ser Asn Lys Glu Trp
1205 1210 1215


Leu Glu Tyr Ala Gln Thr Ser Val Lys His
1220 1225


<210> 19
<211> 1206
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 19

Met Tyr Tyr Glu Ser Leu Thr Lys Gln Tyr Pro Val Ser Lys Thr Ile
1 5 10 15


Arg Asn Glu Leu Ile Pro Ile Gly Lys Thr Leu Asp Asn Ile Arg Gln
20 25 30


Asn Asn Ile Leu Glu Ser Asp Val Lys Arg Lys Gln Asn Tyr Glu His
35 40 45


Val Lys Gly Ile Leu Asp Glu Tyr His Lys Gln Leu Ile Asn Glu Ala
50 55 60


Leu Asp Asn Cys Thr Leu Pro Ser Leu Lys Ile Ala Ala Glu Ile Tyr
65 70 75 80


Leu Lys Asn Gln Lys Glu Val Ser Asp Arg Glu Asp Phe Asn Lys Thr
85 90 95


Gln Asp Leu Leu Arg Lys Glu Val Val Glu Lys Leu Lys Ala His Glu
100 105 110


Asn Phe Thr Lys Ile Gly Lys Lys Asp Ile Leu Asp Leu Leu Glu Lys
115 120 125


Leu Pro Ser Ile Ser Glu Asp Asp Tyr Asn Ala Leu Glu Ser Phe Arg
130 135 140


Asn Phe Tyr Thr Tyr Phe Thr Ser Tyr Asn Lys Val Arg Glu Asn Leu
145 150 155 160


Tyr Ser Asp Lys Glu Lys Ser Ser Thr Val Ala Tyr Arg Leu Ile Asn
165 170 175


Glu Asn Phe Pro Lys Phe Leu Asp Asn Val Lys Ser Tyr Arg Phe Val
180 185 190


Lys Thr Ala Gly Ile Leu Ala Asp Gly Leu Gly Glu Glu Glu Gln Asp
195 200 205


Ser Leu Phe Ile Val Glu Thr Phe Asn Lys Thr Leu Thr Gln Asp Gly
210 215 220


Ile Asp Thr Tyr Asn Ser Gln Val Gly Lys Ile Asn Ser Ser Ile Asn
225 230 235 240


Leu Tyr Asn Gln Lys Asn Gln Lys Ala Asn Gly Phe Arg Lys Ile Pro
245 250 255


Lys Met Lys Met Leu Tyr Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Glu Glu Ser
260 265 270


Phe Ile Asp Glu Phe Gln Ser Asp Glu Val Leu Ile Asp Asn Val Glu
275 280 285


Ser Tyr Gly Ser Val Leu Ile Glu Ser Leu Lys Ser Ser Lys Val Ser
290 295 300


Ala Phe Phe Asp Ala Leu Arg Glu Ser Lys Gly Lys Asn Val Tyr Val
305 310 315 320


Lys Asn Asp Leu Ala Lys Thr Ala Met Ser Asn Ile Val Phe Glu Asn
325 330 335


Trp Arg Thr Phe Asp Asp Leu Leu Asn Gln Glu Tyr Asp Leu Ala Asn
340 345 350


Glu Asn Lys Lys Lys Asp Asp Lys Tyr Phe Glu Lys Arg Gln Lys Glu
355 360 365


Leu Lys Lys Asn Lys Ser Tyr Ser Leu Glu His Leu Cys Asn Leu Ser
370 375 380


Glu Asp Ser Cys Asn Leu Ile Glu Asn Tyr Ile His Gln Ile Ser Asp
385 390 395 400


Asp Ile Glu Asn Ile Ile Ile Asn Asn Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val
405 410 415


Ile Asn Glu His Asp Arg Ser Arg Lys Leu Ala Lys Asn Arg Lys Ala
420 425 430


Val Lys Ala Ile Lys Asp Phe Leu Asp Ser Ile Lys Val Leu Glu Arg
435 440 445


Glu Leu Lys Leu Ile Asn Ser Ser Gly Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu
450 455 460


Ile Val Tyr Ser Ala His Glu Glu Leu Leu Val Glu Leu Lys Gln Val
465 470 475 480


Asp Ser Leu Tyr Asn Met Thr Arg Asn Tyr Leu Thr Lys Lys Pro Phe
485 490 495


Ser Thr Glu Lys Val Lys Leu Asn Phe Asn Arg Ser Thr Leu Leu Asn
500 505 510


Gly Trp Asp Arg Asn Lys Glu Thr Asp Asn Leu Gly Val Leu Leu Leu
515 520 525


Lys Asp Gly Lys Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Asn Thr Ser Ala Asn Lys
530 535 540


Ala Phe Val Asn Pro Pro Val Ala Lys Thr Glu Lys Val Phe Lys Lys
545 550 555 560


Val Asp Tyr Lys Leu Leu Pro Val Pro Asn Gln Met Leu Pro Lys Val
565 570 575


Phe Phe Ala Lys Ser Asn Ile Asp Phe Tyr Asn Pro Ser Ser Glu Ile
580 585 590


Tyr Ser Asn Tyr Lys Lys Gly Thr His Lys Lys Gly Asn Met Phe Ser
595 600 605


Leu Glu Asp Cys His Asn Leu Ile Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile Ser
610 615 620


Lys His Glu Asp Trp Ser Lys Phe Gly Phe Lys Phe Ser Asp Thr Ala
625 630 635 640


Ser Tyr Asn Asp Ile Ser Glu Phe Tyr Arg Glu Val Glu Lys Gln Gly
645 650 655


Tyr Lys Leu Thr Tyr Thr Asp Ile Asp Glu Thr Tyr Ile Asn Asp Leu
660 665 670


Ile Glu Arg Asn Glu Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe
675 680 685


Ser Met Tyr Ser Lys Gly Lys Leu Asn Leu His Thr Leu Tyr Phe Met
690 695 700


Met Leu Phe Asp Gln Arg Asn Ile Asp Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn
705 710 715 720


Gly Glu Ala Glu Val Phe Tyr Arg Pro Ala Ser Ile Ser Glu Asp Glu
725 730 735


Leu Ile Ile His Lys Ala Gly Glu Glu Ile Lys Asn Lys Asn Pro Asn
740 745 750


Arg Ala Arg Thr Lys Glu Thr Ser Thr Phe Ser Tyr Asp Ile Val Lys
755 760 765


Asp Lys Arg Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Thr Leu His Ile Pro Ile Thr
770 775 780


Met Asn Phe Gly Val Asp Glu Val Lys Arg Phe Asn Asp Ala Val Asn
785 790 795 800


Ser Ala Ile Arg Ile Asp Glu Asn Val Asn Val Ile Gly Ile Asp Arg
805 810 815


Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Val Val Val Ile Asp Ser Lys Gly Asn
820 825 830


Ile Leu Glu Gln Ile Ser Leu Asn Ser Ile Ile Asn Lys Glu Tyr Asp
835 840 845


Ile Glu Thr Asp Tyr His Ala Leu Leu Asp Glu Arg Glu Gly Gly Arg
850 855 860


Asp Lys Ala Arg Lys Asp Trp Asn Thr Val Glu Asn Ile Arg Asp Leu
865 870 875 880


Lys Ala Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val Asn Val Val Ala Lys Leu Val
885 890 895


Leu Lys Tyr Asn Ala Ile Ile Cys Leu Glu Asp Leu Asn Phe Gly Phe
900 905 910


Lys Arg Gly Arg Gln Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln Lys Phe Glu
915 920 925


Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Leu Val Ile Asp Lys Ser Arg
930 935 940


Glu Gln Thr Ser Pro Lys Glu Leu Gly Gly Ala Leu Asn Ala Leu Gln
945 950 955 960


Leu Thr Ser Lys Phe Lys Ser Phe Lys Glu Leu Gly Lys Gln Ser Gly
965 970 975


Val Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Tyr Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Thr
980 985 990


Thr Gly Phe Ala Asn Leu Phe Tyr Met Lys Cys Glu Asn Val Glu Lys
995 1000 1005


Ser Lys Arg Phe Phe Asp Gly Phe Asp Phe Ile Arg Phe Asn Ala
1010 1015 1020


Leu Glu Asn Val Phe Glu Phe Gly Phe Asp Tyr Arg Ser Phe Thr
1025 1030 1035


Gln Arg Ala Cys Gly Ile Asn Ser Lys Trp Thr Val Cys Thr Asn
1040 1045 1050


Gly Glu Arg Ile Ile Lys Tyr Arg Asn Pro Asp Lys Asn Asn Met
1055 1060 1065


Phe Asp Glu Lys Val Val Val Val Thr Asp Glu Met Lys Asn Leu
1070 1075 1080


Phe Glu Gln Tyr Lys Ile Pro Tyr Glu Asp Gly Arg Asn Val Lys
1085 1090 1095


Asp Met Ile Ile Ser Asn Glu Glu Ala Glu Phe Tyr Arg Arg Leu
1100 1105 1110


Tyr Arg Leu Leu Gln Gln Thr Leu Gln Met Arg Asn Ser Thr Ser
1115 1120 1125


Asp Gly Thr Arg Asp Tyr Ile Ile Ser Pro Val Lys Asn Lys Arg
1130 1135 1140


Glu Ala Tyr Phe Asn Ser Glu Leu Ser Asp Gly Ser Val Pro Lys
1145 1150 1155


Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Ile Ala Arg Lys Gly Leu
1160 1165 1170


Trp Val Leu Glu Gln Ile Arg Gln Lys Ser Glu Gly Glu Lys Ile
1175 1180 1185


Asn Leu Ala Met Thr Asn Ala Glu Trp Leu Glu Tyr Ala Gln Thr
1190 1195 1200


His Leu Leu
1205


<210> 20
<211> 4059
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 20
atgacccagt tcgagggctt caccaacctg taccaggtga gcaagaccct gcggttcgag 60

ctgatccccc agggcaagac cctgaagcac atccaggagc agggcttcat cgaggaggac 120

aaggcccgga acgaccacta caaggagctg aagcccatca tcgaccggat ctacaagacc 180

tacgccgacc agtgcctgca gctggtgcag ctggactggg agaacctgag cgccgccatc 240

gacagctacc ggaaggagaa gaccgaggag acccggaacg ccctgatcga ggagcaggcc 300

acctaccgga acgccatcca cgactacttc atcggccgga ccgacaacct gaccgacgcc 360

atcaacaagc ggcacgccga gatctacaag ggcctgttca aggccgagct gttcaacggc 420

aaggtgctga agcagctggg caccgtgacc accaccgagc acgagaacgc cctgctgcgg 480

agcttcgaca agttcaccac ctacttcagc ggcttctacg agaaccggaa gaacgtgttc 540

agcgccgagg acatcagcac cgccatcccc caccggatcg tgcaggacaa cttccccaag 600

ttcaaggaga actgccacat cttcacccgg ctgatcaccg ccgtgcccag cctgcgggag 660

cacttcgaga acgtgaagaa ggccatcggc atcttcgtga gcaccagcat cgaggaggtg 720

ttcagcttcc ccttctacaa ccagctgctg acccagaccc agatcgacct gtacaaccag 780

ctgctgggcg gcatcagccg ggaggccggc accgagaaga tcaagggcct gaacgaggtg 840

ctgaacctgg ccatccagaa gaacgacgag accgcccaca tcatcgccag cctgccccac 900

cggttcatcc ccctgttcaa gcagatcctg agcgaccgga acaccctgag cttcatcctg 960

gaggagttca agagcgacga ggaggtgatc cagagcttct gcaagtacaa gaccctgctg 1020

cggaacgaga acgtgctgga gaccgccgag gccctgttca acgagctgaa cagcatcgac 1080

ctgacccaca tcttcatcag ccacaagaag ctggagacca tcagcagcgc cctgtgcgac 1140

cactgggaca ccctgcggaa cgccctgtac gagcggcgga tcagcgagct gaccggcaag 1200

atcaccaaga gcgccaagga gaaggtgcag cggagcctga agcacgagga catcaacctg 1260

caggagatca tcagcgccgc cggcaaggag ctgagcgagg ccttcaagca gaagaccagc 1320

gagatcctga gccacgccca cgccgccctg gaccagcccc tgcccaccac cctgaagaag 1380

caggaggaga aggagatcct gaaaagccag ctggacagcc tgctgggcct gtaccacctg 1440

ctggactggt tcgccgtgga cgagagcaac gaggtggacc ccgagttcag cgcccggctg 1500

accggcatca agctggagat ggagcccagc ctgagcttct acaacaaggc ccggaactac 1560

gccaccaaga agccctacag cgtggagaag ttcaagctga acttccagat gcccaccctg 1620

gccagcggct gggacgtgaa caaggagaag aacaacggcg ccatcctgtt cgtgaagaac 1680

ggcctgtact acctgggcat catgcccaag cagaagggcc ggtacaaggc cctgagcttc 1740

gagcccaccg agaagaccag cgagggcttc gacaagatgt actacgacta cttccccgac 1800

gccgccaaga tgatccccaa gtgcagcacc cagctgaagg ccgtgaccgc ccacttccag 1860

acccacacca cccccatcct gctgagcaac aacttcatcg agcccctgga gatcaccaag 1920

gagatctacg acctgaacaa ccccgagaag gagcccaaga agttccagac cgcctacgcc 1980

aagaagaccg gcgaccagaa gggctaccgg gaggccctgt gcaagtggat cgacttcacc 2040

cgggacttcc tgagcaagta caccaagacc accagcatcg acctgagcag cctgcggccc 2100

agcagccagt acaaggacct gggcgagtac tacgccgagc tgaaccccct gctgtaccac 2160

atcagcttcc agcggatcgc cgagaaggag atcatggacg ccgtggagac cggcaagctg 2220

tacctgttcc agatctacaa caaggacttc gccaagggcc accacggcaa gcccaacctg 2280

cacaccctgt actggaccgg cctgttcagc cccgagaacc tggccaagac cagcatcaag 2340

ctgaacggcc aggccgagct gttctaccgg cccaagagcc ggatgaagcg gatggcccac 2400

cggctgggcg agaagatgct gaacaagaag ctgaaggacc agaagacccc catccccgac 2460

accctgtacc aggagctgta cgactacgtg aaccaccggc tgagccacga cctgagcgac 2520

gaggcccggg ccctgctgcc caacgtgatc accaaggagg tgagccacga gatcatcaag 2580

gaccggcggt tcaccagcga caagttcttc ttccacgtgc ccatcaccct gaactaccag 2640

gccgccaaca gccccagcaa gttcaaccag cgggtgaacg cctacctgaa ggagcacccc 2700

gagaccccca tcatcggcat cgaccggggc gagcggaacc tgatctacat caccgtgatc 2760

gacagcaccg gcaagatcct ggagcagcgg agcctgaaca ccatccagca gttcgactac 2820

cagaagaagc tggacaaccg ggagaaggag cgggtggccg cccggcaggc ctggagcgtg 2880

gtgggcacca tcaaggacct gaagcagggc tacctgagcc aggtgatcca cgagatcgtg 2940

gacctgatga tccactacca ggccgtggtg gtgctggaga acctgaactt cggcttcaag 3000

agcaagcgga ccggcatcgc cgagaaggcc gtgtaccagc agttcgagaa gatgctgatc 3060

gacaagctga actgcctggt gctgaaggac taccccgccg agaaggtggg cggcgtgctg 3120

aacccctacc agctgaccga ccagttcacc agcttcgcca agatgggcac ccagagcggc 3180

ttcctgttct acgtgcccgc cccctacacc agcaagatcg accccctgac cggcttcgtg 3240

gaccccttcg tgtggaagac catcaagaac cacgagagcc ggaagcactt cctggagggc 3300

ttcgacttcc tgcactacga cgtgaagacc ggcgacttca tcctgcactt caagatgaac 3360

cggaacctga gcttccagcg gggcctgccc ggcttcatgc ccgcctggga catcgtgttc 3420

gagaagaacg agacccagtt cgacgccaag ggcaccccct tcatcgccgg caagcggatc 3480

gtgcccgtga tcgagaacca ccggttcacc ggccggtacc gggacctgta ccccgccaac 3540

gagctgatcg ccctgctgga ggagaagggc atcgtgttcc gggacggcag caacatcctg 3600

cccaagctgc tggagaacga cgacagccac gccatcgaca ccatggtggc cctgatccgg 3660

agcgtgctgc agatgcggaa cagcaacgcc gccaccggcg aggactacat caacagcccc 3720

gtgcgggacc tgaacggcgt gtgcttcgac agccggttcc agaaccccga gtggcccatg 3780

gacgccgacg ccaacggcgc ctaccacatc gccctgaagg gccagctgct gctgaaccac 3840

ctgaaggaga gcaaggacct gaagctgcag aacggcatca gcaaccagga ctggctggcc 3900

tacatccagg agctgcggaa caagcggccc gccgccacca agaaggccgg ccaggccaag 3960

aagaagaagg gcagctaccc ctacgacgtg cccgactacg cctaccccta cgacgtgccc 4020

gactacgcct acccctacga cgtgcccgac tacgcctga 4059


<210> 21
<211> 3822
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 21
atgagcaagc tggagaagtt caccaactgc tacagcctga gcaagaccct gcggttcaag 60

gccatccccg tgggcaagac ccaggagaac atcgacaaca agcggctgct ggtggaggac 120

gagaagcggg ccgaggacta caagggcgtg aagaagctgc tggaccggta ctacctgagc 180

ttcatcaacg acgtgctgca cagcatcaag ctgaagaacc tgaacaacta catcagcctg 240

ttccggaaga agacccggac cgagaaggag aacaaggagc tggagaacct ggagatcaac 300

ctgcggaagg agatcgccaa ggccttcaag ggcaacgagg gctacaagag cctgttcaag 360

aaggacatca tcgagaccat cctgcccgag ttcctggacg acaaggacga gatcgccctg 420

gtgaacagct tcaacggctt caccaccgcc ttcaccggct tcttcgacaa ccgggagaac 480

atgttcagcg aggaggccaa gagcaccagc atcgccttcc ggtgcatcaa cgagaacctg 540

acccggtaca tcagcaacat ggacatcttc gagaaggtgg acgccatctt cgacaagcac 600

gaggtgcagg agatcaagga gaagatcctg aacagcgact acgacgtgga ggacttcttc 660

gagggcgagt tcttcaactt cgtgctgacc caggagggca tcgacgtgta caacgccatc 720

atcggcggct tcgtgaccga gagcggcgag aagatcaagg gcctgaacga gtacatcaac 780

ctgtacaacc agaagaccaa gcagaagctg cccaagttca agcccctgta caagcaggtg 840

ctgagcgacc gggagagcct gagcttctac ggcgagggct acaccagcga cgaggaggtg 900

ctggaggtgt tccggaacac cctgaacaag aacagcgaga tcttcagcag catcaagaag 960

ctggagaagc tgttcaagaa cttcgacgag tacagcagcg ccggcatctt cgtgaagaac 1020

ggccccgcca tcagcaccat cagcaaggac atcttcggcg agtggaacgt gatccgggac 1080

aagtggaacg ccgagtacga cgacatccac ctgaagaaga aggccgtggt gaccgagaag 1140

tacgaggacg accggcggaa aagcttcaag aagatcggca gcttcagcct ggagcagctg 1200

caggagtacg ccgacgccga cctgagcgtg gtggagaagc tgaaggagat catcatccag 1260

aaggtggacg agatctacaa ggtgtacggc agcagcgaga agctgttcga cgccgacttc 1320

gtgctggaga aaagcctgaa gaagaacgac gccgtggtgg ccatcatgaa ggacctgctg 1380

gacagcgtga aaagcttcga gaactacatc aaggccttct tcggcgaggg caaggagacc 1440

aaccgggacg agagcttcta cggcgacttc gtgctggcct acgacatcct gctgaaggtg 1500

gaccacatct acgacgccat ccggaactac gtgacccaga agccctacag caaggacaag 1560

ttcaagctgt acttccagaa cccccagttc atgggcggct gggacaagga caaggagacc 1620

gactaccggg ccaccatcct gcggtacggc agcaagtact acctggccat catggacaag 1680

aagtacgcca agtgcctgca gaagatcgac aaggacgacg tgaacggcaa ctacgagaag 1740

atcaactaca agctgctgcc cggccccaac aagatgctgc ccaaggtgtt cttcagcaag 1800

aagtggatgg cctactacaa ccccagcgag gacatccaga agatctacaa gaacggcacc 1860

ttcaagaagg gcgacatgtt caacctgaac gactgccaca agctgatcga cttcttcaag 1920

gacagcatca gccggtaccc caagtggagc aacgcctacg acttcaactt cagcgagacc 1980

gagaagtaca aggacatcgc cggcttctac cgggaggtgg aggagcaggg ctacaaggtg 2040

agcttcgaga gcgccagcaa gaaggaggtg gacaagctgg tggaggaggg caagctgtac 2100

atgttccaga tctacaacaa ggacttcagc gacaagagcc acggcacccc caacctgcac 2160

accatgtact tcaagctgct gttcgacgag aacaaccacg gccagatccg gctgagcggc 2220

ggcgccgagc tgttcatgcg gcgggccagc ctgaagaagg aggagctggt ggtgcacccc 2280

gccaacagcc ccatcgccaa caagaacccc gacaacccca agaagaccac caccctgagc 2340

tacgacgtgt acaaggacaa gcggttcagc gaggaccagt acgagctgca catccccatc 2400

gccatcaaca agtgccccaa gaacatcttc aagatcaaca ccgaggtgcg ggtgctgctg 2460

aagcacgacg acaaccccta cgtgatcggc atcgaccggg gcgagcggaa cctgctgtac 2520

atcgtggtgg tggacggcaa gggcaacatc gtggagcagt acagcctgaa cgagatcatc 2580

aacaacttca acggcatccg gatcaagacc gactaccaca gcctgctgga caagaaggag 2640

aaggagcggt tcgaggcccg gcagaactgg accagcatcg agaacatcaa ggagctgaag 2700

gccggctaca tcagccaggt ggtgcacaag atctgcgagc tggtggagaa gtacgacgcc 2760

gtgatcgccc tggaggacct gaacagcggc ttcaagaaca gccgggtgaa ggtggagaag 2820

caggtgtacc agaagttcga gaagatgctg atcgacaagc tgaactacat ggtggacaag 2880

aaaagcaacc cctgcgccac cggcggcgcc ctgaagggct accagatcac caacaagttc 2940

gagagcttca agagcatgag cacccagaac ggcttcatct tctacatccc cgcctggctg 3000

accagcaaga tcgaccccag caccggcttc gtgaacctgc tgaagaccaa gtacaccagc 3060

atcgccgaca gcaagaagtt catcagcagc ttcgaccgga tcatgtacgt gcccgaggag 3120

gacctgttcg agttcgccct ggactacaag aacttcagcc ggaccgacgc cgactacatc 3180

aagaagtgga agctgtacag ctacggcaac cggatccgga tcttccggaa ccccaagaag 3240

aacaacgtgt tcgactggga ggaggtgtgc ctgaccagcg cctacaagga gctgttcaac 3300

aagtacggca tcaactacca gcagggcgac atccgggccc tgctgtgcga gcagagcgac 3360

aaggccttct acagcagctt catggccctg atgagcctga tgctgcagat gcggaacagc 3420

atcaccggcc ggaccgacgt ggacttcctg atcagccccg tgaagaacag cgacggcatc 3480

ttctacgaca gccggaacta cgaggcccag gagaacgcca tcctgcccaa gaacgccgac 3540

gccaacggcg cctacaacat cgcccggaag gtgctgtggg ccatcggcca gttcaagaag 3600

gccgaggacg agaagctgga caaggtgaag atcgccatca gcaacaagga gtggctggag 3660

tacgcccaga ccagcgtgaa gcacaagcgg cccgccgcca ccaagaaggc cggccaggcc 3720

aagaagaaga agggcagcta cccctacgac gtgcccgact acgcctaccc ctacgacgtg 3780

cccgactacg cctaccccta cgacgtgccc gactacgcct ga 3822


<210> 22
<211> 3756
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 22
atgtactacg agagcctgac caagcagtac cccgtgagca agaccatccg gaacgagctg 60

atccccatcg gcaagaccct ggacaacatc cggcagaaca acatcctgga gagcgacgtg 120

aagcggaagc agaactacga gcacgtgaag ggcatcctgg acgagtacca caagcagctg 180

atcaacgagg ccctggacaa ctgcaccctg cccagcctga agatcgccgc cgagatctac 240

ctgaagaacc agaaggaggt gagcgaccgg gaggacttca acaagaccca ggacctgctg 300

cggaaggagg tggtggagaa gctgaaggcc cacgagaact tcaccaagat cggcaagaag 360

gacatcctgg acctgctgga gaagctgccc agcatcagcg aggacgacta caacgccctg 420

gagagcttcc ggaacttcta cacctacttc accagctaca acaaggtgcg ggagaacctg 480

tacagcgaca aggagaaaag cagcaccgtg gcctaccggc tgatcaacga gaacttcccc 540

aagttcctgg acaacgtgaa aagctaccgg ttcgtgaaga ccgccggcat cctggccgac 600

ggcctgggcg aggaggagca ggacagcctg ttcatcgtgg agaccttcaa caagaccctg 660

acccaggacg gcatcgacac ctacaacagc caggtgggca agatcaacag cagcatcaac 720

ctgtacaacc agaagaacca gaaggccaac ggcttccgga agatccccaa gatgaagatg 780

ctgtacaagc agatcctgag cgaccgggag gagagcttca tcgacgagtt ccagagcgac 840

gaggtgctga tcgacaacgt ggagagctac ggcagcgtgc tgatcgagag cctgaaaagc 900

agcaaggtga gcgccttctt cgacgccctg cgggagagca agggcaagaa cgtgtacgtg 960

aagaacgacc tggccaagac cgccatgagc aacatcgtgt tcgagaactg gcggaccttc 1020

gacgacctgc tgaaccagga gtacgacctg gccaacgaga acaagaagaa ggacgacaag 1080

tacttcgaga agcggcagaa ggagctgaag aagaacaaga gctacagcct ggagcacctg 1140

tgcaacctga gcgaggacag ctgcaacctg atcgagaact acatccacca gatcagcgac 1200

gacatcgaga acatcatcat caacaacgag accttcctgc ggatcgtgat caacgagcac 1260

gaccggagcc ggaagctggc caagaaccgg aaggccgtga aggccatcaa ggacttcctg 1320

gacagcatca aggtgctgga gcgggagctg aagctgatca acagcagcgg ccaggagctg 1380

gagaaggacc tgatcgtgta cagcgcccac gaggagctgc tggtggagct gaagcaggtg 1440

gacagcctgt acaacatgac ccggaactac ctgaccaaga agcccttcag caccgagaag 1500

gtgaagctga acttcaaccg gagcaccctg ctgaacggct gggaccggaa caaggagacc 1560

gacaacctgg gcgtgctgct gctgaaggac ggcaagtact acctgggcat catgaacacc 1620

agcgccaaca aggccttcgt gaaccccccc gtggccaaga ccgagaaggt gttcaagaag 1680

gtggactaca agctgctgcc cgtgcccaac cagatgctgc ccaaggtgtt cttcgccaag 1740

agcaacatcg acttctacaa ccccagcagc gagatctaca gcaactacaa gaagggcacc 1800

cacaagaagg gcaacatgtt cagcctggag gactgccaca acctgatcga cttcttcaag 1860

gagagcatca gcaagcacga ggactggagc aagttcggct tcaagttcag cgacaccgcc 1920

agctacaacg acatcagcga gttctaccgg gaggtggaga agcagggcta caagctgacc 1980

tacaccgaca tcgacgagac ctacatcaac gacctgatcg agcggaacga gctgtacctg 2040

ttccagatct acaacaagga cttcagcatg tacagcaagg gcaagctgaa cctgcacacc 2100

ctgtacttca tgatgctgtt cgaccagcgg aacatcgacg acgtggtgta caagctgaac 2160

ggcgaggccg aggtgttcta ccggcccgcc agcatcagcg aggacgagct gatcatccac 2220

aaggccggcg aggagatcaa gaacaagaac cccaaccggg cccggaccaa ggagaccagc 2280

accttcagct acgacatcgt gaaggacaag cggtacagca aggacaagtt caccctgcac 2340

atccccatca ccatgaactt cggcgtggac gaggtgaagc ggttcaacga cgccgtgaac 2400

agcgccatcc ggatcgacga gaacgtgaac gtgatcggca tcgaccgggg cgagcggaac 2460

ctgctgtacg tggtggtgat cgacagcaag ggcaacatcc tggagcagat cagcctgaac 2520

agcatcatca acaaggagta cgacatcgag accgactacc acgccctgct ggacgagcgg 2580

gagggcggcc gggacaaggc ccggaaggac tggaacaccg tggagaacat ccgggacctg 2640

aaggccggct acctgagcca ggtggtgaac gtggtggcca agctggtgct gaagtacaac 2700

gccatcatct gcctggagga cctgaacttc ggcttcaagc ggggccggca gaaggtggag 2760

aagcaggtgt accagaagtt cgagaagatg ctgatcgaca agctgaacta cctggtgatc 2820

gacaagagcc gggagcagac cagccccaag gagctgggcg gcgccctgaa cgccctgcag 2880

ctgaccagca agttcaagag cttcaaggag ctgggcaagc agagcggcgt gatctactac 2940

gtgcccgcct acctgaccag caagatcgac cccaccaccg gcttcgccaa cctgttctac 3000

atgaagtgcg agaacgtgga gaaaagcaag cggttcttcg acggcttcga cttcatccgg 3060

ttcaacgccc tggagaacgt gttcgagttc ggcttcgact accggagctt cacccagcgg 3120

gcctgcggca tcaacagcaa gtggaccgtg tgcaccaacg gcgagcggat catcaagtac 3180

cggaaccccg acaagaacaa catgttcgac gagaaggtgg tggtggtgac cgacgagatg 3240

aagaacctgt tcgagcagta caagatcccc tacgaggacg gccggaacgt gaaggacatg 3300

atcatcagca acgaggaggc cgagttctac cggcggctgt accggctgct gcagcagacc 3360

ctgcagatgc ggaacagcac cagcgacggc acccgggact acatcatcag ccccgtgaag 3420

aacaagcggg aggcctactt caacagcgag ctgagcgacg gcagcgtgcc caaggacgcc 3480

gacgccaacg gcgcctacaa catcgcccgg aagggcctgt gggtgctgga gcagatccgg 3540

cagaaaagcg agggcgagaa gatcaacctg gccatgacca acgccgagtg gctggagtac 3600

gcccagaccc acctgctgaa gcggcccgcc gccaccaaga aggccggcca ggccaagaag 3660

aagaagggca gctaccccta cgacgtgccc gactacgcct acccctacga cgtgcccgac 3720

tacgcctacc cctacgacgt gcccgactac gcctga 3756


<210> 23
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 23
tcaatagccc agtcggtttt gttagataca ttttatcgaa tctgtaaaga tattttataa 60

taagataata tcagcgccta gctgcggaat tccactcaga gaatacctct cctgaatatc 120

agccttagtg gcgttatacg atatttcaca ctctcaaaat cccgagtcag actatacccg 180

cgcatgttta gtaaaggttg attctgagat ctcgagtcca aaaaagatac ccactacttt 240

aaagatttgc attcagttgt tccatcggcc tgggtagtaa agggggtatg ctcgctccga 300

gtcgatggaa ctgtaaatgt tagccctgat acgcggaaca tatcagtaac aatctttacc 360

taatatggag tgggattaag cttcatagag gatatgaaac gctcgtagta tggcttccta 420

cataagtaga attattagca actaagatat taccactgcc caataaaaga gattccactt 480

agattcatag gtagtcccaa caatcatgtc tgaatactaa attgatcaat tggactatgt 540

caaaattatt ttgaagaagt aatcatcaac ttaggcgctt tttagtgtta agagcgcgtt 600

attgccaacc gggctaaacc tgtgtaactc ttcaatattg tatataatta taggcagaat 660

aagctatgag tgcattatga gataaacata gatttttgtc cactcgaaat atttgaattt 720

cttgatcctg ggctagttca gccataagtt ttcactaata gttaggacta ccaattacac 780

tacattcagt tgctgaaatt cacatcactg ccgcaatatt tatgaagcta ttattgcatt 840

aagacttagg agataaatac gaagttgata tatttttcag aatcagcgaa aagaccccct 900

attgacatta cgaattcgag tttaacgagc acataaatca aacactacga ggttaccaag 960

attgtatctt acattaatgc tatccagcca gccgtcatgt ttaactggat agtcataatt 1020

aatatccaat gatcgtttca cgtagctgca tatcgaggaa gttgtataat tgaaaaccca 1080

cacattagaa tgcatggtgc atcgctaggg tttatcttat cttgctcgtg ccaagagtgt 1140

agaaagccac atattgatac ggaagctgcc taggaggttg gtatatgttg attgtgctca 1200

ccatctccct tcctaatctc ctagtgttaa gtccaatcag tgggctggct ctggttaaaa 1260

gtaatataca cgctagatct ctctactata atacaggcta agcctacgcg ctttcaatgc 1320

actgattacc aacttagcta cggccagccc catttaatga attatctcag atgaattcag 1380

acattattct ctacaaggac actttagagt gtcctgcgga ggcataatta ttatctaaga 1440

tggggtaagt ccgatggaag acacagatac atcggactat tcctattagc cgagagtcaa 1500

ccgttagaac tcggaaaaag acatcgaagc cggtaaccta cgcactataa atttccgcag 1560

agacatatgt aaagttttat tagaactggt atcttgatta cgattcttaa ctctcatacg 1620

ccggtccgga atttgtgact cgagaaaatg taatgacatg ctccaattga tttcaaaatt 1680

agatttaagg tcagcgaact atgtttattc aaccgtttac aacgctatta tgcgcgatgg 1740

atggggcctt gtatctagaa accgaataat aacatacctg ttaaatggca aacttagatt 1800

attgcgatta attctcactt cagagggtta tcgtgccgaa ttcctgactt tggaataata 1860

aagttgatat tgaggtgcaa tatcaactac actggtttaa cctttaaaca catggagtca 1920

agttttcgct atgccagccg gttatgcagc taggattaat attagagctc ttttctaatt 1980

cgtcctaata atctcttcac 2000


<210> 24
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 24
aaaacgtact acgtccacta atatagtgct cagggccttt aaagttatga acaggaatac 60

ggcgatgacg atagagatgt acaactcagt gcgaacccca gtgtatgtac aaaaagttac 120

taattcactt tactgttttg aggatgtacc tgccaaaaag attcagatta tcaaagtcag 180

atctttatat gacggaacgc gcaaaggatc ctattaggat gcgcctcaaa aagccatcta 240

aaaagttcat gtattgagct tattagtaaa ggtatcaaca aaaatgattc caccttatat 300

aaataagctt gatcccatta attgaataat aaagaccgag taatcacttt tatgcatgta 360

acaaaaatcc cgtttgcggc tatgctacaa cggtcatccc atagaatatt atcatcgtac 420

aagcccaaga cccgatgctc aacattagag ccaaataacg tgcacactcc taatatgaga 480

tgactgccgc ttttaacacc agatctgtta gttaggccac gcacttccaa gtttatctag 540

agtgcatgtc tttatatatg ttggtcccct gtaatgactt ataatatttc cttcgactgt 600

gttgaacatc tgtaacaata aagactaaag ctctgggtat ataaggttgc agtggtacct 660

tattaggtcc attatcgcag aatactgcgg atggacaatc ttgccaattt aattgactat 720

ctattagttt gcacaatata acgattcgtc ttggacaaat ttggcgagtg agccccttac 780

tcgctcaaaa tgttacaatt gccgagctcg gagttgaatg attagttaca tattatagaa 840

cacaatgcag atgtagttag acaagatgtg ttgatgaatg tcaagtctga ctggagtaaa 900

ggaacaagag cacccaccta cgtatattgc gcattttaaa tgtagcctcg actctaacac 960

gtgcgacgtg agtcataatt gtgcatgtta ttagatctat ggaatgttgt ttttttaatt 1020

atcaaacgta cgtcaaaccg ccaaactccg tgtgccatag agtatactcc tgaagttcga 1080

aattaggcca taaagtcttt cttgctggtt gtgaaatgaa ggggtgtttc ataatttaac 1140

tttgactgct tctgttggga cgacgtaccc gttcgtttgt ttgtcctact atttagtatc 1200

ttaaaacagt ccatttaccg ttaatgttct taacccttaa agatacaaac ttagctctgt 1260

aatcaacttc aagacgtctt tgacagaacg tctaagaccc agatctgtgt tagccaactc 1320

gtattcaatt tcgtaccggt ggacttcggc ccctcacact gccattagtt gatgctgaac 1380

tttgtatttg ctgggtagga tatataacga ttttgcagat gtgtgtgcta agtatattgt 1440

cttagtgacg gtccagcata taaaacacct acacaagaag gttattctta atggttgatt 1500

gaatattatt aaattgttgc ttttactttt tcctcctaca aattgtcatg agctcaaatt 1560

tgttgaccta aggtattaat attgtatcct acacggattg tgaacggtag ggtcgtaaca 1620

atcgtacttt acggcttaaa aattgtaagc accttgccag gtagatgaaa acttaaagga 1680

tagaagtata gtaactcaca tgcttgcggc agcatcgtag ggcagaggtg tgatcttggt 1740

gattgaaatt aaggggtagg atgatcggcc gcatatatcg gctactagga ttagatagat 1800

gcaacgcttt actttaatca agtgacgtcc gtataagtaa gacatctaat ggctgtattt 1860

ttgtatacaa gtataaggaa ccggggagtc tttatagcga cgcgtaatta tatattccaa 1920

atcagttaag tggcgtcggt tacgaaacta aagagagtgt tcaagacgca atgaagaatc 1980

gtgagcgtaa ttgttcgcgc 2000


<210> 25
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 25
aaccctcgtg tccggtaaaa cacgcttcga atacaaaaga ttatataggt acggaaggct 60

gggaatcttt cttcgatgga actgagatta tattccactg taaccttatt atgactatag 120

atttccaaca tacggataga ttaataccga ctgtagattc catacttgaa ctatgaagcc 180

gtacgagtac ccatactata actaagacta tgacacgtgt gaattcgtgt ttatcatagt 240

gcaaactctt gctattccac atgggagttt agaactcagc tgttcctata caattagcac 300

tacaaaccca ctaatatgga tagcatgata ccatctgagg aggatttggt gttaccatgt 360

tgtaatctaa gaagtttcac aaaatcaacg ttagataaac ggcaatatac gcgcactaat 420

aatgaacccc aagatatcag ttgaaaaatt ttcgatctcc tctttaaatt aacaaatatt 480

gcagagtaag taccgaaatt gtgacacaag tgccgtttgc ccgtcttttt cacagcctat 540

aaagttcaga tctatatggg ctcccactta accttcagat agataacaag ttactggaag 600

tgattctatc ataatacaat caactataac acatccaatg atatatctcg agaaagtcgt 660

agtctagagc tccttctatt atccggtctt acctaaatag ttatatttag ttgcccattt 720

aaaattggat aggaggaggg gtgctcatga tttaaaaacc aactgtgcat gcggttcttt 780

gatgtggatc caccttgcaa agcgctaaag ataaaagtag tcactacagg aattcaactt 840

ccgtcgttgt cagctggcgc gggaacccat cttgtgtaaa aaactgtata accagacacg 900

tggactcgac cgagaaacag tcagaacctg tcacaagaaa taatcttgat taaaggcttt 960

cacggcaaac ggacctcttc cctgctgaag tgtacgattg aatatccaca tcgaaggtca 1020

attaccctca tcttttacat ggtcataaga caataatctc ctatttggat taaaatccgc 1080

gcacgaaaga taagagtgga atcgattgca ttatcgagtt tttaagcccc atacccgaca 1140

gatgtgtaaa aagtgtagtg gtaatggcgt caccaagacc tatgcttctc ataataatag 1200

gacgtatgcc ctagctactg ctaacggtcg ctcttacaat actagctaaa agaaacaaat 1260

ttgaaaagtt atgtaggaag tcattggcgg tgaaaaagtg agaaaaaagg tccccggaga 1320

ctgtgctttc atgttatcaa agtacatgcc gagtgaagag tttgttttga tcaactttta 1380

ttatctggag tcattatacg atattgccat ggttccttgg ctgtccaacc aggggtcttt 1440

tacaccagat aatcttctac tacactacac ctcaggtacg attctttcgt tatcaatcga 1500

ctacaagatt atagtgtctc taaggcgtga tgtaggtttt ccctcaatga caaagacttt 1560

acagcaatcc ggttcaatac gagaattaag tgtgcgagta acagcaaagt aaaatctaac 1620

agaaaggaga ctcagaaaac aacctattga ggactgtaat atcaactcag cattattgtt 1680

tactttaaaa tctaataatc gtttcgagga tatgagcacg gtatcctaac atcaagacaa 1740

ataccacatc atctaaatac aactggttgc aatgagtcga atcgcgaaca aataaagcaa 1800

ctataagcac gataaaccac tgttatggga atgataaaca gtcttatgac gtggtctatc 1860

tgtcgtaggt ggtaaagcct tctgaagatc actatccagt tctggcctca agaaccattt 1920

agacagcctt ttctaaacat gatcgttgct ataaggaccg gggacaccta gacaaactca 1980

cggaagggat aacttacatc 2000


<210> 26
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 26
actgcttata taggaggtac aaacagatac aatccttagt taactagaga gaatgctttt 60

tttcgaccga cacgcttata acttcactgg gcatggtcac catatttagg taaaacaaac 120

tgctgcgcta tatgtcgtac acatcctgag tgtaccaata tgtaggtgga aggcaagttc 180

aatgagacgt cagttaccaa gcaaatttac attctagcag ttataaatgt attatgacgc 240

agttcttgtg gtgagcgatc atttacatta aaactttatt caagagcgta tattagcata 300

tattttccgg agagtgcact acgggccgaa atttaggctg gaactccgca aattggttac 360

gaccctgtat acatagttct tattattaag taaaatgtgt gaataaaacc tacacgacgc 420

gtcatatacg taaaagttta tctcttgtag taatcaacta aattaactta ctactatctg 480

gtcgtccgta tgaccctgtg agcagattat tttcgactcg acatctatga attctacggc 540

acgaaaagtt ggtaacttgt actgggttaa acaatgtgta ttcgggagtc tgcggaagaa 600

cgtttttaat gtaacttcct ttgcaaacca aaatttggtc tattcaaact gacactagcg 660

taatctatac cgcatgagat cctgacatga tcctatatct atgcgcatag gtactcgcac 720

caataagtgg gtcgtagaat ttcacgtaac tcaatgttgt ctcctttcat tttttgttaa 780

ttcgagaaaa ctacaaaaat agttagtaaa atgctcaagg agtcaggtgc tacctgtgga 840

atacatctat gtccaatgga acttgctccc tcggatgtgc gatttcgttg ttcagttggg 900

cctttaagga atacagcaac tccaactctt tgattttagg taagtatttg attcgcggaa 960

agtacagtgt ataatctgtt atttgccaag acgtcatcga aatcgagtgt atcgagatca 1020

gaccatcgcg ctatcgcaag atatgaagag catagacaga tcacgatgcc aatcagtgtc 1080

gatggtgcga agacgcagcc cctgtgatca aatcgtccgt ttctcgattt actagcggaa 1140

aacaaaaacg aagcggtgaa taccctgcga gctaatgtct ttacccggtt atacgagctg 1200

ataactcgga aaatgctaat atcgaggctg cgcacttaaa aaaatacttt aataatatta 1260

ataagcatag ctgtatcata acttaaaatt ctactgtatg atttagaatc taacagtgtt 1320

aacgatctac agaccgcact aagatgaaga cggactaatc tcctccctaa ttttccttgt 1380

tgattagcaa agggagatcc ttttgttatt tgaggtttac gagaaagatg taagagtcga 1440

aataattacg taaacctcat agtcgtcacc tagagcaact ataacatgaa ccactcgcct 1500

tggttaaata taaaataact tcttctctgt aacattgttg cacacaagcg agcgacaaaa 1560

tttcacaaca tttgttgcgt agataatatt actgcatcat ttttgcgtca gagtgaatgt 1620

cacttatata actaggaaaa attagtagga tagctcttgc ggttgagagt aatgtcgact 1680

gaatcgaccg ccatagatgg tagagggagt gattcaaata gattaatgta tgcgctccat 1740

ctataaggac ggacaaggat caatgttccc ttatacttag ctaacaggac cctctccgaa 1800

ggtctgataa tgcactcata taagcatcga tgcgtcctga gtagaaaaat ctttacaaac 1860

ttttaataga taagttatct tggaggtgct atctattcaa atctctgaac agatctgcgg 1920

catgataatg tctttgtacc ggtgtgaata atgtgagtca gacgtctgtg cgaagtggga 1980

accgaaatct tttaatcatt 2000


<210> 27
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 27
gattcggtcg cgttccataa tcgaaccctt aagcccatct tccagctgtt aacgttatgt 60

accatcttac ctcaatgtca gcgatctatg aggttcatgt ttttggtgga ttaaaaaact 120

tctttatagt ggtttagaca gaacgtttag cgctgcgctc gaagtgtctt atctaacgga 180

ggactaaaat tacctggtca ctccttagac ttttcgtagt acttaattgc cggacatccg 240

ttgggctaca ccagcaagaa cacaaagtgg tatgtgtgaa gctagactga cctcatgatt 300

cgtactacat tataagaatc aagcttcccg gatttgtgtt ctgagatatt accacgtaca 360

tttttaaggg ggttcttgac atcgtaacgc taaggctgat taaagaggag ggtgctatgc 420

agagtttatt ggtgtttcat caatgtatca cacaaaatta gctactatag gaagtagctt 480

tggtgcgagc agggggcggt atggttaaga aagctatggt aagaaaggcc caggtgatac 540

tacgtgtaag gttgtgaaga gccacaagag ccaagttttg atattcgact tcctccgaat 600

ctacagctta tcgagggtta aacgttacgc atattacgag attacatgat agcttctcag 660

ttctagcaca tttatgagac cctttgaatg gtgtcaataa ataggaggtc cccatatgac 720

aagtagaata ctaactataa gagatttgta acgctggata ccatttgcag aggattggcc 780

caaagaatga ttgcccaacg cttatattgt cagaccttgc attagaagaa taacgcagaa 840

tacgactgca gtttgatata attttggctc tgggttgcct tagtatcatt actaatagac 900

ttgtggtcta tatccatttg tttaatggaa tagactgggt aaaacacacc tcttccaggc 960

tgtagttctt catgttgtaa ggatccgtca tggcgtgcaa actaggggag gtattttttg 1020

ctaattgcgg taacggctcc agttgggata tcgtcaatat gtgccactcg gccctttctc 1080

tgagacgcta agatttccgt aaggtatagc gataagagtc tctaatgcca gaggaattgt 1140

taccgcgagc aagattcatg tctatatata aaatatcatc cactttgaat tactggttgg 1200

aatcatcgtt cgcgttataa caaaaaacct tttaattatg ttaccacaga tctcgaagtc 1260

ccttttgagg cagaagttta aatataagct ctaattgtcg catctaacgg gtatatcgtc 1320

tcaacggtag gtcaaaaaca tttgttaact tcagactgta cattcgcatt taactcgcca 1380

tgtaaaccgc aatacatctc gtgcctatct ctcctagtaa cgtattatcg ctgggtgaaa 1440

gcgcaactaa gtaataagtg aatgtcattc acaataccta actctatccg acgcgtaaga 1500

gcgacccagc agtttaatga catgataaat caaattctat gcaaggcagt acttgctttg 1560

tggacgatag cgattttcca ccgtattgcg aagtcagtta tgctgaaatt ttattccatt 1620

cgcataacac caaggcttac tcttaggaaa aaatgtaata ccgattttgg tatgaagtat 1680

gttacagtac agaatgaaat gcccggcggc gtggtcaaac tgtttcctga ggttcatata 1740

gggaaaggtc atccctcaga attggccccg taatcgcaaa gcctacggga gctttcttaa 1800

gtccaaccgg taaagccaaa tctcaattca tatgaggaaa tgtttgaccg ataaagaata 1860

gattgtcgaa ctaacagtca cagagaaaat acgagtagca tcacctaaac aaagcaggta 1920

ataaaataga ctaatggaga tcatcgtatc ggcttatgac ctgcgtccat ttaaaggcaa 1980

tgaatacatt accgactaga 2000


<210> 28
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 28
agttatgagg ttcacttctc atataacact atcaacaatg atcatctctt gcgaaacaag 60

cgccctacac agcttcaatg gaaccaagag ccataatgag gtaagggacg gctagttact 120

aataaaggaa tcgattttac aaacactaaa tgaaaaactt gcgctggttg caatgctata 180

aaaaaatgaa atgcaaacca gtgaagatcc cgatcaaccg ttcgctgatt tttattgatg 240

ctgtacgttg tgttagttta atgatatata ggccatctcc aggttactta ggacgccaaa 300

attactattt tgaagctcaa ccgtggtata atagctacaa taattaattg atgcctgcag 360

gtcgtatctc gaacgattgt acgcattacc tatgatatga acagaatctg tatcccatac 420

ttaaaatctt gaccttgtaa agatttcgca tacgcattaa gaaatttcgt tctacccgca 480

cggattgtcc aagtatatct ggccattcac agaagttact aatcttcatc tctaagttta 540

aggccgacaa agggtccaaa acctgcgtag gttacaacgc agcttacact cagtgactaa 600

ccaacgctca gtagggtaac tggacttgtt ctcgctattc agctggtact gtaatgatca 660

acttagaacg gccctatggc taagcaagga gtacgcaatg ttttagaata cgtgtttgct 720

cacacaggta gtagtttaat ataccccctg acaagatatg ttaacataga tgaagtttgg 780

tattacttat agccagacta ttcttcaaca tatacactgg gttttaggag tgtgcaattt 840

ataaggacag ttatattcct acaatcgttg tatgatcctt ttgggtttgg tagaactacg 900

tttgggccgc gcctttggtc aaccacggac tttctgtcta gatgccaatt cctacaagct 960

tagtcctatc aatttagtag agaacaaatt ttgtcatcac tgaattgtcg tcttactatc 1020

ggatcattct ccgctaatta taggattatt agtaacgcgt atataggagc gattaatgac 1080

tcatcaatga atagcatcac taggtgtatt atatgaacct ctctctattc tattaactgc 1140

ccactgtggg taatttgagt tatacctgac cggtccctcg gatccttaat cctttgatgt 1200

cgataggtaa ctgaagtgta agatcctgat atatgaagcc ggtaaggaga cggagatttt 1260

atattagtgt tcttggatac tgtgctagaa ggttctactc taactcaaac aggttataaa 1320

gtaggaagga aaaagttgat agtggtaaac taattatgag ttggcttgct tattccaagt 1380

tagcgaggtt ttcatgacgt aagtctgata aggtttgctg gaagctgaaa agttttacaa 1440

aaacgttgtt ttagaatggt ttgtccccga aaatcgaacc tggcatagcc ctcaggagac 1500

gaacaagccc aggcaaaccg ggggtttctc gcttattgct ataatcacct ctagtgttgt 1560

agaagcaatt acggtgggga ggcgtcaatg tggcctgagt tccgttgagg acttttcacg 1620

tgtaggaccc attaatagag gagatatatg tctttcagct gcggaattca taatagtgga 1680

aagaagaaaa gggattacta gattaatatt actcatccca gacttaagtt gaaagctaca 1740

tcttcacacc caggaaaccg gaccgccttt gttcaggtct aagtagtctg gaacagaacc 1800

gtatcaactg ccccaattca taggtgttag cgtgacagcg atcgcggatt tttagtccag 1860

actggctggg ccatccgctt caataagtta gaggactaca tacaacgatg gacccaattg 1920

gcaatagtcg tggtaaactt cgaaggggcg gtgtaagatt caagctgtag tcgtgatgaa 1980

ggagatcatc gtataaacag 2000


<210> 29
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 29
atacatctag actactaaga gggattatcc cagcgcagtc ccacccaaac atcaatctgt 60

ccctttgttc taatatatct ctggtcgcga atgagtaaac ggggctaaag gtccattatt 120

tttatgtagg agcatgttgc ttattatggc atagcagtcg ccatccccct gtcactcgat 180

ctagatacat ctcacattga ttggaaactt ctacaaaacg ttagtactta agatgagtga 240

tttagtgcat ttctcgtttt cacaaacttt gctaaacaaa cgtattgagt ggcgcgtttt 300

ttgatttgtc gcataaccgt ttactccctg ttcgaaggaa atcgatctcc ttataaataa 360

tgagtacatt atacagctag cataatctgc gtgtggcaaa agtgaacgtt taatctacaa 420

ttgatggaaa aatagcccgt tagtcctttt aaagacgtct tggaaaaata ttgagacaac 480

cttcgtccaa aatatgtcaa agcttcgtca catcttttca cctattacta actccgtagt 540

tcaactgact ttagagggca agttttgaga caatatctta gggctgacta ataagacggt 600

tatatttcaa gaaggaaaga tcttaagagt caaaaaaacg tcagggctat cgttacgata 660

ttggtatgaa cagtaatgat atattttgca gatcttaata taacgacatt cgaacacaat 720

agcgtcagac aaaggttacc actcctctat aattactgca gcttcaattg atgagcgtca 780

tttaattttg gccggacatt tacatcgtga gctggcagca cgctcagctt tattgttctt 840

gccagaacat tacgaatagc cgttcaatgc caattagtat gataaaagta gtgagtgtaa 900

aacatggcct gggtttaaag aatgagtaac tattattttg taggaataac tgattccctt 960

gagttctatc ttaagttgta cagaatcaca ctcctacagc gaataagcaa cgacatagaa 1020

tccgttattt cgtatgtctc ggcgggacat gtataagtag catacgttat atcggttgtc 1080

gcacgaaccg ccttcattcc aaaggcgctt acaaatctgc agtaaaaagc ttagcattta 1140

ctatagagta tcggcgttga ccgttaagcc cgtcccgtcc attcaatcac tcaattgatc 1200

atcttttggc aatagtcgtc atatgagaaa atagctctgt cgttgttatt attggctaga 1260

gtataagctg ttaaactaca gaatgacgtt ttgtggaaag tggacgtaag atccttgttc 1320

gcgaagactc gcacggtggg gaacaattcc tgggaatatt tgatctacgt acggttattc 1380

tgcatgtgat tacaatattt ccaacgcagt ccttttgaca ttatatgaaa ccagacccga 1440

tgcatatgtt ttctgactgg tggtttgagt cagagtcaac aaaagtatca gtctttcgtt 1500

actaaatctt cctaagtaaa tggtgggcga ccattccttg taacctgttc tgttataggt 1560

actattccag cctggaaatc gtggaacaca tcgatctagt tgtctatcta taagagaaca 1620

ctcggttcca aatatgtaat ccgcacgtaa gagaggagtc tcgtacatga tatataacgt 1680

tgggtacatt tcttagacat tccggtgata cataatgtac aagtcacatg attacaccag 1740

ctggtagata gaatacctga gactgggtcc tagatgatta taacaagtgt tacatggacg 1800

ctctcgtttt gttgttggct taacaccagg gcttgctcca tgttctcatg tcgttattac 1860

tgaattatct tccattatga tcctggacgg atgaacgaag cagaagataa caaagatgac 1920

tgaatgccgg aaaaggaatt aggccctgat atatcgcgct tctttatgca tgtttacgct 1980

gtaccaataa acgcaagagg 2000


<210> 30
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 30
gtacccgtat atcgtcactt catttgaagc tattattaat gtaaaatcct tccgtcacac 60

actcttttca aaaagggaag tctaaattaa cattcagatg aaaagcgctg acccacatgg 120

gaatatcctt tctacgctat cagccgaaaa gctccagcga ttagctaaat atctaagcct 180

ccagaacaga gttattatat attggttcga atatgctaat attacagtag aaagtaaggt 240

accggcactt ttaacgccga agtcgaccgg tgtagctgtg aaaatatatt tagtacacgt 300

aatattaatt ggaaattgat gagatcgaat cttcaggaga atctgacgag cattactaat 360

cgcgcgtgac gggaacgtta atatacaagc gtctattcta ggttataata aactcctatc 420

tggcaagttg aatggttttt tcaaaacttt aacgttctgg ctatacaaag ctagttgctt 480

taacttatcg catactatga tccttcccat caatcaatct cagtgactat aaacgcaagt 540

gacacaattg tctgcgttcc acatttctaa atctcttatc gctcattccc tctacacaaa 600

gttcgattac caaacgcggg tctacacaca agcttacaag gattacaata tccaattttt 660

tgttatcaaa ggcgaactca acgaatttaa tcgttggtca ttggtatgga atggcgatta 720

taagaaaact cttttagtca tagtagctcg agatgaagtg aaccgggcca gtcggtagtt 780

tcactatcgc gcagtagtca cgatcagttc ttagaatcta tctcctaatc aagtccaaca 840

agcaatccga aatgttgctt tctataaagg gtatgtgtac ctgccaatat taaacttgat 900

tcactcaata gtgattttaa atatgtccat atttatgcaa gaatcattga cattagtaaa 960

ttcagccgtg catttgacac aataaaggta gatttagact gcatatttcc cgcatattta 1020

ttattgtcaa cgcacaaagt tgatggaccg accacgatcg catcgaagac cgtctaaacg 1080

acgatattct tcggagatcc atatttgttt tcaattaccg accattgttc atcaagtgta 1140

gttcagtcgg aaatttttcg tgtgcttttt aaaataccaa atctgaggaa aaagctcgct 1200

agatgttgag tcaatccgta agaatatgcc ccaggagaca tatgtaagtc acagccgtag 1260

actctcggtt accccacgat atgttccata tgcaacgttt gttgagtaat atgcagttca 1320

gtcgggcgta ttatcaacag acagactggc acagtaaatt ttatcatcgg gtttaaaata 1380

tctagatacc tcagtttcaa gggggagttg aactttaaca cgagatcaaa ctacatacac 1440

aagattatca gtgggtacgc tgagacttat ccttagcctg gagagagtcc agctacagga 1500

actgctagta cttagcgtgc gacctcaaat cgagagaact aattaccctg atcgacagat 1560

cgggcaagtt aagcaaacgc ggctcgcgtg tagaaccata acaattggag atgctcctgc 1620

ttaagagatt atagaaccgc aacccatcaa tcgtcagtta cccgagggct cacgcacgcg 1680

gtgatggaag ttagttcctt tgtacgcacg agctgcaata cgtggtgatt ataatcggcg 1740

cacactaaag gggtggatac aatagtagaa gcatatacgt cgcataggcg tacgcgggcg 1800

aaaattttaa tcgttaacgt ggcactaaca gcgttttgtc tccccactcg tgggttgcgg 1860

tgcatcgcac atattcccac aacacctctt aatgctttat tatttgtatt aatggcgcga 1920

atctgcctga tattagtatt cgcactagtg ggtaacgaaa tcttagtcgc tggctactgc 1980

agaactaatt gcgttgcgat 2000


<210> 31
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 31
actagctaca gatctgtaat agaaaaatgc agatgcttgt tctgcgtcga ctcgctcatc 60

aacatcctgt ctcacaagtt atgcatcctg tgcattttat tgaagctttg atggggatta 120

gatcgtgtat ggaaatgttt attcgcctgg ataagatctg tcggcttatt cgtggccaat 180

aataggtcaa tttgcggaaa cataaagact cgcataccaa tactcgctta tcctgaggtt 240

aaatttagtg tatgtagacg aacaacagta tttagtagta tgacgttccc ccgtattgcc 300

agaactcctg aatatttgga tatgaggtat gactacgaaa aaaatactac gttgctcata 360

accattggtg cagggatacc gaactcattg ttaagggacg ccacagtcca gtctcttttc 420

gttcagagcg tgtttttcaa agtgcttgta ttagtgtgga cagagtttac tgatctctcc 480

gcacttggac tgattgtgat cccgatcatc tcttttcata attgtaacac gctttcatag 540

tacacttctg tacattgaag agtgcttgca gccggacagt cctatagaat ttggcgtttg 600

ttcggccaat gtgtgcattt taactttagg cgccatctct tgagattact cctttgaaaa 660

attttggcgg aggttaactc tggtctttaa cataggcgtg cttaacacga gctttacggt 720

caggtacagg taacaaaaca ggtctaaatt tatttaagca gcttctgata ctttccaagg 780

gtcacagttg gggagccttc cgaggtatga caatcagttt tcaaaaggtg tagaatatca 840

tatattctat ctaggccaga gcattctaag ctgttaaaag agtgctatgc tcagaagttg 900

actgttctaa tcgaaaatcg gacatagata acccgcatac cacaagtccc gttgtaacgt 960

acccatcgtt tttgattcta tgtctttgct aatgattggc gattgagaca tcctacttct 1020

gtagcttggc tgttatgcga tccaaaatgg tatccagtgg tggatgtccg ccgcaaactg 1080

aaactcccta tcagttcttt gaaattaatt tgcgggctat ccgactcatt ctttaggaat 1140

taacagaaga acacgcgtct gtaccaaggt tcttctttgt tatatcacat aacaatgaat 1200

cacgttctat gatgaatcca ggtatagaag ttgtaggtaa gcacttgtat aagggggcgc 1260

tcctctcaga ttgattcatt atttactaaa aaaggagcgt gttattactt ctaacaactc 1320

ctcgccatta tatattattt aactaccatt cccactagaa atggatatcg tgttctaaga 1380

ccctaattgt gctcattaaa ctaactaccg caccaaccgc cttgaatcac cggaccacac 1440

tagttaagct gccgataccc aatatggtat tttagtgtat accggatatg accttattta 1500

cgaatggatt gagctcaccc catagatcag taccagcgtt attatgaaaa tcttgttatt 1560

ttaacagaga gacatgcttg gtcattacta cgaatttgag tttacgttat acaaggcgat 1620

ccaaacggac aatagcgcga tacgagatta tagtaccaat agcacgaatc agttttagcg 1680

atctcgtccg atctgtcaag ccgaatgact ctgaaacgtt agtatctgaa acgtttcatt 1740

cagcctaaga tatgtatagt atcattatac cgtgtgggta gaacaatcaa atgcagataa 1800

agctatttaa tgcacttcac ataacctctc cgttggaaat ccatgtattc tctaatcaat 1860

tgaattgtac cttagaaagc acagggggac acctgaagac ctcccatctc ttaaggttac 1920

cggcacgtga aacttcaaaa gtcagacaat caaacggcaa cgtgaatgtc ttcggaagtg 1980

gtggtatgca catcgcgtca 2000


<210> 32
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 32
ttaatagaag taataagtgc tattggacta aaatcgcgtc aattagctat agaacagctc 60

tgtgacgaac tatcaatggg gcattcgttc actagtggat accgtacaag ctcgccgtga 120

tcgtgcgtca aggatagtgc cagagcgccg cgctatatgt gtaacgacgc ataagtagat 180

gtttatgtta ttgggcaaag tcattcttat ccataataag cgctgccgat aaagattcat 240

cagagatatt gagattctcc atacttgact aatctctgag taattaaaat atatttctaa 300

tcggataagt tagggatcac cgaacccaat gaacttagtt taatgtgttc tcgcgaatat 360

ccccatgata taaagatccg aatacctcag ctccgtgcgt gctcgtgcag tcgtgcgttt 420

tctatgaatc aaccatcagt aacgagtagc ggtaactact tctcgagttt aaccaaagcc 480

tatgtatact agcgtgcaat cacgtgcgga aggtccgacc tacagcagca ttttcgttcg 540

aaaaacgaaa actaatgtgc actatgttga atgggcattc aggccttaac ttctaacgtt 600

aaactagatt tgcgattatt aggtatgaga tcgaccaggt cgccacagat aattaaagat 660

agccctagca aagtgataag gtccggatgt tagaacttgc aagagtgtgt aagattattt 720

actctcggtg cgtcgacagg cgaaacccat aacttttatc ggtcaagatt acgaccttca 780

gctagtatct tgagatttga aagggcctaa aagcaattta gtgtacttgt gtaacataac 840

cttaattatt gatggttcta tcgactccca gcggtaataa tcttgtaata ttgtcggatt 900

tagttgaagg gcaggttgac ataccgaaca atagctagta tcaatgtata actagcaggc 960

atctaatttc gtaaacactc ctgacacttg tcgtgtctaa gcatgttagg acaaaagacc 1020

agttttttta aacctgactg taccggcaac gccacagatt ttatgtctcg catacgtacg 1080

aactgaattt gagggggctc aggtttggac ttacaccgca cgtgactata ctgagatcga 1140

ggctccatta acggcaacat aagactagca ctgtatgatc tgaagccagg ctctggtgaa 1200

attgcgggta gttaacgaca tttatcgacg aacccttgat aaaaagtgat tatgttgtat 1260

ctgcgtgata tattcttttc gtgttcagtc tctagaactt cgtgcgtaat aaagattata 1320

gaggaacggt taacctcatt acaagacgga gaccgttcat agacgccgat ggattacagg 1380

gtctactata gctacctaga acactggtga acatagggat aacatacaat taacaatatt 1440

ccgagccaaa ttatgtcttg agtcttggtt gttatctata tcgttattat gttagaaact 1500

aataaatgcg ataagaacta gattttacag tagatccaaa taccggaatc tatcgggacg 1560

attgattaag acttactcaa acctaacttt agcccgattt tgcaattaga gatacgtcga 1620

tttcgagaca agagtagcgt ccccatggca aatatccacg gacagataat gacacgtgag 1680

ggatggcaag agtagttgct caggatgtag gcgttgatgg tctggcgcta atgtcgtggc 1740

tacctgttga gtctcgcgta atgactagta gtgttcgaac gtatgaccaa gttccttcct 1800

agtgttacca ctttgacaca tacccagggg tttgccgcat gtcgctacta tagtataggt 1860

gctgctatga agcttctgaa tcagcggcta acaagtacct aagaaaattg gacatctttt 1920

ggatgacagt gcacaggagc ctatactgaa ttatcggtga tcgatgcttc atgtaatcaa 1980

aaccagcgcg tacacacttt 2000


<210> 33
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 33
tactcttaat tcattacata ttgtgcggtc gaattcaggg agccgataat gcggttacaa 60

taattcctat acttaaatat acaaagattt aaaatttcaa aaaatggtta ccagcatcgt 120

tagtgcgtat acatcaagag gcacgtgccc cggagacagc aagtaagctc tttaaacatg 180

ctttgacata cgatttttaa taaaacatga gcatttgaat aaaaacgact tcctcatact 240

gtaaacatca cgcatgcaca ttagacaata atccagtaac gaaacggctt cagtcgtaat 300

cgcccatata gttggctaca gaatgttgga tagagaactt aagtacgcta aggcggcgta 360

ttttcttaat atttaggggt attgccgcag tcattacaga taaccgccta tgcggccatg 420

ccaggattat agataacttt ttaacattag ccgcagaggt gggactagca cgtaatatca 480

gcacataacg tgtcagtcag catattacgg aataatccta tcgttatcag atctcccctg 540

tcatatcaca acatgtttcg atgttccaaa accgggaaca ttttggatcg gttaaatgat 600

tgtacatcat ttgttgcaga ccttaggaac atccatcatc cgccgccctt catctctcaa 660

agttatcgct tgtaaatgta tcacaactag tatggtgtaa aatatagtac ccgatagact 720

cgatttaggc tgtgaggtta gtaactctaa cttgtgcttt cgacacagat cctcgtttca 780

tgcaaattta attttgctgg ctagatatat caatcgttcg attattcaga gttttggtga 840

ggagccccct cagatgggag cattttcact actttaaaga ataacgtatt tttcgccctg 900

tcccttagtg acttaaaaag aatgggggct agtgcttaga gctggtaggg ctttttggtt 960

ctatctgtta agcgaataag ctgtcaccta agcaaattaa tgctttcatt gtaccccgga 1020

actttaaatc tatgaacaat cgcaacaaat tgtccaaagg caacaatacg acacagttag 1080

aggccatcgg cgcaggtaca ctctatccac gcctatcaga atgtcacctg gttaatggtc 1140

aatttaggtg gctggaggca catgtgaagc aatatggtct agggaaagat atcggtttac 1200

ttagatttta tagttccgga tccaacttaa ataatatagg tattaaagag cagtatcaag 1260

agggtttctt cccaaggaat cttgcgattt tcatacacag ctttaacaaa tttcactaga 1320

cgcaccttca ttttgtcgtc tcgttgtata tgagtccggg gtaagaattt tttaccgtat 1380

ttaacatgat caacgggtac taaagcaatg tcatttctaa acacagtagg taaaggacac 1440

gtcatcttat tttaaagaat gtcagaaatc agggagacta gatcgatatt acgtgttttt 1500

tgagtcaaag acggccgtaa aataatcaag cagtctttct acctgtactt gtcgctacct 1560

agaatcttta atttatccat gtcaaggagg atgcccatct gaaacaatac ctgttgctag 1620

atcgtctaac aacggcatct tgtcgtccat gcggggttgt tcttgtacgt atcagcgtcg 1680

gttatatgta aaaataatgt tttactacta tgccatctgt cccgtattct taagcatgac 1740

taatattaaa agccgcctat atatcgagaa cgactaccat tggaatttaa aattgcttcc 1800

aagctatgat gatgtgacct ctcacattgt ggtagtataa actatggtta gccacgactc 1860

gttcggacaa gtagtaatat ctgttggtaa tagtcgggtt accgcgaaat atttgaaatt 1920

gatattaaga agcaatgatt tgtacataag tatacctgta atgaattcct gcgttagcag 1980

cttagtatcc attattagag 2000


<210> 34
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 34
ggccctatag attttaacct aagctctagc ttgtgtgtgc tcagagtact gctcataaat 60

atgctcgata aaggaggtaa ggcatatcgt aatttggaag ataataccac acttattggt 120

aacacgttgg aatcacatat taattatgag ccagccttgg cattcgagca gggatatgtg 180

ggagtatcag ttgagtttgg ctccttgcta ctgccctctg atgctctgct tgctctagct 240

taggtcatta atgataaaaa agagccagag tgtgggctaa acaggcaacg gtaccgttgt 300

agagcgaggt attgctatcg ggagacgtcg ggtcaaagtg ggattcatgc agtaagtttg 360

ccaaagggtc tgcttaaaga gaccgattcc ggaaggctat atgccatagc aaggtatgca 420

ctgcattgag ctgaaaactc ttgagcatag tatttactaa ataaagaatc tgatatcttc 480

tagcgtgttc actggactat tatttagatg gtcgccaaca acaagcgtgc gaatcatata 540

gacccaaccc agggtggtat tgaattctat attaaaatgt ctcgccctta taactctcta 600

ggtttccata gtacaaacct aggtgtcgtc aactgcatgc actgcttttt gtatcggtaa 660

tgttgatcga cccgatgggc tttttttaat aaaggtcttg tttagttgat catactacca 720

attttggtgg tcgatggctc aatgaccaat ggaatcttta tagtaaaaga gcccttggca 780

ccaacgaatc atggaattta ggacgatgtc tcatttacca tattttgcat tcagactatg 840

actttcaata atagaatatc atcgtcaaac accgtggata tggcatcgac aagtgttggg 900

atgcccactg aataacgtct cttcgtcatc tttagggcgg ctatccatta aggaggattt 960

tatttttata gcagtcttag tccgaggcat tggcgccaaa catcggctca acactagaca 1020

cgtctttaat ggaaagtatc tagtgttact gcggtacgga aagcaagttc agtactttta 1080

tccaatctaa gtatcaccca gcttatattt aaaagctagg taatagggaa gttactaata 1140

actcatgcgc gtgtagtgta gtcttgctgt cgcttaaagc aactgaatga atgtacggct 1200

gacaaaggct tacccaagaa aactctcttg tacgctacaa gaaacctgta acaagagaaa 1260

aatattttag cccacgtata gtgaggccaa acttgatgcc cgtaaaagca aacaagtaat 1320

attcagcaga atttgcggtc attcaagtgt ttaggtacgt aacttttaca gaattagctg 1380

ttgattaggt aatactaaat caaaatgtcg taataccgaa gcagaagtat atgatctaat 1440

ttgtcgcctc gcttcatgct acgaatgtta cttcgtttat tacagctgca aacttgcagt 1500

gacttgcatt tgataggatt cttcctaggg aaccatactg ggccgcggac agggagtcag 1560

gaactcataa cggatgaaga tgtaatctct ataggggtga ataacaggat tgaagatagt 1620

aatctaagta ctctcatctc gtggacgact ttaagcgcac tgacagcgac tcgcgattcg 1680

acgaacaccc gtgatcgatt tacacgttca ttctgaaaga tatacaggta ataattctaa 1740

aagataattg agtaccaata tataggtttt atgatcttag gcgcatgtca ctgacgagag 1800

aaaagatagt cttgccgcct ctaagtgttc tatttctgga cgtgcctggg cattaagggc 1860

gacgttgact tttatacaca tttcatgtcc actaacaatt ttatatcacg tagcaggaca 1920

taaagggagg actctataaa aagtttcgct atatacgtac agtacgttca aaatctccag 1980

aggaaagctt gtaaaaaaag 2000


<210> 35
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 35
cgctcgacac gagtataaca aatatcgata gatgctatag tgataaggta taagtaaaat 60

agtactgcga atacaaatag cttggagaaa tacgttcatc ctttaacttc aaaaattttt 120

ggacctcagg cacgttgtca ttattactgg caggtgatac cacccaaaaa tcgtacccgc 180

aatatatctt cggtaattct tgccaagttg ggattttaca tacttagtat taatagtggg 240

atcagcttcg atcgaagacc ataactcagt atgtgtattc ctcatacaag atttctgaag 300

gacgaaggct catcaatgct gaggtgttat caggtcaata acaagccgca ttaacgccgt 360

aaccctaatg ccataattct ttgacgaaat gccaaatagt ttcatcagga atcacattat 420

ttggataagg aagcacaaca aacgctttaa tctatacccc tagaattaag aggacagcat 480

gataggcttt gcaatgaacc agtctcctaa gcgtaccacc actccggagc cttatggcgc 540

gccggtatta tggcgatgca ctgcctgggc gaaactcgag tgaatcattt ttcccgatat 600

acacagcagt acgccgacgg tctggtaaaa aaaacgttat aggctttgac cgcatggtga 660

tcgtggttaa gtgcctttac ctagagtgct gctagatgta acacaattga tctgacagtt 720

tacgaccttg taatccaaga accatataga tgacccgctg agttagtaag ataatgcacg 780

ctccggggct aaatctagtg cggttcatga ataccgaatc aactacggtt attggctgcg 840

gtagaatatt tagttgtgtt aaatatactc taagatgaac atgtatcact ataatcactc 900

accccctctg cgttcataag taagtggcta gtgtgatagt aacttgtatc agcgaccact 960

actatatgtg gaagcttttg aatgagaatc tccgcacatg atgatgtatt gatacaattc 1020

ttttgttcga aaaagcttcg gtgtttttta ggacaggaga ttaacgcttt agagtcatac 1080

atatatgtca agaaaccggg gaaaaaatgc cagcccagag tgttctaaac gataggttgt 1140

tcagttttta ataacccgcg acgcgtcaag taacgtcacg ggtcagctac gattaccaat 1200

ttgctataaa ctttcccccg acgagccaaa tccctcaaag ctgccagata aaaggatagc 1260

aacctgtact ccccgtcaaa tctaatgcat tcttgttttt taagtctcgt gtaacatgcg 1320

ttggctaatc ttctctaccg ggtccagtgc cctttcagct tatgcctcac ctttgattag 1380

taatggacat cagcttttag tcacatcgga gtgccaatta taccgttata tctttctctg 1440

atgcagaccg acctgtcgtg taccgattca tcctagggta actagccgtg gcaaaatatc 1500

tttatcgtgt tgtcaggact tggttgttat atactctagc ccgtagattt aaaataaatt 1560

aagtgtagat cgtccaaata tctaaagcaa tcgcagtttt tatcacatca tgtgttaaaa 1620

tgcgatcaaa agaaaaatac tgttatttcg agagtcaagg ctgtgaggaa atatgatgaa 1680

gactgccatc ctggtggact ggcggcccca acgttgaagt ttctatttga tcggttatta 1740

aaggatactc gagaacaaca tcgaaggaat aaacttttat agaaagtctc cgaaatgaat 1800

aacttaagat ataaatttat cgcgcgatag ttctggtgga tgatagcttt attcctctta 1860

atgcagtata gctattgcac ctattaattt gtataataac gtatcatgtt agacggtcag 1920

catgatattc cggatagtgg aagcaaatta cgacatctaa atatgtcgct agtatttgag 1980

tcattatagc ttcgaggctt 2000


<210> 36
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 36
ctctaacgtg catttcttcg tcgcctttgt aagaccccac aaaaacatga cgctttaggg 60

atatggtcca agactccgaa ttgaaagtat gctggtatga tatgggacgt ttttgaaacc 120

cccctctcac gcgggtaatt gggtttttag ttagtgtatc atagtaggta tatctacgaa 180

ctacgtctga ctgagagaga ctttgtgcct ctcaaccgct atggtgtcag cgactgatat 240

tggagttatt tacccgtcgt tatacgtggg taatctttac tacggttcaa ggtaactaat 300

ctagtgtagg tagaatgctg aagaattacc cgttggaccc ggtagtccgt ccgctccacg 360

catggaatgc atgagtaacg tctaggtgaa tatccggagt gcataacttt ttggtatcta 420

gtccgctact ggatgcagaa tgacatattt ttttcgagtg cttactatta ctcttctcaa 480

acagaacgat cattatgttg cttaaattca cgctatgttc tcgatgtaaa acaattttcg 540

tagagaaaga tgcgtaaaac gcagagttag catataaaaa gtacaatcaa gcccgaagca 600

ctcacaagaa acataggggc taaatgttac cgtccaagtg agtaggattt aatatcaagc 660

cgggcttatt gggtacagta cgtggacgga ctacgacgca tgtgtgttat agaatgaagt 720

gcctacaact gaagcacaat tactaaagga atgtacctgg gtttacacta agcatcccat 780

cctcttcgcg gttcagcctg atgtaaacgt aaatctcgtc ttcccattat taagacgcct 840

cgatctacga taggtgatac gtgtacatcg gtggaccatg tgttttgata ttcaacgatg 900

taagtatggt tccctgcagt gaacccctct tcaagtcgtc gatgtacctg caagtgtaca 960

atcggaagac catgggtcca tatgtaaaaa taagttaggg gtcttttggt ctgtgttggt 1020

tataatcgat attgccaaaa tattatggac agttagttcg aattttgtgt atggtagccg 1080

tcgaaaaggg tggacgttaa gtatatccat cccagcggct gggagatatg tagaccgacg 1140

agtgttaagt tattccactt actttaggac gaaatcaata cgattatttt acatcggagg 1200

acatgacaac aaaaaactac tcggtttcga caggtggaag atgtcgctgc gcaccagtag 1260

agcttaggag agcgacggta ctcatttgca gcatgggtac gtaatcacgt tagtaaataa 1320

gtaagtatgc cttctcttat gtcattttat aagctataat ggtgttgtgc caacttaaag 1380

attgacacat gatatgctac cagataagcc tcgagtcgcc tatattttgc tactaaacct 1440

gattaactag agaataggta taatccctgg taaccagtaa ttttaatact atgttgccac 1500

ttgatgtaga cctggctgtg gttactaagg tgctttgaaa ccattgacca cccgtttctg 1560

ctcgggttgt gcatctaacg taaatattca gagataacgt ggctctgcta ttatttttat 1620

attgcctgct gacatatcat catccttgaa tggccagcaa cagttcttga tcggcagagg 1680

ccccatgaac tagggtaata tagcagatta actatcggtt aactgtatta aacttgtgta 1740

atacttatat tgactaattg ggattgcctt tgtcgttatc tcgtttatct tgaaaacggt 1800

gatgttttta gaggcgatag tattgaatag ctcgaatgat caccagccat caagaatgta 1860

gctaactccg aaactccttg acgagagctc aagcgaatac taggtcggcg ctgctatccg 1920

cagagttcag ggttctaccc ggggtataaa atcccattga tcattcagat attatggact 1980

tggcgtttat gcgacgagtc 2000


<210> 37
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 37
aagaagcagc tagtgctact tcggaatagt tgtcgtttaa gtccgttcaa acatgacgct 60

ctagtcattt tgaaacctaa accagtaata atagactgac tcagaatgat tatactgcta 120

tctctagttt aaggagatcc agcgaaataa cttggtgaac tatgccgaga tactataaaa 180

agatcaagga cgggtcgctc acggttttgg tttattttac tacttcttcg tggctgtatt 240

agtcgatgca agttctaata aatagcaaac gttttaagtg ggattagtac atattgatgg 300

acgtccacca cgtcaaatct cgcagcgtca tagaaggagc tataaccatt cactgcgact 360

acgacatgtg tttgggtagt gccaactacc cgcttccgcg tccctgccgt tctgtacact 420

tataaaattg atattttaat cagtggatgt gctgatacgg ggcactgaga tgatgaatag 480

tattaggctg tagtacctta tgtacgcaag aaattttaga gtaaagatta gtctgtgggt 540

aaggaaaaag ctaagttatg attatccatg gccatggcat ctacaagctg atgaacgtac 600

caacattatc taatttaaga acttaacttg tcttatcctc tcttaaagtc ttaatttgca 660

ctattaagct tagggaagtc gcaaccaaac tcgtgtagta ttgagataaa ttattaaact 720

ttcttagtat ctactgatat ccgtatcaag tatgcttata aattcttgtt ctgcctgaca 780

ggctagtgaa tcctgcaccc gggacgattg caggtgtata caggccctca cgctagcaat 840

caataccaat acgaaataag ggctaacatt tttcgtaaca gattagaagc agtcccgttc 900

agaacttacc actgcaccaa cggaggtact gaattcggac tcatagaatc ctcgagtagt 960

aagaccgtag aagagacagt gcatattaat gtcatagatc aatttatatt ttatatggtt 1020

gcccatttca tgatacccct ttaaatttat aacttagaaa aggagccgca ctaataatga 1080

gcggcatgct gtaaaaaagt aggccaaaac gcaagataag gtacctttgt tgtccaatca 1140

aattaattga tttattcttc gatcgatcga ccgtcatagt tgaagtaact atttagttac 1200

ggcagataca gcgtatcaat tcattcggtg actttgctta gataactgct cgataatccg 1260

gaattatcat cgttcaaagt ccttccctta ctaaggctct tggattcaga tgatcggtca 1320

tccctaacaa acagcccact gccatgctgc tatggtgaca ttcgttacta cattgatttc 1380

tgcagacctt catccataat acgatggtaa cgtctcgctt actatgcacg gtgtgcccct 1440

gcctatatct tcacgatata ccaagtggag aaccgtaggc atgtagtcat tcaggtggcc 1500

actctccttc acattatgtt tagaggtcat gaataaccct aatcgtgtga cctcaaacag 1560

catcgtattc cgaataagta acaagtaggg gtgtttcaag ttgcatgaca caataggata 1620

tgattctcaa ccaaacttgg caataaacgc ataggtttag cagtactaac aagccattat 1680

gtttaatata gagcatggct tactctgtca tgttcaaggt ggctaaaccc aacgcgttaa 1740

tacactcatc ggttacagtg tttttagaag agcaattgat atctcttcag gtgatacctg 1800

gttcattatc ctaattcagt tggttcagga agccttataa ctaccaattc gatattttta 1860

agcatataga ttaggtgata ccacaccgta ggaaattgtg cagaatttgg tgtctagaaa 1920

tttaacatta agtgatcaga aaattctctg tgttaaacga ctgttgcgaa tctgtgtctt 1980

tcaacctcaa gtacgatctc 2000


<210> 38
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 38
taacaacctg taactgtcaa ctaatgacct ccttaccaaa attgagggta gttggttcaa 60

agagaatgca gcatgacgca gagcttgtag tcacatcgtt cttctagtac gcagagtgta 120

gagttaagat tattaaactc agagcacgtt gtggacaaac caataccagt ccattcaatt 180

acatggtatc taacagtatc gtacaacttt aatatggtct agggctagtg aagtgtacca 240

actacttgat acgcagtaaa taatttcatc ctatctttac gtcgccatcg aaaagcaaag 300

ttatggcgcg tggaaattca gatgaaccat aaccaaacag ataaattggc agcagttttt 360

tgtagacatt tatataagaa gagctcgagg cgtaggttaa ttctatacaa cgctatgata 420

gtcaagttct acttgaccaa ctacgctggg aatgtttatt aaattcaact gggggcaaac 480

tagcatatac tgtctgagtg tccttcgatg gttctataca aacggggtgt cgaggtacta 540

gtggaatgga gaaactaccg acaaacgcat atcttatctt ctactcggga tttatgaaat 600

tttttgcgta tactattcct gtgagcaatg ttcaacagcg tagtgagcct cataacgtca 660

catcaattgt ttcacgtctg tggctatcga gtattcctta acttaactag agtatagaca 720

ttagagtcta attctatgca agttagataa ctactactac tgtcgtactt cattcagttc 780

ctgctcgtac tcggcgacgc tataaccggc ctagtttgtg cgtcgccaga taactgttcc 840

ttttaaacgt ataaaaagta cgaaagatta acccagcgga agttgggccc cataaatgtc 900

atatagggac tcagactact gttaaaaact cctagtatac attgtagata atcaactaaa 960

gttggactat caagaatcaa actgtaatca ggtcacagaa caaatggact aatagagcta 1020

tctaatcatc atacagattt atacccagtg gaaacaaaac tttacccctt gaggatttac 1080

tggagttgtg tcaagttaga aatcggtcaa cataaattag aaaatgcctt ggaacgctgt 1140

ataactgatc acatatagct gtgcctaatg cttcaatcgt caatgctgac cacaatctac 1200

ctgacttgga aatccgctac acccatatcc atatacttaa agaatccgta ctttatatcc 1260

tattcaccga tgtccgatgt ggcgctatgt gtgtctagta gtatatcagt tcaaggcgag 1320

aatgaagaag aatacagggt ctctttagag cactgtgtca ctgtttctta ggccagttaa 1380

ttctagaaat caaataaatg aataactcgc gacggctcaa aagaaatcta tggtttacgc 1440

ataagctgta ggtacttcta agcttgattt gcttccgggg gatcctaatc taaatgtgaa 1500

ggggcagatt tagatctctg ctcattgagt gggaggttgg acattgaaca tagaactacc 1560

ttccctgcgt gctgtaagat tatgagaatc tatgctcggt cgttgtctaa aaatcagact 1620

acaagggtaa gaataataac agaccgaaat agatgtctcc ttcaagatag tcagtttgcg 1680

caagtctggc aggaacgtta agtaatcctg agttataata gcgccctttt aagctttcct 1740

ggcgaaaacc gaaccaagcc cccgtaacac aatgtcacta tccgtacgaa agttagtgta 1800

ataacgactg tacctattat aagcacattt ggttggctat cttctcccta gattcctggc 1860

ggaaaagaag catgtctacg ttcgatagga ctcatttttg aggaaaacta ttataacggc 1920

tataacgcgc gattaatccc tgtcggtcca tcattcacgt gagtgtaaaa ttgtgattag 1980

tacttaaacg ggttcgtgga 2000


<210> 39
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 39
ttgacgattt atatagctac tacttagcct tactacatat tccggcgtgc cggtagatat 60

gactaagtta atacttacag acattcaata ttaggatttc ggtgacctcg atctctcttg 120

attgaataaa aaatggatat taatgcgtcg atagttgtga taagttatgt atgatgtcct 180

gagggacata tgataatctt ctaatagtta ccttaaaccg aattgtgttt atgatgaaaa 240

atataggtga agttagcacc tatcaccaga ctttgggata gttagtccgt accaagcagc 300

agttcaactg acaggaacgt caattctgtc tctcattact ttggccatgg attgaaaatc 360

gacttcagtc tgactcacaa cagttataga aggattttgg ctcaccactc ttcgaaatag 420

gtcatttaat gcgtactgct ttttttgacg gccctttatt cattctattg agggaatccc 480

taactttagc cacacgcaaa ctggtttata tggatactct caagattgtt tacatatcca 540

gaagcttata cttcctcaat gtgatgcaca caaggtggga tcatcttgtt tctacaatgc 600

agaatgaatt aaaaatcgcc cttcctggca catcttgctg tacggctaca gagtaaaatt 660

agctcgttat ttatgagtgt ttacacaacc caaatctaag tcgaatgtac tttaaacttg 720

gcgtggattc atagacatgc aatcagtgtt aaattgtcac tcaaacacgt gcctgacttc 780

agacaaattc atggattcaa gctgctaata ttcacaatag acgagatagg ggcgtagctt 840

tttctgtacg atgggggaat atacgagcat ttctatgaac caaaacaggc aaaatgagca 900

aataccttgt gcatcatata gtttccatca actggagaaa gcctcttgat cggctacaac 960

ttttcaagtc cttgcggcgt tggccctgaa gtactatagc cttttgttct cactaatcta 1020

gccaatcact tgttgactat tcttgcctca cccatagagt ggtaatggaa ttccaaaaac 1080

ctattcccga gtttaacccg tattgtttga gaggagttcc tagtgtcttc attaaattgc 1140

acatggactc tacggaaatt actttttatt aaatcataga atctctgtca tcagtccatg 1200

cgtcctcagt caataacggt cgccgtgtct acggaaaggt tcattctatg cctgtaaagt 1260

acatctaaca caatttagtg tgggtcttct actacagttc acccgggaaa cgttttatgt 1320

acgagtgttg gtaaagcgtc ctcatcaagt cgatccattg taaggaatcg actatatact 1380

ccagcttaac taggaccccg ttacatctta atggtaggtc taagaggtga taagactgga 1440

acctacatca tgagttgagt gagcaatgag agccagcaaa tggtgggaag actagaccaa 1500

cacaggatct catgcttcct gtagcagtgc aactcagttc gctgcgaaaa taattaacat 1560

atcccctatt ggcaaaaccc tgcatacgta tttagcaaat atctgtaggg gtcgtccaat 1620

agcagtgccg ttttataaat tgggttgata cataacactg aatcaagtga aatcgaacgg 1680

tggtaaaatg gcttgaaagg ggaagttgtt taacattcgc tagcgacaca tgttgcatgg 1740

ttagggttgc tatttcgcct cattctcgtt acgacattct caaccagtag cccaccaacc 1800

caattaaggt cacgcacgaa cctatcatcc acttacctct tacaacataa aatagtcaat 1860

acaccttcct caattagcct taatcaaata aagctagtta tttttgtctc ctggggatca 1920

gggcgcttac ttcgtactcg cttcccccgc taggaaggcc actggttccc gaagaaacgt 1980

gaataattgc acatgcttta 2000


<210> 40
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 40
agtatggaag gtgcctcggt aattacggaa agagcttatc tgccggaaac ttttattttg 60

tttcatcaaa aggttatacg ataataccgc atctaccttt tcgtatcaaa attggtccac 120

aaatccaact tattgtcatc ttgaatcaca cattcatctt tccgtctaat gaaggagcgt 180

cattacttgt tgtatgaaac gcaaattctc tacactagta agtgagacat taactacagc 240

ctattaaata attcaggtag actgatgagt aatatttctt ctatatatat gtgatactca 300

ctctctactg agttgactag tggactcttt gttcttgtac acacacaaca gagaaatgcc 360

tagaacaaag tcaaagaaag cgcctagatg actttgtaaa ttgcaccaga tctgaagtcg 420

agtcgtgaat agaactttgc ataagactct aggacttccg atggcgtatt atacttagga 480

aaccaagccg gtagtaagaa tcgaggataa tactctggga agtcttccgt atttgcgtca 540

acaaccagct tctggatcaa gcatttctta actagattaa gcttcctctt tcgttttaaa 600

gcgttttact tcagcaattg taatccctac atttgtatta gccgaataga acgatgctcc 660

tacaacacca ggccgacctc atgttacgat ggccgagacc ataactcttc gatgaatcat 720

tagtggaaga gttatctact gacggcatga tcctgggaca tgaaattgga aagcatttgc 780

acacgttaat tcgcctttta cttcaacgct cggacccggt ataagataaa attagaccgt 840

tatcttcgta gatcgtaata cgtatcatct cgtatatgcc gcttgtattc aacggtttcc 900

tttttagact ggagcgatct acgctggctt ggtttaagga ctatgctagg gtttgtacgt 960

aatcccttta ataattaacg accgagctga caaactgaat aagtacagca tcaacaggac 1020

ggttcgattg acagctggaa acctattagg catcttggcc cttagcataa gtcccagtat 1080

tatttgttcc tccagtaaaa atctccccgg aattagagca gcggtgaaat ttatggactt 1140

gacctttttg gtttagtcgt agagggacaa atatcatctc atctgaacgc tcatcaccag 1200

ttagttcatc caaattcaat taggaggcgt catattgtcg ggcgtctgta acggagccag 1260

atctagaagt tcattgctat aaagaattag tgtgcttggc acatcaccta atcaaatttt 1320

gggaagcagc atagctattc aggtgttggt caaccagata aagtctatga agaaaaaaac 1380

ctgtgttagt tctgcgtatt agtattgtag tataatgtac gacatcccga aagttaaatt 1440

caggtcgcag agtccctagt ccaccgttct aactcacaaa tcgatgttcg gacatagcta 1500

tttaacagtc catatttacc ttaagtgttt cgacttatgt atgctagtta ggtgtgtggc 1560

tcgccttccc actgttagac cacatctaga cggacatcgt taataatatc tgatatacac 1620

aaaaacgttt accatagaaa acactatatt catggacact ttatcatatt cctcgcccat 1680

cctcacgacc cagataatag ggagttgtag tttttctaaa cggttttaat atgcaggtcc 1740

ataaagcatg cagtacatta ctgtttaaaa ctttaattca gatatatcct ggagaagaaa 1800

atctcgattg gttaatcact tcattgttaa attcgatttc gctatacgtt tctgtactag 1860

gaaatttttc atattaggca cgcggtgttg gttccgtaac actattaatt tcctcccggt 1920

tcgatcatgg cttgcggtaa gtcctcaatt taacataatt gagataccga aatcaaccca 1980

gcgtcgcagt attttgagtt 2000


<210> 41
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 41
ggttaaatgc atgctcacgc ctcgccaggt tgttaaacca tgtacttact caatttgaca 60

actgatgtcc actctccacc tcgcgcgatg ctactttctt aatactaacg ccaccttgtc 120

aaacacctag atcgttctaa gtgtagcacc agacagagta gacaccgtaa aaggtgaaaa 180

ggggattaat ttctcctcct tttgcacaaa aaagttaagg ggtaggccgg aggaaggtta 240

acgcgaagca cctgcgtaat cggtttcgtg ctatatcgga gatataccgt aatgactcgt 300

cgacgaaagt cgaaggcttt aagctccatg ccccatgttg gtgcgttagg actttggtaa 360

agtggtaaaa tttagatctc tttgtgtcct ttatatcaag ttagtgtgaa tgctgagttt 420

tctcattttt taatgtaagt gattaatatg aagatgtgta gtctaatttg gagaaccaac 480

ttaaaacgga ataggatcgg tgtatcaatg catatgaaac cggtaaattt agtcctgttg 540

acctgaaact gatgggaaca aaccctcaaa cgctatcgca acaccgtcct aggttccatg 600

cactattaac ctgttattgc ccgtgcggag atctggtttt tattgtttta tactctagat 660

atattagcgg ttatgttttt ctgttaattt aagatgcata gtctactttg acctccggca 720

acgtgatttg tagaaaatat ttcccacaca cactatatgt gctactcagg ttacccatag 780

tttatgtaat aagtatcact ttaaaccctc cacccgccca tacaatagaa gcccttcaat 840

tatacgagga ggtattgacc tgactagttt accaaagcca aagatacctg gacaagttgg 900

acaaatacta aaggactact gtagcatagt gtttgcgggc cagtatacgc ttatttaaac 960

gatactactg ataagaaaca ctggggtcaa cgtgctttca tcacctgtcc attactccaa 1020

cagtcccaat tttttaaaga aggaattttc gggacagtga acgcggaatc gctaataata 1080

ttcagataga tagctcgaca caatataact aatcagacaa aaactattca aaactttctc 1140

ctaggtagtg cgcggctctt ttacgtgggg tttattcacc tgcgaattat cctgatgccc 1200

aggagcaaac tcattataat accaccaggt gacagcctac aagtttcatg gcatggctgc 1260

aacctgcaca cgaacgctta tgcagcatgt gctcttgagt tataccagct acttgattcg 1320

atatatggtt tttgtgaaga atttgatacc attgacacgg gatgttgcaa atatttaata 1380

agtccatgca tactaatacc aacgccagag atagattgtc agtagaactc ttgaagtcaa 1440

tatggaccga gtgacttggg tggtttatcc cactgttaga aagttatcgt aaaataaatt 1500

cttggtcaaa tctaatcctt ataaacactc tgttattact ctgcttcgaa tatgttgtta 1560

ttgaccatgc tgataactac atcctttatg ttaattcaag gcattctctg aaagtcaaca 1620

attaacttca tatcagacat ttgacctatt cctcactttt ctataacatg acaatcacgg 1680

tgattaaaaa catgacgcgt atcggcagca aaccactgta ctgatatgta agagcgcccg 1740

tcgcatagat attttagact ctgtccaaat cactctacgc caacttgagg tcagaatgca 1800

taccgtggta agctgaatag ttcttataca ctttctaatt tacccagatg acgatttttt 1860

gttatatgaa tgacgatctt ggcattatac tgccaagact gcaatcaaat cctaaattca 1920

taatttagta agtcaatagc agatctgaat cccataaatg aattctatcg aagtacctac 1980

actatgtcac gtagaacaag 2000


<210> 42
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 42
ctaggtaaat tcttaggtag ccgagttgaa ctattaataa gtctcgtctg tgagtatgtc 60

ttccgttagg tattttcata tagcttcatg tgcctgtaaa gacagaagta taattggata 120

catcagactt tttatccctt ttacagtcta gaaagaccta cttgaaacat gtttcttaat 180

gggtaacgta gtgaattatg ctcgtttttc ctttggtaga atgatattta tctccatatg 240

ctctgagttg gataatttgt aaagaattat acacgttaat tcaacctctt tatcaatgaa 300

ctacgcgggc ttgatcagag taaactcaca atagtatctt gatcttcaca atctgatgga 360

tattgatgcg agttatacga cctgtggcat atcaacaatg aagtgaagtg tctgtcctta 420

tgattcgaaa caaaataagt gtccttgcta gctacaccca caccgcggtg tgcatcccat 480

aaaggctcag gtatagtctt gtcataagcg ctacactgcc attcgtttag aatcattgtt 540

tagcaatctc aaaagtaata acatccgact ttcgaatagg ttcagtttcc tgatctactg 600

gagcctatat atatgcacag acgaatctcg tacatggcat aagcaagtca tgagaagagg 660

ctgtaccacg taaatataag cctctgatta cgctgaagct taataatcat cacccatcta 720

cgaatccgat tgagggcata ggctttcatg tctttttcgc tgtaggtcta tgcgattgtg 780

agactattga gttttccaca atatggtggt aggtactgag tagggtacat ttcactgtcc 840

tattgcgctg tcgtatgtct atccgccgtt gccgtcgtcg atgttatacc atttgactaa 900

cagtgttatg agtcactccc ttggatgcga tgtaccttct gttgtgaggg atgtaagttg 960

cagttaagca ctattagcga ataacgctag gattctggaa gaagaaaaca cagggtcgct 1020

tcaggtctcg agaatcttac ggttagaaaa tttggatctg aataaagaga tgtctagcca 1080

gtgtgggggt tgaataagct aaatgtctgc aatgtgtatg cttctgcaca gatattaaca 1140

aatccgccat atttaggcac atttggtaat ggctgacaat cggatctcaa gaattctata 1200

ctgagttatc ggactacaac taaaaagatg ctatataaaa ttgtcataat tcatgaaaag 1260

ccagtaggcc gaccatcatc gctctaagtt gagttgtttg acgcgaggca acattacgtg 1320

catggacgat atacacgtta ctagttgtat ggtatttcgg ctaagtttcc tagctaattt 1380

cattaaaagc tgcgcattgg tgtttttcag cctatatact gacgtagtaa acttacatac 1440

ttaattatac taggtaatga tatagaaaat ggctgtacat cctttctgaa atgcttccat 1500

gcaatggtgc tacaagtctt agatttacat tataatcgga aaaacatcaa cagtatgatt 1560

acctaggagg agctagcata tccagaaagt agaatagcag aagccaccaa cagactgggt 1620

gagagtgacg ttatgacgga tggatcatac cccatcttag gagggtcagg tcatttctca 1680

atcatatgtt tccagatgcg atgcaaagac aaggcccaga aatttcaatt gtaggccaat 1740

cgtccggtcg tattaatctc aaccaagtaa ataaaaagca tgtgggctgg gcgcagtcaa 1800

agtcgctttt cttggtcctt actaatctga agaatataca gtaaacagag gatagtgggg 1860

ctagttcaga gtaataggca acaaaccctt tcatgcatta ctgtagaatt tgatactatt 1920

gcgtgtatcg cttttaactt tataaagagt cgatacagcg caggctcata atgtttggag 1980

tctgtctaat aaacatctaa 2000


<210> 43
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 43
tttatctatt tcatatattg ctagataaag ttgactgact tattacgatt attgtcccag 60

acagccgagc tgggccgtgc gtcaatgcac gggctcagcc tcctaatgtt agcatttgtt 120

actcttggaa catttggata tagttgattt tttgatagtg caaaggttct cggtcatccg 180

gtataacgat actccctacc ctagacattc aatcggtgcg atggtaagtc cgtttcgcac 240

tgaaagcctg tagagtctat ttgatgttta cttaatgcga tttgactcaa atgtaggtta 300

ggagtccgtt cgcatcctat gcagtgataa actatctagt gtgtttaaaa agacgcaacc 360

actaccaatc agaccagcaa atttacatca atttatgtca aaacgccctt acttcgtcta 420

aatatagata tatcaccaca tcaagcctgc acttctcaca ctatgttcta tgtcatgtcg 480

ttgtaccgaa caattgatat ttaaccggag ttgaagatca gctaaagaga gaagttatat 540

aaccaacaaa tacagcccac ccatcaatga tcgtgaaaac aaactgtact taacagttca 600

agaacagtca ccatttctcg acgtacaaaa gattcttcca ttatggttcg atacaaattg 660

ttcaaacgcc tgtctatagc agggctccgc catatttcga gcatactaaa tcattgggtg 720

gtcaaacagt ctcacaaaca ggtctgttgc gattcatacg agacgaccat acttaggcgt 780

tgaaatgtcg ttgcatttaa gtaacaaata ctatagaccg ctggtagtcg ccatataact 840

ctggctccag attatacatg acctgtttag aaaggcaatg ggaagagggc aaaaccccaa 900

gattgttcct aatagttgta gataaatgga tgatatctgc atcatcactg tttagagaat 960

cccgctttcc tttattcggt tatactcacc gtttctcggc gggttgagac atgcataact 1020

tctatctatc gttgagaatt atcaacttca attcccgaga ctgtcattat ctatagttga 1080

ggaaccttcg tcgctgctat tgaatagtaa gaacccctct agtccagctg atgcttgtgg 1140

taactgcact agtaattcat ctgccatccg tgcttaattg ggcatgcttt gttgcatccc 1200

actcccgaac ttgaaggttg gaactctcgt tttgccagca cagttaacag ggagtaagac 1260

ctattggtgt gacataacag ttaggtaaat ccatctaaac acgtgtgttt actaatattc 1320

agtcggtgga ctaacagaca ggagcttacc catccgtgga tgttttctta agggtgtcgt 1380

tagaatgaat agtacatgta tagtactgtc cgaggtgtag atagaataaa tgtgaccgtg 1440

atctcagatt tatggttcaa acgttctaat tttccgagga gtagtacatg ttggtacctt 1500

ttcacattat ggtgctaatt aggcatgtat aatatcatat catagctttg cccatactga 1560

ctatactaaa attgctattt tggaaagttt ataaggccgt ttctcattgt atctaagacc 1620

taagcttcgc gtcaagaaat acccttacaa tcggcctatt taaaattatt catttgtcta 1680

gggcgcgatg atcctttccg aatattttat cgattactac ttatggatac ccgttagacg 1740

cttatcctcc tactacaccg tactaattac gtactttttt cgaagtacga tctgattagt 1800

gtcgaccacc ttgcccttaa atctgatcgc tcccaccagt acgcaggaca cacgtaacgg 1860

tttcgatacc cagcgagatc agccttacca gtgcttgtgt ggtataacca cactatttca 1920

atgcacaatg acaagagtac tatgttaatt cacatgccta tctagttcaa ttacgttcag 1980

actcataaaa tgccattgct 2000


<210> 44
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 44
tcgaaattgg atcgacggag ctaatacgca aattatttgt ttgtgatttc tatcgcgctt 60

caaaacctac aaaaaataac agcctttggt gtaattcgtc gtggccataa atatggctta 120

ttctatatat ccgaggccca ggccataaca aattctccaa gatttactaa attagtacgg 180

ccttcattcc gacgggaagt ttaaactcaa gccatggagt ccggtagtct ttcaactttg 240

tcgtatgacg gtatgctaca tgcccccaat ccgctattga acaatggcaa acactacagc 300

agttagccag agaattacgc tctttcactt tcctagaagt acacaagtcc tgaacctacc 360

aactgactgt acacaccctc tatggtactt ttgctgttta gttgccgaat gatgcatcat 420

gtctgatttt tcgggctagc cttagctgag tgtcagcttc accctgataa gacaggagtc 480

agaaacggaa tttcattaat accgcctaag gcgaaagaga ggctgtcatg taagccggca 540

ggtttccccc ttacggggcc cacactctcc cctcgctatg aaatgacact tcacaaacag 600

tcgctactca ggatttattc caagttccaa cgatgttgag tacattgaga atgtattata 660

ttaagctaat aggcagtttt ctccaactat cgattattcg gctgatatag cccccatcct 720

gagacgttat tacgtcactg aggatgatct attcacacaa cacttgggtt accatagttc 780

ggaatgcgat ctaacgtctc acaatggttt ttggtggaag tatagtctta ttccccgggc 840

tatcgcaagc acccaggagt agtttcgttg gtgtcatgct tatccctacg acccaccaga 900

gtgtccaatc aatttacacc taaactggaa cctaatatat taatcaaact ttaaatctct 960

atatattcag actactttac tcactttgat gttagatgcg taacaagcat ataaacccgt 1020

ttgtgatcgt actcaatcgc acccttctcg ttattgattg atccttgcgc gaggtaacct 1080

gggtaatctc taagttatcg atgcaccgta tcaacattca tgatcgaaaa aagtttagtg 1140

agaaggagtt aatggatcgt tccgactaaa ctaatggaat tatgtatggg atgtatttcg 1200

tttgagccaa ttaactagga actaactcat acatcttgca atagtggtag cgtaaaatgg 1260

ttgaacgtag ttgaaatagt agggatacga catgtcccct aagcctcacc cttggtagtt 1320

ctcgtaagcg gacaacgcgt tatcatcacg ctttggagtg tactagttta tgtctactgc 1380

gttcgctgac aataagaaca gcaatatccc aattctcagt actgacgtag gaccattagc 1440

gctataaaaa aagtagcgtg aactgtcatt tattaagcat tccattttat ccagtgtccg 1500

ctaggcggct aaattataca aacagaacgg tgttcttata ctgttactac ctccacaagt 1560

gggatttacg aacgcagaaa gagataagct cactctcgct atgtgcaccg atgagtcata 1620

cagaggtcat cagtaaagga actcaatcta gagttacagt ccagcaatcc aatccggatg 1680

ccaacaggcg taacgattat attcaaccac taagccgcat aaagtatcga tgattagcgg 1740

gggaatacct cctaaacagt ttgaccggaa cgtctacaat actttgccgg ttatcaatga 1800

aatatgcggg gacgaaccat gcatcgttac tcagcctttg gtgtacgcca gtaggagtac 1860

tacttgttct tcttacacga cacgtagcta cttctatgta tagtaatgta gttgactata 1920

gaatgacgaa tagagaaggg aaccagagct cacttattcc gtcaactcga tttatcatgt 1980

tgttaaaaaa gataaaatgt 2000


<210> 45
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 45
gctactattt tagatatgca tcaaagaaaa acaaggacat ctcctgtata cgtataggta 60

ataagaagag gatccaacgg aaaaagccac cggtggagat aataactatt gttagcaagt 120

ccagttttct gtcaggggca acgttaagat agaggccagg gtaattattt aactactagc 180

tgcacttcga cttcattttc tgagctctgt aaataccaat ggagcgagta gctacggtta 240

aacagatatc ggctggatgt cggtggtagg aaaatgtgcc tgttgcggct gataagcatt 300

aacttaccta aacatagatt gttggttttc ctaaggtttt ataagaacgt atataaagat 360

ttcttaaatg acaagcttag cctgcatagg ctacatgtga gtgtggatgg cttcgacagt 420

gatcccgcag tggaccagat tccattacct gaatgaaaac gttcaattaa accacttacc 480

gtatcactct gtccttgtag ccctgtaaaa tgagacttgc ggataccaaa ttagccaaat 540

tattcatcta actataatac ttcttccatg aaacattaat acggccaccg ggaagccacc 600

gattctgtcg ccttatattt tttgctctat gtctttcttt tagtccgaca actaatgtga 660

acaaatttcg acctaacaaa atagagacaa ataaccctat attaatacaa cgctacgaag 720

atcttcaata ggattggtcc gattatagac caattatact tttacataat atgtacaaaa 780

catctcggca ttcgatggca ttggcgtgga tattcgattg taaaagcaat ggatttttct 840

tgcgctgaaa atgatgatcg ccctcgatca tctgtatagc acgggtcgaa gtttcagaaa 900

tgatagttgc tcaatttggt tcacttcgaa tttacgctga tgtcccaagc gacatgtccc 960

cgatcaacat ggttgttgga tatcaaaaag ctgataaaaa atgtgaaagg acacgcctcc 1020

aacgcgtaac tgtttcacct acttccattt cgaggaactg ggtcgattta acgacatcaa 1080

agttgtttgc tcagacagtc ttcctatgaa aatgaaaagt gatctaggag tagaacccga 1140

tggctattaa taaacacact cttactaaat aatttggcga gcatcagagc gtaggtactc 1200

ggaacctgat tgccgttccg ctttctatac actgtgaata acaaagtcat tgaggtgaca 1260

accttgccgc gtgcacggtc taaagcatga aattttaaag caacaatcaa atctctaacg 1320

gcctatctca agttacgcag ctggcggtag gtgggttttc gcactgactc tttaaccaag 1380

ctgctgctaa aatactctta cctcactgtt gatataatgg tcgcgattac agataatccc 1440

gcacatctgt caaatagaag atccagtaaa gagtccaaat cagagagacc caataaagta 1500

accaaggcat taccgtttca cgaggtggac tttcatgaaa gcataagtat ggcgtataat 1560

ataatgttat ttggaaaaaa gatctccaca acctgtttta ccgctgaaaa acctaaatac 1620

cgtaccagac gaaccacttg atagtcgaat gcgccattga aggaaacatt ctccgttaat 1680

ctgattttaa gctcatcagg cttttatctt tgcgttatct acatttgacg attaccaagg 1740

atcaattacg tgattggact atacttaata tcaatgtacg aaatcgtcta cgatactaca 1800

aggtaaccac tgataattcc tcattgctct atgttcacac tgaccttgct aatcgacgtg 1860

gacttgcgtc cttgtctagc ttataatagt gagatttaat gacaatgctg gtataatacc 1920

gtgcaactac acgcatagaa attactcagc gctcgagaaa agtagattac ttcgctcctt 1980

cggagttttg cgtattttca 2000


<210> 46
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 46
cctcatttgc ccttttatat ttacccgagt tagttcacga atgtgccata attctggtcg 60

cagcaaactg cggtgtttag aaataatctt ccgttattcg tttatcaaga cctcgttgtt 120

tagtagttct agctgaatgc ggtctattaa gttggagaag atctgggttc attacattag 180

aacccaaact aattattaag ttctgctcat tagcattagg tagaatctat tcttgtccgg 240

cgctgttgct actgggttta gtctaagtag tactttaact gttcctaagg gatgctgcaa 300

aatgagatat actcctccga taatgatcaa tttggatttt gggcagcggt aaatgtttta 360

tagtgtgaat tgtgttacta aatttcatga cgtaagctga ccttctaacc gtcgtgcttg 420

gaggatttac gcggcgccaa aaagaaatat actagtccca atcgcactag gatttgttta 480

aaaaaagacg gaaaacctgc aaccaaaggt gtcttgtact gactctatct gcaaaatttg 540

gatgttctag ctccgtttat ggtcgctaca tggaaacgct attggttaaa gattcactat 600

aggccagttc aagtttcccg aaaaatcgtg acggacgtta tactctaaca ttgataagaa 660

ccatgtatca agcgatccgc aatataggga aacacggcga agatcaaatt tatagatggg 720

aggaagcaca cacaatatga gtattagtgt gctgaaatca gcagcgtaaa gtgcttctgt 780

tccacctata cttttacgag tctcgtaata gcgtattacc atgtaagatg cattaaagct 840

ataactttat ggcaaaaaag gtaatttatt cgctcattac tattatttgt cgttttgcat 900

aaataaagtg ttgttacttc aggaagcttt aattctctgt ctgccttaac ccgaattcta 960

cgcgatctcc gtatagcaga tgagaaccgg tgacacgaga cccgcactcg caagtcgttt 1020

cttgaggcta acgacaaaat gaagccatca gcgaaatctc atccgttagg ctacccaaag 1080

ttaagacttt ccctgtatcc cgctaatgcg tcaattggta gacgtatcgg gattagatat 1140

tcaagaccaa gtcaggtaga gttggcgcta gttgaacatg gacctggcct tacaaacaag 1200

aagaccacga gagccctagt acaggaattt atcggaaaaa ataagaaaat taaaatcccc 1260

gatctgtgtg gtgctcaaat aaggcaaggg cgcttagcct cacagtcgtt actaagtcaa 1320

ggttctaaaa gcacgtgttt tagcttgatg gatcatgact tcgctacggt cactactcca 1380

ccgtgtttct ggaggtatgc aagggaaaat cgagggatgt gctcaaatct gtggcaaccg 1440

gagcaccatt ctaggtaact tccattaact tttgatttag agtatatggt taagctatta 1500

aacgtttcct aaggacaagt gggatagtga tatacttttt tcggcgacat caatccagga 1560

ttatccgcta acagatcgcc tagcgctacc gcatatgatg atatccttag gaagagatcc 1620

accccggcca agaaactcca cactcaatag gcggtgacct atttgtgagt tatgcagatg 1680

tgtttcaaga ctcaacgccg acaaagttca ccaccagaga gtgtaaggct tatcaaattt 1740

ctgattttat cgacttataa atttgacacg tctaacagat tcggcctttg attgtaaaca 1800

tcgccgctat gatattttcg tgatcctttg ggatacgaga tgcatcagta ctggccccga 1860

atatttccat tttaattact gtgtaatgct taggttcaca atcaacaagt agttcgtgaa 1920

aatgttacta taatatccac acaaagattt acgcactcta atggtggacg ttggacctct 1980

gttaacccgc tttcgttatt 2000


<210> 47
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 47
actaaagtcc tggagagtat gcttggcctc gtgcggtaac atttgaacag catgctaggt 60

gctagtagac cctttcttga cagcggaatt tgctgttatt caaaccacct gtcaggccaa 120

ttctggagcg caacccacag tgatagaaga tagtcgttac aatcaaatcc cacaacttga 180

gactagccct cagactgcaa cagtacacag ttatgctgtg gagacaaata aaatacgtta 240

tgtattggtc attagatttg gctttcttat acgtcgtgta gtaatgcttg tgatcggttg 300

ccgacatggt tacgaatagc tgtttattaa tttaaaattc aattctgtcg atttagagga 360

tggataatat ccgctatgta gacatgagtg agttccttat ccttcaattc ccttttttct 420

gttattttgg atctacgaat gaggtattaa gttcgtagca ctcgtccgtt tcgtggaatg 480

acttattcga gatggcttga taaggaattg tacctcaaag gtttcattgt taagaagatg 540

aattttcacg cccatggcat aagcatatga ttacgtccac taggtcatag acacatgata 600

actcgtcgct caaaataatc gaaagaacgt ctatcggcca aattattact ttgatcccaa 660

aggagaaatc atattggggc gcgggacttc atgtgtatta ccatccagca agcatttgat 720

aaaagtaact cctatattat tatgaatagc ggtaagtttc tttgaccaac ctgacaataa 780

caccaagtga ctcactgagc ccgttatcta ctaggtattc gcgaataccg taaaagcttg 840

atgcaggtga caatgagaat tatcattagc gtactgtatg ctcaacctag cctccttgca 900

agatttcgtt ctatctattt tgtattcatt tctttccgcg acatgcattc ttttgctaga 960

tcctgggtcc tgcaatcatt tataagcacg caacttagct taaaagtgtg gagacgagac 1020

gtacaatcac tacttcccat cacttcttct cttataagcg taccgaaaga cctcgtattt 1080

tattaaacaa taacgtgcag ttggcctaac ataattcgat gtctttcagt gttctaggaa 1140

aggtgcggtg tgtctagcaa gcatgtcagc cctacagatt cttaacatac ctatgtgtct 1200

aaatcgagta tactataatg atgtaccata agcccttgcc aaaggatcat attcggacta 1260

gttattgcct tctggatggg gtacttagac taacatttta aacctcttgc gatacgacct 1320

ggtgctaata cactattcct tcttttctca cgcgaacttt cagtatcgta caaaagtatg 1380

ggatttaaac cttttgaagt ttggtcgtga ttatttgttt ttagggcctc ctcgacgcct 1440

caaataggga tttcttcagc actacatatt ttgagccgta tgcgaaccct tcttaggacc 1500

gcggtagttt gttcacgagc acgttggcca caccccaatt atccagaaag ccggacttaa 1560

gacatattga gtttgttagt gcataaatag ggtcgcatat tgatctgcga ctcgagtaaa 1620

tgtcgtactg gtgatatatt ctcccgtttt cgaaggcccc aatcaattac taattaccct 1680

atttacgaat gtcgagagat gttcaaacga aacatgaggg cgcatcccaa cgcccatttt 1740

gaaacttgat tgttgtataa ttcttaattt ttgtagattc agcgttcttg acacatttta 1800

aagacgtcag ttcaccgtac ctaccccttc ggttacgcga aaaagattag gttaacgatt 1860

tctatcgttc gttggttgtt atttctgcag tacattaatt ttataacttg atatatcaaa 1920

tctgtttttg attaatgttt gaaagcaaat cgtaacacca aggaatgcaa ataatcatac 1980

gtggcggacc agctactata 2000


<210> 48
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 48
tacatcccca tcagtcaaga cgattcgtta acaaatatcg ctgactggga gaatcccagc 60

atgtcttggc tggctaaata gaagctacta tgttacgcac ttccattttg aattacaggc 120

gacaacatta ccagacttag ttaattatta aacaagatca ctttgcgaca gtcctctgag 180

gatcagttag agtgcaatca cttaagtaat acaaaaatac agaaggattc tctggcgaac 240

aggtttatta gcgcatggcc aaatttctaa tcaacccctt tagttagtac ccatttctag 300

ccaatatcaa atgtactcca agccggcgta tagttgtcag tgtgtgattt aacgaatagg 360

atcccccccc ataacaaata ctaataagag tggagcaatt atagtttaga tcgtaaaggt 420

ttaaataaat aaacgtcaag cacaattatg gactcgtatg gggacaaatt gagcctacta 480

gcagttctag cgaaataagt tgacctaacc agtccatgga ctgccggttc gttgaagtcg 540

gtccaacgga ttgcagatca ttgctaggca gttggtagat aaatttctag tacttatagt 600

cacgtaattg tcaaaagtcc tacgagcgtg gtcaccgtat tactacgacc tccatagttt 660

tctaccgtgc attctgaaag aaatatggct ggagtgtcct agctcatgat agaaaacgcc 720

tacacttagc caatcagaca ttaatgcggt aacggatcaa gcattacagg gcggattggt 780

cgcatatcat tgcacggaaa gcgttgcctt aagttcggta cattccactt tcaacttcat 840

attgactcaa atagtgggac agtgatttac gcggagtttt aatctaaaaa ttcttgagtt 900

tatgatagaa cagatctaaa ttacggtttt tatatgtagt ggtattaata atgttcataa 960

ccctagatat ttccgagatt agcactcgtt cggcgcattg ccggtataga acaatatgtg 1020

aagaaatttg cacctaagaa gttgatattc tcctctacat gcgtataata tatagtacca 1080

taagtggatc attattaaaa taaatctgag tgggtggact tatcttctgt caccctaact 1140

ggatcagcag tgggctagta gccattaagg aacaaccact tggcccgaaa ctatttgaaa 1200

agtgataaat acatacacga tttactacat aaccactcct cttgttgata ggcatgccca 1260

aggattcgta tgggcgattt tccataaacc tacagggtga ttcgcgcata taaataacac 1320

caaagcagtc aggctttttg tatgaagtgt agcttcccta acagtatgat agttgtgtag 1380

agtcgcttct gaactggctg accctagtta taattagttc ggcggaggat gggccgcgag 1440

acaaagtata ctcgaacctt agggccgcat tccaaaggtt atttagataa aagtacgcaa 1500

acccgcacat gagttgaaat aatgaagtac aatgttattt attgtgcgtg gtaatagtct 1560

cgtgactgaa aatttttacc tttagggttc tctatccgga ggagcgtcat gagctcaaat 1620

acaaaatcgg agcattgact caattactac tttatgacaa attctacgtc taagcgattt 1680

ttctaaatcg ccgtgatcaa caaactagat ctacaccagt gatgcatgct cacggcgaat 1740

gtcctgaagt cagatctaat tcttaagggt tggattagct ggctatagca agccatatta 1800

atatgattag tcgtgtatgg tttacgctac ctctccatag atatttctaa cttacatttg 1860

taaatgtttc caagcatacc gtcagtataa atacccaatg atgtggctct ccttcaagtg 1920

tttagataat agctatttcc ataaggtgcc tcccctatcc gctcatcctc gggtttcata 1980

tgttgtaagt ggcacttaga 2000


<210> 49
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 49
ttgtttcttg gagggttact tacgattatt caatgtcaag ctggtaccaa ataatatgtt 60

aacatcgaca accttgctga ttctttaact gtacgattta ctcaatcctt acaacagtct 120

ttccccccga tgcttccgat aatccggatg gaatgtaaaa gctttaattt agccataatg 180

gagctactct gcaacagtaa ggcaaaattt tcttaaatgg aggccaggca agatttgtcc 240

ccgccagaat agcctactcc acaatattct ctttaaatat tcgccatgct atctcacgca 300

tccatgaaca ggttatgaaa gcgtagagtc aaacgtacac tttaggttag gtgccttgtg 360

gggatttcac gccacaaagt agagtagaag cagtgtatca aactatgtgt aaaagtaatt 420

tcatatagta atagccacca agaatgcgaa cataggtgtc ggcctgaaga tctaaaatta 480

tacttattaa caatcatgtg agtaggttgg attttaacac gttcataagt atcgatcgct 540

tcgcttaaat agaataaagt acacatcatg tgacgacgcg cttcgattat tgtgctgcgt 600

taagagtagt aggataattt ttgatagacc tgtctataac acggtattta atccgaagtt 660

cactatacaa tcataatagg atatcgtgtt ctgtctcgat gatctattcg tcgcttcggg 720

tgcaatatag gattcctata tgaaactcac ttccctgagc attgggattt cttgatagct 780

agatcgcgtt agagtcgggc ggtgtatagt ctcggataca agaacataag agtaattatg 840

tggaaccttt tcatgtgatt gtgctaactg tgtgatattc gcaataattc ctacatctta 900

gtttttagac tggacttttt tttcccaagc tctaagcata cattattcgc tgcgtatgtc 960

actgacctag aggaataagt gttctgctgt caaaactaac tctctctagc agcctttttg 1020

accatattat caattacgcg ccatcccata ataacttcaa aatttgcaac catcggaatt 1080

agaaatcccg acgtaatcaa gacgaatctt cgccgattat cgagcttaca taatcgaagg 1140

tgcatttctg aaccttggct acgctaaccc tctagtcggg gcaagatgac ttggttatct 1200

ggttaactag gaactcctag cctcatattg tatcaatctg atctaataca gcgtctacca 1260

attatttgat taggtttgct tgccctcata gcatcgcagc gagtatctca caatgtgtat 1320

gggtattctt ctagttacga gtttagacgg agaataagcc gcttgtggtt aacctctgta 1380

aatacctcta gttgaataag tgtgcaaccc aattcacatt cgtcatgtta acaaatcggc 1440

aatctttcca ctaatgagaa aaaacaaatc attaatatat gtgaaagtaa ttattgtgtc 1500

ctcataacgg taaagactta cgagtaggta acaatctcaa cttcaccaat taccacctag 1560

attccagcac cgccaacgta atcagtgttc cgtgcgtctt acacaagaga actccttaag 1620

cggctagcgt atacttttaa gagcagtggg tatgtggccc ggggcatcta ttgtttaccg 1680

taatataagc gcactagtct atttttacac taaatatcat tccatatccg gttctttcag 1740

taacaaaagt aaacacagtg ttttggaagc agtgtatcaa gaattgtgaa cttctttcac 1800

cggcgcaggg atccactgtc tagagagaat cttaattcta tcaaccgacc ctccatgtct 1860

tatagattgt gtcaacggag cacctaaccg tatccttaaa aatttagagg aaatagaact 1920

ctcattcttc agcctgttaa gccaattaaa tcgaaaccgt tgctattagg tgtaacggta 1980

gatgtgataa aagggtcaca 2000


<210> 50
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 50
aggacgagct ctaggggtgc ccctgctgtt gttggttatt taaaagccgc gatgaagaga 60

acgctagggg gaaaaaacga tttgcctaga atagtggatc ggcgttttga tgtaagtgta 120

attgggtaga aggacttgtt ttacatttgc gaaatcttgc tcggggacgt tataatatgg 180

ccttgaaatg gatgatgaca atatagtttt aatgttatta taattagagt atcgtattat 240

taaaaaggat gtccactgtg gatccaagtt aagcattagg cgcgttgaag agattgtacc 300

gcccgaacca atgcaattga catgcctaac tagcaagaca aacgtgttaa gactaaagtc 360

cctcctatca acgtacacct catacgcttg actaggtaga atactaaaat actctcgtaa 420

tgaataccta ttatctaagt gactgctgcg ttcttttagg tggtgaactg gctccggaaa 480

gtgtgctaat agtctatatg tccgcgcctg ccacgtaacc acgaggcgga tcagctagaa 540

acataaagcc gtttgagcaa taagtgacta tacttaacgg tctgtaaatt cgcgcttcaa 600

tacctcttac tctctgcgtt ctatcccgtc tttttataaa ttcaactata cgctccattg 660

gttatcgcca tatgagtcct tatctactta aactggctac caattccttg ctctaagcta 720

atgaaagtcc attcgcagga ttacaacatc aatgctaact ttctcttgca tacagtatat 780

cgtctaataa atgtataggc tcccggaggt cggaacagca gtactcccgg ccacgtatcc 840

cgaatacaaa ccttattagt aaaggaaaca ctagtgagag cgtacgggga ttactcgaaa 900

tatcgcagga aggtggttaa tatgccaagg aaatacgaat aattctctcc gcattccgaa 960

actgttagca catagacaag acaaagagtt tactgacaca tcttttgaca acccgcactc 1020

tacaacgacc tactctttat acaagtacgg attattgtaa cgctccagcc tagagagagt 1080

aacccggagt tatatggagt cgcttgagga gaaatattaa agctgaattc tgttacgact 1140

agtaacatta ccagccgagg tctgaataac gtgcctatgg cgatcaggac aatacgagag 1200

aatttcttct accacactat gtgcagcagc tcactcaaga gtcctatgta gactgtttaa 1260

ccagtaagga ttgttgtgcg gaagtgtaat atggtcgaga aataccgcta atatggataa 1320

gttaattgaa cttcggacgt cacattctcc tataatgagg atctattcaa atcgttttga 1380

agtaacctcc tcatttgagt aaactaggct tgcctggaga tggggccccc aactgtaatg 1440

tgttatgttt agtttgaact cagttggctc aaagtatccc gcagtactaa tattaaatct 1500

tgttattgta cagctggcga agaaagttaa gaaatgtgac tcctatacta ttactggatt 1560

tacaaagtaa gcgtctttga cattaattat ggtattgaca aatcaaatga gagacagtaa 1620

gatgatgaca ttcgctcata ttgtatggct cgttgactga tgcaaatagt accaaaccct 1680

ttttttagaa ttccagatga ggaattagat ttttcagtca atagttactt gttatgccac 1740

gtaggcttat gtcccctaaa tcgcatataa taagatagag tgcgaatgcg tgcacgtgta 1800

cactaatcag ggcaaactaa acatttaacc tttggagaaa ttccgtggcg ctgaacttag 1860

tgatgatata tgattaaggg atccgttttg ttttcgataa tctaagaact gacgaaggca 1920

ctaatatcgg agttacacag gaaatagaat gtcgcaagat gtgccttagg agtcagaaat 1980

caacgagtgt tgatcccaca 2000


<210> 51
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 51
acaacgactt tcgaaggtgg ctgaagaaaa ccacatgata aaatcgcgag tatggtaaaa 60

ttagctacct gagtatattt aatcgaggtt atatcttttg tgagtcggac acaaattcta 120

tatttgacgg agcatagggc agacggacat ataaaattat aaacagtctg tacggcgggg 180

cctccaattg gattcccgcg atcatatcag tcagttggga accataaatt gcgaaactca 240

gtactatgct tcaatgcccc tttctaacac gtttatcgct tcaacctaac ggtatttgca 300

ctccgactat cgtcttatgc ctcacaatca gatgtaataa tgcgggattt ataaagattt 360

tgaaccattg gacaactgac ggcttctcat ctcaccttga cgagagtatt tcctattaac 420

ctgaatttcg ctaaatactt atctttatcg ccaataattc ctttatgata cacagggctt 480

ctccaattca tccacgcaga aactgcccaa atgaggagaa taaaaaactt tataattaaa 540

tgaattttat agcctatgcg tatcccccta cttcaaatct gtgcagtgat gataaactat 600

tgtaatgaag atcatttaat tcgcgagatt aaacagattc atgttctaat gcgattattc 660

tggtgtgata tcgtgcatgg ataatagaaa gctgatccat ttagaaacca agcttatgcc 720

tatccgcacc tttaacacac gcatagatta gcgctctgcg cgaatcctgc gcgttgcaac 780

tgtactgata caatgcgcac caaaacaact tatactctag caatgtacac acatattgcg 840

agccaatctg ttcagtttcc ctttgatatt tcaggataat cagatggacg ccaaatagat 900

tactcttata ctgaggaaaa tatgaagttc aggttcagcg ttacacgcaa atcagcgatt 960

aggtctgcct aatatgattt acgtaaataa atctaccaac tagaaatccg gatattttac 1020

aataatcatg gcaacgggta tgaccactgg gttcgatcca tatacctgat gggctcggca 1080

aaagtctgta agaattctct acatcccgat cgatgcttct ttatttattt tacttcataa 1140

actcgtattt aagctatgca ttgccaacag ggcttaaata agaaaaagtg ttgcacacag 1200

aagttgctat gccgcaatgg aaagagtact ttcatgaaaa tacgtagata tttaggagct 1260

ttcatttagt aggtcatctg gttgaccata tactaatcgg atacttgcga attattgtcc 1320

tttcagcagt gaatcctgag actgataagc cagcaggcgg gaatcgtatt agtaaaattt 1380

aaggacatct gagtacgggc gaaatctaca acacgacgaa atcatcaatc tattatgaca 1440

taagtattgg acagtacgtc tgactgggaa acatagcttt atgttggata tgtacattag 1500

tgcaaatctg tgttacgtgt taaatcatcg cgttctagaa ctcttaatca catagcgagc 1560

taccttggcg aacactcgtt actgttctcg ttttgctatc atgtcctaaa agcggcaaaa 1620

gttattactg caggaccgaa aaatatgaaa aacttatttt ttcatgggac tacacaaatc 1680

gagttgagcc tttaagcggt tctatgttac ttgagtatct tgaacttgga ggggggttat 1740

aatgataata gcaatacata ggttatgata aactgtcctg ttttagatac acgggagcct 1800

tagtaggctt attttaatag tgtagttgtt gatatgaata atatagaaag gccatggagg 1860

agaagtgcta tgttaagagg gcagtcgcgg tcacgtgtgc cattgacgct cacttatatg 1920

ctgcgttttc gcagtgtctc aaagattaaa ttagccatat ggtgtctatt gttttcgtaa 1980

acgcctagca tgcgttcgtc 2000


<210> 52
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 52
cttgtgcgtc gaaatcgaaa ctcaaatagt atgtacgctg aaaataataa agcctagcta 60

acaatccatc cgcgtttaga tcgtaattca cattttaccg ataaaaagtt aagtacaaca 120

ttggaattgt tattacttag ccagccaata acgcgtccta attaccaaaa aaaacagact 180

ctgaatcatg gtagattaat tgggtatcga taacattatc caaattcagg gggccattcg 240

cttaagaaaa gagatgttaa cgtactccag cgatctgcgg tgttctgact gtaaaaatac 300

gcatacattt cacccatagc agaagacgta ggacgtcttt tctaccaggt gtctgtatta 360

cataccccat gcatatctaa aaggattctg gacgtatttt gatttttacc agttgagata 420

gtgtcaaatt ctgactttca aatgacaatc gcaaaaatgt atgcgaaggc tgatgatctt 480

gtaatcaata ctggtgctag tcacatactg ttgtagatac gccagattta cactatacac 540

agtgaacaag gtcatgtcaa taacaactat ttttgtttat aatcactaac cctgcatatg 600

agggtcttga tccaagttcg aatggttgag aattccgagt ttattggtaa gggaagatgt 660

atcaaatata atccttgctt acttcccaac agtcacaaga agcagagtta acgactgatt 720

acggctggac caataaatat tgaaacatcg caataaaact tgaagaaatt tgactacaaa 780

gtttaagtgt atacagtaga tcggttaggg tatactcaat tagggcggaa cccgcattcc 840

tgtcgataag ctagtagtag gtggttttca ggttggtatc aaccatcaat attcgacata 900

cattaatcca gtgaataggg gcgtccggat tttgtaaagc attaaccttc tgtataaata 960

ctgccaatca tatggcttga gtaaccgttt ttgtcagtgg aatcgtcccc tcgctagaag 1020

catctgtacg atatctaatg gctgtagttg ccttaaatcg gaaaggtaag tcggaacctg 1080

ggctctcatt cgaataagac caatcctaaa cggcgaattc ctttatcttg ttaactgctg 1140

tgtcaagtcc tcttatcgaa aattcttaca tgtttactct tgcgattaac tatggtgaac 1200

taatcccaac aatgactgtt cgtaatagat gtgtttgtaa aattagtatt ttggtgacat 1260

ctctagtcat ttcatgcctt catagatcat cggtatttcg caataatctg ctcatactat 1320

gtacagaaat accactacct tctgacaccc ttgctagcac tctggaacta aataactcat 1380

agacgaaaat acaatgcaaa gctcatcttc ttttgaatat tgagcgaagt agattgttga 1440

cgttaagaaa tgagtagttt cattcgagaa catccgtaat caactacaat tataatctca 1500

caagatcggt ctattaaatc gctcatactc ctaggactag aaccaacgat cgaatttgtg 1560

ctttgggctt aggtaaagac gtataatcct acctagaagt tatccattta tccacttgat 1620

aacatatgtc tattccccaa tcataataag acgtagaaga aaacgactct cacaacgaca 1680

gtatgcccta atatgcgatg gcgactgaaa atcttacggc gcccgcctca atcacgttca 1740

cgtgacccag cacattagat ccaggactga ctcaagatca ttactcggcg atcaacgcac 1800

tatcctcaat tggctatgtg cgaactcctc gtataggata aggatattcc ggtctccgta 1860

tacgctaggc tcagtaacgc gtcttactct gggtcaaggg tttaaagatc atagcggtat 1920

catacaaaaa atcatatggc ctactttgtc gttttaagcg aagatcaacg acgtaatagc 1980

taacttaatg agcaagattt 2000


<210> 53
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 53
tcgataggac agataagtga ccgcttgttg agtcttatat gtattggact taacatcgag 60

caacagtctg taacatatgt cactacgtga ttgaaggccg tcgtcagtaa ttaaggataa 120

ggcggtaaga cataagatac cgtacaagga tatttatcgt tatctcaagg tcaaatctaa 180

ctataggtaa caattacctt ctactagtag gggaattccg ttggatagct agtaaaagat 240

tgcttcaact aatccaacaa agtattacat caaaacagat tggttatcaa gattggagct 300

tcagaactag agtggtgagc aaagcactct catgcctttt gtaagaaccg ggaatgaacc 360

gcaagaatca cttgacaaag gtattgggtg gttatgttgc cgggaagcta cgattatatc 420

caataggcta cggtcgttgt acaaccggtt gtctatctgg tacttggttg atgacctagg 480

tgcgagccat tctgccaaat ttatatggag attaagagtg gtctttgcct gatgaaaggg 540

ccaactgccg aagtactttg gagcagtgtt gactgcagct ccaaacatct tgtattttaa 600

tatttcggaa tagacatcta tcgttagtga ggaaagaatt tgatcccgcg ctattttccc 660

gacattctca acacttggat tacttaactc atagaatttt ctacctatta tattataaca 720

aaaaggtcag tattggtcct gacgtatctg attcacgtat tacggggcgg ggtggaaaaa 780

cttggtttcc tagagcctta gacgagcgtt aatatacaac aaactagttt cacataatat 840

tacgtatgga gtagactcaa acaatggatc gcggcgacgt ggatggtatt atcgcatgat 900

gcaattctaa cgatgaattt gtgtccgcgc tgttgtcgtt ttaacaacga ttttgaggtt 960

atgatagtta taatcattag aacatgtccg aaattcaagt ggttcacctt agctttgtca 1020

attttgtcac acttcaggga gggtccagga ggaactgcaa tcgtcagtct gaatcgttcg 1080

agcagtagaa atgacctaat ttgctcgtga cgtactgacg ataccaaatc aatgattgag 1140

ttcgaggatc tgatgtttgg agcttgcgtt ggacgatctg atactcaaaa gtcgacactc 1200

aacatttttt gccacgacag atattctcca gacttaagaa atccttgctg aatatcaaac 1260

atgcagctta gattagttat tatgtaaatt gtgagatact atgctaactc gatagtgagg 1320

tgttggtctg acaccgtgaa ttaataggtc gtccttaaca agtaccactt agattcctcg 1380

cttttgagtc tttgacgcct ttggccggat gcatgtataa atccttttca aaaggctgtt 1440

cattcccatc caagttctgt aataggtcta tctttacttc tggtaacaag agggagttgg 1500

gttacgacga gtaattgttg tagcaaggat aaactgctat ttttgattaa cagcctcaca 1560

tataatacgg gcagccaagt cagcctgccg gcaaatttag cagtgtttct gctcgccaat 1620

gtctcgagac tcctagctct ctcgtccatt gctgactaga actagccaat tcggcgagca 1680

ttagagtgct aaaaaaatcg gtacaggagc ctaagggtat ccgggcagaa gcaagtggtg 1740

ccaaagacag ttagtttatg agcttacgtc caatgataga atttgcaaac ggtatggtta 1800

ccttcttttc tgtatcttct caatgtaata tgttaatgaa cacattgtta atgtggtttc 1860

atatagtaaa gtagaaaact agccgacaac caaagtaaga ggagcagttt tagaatcaaa 1920

tacaccaact taaaaatttg catctatgtt tttgacaatt gacatacgac ataataaaag 1980

taggatagtt gtagatcgtc 2000


<210> 54
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 54
acaacaatcc agaattaaag agtcaatgat taaagtctct ataattcttg gtggttaagg 60

tgcaactttt gtcaagccaa tgcttctcta gcttacgaaa ggaactagta ttacaatttg 120

ttaccgcata tactaatgat caaacattgt acaggtacgg ttaataggcg cactagtaac 180

accgtcaatt attatcctcg tccgacctga gaaaggatga tagatcgtgc atagagggac 240

ttgtggaacg aagaacattt cctacgcagc tacaaaagat atattgcacc agggacgtca 300

cactaaagat gtatactaca gcattgtttc tcataacctc taggtaggtc tgtagattca 360

gcgtatatcg actacctaca tctcgtctga tattcatcta tcgccttaaa attgtgtaaa 420

ataatctgag gtcatcaatg gttttgtttt tacattatgt aaggtccgta atggtaactt 480

gtgaaccgac atagttcccc gtcgcttagg tgtgcagata attagatcca atggatcaat 540

tctcggagat agtcttctac ggcattctat ctgtacacgt attggtacgg gggtcgtagg 600

cagggagaca tctacaaaag ttagcggttg ctgaattatt aatatacagc tttacgctta 660

tacggttgac tacaaaaaaa ttacaagatt cttcatgaga ttgtacctgt caacttaatt 720

cgtatcaaaa attctaaagt gcgcatctaa cttcatacaa cggagaaaag tacatataag 780

tagggtgtga acgcagataa cgttcaaaat gatttaaact atgattgaga tgtccaagtt 840

aaggacggta gggttgctac cgtggactat aaaccctaat gcctaaatct ttatattcgg 900

gaattgtttc gggttagggg gaatacgcac gaggctaaca caatatgcat agtgcgtatc 960

attagcgtat ggaggacgaa aagagatata cccaattata gcctgaatgt cttaatcaga 1020

cccttatcgt catctcattt ttgactacaa tcggtaataa ctactcgggt ttactagatc 1080

ctaacgggat gactcataat agaacgaata gtgtaaaagc aacctacgcg taagaccttc 1140

ccggtcatga ggatgtcatc ctatgcaagc gttcctcccg cgaacgccac gtgatctctc 1200

gattccattc tataggattc attaaagctc tactattacc ccaattgctg ggtgttctaa 1260

gatctataat gttattgtcc agattaagtt ctcctgcact actcgcgatt gtgtctttcg 1320

cccgcttgtc cccccgtaat tggatcgggc cttcgcgttc tgctaatatt tgttacgtca 1380

cgtcggataa cccctacttg tgcaacatcc tgacgaatgt tgtaaaaagt ttttctttgg 1440

aaatttgtac agttaaaaga caagataata tgattggatg gcaagtgact gtaaagttct 1500

atccagtgtt tcgtatacga ttaatgaaac taaacgagaa actttgctga cctccaccca 1560

agatagcctt cactctttca ctaactccac ggtgaatttt ttttagtaat tttcataaag 1620

gcaaagacta agtttaccta gtaacgccaa tccccccacc atagtacact gtgattcgaa 1680

aaaaggatat ttttgagctt ctatgcttta gggatattta gtttaacgga aagcaccgtc 1740

agcttggaat attaaacacg cacatgattt atggacccat agttgacatc aaggtctttg 1800

ataccgacgg ttttcgtatt ttccagtgaa agccgaagct ttacaaagga gagagtaatt 1860

gagcaaattt ctcactgcat gtcacaggga ctgataaatt agtccaaaaa ctttattacg 1920

tttgacctta gaggtaccct aatgcggctt attatttgga ggccagacta ttgcgcgtaa 1980

caggctgttt gagcatcggt 2000


<210> 55
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 55
ctcctcgagc ttatagaaaa gtcaacgaat gtgtagaacc aagaaagtga ccagctatca 60

aataaataac aagtgagagg tacagcgtat ctaataggcg aaagtctagc tccaggtatc 120

ggtgaagtct aactatgaat taaacgcatt gcgtagctac atggttttac acgcaccatt 180

aacaggcgca taactactgc ctgaatcgct ctgatattaa agtcaaagga agctaaagac 240

ttgctatatc gttgcatggt gttaagtaaa tacgactcga gtattttaaa aaatcctctg 300

aatcgaccaa ctatttattc gttcattctc tgtcattgag tagcgctaat caatgtagta 360

tttggatcaa taaccctctg ggttaggcga ctacatgagt acccttggaa aaactctggt 420

cgagcaaaac aagacacatg gggttaaata aagtctatac agtttataat tatgcaaatt 480

tgacgaattt tgtacagaat tttatctata atcttacggg ggtatacata tgacagcttt 540

ccggtgttac aatactcctt gtgctttgta cacttggcgg aaaattcacc acaatgtatg 600

gggttccgcg caagctctct ttttcggtaa tctgggattc cttttttgtg cccttttaca 660

taacaagacg aattggtctc ctttttactc agaaagaatt ataatacttt tcttacttgt 720

ccgtttcccc tcatcttttt ttacctccaa atccgattca tcgccttaag tccagtgtct 780

tccaatgtag tggtttaacg cgagctacat aaccatcccg gatgtatacg attctacagc 840

gtcttgaaaa tattatgttt aggtttcggg tgaaacgcac ctagaaatta tagcaataat 900

aatcttaaat ctcctcatca taatagatag gttattgata ggcgacatga aacccagcgg 960

attcacctat caccaatcaa accacagttc cttttgatgc agtcattcct acaggcatcc 1020

tattaacaaa caagcgtgtg ccgatgaaga attcgtatct gttaagcatc cgacggcaca 1080

tgtgcaagag tcgatctcct gataccaatt ttagtacttc tcctctgatt aaaacaactt 1140

ccaaagttcc aacagatgga gtatagataa tcaagtttcc agaattaatc agtaatttga 1200

caagtggaag cgctagagga ctattcccgg taatactata acaagtaata gtgaccttgt 1260

gtataaatag acgttgatag atatatatac acttcttgat agctgaggta gacgttgata 1320

caacccgcaa gtgagtccat taccttaggc cctacgaaca tgctcaaacc cttttatgct 1380

ttcccagact caaaatcaat acgtagatat attgtaaccg tatagaaaag agcttctgtt 1440

ggatacagtg gtataacagc tcatgttcaa ggtttatacg gtatgacaaa tgtgattttc 1500

ttttatgtga gataaccgaa ccaatttcga aagattacta ctagttgaaa taccaatttt 1560

aaaggtatcc tttccattag accccttata ttattctact gtattagcaa attttagaaa 1620

gttcgtgtgg tactcaaatc cgatgaaact attcaccgtg accattaaat aagtttgatg 1680

atcaccgaga attcacacct cgtaaataac acctatctta atagaattcg tgcgcagctc 1740

taagagagag catcttccaa aacgaagagc tgtttacaat tgctgccacg tctttgatat 1800

acactctttt attgtccaat ccgatgtttc acaataggat ccatggttcc ggttacttcc 1860

tagctaaaag ggtttgccca cgcggtgagg gaagtctgtc ggtatattag acgtagtgtt 1920

cacgaataag taagattttt aatttggaat ggtttgcaac aattacataa ggataagtaa 1980

acgcgccgta taatgctcta 2000


<210> 56
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 56
attcttaaag tcgattcggt gtcataatag ggttatctaa catatgtaca aacgccctat 60

aaagttatta tcggactggt gcataagtaa cagttcgcta taaagttaaa tgctatcaag 120

agaaataagg catactgtga tgaaaacgag gtcgtacaga aacacctgca ggaattaatc 180

tgccgtatca tacaaggaat atcgttggag tcaagatgac tgcccatttg cagttgtcat 240

cttaactgat gatggtttct tgcttgatag cacccgcctc agtaaaaaca gatggaacac 300

tccaatgcta gccaactgaa atttaacgtt agtaccaaag gcatccaagc agtcccctgg 360

ctaagttgga gtgtggcatc gatataaaat agttaaaaaa acggtctgat gtttcatgca 420

gtcgcaacca cgcatacggt tccggttcgc aacgattgat gtggcggtct cagtatttta 480

caagttttaa catgtcggca gccgctaggt agatacctgc accctgtggt ttcgtatata 540

gggaatttcg gtgctttaag ataaggatta ctcatagggg atattactcg attgcctcga 600

aaaatgcgat gagtctctat attcaacggt ctattacagg ctttctattt tctcgggacg 660

cctaggagtt gaatgatgca catcattaag ctacttatgc ggtcttccat accattccaa 720

tgtcgtcgaa agaggatgca gtgacaactc aggatactaa taattccttg agaactgtct 780

atttcaagcc tattctaaca taattagttg ctagccatat aagaaaatat catcaaacag 840

atagggttga taacagaggg tgctgcccgt atagtgaaca tcgtaaccgg gtttcacatc 900

ctagattggt ggcctcctac tatgtaagat gtagttatac tgaatgtggt gttgtgatca 960

agacgtagga aaatttatca gatatgccaa ctagtatcat cctgagttat aaagggggta 1020

atttcggaca aaggtgttgt ttcaaaaggt tcaagccgac gtacccgcac atcaacttat 1080

cttgtaatga ttcaaggttt atgtagcttg atcaccaagc aacccaagcg agctgtacca 1140

gatacgatta tgttaataaa ggtttggcgt actagactta acgctaaggt ttcgtaatgt 1200

aacgcctgca ttcacgtcaa taatagctca gtatgtgaga agtccgatgc tgttaattct 1260

aataacgctc ccacttgaag gagaaagcgg gagtaggtgc gtttgttcag aaaccactta 1320

agcggtttgt ttgtacgtac aaaatttgct tttagatgta tagttgtata cataaccatc 1380

gtccgaaagt aaccttcata tgaaactcaa aggcattagt tgggaagcag tatgtggcgt 1440

ttgtgacaca tcgggattat aaaattccaa tatatattct aagtagcagt taaatgaact 1500

ccactatggt taaatacttg tacctatcgt tattcgcaat tgtgccactt ttacatagat 1560

tgtgaaccgg tatatcgcgt ggtcaagacc aggcttcaaa gctgtagaga actgtttatt 1620

ctttgagtga catagtatcg agacttgtat aaacatggat ggtacacaac gttggaaaag 1680

ccgaaagcca ataagatatt taagcattat gcttttatgt caacactgac tttctaaacc 1740

acacacctta aatcagtaga acagcatttt gaaggagtgg ctaaaccatg ttgcgtgcaa 1800

ttctccgggc tcgtaaaaac gtgtcgtgct aaaggctcta aatctcgcag taaaggaggc 1860

cctccaaact aacttaactc attttgacga actcaagtag cttctattaa attcgtccga 1920

ataccatgaa gaacgggatt cgcatactgc gttcgccgta gtggagctcg ttacaaatca 1980

aatggatcga taaacaaacg 2000


<210> 57
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 57
ttagtatagt taagataatg cgtcgctaaa caacataaag attctttacc gatgagttct 60

cgctggtatt cgctttttta gtcttactcg ctcaagttat cttgagagat gtggaactga 120

accacttgag gtagccccat caattataag gaaattgaaa taggatcgaa atattctgaa 180

ctatttccat ctagtctact gaaattaaca ttgacacctt tcacaaacga atggcaaaaa 240

aggacggatc catccccaca gacaacttcg tttatttcag cacatttgtc cctggacaac 300

agccgtatgt ggttcgacat actacctgat agtgagcggt tatcgaaatg tccttgacta 360

gctactaaga ggctttatac aatattccta cacacataga cccagtagat atgagttcta 420

gttggagatt tttcaacaca attacgccac gaggtccgac aacgtatcct ccacagttag 480

gaacatttat tacaaggagg ttagctccgt gctacagcaa cacgaattac tccaccgtgt 540

tgagcaggta aacgagggca aaatacaccc caaagcgtaa ctgcatacga ctttccgctc 600

gaagattgtt aaaacaagac tgcaatttct gtggcaaaag acactaaaga tgacagtaca 660

gcacccatgg agagtttgta cccggttcga cctaagtatc tgttgtccag aatcgtgaaa 720

tttgaagtgg cctaaaagct gagacgagta tagtagggtg gaggtttcct atatgttggt 780

cggtcagtaa atatttaaac cacgggagtt aaacttatct taaatgtatc tatacattag 840

tatataggct gagattcgat atatatagac gccaccccga gaaatagaaa gatagtgatt 900

caaattccta acagttcgga gtggtatacg catttctgag taatttggcg tacaaagttt 960

gagtagagca cagagttgat aactagagca atgtctgaga gtggattaac ttggtgtgct 1020

ctgctagaaa tccccagtga tgatctctca taaaaagtga ctgcaagact aggatacaat 1080

ttattatcga agtatcaaga tcgtgggttc cttttttcct ggtcaaagat gaatctgtct 1140

tacttaacga aacacaggaa cttttcttgc ataggcaccg atcttgctat gtattgaagc 1200

tacttcaaag gacctatcag cgggtgtaca caatgtcgga acatgcataa atggcagaag 1260

gcgatgagtc atttcgcaca ccaacaggcc gacgagcgta ggagcgactc agaacactac 1320

caactatagc ataacgataa acggagaacg tccatgccgt tatgtgacca ttcggttcgg 1380

agtcgtgggt taccgaccac gatagaacat ggcacactgc tttctcactt ccccaataag 1440

aaacaccctg gacgtatacc tcgattggat ctggagacag tactcggatc cacacctaag 1500

tagtacctca ctgtgggcga tggccaagac gcgaggttga ctatctgcgt ggtggaaaag 1560

gccgacagat ctttatcaat tgtagtgagc tgatgagtcc tttatccgtt ataagctact 1620

tttattgggt aatagatggt gctcttactc cttcgagtta atatatagaa atcaccgcaa 1680

agttaaacgc aacatgagtg gtttggatta acaacttctg gaatcattat aaccttagga 1740

gcgttctagt gatgctgaaa ttgagacagt aaaaagtgcc catgatgtag gaaagtcact 1800

ataaagtgaa tctcttgtcc ttaaacataa agcgcggtaa acactcacgt taagatggtt 1860

gtggccacaa catgactctt gtggttcttg acgtgttaac gcggtggcac tagcagggat 1920

gatacaagtt gatgcttacc catatgatta ttgttccccg gagccaccac taagccacta 1980

aatgaagatt tttgcggcga 2000


<210> 58
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 58
gatgttctga agttccttag cgtacaaaca caaaacgtgc attggaaaat ggagagggaa 60

ccctctatgt ctgatgattt tttcggttga gctaattcca gtgcaatcga caataagggc 120

atgtccgaaa ttcgcttttt aatggtagta ggtccggcat cattatgttg tcggcctaaa 180

taccataatc attgctcaac cttcaactct ttgctggaac aattagtact tttcgtttgc 240

gcttaaccat gcgtataatg taataaaagc accagtttat agatatcgga aaatttagag 300

ttcatgccat agtttgaacc gacggtaggt acctataacg tcttttgatt tccgcaacct 360

atgtattgta agcagttgtc ctaaggagta ttttcactgt ctaagtggta accagcggcg 420

agaacatagt cggcggaacg gttctgattt cgactagcat cggcgacatt gccttgtcaa 480

tctccataat gatataaaca tggtctttta actctcacaa cctaaattat taacaggtcg 540

atacttctct ggcgaggttg ttttaaaact tccactccgg ataggaattt cattgaaaat 600

ataaaaggtt gatgtgtcaa tcgaagtcta aaaagaatga agattagtgt cgcctaggac 660

atctatttgt tttaaagtgc aaggaacgtg ttcacgtaga attgtgaaat tggatacatg 720

tttagtgtca tgcattgttt atgggattga ctataactta gatagagaac tagttaccct 780

tattactttg cagtatatga acgactgatt gtcaagactg agcctaaatt aaagtaatca 840

gcacattttg gatatggata ggagctcagt ttctggtttc actctcatcg acttctttgt 900

ccaaatacgg caatcacgta atgcataaaa attcaaacat aatgtgatga aagaacatat 960

cacccgtcta aaaaattaaa tatatactat agtgctgcaa tacatcctta aattgtccta 1020

tattggtaag tcaaacgata caacctgcat tcttggggga taactgatgt ttactggacg 1080

gcggaaatac tttaatttat aggctactcc agtgcatagt aagaatcata atttggtagc 1140

gcctagtaaa aagaaatcct caaaaactaa acgctattct gatcgctatc atcaagaaat 1200

gaattgtaag tgagggctgt attctaactc atcctagcag gatttattgc ctgcatcatc 1260

gacattctgt tcgaagcggt gatccccatt tggacaaatt caaggtttgg attatctagc 1320

gcccttggag tctctttacg tgtttaggtg ttcctgtagg aaaatcatct tattgtcgcg 1380

aatagaaggt acaaaaagac ctcaaagtta ccatatgcac catggagatg aaacggtaaa 1440

agtaactggg accaaagctg tccttccggg attcattatt accataatca ttaggcatca 1500

ataatattct gtgcgatatg ttgctcggct tattaacctc aatgaaacaa tatgaccgca 1560

tatcgctaca gtaaatctac gacgttttta ctgattgatt gaatcgcact ttttaataat 1620

tgtatgcccc gatacataaa atgtcataat cgagaagcat atagtagtat tgtagtatcc 1680

tcaggatcgg ttggtagctt taatacgtgt aaatttttct cgtaattatc gagagtgtgg 1740

agacgtccgt gtactggatt cgtaagaatt caataccctg atgtccgtcc gagtagatcg 1800

ataaagtaag tagggatatt cagatattta atgtatttcc tgtacactgt gacatctctg 1860

caacgagatt gttatactgg cggcgcgtag gaaaaattca accagtctgt ttgcagggat 1920

agttaaaatt cattagagac cagagcaaat aatgagcatc cgaaatgtat ccaaagcgat 1980

atacgcgctt acaaactctg 2000


<210> 59
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 59
ttgatgtgcg aatataacat tgatcatcag aggcaaggtg ataggtatta aaacgttagc 60

gtccacgctc ctggttctat aaaacttctt tagatgctgc taagtccatt gatttactgt 120

tttatagata cgagagtaaa tatagtttaa attttttaag tttgaaatac gtgtagctat 180

cgttgcgcta aggagagttg tctatgtact agtgatttca gtcggaaata gcagaaacat 240

gaacctatca catgactgtc gaatggaaaa tttggagtct ggaacattca gtatgagata 300

tacattaatc catgactcag aggaattgac ccactaatgt tattcttagt tgcaattcca 360

ggtatgtcta gaatttgcaa tcggttagcc gttgtgtact tcgtatcaat tttcaaacag 420

aatacaaaac cacgctagtt agccgaaatt actcctaatt gtcgtcacta tgtaagagat 480

ttagaaaaaa tagtatttgg tactactaag ataatcgctg tccactataa acttgtaggt 540

agttagtcga gtgttctgca agggtacatt catggaattc gcgagcaacg ttcgcttctc 600

cccaaatatt gatataaaga cgatccattc tatgtatttt cgcactagta aaatacctat 660

ctactcgact tacgctatag ctcagggatc tatttgtagg catccacagc tcagacgaaa 720

taatagattt acgaactgat agcggccctc catgcctgct aatcatgttc atacatccaa 780

acaaatcgtt ttgttggtag acaacaacat agcgataatt tcaactggtt gaaatggttg 840

tatagctgaa tataaacgat cccaaaaaat tcaagatggt ggctgcaccg gaacgacgtt 900

aatagcgtga ggaggtgtta aaagcaacaa aatcacaccc gccgtcttct agggtaagcg 960

ggtgccagcc gggtctactg gataagtaga tatttagcaa agaacctcag ttatccattt 1020

tctggttacg tgcacaatta gttttgcatc tgccggcttt tgtctctggc acttgacaaa 1080

cctagcaaaa ctcaactgag gggttaacac gctctaagat tcctcttact agatgaggta 1140

ttcatctgcg tatctgattc tacgttatag gctttttctc tcgaatacta atgtctggac 1200

tgatcaataa gaattggcta attgcggaag tcaaaataga accaattata ttcatacttc 1260

tattattagt tctaggatga ttttcccgac catcggtagt aggaggaggt gatgtaactc 1320

agtagtatta tgctgagtga ttgcacctct gattctatta atatgggggg atgctgcttg 1380

cctcgtgggt tagtgtccgg atgaaaaccc ccctaaccta ttcacgtata gtatcccagt 1440

caattgagtc agtgacctta atcctaacaa aaaatacaga atgctgtgaa tgacctcgtt 1500

cttcttattg tgcacgatct gattcgaaaa tgaacggtat agagtctgag catcacgata 1560

taagagattc attctgtatt atttacgaaa ggcgtagcac cattcgatca gcgagcagaa 1620

ccacggggca gtattgaatt tccgtttttc cgatttcaaa acggctagaa atggctgctg 1680

gatgatagat gcccaactca cacggttgaa cttgcttatc aattgtgcgg ttcatatcag 1740

acatagcagt ctgcttggaa gatattgagt aacttcagca ttcaaacgcg caaagctatt 1800

gagttgcccc tgatgctgtc tatcgtgtat taagtgatcg tgggaattag acatacaact 1860

ttacctcttc tagcttgttt atagagcctc accgaggtat aaatcattaa ttacccagga 1920

gaccggtttt gctattacct tgtaatgttc aaaaaagaag tggaacacag tgaaagcctc 1980

atttctcaag caagtgagta 2000


<210> 60
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 60
tgtagacatt tgtcttcaat ctaacctctt tctcacgaaa taagggcttg tattgttcct 60

tcgtttgttt accgcacaga aacagcttca cttaacatac attgtaagtg tgtatttctc 120

ggggtacgta acataacgaa acttaaagca atcagacata cagtgccatt ccctacggta 180

ctgtctcagt atgttaatac tactcatttg caaaaggatg tacgcacttc atactacagc 240

tgctgacggt gtatatcaaa caattatatt aacgctcgta ggatagttca cgtccgccat 300

atctttgatt taggcttcaa aattcagaat aatacgaaat agtctgtcta ctaggccaaa 360

gtcacttaag ggctaagagt gtaatgagta atcaaaataa taatcgttga gtcgtcaatt 420

ggagcatcag ttatggcatt aaaacatcta gtgggtcgaa aggatcagga aattatgtat 480

gggtgagagt cgctgctacg gtatcgcttt tggattgagg gctactacac tcagtaccca 540

cagtgtgtgt attaataaga atcgcaatat gcgtcctttt aagttttaag gtaccctacc 600

tttcatatct agtggaaatc atttacgcct atgcgacaaa ttagagactt ttatttgtaa 660

aacattggat gttggaatga ccctagatgc atgttaaata gcacgttcat tagtggtaca 720

cgcctatcac taacgctatg gaaaaataga agaagccaga acaagtaaac ctatggtgac 780

aaataattac ataaggaaat ccctcataat tagaatacca taaaacgtta gttgtactat 840

ccgtaatcta ccttctagcg tggaatagtt gagtgtattc tagtcacgcc ccgttccata 900

acgatacatg taaaatttac agcgacgttt aggaacccta caaggggagc agcagcgagg 960

atagctgact agccttacaa taagcaccca tacttatgat tgacatgatg gtcatgcggc 1020

gttaccactc cgctagcgtt acttctttcg tcttgtaccg gtttggcaat gcgatgcagc 1080

ccaggtaccg tagagaaagt agcgatgtgt gaggtcgagt actttgtcag aaagcaagtc 1140

ggattgcggt cccatttacc gcgacgtgca tttgtacagt atgaccgttt tttaccactt 1200

actgatgagg ccagactaat aaacgatatt tggtcacagg acaatattac ggccaattat 1260

gaaataactg actggcctat tgaatgacta ggaatgtcaa gtccagactc tagctatttg 1320

ggaggtttat atgtttggac cgacttgtgg gagtttgaca ctacgagtaa caagattatc 1380

cctttttatg ctgcgctagt tgacatggat tgacgaggtt attaatatcc atgactaact 1440

catcacagct tcccgagccg agacggatta ttttaatctc gttgatcgat atattaggtg 1500

acgtgagaag aagatgtgtc gtaatcagta atagttagga tcaagaggtt aaaagaagcg 1560

ccttcttcac agattctcag tatctaccag cacagagttc tcagtttcta acgtgttccg 1620

tatggatttg cgccactttc tgaataagtc ttatgagata tacttacctg gtccagatgt 1680

agcagcgagt taagattata actgcggttt agcacgcagc gtttaaatac aaatactctt 1740

gactgttata acgttcagga ttaggaacag gttcctcacg gatatagaac ccaattcacg 1800

tgcatgaggt attctatctt agggggagga actgcgctgg agcttgaaac tgaccctcta 1860

ggcgcttgct ttcactgaga tctattcaaa ctgacgttta gtaagaaatc ataagactta 1920

tctacgccgc cttataattt atgttattaa aacatgatca tgcgatcaat taggtaaatt 1980

tctttgtgcc ttgcaatatg 2000


<210> 61
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 61
cgaatattta tttttcctac gcacctacac tatcgtgaag ttcatggtat caattatatg 60

tcactagagc cacaaatacg tacttaaatc atttacctcg actgaaggtt gtaggcttgg 120

acatactctt gccaccattg taacaaaggt agatcggttg gacccgaaat ttggtacttt 180

taatctagaa tcagcaatat cctacggaaa ggcccaagag atgtctcaat ggatgagagt 240

gtaattacct aatttcagaa aagagagttt aacacaaata agaacagacg aatatcaata 300

aagtgcacgt cgggcctaaa tgagcccaca gcctggatag attaagtgcg atacgtcgct 360

accaacgaac aaaagtattt ggtattatga catcggctcc gacggtatag gataggaata 420

actcccaaac aatataatct tggatacgat taagtttgag tttgattgat cccatcaaac 480

atttgttggt ataaagttaa tgtgtgatcc agttagaatt atatgaacat agtgttgtca 540

cgattttgag acgaccgtta aacattatac tgcggtggca tagcaagttc atctcctgac 600

attagtcagc atttaatagt aagcaggagt actattaaca cgctcctata atcggttgcc 660

tgttggggat aatcagaaca tgaaaaactc catattagaa aattacataa tatagatcac 720

gtgtatgaaa cctaataccg cgaatataat tacattatga ttgcaataca tagggtagac 780

tcctagttaa cgtaaaccaa ataaccgact cgagaaacac aggactaaca attataattt 840

ataaactaag agtgctatac tagttactgc ctgataccta tgtttatttg caagtcaaaa 900

gtttcaaata gcccttggca agctacatga tgggtgattg gaggtgggac taggagttcc 960

gtccttagtc tgaataaaga acatgatgtg caccgatttg tcgtctactc ggacgttgtg 1020

gcaagaataa aagtgaggta tagtaccgct agccgcagag atactgcctt catatgcgcc 1080

gatactctat tgttcataaa cagcaatgag gcagagcaca taatcttaat tattaattta 1140

gttaacggct tcccaattta gcaatgaata aattttttga ggtgcatctg tgattaattc 1200

acccagaaac gctttcgcga attacctgtc actatagatc cttaatgaat tatcttcgtc 1260

gtcggaacaa ttatcggact ttattttgcc tgttttatgt atcgagttaa ataacgggaa 1320

tcataatttt atattacatc tgttttgtat agcggatctc agtaggttac atcactgtcg 1380

tcggattcaa cagcaacaac accgttaatg aatatagcta cactgcatga gtcccaacag 1440

cactggtcca ctagaaatat ataattatac gaatactttg ctatgttcat gacctgtcaa 1500

aggagaaatc tagtaaagac ccacggatat cgaagaacat tgtagttctg actcggtttg 1560

aatgtccggt aactgcaggt tcccgttata ctgagcggtc cgaaaatggc agtctaagtc 1620

cccctacatg acgattgcta tttattaggt ctcagaatat aacattagac acaagagcac 1680

aatagtcgga gtatgcgtta tcgagaccgt atatgagtca atcgaacgta gatcgatcat 1740

agctaactag gtggtgtatc actgacgact tgacgatgtt ttatcgctga ttagtttatg 1800

atcttgtaaa gattggatgc tacatattat ggtaattttg ctacttcccc caactatacc 1860

aaatgactca ctgtttatca aaggtgactg gataggcgct aggtatatcc cggtgcgcaa 1920

ttattgccct ggcgagccga acatctcgaa tatgtaaaga cgaatactcc ctaattacct 1980

tttcgaggta acaatgaata 2000


<210> 62
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 62
atcgagttgg tttctacgag tagctggcaa gcgcacatag aacacacatt gcatgtgagt 60

ggagcgattg cgagacgaaa caaccttcca aaagcccaac gattacagtg ctagttatct 120

atgggaactt attcccttag ggccaaagtc cctaggttat tctatacgac tcacaccgaa 180

gaggctgtaa attaacccga atatagatga ttagtccttt gtttgtctta gggatggcac 240

cataataaaa ttgtcaaatt agggtacagg actagttcga tttcttctat ccgtcgtcct 300

aggtttatat gtggccgtca ccactgtatc acatgccagc tagcaacagt atgatgtata 360

gcggcaaatc attcgtcggg ggcatgcaga acgtcagtta actttaaaga tgagactacg 420

ttttggtcac aatacaatga cttagactca tctcttaact cagacaatca cttttatact 480

tagtgcaatg tgtcacagcc acttaatggc ctagctaatc cttatagtcg gtagctagcg 540

agttatagaa tcttgttgtg gataatcctg ctcaaccttg cctggaagtc taagaccagt 600

actagaagtt aggcgtcgga gtctgtgatg ctaaagttgt tcggccaact aattaggggt 660

gtacctcctt gtctaatcct cttagaaatt attcgagaag ggtacagtac ccctcacaaa 720

gagaatctaa gttaccgtct gaagtctgag tgatccgttt tgaggtaaac agctgttata 780

catacttaca gcttagtcta catgacctac taagcgcttc gtgctcctta ccgtcccaga 840

atacccatgg ctcgcgtctc ctgccgtaca atacgtagat ttaatactcg taatgtttac 900

aaaaaatggc tcagcgaata tgaatacgat atacagtacc atatttatgg atacaaaatt 960

tgtggcatcc gcctaatagg gctttcctca gggcttactc cacatactgt tcaaccttct 1020

aggttcagta aaagtggaga ccacgatgca gtgtccttct taatctggcc ttatttgtcg 1080

atcccttatc tcgctaagat tagtcacacg acaaagaggt cgttaatgac gtatctagcc 1140

acaatcgaca gtcttctggc gaagatatct acaagagtcg ttgattcgtc acttttagcc 1200

ttgtaaaatt gccctttgaa taggtgacac ccgaatggat tggtactttc gtaattaacc 1260

gagactttgg agaattgtct ccggcgtttc atgtggcgaa gaatagaggt gactttgatg 1320

gcaccagaat ctcactgaca attgctatag acctaatatc ggatatttct gcaacttcct 1380

aatcgaaaaa atttctacaa accagtcgca gccttgagta ttcgcccttg acatagattc 1440

acaagattga gtcgcaaatg gtcctatgat aatggatgtg ttattgctgg aactttatca 1500

tgatgcaaag aggttataat attttgtgtt agtagcacac ttaatgcacg cagaatcctt 1560

aatcaatcat tagctgctaa tgagaatcaa ccgaccgtgt tggtgttact ggaattatat 1620

tcagtatcgc tctgatctta aggccctcag cacctgaggt ctaacgaaaa tttttttaag 1680

cccattctcg caaggccaca accatcagtc tctcgagaac gacattggac ctcatatcca 1740

agcctccggt tattcaccga tgtatttctt cgagtatcta aaatctgcca atacgattca 1800

agagaagtta gtatgcggga tcatgtagcg tacctttata tgaataaaac atacctggta 1860

gatggaaact tggtgacccg ggagtacgtc attctggtac tgatacttga gggtgaacat 1920

ggtgcgtgat tccagtatag cggtgaacct acgacaatat gtgcatggca ttgcttattt 1980

ggtgtatcgt tttttgagaa 2000


<210> 63
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 63
taactatatg gtgtctgttt actacgattg cattaagatt tctagcaatc ttctccagta 60

actgcacttc cccatattgt agaagcgact tatggagcta atctttcact tggtttaatg 120

ctaactggga tttgagcacg taaaacttaa ctcggaccac tttgttgaca taattccgct 180

gcttatatac ccatattcat gtctacgatt ataaagttct tcgtatttgg ctaagcgtct 240

ctacctaggc tcaagccttt ttagccaatc tgaacgctaa acgggtgcta gcctagtgat 300

tatttaatga cgatttgagt tcatggacga aattacatta ttactgtcta accggacaac 360

gggcacgtca caataagaag ggtacagttg ggatcgcagt ttattcatgc tgtatgccaa 420

ttctactacc tctcgtcatc ttaattcata tatagctgaa gggctagcaa gtagtggatg 480

actataatcg ggatttagaa gagttttttc ctcgaacatt agccttatgt gtctattttg 540

ttaaaattga catgctaaac gatagctatt agctggagga ataacataat gttgtaaaag 600

gtaaccagct catcacttca ggaatcttac ttcctacgat ggctgtcttt tagtcgacgt 660

aaagaaaccc aaccaaggaa tacttagaca gacaggagat catcctacaa agatagtcga 720

tcttttattt agtccaacgc ttaccaatga atagggctgt ctgagactca aaatattgga 780

ccatgggttt cgcaaagcgc aaacggagaa ctatgatttc ttgttgtggc agcgtatggt 840

ccccacgggt gactgtacaa tcacggagac ttttatcata taacgatagt acatttatct 900

ggataccgga tccttcattt ctcggaactc tatacttact ttaatttaat ggcccgaaat 960

ctattatcct taaattacac cgccgtggac tcggaatgaa gatgagtccg caaggcatac 1020

tgttagatcg gctgagatat tgcctagtgc aatcgatctt ttgatggtat ttgtgtacat 1080

tctaattcga ggcgaaactg tcaataaact aatgggaaaa gcaagcatat cacgagaaat 1140

attctagggg ataacattac gttttcggaa cacaacaggt tcgacataaa tcttttatca 1200

tattatttgc ttacaattat ttagggcttc cgcccatact cagtagttca aatgatgcaa 1260

aggatgtggt gtctagtaga tctcttaaat ttctatcgaa tggcgtagtt acattgcagt 1320

tatttttaca tggcaaaatg atcaaatttg tacgcaatag cagtaacata ttctctgtag 1380

tctatatctt tatgattgga gactgttaaa agctgatatg actaatcaag aaaatatcga 1440

aatttgatct acgacttaac attttaacta agcagacatc ataacgttta ttcttcaacg 1500

ggccgttact gctaaacatt aatctaacgt aaatcggaac tctgcagagt gcccgtctct 1560

tattttgtct gaattttaga atttacaagg agatgctcaa gccgagttag aagaagagaa 1620

atataatgaa tccaccgagt gtatgtttat acataaagaa ctatctttag gcgacgtgct 1680

agatcccact atgttcatgt gtaacgcatt tattggtgga actctcgcaa aatcttacat 1740

tatttcgcca ttacgtctat acaaaagcta gatccgtgaa gggtcataac ctcctttaaa 1800

ggcatgaaag aggttatcta acttatgatt ctataacatc gtcactggtg gagtaaaaac 1860

atctgtgata aatacttgtg atactctcta acatccctgt aatatgatga tcataacgct 1920

tgcacctatt aacttaaaag aaagttgtct tatggtgatt cttaaataaa agtgcctgag 1980

ccaccttgtg taatttttaa 2000


<210> 64
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 64
cacaatagta tagggacgtc tattattgaa aattatacca tgtggacata ttctggattt 60

gaatttattt tttacgaact tactcgtctc tttgtcgaac tgatcgaacc atgataggcg 120

gtccatacgt gtagtgtgtg ctagaagcat ctgtacttgt attgaaagga acaaagtcaa 180

ccatgctgtt caccaatttg atacgaagga atgtcctatc taaccgggct tattttacag 240

gctaagtagg tgaataatga caggaaaaat tcgaataaat cagaagagtt ttaagtaagg 300

ctcactggtc gaacggtgat aatactggcg gcaagttcta tgtagcttat tagataactc 360

ttcgggtgag agaaagagct tataaatgtg gcgctgaaat ccgatgccag ctgtagccga 420

gtcgcgtcat ctcctaacgg atcagttaac attatgctta ctggacgtaa agtggcttgt 480

ctagctctca tgcgccttgt aaagcttttt ctcactgtgt tcgattatag tgctctcagc 540

ctaccgttgc aaacaatgac tagcgactga gatgacaaca cgccacacat atcgagtggt 600

accgtattgg gagggtagtg gagagaccac ccgatatgga taacacgtac aagatgtggt 660

taaagagcca atcacaaatt gagcggcgat cgtgtcgaca atttttcatt gtgtaagcat 720

gcatgtatac tagaaataga gtaatactta gcatatacga ttaactcttg gtgagatgag 780

attctagctt taaaagaggg gataccgata gagtaataca tgttcttttg agcaaatggg 840

ttgttcgccc tgatccatga taacgactat ttcatagctc taatttagat gcttgaccca 900

gtgtaaagat ccgttttaac taacttagat gataatgaga aataaagtaa ttgactactt 960

agtacacttt aaatcctcca gtcgatgtgt attgtcgcta tatcgcaacc cgatgttcac 1020

atacagggtc ctgactttgg gtatacctta gtacgtaaca atctcactca caatcaatcc 1080

aagcgcggtt actatgttac gacggggaag caatacacag ctaggcgtgc agtactgctc 1140

ttagctctcc gaaatctgat ctagatgccc aaataatttt gtttccaaag ctagcgaggt 1200

tttacgacca gtcatgacag attctgcagt tgaagcatgt cacaggtaag caaaagcgtg 1260

gaacggatgg agcgagtaat caatagaact tactttacga gcggtgttac aaaattgggt 1320

ataatgcact agccgacatc gatggtgtag tgaattggac tggcaccctc aaggcctcgc 1380

ccaactcagt ctcgctagtt tgctacctgc atcctatgaa gctgttttta aaaatatcga 1440

tttctagcgg tagttaaact attaggaagg gctaaaacaa agttaattat acttatgtga 1500

acttacaatt tatatattag aaagtgagta agcatatctg aacaagcatc atcgtaatga 1560

ggtcggttcg aagtataaac ttaagttaac gacatcttcc aataccatcg aagtctacta 1620

agtaagttag gtgcttaatg atcattcata gtgtagcaag tccccgcaac tagataaagt 1680

caacgactta ggagtttaga tagaattgtg taccactagc tcgctacaat tggtttgtct 1740

agacttaatc ccttacctgt tgagaccgac tctatttcgg taaaaatcgg caaaatacgg 1800

taacattgtc tgcagtctga acacagacta gcttatatac atggatcaac catcaggtgt 1860

gactatgttt tattatatga actgttacca tggcgcctac gacaatagta tatttccatt 1920

tcggttacca gtttttgtct actttatcca ttaagtgata tatatacatg tgtccaacgt 1980

tatatggaca gcgttgtgca 2000


<210> 65
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 65
taaaagaacg gacatggcgc acaaaatgac tatgaggcgg ttacttctga tgatcacacc 60

ctagttctta ctcaggctat tgtacaccct gccctctcaa tatacccgga aatatgcatt 120

tatacggcaa tcgatcttga atcccagttc gagtctttac aaattccatc gtttactacg 180

caacgtcatg ctaaataaca ccttcccata tatgtagcgt gggcgggact attagagtca 240

ctttgtgcta aacagccggt aagtataata gtttactccg gaaggtgtca atatgtttag 300

cgactgtatt ttggtacttt atccctaaac ttagctaatt tacacatata gcagctggag 360

gagcaaggta tcatttaatc ttgcttaaga ccctagtttg tacccctgtc gcacactaaa 420

cccaaaattg cgacattgag ccacttaggc cacattcgtt aatctggtag ttacagcaca 480

atggctataa tatacagata cgtctagaaa aaagttattt aatgcatagc ttgcataatc 540

gattctttaa aacagggtgg ggagctacgt atctaggatt ttattctacg tcatgataac 600

gaatcttcct gaacgtacta gatggcgact atcggagaat gatttagaac gccgggtgtg 660

tcttgatgat ataacaataa gtaccacgaa aagaatgtaa ataacttgat atcgactgtc 720

acaatttgtt tgtatcattg ttcgtatcat tatgctcctg ctcgtgtcgc aattcccctt 780

tcaccttttg gttctttata cacaatcata ttatagactt atacggaata ttggttgtaa 840

cttagagtaa taccgattga acccacatgt cgctgactgc gacgctacgg catcttaagc 900

cgatatatcg tcgtgacgta actaggagtc cgtaagcgaa gagtagcata gcgatgatcg 960

tttcagactc ggagtattag agttaccatg ctagccacat agaacggcct tccgtaaccg 1020

gtggcactcg ttcgcagtgg gaagcccaag ttagaataaa ttgctaaatc tgattctccc 1080

gtctggactt cgatcttcga gctagagtgc cactacgggc actaacacat tcaacgagtt 1140

tcgtcgggtg gctcgactat cggcacgagt gttgctctac gagaatacct gccttcctta 1200

ctgcgatttc tctttacgct cttccactgg tgccaagtgg ctgtatatta ctggtcgagt 1260

agggctcgct gattgtcgtg attcaaaaac gcaactctaa aatccatacc tttgttgaat 1320

acctttattc tcgttatcat agaggtgttc gggccctcac tatcgatggc agatatagct 1380

tctccgctcg tactttcata tagatgttcc ccaacagctt taaagttaga atgatccact 1440

ttcagggcat ccagtaactc gagcaattat gtatgtaacc gatctttcga tgatagggga 1500

tagtacacct taacccttgt ccccggtgaa ttgcggcgac accatgcggt aggcgtatgt 1560

acggtgtgcc cttaattaac atcgctactg tactacacgg ttaggtcgtt tgaaaaggca 1620

gccatgaatg ttaagatctt attttaaaat tgatcattta catttagctg ctttgggggt 1680

aaatctactg atccaggtat taatctcttt tgtataatgt accaattgta gtaggttctc 1740

tatgttctta agtttcattg tcgataataa actaatcggc aaaggaagaa aactcaataa 1800

cttgtattgt accaaaaaag cgggggctat agttagatcg gtgactcact ttcttcgata 1860

taagggaaac ccaccgtata acgacggtga tcttaagcct tctcccaggt taacgtatag 1920

cctacaaatg aatgcattca aaatgtcgta agccttttac ctggaaagca caaacgatag 1980

cgcatttcct taaagtacct 2000


<210> 66
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 66
acttgcacag aaatgacaaa gacgtcgatt cacgataagg cattccaata agtataacat 60

aatcgtgttt cggggcgcac aaaatagata cccaaaagag tgtcctttcc actcgacagt 120

agagctcata gttccgtgag attcttgcct cgtaactagt agactgtcta tcgcaagaat 180

atcacaccca atatttaaca acgctctgac gtagtagtgg ctacttgtgc gaataatcta 240

gtttctcata tttgcgattc aacttacggc taaacggcct catagttttt ccctattttg 300

aacataagtc gctgttaagc agagtgatac ttcccttatt taagtgtaag atgttaaaca 360

ctaagctaga acacagtaag cccccgtatc ttagacgtaa tagccctgtt agattaaagg 420

attgcgatcg acataccaac agatgacatt aaagcaagta tagcttcaat tcccgccacg 480

gtaaacacct atcacgatac aaaggataga cttaccgagt accgtagtta gtaacctcta 540

agctagtaaa tcaaagtttt cgctagttat tcataagaac aaaattacaa aatgcgtatt 600

tacaactcat ttacagtgat gagaccgatt ctaatccaat cggtgttagt tttgcttatc 660

tgaaaatact gttagaaatg acgtggctgt taatcaatgt ataacgtgca tgcgctgaat 720

atcaatcatc agtatcgagg agttggcata cgcgggggct gttgttaaaa attgatccga 780

atcatctggt ttactccact aatggattaa gcctcctcaa ggcagctgat gtgaaaccca 840

aagatgtcaa tttgatttcg gtaattaatt gaaatccctg tcctgagcag actataaaca 900

gataaccgta tggaaatctg attccttaga cgttttcaaa tctattcaag taaattttta 960

cgggaatctt aaacgatatc gttccgtgaa gtaattcaaa aaacggtctt gatcttataa 1020

ttcacgtttg atactaattt agtcctccgc tccctaatga ttttttacga aatggtccag 1080

tttattgttt ttaaaactct ttggaaaatt cgtgtatgag gatgataaat tgttcgatca 1140

acgtttgtat acttagatct caagcaagaa ctgtcagcga cctgtcgtta ggtagtttgt 1200

tgcctgccac ctcgcgacct taggaaagga aggtaatcta ttccttaata cgtactatgt 1260

acaagagatg caagaaaagg gcaacatgag aacggttagt ctctttgacc ctcttactgg 1320

ttagtgaata tttttaccag ctgctacgat gcaggatatc tggccctttg actgttccat 1380

ggacacgagc ccgaaggata tttatttaat cgagagctgt atttagtatc ttcataggac 1440

ttgaaatcgg ataccgctgt aattgtggaa cctcatgaga cctcctaaca aaacaagtat 1500

cgacctgccc tatctccgac atttactcaa ctctaccccc aggttgacaa tttaggatgg 1560

tgtctatggg aaatatgatt cgtaacgtgc tgcctcaaga ataggttatg aaaatatata 1620

tataaaattc tatgatagtt ccttcgtctc actcaatact aagtcgttaa gccaactagc 1680

tcgggcgggc tattagttgc catatgagga tccatgaatc aaacaaataa tgcaattctg 1740

ctaaaaagtg tgtatataga gcgtacacac aagaaacaaa actgaccgat ccgacttaac 1800

catttcaata taatgctgca cccttgtcct caatagcttg cagggggcaa ttacgtttgg 1860

agtctggttg tggtaatact cgactgtcct cggcgatata gaataattat agagtgtatt 1920

atagcacaaa ttattaatag attccatagc ctggcgttac atgaatattc tcagttaaag 1980

catttgaacg atcaagtggt 2000


<210> 67
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 67
aggaacaatg ttaatatcaa gtcgggtcca aaaagatgtg taaagtttgc gaaccgttgc 60

gatctgtttc tgtatcgtct tacactgtca gggcactagg actcactacg actcatatgt 120

acattgttta gctcactccg agacgcttag tgaatcgtta ataggttgat ttgttattga 180

agctgtctga cttattatct tcttaaacga ctttttacgt attgggagtc ataggcgttt 240

tacagatatc cgcgtcagtc cacgacgtgg tgctctatcg gataggtaca atcaacaaga 300

atgattattg ctcatcttaa tttactatgt gcgccgtttc accccaaatt cgctcaagct 360

cagaccattg agggcggaat aggattgagg ggtagtgagg cgctgctgta ttaggcaacc 420

ccggtggttc atttgaaaaa acaatcgcgg aaacaactct aggcctaagg ggaacaatcg 480

ctttgactat gagcttctat acctttgaat atacactttg cgtggagctt ggcgcgactc 540

cttttgaggt aatgcgatcc tacccatttt gggttccctc ttaattatat tatcggcttt 600

tgtcaccatg atctcataat actgataagt tacccctgat gttacgaccc cgcagccgtt 660

agatatttta tttaggagga cctacccaag gcctatgatc ctttctctat atcacgagga 720

ttacagacaa gagatgtgta atccgcccaa gttactctac tcaaggttgc gcatattagg 780

ggagggcgtt tgacagttgc agtatgccat cttggaaggc aacaataaac ggtacacaac 840

tttacaaata ttccataatt gtttctactt ttcattcatt cattatgtat ccctctatac 900

ttataaaaca tgtacgacat gtcctgtaga gcgggacctg ttcccgctca tgacagacga 960

gttatttgtc tccgacgtat catccatctt taaatattga atagcagcag catcaagtgt 1020

ggataagtgc aagcactatt aaatccgcgt gaactttcat atgacatgag aatcggactg 1080

tctgttatcg taaataaacc cgagataatg ttaaaactat tctaatgact tcatgaagca 1140

ggatcatcta aagttatcac aagaggtggt cttgagtctt gcaaacttca gaaaacattt 1200

acaaacgatt caaattagcc taaaccactt acttaaccac tcatattcca caagttacgg 1260

ttctttagaa tattaaggtg taatgaccca tcgagcctta tagctcgaat caagattaaa 1320

agaatattct aaatgaccat accggttaca tgtgtgggcg gagtcaaaag tttttctgac 1380

tattaggtgc acaaaggtgt tcagaactta accaaactct tagcacattt gattagctag 1440

tcagattaag gtctccactt tcttttctgt ggtagttcgg taaattgatg ggcattaaca 1500

aacttaaggt tgattacaat ggggggttat cggatggtta ttgtaattga cccgtccata 1560

gatttgctta aaaatcgcat tttgaataca tatcctaact tccaagcatt acacagcgct 1620

gcactataga gctaggatga ctgtacaacc tcggattata gcttctacgt aaggcgtggc 1680

cgtggctggt ataatagtgg ggtggaggga gaattgacaa aaaaagttta tcatttaaat 1740

attagtaatg gggttgtcgt tctaggaccg tatttcgcgt actaagtcac atacccttat 1800

atattttcca cagcaagtct atcattgcaa gctgttaact tcattccggc ggctgctgaa 1860

ccagtatcag ttggtccaca gaagctaaag ttagcaaagt aatacacgcc aacctactta 1920

tatatgtata tcgtatagct taattgagat gtcgtagcca ttacatgctg agccttattt 1980

ttgaccgaga ccaggtacac 2000


<210> 68
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 68
ttggacgtcg aaattatttt tgatatacgt gtaatgatag actaaaggca aaaagaagga 60

gtataagtct aagttcgaag aggcggattt ggttatacgt cctgcacctc ttgccagaca 120

ttcttttaat tcttgtgacc tggacttgaa gttccttttt gcgaccattt gtgggtttag 180

tacgaaaccc ccataagcag ttagcattaa accatcaggt ttgactcgcc acattcgcta 240

tcgcaaatgc tactaattca tcttaatctg acccccccgg gaaggaagcc atttaataga 300

taatctgagt cgttccagag atgtacttct cagataaacc gtgaacacta ttacgacata 360

tgctgaataa ccagtatgta tggctgttgt cgactctcat tcctatagtg gagagaactg 420

atacatacat attccctaca cggatgttaa agagtcgcag gacctggtga ggcactggat 480

caacaagttg ccaaactgag tgccagtgga gctaatcaca ccttcggctc tgcgttacat 540

gcgttagtga aggtccttga ggtgtgccag caaagattgt taacatataa tctaagggat 600

tatatggtgt atatgggact gaaaacctag aggtctgtgg ggaaagaccg tacagtccct 660

gaccatcaca ataaaaaata gccaaaatag cgtgccattc taaaatttta atttttaatc 720

aatcgcgact cctttggttt catgctagtt gattctattt aagaatccaa gtgagtttta 780

atcttaaccc taatgattta aggttccagt aagcaaataa acgactcgcc gtaaagcgaa 840

attgatcgat acgtttcttg ctttattttt gggtacagca atccttcgaa atgttggctt 900

cgtaattccc tccagtaact taaatcagtt aatttgcatt gtaagaaaac agcaagtgaa 960

tcatgtcgcc gcttcagtaa cttactgcaa aatgaaagcc taataaatag ttacccatct 1020

atctaagtat aaacgacttt tgcttatgtc cacccatgct aggctgtgaa tcctcttacg 1080

tataacgtgc tttgcgtgta ctttcgaact ttctaagtat caatcgcaaa tcgaagtaac 1140

ttaccaccgc tcgtaggaat tgcatgttaa aaagggttaa ctcccttcgc tttgtcgttt 1200

cccaacctga tgaaggaagg tgaaatacaa catatggaat gatatatatc acaaatacac 1260

acgactctgg accagtgcaa agtagttata aactcaaaac gcccccgaca tacattaatt 1320

ctacttcgaa aaatatgttg ccctaacgaa atggtttgcc taacagcggc aaaagatatg 1380

tcgactcgat tgtatttaaa tcgattatta agattgggat gagggccacg tagccgaaac 1440

tgcaacatac cgaaatgggc gttacaatgc attaattata atttattggc gctcagcctt 1500

aattaacaat ctaggcgtgc tcatactgtg tactttaaag caccatttac atgtcataac 1560

agattattga tgttacgtaa aattcatagt atacagtatc acctcgatca aattcatatg 1620

tttttatttt aaacaagagt actcctgtgt cgttctgaat tactattagt caggtgcgtt 1680

aagctctgca gaacgatacc gactatctgt gcatctacct gattcgaaaa tgaaggcgat 1740

tgggactctc cactagttct gagttgtcct cctcgattta caaaagataa cttcagctgg 1800

atgtttatcg aacgcacaaa tcttaacaat ggtttaagta gccgaatcag attcgccatt 1860

caaatctttg ctctagtttc atcagtccga gttactctca aaataacaac ctaactcgtc 1920

ttgcctacac tggttctggg ttttatattt agagacataa tcacgaaact tcatgcacta 1980

tagaaggcac catgctgttc 2000


<210> 69
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 69
tgagcttcgc tttttccaga gtcgctgact aaagtgaagt gtctagtcgt tgtccatgcg 60

atatcggggt ccatcaacta gaattcattt acggtacgcg ttgtcatgcc ttatatttag 120

caataagact aacggaagct cctctggagg gaaagtaaga acgtcccccc gggaacatac 180

ctaaaataaa ggtgcatgaa ccatcacgga gtggagacgc aaaagatcaa ttagtacaaa 240

tcagcaggag acatgcaaag accgcgcccc tttcttttta taccatctta atagccttta 300

ctgatcgtgt atgttttcat cgtgcaccta attatggaaa ttctatgaag cttttgctcc 360

taatcgttta gtaatgctct cggatgccac gttatcttac tgagaagccc gtgaccaaag 420

catggtgaca atagaaccaa tatatatgaa aataccgggt tcgtctgaag actgtgtagt 480

aacaaaggta ttcttgtgaa ttcacgtttt taatctcatc tactatcgga tatgacaaca 540

aactctgatt agggtaatat aaaatttacc gttcggccta attaaaggac aaccggtatg 600

taaaacagca acatcaccta gcacgaaatt tacctatgag tgtggaattc gttagcgctg 660

tcgacgtgca taacctacgg gttgttgcat acgggtcagt gggataatgt tgactcggtc 720

cttagtaaag actagctctt cttattcttg cgcttgtaac tgacaagtcg agttcacgtg 780

ggcgcagtaa agtcgggaag acggtaatcg caaaagttcg gtaaaactaa cagtttttaa 840

cgagtccgta agttcaaggg cctaaatagc tggaggattt taacgtctaa acattcggga 900

cacagtgtat gacccgcata aaaggttcaa agaaataata cttagagccg tcgttcggat 960

cttatatgtt tgaatgaacc cttaatcacc ctataacatg aagctacgac acattaatca 1020

gatcaaaacc tacttagagc tcgtccgata ctacaacttg aaatcttcca ccaaaactaa 1080

agggtccatt atgtcaaaat accatttcta tttatatttt aaccatcaat tcgcctatac 1140

ccctaatcag cattaatctc gcttaaagat ggtagagtta aatacaacgc agagctttta 1200

tactaccagt gatggatcac aggattgcgt ttcaaaaggt gatagcaatt accaatgacc 1260

tttgacagta atgttacatc ctaaccggat tatttggaat accctctatt tgctttctgt 1320

ttagccgacg cctgtaattg tctacctgcg tgcgttgtga tgccggtccg ctcgatttaa 1380

gcactccgat atctcatgta ggtgtggact ttggacaagg ggaaataact ctcaatgaca 1440

atcgtactgc ttatgttagg caatgctggc atatgcaact ctgaggctaa ctaagttagt 1500

cttgtccgtg atctcagaac agtaactatt tagttgcttg cgagtatatt tcggtagaga 1560

cgtatcttct actaaacacg gttaaatatt ttttggttat ctctcgcccg gtctagtagt 1620

gccataacgt ttacgaggtc atataactgt catacattgc aaggcgcttt atctcaattg 1680

tgaacaagta attatagcca tgatacaatt tttggacgga acttgtttta tctaaatcga 1740

aagaacctac attgcctcgg catagacctc ggaagcagct agttcactag ctgcttcatg 1800

atggtccaag cttgtgaaag attcacataa aatcaacctc cgtgggagtc tccgatggac 1860

gaagctgtgt gactggatat tatctcatga ttgcgtcacc cttaacatgt gtgaggtaga 1920

gctaactata gaaataccag tcgagttagc gacataatgc gaattgatcc gcctgtcaat 1980

tcctccttat acgcgccgtt 2000


<210> 70
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 70
attgtccatt cttgtatttg aatcactccc taatgaacca aactctctaa gcccattctt 60

gtagtattta acacacatga caacggtcca attttcatgt atagtcggag taacgcgata 120

tactgaatct tctgacttat cagacatata agatgtaaaa acagcggatc aaaagtgttc 180

tctgctgggt gaaaaatgac aattaagcgt ggtattatct ctgtaaataa cacagggatt 240

tatatgtaag gatcgcgccc tcatacattc attaattctc actcagactt ccctccttcg 300

ggctacgtta gattgaaatg aaaataacat gttgtaatca ttaaatagta catactgagt 360

ttttaaagtc gaatactaca aaaaatatca tacttttttt accagttcag tattggagtc 420

gacacatgat ctaacataac agaagacata gcgatgggga ttatcgacct ttttatgggt 480

agtaacaggt ggttgccgga tgcactagca tgatcaggtc tcctactcac acagtccttc 540

tgactgttag gttgtctttg cttataaaaa tactcggatt attgcgccac aattatttga 600

tcaacgagct tcttggagag aataaaaata ttacacttcg gatagataat acaggttagg 660

ttctcctatg aatttgaaga tcccatgttc gttaccgtcc aagagccacg gcttgcttgc 720

tcgaaattaa agtgggcatt cgcgcgggat gggaagtacc ctcagtcttg acaattccca 780

tcgtcaatat tagaacggtg gattcgccat caccaggaaa cgtattgctg atgatgattt 840

caatactgaa gtcgtacact tctcacccgg aaacgttaaa aggacgataa tgacttaatt 900

gagatcatcg aggtacgagc ccatgcctta ggtcgcttcg taggggtcct ccttaaagga 960

gactgtttct tacatgattt gttacttcgt tgaaaataaa tcatggatcg acgtcaccaa 1020

ttactggggt acctgagtat atagcgtaga acgtgaaagt gattacacct gtataggaaa 1080

tgatgagctc ggggaaccat aatgaattat agtgtaaaga taaaaaactt gccccgtgcc 1140

acgagaagga atgtagcaga caatcatggg gacattgtaa cttacccaga ctttaatttc 1200

gttttcacta taccactcaa ttatgatgtg acattctgga attgatagcg tatgttgcag 1260

ccttctaaac tcaacactga gctccttaag ggttattatg gttatatttg agactataat 1320

ataatccgag ttcggtcgaa gtgagtaatc tttggagggt ttaggggggc agaattcact 1380

ataagcagca gagattttct tagaaagagc cgggtcccgt tccaataagc cctaccggac 1440

gtttataatc attggtgcat cagtgaggcc ttctgttcat cttctattct gctgtaccct 1500

tcttgcacca acgcgttgga tccttgtatc gagtcactgc caggtttgtg gattttttgc 1560

agcccaccct acgttatatc ttaacaatcg gataattaaa ccaagctatc gaatgctatg 1620

agctaccaca gattatcatc gattgttttc cctatcatta cgatccctga cggactactt 1680

agtatgtcct tttcttaata ttcgttaaga actggagtac aggctgatta cacaaccagt 1740

aggattagga ttaaatagag aaatgtatcc ggaaaagcgg agttactgtt tgggtcttta 1800

accgcgaatc gcggtttttt ttctaatatg cagtgatcct ttatttggtt actgtacatc 1860

tgctgaacac gctatgtgga tctcccacag ttgcaagtgc aaaatattaa taaattaatc 1920

acaatacagt acagctagat ttcatactaa atgctgattt ttgaccgcac cctcgagagt 1980

aattcaatga cggccatgta 2000


<210> 71
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 71
aatcagaatg agcagatgta aaacatattt atgtaagcag gttatcccgt atggcactcg 60

ttgctctaag tagatgtttt tgtctcgggt aacttatgtc cccatcctca gagtgtattt 120

acttttattt aacccgacgg tgagaacata caacgggtca acaagacaat acgaccatta 180

tactgctaaa ctctcttcct caggtgctat atgagttacg acacaatttt tgatgttaaa 240

gtcgacccta gctgctaact gaacttctgg gacttaaaac taccagaaag gatgaagaat 300

tagtttggtc aataactata tacgaaacgc cctgaaggaa gtcgtattaa atttggagtg 360

cataagacat ggtgagcgaa aactaacacc tacctcttag atacagatta cttttagtta 420

tcttctggtc tatcgttgat cattctaagt ttattcagca ctagagactt ttggaatacg 480

actgccaaag ctagtatagg attatctaaa gatcattatt attaacggat aatgcgaaat 540

ttgctagatc gtatatacta ttaatgcagc aacttaacta aagatatatt tacagtgggg 600

cttatgcaac cggtgagccc tcggttcttt atgattcgtc aagtaaagtt gcacaacgtt 660

cacgatttaa tcttattctt tgatcttggg ctgatgtatc ctcattattt atgatagaaa 720

attgattggt gcatttgatt cgcccgatac tagacccaca gctgttgttc gatcccgtat 780

acaatgagag catgttcaga tcaacagtag gtgtaacatc ttatgttccg agccttctag 840

taaccaacga acacctggca aatgaatttg ccatctttcc gctgtacgaa taggggtaat 900

gtgcccttga tttaaaatgt tatcgatagg ggaactacag atactgagaa ctcctgaaac 960

gacgttaaca aacctcctgc aaaacttgca ctctttgaac gaggttgcct agtttccaga 1020

agtaggttct tgtcacttga atttcgatgg aattctcctt atctatccag tgacgaggaa 1080

gaagaaatgg gtttttacaa ggactaagtg tttagacaga aaaactaatc tttcagtaaa 1140

ggtgagaagt gattttgcag agggagattg tgttacgagg atagtactga cgtttatatg 1200

agaaatagtt atcgataatg tgcgtgtctt taccaaggga ctgaccaact gatgtggaaa 1260

tttaactctt catgatcaca taatttcaat acgttaacag ttagaagcgg tgatctttac 1320

aaagtagaca atgagttatt gtcccatagc aatgcctaat gtcgagcgtg cttcaaacaa 1380

ttgaatggcg ttattttttg atccttagga aacaaaaacc agcaacgtaa cttattcttg 1440

tatcttcatg taatcacatt accggtatag agatggtttt acatatacgc acgttacttt 1500

gagatagcga agcatacgaa tatacacgat acaatgtcag aaggataaaa tcactatggc 1560

ctcactcggt gcatttgatt tcaaaggctt aatgtagctc tgttcgcact cgtggatata 1620

gttggagcca gatagactag gaagatgttt gtttagatag tatcctcgtt cgtgcataat 1680

atccttgaga tagtataggt cgaatctcca cagcagcaag attctccgtg agcattgcca 1740

ctctttcagt agtaagccta agtaattcat taagcgtaat tagagactta ttttccatat 1800

ctgcgcgtcg agtttcttct gcagccctag ttaggagaca tacgggacgc ttgcgttttt 1860

atcgtagatt cacttagtac agggaagata aacatgagag gaaatccgac acctaacaat 1920

actttcaaac tgaggggctg gattgtactt accttcacat catcgaagtc aattcttcac 1980

cttcacaagc tctttcttcg 2000


<210> 72
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 72
atttacaccc atgccgaaca taaataaaca aacacaaaag gatgagagga ataatgggtt 60

aactaagggg agtcgaatcg tattgatact tatgaatggc tatgttacac tcaggttgta 120

ctggatttcg tttgcgctac agcttagacc tttcgctaaa gatacacgcc gcagtgtctg 180

aaacagacgc acatttaaac cgctgggctg ttaacgctca ttctcgctga actagtctgt 240

catttatcag tgacatcagc ttatctccaa tcctcataag accgtcgaca ggaaccctca 300

attccactcg taacagtccc acgctgggtt gcgtagtctg ttgtaagaat tcattcatgg 360

ttgaaatggg gctgatgact atgaggcggc atctattggt atggtttagt agacgatcag 420

aggaagtctg tatagtcagg gctcaatatg tatccacgta gtaatgttgc ctgctaccga 480

cacgatttag acaacgtcag cgtaattacg aacacgacct cggttccacg tgtcatcgtc 540

tagatggtcc ctttgttcgt aggcctccaa gacctcagta atatctaatt cgagcttcaa 600

gtttgctaga cgttgacttg acgtagcaga taaatcgcac tgtaatggaa tgatacctga 660

atcccgttaa cttccagcat ggcacatacg atttttaaat tacgcttaag ataaagaagc 720

agtgcggtct aatccaaagt gcacaagcat atcaaaactc aggtctggtt tgtacgatta 780

tttggagcag attttcaaga tagttatgcc aatctctcca taaccatata cagtgacggg 840

gaccctctat gatacgtcat ctccgggacc tactttgacg ctggagtctt acagatggtg 900

ggaccatttg tgcttaagct acttttagtg cggtaggagc cctccacaat atgattcaaa 960

cctaaagaag ctaggagccc tctcgaccct ggtacttggc attggcttaa atttcacgta 1020

tacgccatag cagattagtt taatctccga ttttcaaaat actagatagg gagagttcta 1080

taccacatta actcgccccg atgggagaac gcacaagagt tagttttcga cgccgcgtaa 1140

aacaattcaa catggccctc gagtctgcta ctgtagtgca tgaaagcttt cctagttggg 1200

ctagtagccc aagattctgg aaaaattcaa gttagtcgac agatgtttcc gccttacgag 1260

taatttaaag aggttacccc gagaccgcaa agagtttagt gcatcttatg tgcattgtgt 1320

tgttcgtcag ggggctttgc acctaaacgg tcttacgtac aagctcagtt cgtggataca 1380

tgaaagtctt ggagtcaaga cctacaaatc gacgcgattc taagtctaat gtatccttac 1440

ttcgggcgta ttgtgatagt atcataacgg ttaagacagt ttaggataaa ccgcagagac 1500

aaaaaatctc gttcgtgtaa ctgagtatat agtgtacact tgtgcccgca aatgcatatt 1560

attgatcgag taatttaacg tgtgcctcct tggtagaggg tttccctaac atactccttt 1620

tcctgattac ctcagtctcc tgcttcaacc ggtctccata agtgagaggt tgtgtgtacc 1680

gcactttaga agagtagagg tttggcaaat tttgggagca ttagactagt cgaatttcat 1740

acttcttagt cgtctgggag aacgtaagac ctgattaaac gcatgataca cgaagtcatt 1800

cagttcttca gttaagaggt tgcatcaaat agcactagct taaatgtaaa tcgtcttaag 1860

tccaactatt atgcggcact tgatcaccat ttcactcacc tcatcactac gcttgatagt 1920

atgatctcat cgtgatggta cccagttgag atcagcgagg atctcctcat aaatttacac 1980

attgttaaaa ggtcccgcgc 2000


<210> 73
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 73
tagatctgct ttgtgaatgc cgaatttcag attgactgtc cgcgcgctag ctcattatga 60

cccggcagtt gaaatcgtat agggttggac ccaactacta acggaactca accactcgcc 120

ctgtacgaga tcacagggaa cgtcggctaa ggaggttatg gtggccttac cttagcacta 180

tataaagtgc gttcgaaacc tcagtgattc cccgatagta tgatttttaa gttctaagat 240

taaatttgat acatcagttg gtcctagagt tagtgctact aagcttaaat caaccaaaat 300

tttacccgtt ctattcagaa ggaaactata gtggtagcaa gtgtgacagt aggtatagac 360

ttaaatagtt acggcgaaat agaaagatta cgacgttcag ccttgtgtat cgaatttgtg 420

actttagagg cacacagagt aatggaccta tcatctacgt cctgtcagag tatcatgtgc 480

atgattcgac agaaatctca ataataaccc aaatcgggct ctcttgcatt gaataattca 540

tcatcaacat gaggtaatag caaaatgcct ttacttcagt tgattagggt gatggccgat 600

cacctatgta tttgaacata tattgtatat ccggtcggaa tatggcatcc ttagccgtcg 660

tgcgccggct ttcggaattt gatctgtctc tgtttagacg cgtaacctca attcgccgca 720

aactagatca ctattctaat aatctcacta ggaatctatt cgacatgcga tctttgatta 780

taggattcag aatctaagaa attgctacga tggggtgtca tagcgatgtc tatttgagtt 840

tctatagtga attggccatt tgttttggca tcatagatcg ctgacacaat cattgtgtct 900

ttcatcgatc tggagtacag ttagaagaga agcgagggct ggtaacatgc ttatagattc 960

ttatacttac taccttaggg tacactaaca atatttgaca ttataggtcg accaaaaaga 1020

tttctctatc aggtttagag acaaagtcgt cgacatattt ctgtttgaac tcttgaggat 1080

gcacgaaagt gtctatcggg gtatcagtga gaaggcgtgg caagcattct ctaggtgaat 1140

tccacccttt ttagtcctcg ttagtacccc gtagaccgcg gaacatcgag aagttattcg 1200

taaacgtgtc tatctgttct atgttaggag taggtcattg aacaaattga gctttcaaat 1260

agattctaga atgtagcgcg taagtatgtc ccgatagcgg ttttcagtgt attagttgca 1320

tctaatgtaa ttgagatgaa gaaaaccttg gtcgaagaga catgcctaaa gaagaaggct 1380

aagtgaaggc ctttatatca cgtggttcat agcccattat ataaaaattt atattggaga 1440

tgtcccattg gtattgatag atggttggta gctgtcagca gtgcgcccta ggtaaaccag 1500

aagactcctt aacagatcgg tataattatt cgaggtttcc ggctctagca ttcagacatg 1560

gaaggttctt tctaagcgga tatattgctc gaagcccgtg aacctttaga atcaaccttt 1620

attatctcta accatctttt ttacgtttca cctttaactt acgcgaatcg attcacgact 1680

gccgaagtac aaacgatgac tcagtgttgg ttttcgctac aacattgagc tcagctctat 1740

agcgcggact acaagttctg cgtagatttt gccaaaaaaa gttgcgggta gccttattca 1800

tttaacgtat gactgggagg cgctcaaatc tctcactgca cctattcgca gacgcaaatt 1860

atggcgtcga ccccaaactt tcaggtaaat agctcacaag attgaccatt ggcaagtttg 1920

aactagtgtc gtaacgtcct gaacaaatgt ttttctagcc gctcctgcta accttatgga 1980

cattttcctc ttcacccctg 2000


<210> 74
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 74
aaactacaga agaacccaaa ggctactcac tccctttgct gtgttcagct cgctggctcg 60

tcaagataac ggactcatgt ctgtgggcaa agcaatttat tacagctata cctttgtgga 120

aaagtctcct tgtaaaattg ttagcaatat tgtttcgagt tatatcgaat ttaaggttta 180

ttgttattcg tgaccataag gagctaacat gatgcggttt aatgcgtatg gaaaagcgat 240

agtgttttta gtgagggaat gtagaagacc tcgtttcaac ccttaccata cccgagggtg 300

tcttaatctg ttattaaata aagagcagca aaataaaaaa aaaatgcagt gtctatcaaa 360

ttcccaaatt tggctacgtc gttcactacc aattttcaaa ataataagaa gaagtatatg 420

gatccagtct gattgtcttt ccgatcagca atataaagca ccaacgtctt ataagagcta 480

aatagtgatg attccatgca gtataattca attcccctaa agctactgtc gataaacttc 540

atataacata tgtacttgga ccgtttggtt tggacttgac aggctttaag cagtctgcat 600

catgagcctc cttctagatg tgcaagcatt ccccagaggc ggttcgcttc agcgtggtaa 660

ggaatgatct ctgggtcgga ggtagtgcag aatgaccact tatcctatct agtggtttac 720

tttatctaaa acaacagggg actagatctt attatacggc caaaactgaa atgaagatca 780

tctcatgaat attctcttaa catgagaaat ttccgttgtc aatttttaaa tggattaatg 840

tcataaaatc tgggatatgg cgagcttaac acaatgcccc tagtttacgt taagaaacat 900

ttgatacatc aacaaaacgt aggatccgcc ccggtttttt ggaatccact tctagaagca 960

ggagcgggtc gctgtattta agtcataaag gacgtcgttt tacgaacaag accgtgtatg 1020

aatctggact gttacaacgg cccatcccca ccactagtta tactagtcac cgaataatct 1080

gaactatttt actagaaagt ctagaaattc atcctttgac ataaatggat tggaattaaa 1140

aaaagaattt caaatataat catataaaag tggatgcacc agagctcatg cgacgtcatt 1200

ctacgagcga tttatagctt ataccaataa accccgcgtg tattaacggt ccagtcaaaa 1260

atactatgat accgaacaag gtttatcgac ttgtcccgtt gaaatcctag atgaagttta 1320

taaccaaatg gcgccccttt agtgacgctg taaacgcaga tttatcaaac aggaaacatt 1380

tctgattaac cagaagtatg cgtagtgaag gtatatcgcg cagtaacatt caggtgcttc 1440

ggggattcaa aaacgtgttg ctggtatagc tcgcctgttt tatcgaatgt agtctcaaaa 1500

tctagccgag tttatcaact ggtcgacgct ggaagtctgc acttgaacat cgttcacatg 1560

taagccagag ataatggcct cagcatcgtc ttattgctaa tctcacgctg ctttgtcgcg 1620

acgtactctc tgcattacca aatgggatta gtttaatttc gttctctggg tgaccttgtg 1680

cacgctatgt gggtttgtat tagttgatta aagagtccct ttgaagatgg cttcactcac 1740

cacatgacta cacttcctat cgaggtaagg aaacgttttc ttgtgcaaac accccagact 1800

taccaagttt aaagttttgt ataatattaa gaatttatct aacactgaga caccatacac 1860

agcttccgta ccctattggt ccacaatata agacgttaga tattgccaat aaatgcttca 1920

ttcggttttt tgttagacaa ttggaaaatc ttatacataa catataaacg tttcgcatcc 1980

ctggttcctt ccgataggtc 2000


<210> 75
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 75
tcgttttatc acgttttaac attgaatctt tagtgcaacc aagagccact tctcctgggt 60

tataatcatc atctatttag cataccaacg cgtttggctg cctcggtttg tatatagtcg 120

taaaagcctc cggtttatga ggtgatggaa attagttgga tacttgaata gataatatcc 180

catgcggtat tcacccactg aatcacatcg cctgatgatc cttgctgttt gcgggagagc 240

tcttctaatg atttttgcaa atgctgtgca tccctaatag tcttttacag ggcaaagtac 300

agggattgac agcccccgaa tgtctacagc cgacaaaccg aaagtcttct accccgaggt 360

agctgaaggt gcatagacgt agacatgttg actaatctca tcttgtctac tatcttgtac 420

acaaaatcaa aattacaatt atatggaagg catgggatga gtgatcgtta attagacagg 480

ggcgtctttg gcaatgcatt ctcttatgat aaaaggttga ccagattact gctcatgact 540

tagtgtccac cggcccaaca attaataatt aagagactca accgacatac gttaataccc 600

aataatgccc caatacccag acttttacag ggttattcgt gaacatgagt ccctcgacat 660

cttcccagat tttaatcccc atattactag tttgtaacag attggttatg ggactgatta 720

gaacagggaa tttcagctgg aaatcactac taacttattg ctagtttgcc gatctaagaa 780

gagtctttgc taattgattt taaagagata ttctgaacac gtcaatatcc aaattttatc 840

cgcaccattc tgacgtaatg acgcctagag aacgagttgg tggcagtcta tcgcttctgt 900

ttattttaac cttcaaaata tgataaggcc ccagttataa actatttttt acggcaactt 960

cggattaagt gttctatacg ccaaaactat tgatttactt aacatttcat cccgagaagc 1020

tccgtcttat caagtacgag atgatcccct attagaaaaa ccacggctag tatcaacgac 1080

atgcgttaca cacacgcctc agtgggggcc gtcacacata gttcaaatat tgatactgct 1140

cgtctcgata tgtgttcaat gtcggcaatc aagcagtgtc ggaactgaac ccgcactacg 1200

ggctcgtaaa cgacccaaaa tcccctaatc aatcattgta gtaatggtag caacttgtat 1260

gtcctgtcaa cgcaacaccc tcctggtgaa ttattctatt agaactacta aaaaataaac 1320

ccgaggtcca gctctatcgt acacgacacg aaaacgtatc aaggtacagt tcgatagccg 1380

tacttattat ggtgactagc gccatataca aggtcataag ggaccttgtt agcggtgtgt 1440

tcacttcatc gtcagcgact cgttcgactg tcatttcaat gaaatcttta atgagtttaa 1500

tagagtagga agggacagta agatatttta tgaataatgt cgtacgtagg atttttttca 1560

aatgatgact atcacagtac ggcatacgga aaattcagta gggaattaga tcaagtgtaa 1620

aattactggt atactagcgt atacctagta cgatgataat taacaatcac ccccagcatg 1680

atgtgagaat agtaaagtat ccatatttac aactaaaaag ctcggaagct gaaatcccaa 1740

accgcttgaa cagctctcga ataataccgg tgtttatcat cggaaggaca gcgcctcagg 1800

attttcggca aatcatagct cttatcttcg atctaagcgt ttgatgaata ttagaatcgg 1860

actgagatat aaagaatagt gatatatgtc ggaaaacgac gatgtcattt tagactatga 1920

tcttaagacg gagaaagcta ccatcataac accgacttgt cctgccattg tattactggc 1980

tttccatcgt gagggatagc 2000


<210> 76
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 76
attatgatcc caggcttcgt tgagtctaat agctatccga ctaatcaact tctcaggcat 60

gtctcgactc cgatcctggt ggccttaaat ttcttaggtg cacggaattg tgtgtacctg 120

gtatgtagag actataacga ctcacttctt gccaattagg attcaaaact ccctacttga 180

gcaacgtgtt cccccgcatt atccatatca caacagttga atttttctaa cgtcttctcc 240

tcaaaccgga gggaagtgtg aatgtactgt tgtccggcca tgcctgaggt attttgattc 300

tagttagtaa ttacattagg aactcacttc gtcaactcaa acacgttgac aaatgtgcag 360

ttgggtaata catgccgtgc aaagcatgta tgaccgtggt ctactagatg gcttcgcgat 420

ttactgtttt gcgatatagg cgtcggaata aacttcagca ggtgcggatg ctgatctggc 480

gccgtcattt ataaagatat ggctacgact tagctcgtga gatcgagaca aaatcaagat 540

cttatcgtct tccacaaaaa gtaccctcaa tcggatattc ggaccgtaaa aaagagcatg 600

gcgcttgatt atcgtagcta gcgcccaagg aacaattgta ttattcagat taaaccccgg 660

attggaccta ttttcatcct agtagaaacg gtgacgacgc gacttccgaa aactccagga 720

acagtgcggt ctacccaggt tgtagtagat gcccgttttc tcagggcaac cagggcatca 780

tacgttaact taatcggttt taaccgcgaa gttcgatacg gactgattta ataataaacg 840

cgaacaacct agtaatatca taaattgcgg cgtgtacttc agaaatggta actaaatgtc 900

agacttcttg aaaaggaaca agcgcgcttt ctcaagtttg ttgagtctca tcataatggg 960

ggaactccgt acatggtccg atggactcga tatccgaagg cgataataat tatccccgtg 1020

ttctacgcta tttacgaact attaataatg atcggtcatg tcggtggttt attccattcc 1080

tttatctccg ataagtacgt taccatggga ttacgcaaca gctagatttt caaatgatcg 1140

ggtcgaatcc ggcctaaacg aaacgtcgct agcgattgag aacggatgta cagatctctc 1200

gaatacatga gatgcgcgta atcatagtgt acgatagaac ctcatgttat caacaggtgc 1260

tatcttagta aaatacatag tcatattctt tacacgcgta aagattcttt gagccagcga 1320

acatggaaat gggcgttggt gtgtttctcc ccggctttcg taatagtcgc caccatccgc 1380

ttgggtgctg attcgatcag ttctaaccaa ggagcctgac agtcttcgat ttttgtgtat 1440

tcctgtagaa tatggcacca taattcagcg ggaaaaaatt gtcaactcag cagtgtctat 1500

taagagatta ctctcgcttt tggactggta cagcctttac ctagtaatat agacggacaa 1560

aaattttgtg agtcagacgg catatcctga aaacaaatac aagtgtagtc tacgttttag 1620

aatagactga gtggcgtcgg tagaagttac tgctcgagtt attgtaaaat tcttgccaag 1680

aacgaagtta ctccatatgg aaaagatgac tcaatcgagt cttactagat tatttccgaa 1740

gtcttaaacg tttagaccta acttagtcga aagttgagct ccagaagtca tctctcccag 1800

tttatcaata gtgggtggaa caaattcatc ggctgttgac cttattgcat ccacctcgtt 1860

ggagttatct tgccatgtat cctcaagtgt tccgacctgg aagtatgtag aaaccccttt 1920

gaaatatcta tcacaaagca atatcttata ttatcttcgt agtttttaga attatatcta 1980

tttaagggca caaagtctag 2000


<210> 77
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 77
ttaacaataa atgattaggt tgtgcttgcc tcctaatttt gtttaaaaag ttgttcttct 60

gctgactagt ttgattctac tcatttctgt agtaccggtt cggcgtactt tttttagagg 120

aaaatactaa tgtgcggagg agggcttaag aaaactgcag atcactggat gagcaggaaa 180

accgaaggac gtgcacgaaa atcggacttg ctgttgtgac tatacgcagg ctagaatcaa 240

taccgtcggt gctcgtgcct cagccgtatc agatatgatt cttgagcgat gttatcgttg 300

gatcaaatag ttcttttcgt ggaaaggtat ggttagatat ccggggcctc ttaatattgg 360

tttcgactag atctgacaga gtcgggtcaa agctaacgct gtcgctaatg atgacagtgt 420

caatctggtt aagtatactc tggagttatt agtcgatctc tctcagtgtt tcttaaggtg 480

ttctcagctg gccgggttgt gcgcttgtga gggagcgata gcagtttgtg ctcggtctac 540

gcagtagatc gttcacaact tagtcagacc aatttatatt cctatgccta agaaatagta 600

gatcatctaa atgtagttgc cgatcaactc aaaaatcatg agcagtgata aacgctagta 660

cggagctagc atatgcgcct gccgatagat tgcatagaac cacagaatct ctaaatttct 720

ggcactgact ttaccttact tgtctactga tcatttagtt ctaaggcggg tcccagcata 780

tactgagtaa aggaaattgc aacggtccaa caaagaatca ataagtaaat agaactcatc 840

aatctccatg gttttttacc ctgtggtatg agagcttcga gacagtacaa atacattcta 900

cgagtgcatt tattaaacac acggacccta tacaaattaa tagcatcact agctcgaaac 960

ctattacagc ctgaacgttt cgaacgcact tcggtataca gtgtactcgc gcgcgtgttg 1020

aaccgaaggt gctagccgaa ttagttggat tcgtatatat gtgggatccc gatttccaag 1080

tccttgctgg tttaacacac ggatattagt tgctattatt agcgtgtttg aaaaccatgt 1140

cagagttaac gaccggctaa aaagccgact tataaaaagc cgagtggttt ggcaaccttc 1200

tactggtctt ggaattaact tctgaataaa tacaaacatg aaaagagtga actgctagac 1260

tgcacctgtg gaatgatcca taacagttaa attactccgc cgagtccatt ttgctgacgg 1320

tggattatcc taactgaaga gcgtacagcg attctgtcca accgttgaaa tcagtaattt 1380

tctataccta ctatcgtttg accaaactca gggaagcata cctaaatatc atcaaggcga 1440

gaaactttta gacccatagt tgtattatag tctaatttca atgcacattc tgttcaggca 1500

cagactgata ttgaaagagg cccgcgactt tgaaggtggg ctaaatttat gcaataatgg 1560

cacaccaatc aacacagtct agaacttacc aaaccaagcc tagattcacc tatctatttt 1620

tgatccgact gtataacgta ttgtaatacc tcaagacata agacactcat aacaatttaa 1680

ctttctctta ttaggaggct cctctatggg attcgtcgtc gagttaaatg atttgaggtt 1740

ttatgtggac tccgagcacg cccggtaaga atttctagga cttaggatac aatgcaactc 1800

agtggagtat gttcccccgt gtgatctata tgatagctga gtacgacaat aggcatgcga 1860

ttcagactat ccgcttttaa ttaccaatga atgtcacgac ggagaacgtt atgaaaggtt 1920

ttctctagca cgccctatcg ctcttatatg cgaaatacat tcctgcttgt gaatggccgg 1980

gattgcttac acattagcct 2000


<210> 78
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 78
cttaagattt cagctagaat ggttctggcg cgcctaagaa actaggttaa gtcttctttt 60

gcgcgttaaa taaaaatttt gtcggtagtt cttaaatggt gcacgaagtt gactgcatat 120

atatatgaag cacctaagag ctctatcccc ccttaaatgt caagattggc taatatacca 180

ccccatacac atgattaacc cggttacctt cgacaggttt ggatctttaa atacaattag 240

ttgatcttcg ctctggcaga gctcgggttc gttcgtagtg tataaaatat ctctacttgc 300

aattatcgtt taacccctgc aagagcgtct attggtcttg ctgttttctt acagttgtat 360

gctcgccatg tataggcagg taaacagact ttgacaaggg tgggcgagtc gcgtagaacc 420

tttccatgaa ggcatttatt tttgattatc tctgatacct gggtgtgtat aattggatgc 480

aacgtcgctt gctaagacat tcgagctcga aattctagga ttttgtctat accctttaga 540

atcttcactt ctataaatga ctaaaaacat gggaaatgac aaattagcaa gcggcgcttt 600

tttgaatcaa tcactagata tatttctaaa acttagcaat gctttcatga aaaccactaa 660

ttttaattac atatttgtaa ataacccgca tcaaacgcaa gttgatgtcg catcatatat 720

atctccatag tcatttctat tcaactggca tgttcggtta atcaaacaaa cctgacaaca 780

ttattggtct catcaaaatt tgctctattg gcatccagaa gattgaattt tgagtgacca 840

gtaatattac cctctgggac tacttgtatc ttttgtaaaa gacgtataat tgtagggaaa 900

atttgaagtt gtaaactaga acaatgaaat aaatcacaag cctcttaaat ttccgagtgt 960

gtttaatagc tgtccgaaga ataaatatcc agggaggatc tgatctctaa aaaggaaact 1020

ttcctaggtg caattcatgg gacaatagtc tttaccatca tttggatcgg aatctttaaa 1080

gatttaacgt aaaactgtag atgggtgaag caaccactgg tgtcaggatt gttgtaataa 1140

cctacaatac gaaaacacat ggaaatattt ttttcacgag ctatacacgt agttatacgt 1200

atgaaaacaa acaggactca aataatctat agaggaattt ataggttctt cgtgaacgtt 1260

tcgagagcat agacatgatt acaggctgca gatgattgct ctagggacac tggatacgtc 1320

tgtctcagta tattaagagg cattaactta tagagctggt ttgagttcct catgagagag 1380

aatatatatt tgcacaatga tactcaaaaa cttaccgctc tgcacaatcc gcacatcgcg 1440

atcatacgcg ccgttaaagt tatcatccaa tatactcata aatggtgtaa cctagctcct 1500

accacaaact gagtaccggg atcgctatcc acatcgctga aacaatggga aaagaaaggt 1560

ttccttcgag tcacgcactg actagatcta caatacttat gctctagaac gcgtgatatt 1620

tctatgtaaa gtaaagcatg ctactaaggt acatctaatt ttacgaaacc gtatactact 1680

actcgccatt ggtatacttt agactttgta agtaaaaaac gagtagggcc tcaaggacat 1740

agtcactgct tatacagcga aacgaagctg ctaacaaagc tcagaccggt attgctgtta 1800

gtatattctt gttagaagcg tacatcggtt gggccgtatg gtccgattac cttaagaata 1860

gttgactagg atcgtctcta aggtcgtact tacccaccta gcagctgata tcttcgatgc 1920

ctatatctgt ataggtagag attcattctc agcgcattgc cgcggtagat cctatgtaga 1980

ttatttagca tagttaatta 2000


<210> 79
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 79
gaaccttggg tccttatcct gaaataaaaa gaaagtgcac gtctccgtaa tatatggatg 60

tctcagtgat atccacgatt acatcaagct gagttatttt taatgatagt tgactgtatt 120

gcctaaaacg tatctgtagt aatgaataca taaaggtact ggtgattgag aagttctcat 180

taaacgttaa aatccgcatc atctgtaaaa ggtgggtaat tgcactatag agggtagacc 240

acgcctgtag cccgcttaga acaattcttg tactatcatt tttaagtcct tcaatgtcta 300

tcataagtat tggacattgc acgagaaaac acgggacaaa atgctcgtcg tttgagacta 360

tggatcgcta ttcgggtcga gcaatctgaa acagatattg tcatgtttgg aaggtgagcc 420

cattagtagt aagcgcttta taccactatt caggagtaat aatttaagga gtgtaacagt 480

atgatgtcta ccggtacacg ggagattgta atacagtagt agctccttat ggcttgggaa 540

taaattacaa actgaacgct ttctttagag ctctagtgtc ctgatttatg ggtaaggcgt 600

attatctgca agtctcagtt cgggataggt attccgtcat ctaatattac ctctagggtg 660

tatactacca tcctttgcag actataaata ctatctatcg tcggcactga tagatggagg 720

attccttgca agacctgata tctccgtctc catgtctagt ttatagattt gccttacaag 780

ttcatttatg catgtgtaat agaatgattt atatgaaccg tcatagttcc attttagcat 840

ccgagcgtgt gtcctctctc gtaattaggc gtacgtcgaa tcattttgct ttcactgtaa 900

ataggcaaag caaaatgtag caaaggaagg aatgaaatga tcattctcat gctacatgtg 960

tccttataca taaaaatata tatacttgat taattgcaca tgaatcactt acattcgatt 1020

atcataatac atcccccact cggattgctc cacgaccaga tggttaaaaa gttgaatctg 1080

tgctttgatt tttaagtgag cactcacgta gtatgaaacc gctagctcag gttttttttg 1140

gggatcgttc agtattcacg aaagaagaat gcggcggggt ggttccacac catatcaact 1200

agtgtttata gttgcttata taacggcaac cggctagtaa atggtaactt aacagtaaaa 1260

tgtctaggat tagtaaacat atattatgga ggcgttaagg ctgtacgcct tgatagtaca 1320

caccttttta caatcacaat cctaggttga tctaaaaccg ttgacgtcaa gtccattata 1380

aaatcttaat cgcctgattt ccctgtccta aaatgaagag attaaagaag tgaaatatat 1440

ccctaagcca gaagtgggag aataccattt ggatatatgc gagcttctgc caaatcttag 1500

agatttctgg acttttcaat tatccaatat gaggcttgag gattaccaac tctggactac 1560

atgacagttc cacagaaact atttagttag acgcagagcc aattagaacc tcgacaatta 1620

ggtaaagtaa agtttacaat actgttaagt cgcgtaaaaa aggttgattc aactatgacg 1680

ggtatagagg aggaaataga ggctctcgtt agctgtgtcg ttggacatag taacttttta 1740

caaagaatgt tagagctgtt gaatatttac gcttatacaa agtatctgct gtatcacgac 1800

ggattttatc catgcagggc agtaatccat caggcttttg gagaggacag ccttgggaag 1860

gatatcgtca cgaggcgttt cgcactcaga cacccgaaaa aattacgagg aaatgataat 1920

cgtaacgtgg cgcctagcgc tggataatta ccataattta acagaggcca caacaggttt 1980

tcacccttca atgagtgtaa 2000


<210> 80
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 80
gattctgtac aattgtttca aaatatagct taacacattt gatggaataa taagggttcc 60

aactagatat agttagttag gagttacggg agtggtgctc gggtacaccg aagcgtttat 120

gtctaagctc tcttctgagg gggctcagac agctggtaca ataattcatc cgagccgcgg 180

tgaatgcggc atcaggcccc ttctatactt ataaaagagc atatctaatt tattggcata 240

ttcctgcagg ctacataaag tcactcggtc gaggcatccc tattcgggct aaatttcaac 300

acgtctggtt tgaatagcga ctgtttttta cagatggctt ggataaccaa tcaaccttca 360

agaagcacag ttcttatgtt aggaaccgta tgcaaccgta gactcctatt ttcacttgcg 420

tgagcattca acgaaattgg gaagacagat ggacttacat taacgtatcg gactacgatc 480

gtaatatccg tgatgtgagt attatagtat acaagagtga ggagatggaa atcatgacgg 540

ttatcccacg tagcagcaca cgcagatgca gaccagacag atacgaataa acttttttgt 600

acggttgccc ggtaaactag cctgggatcc cgcgaacaaa tgttagaata aaaacgcgag 660

agacttgctt tagtagcttt tcatcaggat tccttgcaaa aagttaacac aaagtaagcg 720

tgttgttagt aatgtaatgt ttgtgaggta acactgtggg ttaagtagta ctaatgatct 780

ttctttgctg tttgactttc aaaatgcgtg gagttcagtg gtggcaaaga ttgtttaagt 840

cttacgtatt ggtagtactc gttaagcttg aaagtttcga ttatctcttt ttattccgat 900

ctgaaatgag cttgttctat ccgaagctga ggtagtccac ttagaccgat ctatcgctaa 960

cgagaataat acttattatt taaatccttt ctcatgccaa tagaggagac tgtcatggta 1020

accggtatgc ttgtgttcat attaattcta agatttgcta caggattaag tctagttcaa 1080

gtcctattcc aaataccaca atctctaagg cctcacacgc cttaacagaa aggggattat 1140

acgcgtcggt tgttcgttat gccttatagt actcaaccca taaatagatc gcacataaga 1200

gtatgaatcg gttgatgaaa aagtacataa ctcactacag tgccggatga gagattcccg 1260

tgaattaact agtggctaca aaacgtaacg tgcgaagagc aaaggtggcc gcgatattac 1320

ctttactttc ggtgccttag taaaagagga taatggcaaa atgaacgtcc tgggcaatca 1380

gaccagaggg aatatgctta gctattggct ttgtaattgt tgtagttttt aatggttcta 1440

aatatcaaca aataccatca tgatagttac cgatcagatg agcttgagcc gttgaaaaga 1500

atgcaaatac aaaatcttgt tcattaatcc gatgcaacgt gccggcttga aattcatttt 1560

cgaagtagtg cgtccccgcg tatagacgct acagtagctc cgaaggtcta ttgttagaac 1620

aacattttag aaacgggcct aataggagtt cctcgggaaa aagaggaagg gacaagttga 1680

ttgtctatta agatagatga tcctattata gcgatgtcaa tactacgccc agtgacacca 1740

tcaaaataga ctggaaatga tggtacgatt ggatgagaag atcattagct gcctttacct 1800

tcgacgactt cgtcgtagtg agggttctga ccaatgtcca tagcagttga aagcgcgaca 1860

ttactcgaac aacgctgtgg tcactcttta atgattcgta taatgaatct tcctctgcaa 1920

cagttggaca gaaaagtggc ttcttgctta ggacctagct agactttgtt gcctttctat 1980

gtaatacgta cgcaaattcc 2000


<210> 81
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 81
cagtagatga ggataagccc aagtatcgat tccaggaagc cgccatatgg agatatagag 60

gtatctctgg cttcgcgaac tcacaaagga gtgtctcgat ggacctccat aggtaacaaa 120

gatcaaggcc ccttaccaac tcatgttcta taaactgaca tctatgcaat aaagttaaca 180

ccagaaggtg ggtcagacca caaaccacaa ccccgctcaa ttttagaaca aagtctacta 240

agaggtgcga atcaagccga aaacgggagt ttattgtcca tatgatgctg gatcggatta 300

ttgtattata atagcctaag atcgtgtctc cgatccaaat gcgtgtacgc atcaatcctg 360

agagatccgg gatggttgct ggggttaata acttctcctt tatatccgga tgactgctaa 420

ttcctcaaat gcaatcattc tggaattatg aggcctatta aacgaattta acagtaccta 480

gtcggtagaa acaattctac cccgcatcct taagtctact ttcagagcta ctggcgcctt 540

tgacgcatag gtaaaaccgg cgactagagg aatgtcgtat caagataagc cctaatttac 600

ttatgctagc ctgtgttcga taaataagat gtctgaattg aattcgcgca gaaaccagtg 660

ctgccacggt gaagagtgat cggggcggct atcaactacg cggtgaacta ccccaaaaca 720

tttaggacat gcgaatatat caaagagaaa tcaattccat tagttcgaag atgagcacga 780

tcgttactaa ctgcagacaa agaaggcact attgatagaa ccgattgaca acccgaacgt 840

gtaccggagt ttggatcaga tcttgagact gcgcttaaaa gcaagaaccc atcacaaaaa 900

ggcaatagca ttaggaggaa tcgcgcacaa gtacaataac tttttccgta ttttaataat 960

attaattgtc cttctcacca cgaggccgtt tccttcgtgg aaccagtcgt cctactttct 1020

ctccgtaatt tcattttatt tagaataaag gtatatacgg acgactatcg ttcggaacaa 1080

ctaataacag tgcttggagg tgaatagaag taagttgaac tgagctaaag tgaacaacta 1140

caattcgtag ccctgatttc attgtcattt tttttctgac tcaacacccc aaagatcgcg 1200

caaagaataa ggccatagct caaacccgaa aaaatcttct aaggcctgat aacttagtta 1260

ttatatgaac accggtaatc cctgcatgca gcatatatga aataaaatgc cgtcgttttc 1320

attgtttcgt ataagtaggg aacgaggtcc atgtgctatt ttgctctttt atgtgtgccc 1380

aaggggtact ggaatgtcga gtaatactca gtccttcaat gctcatcttg tgaccaaatt 1440

cattggggaa ctccattggg aaaggaatct gtgagagtga atccagacta ggatctaccc 1500

acattgtagt ctgaatttta ccttctagaa agtaccgctc aagttgacta tattttacac 1560

aatgtgggct gatggctggt ctccggttga ggaaggatca atcatactca tcatgcatac 1620

atgaagatat actagtatga ttaacaatag gttttcaaaa cagacactcg acttattgag 1680

caccctattg gctaagcaac tgcatctgca ctagcaatgg atcttaaggc atcatataac 1740

cggttaggta ctttcttgtt aggtagaaca acacggttga tcaggccaat cgctactgaa 1800

gtaatgaaat caataaacac tgagtcttat gaagtactat tacaatctcc tagggtcgta 1860

tcagaccttt gttatgtttt aaggacaatg cgggatctct catccaaaaa gcgaaattga 1920

taccaggcat tggtagtcaa gattaccgaa ttattttacg taggtcatta tatgcctgca 1980

attttggcgc tttacgctca 2000


<210> 82
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 82
gtttaatctc cttgactaac aggagtctct tgccaacgga tgtacgtaac cgtatgttaa 60

gacattatga agagttaata ttacatgcaa ccattcgatt tgccataaat gtaccgaacg 120

ccgttatatt tacttactgg atgaaagatt caagaatcaa tataagttaa aatcttaaaa 180

agatcaatca tacgtataaa gtctatttgc tattagagac gactgtctga tttgatgatg 240

cagcgcgttg ttataaacct cataaataag aggcggtggc tttcttacta ttagcacaag 300

tctcactgag tagtagaata actcttactc tatatgtttc atcaggtacg accccacgtg 360

gcaaaattac attttgcaca cgaggcacat taagaccgaa gagaacattt ggccgagagg 420

tatgtcaaag ccggcttaat gatatcgaca caactcataa atggtgaaag ttataaccag 480

gtaatcttat gggattctgt ggagtaaagc ccattggact tcggaataaa taagcaagct 540

aatcagttat aatagcatat atgttaatac caagcgtgga atgagcacat tttggcagtt 600

taacactaag cttgataaaa ctcgtagagt agcgattgga cactacaaga cgcgtgtttc 660

gctagagacg aaccaccttg tgccaacaga ttactctgaa gctcgcctat ttgtggaagt 720

aaatattacg taacggttat agcattgtta acgatgattt tgtcgagtaa cggtatgaat 780

ttatgaaaaa cgtcaaacaa gcgtgatcag tttcgcatga tcgaattgag tttttgcccg 840

cgcagggttc gcgtcaaaac accttagagt aaatacttaa gaggaatcgc tacgtctatt 900

tgtaaaagtc cgagtaccca ccttggaatc cccatttttt tttttccagt cagctcaacg 960

gttgaatcca cgtgtccgaa gaagctctga gcaaactatg gtgtcgccgt tctaagccca 1020

tttcaaacgt tatggagcgt tgtgcctctt tgttggcact tgttattcac cgcggcgaag 1080

taacgcgctc gtcaagcgaa tcattttatg cctactcggg ctatagttaa cggagttaaa 1140

atgcttcaag tgtaggtcga caaaagatca ggaattcgag ataaactctc catgtgaaat 1200

agcaagttta cgtcctcgtt tttgattata gactaagatt acgaattctt tagcgctggc 1260

tcatttgaat ccaaaaccgt agaataagaa ccccagactt atgtcctcga aattatcagg 1320

taagagaaca aataattcac gagtactgac agtataagcg cttatgtgag acgaccacgt 1380

aactacaatt tataaacttg accgttatta tgtagtattt agtggctcat aaaaccagct 1440

tagcttagat ctgtgagact gaccagctga cccacaagac ttttacattg aagttgcagc 1500

tatatggaaa cgtactttat aatttcttaa tgtaagaata aatttgctgt atcgctttgt 1560

tcgtttgaac tcttttctat gtaaaaggct gactaaccca ggaagagggg agcatatttt 1620

acaaattagt aagcgctctc tcattcattt aatgatcacc ttataccgac ttcagcctat 1680

ggaagatctt gcgctgttgc gtacctacag cgggtaaacg gatgtgttaa acacgatagt 1740

aatagtaagt ttccgttagg ctgtagttta taacagtaac ataagtgcta acgagatcaa 1800

cacaattcaa gttgcgaaag caagaaaatc ttgctacata tatcttagat aagtatgaaa 1860

acatagattg cgtttttaca aaaagtacga aaacattata ttctcaagct cacgctccat 1920

gaacatgcca tggatgcgag agctacttaa tattatccgg taattattaa agtaactacc 1980

ggttgcgcac aacggcttaa 2000


<210> 83
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 83
gactcttctt ctcagtccac gtttgaaaat cagacaacta catattcaat ggaagcgctg 60

agtcggagtg gctttccgat tgactgcagg tgtctggcga tagattatta aaataaccga 120

ggacctcatc tgtgattact tatgttaaca cgtcgttaca agcaaaatgt acagatcgtg 180

tgtgggttag gggttcacta gaatcggtgg ggcaaatttg ccgcaaccga tatcgtatct 240

gtcgccattt agtgggagct gggcgtgcta tcagaattta tttaaacggt ttggggacaa 300

aagaggacct tatactggta gtataccttc tttagtcttt gctccgattg aatacaccgg 360

aacctaattt gtaaagaggc ccagatgttg gacagagtgg ttatgagtgc aggtttatag 420

ttcaagcatc agaatagtat taagataaaa ctgagggctt tcaggccttg atttaaatgt 480

gagagtattg tcaggccatt tggaaatatc ataaaatcct ttgtgccaga tagttatgaa 540

gctgcttaga tccacttgcc ttcatttgag tctgctgact gccaattaga gtcctcctcg 600

gtacgtatga atagaaaact tcaaatacga ttctccccaa tttgctctgt gcagccttgc 660

cgatagtcct ttatgtcata cactaggtgt gagctccaag ggtcttggtt ccagccccgc 720

aattcagata aacataagcc ccagtagcgg aggagatttt gaataccaaa ctaactttat 780

aacccgcgca tggccagtgc catagcgaat gcgcggggag aagtcatttt agaagcctat 840

caggcgatcc cggatcatta ccctcgtata ataaatagcc ttagctgcaa gttcgtgtcg 900

ccgccaacgt attcggtatc agactctgat gtcctttaat agtgattatg acgactgtca 960

taaactttgt agtagtgtat attatcgatt gcgttttatt catcttgatg atgggataca 1020

tctgcacttt tgagctaatc taagatcaaa tatctatttt cacgatcccg ctactacggc 1080

tcgagaaagt tactttaccg gaccgggctt aacacaagac ttacgacgtc ctggatagaa 1140

ttttaggggt ttctaaattg atccggtttg agaacttctt acttatattc cagtttcgag 1200

gactaggcat ttcttcatta agaccgaggc atgggttatt tttatattgt gatgcaaatc 1260

ggtttgcccc gccggagaga ctacatgcca gttggtaacg tgacaaggca tgtgcaacgt 1320

tctttagtgt cgctacggga ttctgaagtc tactgcttac ctgattatac cacggttcaa 1380

cttcggttac aaaggatatt cgctattgca cgggatggaa atttattcat gtcccaaaaa 1440

acaaactcga caaaggtgcc cacatgcggc ctcattttac agtgcactta tgagctattg 1500

cgagctccct ccaaatattg gtgggacagt taataaaaac gatctgataa aaatagtagg 1560

tatcgagacc taagattgga atgatcacat tcgcgtgtta taagattgga gatgttctaa 1620

cttggatgaa aatgttagtt acaataacca tatcctggtt cgaagagtat tgagatggac 1680

tttcgacatt ataatatgat ttcagaaagg tcgcacatga ctgatccttt cctctgcagg 1740

tggtcctgtc atcgggtatg tttttttcct ctagataaat ggatattgta agcaaatagt 1800

aattcctgca tgctggatac catacatgat gtgaccgcca taagctaacc agcttctaaa 1860

aaaatacact ccttgctagt atggtgatta gttacggtgc atgaaaatag taggaacgct 1920

gattctcgtt cattttgtgt gcgttccacg acgaatttct gttcaaagtc ctgcagatct 1980

tattgagacc tttacagcac 2000


<210> 84
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 84
tcgtaggcta atagaaacag aattatcaat tccttattta atacatcact ggactgagtc 60

attctctcag agcaaaaggt aatcgcttca ttaaggtatt gtctatcctg taagaacacc 120

cacgccgtgg atatatctca acatgtaatt agggggtaca tgcagtgtcg caaaattcaa 180

gcgcgaactg gggcatttct agttatgcta gctaatctac tcttgtaaag gagctttcga 240

ctaaaaactg ccactataat ctgattcaat ggtggtaata agcggtaatc tttaaccgtg 300

tttttgctgt ccgacttagt gaattgatac gtttataggg aaaaaatagg tcgctcaata 360

taccttaaag ataatatcac cggcatgcgc ctatgaggta tcgatcctgt gtctatgagg 420

taaaaaacga gactaaagtt tgactgtatt aataattatg aaagggaacc ttgtagtcaa 480

aagattaaga gcaaacccgt ctttcaatga caagacatac attggatgcc tcgaaattga 540

ttattaagta accagaacca atgattatac taagagctta ttcctttctc cgcagactct 600

taagaaacaa ggacaactgc ccctgagcaa ccagcctgct gatacgtcca aacaacccgt 660

tatcattagc ctgtattgag ctaaaagcac gtttattact tacatggcaa gtattattta 720

ttatgtggct cgtataggtc gggtatagaa atgttgcaca ttacaagaaa gttcaatcat 780

aaagcgaatc gtttatgtta gcagacttta tctacagtta acacgaggct agcgagatgt 840

gctacttttc aagtgtttgg aatgcatccg aggtcactat aggcaattct ttaccgcgat 900

caattcgtat ttgaaacgcc cggctagcct cccatagatt cccagtcaaa ggaatcaagg 960

ctgcgccatt ctgtgattta ctccctcttt ggacaaccaa cgtactagcc tgcaggatac 1020

gatgccaaca ttaattttta taaccgtgag atcaacgcgg tcaaggaaaa agttaggcat 1080

aatatcgcgg acaccctggc gtgaacgatt aacatctgcg ggatatgaac atttctcgat 1140

ttactttaat gatacttggc ttcataataa acataataca tccccctgag gttgataaac 1200

gttagaaact taggcgagtc cataagcgct ttaaaggatc ttttatcaca cacgcgaaac 1260

attaccattc gataaaactc ttatcactca tcccgaaatg ccagtttcgc acatgcaaaa 1320

ataagccttc gagattggtc acgcccgatc agtcgtcttt cgctacctaa cctatgataa 1380

aatagttctt aggagtcagg caattgactt gcctgtgtct ctttggaggc ttccaagttc 1440

ggatttaagg gtatatgcct gttgtagtcg gacaaataga taggataagc gctttccagg 1500

cggactacac tattagtaac tatcagcgaa tataaatgta ctcggcagct taagcgtaga 1560

cttagtactc gcaggacctc ttgctcgttc tagcatatat cctggtcgtt tttaacattt 1620

taagctcgaa aaagttgtcg gaagatgact ccattagatg gacgattaac gaacaaaggt 1680

ctgtgaatga catacacatc tgatcagtat tggccgcatt cgcaggatag tacatcgcgg 1740

ggcagacgta ttaaatcaac ctctccacac ccgggtttcg ttttgccatt gttgccctcg 1800

acagcagcgt ttcattaata ggaggcttta taatacgtcc agaaggtgtc agaggcctac 1860

gagctcacga acgtatcctc ataaacttat tgtgtcacca gtcaagtcgt attttatctc 1920

ctaaaacgac ttacccacac cttatggagg cttagcgatc gtgtatatat gcttcttatt 1980

atagtgcacc ctgggttcta 2000


<210> 85
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 85
attgggcatt tcgtcggaca ctaaatgaac attaaaggat tgatcttaga gtgctatatt 60

gaatcactca gcccagtcct tcggacttcc ttgtatttca ctgggcgtat actacattct 120

caaaataatt ttgcgagtca attaaactag ataccaccta tggggggttt cgtcttggtt 180

tcaaattaga tggtagtaag tttacgtgaa caccgttgag acgtagacgg cttttatggg 240

ttgtctgtgt tagactcatt gagctgctca tccgaattat tcattcagta ctatttagca 300

cttggacatc cctgctagag ctctgcgaaa tgcggtatta ggtctggggt gacctccagc 360

tcaattaatt tacaccggta gtaaccaaag gttagttaaa ctcacgaaaa tgatactcac 420

tgttttgtgt atccttagtt atatgtcggc ggattcaacc ttcggataat aagtaaatgg 480

tctcagatcg tagctgcaaa aaatcgtaaa gcaactgttg ttaagattgg ctactcctaa 540

caaattccgc ctccctcaag caggacactt cggaatacaa tccggaaata tggcgtgaac 600

cctctatgat cgactgattc caatcacggt tcagtccact ctatctaatt aacttatcgg 660

gtagatacta gaaactcact caaaccgtat tcgtgaaata attattcgga gtcagtaagc 720

aaagcccagt gtgtatttta cacttaattg gctctctgtc aacttcttgc aaattaatcc 780

attacttgat aataatatat cgcgttcaat ggcaagaaat ccaccgcaga atcgcaaatg 840

gactccctct catctaggtt aaagcaaaaa tgttgagatt ccacctaaaa gtggatatag 900

aagacaaaat tatttgtacc aacagtaaac agggacggaa ggtgcctctc aggtagttac 960

tgaatacctg ttagacgggt tctgcccggc ttctatgact tgagattatg tggttctaca 1020

gtatatcatc cgtctaggag tgaacctaat gaaaaatact ctaggttggt acgtattcat 1080

tcacataaac ggatgcgatg agttggcggg ttggaagttc tgttaatgtc gtaagtactt 1140

ataggctgac aagaggtaac tgtcatacga aaggattcgg tctcgacggc cgaactctaa 1200

aaggtctcct tttccggaga acacaagact cttctgcttc tgaccgtatt tggatagatc 1260

catcggcggt acctttgttt gttggatcgt aacatctctt ttgatcctac tatgtgccaa 1320

ctcagttagt tcgcgctgaa ttaagattca agatcctgtt catatctttt ataaaacatg 1380

tggatgtctt aaaactcatc tcttcaaacg ccattgctcg tttctggagt gttacgggtt 1440

cggagtagag tggtattgga tgtcaatatg tgaatttatc cactctgaca tacacaacga 1500

gtccgagaat tttagatcgt gcctccaaac agcgctcaaa tcttacaaat attaatgtag 1560

agccatggcc ccatgcagag atgttacatt cgcatggatc aatctaagtt tgtacaaaag 1620

aaaggcactt cttaatctga acttcatatc gtgtttccct agcgattact atgattctag 1680

tgtagcgtta gttgcttatg ctctttatac actcgaggta tcatgtacca acaacctagc 1740

gaaactgata ctgagaggtt gcagatagtc ttcgacgatt tagctactgt catttaacat 1800

tcctgcctaa aatagcttcc gtccactcac gtactggatc tcattctccg cgagccttat 1860

agagactgga ttacgtatat tcaataataa tctactctag accaccgacc tcatcccttg 1920

tttattgata gtggtgtccc tagctgacca gtcttgttgg gaagaagcat gtaacattcc 1980

tattagcgcc aacaacgcgt 2000


<210> 86
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 86
agagaacgtg tcacgtacta agtgcaaaag aggctgggtt ttttttgtta gcttaaaaca 60

ccaatagaca caaatccatg gagatttaaa tgcaattatt aatcttgatc gaattgtctt 120

ttagccgaca acctgttggt cccgacaata aatttaacga ttgtttttat cctaagatca 180

accgttgacg aacaaattag gcgaaagtta tattagtagc cagacgcgtt tggaaacagg 240

caaaaactgc tagaataccc gtagaaacct actggaataa atgaaccgat acgttaccgt 300

ctcaggaact acttaggttt gatagacagt ggaatgccat atgtctttta gcgtaacaac 360

cctaaaacct tattattgga aatttaccag gtaggatgtc atgtaacacg ccaatccaat 420

tcatgtcaca aagtgattag gtatactagc atttataact tgggtaagtg catctcatgt 480

aagtaccgat gggcgtacct cttcgatgta ttaaccagca cccacttcat acaagttcat 540

cggtaagtgg tttacaagaa acatcataaa tagaaataac acctcttcag tgataagcgg 600

aaccccgtgc cacttgaaac aatctctcgc agatgaccct tggaacaggg ctgacagttt 660

gaagtgacag ggtgaagtca ttcctttaca atttaagccg ggaaatttat caacactaaa 720

cgtaaaataa aattggcgta ctgcctggac attggtcgca atgtaatctt ctttgttctc 780

gtaaaccaaa caataatatt ttgaatcgta ttatattgca caggtaagcc actgcaatta 840

aattagagcc catcacttcc cgggctaatt gagactaagt caaattatcc tttcagactt 900

ctttaaccta aacatgaaga gggttttgga attgttaaag acattccatg gggtactgac 960

gtagtaccag ccagagttcg attcttacaa ttcacacgta taggtagagg gtcccacagc 1020

tacatatcct atcctgagcc gaattctcgc cattgttagc tttaaatatt tcgagccaga 1080

cctgtggaat ttagtgagtt gaagactatg ggagccatac cgaagttgct aataaaattg 1140

tttctaatta ctcttcgtac atcagaggca cgccatgtgt gtgattaatt catcttgttt 1200

cccgtacaag caatagcaat attgctcgca tcacgtccac caagtaatta ttgtatagtt 1260

actttgaact atatctctgt agcatttcga gtggtgctca gaggcgcgga tcttgcctgt 1320

cggggattgt gaaagttggt cagaaagtta caacggtatg gtattttaga aatcgcgaac 1380

ctgattgcgt cctaacgcga tgttattagt attcaacggt tggtcagagt tatatacccc 1440

tagagaggcc tatggagata gacagtctcg cgtatctcat cataactctt gatcaatcta 1500

gtcaagtagt tcacgggact agccgtacac aataaggaac ctaagtgcaa aaccactctt 1560

tagataagga tcctgcgcca tgctttgagc cgcagcattc tctcgatgag tccagcgtgg 1620

tttgcaacac ttagtacata agatagttaa atacagagcg gtcctatttt gaaaaagaaa 1680

tcctatggac cgcaccagcc ggaggttacc taagacttcg gacgaacatc cttgtttaaa 1740

tgtatgactg gatgactgat tttcaacaga gcgaggtcca agaaaaacta caagccactt 1800

attaaagaca tgagtaagga cgagttattg aaactaagac atacgtggga tagctaggtg 1860

gcataataca agcagataac cccgtacgat tcaaacgatc ttaacaagta ttttattaca 1920

aacgggcctg gttttaagag aaaaacgtgc agtaccctca atatgagtaa taagggaagt 1980

gacagggagc actcggcgat 2000


<210> 87
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 87
agggcttgca tatccacaaa aatgaattta tctaggttca attacgtgtt atccactcca 60

gcgaaaactt gacactagga ttattgtctt ttgtcgacac gttaatacag caacgtccaa 120

gagatctctt gctttggctt gaacttgcaa tattcacggg ttgtttccat tcttacctcg 180

actggctagc tgaatgacct ttcacctggg ttacgatgta cgcggggcac tgtggcatta 240

aacgaagtca ttatctgcac caacccttga taacaaaata aatatggtct gcgacacctt 300

gtgctgggag acaaaaatct tctgtaattg gttctgtacg acaggattag ttcctcttta 360

tttcttacca tgtttcctct tccagcatta agatggtaaa ttgaatgtat agtgcgcgat 420

acggagcacg tgtcagttgt cgctcggtcg tcgcgattat tgcttggagg atcctaataa 480

agctaaatga gtggagtagt agtatgcgtg tgtgccggcc gtaatatctc attcacgtgc 540

atcatagcgc atatattcga cacttgtaat cccgtctttc gaagaatcta ggttaaatgg 600

atactacttt ttacacacgc atcctgcctc tcggcgggaa atatgttatt agaaacttct 660

gaagttgtct ggattaaagt actcatcatg gctaaaacac tctatttttg gtgtgaatat 720

agctctattt acttctatcg aggcctcgtt ctagaggtta ttagtgacag tccgtccgta 780

aattttcctg tatactcgtc ttccttatta gggttgaggt gtactgcatg tcttatgcta 840

tacaatcagc gtacgatcaa gactgtaata tgtgtatacg accacattat gaatgagggt 900

aaggtgcgat agtcagtagc tgcttgctat tatccttaaa tcgaataatg cagcgcttca 960

acaatagatc atatgtattt caagcaacaa ttaggggatt caactagaga tgctaatgta 1020

ggtttgtgaa tattttggtc gtacattggt agggcatctg attgcatgta tacagtcata 1080

attcagagcg acgctctttt taaccttggg aaaggccgtg aacgaatgcg attaggccaa 1140

tctagcgcat atagttaatt attttactct ttatctcttg agcaacagcg gcaaggaaac 1200

ctgggagttg ctagacaccg agtagaaatc ccttacttcg ccagcggatc gatctgtact 1260

acatgcatct tctactaatg gttgaaagtg aagctagtac ttatttgcat ggtgcaccca 1320

ttcttacaac caggttgttc taatgtcttt tcatcaattc ttagcggagt gggcataatg 1380

aaagtataag aatggaagtg ttctattttg caaccggaga ccacatgaaa ggatcgacac 1440

agagatgcaa acagtgcata cattcgatgt ggcatagacc aactcttgta cgatttaatg 1500

tgatctctgt cacaattcgt ttaggtgtct atggtaaaac ctcagccaca acatgtatag 1560

tcttacaggc atggctatcg tgatttaacc gtgaataact tgtcggtaac agaaactctg 1620

gcacaggtga gcgtaatcaa atcaacttca gtaatgagga cttctaagat agttccgaat 1680

ctgttcacag tattagcacg gtgattgagt tctcttctaa tattcctatc tttacattgc 1740

gtactgtcac agaatgctgt tgcctctatg attttacaac ggcaatctaa atcgtcgtat 1800

catatgttca gaatattaaa tagctcaact ccgtgttgag tcctaagata aagatagaaa 1860

cattgactat aaaatctatc cattgtaaac cagactaatc atgcaagcac aaattagagg 1920

gcagaccgcg gccattggaa tcatttatat ctttatcgtt taattcacaa gaatggctaa 1980

atgccggatt ttgaccgggc 2000


<210> 88
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 88
ttacataacg actccgtcga agccgtcccg gacatcgagt ctgacactta caaccctgag 60

agccgcttcc ctatatgtct atagattgcg agtgtatgcc actgtcattg cagatttagg 120

gtcaccccaa aaacacgagt attattagag actacgaatc atttagcaaa caatttcgcg 180

aagccctaat tgaaaaggca accgattcac ccctggatag ataagctaaa atagtgttat 240

gcggagcaat gttctcattt ggacccatac actctattcc ttctgaatga ccttcgaaat 300

acgaataaga acatggcgtt cccaatcatc catatacccg ttcaggctga gtagccaaca 360

tttcgtattc aaagatacag ttgacaagct gacattcatt gatgacttag gggctaacat 420

atcaggcctt ttcttaatgt ttaaatactt gcctattatg tggccatgag gagtgcgatg 480

ataccaatgt tattggagta tcgttaaaaa aattcggtag tgttataatt acgaactata 540

gcttacgggt catctatttt aacatagtga gggcttcttc acacttccag tcgtcggtct 600

gcatgaaaca aaaatgagtt acatttagag gaatgcgggg taggcacaac taaacacaag 660

gattaaattc gtcgcgacag gagtacacta aacgtaatta aaaagctacc aggcgaaact 720

tctatttacg ggcaattacg aatcctatga cacttcaagg acctctcatt ctaaaataga 780

gacagcctcc actcgagctc cgattgagct ctgctctctt ccaaacaaga acctccgtgc 840

gagcagcata tagcgagcat tcttcggaag gacctatata gatcggtcag ttgggaaatc 900

ttacaaaacg tcgagcatat attatttgcc gtccgcaacc tatgcacagg ggcctttaaa 960

tcagtttatt taaaaaatct aatttcaaac agtcttgcaa taggttaggt gggtatagag 1020

tatcaaaaat acgtgactaa aaacaacaga agttgataaa caacagtgat tttcgggatt 1080

tatgctacac cttagcgaga aacttctgtt aacattgtct atgctttgaa actatgtaaa 1140

ggaattcgtg atatggtata cctaataggc ccataccatt aaactgaatc atagtggacg 1200

agaagcttta tcgccctcta atgcgtagtg acgaatgaaa atcagacaac cattatagaa 1260

gtccgagtca gccacggatg ttcggaattg ctatatatac gcatgacttg ccaaagttgt 1320

ggtttactgt atatttcgta ttccacaatt acatatagct aaatctacga tcgcggcgcg 1380

gtataagatt tcaaactcgg taaacttgaa tgatttaaat catccaattg ttttatggat 1440

cgtggcctgg agtttggcaa ttaattaaag gatatttagc tgaatgtgta aaataatttt 1500

taacccaaat gtgtctataa tatgtgctcg gataaagctc aggcataacc acagatctac 1560

gcgaccttgt gatcgtcctt gtatgtgtat atagagcaac taccaacagt tgttcagacg 1620

caatcaaacg atagctttac gataggatgt tcatttatta ccaagtacta ttattcactc 1680

tatagggtta ttatatcctc tactactccg gggtgcgcaa ctttccttac gccattatta 1740

acggaatgag cggtaagcgg caccttctat atcatcgtca taagagtgag atgtaatgtt 1800

actatgcctt atgcttgcca tggtaagccg aaaataagaa gatcacaaaa tagcaccatc 1860

ttttccatag attctcataa acattgatgt ttgagcaaaa taacagctat tacaatgatg 1920

taaattatta taaatgtcta atcataagcc agtaatttcg ttaagcaatc tagagaagta 1980

tcttaagagc gttaagaacc 2000


<210> 89
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 89
cctcactgag accaattatg acttttctct tgcaattaca caatagtgcg ttaagtactg 60

aaaaccatcc tcaaggctaa atgttataag atttttcata cgagtggcga aaaccaagtc 120

aaactggtta aatgatgtct actacaagtt tgggcttggc tgacaaattt ttctatgagc 180

tactgtaata atgcgtcttc atacgaacgc actctgccca taaataggcg atggacctaa 240

tacgtcaagc ccatcttcaa atagtttttc ttgtaaattt ttgtcttgac agacatgata 300

cgttaacgtt gtctttgacc attatatctt cgcgataggg tcgagttcgt atttattaaa 360

ttgatgaaat tgcgacacat atcacgtgac ttaatcccga aaaattagag ttcttgcgct 420

tgtcataggc atgaaaagct cccctcataa tacgtttgac ctttaacgta tgtctttaac 480

atatgttcct ggtaaccagg atttaaagtc atggtcagcc ttcgaaaaat gtgagaagat 540

cgcgaataca tcacgaactc tctcaggcaa acatctcatc caccatttat atagtagatg 600

cgctacccac tgttaacctg tttgagatgt cgatttaaac gttagaaggt ggttccatcg 660

ctggattgca acctttactt aaggtcgatg atacgtacaa tcgctttact ttaagctaag 720

ttattggcat actactgaaa ttcacttcct ggcagacttg cgttgctctc gcaatcccgc 780

agtcctttat gatgtctagg cgttttacaa atcgacagtc attgtattaa agtcattgga 840

ttgtacggtg taagtcgaca gggaacgtgt tgagttaata gtaaaaggtt cagattcttg 900

caagcgcgct tttctatcgc ctggtttatc aaactcatgg tgattatata ttttgcaatt 960

catcagccct catatgttgg taagactcgg attgggtcga cgccagacta acgtcataaa 1020

tgttagaatt attaaagacg caattgttta tgatactcac taatgggtcg ttagatactt 1080

attgttttaa ggcaccagcc tccatttgtc cgagtccagg cccgagcttg ggcgcaaaac 1140

ttttagtatc taactgtgag tgacaacctt tagagttctc tcgtatagaa ggtccgacgt 1200

cagagtatca taacctactg gaattggccg ggttcgcgtg cactctcact tcctgccaga 1260

acgcaattaa gcatgctggt agtctcgacc cggtacctca ctctatcaaa tgaaactata 1320

gtatacctat cgatcttaag atgtgggttc tagctgtgac tgcccgaaga aatagtattt 1380

caacgacccg atcgtctagg agcgttgtgg gagggttcaa tgctctcgta tcgattccca 1440

agacgttgtg gacatactag ctggcgaata atactatgtg tagtgaagtt tgcggtaatc 1500

tgcgtagtgg ctaattaaga aacaccgagc cgtgtctttt gcaaactcat cgaggcgttg 1560

actaaaatgt ctaacggtta gggcgatatt ttatttttac ccgcggttta ttatctatga 1620

gtactcccca ttcccatata gcgtgcatag tttacttttc catatgttat tagcaggctg 1680

tccgcccaaa cgttgcgcta gccaccgtta gatcacagtc atattatcat aacgattacc 1740

aggttatagt ttcactgact aaggagccca taaatgttca ttttcactag acatgctatg 1800

ggtttggccc gaccaagatt gataaactgc ggtaatggcg atatgattaa acgattaaac 1860

ttttaactac catggggaga caagacttct taactagtcg gtatggattg ctgcttgtaa 1920

agctaaacaa gctgaatgta agaacaggct ggccggttca taacactatc acgagtggct 1980

gacagagttt tacttatagt 2000


<210> 90
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 90
attcgcattg tttgagtagc cgagcactag tgggatcatt taccttctcg cggaagagtt 60

acaaaagtac tgaggaaata tgtgaattgt tatagctttt aggaaagtaa acatgaaaca 120

aggtagaaca gatgacgacg tgatacaatt atttacacaa ctggaaaatt ccgtcaaagt 180

tttaaagtat attccttgag tcctattatt gaatattcga aaggtagtca cctgagttgt 240

cccgtaataa ttacataagt atccgtatgg caacaaatat ctcctagatc cgggccgcgg 300

atagttttcg ctaaagtatc taaatcgaac ttcttagcat acgattacta gactatcacc 360

ttgagtagtc tatatctctg cgagtgtaaa atgcacacgc cgttaaatcg cctaaatgcc 420

tttccgtggc cattatatgc cccacttgct ttcaattcat tccataaact atgatcatgg 480

acccggttgc gagatgttac agataaagtc gaaactttca agagcagctg acgacaggta 540

aaattacgat gcactgcggt gtaaggaaat aatctccagg ttgcaataga catttaaatt 600

gtagaggaat agagttacgc aaaccaagcc caaggatcta ccgaacccct ctaccttata 660

caaactcgtc agccgaaata taccaaatag cacgttgcct agaggtttac attaatcatt 720

ttacacgatc cctttactat taatatatcg attccgatct aaaaggcgtt tcaaggatag 780

caatagtcct atcaaaatca ttcagttact ggcaatccaa ccaattcgct gtacacgacg 840

gggtgaggtc gtaaaatatt atatgtcata gatgcactgt ttgcgaccat gtctagcatt 900

tttcaatagc tccacccacg cgttggcgac ccattgttat tcaaaaatgg gccgcatgaa 960

gagttaattc gtcttgttct gacataagtg ttgaccatca gacaatagac gtataccgct 1020

ggttacctct aatcgaagat ccagagctcc ttatgcaacg tatagtaaac ctggctcgga 1080

aaggggttac tcttattttt agcacctaca ttcgggatca aatcatatgc actttcaaga 1140

tggtgctcac tataacacaa taacttgggt ttccagttag gatgaggaat ccgccaggtt 1200

actctatgaa gtcaagctct tccgtagttt aggcgacgct tgacccgcgt tcctcacaag 1260

taacgcgaca gattggagca atagcgactg cttcaccata tagggactta catacagatc 1320

gaatgatttg cagctttaac aacccataac gatctgcact agatgcgatg agatctctgt 1380

aaaacgaaac ttggaattac ccagagcagt tctaattaag ctttttcgat aatattacac 1440

agcaactaaa tgagcacgta tgctcaagtg tcgcaaaatc cttattgtat aggaataggt 1500

cgttgtcaca acataggtct gtcaccaaac tcagacatta tagtacttta cggagcatgt 1560

ttagacataa tctgcacaat gctgattagt ctcagtgtgg tcaaattctt taacgtctct 1620

gttccaatca aagtgagcag actgattgca tcacaactcc atcacttaac caattattaa 1680

tagtccacac aattcattca ctcttcactg ttcagcactc agtcatgctc tggatattcc 1740

atatttcccc gccacatata ctgagtttgg tcactcatat gttcgctaaa atcgattttt 1800

aagccattct tgcctattaa cgacggtcct aatcgtttcc cttcaccatg gatatacggt 1860

acgggcccta ttatctgcgt tacgcaatgt caataaaaga tattctaaga agaaaaaaag 1920

ataagttgcg taagcgtgct gcaagagaca ctctctcttc gcagtaaact aatttttcct 1980

ttaagaatac aaagcgaaca 2000


<210> 91
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 91
ggattagatt gtgccataac gcaacaggta aaattattag accagcaaaa gaatcctaac 60

gtatacaatt ttatcgtaca taacccgtga atcttattaa acccagccag gccgccttac 120

tttgctccaa gtaggagcat aatgcataga agtttcagta tcctgtctaa agctattaag 180

tcgaaatgag acaaaagtga cgagttatta acgatcagaa actagtctaa agggaaccct 240

cctgcggcca tttcttgagg acttacgtgc accatatcat gaggtcctac tgtgggaaag 300

gaaatcctca gtttacatga tttgaaatac tgtagtgacc tgtcaattta ctgatttcta 360

tgcataaaat gacaatctca ccgagtacgc ataaatcagc gcagatctca tatattcata 420

ataatctccg ggacgttatt aaattaattt ttttctagac agatattcag aagtccgacg 480

ttatacaagt gcccagtaac atgttctgag caaatagatt gtcgacagcc ccaattaacc 540

acctactagt ctttaggcac tgtgtgaatg aagctattaa gtactagaca taatgtcatt 600

gctggctcta gctgaagagt atacctagct ttttttccag atttttgagt acgggatctg 660

ttcttgttga acaaataatc tggatggcgc catacaggcg tcgcctggag cgtcaagctc 720

acatacccta tcgtcaaagt atgttccgtc aaaggtgtct cagcacttaa atacttaaac 780

aatccgagtt tcgagttcta aatggttgca caatatgcct ggtagattga tataatcttg 840

aagcaacgat ggatgaacaa aaattattga tacttacttt tacccacaca aaccgtctga 900

gtgtcttttt aagagggtta cgaatatata aaagcggatc acgatattcc accgggaata 960

gcgcaattag tcatatggaa catggtgtga aaccacaact atgaaatcta tccgtacacc 1020

aaccaagaga cctaaaagtt ttacataatc cgtttgcttt cgtattgccc tctatctaat 1080

gaaaacccat tgacaattat aaagaacaaa ggttatcaca cgctgcgtat ttagagaaga 1140

gaggacatgt gggatcaatg tggtcgcaaa aattatcact ttaatcaaca ccgattctaa 1200

gaagaaataa acgtcgtatt caagggtact gtataggtac gttaagcgtt gtcgtacact 1260

cagcgattta actaacagcc gggagaatgc ataattatga taaagtgaat ccacttagcg 1320

tctcgaatag aggctatttc gcttgcaatc aaatgcttaa gagtatccta accaatttta 1380

gacaaatatc agtatgttta tcgattaagc tggacaattc ctctacacag atgtttaagc 1440

gaactagcat tttcatcctc ccgactcata ggagtccttc gttgcacagt agatagtcag 1500

cgtgtgttct cttctccaat tgatatgctg aaaaactata ggttacccgt ttcggtcgga 1560

taaagaattt gacttaattt tcttgccgat agtaggtata ctgtaaggca gccaatataa 1620

ccgttagagc ttgattagta tgatattcgc tccttttaat gtatctacat ctagctctgg 1680

aaaacccggt gtagaagtaa tgtattaagt ctgcgaagcg ggaatctgct tgtgacaaag 1740

attctgtcgc ccgcaaacgt caagtaataa atcgcagata cggtcagaaa ttccttctgc 1800

atttcaagat tagtaatcta ttcgattcca aacatcctgc tcctaacaga atgcgcacgg 1860

gacctaatga acttttcata tacgtttcat caagcagtag tgttcggaaa cgagacataa 1920

cagggtacat gtgcatcaac ctttaaaaac caatctctat ttggtatagt cgtattcgaa 1980

atccagtagt gaggtgaaaa 2000


<210> 92
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 92
aattggagcc aaccataaat tggatggtag ttccaaaatt ttataaccta ttctagtgtc 60

tgcaagtatt taggagatag gtgaattaca cgtcgtacac ataaatatga taatgcgatc 120

aagagtgaat ggggtctata gtaatatgat gtaaaactta aggatattgt ggactgattt 180

aacgttacgt agtcctgaca agagtttaga tgccaggtcg tagaagttgt gtatccccct 240

attctcccaa tggtagatac cgtgataaaa gataaattcc tgttaaggaa gtcgaggatg 300

ttctgtggag tgcagagttc tacatgtgat gagataacct aagagaaaaa gtaatttata 360

gattgccccc gttaggagct acacccgact atttgtttcg ttaagatatt tgttcgtacc 420

atgctgttat aacgacactc cctcgaatct tattttatgg caattaaaga tgttacaggt 480

ggcgttggca attctggtaa actccgcact ttacaaattg ttgtttgcaa ctctctcata 540

ttgtatgcaa tcgaccccaa accctcatcc tcgaccctat gaatgaaggt tttctgtgcc 600

aaaagccatt ttactcaaaa attagctttt aatttgggga gcttaatagc gaattccaga 660

atcgtttcat ggggattagg agatatatta taggagtcca ccaatagtct attgacttag 720

tggttttggc tcatgcacgg tggacaaaac ttcaggcgtg ttatctaatt acaacccgta 780

ttcatacata tcaggggtgt tgatttcaga gaatagatta ggaaactacg agcaatacca 840

attttgaaga tatggtctac tagtagctca cttactcaac attgctactt tattcgaagg 900

cccatattga ggaatactgt cttgttgagt aaaacgatac ccgtaacttt aaactataaa 960

ggcataccag aaaaagtgtc accgcaggaa aatataagaa cgtccatcaa tatatgatgc 1020

aaactagaga aagagcttga taaattatca aactagcact tctgggaata ctccgtggtt 1080

gcaaggttac agggttcagt caaagagtta ttaaatcgat tgatatactt attcaagtga 1140

ttgattctat atagctacgc atatctgctg actttttcga aacgttgcct ggttgtccag 1200

agcatgtttt ggacgagaaa tttcgcgcag atatcatgat tacgattggc aactaaggat 1260

gactagcgta atgagaacct ggctaatttt gtgtttctta ttcaaattgt ataactaggt 1320

aaggaacgac tcgttcagaa tgagttctaa tcataatctt ctaaaatact gacagaaata 1380

ataatatata ttatgactat tcagaaaacc tataaaaagc actccgtaga agctcttcaa 1440

tcttagaatc ctcacctagg aacctgaaga ttattgtatt gacttatttt gtagttatta 1500

aagaaatcca acgacgggga cgactgcttg tatgtaatat ttccgttcca caagccggga 1560

gtaataataa gcaaccgtag aggagcaatg ggtttttatc tcacgcacag gatgtcggag 1620

tagcgagccg tctgagtatg ttatcaccaa agatatatgt aatatggtta atcagctgat 1680

ttaaagagaa cttcatccca acctcgaccg acgatccgat tactgtttat cgtcatacct 1740

tacgagatgt caggtcctcg cacaaaccgc cacaaattcc ttgtcactgc aagaataagt 1800

ttgtccgcaa actgtctacg cgctaggtcg ttgtatgtat tgatgagccc tatccttatg 1860

acactcggac tgctagcctt ctgagattta cgacaggcag tctagtatta aacccttact 1920

actttttgct gtatattgca ttgcaagttc caacaagtta atgaaacaca aaccgtgatc 1980

gcctcacccc acaaaaggct 2000


<210> 93
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 93
gtaagggtcg aacctctgat catattcgat tactaataac tccagatata tagaattgag 60

aaaggcaaat gtattttaaa cagcaagaaa ctgtttcaat tcggcttatc tgatgtacat 120

ttaataaata gaatgaagat cgagtattag aactgatatg aaagttcgta acatcaggac 180

gattagagtt tatgcatgct aacaggaact gacctgctga cattatatca tacaatttcc 240

tgcgtcccgc ttatggatgg cgtcaatagg ctagtaacct aattgcagct tagaataagg 300

agaaccaagt aacgacaaca aaatgaaaag caatagatgg cggactgcgc tttaattgca 360

ttgaaatact ctgggcttca agtgttagtt cattaaagct gtctcgcgat acacaaacgc 420

tgcgaagtgg ttccggagta aatgtgacca atgttagaca gtgggcccgc catgaatgtg 480

aagttagtta ctaggaagag tattctcagt ttggtgttta ctagaggtgt gcttggcgtt 540

tatctgggat aataattgta actcaattct attctttttc gttttttctg ctcatatcga 600

agttttgctc gcctcaatca acgttgtttg tatagcactt aggatcactc tgcgcatagg 660

gaatgcttaa atcagggagt tcatcggtgt ccatcctgca gggacatgaa agctgtcata 720

cacggactcg taccggtctg acaatccgct ttgcctcata gcaactattg agccgcattc 780

gcgtggagct gaactatcag aatggctaga aaggataaac ctgtggtggg tccacgagat 840

tggtcttctt atgttaatat tagctcacaa agtccagagt tagtatccat ctcttccagt 900

cacatggaat tttactaatt attgtggtat cattattata aaaatgacat tatctagcat 960

gactccctac cactagtgca gagctactat gtacataact cgctgtttat gcgatactcc 1020

aacaagtaga tacggtaatt tcgatatagg atgaaaaaac cttcataaca gcttaagttt 1080

aacttcgagg gtccgtgtaa tcggacaacg cacatacgaa gtggcacgac ctttcatttg 1140

ggctcccttt tgcaggctag taaacctagt atacatgaaa gccgtcttgc ttgtgcctac 1200

ggcttatttc gttgaacgta cgtctaatag tgccaaggaa cgaacacacg gctagatcat 1260

aatattactc caggtgatgg tttcggtatt tgcaaagtaa agataagtta tctgattcac 1320

aacaatcgag aatttgtcct gtttgaacgc cgaaatatta tcttactatt gctttactca 1380

gatacctcca ataaattata aaatggcttg tttgaatgtg tatcgaaacc gaaagctata 1440

tcttttgacc gaattaacca aatgctacgc gtttgctgtt tattatgtcc atcatcgctt 1500

taggttaagc ttaataggtt agggaaaact accagcattc acataatatc ctatctagga 1560

agttaaattc acccatgtat actatactac ttagtctaca atatttctgc tttattcttt 1620

atttccatta tcaaagtatt tcggctctta aatggggcaa ttacgaaaga tatgattcta 1680

gctcatgctc aattgagatg aatttatgac tttaatgggg tgtaccattt aataatgcag 1740

cgctaacata acgtgcgacg ctaatatcat ttactaatag attttcattc actataataa 1800

ttaataatct tctggcccca tggcacaggc aattttaaat ccgtacccgt cagccctaaa 1860

atgccaagat tagtgaatct ggtgtcatac aggactaaca ggtgcaaaaa ccggttgcgt 1920

catcaaaacg caggatttac tcaggatctt aagaaatcta aattttcgca gaatcgctca 1980

tcgccaaaat tttaggcgtc 2000


<210> 94
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 94
cacgtggttt tcagcggtta acgcaatctg cattattggt agaattttac acttaacaaa 60

atatcaccac gcggacaact gatttagcaa atgccgtccg tgacgcggga cccgcagcac 120

attattagac atagtacatc agcctgtaac cgatcagtca tcacatatcc cggaaagatt 180

tcaatccagt tgtaatcaac gcgtaaagtt atataatcac ttcaatcacc ttactaactt 240

cagaatggca gcctaaaaat ctgatgctac gaaccgcatg gtgttgaata aattcaatag 300

aatggagctc ctggatattt cacgacgccg ggacagaaat agtgttatag agaagaaggc 360

atgccgtttt actcgattcg taagtagttt gacgaagcaa aaacttgggg aagaacttat 420

gagttagcca cgacaactac cgggaggatt tgcttttctt cctccatgcc aatcttggag 480

ggagtacctc aatcacacga tgaatcagcc ttaatgggcg cccaaaacat tcttggtgcc 540

agaaaagcgg atgcttcctc gaatgtgtaa tcagaaaagt ggtagatgaa tctccggctc 600

catcatggat agagctgcag gtattggtgc agcaggaacg aaggttctac cagtaagtaa 660

agtttgacgt tagttacgag tctagaaggc ccaaagggca accaaaacgt cggcaccata 720

acatctacag gtggtaggct aatgtaaaag tggttataat tgctaggcag aaataaggcc 780

gttcattggg catgtgtaca ctccattgat ggagcttaat tcctctcaaa ataattacat 840

tctgttaaca agaaataact tattggtcga tctacgagct agcaataaat aatcatgacc 900

aaagagctgt gctgtgatca gaagttatga cgcttataca gagagcattg taaagggcag 960

gccgaagcaa attcacagag tacctgaagc gaacaaagga agagacttct ttataattta 1020

catcgcttgg caattaaaga agcgaaacac agttgctcga atcacatcct tacgtgtcgt 1080

cgacaatatc ataagcatta ctagtttaga gaggtgagat atcggtagta ggtattagaa 1140

cattctaata cctaaagctc attactatta gcacctttcc tcaccttatt tggatttccc 1200

gcacgccgtt cgcaccgagc taagtgcaat aagccatggc gatgacttag atgtcacatt 1260

gccccatgaa ttcaccccag tgagttgaga cgatttgaag tttaatacgt cgttcgtgga 1320

cagcttgaat gtttcacacg tggtaagttg catatgaaca tataggaggg gccacaaagc 1380

ttatgcgtga agcaaatatg attcctccct cgatccgtta attagagttg ctgaagggca 1440

taaactttag cgagtttgta ttaacatagt catatgaagt aacagagacc cgtcataacg 1500

cttgaaaacc tgaactcaga atgcgctttg tgtaccatag gcatataccc cacattacgg 1560

agatgataat cgacaaatgc tccaagaagt agacctctag ccatcatcac gtgtctctac 1620

tgtattctcc gaagttccgg aggccagttc ttaagtaggc acagaacaca cgatggattt 1680

cctagggacg tacgtatgtt cgacttctcg tcagtaatcg cgacagaaat gggaaggtga 1740

gcttaaccta acccacattt ttgtcatggg actctgtgaa tggtgtttct tatgaagcta 1800

tcacggtgta aagatatcta gacacgctat gtgctactcc gataacccta cgtttaggtt 1860

tacgagattg gagaaatata ctttattaat tcttccctgg aatcgtacca acaagttcca 1920

aaatggctct gcggtctgtc aaaatatgaa gggctcaact tgacaggacg actgaccgga 1980

aatgatttaa gtgaacctcc 2000


<210> 95
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 95
ataattatcg acatagatgt gcttcactcg atttgacagc tggatagtaa gaattagtgt 60

ataacccaat acgtatgcta atacaaaccc tggactgatt tgaatgtaat cctattcata 120

atattttagc taccgtaaat gtattctgca attgaatttc gtgtgaatgt aaaaggttta 180

gaagtttcct aagttatcgg gtgacgtttt taatgggtct taccgtagat tcagacaatc 240

ttttggaaac caactgaaga aggaaatcac acgacctggc ggataagggt ttgtaattcg 300

cgttaaaaaa ctgacgtttg ctataagaga cgttaatgta aatgtaacgc tttaaattct 360

ctgtgcgaga gttttttaaa tgagatcaag gattgttaat ttcaggaagc tccgttattg 420

gattttgcct tctcattcgt cactatccct ctccgatcaa tccgattgag tcctagtgta 480

gaaagttcac atagaaagca gttttccgat tagtctagcg gggtactaag tgaacactag 540

tcagttggtg atatactata gctaggctgt gataatgtta atcggtttgt gcctactgga 600

atgcttaatt tcatcttgag gacttgcgct aggaatcggt atgtcttcgt taagtccaaa 660

gtgccttttc gacagatgtt ggattgatgc actcctccga aaaggaatca aattgggttt 720

ataaattttg tctttgtgac acctgccgaa tttagatctc accattatcc acaataaccc 780

tattatcttt acctacttcc gtcggagctt gattatgaat attggcagaa ttatgtaata 840

gtcattaata tgttgaataa agatatcaat acattcagac aattgaatta atcctgcgta 900

aaaacctact taggacgagt tgctggtatt tgtttttata atggtagaca tgagggacat 960

attacgaacc tctgtaagcc tgttctgatg tggccggcga tcacgttacc tgatgagatt 1020

tatagatctc aagtcggatg tcctctttaa taaactgaaa aattgacgac taagtgggct 1080

aattatgcca tcagaaataa gctaaccaaa cctctaaagt cgaccctgta gtataactgg 1140

cagtgctaga tatcacaggg tgtttgtcta ctgaaatttc ggcattctgg tcacacttat 1200

tgccgatagg ttctagtagc tagtttatct agactccaat tgaaagctta cttcggccta 1260

tcaggttgaa tgatagacgg tctgtcttaa gaaactacag gacatatact gcatcgaatg 1320

cgtttaaatc ctaacgcaga agggttgtta tctgatcatc agtaagcacc aatctgcatg 1380

attacagacg taccaacaac tgaatacatc ctgcctcctg agaactagaa cctattgtat 1440

tgcggatgag ggtaagatag gtagaaacct gctgccaact tatcgataat aattatgaac 1500

catgcgtggg tgttgatata gacttaatat gacctcctgt ctggttcata taccagtttt 1560

caatgcttaa gagaactagc ttgtacggag tttttttaat acaagtgcta aattaacaat 1620

tgttcaaaaa cagtttatag tagtaaggta ttgtaccaat cgtatagcaa taaatcatac 1680

ctgtgtttac tccatacttt cttgattatc gggcacgaga agaggacaac tcccaaacat 1740

caatgtagcc atagtgaatg aaaaaagtcg gttatgaatc gttagctaaa tcgtttgctc 1800

caattaacaa aactataacc taaactggtg aacacataga taaatgccaa ctcgttatcg 1860

tgttatgcta tagatccgaa tttggtggtt ctccgagtct gtatcgtttt taatcgagat 1920

cttaccttat tcctaaccac atttcgtaag cctattgaaa cgggtattgc cggttcgccc 1980

atctggtagt acgtaaacga 2000


<210> 96
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 96
gaggttagtg atcaagcgca ttagcttttt actgcggaac gcatacagga tatttacgct 60

taaaaaggtg gatttcgtat ttattaagta ttctctttac tgaattattg tccatcagta 120

atcgctggct ttatgaacta tcaacattcg gtgttgtgtt aagttattaa tgacacatgc 180

tcgacgttcc ccaattcccg tgcgtgatat attatcatat gaccattaaa tgattaaagg 240

ggcataatat tttgaaataa cactattaat ttgaaacttt tgtccttttc gcactacatg 300

ttggtaacat cgcacgcact aaatactgac atatcgtgca ccatgctttc taatagcact 360

ccgttccagt ccatagctga gactgtcttt tcggacaaca caatagataa gagtctatct 420

ctcatcaaaa ctgtaagaaa agctctacca taattggggc cgaaacgtaa tacgattatt 480

atgatatcgc tcctgccgag gtcaaacacc atagcactca aaaatggtat ccaatttaga 540

ggggctatga gtagttaaaa aataggaatt aaggtggcaa caggacagaa gtcaataggt 600

tcccttgaag gctagattaa cagaactgta atgtgactgc ctgtaagcgc actggagaca 660

tcaagtattg tacgagtata attgcacttt ggaggtacaa catcgcactc gactctttca 720

tcgatatttt ttcgtgggtg aacttgagtt aaagttgatg gtcccattca caacgagcgg 780

ttttcgcgat gtaaacgccg gccaaagaca acctaacgcc gaattattct acttcatatg 840

cctaagtaag cccgttcttt ggagaagtct catcctctat tattatacat agttatcata 900

ttagtctagt cgccaaagtg tggtttctaa ttgataaata taataagtta aaaaatgaga 960

gctcaaagtt tttccttacc gtgccgcaca agtaagtagt ctcaaaagga ccgcgtaggg 1020

agggaaaatt taatgagttc taatataata tgcaggcttg tgaaagctga cattgactac 1080

tctggactgg tcggatagtt gctagacata cctattgtga caaactgacc cattatcgag 1140

tctagtagaa ccggtccgta caattacaca ttcttcgtaa actagttcta taaagactaa 1200

aaaaatctat atcacttgga gaattatgga agatgagtca actccgaagt gtggtcaaaa 1260

atattacaga ttgtatcaaa tcgaataggc cgtaaacaag gggtatacgt tcacagtaca 1320

aaataaatca aagccttcaa ttatatcgag agattattac actaccgctg ctcttgacta 1380

gtcaaacgta cctctcattg acaacattca gcatgattat tgctccatgt caaagactcc 1440

gtgttcccat tagttttaaa ggcataattt atctcttttc ctcttggata acgagagata 1500

attagacaat gctagtttca ccaagcccga ctcgataagt ggcggtttta gcctacccaa 1560

tcgcctaaat atatcaaaaa tgacttgtac gcgataatac tgctcgggta gttaacggcc 1620

aagtacacgc tcacagaaca acggttgtac cgcttatcta attagggaat gtacggctct 1680

ctcactaata tgcgattaat ctattttgat ttttatgcag agcatcctaa gtgaaactct 1740

agatgccgcc aatttttgtt tatcatttcg ccaaccgtga attccaagat ggcccgccaa 1800

agggcgtata aatcgagtat ttacgaagta ataagttaat tctaaaattc tttaaatatg 1860

aagacaaaca atgaattgat tatgatttcc agatatttac tttggtaccg gattaaaccc 1920

atttgaacgt cattcgatat caaagtccgc taataagggt ttcaattaca attcttcagg 1980

agaacacatc ggtaaccttc 2000


<210> 97
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 97
gcgcaaacca gcaaattagg tttgaccttc aacaactgta actcgatctg cagacgagtg 60

agtaacaaca gctactggta caattttttt gtaccgcagc attcaggtat taccccttca 120

cgctcagtac agaggtatcg ggcatccgta taaaaaattg acttcttttt acgatagtcc 180

aatagaccgt tagcttctac ttcatagtac taataataac ctaatgcaat agtctggata 240

acattcacgg gacactgata ctagaatcaa ctacgctgat gagcatgtcc agactgacaa 300

tcggtcgaca tgagaaggaa tagaaaaaat cctaccctgt taattctggt catgtttgct 360

ggtctctttc ctactcggtg cttctcaaat gccacatatt cgagcataat acctagttat 420

aggcataaac ttattgttgc tgcccatgtt gagcattttt tatatttagg ccttttacga 480

atttctgttt ctattactaa agatgtcaga gtaataccac cttcagacag aatcacatga 540

ttaaaactat agaatcggcg gtacaaagat gtatctcacc tatagagtat gctgataaaa 600

tcatagaccc tagacatact attcttatcg ccccttagaa attattgtag gggttgcgat 660

tacaacgcat acggtatttg ctatatgagc actcatggct tatgtgtaca atttattgat 720

atatatattt agagctccgg atcgggttac agaatcactt cacgacccag caaatgctaa 780

tgatttaagc gtagtatatt ggctttgtgt ccagttttca ctacgggttc ctttctatgt 840

cctgataatc tgtacaaccg acataccctg aattcatgcc gcatatgtcg tgttaacagt 900

gatctagggt ccagtgatag ggtcattttc gtatcgtcgc atctgtatcg attggaaaag 960

aattatacag tccgattatc acttagaact acacgagggg acctcttatc tgccctacct 1020

attggagtta aagttctaac tgctcaatct caagacggcc gaagatggtt ttaaaatgac 1080

ggtccacaca tttacagaca aattggaatg cttagatata tcctactgtt gatttttgtc 1140

caaaattaga ggcgatgtaa ccccactgaa agattgagca gtacagtaat tctaacttga 1200

aaaaataaat ttttgggtat gctcaatctt taaggtgacc tactaacaat atcctagatc 1260

ccatacggta gttcgacaga gatccaatac attctaatcg aacattagta agttaaataa 1320

tatagagcta catttctaag taaatcgatg cttgaagata ttggtagttc gcagaatttg 1380

catccatcac aaacactagt ctttacgttt gccaattgct aggtagagta gattacgagt 1440

caatcagaag accaaatttt ttgacccata ggatacaaca cgtagtcatg acaatcgcat 1500

atcgctagta tgttagatct aagaaaatag tctacttaac cgggtcatac atctcagcta 1560

ttaacgatat tatgttgcct tatgttagac acgtcaataa gtagagcatg catttctgcc 1620

tcaaataaca aatttgttaa tatgcaatga atacctgagt tgaatgaacc caaactaaac 1680

tcagggtcct tccatagcga gagcgctagg ctaacatgag attctgacgt cttcgtgagt 1740

tgacaggatc ttgccaacaa attacatatt tgaataggca tgtacgatcc attatactat 1800

gagtgccaga gaaaactctg ctggccgacc gttttacggg gggaaagtca aatatgtagt 1860

aagtacgaat tttcctggga gactatagtt gctgaacgtt cttattctca ttttcttgaa 1920

gttaaggatg gtaaaacata ctatacctat gtagatattc tttggtagta taactattat 1980

agtagcgtag acgttatgtg 2000


<210> 98
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 98
gcctaaagac ctctatattt taagctagca taaaggcagg agacgttcta acatcgcacc 60

gagttcgact atgaagagag gtattatcaa ccctgtctcc cagttcacac cggttgcatt 120

atcatgacgt ttttgatttg ttttttttga gtaacgggtt cattgtacgt tcgatagagt 180

actcgataaa cgactcattc cacgcaagcc tattttgtaa cttataacta gacattagtc 240

tatggctact ttcacacccg aacttacgaa caacgagtat tttttttttg gcaaaaacgt 300

aacgttcgta tgtggcctaa gtcattaaaa gacaaatatt gaagaaaaac ccatgattta 360

ataccgatag gacattacaa gggtcattag agataacaaa taaattaggc ttcttccaag 420

agttatccga ctagttgtgc tccagatctg cgatactgat cgaatttata cctcattaga 480

cattcgtagt cattggtgtt ggacttgaag ttctgtacaa tcctcggtga tcactcttgg 540

acaacctgct gataaaacat gtctatcgtc agtccagttt gtataataaa ctaatgagac 600

aatatacaaa acaatccgtg gcactacatg ttgtatacca acataaattc tgaagaccta 660

tgattcttgt ggccgaatag tcaacagatt ttacgatcac taataaccat atatctgtta 720

cttgtcttct cagataggag cggactagaa atactcactt atgttattct tacgttactg 780

tgccagacga gaggtttttg cagactctat ggtttgccgg atcttgctag gaaaagggta 840

actggtgcct gattgcatga actatgtggt atgactatag atgaagcatc cgtcactgag 900

ctcttcgaag tcttttatga gacaagaata ttctttgata gaatcatcta tgtctcaatt 960

taatcaaggg aacggttggg tactaaatcg agttatcatg aggtcctatc ggaatgcatt 1020

gtatttgagc aatatctata actgtaggta ctatggcgga tatttatttt ccttgctgcg 1080

acttcatgta gcaagtcggc aattccccgc ggttttacat tttctgcttc gaggtattaa 1140

ggccctaaag ttgtatatat tataaattaa agatctggat tattaactca gtgcagaggg 1200

cgtaatctga cgtggcgaca tgtagatgaa gcttgcccaa aagatatgag atcttaatat 1260

ctataagaag tatgcctact gttaattttg gggagaaatg ctaccccgga caattatgcg 1320

attgtcaagc gaatatcttg attttatcct tggaataggt atattacttc ggttacacca 1380

gatatgaacc tatctattac ttcatatttt actcaggctt ggtcgggacc tgtgttactt 1440

taaaggcatt aaaacataca gcgtcgacaa tcctcctaat caatatcctc agaaggaatt 1500

tactcgcaat agcgaactga gttttttgcc tgtacaacgg tcgtgcctac tcaatcattg 1560

ccgcatacta atctctatca tattgccttt acggggcgac caaggaggaa tcctatctaa 1620

tcccagggca cctggaacac ctgcggaaca tgcttcaata ataacatcgt ataagtctat 1680

gtctgcgctt gtgacgtcat agtacttctt ctagtgatat attacgccgt tggattggga 1740

tcacgtttag aacgacactg tgaacttcta tatgtactct tttctcacga tatgccgtcg 1800

agttttttat cgataatagg cagtgttgga gcgggacgtg tcattagtaa taagtttttc 1860

ctatcaattt cctgcgatac ttgactcctt tggggcaaac atagacgacg gttggagtca 1920

aggtgaacca aaatagaagt acctgggtaa atgcttcata ggcacttgga caagacatta 1980

agtcgacaca ctatgccttt 2000


<210> 99
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 99
aatgttcggt cccgggtaag ctatcattct ataaaagtcc caccccgctt atttaagatt 60

cacagcgccg caatgacgcg gaacagggtt gtctatgatg acctaactac ggcactttag 120

gtatcatata ttgagttgag cgaatggatc tgctaggctt cccgtctatc ggatgcttta 180

atgcaggtta atggcccgat tgaagtttat agtatatata tacactgtga tggtgtaact 240

acgttacttc gttactgatc aattttcaaa ttatctcatt tgttaggcta caactaggac 300

taaagctcaa gtaaccgatg cgaagaggcc gagatggtat aatcaacggg ggtgtaatct 360

aatatacgaa tcatgctagg agagcagctt atcgtcaaaa ctctgttggc cagattctaa 420

ttactcttta ttgtatcttt tttcatgtag attaaccgtg aagacagtag ttcatgtacg 480

ttagtcaatt attgagaaca ttagcttgaa tggacgcgtg ctcaaataat accccagtaa 540

tctaaaccat attgttaatc ttttacaaga cccaccaatg acctaatgag ttcacctcca 600

catacctgtc attaggtgac cttatttcca catttgtatt aaatactaat aactgaccat 660

attgtgctgt ggttctgtac acttgtatac ctgttcggct aatactagtc agtgatttca 720

tagcgaatat aacatttgac aagactgtag caacaagttt ttggtatagg gtttgttaaa 780

gcataccgcg caggacgacc gtctcttaca ttaatttact cgttttaatc tataattatc 840

catataatca actagtcctg agccaaatct tcaatttccc ccgcgtttga gattgcttga 900

tgaggcgaaa taagaggcga acggaactcc aaaaaagagc gatcttttat cacgtccctc 960

cataacgctt tataagtcat tagtcggcat cgttacaaat taatgataga ccagaaagta 1020

cacagacgtg tcttttatcc tgtaacgacc ctaattcggc accgtctact aaatgctttg 1080

ccgtacgctc tgatgattct atccagcgat tacgtatatg ttccggggta actacctaaa 1140

tctaatgcgg ccataggccc atactgatcc gccgatttcg cgcactgctt tacttatata 1200

catcagtact actcgggcaa ccggtaaata atttacaata gaagtttaag tgcagttaca 1260

tgcttaagat atcgagagaa cttgtgaaat acgtacacta ggattttctc aaattcgtga 1320

cattacaagg tctggtttcg cgattctctt ggactgatat aatatgattg aaaaatgtag 1380

tagatatgat cctggataac atttttaaac aagtcttggg tgagctcggt accttaaatc 1440

cgatcataga atacaacatg gcacctacat tcatattaaa tagtctatta catgataaga 1500

ctccttcatg tctgaaacat tggttagaca attcgcggtt tcagtgggta gcgtgttcta 1560

ttgacttcga aatgagaaag tgtttcggcg cgtacggtat atcttccccc atgattatac 1620

ataacatcct tctaaaaatc gcgccactgc agggtcctct tttcttatat attattgagg 1680

atttggaccg atcaaactta atattaaata tgattctaca tacaaaggta atgatggcaa 1740

tctacttgcg ggctcgactc gtagtctgtt caatgaaaaa tacatttctc aagaaataat 1800

cttcgagcta tttcactctg tagttaaagt ttcaatcttg ttacatactg cttatacaaa 1860

tttaatttaa aagcatgtgt caatttaagg ctaaatgctc agtgtaaatt gtattggtaa 1920

actccctaag actaatgaat aacttgataa tgtggataga ttaaatccgt gcaagcctat 1980

cctaaaatca atttgaagtg 2000


<210> 100
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 100
tacaaattgt ccacgggcgt gaaaacaagc ccattcttct tcaattgcaa gatttgcgat 60

acttaaacct tactgattta ataatcgatt caaaacgcaa gagtcatgaa cagaacgaga 120

ccccgccata tttaaatgca cattcgtgca gcgatgggta tattgaggct gtgagaggct 180

caattaaaca ttttaccagg agatgggcaa aataatgcgt ggggatcgcg ggactataat 240

ctaatcagtc atactctaaa gtgagcttcg tgatatcttg aggataaaaa agggcctaag 300

cgcacagggt tattgagttc cagctaatga tgctcgataa taatcggccg taacttcaat 360

gcgaagagaa tatacgattc tgaacagtta cagataaggc ctattaggcg cgaaaatagt 420

cgtctaaaag aggagaactg ctggtcgaga atgagtgggg gttattctaa caaaggtagc 480

taggtgtggt tataaacgag aaggactaca cccaattgat ctcgataata gggcgggatt 540

gtttattgac agtagtgagg tgttctaata acagaaattt agttaaggtg cgtattcttg 600

gagtagagca caaaacccgc taatgagcat tgtatgaatc cgcgacaaaa gagcaaagat 660

cacagcaacg aaagtctaat tgaaatagtc ctcgattatg ccggtgagtt gaaaaaagtt 720

gtacgttcgt ttatgccgtt ctagataatt tacacatcac attcctcacg taactacatg 780

atttacctac tatcacttcc aatcaccaac tcggatttag gaatactgta acttatttcc 840

gattatccga ttgagaccta agcagaaaaa cataagatgc ccatccgaat tgtgatgtgg 900

ataccagttg tgataattcg tcggattgaa ctcagcctgc ttaccgcttt tgatcgcagt 960

cgccgcgggt agatgtagtt agcctcaccg gctggataca tatctccagg aaatcgcgga 1020

gtatcaatct ctagagtaaa tcccctgcct tccgttgatc gtcttgctca cctaaatgtc 1080

tgaactaggc tgagaacaca accatactcc ggccacgtag acgatgctga atattacgca 1140

gctatactca aagttaaact cttctcagtg atttatgatg tagcttagtg atctttacag 1200

atttggtatc gattgggaat ccagtttaaa actgaaacga catatagaaa tatgtaccaa 1260

tctaccagcg caaaccgagt cgaagtcata ttatacggta aatcaccatc gtgtgatata 1320

ttgcaatttg aactgatttt taatccctag cttaaatact tcattgattt ctcgccttta 1380

attctctgaa cgttacaatt tttctgccca acggtcctcc tctagaatac ctcgagagcc 1440

gacacaaata cagttagaga atttttggtg atttgtgcga cttattagaa ccacggggtc 1500

atgaccttag cccgaatagg tagtatccgg atatctgaaa ctccaggcag taataataca 1560

ttgccggaac gacaatcgga tctagtgaat gcgacataga cggtaatatg ttaagcacct 1620

catagatgat tactatcagg aaatatcaat ttaaagctgc gatgaaaggg tcaggaccca 1680

gccctttcaa gtctacgtaa ctccactagc cacattgtct aagggtgcca atcatagatc 1740

atgcatcaac accggcgata cgcttgttca ggcattcata tcttatagtt ataaaatttg 1800

tttatcgtgt gcaggggtcg atttttctca ctttcggcaa ccaggaaaag tagtaattac 1860

tatataaaat gaaggcgaat ttcggattac tctgcaaaaa atcattagaa tacacatcta 1920

ggatccggag gtatctgcct ccatgaagtt aactccattg tggatatgat gcgagtaaca 1980

tatttaggtc cgaagaaagg 2000


<210> 101
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 101
atcatctacc taagacagag ctgaccgtat ccattgtcaa tagaacagca acgatttttt 60

ccatcgctgg aagagtgatg cgcactagtt catttcggac aagtaacttg gacgcgatac 120

aagatacaat cgatgtcaca gcctctttag tacataccat ggaattatga atcgactaaa 180

aacgcagacg tataattcag ctgatcgaat gatttcgatt atataccgaa gtcagtgacg 240

agaaccttca ctttgcggga taccgaactc tgtcacaaga aataagtata ggttagaatc 300

cagagaaaac attgaatatt atgttttttc gcaccaaaat aatccaacga tgttacgctt 360

agttagtgga tatcatgact tcactaaaca cttggattgt tatctaaagt ttttatcttc 420

ctggctgcga cattgtttat ttaagacgta gttaaaaaag tcgaccacgg aggaggaatt 480

acatcgtcgc tgatgagccc attttcgcta aatgcagtcg actacgaaga gtttttcgcg 540

tatcgtcaac ataagttgat ctttttagat aacaaacaaa actcttcgca tcgacgtaaa 600

acatttttca taggcgcttt ttacaccgaa gaatctcagc ttcagaattg tacgatgtct 660

tgtcacagat atcctttaaa caaataacta atagcgttga ttgtttgaca tctactcctt 720

attgttatga atgtatacca tattgttata tgctattaaa tcccacatat tgcggttcgc 780

actaaaatga acatctatat aacttgactg ttacttgaat tagttatggt ccagctaatt 840

tttcattcta ggcatttaat cctttatgtt ccatagtttc cttcgacgcc ttgaacgatg 900

ggtgcgagtc cgacggacta acatttataa acacatttgt gggtttgggt ttgctacaga 960

tatctggacg caggatgttt agagtaacat ctgttgtcat ttggctagca aaatttgagt 1020

tacctgatag accttcctca ttcccttaat attaaactgt ctttctcgaa taccgttcgc 1080

acagggtcca ggaaatgtga tgttatgacg gcgtgcaatg gttagtcctt atgcaggagt 1140

ttctccgcac ccatcaatgc cattatttta cagtcaaaaa aacataaact tgtatgacga 1200

atgcagacct ttgaactttt gttaacctac ttttgtaaaa ccagcgaacc ctaacagtta 1260

tgtaacgaga tccgttaacc aaaagcggtt atccgaggat aagcttccta cgacgtcaca 1320

tttgtcatct tccttaccgg tatgaattgt atgcaggtcc ctattcgaaa tgtggttata 1380

actgatgggt atcagcaggt tatttataac gcgtacttta tccttgtagg ttagttgctc 1440

agtacgccca aatcaaagag gaggccgagg tgcaggaagg acctgactga caatcgtaac 1500

taaattatcc aacaggattg ttaattgaca atgtttacac tgactatggc aaaaattgtc 1560

tcccaaacgg ctgcggacag cgttcttttt atcgatctga ggtagcactt gcatatggat 1620

atagcaataa gaaataggga gataccagcg aagaacggag tagatgcctg tgacgtgtgc 1680

cgacctgaca ttgattatcg agcatgcgga ttaaaattca acaactattc ccgtgaagag 1740

tgccagcctg tagtcaatta ttgtggatat tatctaagtt cagatcatac ctctcgtcgg 1800

tgaaaacaga tagaggccaa agggcaaatc tattgaatga ttgacaattt gatcatatac 1860

gtgtctaaga attaattgta acggatgcga attcgttaat cttcctgggg tactcttctc 1920

cacgtcacga gagataacaa caacatcagg cttctgataa atagcgtaac aacgtattat 1980

caaatgcatc ctgtctgtat 2000


<210> 102
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 102
ttaatgaccc ctgccttact gcataaatct cctaattgtg taatcactcc tcactcagat 60

aacgctttac gtatggatta ccaagtaagt gaaatcacta tacaagagat tgcctaattt 120

tgctaagtta gcgttgttcg tgttttataa ttttattgtg agtctttcac cgaagtagaa 180

ggaagtaaac tcgcagtttc ttataaccac ttctaggcga tgtagacgac atagaaaatg 240

gggtaaggaa ctcataattt ttaagtcaat gatacagcct taaaagataa aaattagatt 300

accgtttaat gagggtacgt gaccattaac agtaagaaag cctgcaagca tgggacaggt 360

gctattgcag agctcataaa cgaaatgtcg cttgggcgtc ctgcaccaga tacttagtgg 420

cggatgtcaa tagcgaggac gaatcattgg atgaatatta gctagtggat acggaaaaac 480

gtgactacga ttgcggcatc gagttcttaa ccctctcatg gaggcatctc tcgaccttac 540

acagtgagag tgcattttgt tcgccagtct actatgacac attaaggctc aaacacgctc 600

tgcttattca tttggccttg gggttctaga tcacactaca attgcccttt gcaagaaaaa 660

caaatgtcat tgaaaaatta actgctgtct tataaaccta aactaccaga tactgtaatt 720

ggttttaggt ttgagcatcc accaacacca atagccaaga ttgttaaact ctaataactg 780

tctaatacac gtgcatattc atagtgaatc agtgcggttc attttctgaa gagctccaat 840

ctgaacgata caaggcgtcc tgcgcgtgga ttaaaaacaa cttaagcgtt acgcagagca 900

gtattccatt ttataatata ccgtttgccg caggaggtta tattgtagaa gattagttca 960

ttttgtgggg gatttacagg ccaatattta ccaaatttta cgaggtagtt gaacctagtg 1020

ttacttcgtg aggctcgaac ggtcttcccg ctccaactgt acctttagat gggggcttct 1080

ttggatgtaa cgaagtaccg gcttaatatg agacgtttgt acgcgaggca ttcttattta 1140

acccatactt aatcaattca aaatttatct tggtgagtag cactggagaa tttggtatcc 1200

atagcggacc gatagaaaga ttgttatacc aaaattcatg aatgacgctt agtattttct 1260

agtttgataa catggttaag actacattct atccgaattc ttattaaaat tgaaatgacg 1320

cattgcatgc tgtgattcca aaaccatgcc gacaggaggt cttcttaaaa attcagcgtg 1380

aggttactac accttcaaaa gtgcataatt ggtggacaac taaaggataa ttgggtaaga 1440

tctttctaca ttccattaaa aaattctaac aaaccctatc tcatgttaag tacttatgtt 1500

gcctcttact acattgaccc tacactcaga tatgataaat tgatgtttaa cctaactatt 1560

taaaagctca ataccttcct ttttacgcgc aataaaaggt taggcacttt taatgtgaaa 1620

tttcagcgaa atattcgatc ttgatataac taagtttaca gttcctatta ctactcatta 1680

taatagaatg tatgggctat gaataataaa tggaccctta gaaggataaa tgcattgatt 1740

cgatgctaga gtaaactgat ggctcagaca gaatcatgcc catggggaaa cataacacct 1800

aatcagcatc aactaaaagt cacatgtacg agagcagaat caaatacaaa tcaattatat 1860

aacgtgaacg tagaatccgg accagggacg tttctactct gactatatta ccgccagctg 1920

ctatagtaat cgcgtatgga gcatgtattt gctgactaat gctaaagtac aacattactg 1980

tgtaatttaa aatgctacct 2000


<210> 103
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 103
tgtacttgtc ttcttgtttg tcacatacgg accctaaatg accttgtcta gttatccgat 60

acaccttgct taagtagcct cccctagggg gaacttatta cggaataaca gttttacagt 120

attaatcaaa ctcttatcca cgttttcctg tgatcacaac gtattgtttc ccttgatttg 180

ttgagaatct ctattgagcc ttttatctat tagagtctcc gtcgcacata atcccggtgc 240

gttgaacaga tactggctag actccttact tttctatcag ttgaacggag gatacgagct 300

tcaaaataat gatttgtttg tagatgtcag agcatcgtcg tgagaggaac ccggataggg 360

ggaataacag gtagcgttgc ggttgcctga ctaaaaccca ggactcaagt ttcattatta 420

acattatttg catgaatgac agtgtcgcag atctggtata atgaccaacg atcgtttagt 480

agataaattc caatctaaca aacactaacc agtatctcag cccacattgc atcttgtttt 540

agcaatcctg cagatatcag aaccctcctg cagtgaattg actagtgcac gacggtaaca 600

tatctcttta atagcgcacc gtcctcaacg tagatgttac gtctggggtt atattgggcc 660

ggaatgtcct gggcttggac taatgaaggc aaaggctata aatgtgctta ttatttactt 720

ctgcgtactt atttggagaa tgtcatatta aagatgtcgc ggtggtcgga ttaattgaat 780

aatgtgcgac ttggatgcac ctcaatcttc attgttttga aaagtctgga gacgtgcaat 840

tacactctat atgtctttgt attaatcgtt ataagctcta aaggagatag caagctcggg 900

caaatggtag attaatgctt caagaaaata caagcctggg gattcacatt ccgaatatac 960

aactaatgac gctctcattc tcttgcaagt atagtaatcg gcccgctact ctatggggag 1020

tatggcatca ggagagagta tcattgacat tcgaagtttg catactgagc aataagcggg 1080

taatgcttca aaacaaagtg cactcactta atgtcggaca ttgtttataa gtgttagcgc 1140

tcaattttcc gcaatcacgc tcgagcacta atagttggag ttcgctttag tttgataata 1200

acaaatatga ctttgtcgcg agattgccta tttgcatcca ggactatcga acgcaacaaa 1260

ctcgtgaaga ggccgcattt taactgcagg atagtaagat ctaattatga aatacatagt 1320

ccagaaaatc attcgagact acttaacaaa tagtttcaga ggttctagac tttctcaaat 1380

gtatgtagtt cgtgaatatg tagttatact caattacgac tttgattttt atttaccgcc 1440

taagaaactt gattgaaata atctagaagc ctcaatcctg ctccatcaca aacataatat 1500

actgaaagct agagggcgtt accacagtgg tacgtctaga ttccaaagcg tgctaggaga 1560

ttagtggtcg aaacgcaggt tccgcgagca gtatcaccct acaaagtagc tggttacagt 1620

caacacctag cagcaatttc ttcacttttg ttacgatacg tccgtggcat gatcgtcgtt 1680

gcctaattct acgacttaaa gataccgaaa aaagcaaaat ctagaaccat gatagagcta 1740

caaaatccct ctacccgttc gtacgtgctt cctaatcaga tcaactatgt gagcgacata 1800

gttttagcta gtacttgagc gggagttttg ttctcgtctc tgaatatata aagtgtttaa 1860

tgaagtgcta tgagggccac tcatctttag catactaaat catcagacat aaaggtcacc 1920

cgaaataatc aagcagaaga ctaacagaac atgctaagag aggtctttca actacgcact 1980

tgatagataa ccgttagctc 2000


<210> 104
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 104
tcacgacgag tgaggtctga gaccgtcatc aaagatcgta acacttttta ccgggctgcc 60

ataacgtaag atgcatgact gcaagaaagt tcacggtggt aatttcaatg agtcattgtc 120

attccctgaa ggacgtataa tactatgtta cgtagattat tagggatcct tatgcgttga 180

ggagatatct tgccttgagt gaaagaaact catctgttta gaaacatacc aaatatgtca 240

gacacggtcg gctttgataa gagtccctaa ctaattggct gcacattacg attcgccgaa 300

aatatatgtt gggagtagtg tacacgattt tagacaaatt cccgagatga tgaccgtgac 360

atgtacaatc gcactaaaaa tccccggtat tagactttga agtggttttg gtatgtgatc 420

ttaagcatat tcactatact agcataacaa tggtggttgc ttttggacgc aagttctgag 480

tatatgacta tgaagcggaa tcgattaatt atgtcttcca ataaagctta gaagtatggt 540

tcgtgaacag cttccagtat aatttagaga ggccgacaat atatataggg ttttatttac 600

tattggccaa gaacatcctc agtcgatcta aacttcttcc aaagcactaa ttctatcgca 660

aaatggtatt ataacaacac taatcttgga gtcaactcat atacgcgcgt gtagagtcat 720

gtaatactca gcggctaact acatgtatta tgtcaagtct tccttgctat gaatactggt 780

attcctttgt ggattaaaac ggtaccgtca tgtaattttg agataaagat ctaggacggg 840

gaagaaaata gtaatacggt atgtatgcgt tgagttgggt ctggatattc agtcaactat 900

gggtaactga ggactttgac gctgcatccc ctgctggtgc gtagtcctaa aaaaaattct 960

ctgggacaat atgtcttcac aagatccttg tgagaatccc gcttccggtc cggctgggcc 1020

atatagactc ctattacttt caaacttcgc acagaatctt aaatatgaga ttgtaaggaa 1080

actatcagat ctgctctaga caccgacgga ggagctcccg gaacgttcca aagctttttt 1140

ttctaagtgt tgcacttggc cggtcgtaca cgcagagcgg tagataaccc aaatacagtt 1200

cttctctatg tctacgccca ttatgggacg cgtggagtct ctgtgacgtt gacggtttat 1260

aggttaagta tgcttacgga tgaatattaa tgaatcgtcg tagttattga agacggccga 1320

tgtagtatgc accgtcagcc gattccaaac tagtatcttg ctcctgagtt actctgttag 1380

attcctgtca gtttatccat tttagtgtag aaatatcctt gaatggttgt accatggctc 1440

ctagaactag acaagataaa atgttatacc gtctggtgaa catttaacct cgtacttatc 1500

cggactaatg gtaattgtcg accgcctcct gaaaactcgc attggtgtcg aaaaaagcaa 1560

tgagcgcgta tttttatgga gataggtgca tgtattagtc tgtattctta gatgctctgt 1620

cgataacatg atgtaatgcg aattgattag aacaatctga gaggctgaaa ttgattgcct 1680

gcccaaacac gatacggttc gatagctagc tgccgatgcg cttcgatatt aaacgtaggc 1740

aaagacttcc attctgttgg tggtaatcct atcgattcct taatgaaccc acgacattgg 1800

atattgatat cgtgcttaga tatttgccac catatgatgt atataattaa aatacatatg 1860

cttaaggcga tagtatttac tccctgtacg cgcagttacc gttggcatgt aacaatttaa 1920

tggcccaatg aagcgactac gaaccatata atttgctaca atagtactat taacatgcta 1980

tgaatttatg caaaaaaaaa 2000


<210> 105
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 105
gagttgattt tccgcatttc atggaaatat aatagggtaa cgtttagtta cggaacgtat 60

tcttttgaaa actctactta gtgtcgcaac taaacttctc tgttttagta cagtcaggat 120

tagagactac taagaaattc ctgatctgct cgctactgcc acactttacg caggaggctt 180

gttttcgcag taaccggtga gttaaggtcc aacagggtca gatgtccctt ttgtcaccac 240

gaatcactgg ctcattagaa attgatagat ttgttaaaac gaacctctat gtcaacaaat 300

gcttggaacg tcattatgac agtgttttga tgtcagttta tccagaaggg cgagagggtc 360

atggcgcggt caattagagg ttcgcatatt agtacttagg tattgtcaga tcaccggagt 420

ttggaaaccc tgcttgtgtg atacctacaa cttaacttgg cccaacatga gaacgttcca 480

tgcttctggt atccgtgttt aagctctcag tggagaaatt cttaaaatga tattcgtaac 540

taaaggcatg aaacaaaatg tgaggatcgg ttataatgga cacagtcctg accccttcga 600

ttgacctaaa atattgaaac tacattcaag tagcgagaat tttttaattg ttcctaaagt 660

tttattatta gataagtggt cgatgtgtag gaaataagag atgataagaa aaccagacgt 720

tatttaaagg gaaatgtcca ccagtgcccc agcgttataa catgatagcc aagaatttgg 780

ttatacgcaa agttcgattg cgtgctcggt tactggagat caaattaatg gagcttcaat 840

aatagtacta aatcatgttt tcaatttctt agcacatccc cactaatagt ttgtctcaga 900

tattatatga tatagttgat cgaccctgtt atacgcctaa aaccaattct ctttcgctac 960

ccgagagtga aaacatattc aaagttgtca gcctcgacgt ttaatcttcg taataatttg 1020

tcggtaacag attaaatacg gaagacaaat attattatct tcaactgtcc aaattctccg 1080

tctccatttg agacttactc atacttcagt gaccttggca ctatagctga tgtttggaga 1140

gaattaaacc gagatactta taataatgag agctaatgaa atggtagttc gtatatgcgg 1200

ttatagactg taagaactat ccaacagact ctgccgcact ctcagatttc atcttaggct 1260

aggttataat gtatgggacg gctcggatat tctattgaat ttaacaattt cgtccaacaa 1320

cccttggtaa ctgagtttcc cgattacatg acgatccagc ttaccgtaac catagaactt 1380

ggcaatcctc tccttaaggc gcatgactag atcatcaatc gcacttcttc aatcaagttc 1440

tctatctggc gcggacatac tgttttacgt ctcgtttcat tgtaaaaacc cttctgtgta 1500

ataagaacac gcgactttga tggttgcgat ccctacgtaa cgtgcactta actacatata 1560

cttggtgaga ttgtgctcca tattgaaagt cgatgttaat caagacggag ttgtgattaa 1620

taaaatggca taatacacct gtgtttttcc tatataatcc agagaggaaa ataactgttt 1680

tccgaccaag tttgtactag atttatgatt ttccgaatat gcatctgcgt gagtgtgtac 1740

gtctgtgtgc atacgtcatt cagaaagatc ttccgtatgt gagacctttt ggatcagttg 1800

ttcatttttg tacctgccta ctttagacca ggttctaaaa ggctcattta acacatgatt 1860

attatagatc atataaccat tactcctaat caaatttgtg ccatcgttgc aaccgaaatc 1920

gtctagcaag atgatcatcg agcaataccg accctttata taggctcaac cctatattca 1980

gaggaaaatc acggtttgtc 2000


<210> 106
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 106
gtccatcatt gactctgttt tctcgaggaa ctctgcaaac cagataagag attattagca 60

tatatgtacc tagaaggaca tattatcgtg gacatcccgg gtgtttgcta tttgagattt 120

attgattgtt ttttggtaaa agatctgatt tacatggcat tatagccgag gctcatgttt 180

acattagcat agtaggctgg actagttgcg agagattttg ttacccggga tcaattgcca 240

ttacatcaaa tcacgtgaaa cgcttttcca atacatgcat atcccagccg atacttagta 300

cgagatgata gttgtacgac ggatatataa ttacgtctat acgttataaa ttgtcacctg 360

tcaccacttt ctgaattaaa agctgaggga cgagccgtat taatactaag agcgtaagag 420

cctcctaggg ttatataact tccgcactca gctattatta ttgaacctgc gtacaagtat 480

ctacttattc aagttactac gtatgaatta gtaagcatct tgttttactt atgaccgcaa 540

tttcatacgt tgcatgataa gacaagttca agcacaataa ctacggcagt aggaattgtg 600

gctcgacaag agagagctgt tttcgccgtt ctggggatga gcatatttaa agttgtttaa 660

cacatccttt aacgataaca aaagacatac acaggatgag gtatttctgt caagagaatt 720

ggtagtttgt gttaagaaga tccctgaccg tccttagatg gaagaattaa cgtccatagc 780

tggaggtgtt gtctttattc acggaagcat aagagactcg tagtacagaa taagacggtc 840

tcagggtatc caccaggatc aacgccagaa agtgggcaac agatcggaag tggaattcgg 900

aacaaacttc atatgtgaaa gaaaagcttt gatacgactt ccatgccttg gtgataggtc 960

aaatttagct attagaaact gcaatgggag atgttcgtgc atgggaagta aatgtatcga 1020

ccataatcgc tctgcgggct agagcttgcg gacagttagc ggttctttag acgggctgaa 1080

ccctatcgag aaccgataca gcaatgtagt ccattacgac atatgtgctt cctcgacttt 1140

actggagaac cttaagacgc gatggattat ttaactaaat ttccagttat ctgaactggc 1200

ataatttaca acaaacctaa acattttcca tagaaactcg ttatgagcat ttcatgcagt 1260

gcgtccactg tgatatctgt aatggtaatc ggtcctcatg cgatacggct cggtagtttg 1320

tcttgcgact taaggcaatg atgtgtggca tgctgtccag aagcagatag atcagggtca 1380

agtattgccc gcccatttaa ttactaaaga gaataatgca cataataatc tctattgtta 1440

atgatataat tattctagtg atttatatct ttataaggta agcgatttca acaaattaaa 1500

ttaaacgcca taaatttcta gcaatttaga tactgtatgg gactattagg gactccataa 1560

ttaacgtatg acatactaca ctaataacta aactctattt gacagttgca ttgcttaaac 1620

acccttgtgt gttaaaccat acaaccttat gtctggctat atttgtactt caggaccggg 1680

attcatgata agtgcttagg aacctagacg atgaatcaag atcaacgtct tatttataaa 1740

acgttgacac aatattaatc ctacaagatc taactttacc attaaacaga acttgctaat 1800

ccctaatgac caacagactt ctggcaacga gaaaaaaata atcataattt gtgcggtaca 1860

ctttagcatt aatttctagg attcagctag ctgggcctag ggaacacgag ctttacgtgg 1920

cgtcgtccga atcgttagag aaacattgtg agatactcga tatttttatc ggtagaatcc 1980

tccctcattc ttacaatgta 2000


<210> 107
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 107
ctcaacagca ttctatagcc actaatctta tctcacaggc gcattgctgc cataccgtta 60

gagggtttat gagtgtggtg ccaaatttaa tttccagcta ttgctgagaa gtcatataag 120

tttaagtgcc tctattcatg aatctacgaa gactacgccg tctgcgcact ggctttgccg 180

tcccacttaa tttaacgtta atatgcaggt ccgggttaat tcatgaaatt tatacgaggg 240

ggtagattgt cgcattatac gctcacctac aaatctgcct atcagcacag ccattatgac 300

tagatttacc ggggaatttt catatacaca aaccacactc attttcccac ttataggatt 360

gagtctcaga tcacacttgt gctgcttgct gcaaatcctt ttatcattgt tcatggttac 420

ttgtttaact aatatcattc atttaagata gggtatcttt ataccttgag gccaagtttt 480

ttcacagaat actgaacatc gaaaccttta cttcaaatag atcaggtaag attgtttttc 540

atttaaagcg attcgctcat acagctttct gttaatagtg atatggattg gaaactaaat 600

taccgagata tatcgtcatc gtcggcaagc agctgcttta tactaggata cagaagacgg 660

ccgtttccag taaaaaaacc gccgattcga tcttcgatta ttaccttttt acttgcggca 720

ccaaatgtag ctgaattatg ttatgagcta tgcgtagtat accccctttg tcctagtgct 780

aggctctatc attttatgaa atttaactct tgctccagga tacgtcggat gtacttttaa 840

caaaatctac tgagaggaca ggattgacca cgtaatagta gaactgatag gcgggatgat 900

aggatcatgg gcagtattgc tgattttaga ccttggagat agctgcttaa tgagctcctc 960

gacctcacac ttactgcaag gtcaagataa gaaaatctcc taaagatcaa accattccaa 1020

attcgtgttt acataaattt tactattata catcgtaatg ttaagtgatt tagctactgt 1080

gtgtctagga tccaggatag tcgtctaaga agccgaccaa cgtgctaaat aggatttgaa 1140

cagcgttata gtttagttta taaggttgtc tattttatca gttactgcac gacacatata 1200

ctctcagaga atagggtatc acggtataca tcgctatcat attgactaac gattgttcac 1260

ggcttatatt ttcacgagca ttccaatgtg gtaaccattc gcaatcatct gggctctcag 1320

ttgttaatgt agaatttaac caggttccgt attagtcgaa atcgatgctc tatgacctca 1380

accttcctct tgtcatgata gggtgactaa agaagtttcc gatacgcgac gtgaagtccg 1440

attattatcc agatggtaaa gtgaagctta aaacataaga gatcattctc tctgatgaga 1500

cataatgata tcatttcaaa gttctgttaa taatacaact gctagtcaac ggaatccttt 1560

ccatctaaag gcgaacacta actaatttga atgagaaaga taacactaaa accgccaacc 1620

tagtagttac ttgagctaac acatatatta cttaagtagc tttatctctg gtctaagtcg 1680

gaggtcacaa tgacttggac ttcttttagt ttttcgagta caactagaca atgacctccc 1740

gacgtagcat atagaaagtt agaacatagg attaccgagt ggtaatagcc caatcaaatt 1800

atggtgcgaa aagatagtac tgtactcatt acttccggta tgggacaaag ccgatctatt 1860

tgtcggagca cgttaatttt atgaccggct accctacgtt tactgagtct aaaaatttgt 1920

aaatacaaaa atttttcccg cgctaagtta accataactc tcaagttata cggggtaatg 1980

gatcttaagt tcccggaaaa 2000


<210> 108
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 108
gtaagactga ttaagaaatt acatagggac ctggaaccgg tatcagattt caaattttgg 60

ataataaacc gccaggtgtt aacccatcaa catctagtat tggcgtagtg agatctcttg 120

catttcagac atcctgggac ggcaggagtt tctatccatt ttccgcaagt gttatgctcc 180

aattgacaga tatgtcgccg aggaacacca atctggagaa tatttagtcg agaggcacaa 240

ctggtgttat aatcttagtg ttatcaagat gaccttttgg agtcctttgg atacatgaac 300

ccatacaaat tatcagcgct ctactcttct gtaacacctc ggaaatacac tgaaacagat 360

gtcagagata accatgagtg gtgattgcaa tcggtgacca tgttcgtaga tcagtcctac 420

gagcgtccat atggcgacga gggaactcca cctttcgagc aatcatattg gattgagcaa 480

atggtcattc aaaaatatac tgttcactct gccaatataa aaatagcact cgttttttct 540

attaggacga tactaagtgg gcactttatc cctaaataac tttcacaaac ccgattatag 600

atcccccgta tccaactggt agaaggcggc tcggatctat caagcatttg ccgaattttg 660

cgtgaaattt ttccactgac tgctaagcat aaaccgatga agccaatctt gaatgggtta 720

tcttgaaaat attttgctag atttcataga aactttgatt aactatatac gatatactta 780

tgaataacgc gaattacata tatagacatg ttctacgttc cctgaccttg cgtcaacaaa 840

aatcggttat gtcttaatca gaattgtatt ataatacata cgtagccgtt ttttaactac 900

tgcttataag agaatatttc tatacttact acacagatgt ttggactata aatagaatga 960

catgggggca ggggaatatg tataaatgcc tgtgtgatct ccaactgcgc attttgccga 1020

tgatatgtag ataatacttt gagtcttgga cggccaacgc gcacagacta cacactacta 1080

tagacaatgg atgatttcag acgcaataaa atgctaaaat cctaccgatt gtcatatttt 1140

taagtctata cctcaccgta tattgaattc atgtcgtatc cgagcgattt tcgatttgcc 1200

ctgagaccat agataaaact cactgagctc taacgtaaga ttcaattcaa tcaattataa 1260

gagcaaaagt gtaacccgtc gaagttatta agctgaaata gtcgcaaaaa ctgtcaggta 1320

ttgctgtcca agttagcggg gcgccatgag aatgtgaatg acacggctcc ttgatatcac 1380

agcgtcaatg tttaggtgga ttagagcaga gatataacga atgctcatcc gatatgacgt 1440

ataaacaaat gagtaatgtt aacactttta tactccggta cctcagtatt ccagatctga 1500

cgtccgtgga cacagtcctc aattacgctg ttattgtatg gactacccat cgctgcttga 1560

cacgatcttg aatttatata gctacgaatg cagaggtttt gcaccgcttg gcactaccga 1620

gtataaggat tatgtcagtc gaggcctgaa gcggggactg tgaaaagcac tccacacaca 1680

acagccaatg tagagccttc gtgtttgaaa ttctaggttt tcaacatagt tttttggctg 1740

ctattctatt aactactagc tttacttgta atcttcggct aaagtaggaa tgtattaatt 1800

cgctcaccga atatcgccca tccttgacca cgatgtcccg tcaatttgta aaaggcatct 1860

agtattcatc acggtatggt atcccttaag ttgtgtatgg ctacaaaaaa gtaatggaat 1920

ctaactaatt ccatcatgcg cgattcatga gctcgtgtct gtatgaaaga atataccatt 1980

caatagacac aacaatgatt 2000


<210> 109
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 109
caagctagtc taaactaaca acagcaggag ggcgagaacg ttggccacaa gacattaggc 60

gttctgttta tcaagcatcg acgtctaata attttaatac taaaattcgt cactatctag 120

ttgttcacca tggattttta tgtaggcgat atcaattcag taaggtaacc ctagttctct 180

gggctcatgt atgaaatcgg gaagaaagat atgaatgaaa agaacctaac tactgaaggg 240

tagtcgacga gaggcagcta ataggcaacc tttgtccctt cggacggact ggttgctgaa 300

attaatttac ataaattaat gaaacatccc caacgccacc ttacccatag ggcgtctcac 360

gctatacggt ctattttaat gcctaagaat ttacgatgag cctataaata ccttagttgt 420

gaacgaaacg cagcacacga caatcgtaca acctcacttt taatgttata tacgggcgcg 480

gcttggtaaa tgccgtagct ctagtaacat aatgcatcct caccatacca gcaaagctaa 540

aaatcttcaa atattcgtat aaaactaacc agtttaacgt gtatgaggcg gtctttttac 600

cagtttggga gcatattgca cgtactatct tctttttagc agacctggga tctgagaact 660

tcccctgggt agtcttacga ttatagttag cctaatagat tatttgttcg ttaggaagaa 720

ttcatatata ctaggttatc cttcaggttg aaaattaagg acgttacaga tttttcacaa 780

ttataccgac taccataagt gggagcgcga atagcatttg agtatttgga tcaagcatct 840

gctgggttac acgtattaat tagacccttg ccgagatcta gggaaacaaa atccagaccc 900

gcagtacgtg ggtggtatga cgcttcttag gataggagcg caagtccata gacctttata 960

ttactacgtt tacctgatct aaataatctg atagaaaatt aaccaggagt cccattaagg 1020

tattcaacca cggaacagag tataatctgg ttgataaagt cgttttgatc tgttaaagat 1080

ttgttaaact aaacgagact tctttgggta acatcataca agtctgataa aggatgatgc 1140

agggactagt ctaaaatgag ggagtctttg ggtatccacc aaataatttc aggagttaag 1200

agcacttcca acgatgcagt cctttggcct tctcgtgcga caaggcaaga aaagtttata 1260

actctacagc ttgtgtaact cgaaagctga cctactatat aatgttattg gaaatcaaac 1320

tcagggttat cttcaaacag tttgttattg gctagacagc tattaccttt aattggtcct 1380

taatcttgcc tatggacatg ctccacacat taaacatact taatggcatg caattataga 1440

ttgtcccgtt cattcactat agcttcataa tggttggggt agtacacgca aagtctactt 1500

atatgggcaa cgcgccggcc cgtctttcct gttaagttac gggaggtcgc taattactat 1560

tttactggga atgcgcaatc aaatcttgat tgagaccaac gccaggcccg aactattctt 1620

attgttccag agtctttact tgaatgcata gtatcgggat ggggtgatgc cggccaccgg 1680

atcaccatgg atatacgtca gttggcccac gtgttaatta atgtcatatt gttatgggct 1740

aatacattac tgtattgttt aaatacaatt cgtcatgcat tatcagtact gtgtaattta 1800

tataagcgtt catcattgaa cgtgtatttt gttggtgcgt actgagttag atattggaga 1860

aattccctaa ccaaggaaca atgactggac ttgttagcga tgtaagagta atgcaaaagt 1920

taatgagact gatattggaa acagtattgt ttaggctagt ctagaaataa actgctcata 1980

aagaatcttg cagttaatat 2000


<210> 110
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 110
ttcactatta agtacaccta gtcagacgtg aaagttagtt cttttcacgt ctcatatagt 60

gctattttcg accacgtctt gcaatcgtga tagacagagc tgtcattaac aagatcaagt 120

tataaaattg tacgggttgt acctgcttat agttatatgt tgaaattgca aggccgcgtt 180

gtgaccggtt tgacggaatc tgaagggatt agaggagttt atatttaatt tctttcatgt 240

agagatagaa cccaataacc tctcgctaca tagaactaac gttttcgcag tgatttacct 300

tgtgaagtgc acagtacact tcactgcctt ttactcgcat attgatacag tagccaaaag 360

tatcattatt agtgcataac cttcacctat tccaacggtt ttacgcattc tgcgtacgtt 420

cgattgaaat agaacaaata taactataat tggtacccat gatgtaacat tttacctcag 480

taatatgtcg aagataggct aagtccccag ctagcgtaac tagctaagcc ttgatgcgta 540

ttccttaatc ttgtttaacg tctctgctta cgctagtttt tagtagagca taagatagca 600

atttcaggat ggaacgagtt atagaacaga ccactcctac agtgagtagg gtcacatgta 660

ttgtccgaca ctgtttattc aattccaatc ttttaagtgc gaatataata agaagcaccc 720

tttcaaacaa ttgttataat acgttttcat gacaccaacg atgtcgacta tgatgtgctt 780

ctcttttggt tagacatctt tgcatttcga cgactccttt tcattgagca ggttttagtt 840

agctaagtgt ttcctacatt gtagcgcatt agtctaatag agagtgagca ttagtcacaa 900

tatagtccaa tggatctgag aagccttatg aggcgtgctt agggaacaat tgcagtttag 960

gcagaaagag ttacccttta agggtggtat tcttatctca tatctatctt attggtgcaa 1020

agtttgtctt tgaacgacag agtaactcca ttcgcagcct tgctaaaagt ggagagacgc 1080

aaaagtggag gcacaggtcg tttcttttag tcgtatatcc agtttatgag cttcacattt 1140

aagatcaaat cccttctcga aataaaaagg attcccactt taaataggcg attgattgtg 1200

cgcactattt attcgtaatc tatacgtaaa gaaactgaac gccacagcct aatacatgct 1260

agtatttcat acatgtgagc cgaagacacg cacttccttt ttgatgcgag aatttagggc 1320

gaccaagtct ggtaacattc tgtcctagtt gccgagtaac atagatataa gccttagcag 1380

ggcgcggcta taccttggta gtaagacggg tgtttgagta atattagtag cttaattaac 1440

agcggtcaat cgccaaacgg aattgtaact ggaatgtcgt ataatcccat ttatatctca 1500

gcacataaat caaaatggct gtgagattta aagaggttag taattgttca gaaatccgaa 1560

atcctcataa ccaaataaaa ttcgcatatg catacttgat cggcggagcg atgaaagaat 1620

tacactttta gtatccaatt ataaacatca tttgcggcct acttttccca gtaaatcaat 1680

acgtggagaa ctggctcgta ctctgctcta cacttattga atgagttagc caatgtagag 1740

ctggatacta agctctagaa gttactccag aacaattacc acgttaataa cttctattat 1800

tcagagtcgt aacagccctc aagtcctctc ttgttcgcct gtcagcaatc tcctacggac 1860

ctaccctgcc aggtagttgc tgtctaagcc actattagag ttgctagatt tgttaattat 1920

aatgcttcgc catagtcatc cacggtcagg gcggtacctc gcagcttgtg taagggatcc 1980

ctcgagtaac tcttgatgat 2000


<210> 111
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 111
cgtagtattt tgtgagctag atggagtact ccgattcaag gtattatgaa cgatagatac 60

cgtggctata tcataggatt gctacactgt aggttccaga ccttagcgaa gcggatacct 120

tccgttcggt tatctgttaa aaactttaca tcttcatgat aaagtgtgcc tacctttgta 180

tcactgatgt acttccctac aatagatact ctttaagacc tgagtacgcc gaaagaatct 240

gttcgatcta gcaacgacaa aacagttatc agcatatccg tatattgtgg tgtagcgtct 300

tcgtgtacta atttagattt ctgcatctgt ctagttacgt gtagggccta tgacggtccc 360

ttgcttttcc cgggaaatat caattgcagt tgtgaaaatt gtttatagga aaacacaaat 420

ctaaataaat tactccaagg atcttctccc agatgactat tcttagataa tgagaaaggg 480

agactcgatt aagtaatatt gtcgagcacc acaatctgcc tatattctaa cttagtaata 540

attaattaat tatgagtcaa ccaaagggtc gtttagctga ttcatataca tactatattt 600

gatcaccacc tacgagcagt tggcataatt tccttgttga ctagttttga cccacgtgat 660

tcccctaaat tttttgtgct ctatgaccga caaccacagt gtaatgtctc aggtaaaaat 720

gagtacatac tacttttcca gattgcataa gttatagact tcggtatttt ccaaatatta 780

ttgcattgta ctacaaaact aacgggtatg agtagacaca aacgatcacg ggtttcactt 840

atgaataacg ttgtaacgat aagtgcgcct cgcctgcacc gcatcactaa cgcctttttc 900

gaggtaatac cacgttccga agaatctatt tagttcctcg aataaaacat tattgataag 960

tagtgaatca ccagcctccc aaaaatacca gaagagagaa acaggtcttt caattgctgg 1020

tactatttga tatcctttac acgttttcta ttctccagtg taagtctcgt tatgcaagtt 1080

tgtcaatatc agaacaatat gatatacaac acctcgcaag ctgctagcag ttagatgcga 1140

tccgatgatg atcgataaaa acttatgtac tggacctgct ggtttagcct ttaagaataa 1200

gttgattctt gacatacagc tcgggcgata ggattgaaga gtaaaagcga tgtaaaccag 1260

gtctgtgttc gatgcagagc aagttcctgc atcggatttt tcggatatgc agcttagatg 1320

gttactcaaa tccaattccg ggctgttgtc tgtacaattt gggaggttga cattgccacc 1380

tgggcaaatg ttgtccgaga attcgcccga tgagagaagg gacttggtgg agtcacaaga 1440

ataggcgatt tcgccccaaa tttaatatcc aaaagaaggc gttctactaa ccgtaacgtt 1500

agacatattc gtacagtgaa gttcgcacta tgtgtgcatt actcaagtat ctgttgtata 1560

ggatacctta gtggttcagt attaaacacg attcttttat cttgtatgtt gtaatagcga 1620

tcgttactta tcaacagagt taaaccatgg tacaagtgca caagtcatta agcatctaga 1680

ctgcactaca tcgcttctat attcaccata tgacgttaca atctcccaaa gtaagtatgt 1740

gacaacttct ccggccagct acatccggta gaattgtgtt aactaacagt gtaattatac 1800

tccatcatac gatttaaccg gttgaatgac taaaacttaa gtagttctcg catgggtctc 1860

cgcctcactg gtaatatgtg accgctctat tgaattcgag accaggatca attacatcct 1920

caccgggtaa agagtagatc aggattttta agtgagtaac ctggcgatga atacaaggtt 1980

gtactgcagt tttaccctga 2000


<210> 112
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 112
gatttaaatg gtaattaaaa tcgaaggttt taaaaggtga gaattttttt ataaaatgca 60

atctgttacg cccctaatat tcggtttcat gatttgctta atattgtatc aacacaagca 120

tattgttaaa cagtctctgt actttcttga tgaccaataa tgaacagatg aagtcttcat 180

atattgaact tcaattgaat gcgtgcatgc cattattcgt catcgagaat taggaagaaa 240

acaattgcag ccttctagcg ccaattgcga ttagtaagct tcgccctcac gtactaaatt 300

atattagact gatcggagac attaacaagc tgcttattcc gtcttgaaga ccgtatttct 360

tactgttacg gtgtccttag gcgtcatata tcaactaata taaaccggta ctttattcat 420

aatagccgat attcagtgat tgtttgccat aggctacttt ctttcccaaa tccccggtat 480

cgctatccta tgatttctgc gtcaggggtt aattacggcg acaccagcct aacccaagat 540

cagactagga taatatttca ctggcaatac tcatcgatta attcaactag tatctatttt 600

ttcacactcc gcaaaaaagg gcaaaacaaa gtcgtcaagc cgggaataag ggttattctt 660

gcagtcttcg taataaaatt tgaactcagt tattgcgaat ttactcgtat aaagcttcta 720

ttatcattct ctgattactc aaaaacgctc catgagggta gtagcacata agtagaattg 780

ctcatagtgg cttctttctc tcaatccctt tgatactcat ttttatatta cttacatgta 840

acgattgttg aaggccagca aaccatataa gtggacagaa cagggaacaa gagaaaataa 900

tacagaaagt agtaactagt caagaaagtc tagatgaatc tataagttgt acctatcgaa 960

ctatgatcgt agcattttca gtctacttga gggagaggct gtaaggaatt ttagcggcca 1020

gatatatatc gctggaacca agttatcgca tggaaacttg atcacgtaca gaatgtgatg 1080

tacgcgcaaa ttagatctga aatccctctg tcctcatttt ttaattaata caattaatat 1140

caaaggcctt cttttctgaa tgttattaga cggaacacgg aactgcgatt catcatccta 1200

actacacaac acgaactgac cagatttgcg tgtaatcgtc acgtgccgtt gcttactcta 1260

gtaaaccccg gcgcaagggc gaattgtgaa aaaatgagtc aattcgctac agtggcaaaa 1320

aacgagctcc tggacgacac aacctcgtat agcaaggcgt agctcaatgc gccagatatt 1380

caggtattgt agcccatgac aacaagaaat aaagctatag taggcatcat tatcgtttcg 1440

tccggcagct tttttctgac ttccacctca ttgcgtctta tgtcattact gcgtagggtc 1500

acctatatga gtcttcatcc ctgggacact gaagggagta cgccagtatt tcatctatga 1560

ataaacctcg attactcctt tatgagaaca atacttacac tcgacggggt cttgtggtag 1620

tgatcttaag attatctacc atttgttcac ccttgaaaaa agagacttac ctctcgactt 1680

ttttctatac tgggccccga ccgctgacat gcagaatatt gaggagatgc agattgatat 1740

ttacaaaaat taaagcagat actcaacgca tattctatga aaatcaggga cacccagggt 1800

ggtgctttag gatgatttac atgaaacttt aaaaggaccg ggataaactg gccgccggtc 1860

tttcactgcc acagggatct tattcattcg gatatattat tgccactcaa gataaattct 1920

gttagtaagt gttaaagtgt atcattattg cccattcttc agactcgaga acttcgaagg 1980

caaatgctgg acgtgtgtac 2000


<210> 113
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 113
agatccacgg ccctgaaatc gccatcgctg ttcttctttg atgaataatg caagggctga 60

gttcatcagt gtattcgaat gctactatat ttcagtattg tgagtatcac agctgtaatc 120

ttcggaaata caaggatgtt tgtcgacctc gctaacacta gattattttg gcccgttact 180

atttatattt ttatgacttc aaaatgcgct tcaagattgt aactctggtt gatataggat 240

gcagggaccg gctcagggcc gctctgcact acattaatac ctcagggatc tctatttcgt 300

tagagcacac gacttagtga ctagaatagc tttaaatgta aaacttcatc atatattcct 360

cctggctaag ccttaatttc attcttgggg ctgttgccaa gactgctcaa gagttagttt 420

ttctttctcc ttgtagtacc cgttctccta agtgcaaata atctatacac acttcatatt 480

gggtatacca ttcttggttt attgtcacct gttatgtatt ttgcatcaaa ataatcatcg 540

atgtatacgt taacccagga gacaatcgac cggctaattc cgggaacgta gatgtatgta 600

aagtaacatg tatttcaatt tcttctgaag tatgagattt cagttgcaca aaaggtactc 660

agcatgtctt atcatccata gggccgcaat tatagaggat cttgagtgga gggtccatac 720

gaggccttag gaagccggct tatctcagcg aaggttatcg agatgctaaa tttacggata 780

aagatccgtt actcttcttt agaactaccg ttccaactcg aacatagaat cggctccgaa 840

ttcttgggta ccttgcagaa ctgaaaaata gatatctcgg tatctaaagg cagaaatagt 900

tttcgctctg gattggtttc taaagtgaat ctcaagttct aggtaagcat tcaagtccat 960

tggggaccat taggggttaa tacgcactga cgtcggtctt tcgattgata aatacttaac 1020

ctcgttagca gtgagggtca acaatcatta atctccagct atagagcggg ttagccagat 1080

tttatatcgg cgtcattcct tttatctttg aaatttaggc caaaaagaag ggaactggtt 1140

ctattcgcga attgaaccgc atttatggta atagatctga ccacgtgcta ctgctcactt 1200

acaatagcta gttttcggct caaactttgt ataaggctca ctaggcatat aacgagttaa 1260

aacttttcac atgatacgtg actagcttcg cccgacatac tatatataag gtctaccgtt 1320

gcgggaaaag atgaagatga tattatcaag tctttgacta ataaattaac ttatgcttac 1380

aaatttccaa aatagatatt ccagtcgtct atccttctat tacagagaaa ggcagactta 1440

atccgttcat tatataattt atttagatgt tagtctttct ggtgggtcga ttgttagtct 1500

ttacatagaa ctcctttaat gttcataagt ttccatcagt agaaagtgag cttatgggtt 1560

attcaccttt gatattaaaa gatttactac tgctataatc tacctagctc agctgagagg 1620

caagaggatc acatgttatt gttataatgc tttgattggt aaactatagt gtcaaggcaa 1680

ttcgagtgtc gccaagttac gtcgattaga tcgatcatta aaatctaata atgtttagag 1740

tttgttagag taatggtgtt gatcggcaca taagagtcag aacgcgggag tattgatatt 1800

ttgccgaatt gcaaatttat caacatcggt tctacgtatc gttgatgtcc taaggcctta 1860

gttacgtagc ttacatttaa tgcgcatagg gttgaagcgt gtgttaatcg ctctttcaaa 1920

taagtgttag gaaatatacg aagtaacgaa tatcagccta attccagcga ctaaaatgaa 1980

acaagagcat ccggtggtag 2000


<210> 114
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 114
ttgatagtgt gattaattag ctggtcatta tcggtatcgt tgacaacagt aggatgatgg 60

cgattgtctg cagatttcgt ccattaatat aagtaatact tgttatgatg tccaacttag 120

atatattgga gttttattgc tctatttcct gtacccttgt gacgagtaac tgctccgtga 180

tataggcaag ttaagtgtgt cgcaatatgg cagtaggctg aataccacac atactgtctt 240

tctaaataac actaggcgac tacctttaac ttcatctaag gacgttattt cacactaagc 300

actccgtccc gagaacaggg tctattgagg ctactgattg cgtaaagtag ttggacacgc 360

atgggttcta gatcctcatc tctggtttct caacatattg agttatactt tctgttagtt 420

gttaagccgg gcgatcaaag catttctact tcagaaatgg aggactgtag ttatatacta 480

cattctgaag cggtaccatt aatgctttcc gcattgatga atatctatat ttacagtttg 540

gtgaacacaa ttaggagagt cggactgcgc aaacagaata tttagttact tatagttaat 600

atacacctat acacggtaga aggtcagttc atatagactt ctgggtgtgt acttcatcag 660

aagtctcctg tctgtttagc caatcgccac cttctcagtc ccgtgggagt accactcgaa 720

tagatcgttg ttttcgttgt tgataaacgg accccgtctt attttcgtta ccatttaata 780

cgatatcata taattgaaat attaggaaac ggcatttcaa atacgaacga tttgaacttc 840

acctaccttt tgacatttat attacaattt tatagggcaa aacgtaatgc acctaaattt 900

actgcacttc agatctacca attgatttgt cacaccagct atttaacgaa caatatgact 960

aaatattagc tggtatgcaa tctgaaaagt caacatggta tttctgctta caccggtagg 1020

gttaatggaa gttctgcgcc cattcgaatt ttagaactga acaataattc atgaaaattt 1080

acgttagcag tacctttttg tcttactagt tgttgcagaa atttaaacat tacttggtag 1140

cctgctgtgt atataaaaga gcgatctccg ataagttgtt aatctgttgc tacctaagcg 1200

cttactgtgt gccttggctc gcgtatatgc ccaggtcaac atttatttgt cgctcgactc 1260

gaaataatct atatcataag atgggaacga gtatgctcca tgagggagcc ggactaggca 1320

ttcaattttg tttgagtctt tagtaaccat acctattcat gcgtagttaa cttcgtagta 1380

aagcagcgtt tatacataaa caccaaaaaa tgtcctaggg gcataccaag aatctaagaa 1440

acagcgcagt agttcgttcg gtttggcaac catacgaaag tatcattgca cacgacgcat 1500

acagcatcct aggagtttac tatgtcttcg tttttttgta ggccccacac acattaaatt 1560

cgatttatta cactcagagt acctgtccgc caattcacgt gagtaccttc gcgcagcaga 1620

taatacattg ctatgcgttc agaccattgt aagaaaacag atcatgactc tagaaaaagt 1680

ggccttagat caataaatgt taaatccggt tctctctaac ctcgccgtac acagttaaaa 1740

tcaacgcgca tacataaaca ttgatcttat gggggctcac atagtgagac aatagtagta 1800

cccagtgtta tacctaatct aatatatagg ctaaaaggta gattaattgt ctgatcatag 1860

atctcaaccg atcatggata gctgggaata cgttataaag gtaggtctac gacccgcgaa 1920

atctcgagga accacaacag aaaccattgt ctgtacgagc gacagcgtat gtactccgtg 1980

gctggtctac ctcggtaatg 2000


<210> 115
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 115
gggtagtttt ttctccaagg atccccttaa ctagggtgaa gattgggatt aaacctaaga 60

taaagatata acggtcactg gcgacaagct tacaaatttg cgctttacaa cagaccaagg 120

cgaaagtaat cttggcccta ctaaaccaag ggaaatcagt agtagtgttc tccaaatagg 180

caaggctaat atctatactg tccctgcatg atgtgttaag ccataggcgt gtaatgttat 240

tccttttcct aaccagcttt taatgtatcc ttgtgtagga agaactgcga agttatgtta 300

ctccgaagcc aaccaacatg tgtcctcttg gcaccatgat tcgaaggtga tattataagt 360

tattcgaccg tgaagattac atattactgg atggtgtata aatagaccat acgttcattg 420

aagcgtgact gaagccgaca acggcttacg taatgattca aaatcggtaa taaggataac 480

ggttatatat agtagaattc gagatggaaa aaccaacttg ctaatgacaa tattaagggt 540

atatcacact gtggtttgta aagtagtcac ctattcgtga tgccgtgtac ttcaacttat 600

agtaaaaagt attgttttct aaccagcggt aacctgttgc aaaaaaccac gtttaaccga 660

ttgatagctt gtggtaaagt ggcatagagt atacttcctc catctgtagt acttaatagg 720

tgttccagtt gcagtataaa cctttcttcg agtatcatca ctaagaccat tagacatagg 780

atatatacaa taagagctgg aacttgaatc ttctaatgac agactttact aattatagtt 840

caagcgcagt ttaactataa atacaattgt caattcatca tatggtaggc aagattcctt 900

tagcctggcg tacagtggcc cggaggcctt gaccaaaaca tggttctgtt atatcacgag 960

atggattgac tatgctcgtg aatctggaga ggcactaact tggtaacgcc cgtactctac 1020

cgcagcggga caggtgatag actgtctatg taaatcgtca tcaatctata tttcaataca 1080

actataaatc cagacaagta tccttgagat aatagttaat ctatcctaac taataagaag 1140

aaaagagacg atacggtagt agattaagct ttcgcggaaa caagaggaat ctacagaaaa 1200

caccctaaat aagctattcc atgccgcctt tgctatgaac gaagtacgga agcatgatgc 1260

ttatcaacgt caggaaccta gctcaaatca aggtcttacc agtgacgata acatgggtgc 1320

ggatggttat ttgtggagag gcgtaataca atgtacttgt tttcaggata tcaatttaat 1380

ttcacttaga atacgagacg gccgacaact ttaacgaata catttgcatc ccacattaat 1440

acctgagtgc cgctcatatc gtcctagcac aatttttaac agaagttttg gtggtgagta 1500

gaacaacaac atgtagtcat cttaagcgta tgaaatctgg ctctcaaatt catgtttaat 1560

agtgtttaat cttttatgta taaatcgttt ttatggttta gacgaagcac tcaaaaatat 1620

agactgatgc ctatgacctg tgctatcttt attttccagg gcaaagatga tctttccgag 1680

tccatatctt gaatgacttc ccgcctgaac caatacctgg tcggaaggag gactcattaa 1740

taaacatgca taaatggcag atctgaactg gacggctgac ttatctcaca atgtgttcta 1800

aagtccacac cgtttctgta ccaatgaaag gacgaattat acatgcattg gtttggttaa 1860

aaccaatact tggtaacgat ctggaccggg cggttagaat gatgaattaa tgcgccgtat 1920

gtggaatgaa gtcctgttaa aatgcaaaag gtggctcttc gagagttgtt gggttgaatg 1980

agagaaacgc caccttcaca 2000


<210> 116
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 116
tagtatctag tttcaggtgt gcacagaata gttatcctcc tttgtctgtg gctatttgga 60

gaacgtatta gaggaagcat atggcaaaat ggcctgtaca cgatagatgg tatcatgttt 120

ggaggacgct aggcatttcg ccctaaacac cgcaacgata cctaaagagc tcgtcaatgg 180

gcttgccgat taaatacgca agttttagtc agtccagacc acatttaccg gtaattatgc 240

acagacaaga tattatgctg gtttatagcc catatttgtc tccccctaaa gtgagctctg 300

atatttggtt aggtcgagta gtacagtttg ctatctatgg atacgatgta attgtgcttg 360

agatacgtgc atcacgaaca ttgctaagcg gattcgcaat gttcgtgatg catggagtag 420

tctaagcaat ccaacaagcg cctgaatata attttgtcac aagtaaacct tcatattgtc 480

taacatacag agctgtttta ccccctcatg atctaaatct ttcgcttctt cccaaactgc 540

acgccctatt cgcctgttag cgcattcaac cctaatacag ctgttgtggg gatactctga 600

ttgaaacaaa gttctctatg gaagcttcat cattaggcca tacgaaatag aatcccctgt 660

tgtccaggtg cttctcgact gcgttgcggt tcttattttg gctttgctaa taggaacttc 720

tctcttcgag ctcggtcgaa cgccagttcg tcaactatac cgccttcttt ttgcgcaagg 780

tcatcgaaac tgaggtccat cctgggacaa gagatcagtt aagcctacac ttgtgtgaga 840

ctccgcagaa aatcgggacc aaagcgttag ggcttcccaa ttatgaggat ctatggtgtc 900

attgaaattg ataatcctta tagggccatt tttatccctg acctgaattc tatttggtga 960

ataaagtatt ggtcgccttt cgagggatac tactatgtta tggacctaat ggatgaccat 1020

ctggaacatt agcaacagca actctaatct tattttatca tcttcagtgt aatatatcgt 1080

acattttagg ctttccttta tgttaaattg ttattatgaa agaggtgtat tataagctag 1140

ttaagcgcgt taaaacacaa gtggtctgct gtcattcata taccaaagaa ggtcttgatg 1200

gacaatgtct tcacaagacc atgcatagat tctaaatcga tatgacacct aacaaatgcg 1260

ggctaatatt cgatttctga ctcccacact gtgagcacgt ttattgcgga gacttttaag 1320

cgagatactc ttactcccca ttgccatata tgtaaaatgg acttccaatt ctgcatattt 1380

cagtacatcc ggactgcgtt ataagcattg tcgtggatgc atcaccatcc catagttcca 1440

cttctttttt ttagttcaga tccaaactac actatagggt gacttattgt cgatcaaaat 1500

tattatatgt aagtaataga tcatacatca acaccgaggt ctttgtccaa tagaaatagt 1560

atgtcctgga gttttatcaa atacctgcca tgtgcaagtt cacagaatag gacgcttcta 1620

cagaattcat aaaatcccac atccttagcg taagttgtca gatgaattaa ttatattttt 1680

gatacggccc cagttattct cgaagtccac tcttaaaaaa agttattgta cgaacttgca 1740

taaatcgata acctgttacc aacatgcccc ggcataaatc aacaacgtgg ttcggatacg 1800

acaatatcaa tcaatccgaa attcaaaata gaatattcaa cttgacttaa tcgcagttca 1860

ttcgtgaata gacacatatt agctctcgcg cgctttctta tcttcacagc ttcttctcga 1920

tacctgaata agtacgggac catttatgtt cataagcatt cagtgaaact gcagtctaaa 1980

tactattggc atatacttat 2000


<210> 117
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 117
gatatgccat ctatcgaggc ctgttagctt aggacattac atgacagtga gacctagata 60

tatagttgca tgagtagatg taaccgaagg tactcaggga cagaactgac ggattgacgt 120

ttttcagtat cgtaaaagtt tgagatccaa caatgaaagc ttgatgcgcc agatgatgga 180

aatgcgcaaa ctgtcgtgtg ataacacggg aattggtgct aagctggaat ggtctaattc 240

aagttccaat ccatatccat ctatgtgcga ggaatttgta acggtaatta tattgcctta 300

caattattat caaccaacac acttgaacga tgtaattggg ggtatatacc aataatagta 360

ctgccaacta ctgttttttg caagaattaa tcgtagtccg aattaaaaga aaagacggtg 420

tacgcaaccc aagtaattaa acgaataatc atacggtcga tatgctcatt cgataaaacg 480

cgagatcttt aagttctctc accggggtaa tgcataattg ccttaattgg aaattgcttt 540

aggtgagagt cagtaaacca ttggtgagat gtggttatac tgcacctcac gcaaattaat 600

attctaactt taacctgaat tatgggttcc cctcatcggg aagtatatct agtgccaacc 660

tatcacagtt gcgcacatat gtttagaaat ggttagtcgg tcaggggaac tcacgtaagc 720

ggtagtagta gaatttaatt tatggtctcc taaagcatcg acatagtaca ctgcgaccat 780

tctaacacat actaaacttt gaacttactg atatctttta tgtttgactt ccttgctacg 840

caagtccagg cccagacagc tgagttgtcc ttacacgagc tatttgctga tcatatggtt 900

taatcggcac gcgaattgca agtttgattt aaggtgagcg catacttgaa tacagccagg 960

gagctcccta ctcagcgatc gtcttcagag atttcacgaa aatataagca ttcccatcag 1020

aaattctaat taaaccttac cggaggtggg gattactcgc agagttaaat aatgagccca 1080

cattatgcgt ttgcttctgg agattatggg tggtttttcc cgtaccgcct aatatagtat 1140

gcttcgactc agcaacttca ctctaaaccc tagagagcct ctgtatgtac gcgcgtggat 1200

gaaatcaaga atggttggag tcaatgactg gggcacaagt gtaatctggt tcgattaata 1260

catggcacta ggtgctacga ggacgagtga atgcaatata tgagtccttg ctaataagca 1320

tcgaagatac tctccggtac tccttcatat tcgactaatc ggtgcactca actttagggg 1380

ggctccttat tataaaatac atatagggtt tgtttaaatg atttgttcta ttaatacggg 1440

caaaattaat gcaatgttca cctaggcacg ttggtactcg ccgccaaaca ttggcattaa 1500

tggggatact tagaaacaac ataacatgaa aaatatctag gaacgccaac atatacgccg 1560

tgaccgtctg tcttaataga ctctttttgt ttaaagggta ctgagtgatt aactaatgct 1620

ttccaatcct ttccgttaga aggctattac tacaagtgtt tcccacgtgc cgttaaaaat 1680

agaattatct ttgtgggttt acgagcgcgt actgaaaaca ggtttcttgg atgggataat 1740

attatagata gcaataaagt aaactggaaa acagtattgg atagcatgtg atggaccttg 1800

acccccttgt ggcataagat aatctcagcg tttcgttaca cttacattca ctgttaatgt 1860

ctataggcaa gttactattt ggagtatttc aaagtgaacg gaagaaatag aagtgctaac 1920

aaactccgtc atagtaggat catatctcca gagcgacctc atacatgcta aaaacctagt 1980

agacttcgta ctatggattt 2000


<210> 118
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 118
aagacacttt accacataag taaaccgttg acattatcgt ggcggagaga tactgcttgt 60

actgggacac tcagtatttt gtggaatatt gtacctagcg cctcgttccg tgaaagtgtg 120

gcatggattt tcataatttt atgctgtcct cattgcctac aattaatcca gtaagcacta 180

gagaaatatc tgctcctatg ctgagattag ccttatgagg tctttatatc tttctgtaaa 240

ggccattgtt cttttgatcc tggagtctct gaattttgat ttgtccctca aagccttatg 300

tgtacccggt cccggagcat gaagacgtat atcttgaagt aatccgaaag tatttaggtg 360

tcgttgtcca gtagtaatcc cggttatggg ttataattaa gtgttaacat ccgagcttgg 420

tctgtataat agtgtgtttg aatagtaaat atcaggactc tacagggacc tattctactt 480

cgggttgtgt atcttccttg gaataacttt tgctacgcaa aaaagctata acaaggtctg 540

gagacggatg tgatttagta gggcaaatag atttaggtct tcgatagtac agaatactat 600

gctacaacca atctcttcat ggctttatca atacaatgtt cttccttaac tcagacggga 660

gcaattatag ttagctgaag gttgcctcac aatatgtgtc agagctagcg aaaagctcct 720

accaatatac atcagataag gagttcatac atctgtggcc gatcaagcaa gcaaggccgt 780

ccggttcacg acctgggtag tctgagtttg gaggagaagc catcgcctct cgcattctac 840

tagagaaaga tttcacactt actgacagag ctacactggt acgacgaatc tacaaaacta 900

agcaaagtcc tagggtgagc aatgcatggt aactagtacg attgatcagt gcgtggtata 960

ctatccggat agtccagacg tcaagaccta atcatcgtac gtaattaaat aataatgcat 1020

tcaactcttc ggatacgata tatacttata tgcattaact atactttctc atgcattgta 1080

tctaacaaaa tctgtacggc agaattaatt actaaagtct taatgattcg aatattaata 1140

tcaattttat tacgaaacaa ccaaactgac aacgtagaga ggcaactacc cagagtcgcc 1200

aagaatactg tttacgaatt gtagaaaaga tgtaagaatg ttcggatgtc ggattactta 1260

attgcgaacg tttgtcaagt cgttgcagga taccctcatc tcctcttcct agtgaattat 1320

ctgaaagtac tattatacaa tctaaatcgg atacattcgt ttgtaacacc acatggttgg 1380

ctcagctgac catttacgcg cgatattctg tgctatccga aggcgtaaaa ggaattcaag 1440

tcagtctcct cttcgttatg tagaaaggga ggactcctcc gccgtatatt cagctggctt 1500

taactaggaa catagttgca gttcaaacag tagaaaatcc tggaagacat ttcttgatag 1560

tctatctcag aaaaaggggg gtgacgttca tgtttactaa gacttgaaat gtggctccgt 1620

atctgcacaa ccaggtttgg gcggatgccg gccgccatgt aacactgaac ctcgcaagaa 1680

atgcacaatt gaacaaatga atactcacat cttatcgctt aatgttaaat tcaaggcgag 1740

actggctcga attattggag cctatgaaga tgtatattaa tgccaaggca ccgcacatag 1800

taaagactat actaaccaag tgtgatattc aatcgatcgt tgtggggaat caggtacagt 1860

tagtggcgaa cagctttgac atccgtttaa ctttggcagc accacaaacc ctttgcgtac 1920

gtttttgtgt tataaccaag ttatgttgca acctactttg acctcttatt tctttgccgc 1980

aagactgaat gtcgtattat 2000


<210> 119
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 119
gagcaaccta cggatatact atcgattctg gacatggtaa gtgtgttgcg tggttaataa 60

aaagatttcg tggtcggggg tagatatacc tgtaaggttt ccaacagacc gctttgtaga 120

aagagactta gtccctttgc aaaatgaggg gaccgactaa gaaagcgttg aattcaggta 180

atactttttg acgttaccat agttgttgca gtcccggagt taaacagaga cacatcgtgg 240

cggagtccgt agtatcgcat gcgtggattt attgttgtaa tcagatgttc aatatggcgt 300

caatatacaa ataaacaggt cagatggagt tagccttact taaaaaacga aaacaatgta 360

tgccctaagc aaaaaaacta gataaggacg atcaccacag ttttaagaga tctatatgcc 420

cctttgacat ccttattctg acaatgggca gatccaacta caagatgtcg taccgctaac 480

acttgactaa ctaacgtcaa gtaaaaagtt cgttagtcat attatcaagt atggacttat 540

tcatcgacag gttgtaatta gccctcccct agattagctg ggctgaaccc ctattcctac 600

gctcccttgt cacatgtatt ctctacctca ataggccgga aactcgcaag cccaagtata 660

gcgtacggat taaattcgcg caatcgctct tgaccatgtt aaatgcttgc gcgtaacatc 720

gaaaaggagg caagacattt cagaagtaac atatcagttg acggcttacg gtgctgaggt 780

ttaaaatccg actgattgct atcctatcgc tgaggaatga ctaaccttgc aaatccaagt 840

ctagaactgt cctagttctg taccatgccc agcgttcgga tgtcagtacg tgtatgcagc 900

atttaggagg tgatgtctcc cagtcggtca ataagctttg cttacctcac ggataactaa 960

gttcatctcc agtgtacgaa gattctctag cactaactat tcattgtaac taattggtat 1020

ccgactttaa gccatagtgt ggcatgacgt aagttatgtc agttctttgg aactttttgc 1080

gcagctgtgt tgacgaaaca caggttgcag gttggtctag gtaagggatg cactcactgc 1140

gatgtgatcc tttaatggcc atttaaatct atctcgagta tagcgtgtat acttactatg 1200

aagcaaatta gtatacatat aacaatgaat atacacatag tgggaggttg ccattcatcc 1260

atgtaggcat gtaatatggc acctcctctt tggatacaga ggcccatgcc tccgaatcac 1320

atatttactt aaacagttaa cggaattcag gtatcccgtt tcattattcg aaacgtctct 1380

ggggttacct tacttacgtt atctgcatga gaatagagtc catcggcgtt tctaacaatc 1440

aatcatgctt gcaattcagc gagtgtagag gaattgtaag aacgccggat gctcccttta 1500

ccttatccgc acaggcccct acgattgaac tattgaaagt tttattacaa atctcatata 1560

tgggggagca gttaaagttc tgcataagaa ggacctagga taatgccata aaaggttgat 1620

atggaaatac tattggaata agaaagtata tggtgtctat aatggatata tcagtaaacg 1680

aaggcatttc ttacactttg atttcattaa ctgtaatctc tatttgtgtt ggcgaatccg 1740

gtaaacagag gtttataact ggtttacctt agtcgagtgt cttagatata catgtcgatt 1800

cagatcaatc ctactcatcc caaacgcaca tgtcacgata cgtactttat acagtaagag 1860

gcacaatgtg ggtgccctct ctcgtccgac ttattgcgga cggagaaata gttagtacgg 1920

actgtcacaa gtctgtaacc actaaagatc gggcagctca gacattattg aaggtaggcc 1980

aaagtatcat taatgctttg 2000


<210> 120
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 120
attaataaat gtctaacggt ctagaaatgc acctaatttg ctactgctga actcctgatt 60

actcctcctc gtttatactt gttcattaag aattttttcc gtctagatta agtacacggt 120

aatacacacg attaaataca ccgccacaga tcttcgctat caatattaca ttttgttcac 180

tcattacgat aagcgtggct tggctgagtt ctagacttat cgtgttaacg tcaatgaaaa 240

cttatggatt tgaagctacg atgctaatct aactttacct taagcaagaa agaccttcgt 300

taataggacc cttaaagcct gtgatgtcgg ttaaacggtt ctagtttgat agtgacgtta 360

gggactcggt atacatctta gccgaactgt ctaaattact ttagagaaac ttttccctgg 420

gggaggcacg ttccgtttat ggacctcatt tgagactcaa tatgtacaac taatagtgtg 480

attagatcct gattcccata cgtatcggct cgcccttaat caatacagat ccgtgctatg 540

tccatactgc gattccaaag gttgtctaac aagacaaact tgagagaggc ttcacaaagc 600

aacccagcac ccttgtcctc ttttttaggg gtacgctgac atctggatgc attaagaaat 660

acgtatctag aaggatcgcg ataagtcgca caagtttacc accttatatt ctgcaggctg 720

ctattggagg taatacgtgc tcgcacacgc ccaagtgagg cattcttaca agacttacct 780

tacagcctat taataacgtc gaattttgcg cagcaaccaa ttccagggca aactataagc 840

cttattgagg ttaatagggc gcaatatatt tacgatagaa ggtaaatcta taatactgtc 900

acttgtcaat gatgatggtc taactaattg attcccatgc aagtggcgaa ccaggcttac 960

tttagtttaa tagcgatcaa gtatactaag cacacactga atgtatcaca taagatacgt 1020

aaaataaatc aactcattaa atcaaagaca gattcacaaa tgtttcgtgt tttaacagat 1080

ctgaatataa actctgctga tgtgatcgta ggacgtaaga aggtatagtt gaagaatagc 1140

gtgaatatct gatctctgtt agcaaataca tcacgattat caccaggttt accacaacaa 1200

taagattgtg actgacacta ctttctatat gaatgtattc tcatgaggat gcgtaagacg 1260

tataggatca tactgaatta taactccata ttagggtcta tatcacatac atctccaagt 1320

taaaaagtct attggcgatt ccacacaact cgcgctagta gtacatttta ccggtaccgg 1380

tacagtctaa gttattgatc taggttcaac ttctaaaata ctgaagtctc aggtatatag 1440

aatttatact actcgcggga cgtaaagccc ctctgtggtt agcgtcgcag cgtcgagtaa 1500

attccttata gagcctaaac cttgataatt tcgacgtacc gttataacgc aattaataga 1560

cttctcattt tcctgccgag tcgggtctgg tatagtctag gacgggggta gatatgatcg 1620

tcgtcttctc taatctaatt taatctataa ccacagcgta caagtaaggt atgtaagata 1680

cagagataaa ttagagattt gtgttactcc gcatgttgaa ctaaacccaa aggttcacgc 1740

cgtatgcctt tcaagttcct ccgctcaaaa ggctccgggt gtcccctacc cgatatggcg 1800

gaaatcgtta attctcataa cgaccaacct taccttggac acacctaagc actaagtcgg 1860

taaatggagt acacaatgtg ggagttgtgt ttaacataat gaggctcgtt cagactatgt 1920

tcgaggcgta taacgatttg tgacagattc ctcatcaact cgggtcagat ttatagcaat 1980

ggtaaattcc ctatatccta 2000


<210> 121
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 121
tatggtgtgg cacatatgaa taaaacaagg agaagcagcc gacaatactt agaacgtgtc 60

agaacaatca agatgtctga aacgttcaac aatcgagtta ttccgggcta atttattccc 120

atccttatat acagagccgc acaataccaa gtaacgtgct ttgggccacg aactcactct 180

agtcttccgg accctccggt actactcggt atggtggata ttcatgagaa tggttttagt 240

cttaaaaaaa tgtgaacaag aaaacattta cgtccaagaa agcggtattt tgtttgggtc 300

taggaaacaa tcagtcgtgg acctgggcga gatcggctgt tttcgaccga ttttatgcta 360

agcagaagga agtgaccgag gttgtgttta gatccagtaa aagtcgtcat acccgaggag 420

atttctgtgg tgcctagtga ctagcgatcc cgtgcagcag ttcaaatgcg ctggatagtt 480

cgctcctgca ccactagttc acaccagaag tatgtctttt aagagactgt ctaagaaata 540

tagtctctaa acgtgactat cgttcactcc ctgtacaaat ctaggactaa cgggtataga 600

ttaaacgtat tagaatttcg gagcattaga attttgttgt tctaagttag gatgatttca 660

agtgtccatg taaattgagg tcaatatagg acgatctaca tccgagatag gccaagtacg 720

attctgtgtt acattttgcg ttcgcacaag ctaggacgag ggtatgagca ttttgtgcta 780

accgaatgag atgcagctta ttgtatcctt acccgcaaca tagggcatga aggcgtggtt 840

cgagaatcgc gcgagataaa tacatgtttc gatttatgtc aaccactgca atggtttata 900

aatgttattc aagcatcgat tcaataacct ctggatgtag taatatctgc gggtgtgtaa 960

gtgcgatatc ctaagtcggg agatttaaca ataccttggg atgctccgga caattttcga 1020

cgtacgcaat tatgaacatg cattgattga ctaaacttaa gaaacataat cagtgtatag 1080

tattgtaaca atggattctg agtgtctaat gttttctcgc tccatgttat aacacataat 1140

tatacttata ataccatccc atctttaagt acaaaacctt gttgcgctgc tttatggaga 1200

ctattgagcc caacgggttg agtggttatt actatttgaa gtaaaagcag tatctactca 1260

gattcctaga ggtaaatatg aacttgtttt ctatctggtt atctattttt agttttatgg 1320

atatggacga agttaaaagt tatagacctg acattcttct cccataggta tagaagtgga 1380

gttaaacaag ttcttagtgg gggaaatgac gtacagacta ctatcttgat gatagctttt 1440

cgatcaaaca agagtttcaa ccgctgtaaa ggtttatatg cgatgtagtg tggtacgata 1500

acgtactttg ccgatcattc actgattcca ttaggtacga cactctcagt tacaaagcgg 1560

tactaaccta gcaaaaagtg aatatcgccc tacaaactat tactggagtg cggtggcagc 1620

tttggcgaaa attggccgaa ctctttgctg tttatatggt aactattctc actatgctac 1680

tgattggaaa aagatatttg ccaactaata gtcgtaatgt tagtattgat agggataata 1740

ggcatttaaa gttccctgaa acatacggta aataagatct cttttaacaa caccaggggt 1800

ggctcactgg ggtagcaaat acttaacgat ccctttttca tcaagtgagt tatctgcttt 1860

ggattcttac aactagatgt tataaagaaa gaagctgcgc agtttgcatg actaaaattt 1920

atatgaagta gtagttatta gtactatctc ttagtaggct agaatgtaaa cctgcagaca 1980

tcatggaatg cacatacccg 2000


<210> 122
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 122
tcaatagccc agtcggtttt gttagataca ttttatcgaa tctgtaaaga tattttataa 60

taagataata tcagcgccta gctgcggaat tccactcaga gaatacctct cctgaatatc 120

agccttagtg gcgttatacg atatttcaca ctctcaaaat cccgagtcag actatacccg 180

cgcatgttta gtaaaggttg attctgagat ctcgagtcca aaaaagatac ccactacttt 240

aaagatttgc attcagttgt tccatcggcc tgggtagtaa agggggtatg ctcgctccga 300

gtcgatggaa ctgtaaatgt tagccctgat acgcggaaca tatcagtaac aatctttacc 360

taatatggag tgggattaag cttcatagag gatatgaaac gctcgtagta tggcttccta 420

cataagtaga attattagca actaagatat taccactgcc caataaaaga gattccactt 480

agattcatag gtagtcccaa caatcatgtc tgaatactaa attgatcaat tggactatgt 540

caaaattatt ttgaagaagt aatcatcaac ttaggcgctt tttagtgtta agagcgcgtt 600

attgccaacc gggctaaacc tgtgtaactc ttcaatattg tatataatta taggcagaat 660

aagctatgag tgcattatga gataaacata gatttttgtc cactcgaaat atttgaattt 720

cttgatcctg ggctagttca gccataagtt ttcactaata gttaggacta ccaattacac 780

tacattcagt tgctgaaatt cacatcactg ccgcaatatt tatgaagcta ttattgcatt 840

aagacttagg agataaatac gaagttgata tatttttcag aatcagcgaa aagaccccct 900

attgacatta cgaattcgag tttaacgagc acataaatca aacactacga ggttaccaag 960

attgtatctt acattaatgc tatccagcca gccgtcatgt ttaactggat agtcataatt 1020

aatatccaat gatcgtttca cgtagctgca tatcgaggaa gttgtataat tgaaaaccca 1080

cacattagaa tgcatggtgc atcgctaggg tttatcttat cttgctcgtg ccaagagtgt 1140

agaaagccac atattgatac ggaagctgcc taggaggttg gtatatgttg attgtgctca 1200

ccatctccct tcctaatctc ctagtgttaa gtccaatcag tgggctggct ctggttaaaa 1260

gtaatataca cgctagatct ctctactata atacaggcta agcctacgcg ctttcaatgc 1320

actgattacc aacttagcta cggccagccc catttaatga attatctcag atgaattcag 1380

acattattct ctacaaggac actttagagt gtcctgcgga ggcataatta ttatctaaga 1440

tggggtaagt ccgatggaag acacagatac atcggactat tcctattagc cgagagtcaa 1500

ccgttagaac tcggaaaaag acatcgaagc cggtaaccta cgcactataa atttccgcag 1560

agacatatgt aaagttttat tagaactggt atcttgatta cgattcttaa ctctcatacg 1620

ccggtccgga atttgtgact cgagaaaatg taatgacatg ctccaattga tttcaaaatt 1680

agatttaagg tcagcgaact atgtttattc aaccgtttac aacgctatta tgcgcgatgg 1740

atggggcctt gtatctagaa accgaataat aacatacctg ttaaatggca aacttagatt 1800

attgcgatta attctcactt cagagggtta tcgtgccgaa ttcctgactt tggaataata 1860

aagttgatat tgaggtgcaa tatcaactac actggtttaa cctttaaaca catggagtca 1920

agttttcgct atgccagccg gttatgcagc taggattaat attagagctc ttttctaatt 1980

cgtcctaata atctcttcac 2000


<210> 123
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 123
atctcataga taactctatg aggagttaac gcctagaaat tttggtctgc atggtacagt 60

tacatatcgt atgaattcgt ctaacatttg aacggaccac accatctgat ccgcactcaa 120

tggacagtag gcattcggtt acactttcgt ctggaagaac agtccgaata tgaaaatatg 180

cttagatgat tccaagttaa tttcgtctat aaataagtag cttttgctct ataaagataa 240

cctcctacag tcgtaacaga gctcatatac gataagaaga gtatactttt agtttttcgc 300

acatttagcc attcaatcga gaacatagac gcctcgagcc gaattgctta gcacattttc 360

ctaataaatg tattcgaata tccaaaatga acttgcatga ctccgtagca cgcactagat 420

ttagtgtgcc taaagattaa tatcccaagg ttgggctaga actaaaaacg ctgttgccaa 480

taggttagat tgtaaactgg cccttaacaa gctgattatc aggtgctttg gatacttagc 540

acatacttaa cacatcggcg tgaataagtg ggaaaatgtg cacaaactca ttagaaattc 600

tgtgattggg tctttacgtt atgttaaagt tggtattgct tataataact tattctcgca 660

gcgtactcga gaacgtttga attcgtgaga gcccttaaat caacgacccc cggcgtttag 720

aaacggcaat ccatatacct gtcataaatt atcttagaat tattattata ccctagcctt 780

agccattttg tttaccagaa cacggatgga tctagttacg attcatataa agtgagagag 840

gctagtgttg taagggagtg agagagcttg catcttacga gctcttagct cctcttatca 900

aaatatcatt tgggcccaac aacgcgtaag tcagatgatc tattagcagt ttggatatgt 960

tcaagaagtc ctccagcggg tttgcgagat tctctgtatc gttgacttgt gacatatgat 1020

ttgtattcca agacggtcag ttgcaatctt gcctgaacta gttggattat cagccacccc 1080

aggctgttgc atctaattaa gttttcctat ctgtaaaacc tttcacttag caatggctta 1140

atgctcttac cgatcagctg gaagccggta gtactgtcac ttggttttct taacctatca 1200

aaacggaaac aagccgtatt tttgatggta gcacttcaaa tggtgggcaa ccgactaaag 1260

aacgtcactc tttaaattct cataagttaa aatcggatgt cgagtcaata ttttgtcggg 1320

ccatgggaaa gagagcagta tgctaccttc ttaatctcta ccttacttta gacaagcata 1380

cgtcaacaac tgtgactctt caaggacggg tattccctga ctcaatgctt tggaagaaca 1440

tttaactggg ttccattata gtggtcggac tctttatgct tatgtcgcac caggtccatc 1500

tatcgaattc ctgtattcta taaacaccgg ctgcactcta agaaagatcg agcttctgat 1560

tccaaaagtc tataaatgat cagttagcct agcgccgaca cattgctccg ttagaagctt 1620

gacgtttgtt attatgaggg atcacagatt accgtgtgtc gattggtggc tcacttatct 1680

atgagccagt ttcgttatgg tcataccttt aattaaggga acatcgtgct aaaattttta 1740

gaatggggta ctgtctagac tgtctcgagg attcatgccg atgaagacct gaaatttgaa 1800

tcggaacttt tgtggcaccg ccgtatcgca aaatgagaaa aagatatcgt taacccctta 1860

taaaccgcaa ctaactaagt caaaataagt cgacgtgact taagatactg attaagaaat 1920

ggtatcacgg ctcttttgca ataccattac caaaattgcc aatgaaactg ttttggccta 1980

tcttaagcca cgaataatat 2000


<210> 124
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 124
agacagauau uugcauugag 20


<210> 125
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 125
cauugagaua guguggggaa 20


<210> 126
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 126
uagccuuugc cuuguuccga 20


<210> 127
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 127
ccuuguuccg auucagucau 20


<210> 128
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 128
ucuaauuuau ucuucccuuu 20


<210> 129
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 129
cuucucccau cauagaggau 20


<210> 130
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 130
uucucccacc auagaagaua 20


<210> 131
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 131
ccacuggaua agugugugug 20


<210> 132
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 132
gcguagcucu ucuaugcuca 20


<210> 133
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 133
cugagcauag aagagcuacg 20


<210> 134
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 134
ucacuggaua aguguaugug 20


<210> 135
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 135
guguagcucu ucuaugcucg 20


<210> 136
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 136
ccgagcauag aagagcuaca 20


<210> 137
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 137
ccuugucaag gcuauugguc 20


<210> 138
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 138
gacagauauu ugcauugaga 20


<210> 139
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 139
acacuaucuc aaugcaaaua 20


<210> 140
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 140
cacacuaucu caaugcaaau 20


<210> 141
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 141
ccacacuauc ucaaugcaaa 20


<210> 142
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 142
uuccccacac uaucucaaug 20


<210> 143
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 143
gauucaguca uuccaguuuu 20


<210> 144
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 144
auucagucau uccaguuuuu 20


<210> 145
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 145
gucauuccag uuuuucucua 20


<210> 146
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 146
aguuuuucuc uaauuuauuc 20


<210> 147
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 147
guuuuucucu aauuuauucu 20


<210> 148
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 148
gauucaguca uuccaauuuu 20


<210> 149
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 149
auucagucau uccaauuuuu 20


<210> 150
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 150
gucauuccaa uuuuucucua 20


<210> 151
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 151
aauuuuucuc uaauuuauuc 20


<210> 152
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 152
auuuuucucu aauuuauucu 20


<210> 153
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 153
uucucccauc auagaggaua 20


<210> 154
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 154
aucauagagg auaccaggac 20


<210> 155
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 155
accauagaag auaccaggac 20


<210> 156
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 156
caguaccugc caaagaacau 20


<210> 157
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 157
uaguaucugg uaaagagcau 20


<210> 158
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 158
ucaaugcaaa uaucugucug 20


<210> 159
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 159
cucuuggggg ccccuucccc 20


<210> 160
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 160
gauucaguca uuccaauuuu 20


<210> 161
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 161
auucagucau uccaauuuuu 20


<210> 162
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 162
aaaaaaauua gcaguauccu 20


<210> 163
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 163
gccuuugccu uguuccgauu 20


<210> 164
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 164
aaaaaaauua agcagcagua 20


<210> 165
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 165
cucaguaaag augaugguag 20


<210> 166
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 166
acuggauaag uguaugugcu 20


<210> 167
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 167
ugcuggcuga ugacccaggg 20


<210> 168
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 168
cucgguaaag augaugguag 20


<210> 169
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 169
ugguaaagag cauucuacca 20


<210> 170
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 170
agacagatat ttgcattgag 20


<210> 171
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 171
cattgagata gtgtggggaa 20


<210> 172
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 172
tagcctttgc cttgttccga 20


<210> 173
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 173
ccttgttccg attcagtcat 20


<210> 174
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 174
tctaatttat tcttcccttt 20


<210> 175
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 175
cttctcccat catagaggat 20


<210> 176
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 176
ttctcccacc atagaagata 20


<210> 177
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 177
ccactggata agtgtgtgtg 20


<210> 178
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 178
gcgtagctct tctatgctca 20


<210> 179
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 179
ctgagcatag aagagctacg 20


<210> 180
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 180
tcactggata agtgtatgtg 20


<210> 181
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 181
gtgtagctct tctatgctcg 20


<210> 182
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 182
ccgagcatag aagagctaca 20


<210> 183
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 183
ccttgtcaag gctattggtc 20


<210> 184
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 184
gacagatatt tgcattgaga 20


<210> 185
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 185
acactatctc aatgcaaata 20


<210> 186
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 186
cacactatct caatgcaaat 20


<210> 187
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 187
ccacactatc tcaatgcaaa 20


<210> 188
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 188
ttccccacac tatctcaatg 20


<210> 189
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 189
gattcagtca ttccagtttt 20


<210> 190
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 190
attcagtcat tccagttttt 20


<210> 191
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 191
gtcattccag tttttctcta 20


<210> 192
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 192
agtttttctc taatttattc 20


<210> 193
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 193
gtttttctct aatttattct 20


<210> 194
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 194
caagaggata ctgctgctta 20


<210> 195
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 195
aagaggatac tgctgcttaa 20


<210> 196
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 196
gattcagtca ttccaatttt 20


<210> 197
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 197
attcagtcat tccaattttt 20


<210> 198
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 198
gtcattccaa tttttctcta 20


<210> 199
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 199
aatttttctc taatttattc 20


<210> 200
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 200
atttttctct aatttattct 20


<210> 201
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 201
ttctcccatc atagaggata 20


<210> 202
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 202
atcatagagg ataccaggac 20


<210> 203
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 203
accatagaag ataccaggac 20


<210> 204
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 204
cagtacctgc caaagaacat 20


<210> 205
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 205
tagtatctgg taaagagcat 20


<210> 206
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 206
tcaatgcaaa tatctgtctg 20


<210> 207
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 207
ctcttggggg ccccttcccc 20


<210> 208
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 208
aaaaaaatta gcagtatcct 20


<210> 209
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 209
gcctttgcct tgttccgatt 20


<210> 210
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 210
aaaaaaatta agcagcagta 20


<210> 211
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 211
ctcagtaaag atgatggtag 20


<210> 212
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 212
actggataag tgtatgtgct 20


<210> 213
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 213
tgctggctga tgacccaggg 20


<210> 214
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 214
ctcggtaaag atgatggtag 20


<210> 215
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 215
tggtaaagag cattctacca 20


<210> 216
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 216
uugcuccagg ccacagcacu 20


<210> 217
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 217
ucgaccagcu ugacaucaca 20


<210> 218
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 218
agaaucaaaa ucggugaaua 20


<210> 219
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 219
caugugcaaa cgccuucaac 20


<210> 220
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 220
aaaguuuagg uucguaucug 20


<210> 221
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 221
uuugagaauc aaaaucggug 20


<210> 222
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 222
auucucaaac aaauguguca 20


<210> 223
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 223
cuuuuagaaa guuccuguga 20


<210> 224
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 224
aaagcuuuuc ucgaccagcu 20


<210> 225
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 225
gagucucuca gcugguacac 20


<210> 226
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 226
ucugugauau acacaucaga 20


<210> 227
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 227
uaaaaggaaa aacagacauu 20


<210> 228
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 228
cagauacgaa ccuaaacuuu 20


<210> 229
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 229
gaaaguuccu gugaugucaa 20


<210> 230
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 230
gguucguauc uguaaaacca 20


<210> 231
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 231
aaaaccuguc agugauuggg 20


<210> 232
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 232
aucugcucau gacgcugcgg 20


<210> 233
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 233
cacaugcaaa gucagauuug 20


<210> 234
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 234
ugacacauuu guuugagaau 20


<210> 235
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 235
aaacagguaa gacagggguc 20


<210> 236
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 236
aggaggagga uucggaaccc 20


<210> 237
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 237
ggccacagca cuguugcucu 20


<210> 238
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 238
agaagacacc uucuucccca 20


<210> 239
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 239
ucaccucagc uggaccacag 20


<210> 240
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 240
acagauaucc agaacccuga 20


<210> 241
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 241
uaucuguaaa accaagaggc 20


<210> 242
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 242
aauccuccuc cugaaagugg 20


<210> 243
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 243
aggccccuca ccucagcugg 20


<210> 244
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 244
gaacccaauc acugacaggu 20


<210> 245
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 245
ugugauguca agcuggucga 20


<210> 246
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 246
acucccagcu ucaaggcccc 20


<210> 247
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 247
ugucuuaccu guuucaaagc 20


<210> 248
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 248
cagcccaggu aagggcagcu 20


<210> 249
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 249
gaacccugac ccugccgugu 20


<210> 250
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 250
gaauccuccu ccugaaagug 20


<210> 251
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 251
gaagacaccu ucuuccccag 20


<210> 252
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 252
ggaggaggau ucggaaccca 20


<210> 253
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 253
gcugagguga ggggccuuga 20


<210> 254
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 254
gugacaaguc ugucugccua 20


<210> 255
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 255
agcuucaagg ccccucaccu 20


<210> 256
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 256
aagcuuuucu cgaccagcuu 20


<210> 257
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 257
ccagcccagg uaagggcagc 20


<210> 258
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 258
uuuuagaaag uuccugugau 20


<210> 259
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 259
agcccaggua agggcagcuu 20


<210> 260
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 260
agagcaacag ugcuguggcc 20


<210> 261
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 261
ccgauuuuga uucucaaaca 20


<210> 262
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 262
acaacagcau uauuccagaa 20


<210> 263
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 263
aaaccuguca gugauugggu 20


<210> 264
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 264
uagaccucau gucuagcaca 20


<210> 265
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 265
ucacagacaa aacugugcua 20


<210> 266
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 266
cagaacccug acccugccgu 20


<210> 267
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 267
gacuucaaga gcaacagugc 20


<210> 268
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 268
ugugggacaa gaggaucagg 20


<210> 269
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 269
acagacaaaa cugugcuaga 20


<210> 270
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 270
uguaaaacca agaggccaca 20


<210> 271
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 271
cacaucagaa uccuuacuuu 20


<210> 272
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 272
aaaaccuguc agugauug 18


<210> 273
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 273
aaaaccuguc agugauugg 19


<210> 274
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 274
aaaaccuguc agugauuggg 20


<210> 275
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 275
aaaaccuguc agugauuggg u 21


<210> 276
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 276
aaaaccuguc agugauuggg uu 22


<210> 277
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 277
aaaaccuguc agugauuggg uuc 23


<210> 278
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 278
aaaaccuguc agugauuggg uucc 24


<210> 279
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 279
aaacagguaa gacagggg 18


<210> 280
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 280
aaacagguaa gacaggggu 19


<210> 281
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 281
aaacagguaa gacagggguc 20


<210> 282

<400> 282
000

<210> 283
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 283
aaacagguaa gacagggguc u 21


<210> 284
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 284
aaacagguaa gacagggguc ua 22


<210> 285
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 285
aaacagguaa gacagggguc uag 23


<210> 286
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 286
aaacagguaa gacagggguc uagc 24


<210> 287
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 287
aaagcuuuuc ucgaccag 18


<210> 288
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 288
aaagcuuuuc ucgaccagc 19


<210> 289
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 289
aaagcuuuuc ucgaccagcu 20


<210> 290
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 290
aaagcuuuuc ucgaccagcu u 21


<210> 291
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 291
aaagcuuuuc ucgaccagcu ug 22


<210> 292
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 292
aaagcuuuuc ucgaccagcu uga 23


<210> 293
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 293
aaagcuuuuc ucgaccagcu ugac 24


<210> 294
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 294
aaaguuuagg uucguauc 18


<210> 295
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 295
aaaguuuagg uucguaucu 19


<210> 296
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 296
aaaguuuagg uucguaucug 20


<210> 297
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 297
aaaguuuagg uucguaucug u 21


<210> 298
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 298
aaaguuuagg uucguaucug ua 22


<210> 299
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 299
aaaguuuagg uucguaucug uaa 23


<210> 300
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 300
aaaguuuagg uucguaucug uaaa 24


<210> 301
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 301
acagauacga accuaaac 18


<210> 302
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 302
acagauacga accuaaacu 19


<210> 303
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 303
acagauacga accuaaacuu 20


<210> 304
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 304
acagauacga accuaaacuu u 21


<210> 305
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 305
acagauacga accuaaacuu uc 22


<210> 306
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 306
acagauacga accuaaacuu uca 23


<210> 307
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 307
acagauacga accuaaacuu ucaa 24


<210> 308
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 308
agaaaguucc ugugaugu 18


<210> 309
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 309
agaaaguucc ugugauguc 19


<210> 310
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 310
agaaaguucc ugugauguca 20


<210> 311
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 311
agaaaguucc ugugauguca a 21


<210> 312
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 312
agaaaguucc ugugauguca ag 22


<210> 313
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 313
agaaaguucc ugugauguca agc 23


<210> 314
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 314
agaaaguucc ugugauguca agcu 24


<210> 315
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 315
agaaucaaaa ucggugaa 18


<210> 316
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 316
agaaucaaaa ucggugaau 19


<210> 317
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 317
agaaucaaaa ucggugaaua 20


<210> 318
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 318
agaaucaaaa ucggugaaua g 21


<210> 319
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 319
agaaucaaaa ucggugaaua gg 22


<210> 320
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 320
agaaucaaaa ucggugaaua ggc 23


<210> 321
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 321
agaaucaaaa ucggugaaua ggca 24


<210> 322
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 322
aggaggagga uucggaac 18


<210> 323
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 323
aggaggagga uucggaacc 19


<210> 324
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 324
aggaggagga uucggaaccc 20


<210> 325
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 325
aggaggagga uucggaaccc a 21


<210> 326
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 326
aggaggagga uucggaaccc aa 22


<210> 327
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 327
aggaggagga uucggaaccc aau 23


<210> 328
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 328
aggaggagga uucggaaccc aauc 24


<210> 329
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 329
aucugcucau gacgcugc 18


<210> 330
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 330
aucugcucau gacgcugcg 19


<210> 331
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 331
aucugcucau gacgcugcgg 20


<210> 332
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 332
aucugcucau gacgcugcgg c 21


<210> 333
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 333
aucugcucau gacgcugcgg cu 22


<210> 334
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 334
aucugcucau gacgcugcgg cug 23


<210> 335
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 335
aucugcucau gacgcugcgg cugu 24


<210> 336
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 336
auucucaaac aaaugugu 18


<210> 337
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 337
auucucaaac aaauguguc 19


<210> 338
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 338
auucucaaac aaauguguca 20


<210> 339
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 339
auucucaaac aaauguguca c 21


<210> 340
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 340
auucucaaac aaauguguca ca 22


<210> 341
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 341
auucucaaac aaauguguca caa 23


<210> 342
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 342
auucucaaac aaauguguca caaa 24


<210> 343
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 343
cacaugcaaa gucagauu 18


<210> 344
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 344
cacaugcaaa gucagauuu 19


<210> 345
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 345
cacaugcaaa gucagauuug 20


<210> 346
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 346
cacaugcaaa gucagauuug u 21


<210> 347
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 347
cacaugcaaa gucagauuug uu 22


<210> 348
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 348
cacaugcaaa gucagauuug uug 23


<210> 349
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 349
cacaugcaaa gucagauuug uugc 24


<210> 350
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 350
cagauacgaa ccuaaacu 18


<210> 351
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 351
cagauacgaa ccuaaacuu 19


<210> 352
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 352
cagauacgaa ccuaaacuuu 20


<210> 353
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 353
cagauacgaa ccuaaacuuu c 21


<210> 354
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 354
cagauacgaa ccuaaacuuu ca 22


<210> 355
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 355
cagauacgaa ccuaaacuuu caa 23


<210> 356
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 356
cagauacgaa ccuaaacuuu caaa 24


<210> 357
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 357
caugugcaaa cgccuuca 18


<210> 358
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 358
caugugcaaa cgccuucaa 19


<210> 359
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 359
caugugcaaa cgccuucaac 20


<210> 360
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 360
caugugcaaa cgccuucaac a 21


<210> 361
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 361
caugugcaaa cgccuucaac aa 22


<210> 362
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 362
caugugcaaa cgccuucaac aac 23


<210> 363
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 363
caugugcaaa cgccuucaac aaca 24


<210> 364
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 364
ccuuuuagaa aguuccug 18


<210> 365
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 365
ccuuuuagaa aguuccugu 19


<210> 366
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 366
ccuuuuagaa aguuccugug 20


<210> 367
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 367
ccuuuuagaa aguuccugug a 21


<210> 368
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 368
ccuuuuagaa aguuccugug au 22


<210> 369
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 369
ccuuuuagaa aguuccugug aug 23


<210> 370
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 370
ccuuuuagaa aguuccugug augu 24


<210> 371
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 371
cucgaccagc uugacauc 18


<210> 372
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 372
cucgaccagc uugacauca 19


<210> 373
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 373
cucgaccagc uugacaucac 20


<210> 374
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 374
cucgaccagc uugacaucac a 21


<210> 375
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 375
cucgaccagc uugacaucac ag 22


<210> 376
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 376
cucgaccagc uugacaucac agg 23


<210> 377
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 377
cucgaccagc uugacaucac agga 24


<210> 378
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 378
cuuuuagaaa guuccugu 18


<210> 379
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 379
cuuuuagaaa guuccugug 19


<210> 380
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 380
cuuuuagaaa guuccuguga 20


<210> 381
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 381
cuuuuagaaa guuccuguga u 21


<210> 382
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 382
cuuuuagaaa guuccuguga ug 22


<210> 383
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 383
cuuuuagaaa guuccuguga ugu 23


<210> 384
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 384
cuuuuagaaa guuccuguga uguc 24


<210> 385
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 385
gaaaguuccu gugauguc 18


<210> 386
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 386
gaaaguuccu gugauguca 19


<210> 387
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 387
gaaaguuccu gugaugucaa 20


<210> 388
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 388
gaaaguuccu gugaugucaa g 21


<210> 389
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 389
gaaaguuccu gugaugucaa gc 22


<210> 390
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 390
gaaaguuccu gugaugucaa gcu 23


<210> 391
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 391
gaaaguuccu gugaugucaa gcug 24


<210> 392
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 392
gaaaguuuag guucguau 18


<210> 393
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 393
gaaaguuuag guucguauc 19


<210> 394
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 394
gaaaguuuag guucguaucu 20


<210> 395
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 395
gaaaguuuag guucguaucu g 21


<210> 396
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 396
gaaaguuuag guucguaucu gu 22


<210> 397
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 397
gaaaguuuag guucguaucu gua 23


<210> 398
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 398
gaaaguuuag guucguaucu guaa 24


<210> 399
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 399
gagucucuca gcugguac 18


<210> 400
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 400
gagucucuca gcugguaca 19


<210> 401
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 401
gagucucuca gcugguacac 20


<210> 402
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 402
gagucucuca gcugguacac g 21


<210> 403
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 403
gagucucuca gcugguacac gg 22


<210> 404
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 404
gagucucuca gcugguacac ggc 23


<210> 405
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 405
gagucucuca gcugguacac ggca 24


<210> 406
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 406
gauucucaaa caaaugug 18


<210> 407
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 407
gauucucaaa caaaugugu 19


<210> 408
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 408
gauucucaaa caaauguguc 20


<210> 409
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 409
gauucucaaa caaauguguc a 21


<210> 410
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 410
gauucucaaa caaauguguc ac 22


<210> 411
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 411
gauucucaaa caaauguguc aca 23


<210> 412
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 412
gauucucaaa caaauguguc acaa 24


<210> 413
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 413
gguucguauc uguaaaac 18


<210> 414
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 414
gguucguauc uguaaaacc 19


<210> 415
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 415
gguucguauc uguaaaacca 20


<210> 416
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 416
gguucguauc uguaaaacca a 21


<210> 417
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 417
gguucguauc uguaaaacca ag 22


<210> 418
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 418
gguucguauc uguaaaacca aga 23


<210> 419
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 419
gguucguauc uguaaaacca agag 24


<210> 420
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 420
gucugugaua uacacauc 18


<210> 421
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 421
gucugugaua uacacauca 19


<210> 422
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 422
gucugugaua uacacaucag 20


<210> 423
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 423
gucugugaua uacacaucag a 21


<210> 424
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 424
gucugugaua uacacaucag aa 22


<210> 425
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 425
gucugugaua uacacaucag aau 23


<210> 426
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 426
gucugugaua uacacaucag aauc 24


<210> 427
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 427
uaaaaggaaa aacagaca 18


<210> 428
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 428
uaaaaggaaa aacagacau 19


<210> 429
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 429
uaaaaggaaa aacagacauu 20


<210> 430
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 430
uaaaaggaaa aacagacauu c 21


<210> 431
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 431
uaaaaggaaa aacagacauu cu 22


<210> 432
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 432
uaaaaggaaa aacagacauu cuu 23


<210> 433
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 433
uaaaaggaaa aacagacauu cuuu 24


<210> 434
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 434
uccuuuuaga aaguuccu 18


<210> 435
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 435
uccuuuuaga aaguuccug 19


<210> 436
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 436
uccuuuuaga aaguuccugu 20


<210> 437
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 437
uccuuuuaga aaguuccugu g 21


<210> 438
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 438
uccuuuuaga aaguuccugu ga 22


<210> 439
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 439
uccuuuuaga aaguuccugu gau 23


<210> 440
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 440
uccuuuuaga aaguuccugu gaug 24


<210> 441
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 441
ucgaccagcu ugacauca 18


<210> 442
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 442
ucgaccagcu ugacaucac 19


<210> 443
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 443
ucgaccagcu ugacaucaca 20


<210> 444
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 444
ucgaccagcu ugacaucaca g 21


<210> 445
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 445
ucgaccagcu ugacaucaca gg 22


<210> 446
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 446
ucgaccagcu ugacaucaca gga 23


<210> 447
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 447
ucgaccagcu ugacaucaca ggaa 24


<210> 448
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 448
ucugugauau acacauca 18


<210> 449
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 449
ucugugauau acacaucag 19


<210> 450
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 450
ucugugauau acacaucaga 20


<210> 451
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 451
ucugugauau acacaucaga a 21


<210> 452
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 452
ucugugauau acacaucaga au 22


<210> 453
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 453
ucugugauau acacaucaga auc 23


<210> 454
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 454
ucugugauau acacaucaga aucc 24


<210> 455
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 455
ugacacauuu guuugaga 18


<210> 456
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 456
ugacacauuu guuugagaa 19


<210> 457
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 457
ugacacauuu guuugagaau 20


<210> 458
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 458
ugacacauuu guuugagaau c 21


<210> 459
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 459
ugacacauuu guuugagaau ca 22


<210> 460
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 460
ugacacauuu guuugagaau caa 23


<210> 461
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 461
ugacacauuu guuugagaau caaa 24


<210> 462
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 462
uugcuccagg ccacagca 18


<210> 463
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 463
uugcuccagg ccacagcac 19


<210> 464
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 464
uugcuccagg ccacagcacu 20


<210> 465
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 465
uugcuccagg ccacagcacu g 21


<210> 466
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 466
uugcuccagg ccacagcacu gu 22


<210> 467
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 467
uugcuccagg ccacagcacu guu 23


<210> 468
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 468
uugcuccagg ccacagcacu guug 24


<210> 469
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 469
uuugagaauc aaaaucgg 18


<210> 470
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 470
uuugagaauc aaaaucggu 19


<210> 471
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 471
uuugagaauc aaaaucggug 20


<210> 472
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 472
uuugagaauc aaaaucggug a 21


<210> 473
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 473
uuugagaauc aaaaucggug aa 22


<210> 474
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 474
uuugagaauc aaaaucggug aau 23


<210> 475
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 475
uuugagaauc aaaaucggug aaua 24


<210> 476
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 476
cagaggaccu gaaaaacgug 20


<210> 477
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 477
agguccucug gaaagggaag 20


<210> 478
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 478
agccaucaga agcagagauc 20


<210> 479
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 479
ggugugggag aucucugcuu 20


<210> 480
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 480
gcccuauccu ggguccacuc 20


<210> 481
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 481
uuccccuguu uucuuucaga 20


<210> 482
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 482
uuucagacug uggcuucacc 20


<210> 483
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 483
aggccucggc gcugacgauc 20


<210> 484
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 484
caggccccac ucaccugcuc 20


<210> 485
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 485
aggccccacu caccugcucu 20


<210> 486
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 486
acucaccugc ucuaccccag 20


<210> 487
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 487
agagcccgua gaacuggacu 20


<210> 488
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 488
cucgucauuc uccgagagcc 20


<210> 489
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 489
gcaaccacuu ccgcugucaa 20


<210> 490
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 490
gcugucaagu ccaguucuac 20


<210> 491
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 491
cugucaaguc caguucuacg 20


<210> 492
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 492
guucuacggg cucucggaga 20


<210> 493
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 493
cuuuccagag gaccugaaaa 20


<210> 494
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 494
uuuccagagg accugaaaaa 20


<210> 495
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 495
agaggaccug aaaaacgugu 20


<210> 496
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 496
gguccucugg aaagggaaga 20


<210> 497
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 497
gaggaccuga aaaacguguu 20


<210> 498
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 498
cacccgaggu cgcuguguuu 20


<210> 499
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 499
acacccaaaa ggccacacug 20


<210> 500
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 500
gaccacgugg agcugagcug 20


<210> 501
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 501
cguggucggg guagaagccu 20


<210> 502
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 502
cccaccagcu cagcuccacg 20


<210> 503
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 503
auucacccac cagcucagcu 20


<210> 504
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 504
cauucaccca ccagcucagc 20


<210> 505
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 505
acugugcacc uccuucccau 20


<210> 506
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 506
ucaaggagca gcccgcccuc 20


<210> 507
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 507
gauacugccu gagcagccgc 20


<210> 508
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 508
cgcaaccacu uccgcuguca 20


<210> 509
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 509
ggcaucuccc caggccccac 20


<210> 510
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 510
cuguuuucuu ucagacugug 20


<210> 511
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 511
gacuguggcu ucaccuccgg 20


<210> 512
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 512
ccuccgguaa gugagucucu 20


<210> 513
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 513
uagcaagauc ucauagagga 20


<210> 514
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 514
cuagcaagau cucauagagg 20


<210> 515
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 515
acccuccucc uuaccauggc 20


<210> 516
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 516
auuaccucuu cccuuuccag 20


<210> 517
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 517
uggagucauu gagggcgggc 20


<210> 518
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 518
cuggguccac ucgucauucu 20


<210> 519
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 519
agaucuugcu agggaaggcc 20


<210> 520
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 520
ccgugcuggu cagugcccuc 20


<210> 521
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 521
ccacccuccu ccuuaccaug 20


<210> 522
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 522
agacuguggc uucaccuc 18


<210> 523
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 523
agacuguggc uucaccucc 19


<210> 524
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 524
agacuguggc uucaccuccg 20


<210> 525
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 525
agacuguggc uucaccuccg g 21


<210> 526
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 526
agacuguggc uucaccuccg gu 22


<210> 527
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 527
agacuguggc uucaccuccg gua 23


<210> 528
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 528
agacuguggc uucaccuccg guaa 24


<210> 529
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 529
agccaucaga agcagaga 18


<210> 530
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 530
agccaucaga agcagagau 19


<210> 531
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 531
agccaucaga agcagagauc 20


<210> 532
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 532
agccaucaga agcagagauc u 21


<210> 533
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 533
agccaucaga agcagagauc uc 22


<210> 534
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 534
agccaucaga agcagagauc ucc 23


<210> 535
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 535
agccaucaga agcagagauc uccc 24


<210> 536
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 536
agguccucug gaaaggga 18


<210> 537
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 537
agguccucug gaaagggaa 19


<210> 538
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 538
agguccucug gaaagggaag 20


<210> 539
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 539
agguccucug gaaagggaag a 21


<210> 540
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 540
agguccucug gaaagggaag ag 22


<210> 541
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 541
agguccucug gaaagggaag agg 23


<210> 542
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 542
agguccucug gaaagggaag aggu 24


<210> 543
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 543
cagaggaccu gaaaaacg 18


<210> 544
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 544
cagaggaccu gaaaaacgu 19


<210> 545
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 545
cagaggaccu gaaaaacgug 20


<210> 546
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 546
cagaggaccu gaaaaacgug u 21


<210> 547
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 547
cagaggaccu gaaaaacgug uu 22


<210> 548
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 548
cagaggaccu gaaaaacgug uuc 23


<210> 549
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 549
cagaggaccu gaaaaacgug uucc 24


<210> 550
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 550
cagguccucu ggaaaggg 18


<210> 551
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 551
cagguccucu ggaaaggga 19


<210> 552
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 552
cagguccucu ggaaagggaa 20


<210> 553
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 553
cagguccucu ggaaagggaa g 21


<210> 554
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 554
cagguccucu ggaaagggaa ga 22


<210> 555
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 555
cagguccucu ggaaagggaa gag 23


<210> 556
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 556
cagguccucu ggaaagggaa gagg 24


<210> 557
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 557
cuuccccugu uuucuuuc 18


<210> 558
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 558
cuuccccugu uuucuuuca 19


<210> 559
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 559
cuuccccugu uuucuuucag 20


<210> 560
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 560
cuuccccugu uuucuuucag a 21


<210> 561
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 561
cuuccccugu uuucuuucag ac 22


<210> 562
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 562
cuuccccugu uuucuuucag acu 23


<210> 563
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 563
cuuccccugu uuucuuucag acug 24


<210> 564
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 564
cuuucagacu guggcuuc 18


<210> 565
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 565
cuuucagacu guggcuuca 19


<210> 566
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 566
cuuucagacu guggcuucac 20


<210> 567
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 567
cuuucagacu guggcuucac c 21


<210> 568
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 568
cuuucagacu guggcuucac cu 22


<210> 569
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 569
cuuucagacu guggcuucac cuc 23


<210> 570
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 570
cuuucagacu guggcuucac cucc 24


<210> 571
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 571
gagcuagccu cuggaauc 18


<210> 572
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 572
gagcuagccu cuggaaucc 19


<210> 573
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 573
gagcuagccu cuggaauccu 20


<210> 574
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 574
gagcuagccu cuggaauccu u 21


<210> 575
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 575
gagcuagccu cuggaauccu uu 22


<210> 576
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 576
gagcuagccu cuggaauccu uuc 23


<210> 577
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 577
gagcuagccu cuggaauccu uucu 24


<210> 578
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 578
gcccuauccu ggguccac 18


<210> 579
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 579
gcccuauccu ggguccacu 19


<210> 580
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 580
gcccuauccu ggguccacuc 20


<210> 581
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 581
gcccuauccu ggguccacuc g 21


<210> 582
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 582
gcccuauccu ggguccacuc gu 22


<210> 583
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 583
gcccuauccu ggguccacuc guc 23


<210> 584
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 584
gcccuauccu ggguccacuc guca 24


<210> 585
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 585
ggagcuagcc ucuggaau 18


<210> 586
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 586
ggagcuagcc ucuggaauc 19


<210> 587
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 587
ggagcuagcc ucuggaaucc 20


<210> 588
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 588
ggagcuagcc ucuggaaucc u 21


<210> 589
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 589
ggagcuagcc ucuggaaucc uu 22


<210> 590
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 590
ggagcuagcc ucuggaaucc uuu 23


<210> 591
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 591
ggagcuagcc ucuggaaucc uuuc 24


<210> 592
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 592
ggguguggga gaucucug 18


<210> 593
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 593
ggguguggga gaucucugc 19


<210> 594
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 594
ggguguggga gaucucugcu 20


<210> 595
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 595
ggguguggga gaucucugcu u 21


<210> 596
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 596
ggguguggga gaucucugcu uc 22


<210> 597
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 597
ggguguggga gaucucugcu ucu 23


<210> 598
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 598
ggguguggga gaucucugcu ucug 24


<210> 599
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 599
ggugugggag aucucugc 18


<210> 600
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 600
ggugugggag aucucugcu 19


<210> 601
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 601
ggugugggag aucucugcuu 20


<210> 602
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 602
ggugugggag aucucugcuu c 21


<210> 603
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 603
ggugugggag aucucugcuu cu 22


<210> 604
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 604
ggugugggag aucucugcuu cug 23


<210> 605
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 605
ggugugggag aucucugcuu cuga 24


<210> 606
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 606
ucagguccuc uggaaagg 18


<210> 607
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 607
ucagguccuc uggaaaggg 19


<210> 608
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 608
ucagguccuc uggaaaggga 20


<210> 609
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 609
ucagguccuc uggaaaggga a 21


<210> 610
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 610
ucagguccuc uggaaaggga ag 22


<210> 611
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 611
ucagguccuc uggaaaggga aga 23


<210> 612
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 612
ucagguccuc uggaaaggga agag 24


<210> 613
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 613
ucuuccccug uuuucuuu 18


<210> 614
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 614
ucuuccccug uuuucuuuc 19


<210> 615
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 615
ucuuccccug uuuucuuuca 20


<210> 616
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 616
ucuuccccug uuuucuuuca g 21


<210> 617
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 617
ucuuccccug uuuucuuuca ga 22


<210> 618
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 618
ucuuccccug uuuucuuuca gac 23


<210> 619
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 619
ucuuccccug uuuucuuuca gacu 24


<210> 620
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 620
ucuugaccug uggaagag 18


<210> 621
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 621
ucuugaccug uggaagaga 19


<210> 622
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 622
ucuugaccug uggaagagag 20


<210> 623
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 623
ucuugaccug uggaagagag a 21


<210> 624
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 624
ucuugaccug uggaagagag aa 22


<210> 625
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 625
ucuugaccug uggaagagag aac 23


<210> 626
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 626
ucuugaccug uggaagagag aaca 24


<210> 627
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 627
uuccccuguu uucuuuca 18


<210> 628
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 628
uuccccuguu uucuuucag 19


<210> 629
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 629
uuccccuguu uucuuucaga 20


<210> 630
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 630
uuccccuguu uucuuucaga c 21


<210> 631
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 631
uuccccuguu uucuuucaga cu 22


<210> 632
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 632
uuccccuguu uucuuucaga cug 23


<210> 633
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 633
uuccccuguu uucuuucaga cugu 24


<210> 634
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 634
uuucagacug uggcuuca 18


<210> 635
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 635
uuucagacug uggcuucac 19


<210> 636
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 636
uuucagacug uggcuucacc 20


<210> 637
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 637
uuucagacug uggcuucacc u 21


<210> 638
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 638
uuucagacug uggcuucacc uc 22


<210> 639
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 639
uuucagacug uggcuucacc ucc 23


<210> 640
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 640
uuucagacug uggcuucacc uccg 24


<210> 641
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 641
uggccuggag gcuauccagc 20


<210> 642
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 642
ccgauauucc ucagguacuc 20


<210> 643
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 643
gaguaccuga ggaauaucgg 20


<210> 644
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 644
cucacgucau ccagcagaga 20


<210> 645
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 645
cauucucugc uggaugacgu 20


<210> 646
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 646
acuuuccauu cucugcugga 20


<210> 647
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 647
cugaauugcu augugucugg 20


<210> 648
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 648
auccauccga cauugaaguu 20


<210> 649
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 649
aauucucucu ccauucuuca 20


<210> 650
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 650
agcaaggacu ggucuuucua 20


<210> 651
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 651
uaucucuugu acuacacuga 20


<210> 652
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 652
agugggggug aauucagugu 20


<210> 653
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 653
ucacagccca agauaguuaa 20


<210> 654
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 654
agcagcuuac aaaagaaugu 20


<210> 655
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 655
ugaagcugac agcauucggg 20


<210> 656
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 656
ggccgagaug ucucgcuccg 20


<210> 657
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 657
uggccuuagc ugugcucgcg 20


<210> 658
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 658
gcgugagucu cuccuacccu 20


<210> 659
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 659
ggccagaaag agagaguagc 20


<210> 660
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 660
cgauauuccu cagguacucc 20


<210> 661
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 661
ucagguacuc caaagauuca 20


<210> 662
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 662
aagauucagg uuuacucacg 20


<210> 663
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 663
gguuuacuca cgucauccag 20


<210> 664
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 664
gcagagaaug gaaagucaaa 20


<210> 665
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 665
uucucugcug gaugacguga 20


<210> 666
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 666
auucucugcu ggaugacgug 20


<210> 667
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 667
ugaauugcua ugugucuggg 20


<210> 668
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 668
ggaaauuuga cuuuccauuc 20


<210> 669
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 669
uccauccgac auugaaguug 20


<210> 670
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 670
uccgacauug aaguugacuu 20


<210> 671
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 671
acauugaagu ugacuuacug 20


<210> 672
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 672
augucggaug gaugaaaccc 20


<210> 673
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 673
guaagucaac uucaaugucg 20


<210> 674
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 674
uucuucagua agucaacuuc 20


<210> 675
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 675
auucucucuc cauucuucag 20


<210> 676
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 676
cuuuuucaau ucucucucca 20


<210> 677
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 677
gacuugucuu ucagcaagga 20


<210> 678
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 678
gcaaggacug gucuuucuau 20


<210> 679
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 679
guguaguaca agagauagaa 20


<210> 680
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 680
cccccacuga aaaagaugag 20


<210> 681
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 681
cacugaaaaa gaugaguaug 20


<210> 682
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 682
acugaaaaag augaguaugc 20


<210> 683
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 683
guggggguga auucagugua 20


<210> 684
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 684
cacggcaggc auacucaucu 20


<210> 685
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 685
acuuaacuau cuugggcugu 20


<210> 686
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 686
gcagcuuaca aaagaaugua 20


<210> 687
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 687
cagcgugagu cucuccuacc 20


<210> 688
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 688
ugucuggguu ucauccaucc 20


<210> 689
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 689
ucuuguacua cacugaauuc 20


<210> 690
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 690
ccugccgugu gaaccaugug 20


<210> 691
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 691
uugggcugug acaaagucac 20


<210> 692
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 692
aauucucucu ccauucuu 18


<210> 693
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 693
aauucucucu ccauucuuc 19


<210> 694
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 694
aauucucucu ccauucuuca 20


<210> 695
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 695
aauucucucu ccauucuuca g 21


<210> 696
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 696
aauucucucu ccauucuuca gu 22


<210> 697
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 697
aauucucucu ccauucuuca gua 23


<210> 698
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 698
aauucucucu ccauucuuca guaa 24


<210> 699
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 699
acuuuccauu cucugcug 18


<210> 700
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 700
acuuuccauu cucugcugg 19


<210> 701
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 701
acuuuccauu cucugcugga 20


<210> 702
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 702
acuuuccauu cucugcugga u 21


<210> 703
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 703
acuuuccauu cucugcugga ug 22


<210> 704
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 704
acuuuccauu cucugcugga uga 23


<210> 705
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 705
acuuuccauu cucugcugga ugac 24


<210> 706
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 706
agcaaggacu ggucuuuc 18


<210> 707
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 707
agcaaggacu ggucuuucu 19


<210> 708
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 708
agcaaggacu ggucuuucua 20


<210> 709
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 709
agcaaggacu ggucuuucua u 21


<210> 710
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 710
agcaaggacu ggucuuucua uc 22


<210> 711
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 711
agcaaggacu ggucuuucua ucu 23


<210> 712
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 712
agcaaggacu ggucuuucua ucuc 24


<210> 713
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 713
agugggggug aauucagu 18


<210> 714
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 714
agugggggug aauucagug 19


<210> 715
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 715
agugggggug aauucagugu 20


<210> 716
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 716
agugggggug aauucagugu a 21


<210> 717
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 717
agugggggug aauucagugu ag 22


<210> 718
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 718
agugggggug aauucagugu agu 23


<210> 719
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 719
agugggggug aauucagugu agua 24


<210> 720
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 720
auccauccga cauugaag 18


<210> 721
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 721
auccauccga cauugaagu 19


<210> 722
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 722
auccauccga cauugaaguu 20


<210> 723
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 723
auccauccga cauugaaguu g 21


<210> 724
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 724
auccauccga cauugaaguu ga 22


<210> 725
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 725
auccauccga cauugaaguu gac 23


<210> 726
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 726
auccauccga cauugaaguu gacu 24


<210> 727
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 727
caauucucuc uccauucu 18


<210> 728
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 728
caauucucuc uccauucuu 19


<210> 729
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 729
caauucucuc uccauucuuc 20


<210> 730
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 730
caauucucuc uccauucuuc a 21


<210> 731
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 731
caauucucuc uccauucuuc ag 22


<210> 732
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 732
caauucucuc uccauucuuc agu 23


<210> 733
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 733
caauucucuc uccauucuuc agua 24


<210> 734
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 734
cagugggggu gaauucag 18


<210> 735
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 735
cagugggggu gaauucagu 19


<210> 736
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 736
cagugggggu gaauucagug 20


<210> 737
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 737
cagugggggu gaauucagug u 21


<210> 738
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 738
cagugggggu gaauucagug ua 22


<210> 739
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 739
cagugggggu gaauucagug uag 23


<210> 740
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 740
cagugggggu gaauucagug uagu 24


<210> 741
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 741
cauucucugc uggaugac 18


<210> 742
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 742
cauucucugc uggaugacg 19


<210> 743
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 743
cauucucugc uggaugacgu 20


<210> 744
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 744
cauucucugc uggaugacgu g 21


<210> 745
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 745
cauucucugc uggaugacgu ga 22


<210> 746
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 746
cauucucugc uggaugacgu gag 23


<210> 747
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 747
cauucucugc uggaugacgu gagu 24


<210> 748
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 748
cccgauauuc cucaggua 18


<210> 749
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 749
cccgauauuc cucagguac 19


<210> 750
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 750
cccgauauuc cucagguacu 20


<210> 751
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 751
cccgauauuc cucagguacu c 21


<210> 752
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 752
cccgauauuc cucagguacu cc 22


<210> 753
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 753
cccgauauuc cucagguacu cca 23


<210> 754
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 754
cccgauauuc cucagguacu ccaa 24


<210> 755
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 755
ccgauauucc ucagguac 18


<210> 756
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 756
ccgauauucc ucagguacu 19


<210> 757
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 757
ccgauauucc ucagguacuc 20


<210> 758
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 758
ccgauauucc ucagguacuc c 21


<210> 759
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 759
ccgauauucc ucagguacuc ca 22


<210> 760
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 760
ccgauauucc ucagguacuc caa 23


<210> 761
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 761
ccgauauucc ucagguacuc caaa 24


<210> 762
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 762
cucacgucau ccagcaga 18


<210> 763
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 763
cucacgucau ccagcagag 19


<210> 764
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 764
cucacgucau ccagcagaga 20


<210> 765
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 765
cucacgucau ccagcagaga a 21


<210> 766
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 766
cucacgucau ccagcagaga au 22


<210> 767
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 767
cucacgucau ccagcagaga aug 23


<210> 768
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 768
cucacgucau ccagcagaga augg 24


<210> 769
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 769
cugaauugcu augugucu 18


<210> 770
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 770
cugaauugcu augugucug 19


<210> 771
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 771
cugaauugcu augugucugg 20


<210> 772
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 772
cugaauugcu augugucugg g 21


<210> 773
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 773
cugaauugcu augugucugg gu 22


<210> 774
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 774
cugaauugcu augugucugg guu 23


<210> 775
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 775
cugaauugcu augugucugg guuu 24


<210> 776
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 776
gaguaccuga ggaauauc 18


<210> 777
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 777
gaguaccuga ggaauaucg 19


<210> 778
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 778
gaguaccuga ggaauaucgg 20


<210> 779
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 779
gaguaccuga ggaauaucgg g 21


<210> 780
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 780
gaguaccuga ggaauaucgg ga 22


<210> 781
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 781
gaguaccuga ggaauaucgg gaa 23


<210> 782
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 782
gaguaccuga ggaauaucgg gaaa 24


<210> 783
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 783
uaucucuugu acuacacu 18


<210> 784
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 784
uaucucuugu acuacacug 19


<210> 785
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 785
uaucucuugu acuacacuga 20


<210> 786
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 786
uaucucuugu acuacacuga a 21


<210> 787
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 787
uaucucuugu acuacacuga au 22


<210> 788
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 788
uaucucuugu acuacacuga auu 23


<210> 789
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 789
uaucucuugu acuacacuga auuc 24


<210> 790
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 790
ucaauucucu cuccauuc 18


<210> 791
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 791
ucaauucucu cuccauucu 19


<210> 792
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 792
ucaauucucu cuccauucuu 20


<210> 793
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 793
ucaauucucu cuccauucuu c 21


<210> 794
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 794
ucaauucucu cuccauucuu ca 22


<210> 795
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 795
ucaauucucu cuccauucuu cag 23


<210> 796
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 796
ucaauucucu cuccauucuu cagu 24


<210> 797
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 797
ucacagccca agauaguu 18


<210> 798
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 798
ucacagccca agauaguua 19


<210> 799
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 799
ucacagccca agauaguuaa 20


<210> 800
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 800
ucacagccca agauaguuaa g 21


<210> 801
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 801
ucacagccca agauaguuaa gu 22


<210> 802
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 802
ucacagccca agauaguuaa gug 23


<210> 803
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 803
ucacagccca agauaguuaa gugg 24


<210> 804
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 804
ucaguggggg ugaauuca 18


<210> 805
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 805
ucaguggggg ugaauucag 19


<210> 806
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 806
ucaguggggg ugaauucagu 20


<210> 807
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 807
ucaguggggg ugaauucagu g 21


<210> 808
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 808
ucaguggggg ugaauucagu gu 22


<210> 809
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 809
ucaguggggg ugaauucagu gua 23


<210> 810
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 810
ucaguggggg ugaauucagu guag 24


<210> 811
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 811
uggccuggag gcuaucca 18


<210> 812
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 812
uggccuggag gcuauccag 19


<210> 813
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 813
uggccuggag gcuauccagc 20


<210> 814
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 814
uggccuggag gcuauccagc g 21


<210> 815
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 815
uggccuggag gcuauccagc gu 22


<210> 816
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 816
uggccuggag gcuauccagc gug 23


<210> 817
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 817
uggccuggag gcuauccagc guga 24


<210> 818
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 818
auagaucgag acauguaa 18


<210> 819
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 819
auagaucgag acauguaag 19


<210> 820
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 820
auagaucgag acauguaagc 20


<210> 821
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 821
auagaucgag acauguaagc a 21


<210> 822
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 822
auagaucgag acauguaagc ag 22


<210> 823
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 823
auagaucgag acauguaagc agc 23


<210> 824
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 824
auagaucgag acauguaagc agca 24


<210> 825
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 825
cauagaucga gacaugua 18


<210> 826
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 826
cauagaucga gacauguaa 19


<210> 827
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 827
cauagaucga gacauguaag 20


<210> 828
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 828
cauagaucga gacauguaag c 21


<210> 829
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 829
cauagaucga gacauguaag ca 22


<210> 830
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 830
cauagaucga gacauguaag cag 23


<210> 831
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 831
cauagaucga gacauguaag cagc 24


<210> 832
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 832
cuccacuguc uuuuucau 18


<210> 833
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 833
cuccacuguc uuuuucaua 19


<210> 834
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 834
cuccacuguc uuuuucauag 20


<210> 835
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 835
cuccacuguc uuuuucauag a 21


<210> 836
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 836
cuccacuguc uuuuucauag au 22


<210> 837
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 837
cuccacuguc uuuuucauag auc 23


<210> 838
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 838
cuccacuguc uuuuucauag aucg 24


<210> 839
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 839
ucauagaucg agacaugu 18


<210> 840
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 840
ucauagaucg agacaugua 19


<210> 841
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 841
ucauagaucg agacauguaa 20


<210> 842
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 842
ucauagaucg agacauguaa g 21


<210> 843
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 843
ucauagaucg agacauguaa gc 22


<210> 844
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 844
ucauagaucg agacauguaa gca 23


<210> 845
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 845
ucauagaucg agacauguaa gcag 24


<210> 846
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 846
uccacugucu uuuucaua 18


<210> 847
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 847
uccacugucu uuuucauag 19


<210> 848
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 848
uccacugucu uuuucauaga 20


<210> 849
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 849
uccacugucu uuuucauaga u 21


<210> 850
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 850
uccacugucu uuuucauaga uc 22


<210> 851
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 851
uccacugucu uuuucauaga ucg 23


<210> 852
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 852
uccacugucu uuuucauaga ucga 24


<210> 853
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 853
ucuccacugu cuuuuuca 18


<210> 854
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 854
ucuccacugu cuuuuucau 19


<210> 855
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 855
ucuccacugu cuuuuucaua 20


<210> 856
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 856
ucuccacugu cuuuuucaua g 21


<210> 857
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 857
ucuccacugu cuuuuucaua ga 22


<210> 858
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 858
ucuccacugu cuuuuucaua gau 23


<210> 859
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 859
ucuccacugu cuuuuucaua gauc 24


<210> 860
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 860
uucuccacug ucuuuuuc 18


<210> 861
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 861
uucuccacug ucuuuuuca 19


<210> 862
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 862
uucuccacug ucuuuuucau 20


<210> 863
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 863
uucuccacug ucuuuuucau a 21


<210> 864
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 864
uucuccacug ucuuuuucau ag 22


<210> 865
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 865
uucuccacug ucuuuuucau aga 23


<210> 866
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 866
uucuccacug ucuuuuucau agau 24


<210> 867
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 867
uuucuccacu gucuuuuu 18


<210> 868
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 868
uuucuccacu gucuuuuuc 19


<210> 869
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 869
uuucuccacu gucuuuuuca 20


<210> 870
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 870
uuucuccacu gucuuuuuca u 21


<210> 871
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 871
uuucuccacu gucuuuuuca ua 22


<210> 872
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 872
uuucuccacu gucuuuuuca uag 23


<210> 873
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 873
uuucuccacu gucuuuuuca uaga 24


<210> 874
<211> 18
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 874
uuuucuccac ugucuuuu 18


<210> 875
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 875
uuuucuccac ugucuuuuu 19


<210> 876
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 876
uuuucuccac ugucuuuuuc 20


<210> 877
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 877
uuuucuccac ugucuuuuuc a 21


<210> 878
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 878
uuuucuccac ugucuuuuuc au 22


<210> 879
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 879
uuuucuccac ugucuuuuuc aua 23


<210> 880
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 880
uuuucuccac ugucuuuuuc auag 24


<210> 881
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 881
ucgaguugga uguggaaggu 20


<210> 882
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 882
uuuucauccc cacuucacac 20


<210> 883
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 883
ccucggggga gagagaggug 20


<210> 884
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 884
ugggcucagg ugcuuccuca 20


<210> 885
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 885
ucaaaguaga gcacauagga 20


<210> 886
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 886
ccaucaaaag uccuuuuugg 20


<210> 887
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 887
gugucuacac uuagccuuuc 20


<210> 888
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 888
gggugaaauu ucccaacuuu 20


<210> 889
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 889
ccggccuuuu uaccuugggg 20


<210> 890
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 890
ucugcagccu ucccagagga 20


<210> 891
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 891
aaagaggacc uucuaaaaau 20


<210> 892
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 892
ggguuuauuu ucauccccac 20


<210> 893
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 893
auccccacuu cacacugcau 20


<210> 894
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 894
cuugucuggg cagcggaacu 20


<210> 895
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 895
agaaaaacca gagaccaacu 20


<210> 896
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 896
agucugaguu agaacauugu 20


<210> 897
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 897
ugacuuuucu gcccaacuuc 20


<210> 898
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 898
aggagccaug ugggggcagg 20


<210> 899
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 899
aaacugugcu ucccccuggg 20


<210> 900
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 900
gaagguccuc uuugaaacug 20


<210> 901
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 901
agacaccugu uuagugucua 20


<210> 902
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 902
aaaggcuaag uguagacacu 20


<210> 903
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 903
ccaaaaagac acagaccgcg 20


<210> 904
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 904
ccaacuuuca gguuaucccu 20


<210> 905
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 905
aguaaguuug uggugggugg 20


<210> 906
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 906
aaauccugca ugcaguguga 20


<210> 907
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 907
aaaaaugaac uuacccagau 20


<210> 908
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 908
accccaaagc ucaccaucug 20


<210> 909
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 909
ugcccaacuu cugcuggcau 20


<210> 910
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 910
auggcaaaaa gaucaggaau 20


<210> 911
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 911
guaaaugggc aguauuuuua 20


<210> 912
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 912
cucccagaac ccgacacaga 20


<210> 913
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 913
agguuauccc uaccuaccaa 20


<210> 914
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 914
ccuuggggcu cugacaggua 20


<210> 915
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 915
uggugggugg ggaggucuug 20


<210> 916
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 916
uuuuuuaaac cacuuggagc 20


<210> 917
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 917
uccccacuuc acacugcaug 20


<210> 918
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 918
agggacuuuu ccucccagaa 20


<210> 919
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 919
gcagaccuga agcacuggaa 20


<210> 920
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 920
guaaguuugu gguggguggg 20


<210> 921
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 921
aggcagcuca cagugugcca 20


<210> 922
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 922
aggacuccca gcuggagggc 20


<210> 923
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 923
cgcccugcug gguccuaccu 20


<210> 924
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 924
caaggaugcc uucggaugcc 20


<210> 925
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 925
acucgagaaa auauuccuga 20


<210> 926
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 926
aucucagcug gugggagaug 20


<210> 927
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 927
cccugggcca ccaccuucca 20


<210> 928
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 928
cugggccacc accuuccaca 20


<210> 929
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 929
aacuggugac ugguuaguga 20


<210> 930
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 930
ucgggggaga gagaggugaa 20


<210> 931
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 931
ugaucuuuuu gccaucaaaa 20


<210> 932
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 932
ccugggccac caccuuccac 20


<210> 933
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 933
ucccagaacc cgacacagac 20


<210> 934
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 934
agugcuucag gucugccgga 20


<210> 935
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 935
uucaucuccc accagcugag 20


<210> 936
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 936
aagaggaccu ucuaaaaaua 20


<210> 937
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 937
cugugccucu accacuucua 20


<210> 938
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 938
cagaggagcu uccggcagac 20


<210> 939
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 939
aacuuucagg uuaucccuac 20


<210> 940
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 940
aaagcucacc aucugagcuc 20


<210> 941
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 941
cagaagagau gcaugcacug 20


<210> 942
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 942
cucccaggca gcucacagug 20


<210> 943
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 943
cacccaccac aaacuuacug 20


<210> 944
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 944
ggagucuggc agccccuccu 20


<210> 945
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 945
ggcagaccug aagcacugga 20


<210> 946
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 946
ggacucccag cuggagggcc 20


<210> 947
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 947
aacuccaugg uggcacacug 20


<210> 948
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 948
ucaccuucca ugucacacaa 20


<210> 949
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 949
aaggcauccu uggggaagcu 20


<210> 950
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 950
acauccaacu cgagaaaaua 20


<210> 951
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 951
cucgggggag agagagguga 20


<210> 952
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 952
agaggagcuu ccggcagacc 20


<210> 953
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 953
gacaccuguu uagugucuac 20


<210> 954
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 954
agaagagaug caugcacuga 20


<210> 955
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 955
guuccgcugc ccagacaagg 20


<210> 956
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 956
ucccaggcag cucacagugu 20


<210> 957
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 957
cacuucacac ugcaugcagg 20


<210> 958
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 958
ccucucucuc ccccgaggga 20


<210> 959
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 959
uggucucuuc aucaccuucc 20


<210> 960
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 960
gcaggcuguu gugugacaug 20


<210> 961
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 961
accagcugag auggaacguu 20


<210> 962
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 962
ugguggcaca cugugagcug 20


<210> 963
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 963
gcugggaguc cuggaagaca 20


<210> 964
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 964
ggagcugcug ccuggcuggg 20


<210> 965
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 965
ucucagcugg ugggagauga 20


<210> 966
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 966
gugcuucagg ucugccggaa 20


<210> 967
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 967
caacuuucag guuaucccua 20


<210> 968
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 968
gguagccacc uucuaggggc 20


<210> 969
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 969
ugucacacaa cagccugcug 20


<210> 970
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 970
gcugcccaga caaggaaaag 20


<210> 971
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 971
ccaaggaugc cuucggaugc 20


<210> 972
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 972
gauaguuuaa gucugaguua 20


<210> 973
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 973
agaacccgac acagacacca 20


<210> 974
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 974
aaaaaggacu uuugauggca 20


<210> 975
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 975
gguuaucccu accuaccaac 20


<210> 976
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 976
gagggaaauc aggugucgcc 20


<210> 977
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 977
uacucucacc gaucacuuca 20


<210> 978
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 978
cgagggaaau caggugucgc 20


<210> 979
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 979
ucaccgauau uggcauaagc 20


<210> 980
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 980
acuucacacu gcaugcagga 20


<210> 981
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 981
agugguuuaa aaaaugaacu 20


<210> 982
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 982
aagguaaaaa ggccgggaaa 20


<210> 983
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 983
ggucugccgg aagcuccucu 20


<210> 984
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 984
ccgagggaaa ucaggugucg 20


<210> 985
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 985
uccucgugcc cucagcuucc 20


<210> 986
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 986
cauccaacuc gagaaaauau 20


<210> 987
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 987
agcccaccug cccugcacac 20


<210> 988
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 988
cggccuuuuu accuuggggc 20


<210> 989
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 989
aaccccagcc caccugcccu 20


<210> 990
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 990
aauccugcau gcagugugaa 20


<210> 991
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 991
uacacaaugc guugccuggc 20


<210> 992
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 992
ccccaaagcu caccaucuga 20


<210> 993
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 993
ugggccacca ccuuccacau 20


<210> 994
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 994
gccaggucca ucuggucaua 20


<210> 995
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 995
augucacaca acagccugcu 20


<210> 996
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 996
ggccuuuuua ccuuggggcu 20


<210> 997
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 997
uaccuaccaa cgcacuacaa 20


<210> 998
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 998
ucuggucaua gaagugguag 20


<210> 999
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 999
cacugcaugc aggauuugaa 20


<210> 1000
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1000
agcuggaggg ccugagcaag 20


<210> 1001
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1001
aaggaugccu ucggaugccc 20


<210> 1002
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1002
ugugccucua ccacuucuau 20


<210> 1003
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1003
uagaaggugg cuaccuggag 20


<210> 1004
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1004
uugucugggc agcggaacug 20


<210> 1005
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1005
acccaccaca aacuuacuga 20


<210> 1006
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1006
uccaagggac uuuuccuccc 20


<210> 1007
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1007
ucugguccua ugugcucuac 20


<210> 1008
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1008
cugcccagac aaggaaaagc 20


<210> 1009
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1009
agccaggcag cagcucccgg 20


<210> 1010
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1010
gaugcccagc ucagaagcac 20


<210> 1011
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1011
ucucccacca gcugagaugg 20


<210> 1012
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1012
ugaagaucag ugcaugcauc 20


<210> 1013
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1013
ccuaccuacc aacgcacuac 20


<210> 1014
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1014
accagaugga ccuggcugga 20


<210> 1015
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1015
ugcucuacuu ugagaaaaac 20


<210> 1016
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1016
ucuuccagga cucccagcug 20


<210> 1017
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1017
cuguucccag aagagaugca 20


<210> 1018
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1018
ggugaggaag caccugagcc 20


<210> 1019
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1019
ccaauaucgg ugaggaagca 20


<210> 1020
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1020
gagaugccag cagaaguugg 20


<210> 1021
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1021
gtgacaagtc tgtctgccta 20


<210> 1022
<211> 143
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1022
actccagcct gggttggggc aaagagggaa atgagatcat gtcctaaccc tgatcctctt 60

gtcccacaga tatccagaac cctgaccctg ccgtgtacca gctgagagac tctaaatcga 120

gtgacaagtc tgtctgccta ttc 143


<210> 1023
<211> 314
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1023
gctctggtgg ttagtctcct caaaatctgt agtaactggt ctcgagaccc gtcttggacc 60

ggtaaggact tcgttccttt gtcggacgct tccgtggttt cgacgggaat ggacccgacc 120

ccttcttcca cagaagacct tattacgaca acaacttccg caaacgtgta cgtttcagtc 180

taaacaacga ggtccggtgt cgtgacaacg agaacttcag gtatctggag tacagatcgt 240

gtcaaaacag acactatatg tgtagtctta ggaatgaaac actgtgtaaa caaactctta 300

gttttagcca ctta 314


<210> 1024
<211> 500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1024
tggggagacc actccagatt ccaagatgta cagtttgctt tgctgggcct ttttcccatg 60

cctgccttta ctctgccaga gttatattgc tggggttttg aagaagatcc tattaaataa 120

aagaataagc agtattatta agtagccctg catttcaggt ttccttgagt ggcaggccag 180

gcctggcgtg aacgttcact gaaatcatgg cctcttggcc aagattgata gcttgtgcct 240

gtccctgagt cccagtccat cacgagcagc tggtttctaa gatgctattt cccgtataaa 300

gcatgagacc gtgacttgcc agccccacag agccccgccc ttgtccatca ctggcatctg 360

gactccagcc tgggttgggg caaagaggga aatgagatca tgtcctaacc ctgatcctct 420

tgtcccacag atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcg 480

agtgacaagt ctgtctgcct 500


<210> 1025
<211> 500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1025
gtcattcccc gtttgtcaga ctcgtttccg tccgtccgtc cttgagtcaa cctctctgac 60

tccgacccgg tgcacgggag aggacggtgg aagagaagta gacgaaaaaa gggcacagta 120

agagacctga cggtcttgtt ccgagtgaca aagaatcatt tttctcccaa aaccaccgtt 180

acctattccg gctctggtgg ttagtctcct caaaatctgt agtaactggt ctcgagaccc 240

gtcttggacc ggtaaggact tcgttccttt gtcggacgct tccgtggttt cgacgggaat 300

ggacccgacc ccttcttcca cagaagacct tattacgaca acaacttccg caaacgtgta 360

cgtttcagtc taaacaacga ggtccggtgt cgtgacaacg agaacttcag gtatctggag 420

tacagatcgt gtcaaaacag acactatatg tgtagtctta ggaatgaaac actgtgtaaa 480

caaactctta gttttagcca 500


<210> 1026
<211> 310
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1026
tactcttaat tcattacata ttgtgcggtc gaattcaggg agccgataat gcggttacaa 60

taattcctat acttaaatat acaaagattt aaaatttcaa aaaatggtta ccagcatcgt 120

tagtgcgtat acatcaagag gcacgtgccc cggagacagc aagtaagctc tttaaacatg 180

ctttgacata cgatttttaa taaaacatga gcatttgaat aaaaacgact tcctcatact 240

gtaaacatca cgcatgcaca ttagacaata atccagtaac gaaacggctt cagtcgtaat 300

cgcccatata 310


<210> 1027
<211> 139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1027
actacctaca aggattccag acgttgttta ctacatgtta gtaaattggc taggttttac 60

aagggccaaa accttgtagc tttgtacaac actatactgt cccctctaga ctattgctat 120

cctaataagg cattatacg 139


<210> 1028
<211> 304
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1028
tcctaaagct tggaacactt tcccttcctt aagaaccatc cttgctactc agctgcaatc 60

aatccagccc ccaggtcttc actgaacctt ttcccatctc ttccaaaaca tctgtttctg 120

agaagtcctg tcctatagag gtctttcttc ccaccggatt tctcctacac catttactcc 180

cacttgcaga actcccgtgt acaagtgtct ttactgcttt tatttgctca tcaaaatgca 240

catctcatat aaaaataaat gaggagcatg cacacaccac aaacacaaac aggcatgcag 300

aaat 304


<210> 1029
<211> 665
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1029
ataaagatga acccatagtg agctgagagc tccagcctgg cctccagata actacacacc 60

aagcttccac ccagaatcaa gcctatgtta acttccctca aagcctgaga ttttgccttc 120

ccattaaatg caggtagttg ttccccttca agcactagtc actggccata atttaaatct 180

tgctatcttc ttgccaccat gaaccctgta tgttgtaggc tgaagacgtt aaaagaaaca 240

cacgctgaca cacacacaca cacgcgcgcg cgcacacaca cacacacaca cagagctgac 300

tttcaaaatc tactccagcc caaatgtttc aattgttcct cacccctgga catactttgc 360

ccccatctgg aattaaagga tataagtttg taatgaagca ttagcagcat tttatatgtg 420

tccagctgat ataggaatag ccttagcaat gtatgtttgg ccaccaaagt tccccacttt 480

gactgagcca atatatgcct tctgcctgca tctttttaac gaccatactt gtcctgcctc 540

cagatagatg ttttaaaaca acaaaaatga gggaaagatg aaagttcttt ctactggaat 600

ctaataaaga aaagtcattt tcctcatttc cacctctctt ttctcaaagt caaaattgtc 660

catct 665


<210> 1030
<211> 165
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1030
ccctaaaaca ttaccactgg gtctcagccc agttagtcct ctgcagtttc ttcaccccca 60

accccagtat cttcaaacag ctcacaccct gctgtgctca gatcaatact ccgttgtcta 120

agttgcctcg agactaaagg caacagggct gaaacatctc ctgga 165


<210> 1031
<211> 122
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1031
ctgtgagatt gacaagaaca gtttgacagt cagaaggtgc cacaaatcct gagaagcgac 60

ctggactttt gccaggcaca gggtccttcc ttccctccct tgtcctggtc accagagcct 120

ac 122


<210> 1032
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1032
gccgccggcc cctggcctca ctgg 24


<210> 1033
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1033
ccttgtcaag gctattggtc aaggcaaggc tgg 33


<210> 1034
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1034
tgagatagtg tggggaaggg gcccccaaga ggatac 36


<210> 1035
<211> 41
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1035
tatagccttt gccttgttcc gattcagtca ttccagtttt t 41


<210> 1036
<211> 114
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1036
tcttcccttt agctagtttc cttctcccat catagaggat accaggactt cttttgtcag 60

ccgtttttta ccttcttgtc tctagctcca gtgaggcctg tagtttaaag ctaa 114


<210> 1037
<211> 86
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1037
ccacagtttc agcgcagtaa tagattagtg ttacataata taagacctaa tgcttacctc 60

aatatctact tatccgtacc tatttg 86


<210> 1038
<211> 142
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1038
tattcaggta tgtatgtata caccagatga tgtgtattta ccactggata agtgtgtgtg 60

ctggctgatg acccagggtt ttggcgtagc tcttctatgc tcagtaaaga tgatggtaga 120

atgttctttg gcaggtactg tg 142


<210> 1039
<211> 697
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1039
caataaagat gaacccatag tgagctgaga gctccagcct ggcctccaga taactacaca 60

ccaagcttcc acccagaatc aagcctatgt taacttccct caaagcctga gattttgctt 120

tcccattaaa tgcaggtagt tgttcttctt gcagcactag tcactggcca taatttaaat 180

cttgttatct tcttgccacc atgaaccctg tatgctgtag gctgaaaacg ttaaaagaaa 240

cacacgctct cacacacaca caaacacacg cgcgcacaca cacacacaca cacacagagc 300

tgactttcaa aatctactcc agcccaaatg tttcaattgt tcctcacccc tggacatact 360

ttgcccccat ctggaattaa aggatataag tttgtaatga agcattagca gcattttata 420

tgtgtccagc tgatatagga atagccttag caatgtatgt ttggccacca aagttcccca 480

ctttgactga gccaatatat gccttctgcc tgcatctttt taatgaccat acttgtcctg 540

cctccagata gatgttttaa aacgaataac aaaaataggg gaaaggtgaa agttctttct 600

accgaaatct aataaagaaa agtcattttc ctcatttcca cctctctttt ctcaaagtca 660

aagttgtcca tctagatttt cagaggcact ccttagg 697


<210> 1040
<211> 185
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1040
ccctaaaaca ttgccactgg gtctcagccc agttagtcct ctgcagtttc ttcactccca 60

accccagtat cttcaaacag ctcacaccct gctgtgctca gatcaatact cagttgtcta 120

agttgcctcg agactaaagg caacagtgct gaaacatctc ctggactcac cttgaagttc 180

tcagg 185


<210> 1041
<211> 137
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1041
agcctgtgag attgacaaga acagtttgac agtcagaagg tgccacaaat cctgagaagc 60

gacctggact tttgccaggc acagggtcct tccttccctc ccttgtcctg gtcaccagag 120

cctaccttcc cagggtt 137


<210> 1042
<211> 38
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1042
ccgccggccc ctggcctcac tggatactct aagactat 38


<210> 1043
<211> 31
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1043
ccttgtcaag gctattggtc aaggcaaggc t 31


<210> 1044
<211> 75
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1044
cagggaccgt ttcagacaga tatttgcatt gagatagtgt ggggaagggg cccccaagag 60

gatactgctg cttaa 75


<210> 1045
<211> 29
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1045
ttgccttgtt ccgattcagt cattccaat 29


<210> 1046
<211> 104
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1046
tttagctagt tttcttctcc caccatagaa gataccagga cttcttttgt cagccgtttt 60

tcaccttctt gtctgtagct ccagtgaggc ctgtagttta aagt 104


<210> 1047
<211> 38
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1047
ggacacgtct tagtctcatt tagtaagcat tggtttcc 38


<210> 1048
<211> 124
<212> DNA
<213> Homo sapiens

<400> 1048
ttttttatat tcaggtatgt atgtaggcac ccgatgatgt gtatttatca ctggataagt 60

gtatgtgctg gctgatgacc cagggttttg gtgtagctct tctatgctcg gtaaagatga 120

tggt 124


<210> 1049

<400> 1049
000

<210> 1050
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1050
ccuugucaag gcuauugguc 20


<210> 1051
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1051
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1052
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1052
uaauuucuac ucuuguagau ccuugucaag gcuauugguc 40


<210> 1053
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1053
cccauggguu ggccagccuu 20


<210> 1054
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1054
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1055
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1055
uaauuucuac ucuuguagau cccauggguu ggccagccuu 40


<210> 1056
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1056
uggcuaaacu ccacccaugg 20


<210> 1057
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1057
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1058
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1058
uaauuucuac ucuuguagau uggcuaaacu ccacccaugg 40


<210> 1059
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1059
ugucugaaac ggucccuggc 20


<210> 1060
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1060
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1061
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1061
uaauuucuac ucuuguagau ugucugaaac ggucccuggc 40


<210> 1062
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1062
ucaaugcaaa uaucugucug 20


<210> 1063
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1063
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1064
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1064
uaauuucuac ucuuguagau ucaaugcaaa uaucugucug 40


<210> 1065
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1065
gucaaguuug ccuugucaag 20


<210> 1066
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1066
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1067
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1067
uaauuucuac ucuuguagau gucaaguuug ccuugucaag 40


<210> 1068
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1068
gccuugucaa ggcuauuggu 20


<210> 1069
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1069
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1070
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1070
uaauuucuac ucuuguagau gccuugucaa ggcuauuggu 40


<210> 1071
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1071
ccuugucaag gcuauugguc 20


<210> 1072
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1072
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1073
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1073
uaauuucuac ucuuguagau ccuugucaag gcuauugguc 40


<210> 1074
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1074
ucaaggcuau uggucaaggc 20


<210> 1075
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1075
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1076
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1076
uaauuucuac ucuuguagau ucaaggcuau uggucaaggc 40


<210> 1077
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1077
gucaaggcaa ggcuggccaa 20


<210> 1078
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1078
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1079
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1079
uaauuucuac ucuuguagau gucaaggcaa ggcuggccaa 40


<210> 1080
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1080
ccuugaccaa uagccuugac 20


<210> 1081
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1081
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1082
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1082
uaauuucuac ucuuguagau ccuugaccaa uagccuugac 40


<210> 1083
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1083
gccagccuug ccuugaccaa 20


<210> 1084
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1084
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1085
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1085
uaauuucuac ucuuguagau gccagccuug ccuugaccaa 40


<210> 1086
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1086
gucaaguuug ccuugucaag 20


<210> 1087
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1087
aauuucuacu guuuguagau 20


<210> 1088
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1088
aauuucuacu guuuguagau gucaaguuug ccuugucaag 40


<210> 1089
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1089
gccagccuug ccuugaccaa 20


<210> 1090
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1090
aauuucuacu guuuguagau 20


<210> 1091
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1091
aauuucuacu guuuguagau gccagccuug ccuugaccaa 40


<210> 1092
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1092
auucccauug agaaauaaaa 20


<210> 1093
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1093
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1094
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1094
uaauuucuac ucuuguagau auucccauug agaaauaaaa 40


<210> 1095
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1095
ggaaggcucu cuuggugaug 20


<210> 1096
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1096
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1097
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1097
uaauuucuac ucuuguagau ggaaggcucu cuuggugaug 40


<210> 1098
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1098
cccagggggg ccucuuucgg 20


<210> 1099
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1099
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1100
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1100
uaauuucuac ucuuguagau cccagggggg ccucuuucgg 40


<210> 1101
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1101
gccucugauu aggguggggg 20


<210> 1102
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1102
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1103
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1103
uaauuucuac ucuuguagau gccucugauu aggguggggg 40


<210> 1104
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1104
ucacaggcuc caggaagggu 20


<210> 1105
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1105
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1106
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1106
uaauuucuac ucuuguagau ucacaggcuc caggaagggu 40


<210> 1107
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1107
aagcuagucu agugcaagcu 20


<210> 1108
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1108
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1109
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1109
uaauuucuac ucuuguagau aagcuagucu agugcaagcu 40


<210> 1110
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1110
cacuggaauc agcuaucugc 20


<210> 1111
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1111
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1112
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1112
uaauuucuac ucuuguagau cacuggaauc agcuaucugc 40


<210> 1113
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1113
agccaucuca cuacagauaa 20


<210> 1114
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1114
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1115
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1115
uaauuucuac ucuuguagau agccaucuca cuacagauaa 40


<210> 1116
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1116
cccauggggc acagucaggc 20


<210> 1117
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1117
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1118
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1118
uaauuucuac ucuuguagau cccauggggc acagucaggc 40


<210> 1119
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1119
cagggugggg ugcagacauu 20


<210> 1120
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1120
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1121
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1121
uaauuucuac ucuuguagau cagggugggg ugcagacauu 40


<210> 1122
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1122
cauugagaaa uaaaauccaa 20


<210> 1123
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1123
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1124
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1124
uaauuucuac ucuuguagau cauugagaaa uaaaauccaa 40


<210> 1125
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1125
auucuccauc accaagagag 20


<210> 1126
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1126
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1127
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1127
uaauuucuac ucuuguagau auucuccauc accaagagag 40


<210> 1128
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1128
gaaagaggcc ccccugggca 20


<210> 1129
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1129
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1130
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1130
uaauuucuac ucuuguagau gaaagaggcc ccccugggca 40


<210> 1131
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1131
ccugggcaaa cggccaccga 20


<210> 1132
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1132
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1133
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1133
uaauuucuac ucuuguagau ccugggcaaa cggccaccga 40


<210> 1134
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1134
ucgguggccg uuugcccagg 20


<210> 1135
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1135
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1136
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1136
uaauuucuac ucuuguagau ucgguggccg uuugcccagg 40


<210> 1137
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1137
acccacgccc ccacccuaau 20


<210> 1138
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1138
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1139
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1139
uaauuucuac ucuuguagau acccacgccc ccacccuaau 40


<210> 1140
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1140
cacccuaauc agaggccaaa 20


<210> 1141
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1141
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1142
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1142
uaauuucuac ucuuguagau cacccuaauc agaggccaaa 40


<210> 1143
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1143
uggagccugu gauaaaagca 20


<210> 1144
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1144
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1145
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1145
uaauuucuac ucuuguagau uggagccugu gauaaaagca 40


<210> 1146
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1146
aaguuguauu gacccuggug 20


<210> 1147
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1147
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1148
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1148
uaauuucuac ucuuguagau aaguuguauu gacccuggug 40


<210> 1149
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1149
cuuugcacug gaaucagcua 20


<210> 1150
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1150
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1151
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1151
uaauuucuac ucuuguagau cuuugcacug gaaucagcua 40


<210> 1152
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1152
agugcaaagu ccauacaggu 20


<210> 1153
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1153
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1154
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1154
uaauuucuac ucuuguagau agugcaaagu ccauacaggu 40


<210> 1155
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1155
aggugugcau aaguaagagc 20


<210> 1156
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1156
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1157
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1157
uaauuucuac ucuuguagau aggugugcau aaguaagagc 40


<210> 1158
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1158
gccaucucac uacagauaac 20


<210> 1159
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1159
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1160
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1160
uaauuucuac ucuuguagau gccaucucac uacagauaac 40


<210> 1161
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1161
aaguccuguc uagcugccuu 20


<210> 1162
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1162
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1163
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1163
uaauuucuac ucuuguagau aaguccuguc uagcugccuu 40


<210> 1164
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1164
augggcaaac cagacuaguu 20


<210> 1165
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1165
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1166
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1166
uaauuucuac ucuuguagau augggcaaac cagacuaguu 40


<210> 1167
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1167
aggguggggu gcagacauuc 20


<210> 1168
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1168
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1169
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1169
uaauuucuac ucuuguagau aggguggggu gcagacauuc 40


<210> 1170
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1170
acccuggaaa acagccugac 20


<210> 1171
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1171
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1172
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1172
uaauuucuac ucuuguagau acccuggaaa acagccugac 40


<210> 1173
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1173
ggguggggug cagacauucu 20


<210> 1174
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1174
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1175
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1175
uaauuucuac ucuuguagau ggguggggug cagacauucu 40


<210> 1176
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1176
acaggcucca ggaaggguuu 20


<210> 1177
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1177
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1178
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1178
uaauuucuac ucuuguagau acaggcucca ggaaggguuu 40


<210> 1179
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1179
ucuaagagua gaugccauau 20


<210> 1180
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1180
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1181
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1181
uaauuucuac ucuuguagau ucuaagagua gaugccauau 40


<210> 1182
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1182
gcaucuacuc uuagacauaa 20


<210> 1183
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1183
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1184
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1184
uaauuucuac ucuuguagau gcaucuacuc uuagacauaa 40


<210> 1185
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1185
gacuuugcac uggaaucagc 20


<210> 1186
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1186
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1187
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1187
uaauuucuac ucuuguagau gacuuugcac uggaaucagc 40


<210> 1188
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1188
cacaccuggg gcauagagcc 20


<210> 1189
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1189
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1190
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1190
uaauuucuac ucuuguagau cacaccuggg gcauagagcc 40


<210> 1191
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1191
ccccaggugu gcauaaguaa 20


<210> 1192
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1192
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1193
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1193
uaauuucuac ucuuguagau ccccaggugu gcauaaguaa 40


<210> 1194
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1194
gcuuuucagc caucucacua 20


<210> 1195
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1195
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1196
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1196
uaauuucuac ucuuguagau gcuuuucagc caucucacua 40


<210> 1197
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1197
acaggaauag cacccaaggu 20


<210> 1198
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1198
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1199
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1199
uaauuucuac ucuuguagau acaggaauag cacccaaggu 40


<210> 1200
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1200
aacuagucug guuugcccau 20


<210> 1201
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1201
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1202
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1202
uaauuucuac ucuuguagau aacuagucug guuugcccau 40


<210> 1203
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1203
uaagcaucac aacaggcaga 20


<210> 1204
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1204
uaauuucuac ucuuguagau 20


<210> 1205
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1205
uaauuucuac ucuuguagau uaagcaucac aacaggcaga 40


<210> 1206
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1206
uaccccaccc acgcccccac 20


<210> 1207
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1207
uaauuucuac uguuguagau 20


<210> 1208
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1208
uaauuucuac uguuguagau uaccccaccc acgcccccac 40


<210> 1209
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1209
ccttgtcaag gctattggtc 20


<210> 1210
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1210
tggctaaact ccacccatgg 20


<210> 1211
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1211
gccttgtcaa ggctattggt 20


<210> 1212
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1212
acagggcagt aacggcagac t 21


<210> 1213
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1213
tccacgttca ccttgcccca c 21


<210> 1214
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1214
cgttcacctt gccccacagg g 21


<210> 1215
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1215
tggagcctgt gataaaagca 20


<210> 1216
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1216
taagactatt ggtcaagttt gccttgtcaa ggctattggt caaggcaagg ctggccaacc 60

catgg 65


<210> 1217
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1217
ccatgggttg gccagccttg ccttgaccaa tagccttgac aaggcaaact tgaccaatag 60

tctta 65


<210> 1218
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1218
atcagaggcc aaacccttcc tggagcctgt gataaaagca actgttagct tgcact 56


<210> 1219
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1219
agtgcaagct aacagttgct tttatcacag gctccaggaa gggtttggcc tctgat 56


<210> 1220
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1220
cggcccctgg cctcactgga tactctaaga c 31


<210> 1221
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1221
gtcttagagt atccagtgag gccaggggcc g 31


<210> 1222
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1222
tattggtcaa gtttgccttg tcaaggctat tggtcaaggc aaggctggcc aacccatggg 60

tggagtttag ccagggaccg tttcagacag atatttgcat tgagatagtg tggggaaggg 120

g 121


<210> 1223
<211> 121
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1223
ccccttcccc acactatctc aatgcaaata tctgtctgaa acggtccctg gctaaactcc 60

acccatgggt tggccagcct tgccttgacc aatagccttg acaaggcaaa cttgaccaat 120

a 121


<210> 1224
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1224
ggggagagtg cagacagggg aagcttcacc tcctttacaa ttttgggagt ccacacggca 60

tggcatacaa attatttcat tcccattgag aaataaaatc caatt 105


<210> 1225
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1225
aattggattt tatttctcaa tgggaatgaa ataatttgta tgccatgccg tgtggactcc 60

caaaattgta aaggaggtga agcttcccct gtctgcactc tcccc 105


<210> 1226
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1226
ctccatcacc aagagagcct tccgaaagag gcccccctgg gcaaacggcc accgatggag 60

aggtctgcca gtcctcttct accccaccca cgcccccacc c 101


<210> 1227
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1227
gggtgggggc gtgggtgggg tagaagagga ctggcagacc tctccatcgg tggccgtttg 60

cccagggggg cctctttcgg aaggctctct tggtgatgga g 101


<210> 1228
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1228
taatcagagg ccaaaccctt cctggagcct gtgataaaag caactgttag cttgcactag 60

actagcttca aag 73


<210> 1229
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1229
ctttgaagct agtctagtgc aagctaacag ttgcttttat cacaggctcc aggaagggtt 60

tggcctctga tta 73


<210> 1230
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1230
ttgtattgac cctggtgtgt tatgtctaag agtagatgcc atatctcttt tctctggcct 60

atgttattac ctgtatggac tttgcactgg aatcagcta 99


<210> 1231
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1231
tagctgattc cagtgcaaag tccatacagg taataacata ggccagagaa aagagatatg 60

gcatctactc ttagacataa cacaccaggg tcaatacaa 99


<210> 1232
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1232
tctgctctta cttatgcaca cctggggcat agagccagcc ctgtatcgct tttcagccat 60

ctcactacag ataactccca agtcctgtct agctgcctt 99


<210> 1233
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1233
ggcagctaga caggacttgg gagttatctg tagtgagatg gctgaaaagc gatacagggc 60

tggctctatg ccccaggtgt gcataagtaa gagcaga 97


<210> 1234
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1234
ccttatcaca ggaatagcac ccaaggtcca tcagtacctc agagtagaac cccctataaa 60

ctagtctggt ttgcccatgg ggc 83


<210> 1235
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1235
gccccatggg caaaccagac tagtttatag ggggttctac tctgaggtac tgatggacct 60

tgggtgctat tcctgtgata agg 83


<210> 1236
<211> 103
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1236
ggtacctgga aaactgtaat tcttttcctg ctcaaagaca ggcaattcaa taccccttcc 60

cccaaccaaa aacccttgcc accatgggag cctggggcag aga 103


<210> 1237
<211> 103
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1237
tctctgcccc aggctcccat ggtggcaagg gtttttggtt gggggaaggg gtattgaatt 60

gcctgtcttt gagcaggaaa agaattacag ttttccaggt acc 103


<210> 1238
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1238
uuuvccuugg ggcucugaca ggua 24


<210> 1239
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1239
atggacagtc tcggggttcc attt 24


<210> 1240
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic


<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or u

<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, or u

<400> 1240
nyynucccag gcagcucaca gugu 24


<210> 1241
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1241
tgtgacactc gacggaccct ccct 24


<210> 1242
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic


<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or u

<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, or u

<400> 1242
nyyngcaggc uguuguguga caug 24


<210> 1243
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1243
gtacagtgtg ttgtcggacg actt 24


<210> 1244
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic


<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, or u

<400> 1244
uuunucugca gccuucccag agga 24


<210> 1245
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1245
aggagaccct tccgacgtct cttt 24


<210> 1246
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1246
tgctgggtcc tacctgtcag agccccaagg taaaaaggcc gggaaagcat cttaatttag 60

cgtgcagtct cagctggt 78


<210> 1247
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1247
accagctgag actgcacgct aaattaagat gctttcccgg cctttttacc ttggggctct 60

gacaggtagg acccagca 78


<210> 1248
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1248
ggtgactgag cattgtcttc cctcccaggc agctcacagt gtgccaccat ggagttgggg 60

cccctagaag gtgg 74


<210> 1249
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1249
ccaccttcta ggggccccaa ctccatggtg gcacactgtg agctgcctgg gagggaagac 60

aatgctcagt cacc 74


<210> 1250
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1250
cagttcagca ggctgttgtg tgacatggaa ggtgatgaag agaccaggga ggcttatgcc 60

aatatcggtg agga 74


<210> 1251
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1251
tcctcaccga tattggcata agcctccctg gtctcttcat caccttccat gtcacacaac 60

agcctgctga actg 74


<210> 1252
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1252
catgttttct ctgcagcctt cccagaggag cttccggcag acctgaagca ctggaagcca 60

ggtgtgcagg gcaggtgggc tg 82


<210> 1253
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1253
cagcccacct gccctgcaca cctggcttcc agtgcttcag gtctgccgga agctaatctg 60

ggaaggctgc agagaaaaca tg 82


<210> 1254
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1254
agugggggug aauucagugu 20


<210> 1255
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1255
acagtcaggc tgttttccag ggtggggtgc agacattctc tgcctgttgt gatgcttaca 60

tataacgtca taacagacac acgt 84


<210> 1256
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1256
acgtgtgtct gttatgacgt tatatgtaag catcacaaca ggcagagaat gtctgcaccc 60

caccctggaa aacagcctga ctgt 84


<210> 1257
<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1257
atgtgttgtg atccctgtgg tttgagagtt tggagcttcc ctaaaagtca aaatattctc 60

aatgggccct caatcagcac atacacacaa aa 92


<210> 1258
<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1258
ttttgtgtgt atgtgctgat tgagggccca ttgagaatat tttgactttt agggaagctc 60

caaactctca aaccacaggg atcacaacac at 92


<210> 1259
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1259
aggacagtct cggggttcca ttt 23


<210> 1260
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1260
uaauuucuac ucuuguagau agacagauau uugcauugag 40


<210> 1261
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1261
uaauuucuac ucuuguagau cauugagaua guguggggaa 40


<210> 1262
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1262
uaauuucuac ucuuguagau uagccuuugc cuuguuccga 40


<210> 1263
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1263
uaauuucuac ucuuguagau ccuuguuccg auucagucau 40


<210> 1264
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1264
uaauuucuac ucuuguagau ucuaauuuau ucuucccuuu 40


<210> 1265
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1265
uaauuucuac ucuuguagau cuucucccau cauagaggau 40


<210> 1266
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1266
uaauuucuac ucuuguagau uucucccacc auagaagaua 40


<210> 1267
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1267
uaauuucuac ucuuguagau ccacuggaua agugugugug 40


<210> 1268
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1268
uaauuucuac ucuuguagau gcguagcucu ucuaugcuca 40


<210> 1269
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1269
uaauuucuac ucuuguagau cugagcauag aagagcuacg 40


<210> 1270
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1270
uaauuucuac ucuuguagau ucacuggaua aguguaugug 40


<210> 1271
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1271
uaauuucuac ucuuguagau guguagcucu ucuaugcucg 40


<210> 1272
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1272
uaauuucuac ucuuguagau ccgagcauag aagagcuaca 40


<210> 1273
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1273
uaauuucuac ucuuguagau gacagauauu ugcauugaga 40


<210> 1274
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1274
uaauuucuac ucuuguagau acacuaucuc aaugcaaaua 40


<210> 1275
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1275
uaauuucuac ucuuguagau cacacuaucu caaugcaaau 40


<210> 1276
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1276
uaauuucuac ucuuguagau ccacacuauc ucaaugcaaa 40


<210> 1277
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1277
uaauuucuac ucuuguagau uuccccacac uaucucaaug 40


<210> 1278
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1278
uaauuucuac ucuuguagau gauucaguca uuccaguuuu 40


<210> 1279
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1279
uaauuucuac ucuuguagau auucagucau uccaguuuuu 40


<210> 1280
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1280
uaauuucuac ucuuguagau gucauuccag uuuuucucua 40


<210> 1281
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1281
uaauuucuac ucuuguagau aguuuuucuc uaauuuauuc 40


<210> 1282
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1282
uaauuucuac ucuuguagau guuuuucucu aauuuauucu 40


<210> 1283
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1283
uaauuucuac ucuuguagau gucauuccaa uuuuucucua 40


<210> 1284
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1284
uaauuucuac ucuuguagau aauuuuucuc uaauuuauuc 40


<210> 1285
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1285
uaauuucuac ucuuguagau auuuuucucu aauuuauucu 40


<210> 1286
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1286
uaauuucuac ucuuguagau uucucccauc auagaggaua 40


<210> 1287
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1287
uaauuucuac ucuuguagau aucauagagg auaccaggac 40


<210> 1288
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1288
uaauuucuac ucuuguagau accauagaag auaccaggac 40


<210> 1289
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1289
uaauuucuac ucuuguagau caguaccugc caaagaacau 40


<210> 1290
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1290
uaauuucuac ucuuguagau uaguaucugg uaaagagcau 40


<210> 1291
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1291
uaauuucuac ucuuguagau cucuuggggg ccccuucccc 40


<210> 1292
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1292
uaauuucuac ucuuguagau gauucaguca uuccaauuuu 40


<210> 1293
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1293
uaauuucuac ucuuguagau auucagucau uccaauuuuu 40


<210> 1294
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1294
uaauuucuac ucuuguagau gccuuugccu uguuccgauu 40


<210> 1295
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1295
uaauuucuac ucuuguagau cucaguaaag augaugguag 40


<210> 1296
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1296
uaauuucuac ucuuguagau acuggauaag uguaugugcu 40


<210> 1297
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1297
uaauuucuac ucuuguagau ugcuggcuga ugacccaggg 40


<210> 1298
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1298
uaauuucuac ucuuguagau cucgguaaag augaugguag 40


<210> 1299
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic

<400> 1299
uaauuucuac ucuuguagau ugguaaagag cauucuacca 40

Claims (36)

  1. プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからのＣＲＩＳＰＲと、ＨＢＧ遺伝子配列又はＢＣＬ１１ａ遺伝子配列を標的とするｇＲＮＡ分子とを含むＲＮＰ複合体の送達によって生成される、前記ＨＢＧ遺伝子配列又は前記ＢＣＬ１１ａ遺伝子配列における修飾を含む単離された細胞。
  2. ＨＢＧ遺伝子のシス調節領域の破壊を含む１つ又は複数の細胞を有するＣＤ３４＋細胞又は造血幹細胞（ＨＳＣ）集団であって、前記破壊は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、前記ＨＢＧ遺伝子の前記シス調節領域を標的とするｇＲＮＡとを含むＲＮＰ複合体を使用して生成される、ＣＤ３４＋細胞又は造血幹細胞（ＨＳＣ）集団。
  3. 前記シス調節領域は、ＨＢＧ遺伝子プロモーターのＣＡＡＴボックスを含む、請求項２に記載の細胞集団。
  4. 異常ヘモグロビン症の症状の治療又は緩和を、それを必要とする対象において行う方法であって、請求項２又は３に記載の細胞集団を前記対象に投与することを含む方法。
  5. 前記細胞集団は、未修飾細胞集団と比較して胎児型ヘモグロビン発現の発現の増加を有するか、又は投与に引き続いて胎児型ヘモグロビンの増加した発現をもたらし、前記胎児型ヘモグロビンの発現の前記増加は、前記異常ヘモグロビン症の症状を部分的に又は完全に緩和するのに適した量である、請求項４に記載の方法。
  6. プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからのＣＲＩＳＰＲと、核酸配列を標的とするｇＲＮＡ分子とを含む複合体の送達によって生成される、前記核酸配列における修飾を含む単離されたＴ細胞であって、前記核酸配列は、ＦＡＳ遺伝子配列の一部、ＢＩＤ遺伝子配列の一部、ＣＴＬＡ４遺伝子配列の一部、ＰＤＣＤ１遺伝子配列の一部、ＣＢＬＢ遺伝子配列の一部、ＰＴＰＮ６遺伝子配列の一部、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、単離されたＴ細胞。
  7. ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡからなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の破壊を含むＴ細胞集団であって、前記破壊は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＩＩＴＡ及びＢ２Ｍからなる群から選択される遺伝子を標的とするｇＲＮＡとを含む１つ又は複数のＲＮＰ複合体を使用して生成され、前記Ｔ細胞集団の少なくとも６０％のＴ細胞は、前記Ｔ細胞の表面上において、検出可能なレベルのＭＨＣ ＩＩ受容体、ＴＣＲ又はＢ２Ｍを含まない、Ｔ細胞集団。
  8. 破壊されたＴＲＡＣ遺伝子座に挿入されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は操作されたＴ細胞受容体（ｅＴＣＲ）をさらに含む、請求項７に記載のＴ細胞集団。
  9. 前記Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ８＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ８＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞、ＴＨ１７ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ１ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ２ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＨ９ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞である、請求項６～８のいずれ一項に記載の単離されたＴ細胞又はＴ細胞集団。
  10. 核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからの単離されたＣＲＩＳＰＲであって、前記Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、前記ヌクレアーゼのＮ末端若しくはその近傍の１つ若しくは複数のＮＬＳ配列、前記ヌクレアーゼのＣ末端若しくはその近傍の１つ若しくは複数のＮＬＳ配列又は前記ヌクレアーゼのＮ末端及びＣ末端若しくはその近傍の１つ若しくは複数のＮＬＳ配列を含む、単離されたＣＲＩＳＰＲ。
  11. 前記ＮＬＳ配列は、ヌクレオプラスミンＮＬＳ（ｎＮＬＳ）（配列番号１）及びシミアンウイルス４０「ＳＶ４０」ＮＬＳ（ｓＮＬＳ）（配列番号２）からなる群から選択される、請求項１０に記載の単離されたＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。
  12. システインアミノ酸の欠失又は置換を含む、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからの単離されたＣＲＩＳＰＲであって、前記Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、野生型ＡｓＣｐｆ１アミノ酸配列のＣ６５、Ｃ２０５、Ｃ３３４、Ｃ３７９、Ｃ６０８、Ｃ６７４、Ｃ１０２５又はＣ１２４８に欠失又は置換を含み、前記置換は、Ｃ６５Ｓ／Ａ、Ｃ２０５Ｓ／Ａ、Ｃ３３４Ｓ／Ａ、Ｃ３７９Ｓ／Ａ、Ｃ６０８Ｓ／Ａ、Ｃ６７４Ｓ／Ａ及びＣ１０２５Ｓ／Ａからなる群から選択される、単離されたＣＲＩＳＰＲ。
  13. 請求項１０～１２のいずれか一項に記載のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする単離された核酸。
  14. ＨＳＣ又はＴ細胞の集団において、関心のある１つ又は複数の標的配列を修飾する方法であって、前記細胞集団を、
    （ａ）前記関心のある標的配列に相補的なｇＲＮＡ分子；及び
    （ｂ）請求項１０～１２のいずれか一項に記載のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
    を含む１つ又は複数のＲＮＰ複合体とエクスビボ又はインビトロで接触させることを含み、前記１つ又は複数のＲＮＰ複合体は、前記細胞集団内の前記１つ又は複数の関心のある標的配列を修飾する、方法。
  15. 前記細胞集団内の前記細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％は、生産的インデルを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記標的核酸配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４又は１５に記載の方法。
  17. 細胞集団を対象に投与する方法であって、前記細胞集団は、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからのＣＲＩＳＰＲと、ＨＢＧ遺伝子配列又はＢＣＬ１１ａ遺伝子配列を標的とするｇＲＮＡ分子とを含む複合体の送達によって生成される、前記ＨＢＧ遺伝子配列又は前記ＢＣＬ１１ａ遺伝子配列における修飾を含む、方法。
  18. 前記対象は、異常ヘモグロビン症に罹患している、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記細胞集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）又はヒト臍帯血誘導赤血球前駆（ＨＵＤＥＰ）細胞を含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
  20. Ｔ細胞の集団を対象に投与する方法であって、前記細胞集団は、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、遺伝子を標的とするｇＲＮＡ分子とを含む複合体の送達によって生成される、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＩＩＴＡ及びＢ２Ｍからなる群から選択される前記遺伝子における修飾を含む、方法。
  21. 前記対象は、がん又は自己免疫障害に罹患している、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記細胞集団内の前記細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％は、生産的インデルを含む、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 標的配列に相補的な第１の標的化ドメインを含む、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからのＣＲＩＳＰＲのｇＲＮＡ分子であって、前記標的配列は、ＨＢＧ遺伝子配列又はＢＣＬ１１ａ遺伝子配列であり、前記ｇＲＮＡ分子は、図６、図７、図８、図４６及び表１９で提供される配列と同一であるか、又は３つ以下のヌクレオチドだけ異なる配列を含む、ｇＲＮＡ分子。
  24. （ａ）前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、細胞に導入され、インデルは、前記ｇＲＮＡ分子の前記第１の標的化ドメインに相補的な前記標的配列又はその近傍に形成され；及び／又は（ｂ）前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムが細胞に導入されると、欠失は、ＨＢＧ１プロモーター領域又はＨＢＧ２プロモーター領域内における、前記ｇＲＮＡの第１の標的化ドメインに相補的な配列に生じる、請求項２３に記載のｇＲＮＡ分子。
  25. 前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステムが細胞集団に導入されると、
    （ａ）胎児型ヘモグロビンの発現は、前記ｇＲＮＡ分子が導入されなかった細胞集団又はその子孫集団における胎児型ヘモグロビンの発現のレベルと比較して前記細胞集団又はその子孫で増加し；及び／又は
    （ｂ）異常ヘモグロビン症の症状を部分的に又は完全に緩和するのに適した量で前記胎児型ヘモグロビンの発現の増加をもたらす、請求項２３に記載のｇＲＮＡ分子。
  26. 請求項２３～２５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子を含む組成物。
  27. プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからのＣＲＩＳＰＲをさらに含む、請求項２６に記載の組成物。
  28. 請求項２７に記載の組成物を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む組成物。
  29. 異常ヘモグロビン症に罹患している対象の治療で使用するための、請求項２３～２５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子又は請求項２６～２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 標的配列に相補的な第１の標的化ドメインを含む、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからのＣＲＩＳＰＲのｇＲＮＡ分子であって、前記標的配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記ｇＲＮＡ分子は、表２～９で提供される配列と同一であるか、又は３つ以下のヌクレオチドだけ異なる配列を含む、ｇＲＮＡ分子。
  31. （ａ）前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、細胞に導入され、インデルは、前記ｇＲＮＡ分子の前記第１の標的化ドメインに相補的な前記標的配列又はその近傍に形成され；及び／又は（ｂ）前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムが細胞に導入されると、欠失は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子配列、前記ＴＲＡＣ遺伝子配列、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子配列又は前記ＴＲＢＣ遺伝子配列内における、前記ｇＲＮＡの第１の標的化ドメインに相補的な配列に生じる、請求項３０に記載のｇＲＮＡ分子。
  32. 請求項３０又は３１に記載のｇＲＮＡ分子を含む組成物。
  33. プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからのＣＲＩＳＰＲをさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
  34. がんに罹患している対象の治療で使用するための、請求項３０若しくは３１に記載のｇＲＮＡ分子又は請求項３２若しくは３４に記載の組成物。
  35. ゲノム編集システムであって、
    （ａ）図６、図７、図８、図９、図１０、図１１、図１２、図４６並びに表２～９及び１９で提供される配列を含むｇＲＮＡ分子；及び
    （ｂ）請求項１０～１２のいずれか一項に記載のＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
    を含む１つ又は複数のＲＮＰ複合体を含むゲノム編集システム。
  36. 試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによる標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を評価するためのアッセイであって、
    （ａ）一致部位標的核酸配列を含む標的核酸配列の編集及び／又は発現の調整に関して、前記試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性を判定すること；
    （ｂ）前記一致部位標的核酸配列を含む前記標的核酸配列の前記編集及び／又は発現の調整に関して、前記試験Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの前記活性を対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性と比較すること
    を含むアッセイ。
JP2023193282A 2017-12-11 2023-11-13 遺伝子編集のためのｃｐｆ１関連方法及び組成物 Pending JP2024023294A (ja)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762597118P 2017-12-11 2017-12-11
US62/597,118 2017-12-11
US201862623501P 2018-01-29 2018-01-29
US62/623,501 2018-01-29
US201862664905P 2018-04-30 2018-04-30
US62/664,905 2018-04-30
US201862746494P 2018-10-16 2018-10-16
US62/746,494 2018-10-16
PCT/US2018/065032 WO2019118516A1 (en) 2017-12-11 2018-12-11 Cpf1-related methods and compositions for gene editing
JP2020531964A JP2021505187A (ja) 2017-12-11 2018-12-11 遺伝子編集のためのｃｐｆ１関連方法及び組成物

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020531964A Division JP2021505187A (ja) 2017-12-11 2018-12-11 遺伝子編集のためのｃｐｆ１関連方法及び組成物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024023294A true JP2024023294A (ja) 2024-02-21

Family

ID=65023985

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020531964A Pending JP2021505187A (ja) 2017-12-11 2018-12-11 遺伝子編集のためのｃｐｆ１関連方法及び組成物
JP2023193282A Pending JP2024023294A (ja) 2017-12-11 2023-11-13 遺伝子編集のためのｃｐｆ１関連方法及び組成物

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020531964A Pending JP2021505187A (ja) 2017-12-11 2018-12-11 遺伝子編集のためのｃｐｆ１関連方法及び組成物

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20200299661A1 (ja)
EP (1) EP3724326A1 (ja)
JP (2) JP2021505187A (ja)
KR (1) KR20200097760A (ja)
CN (1) CN111712569A (ja)
AU (1) AU2018383712A1 (ja)
CA (1) CA3085338A1 (ja)
MX (1) MX2020006072A (ja)
WO (1) WO2019118516A1 (ja)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018170184A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
WO2018209158A2 (en) 2017-05-10 2018-11-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
CA3093702A1 (en) * 2018-03-14 2019-09-19 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
US20200216825A1 (en) * 2019-01-08 2020-07-09 Integrated Dna Technologies, Inc. CAS12a MUTANT GENES AND POLYPEPTIDES ENCODED BY SAME
SG11202107045PA (en) * 2019-02-13 2021-07-29 Beam Therapeutics Inc Compositions and methods for treating hemoglobinopathies
US20230056843A1 (en) * 2019-08-19 2023-02-23 Southern Medical University Construction of high-fidelity crispr/ascpf1 mutant and uses thereof
CA3153700A1 (en) * 2019-09-09 2021-03-18 Scribe Therapeutics Inc. Compositions and methods for use in immunotherapy
AU2020388690A1 (en) * 2019-11-20 2022-06-09 Cartherics Pty. Ltd. Method for providing immune cells with enhanced function
CN111647618A (zh) * 2020-01-15 2020-09-11 温州医科大学 一种新型基因组编辑工具（Lb2Cas12a-RVR）及其构建方法和应用方法
CN113355389B (zh) * 2020-03-05 2022-11-15 广西扬翔股份有限公司 利用CRISPR/Cas12a系统靶向富集核酸目标区域的方法及其应用
WO2022065867A1 (ko) * 2020-09-22 2022-03-31 (주)지플러스생명과학 변형된 cas12a 단백질 및 이의 용도
KR102497690B1 (ko) * 2020-09-22 2023-02-10 (주)지플러스생명과학 신규한 crispr 연관 단백질 및 이의 용도
JP2023548588A (ja) * 2020-10-30 2023-11-17 アーバー バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド Ｔｒａｃを標的とするｒｎａガイドを含む組成物及びその使用
US20230399639A1 (en) * 2020-10-30 2023-12-14 Arbor Biotechnologies, Inc. Compositions comprising an rna guide targeting b2m and uses thereof
US20230416732A1 (en) * 2020-10-30 2023-12-28 Arbor Biotechnologies, Inc. Compositions comprising an rna guide targeting bcl11a and uses thereof
JP2023549348A (ja) * 2020-11-11 2023-11-24 ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク マルチプレックスエピゲノム編集
WO2022113056A1 (en) 2020-11-30 2022-06-02 Crispr Therapeutics Ag Gene-edited natural killer cells
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
CR20230303A (es) * 2020-12-11 2023-09-01 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y métodos para reducir el mhc de clase ii en una célula
BR112023012432A2 (pt) * 2020-12-23 2023-11-07 Intellia Therapeutics Inc Composições e métodos para modificação genética de ciita em uma célula
EP4271798A1 (en) 2020-12-30 2023-11-08 CRISPR Therapeutics AG Compositions and methods for differentiating stem cells into nk cells
CN112725487A (zh) * 2021-02-03 2021-04-30 张国良 用于链霉素耐药结核分枝杆菌的核酸快速检测试剂盒及其检测方法
WO2022217086A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Vor Biopharma Inc. Photocleavable guide rnas and methods of use thereof
JP2024518413A (ja) * 2021-05-06 2024-05-01 アーティザン ディヴェロップメント ラブス インコーポレイテッド 修飾ヌクレアーゼ
US20230014010A1 (en) * 2021-06-23 2023-01-19 Crispr Therapeutics Ag Engineered cells with improved protection from natural killer cell killing
WO2023283585A2 (en) 2021-07-06 2023-01-12 Vor Biopharma Inc. Inhibitor oligonucleotides and methods of use thereof
WO2023004411A1 (en) * 2021-07-23 2023-01-26 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai A method for in vivo gene therapy to cure scd without myeloablative toxicity
CA3228272A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for gene modification
WO2023049926A2 (en) 2021-09-27 2023-03-30 Vor Biopharma Inc. Fusion polypeptides for genetic editing and methods of use thereof
WO2024073751A1 (en) 2022-09-29 2024-04-04 Vor Biopharma Inc. Methods and compositions for gene modification and enrichment
CN116144631B (zh) * 2023-01-17 2023-09-15 华中农业大学 耐热型核酸内切酶及其介导的基因编辑系统
CN116179511B (zh) * 2023-03-10 2023-12-22 之江实验室 Cpf1蛋白在制备用于核酸检测的试剂盒中的应用
CN116179513B (zh) * 2023-03-10 2023-12-22 之江实验室 一种Cpf1蛋白及其在基因编辑中的应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5994627A (en) 1995-03-31 1999-11-30 Common Wealth Scientific And Industrial Research Organisation Genetic sequences conferring nematode resistance in plants and uses therefor
GB201013153D0 (en) 2010-08-04 2010-09-22 Touchlight Genetics Ltd Primer for production of closed linear DNA
WO2013169802A1 (en) 2012-05-07 2013-11-14 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
LT3066201T (lt) 2013-11-07 2018-08-10 Editas Medicine, Inc. Su crispr susiję būdai ir kompozicijos su valdančiomis grnr
DK3116997T3 (da) 2014-03-10 2019-08-19 Editas Medicine Inc Crispr/cas-relaterede fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af lebers kongenitale amaurose 10 (lca10)
CA2963820A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
WO2017106657A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
AU2017226172B9 (en) * 2016-03-04 2023-08-24 Editas Medicine, Inc. CRISPR/Cpf1-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy
CA3017956A1 (en) * 2016-03-14 2017-09-21 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating beta hemoglobinopathies
WO2017182881A2 (en) * 2016-04-18 2017-10-26 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
CA3026055A1 (en) * 2016-04-19 2017-10-26 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
CA3026110A1 (en) * 2016-04-19 2017-11-02 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
US11866726B2 (en) * 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites

Also Published As

Publication number Publication date
EP3724326A1 (en) 2020-10-21
US20200299661A1 (en) 2020-09-24
KR20200097760A (ko) 2020-08-19
JP2021505187A (ja) 2021-02-18
AU2018383712A1 (en) 2020-07-02
CN111712569A (zh) 2020-09-25
MX2020006072A (es) 2020-08-24
WO2019118516A1 (en) 2019-06-20
CA3085338A1 (en) 2019-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2024023294A (ja) 遺伝子編集のためのｃｐｆ１関連方法及び組成物
KR102438360B1 (ko) 암 면역요법을 위한 crispr-cpf1-관련 방법, 조성물 및 구성성분
RU2737537C2 (ru) Новые ферменты и системы crispr
KR20230057487A (ko) 게놈 조정을 위한 방법 및 조성물
KR102604903B1 (ko) 내인성 및 공급원 DNA의 원-샷 가이드 RNA(ogRNA) 표적화를 위한 시스템 및 방법
JP7275043B2 (ja) 増大したｈＡＴファミリートランスポゾン媒介遺伝子導入ならびに関連する組成物、システムおよび方法
KR20230053735A (ko) 게놈의 조정을 위한 개선된 방법 및 조성물
US11866726B2 (en) Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
US20230022146A1 (en) Compositions and methods for editing beta-globin for treatment of hemaglobinopathies
US20210115475A1 (en) Systems and methods for modulating chromosomal rearrangements
KR20220002609A (ko) 포유동물 세포의 특성을 변경하기 위한 인공 마이크로-rna 및 이들 생성물의 조성물을 사용한 포유동물 세포의 변형
KR20210125560A (ko) 유전성 질환의 치료를 위한 것을 포함하는, 아데노신 데아미나제 염기 편집기를 사용한 질환-관련 유전자의 스플라이스 수용체 부위 파괴
JP2024041866A (ja) 強化されたｈＡＴファミリーのトランスポゾンが介在する遺伝子導入ならびに関連する組成物、システム、及び方法
CN114174520A (zh) 用于选择性基因调节的组合物和方法
KR20230111189A (ko) 재프로그램 가능한 iscb 뉴클레아제 및 이의 용도
KR20220052370A (ko) 보편적 공여자 세포
KR20220058579A (ko) 보편적 공여자 세포
KR20220097414A (ko) X-연관 연소 망막층간분리 치료법을 위한 crispr 및 aav 전략
KR20210082205A (ko) 레트로바이러스 인테그라제-Cas9 융합 단백질을 이용한 유도된 비상동 DNA 삽입에 의한 게놈 편집
RU2792654C2 (ru) Новые ферменты и системы crispr
CN117062912A (zh) 用于基于crispr的转录抑制的融合蛋白
KR20240000580A (ko) 레트로바이러스 인테그라제-Cas 융합 단백질을 이용한 직접 비상동 DNA 삽입에 의한 게놈 편집 및 치료 방법
CN117043324A (zh) 用于治疗先天性肌营养不良的治疗性lama2载荷
KR20240043772A (ko) 헤모글로빈병증의 치료를 위한 시스템 및 방법
KR20230125806A (ko) 선천성 근이영양증의 치료를 위한 치료용 lama2 페이로드

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231213

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20231213

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231225