CN117062912A - 用于基于crispr的转录抑制的融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于调节核酸表达的组合物以及使用这些组合物的方法。所述组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白含有SALLI和SUDS3中的一者或两者的抑制结构域。在一些实施方案中，组合物是可与gRNA或其它RNA组合使用的Cas融合蛋白。额外或可选地，组合物是RNA抑制结构域复合物。

Description

用于基于CRISPR的转录抑制的融合蛋白
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年2月5日提交的美国临时申请序列号63/146,419的权益，其全部公开内容通过引用并入本文，如同在本文完全阐述。
技术领域
本发明涉及基于CRISPR的转录抑制的领域。
背景技术
生物技术界现在十分熟悉CRISPR-Cas9系统，该系统允许基因的特定靶向和编辑。这个系统最初是在古细菌和细菌中发现的，但最有希望的是用于人类。
基本的CRISPR/Cas9系统包含Cas9蛋白和向导RNA(“gRNA”)。基于间隔区序列和靶位点序列之间的互补性，gRNA中的间隔区序列(也称为靶向序列)将Cas9蛋白导向基因组靶位点。Cas9蛋白被带到靶位点后，它可以切割靶DNA并导致DNA编辑。或者，失活的Cas9(“dCas9”)可用于序列特异性靶向并带来具有不同功能的其它效应子。
因为CRISPR/Cas9系统在定位和编辑靶位点方面是有效的，所以研究人员已经探索了在该系统上搭载的方法，以便引入除了那些可能由天然存在的Cas9蛋白的活性位点引起的功能之外的功能。此外，研究人员已经开始探索使用其它依赖gRNA特异性的Cas蛋白，以便将这些蛋白带到靶位点。
虽然研究人员最初在低等生物中发现了CRISPR-Cas9系统，但该系统已成功用于哺乳动物细胞中的基因编辑应用，M.Jinek,et al.,“A programmabledual-RNA-guidedDNA endonuclease in adaptive bacterial immunity,”Science.337:p.816-821(2012)。此外，研究人员已经能够通过将点突变引入催化残基(在常用的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白的情况下为D10A和H840A)来消除Cas蛋白的核酸酶活性，从而产生失活的Cas9，当由序列特异性向导RNA指导时，该Cas9保持结合靶DNA的能力。当dCas9融合至转录调节因子并被引导至基因启动子区时，它诱导RNA指导的转录调节。基于CRISPR的转录调控技术包括用于转录抑制的CRISPR干扰(CRISPRi)和用于转录上调的CRISPR激活(CRISPRa)(Qi,L.S.,et al.,“Repurposing CRISPR as an RNA-guidedplatform for sequence-specific control of gene expression,”Cell,152(5):p.1173-83(2013)；A.W.Cheng,et al.,“Multiplexed activation of endogenous genesby CRISPR-on,an RNA-guided transcriptional activator system,”Cell Res.,23(10):p.1163-71(2013))。
一种已知的基于CRISPR的转录抑制方法利用来自锌指蛋白10(KOX1)的Krüppel相关盒(KRAB)结构域作为转录抑制物，L.A.Gilbert,et al.,“CRISPR-mediated modularRNA-guided regulation of transcription in eukaryotes,”Cell,154(2):p.442-51(2013)；L.A.Gilbert et al.,“Genome-scale CRISPR-mediated control of generepression and activation,”Cell,159:p.647–661(2014)。然而，这种方法有其局限性。研究人员已经表明，它不能在所有应用中提供足够的抑制，并且使用它会导致对靶基因的不太强的抑制，L.Stojic et al.,“Specificity of RNAi,LNA and CRISPRi as loss-of-function methods in transcriptional analysis,”Nucleic Acids Research,46(12):p.5950–5966(2018)；Yeo,et al.,“An enhanced CRISPR repressor for targetedmammalian gene regulation,”Nat.Methods,15(8):p.611-616(2018)。鉴于在CRISPR-KRAB融合蛋白(最常用于转录抑制的融合蛋白)表现方面的报道的可变性，需要额外的基于CRISPR的转录抑制方法。
发明内容
本发明提供了新型的融合蛋白，编码这些蛋白的核酸序列，以及通过使用这些蛋白和/或核酸进行基因抑制的方法。通过使用本发明的各种实施方案，人们可以高效和有效地调节基因表达。
根据第一实施方案，本发明提供了包含Cas蛋白以及SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域中的一者或两者的Cas融合蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白是失活的，这也可以被称为死的或减毒的。
根据第二实施方案，本发明提供了编码本发明的Cas融合蛋白的核酸。
根据第三实施方案，本发明提供了RNA抑制结构域复合物。RNA抑制结构域复合物包含：(a)gRNA分子，其中gRNA分子包含30至180个核苷酸；(b)配体结合部分，其中配体结合部分或者(i)直接与gRNA分子结合，或者(ii)通过配体结合部分接头与gRNA分子结合；(c)配体，其中配体能够与配体结合部分可逆地结合；和(d)融合蛋白，其中融合蛋白包含SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域，并且其中融合蛋白或者(i)直接与配体结合，或者(ii)通过接头与配体结合。
根据第四实施方案，本发明提供了调节靶核酸表达的方法，包括将本发明的Cas融合蛋白或RNA抑制结构域复合物或本发明的核酸引入细胞(例如真核细胞)或生物体(例如哺乳动物，诸如人)。在一些实施方案中，引入是体内、体外或离体的。
根据第五实施方案，本发明提供了包含本发明的Cas融合蛋白或编码本发明的Cas融合蛋白的核酸的试剂盒，并且在一些实施方案中，还可以包含gRNA或编码gRNA的核酸。
根据第六实施方案，本发明提供了试剂盒，其包含RNA-抑制结构域复合物或编码两个分子(本发明的RNA配体结合结构域和配体抑制物)的核酸。
根据第七实施方案，本发明提供了蛋白质，其包含与SEQ ID NO:10具有至少80％相似性的序列，或基本由与SEQ ID NO:10具有至少80％相似性的序列组成，或由与SEQ IDNO:10具有至少80％相似性的序列组成。
附图说明
图1是与单个向导RNA(“sgRNA”)和靶DNA结合的本发明的Cas融合蛋白的示意图。
图2是可用于本发明的各种实施方案的sgRNA的实例。
图3A是描述用dCas9-KRAB或dCas9-SALL1-SUDS3 mRNA核转染(nucleofected)的K562细胞中基因敲除的图。图3B是描述用dCas9-KRAB或dCas9-SALL1-SUDS3 mRNA核转染的Jurkat细胞中基因敲除的图。图3C是描述用dCas9-KRAB和dCas9-SALL1-SUDS3mRNA核转染的U2OS细胞中基因敲除的图。
图4是对比将dCas9-SALL1-SUDS3 eGFP mRNA引入HCT 116细胞时靶基因的抑制与将dCas9-KRAB eGFP mRNA引入HCT 116细胞时靶基因的抑制的图。这些基因被以25nM递送的三种合成的sgRNA集合靶向。转染后24小时，将细胞分为两类：GFP阴性(GFP Neg)和表达GFP最多的10％(前10％)，24小时恢复后，分析靶基因的转录抑制。
图5A-5C对比了不同细胞系中含有dCas9-KRAB的系统与含有dCas9-SALL1-SUDS3的系统中的抑制：U2OS(图5A)；Jurkat(图5B)；和hiPS稳定的hEFlα(图5C)。
图6A示出了K562细胞中dCas9-KRAB和dCas9-SALL1-SUDS3对BRCA1、PSMD7、SEL1L和ST3GAL4的基因抑制。图6B显示了在A375细胞中dCas9-KRAB和dCas9-SALL1-SUDS3对BRCA1、PSMD7、SEL1L和ST3GAL4的基因抑制。
图7A-7D对比了在U2OS细胞中针对不同基因靶的六天期间中dCas9-KRAB的抑制与dCas9-SALL1-SUDS3的抑制：BRCA1(图7A)；CD46(图7B)；HBP1(图7C)；和SEL1L(图7D)。
图8A示出了当引入本发明的Cas融合蛋白时，使用针对PPIB、SEL1L和RAB11A的单个sgRNA和针对这些靶的sgRNA集合的抑制。图8B显示了当引入本发明的Cas融合蛋白时，单个sgRNA对BRCA1、PSMD7、SEL1L和ST3GAL4的抑制或sgRNA集合对这些靶的抑制。
图9示出了当多路复用时(即使用sgRNA针对多种基因)，在gRNA和dCas9-SALL1-SUDS3存在下，hiPSC细胞中下列基因的表达：PPIB、RAB11A和SEL1。
图10的图示出了在存在gRNA和dCas9的情况下，U2OS-Ubi(G76V)-EGFP报道细胞系中PSMD3、PSMD8和PSMD11基因的抑制的功能表型，所述gRNA和dCas9在dCas9的N末端氨基酸或dCas9的C末端氨基酸处与KRAB或SALLI-SUDS3融合。
图11是具有在A375细胞中共转染表达gRNA的质粒和表达融合蛋白的质粒的系统中转录抑制的图。
图12是具有在U2OS细胞中共转染表达gRNA的质粒和表达融合蛋白的质粒的系统中转录抑制的图。
图13的图示出了SALL1或SUDS3各自与额外的抑制结构域组合的效果的图。
图14A是与U2OS细胞中的dMAD7相比，dMAD7-SALL1-SUDS3的抑制的图示。图14B是与U2OS细胞中的dCasPhi8相比，dCasPhi8-SALL1-SUDS3的抑制的图示。
图15A是使用不同crRNA靶向尺寸的sgRNA和未失活的Cas9同时进行抑制和基因编辑的效果图。图15B是描述同时编辑LBR时对MRE11a的抑制的测量图。图15C是描述同时编辑PPIB时对MRE11a的抑制的测量图。图15D是描述同时编辑LBR时SEL1L的抑制的测量图。图15E是描述同时编辑PPIB时SEL1L的抑制的测量图。
图16是在U2OS-Ubi(G76V)-EGFP报道细胞系中含有单一抑制物dCas9融合蛋白的系统的抑制效果图。
图17是对比用合成的向导RNA转染的稳定表达dCas9-KRAB、dCas9-KRAB MeCP2或dCas9-SUDS3的U2OS细胞中转录抑制的图。
图18A是在表达dCas9-KRAB或dCas9-SALL1-SUDS3并用靶向蛋白酶体基因的合成的向导转染的U2OS Ubi[G76V]-EGFP报道细胞中基因敲除的表型效应的示意图。图18B描述了靶向蛋白酶体基因的相应转录抑制。
图19A示出了稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3和来自单一慢病毒载体或来自两个独立载体的向导RNA的U2OS细胞中PPIB和SEL1L的转录抑制。图19B显示了稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3和来自单一慢病毒载体或来自两个独立载体的向导RNA的HCT 116细胞中PPIB和SEL1L的转录抑制。
图20A示出了在稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3的U2OS细胞中，合成的或质粒sgRNA对BRCA1、PSMD7、SEL1L和ST3GAL4的转录抑制。图20B显示了在稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3的A375细胞中，合成的或质粒sgRNA对BRCA1、PSMD7、SEL1L和ST3GALA的转录抑制。
图21示出了在稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3的U2OS细胞中，合成的sgRNA或合成的crRNA：tracRNA复合物对CD151、SEL1L、SETD3和TFRC的转录抑制。
图22示出了在稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3的U2OS细胞中，具有5’截短的14mer靶向区或全长20mer靶向区的合成的sgRNA对LBR、MRE11a、XRCC4和SEL1L的转录抑制。
图23A示出了在表达dCas9-SALL1-SUDS3的U2OS Ubi[G76V]-EGFP报道细胞中，合成的sgRNA基因敲除PSMD7和PSMD11的表型效应，所述sgRNA在sgRNA的5’和3’端含有两个2’-O-甲基和硫代磷酸酯连接键(2x MS)和两个锁定核酸(LNA)修饰的各种组合。图23B显示了在表达dCas9-SALL1-SUDS3的U2OS Ubi[G76V]-EGFP报道细胞中，合成的sgRNA末端基因敲除PSMD7和PSMD11的表型效应，所述sgRNA末端用两个2’-O-甲基和硫代磷酸酯连接键(2xMS)稳定，并在靶向区域的不同位置含有各种锁定的核酸(LNA)。
图24A示出了合成的crRNA：tracrRNA复合物对BRCA1、CD151和SETD3的转录抑制，其中tracrRNA在不同位置(在tracrRNA的茎环2或3’末端)包含MS2茎环，以募集MCP-SALL1-SUDS3至dCas9。图24B显示了合成的crRNA：tracrRNA复合物对BRCA1、CD151和SETD3的转录抑制，其中tracrRNA含有各种MS2茎环序列以募集MCP-SALL1-SUDS3至dCas9。
图25A的图示出了在用dCas9-SALL1-SUDS3和合成的非靶向对照或靶向目标基因的三种向导的集合对原代人CD4+T细胞进行核转染1天和3天后，CXCR3的转录抑制和蛋白质水平敲除。图25B提供了上述T细胞群体中CXCR3和CD4蛋白表达的图示。
具体实施方式
现在将详细参考本发明的各种实施方案，其示例在附图中示出。在下面的描述中，阐述了许多具体细节，以便提供对本发明的透彻理解。然而，除非上下文中另有说明或隐含，否则这些细节旨在作为示例，不应被视为以任何方式限制本发明的范围。此外，结合各种或特定实施方案描述的特征不应被解释为不适于结合本文公开的其他实施方案使用，除非这种排他性被明确陈述或从上下文中隐含。
本文提供的标题是为了方便读者，并不限制本文公开的任何实施方案的范围。
定义
除非另有说明或从上下文中隐含，以下术语和短语具有下面提供的含义。
短语“2’修饰”指具有在糖部分的2’位置被修饰的糖部分的核苷酸单位。2’修饰的实例是形成2’-O-烷基修饰的核苷酸的2’-O-烷基修饰，或形成2’卤素修饰的核苷酸的2’卤素修饰。
短语“2’-O-烷基修饰的核苷酸”是指具有糖部分的核苷酸单位，例如具有在2’位置被修饰的脱氧核糖基或核糖基部分，使得氧原子连接到位于糖的2’位置的碳原子和烷基基团上。在各种实施方案中，烷基部分由碳和氢组成或基本上由碳和氢组成。当O部分和它所连接的烷基基团被视为一个基团时，它们可以被称为O-烷基，例如-O-甲基、-O-乙基、-O-丙基、-O-异丙基、-O-丁基、-O-异丁基、-O-乙基-O-甲基(-OCH2CH2OCH3)和-O-乙基-OH(-OCH2CH2OH)。2’-O-烷基修饰的核苷酸可以是取代的或未取代的。
短语“2’卤素修饰的核苷酸”指具有糖部分的核苷酸单位，例如具有在2’位置被修饰的脱氧核糖基部分，使得该位置的碳直接连接到卤素物质，例如F、l、Cl或Br。
术语“互补”是指核酸通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对或其它非传统类型的碱基配对与另一核酸序列形成一个或多个氢键的能力。互补百分比表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个中的5、6、7、8、9、10个，分别为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补性)。“完全互补”是指核酸序列的所有连续残基将与第二个核酸序列中相同数量的连续残基形成氢键。本文所用的“基本上互补”是指在例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个连续核苷酸的区域上，互补程度为至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％，或者是指在严格条件下杂交的两个核酸。
术语“编码”指核苷酸序列或氨基酸序列提供描述另一序列或分子中核苷酸或氨基酸序列的信息的能力。因此，核苷酸序列编码的分子包含与编码它的核苷酸序列相同的核苷酸；其包含符合沃森-克里克碱基配对规则的互补核苷酸；包含编码它的核苷酸的RNA等价物；包含编码它的互补核苷酸的RNA等价物；包含可以基于序列中的连续密码子产生的氨基酸序列；并且包含基于序列中连续密码子的互补产生的氨基酸序列。
“gRNA”是向导RNA。gRNA包含CRISPR RNA(crRNA)，或基本由CRISPR RNA(crRNA)组成，或由CRISPR RNA(crRNA)组成，并且在一些实施方案中，它还可以包含反式激活CRISPRRNA(tracrRNA)。它可以合成或酶促产生，并且它可以是连续的核苷酸链的形式，在这种情况下它是“sgRNA”，或者在一些实施方案中，通过crRNA和tracrRNA的杂交形成，所述crRNA和tracrRNA没有共价连接在一起形成连续的核苷酸链。此外，每种gRNA(或其组分，例如crRNA和tracrRNA，如果存在的话)可以独立地由质粒、慢病毒或AAV(腺相关病毒)、逆转录病毒、腺病毒、冠状病毒、仙台病毒或其它载体编码。gRNA将特异性引入CRISPR/Cas系统。特异性部分由靶DNA和gRNA的区域的序列之间的碱基配对决定，该区域可以被称为间隔区或靶区。
影响gRNA与靶DNA序列结合特异性的另一个因素是靶序列中存在的PAM(原间隔区相邻基序)序列(也称为PAM位点)。每个靶序列及其相应的PAM位点/序列可以统称为Cas靶向位点。例如，酿脓链球菌(S.pyogenes)的2类CRISPR系统使用具有N12-20NGG的靶向位点，其中NGG代表来自酿脓链球菌的PAM位点，N12-20代表直接位于PAM位点5’的12-20个核苷酸。来自其它细菌物种的额外的PAM位点序列包括NGGNG、NNNNGATT、NNAGAA、NNAGAAW和NAAAAC。参见，例如US20140273233,WO 2013176772,Cong etal.,Science 339(6121):819–823(2012),Jinek et al.,Science 337(6096):p.816–821(2012)、Mali et al.,Science339(6121):p.823–826(2013),Gasiunas et al.,Proc Natl Acad.Sci.U S A,109(39):p.E2579–E2586(2012)、Cho et al.,Nature Biotechnology 31:p.230–232(2013),Hou etal.,Proc.Natl Acad.Sci.U S A.110(39):p.15644-15649(2013)、Mojica et al.,Microbiology 155(Pt 3):p.733-740(2009),and www.addgene.org/CRISPR/。这些文件的内容通过引用整体并入本文。
术语“杂交(hybridization)”和“杂交(hybridizing)”指完全、基本或部分互补的核酸链在特定的杂交条件下结合在一起形成双链结构或区域的过程，其中两条组成链通过氢键连接。除非另有说明，杂交条件是自然发生的或实验室设计的条件。虽然氢键通常在腺嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶(A和T或U)之间或胞苷和鸟嘌呤(C和G)之间形成，但也可形成其它碱基对(参见，例如Adams et al.,The Biochemistry of the Nucleic Acids,11thed.,1992)。
“配体结合部分”是指例如适体的部分，诸如结合特定配体并能可逆或不可逆地与该配体结合的寡核苷酸或肽或另一种化合物。可逆结合是指两个分子或复合物可以通过例如非共价键(诸如氢键)保持彼此结合，并且彼此分离，而没有一个分子或复合物失去与其它分子或复合物结合的能力。
术语“修饰的核苷酸”是指在碱基、糖和/或磷酸的化学结构中具有至少一个修饰的核苷酸，包括但不限于5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、胞嘧啶环外胺的修饰以及5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶的取代；和2’-修饰，包括但不限于糖修饰的核糖核苷酸，其中2’-OH被基团例如H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN取代。
修饰的碱基是指核苷酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、肌苷和喹啉，它们已经通过替换或添加一个或多个原子或基团而被修饰。这些类型的修饰的一些实例包括，但不限于，烷基化、卤化、硫醇化、胺化、酰胺化或乙酰化碱基，单独的和各种组合。更具体的修饰碱基包括，例如，5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、N,N-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷以及在5位具有修饰的其它核苷酸，5-(2-氨基)丙基尿苷、5-卤代胞苷、5-卤代尿苷、4-乙酰胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鸟苷、7-甲基鸟苷、2,2-二甲基鸟苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲氧基尿苷，去氮核苷酸(例如7-去氮腺苷、6-偶氮尿苷、6-偶氮胞苷、6-偶氮胸苷、5-甲基-2-硫尿苷)、其他硫代碱基(例如2-硫尿苷和4-硫尿苷和2-硫胞苷)、二氢尿苷、假尿苷、喹啉、阿古碱、萘基和取代的萘基)、任何O-和N-烷基化的嘌呤和嘧啶(例如N6-甲基腺苷)、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基和修饰的苯基基团(例如氨基苯酚或2,4,6-三甲氧基苯)、作为G-钳核苷酸的修饰的胞嘧啶、8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮杂嘧啶、羧基羟烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸和烷基羰基烷基化核苷酸。修饰的核苷酸还包括糖部分被修饰的那些核苷酸，以及不含核糖基的糖或其类似物的核苷酸。例如，糖部分可以是或基于甘露糖、阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4-硫代核糖和其它糖、杂环或碳环。
术语“核苷酸”指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其修饰形式，以及其类似物。核苷酸包括包含嘌呤的种类，例如腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤及其衍生物和类似物，以及嘧啶，例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及其衍生物和类似物。优选地，核苷酸包含胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤部分。此外，术语核苷酸还包括具有可检测标记的那些种类，例如放射性或荧光部分，或与核苷酸连接的质量标记。术语核苷酸还包括本领域中已知的通用碱基。举例来说，通用碱基包括但不限于3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或吲哚啉。核苷酸类似物是指，例如，包括具有碱基的核苷酸，例如肌苷、喹啉、黄嘌呤、糖(诸如2’-甲基核糖)以及非天然磷酸二酯核苷酸间连接键，诸如甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、乙酰磷酸酯和肽。
术语“抑制结构域”指形成导致基因表达抑制的抑制物分子结构域的氨基酸序列。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指生物体，例如脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类。哺乳动物包括但不限于，老鼠、猿猴、人类、农场动物、运动动物和宠物例如狗和猫。体内获得或体外培养的生物体或其他生物实体的组织、细胞及其子代也包括在术语“受试者”和“患者”中。此外，在一些实施方案中，受试者可以是无脊椎动物，例如，昆虫或线虫；而在其它情况下，受试者可以是植物或真菌。
“末端氨基酸”是蛋白质或融合蛋白区内的最后一个氨基酸。例如，在融合蛋白中，Cas蛋白的末端氨基酸不仅可以与融合蛋白的Cas蛋白区域内的另一个氨基酸结合，还可以与抑制结构域或接头结合。类似地，在融合蛋白内，抑制结构域的末端氨基酸不仅可以与抑制结构域内的另一个氨基酸结合，还可以与另一个抑制结构域或融合蛋白的Cas蛋白区或接头结合。末端氨基酸可以是C末端氨基酸或N末端氨基酸。
如本文所用，“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“减轻”和“改善”可互换使用。这些术语是指获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处和/或预防益处。治疗益处是指在治疗中对一种或多种疾病、病症或症状的任何治疗相关的改善或作用。为了预防的益处，本发明的复合物可以在再次施用之前，在体外施用于具有发展为特定疾病、病症或症状的风险的受试者，或受试者的细胞或组织，或另一受试者的细胞或组织，或施用于报告有一种或多种疾病的生理症状的受试者，即使该疾病、病症或症状可能尚未表现出来。
术语“载体”是指转运另一分子的分子或复合物，包括但不限于能够转运另一核酸分子至与其连接，或者已经整合到载体序列中的核酸分子。可以将载体引入细胞和生物体中，以表达RNA转录物、蛋白质和肽，这可以称为“表达载体”。载体的实例包括但不限于质粒、慢病毒、甲病毒、腺病毒或腺相关病毒。载体可以是单链、双链的，或者具有至少一个单链区和至少一个双链区。此外，核酸可以包含RNA或DNA，或基本由RNA或DNA组成，或由RNA或DNA组成。
如本文所公开的，提供了许多数值范围。应当理解，除非上下文明确指出，否则该范围的上限和下限之间的每个中间值，直到下限单位的十分之一，也被具体公开。在规定范围内的任何规定值或中间值与该规定范围内的任何其它规定值或中间值之间的每个较小范围都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括或排除在该范围内，并且其中任一个、两个或两个极限都不包括在该较小范围内的每个范围也包括在本发明内，服从所述范围内任何具体排除的极限。当所述范围包括一个或两个极限时，排除这些所包括的极限中的一个或两个的范围也包括在本发明中。
术语“约”通常是指所示数字的±10％。例如，“约10％”可以表示9％至11％的范围，而“约20”可以表示18-22。“约”的其它含义可能从上下文中显而易见，例如四舍五入；例如，“约1”也可以指从0.5到1.4。
本发明的各种实施方案涉及融合蛋白及其用途。融合蛋白是包含两种或多种蛋白质中每一种的部分或完整氨基酸序列的分子。融合蛋白的组分可以通过例如如下文所述的共价键或接头直接相互融合。融合蛋白也可以与不含氨基酸的部分(例如核苷酸序列)相关联。
Cas融合蛋白
根据第一实施方案，本发明涉及Cas融合蛋白。Cas融合蛋白包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：Cas蛋白和SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域中的一者或两者或与前述抑制结构域中的一者具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相同的序列。
Cas蛋白可以是天然存在于例如古细菌或细菌中的任何CRISPR相关蛋白，或其修饰形式，例如其失活形式、截短形式或其衍生物。许多Cas蛋白的氨基酸序列和核酸序列可通过公众来源获得，例如美国国家卫生研究所(United States of America’s NationalInstitute of Health)：https://www.ncbi.nim.nlh.gov/或Uniprot https:// www.uniprot.org/，其全部内容通过引用并入本文。
Cas蛋白的实例包括但不限于：Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8al、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9(Csnl或Csxl2)、CaslO、CaslOd、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12h、Cas12i、Cas12j、Mad7、CasX、CasY、Cas 13a、Casl4、C2cl、C2c2、C2c3、CasF、CasG、CasH、Csyl、Csy2、Csy3、Csel(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4和Cul966，及其同源物或修饰形式。除非另有说明或上下文隐含，Cas蛋白的叙述包括所有活性和失活形式，以及其同源物和衍生物。
在一些实施方案中，Cas蛋白是II型Cas蛋白(例如Cas9)或V型Cas蛋白，例如Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12h、Cas12i、Cas12j和MAD7。
可用于本发明的Cas蛋白的修饰形式包括但不限于无催化活性的形式，例如dCas9和dCas12，或具有修饰的减毒催化活性以提供切口功能的形式，例如切口酶nCas9。切口酶是一种在特定识别核苷酸序列处切割双链DNA的一条链的酶。这些酶只切割DNA双链的一条链，产生“切口”而不是切割的DNA分子。可用于本发明的Cas蛋白的氨基酸序列的实例有：
失活的Cas9：
失活的MAD7：
失活的CasPhi8(dCasPhi8)：
Cas蛋白可与抑制结构域一起使用。SALL1的抑制结构域是：
SUDS3的抑制结构域是：
在一些实施方案中，Cas融合蛋白包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：Cas蛋白和SALL1抑制结构域或与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相似性的抑制结构域。在一些实施方案中，SALL1抑制结构域或与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相似性的抑制结构域与Cas蛋白的N末端氨基酸连接。在一些实施方案中，SALL1抑制结构域或与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相似性的抑制结构域与Cas蛋白的C末端氨基酸连接。
在一些实施方案中，Cas融合蛋白包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：Cas蛋白和SUDS3抑制结构域或与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相似性的抑制结构域。在一些实施方案中，SUDS3抑制结构域或与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相似性的抑制结构域与Cas蛋白的N末端氨基酸连接。在一些实施方案中，SUDS3抑制结构域或与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相似性的抑制结构域与Cas蛋白的C末端氨基酸连接。
在一些实施方案中，Cas融合蛋白包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：Cas蛋白以及SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域。在一些实施方案中，Cas融合蛋白以下列其中一种方式组织(从N末端至C末端书写)：
[Cas蛋白]-[SALL1抑制结构域]-[SUDS3抑制结构域]；
[Cas蛋白]-[SUDS3抑制结构域]-[SALL1抑制结构域]；
[SALL1抑制结构域]-[SUDS3抑制结构域]-[Cas蛋白]；
[SUDS3抑制结构域]-[SALL1抑制结构域]-[Cas蛋白]；
[SALL1抑制结构域]-[Cas蛋白]-[SUDS3抑制结构域]；
[SUDS3抑制结构域]-[Cas蛋白]-[SALL1抑制结构域]。
在一些实施方案中，Cas融合蛋白包含SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域，其中SALL1抑制结构域包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相似性的序列，SUDS3抑制结构域包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相似性的序列。在一些实施方案中，Cas融合蛋白包含SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域，其中SALL1抑制结构域包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO:1相同的序列，SUDS3抑制结构域包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO:2相同的序列。
在一些实施方案中，Cas融合蛋白包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：Cas蛋白和两种或多种的SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域的拷贝。在一些实施方案中，该Cas融合蛋白以下列其中一种方式组织：
[SALL1抑制结构域]-[SUDS3抑制结构域]-[Cas蛋白]-[SALL1抑制结构域]-[SUDS3抑制结构域]；
[SALL1抑制结构域]-[SUDS3抑制结构域]-[Cas蛋白]-[SUDS3抑制结构域]-[SALL1抑制结构域]；
[SUDS3抑制结构域]-[SALL1抑制结构域]-[Cas蛋白]-[SALL1抑制结构域]-[SUDS3抑制结构域]；
[SUDS3抑制结构域]-[SALL1抑制结构域]-[Cas蛋白]-[SUDS3抑制结构域]-[SALL1抑制结构域]。
在一些实施方案中，Cas融合蛋白包含多个SALL1抑制结构域和多个SUDS3抑制结构域，其中每个SALL1抑制结构域包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相似性的序列，并且每个SUDS3抑制结构域包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相似性的序列。在一些实施方案中，Cas融合蛋白包含多个SALL1抑制结构域和多个SUDS3抑制结构域，其中每个SALL1抑制结构域包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO:1相同的序列，并且每个SUDS3抑制结构域包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO:2相同的序列。
在一些实施方案中，Cas融合蛋白还包含额外的抑制蛋白的结构域：[R]。在一些实施方案中，[R]选自由NIPP1抑制结构域、KRAB抑制结构域、DNMT3A抑制结构域、BCL6抑制结构域、CbpA抑制结构域、H-NS抑制结构域、MBD3抑制结构域和KRAB-Me-CP2抑制结构域组成的组。
NIPP1抑制结构域可表示如下：
MVQTAVVPVKKKRVEGPGSLGLEESGSRRMQNFAFSGGLYGGLPPTHSEAGSQPHGIH GTALIGGLPMPYPNLAPDVDLTPVVPSAVNMNPAPNPAVYNPEAVNEPKKKKYAKEAWPGK KPTPSLLI(SEQ ID NO:34)或与SEQ ID NO:34具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。
KRAB抑制结构域可表示如下：
MDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLV(SEQ ID NO:35)或与SEQ ID NO:35具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。
DNMT3A抑制结构域可表示如下：
PSRLQMFFANNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACV(SEQ ID NO:36)或与SEQ ID NO:36具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。
BCL6抑制结构域可表示如下：
MASPADSCIQFTRHASDVLLNLNRLRSRDILTDVVIVVSREQFRAHKTVLMACSGLFYS IFTDQLKCNLSVINLDPEINPEGFCILLDFMYTSRLNLREGNIMAVMATAMYLQMEHVVDTC RKFIKASEAEM(SEQ ID:173)或与SEQ ID:173具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。
CbpA抑制结构域可表示如下：
MELKDYYAIMGVKPTDDLKTIKTAYRRLARKYHPDVSKEPDAEARFKEVAEAWEVLSDEQRRAEYDQMWQHRNDPQFNRQFHHGDGQSFNAEDFDDIFSSIFGQHARQSRQRPATRGHDIEIEVAVFLEETLTEHKRTISYNLPVYNAFGMIEQEIPKTLNVKIPAGVGNGQRIRLKGQGTPGENGGPNGDLWLVIHIAPHPLFDIVGQDLEIVVPVSPWEAALGAKVTVPTLKESILLTIPPGSQAGQRLRVKGKGLVSKKQTGDLYAVLKIVMPPKPDENTAALWQQLADAQSSFDPRKDWGKA(SEQ ID:174)或与SEQ ID:174具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。
H-NS抑制结构域可表示如下：
MSEALKILNNIRTLRAQARECTLETLEEMLEKLEVVVNERREEESAAAAEVEERTRKL QQYREMLIADGIDPNELLNSLAAVKSGTKAKRAQRPAKYSYVDENGETKTWTGQGRTPAVI KKAMDEQGKSLDDFLIKQ(SEQID:175)或与SEQ ID:175具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。
MBD3抑制结构域可表示如下：
MERKRWECPALPQGWEREEVPRRSGLSAGHRDVFYYSPSGKKFRSKPQLARYLGGSMDLSTFDFRTGKMLMSKMNKSRQRVRYDSSNQVKGKPDLNTALPVRQTASIFKQPVTKITNHPSNKVKSDPQKAVDQPRQLFWEKKLSGLNAFDIAEELVKTMDLPKGLQGVGPGCTDETLLSAIASALHTSTMPITGQLSAAVEKNPGVWLNTTQPLCKAFMVTDEDIRKQEELVQQVRKRLEEALMADMLAHVEELARDGEAPLDKACAEDDDEEDEEEEEEEPDPDPEMEHV(SEQID:176)或与SEQ ID:176具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。
KRAB-MeCP2抑制结构域可表示如下：
MDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVSGGGSGGSGSSPKKKRKVEASVQVKRVLEKSPGKLLVKMPFQASPGGKGEGGGATTSAQVMVIKRPGRKRKAEADPQAIPKKRGRKPGSVVAAAAAEAKKKAVKESSIRSVQETVLPIKKRKTRETVSIEVKEVVKPLLVSTLGEKSGKGLKTCKSPGRKSKESSPKGRSSSASSPPKKE(SEQ ID:177)或与SEQ ID:177具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列。
这些序列的定向的实例可以表示如下：
[Cas蛋白]-[SALL1抑制结构域]-[R]；
[Cas蛋白]-[SUDS3抑制结构域]-[R]；
[R]-[SUDS3抑制结构域]-[Cas蛋白]；
[R]-[SALL1抑制结构域]-[Cas蛋白]；
[Cas蛋白]-[R]-[SUDS3抑制结构域]；
[Cas蛋白]-[R]-[SALL1抑制结构域]；
[SALL1抑制结构域]-[R][Cas蛋白]；
[SUDS3抑制结构域]-[R]-[Cas蛋白]；
[R]-[Cas蛋白]-[SUDS3抑制结构域]；
[R]-[Cas蛋白]-[SALL1抑制结构域]；
[SALL1抑制结构域]-[Cas蛋白]-[R]；
[SUDS3抑制结构域]-[Cas蛋白]-[R]。
此外，在一些实施方案中，Cas融合蛋白包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：Cas蛋白和SALL1抑制结构域、SUDS3抑制结构域和[R]抑制结构域中的每一个。当所有三个抑制结构域都存在时，它们可以都在Cas蛋白的C末端氨基酸上，都在Cas蛋白的N末端氨基酸上，两个在Cas蛋白的C末端氨基酸上，一个在Cas蛋白的N末端氨基酸上，或者两个在Cas蛋白的N末端氨基酸上，一个在Cas蛋白的C末端氨基酸上。这些序列的定向的实例可以表示如下：
[Cas蛋白]-[SALL1抑制结构域]-[R]-[SUDS3抑制结构域]；
[Cas蛋白]-[SALL1抑制结构域]-[SUDS3抑制结构域]-[R]；
[Cas蛋白]-[SUDS3抑制结构域]-[SALL1抑制结构域]-[R]；
[Cas蛋白]-[SUDS3抑制结构域]-[R]-[SALL1抑制结构域]；
[Cas蛋白]-[R]-[SUDS3抑制结构域]-[SALL1抑制结构域]；
[Cas蛋白]-[R]-[SALL1抑制结构域]-[SUDS3抑制结构域]；
[SALL1抑制结构域]-[R]-[SUDS3抑制结构域]-[Cas蛋白]；
[SALL1抑制结构域]-[SUDS3抑制结构域]-[R]-[Cas蛋白]；
[SUDS3抑制结构域]-[SALL1抑制结构域]-[R]-[Cas蛋白]；
[SUDS3抑制结构域]-[R]-[SALL1抑制结构域]-[Cas蛋白]；
[R]-[SUDS3抑制结构域]-[SALL1抑制结构域]-[Cas蛋白]；
[R]-[SALL1抑制结构域]-[SUDS3抑制结构域]-[Cas蛋白]；
[SALL1抑制结构域]-[Cas蛋白]-[R]-[SUDS3抑制结构域]；
[SALL1抑制结构域]-[Cas蛋白]-[SUDS3抑制结构域]-[R]；
[SUDS3抑制结构域]-[Cas蛋白]-[SALL1抑制结构域]-[R]；
[SUDS3抑制结构域]-[Cas蛋白]-[R]-[SALL1抑制结构域]；
[R]-[Cas蛋白]-[SUDS3抑制结构域]-[SALL1抑制结构域]；
[R]-[Cas蛋白]-[SALL1抑制结构域]-[SUDS3抑制结构域]；
[R]-[SUDS3抑制结构域]-[Cas蛋白]-[SALL1抑制结构域]；
[SUDS3抑制结构域]-[R]-[Cas蛋白]-[SALL1抑制结构域]；
[SALL1抑制结构域]-[R]-[Cas蛋白]-[SUDS3抑制结构域]；
[R]-[SALL1抑制结构域]-[Cas蛋白]-[SUDS3抑制结构域]；
[SUDS3抑制结构域]-[SALL1抑制结构域]-[Cas蛋白]-[R]；
[SALL1抑制结构域]-[SUDS3抑制结构域]-[Cas蛋白]-[R]。
作为非限制性实例，在一些实施方案中，在Cas融合蛋白中，Cas蛋白是dCas9或dCas12，例如dCas12a，并且Cas融合蛋白包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域。
本发明的融合构建体的氨基酸序列的实例包括但不限于：
MCP-SALL1-SUDS3氨基酸序列：
SEQ ID NO:41可以例如由包含EQ ID NO:170的核酸编码，基本由EQ ID NO:170组成的核酸编码，或由EQ ID NO:170组成的核酸编码。
SUDS3-SALL1-活性Cas9氨基酸序列：
SEQ ID NO:171可以例如由包含SEQ ID NO:172的核酸编码，基本由SEQ ID NO:172组成的核酸编码，或由EQ ID NO:172组成的核酸编码：
/>
/>
/>
在本发明的范围内，蛋白质和多肽序列是SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:171的片段，以及这些序列的衍生物，它们可用于执行基本上相似的功能。在一些实施方案中，蛋白质或多肽与SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:171具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的相似性。此外，在本发明的范围内，核酸序列包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：SEQID NO:170或SEQ ID NO:172或其互补序列，或与SEQ ID NO:170或SEQ ID NO:172具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％相似性或互补的序列。
接头
当抑制结构域与Cas蛋白融合时，融合可以通过抑制蛋白的N末端氨基酸和Cas蛋白的C末端氨基酸之间的直接键(例如共价键)或抑制蛋白的C末端氨基酸和Cas蛋白的N末端氨基酸之间的直接键(例如共价键)进行。
然而，除了在两种组分，即两种或多种抑制结构域或抑制结构域和Cas蛋白之间直接连接或形成键，还可以使用接头。在一些实施方案中，接头包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：例如长度为1至100个氨基酸或长度为3至90个氨基酸或长度为10至50个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含非氨基酸序列的序列，基本由非氨基酸序列的序列组成，或由非氨基酸序列的序列组成。
当接头位于Cas蛋白和抑制结构域之间时，接头可被称为Cas接头。在一些实施方案中，Cas蛋白具有C末端氨基酸，Cas融合蛋白包含Cas接头，其中Cas接头与Cas蛋白的C末端氨基酸共价结合。在一些实施方案中，Cas蛋白具有N末端氨基酸，Cas融合蛋白包含Cas接头，其中Cas接头与Cas蛋白的N末端氨基酸共价结合。在一些实施方案中，Cas蛋白具有C末端氨基酸和N末端氨基酸，Cas融合蛋白包含两个Cas接头，其中第一Cas接头与Cas蛋白的C末端氨基酸共价结，第二Cas接头与Cas蛋白的N末端氨基酸共价结合。当存在第一Cas接头和第二Cas接头时，第一Cas接头可与第一抑制结构域结合，第二Cas接头可与第二抑制结构域结合。
在一些实施方案中，存在一个Cas接头，并且Cas接头包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO:7:GSGGGSGGSGS具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相似性的序列。在一些实施方案中，Cas接头包含SEQ ID NO:7序列，基本由SEQ ID NO:7序列组成，或由SEQ ID NO:7序列组成。在一些实施方案中，存在两个Cas接头，每个Cas接头包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO:7:GSGGGSGGSGS具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相似性的序列。在一些实施方案中，两个Cas接头中的每一个都包含SEQ ID NO:7序列，或基本由SEQ ID NO:7序列组成，或由SEQ ID NO:7序列组成。
在一些实施方案中，Cas接头与Cas蛋白和抑制结构域共价结合，所述抑制结构域包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％相似性的序列。在一些实施方案中，Cas接头与Cas蛋白和抑制结构域共价结合，所述抑制结构域包含SEQ ID NO:1序列，基本由SEQ ID NO:1序列组成，或由SEQ ID NO:1序列组成。
在一些实施方案中，Cas接头与Cas蛋白和抑制结构域共价结合，所述抑制结构域包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％相似性的序列。在一些实施方案中，Cas接头与Cas蛋白和抑制结构域共价结合，所述抑制结构域包含SEQ ID NO:2序列，或基本由SEQ ID NO:2序列组成，或由SEQ IDNO:2序列组成。
当Cas融合蛋白包含两种或多种抑制结构域，并且两种或多种抑制结构域位于Cas蛋白的同一侧，即N侧或C侧时，每对抑制结构域可以直接，例如，彼此共价结合，或者它们可以通过接头连接。连接两个抑制结构域的接头可称为抑制接头。
抑制接头可以与Cas接头相同或不同。在一些实施方案中，抑制接头包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQ ID NO:7:GSGGGSGGSGS具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相似性的序列。在一些实施方案中，抑制接头包含SEQ ID NO:7序列，基本由SEQ ID NO:7序列组成，或由SEQ ID NO:7序列组成。
作为非限制性实例，在本发明的Cas融合蛋白中，Cas蛋白可以是dCas9蛋白或dCas12蛋白，例如dCas12a蛋白，其中Cas蛋白具有C末端氨基酸，Cas融合蛋白还包含Cas接头和抑制接头，其中Cas接头与Cas蛋白的C末端氨基酸和SALL1抑制结构域的N末端氨基酸共价结合，并且其中抑制接头位于SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域之间。
作为另一个非限制性实例，在本发明的Cas融合蛋白中，Cas蛋白可以是dCas9蛋白或dCas12蛋白，例如dCas12a蛋白，其中Cas蛋白具有C末端氨基酸，Cas融合蛋白还包含Cas接头和抑制接头，其中Cas接头与Cas蛋白的C末端氨基酸和SUDS3抑制结构域共价结合，并且其中抑制接头与SUDS3抑制结构域和SALL1抑制结构域结合。
作为另一个非限制性实例，在本发明的Cas融合蛋白中，Cas蛋白可以是dCas9蛋白或dCas12蛋白，例如dCas12a蛋白，其中Cas蛋白具有N末端氨基酸，Cas融合蛋白还包含Cas接头和抑制接头，其中Cas接头与Cas蛋白的N末端氨基酸和SUDS3抑制结构域共价结合，并且其中抑制接头与SUDS3抑制结构域和SALL1抑制结构域结合。
作为另一个非限制性实例，在本发明的Cas融合蛋白中，Cas蛋白可以是dCas9蛋白或dCas12蛋白，例如dCas12a蛋白，其中Cas蛋白具有N末端氨基酸，Cas融合蛋白还包含Cas接头和抑制接头，其中Cas接头与Cas蛋白的N末端氨基酸和SALL1抑制结构域共价结合，并且其中抑制接头与SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域结合。
作为另一个非限制性实例，在本发明的Cas融合蛋白中，Cas蛋白可以是dCas9蛋白或dCas12蛋白，例如dCas12a蛋白，其中Cas蛋白具有N末端氨基酸和C末端氨基酸，Cas融合蛋白还包含第一Cas接头和第二Cas接头，其中第一Cas接头与Cas蛋白的N末端氨基酸和SUDS3抑制结构域共价结合，其中第二Cas接头与Cas蛋白的C末端和SALL1抑制结构域结合。
作为另一个非限制性实例，在本发明的Cas融合蛋白中，Cas蛋白可以是dCas9蛋白或dCas12蛋白，例如dCas12a蛋白，其中Cas蛋白具有N末端氨基酸和C末端氨基酸，Cas融合蛋白还包含第一Cas接头和第二Cas接头，其中第一Cas接头与Cas蛋白的C末端氨基酸和SUDS3抑制结构域共价结合，其中第二Cas接头与Cas蛋白的N末端氨基酸和SALL1抑制结构域结合。
作为另一个实例，在一些实施方案中，Cas融合蛋白包含与如下的SEQ ID NO:10具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相似性的序列：
在一些实施方案中，Cas融合蛋白包含与SEQ ID NO:10相同的序列。
在一些实施方案中，Cas融合蛋白是：
[dCas9]-[Cas接头]-[SALL1抑制结构域]-[抑制接头]-[SUDS3抑制结构域]。
在一些实施方案中，Cas融合蛋白是：
[dCas9]-[Cas接头]-[SUDS3抑制结构域]-[抑制接头]-[SALL1抑制结构域]。
在一些实施方案中，Cas融合蛋白是：[dMAD7]-[Cas接头]-[SALL1抑制结构域]-[抑制接头]-[SUDS3抑制结构域]。
在一些实施方案中，Cas融合蛋白是：
[dMAD7]-[Cas接头]-[SUDS3抑制结构域]-[抑制接头]-[SALL1抑制结构域]。
在一些实施方案中，Cas融合蛋白是：
[SALL1抑制结构域]-[抑制接头]-[SUDS3抑制结构域]-[Cas接头]-[dCas9]。
在一些实施方案中，Cas融合蛋白是：
[SUDS3抑制结构域]-[抑制接头]-[SALL1抑制结构域]-[Cas接头]-[dCas9]。
在一些实施方案中，Cas融合蛋白是：
[SALL1抑制结构域]-[抑制接头]-[SUDS3抑制结构域]-[Cas接头]-[dMAD7]。
在一些实施方案中，Cas融合蛋白是：
[SUDS3抑制结构域]-[抑制接头]-[SALL1抑制结构域]-[Cas接头]-[dMAD7]。
gRNA
本发明的Cas融合蛋白可与gRNA结合使用。在一些实施方案中，gRNA包含30至180个核苷酸或45至135个核苷酸或60至120个核苷酸。gRNA可以化学合成或酶促合成。当酶促合成时，合成可以在体外、体内或离体进行。
gRNA的核苷酸可以是专门修饰的核糖核苷酸，专门未修饰的核糖核苷酸，或修饰的和未修饰的核糖核苷酸的组合。在一些实施方案中，gRNA包含一个或多个修饰，例如2’修饰，例如2-O-烷基，诸如2’-O-甲基或2’-O-乙基，或2’-卤素修饰，例如2’氟。在一些实施方案中，gRNA包含一个或多个修饰的核苷酸间连接键，例如硫代磷酸酯连接键。
在一些实施方案中，gRNA具有以下修饰：
·第一个和第二个5’端核苷酸上的2’-O-甲基修饰，
·倒数第二个3’核苷酸(第二个3’端核苷酸)和倒数第三个3’核苷酸(第三个3’端核苷酸)上的2’-O-甲基修饰，
·所有其它核苷酸在其2’位置未被修饰，
·第一个和第二个5’端核苷酸、第二个和第三个5’端核苷酸、倒数第三个3’核苷酸和倒数第二个3’核苷酸以及倒数第二个3’核苷酸和3’端核苷酸之间的硫代磷酸酯连接键，和
·所有其它的核苷酸间连接键都是磷酸二酯连接键。
在一些实施方案中，gRNA具有以下修饰：
·第一个和第二个5’端核苷酸上的2’-O-甲基修饰，
·所有其它核苷酸在其2’位置未被修饰，
·第一个和第二个5’端核苷酸、第二个和第三个5’端核苷酸之间的硫代磷酸酯连接键，和
·所有其它的核苷酸间连接键都是磷酸二酯连接键。
在一些实施方案中，gRNA包含crRNA，基本由crRNA组成，或由crRNA组成。在一些实施方案中，gRNA包含crRNA序列和tracrRNA序列，基本由crRNA序列和tracrRNA序列组成，或由crRNA序列和tracrRNA序列组成。当gRNA包含crRNA序列和tracrRNA序列，基本由crRNA序列和tracrRNA序列组成，或由crRNA序列和tracrRNA序列组成时，crRNA和tracrRNA可以是sgRNA的一部分，或者它们各自可以在不同的核苷酸链上并形成crRNA分子和tracrRNA分子，它们各自是多核苷酸。当它们是两个不同的核苷酸的一部分时，tracrRNA分子和crRNA分子中的一个可以称为第一RNA分子，而其它tracrRNA分子和crRNA分子中的另一个可以称为第二RNA分子。当存在不同的tracrRNA分子和crRNA分子时，这两个分子中结合的核苷酸总数可以例如与本发明各种实施方案中描述的sgRNA中的相同。此外，对sgRNA核苷酸的任何化学修饰可存在于tracrRNA分子和crRNA分子中的任一者或两者中，并且sgRNA的任何核苷酸间修饰可存在于tracrRNA分子和crRNA分子中的任一者或两者中。此外，在sgRNA的情况下，被描述为存在于gRNA的5’端或3’端的任何部分可以存在于sgRNA的5’端或3’端，并且在各自具有5’端或3’端的不同的tracrRNA分子和crRNA分子的情况下，存在于tracrRNA分子或crRNA分子的5’端或3’端。
crRNA包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：Cas结合区和间隔区(也称为靶向区)。靶向区与预先选择的目标靶位点充分互补，并能够与预先选择的目标靶位点杂交。在各种实施方案中，向导序列的靶特异性成分可包含约10个核苷酸至超过约25个核苷酸，例如至多36个核苷酸。在一些实施方案中，向导序列和相应的靶位点序列之间的碱基配对区的长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25或超过25个核苷酸。在一些实施方案中，靶向区长度为12至30个核苷酸，或长度为14至25个核苷酸，或长度约17至20个核苷酸，或长度为约14个核苷酸，或长度为约20个核苷酸。靶向区可以在至少14个连续核苷酸、至少15个连续核苷酸、至少16个连续核苷酸、至少17个连续核苷酸、至少18个连续核苷酸、至少19个连续核苷酸、至少20个连续核苷酸或14至20个连续核苷酸上与靶dsDNA的区域至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％互补。
当靶向区的长度为约20个核苷酸并与能够切割两条DNA链的活性Cas蛋白一起使用时，将在靶向DNA上产生双链断裂，这可导致基因组中的插入和/或缺失(Indel)。如果希望在不产生Indel的情况下引起抑制，可以使用无活性的Cas蛋白，例如失活的Cas9蛋白。如果使用通常能够切割两条DNA链的活性Cas蛋白或通常能够切割一条靶DNA链的Cas切口酶变体，可以使用具有较短靶向区的gRNA(例如长度为约14个核苷酸)用于基因抑制。具有20nt靶向区的向导可以将活性Cas9抑制物引导至另一个基因组位点，用于DNA切割和随后的编辑。
Cas结合区，其可以具有例如长度为约18-36个核苷酸，是crRNA的一部分，其允许crRNA(并因此gRNA保持与Cas蛋白的结合)。在一些实施方案中，在不存在tracrRNA的情况下，与Cas蛋白的结合是可能的。在其它实施方案中，结合需要tracrRNA的存在。
当crRNA需要tracrRNA存在以与Cas蛋白结合时，Cas结合区与tracrRNA内的反重复区(anti-repeat region)杂交。tracrRNA也可以包含反重复区3’的远端区，并且不与crRNA的任何区互补。
当Cas结合区(也称为重复区)和反重复区之间存在杂交时，gRNA支架的重复：反重复区可以分成3个部分：下茎、凸起和上茎。下茎的长度为6个碱基对，通过沃森-克里克和非沃森-克里克碱基配对形成；随后是6个核苷酸的凸起结构。最后是由4个碱基对结构组成的上茎。
当gRNA是sgRNA时，在一些实施方案中，单链可包含互补区，并且当互补区杂交时，允许与Cas蛋白(例如II型Cas酶)结合，包括但不限于活性或失活形式的Cas9，和活性或失活形式的V型Cas酶，例如Cas12c、Cas12d、Cas12e和Cas12f。在其它实施方案中，当gRNA是sgRNA时，没有互补区，但是sgRNA能够与Cas酶结合，例如活性或失活形式的某些V型Cas酶，诸如Cas12a、MAD7(ErCas12a的工程变体)、Cas12h、Cas12i和Cas12j(Casφ)。
图2显示了sgRNA的非限制性实例。图2的sgRNA具有以下序列：(SEQ ID NO:11)：
m表示2’O-甲基基团；
*表示硫代磷酸酯连接键；和
N表示A、C、G或U中的任何一个。
如图2所示，crRNA区和tracrRNA区通过四环连接，并且tracrRNA区具有三个茎环区。这个sgRNA的实例有100个核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA长度为60至120个核苷酸或长度为90至110个核苷酸。
所示的N区的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，N区的长度为10至36个核苷酸或长度为14至26个核苷酸或长度为18至22个核苷酸。
各种tracrRNA序列在本领域中是已知的，实例包括SEQ ID NO:27-SEQ ID NO:34及其活性部分。
如本文所用，tracrRNA的活性部分保留了与Cas蛋白(例如Cas9或dCas9或nCas9)形成复合物的能力。
作为非限制性实例，gRNA可以是杂交RNA分子，其中上述crRNA包含与tracrRNA融合的可编程gRNA，以模拟天然crRNA：tracrRNA双链体。这种类型的杂交体的实例是crRNA：tracrRNA，gRNA序列：5’-(20nt向导)-
产生crRNA-tracrRNA杂交RNA(也称为sgRNA)的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，其中crRNA和tracrRNA作为sgRNA提供，两种组分通过四茎环连接在一起。在一些实施方案中，重复反重复区被延伸。例如，在重复：反重复区的任一侧可以有2、3、4、5、6、7个碱基或7个以上碱基的延伸。在另一个实施方案中，重复：反重复区在茎的任一侧具有7个核苷酸的延伸。任一侧的7个碱基的延伸产生长度为14个碱基对的区域。在其它实施方案中，延伸可以超过7个碱基。参见例如WO2014099750、US20140179006和US 20140273226中关于tracrRNA的额外公开。这些文件的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，tracrRNA来自或衍生自酿脓链球菌。
在一些实施方案中，靶位点位于DNA上。在DNA中，靶核酸链可以是两条链中的任何一条，例如，在宿主细胞的基因组DNA中。这种基因组dsDNA的实例包括但不必然限于宿主细胞染色体、线粒体DNA和稳定维持的质粒。然而，应当理解，本方法可以在宿主细胞中存在的其它dsDNA上实施，例如不稳定的质粒DNA、病毒DNA和噬菌粒DNA，只要存在Cas靶向位点。
在一些实施方案中，不是将融合蛋白与gRNA组合使用，而是将本发明的融合蛋白与scoutRNA和适用的crRNA组合使用。例如，本发明的融合蛋白可用于系统中或作为复合物的一部分，该复合物具有：(a)crRNA，其中crRNA长度为30至60个核苷酸，并且crRNA包含Cas结合区和靶向区，其中Cas结合区的长度为15至30个核苷酸，靶向区的长度为15至30个核苷酸；(b)scoutRNA，其中scoutRNA的长度为20至100个核苷酸，并且其中scoutRNA包含反重复区，其中反重复区的长度为3至10个核苷酸，并且反重复区与Cas结合区内的至少3个连续核苷酸互补，并且反重复区能够与Cas结合区内的所述至少3个连续核苷酸杂交以形成杂交区，其中当crRNA和scoutRNA形成杂交区时，crRNA和scoutRNA能够保持与V型Cas蛋白的RNA结合结构域的结合。
RNA抑制结构域复合物
在一些实施方案中，本发明涉及RNA抑制结构域复合物的用途。RNA-抑制结构域复合物包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：能够与上述scoutRNA结合的gRNA(例如上述gRNA)或scoutRNA和/或crRNA、配体结合部分、配体和一个或多个抑制结构域。RNA抑制结构域复合物可与本发明的Cas融合蛋白或其它非融合蛋白的Cas蛋白联合使用。
能够与scoutRNA结合的gRNA或scoutRNA或crRNA可直接与配体结合部分融合，或通过配体结合部分接头与配体结合部分结合。配体结合部分能够可逆地与配体结合。配体直接或通过配体接头与抑制结构域融合。抑制结构域可以是任何效应子。配体结合部分接头和配体接头中的每一个(如果其中一者或两者都存在的话)可以包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：核苷酸、氨基酸和其它有机和无机部分及其组合。
表1中提供了可用于本发明的各种实施方案的配体结合部分-配体对的实例的非穷尽列表。未修饰的和化学修饰的形式或配体结合部分和配体都在本发明的范围内。
表1
1.端粒酶Ku结合基序/Ku异二聚体
a.Ku结合发术(hairpin)5’-
b.异二聚体
2.端粒酶Sm7结合基序/Sm7同源七聚体c.Sm共有位点(单链)
d.单体Sm-样蛋白(古细菌)
3.MS2噬菌体操纵子茎环/MS2衣壳蛋白
a.MS2噬菌体操纵子茎环5’-
b.MS2衣壳蛋白
4.PP7噬菌体操纵子茎环/PP7衣壳蛋白
a.PP7噬菌体操纵子茎环
b.PP7衣壳蛋白(PCP)
5.SfMu Com茎环/SfMu Com结合蛋白
a.SfMu Com茎环
b.SfMu Com结合蛋白
6.BoxB适体/Lambda N22plus
e.BoxB适体
f.Lambda N22plus
7.Csy4结合茎环/Csy4[H29A]
a.Csy4结合基序
b.Csy4[H29A]
8.Qbeta结合茎环[Q65H]
a.Qbeta噬菌体操纵子茎环
b.Qbeta衣壳蛋白[Q65H]
在每个上述序列中，例如，可以使用在结合对的一个或两个序列中具有一个或多个插入、缺失或取代的相同的一个序列或多个序列。作为非限制性实例，对于结合对的任一成员或两个成员，可以使用与前述序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。
在一些实施方案中，形成复合物，所述复合物包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：本发明的Cas融合蛋白和本发明的RNA抑制结构域复合物。因此，如果Cas-融合蛋白包含融合至抑制结构域SUDS3的Cas蛋白，则配体可以融合至SALL1或任何其它现在已知的或将要已知的抑制结构域。类似地，如果Cas-融合蛋白包含融合至抑制结构域SALL1的Cas蛋白，则配体可以融合至SUDS3或任何其它现在已知的或将要已知的抑制结构域。此外，在一些实施方案中，Cas-融合蛋白包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：Cas蛋白、SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域，并且RNA-抑制结构域复合物包含gRNA、配体结合部分、配体和除SALL1或SUDS3之外的一个或多个抑制结构域。作为非限制性实例，一个或多个抑制结构域可选自由NIPP1、KRAB和DNMT3A组成的组。
或者，可以将RNA抑制结构域复合物与不属于Cas-融合蛋白复合物的一部分的Cas酶一起使用。例如，RNA抑制结构域复合物可包含gRNA、配体结合部分和如上文定义的SUDS3抑制结构域和SALL1抑制结构域中的一者或两者。如上文定义的抑制接头可以存在于SUDS3抑制结构域和SALLI抑制结构域之间，并且配体可以直接或通过配体接头连接到SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域中的任一者上。
编码Cas融合蛋白的核酸
在一些实施方案中，本发明提供了编码本发明的融合蛋白的核酸。核酸可以是单链、双链，或者具有至少一个单链区和至少一个双链区。此外，核酸可以包含RNA或DNA，基本由RNA或DNA组成，或由RNA或DNA组成。
在一些实施方案中，编码融合蛋白的核酸仅包含融合蛋白的核苷酸和存在的任何接头。在其它实施方案中，编码融合蛋白的核酸是较大的核酸或载体的一部分。
在一些实施方案中，本发明涉及包含编码本发明的融合蛋白的核酸的载体。在一些实施方案中，载体是质粒或病毒载体。当载体是病毒载体时，在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，本发明涉及编码本发明的Cas融合蛋白的mRNA，而不是包含编码Cas融合蛋白的多核苷酸序列的载体。
在一些实施方案中，核酸包含编码Cas蛋白和至少一个抑制结构域(例如SUDS3或SALL1)的序列。在一些实施方案中，核酸包含编码Cas蛋白和至少两个抑制结构域(例如SUDS3和SALL1)的序列。在一些实施方案中，核酸包含编码Cas蛋白和至少三个抑制结构域(例如SUDS3、SALLI和NIPP1、KRAB和DNMT3A中的一个或多个)的序列。
在一些实施方案中，核酸序列包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性或互补的序列，所述SEQ IDNO:4编码SALL1抑制结构域：
在一些实施方案中，核酸序列包含与SEQ ID NO:4相同的序列，或基本由与SEQ IDNO:4相同的序列组成，或由与SEQ ID NO:4相同的序列组成。
在一些实施方案中，核酸序列包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQID NO:5具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性或互补的序列，所述SEQ IDNO:5编码SUDS3抑制结构域：
在一些实施方案中，核酸序列包含与SEQ ID NO:5相同的序列，基本由与SEQ IDNO:5相同的序列组成，或由与SEQ ID NO:5相同的序列组成。
在一些实施方案中，核酸序列包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQID NO:6具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性或互补的序列，所述SEQ IDNO:6编码NIPP1抑制结构域：
在一些实施方案中，核酸序列包含与SEQ ID NO:6相同的序列，基本由与SEQ IDNO:6相同的序列组成，或由与SEQ ID NO:6相同的序列组成。
在一些实施方案中，核酸序列包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQID NO:37具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性或互补的序列，所述SEQ IDNO:37编码KRAB抑制结构域：
在一些实施方案中，核酸序列包含与SEQ ID NO:37相同的序列，或基本由与SEQID NO:37相同的序列组成，或由与SEQ ID NO:37相同的序列组成。
在一些实施方案中，核酸序列包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQID NO:38具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性或互补的序列，所述SEQ IDNO:38编码DNMT3A抑制结构域：
在一些实施方案中，核酸序列包含与SEQ ID NO:38相同的序列，基本由与SEQ IDNO:38相同的序列组成，或由与SEQ ID NO:38相同的序列组成。
在一些实施方案中，核酸序列包含编码至少一个接头序列，并且与SEQ ID NO:8:GGATCCGGTGGGGGATCTGGGGGATCTGGCTCG具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性或互补的序列。
在一些实施方案中，核酸序列包含与SEQ ID NO:8相同的序列。
在一些实施方案中，核酸序列包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQID NO:184具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性或互补的序列，所述SEQID NO:184编码SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域：
额外地或可选地，在一些实施方案中，核酸序列包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与编码失活的Cas9(dCas9)的SEQ ID NO:183相同的序列：
/>
额外地或可选地，在一些实施方案中，核酸序列包含与编码失活的MAD7(dMAD7)的SEQ ID NO:178相同的序列，基本由与编码失活的MAD7(dMAD7)的SEQ ID NO:178相同的序列组成，或由与编码失活的MAD7(dMAD7)的SEQ ID NO:178相同的序列组成：
/>
/>
在一些实施方案中，核酸序列包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQID NO:178具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性或互补的序列。
额外地或可选地，在一些实施方案中，核酸序列包含与编码失活的CasPhi8(dCasPhi8)的SEQ ID NO:179相同的序列，基本由与编码失活的CasPhi8(dCasPhi8)的SEQID NO:179相同的序列组成，或由与编码失活的CasPhi8(dCasPhi8)的SEQ ID NO:179相同的序列组成：
/>
在一些实施方案中，核酸序列包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：与SEQID NO:179具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性或互补的序列。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白可与核定位信号(NLS)、表位标签或报道基因序列连接。核定位信号的实例包括但不限于SV40大T抗原、核质蛋白、EGL-13和TUS蛋白。表位标签的实例包括但不限于FLAG标签、V5标签、组氨酸(His)标签和流感血凝素(HA)标签。报道基因的实例包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、小泛素样修饰物(SUMO)、泛素、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)和荧光素酶。
在一些实施方案中，编码本发明的融合蛋白的核酸或载体也将编码各种调控元件或选择标记。调控元件包括但不限于启动子(例如巨细胞病毒(CMV)启动子或人EFlα启动子)、增强子(例如土拨鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)或HIV-1Rev反应元件(RRE))、聚腺苷酸化信号、自切割肽(例如T2A)，和内部核糖体进入位点(IRES)。选择标记的实例包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、赋予嘌呤霉素抗性的嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(PAC)、潮霉素抗性基因和杀稻瘟素-S脱氨酶(BSD)。
调节表达的方法
在一些实施方案中，本发明涉及调节真核细胞中靶核酸表达的方法。该方法包括向细胞提供gRNA和本发明任何实施方案的Cas融合蛋白。当与如图1所示的gRNA结合时，与融合至SUDS3 130的SALL1 120融合的Cas蛋白(显示为dCas蛋白)110可以作用于基因组DNA150的靶区域。
在一些实施方案中，该方法包括将Cas融合蛋白引入多种gRNA。多种gRNA可以是两种或更多种，例如2-10种或4-8种gRNA。
两种或多种或所有的gRNA可以靶向相同的基因或基因内的相同基因座。如果两种或多种gRNA靶向同一基因座，它们可能具有相同或重叠的间隔区序列或非重叠序列。在一些实施方案中，两种或多种或所有的gRNA可以靶向不同的基因或基因内的不同基因座。
在一些实施方案中，通过向细胞引入编码gRNA的核酸向细胞提供一种或多种gRNA，并且通过向细胞引入编码Cas融合蛋白的核酸向细胞提供Cas融合蛋白。可以将细胞置于细胞表达gRNA和Cas融合蛋白的条件下。
在一些实施方案中，本发明涉及通过引入Cas融合蛋白和RNA抑制结构域复合物来调节真核细胞中靶核酸表达的方法。在一些实施方案中，本发明涉及通过引入非融合蛋白的Cas蛋白和RNA抑制结构域复合物来调节真核细胞中靶核酸表达的方法。
在一些实施方案中，真核细胞是酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞，例如人或鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是细胞系的一部分，例如HEK293、K562、Jurkat或US2OS。
当引入融合蛋白时，融合蛋白可在细胞或生物体外合成。或者，可以引入编码融合蛋白的mRNA。在一些实施方案中，在细胞外合成gRNA，并通过向细胞中引入编码Cas融合蛋白的核酸向细胞提供Cas融合蛋白。
Cas融合蛋白、RNA抑制结构域复合物和/或gRNA可通过其它各种方法和各种形式(DNA、RNA或蛋白质)或这些不同形式的组合递送至靶细胞和生物体。例如，不同的组分可以被递送为：(a)编码Cas融合蛋白或gRNA的相关序列的DNA多核苷酸；(b)编码Cas融合蛋白(信使RNA)和合成gRNA序列的RNA；(c)Cas融合蛋白的纯化蛋白；(d)编码RNA的RNA；和(e)纯化的RNA抑制结构域复合物。
当以蛋白质形式递送Cas融合蛋白时，Cas蛋白可与适用的gRNA组装形成核糖核蛋白复合物(RNP)，用于递送至靶细胞、生物体和受试者中。例如，通过电穿孔、核转染、转染，通过纳米颗粒、通过病毒介导的RNA递送、通过非病毒介导的递送、通过细胞外小泡(例如，外泌体和微泡)、通过真核细胞转移(例如，通过重组酵母)和其它可以包装分子使得它们可以递送至靶活细胞而不改变基因组景观的方法，可以一起或单独地递送组装的组分或复合物(Cas融合蛋白-[gRNA])。其它方法包括但不限于DNA多核苷酸的非整合性瞬时转移，所述DNA多核苷酸包括用于蛋白质募集的相关序列，使得该分子可以被转录成所需的RNA分子。这包括但不限于纯DNA的载体(例如，质粒、微环、微载体、微串(MiniString)、蛋白酶产生的DNA分子(例如，Doggybones)、人工染色体(例如HAC)和粘粒)、通过纳米颗粒、细胞外泡(例如，外泌体和微泡)的DNA载体，通过真核细胞转移(例如，通过重组酵母)、通过AAV的瞬时病毒转移、非整合病毒颗粒(例如，基于慢病毒和逆转录病毒的系统)、细胞穿透肽和其它可以介导DNA引入细胞而不直接整合到基因组景观中的技术。
引入RNA组分的另一种方法包括使用整合型基因转移技术将RNA转录机制稳定引入靶细胞的基因组中。这些方法可以通过组成型或启动子诱导型系统来控制，以减弱RNA表达，并且这也可以被设计成使得该系统可以在效用满足后被移除(例如，引入Cre-Lox重组系统)，这种用于稳定基因转移的技术包括但不限于整合病毒颗粒(例如，基于慢病毒、腺病毒和逆转录病毒的系统)、转座酶介导的转移(例如，睡美人(Sleeping Beauty)和Piggybac)、利用由DNA断裂引入的非同源修复途径(例如，利用CRISPR和TALEN)技术和替代DNA分子，以及其它促进靶DNA整合到目标细胞中的技术。
本发明的复合物的各种组分，如果不是在细胞或溶液中酶促合成的，可以化学产生，或者如果是天然产生的，可以从天然来源分离和纯化。化学和酶促合成本发明的各种实施方案的方法是本领域普通技术人员熟知的。类似地，用于在本发明组分之间连接或引入共价键的方法也是本领域普通技术人员熟知的。
试剂盒
在一些实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含以下，基本由以下组成，或由以下组成：本发明的Cas融合蛋白或具有编码本发明蛋白的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒还包含编码gRNA或多个gRNA或gRNA文库的gRNA或核酸，以及任选的用于转染和/或以其它方式递送至细胞或受试者的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含能够表达gRNA和本发明的Cas融合蛋白的核酸。在一些实施方案中，试剂盒包含已经被工程化以表达本发明的Cas融合蛋白的细胞系，并且任选地还包含gRNA或编码gRNA的核酸。
在一些实施方案中，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包含发明的RNA抑制结构域复合物，或基本由发明的RNA抑制结构域复合物组成，或由发明的RNA抑制结构域复合物组成。在一些实施方案中，试剂盒还包含Cas蛋白或Cas融合蛋白或编码Cas蛋白或Cas融合蛋白的核酸，以及任选的用于转染和/或以其它方式递送至细胞或受试者的试剂。
在一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其中所述试剂盒包含：(1)慢病毒颗粒，其中所述慢病毒颗粒包含编码本发明的Cas融合蛋白的第一多核苷酸，例如dCas9-SALL1-SUDS3；和(2)第二多核苷酸，其中第二多核苷酸是sgRNA。
在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其中所述试剂盒包含：(1)第一慢病毒颗粒，其中所述第一慢病毒颗粒包含编码本发明的Cas融合蛋白的第一多核苷酸，例如dCas99-SALL1-SUDS3；和(2)第二慢病毒颗粒，其中所述第二慢病毒颗粒包含第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸编码sgRNA。
在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其中所述试剂盒包含：(1)慢病毒颗粒，其中所述慢病毒颗粒包含编码本发明的Cas融合蛋白的第一多核苷酸，例如dCas99-SALL1-SUDS3；和(2)第二多核苷酸，其中第二多核苷酸是质粒，其中所述质粒编码第二多核苷酸，第二多核苷酸是sgRNA。
在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其中所述试剂盒包含：(1)第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸是编码本发明的Cas融合蛋白的mRNA，例如dCas99-SALL1-SUDS3；和(2)第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸是sgRNA。
试剂盒中的sgRNA可设计成与由上文所述的多核苷酸编码的Cas融合蛋白结合。任选地，试剂盒中可以有一种或多种下列物质：靶细胞，以及一种或多种选择性化学品和/或介质(例如杀稻瘟菌素、嘌呤霉素)。
应用
在另一个实施方案中，本发明提供了同时抑制多种基因的方法。在这些方法中的一些方法中，可以递送具有不同gRNA的相同dCas9-抑制Cas融合蛋白，所述不同gRNA靶向不同的基因启动子或相同基因的不同转录起始位点。在另一个实施方案中，本发明提供了同时抑制和基因编辑的方法。在这些方法中，可以递送具有常规gRNA(20个核苷酸的靶向区)的Cas9-抑制Cas融合蛋白以引起基因编辑和具有截短的gRNA(14个核苷酸的靶向区)的Cas9-抑制Cas融合蛋白以引起基因抑制。这些方法可用于在进行基因编辑时抑制炎症反应，例如骨髓分化初级反应88(MyD88)，或抑制参与非同源末端连接的各种基因，从而增加同源定向DNA修复事件(HDR)的可能性，或调节参与调节双链DNA断裂修复的宿主基因，从而导致不同的结果。这些方法可用于实现合成致死，由此可编辑基因靶并可抑制次级基因靶，以引起仅含有一种基因组扰动的细胞中不存在的细胞毒性反应。
图15说明了使用不同尺寸的crRNA区与融合至SALL1和SUDS3的活性Cas9的效果。当使用14-mer crRNA靶向区时，存在靶的转录抑制(图的左侧y轴)。然而，当使用20-mercrRNA靶向区时，存在靶的基因编辑(图的右侧y轴)。
本发明的各种实施方案也可用于阵列筛选应用。例如，可以使用阵列化的gRNA文库进行系统的功能丧失研究。在一些实施方案中，可以汇集2-5个合成的向导RNA用于阵列筛选应用。
本发明的各种实施方案也可用于汇集的慢病毒筛选应用。例如，可以使用靶向一组基因靶或整个基因组的慢病毒sgRNA构建体的汇集的文库进行系统的功能丧失研究。这些gRNA可以在表达本发明的Cas融合构建体的细胞中递送，或者通过表达Cas融合蛋白和gRNA的慢病毒构建体递送。
此外，在其它实施方案中，可以将不同的CRISPR Cas系统与相同细胞中的不同效应子组合，以用一个系统引起转录抑制，用另一个Cas系统引起另一个效应(激活、基因编辑、碱基编辑或表观遗传修饰)。
例如，这些方法可用于例如引起选自T细胞(包括初级T细胞)、自然杀伤细胞(NK细胞)、B细胞或CD34+造血干细胞祖细胞(HSPC)的免疫细胞的特异性基因抑制。免疫细胞可以是工程化免疫细胞，例如包含嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)的T细胞。因此，本文的方法可用于进一步调节细胞的基因表达，所述细胞已经被修饰以包括在对治疗有用的CAR和/或TCR。作为进一步的实例，初级免疫细胞，无论是宿主动物内或患者体内天然存在的，还是衍生自干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)的，都可以使用本文提供的方法和复合物用于特异性基因抑制。合适的干细胞包括但不限于哺乳动物干细胞，例如人类干细胞，包括但不限于造血、神经、胚胎、iPSC、间充质、中胚层、肝脏、胰腺、肌肉和视网膜干细胞。其它干细胞包括但不限于哺乳动物干细胞，例如小鼠干细胞，诸如小鼠胚胎干细胞。
本文还提供了在原核或真核细胞中体外、体内或离体进行基因组工程(例如，改变或操纵一种或多种基因或一种或多种基因产物的表达)的方法。具体地，本文提供的方法可用于哺乳动物细胞中的靶向基因表达调节，所述哺乳动物细胞包括原代人T细胞、NK细胞、CD34+HSPC，例如从脐带血或骨髓分离的HSPC和从它们分化的细胞。
本文还提供了来源于造血干细胞的基因工程化细胞，例如T细胞，其已经根据本文所述方法进行了修饰。
作为非限制性实例，本发明的各种实施方案可用于以下应用，碱基编辑、基因组编辑、基因组筛选、治疗性细胞的产生、基因组标记、表观基因组编辑、核型工程、染色质成像、转录组和代谢途径工程、遗传电路工程、细胞信号传导感测、细胞事件记录、谱系信息重建、基因驱动、DNA基因分型、miRNA定量、体内克隆、定点诱变、基因组多样化和原位蛋白质组分析。在一些实施方案中，将细胞或细胞群暴露于本发明的融合蛋白，并通过输注将一种或多种细胞引入受试者。
应用还包括人类疾病的研究，例如癌症免疫疗法、抗病毒疗法、噬菌体疗法、癌症诊断、病原体筛选、微生物群重塑、干细胞重编程、免疫基因组工程、疫苗开发和抗体生产。
在一些实施方案中，将本文所述的一种或多种分子或复合物，包括Cas融合蛋白、融合蛋白、Cas蛋白、gRNA和编码任何前述物质的核酸引入受试者。例如，引入可以是药物的形式。
实施例
在以下实施例中，使用了来自以下方法和材料的适用方案：
稳定的细胞系产生
U2OS Ubi[G76V]-EGFP(BioImage，已停产)、U2OS(ATCC，目录号##HTB-96)、A375(ATCC，目录号##CRL-161、K-562(ATCC，目录号##CCL-243)、Jurkat(ATCC，目录号##TIB-152)、HCT 116(ATCC，目录号#CCL-247)和WTC-11hiPS(科里尔研究所(Coriellinstitute)，目录号#GM25256)细胞用共表达杀稻瘟菌素抗性基因和设计用于CRISPRi的各种基于Cas的效应蛋白的慢病毒颗粒以0.3的感染复数(MOI)进行转导。随后将细胞在含有5-10μg/mL杀稻瘟菌素的细胞系特异性培养基中培养至少10天，以选择稳定表达CRISPRi效应蛋白的细胞群。随后用共表达MCP-SALLl-SUDS3和潮霉素抗性基因的慢病毒颗粒以0.3的MOI转导稳定表达dCas9的U2OS细胞。将细胞在含有200μg/mL潮霉素的培养基中培养14天，以选择稳定表达MCP-SALL1-SUDS3和dCas9的细胞群。
向导RNA的合成
所有的sgRNA、crRNA和tracrRNA都是在Horizon Discovery(以前的Dharmacon)合成的。sgRNA和crRNA分子是基于2016年M.A.Horlbeck et al.,“Compact and highlyactive next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression andactivation,”eLife.5,e19760(2016)开发的CRISPRi版(v2.1)向导RNA预测算法设计的。除非另有说明，实验使用修饰的sgRNA，其作为前三个算法排序的sgRNA的等摩尔集合递送，在下表2中标记为g1-g3。相同的靶向序列用于sgRNA、crRNA和表达的sgRNA，除了表达的sgRNA中的第一个碱基总是G。
用合成的向导RNA进行脂质转染
在转染前一天，将U2OS或A375细胞分别以每孔10,000或20,000个细胞接种在96孔板中。用靶向特定基因的合成的向导RNA转染细胞，最终浓度为25nM。对于在无血清培养基(GE Healthcare HyClone，目录号#SH30564.01)中的每个实验，将合成的向导RNA与DharmaFECT 4转染试剂(Horizon Discovery，目录号#T-2005-01)复合20分钟。移去平板细胞上的培养基，用转染混合物代替。在37℃、5％ CO2下孵育细胞24-144小时，直至进行分析。
用dCas9 mRNA和合成的sgRNA共转染
在转染前一天，将U2OS细胞以每孔10,000个细胞接种在透明的96孔板中；在转染前一天，将HCT 116细胞以每孔200,000个细胞接种在透明的6孔板中。用0.2μg/孔的dCas9-SALL1-SUDS3或dCas9-KRAB mRNA和25nM合成的sgRNA共转染U2OS细胞；用2.5μg/孔的dCas9-SALL1-SUDS3或dCas9-KRAB mRNA和25nM合成的sgRNA共转染HCT 116细胞。将dCas9mRNA和sgRNA在无血清培养基(GE Healthcare HyClone，目录号#SH30564.01)中与DharmaFECT Duo转染试剂(Horizon Discovery，目录号#T-2010)复合20分钟。移去平板细胞上的培养基，用转染混合物代替。在37℃、5％ CO2下孵育细胞。
核转染
使用Amaxa 96孔穿梭系统(Shuttle System)将K562、Jurkat、WTC-11人诱导多能干细胞(hiPS细胞)和原代人CD4+T细胞进行每孔电穿孔。将每次复制的200,000个K562细胞重悬于SF缓冲液(Lonza，目录号#V4SC-2096)中，并使用FF-120程序进行核转染；将200,000个Jurkat细胞重悬于SE缓冲液(Lonza，目录号#V4SC-1960)中，并使用程序Cl-120进行核转染；将80,000个hiPS细胞重悬于P3缓冲液(Lonza，目录号#V4SP-3096)中，并使用DC-100程序进行核转染；将250,000个原代人CD4+T细胞重悬于P3缓冲液中，并使用程序E0-115进行核转染。以2.5至9μM之间的细胞系依赖性终浓度递送合成的向导RNA。在细胞不稳定表达dCas9 CRISPRi构建体的情况下，以1-2.5μg/核转染的细胞系依赖性浓度递送dCas9-SALL1-SUDS3或dCas9-KRAB mRNA。
用质粒sgRNA转染
在用CRISPRi sgRNA质粒转染前一天，将U2OS和A375细胞以10,000或20,000细胞/孔接种在96孔板中。将质粒与DharmaFECT kb转染试剂(Horizon Discovery，目录号#T-2006)在无血清培养基(GE Healthcare HyClone，#SH30564.01)中复合10分钟。移去平板细胞上的培养基，并用转染混合物代替。在37℃、5％ CO2下孵育细胞72小时，直至进行分析。
慢病毒转导
以每孔10,000个细胞接种U2OS细胞和HCT 116细胞，并用CRISPRi sgRNA慢病毒颗粒以0.3的感染复数(MOI)转导，以获得具有单一整合体的细胞。在RT-qPCR分析前，用2.5μg/mL嘌呤霉素选择细胞7天，每3-4天传代一次。
RT-qPCR
分离总RNA，使用用于RT-qPCR的Maxima第一链cDNA合成试剂盒，用dsDNase(ThermoFisher Scientific，目录号#K1672)进行逆转录，并使用TaqMan Gene ExpressionMaster Mix和TaqMan基因表达测定法进行qPCR评估。使用GAPDH或ACTB作为管家基因，用ΔΔCq方法计算每种基因的相对表达，并标准化为非靶向对照(NTC)。
蛋白酶体测定-蛋白酶体基因抑制的功能报告测定
蛋白酶体测定利用重组U2OS细胞系，该细胞系稳定表达与增强型绿色荧光蛋白(Ubi[G76V]-EGFP)融合的突变泛素。在实验终点，用杜氏磷酸缓冲液(Dulbecco’sPhosphate Buffered Saline)(Cytivia，目录号SH30028.02)代替细胞培养基，并使用平板读数器测量EGFP荧光。将用靶向关键蛋白酶体基因的向导RNA转染的细胞群的荧光值标准化为未处理细胞群的荧光值。
Sanger法测序基因编辑分析
在56℃下，将细胞在含有蛋白酶K(Thermo Scientific，#FEREO0492)、RNase A(Thermo Scientific，#FEREN0531)和Phusion HF缓冲液(Thermo Scientific，#F-518L)的100μL缓冲液中裂解30分钟，随后在95℃下热灭活5分钟。该细胞裂解物用于产生跨越含有基因编辑位点的区域的400-600个核苷酸PCR扩增子。对未纯化的PCR扩增子进行Sanger法测序。使用TIDE分析从AB1文件计算基因编辑效率，Brinkman et al.,“Easy quantitativeassessment of genome editing by sequence trace decomposition,”Nucleic acidsresearch,42(22)(2014)。TIDE使用来自靶样品的定量序列追踪数据来量化靶基因座上的小插入和缺失(Indel)的频率和类型，所述定量序列追踪数据被标准化为对照样品的序列追踪数据。
FACS分析
核转染后24和72小时，通过FACS分析，以表达靶基因的细胞的百分比来评估CXCR3的功能性敲除。将细胞重悬于Fc阻断(BD Biosciences，目录号564220)的1：50溶液中，并使用Alexa Fluor 488缀合抗体(Biolegend，目录号50166932)对CD4进行染色作为阳性表达对照和使用APC缀合一抗(Biolegend，目录号353707)对CXCR3进行染色作为阳性表达对照。未染色的细胞用于选通CD4和CXCR3阳性细胞。将靶细胞群中CXCR3阳性细胞的百分比标准化为对照细胞群中的百分比，以确定功能性敲除。
实施例1：dCas9-KRAB和作为mRNA递送的dCas9-SALL1-SUDS3的沉默对比
dCas9-KRAB和dCas9-SALL1-SUDS3的沉默对比是针对以下每个靶进行的：BRCA1、PPIB、CD46、PSMD7、SEL1L和ST3GAL4。用dCas9-KRAB或dCas9-SALL1-SUDS3 mRNA核转染K562细胞，然后测量基因敲除。在每种情况下，向细胞提供靶向各自基因的三种汇集的合成的sgRNA集合的5μM的混合物。
核转染后48小时，测量相对于非靶向对照的基因表达。结果如图3A所示。如柱状图所示，在每种情况下，dCas9-SALL1-SUDS3的基因表达沉默与dCas9-KRAB的沉默相当，如果不是更好的话。
图3B显示了类似研究的结果，除了靶细胞是Jurkat细胞，并且在核转染后72小时测量表达。在图3B中，我们再次看到，在每种情况下，dCas9-SALL1-SUDS3基因表达的沉默与dCas9-KRAB的沉默相当，如果不是更好的话。
图3C显示了另一个类似研究的结果，除了靶细胞是U2OS细胞，试剂是通过脂质转染递送的，脂质转染使用靶向各自基因的三种汇集的合成的sgRNA集合的25nM的混合物，并且在转染后72小时测量表达。在图3C中，我们再次看到，在每种情况下，dCas9-SALLI-SUDS3基因表达的沉默与dCas9-KRAB的沉默相当，如果不是更好的话。
实施例2：Cas融合蛋白抑制物与dCas9-KRAB的效力对比
将HCT116细胞以每孔400,000个细胞平铺。24小时后，使用Duo转染试剂，用dCas9-SALLI-SUDS3 eGFP mRNA或dCas9-KRAB eGFP mRNA和靶向下列基因：PPIB、PSMD7和SELIL中的每一种的三种合成的sgRNA集合的25nM的混合物以及非靶向对照(NTC)共转染细胞。转染后24小时，用胰蛋白酶消化细胞，并进行FACS。将细胞分为两类：阴性细胞和前10％的细胞，然后将其接种在6孔培养皿中并使其恢复。在恢复24小时(总共48小时)后，分离总的RNA量，并使用RT-qPCR测量相对基因表达。使用GAPDH作为管家基因，用ΔΔCq方法计算每种基因的相对表达，并标准化为非靶向对照。
如图4所示，dCas9-SALL1-SUDS3 eGFP mRNA可用于FACS富集，并在选择的和未选择的群体中提供比dCas9-KRAB eGFP mRNA更强的靶基因抑制。
实施例3：不同细胞系中dCas9-KRAB与dCas9-SALL1-SUDS3的抑制对比
稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3或dCas9-KRAB的U2OS、Jurkat和hiPS细胞用靶向所列基因的三种合成的sgRNA的集合以及NTC进行转染或核转染。72小时后收获细胞。在每个细胞系中，dCas9-KRAB或dCas9-SALL1-SUDS3处于hEFlα启动子的控制之下。分离总RNA，并使用RT-qPCR测量相对基因表达。使用GAPDH作为管家基因，用ΔΔCq方法计算每种基因的相对表达，并标准化为非靶向对照。
如图5A所示，在U2OS稳定的hEFlα细胞系中，dCas9-SALL1-SUDS3表现出对BRCA1、PSMD7、SEL1L和ST3GAL4更强的基因抑制。如图5B所示，在Jurkat稳定的hEFlα细胞系中，dCas9-SALL1-SUDS3也表现出对BRCA1、PSMD7、SEL11L和ST3GAL4更强的基因抑制。如图5C所示，在USOS稳定的hEFlα细胞系中，dCas9-SALL1-SUDS3表现出对RAB11A、PPB和SEL1L更强或相似的基因抑制。如图6A所示，在K562稳定的hEFlα细胞系中，dCas9-SALL1-SUDS3也表现出对BRCA1、PSMD7、SEL1L和ST3GAL4更强的基因抑制。如图6B所示，在A375稳定的hEFlα细胞系中，dCas9-SALLI-SUDS3表现出对BRCA1、PSMD7、SEL1L和ST3GAL4更强或相似的基因抑制。
实施例4：在6天期间，dCas9-KRAB与dCas9-SALL1-SUDS3的对比
在hEFlα启动子控制下，稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3或dCas9-KRAB的U2OS细胞系用靶向下列基因：BRCA1、CD46、HBP1和SELIL中的每一种的三种合成的sgRNA集合转染。用转染后每24小时收获的样品，在六天内测量抑制。分离总RNA，通过RT-qPCR评估基因表达。使用GAPDH作为管家基因，用ΔΔCq方法计算每种基因的相对表达，并标准化为非靶向对照。
图7A示出在所有时间点，对于BRCA1，dCas9-SALL1-SUDS3比dCas9-KRAB产生更强的抑制。图7B示出在所有时间点，对于CD46，dCas9-SALLI-SUDS3比dCas9-KRAB产生更强的抑制。图7C示出在所有时间点，对于HBP1，dCas9-SALL1-SUDS3比dCas9-KRAB产生更强的抑制。图7D示出在所有时间点，对于SEL1L，dCas9-SALLI-SUDS3比dCas9-KRAB产生更强的抑制。注意，在每个实施例中，由dCas9-SALL1-SUDS3介导的抑制比由dCas9-KRAB介导的抑制更快开始，并且由dCas9-SALL1-SUDS3介导的抑制比由dCas9-KRAB介导的抑制在接近最大水平下持续更长时间。
实施例5：汇集sgRNA
将稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3的WTC-11hiPSC和稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3的U2OS细胞用单独的或三种合成的sgRNA集合进行核转染或转染，所述合成的sgRNA靶向通过脂质转染递送的3μM每种电穿孔的sgRNA的PPIB(3μM)、SEL1L(3μM)、RAB11A(3μM)、BRCA1(25nM)、PSDM7(25nM)、SELIL(25nM)和ST3GAL4(25nM)。72小时后收获细胞。分离总RNA，并使用RT-qPCR测量相对基因表达。使用GAPDH作为管家基因，用ΔΔCq方法计算相对基因表达，并标准化为非靶向对照。
如图8A所示，在WTC-11hiPSC中，汇集相当于或优于使用单独的sgRNA。类似地，如图8B所示，在US2OS hEFlαdCas9-SALL1-SUDS3中，汇集与使用每种单独的sgRNA相当或更好。
实施例6：用于同时抑制多种基因的gRNA的多路复用
稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3的hiPSC用单独的sgRNA和靶向独特基因的至多6个sgRNA集合进行核转染。72小时后收获细胞。分离总RNA，并使用RT-qPCR测量相对基因表达。使用GAPDH作为管家基因，用ΔΔCq方法计算相对基因表达，并标准化为非靶向对照。
如图9所示，当人iPS细胞中的至多6个基因被靶向同时抑制时，靶基因抑制的水平与只有一个基因被靶向时相当。
实施例7：与Cas蛋白的N-末端氨基酸和C-末端氨基酸的融合
图10底部示出了三种Cas融合蛋白的结构：dCas9-KRAB；dCas9-SALL1-SUDS3和SUDS3-SALL1-dCas9。Cas融合蛋白在人EFlα启动子的控制下表达。
产生了稳定表达各种基于二分dCas9融合蛋白的U2OS Ubi[G76V]-EGFP细胞系，以及稳定表达dCas9-KRAB的细胞系。用已知对蛋白酶体功能至关重要的25nM合成的sgRNA靶向基因以及非靶向对照转染细胞。在转染后72小时，用平板阅读器测定每种转染条件的荧光，并将值标准化为未处理细胞系的值。
U2OS细胞系稳定表达与增强型绿色荧光蛋白(Ubi[G76V]-EGFP)融合的突变泛素。在未经处理的细胞中，表达的泛素EGFP蛋白被组成性降解，仅留下背景荧光，而蛋白酶体功能受抑制的细胞显示EGFP的积累。因此，靶基因的抑制导致荧光增强。
如图10所示，包含dCas9、SUDS3和SALL1的Cas融合蛋白显示出比dCas9-KRAB明显更强的抑制，无论融合发生在Cas蛋白的N-末端氨基酸还是C-末端氨基酸(较高的平均GFP表达与更强的抑制相关)。
实施例8：A375细胞&U2OS细胞中的质粒：质粒共转染
质粒抑制物：(1)hEFlα-dCas9 KRAB；或(2)使用0.6μL/孔的kb，用向导(总计＝100ng)共转染的dCas9-SALL1-SUDS3。图11示出了在A375细胞中抑制物和基因靶的质粒共转染后三天，通过RT-qPCR测量基因表达的结果。图12示出了在U2OS细胞中抑制物和基因靶的质粒共转染后三天，通过RT-qPCR测量基因表达的结果。这两个图一致在含有dCas9-SALL1-SUDS3质粒的系统中显示出更强的抑制。
实施例9：额外的抑制物
产生了稳定表达各种基于二分dCas9融合蛋白的U2OS Ubi[G76V]-EGFP细胞系，以及稳定表达dCas9-KRAB的细胞系。用已知对蛋白酶体功能至关重要的25nM合成sgRNA靶向基因以及非靶向对照转染细胞。在转染后72小时，用平板阅读器测定每种转染条件下的荧光。这些值被标准化为未经处理的细胞系的值。
如图13所示，包含：(i)dCas9；(ii)SUDS3或SALL1；和(iii)KRAB或NIPP1的Cas融合蛋白显示出比dCas9更强或相当的抑制(更高的柱形表示更强的抑制。该系统采用与实施例8中的系统相同的方式设计。
实施例10：V型Cas蛋白-SALL1-SUDS3融合构建体
克隆失活的MAD7(工程化Cas12a蛋白)-SALL1-SUDS3融合构建体(dMAD7-SALL1-SUDS3)，并产生在最小CMV(mCMV)启动子控制下稳定表达它的U2OS细胞。克隆失活的CasPhi8(Cas12J蛋白)-SALL1-SUDS3融合构建体(dCAsPhi8-SALL1-SUDS3)，并产生在mCMV启动子控制下稳定表达它的U2OS细胞。这些细胞，连同稳定表达dMAD7或dCasPhi8的U2OS细胞，用为各自Cas蛋白设计的合成向导进行脂质转染，在每种情况下以25nM递送。转染后48小时评估转录抑制。
图14A示出了针对BRCA1和PPIB中的每一种的两种不同的合成的向导RNA，以及针对合成的向导RNA的集合和NTC，在稳定表达dMAD7或dMAD7-SALL1-SUDS3的U2OS细胞中CRISPRi诱导的转录抑制。该图示出了与dMAD7相比，dMAD7-SALL1-SUDS3受到显著更强的抑制。
图14B示出了靶向BRCA1中相同位点的不同的合成向导RNA的三次迭代，CRISPRi在稳定表达dCasPhi8或dCasPhi8-SALL1-SUDS3的U2OS细胞中诱导的转录抑制，以及未处理的U2OS细胞中的基础BRCA1表达。该图显示了与dCasPhi8相比，dCasPhi8-SALL1-SUDS3受到显著更强的抑制。
这些图表明SALL1和SUDS3可以与各种V型Cas蛋白融合，并用合成的向导RNA编程，以实现显著的靶基因抑制。
实施例11：用活性Cas9融合蛋白同时进行编辑和抑制
在hEFlα启动子控制下稳定表达SUDS3-SALL1-WtCas9的U2OS细胞用设计用于CRISPR和CRISPR编辑的25nM向导RNA集合转染。为CRISPRi设计的向导包含截短的14-mer靶向区。为CRISPR编辑设计的向导包含全长的20-mer靶向区。转染后72小时后，收获细胞。分离总RNA，使用RT-qPCR测量相对基因表达。使用GAPDH作为管家基因，使用ΔΔCq方法计算相对基因表达，并标准化为非靶向对照。分离基因组DNA，使用PCR扩增靶区域并进行Sanger法测序，使用TIDE分析Indel形成。
图15B示出了当LBR被同时编辑时，MRE11A可以被抑制。图15C示出了当PPIB被同时编辑时，MRE11A可以被抑制。图15D示出了当LBR被同时编辑时，SEL1L可以被抑制。图15E示出了当PPIB被同时编辑时，SEL1L可以被抑制。
实施例12：作为dCas9-融合蛋白的单个抑制结构域的对比
产生了稳定表达各种单一抑制dCas9融合蛋白(BCL6、CbpA、H-NS、MBD3、NIPP1、SALL1和SUDS3)的U2OS Ubi[G76V]-EGFP细胞系，以及稳定表达dCas9-KRAB的细胞系，所有这些都在人EFlα启动子的控制下。用靶向已知对蛋白酶体功能至关重要的基因的25nM合成的sgRNA以及非靶向对照转染细胞。
在转染后72小时，用平板阅读器测定每种转染条件的荧光，并将值标准化为未处理细胞系的值。U2OS细胞系稳定表达与增强型绿色荧光蛋白(Ubi[G76V]-EGFP)融合的突变泛素。在未经处理的细胞中，表达的泛素EGFP被组成性降解，仅留下背景荧光，而蛋白酶体功能受抑制的细胞显示EGFP的积累。因此，靶基因的抑制导致荧光增强。如图16所示，含有NIPP1、SALL1和SUDS3的dCas融合蛋白显示出比dCas9-KRAB显著更强的抑制(较高的平均GFP表达与更强的抑制相关)。
实施例13：dCas9-SUDS3抑制与dCas9-KRAB和dCas9-KRAB-MeCP2系统的对比
在人EFlα启动子控制下，产生了稳定表达dCas9-KRAB、dCas9-KRAB MeCP2或dCas9-SUDS3的U2OS Ubi[G76V]-EGFP细胞系。用已知对蛋白酶体功能至关重要的25nM合成的sgRNA靶向基因以及非靶向对照转染细胞。转染后72小时收获细胞，分离总RNA，并通过RT-qPCR评估靶基因的表达。使用GAPDH作为管家基因，用ΔΔCq方法计算相对表达，并标准化为非靶向对照。图17示出，对于每个基因靶，dCas9-SUDS3比dCas9-KRAB或dCas9-KRAB-MeCP2受到显著更强的转录抑制。
实施例14：蛋白酶体功能报告测定和转录抑制
在人EFlα启动子控制下，产生了稳定表达dCas9-KRAB或dCas9-SALL1-SUDS3的U2OS Ubi[G76V]-EGFP细胞系。用已知对蛋白酶体功能至关重要的25nM合成的sgRNA靶向基因以及非靶向对照转染细胞。在转染后72小时，用平板阅读器测定每种转染条件的荧光，并将值标准化为未处理细胞系的值。U2OS细胞系稳定表达与增强型绿色荧光蛋白(Ubi[G76V]-EGFP)融合的突变泛素。在未经处理的细胞中，表达的泛素EGFP被组成性降解，仅留下背景荧光，而蛋白酶体功能受抑制的细胞显示EGFP的积累。因此，靶基因的抑制导致荧光增强。分离总RNA，并通过RT-qPCR评估靶基因的表达。使用GAPDH作为管家基因，用ΔΔCq方法计算相对表达，并标准化为非靶向对照。图18A示出了dCas9-SALL1-SUDS3受到比dCas9-KRAB更显著的表型敲除(较高的平均GFP表达与更强的抑制相关)。图18B示出了dCas9-SALL1-SUDS3观察到，与靶向蛋白酶体基因的转录抑制增加相关的更显著的表型。
实施例15：慢病毒递送
图19A示出了稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3和来自单一慢病毒载体或来自两个不同载体的向导RNA的U2OS细胞中，PPIB和SEL1L的转录抑制。图19B示出了稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3和来自单一慢病毒载体或来自两个不同载体的向导RNA的HCT 116细胞中，PPIB和SEL1L的转录抑制。
慢病毒载体用于产生U2OS和HCT 116细胞，它们分别在人EFlα启动子(hEFlα)或小鼠CMV启动子(mCMV)的控制下稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3。这些细胞随后用含有载体的慢病毒颗粒转导，所述载体表达来自人U6启动子和靶向PPIB、SEL1L的不同向导RNA，或含有非靶向对照序列。用含有单一载体的慢病毒颗粒转导亲代U2OS和HCT 116细胞，所述载体在hEFlα(U2OS)或mCMV(HCT 116)启动子的控制下表达dCas9-SALL1-SUDS3，以及来自人U6启动子的单独向导RNA。这些单一载体系统也靶向PPIB或SELIL，或者包含非靶向对照序列。转导后24小时，加入含有2.5μg/mL嘌呤霉素的培养基以富集转导的细胞。在该培养基中培养细胞7天，每3至4天传代一次。在转导后8天收获细胞，分离总RNA，并通过RT-qPCR测定靶基因的相对表达。使用GAPDH作为管家基因，用ΔΔCq方法计算相对基因表达，并标准化为非靶向对照。
图19A示出了单慢病毒或双慢病毒载体系统可用于表达dCas9-SALL1-SUDS3和向导RNA，以在U2OS细胞中强力抑制靶基因。图19B示出了单慢病毒或双慢病毒系统可用于表达dCas9-SALLI-SUDS3和向导RNA，以在HCT 116细胞中强力抑制靶基因。
实施例16：质粒sgRNAvs合成的sgRNA
在hEFlα启动子控制下，将稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3的U2OS和A375细胞用靶向BRCA1、PSMD7、SEL1L和ST3GAL4的单独的、匹配的25nM合成的sgRNA或100ng质粒sgRNA转染。转染后72小时收获细胞，分离总RNA，使用RT-qPCR评估每种靶基因的相对基因表达。使用GAPDH作为管家基因，用ΔΔCq方法计算相对基因表达，并标准化为非靶向对照。图20A表明，在U2OS细胞中，与用质粒sgRNA递送相比，用合成的sgRNA递送时，dCas9-SALL1-SUDS3介导实质上更大的靶基因表达。图20B表明，在A375细胞中，与用质粒sgRNA递送相比，用合成的sgRNA递送时，dCas9-SALL1-SUDS3介导了实质上更多的靶基因表达。
实施例17：合成的sgRNA vscrRNA:tracrRNA
在hEFlα启动子控制下，稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3的U2OS细胞用汇集的25nM合成的sgRNA或合成的crRNA:tracrRNA复合物转染。转染后72小时收获细胞，分离总RNA，并使用RT-qPCR测量每种靶基因的相对基因表达。使用GAPDH作为管家基因，用ΔΔCq方法计算相对基因表达，并标准化为非靶向对照。图21表明，虽然汇集的合成的sgRNA的抑制明显更明显，但合成的sgRNA和合成的crRNA:tracrRNA复合物都可以用dCas9-SALL1-SUDS3递送，以引起靶基因抑制。
实施例18：5’截短的间隔区
在hEFlα启动子控制下，将稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3的U2OS细胞用含有截短的14-mer靶向区或全长20-mer靶向区的25nM向导RNA集合进行转染。转染后72小时收获细胞。分离总RNA，并使用RT-qPCR测量靶基因的相对基因表达。使用GAPDH作为管家基因，用ΔΔCq方法计算相对基因表达，并标准化为非靶向对照。图22示出，当用dCas9-SALL1-SUDS3递送时，向导RNA的靶向区可以在5’末端缩短至少6-mer，并且仍然影响转录抑制。
实施例19：LNA修饰的sgRNA
在人EFlα启动子控制下，将稳定表达dCas9-SALL1-SUDS3的U2OS Ubi[G76V]-EGFP细胞用靶向已知对蛋白酶体功能至关重要的两种基因的25nM合成的sgRNA以及非靶向对照转染。向导包含2’-O-甲基和硫代磷酸酯连接键的各种组合，并在sgRNA分子的末端和20-mer靶向区中，从5’末端的位置1至位置20锁定核酸。转染后144小时，用平板阅读器测定每种转染条件的荧光，并将值标准化为未处理细胞系的值。U2OS细胞系稳定表达与增强型绿色荧光蛋白(Ubi[G76V]-EGFP)融合的突变泛素。在未经处理的细胞中，表达的泛素EGFP被组成性降解，仅留下背景荧光，而蛋白酶体功能受抑制的细胞显示EGFP的积累。因此，靶基因的抑制导致荧光增强。/>
图23A示出了对sgRNA分子的各种化学末端修饰对dCas9-SALL1-SUDS3介导的功能性敲除的影响。在sgRNA分子的5’和3’末端掺入锁定的核酸可用于稳定gRNA。在靶向PSMD7和PSMD11的sgRNA的3’末端掺入两个锁定的核酸进一步改善了靶基因抑制(较高的平均GFP表达与更强的抑制相关)。图23B示出了将锁定的核酸位置掺入sgRNA靶向区对dCas9-SALL1-SUDS3介导的功能性敲除的影响。可以在sgRNA靶向区的一些位置掺入锁定的核酸，以改善靶基因抑制。
实施例20：RNA抑制复合物募集
各自在人EFlα启动子的控制下，将稳定表达融合至MS2衣壳蛋白配体(MCP-SALL1-SUDS3)的dCas9和SALL1-SUDS3的U2OS细胞通过相应的慢病毒表达载体的顺序转导产生。然后用靶向BRCA1、CD151和SETD3的25nM合成的crRNA:tracrRNA复合物以及NTC转染细胞。针对每个基因靶测试了几种含有不同MS2配体结合部分序列和位置的tracrRNA设计，并与含有不含MS2配体结合部分的tracrRNA的复合物进行对比，标记为crRNA:tracrRNA w/outMS2。转染后72小时收获细胞，分离总RNA，并使用RT-qPCR测量每种靶基因的相对基因表达。使用GAPDH作为管家基因，使用ΔΔCq方法计算相对基因表达，并标准化为非靶向对照。
图24A证明了MCP-SALL1-SUDS3可以通过位于sgRNA茎环2或tracrRNA分子3’末端的C-5MS2序列募集至dCas9。MCP-SALL1-SUDS3的募集可以增强dCas9结合的抑制效果，在本文表示为crRNA:tracrRNA w/out MS2。图24B示出了MCP-SALL1-SUDS3可以通过C-5MS2序列和包含2dAP化学修饰的F-5MS2序列募集至dCas9，以显著改善dCas9结合的抑制效果。
实施例21：敲除T细胞
用dCas9-SALL1-SUDS3 mRNA核转染原代人CD4+T细胞，并通过Lonza 96孔穿梭系统汇集合成的sgRNA。核转染后24和72小时，通过FACS分析，以表达靶基因的细胞的百分比来评估CXCR3的功能性敲除。使用Alexa Fluor 488缀合的抗体，对CD4细胞进行染色作为阳性表达对照，使用APC缀合的一抗，对CXCR3进行染色。在每个时间点分离总RNA，并通过RT-qPCR评估CXCR3的mRNA表达。使用GAPDH作为管家基因，用ΔΔCq方法计算CXCR3的相对表达，并标准化为非靶向对照。
图25A的图示出了在用dCas9-SALL1-SUDS3和合成的非靶向对照或靶向目标基因的3种向导的集合对原代人CD4+T细胞进行核转染1天和3天后，CXCR3的转录抑制和蛋白质水平敲除。
图25B示出了在这种临床相关的原代细胞类型中，dCas9-SALL1-SUDS3敲除的开始是快速的并持续了几天，对比了第1天未转染对照系统中的蛋白质表达、第3天未转染对照系统中的蛋白质表达、第1天CXCR3集合系统中的蛋白质表达和第3天CXCR3集合系统中的蛋白质表达。
表2：合成的sgRNA(Sp Cas9)
靶区域用粗体表示，化学修饰用斜体表示。
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
表3：5’截短的14mer靶向区合成的sgRNA(Sp Cas9)
靶区域用粗体表示，化学修饰用斜体表示。
/>
表4：LNA修饰的合成的sgRNA(Sp Cas9)
靶区域用粗体表示，化学修饰用斜体表示。
/>
/>
表5：合成的crRNA(Sp Cas9)
靶区域用粗体表示，化学修饰用斜体表示。
表6：合成的tracrRNA(Sp Cas9)
MS2适体区用粗体表示，化学修饰用斜体表示。
/>
表7：合成的V类Cas crRNA
靶区域用粗体表示，化学修饰用斜体表示。
/>
表8：通过颗粒或作为质粒递送的慢病毒向导RNA(Sp Cas9)
靶区域用粗体表示
/>
/>
序列表
<110> 达尔马科恩有限公司
<120> 用于基于CRISPR的转录抑制的融合蛋白
<130> DHARMA 0111-WO
<150> 63146419
<151> 2021-02-05
<160> 184
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 183
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Ser Arg Arg Lys Gln Ala Lys Pro Gln His Phe Gln Ser Asp Pro
1 5 10 15
Glu Val Ala Ser Leu Pro Arg Arg Asp Gly Asp Thr Glu Lys Gly Gln
20 25 30
Pro Ser Arg Pro Thr Lys Ser Lys Asp Ala His Val Cys Gly Arg Cys
35 40 45
Cys Ala Glu Phe Phe Glu Leu Ser Asp Leu Leu Leu His Lys Lys Asn
50 55 60
Cys Thr Lys Asn Gln Leu Val Leu Ile Val Asn Glu Asn Pro Ala Ser
65 70 75 80
Pro Pro Glu Thr Phe Ser Pro Ser Pro Pro Pro Asp Asn Pro Asp Glu
85 90 95
Gln Met Asn Asp Thr Val Asn Lys Thr Asp Gln Val Asp Cys Ser Asp
100 105 110
Leu Ser Glu His Asn Gly Leu Asp Arg Glu Glu Ser Met Glu Val Glu
115 120 125
Ala Pro Val Ala Asn Lys Ser Gly Ser Gly Thr Ser Ser Gly Ser His
130 135 140
Ser Ser Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Ser Ser Thr Gly Thr Ser Ala Ile Thr Thr Ser Leu
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<211> 328
<212> PRT
<213> 智人
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Pro Pro Ala Pro Glu Tyr Tyr Pro Glu Glu Asp Glu Glu Leu Glu Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Lys Arg Gln Leu Gln Gln Leu Gln Glu Gly Thr Leu Gln Glu Tyr Gln
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<213> 智人
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Pro Val Val Pro Ser Ala Val Asn Met Asn Pro Ala Pro Asn Pro Ala
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115 120 125
<210> 4
<211> 1566
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SALL1抑制结构域核苷酸序列
<400> 4
atgagtagga gaaaacaagc aaaaccacag cactttcaaa gtgatcctga ggtagcaagc 60
cttccacggc gggacggtga cacggagaag ggtcaaccaa gtcgacccac gaaaagcaaa 120
gatgctcatg tatgtggacg ctgttgcgca gaattttttg aattgtccga tcttcttctt 180
cacaaaaaga actgcacgaa gaatcagttg gttttgatag taaacgaaaa tccagcttca 240
cccccagaaa ctttttcccc gtcacctcct ccagataatc ctgatgaaca aatgaatgac 300
accgtaaata aaaccgacca agtagactgt tctgatttga gcgaacacaa cggtttggat 360
cgagaagagt caatggaagt agaggcccca gttgccaata agtcaggcag cggtacttct 420
tccggctccc acagttcaac agctccatcc tcaagtagtt caagctcttc tagttcagga 480
ggcgggggga gtagctctac cggcacttct gccatcacaa cctcacttcc tcagcttgga 540
gacttgacag gatccggtgg gggatctggg ggatctggct cgatgtctgc agctggcctt 600
ttggctcctg cccccgcaca agcgggagct cctcccgcac cggagtacta tccagaagag 660
gatgaggaac tggaatctgc cgaagacgac gagcgcagtt gccgggggag ggaatctgac 720
gaggatactg aggatgcttc tgagaccgac ctcgcgaaac atgatgagga agactacgtt 780
gaaatgaaag agcagatgta ccaagacaaa cttgctagcc tcaagagaca gttgcagcaa 840
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aattatatta aggaaaaaaa agccgctgtg aaggagttcg aagacaagaa agtggaactt 1020
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cgacgcccaa acgatccggt accgatccct gataagcggc gcaagcccgc accggctcag 1200
ctcaattacc tgctgaccga cgaacaaata atggaggacc tgcggactct taataagctg 1260
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aagatgcgca tatatctggg acaattgcaa agaggacttt ttgttataag acggagaagc 1560
gctgct 1566
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SUDS3抑制结构域核苷酸序列
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gagtactatc cagaagagga tgaggaactg gaatctgccg aagacgacga gcgcagttgc 120
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ctgcccgcta ctcccgcgga gagccctgct cagcgctttg aggcccgaat cgaggacgga 780
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aagacctctg atagtacgaa gatgcgcata tatctgggac aattgcaaag aggacttttt 960
gttataagac ggagaagcgc tgct 984
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<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NIPP1抑制结构核苷酸序列
<400> 6
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gcactcatcg gtggcttgcc catgccatac ccaaaccttg cccctgatgt ggacttgact 240
cctgttgtgc cgtcagcagt gaacatgaac cctgcaccaa accctgcagt ctataaccct 300
gaagctgtaa atgaacccaa gaagaagaaa tatgcaaaag aggcttggcc aggcaagaag 360
cccacacctt ccttgctgat t 381
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成的
<400> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
ggatccggtg ggggatctgg gggatctggc tcgatgagta ggagaaaaca agcaaaacca 60
cagcactttc aaagtgatcc tgaggtagca agccttccac ggcgggacgg tgacacggag 120
aagggtcaac caagtcgacc cacgaaaagc aaagatgctc atgtatgtgg acgctgttgc 180
gcagaatttt ttgaattgtc cgatcttctt cttcacaaaa agaactgcac gaagaatcag 240
ttggttttga tagtaaacga aaatccagct tcacccccag aaactttttc cccgtcacct 300
cctccagata atcctgatga acaaatgaat gacaccgtaa ataaaaccga ccaagtagac 360
tgttctgatt tgagcgaaca caacggtttg gatcgagaag agtcaatgga agtagaggcc 420
ccagttgcca ataagtcagg cagcggtact tcttccggct cccacagttc aacagctcca 480
tcctcaagta gttcaagctc ttctagttca ggaggcgggg ggagtagctc taccggcact 540
tctgccatca caacctcact tcctcagctt ggagacttga caggatccgg tgggggatct 600
gggggatctg gctcgatgtc tgcagctggc cttttggctc ctgcccccgc acaagcggga 660
gctcctcccg caccggagta ctatccagaa gaggatgagg aactggaatc tgccgaagac 720
gacgagcgca gttgccgggg gagggaatct gacgaggata ctgaggatgc ttctgagacc 780
gacctcgcga aacatgatga ggaagactac gttgaaatga aagagcagat gtaccaagac 840
aaacttgcta gcctcaagag acagttgcag caactgcaag aaggcacgct ccaggagtac 900
cagaagagaa tgaaaaaact cgaccagcag tacaaggaac gaattagaaa cgcagagctc 960
tttcttcagc tggagactga acaggttgag cgcaattata ttaaggaaaa aaaagccgct 1020
gtgaaggagt tcgaagacaa gaaagtggaa cttaaagaaa acctcatcgc cgaactggag 1080
gagaagaaga agatgataga gaacgaaaaa ctcacaatgg aactgacggg tgattccatg 1140
gaggtaaaac cgattatgac ccgaaagctc cgccgacgcc caaacgatcc ggtaccgatc 1200
cctgataagc ggcgcaagcc cgcaccggct cagctcaatt acctgctgac cgacgaacaa 1260
ataatggagg acctgcggac tcttaataag ctgaagagtc ctaaacggcc agcttccccc 1320
agttcccccg aacacctgcc cgctactccc gcggagagcc ctgctcagcg ctttgaggcc 1380
cgaatcgagg acggaaaatt gtactatgac aaacgctggt atcataagag ccaggctata 1440
tacctggagt caaaagataa ccaaaagttg tcatgtgtaa tctcctcagt cggggctaac 1500
gaaatatggg tgcggaagac ctctgatagt acgaagatgc gcatatatct gggacaattg 1560
caaagaggac tttttgttat aagacggaga agcgctgct 1599
<210> 10
<211> 533
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Met Ser Arg Arg Lys
1 5 10 15
Gln Ala Lys Pro Gln His Phe Gln Ser Asp Pro Glu Val Ala Ser Leu
20 25 30
Pro Arg Arg Asp Gly Asp Thr Glu Lys Gly Gln Pro Ser Arg Pro Thr
35 40 45
Lys Ser Lys Asp Ala His Val Cys Gly Arg Cys Cys Ala Glu Phe Phe
50 55 60
Glu Leu Ser Asp Leu Leu Leu His Lys Lys Asn Cys Thr Lys Asn Gln
65 70 75 80
Leu Val Leu Ile Val Asn Glu Asn Pro Ala Ser Pro Pro Glu Thr Phe
85 90 95
Ser Pro Ser Pro Pro Pro Asp Asn Pro Asp Glu Gln Met Asn Asp Thr
100 105 110
Val Asn Lys Thr Asp Gln Val Asp Cys Ser Asp Leu Ser Glu His Asn
115 120 125
Gly Leu Asp Arg Glu Glu Ser Met Glu Val Glu Ala Pro Val Ala Asn
130 135 140
Lys Ser Gly Ser Gly Thr Ser Ser Gly Ser His Ser Ser Thr Ala Pro
145 150 155 160
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
165 170 175
Ser Thr Gly Thr Ser Ala Ile Thr Thr Ser Leu Pro Gln Leu Gly Asp
180 185 190
Leu Thr Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Met Ser Ala
195 200 205
Ala Gly Leu Leu Ala Pro Ala Pro Ala Gln Ala Gly Ala Pro Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Tyr Tyr Pro Glu Glu Asp Glu Glu Leu Glu Ser Ala Glu Asp
225 230 235 240
Asp Glu Arg Ser Cys Arg Gly Arg Glu Ser Asp Glu Asp Thr Glu Asp
245 250 255
Ala Ser Glu Thr Asp Leu Ala Lys His Asp Glu Glu Asp Tyr Val Glu
260 265 270
Met Lys Glu Gln Met Tyr Gln Asp Lys Leu Ala Ser Leu Lys Arg Gln
275 280 285
Leu Gln Gln Leu Gln Glu Gly Thr Leu Gln Glu Tyr Gln Lys Arg Met
290 295 300
Lys Lys Leu Asp Gln Gln Tyr Lys Glu Arg Ile Arg Asn Ala Glu Leu
305 310 315 320
Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Gln Val Glu Arg Asn Tyr Ile Lys Glu
325 330 335
Lys Lys Ala Ala Val Lys Glu Phe Glu Asp Lys Lys Val Glu Leu Lys
340 345 350
Glu Asn Leu Ile Ala Glu Leu Glu Glu Lys Lys Lys Met Ile Glu Asn
355 360 365
Glu Lys Leu Thr Met Glu Leu Thr Gly Asp Ser Met Glu Val Lys Pro
370 375 380
Ile Met Thr Arg Lys Leu Arg Arg Arg Pro Asn Asp Pro Val Pro Ile
385 390 395 400
Pro Asp Lys Arg Arg Lys Pro Ala Pro Ala Gln Leu Asn Tyr Leu Leu
405 410 415
Thr Asp Glu Gln Ile Met Glu Asp Leu Arg Thr Leu Asn Lys Leu Lys
420 425 430
Ser Pro Lys Arg Pro Ala Ser Pro Ser Ser Pro Glu His Leu Pro Ala
435 440 445
Thr Pro Ala Glu Ser Pro Ala Gln Arg Phe Glu Ala Arg Ile Glu Asp
450 455 460
Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Lys Arg Trp Tyr His Lys Ser Gln Ala Ile
465 470 475 480
Tyr Leu Glu Ser Lys Asp Asn Gln Lys Leu Ser Cys Val Ile Ser Ser
485 490 495
Val Gly Ala Asn Glu Ile Trp Val Arg Lys Thr Ser Asp Ser Thr Lys
500 505 510
Met Arg Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Gln Arg Gly Leu Phe Val Ile Arg
515 520 525
Arg Arg Ser Ala Ala
530
<210> 11
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 核糖含有2' O甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 核苷酸之间的连接键是硫代磷酸酯键
<220>
<221> N_region
<222> (1)..(20)
<223> N是 A, C, G或U
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(20)
<223> n是a, c, g或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (98)..(99)
<223> 核糖含有2' O甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (98)..(100)
<223> 核苷酸之间的连接键是硫代磷酸酯键
<400> 11
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 12
<211> 66
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ku结合发术
<400> 12
uucuugucgu acuuauagau cgcuacguua uuucaauuuu gaaaaucuga guccugggag 60
ugcgga 66
<210> 13
<211> 609
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ku异二聚体
<400> 13
Met Ser Gly Trp Glu Ser Tyr Tyr Lys Thr Glu Gly Asp Glu Glu Ala
1 5 10 15
Glu Glu Glu Gln Glu Glu Asn Leu Glu Ala Ser Gly Asp Tyr Lys Tyr
20 25 30
Ser Gly Arg Asp Ser Leu Ile Phe Leu Val Asp Ala Ser Lys Ala Met
35 40 45
Phe Glu Ser Gln Ser Glu Asp Glu Leu Thr Pro Phe Asp Met Ser Ile
50 55 60
Gln Cys Ile Gln Ser Val Tyr Ile Ser Lys Ile Ile Ser Ser Asp Arg
65 70 75 80
Asp Leu Leu Ala Val Val Phe Tyr Gly Thr Glu Lys Asp Lys Asn Ser
85 90 95
Val Asn Phe Lys Asn Ile Tyr Val Leu Gln Glu Leu Asp Asn Pro Gly
100 105 110
Ala Lys Arg Ile Leu Glu Leu Asp Gln Phe Lys Gly Gln Gln Gly Gln
115 120 125
Lys Arg Phe Gln Asp Met Met Gly His Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Ser
130 135 140
Glu Val Leu Trp Val Cys Ala Asn Leu Phe Ser Asp Val Gln Phe Lys
145 150 155 160
Met Ser His Lys Arg Ile Met Leu Phe Thr Asn Glu Asp Asn Pro His
165 170 175
Gly Asn Asp Ser Ala Lys Ala Ser Arg Ala Arg Thr Lys Ala Gly Asp
180 185 190
Leu Arg Asp Thr Gly Ile Phe Leu Asp Leu Met His Leu Lys Lys Pro
195 200 205
Gly Gly Phe Asp Ile Ser Leu Phe Tyr Arg Asp Ile Ile Ser Ile Ala
210 215 220
Glu Asp Glu Asp Leu Arg Val His Phe Glu Glu Ser Ser Lys Leu Glu
225 230 235 240
Asp Leu Leu Arg Lys Val Arg Ala Lys Glu Thr Arg Lys Arg Ala Leu
245 250 255
Ser Arg Leu Lys Leu Lys Leu Asn Lys Asp Ile Val Ile Ser Val Gly
260 265 270
Ile Tyr Asn Leu Val Gln Lys Ala Leu Lys Pro Pro Pro Ile Lys Leu
275 280 285
Tyr Arg Glu Thr Asn Glu Pro Val Lys Thr Lys Thr Arg Thr Phe Asn
290 295 300
Thr Ser Thr Gly Gly Leu Leu Leu Pro Ser Asp Thr Lys Arg Ser Gln
305 310 315 320
Ile Tyr Gly Ser Arg Gln Ile Ile Leu Glu Lys Glu Glu Thr Glu Glu
325 330 335
Leu Lys Arg Phe Asp Asp Pro Gly Leu Met Leu Met Gly Phe Lys Pro
340 345 350
Leu Val Leu Leu Lys Lys His His Tyr Leu Arg Pro Ser Leu Phe Val
355 360 365
Tyr Pro Glu Glu Ser Leu Val Ile Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ser Ala
370 375 380
Leu Leu Ile Lys Cys Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Cys Arg Tyr
385 390 395 400
Thr Pro Arg Arg Asn Ile Pro Pro Tyr Phe Val Ala Leu Val Pro Gln
405 410 415
Glu Glu Glu Leu Asp Asp Gln Lys Ile Gln Val Thr Pro Pro Gly Phe
420 425 430
Gln Leu Val Phe Leu Pro Phe Ala Asp Asp Lys Arg Lys Met Pro Phe
435 440 445
Thr Glu Lys Ile Met Ala Thr Pro Glu Gln Val Gly Lys Met Lys Ala
450 455 460
Ile Val Glu Lys Leu Arg Phe Thr Tyr Arg Ser Asp Ser Phe Glu Asn
465 470 475 480
Pro Val Leu Gln Gln His Phe Arg Asn Leu Glu Ala Leu Ala Leu Asp
485 490 495
Leu Met Glu Pro Glu Gln Ala Val Asp Leu Thr Leu Pro Lys Val Glu
500 505 510
Ala Met Asn Lys Arg Leu Gly Ser Leu Val Asp Glu Phe Lys Glu Leu
515 520 525
Val Tyr Pro Pro Asp Tyr Asn Pro Glu Gly Lys Val Thr Lys Arg Lys
530 535 540
His Asp Asn Glu Gly Ser Gly Ser Lys Arg Pro Lys Val Glu Tyr Ser
545 550 555 560
Glu Glu Glu Leu Lys Thr His Ile Ser Lys Gly Thr Leu Gly Lys Phe
565 570 575
Thr Val Pro Met Leu Lys Glu Ala Cys Arg Ala Tyr Gly Leu Lys Ser
580 585 590
Gly Leu Lys Lys Gln Glu Leu Leu Glu Ala Leu Thr Lys His Phe Gln
595 600 605
Asp
<210> 14
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ku异二聚体
<400> 14
Met Val Arg Ser Gly Asn Lys Ala Ala Val Val Leu Cys Met Asp Val
1 5 10 15
Gly Phe Thr Met Ser Asn Ser Ile Pro Gly Ile Glu Ser Pro Phe Glu
20 25 30
Gln Ala Lys Lys Val Ile Thr Met Phe Val Gln Arg Gln Val Phe Ala
35 40 45
Glu Asn Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Leu Phe Gly Thr Asp Gly Thr
50 55 60
Asp Asn Pro Leu Ser Gly Gly Asp Gln Tyr Gln Asn Ile Thr Val His
65 70 75 80
Arg His Leu Met Leu Pro Asp Phe Asp Leu Leu Glu Asp Ile Glu Ser
85 90 95
Lys Ile Gln Pro Gly Ser Gln Gln Ala Asp Phe Leu Asp Ala Leu Ile
100 105 110
Val Ser Met Asp Val Ile Gln His Glu Thr Ile Gly Lys Lys Phe Glu
115 120 125
Lys Arg His Ile Glu Ile Phe Thr Asp Leu Ser Ser Arg Phe Ser Lys
130 135 140
Ser Gln Leu Asp Ile Ile Ile His Ser Leu Lys Lys Cys Asp Ile Ser
145 150 155 160
Glu Arg His Ser Ile His Trp Pro Cys Arg Leu Thr Ile Gly Ser Asn
165 170 175
Leu Ser Ile Arg Ile Ala Ala Tyr Lys Ser Ile Leu Gln Glu Arg Val
180 185 190
Lys Lys Thr Trp Thr Val Val Asp Ala Lys Thr Leu Lys Lys Glu Asp
195 200 205
Ile Gln Lys Glu Thr Val Tyr Cys Leu Asn Asp Asp Asp Glu Thr Glu
210 215 220
Val Leu Lys Glu Asp Ile Ile Gln Gly Phe Arg Tyr Gly Ser Asp Ile
225 230 235 240
Val Pro Phe Ser Lys Val Asp Glu Glu Gln Met Lys Tyr Lys Ser Glu
245 250 255
Gly Lys Cys Phe Ser Val Leu Gly Phe Cys Lys Ser Ser Gln Val Gln
260 265 270
Arg Arg Phe Phe Met Gly Asn Gln Val Leu Lys Val Phe Ala Ala Arg
275 280 285
Asp Asp Glu Ala Ala Ala Val Ala Leu Ser Ser Leu Ile His Ala Leu
290 295 300
Asp Asp Leu Asp Met Val Ala Ile Val Arg Tyr Ala Tyr Asp Lys Arg
305 310 315 320
Ala Asn Pro Gln Val Gly Val Ala Phe Pro His Ile Lys His Asn Tyr
325 330 335
Glu Cys Leu Val Tyr Val Gln Leu Pro Phe Met Glu Asp Leu Arg Gln
340 345 350
Tyr Met Phe Ser Ser Leu Lys Asn Ser Lys Lys Tyr Ala Pro Thr Glu
355 360 365
Ala Gln Leu Asn Ala Val Asp Ala Leu Ile Asp Ser Met Ser Leu Ala
370 375 380
Lys Lys Asp Glu Lys Thr Asp Thr Leu Glu Asp Leu Phe Pro Thr Thr
385 390 395 400
Lys Ile Pro Asn Pro Arg Phe Gln Arg Leu Phe Gln Cys Leu Leu His
405 410 415
Arg Ala Leu His Pro Arg Glu Pro Leu Pro Pro Ile Gln Gln His Ile
420 425 430
Trp Asn Met Leu Asn Pro Pro Ala Glu Val Thr Thr Lys Ser Gln Ile
435 440 445
Pro Leu Ser Lys Ile Lys Thr Leu Phe Pro Leu Ile Glu Ala Lys Lys
450 455 460
Lys Asp Gln Val Thr Ala Gln Glu Ile Phe Gln Asp Asn His Glu Asp
465 470 475 480
Gly Pro Thr Ala Lys
485
<210> 15
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sm共有位点
<400> 15
aauuuuugga 10
<210> 16
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Sm7同源七聚体
<400> 16
Gly Ser Val Ile Asp Val Ser Ser Gln Arg Val Asn Val Gln Arg Pro
1 5 10 15
Leu Asp Ala Leu Gly Asn Ser Leu Asn Ser Pro Val Ile Ile Lys Leu
20 25 30
Lys Gly Asp Arg Glu Phe Arg Gly Val Leu Lys Ser Phe Asp Leu His
35 40 45
Met Asn Leu Val Leu Asn Asp Ala Glu Glu Leu Glu Asp Gly Glu Val
50 55 60
Thr Arg Arg Leu Gly Thr Val Leu Ile Arg Gly Asp Asn Ile Val Tyr
65 70 75 80
Ile Ser Pro
<210> 17
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ms2噬菌体操纵子茎环
<400> 17
gcacaugagg aucacccaug ugc 23
<210> 18
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MS2衣壳蛋白
<400> 18
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1 5 10 15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Ile Ala Glu
20 25 30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
35 40 45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu
50 55 60
Val Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile
65 70 75 80
Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met
85 90 95
Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala
100 105 110
Asn Ser Gly Ile Tyr
115
<210> 19
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PP7噬菌体操纵子茎环
<400> 19
auaaggaguu uauauggaaa cccuua 26
<210> 20
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PP7衣壳蛋白(PCP)
<400> 20
Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu
1 5 10 15
Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val
20 25 30
Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn
35 40 45
Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp
50 55 60
Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg
65 70 75 80
Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr
85 90 95
Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala
100 105 110
Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg
115 120 125
<210> 21
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SfMu Com茎环
<400> 21
cugaaugccu gcgagcauc 19
<210> 22
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SfMu Com结合蛋白
<400> 22
Met Lys Ser Ile Arg Cys Lys Asn Cys Asn Lys Leu Leu Phe Lys Ala
1 5 10 15
Asp Ser Phe Asp His Ile Glu Ile Arg Cys Pro Arg Cys Lys Arg His
20 25 30
Ile Ile Met Leu Asn Ala Cys Glu His Pro Thr Glu Lys His Cys Gly
35 40 45
Lys Arg Glu Lys Ile Thr His Ser Asp Glu Thr Val Arg Tyr
50 55 60
<210> 23
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Box B适体
<400> 23
gcccugaaga agggc 15
<210> 24
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Lambde N22plus蛋白
<400> 24
Met Asn Ala Arg Thr Arg Arg Arg Glu Arg Arg Ala Glu Lys Gln Ala
1 5 10 15
Gln Trp Lys Ala Ala Asn
20
<210> 25
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Csy4结合基序
<400> 25
cugccguaua ggcagc 16
<210> 26
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Csy4[H29A]
<400> 26
Met Asp His Tyr Leu Asp Ile Arg Leu Arg Pro Asp Pro Glu Phe Pro
1 5 10 15
Pro Ala Gln Leu Met Ser Val Leu Phe Gly Lys Leu Ala Gln Ala Leu
20 25 30
Val Ala Gln Gly Gly Asp Arg Ile Gly Val Ser Phe Pro Asp Leu Asp
35 40 45
Glu Ser Arg Ser Arg Leu Gly Glu Arg Leu Arg Ile His Ala Ser Ala
50 55 60
Asp Asp Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Pro Trp Leu Glu Gly Leu Arg
65 70 75 80
Asp His Leu Gln Phe Gly Glu Pro Ala Val Val Pro His Pro Thr Pro
85 90 95
Tyr Arg Gln Val Ser Arg Val Gln Ala Lys Ser Asn Pro Glu Arg Leu
100 105 110
Arg Arg Arg Leu Met Arg Arg His Asp Leu Ser Glu Glu Glu Ala Arg
115 120 125
Lys Arg Ile Pro Asp Thr Val Ala Arg Ala Leu Asp Leu Pro Phe Val
130 135 140
Thr Leu Arg Ser Gln Ser Thr Gly Gln His Phe Arg Leu Phe Ile Arg
145 150 155 160
His Gly Pro Leu Gln Val Thr Ala Glu Glu Gly Gly Phe Thr Cys Tyr
165 170 175
Gly Leu Ser Lys Gly Gly Phe Val Pro Trp Phe
180 185
<210> 27
<211> 93
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
guuuaagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuuaaau aaggcuaguc cguuaucaac 60
uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 93
<210> 28
<211> 79
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
ggaaccauuc aaaacagcau agcaaguuaa aauaaggcua guccguuauc aacuugaaaa 60
aguggcaccg agucggugc 79
<210> 29
<211> 60
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc 60
<210> 30
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg 60
gugc 64
<210> 31
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
caaaacagca uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc 60
gagucggugc 70
<210> 32
<211> 45
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aagug 45
<210> 33
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau ca 32
<210> 34
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
uagcaaguua aaauaaggcu aguccg 26
<210> 35
<211> 75
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Met Asp Ala Lys Ser Leu Thr Ala Trp Ser Arg Thr Leu Val Thr Phe
1 5 10 15
Lys Asp Val Phe Val Asp Phe Thr Arg Glu Glu Trp Lys Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Gln Gln Ile Val Tyr Arg Asn Val Met Leu Glu Asn Tyr Lys
35 40 45
Asn Leu Val Ser Leu Gly Tyr Gln Leu Thr Lys Pro Asp Val Ile Leu
50 55 60
Arg Leu Glu Lys Gly Glu Glu Pro Trp Leu Val
65 70 75
<210> 36
<211> 311
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Pro Ser Arg Leu Gln Met Phe Phe Ala Asn Asn His Asp Gln Glu Phe
1 5 10 15
Asp Pro Pro Lys Val Tyr Pro Pro Val Pro Ala Glu Lys Arg Lys Pro
20 25 30
Ile Arg Val Leu Ser Leu Phe Asp Gly Ile Ala Thr Gly Leu Leu Val
35 40 45
Leu Lys Asp Leu Gly Ile Gln Val Asp Arg Tyr Ile Ala Ser Glu Val
50 55 60
Cys Glu Asp Ser Ile Thr Val Gly Met Val Arg His Gln Gly Lys Ile
65 70 75 80
Met Tyr Val Gly Asp Val Arg Ser Val Thr Gln Lys His Ile Gln Glu
85 90 95
Trp Gly Pro Phe Asp Leu Val Ile Gly Gly Ser Pro Cys Asn Asp Leu
100 105 110
Ser Ile Val Asn Pro Ala Arg Lys Gly Leu Tyr Glu Gly Thr Gly Arg
115 120 125
Leu Phe Phe Glu Phe Tyr Arg Leu Leu His Asp Ala Arg Pro Lys Glu
130 135 140
Gly Asp Asp Arg Pro Phe Phe Trp Leu Phe Glu Asn Val Val Ala Met
145 150 155 160
Gly Val Ser Asp Lys Arg Asp Ile Ser Arg Phe Leu Glu Ser Asn Pro
165 170 175
Val Met Ile Asp Ala Lys Glu Val Ser Ala Ala His Arg Ala Arg Tyr
180 185 190
Phe Trp Gly Asn Leu Pro Gly Met Asn Arg Pro Leu Ala Ser Thr Val
195 200 205
Asn Asp Lys Leu Glu Leu Gln Glu Cys Leu Glu His Gly Arg Ile Ala
210 215 220
Lys Phe Ser Lys Val Arg Thr Ile Thr Thr Arg Ser Asn Ser Ile Lys
225 230 235 240
Gln Gly Lys Asp Gln His Phe Pro Val Phe Met Asn Glu Lys Glu Asp
245 250 255
Ile Leu Trp Cys Thr Glu Met Glu Arg Val Phe Gly Phe Pro Val His
260 265 270
Tyr Thr Asp Val Ser Asn Met Ser Arg Leu Ala Arg Gln Arg Leu Leu
275 280 285
Gly Arg Ser Trp Ser Val Pro Val Ile Arg His Leu Phe Ala Pro Leu
290 295 300
Lys Glu Tyr Phe Ala Cys Val
305 310
<210> 37
<211> 225
<212> DNA
<213> 智人
<400> 37
atggacgcga aatcacttac ggcatggtcg agaacactgg ttacgttcaa ggacgtgttt 60
gtggacttta cacgtgagga gtggaaattg ctggatactg cgcaacaaat tgtgtatcga 120
aatgtcatgc ttgagaatta caagaacctc gtcagtctcg gataccagtt gacgaaaccg 180
gatgtgatcc ttaggctcga aaagggggaa gaaccttggc tggta 225
<210> 38
<211> 933
<212> DNA
<213> 智人
<400> 38
ccctcccggc tccagatgtt cttcgctaat aaccacgacc aggaatttga ccctccaaag 60
gtttacccac ctgtcccagc tgagaagagg aagcccatcc gggtgctgtc tctctttgat 120
ggaatcgcta cagggctcct ggtgctgaag gacttgggca ttcaggtgga ccgctacatt 180
gcctcggagg tgtgtgagga ctccatcacg gtgggcatgg tgcggcacca ggggaagatc 240
atgtacgtcg gggacgtccg cagcgtcaca cagaagcata tccaggagtg gggcccattc 300
gatctggtga ttgggggcag tccctgcaat gacctctcca tcgtcaaccc tgctcgcaag 360
ggcctctacg agggcactgg ccggctcttc tttgagttct accgcctcct gcatgatgcg 420
cggcccaagg agggagatga tcgccccttc ttctggctct ttgagaatgt ggtggccatg 480
ggcgttagtg acaagaggga catctcgcga tttctcgagt ccaaccctgt gatgattgat 540
gccaaagaag tgtcagctgc acacagggcc cgctacttct ggggtaacct tcccggtatg 600
aacaggccgt tggcatccac tgtgaatgat aagctggagc tgcaggagtg tctggagcat 660
ggcaggatag ccaagttcag caaagtgagg accattacta cgaggtcaaa ctccataaag 720
cagggcaaag accagcattt tcctgtcttc atgaatgaga aagaggacat cttatggtgc 780
actgaaatgg aaagggtatt tggtttccca gtccactata ctgacgtctc caacatgagc 840
cgcttggcga ggcagagact gctgggccgg tcatggagcg tgccagtcat ccgccacctc 900
ttcgctccgc tgaaggagta ttttgcgtgt gtg 933
<210> 39
<211> 1302
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
Met Val Asp Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser
1 5 10 15
Thr Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asn Asn Gly Thr Asn Asn Phe Gln
20 25 30
Asn Phe Ile Gly Ile Ser Ser Leu Gln Lys Thr Leu Arg Asn Ala Leu
35 40 45
Ile Pro Thr Glu Thr Thr Gln Gln Phe Ile Val Lys Asn Gly Ile Ile
50 55 60
Lys Glu Asp Glu Leu Arg Gly Glu Asn Arg Gln Ile Leu Lys Asp Ile
65 70 75 80
Met Asp Asp Tyr Tyr Arg Gly Phe Ile Ser Glu Thr Leu Ser Ser Ile
85 90 95
Asp Asp Ile Asp Trp Thr Ser Leu Phe Glu Lys Met Glu Ile Gln Leu
100 105 110
Lys Asn Gly Asp Asn Lys Asp Thr Leu Ile Lys Glu Gln Thr Glu Tyr
115 120 125
Arg Lys Ala Ile His Lys Lys Phe Ala Asn Asp Asp Arg Phe Lys Asn
130 135 140
Met Phe Ser Ala Lys Leu Ile Ser Asp Ile Leu Pro Glu Phe Val Ile
145 150 155 160
His Asn Asn Asn Tyr Ser Ala Ser Glu Lys Glu Glu Lys Thr Gln Val
165 170 175
Ile Lys Leu Phe Ser Arg Phe Ala Thr Ser Phe Lys Asp Tyr Phe Lys
180 185 190
Asn Arg Ala Asn Cys Phe Ser Ala Asp Asp Ile Ser Ser Ser Ser Cys
195 200 205
His Arg Ile Val Asn Asp Asn Ala Glu Ile Phe Phe Ser Asn Ala Leu
210 215 220
Val Tyr Arg Arg Ile Val Lys Ser Leu Ser Asn Asp Asp Ile Asn Lys
225 230 235 240
Ile Ser Gly Asp Met Lys Asp Ser Leu Lys Glu Met Ser Leu Glu Glu
245 250 255
Ile Tyr Ser Tyr Glu Lys Tyr Gly Glu Phe Ile Thr Gln Glu Gly Ile
260 265 270
Ser Phe Tyr Asn Asp Ile Cys Gly Lys Val Asn Ser Phe Met Asn Leu
275 280 285
Tyr Cys Gln Lys Asn Lys Glu Asn Lys Asn Leu Tyr Lys Leu Gln Lys
290 295 300
Leu His Lys Gln Ile Leu Cys Ile Ala Asp Thr Ser Tyr Glu Val Pro
305 310 315 320
Tyr Lys Phe Glu Ser Asp Glu Glu Val Tyr Gln Ser Val Asn Gly Phe
325 330 335
Leu Asp Asn Ile Ser Ser Lys His Ile Val Glu Arg Leu Arg Lys Ile
340 345 350
Gly Asp Asn Tyr Asn Gly Tyr Asn Leu Asp Lys Ile Tyr Ile Val Ser
355 360 365
Lys Phe Tyr Glu Ser Val Ser Gln Lys Thr Tyr Arg Asp Trp Glu Thr
370 375 380
Ile Asn Thr Ala Leu Glu Ile His Tyr Asn Asn Ile Leu Pro Gly Asn
385 390 395 400
Gly Lys Ser Lys Ala Asp Lys Val Lys Lys Ala Val Lys Asn Asp Leu
405 410 415
Gln Lys Ser Ile Thr Glu Ile Asn Glu Leu Val Ser Asn Tyr Lys Leu
420 425 430
Cys Ser Asp Asp Asn Ile Lys Ala Glu Thr Tyr Ile His Glu Ile Ser
435 440 445
His Ile Leu Asn Asn Phe Glu Ala Gln Glu Leu Lys Tyr Asn Pro Glu
450 455 460
Ile His Leu Val Glu Ser Glu Leu Lys Ala Ser Glu Leu Lys Asn Val
465 470 475 480
Leu Asp Val Ile Met Asn Ala Phe His Trp Cys Ser Val Phe Met Thr
485 490 495
Glu Glu Leu Val Asp Lys Asp Asn Asn Phe Tyr Ala Glu Leu Glu Glu
500 505 510
Ile Tyr Asp Glu Ile Tyr Pro Val Ile Ser Leu Tyr Asn Leu Val Arg
515 520 525
Asn Tyr Val Thr Gln Lys Pro Tyr Ser Thr Lys Lys Ile Lys Leu Asn
530 535 540
Phe Gly Ile Pro Thr Leu Ala Asp Gly Trp Ser Lys Ser Lys Glu Tyr
545 550 555 560
Ser Asn Asn Ala Ile Ile Leu Met Arg Asp Asn Leu Tyr Tyr Leu Gly
565 570 575
Ile Phe Asn Ala Lys Asn Lys Pro Asp Lys Lys Ile Ile Glu Gly Asn
580 585 590
Thr Ser Glu Asn Lys Gly Asp Tyr Lys Lys Met Ile Tyr Asn Leu Leu
595 600 605
Pro Gly Pro Asn Lys Met Ile Pro Lys Val Phe Leu Ser Ser Lys Thr
610 615 620
Gly Val Glu Thr Tyr Lys Pro Ser Ala Tyr Ile Leu Glu Gly Tyr Lys
625 630 635 640
Gln Asn Lys His Ile Lys Ser Ser Lys Asp Phe Asp Ile Thr Phe Cys
645 650 655
His Asp Leu Ile Asp Tyr Phe Lys Asn Cys Ile Ala Ile His Pro Glu
660 665 670
Trp Lys Asn Phe Gly Phe Asp Phe Ser Asp Thr Ser Thr Tyr Glu Asp
675 680 685
Ile Ser Gly Phe Tyr Arg Glu Val Glu Leu Gln Gly Tyr Lys Ile Asp
690 695 700
Trp Thr Tyr Ile Ser Glu Lys Asp Ile Asp Leu Leu Gln Glu Lys Gly
705 710 715 720
Gln Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Lys Lys Ser
725 730 735
Thr Gly Asn Asp Asn Leu His Thr Met Tyr Leu Lys Asn Leu Phe Ser
740 745 750
Glu Glu Asn Leu Lys Asp Ile Val Leu Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu
755 760 765
Ile Phe Phe Arg Lys Ser Ser Ile Lys Asn Pro Ile Ile His Lys Lys
770 775 780
Gly Ser Ile Leu Val Asn Arg Thr Tyr Glu Ala Glu Glu Lys Asp Gln
785 790 795 800
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805 810 815
Gln Glu Leu Tyr Lys Tyr Phe Asn Asp Lys Ser Asp Lys Glu Leu Ser
820 825 830
Asp Glu Ala Ala Lys Leu Lys Asn Val Val Gly His His Glu Ala Ala
835 840 845
Thr Asn Ile Val Lys Asp Tyr Arg Tyr Thr Tyr Asp Lys Tyr Phe Leu
850 855 860
His Met Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ala Asn Lys Thr Gly Phe Ile
865 870 875 880
Asn Asp Arg Ile Leu Gln Tyr Ile Ala Lys Glu Lys Asp Leu His Val
885 890 895
Ile Gly Ile Ala Arg Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Val Ser Val Ile
900 905 910
Asp Thr Cys Gly Asn Ile Val Glu Gln Lys Ser Phe Asn Ile Val Asn
915 920 925
Gly Tyr Asp Tyr Gln Ile Lys Leu Lys Gln Gln Glu Gly Ala Arg Gln
930 935 940
Ile Ala Arg Lys Glu Trp Lys Glu Ile Gly Lys Ile Lys Glu Ile Lys
945 950 955 960
Glu Gly Tyr Leu Ser Leu Val Ile His Glu Ile Ser Lys Met Val Ile
965 970 975
Lys Tyr Asn Ala Ile Ile Ala Met Ala Asp Leu Ser Tyr Gly Phe Lys
980 985 990
Lys Gly Arg Phe Lys Val Glu Arg Gln Val Tyr Gln Lys Phe Glu Thr
995 1000 1005
Met Leu Ile Asn Lys Leu Asn Tyr Leu Val Phe Lys Asp Ile Ser
1010 1015 1020
Ile Thr Glu Asn Gly Gly Leu Leu Lys Gly Tyr Gln Leu Thr Tyr
1025 1030 1035
Ile Pro Asp Lys Leu Lys Asn Val Gly His Gln Cys Gly Cys Ile
1040 1045 1050
Phe Tyr Val Pro Ala Ala Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Thr Thr
1055 1060 1065
Gly Phe Val Asn Ile Phe Lys Phe Lys Asp Leu Thr Val Asp Ala
1070 1075 1080
Lys Arg Glu Phe Ile Lys Lys Phe Asp Ser Ile Arg Tyr Asp Ser
1085 1090 1095
Glu Lys Asn Leu Phe Cys Phe Thr Phe Asp Tyr Asn Asn Phe Ile
1100 1105 1110
Thr Gln Asn Thr Val Met Ser Lys Ser Ser Trp Ser Val Tyr Thr
1115 1120 1125
Tyr Gly Val Arg Ile Lys Arg Arg Phe Val Asn Gly Arg Phe Ser
1130 1135 1140
Asn Glu Ser Asp Thr Ile Asp Ile Thr Lys Asp Met Glu Lys Thr
1145 1150 1155
Leu Glu Met Thr Asp Ile Asn Trp Arg Asp Gly His Asp Leu Arg
1160 1165 1170
Gln Asp Ile Ile Asp Tyr Glu Ile Val Gln His Ile Phe Glu Ile
1175 1180 1185
Phe Arg Leu Thr Val Gln Met Arg Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu
1190 1195 1200
Asp Arg Asp Tyr Asp Arg Leu Ile Ser Pro Val Leu Asn Glu Asn
1205 1210 1215
Asn Ile Phe Tyr Asp Ser Ala Lys Ala Gly Asp Ala Leu Pro Lys
1220 1225 1230
Asp Ala Ala Ala Asn Gly Ala Tyr Cys Ile Ala Leu Lys Gly Leu
1235 1240 1245
Tyr Glu Ile Lys Gln Ile Thr Glu Asn Trp Lys Glu Asp Gly Lys
1250 1255 1260
Phe Ser Arg Asp Lys Leu Lys Ile Ser Asn Lys Asp Trp Phe Asp
1265 1270 1275
Phe Ile Gln Asn Lys Arg Tyr Leu Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys
1280 1285 1290
Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1295 1300
<210> 40
<211> 750
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Met Val Asp Gly Ser Gly Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ile Lys Pro Thr Val Ser Gln Phe Leu Thr Pro Gly Phe Lys
20 25 30
Leu Ile Arg Asn His Ser Arg Thr Ala Gly Leu Lys Leu Lys Asn Glu
35 40 45
Gly Glu Glu Ala Cys Lys Lys Phe Val Arg Glu Asn Glu Ile Pro Lys
50 55 60
Asp Glu Cys Pro Asn Phe Gln Gly Gly Pro Ala Ile Ala Asn Ile Ile
65 70 75 80
Ala Lys Ser Arg Glu Phe Thr Glu Trp Glu Ile Tyr Gln Ser Ser Leu
85 90 95
Ala Ile Gln Glu Val Ile Phe Thr Leu Pro Lys Asp Lys Leu Pro Glu
100 105 110
Pro Ile Leu Lys Glu Glu Trp Arg Ala Gln Trp Leu Ser Glu His Gly
115 120 125
Leu Asp Thr Val Pro Tyr Lys Glu Ala Ala Gly Leu Asn Leu Ile Ile
130 135 140
Lys Asn Ala Val Asn Thr Tyr Lys Gly Val Gln Val Lys Val Asp Asn
145 150 155 160
Lys Asn Lys Asn Asn Leu Ala Lys Ile Asn Arg Lys Asn Glu Ile Ala
165 170 175
Lys Leu Asn Gly Glu Gln Glu Ile Ser Phe Glu Glu Ile Lys Ala Phe
180 185 190
Asp Asp Lys Gly Tyr Leu Leu Gln Lys Pro Ser Pro Asn Lys Ser Ile
195 200 205
Tyr Cys Tyr Gln Ser Val Ser Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Lys Tyr
210 215 220
His Asn Val Asn Leu Pro Glu Glu Tyr Ile Gly Tyr Tyr Arg Lys Ser
225 230 235 240
Asn Glu Pro Ile Val Ser Pro Tyr Gln Phe Asp Arg Leu Arg Ile Pro
245 250 255
Ile Gly Glu Pro Gly Tyr Val Pro Lys Trp Gln Tyr Thr Phe Leu Ser
260 265 270
Lys Lys Glu Asn Lys Arg Arg Lys Leu Ser Lys Arg Ile Lys Asn Val
275 280 285
Ser Pro Ile Leu Gly Ile Ile Cys Ile Lys Lys Asp Trp Cys Val Phe
290 295 300
Asp Met Arg Gly Leu Leu Arg Thr Asn His Trp Lys Lys Tyr His Lys
305 310 315 320
Pro Thr Asp Ser Ile Asn Asp Leu Phe Asp Tyr Phe Thr Gly Asp Pro
325 330 335
Val Ile Asp Thr Lys Ala Asn Val Val Arg Phe Arg Tyr Lys Met Glu
340 345 350
Asn Gly Ile Val Asn Tyr Lys Pro Val Arg Glu Lys Lys Gly Lys Glu
355 360 365
Leu Leu Glu Asn Ile Cys Asp Gln Asn Gly Ser Cys Lys Leu Ala Thr
370 375 380
Val Ala Val Gly Gln Asn Asn Pro Val Ala Ile Gly Leu Phe Glu Leu
385 390 395 400
Lys Lys Val Asn Gly Glu Leu Thr Lys Thr Leu Ile Ser Arg His Pro
405 410 415
Thr Pro Ile Asp Phe Cys Asn Lys Ile Thr Ala Tyr Arg Glu Arg Tyr
420 425 430
Asp Lys Leu Glu Ser Ser Ile Lys Leu Asp Ala Ile Lys Gln Leu Thr
435 440 445
Ser Glu Gln Lys Ile Glu Val Asp Asn Tyr Asn Asn Asn Phe Thr Pro
450 455 460
Gln Asn Thr Lys Gln Ile Val Cys Ser Lys Leu Asn Ile Asn Pro Asn
465 470 475 480
Asp Leu Pro Trp Asp Lys Met Ile Ser Gly Thr His Phe Ile Ser Glu
485 490 495
Lys Ala Gln Val Ser Asn Lys Ser Glu Ile Tyr Phe Thr Ser Thr Asp
500 505 510
Lys Gly Lys Thr Lys Asp Val Met Lys Ser Asp Tyr Lys Trp Phe Gln
515 520 525
Asp Tyr Lys Pro Lys Leu Ser Lys Glu Val Arg Asp Ala Leu Ser Asp
530 535 540
Ile Glu Trp Arg Leu Arg Arg Glu Ser Leu Glu Phe Asn Lys Leu Ser
545 550 555 560
Lys Ser Arg Glu Gln Asp Ala Arg Gln Leu Ala Asn Trp Ile Ser Ser
565 570 575
Met Cys Asp Val Ile Gly Ile Glu Asn Leu Val Lys Lys Asn Asn Phe
580 585 590
Phe Gly Gly Ser Gly Lys Arg Glu Pro Gly Trp Asp Asn Phe Tyr Lys
595 600 605
Pro Lys Lys Glu Asn Arg Trp Trp Ile Asn Ala Ile His Lys Ala Leu
610 615 620
Thr Glu Leu Ser Gln Asn Lys Gly Lys Arg Val Ile Leu Leu Pro Ala
625 630 635 640
Met Arg Thr Ser Ile Thr Cys Pro Lys Cys Lys Tyr Cys Asp Ser Lys
645 650 655
Asn Arg Asn Gly Glu Lys Phe Asn Cys Leu Lys Cys Gly Ile Glu Leu
660 665 670
Asn Ala Asp Ile Asp Val Ala Thr Glu Asn Leu Ala Thr Val Ala Ile
675 680 685
Thr Ala Gln Ser Met Pro Lys Pro Thr Cys Glu Arg Ser Gly Asp Ala
690 695 700
Lys Lys Pro Val Arg Ala Arg Lys Ala Lys Ala Pro Glu Phe His Asp
705 710 715 720
Lys Leu Ala Pro Ser Tyr Thr Val Val Leu Arg Glu Ala Val Lys Arg
725 730 735
Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
740 745 750
<210> 41
<211> 682
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1 5 10 15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
20 25 30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
35 40 45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Lys Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu
50 55 60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65 70 75 80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe
85 90 95
Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu
100 105 110
Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
115 120 125
Ile Tyr Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Ala Ala Gly Ser
145 150 155 160
Met Ser Arg Arg Lys Gln Ala Lys Pro Gln His Phe Gln Ser Asp Pro
165 170 175
Glu Val Ala Ser Leu Pro Arg Arg Asp Gly Asp Thr Glu Lys Gly Gln
180 185 190
Pro Ser Arg Pro Thr Lys Ser Lys Asp Ala His Val Cys Gly Arg Cys
195 200 205
Cys Ala Glu Phe Phe Glu Leu Ser Asp Leu Leu Leu His Lys Lys Asn
210 215 220
Cys Thr Lys Asn Gln Leu Val Leu Ile Val Asn Glu Asn Pro Ala Ser
225 230 235 240
Pro Pro Glu Thr Phe Ser Pro Ser Pro Pro Pro Asp Asn Pro Asp Glu
245 250 255
Gln Met Asn Asp Thr Val Asn Lys Thr Asp Gln Val Asp Cys Ser Asp
260 265 270
Leu Ser Glu His Asn Gly Leu Asp Arg Glu Glu Ser Met Glu Val Glu
275 280 285
Ala Pro Val Ala Asn Lys Ser Gly Ser Gly Thr Ser Ser Gly Ser His
290 295 300
Ser Ser Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly
305 310 315 320
Gly Gly Gly Ser Ser Ser Thr Gly Thr Ser Ala Ile Thr Thr Ser Leu
325 330 335
Pro Gln Leu Gly Asp Leu Thr Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
340 345 350
Gly Ser Met Ser Ala Ala Gly Leu Leu Ala Pro Ala Pro Ala Gln Ala
355 360 365
Gly Ala Pro Pro Ala Pro Glu Tyr Tyr Pro Glu Glu Asp Glu Glu Leu
370 375 380
Glu Ser Ala Glu Asp Asp Glu Arg Ser Cys Arg Gly Arg Glu Ser Asp
385 390 395 400
Glu Asp Thr Glu Asp Ala Ser Glu Thr Asp Leu Ala Lys His Asp Glu
405 410 415
Glu Asp Tyr Val Glu Met Lys Glu Gln Met Tyr Gln Asp Lys Leu Ala
420 425 430
Ser Leu Lys Arg Gln Leu Gln Gln Leu Gln Glu Gly Thr Leu Gln Glu
435 440 445
Tyr Gln Lys Arg Met Lys Lys Leu Asp Gln Gln Tyr Lys Glu Arg Ile
450 455 460
Arg Asn Ala Glu Leu Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Gln Val Glu Arg
465 470 475 480
Asn Tyr Ile Lys Glu Lys Lys Ala Ala Val Lys Glu Phe Glu Asp Lys
485 490 495
Lys Val Glu Leu Lys Glu Asn Leu Ile Ala Glu Leu Glu Glu Lys Lys
500 505 510
Lys Met Ile Glu Asn Glu Lys Leu Thr Met Glu Leu Thr Gly Asp Ser
515 520 525
Met Glu Val Lys Pro Ile Met Thr Arg Lys Leu Arg Arg Arg Pro Asn
530 535 540
Asp Pro Val Pro Ile Pro Asp Lys Arg Arg Lys Pro Ala Pro Ala Gln
545 550 555 560
Leu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gln Ile Met Glu Asp Leu Arg Thr
565 570 575
Leu Asn Lys Leu Lys Ser Pro Lys Arg Pro Ala Ser Pro Ser Ser Pro
580 585 590
Glu His Leu Pro Ala Thr Pro Ala Glu Ser Pro Ala Gln Arg Phe Glu
595 600 605
Ala Arg Ile Glu Asp Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Lys Arg Trp Tyr His
610 615 620
Lys Ser Gln Ala Ile Tyr Leu Glu Ser Lys Asp Asn Gln Lys Leu Ser
625 630 635 640
Cys Val Ile Ser Ser Val Gly Ala Asn Glu Ile Trp Val Arg Lys Thr
645 650 655
Ser Asp Ser Thr Lys Met Arg Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Gln Arg Gly
660 665 670
Leu Phe Val Ile Arg Arg Arg Ser Ala Ala
675 680
<210> 42
<211> 1942
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
Met Ser Ala Ala Gly Leu Leu Ala Pro Ala Pro Ala Gln Ala Gly Ala
1 5 10 15
Pro Pro Ala Pro Glu Tyr Tyr Pro Glu Glu Asp Glu Glu Leu Glu Ser
20 25 30
Ala Glu Asp Asp Glu Arg Ser Cys Arg Gly Arg Glu Ser Asp Glu Asp
35 40 45
Thr Glu Asp Ala Ser Glu Thr Asp Leu Ala Lys His Asp Glu Glu Asp
50 55 60
Tyr Val Glu Met Lys Glu Gln Met Tyr Gln Asp Lys Leu Ala Ser Leu
65 70 75 80
Lys Arg Gln Leu Gln Gln Leu Gln Glu Gly Thr Leu Gln Glu Tyr Gln
85 90 95
Lys Arg Met Lys Lys Leu Asp Gln Gln Tyr Lys Glu Arg Ile Arg Asn
100 105 110
Ala Glu Leu Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Gln Val Glu Arg Asn Tyr
115 120 125
Ile Lys Glu Lys Lys Ala Ala Val Lys Glu Phe Glu Asp Lys Lys Val
130 135 140
Glu Leu Lys Glu Asn Leu Ile Ala Glu Leu Glu Glu Lys Lys Lys Met
145 150 155 160
Ile Glu Asn Glu Lys Leu Thr Met Glu Leu Thr Gly Asp Ser Met Glu
165 170 175
Val Lys Pro Ile Met Thr Arg Lys Leu Arg Arg Arg Pro Asn Asp Pro
180 185 190
Val Pro Ile Pro Asp Lys Arg Arg Lys Pro Ala Pro Ala Gln Leu Asn
195 200 205
Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gln Ile Met Glu Asp Leu Arg Thr Leu Asn
210 215 220
Lys Leu Lys Ser Pro Lys Arg Pro Ala Ser Pro Ser Ser Pro Glu His
225 230 235 240
Leu Pro Ala Thr Pro Ala Glu Ser Pro Ala Gln Arg Phe Glu Ala Arg
245 250 255
Ile Glu Asp Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Lys Arg Trp Tyr His Lys Ser
260 265 270
Gln Ala Ile Tyr Leu Glu Ser Lys Asp Asn Gln Lys Leu Ser Cys Val
275 280 285
Ile Ser Ser Val Gly Ala Asn Glu Ile Trp Val Arg Lys Thr Ser Asp
290 295 300
Ser Thr Lys Met Arg Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Gln Arg Gly Leu Phe
305 310 315 320
Val Ile Arg Arg Arg Ser Ala Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
325 330 335
Ser Gly Ser Met Ser Arg Arg Lys Gln Ala Lys Pro Gln His Phe Gln
340 345 350
Ser Asp Pro Glu Val Ala Ser Leu Pro Arg Arg Asp Gly Asp Thr Glu
355 360 365
Lys Gly Gln Pro Ser Arg Pro Thr Lys Ser Lys Asp Ala His Val Cys
370 375 380
Gly Arg Cys Cys Ala Glu Phe Phe Glu Leu Ser Asp Leu Leu Leu His
385 390 395 400
Lys Lys Asn Cys Thr Lys Asn Gln Leu Val Leu Ile Val Asn Glu Asn
405 410 415
Pro Ala Ser Pro Pro Glu Thr Phe Ser Pro Ser Pro Pro Pro Asp Asn
420 425 430
Pro Asp Glu Gln Met Asn Asp Thr Val Asn Lys Thr Asp Gln Val Asp
435 440 445
Cys Ser Asp Leu Ser Glu His Asn Gly Leu Asp Arg Glu Glu Ser Met
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Thr Ser Leu Pro Gln Leu Gly Asp Leu Thr Gly Ser Gly Gly Gly Ser
515 520 525
Gly Gly Ser Gly Ser Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala
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Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Asp
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Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp
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Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val
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Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala
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Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg
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Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe
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Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu
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<221> misc_feature
<222> (98)..(100)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<400> 85
gacuacgcug aagaccucga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<222> (1)..(2)
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<222> (1)..(3)
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cccggacucg gacgcguggu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
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<212> RNA
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<220>
<223> 合成的
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ccucgcagag cucggagacg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
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<220>
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<221> misc_feature
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gcagccauag ggagccgcac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
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<220>
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cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
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cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
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<220>
<223> 合成的
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auagucgcac agcaacccgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
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<212> RNA
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<223> 合成的
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<220>
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<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
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<222> (1)..(3)
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agauaccgga aguagaguca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
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<220>
<223> 合成的
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uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcum umuu 104
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<220>
<223> 合成的
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<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
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gccgauggug aagugguaag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
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<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
<222> (98)..(100)
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<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
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<220>
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<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(93)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(94)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<400> 107
gcacagcaac ccggguuuua gagcuagaaa uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau 60
caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc uuuu 94
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(94)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(93)
<223> 2'-O-甲基
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gucgcacagc aaccguuuua gagcuagaaa uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau 60
caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc uuuu 94
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<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 2'-O-甲基
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<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(93)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(94)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<400> 109
ggcggugaca cggaguuuua gagcuagaaa uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau 60
caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc uuuu 94
<210> 110
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(94)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(93)
<223> 2'-O-甲基
<400> 110
uccgcgggag agaaguuuua gagcuagaaa uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau 60
caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc uuuu 94
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(93)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(94)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<400> 111
aaaagaaaac aacaguuuua gagcuagaaa uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau 60
caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc uuuu 94
<210> 112
<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(94)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(94)
<223> 2'-O-甲基
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aaaccugaau uccgguuuua gagcuagaaa uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau 60
caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc uuuu 94
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<222> (1)..(2)
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<220>
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cggauacuga cccgguuuua gagcuagaaa uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau 60
caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc uuuu 94
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<223> 2'-O-甲基
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uuugaccuac gaauguuuua gagcuagaaa uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau 60
caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc uuuu 94
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<223> T-LNA
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gcgccgccgg cccagcuaua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuttu 100
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<212> DNA
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<223> 合成的
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<222> (1)..(1)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
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<212> DNA
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<223> T-LNA
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gtgugagagc gguaagaugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuttu 100
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gcgccgccgg cccagcuaua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
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gugugagagc gguaagaugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
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<222> (1)..(2)
<223> 2'-O-甲基
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<222> (1)..(3)
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连接键
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<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-甲基
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ggugguggcu gaguccgugg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
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<222> (1)..(3)
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<221> misc_feature
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<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
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gcagccauag ggagccgcac guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 144
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 2'-O-甲基
<400> 144
ggauggcggc cccuaaccgg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 145
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<400> 145
cagagcgucg ggauaucggg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42
<210> 146
<211> 74
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(74)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(73)
<223> 2'-O-甲基
<400> 146
aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60
ucggugcuuu uuuu 74
<210> 147
<211> 104
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (102)..(104)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<220>
<221> misc_feature
<222> (102)..(103)
<223> 2'-O-甲基
<400> 147
aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuuggccaac augaggauca 60
cccaugucug cagggccaag uggcaccgag ucggugcuuu uuuu 104
<210> 148
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(99)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(98)
<223> 2'-O-甲基
<400> 148
aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60
ucggugcgcg cacaugagga ucacccaugu gcuuuuuuu 99
<210> 149
<211> 98
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(77)
<223> 2ADP
<220>
<221> misc_feature
<222> (96)..(97)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (96)..(98)
<223> 硫代磷酸酯连接键
<400> 149
aacagcauag caaguuaaaa uaaggcuagu ccguuaucaa cuugaaaaag uggcaccgag 60
ucggugcgcg gcccggggau caccacgggc cuuuuuuu 98
<210> 150
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 150
uuaauuucua cucuuguaga uagagugccu agaaagauga ca 42
<210> 151
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 151
uuaauuucua cucuuguaga ucuggacggg ggacaggcug ug 42
<210> 152
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 152
uuaauuucua cucuuguaga uucagauaac ugggccccug cg 42
<210> 153
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 153
uuaauuucua cucuuguaga ucccccuccg gcucggcgcc gg 42
<210> 154
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 154
uuaauuucua cucuuguaga ugccuccgcc uguggaugcu gc 42
<210> 155
<211> 54
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸酯
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)..(54)
<223> 硫代磷酸酯
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(54)
<223> 2'-O-甲基
<400> 155
cuuucaagac uaauagauug cuccuuacga ggagacagag ugccuagaaa gaug 54
<210> 156
<211> 54
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸酯
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)..(53)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)..(54)
<223> 硫代磷酸酯
<400> 156
cuuucaagac uaauagauug cuccuuacga ggagaccugg acgggggaca ggcu 54
<210> 157
<211> 43
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸酯
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(43)
<223> 硫代磷酸酯
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(43)
<223> 2'-O-甲基
<400> 157
aauagauugc uccuuacgag gagaccugga cgggggacag gcu 43
<210> 158
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸酯
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(39)
<223> 硫代磷酸酯
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(38)
<223> 2'-O-甲基
<400> 158
aauagauugc uccuuacgag gagaccugga cgggggaca 39
<210> 159
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 159
gtaacgcgaa ctacgcgggt gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat 60
aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 113
<210> 160
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 160
ggattgttgc gtcccatatc gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat 60
aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 113
<210> 161
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 161
gctcagtcgg gcaagagtcg gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat 60
aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 113
<210> 162
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 162
gactgggcct gaaagggtac gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat 60
aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 113
<210> 163
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 163
gcgccgccgg cccagctata gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat 60
aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 113
<210> 164
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 164
gcggcagcag tagcggtcac gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat 60
aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 113
<210> 165
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 165
ggggggcgga tactgacccg gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat 60
aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 113
<210> 166
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 166
ggtggtggct gagtccgtgg gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat 60
aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tt 112
<210> 167
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 167
ggtggtggct gagtccgtgg gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat 60
aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 113
<210> 168
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 168
gcacagcctg tcccccgtcc gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat 60
aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 113
<210> 169
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 169
gatccgctag gcgcaccgac gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat 60
aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 113
<210> 170
<211> 2046
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 170
atggcttcaa actttactca gttcgtgctc gtggacaatg gtgggacagg ggatgtgaca 60
gtggctcctt ctaatttcgc taatggggtg gcagagtgga tcagctccaa ctcacggagc 120
caggcctaca aggtgacatg cagcgtcagg cagtctagtg cccagaagag aaagtatacc 180
atcaaggtgg aggtccccaa agtggctacc cagacagtgg gcggagtcga actgcctgtc 240
gccgcttgga ggtcctacct gaacatggag ctcactatcc caattttcgc taccaattct 300
gactgtgaac tcatcgtgaa ggcaatgcag gggctcctca aagacggtaa tcctatccct 360
tccgccatcg ccgctaactc aggtatctac agcgctggag gaggtggaag cggaggagga 420
ggaagcggag gaggaggtag cggacctaag aaaaagagga aggtggcggc cgctggatcc 480
atgagtagga gaaaacaagc aaaaccacag cactttcaaa gtgatcctga ggtagcaagc 540
cttccacggc gggacggtga cacggagaag ggtcaaccaa gtcgacccac gaaaagcaaa 600
gatgctcatg tatgtggacg ctgttgcgca gaattttttg aattgtccga tcttcttctt 660
cacaaaaaga actgcacgaa gaatcagttg gttttgatag taaacgaaaa tccagcttca 720
cccccagaaa ctttttcccc gtcacctcct ccagataatc ctgatgaaca aatgaatgac 780
accgtaaata aaaccgacca agtagactgt tctgatttga gcgaacacaa cggtttggat 840
cgagaagagt caatggaagt agaggcccca gttgccaata agtcaggcag cggtacttct 900
tccggctccc acagttcaac agctccatcc tcaagtagtt caagctcttc tagttcagga 960
ggcgggggga gtagctctac cggcacttct gccatcacaa cctcacttcc tcagcttgga 1020
gacttgacag gatccggtgg gggatctggg ggatctggct cgatgtctgc agctggcctt 1080
ttggctcctg cccccgcaca agcgggagct cctcccgcac cggagtacta tccagaagag 1140
gatgaggaac tggaatctgc cgaagacgac gagcgcagtt gccgggggag ggaatctgac 1200
gaggatactg aggatgcttc tgagaccgac ctcgcgaaac atgatgagga agactacgtt 1260
gaaatgaaag agcagatgta ccaagacaaa cttgctagcc tcaagagaca gttgcagcaa 1320
ctgcaagaag gcacgctcca ggagtaccag aagagaatga aaaaactcga ccagcagtac 1380
aaggaacgaa ttagaaacgc agagctcttt cttcagctgg agactgaaca ggttgagcgc 1440
aattatatta aggaaaaaaa agccgctgtg aaggagttcg aagacaagaa agtggaactt 1500
aaagaaaacc tcatcgccga actggaggag aagaagaaga tgatagagaa cgaaaaactc 1560
acaatggaac tgacgggtga ttccatggag gtaaaaccga ttatgacccg aaagctccgc 1620
cgacgcccaa acgatccggt accgatccct gataagcggc gcaagcccgc accggctcag 1680
ctcaattacc tgctgaccga cgaacaaata atggaggacc tgcggactct taataagctg 1740
aagagtccta aacggccagc ttcccccagt tcccccgaac acctgcccgc tactcccgcg 1800
gagagccctg ctcagcgctt tgaggcccga atcgaggacg gaaaattgta ctatgacaaa 1860
cgctggtatc ataagagcca ggctatatac ctggagtcaa aagataacca aaagttgtca 1920
tgtgtaatct cctcagtcgg ggctaacgaa atatgggtgc ggaagacctc tgatagtacg 1980
aagatgcgca tatatctggg acaattgcaa agaggacttt ttgttataag acggagaagc 2040
gctgct 2046
<210> 171
<211> 1942
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 171
Met Ser Ala Ala Gly Leu Leu Ala Pro Ala Pro Ala Gln Ala Gly Ala
1 5 10 15
Pro Pro Ala Pro Glu Tyr Tyr Pro Glu Glu Asp Glu Glu Leu Glu Ser
20 25 30
Ala Glu Asp Asp Glu Arg Ser Cys Arg Gly Arg Glu Ser Asp Glu Asp
35 40 45
Thr Glu Asp Ala Ser Glu Thr Asp Leu Ala Lys His Asp Glu Glu Asp
50 55 60
Tyr Val Glu Met Lys Glu Gln Met Tyr Gln Asp Lys Leu Ala Ser Leu
65 70 75 80
Lys Arg Gln Leu Gln Gln Leu Gln Glu Gly Thr Leu Gln Glu Tyr Gln
85 90 95
Lys Arg Met Lys Lys Leu Asp Gln Gln Tyr Lys Glu Arg Ile Arg Asn
100 105 110
Ala Glu Leu Phe Leu Gln Leu Glu Thr Glu Gln Val Glu Arg Asn Tyr
115 120 125
Ile Lys Glu Lys Lys Ala Ala Val Lys Glu Phe Glu Asp Lys Lys Val
130 135 140
Glu Leu Lys Glu Asn Leu Ile Ala Glu Leu Glu Glu Lys Lys Lys Met
145 150 155 160
Ile Glu Asn Glu Lys Leu Thr Met Glu Leu Thr Gly Asp Ser Met Glu
165 170 175
Val Lys Pro Ile Met Thr Arg Lys Leu Arg Arg Arg Pro Asn Asp Pro
180 185 190
Val Pro Ile Pro Asp Lys Arg Arg Lys Pro Ala Pro Ala Gln Leu Asn
195 200 205
Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gln Ile Met Glu Asp Leu Arg Thr Leu Asn
210 215 220
Lys Leu Lys Ser Pro Lys Arg Pro Ala Ser Pro Ser Ser Pro Glu His
225 230 235 240
Leu Pro Ala Thr Pro Ala Glu Ser Pro Ala Gln Arg Phe Glu Ala Arg
245 250 255
Ile Glu Asp Gly Lys Leu Tyr Tyr Asp Lys Arg Trp Tyr His Lys Ser
260 265 270
Gln Ala Ile Tyr Leu Glu Ser Lys Asp Asn Gln Lys Leu Ser Cys Val
275 280 285
Ile Ser Ser Val Gly Ala Asn Glu Ile Trp Val Arg Lys Thr Ser Asp
290 295 300
Ser Thr Lys Met Arg Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Gln Arg Gly Leu Phe
305 310 315 320
Val Ile Arg Arg Arg Ser Ala Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
325 330 335
Ser Gly Ser Met Ser Arg Arg Lys Gln Ala Lys Pro Gln His Phe Gln
340 345 350
Ser Asp Pro Glu Val Ala Ser Leu Pro Arg Arg Asp Gly Asp Thr Glu
355 360 365
Lys Gly Gln Pro Ser Arg Pro Thr Lys Ser Lys Asp Ala His Val Cys
370 375 380
Gly Arg Cys Cys Ala Glu Phe Phe Glu Leu Ser Asp Leu Leu Leu His
385 390 395 400
Lys Lys Asn Cys Thr Lys Asn Gln Leu Val Leu Ile Val Asn Glu Asn
405 410 415
Pro Ala Ser Pro Pro Glu Thr Phe Ser Pro Ser Pro Pro Pro Asp Asn
420 425 430
Pro Asp Glu Gln Met Asn Asp Thr Val Asn Lys Thr Asp Gln Val Asp
435 440 445
Cys Ser Asp Leu Ser Glu His Asn Gly Leu Asp Arg Glu Glu Ser Met
450 455 460
Glu Val Glu Ala Pro Val Ala Asn Lys Ser Gly Ser Gly Thr Ser Ser
465 470 475 480
Gly Ser His Ser Ser Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
485 490 495
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Thr Gly Thr Ser Ala Ile Thr
500 505 510
Thr Ser Leu Pro Gln Leu Gly Asp Leu Thr Gly Ser Gly Gly Gly Ser
515 520 525
Gly Gly Ser Gly Ser Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala
530 535 540
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Asp
545 550 555 560
Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp
565 570 575
Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val
580 585 590
Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala
595 600 605
Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg
610 615 620
Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu
625 630 635 640
Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe
645 650 655
His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu
660 665 670
Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu
675 680 685
Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr
690 695 700
Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile
705 710 715 720
Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn
725 730 735
Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln
740 745 750
Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala
755 760 765
Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile
770 775 780
Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile
785 790 795 800
Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu
805 810 815
Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp
820 825 830
Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe
835 840 845
Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu
850 855 860
Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile
865 870 875 880
Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu
885 890 895
Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln
900 905 910
Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu
915 920 925
Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr
930 935 940
Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln
945 950 955 960
Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu
965 970 975
Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys
980 985 990
Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr
995 1000 1005
Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met
1010 1015 1020
Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
1025 1030 1035
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met
1040 1045 1050
Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys
1055 1060 1065
His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr
1070 1075 1080
Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu
1085 1090 1095
Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr
1100 1105 1110
Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys
1115 1120 1125
Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp
1130 1135 1140
Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile
1145 1150 1155
Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile
1160 1165 1170
Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu
1175 1180 1185
Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp
1190 1195 1200
Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly
1205 1210 1215
Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser
1220 1225 1230
Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn
1235 1240 1245
Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys
1250 1255 1260
Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
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His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys
1280 1285 1290
Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val
1295 1300 1305
Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg
1310 1315 1320
Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg
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Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile
1340 1345 1350
Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys
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Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp
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Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His
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Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys
1400 1405 1410
Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val
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Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln
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Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu
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Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly
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Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His
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Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn
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Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile
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Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln
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Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala
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Lys Lys Lys Lys
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<223> 合成的
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atgtctgcag ctggcctttt ggctcctgcc cccgcacaag cgggagctcc tcccgcaccg 60
gagtactatc cagaagagga tgaggaactg gaatctgccg aagacgacga gcgcagttgc 120
cgggggaggg aatctgacga ggatactgag gatgcttctg agaccgacct cgcgaaacat 180
gatgaggaag actacgttga aatgaaagag cagatgtacc aagacaaact tgctagcctc 240
aagagacagt tgcagcaact gcaagaaggc acgctccagg agtaccagaa gagaatgaaa 300
aaactcgacc agcagtacaa ggaacgaatt agaaacgcag agctctttct tcagctggag 360
actgaacagg ttgagcgcaa ttatattaag gaaaaaaaag ccgctgtgaa ggagttcgaa 420
gacaagaaag tggaacttaa agaaaacctc atcgccgaac tggaggagaa gaagaagatg 480
atagagaacg aaaaactcac aatggaactg acgggtgatt ccatggaggt aaaaccgatt 540
atgacccgaa agctccgccg acgcccaaac gatccggtac cgatccctga taagcggcgc 600
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cggactctta ataagctgaa gagtcctaaa cggccagctt cccccagttc ccccgaacac 720
ctgcccgcta ctcccgcgga gagccctgct cagcgctttg aggcccgaat cgaggacgga 780
aaattgtact atgacaaacg ctggtatcat aagagccagg ctatatacct ggagtcaaaa 840
gataaccaaa agttgtcatg tgtaatctcc tcagtcgggg ctaacgaaat atgggtgcgg 900
aagacctctg atagtacgaa gatgcgcata tatctgggac aattgcaaag aggacttttt 960
gttataagac ggagaagcgc tgctggatcc ggtgggggat ctgggggatc tggctcgatg 1020
agtaggagaa aacaagcaaa accacagcac tttcaaagtg atcctgaggt agcaagcctt 1080
ccacggcggg acggtgacac ggagaagggt caaccaagtc gacccacgaa aagcaaagat 1140
gctcatgtat gtggacgctg ttgcgcagaa ttttttgaat tgtccgatct tcttcttcac 1200
aaaaagaact gcacgaagaa tcagttggtt ttgatagtaa acgaaaatcc agcttcaccc 1260
ccagaaactt tttccccgtc acctcctcca gataatcctg atgaacaaat gaatgacacc 1320
gtaaataaaa ccgaccaagt agactgttct gatttgagcg aacacaacgg tttggatcga 1380
gaagagtcaa tggaagtaga ggccccagtt gccaataagt caggcagcgg tacttcttcc 1440
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ttgacaggat ccggtggggg atctggggga tctggctcga tggattacaa agacgatgac 1620
gataagatgg ccccaaagaa gaagcggaag gtcggtatcc acggagtccc agcagccgac 1680
aagaagtaca gcatcggcct ggacatcggc accaactctg tgggctgggc cgtgatcacc 1740
gacgagtaca aggtgcccag caagaaattc aaggtgctgg gcaacaccga ccggcacagc 1800
atcaagaaga acctgatcgg agccctgctg ttcgacagcg gcgaaacagc cgaggccacc 1860
cggctgaaga gaaccgccag aagaagatac accagacgga agaaccggat ctgctatctg 1920
caagagatct tcagcaacga gatggccaag gtggacgaca gcttcttcca cagactggaa 1980
gagtccttcc tggtggaaga ggataagaag cacgagcggc accccatctt cggcaacatc 2040
gtggacgagg tggcctacca cgagaagtac cccaccatct accacctgag aaagaaactg 2100
gtggacagca ccgacaaggc cgacctgcgg ctgatctatc tggccctggc ccacatgatc 2160
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Met Ala Ser Pro Ala Asp Ser Cys Ile Gln Phe Thr Arg His Ala Ser
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Asp Val Leu Leu Asn Leu Asn Arg Leu Arg Ser Arg Asp Ile Leu Thr
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Asp Val Val Ile Val Val Ser Arg Glu Gln Phe Arg Ala His Lys Thr
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Val Leu Met Ala Cys Ser Gly Leu Phe Tyr Ser Ile Phe Thr Asp Gln
50 55 60
Leu Lys Cys Asn Leu Ser Val Ile Asn Leu Asp Pro Glu Ile Asn Pro
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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1 5 10 15
Asp Leu Lys Thr Ile Lys Thr Ala Tyr Arg Arg Leu Ala Arg Lys Tyr
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Tyr Asp Gln Met Trp Gln His Arg Asn Asp Pro Gln Phe Asn Arg Gln
65 70 75 80
Phe His His Gly Asp Gly Gln Ser Phe Asn Ala Glu Asp Phe Asp Asp
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100 105 110
Pro Ala Thr Arg Gly His Asp Ile Glu Ile Glu Val Ala Val Phe Leu
115 120 125
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210 215 220
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245 250 255
Gly Leu Val Ser Lys Lys Gln Thr Gly Asp Leu Tyr Ala Val Leu Lys
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Ser Leu Asp Asp Phe Leu Ile Lys Gln
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<223> 合成的
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atggatgact attatagggg ctttatatcc gagacactga gcagcattga tgatatagac 300
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gagaaatatg gcgaatttat cacccaggaa gggatttcct tctataatga catttgcggc 840
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tacaagttcg agagtgatga ggaggtgtat caatctgtca atggtttcct tgataatatt 1020
tcttctaagc atattgttga acgactccga aagataggag acaactataa tggatacaat 1080
ttggataaaa tctacatcgt gtctaaattt tacgagagtg tgtcacaaaa aacatataga 1140
gactgggaga caattaatac cgccctggag atacattaca acaatatact tcccgggaac 1200
gggaagtcta aggcagacaa ggtgaagaaa gccgtgaaga acgacttgca aaagtcaatt 1260
accgaaatca atgagcttgt ttcaaactat aaactttgtt cagatgacaa tattaaagcc 1320
gaaacctata ttcatgaaat ctctcatatt ctgaataact ttgaggcgca agaactgaaa 1380
tataacccag aaatacacct cgttgagtcc gaactgaaag caagcgaact gaaaaatgtt 1440
ttggacgtga taatgaacgc ttttcattgg tgctcagtct ttatgacaga ggagcttgtt 1500
gacaaggata acaatttcta tgcggaactg gaagagattt acgacgaaat ctatccggtc 1560
atatccctgt ataacctggt tcgcaactat gtcacgcaaa aaccatacag cacgaagaag 1620
attaaactga actttggtat tccgacgctg gccgatggat ggtcaaaatc taaggaatac 1680
tcaaacaatg ccataatcct gatgcgagat aacctctact accttggaat ctttaatgct 1740
aaaaataaac ccgataaaaa aattatcgaa gggaacacga gtgaaaacaa aggtgattat 1800
aaaaaaatga tatataatct gcttccagga ccaaataaga tgatacccaa agttttcctt 1860
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caaaataaac atatcaaatc atctaaggat tttgacatta cgttctgtca tgatttgatt 1980
gactatttca aaaattgcat agccattcat ccagagtgga aaaactttgg gtttgacttc 2040
tctgatacca gtacatatga agacataagt ggattttacc gagaagtaga gctccaaggt 2100
tataaaatag actggaccta tatatctgaa aaggatatag accttttgca agagaaggga 2160
cagctttatc ttttccaaat ctacaacaaa gacttcagta agaaaagtac cgggaatgac 2220
aatcttcata ccatgtatct gaagaacctg ttctccgaag aaaatctgaa ggacatagtc 2280
ctgaagctta atggcgaagc ggaaattttt ttccgaaaga gctctattaa gaaccccata 2340
atacataaga agggaagcat tctcgttaat cgaacgtatg aggccgaaga gaaagatcaa 2400
tttgggaata tccaaatcgt tcgaaagaac ataccagaaa atatttacca agaattgtac 2460
aaatatttta acgataaaag cgacaaagaa ctgtctgatg aagctgctaa gctgaaaaac 2520
gtcgtcggcc atcatgaggc cgcgacgaat atagtcaagg attaccgata tacatacgat 2580
aagtatttcc tgcatatgcc catcactatc aactttaagg caaataagac tggattcatt 2640
aatgacagaa tactgcaata catagctaaa gaaaaagatt tgcatgttat tggcattgcc 2700
aggggtgagc gcaatcttat ctatgtaagc gtcattgata cttgcgggaa tatcgtagag 2760
cagaagtcat ttaatattgt aaatgggtac gattaccaaa tcaagttgaa gcagcaagag 2820
ggagcacgac agattgcccg caaggagtgg aaagagatcg gaaagataaa ggagatcaag 2880
gaggggtatt tgtcccttgt tatacacgaa atttccaaga tggtaatcaa gtacaacgct 2940
ataattgcta tggcggatct ctcctatgga tttaaaaagg gaagatttaa agtcgagcgg 3000
caggtatatc agaaatttga aacaatgctt attaataaac ttaattatct cgttttcaaa 3060
gacattagta tcaccgaaaa cggtgggctg ttgaagggct atcaacttac gtacatacca 3120
gataagctta agaatgtggg tcaccaatgc ggatgcatat tctacgtgcc cgcagcttat 3180
acaagcaaaa tcgacccaac aacgggtttc gtaaacatat ttaagttcaa ggatctcacc 3240
gtggatgcca agcgagagtt cataaaaaaa tttgactcaa tcagatatga ctcagaaaag 3300
aatctttttt gttttacctt cgactacaat aatttcatta cacaaaatac ggttatgagc 3360
aagtcatcct ggtccgtata tacgtatgga gtgcgcataa agcggagatt cgttaacggg 3420
cgattttcta atgagtccga tacaatcgat ataacaaagg atatggaaaa aactctggaa 3480
atgactgata taaattggag ggacggtcat gacctcaggc aagacattat cgattatgag 3540
atcgtgcaac atatttttga gatctttcgg ttgactgtcc aaatgaggaa ctctctgtct 3600
gaattggaag atagggacta cgatcgcctg ataagccccg tgttgaacga gaataacata 3660
ttctacgatt ccgcgaaagc cggggatgcg ctccctaagg acgccgctgc aaatggggcc 3720
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gacgggaagt ttagtcggga taaactgaag atatccaaca aggactggtt tgactttatc 3840
caaaataagc gatatttgaa gcgtcctgct gctactaaga aagctggtca agctaagaaa 3900
aagaaa 3906
<210> 179
<211> 2250
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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atggtcgacg ggagcgggcc ggcagctaaa cgggtgaagt tggacagtgg tggaattaaa 60
cctacagttt ctcagtttct tacccctggt tttaagctga taagaaacca tagtcggacg 120
gctggactta agctgaagaa tgagggcgaa gaggcatgca agaagttcgt acgggagaac 180
gaaattccca aagatgaatg tccaaacttt caaggtggac ccgcaatcgc gaacattata 240
gccaagagtc gcgaatttac cgagtgggaa atatatcaaa gttcactggc gatccaagag 300
gtgattttca ccttgccgaa ggataagctg cccgagccta tactcaagga agaatggcgc 360
gcccaatggt tgagcgaaca cggcctcgat acggtgcctt acaaggaagc tgccggactt 420
aatttgataa ttaagaacgc ggtcaacact tacaaagggg tccaggtgaa agtcgataat 480
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
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Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
20 25 30
Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
35 40 45
Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
50 55 60
Val His Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser
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Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
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Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu
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Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln
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<220>
<223> 合成的
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Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg
1 5 10 15
Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile
20 25 30
Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg
85 90 95
Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser
100 105 110
Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu
115 120 125
Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe
130 135 140
Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile
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Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu
165 170 175
Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His
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Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg
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Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly
245 250 255
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260 265 270
Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys
275 280 285
Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu
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305 310 315 320
Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu
325 330 335
Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu
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355 360 365
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370 375 380
Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe
385 390 395 400
Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val
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Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu
435 440 445
Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys
450 455 460
Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu
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Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu
485 490 495
Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser
500 505 510
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515 520 525
Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr
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Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu
565 570 575
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Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val
595 600 605
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Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile
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Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met
645 650 655
Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val
660 665 670
Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser
675 680 685
Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile
690 695 700
Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln
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Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala
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Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val
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Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu
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Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp
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Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys
865 870 875 880
Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro
885 890 895
Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu
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Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala
915 920 925
Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg
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Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu
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Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile
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Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr
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Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu
1040 1045 1050
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1055 1060 1065
Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg
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Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val
1085 1090 1095
Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser
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Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys
1130 1135 1140
Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly
1145 1150 1155
Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys
1160 1165 1170
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Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn
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Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly
1235 1240 1245
Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu
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Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu
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Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu
1280 1285 1290
Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala
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Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg
1310 1315 1320
Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe
1325 1330 1335
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1355 1360 1365
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1385 1390 1395
Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
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ttcatcaaga gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa agcacgtggc acagatcctg 2880
gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga agtgaaagtg 2940
atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt ttacaaagtg 3000
cgcgagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc tgaacgccgt cgtgggaacc 3060
gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga ctacaaggtg 3120
tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc taccgccaag 3180
tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct ggccaacggc 3240
gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat cgtgtgggat 3300
aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt gaatatcgtg 3360
aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc caagaggaac 3420
agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg cggcttcgac 3480
agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg caagtccaag 3540
aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag cagcttcgag 3600
aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa ggacctgatc 3660
atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag aatgctggcc 3720
tctgccggcg aactgcagaa gggaaacgaa ctggccctgc cctccaaata tgtgaacttc 3780
ctgtacctgg ccagccacta tgagaagctg aagggctccc ccgaggataa tgagcagaaa 3840
cagctgtttg tggaacagca caagcactac ctggacgaga tcatcgagca gatcagcgag 3900
ttctccaaga gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca aagtgctgtc cgcctacaac 3960
aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct gtttaccctg 4020
accaatctgg gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca ccaccatcga ccggaagagg 4080
tacaccagca ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc accagagcat caccggcctg 4140
tacgagacac ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca agcgtcctgc tgctactaag 4200
aaagctggtc aagctaagaa aaagaaa 4227
<210> 184
<211> 1566
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 184
atgagtagga gaaaacaagc aaaaccacag cactttcaaa gtgatcctga ggtagcaagc 60
cttccacggc gggacggtga cacggagaag ggtcaaccaa gtcgacccac gaaaagcaaa 120
gatgctcatg tatgtggacg ctgttgcgca gaattttttg aattgtccga tcttcttctt 180
cacaaaaaga actgcacgaa gaatcagttg gttttgatag taaacgaaaa tccagcttca 240
cccccagaaa ctttttcccc gtcacctcct ccagataatc ctgatgaaca aatgaatgac 300
accgtaaata aaaccgacca agtagactgt tctgatttga gcgaacacaa cggtttggat 360
cgagaagagt caatggaagt agaggcccca gttgccaata agtcaggcag cggtacttct 420
tccggctccc acagttcaac agctccatcc tcaagtagtt caagctcttc tagttcagga 480
ggcgggggga gtagctctac cggcacttct gccatcacaa cctcacttcc tcagcttgga 540
gacttgacag gatccggtgg gggatctggg ggatctggct cgatgtctgc agctggcctt 600
ttggctcctg cccccgcaca agcgggagct cctcccgcac cggagtacta tccagaagag 660
gatgaggaac tggaatctgc cgaagacgac gagcgcagtt gccgggggag ggaatctgac 720
gaggatactg aggatgcttc tgagaccgac ctcgcgaaac atgatgagga agactacgtt 780
gaaatgaaag agcagatgta ccaagacaaa cttgctagcc tcaagagaca gttgcagcaa 840
ctgcaagaag gcacgctcca ggagtaccag aagagaatga aaaaactcga ccagcagtac 900
aaggaacgaa ttagaaacgc agagctcttt cttcagctgg agactgaaca ggttgagcgc 960
aattatatta aggaaaaaaa agccgctgtg aaggagttcg aagacaagaa agtggaactt 1020
aaagaaaacc tcatcgccga actggaggag aagaagaaga tgatagagaa cgaaaaactc 1080
acaatggaac tgacgggtga ttccatggag gtaaaaccga ttatgacccg aaagctccgc 1140
cgacgcccaa acgatccggt accgatccct gataagcggc gcaagcccgc accggctcag 1200
ctcaattacc tgctgaccga cgaacaaata atggaggacc tgcggactct taataagctg 1260
aagagtccta aacggccagc ttcccccagt tcccccgaac acctgcccgc tactcccgcg 1320
gagagccctg ctcagcgctt tgaggcccga atcgaggacg gaaaattgta ctatgacaaa 1380
cgctggtatc ataagagcca ggctatatac ctggagtcaa aagataacca aaagttgtca 1440
tgtgtaatct cctcagtcgg ggctaacgaa atatgggtgc ggaagacctc tgatagtacg 1500
aagatgcgca tatatctggg acaattgcaa agaggacttt ttgttataag acggagaagc 1560
gctgct 1566

Claims (106)

1.Cas融合蛋白，其包含Cas蛋白以及SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域中的一者或两者。
2.根据权利要求1所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas融合蛋白包含SALL1抑制结构域。
3.根据权利要求1所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas融合蛋白包含SUDS3抑制结构域。
4.根据权利要求1所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas融合蛋白包含SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的Cas融合蛋白，其还包含额外的抑制结构域，其中所述额外的抑制结构域是不同于SALL1抑制结构域或SUDS3抑制结构域的抑制结构域。
6.根据权利要求5所述的Cas融合蛋白，其中所述额外的抑制结构域是NIPP1抑制结构域。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白是无催化活性的。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白是切口酶。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白为活性或失活形式的Cas9。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白是V型Cas蛋白。
11.根据权利要求10所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白选自由Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12h、Cas12i和Cas12j组成的组。
12.根据权利要求11所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白是Cas12a。
13.根据权利要求1至4中任一项所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas融合蛋白还包含Cas接头。
14.根据权利要求13所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas接头是包含与SEQ ID NO:7具有至少80％相似性的序列的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas接头包含SEQ ID NO:7。
16.根据权利要求15所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas接头是SEQ ID NO:7。
17.根据权利要求13所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白具有N末端氨基酸，并且所述Cas融合蛋白包含SUDS3抑制结构域，并且所述Cas接头与所述Cas融合蛋白的SUDS3抑制结构域和N末端氨基酸结合。
18.根据权利要求13所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白具有N末端氨基酸，并且所述Cas融合蛋白包含SALL1抑制结构域，并且所述Cas接头与所述Cas融合蛋白的SALL1抑制结构域和N末端氨基酸结合。
19.根据权利要求13所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白具有C末端氨基酸，并且所述Cas融合蛋白包含SUDS3抑制结构域，并且所述Cas接头与所述Cas融合蛋白的SUDS3抑制结构域和C末端氨基酸结合。
20.根据权利要求13所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白具有C末端氨基酸，并且所述Cas融合蛋白包含SALL1抑制结构域，并且所述Cas接头与所述Cas融合蛋白的SALL1抑制结构域和C末端氨基酸结合。
21.根据权利要求2或权利要求4所述的Cas融合蛋白，其中所述SALL1抑制结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少80％相似性的序列。
22.根据权利要求2或权利要求4所述的Cas融合蛋白，其中所述SALL1抑制结构域包含SEQ ID NO:1。
23.根据权利要求3或权利要求4所述的Cas融合蛋白，其中所述SUDS3抑制结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少80％相似性的序列。
24.根据权利要求3或权利要求4所述的Cas融合蛋白，其中所述SUDS3抑制结构域包含SEQ ID NO:2。
25.根据权利要求4所述的Cas融合蛋白，其中所述SALL1抑制结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少80％相似性的序列，并且所述SUDS3抑制结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少80％相似性的序列。
26.根据权利要求25所述的Cas融合蛋白，其中所述SALL1抑制结构域包含SEQ ID NO:1，并且所述SUDS3抑制结构域包含SEQ ID NO:2。
27.根据权利要求25所述的Cas融合蛋白，其中所述SALL1抑制结构域是SEQ ID NO:1，并且所述SUDS3抑制结构域是SEQ ID NO:2。
28.根据权利要求4所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白是dCas9蛋白，其中所述dCas9蛋白具有C末端氨基酸，并且所述Cas融合蛋白还包含Cas接头和抑制接头，其中所述Cas接头与dCas9蛋白的C末端氨基酸和SALL1抑制结构域的N末端氨基酸共价结合，并且其中所述抑制接头与SALL1抑制结构域的C末端氨基酸和SUDS3抑制结构域的N末端氨基酸结合。
29.根据权利要求4所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白是dCas9蛋白，其中所述dCas9蛋白具有C末端氨基酸，并且所述Cas融合蛋白还包含Cas接头和抑制接头，其中所述Cas接头与所述dCas9蛋白的C末端氨基酸和SUDS3抑制结构域共价结合，并且其中所述抑制接头与所述SUDS3抑制结构域和SALL1抑制结构域结合。
30.根据权利要求4所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白是dCas9蛋白，其中所述dCas9蛋白具有N末端氨基酸，并且所述Cas融合蛋白还包含Cas接头和抑制接头，其中所述Cas接头与dCas9蛋白的N末端氨基酸和SALL1抑制结构域共价结合，并且其中所述抑制接头与SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域结合。
31.根据权利要求4所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白是dCas9蛋白，其中所述dCas9蛋白具有N末端氨基酸，并且所述Cas融合蛋白还包含Cas接头和抑制接头，其中所述Cas接头与所述dCas9蛋白的N末端氨基酸和SUDS3抑制结构域共价结合，并且其中所述抑制接头与所述SUDS3抑制结构域和SALL1抑制结构域结合。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas接头和所述抑制接头各自包含长度为3至90个氨基酸的氨基酸序列。
33.根据权利要求32所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas接头和所述抑制接头各自包含SEQ ID NO:7。
34.根据权利要求33所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas接头和所述抑制接头各自是SEQID NO:7。
35.根据权利要求4所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白是Cas12a蛋白，其中所述Cas12a蛋白具有C末端氨基酸，并且所述Cas融合蛋白还包含Cas接头和抑制接头，其中所述Cas接头与所述Cas12a蛋白的C末端氨基酸和SALL1抑制结构域共价结合，并且其中所述抑制接头与SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域结合。
36.根据权利要求4所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白是Cas12a蛋白，其中所述Cas12a蛋白具有C末端氨基酸，并且所述Cas融合蛋白还包含Cas接头和抑制接头，其中所述Cas接头与所述Cas12a蛋白的C末端氨基酸和SUDS3抑制结构域共价结合，并且其中所述抑制接头与SUDS3抑制结构域和SALL1抑制结构域结合。
37.根据权利要求4所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白是Cas12a蛋白，其中所述Cas12a蛋白具有N末端氨基酸，并且所述Cas融合蛋白还包含Cas接头和抑制接头，其中所述Cas接头与Cas12a蛋白的N末端氨基酸和SALL1抑制结构域共价结合，并且其中所述抑制接头与SALL1抑制物和SUDS3抑制结构域结合。
38.根据权利要求4所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas蛋白是Cas12a蛋白，其中所述Cas12a蛋白具有N末端氨基酸，并且所述Cas融合蛋白还包含Cas接头和抑制接头，其中所述Cas接头与所述Cas12a蛋白的N末端氨基酸和SUDS3抑制结构域共价结合，并且其中所述抑制接头与SUDS3抑制结构域和SALL1抑制结构域结合。
39.根据权利要求35至38中任一项所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas接头和所述抑制接头各自包含SEQ ID NO:7。
40.根据权利要求39所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas接头和所述抑制接头各自是SEQID NO:7。
41.根据权利要求40所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas接头和所述抑制接头各自包含SEQ ID NO:7。
42.根据权利要求41所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas接头和所述抑制接头各自是SEQID NO:7。
43.根据权利要求4所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas融合蛋白包含与SEQ ID NO:10具有至少80％相似性的序列。
44.根据权利要求43所述的Cas融合蛋白，其中所述Cas融合蛋白包含SEQ ID NO:10的序列。
45.核酸，其编码权利要求1至44中任一项所述的Cas融合蛋白。
46.根据权利要求45所述的核酸，其中所述核酸存在于载体中。
47.根据权利要求46所述的核酸，其中所述载体是质粒或病毒载体。
48.根据权利要求47所述的核酸，其中所述核酸存在于病毒载体，所述病毒载体选自由慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、冠状病毒和仙台病毒组成的组中。
49.调节真核细胞中靶核酸表达的方法，其包括向细胞提供gRNA和权利要求1至44中任一项所述的Cas融合蛋白。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述gRNA是在细胞外合成的，并且其中通过向细胞引入编码Cas融合蛋白的mRNA来向细胞提供Cas融合蛋白。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述真核细胞是酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞。
54.根据权利要求49所述的方法，其中所述提供包括从载体获得gRNA和Cas融合蛋白，其中所述载体编码gRNA和Cas融合蛋白。
55.根据权利要求49所述的方法，其还包括在细胞外合成gRNA和在细胞外合成Cas融合。
56.调节真核细胞中靶核酸表达的方法，所述方法包括向细胞提供权利要求1至44中任一项所述的Cas融合蛋白和RNA-抑制结构域复合物，其中RNA-抑制结构域复合物包含：
(a)gRNA分子，其中所述gRNA分子包含30至180个核苷酸；
(b)配体结合部分，其中所述配体结合部分或者(i)直接与gRNA分子结合，或者(ii)通过配体结合部分接头与gRNA分子结合；
(c)配体，其中所述配体能够与配体结合部分可逆地结合；和
(d)抑制结构域，其中所述抑制结构域或者(i)直接与配体结合，或者(ii)通过配体接头与配体结合。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述真核细胞是人类细胞。
58.试剂盒，其包含权利要求1至44中所述的Cas融合蛋白和RNA抑制结构域复合物，其中所述RNA抑制结构域复合物包含：
(a)gRNA分子，其中所述gRNA分子包含30至180个核苷酸；
(b)配体结合部分，其中所述配体结合部分或者(i)直接与gRNA分子结合，或者(ii)通过配体结合部分接头与gRNA分子结合；
(c)配体，其中所述配体能够与配体结合部分可逆地结合；和
(d)抑制结构域，其中所述抑制结构域或者(i)直接与配体结合，或者(ii)通过配体接头与配体结合。
59.RNA抑制结构域复合物，其中所述RNA抑制结构域复合物包含：
(a)gRNA分子，其中所述gRNA分子包含30至180个核苷酸；
(b)配体结合部分，其中所述配体结合部分或者(i)直接与gRNA分子结合，或者(ii)通过配体结合部分接头与gRNA分子结合；
(c)配体，其中所述配体能够与配体结合部分可逆地结合；和
(d)融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SALL1抑制结构域和SUDS3抑制结构域，并且其中所述融合蛋白或者(i)直接与配体结合，或者(ii)通过配体接头与配体结合。
60.根据权利要求59所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述gRNA分子包含crRNA序列。
61.根据权利要求60所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述crRNA序列包含靶向序列，其中所述靶向序列的长度为12至30个核苷酸。
62.根据权利要求60所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述gRNA分子还包含tracrRNA序列。
63.根据权利要求59所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述gRNA分子包含tracrRNA序列。
64.根据权利要求59所述的RNA抑制结构域复合物，其包含所述配体接头，其中所述配体接头是氨基酸序列。
65.根据权利要求59至64中任一项所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述gRNA为sgRNA分子，且所述sgRNA分子具有3’末端，且所述配体结合部分在所述3’末端与所述gRNA分子连接。
66.根据权利要求59至64中任一项所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述gRNA分子为sgRNA分子，且所述sgRNA分子具有5’末端，且所述配体结合部分在所述5’末端与所述gRNA分子连接。
67.根据权利要求59至64中任一项所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述gRNA分子为sgRNA分子，且所述sgRNA分子形成至少一个茎环结构，且所述配体结合部分在所述至少一个茎环结构中的其中一个与所述gRNA分子连接。
68.根据权利要求67所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述茎环结构中的至少一个茎环结构的长度为4至40个核苷酸。
69.根据权利要求59至64中任一项所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述gRNA是sgRNA分子，且所述sgRNA分子包含至少一个2’修饰的核苷酸。
70.根据权利要求59至64中任一项所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述gRNA分子是sgRNA分子，且所述sgRNA分子包含至少一个硫代磷酸酯连接键。
71.根据权利要求59至64中任一项所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述gRNA分子是sgRNA，且所述sgRNA包含tracrRNA序列和crRNA序列。
72.根据权利要求59至64中任一项所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述gRNA分子包含第一RNA分子和第二RNA分子，其中所述第一RNA分子包含tracrRNA序列，所述第二RNA分子包含crRNA序列，所述tracrRNA序列包含反重复区，且所述crRNA序列包含Cas结合区，其中所述反重复区和所述Cas结合区在至少18个核苷酸的跨度上至少80％互补。
73.根据权利要求72所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述第一RNA分子和所述第二RNA分子各自具有3’末端，且所述配体结合部分与所述第一RNA分子的3’末端或所述第二RNA分子的3’末端连接。
74.根据权利要求72所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述第一RNA分子和所述第二RNA分子各自具有5’末端，且所述配体结合部分与所述第一RNA分子的5’末端或所述第二RNA分子的5’末端连接。
75.根据权利要求72所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述第一RNA分子和所述第二RNA分子中的任一者或两者包含至少一个2’修饰的核苷酸。
76.根据权利要求72所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述第一RNA分子和所述第二RNA分子中的任一者或两者包含至少一个硫代磷酸酯连接键。
77.根据权利要求59所述的RNA抑制结构域复合物，其还包含Cas蛋白。
78.根据权利要求77所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述Cas蛋白是II型Cas蛋白。
79.根据权利要求78所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述Cas蛋白是失活的。
80.根据权利要求78所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述Cas蛋白是dCas9。
81.根据权利要求77所述的RNA抑制结构域，其中所述Cas蛋白是V型Cas蛋白。
82.根据权利要求81所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述Cas蛋白是失活的。
83.根据权利要求82所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述Cas蛋白是dCas12a。
84.根据权利要求59所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述配体选自由以下项组成的组：MS2、Ku、PP7、SfMu、Sm7、Tat、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、CSY4、Qbeta、COM、pumilio、lambda N22和PDGFβ链。
85.根据权利要求84所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述配体是MS2。
86.根据权利要求59所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述融合蛋白包含与SEQ IDNO:10具有至少80％相似性的序列。
87.根据权利要求86所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述Cas融合蛋白包含SEQ IDNO:10的序列。
88.用于转录抑制的方法，其包括将权利要求59至87中任一项所述的RNA抑制结构域复合物暴露于双链DNA中。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述方法在体外进行。
90.根据权利要求88所述的方法，其中所述方法在体内进行。
91.根据权利要求88所述的方法，其中所述方法离体进行。
92.试剂盒，其包含权利要求59至87中任一项所述的RNA抑制结构域复合物。
93.治疗受试者的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求1至44中任一项所述的Cas融合蛋白。
94.根据权利要求93所述的方法，其还包括施用gRNA。
95.根据权利要求94所述的方法，其还包括施用编码所述gRNA的mRNA。
96.治疗受试者的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求59至76中任一项所述的抑制结构域复合物。
97.根据权利要求96所述的方法，其还包括施用Cas蛋白。
98.根据权利要求97所述的方法，其还包括施用编码Cas蛋白的mRNA。
99.根据权利要求59至63中任一项所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述gRNA具有：
(a)第一个和第二个5’端核苷酸上的2’-O-甲基修饰，
(b)倒数第二个3’核苷酸和倒数第三个3’核苷酸上的2’-O-甲基修饰，和
(c)第一个和第二个5’端核苷酸之间、第二个和第三个5’端核苷酸之间、倒数第三个3’核苷酸和倒数第二个3’核苷酸之间、倒数第二个3’核苷酸和3’端核苷酸之间的硫代磷酸酯连接键，和
其中所有其它核苷酸间连接键是磷酸二酯连接键，所有其它核苷酸在其2’位置未被修饰。
100.根据权利要求59至63中任一项所述的RNA抑制结构域复合物，其中所述gRNA具有：
(a)第一个和第二个5’端核苷酸上的2’-O-甲基修饰，所有其它核苷酸在其2’位置上未被修饰，和
(b)第一个和第二个5’端核苷酸之间以及第二个和第三个5’端核苷酸之间的硫代磷酸酯连接键，所有其它核苷酸间连接键是磷酸二酯连接键。
101.调节细胞中靶核酸表达的方法，其包括向细胞提供sgRNA和权利要求1所述的Cas融合蛋白。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述sgRNA经化学修饰。
103.根据权利要求101或权利要求102所述的方法，其中所述sgRNA具有长度为12至30个核苷酸的间隔区。
104.调节细胞中靶核酸表达的方法，其包括向细胞提供crRNA分子、tracrRNA分子和权利要求1所述的Cas融合蛋白。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述crRNA分子和所述tracrRNA分子中的一者或两者经化学修饰。
106.根据权利要求104或权利要求105所述的方法，其中所述crRNA分子具有长度为12至30个核苷酸的间隔区。
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