CN116144631B - 耐热型核酸内切酶及其介导的基因编辑系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高活性和耐热性高的核酸内切酶及其介导的基因编辑系统，具体地，本发明提供了一种利用宏基因组学结合实验鉴定出的温度适用范围广的核酸内切酶Gs12‑7，其优点在于蛋白温度耐受性高，识别含有BTYV的PAM序列，因而具有更大基因编辑空间且在基因组中高活性高特异切割靶标DNA。本发明建立了基于CRISPR/Gs12‑7系统介导的核酸可视化检测与基因组靶向编辑技术，在基因组定点修饰与核酸检测领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因组编辑技术领域，具体地涉及新鉴定的RNA介导的耐热型核酸内切酶Gs12-7及其介导的核酸检测、基因组靶向编辑技术开发与应用。
背景技术
CRISPR/Cas系统介导的基因编辑技术经过近10年的发展已风靡全球，成为现有基因编辑和基因组修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易操作的技术之一。该技术在基础研究、临床转化和农业生产中展现出无穷潜力。CRISPR/Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统，该系统包含CRISPR基因座和Cas基因(CRISPR关联基因)两部分。目前CRISPR/Cas系统分为两大类，第一大类：它们切割外源核酸的效应因子为多个Cas蛋白形成的复合物，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型；第二大类：它们的作用因子是比较单一的Cas蛋白，比如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cas12a蛋白。
CRISPR/Cas9或Cas12a系统主要由Cas9或Cas12a蛋白和向导RNA(sgRNA或crRNA)组成。其中crRNA提供序列特异性，靶向与之配对的DNA序列，从而为Cas9或Cas12a核酸酶提供精准定位、并最终切割DNA，进而实现基因编辑。除了crRNA外，CRISPR/Cas9或Cas12a在行使编辑功能时，还依赖于识别靶标DNA上的前间隔序列邻近基序序列(PAM，protospaceradjacent motif)。目前，被最为广泛应用的CRISPR系统是II型CRISPR/Cas系统，除了CRISPR/Cas9外，还有CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13和CRISPR/Cas14等。其中SpCas9核酸酶识别的PAM序列为“NGG”，而Cas12a核酸酶识别的PAM序列为“TTTV或TTV”。PAM序列的复杂程度决定了可编辑位点的上限。在实际应用中，常常因为靶位点没有PAM序列，导致Cas9或Cas12a无法靶向、进而阻碍了基因编辑的有效性。其次，进行基因编辑需要考虑不同反应温度，以期能与LAMP或RPA等温核酸扩增反应兼容。因而，发掘PAM限制少且耐热性高的核酸酶成为研究热点。
长期以来，科研人员致力于优化升级Cas9或Cas12蛋白，以拓展其对不同PAM序列的兼容性和耐热性，尤其让Cas蛋白拥有更广的编辑能力。以SpCas9为例，通过易错PCR策略获得可识别NGA的SpCas9-VRQR突变体及NGCG的SpCas9-VRER突变体。利用定向演化技术PACE构建出可识别NGG、NG、GAA和GAT的xCas9 3.7变体；另外有活性更强的SpCas9-NG变体被开发，其识别的PAM序列拓展至NG。利用PACE技术构建出了一系列SpCas9突变体，将识别PAM序列拓展至NRNH(R为A/G，H为A/C/T)，这些工作让SpCas9及其突变体几乎摆脱了PAM困扰。对SpCas9蛋白进行改造，开发出的SpRY其识别的PAM序列涵盖NRN和NYN(Y为C/T)(NRN>NYN)。新鉴定有耐高温的Cas12b蛋白，仅识别5'-TTN的PAM序列。然而，目前还未见存在耐热能力强且PAM限制少的Cas12a核酸酶。
与Cas9相比，Cas12a具有较多优势，如crRNA较短，更容易被递送至细胞中；切割后产生粘性末端，更利于基因组精准识别编辑；切割位点与其识别位点距离较远，可实现连续多次编辑的目的。此外，Cas12a蛋白最大特征在于，其除了用于细胞或个体水平基因编辑外，还被广泛应用于核酸或蛋白等小分子的高灵敏、高特异性检测。在目标DNA结合后，Cas12a会切割顺式的目标DNA和反式的非目标单链DNA(ssDNA)。若在体外进行核酸切割的同时，提供荧光与淬灭基团修饰的ssDNA作为报告基因，即可用于指示是否存在目标核酸靶标分子，该策略已被广泛用于核酸现场可视化检测。目前已知的Cas12a蛋白较少，如天然的AsCas12a、LbCas12a和FnCas12a和人工改造的增强型enAsCas12a等，它们识别的PAM序列均为“TTTV或TTV”，导致存在靶标识别范围小的缺点。尽管有研究显示，不同细菌来源的Cas9或Cas12a蛋白，其PAM序列存在差异，但是否存在耐热性高且PAM序列碱基限制少的Cas12a蛋白目前依然未见报道。
因此，本领域仍然亟需寻找温度耐热性高和靶标识别范围更广的CRISPR/Cas12a基因编辑系统。
发明内容
本发明首次开发了一种高活性和耐热性高的CRISPR/Gs12-7基因编辑系统，其优点在于蛋白温度耐受性高，识别含有BTYV的PAM序列，因而具有更大基因编辑空间且在基因组中高活性高特异切割靶标DNA，本发明还建立了基于Gs12-7蛋白介导的核酸可视化检测与基因组靶向编辑技术。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
CRISPR/Cas系统中的核酸内切酶，包括以下蛋白：
I、SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的Gs12-7蛋白；
II、与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，具有80％以上的序列相似性的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能；
III、与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能。
融合蛋白，包含上述核酸内切酶，以及与所述蛋白的N端或C端连接的多肽。
多核苷酸，所述多核苷酸为编码上述核酸内切酶的多核苷酸，或编码上述融合蛋白的多核苷酸。含有所述多核苷酸的载体或宿主细胞。
上述核酸内切酶在基因编辑中的应用，包括原核生物基因组、真核生物基因组或体外基因的修饰基因、敲除基因、改变基因产物的表达、修复突变或插入多核苷酸。
一种CRISPR/Cas基因编辑系统，包括上述核酸内切酶，或融合蛋白，或多核苷酸，或载体，或宿主细胞。进一步地，还包括能够结合上述核酸内切酶的同向重复序列和能够靶向目标序列的引导序列。
一种可视化核酸检测试剂盒，包括上述的核酸内切酶，单链DNA荧光-淬灭报告基因，与靶标核酸配对的向导RNA。
本发明的技术方案具有如下主要的有益效果：
1.本发明首次提供了一种结合宏基因组学与实验手段挖掘到的新型CRISPR/Cas12a系统家族新成员Gs12-7。
2.本发明发现高活性和温度耐受性高的CRISPR/Gs12-7基因编辑系统，有更大温度范围的基因编辑空间且在基因组中高活性高特异切割靶标DNA。
3.本发明首次提供了CRISPR/Gs12-7系统介导的核酸可视化检测与基因组靶向编辑技术。
附图说明
图1.利用宏基因组学方法预测的向导RNA依赖型核酸内切酶Gs12-7与系统进化树分析。
图2.核酸内切酶Gs12-7基因座、结构域及向导RNA的DR序列模式图。A.Gs12-7基因座示意图；B.向导RNA的DR序列二级结构折叠与多序列比对。
图3.预测的Gs12-7蛋白氨基酸序列与已知Cas12a蛋白(AsCas12a、LbCas12a和FnCas12a)氨基酸序列保守性分析。
图4.凝胶电泳检测Gs12-7切割双链DNA靶标活性。靶标为非洲猪瘟病毒ASFV p72基因扩增片段，识别的靶标位点PAM为“TTTA”。
图5.在细菌中利用PAM文库消减实验鉴定Gs12-7识别PAM的特征。该核酸内切酶识别PAM基序为BTYV(B＝G/T/C；Y＝C/T；V＝G/A/C)。
图6.验证Gs12-7对线性双链DNA中含不同PAM的同一靶标位点体外切割能力。靶标为非洲猪瘟病毒ASFV p72基因扩增片段，其中spacer序列相同，而PAM序列不同。
图7.比较Gs12-7与野生型LbCas12a对ssDNA-FQ报告系统碱基偏好性的反式切割活性。靶标为非洲猪瘟病毒ASFV p72基因扩增片段，识别的靶标位点PAM为“TTTA”。A.蓝光仪检测结果；B.多功能酶标仪检测结果。
图8.评估Gs12-7反式切割活性的最适酶切温度。靶标为ASFV p72基因。
图9.验证Gs12-7对线性双链DNA中含不同PAM的靶标位点的反式切割活性。靶标为非洲猪瘟病毒ASFV p72基因扩增片段。A.实验流程示意图，B.蓝光仪检测结果。
图10.评估靶标中单个碱基错配对Gs12-7反式切割活性的位置效应。靶标为非洲猪瘟病毒ASFV p72基因扩增片段，TTTA为阳性对照。
图11.通过T7EN1酶切实验检测RNP递送Gs12-7蛋白与体外转录的crRNA复合物在细胞中的基因组编辑活性。靶标为人的FANCF基因，Control为阴性对照。
图12.通过T7EN1酶切实验检测脂质体共转染Gs12-7真核表达载体单个或串联的crRNA表达载体在细胞中的基因组编辑活性。A.单个或串联的crRNA表达载体示意图。B.T7EN1酶切实验。细胞为人源HEK293T。
图13.评估CRISPR/Gs12-7系统介导的真核细胞多重基因编辑活性。A.串联crRNA表达载体模式图；B.T7EN1酶切实验。细胞为人源HEK293T。
具体实施方式
术语说明
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
Genie scissor(灵剪)核酸内切酶家族，其中Genie是精灵的意思，代表为细菌来源，scissor代表基因剪刀，表明其可能发挥的基因编辑功能。Genie scissor核酸内切酶对应的中文名称为“灵剪”核酸内切酶，Genie scissor基因编辑系统代表“灵剪”核酸内切酶介导的基因编辑系统，简称为“灵剪基因编辑”。
前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif，简称PAM)是一个短的DNA序列(通常为2-6碱基对长度)。传统观点认为，PAM是Cas核酸内切酶切割所必需的，通常在切割位点下游3-4个核苷酸。有许多不同Cas核酸内切酶可以从不同的细菌中纯化，并且每种酶可能识别不同的PAM序列。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.基于宏基因组学方法挖掘新型向导RNA依赖型核酸内切酶
基于发明人搭建的新型向导RNA依赖型核酸内切酶的生物信息学鉴定流程，对NCBI nr(Non-Redundant Protein Sequence Database)非冗余蛋白库、全球微生物基因目录数据库(GMGC)等公共数据库中的海量宏基因组测序数据进行了细菌编码蛋白深度挖掘。大致分析流程为：针对目标数据库中所有的contig序列，使用minced软件搜寻与定位CRISPR array，接着使用prodigal软件预测CRISPR array邻近表达的蛋白质，通过CD-hit软件对预测到的所有蛋白去冗余、并利用mega软件进行蛋白质聚类分析、利用hmmer软件进行CRISPR-Cas相似性蛋白鉴定与分类，最终获得一种新的未知细菌蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
通过系统发育进化树分析，发现这种新的细菌蛋白位于不同CRISPR-Cas12a系统进化分支上(图1)，推测它可能为新的RNA引导型核酸内切酶。本发明对这类来自不同细菌中新发现的蛋白命名为Genie scissor(灵剪，GS)核酸内切酶。为了方便后续研究，进一步基于细菌种属来源，发明人将这种新的未知细菌蛋白命名为Gs12-7，其命名规则为：“核酸内切酶+数字编号”。
接着，发明人利用本地化blast程序，对这种新发现的细菌蛋白与NCBI nr数据库进行序列相似性比对。结果发现，新的Gs12-7蛋白与已知核酸内切酶LbCas12a、FnCas12a和AsCas12a的氨基酸序列保守性分别为34.09％、36.47％、39.72％(图1)。
进一步，发明人通过对这种蛋白的基因座用CRISPRCasFinder软件进行分析。结果发现，Gs12-7具有CRISPR array序列，包含多个重复和间隔序列，以及Cas4、Cas1和Cas2蛋白。通过使用hmmer软件与Pfam数据库中的结构域序列进行隐马尔可夫模型比对分析，分析得到了REC1 domain(Alpha helical recognition lobe domain)，RuvC nuclease domain和NUC domain(Nuclease domain)，推测这个新的细菌蛋白可能具有核酸切割活性；接着发明人对Gs12-7的DR序列二级结构通过RNAfold web server(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)在线网站进行预测与多序列比对，结果发现这个新预测的细菌蛋白与已知Cas12a蛋白的DR二级结构类似，但存在一个碱基差异(图2)。
最后发明人对Gs12-7的RuvC和Nuc结构域分别与已知的LbCas12a、FnCas12a和AsCas12a蛋白进行氨基酸多序列比对。如图3所示，发现Gs12-7蛋白结构域已知Cas12a蛋白的氨基酸序列相似性存在较大差别，因此亟需通过进一步实验确定它是否具有核酸定向切割活性。
实施例2.发现向导RNA依赖型Gs12-7核酸内切酶具有体外核酸切割活性
本实施例通过体外实验测试Gs12-7蛋白对双链DNA的切割活性。利用与靶核酸配对的向导RNA引导Gs12-7蛋白识别并结合在靶核酸上，从而激发Genie scissor蛋白对靶核酸的切割活性，切割体系里的双链靶核酸。接着进行琼脂糖凝胶电泳观察目标条带大小变化来鉴定它的酶切活性。
本实施例中选择靶标双链DNA(dsDNA)为非洲猪瘟P72基因，PAM为TTTA，其序列： 加粗标记为PAM，下划线为靶向序列。向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUAGAGCAGACAUUAGUUUUUC(下划线区域为靶向区)。以pmd-18t-p72质粒为模板，p72-F：CTGTAACGCAGCACAGCTGA，p72-R：CCATGGTTTATCCCAGGAGT为引物进行PCR扩增得到P72双链DNA。其次，通过大肠杆菌密码子优化后合成编码Gs12-7的DNA序列，并分别在其C端加入NLS核定位信号，其DNA序列如SEQ ID NO：3所示。随后连接至pET-28a原核表达载体中，转化至大肠杆菌BL21菌株，鉴定阳性克隆后进行IPTG诱导表达，通过亲和层析纯化获得目的蛋白。体外切割反应采用如下体系：10×CutSmart Buffer 2μL，预测的Geniescissor-NLS-tagged蛋白为500ng，向导RNA为500ng，P72靶标扩增产物2μL。37℃分别孵育0.5min，2min，10min和20min。反应完成后分别加入1μL蛋白酶K，55℃孵育10min终止反应。实验组添加向导RNA和靶标核酸，对照组不添加向导RNA。反应后通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，通过UV照胶仪检测新发现的Gs12-7实验组与对照组目标条带区别，并通过Image J软件分析切割效率。
结果如图4所示，与不加向导RNA的对照组相比，实验组中的Gs12-7蛋白仅需0.5min就能够切割靶标双链DNA，其存在2条明显的切割目的条带，计算其切割效率为65.42％。特别是发现，随着反应时间增加，其切割效率也明显提高，分别为72.50％，78.27％和87.63％。由此可见，通过宏基因组学策略预测的Gs12-7蛋白具有较高的核酸靶向切割能力。
实施例3.发现CRISPR-Gs12-7系统特异识别的PAM基序为BTYV
通过细菌PAM文库消减实验，对同源性低且具有体外目标核酸切割活性的Gs12-7蛋白所识别的PAM序列进行了鉴定。其中随机混合PAM载体库构建流程为：合成DNA oligo序列GGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGNNNNNNNGAGAAGTCATTTAATAAGGCCACTGTTAAAAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTT，其中N为随机脱氧核苷酸。以Oligo-F：GGCCAGTGAATTCGAGCTCGG和Oligo-R：AAACAGCTATGACCATGATTACGCCAA为上下游引物经PCR扩增后，以同源重组的方式连入pUC19载体，转化大肠杆菌后提取质粒即可形成随机混合PAM载体库。采用的向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUGAGAAGUCAUUUAAUAAGGCCACU(下划线区域为靶向识别序列)。
细菌PAM文库消减实验：将构建好的预测的Gs12-7蛋白和crRNA共表达的载体pACYC-Duet-1-Gs12-7-crRNA转化至DE3(BL21)感受态中，制备稳定表达的细菌株。不含crRNA的表达载体pACYC-Duet-1-Gs12-7构建的稳转细菌株作为阴性对照。将100ng的PAM文库质粒分别电转至稳定表达的细菌株中，通过氨苄霉素和氯霉素双抗性的板子进行筛选，16h后将板子上的菌落刮下进行质粒提取。分别以100ng提取的质粒为模板，用文库测序引物Seq-F：GGCCAGTGAATTCGAGCTCGG和PAM-Seq-R：CAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACC进行PCR扩增，产物回收后分别将实验组和对照组进行二代高通量测序，对测序结果通过Weblogo3.0分析展示。
鉴定Gs12-7蛋白识别的PAM序列特征：对起始载体库中含有的16384种不同类型的PAM序列，分别统计它们在高通量测序中实验组和对照组中出现的次数高低，并用各自组所有PAM序列总数进行标准化。针对每条PAM消耗变化的计算方式为log2(对照组标准化值/实验组标准化值)，当该值大于3.5时，认为这条PAM被显著消耗。然后使用Weblogo3.0对显著消耗的PAM序列各位置碱基出现频率进行可视化展示。结果如图5所示，发现Gs12-7蛋白识别PAM序列为BTYV(B＝G/T/C；Y＝C/T；V＝G/A/C)，这与已报道的Cas12a蛋白特异识别PAM为“TTTV”碱基组成序列存在差异。
为了证明细菌PAM文库消减实验验证出来的“BTYV”可靠性，通过体外酶切双链DNA实验进行验证。以pmd-18t-p72质粒为模板，以P72-F1和P72-R1为引物进行扩增得到P72片段1，通过不同的P72-F2和P72-R2引物进行扩增得到P72片段2，通过P72-F3和P72-R3引物进行扩增得到P72片段3，最后以P72-F1和P72-R3引物，以片段1，3和不同的片段2为模板，Overlap PCR得到不同PAM靶标双链DNA(dsDNA)非洲猪瘟P72基因。引物序列如下表所示：
本实施例中选择不同PAM靶标双链DNA(dsDNA)为非洲猪瘟P72基因，其序列： 加粗标记为PAM，下划线为靶向序列。针对同一条向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUAGAGCAGACAUUAGUUUUUC(下划线区域为靶向区)。
其次，通过大肠杆菌密码子优化后合成编码Gs12-7的DNA序列，并分别在其C端加入NLS核定位信号，其DNA序列如SEQ ID NO：3所示。随后连接至pET-28a原核表达载体中，转化至大肠杆菌BL21菌株，鉴定阳性克隆后进行IPTG诱导表达，通过亲和层析纯化获得目的蛋白。体外切割反应采用如下体系：10×CutSmart Buffer 2μL，预测的Genie scissor-NLS-tagged蛋白为500ng，向导RNA为500ng，不同PAM的P72靶标PCR扩增产物2μL。37℃分别孵育30min。反应完成后分别加入1μL蛋白酶K，55℃孵育10min终止反应。实验组添加向导RNA和靶标核酸，对照组不添加向导RNA。反应后通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，在UV照胶仪下进行成像观察不同PAM靶标位点下预测的新型核酸内切酶Gs12-7实验组和对照组的目标条带区别，并通过Image J软件分析切割效率。
结果如图6所示，与不加向导RNA的对照组相比，针对不同PAM的P72基因的同一条crRNA，在PAM为“BTYV”的靶标位点中，实验组中的Gs12-7蛋白能够切割反应溶液里的不同PAM的双链DNA，存在2条明显的切割条带但是切割效率不同。在一些非经典的PAM中，如“AATA”，“ATTA”，“ACTA”，“AGTA”等，虽然没有经典的PAM切割效率高，但是也存在一定的切割效率。然而，在另一些非经典的PAM中，如“ACTC”，“ACTG”，“AGTC”，“CCCC”没有切割效率，这些非经典的PAM接下来是一个值得思考的问题。由此可见，通过细菌PAM文库消减实验鉴定出Gs12-7的基序为“BTYV”。
实施例4.CRISPR-Gs12-7系统可介导核酸现场可视化快速检测
进一步评估Gs12-7蛋白是否具有反式切割(trans cleavage)活性。利用可以与靶核酸配对的向导RNA引导核酸内切酶Gs12-7识别并结合在靶核酸上；随之激发其对任意单链核酸的“反式切割”活性，从而切割反应体系里的单链DNA荧光-淬灭报告基因(ssDNA-FQ)；进一步可以通过激发的荧光强度、背景噪音和肉眼颜色变化来判断Gs12-7蛋白的反式切割功能。通过筛选中间单链DNA的不同碱基组合，来找到Gs12-7蛋白最佳的荧光-淬灭报告基因(ssDNA-FQ)。
本实施例中采用的靶标双链DNA(dsDNA)为非洲猪瘟病毒ASFV的p72部分保守基因，序列如下： 加粗标记为PAM，下划线为靶向序列。向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUAGAGCAGACAUUAGUUUUUC(下划线区域为靶向区)。单链DNA荧光-淬灭报告基因序列分别为ROX-TATAT-BHQ2,ROX-TTTTT-BHQ2，ROX-GGGGG-BHQ2，ROX-CCCCC-BHQ2，ROX-AAAAA-BHQ2，ROX-GCGCG-BHQ2或ROX-random-BHQ2(5’ROX/GTATCCAGTGCG/3’BHQ2)，首先原核表达纯化出Gs12-7和LbCas12a蛋白，体外转录出向导RNA和PCR扩增出p72靶基因双链DNA。接着采用以下反应体系：Gs12-7/LbCas12a蛋白500ng，向导RNA 500ng，2μL 10×CutSmart Buffer，1μM不同碱基组合的单链DNA荧光-淬灭报告基因和2μL的PCR扩增靶标产物。阴性对照为不加靶标。37℃反应15min，98℃反应2min灭活。接着利用酶标仪和蓝光仪检测Gs12-7蛋白反式切割活性对报告基因碱基的偏好性。
结果如图7A和7B所示，从切割前后反应溶液荧光变化来看，新发现的Gs12-7蛋白与已知的LbCas12a蛋白都具有核酸反式切割活性；与已知的LbCas12a相比，激活的新鉴定的蛋白不仅可以反式切割ROX-GCGCG-BHQ2和ROX-random-BHQ2，同时还切割ROX-TATAT-BHQ2，ROX-TTTTT-BHQ2，ROX-CCCCC-BHQ2，ROX-AAAAA-BHQ2报告基因。由此可见，新的Gs12-7蛋白反式切割靶向报告基因碱基组成范围较广，且活性较高。
接着评估了Gs12-7蛋白介导的核酸检测技术最适酶切反应温度。采用上述的靶标作为核酸检测的位点进行以下体系反应：Gs12-7蛋白500ng，向导RNA 500ng，2μL 10×CutSmart Buffer，1μM单链DNA荧光-淬灭报告基因(ROX-random-BHQ2)和2μL的PCR扩增靶标产物。阴性对照为不加靶标。分别在37℃、45℃、55℃、60℃以及65℃反应15min，98℃灭活2min。通过在蓝光下观察荧光强度和背景噪音等。结果如图8所示，Gs12-7蛋白的酶切最适反应温度为37℃-60℃，与已知的LbCas12a相比，其具有相对高的温度耐受性。
最后，为了验证Gs12-7蛋白在细菌中鉴定的PAM是否适用于核酸检测，采用靶标双链DNA(dsDNA)为非洲猪瘟病毒ASFV的p72部分保守基因，序列如下：CTGTAACGCAGCACAGCTGAACCGTTCTGAAGAAGAAGAAAGTTAATAGCAGATGCCGATACCACAAGATCAGCCGTAGTGATAGACCCCACGTAATCCGTGTCCCAACTAATATAAAATTCTCTTGCTCTGGATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCACCCGGATCATCGGGGGTTTTAATCGCATTGCCTCCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAGCTGCAGAACTTTGATGGAAATTTATCGATAAGATTGATACCATGAGCAGTTACGGAAATGTTTTTAATAATAGGTAATGTGATCGGATACGTAACGGGGCTAATATCAGATATAGATGAACATGCGTCTGGAAGAGCTGTATCTCTATCCTGAAAGCTTATCTCTGCGTGGTGAGTGGGCTGCATAATGGCGTTAACAACATGTCCGAACTTGTGCCAATCTCGGTGTTGATGAGGATTTTGATCGGAGATGTTCCAGGTAGGTTTTAATCCTATAAACATATATTCAATGGGCCATTTAAGAGCAGACATTAGTTTTTCATCGTGGTGGTTATTGTTGGTGTGGGTCACCTGCGTTTTATGGACACGTATCAGCGAAAAGCGAACGCGTTTTACAAAAAGGTTGTGTATTTCAGGGGTTACAAACAGGTTATTGATGTAAAGTTCATTATTCGTGAGCGAGATTTCATTAATGACTCCTGGGATAAACCATGG；针对“BTYV”的PAM位点，设计多条不同的向导RNA(crRNA)，crRNA-ATTV-1，crRNA-ATTV-3，crRNA-TTTV-1，crRNA-TTTV-2，crRNA-TTTV-3，crRNA-CTTV-1，crRNA-CTTV-2，crRNA-CTTV-3，crRNA-GTTV-1，crRNA-GTTV-2，crRNA-GTTV-3以及crRNA-PC，其序列分别为：
crRNA-ATTV-1：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUCUCCCGUGGCUUCAAAGCAA；
crRNA-ATTV-3：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUAUACCAUGAGCAGUUACGGA；
crRNA-TTTV-1：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUAAGCCACGGGAGGAAUACCA；
crRNA-TTTV-2：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUCACUACGGAGGCAAUGCGAU；
crRNA-TTTV-3：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUCGUAACUGCUCAUGGUAUCA；
crRNA-CTTV-1：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUAAAGCAAAGGUAAUCAUCAU；
crRNA-CTTV-2：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUGAUGGAAAUUUAUCGAUAAG；
crRNA-CTTV-3：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUCAUACCCUUCCACUACGGAG；
crRNA-GTTV-1：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUCGGAAATGUUUUUAAUAAUA；
crRNA-GTTV-2：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUAUCUAUAUCUGAUAUUAGCC；
crRNA-GTTV-3：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUUUAAUAAUAGGUAAUGUGAU；
crRNA-PC：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUAGAGCAGACAUUAGUUUUUC。
下划线为靶向序列。采用上述的P72靶标作为核酸检测的位点，分别体外转录纯化得到上述的crRNA进行以下体系反应：Gs12-7蛋白500ng，上述不同的crRNA 500ng，2μL 10×CutSmart Buffer，1μM单链DNA荧光-淬灭报告基因(ROX-random-BHQ2)和2μL的靶标P72的PCR扩增产物。阴性对照为不加靶标。在37℃反应15min，98℃灭活2min。通过蓝光仪检测不同PAM靶标荧光强度进行验证。结果如图9所示，所有不同的靶标位点都具有较高荧光信号，表明Gs12-7蛋白介导的核酸检测可识别PAM为“BTYV”的靶标位点。
实施例5.评估CRISPR-Gs12-7系统的特异性
进一步鉴定了CRISPR-Gs12-7系统对靶标区域单碱基错配识别能力。本实施例中采用的靶标双链DNA(dsDNA)为非洲猪瘟病毒ASFV的p72部分保守基因，序列如下： 加粗标记为PAM，下划线为靶向序列。首先PCR扩增出含有从1-24位连续靶标位点突变的双链DNA模板，分别以Target-F至Target-p72-F-20G引物为上游，以Target-p72-R引物为下游进行扩增得到靶标双链基因。本实施例使用的引物序列表如下：
其中向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUAGAGCAGACAUUAGUUUUUC(下划线区域为靶向区)。单链DNA荧光-淬灭报告基因序列为ROX-random-BHQ2；首先原核表达纯化出Gs12-7蛋白，体外转录向导RNA，PCR分别扩增p72单碱基突变的靶基因DNA。接着采用以下反应体系：Gs12-7蛋白500ng，向导RNA500ng，2μL 10×CutSmart Buffer，1μM单链DNA荧光-淬灭报告基因5’ROX/GTATCCAGTGCG/3’BHQ2和2μL的不同碱基突变的PCR扩增靶标产物。通过在蓝光下判读荧光强度和背景信号评估Gs12-7蛋白对与靶标存在单碱基错配位点的识别能力，并以此评估其靶标识别特异性。
结果如图10所示，与完全配对的阳性靶标对照相比，存在单碱基错配的位点能显著抑制Gs12-7蛋白的核酸反式切割的活性，尤其在单碱基突变位点为9-14时，其抑制效果明显。由此可见，Gs12-7蛋白区分靶DNA单碱基错配能力较强，暗示其特异性高，适合作为单核苷酸序列多态性(SNP)检测或碱基编辑的工具酶。
实施例6.CRISPR-Gs12-7系统可介导真核细胞的基因组高效编辑
评估了Gs12-7蛋白介导的细胞基因组定向编辑能力。本实施例首先参考LipofectamineTMCRISPRMAXTM试剂说明书，将新的Gs12-7和enAsCas12a蛋白与向导RNA进行孵育。接着分别将核糖核蛋白复合体(RNP)转染至人源HEK 293T细胞中，利用向导RNA引导Gs12-7和enAsCas12a蛋白识别并结合在靶核酸上，从而进行基因组切割。最后收集细胞和提取基因组DNA，并通过T7EN1酶切检测切割活性。
本实施例中选择靶标核酸为人FANCF基因，PAM为TTTG，其序列： 加粗部分为PAM序列，下划线区域为靶向区。向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUGUCGGCAUGGCCCCAUUCGC(下划线区域为靶向区)；在HEK 293T细胞融合度至70-80％进行铺板，12孔板中接种细胞数为8×104细胞/孔。铺板6-8h进行转染，预测的Genie scissor或Cas12a-NLS-tagged蛋白加入1.25μg和625ng向导RNA孵育后，与50μLopti-MEM以及2.6μL Cas9 plusTM reagent混匀；50μL opti-MEM中加入3μL的CRISPRTMreagent进行混匀。稀释好的CRISPRTM reagent与稀释后RNP混合均匀，室温孵育10min。孵育好的混合液加入铺有细胞的培养基中进行转染。37℃培养72h后，弃去培养基，用100μL PBS进行细胞重悬提取细胞的基因组。对转染阳性细胞的靶位点进行PCR扩增。通过T7EN1酶处理反应和琼脂糖凝胶电泳观察条带的变化来判断预测蛋白有无在体内基因编辑活性，同时通过Image J来粗略计算编辑效率。阴性对照的模板为不转染RNP的正常培养HEK 293T细胞基因组。
结果如图11所示，与不加RNP转染的阴性对照相比，实验组中的enAsCas12a、和Gs12-7蛋白，通过T7EN1酶切反应和电泳检测，发现这2种蛋白均具有明显的细胞基因组编辑活性，它们的切割效率(Indel)分别为32.16％和33.14％，由此可见，新发现的Gs12-7蛋白可用于细胞基因组定向或特异编辑，且编辑活性与增强型enAsCas12a活性一致。
进一步，本实施例通过将新发现Gs12-7蛋白进行真核细胞密码子优化，并在其蛋白质的N与C端分别加入SV40 NLS和NLS核定位信号，序列如SEQ ID NO：4所示，将合成的序列构建至Lenti-puro慢病毒载体中，同时与向导RNA真核表达载体通过脂质体共转染至HEK293T细胞中，利用与靶核酸配对的向导RNA引导Gs12-7蛋白识别并切割靶标核酸分子，通过T7EN1酶切和琼脂糖凝胶电泳检测其是否具有细胞基因组定向编辑活性。
本实施例中选择靶标核酸分别为人FANCF基因，PAM为TTTG，其序列： 加粗部分为PAM序列，下划线区域为靶向区，向导RNA序列为：AAUUUCUACUAUUGUAGAUUGUCGGCAUGGCCCCAUUCGC(下划线区域为靶向区)；以及人RUNX1基因，PAM为TTTC，其序列： 加粗部分为PAM序列，下划线区域为靶向区；人EMX1基因，PAM为TTTG，其序列： 设计的两条向导RNA序列分别为：E-crRNA1，AAUUUCUACUAUUGUAGAUUUGGUUGCCCACCCUAGUCAU；E-crRNA2，AAUUUCUACUAUUGUAGAUUUACUUUGUCCUCCGGUUCUG(下划线区域为靶向区)。
在HEK 293T细胞融合度至70-80％进行铺板，12孔板中接种细胞数为8×104细胞/孔。铺板6-8h进行转染，向200μl Jetprime Buffer依次加入预测1μg的Gs12-7真核表达载体或已知的增强enAsCas12a真核表达载体，1μg单个或串联的向导RNA表达载体和10μLJetprime regent吹打混匀，室温孵育10min。孵育好的混合液加入铺有细胞的培养基中进行转染。37℃培养72h后，弃去培养基，用100μL PBS进行细胞重悬提取细胞的基因组。对转染阳性细胞的靶位点进行PCR扩增编辑附近的序列。通过T7EN1酶切反应和琼脂糖凝胶电泳观察目标条带变化，阴性对照的模板为不转染的正常培养HEK293细胞基因组。
评估了CRISPR-Gs12-7蛋白对单个靶标基因、多个靶标基因以及单基因多个位点的定向编辑能力。结果如图12-13所示，在对RUNX1基因的单一位点进行编辑时，发现新鉴定的Gs12-7和已知enAsCas12a的切割活性分别为45.53％和46.18％，两者活性接近(图12)。在同时对RUNX1和FANCF进行编辑时，发现针对RUNX1基因，Gs12-7和已知enAsCas12a的编辑效率分别为35.39％和38.43％，而针对FANCF基因，两者编辑活性分别为30.25％和31.45％。在图13所示中，针对EMX1基因的2个位点同时进行编辑时，Gs12-7和已知enAsCas12a的编辑活性分别为39.88％和45.66％。由此可见，新鉴定的Gs12-7蛋白能实现单基因或多重基因编辑，且活性与增强型enAsCas12a一致。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本领域的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。
Claims (9)
1.CRISPR/Cas 系统中的核酸内切酶，其特征在于，所述的核酸内切酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示的Gs12-7 蛋白。
2.多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1 所述核酸内切酶的多核苷酸。
3.载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2 所述的多核苷酸。
4.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求2 所述的多核苷酸或权利要求3所述的载体，所述宿主细胞不是植物细胞。
5.权利要求1 所述的核酸内切酶，或权利要求2 所述的多核苷酸，或权利要求3 所述的载体，或权利要求4 所述的宿主细胞在基因编辑中的应用。
6.根据权利要求5 所述的应用，其特征在于，所述的基因编辑包括对原核生物基因组、真核生物基因组进行基因修饰或基因敲除。
7.一种CRISPR/Cas 基因编辑系统，其特征在于，包括权利要求1 所述的核酸内切酶，或权利要求2 所述的多核苷酸，或权利要求3 所述的载体，或权利要求4 所述的宿主细胞。
8.根据权利要求7 所述的CRISPR/Cas 基因编辑系统，其特征在于，还包括能够结合权利要求1 所述的核酸内切酶的同向重复序列和能够靶向目标序列的引导序列。
9.一种可视化核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1 所述的核酸内切酶，单链DNA荧光-淬灭报告基因，与靶标核酸配对的向导RNA。
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