CN111926030A

CN111926030A - 一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体及其应用

Info

Publication number: CN111926030A
Application number: CN202010670227.2A
Authority: CN
Inventors: 陶攀; 柳月鹏; 董俊花
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2020-07-13
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2040-07-13
Also published as: CN111926030B

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体，该载体包含由proC启动子调控的LbCas12a蛋白编码框核酸序列、J23100启动子调控的crRNA表达框核酸序列、包含大肠杆菌复制因子CloDF13、壮观霉素耐受基因SMR和负责调控LbCas12a蛋白表达的proC启动子元件的质粒骨架核酸序列。本发明还公开了该载体的构建方法及其在噬菌体基因组编辑中的应用。很多噬菌体通过对自身基因组DNA进行共价化学修饰(如T4噬菌体基因组中的胞嘧啶被高度糖基化修饰)以耐受宿主核酸酶对其基因组的切割，噬菌体的这种自我保护机制给基因组编辑带来了很大障碍，本发明克服了噬菌体基因组共价修饰的限制，实现了对噬菌体基因组的高效编辑。

Description

一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体，其构建方法和应用。

背景技术

噬菌体无论从数量上还是种类上都被认为是地球上最丰富的物种，蕴藏着丰富的生物宝藏。近年来，噬菌体作为天然的生物材料已经被用于疫苗载体、基因治疗载体、细菌检测、耐药菌治疗、组织再生、能量电池等等。然而，野生型噬菌体往往不能满足各种研发需求，对噬菌体进行改造是上述研究的基本前提。传统的噬菌体基因组编辑方法效率低、操作费时、工作量大，极大的限制了噬菌体的相关研究。为此，科学家们用CRISPR-Cas系统开发了新型噬菌体基因组编辑技术。

CRISPR-Cas是细菌和古细菌的获得性免疫系统，能特异性地识别并切割噬菌体的基因组DNA，从而抵御噬菌体的侵袭。目前已经发现6种类型CRISPR-Cas系统，其中II型(CRISPR-Cas9)和V型(CRISPR-Cas12a)系统结构较为简单。基于CRISPR-Cas9的噬菌体基因组编辑技术利用crRNA来引导SpCas9核酸酶特异地识别和切割噬菌体的基因组，产生的双链DNA切口通过同源重组与含有预期突变的供体质粒交换片段，从而将预期突变引入到噬菌体的基因组中。使用该方法可以对噬菌体的基因组进行缺失、插入和替换等操作。

限制-修饰系统是细菌抵御噬菌体感染的另一道防线，它利用细菌的核酸酶切割噬菌体的基因组，而细菌自身基因组DNA通过共价修饰免受核酸酶的切割。为了抵抗细菌的限制-修饰系统，噬菌体也对自身的基因组DNA进行共价化学修饰，如T4噬菌体基因组中的胞嘧啶被高度糖基化修饰。研究表明噬菌体基因组的共价化学修饰同样耐受Cas9的切割，这也极大地限制了CRISPR-Cas9噬菌体编辑的应用。因此，开发一种高效、便捷的噬菌体基因组编辑方法将会极大促进人类探寻噬菌体生物宝藏的效率，对疫苗、耐药菌治疗、细菌检测、基因治疗、组织再生、能量电池等生物医学及相关领域的研究具有很大的促进作用。

发明内容

本发明的第一个目的是开发一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体，旨在克服传统噬菌体基因组编辑和CRISCR-Cas9噬菌体编辑技术的缺陷，能够高效、便捷地对噬菌体基因组进行编辑。

本发明的第二个目的是提供一种构建所述噬菌体基因组编辑载体的方法。

本发明的第三个目的是提供一种噬菌体基因组编辑载体的工程菌。

本发明的第四个目的是提供所述的噬菌体基因组编辑载体、以及所述的工程菌在编辑噬菌体基因组中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种编辑噬菌体基因组的方法。

为实现第一个目的，本发明利用来源于毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)的V型CRISPR-Cas系统(LbCas12a)开发了一种高效、便捷的噬菌体编辑载体pLbCas12a，该载体包含由proC启动子调控的来源于毛螺科菌的LbCas12a蛋白编码框核酸序列、J23100启动子调控的crRNA表达框核酸序列、包含复制因子、耐受基因和负责调控LbCas12a蛋白表达的proC启动子元件的质粒骨架核酸序列。

所述复制因子是大肠杆菌复制因子CloDF13。

所述耐受基因是壮观霉素耐受基因SMR。

更具体地，所述噬菌体编辑载体具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，或者与SEQID NO.5所示的序列具有70％以上同源性的序列。

为实现第二个目的，本发明提供的构建方法包括以下步骤：

1)以pET28b-NLS-LbCpF1质粒为模板，PCR扩增得到由proC启动子调控的LbCas12a蛋白编码框核酸序列，该序列如SEQ ID NO.1所示；

2)以DS-SPCas质粒为模板，PCR扩增得到J23100启动子调控的crRNA表达框核酸序列，该序列如SEQ ID NO.2所示；

3)以DS-SPCas质粒为模板，PCR扩增得到包含大肠杆菌复制因子CloDF13、壮观霉素耐受基因SMR和proC启动子元件的质粒骨架核酸序列，该质粒骨架序列如SEQ ID NO.3所示；

4)通过克隆方法将上述三种核酸序列片段连接在一起，得到噬菌体基因组编辑载体(pLbCas12a)。

为实现第三个目的，将上述载体转化到大肠杆菌DH5a中，即可得到含有所述噬菌体基因组编辑载体的工程菌。

为实现第四个目的，本发明提供了所述的噬菌体基因组编辑载体、以及所述的工程菌在编辑噬菌体基因组中的应用，该应用能克服噬菌体基因组的共价化学修饰，提高噬菌体基因组的编辑效率。

为实现第五个目的，本发明进一步提供了一种编辑噬菌体基因组的方法，该方法包括以下步骤：

1)将噬菌体靶向目标区域的Spacer序列克隆到以上所述的噬菌体基因组编辑载体，得到表达特定crRNA的pLbCas12a-crRNA质粒；

2)在线性化载体DNA片段上拼接噬菌体突变区域和上下游同源臂，构建含有预期突变的供体质粒；

3)将1)和2)中构建的质粒共转化到宿主菌；

4)用噬菌体感染含有上述含有两种质粒的宿主菌，得到含有预期突变的重组噬菌体。

所述噬菌体为T4噬菌体。

优选地，所述宿主菌为大肠杆菌。

本发明提供的噬菌体基因组编辑方法具有编辑效率高等优点，在疫苗载体、噬菌体治疗、病原体检测中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1：构建的pLbCas12a-crRNA载体工作原理示意图。

图2：当SpCas9复合物与LbCas12a复合物识别的靶区域重合时，SpCas9与LbCas12a复合物切割T4噬菌体DNA效率的对比。图中，**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

图3：当SpCas9复合物与LbCas12a复合物识别的靶区域酶切位点重合时，SpCas9与LbCas12a复合物切割T4噬菌体DNA效率的对比。图中，**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

图4：靶向T4噬菌体不同区域的LbCas12a-crRNA复合物之间具有协同效应。图中，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；★：EOP<10^-7。

图5：利用pLbCas12a载体构建表达EGFP-Hoc的重组T4噬菌体的流程及鉴定结果。

图6：利用pLbCas12a载体构建MiNi-T4的流程及鉴定结果。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步的详细说明。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

实施例1：构建pLbCas12a质粒

1.利用PCR技术扩增得到片段A，B和片段C：

1)用引物LbCas12a-F/LbCas12a-R，以pET28b-NLS-LbCpF1质粒为模板扩增出片段A，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。其中pET28b-NLS-LbCpF1质粒含有由proC启动子调控的LbCas12a蛋白编码框，该质粒由美国天主教大学Venigalla Rao惠赠，质粒序列如SEQ ID NO.4所示。反应体系与扩增条件如下：

片段A的PCR扩增体系：

引物序列：

LbCas12a-F：5’-tactagaggaggaggcaaaaatgagcaaactggaaaaatttacg-3’(SEQ IDNO.6)

LbCas12a-R：5’-ctcagtgtttaaccgatgtctgtgc-3’(SEQ ID NO.7)

片段A的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，56℃15sec，72℃1.5min，进行30个循环，72℃延伸7min。

2)用引物J23100-F/J23100-R，以DS-SPCas(Addgene no.48645)为模板扩增出片段B。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。反应体系、引物序列、扩增条件如下：

片段B的PCR扩增体系：

引物序列：

J23100-F：5’-gacatcggttaaacactgagatacttctattctactctgactgcaaacc-3’(SEQID NO.8)

J23100-R：5’-tctcaaagcttacagaattctatctcgagattaagctagcactgtacc-3’(SEQID NO.9)

片段B的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，56℃15sec，72℃10sec，进行30个循环，72℃延伸7min。

3)用引物Backbone-F/Backbone-R，以DS-SPCas为模板扩增出片段C。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。扩增体系、引物序列和扩增条件如下：

片段C的PCR扩增体系：

引物序列：

Backbone-F：5’-gaattctgtaagctttgagacccaagcccg-3’(SEQ ID NO.10)

Backbone-R：5’-ttttgcctcctcctctagtaaaagt-3’(SEQ ID NO.11)

片段C的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，56℃15sec，72℃45sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

3.片段拼接：

采用南京诺唯赞公司一步克隆法试剂盒(货号C113)，将A、B和C等三个片段体外重组拼接在一起，得到pLbCas12a质粒。体外重组反应体系及反应条件如下：

反应体系(20μl)：

反应条件：

将上述混合物置于37℃下孵育30min,然后立即置于冰上冰浴冷却5min。

4.质粒的转化和扩增：

将上述重组产物转化到大肠杆菌DH5a中，然后将平板置于37℃培养箱过夜培养，次日挑取单菌落接种到用含有50μg/ml壮观霉素的LB培养基，37℃培养12h后进行菌液PCR鉴定，选取PCR阳性克隆，提取质粒后送公司测序，得到pLbCas12a质粒，序列如SEQ ID NO.5所示。

实施例2：CRISPR-Cas12a与CRISPR-Cas9切割T4噬菌体效率比较

1.制备表达CRISPR-Cas12a的大肠杆菌

1)构建稳定表达pLbCas12a-crRNA的质粒

本实例构建了9种表达不同crRNA(序列如下表)的pLbCas12a-crRNA质粒。采用南京诺唯赞公司一步克隆法试剂盒(货号C112)，将含有特定Spacer序列的DNA片段(Spacer^LbCas12a)分别克隆到QuickCut^TM XhoI/QuickCut^TM EcoRI(Takara)双酶切线性化的载体pLbCas12a中，得到表达不同crRNA的pLbCas12a-crRNA质粒。具体步骤如下：

I.含有特定Spacer序列的DNA片段(Spacer^LbCas12a)

合成两条3’端末尾有17个碱基互补的单链DNA(序列如下表)，通过复性、延伸得到双链DNA，作为PCR扩增的模板。得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。PCR扩增体系与扩增条件、引物序列、合成的单链DNA及对应的Spacer序列如下：

PCR扩增体系:

PCR扩增条件：

98℃3min，98℃15sec，52℃15sec，72℃08sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

合成的单链DNA的序列。波浪线显示相应的Spacer序列。

II.制备线性化pLbCas12a载体:

利用QuickCut^TM XhoI/QuickCut^TM EcoRI(Takara)将pLbCas12a双酶切，制备线性化载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。酶切体系如下：

反应条件：

酶切产物置于37℃水浴锅孵育1h,然后80℃孵育15min灭活内切酶。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收备用。

III.片段拼接

采用南京诺唯赞公司一步克隆法试剂盒(货号C112)，将上述PCR产物片段和线性化载体片段在体外重组拼接在一起，得到pLbCas12a-crRNA质粒。

体外重组反应体系及反应条件如下：

反应体系(20μl)：

反应条件：

重组产物置于37℃下孵育30min,然后立即置于冰上冰浴冷却5min

2)pLbCas12a-crRNA质粒的转化与鉴定

将上述重组产物转化到大肠杆菌DH5a中，37℃过夜培养，次日挑取单菌落接种到含有50μg/ml壮观霉素的LB培养基，37℃培养12h后进行菌液PCR鉴定。选取PCR阳性克隆，提取质粒后送公司测序，得到表达CRISPR-Cas12a的大肠杆菌。构建的pLbCas12a-crRNA载体在大肠杆菌细胞内稳定表达LbCas12a蛋白，并且由J23100启动子启动转录Pre-crRNA，LbCas12a蛋白加工自身pre-crRNA，得到能靶向目标DNA的LbCas12a-crRNA效应物，如图1所示。

2.制备表达CRISPR-Cas9的大肠杆菌

1)构建稳定表达pSpCas9-crRNA的质粒

本实例构建了15种表达不同crRNA(序列如下表)的pSpCas9-crRNA质粒。采用南京诺唯赞公司一步克隆法试剂盒(货号C112)，将含有特定Spacer序列的DNA片段(Spacer^SpCas9)分别克隆到线性化的载体DS-SPcas(addgene:48645)中，得到表达不同crRNA的pSpCas9-crRNA质粒。具体步骤如下：

I.制备线性化载体pSpCas9

以DS-SPcas质粒为模板，引物为Cas9-F1/Cas9-R1，PCR扩增得到线性化载体pSpCas9。PCR产物采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。扩增体系、引物序列和扩增条件如下：

引物序列：

Cas9-F1：5’-attaagctagcactgtacct-3’

Cas9-R1：5’-gttttagagctatgctgttt-3’

扩增条件：98℃5min，98℃30sec，52℃30sec，72℃2.5min，进行30个循环，72℃延伸7min。

II.制备含有特定Spacer的DNA片段(Spacer^SpCas9)

合成两条完全互补的单链寡核苷酸，56℃，退火30min后，形成含有特定Spacer的DNA片段，得到DNA片段经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。退火反应体系、反应条件及合成的单链寡DNA核苷酸序列如下表：

退火反应体系 (20μl)：

寡链核苷酸(+) 10.0μl

寡链核苷酸(-) 10.0μl

反应条件：

95℃5min,56℃30min,然后将退火产物取出并冷却到室温。

合成的寡链DNA核苷酸序列。红色显示相应的Spacer序列。

III.片段拼接

采用南京诺唯赞公司一步克隆法试剂盒(货号C112)，将上述制备的含有特定Spacer的DNA和线性化载体在体外重组拼接在一起，得到pSpCas9-crRNA质粒。体外重组反应体系、反应条件如下：

重组反应体系(20μl)：

反应条件：重组产物置于37℃下孵育30min,然后立即置于冰上冰浴冷却5min

2)pSpCas9-crRNA质粒的转化与鉴定

将上述重组产物转化到大肠杆菌DH5a中，37℃过夜培养，次日挑取单菌落接种到用含有50μg/ml壮观霉素的LB培养基，37℃培养12h后进行菌液PCR鉴定。选取PCR阳性克隆，提取质粒后送公司测序，得到表达CRISPR-Cas9的大肠杆菌。

3.T4噬菌体感染噬斑测定

分别取上述表达pLbCas12a-crRNA和pSpCas9-crRNA的大肠杆菌300μl，各加入100μl T4噬菌体稀释液，混匀。37℃孵育7min后，加入含壮观霉素(50μg/ml)的半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃温箱内培养12h左右。计数平板上长出的噬菌斑数，计算每种CRISPR-Cas质粒的铺板效率(Efficiency of plating,EOP)。EOP的计算公式如下：噬菌斑数/用于感染的噬菌体数量。

当SpCas9-crRNA和LbCas12a-crRNA识别区域重叠时，LbCas12a-crRNA切割T4噬菌体基因组DNA的效率明显高于SpCas9。如图2所示，在所有测定的6个位点中，LbCas12a-crRNA切割位点1、4、6的效率分别是SpCas9-crRNA的10⁶、10⁵、10⁴倍。在位点2、3、5，LbCas12a-crRNA切割效率也要明显高于SpCas9-crRNA。

如图3A所示，SpCas9-crRNA复合物识别靶向区域是20bp，产生平末端切口；LbCas12a-crRNA复合物识别靶向区域是23bp，产生粘性末端切口，它们具体切割靶向区DNA的位点。如图3B所示，当SpCas9-crRNA和LbCas12a-crRNA靶向区域部分重叠且切割位点重叠时，即每一组内LbCas12a-crRNA的三个切割位点分别与其它三个SpCas9-crRNA的切割位点相重叠，发现LbCas12a-crRNA的切割效率明显高于SpCas9-crRNA，在所有测定的3组数据中，LbCas12a-crRNA的切割效率分别是SpCas9-crRNA的10到10⁶倍不等。这些数据表明，LbCas12a-crRNA切割T4噬菌体DNA的能力明显强于SpCas9-crRNA。

实施例3：靶向T4噬菌体不同区域的LbCas12a-crRNA复合物之间具有协同效应

当大肠杆菌同时表达2种靶向T4噬菌体不同区域的LbCas12a-crRNA复合物时(如图4A所示)，LbCas12a-crRNA复合物具有协同效应。在6组实验中，均发现同时表达2种LbCas12a-crRNA复合物的大肠杆菌，能更有效地抑制T4噬菌体感染，在前4组实验中发现其抑制效率比只表达单个LbCas12a-crRNA复合物的大肠杆菌要高5倍-300倍,而在第5组和第6组实验中，发现虽然单个LbCas12a-crRNA复合物表现出中等的抑制效率(10^-3-10^-4)，但是2种中等抑制效率的LbCas12a-crRNA复合物所产生的协同效应则表现出非常高的抑制效率(<10^-7)(如图4B所示)。这说明，利用不同区域的LbCas12a-crRNA复合物具有的协同效应可以提高切割T4噬菌体基因组的效率，即使大肠杆菌内单个LbCas12a-crRNA复合物不能很好地切割T4基因组，大肠杆菌内表达的2种LbCas12a-crRNA复合物产生的协同效应也可以突破T4基因组的共价修饰作用的限制，去切割T4基因组，从而提高T4噬菌体编辑的效率。

实施例3中构建两种靶向T4噬菌体不同区域的pLbCas12a-crRNA质粒制备方法如下：

构建表达2种靶向T4噬菌体不同区域的pLbCas12a-crRNA质粒，过程如上述实施例2所述，合成两条3’端末尾有17个碱基互补的单链DNA(序列如下)，通过复性、延伸得到双链DNA，作为PCR扩增的模板。得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。PCR扩增体系与扩增条件、合成的单链DNA序列如下：

PCR扩增体系：

模板(合成的两条单链DNA) 0.5μl(+)/0.5μl(-)(10μM)

2x Primer Star Mix 20.0μl(公司：宝生物，产品货号：R045A)

ddH₂O 19.0μl

PCR扩增条件(#1—#8)：

98℃3min，98℃15sec，52℃15sec，72℃8sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

PCR扩增条件(#1+#2—#8+#6)：

98℃3min,98℃15sec，52℃15sec，72℃10sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

合成的单链DNA模板序列(5’-3’)：

实施例4：利用CRISPR-Cas12a系统构建表达EGFP-Hoc的重组T4噬菌体

Hoc是T4噬菌体的非必需基因，编码的Hoc蛋白位于T4噬菌体衣壳的表面。Hoc蛋白呈杆状结构，C端结合到T4衣壳上，N端则远离衣壳。外源蛋白融合到Hoc蛋白的N端时，能够很好的展示在T4衣壳表面。基于这些特点，Hoc基因常被用于蛋白展示和亚单位疫苗研发。本实例用CRISPR-Cas12a技术编辑T4基因组，构建表达GFP-Hoc融合蛋白的重组T4噬菌体。

1.制备靶向Hoc的pLbCas12a-crRNA质粒

构建表达靶向切割Hoc基因效应物的pLbCas12a-crRNA(Hoc)质粒，过程如上述实施例2所述，合成两条3’端末尾有17个碱基互补的单链DNA(序列如下)，通过复性、延伸得到双链DNA，作为PCR扩增的模板。得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。PCR扩增体系与扩增条件、合成的单链DNA及对应的Spacer序列如下：

PCR扩增体系：

模板(合成的两条单链DNA) 0.5μl(+)/0.5μl(-)(10μM)

2x Primer Star Mix 20.0μl(公司：宝生物，产品货号：R045A)

ddH₂O 19.0μl

PCR扩增条件：

98℃3min，98℃15sec，52℃15sec，72℃10sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

两条合成的单链DNA模板序列(5’-3’)：

(+):cagtgctagcttaatctcgaggtcaaaagacctttttaatttctactaagtgtagatggagttatatcaactgtaaaagtgtcaaaaga

(-):gtctcaaagcttacagaattcagtttgaccactgggtgtagcagatctacacttagtagaaattaaaaaggtcttttgacacttttaca

对应的Spacer序列(5’-3’):

Spacer^1st:ggagttatatcaactgtaaaagt(SEQ ID NO.21)

Spacer^2nd:ctgctacacccagtggtcaaact(SEQ ID NO.22)

2.构建供体质粒pUC-EGFP-Hoc

1)制备同源臂和线性化的pUC19载体DNA

用载体特异性引物pUC19-F和pUC19-R扩增质粒pUC19(Addgene no.50005)，得到线性化的pUC19，即片段A1；用5‘端同源臂扩增引物(L_arm-F和L_arm-R)扩增出左侧同源臂DNA片段，即片段A2；用引物(EGFP-F和EGFP-R)扩增质粒pET-GFPSoc(本实验室保存)，得到片段A3；用3’端同源臂扩增引物(R_arm-F和R_arm-R)扩增出右侧同源臂DNA片段，即片段A4；以上得到PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，得到回收的DNA片段备用。涉及的扩增体系及条件如下：

片段A1的PCR扩增体系：

引物序列：

pUC19-F：5’-atcagcagcatcaggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatg-3’(SEQ IDNO.23)

pUC19-R：5’-ggttgtggtggttgcgctcactgcccgc-3’(SEQ ID NO.24)

片段A1的PCR扩增条件：

片段A2的PCR扩增体系：

引物序列：

L_arm-F:5’-tcacgaggcctgatgctgctgatgccgc-3’(SEQ ID NO.25)

L_arm-R:5’-agtcataagttatccttattttaatgttacga-3’(SEQ ID NO.26)

片段A2的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，56℃15sec，72℃15sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

片段A3的PCR扩增体系：

引物序列：

EGFP-F:5’-aataaggataacttatgactgtgagcaagggcgaggagc-3’(SEQ ID NO.27)

EGFP-F:5’-agtacataactaaaagttgcgtacagctcgtccatgccga-3’(SEQ ID NO.28)

片段A3的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，56℃15sec，72℃20sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

片段A4的PCR扩增体系：

引物序列：

R_arm-F:5’-gcaacttttagttatgtactaaaaggacc-3’(SEQ ID NO.29)

R_arm-R:5’-tgagcgcaaccaccacaacctcagttctcataatc-3’(SEQ ID NO.30)

片段A4的PCR扩增条件：

98℃5min，98℃15sec，56℃15sec，72℃30sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

片段拼接

采用南京诺唯赞公司一步克隆法试剂盒(货号C113)，将上述得到的四个DNA片段混合，通过体外重组拼接在一起，得到供体质粒pUC-EGFP-Hoc。重组反应体系及条件如下所示：

重组反应体系(20μl)：

3)质粒转化与鉴定

将上述重组产物转化到大肠杆菌DH5a中，37℃过夜培养，次日挑取单菌落接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养12h后进行菌液PCR鉴定。选取PCR阳性克隆，提取质粒后送公司测序，得到供体质粒pUC-EGFP-Hoc，序列如SEQ ID NO.31所示。

3.构建表达EGFP-Hoc的重组T4噬菌体

1)制备用于重组的大肠杆菌

将靶向Hoc的pLbCas12a-crRNA质粒与供体质粒pUC-EGFP-Hoc共转化至大肠杆菌B834中，挑取单菌落，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml壮观霉素LB培养基中培养12h备用。于此同时，将靶向Hoc的pLbCas12a-crRNA质粒单独转化到大肠杆菌B834中，制备只表达LbCas12a-crRNA的大肠杆菌作为对照。

2)体内重组制备表达Hoc-EGFP的T4噬菌体

取300μl上述含有pLbCas12a-crRNA和pUC-EGFP-Hoc的大肠杆菌培养物，加入约8*10⁵PFU T4噬菌体，混匀。37℃孵育7min后，加入含氨苄青霉素(100μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃温箱内过夜培养。于此同时，取300μl只含有pLbCas12a-crRNA质粒的大肠杆菌B834中，加入约8*10⁴PFU T4噬菌体，混匀。37℃孵育7min后，加入壮观霉素(50μg/ml)的半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃温箱内过夜培养。结果发现，T4噬菌体感染含有pLbCas12a-crRNA和pUC-EGFP-Hoc的大肠杆菌时，在双层平板上长出了53个噬菌斑。但用同样数量的T4噬菌体侵染只含有pLbCas12a-crRNA大肠杆菌时，在双层平板上没有长出噬菌斑。这表明，靶向Hoc的LbCas12a-crRNA复合物可以有效切割T4噬菌体的基因组，所以不能长出噬菌斑。当大肠杆菌中同时存在供体质粒时，噬菌体基因上的LbCas12a-crRNA切口能够通过同源重组得以修复，因而能在双层平板上形成噬菌斑，如图5A所示。

3)重组T4噬菌体的鉴定

取1.5mL的EP管若干，每管加入200μl Pi-Mg缓冲液(26mM Na₂HPO₄、68mM NaCl，22mM KH₂PO₄、1mM MgSO₄，pH 7.5)。中。在无菌条件下分别挑取上述噬菌斑置于缓冲液中，室温静置1h，在此期间每10分钟轻微震荡帮助噬菌体释放到溶液中。分别从EP管中取4.0μl样品，用作模板，进行PCR鉴定，得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，如图5B所示，阳性克隆送公司测序进一步验证。PCR鉴定体系、引物序列、扩增条件如下:

重组噬菌体PCR鉴定扩增体系(40μl)：

引物序列：

F-1:5’-cgcgatggatcagttttaattcg-3’

R-1:5’-caggttgagaagctaaggca-3’

重组噬菌体的鉴定PCR扩增条件：

95℃10min，95℃30sec，52℃30sec，72℃1.5min，进行30个循环，72℃延伸5min。

实施例5：利用CRISPR-Cas12a系统编辑T4噬菌体基因组构建MiNi-T4

T4基因组包含170kb，编码约200种蛋白质，其中许多蛋白质对于T4生存不是必需的。因此，我们的目的是通过使用CRISPR-Cas12a删除多个T4基因组非必需基因，创建mini-T4噬菌体。我们敲除了T4基因组上的两个区域，这两个区域分别位于基因39和基因56之间(长度约为10,768bp)和基因31和基因DenA之间(区域约为5,300bp)。我们首先利用CRISPR-Cas12a系统编辑T4噬菌体，缺失掉基因39和基因56之间的区域，得到突变体T4△(39-56)；随后再以此为基础缺失掉基因31和基因DenA之间的区域，得到突变体T4△(39-56)△(31-DenA)，如图6所示。具体实施过程如下所述。

1.制备靶向39-56区域和31-DenA区域的pLbCas12a-crRNA质粒

构建表达靶向切割39-56区域和31-DenA区域效应物的pLbCas12a-crRNA(39-56)质粒和pLbCas12a-crRNA(31-DenA)，过程如上述实施例2所述，合成两条3’端末尾有17个碱基互补的单链DNA(序列如下)，通过复性、延伸得到双链DNA，作为PCR扩增的模板。得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，切胶回收备用。PCR扩增体系与扩增条件、合成的单链DNA及对应的Spacer序列如下：

PCR扩增体系(pLbCas12a-crRNA(39-56))：

模板(合成的两条单链DNA) 0.5μl(+)/0.5μl(-)(10μM)

2x Primer Star Mix 20.0μl(公司：宝生物，产品货号：R045A)

ddH₂O 19.0μl

PCR扩增条件：

98℃3min，98℃15sec，52℃15sec，72℃10sec，进行30个循环，72℃延伸5min

两条合成的单链DNA模板序列(5’-3’)：

(+):cagtgctagcttaatctcgaggtcaaaagacctttttaatttctactaagtgtagataaaaggctccatacctaaacgtcgtcaaaaga

(-):gtctcaaagcttacagaattctgaacgtgagctaatatctgcatatctacacttagtagaaattaaaaaggtcttttgacgacgtttag

对应的Spacer序列(5’-3’):

Spacer^1st:aaaaggctccatacctaaacgtc(SEQ ID NO.32)

Spacer^2nd:atgcagatattagctcacgttca(SEQ ID NO.33)

PCR扩增体系(pLbCas12a-crRNA(31-DenA))：

模板(合成的两条单链DNA) 0.5μl(+)/0.5μl(-)(10μM)

2x Primer Star Mix 20.0μl(公司：宝生物，产品货号：R045A)

ddH2O 19.0μl

PCR扩增条件：

98℃3min，98℃15sec，52℃15sec，72℃08sec，进行30个循环，72℃延伸5min

两条合成的单链DNA模板序列(5’-3’)：

(+):cagtgctagcttaatctcgaggtcaaaagacctttttaatttctactaagtgtagataa

(-):gtctcaaagcttacagaattcaaattatcgctaataatatgtttatctacacttagtag

对应的Spacer序列(5’-3’):

Spacer:aaacatattattagcgataattt(SEQ ID NO.34)

2.构建供体质粒pET-39/56和pUC-31/DenA

1)制备供体质粒pET-39/56和pUC-31/DenA的同源臂

用5‘端同源臂扩增引物(L_arm-F³⁹和L_arm-R³⁹)扩增出左侧同源臂DNA片段，即片段L-39；用3’端同源臂扩增引物(R_arm-F⁵⁶和R_arm-R⁵⁶)扩增出右侧同源臂DNA片段，即片段R-56；用5‘端同源臂扩增引物(L_arm-F³¹和L_arm-R³¹)扩增出左侧同源臂DNA片段，即片段L-31；用3’端同源臂扩增引物(R_arm-F^DenA和R_arm-R^DenA)扩增出右侧同源臂DNA片段，即片段R-DenA。以上得到PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，得到回收的DNA片段备用。涉及的扩增体系及条件如下：

片段L-39的PCR扩增体系：

引物序列：

L_arm-F³⁹:5’-ggaagatctaggataaactacagcaagtgtctggag-3’(SEQ ID NO.35)

L_arm-R³⁹:5’-cgcggatccaggattcaactattcgtttta-3’(SEQ ID NO.36)

片段L-39的PCR扩增条件：

片段R-56的PCR扩增体系：

引物序列：

R_arm-F⁵⁶:5’-atttgcggccgcagattcatgtttcccagcgtacc-3’(SEQ ID NO.37)

R_arm-R⁵⁶:5’-ccgctcgagacggaaaggaaaacactcttct-3’(SEQ ID NO.38)

片段R-56的PCR扩增条件：

片段L-31的PCR扩增体系：

引物序列：

L_arm-F³¹:5’-caggtcgactctagaggatccatgagacagcacgaattggtagc-3’(SEQ IDNO.39)

L_arm-R³¹:5’-ctagaatgtcgtggattgggtttgtattgatagaccatatagt-3’(SEQ IDNO.40)

片段L-31的PCR扩增条件：

片段R-DenA的PCR扩增体系：

引物序列：

R_arm-F^DenA:5’-cccaatccacgacattctagtgcatctgg-3’(SEQ ID NO.41)

R_arm-R^DenA:5’-aaaacgacggccagtgaattcaacagtgcggtcttccatgc-3’(SEQ IDNO.42)

片段R-DenA的PCR扩增条件：

2)将制备的同源臂片段插入到供体质粒骨架。

采用酶切连接方法将L-39片段与R-56片段插入pET-28b载体，首先利用QuickCut^TMBglII/QuickCut^TMBamHI(Takara)对L-39片段和pET-28b载体同时进行双酶切，得到酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，得到回收的DNA片段备用。然后利用T4连接酶连接这两个切胶回收后片段，得到pET-39质粒。然后利用QuickCut^TMXhoI/QuickCut^TMNotI(Takara)对R-56片段和pET-39质粒同时进行双酶切，得到酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，得到回收的DNA片段备用。然后利用T4连接酶连接这两个切胶回收后片段，得到供体质粒pET-39/56,序列如SEQ IDNO.43所示。利用QuickCut^TMEcoRI/QuickCut^TMBamHI(Takara)对pUC-19质粒进行双酶切，得到酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用OMEGA凝胶回收试剂盒，得到回收的DNA片段备用。然后采用南京诺唯赞公司一步克隆法试剂盒(货号C113)，将制备的同源臂片段L-31，R-DenA与由QuickCut^TMEcoRI/QuickCut^TMBamHI(Takara)双酶切线性化的pUC-19在体外重组拼接一起，得到供体质粒pUC-31/DenA,序列如SEQ ID NO.44所示。过程中涉及的酶切体系，重组反应体系，反应条件如下：

酶切体系与反应条件(pET-28b/L-39)：

反应条件：

酶切产物置于37℃水浴锅孵育1h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收备用。

连接体系与反应条件(pET-28b酶切回收产物/L-39酶切回收产物)：

反应条件：

连接反应产物置于16℃水浴锅孵育12h。

酶切体系与反应条件(pET-39/D-56)：

反应条件：

酶切产物置于37℃水浴锅孵育1h，然后80℃孵育15min灭活内切酶。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收备用。

连接体系与反应条件(pET-39酶切回收产物/D-56酶切回收产物)：

反应条件：

连接反应产物置于16℃水浴锅孵育12h。

质粒酶切体系(pUC-19)：

反应条件：

酶切产物置于37℃水浴锅孵育1h，然后60℃孵育15min灭活内切酶。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收备用。

体外重组反应体系及反应条件(L-31/R-DenA/线性化载体(pUC-19))：

反应条件：

重组产物置于37℃下孵育30min,然后立即置于冰上冰浴冷却5min

3)质粒转化与鉴定

将上述连接产物或者重组产物转化到大肠杆菌DH5a中，37℃过夜培养，次日挑取单菌落接种到含有50μg/ml卡那霉素(pET-39,pET-39/56)或者含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(pUC-31/DenA)，37℃培养12h后进行菌液PCR鉴定。选取PCR阳性克隆，提取质粒后送公司测序。

3.构建MiNi-T4噬菌体

1)制备用于重组的大肠杆菌

将pLbCas12a-crRNA(39-56)质粒与供体质粒pET-39/56共转化至大肠杆菌B834中，挑取单菌落，接种于含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml壮观霉素LB培养基中培养12h备用。于此同时，将pLbCas12a-crRNA(39-56)质粒单独转化到大肠杆菌B834中，制备只表达LbCas12a-crRNA的大肠杆菌作为对照。

将pLbCas12a-crRNA(31-DenA)质粒与供体质粒pUC-31/DenA共转化至大肠杆菌B834中，挑取单菌落，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml壮观霉素LB培养基中培养12h备用。于此同时，将pLbCas12a-crRNA(31-DenA)质粒单独转化到大肠杆菌B834中，制备只表达LbCas12a-crRNA的大肠杆菌作为对照。

2)体内重组制备MiNi-T4噬菌体

取300μl上述含有pLbCas12a-crRNA(39-56)和pET-39/56的大肠杆菌培养物，加入约2*10⁴PFU T4噬菌体，混匀。37℃孵育7min后，加入含卡那霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃温箱内过夜培养。于此同时，取300μl只含有pLbCas12a-crRNA(39-56)质粒的大肠杆菌B834中，也加入约2*10⁴PFU T4噬菌体，混匀。37℃孵育7min后，加入壮观霉素(50μg/ml)的半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃温箱内过夜培养。结果发现，T4噬菌体感染含有pLbCas12a-crRNA(39-56)和pET-39/56的大肠杆菌时，在双层平板上长出了噬菌斑。但用同样数量的T4噬菌体侵染只含有pLbCas12a-crRNA(39-56)大肠杆菌时，在双层平板上没有长出噬菌斑。将平板上长出的重组噬菌体进行鉴定，鉴定结果如图6A所示，即得到T4△(39-56)重组噬菌体。

取300μl上述含有pLbCas12a-crRNA(31-DenA)和pUC-31/DenA的大肠杆菌培养物，加入约2*10⁴PFU T4△(39-56)噬菌体，混匀。37℃孵育7min后，加入含氨苄青霉素(100μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃温箱内过夜培养。于此同时，取300μl只含有pLbCas12a-crRNA(31-DenA)质粒的大肠杆菌B834中，加入约2*10⁴PFU T4△(39-56)噬菌体，混匀。37℃孵育7min后，加入壮观霉素(50μg/ml)的半固体培养基，混匀后倾倒到含有LB琼脂层的预制平板上，37℃温箱内过夜培养。结果发现，T4△(39-56)噬菌体感染含有pLbCas12a-crRNA(31-DenA)和pUC-31/DenA的大肠杆菌时，在双层平板上长出了噬菌斑。但用同样数量的T4△(39-56)噬菌体侵染只含有pLbCas12a-crRNA(31-DenA)大肠杆菌时，在双层平板上没有长出噬菌斑。将重组噬菌体进行鉴定，鉴定结果如图6B所示，即得到T4△(39-56)△(31-DenA)重组噬菌体。

在此制备MiNi-T4噬菌体过程中涉及到的PCR鉴定体系，条件，引物序列如下:

重组T4△(39-56)噬菌体PCR鉴定扩增体系(40μl)：

引物序列：

F1:5’-aataaaggagaattacatggcta-3’

R1:5’-ttaaccagttactttccacaaat-3’

重组噬菌体的鉴定PCR扩增条件：

95℃10min，95℃30sec，52℃30sec，72℃45sec，进行30个循环，72℃延伸5min。

引物序列：

F2:5’-gaaaaccatccggtgaac-3’

R2:5’-tagatcctccgtatctca-3’

重组噬菌体的鉴定PCR扩增条件：

95℃10min，95℃30sec，52℃30sec，72℃2.5min，进行30个循环，72℃延伸5min。

重组T4△(39-56)△(31-DenA)噬菌体PCR鉴定扩增体系(40μl)：

引物序列：

F3:5’-ctcaactggatacttcgtcaca-3’

R3:5’-caaagaatacggctggaaag-3’

重组噬菌体的鉴定PCR扩增条件：

引物序列：

F4:5’-tcaccaacttcgcagaaa-3’

R4:5’-gagctcaatcgaacatac-3’

重组噬菌体的鉴定PCR扩增条件：

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体及其应用

<160> 44

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3684

<212> DNA

<213> 毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)

<400> 1

atgagcaaac tggaaaaatt tacgaattgt tatagcctgt ccaagaccct gcgtttcaaa 60

gccatccccg ttggcaaaac ccaggagaat attgataata aacgtctgct ggttgaggat 120

gaaaaaagag cagaagacta taagggagtc aaaaaactgc tggatcggta ctacctgagc 180

tttataaatg acgtgctgca tagcattaaa ctgaaaaatc tgaataacta tattagtctg 240

ttccgcaaga aaacccgaac agagaaagaa aataaagagc tggaaaacct ggagatcaat 300

ctgcgtaaag agatcgcaaa agcttttaaa ggaaatgaag gttataaaag cctgttcaaa 360

aaagacatta ttgaaaccat cctgccggaa tttctggatg ataaagacga gatagcgctc 420

gtgaacagct tcaacgggtt cacgaccgcc ttcacgggct ttttcgataa cagggaaaat 480

atgttttcag aggaagccaa aagcacctcg atagcgttcc gttgcattaa tgaaaatttg 540

acaagatata tcagcaacat ggatattttc gagaaagttg atgcgatctt tgacaaacat 600

gaagtgcagg agattaagga aaaaattctg aacagcgatt atgatgttga ggattttttc 660

gagggggaat tttttaactt tgtactgaca caggaaggta tagatgtgta taatgctatt 720

atcggcgggt tcgttaccga atccggcgag aaaattaagg gtctgaatga gtacatcaat 780

ctgtataacc aaaagaccaa acagaaactg ccaaaattca aaccgctgta caagcaagtc 840

ctgagcgatc gggaaagctt gagcttttac ggtgaaggtt ataccagcga cgaggaggta 900

ctggaggtct ttcgcaatac cctgaacaag aacagcgaaa ttttcagctc cattaaaaag 960

ctggagaaac tgtttaagaa ttttgacgag tacagcagcg caggtatttt tgtgaagaac 1020

ggacctgcca taagcaccat tagcaaggat atttttggag agtggaatgt tatccgtgat 1080

aaatggaacg cggaatatga tgacatacac ctgaaaaaga aggctgtggt aactgagaaa 1140

tatgaagacg atcgccgcaa aagctttaaa aaaatcggca gctttagcct ggagcagctg 1200

caggaatatg cggacgccga cctgagcgtg gtcgagaaac tgaaggaaat tattatccaa 1260

aaagtggatg agatttacaa ggtatatggt agcagcgaaa aactgtttga tgcggacttc 1320

gttctggaaa aaagcctgaa aaaaaatgat gctgttgttg cgatcatgaa agacctgctc 1380

gatagcgtta agagctttga aaattacatt aaagcattct ttggcgaggg caaagaaaca 1440

aacagagacg aaagctttta tggcgacttc gtcctggctt atgacatcct gttgaaggta 1500

gatcatatat atgatgcaat tcgtaattac gtaacccaaa agccgtacag caaagataag 1560

ttcaaactgt atttccagaa cccgcagttt atgggtggct gggacaaaga caaggagaca 1620

gactatcgcg ccactattct gcgttacggc agcaagtact atctcgccat catggacaaa 1680

aaatatgcaa agtgtctgca gaaaatcgat aaagacgacg tgaacggaaa ttacgaaaag 1740

attaattata agctgctgcc agggcccaac aagatgttac cgaaagtatt tttttccaaa 1800

aaatggatgg catactataa cccgagcgag gatatacaga agatttacaa aaatgggacc 1860

ttcaaaaagg gggatatgtt caatctgaat gactgccaca aactgatcga tttttttaaa 1920

gatagcatca gccgttatcc taaatggtca aacgcgtatg attttaattt ctccgaaacg 1980

gagaaatata aagacattgc tggtttctat cgcgaagtcg aagaacaggg ttataaagtt 2040

agctttgaat cggccagcaa gaaagaggtt gataaactgg tggaggaggg taagctgtat 2100

atgtttcaga tttataacaa agactttagc gacaaaagcc acggtactcc taatctgcat 2160

acgatgtact ttaaactgct gtttgatgag aataaccacg gccaaatccg tctctccggt 2220

ggagcagaac tttttatgcg gcgtgcgagc ctaaaaaagg aagaactggt ggtgcatccc 2280

gccaacagcc cgattgctaa caaaaatcca gataatccta agaagaccac cacactgtcg 2340

tacgatgtct ataaggataa acgtttctcg gaagaccagt atgaattgca tataccgata 2400

gcaattaata aatgcccaaa aaacattttc aaaatcaaca ctgaagttcg tgtgctgctg 2460

aaacatgatg ataatccgta tgtgatcgga attgaccgtg gggagagaaa tctgctgtat 2520

attgtagtcg ttgatggcaa gggcaacatc gttgagcagt atagcctgaa tgaaataatt 2580

aataatttta acggtatacg tattaaaacc gactatcata gcctgctgga taaaaaggag 2640

aaagagcgtt ttgaggcacg ccaaaattgg acgagcatcg aaaacatcaa ggaactgaag 2700

gcaggatata tcagccaagt agtccataaa atctgtgaac tggtggagaa gtacgacgct 2760

gtcattgccc tggaagacct caatagcggc tttaaaaaca gccgggtgaa ggtggagaaa 2820

caggtatacc aaaagtttga aaagatgctc attgataagc tgaactatat ggttgataaa 2880

aagagcaacc cgtgcgccac tggcggtgca ctgaaagggt accaaattac caataaattt 2940

gaaagcttta aaagcatgag cacgcagaat gggtttattt tttatatacc agcatggctg 3000

acgagcaaga ttgaccccag cactggtttt gtcaatctgc tgaaaaccaa atacacaagc 3060

attgcggata gcaaaaaatt tatttcgagc ttcgaccgta ttatgtatgt tccggaggaa 3120

gatctgtttg aatttgccct ggattataaa aacttcagcc gcaccgatgc agattatatc 3180

aaaaaatgga agctgtacag ttatggtaat cgtatacgta tcttccgtaa tccgaagaaa 3240

aacaatgtgt tcgattggga agaggtctgt ctgaccagcg cgtataaaga actgttcaac 3300

aagtacggaa taaattatca gcaaggtgac attcgcgcac tgctgtgtga acagtcagat 3360

aaagcatttt atagcagctt tatggcgctg atgagcctga tgctccagat gcgcaacagc 3420

ataaccggtc gcacagatgt tgactttctg atcagccctg tgaagaatag cgacggcatc 3480

ttctacgatt ccaggaacta tgaagcacag gaaaacgcta ttctgcctaa aaatgccgat 3540

gccaacggcg cctataatat tgcacggaag gttctgtggg cgattggaca gttcaagaaa 3600

gcggaagatg agaagctgga taaggtaaaa attgctatta gcaataagga atggctggag 3660

tacgcacaga catcggttaa acac 3684

<210> 2

<211> 197

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gatacttcta ttctactctg actgcaaacc aaaaaaacaa gcgctttcaa aacgcttgtt 60

ttatcatttt tagggaaatt aatctcttaa tccttttatc attctacatt taggcgctgc 120

catcttggga caatgaaaac gttagtcatg gcgcgccttg acggctagct cagtcctagg 180

tacagtgcta gcttaat 197

<210> 3

<211> 2302

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

tgagacccaa gcccggccgg cctaaggcga tgccccctcg acctcgatca gggaggcgtt 60

caggacgact cacaaagaaa gccgggcaat gcccggcttt ttccacgcct cctgggctga 120

cttcaggtgc tacatttgaa gagataaatt gcactgaaat ctagagcggt tcagtagaaa 180

agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatcttttgc cctgtaaacg 240

aaaaaaccac ctggggaggt ggtttgatcg aaggttaagt cagttgggga actgcttaac 300

cgtggtaact ggctttcgca gagcacagca accaaatctg tccttccagt gtagccggac 360

tttggcgcac acttcaagag caaccgcgtg tttagctaaa caaatcctct gcgaactccc 420

agttaccaat ggctgctgcc agtggcgttt taccgtgctt ttccgggttg gactcaagtg 480

aacagttacc ggataaggcg cagcagtcgg gctgaacggg gagttcttgc ttacagccca 540

gcttggagcg aacgacctac accgagccga gataccagtg tgtgagctat gagaaagcgc 600

cacacttccc gtaagggaga aaggcggaac aggtatccgg taaacggcag ggtcggaaca 660

ggagagcgca agagggagcg acccgccgga aacggtgggg atctttaagt cctgtcgggt 720

ttcgcccgta ctgtcagatt catggttgag cctcacggct cccacagatg caccggaaaa 780

gcgtctgttt atgtgaactc tggcaggagg gcggagccta tggaaaaacg ccaccggcgc 840

ggccctgctg ttttgcctca catgttagtc ccctgcttat ccacggaatc tgtgggtaac 900

tttgtatgtg tccgcagcgc ccgccgcagt ctcacgcccg gagcgtagcg accgagtgag 960

ctagctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 1020

ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagggaagc ggtgatcgcc 1080

gaagtatcga ctcaactatc agaggtagtt ggcgtcatcg agcgccatct cgaaccgacg 1140

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tacgcacaga catcggttaa acactgagat acttctattc tactctgact gcaaaccaaa 3720

aaaacaagcg ctttcaaaac gcttgtttta tcatttttag ggaaattaat ctcttaatcc 3780

ttttatcatt ctacatttag gcgctgccat cttgggacaa tgaaaacgtt agtcatggcg 3840

cgccttgacg gctagctcag tcctaggtac agtgctagct taatctcgag atagaattct 3900

gtaagctttg agacccaagc ccggccggcc taaggcgatg ccccctcgac ctcgatcagg 3960

gaggcgttca ggacgactca caaagaaagc cgggcaatgc ccggcttttt ccacgcctcc 4020

tgggctgact tcaggtgcta catttgaaga gataaattgc actgaaatct agagcggttc 4080

agtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tcttttgccc 4140

tgtaaacgaa aaaaccacct ggggaggtgg tttgatcgaa ggttaagtca gttggggaac 4200

tgcttaaccg tggtaactgg ctttcgcaga gcacagcaac caaatctgtc cttccagtgt 4260

agccggactt tggcgcacac ttcaagagca accgcgtgtt tagctaaaca aatcctctgc 4320

gaactcccag ttaccaatgg ctgctgccag tggcgtttta ccgtgctttt ccgggttgga 4380

ctcaagtgaa cagttaccgg ataaggcgca gcagtcgggc tgaacgggga gttcttgctt 4440

acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgagccgaga taccagtgtg tgagctatga 4500

gaaagcgcca cacttcccgt aagggagaaa ggcggaacag gtatccggta aacggcaggg 4560

tcggaacagg agagcgcaag agggagcgac ccgccggaaa cggtggggat ctttaagtcc 4620

tgtcgggttt cgcccgtact gtcagattca tggttgagcc tcacggctcc cacagatgca 4680

ccggaaaagc gtctgtttat gtgaactctg gcaggagggc ggagcctatg gaaaaacgcc 4740

accggcgcgg ccctgctgtt ttgcctcaca tgttagtccc ctgcttatcc acggaatctg 4800

tgggtaactt tgtatgtgtc cgcagcgccc gccgcagtct cacgcccgga gcgtagcgac 4860

cgagtgagct agctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga 4920

gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agggaagcgg 4980

tgatcgccga agtatcgact caactatcag aggtagttgg cgtcatcgag cgccatctcg 5040

aaccgacgtt gctggccgta catttgtacg gctccgcagt ggatggcggc ctgaagccac 5100

acagtgatat tgatttgctg gttacggtga ccgtaaggct tgatgaaaca acgcggcgag 5160

ctttgatcaa cgaccttttg gaaacttcgg cttcccctgg agagagcgag attctccgcg 5220

ctgtagaagt caccattgtt gtgcacgacg acatcattcc gtggcgttat ccagctaagc 5280

gcgaactgca atttggagaa tggcagcgca atgacattct tgcaggtatc ttcgagccag 5340

ccacgatcga cattgatctg gctatcttgc tgacaaaagc aagagaacat agcgttgcct 5400

tggtaggtcc agcggcggag gaactctttg atccggttcc tgaacaggat ctatttgagg 5460

cgctaaatga aaccttaacg ctatggaact cgccgcccga ctgggctggc gatgagcgaa 5520

atgtagtgct tacgttgtcc cgcatttggt acagcgcagt aaccggcaaa atcgcgccga 5580

aggatgtcgc tgccgactgg gcaatggagc gcctgccggc ccagtatcag cccgtcatac 5640

ttgaagctag acaggcttat cttggacaag aagaagatcg cttggcctcg cgcgcagatc 5700

agttggaaga atttgtccac tacgtgaaag gcgagatcac caaggtagtc ggcaaataat 5760

gtctaacaat tcgttcaagc cgaggggccg caagatccgg ccacgatgac ccggtcgtcg 5820

gttcagggca gggtaccagg cacgcctaac cgtcagtgag attggatgag tgaacgatat 5880

tgatcgagaa gagccctgcg cagccgctgc cgtgcctgca ggaagcaacg gcccggaggg 5940

tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg 6000

acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact ctgctagctt ctagagcaca gctaacacca 6060

cgtcgtccct atctgctgcc ctaggtctat gagtggttgc tggataactt tacgggcatg 6120

cataaggctc gtatgatata ttcaggctga ccacaacggt ttccctctac aaataatttt 6180

gtttaacttt tactagagga ggaggcaaaa 6210

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

tactagagga ggaggcaaaa atgagcaaac tggaaaaatt tacg 44

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

ctcagtgttt aaccgatgtc tgtgc 25

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

gacatcggtt aaacactgag atacttctat tctactctga ctgcaaacc 49

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

tctcaaagct tacagaattc tatctcgaga ttaagctagc actgtacc 48

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

gaattctgta agctttgaga cccaagcccg 30

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

ttttgcctcc tcctctagta aaagt 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

attcttttta ctccacttgt agt 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

ttccttctcc accctgacca cca 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

caccgtaata gtcatcaaaa tcc 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

aagatgctga ccatattctt gcg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

attttagaaa caactttatc acc 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

agctaatgtt cctacctcaa gca 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

tggattccaa cgcccgtttt tac 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

catgagccga atcccatata tgt 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

agcaaatgta cccccgacga ata 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

ggagttatat caactgtaaa agt 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

ctgctacacc cagtggtcaa act 23

<210> 23

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

atcagcagca tcaggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatg 47

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

ggttgtggtg gttgcgctca ctgcccgc 28

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

tcacgaggcc tgatgctgct gatgccgc 28

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

agtcataagt tatccttatt ttaatgttac ga 32

<210> 27

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

aataaggata acttatgact gtgagcaagg gcgaggagc 39

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

agtacataac taaaagttgc gtacagctcg tccatgccga 40

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

gcaactttta gttatgtact aaaaggacc 29

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 30

tgagcgcaac caccacaacc tcagttctca taatc 35

<210> 31

<211> 4392

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 31

gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 60

cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 120

tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 180

aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 240

gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 300

ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 360

ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 420

gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 480

ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 540

cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 600

cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 660

gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 720

aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 780

tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 840

gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 900

tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 960

gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 1020

tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 1080

ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 1140

ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc 1200

tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 1260

aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 1320

gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc 1380

gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 1440

ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 1500

gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 1560

gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 1620

gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca 1680

tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 1740

gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 1800

agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 1860

aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata 1920

ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta 1980

gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta 2040

agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggcctgatgc 2100

tgctgatgcc gcagagggat taaaatatga cgatgaagaa gtcaatccag aagcagcact 2160

tctgattgat tctccgatta aatctgacat taaaattgaa gtagtagaaa cggataaaat 2220

tcctgaaaat accgatgttt tgattgaaga tactcctttt gttgaagaaa aattcgaaca 2280

ggctgtagct gagattattg aatctgaaaa gccgtctgta tttactcttc cggaaaactt 2340

tagtccgaat cttcaactga ttggaaaaaa tctaggattc tgtactgttc cttggtggat 2400

ttatcaatgg attgctgaaa ctcctgattg gaaatctcac ccaactagtt ttgaacatgc 2460

gtcagcacac caaactttat ttagcttaat ttattacatt aatcgcgatg gatcagtttt 2520

aattcgtgaa acacgcaact cttctttcgt aacattaaaa taaggataac ttatgactgt 2580

gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga 2640

cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa 2700

gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt 2760

gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca 2820

cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa 2880

ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa 2940

ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct 3000

ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat 3060

caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca 3120

ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct 3180

gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct 3240

ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtacg caacttttag 3300

ttatgtacta aaaggacctg ccggtcaaaa gactattaaa gtagttgcaa caaatacact 3360

ttctgaagga ggcccggaaa cggctgaagc gacaacaact atcacagtta aaaataagac 3420

acagacgact accttagccg taactcctgc tagtcctgcg gctggagtga ttggaacccc 3480

agttcaattt actgctgcct tagcttctca acctgatgga gcatctgcta cgtatcagtg 3540

gtatgtagat gattcacaag ttggtggaga aactaactct acatttagct atactccaac 3600

tacaagtgga gtaaaaagaa ttaaatgcgt agcccaagta accgcgacag attatgatgc 3660

actaagcgtt acttctaatg aagtatcatt aacggttaat aagaagacaa tgaatccaca 3720

ggttacattg actcctcctt ctattaatgt tcagcaagat gcttcggcta catttacggc 3780

taatgttacg ggtgctccag aagaagcaca aattacttac tcatggaaga aagattcttc 3840

tcctgtagaa gggtcaacta acgtatatac tgtcgatacc tcatctgttg gaagtcaaac 3900

tattgaagtt actgcaactg ttactgctgc agattataac cctgtaaccg ttaccaaaac 3960

tggtaatgta acagtcacgg ctaaagttgc tccagaacca gaaggtgaat taccttatgt 4020

tcatcctctt ccacaccgta gctcagctta catctggtgc ggttggtggg ttatggatga 4080

aatccaaaaa atgaccgaag aaggtaaaga ttggaaaact gacgacccag atagtaaata 4140

ttacctgcat cgttacactc tccagaagat gatgaaagac tatccagaag ttgatgtcca 4200

agaatcgcgt aatggataca tcattcataa aactgcttta gaaactggta tcatctatac 4260

ctatccataa tcataagggg cttcggcccc tttcttcatt ttgaaagcac acaaaacaca 4320

atcagaaaat gatgtatata atggcaccaa ctcgataaca tgagattgat tatgagaact 4380

gaggttgtgg tg 4392

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 32

aaaaggctcc atacctaaac gtc 23

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 33

atgcagatat tagctcacgt tca 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 34

aaacatatta ttagcgataa ttt 23

<210> 35

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 35

ggaagatcta ggataaacta cagcaagtgt ctggag 36

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 36

cgcggatcca ggattcaact attcgtttta 30

<210> 37

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 37

atttgcggcc gcagattcat gtttcccagc gtacc 35

<210> 38

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 38

ccgctcgaga cggaaaggaa aacactcttc t 31

<210> 39

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 39

caggtcgact ctagaggatc catgagacag cacgaattgg tagc 44

<210> 40

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 40

ctagaatgtc gtggattggg tttgtattga tagaccatat agt 43

<210> 41

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 41

cccaatccac gacattctag tgcatctgg 29

<210> 42

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 42

aaaacgacgg ccagtgaatt caacagtgcg gtcttccatg c 41

<210> 43

<211> 6706

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 43

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcta ggataaacta 4980

cagcaagtgt ctggagacga tccagtgtaa tgtcaagata aacttgggac agctcattag 5040

tttcaaatga cataaaatca ggaatgaaag taacacgagt tcctttccat tttccaggaa 5100

tatcttccca tgatttattt tccatgccat ttgaacaacg aactacaata ttattttgac 5160

cgtcgccagt ttcaccgaca aacatcacag aaaaaatgtt tgtcaaacta gaaccaacac 5220

cgttcatacc gccggtgacg cgttctttat catcaccaaa gttaccacct gcttttggaa 5280

tagtccatgc ggcaacagga ccaggaattt cttcaccggt aggtgtttta accatcgctt 5340

gtggaatacc gcgaccgtta tcttcaactg ttacttgatt gtttttaata gtaacattaa 5400

ttttattcgc gaatttaaac ttagtacgaa taccttcatc tactgagtta tcgataattt 5460

catcaataag cttaacaaga ccaggtacat actgaacact ttcccattta ccaaacataa 5520

agcgctcatg cgtttcatta gcagaagagc caatgtacat gccactacgc tttttgatat 5580

gttcaatatc gctcagaatt ttaatttcat tcttaatcat cacttatcct cgtttggttt 5640

cgggaatatt atactccggt aatcataaag ctaaaggccc gaaggccttt tatttaaaac 5700

gaatagttga atcctggatc cgaattcgag ctccgtcgac aagcttgcgg ccgcagattc 5760

atgtttccca gcgtaccaaa agacgccttt cggcgtccta acttttacta tatatgttct 5820

ataaaatttt tgtttaatat ccattatctt gacgttcaaa attatgtttg ttcttcagat 5880

aataaagttt aaagatttct tccgcattca ttccaaggcc aacaaacata tttaatacga 5940

aatgaaatat atccacaagc tcaaatttaa tttcgagctg gtcttcgggg gacatttcat 6000

caatgcgttt ttcttgcgct tcaatataac gtgctttcca ttttttccat acagcagaag 6060

cttctttttc accacgtgac atttcaccaa gagaagtcag aagttcgcgg aattcatcat 6120

caatacagtc tttttgttca cgcatccaag aaacaacatc accggcagtt tctaatttat 6180

ctggatgata gcagtattcg cggacattag ccaaacgaat ctgtaaaaac cgctgcatat 6240

caagcataac ttgcagcgga tctttttcat caccgagaat atcccagtat tcattttgag 6300

ctttatcaac accttcgatc aaatgagcac attcattaaa gtgagccatt agttttcctt 6360

tcaattcatt aataagttaa ataattatat catttgagta tgtaagcaat taattaaaaa 6420

tatatacttc atcagttcca ttcttttctt tggaatgata tatgttaaag acgtattttt 6480

tattaagatg ctttacatta tattttttag accattcttt aagaagagtg ttttcctttc 6540

cgtctcgagc accaccacca ccaccactga gatccggctg ctaacaaagc ccgaaaggaa 6600

gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa 6660

cgggtcttga ggggtttttt gctgaaagga ggaactatat ccggat 6706

<210> 44

<211> 4040

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 44

gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 60

caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 120

aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 180

tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 240

acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 300

ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 360

gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc 420

tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa 480

agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc 540

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 600

cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagcttgca tgcctgcagg tcgactctag 660

aggatccatg agacagcacg aattggtagc tgttgtactt cagacatcgt ttttcctttt 720

tgttaacaga tgaattaata ataacaaata gttcttaaag catttattta ccaataaatt 780

gaagcaaatg ctcaactttc ataccattaa cggaaatcaa tttgtcaata gaaaaacctc 840

gccacgcacc aagctcaaca tcaaatactg gaatcatgtc agtagattct ttccgagtag 900

attcagtcaa tttgccagtt tgcatggttg gcataaagtc tgcatcacga gtacctttca 960

tagtacgaat agtaccatca gacttttcaa aaactacgtt tgaaacaccc atggacaatt 1020

tagttttcaa aatttcacga attgctactt tctgctcagt tgtcagtttc atttatttac 1080

ctattacagt tttaatatga gttgttccac gttctttaag ggtggaaagt aatttttggc 1140

atttttctaa atcagatttc caactatatg gtctatcaat acaaacccaa tccacgacat 1200

tctagtgcat ctggaagtaa ccaatcagaa taagatgcat aattatatga gaaaattctg 1260

taagttcttc cagatgcact tacatcatct gagtaaaaaa acttacgctg cgaatcctta 1320

catagttcca ttaaattgtt aaaaagttct tgcattgtgt atcctctttt gtgttttgaa 1380

tatagtacca cactccatgt ggaagcatca ttttttcttg tgttgaatat tccaaggcgg 1440

gttaaacagt ttaatgaata gaggctcctc taagtcaatc gttgcgattg tcattgtacc 1500

taactcattt gtcatagaaa gattaaaaca ttggcgggcg taaaattcaa ctttgcttcc 1560

ttcctttagc gcagaatgaa ttaatgcaga tttagtagaa tcagacgttt tgtctttgcg 1620

gttaatagca gttctataat agtttattct tttacgtaaa tttttagttt ttccaatata 1680

aacaagctca tcatttatag caatagcata aattacgtta tacttgtttg gaatagataa 1740

ttgttttata cttccattgt cgtctaattc tagctcagta tatttaataa atgaatattc 1800

tgttgcaatt tctttcataa taaaatgggc cttgcggccc actccttaaa agtatttttt 1860

aaaactcatc ataactttat catcaacatc attatcaatc tgtgcaacaa ggtaagatga 1920

cagttctact tcttgcggcg cggattgaac attatcagaa ttaagatatt cacgaatcca 1980

aggatatgga tgtttaaccg gagcatcggt aattgggcat ggaagaccgc actgttgaat 2040

tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 2100

cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 2160

cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc 2220

cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct 2280

gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg 2340

gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg 2400

tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc 2460

ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt 2520

cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 2580

ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg 2640

agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt 2700

tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga 2760

gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa 2820

gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt 2880

attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 2940

gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 3000

agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 3060

ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 3120

cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 3180

gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 3240

cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 3300

gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 3360

ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 3420

acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 3480

ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 3540

aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 3600

aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 3660

ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 3720

ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 3780

actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc 3840

caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 3900

gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 3960

ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 4020

cgaacgacct acaccgaact 4040

Claims

1.一种基于CRISPR-Cas12a系统的噬菌体基因组编辑载体，包含由proC启动子调控的毛螺科菌LbCas12a蛋白编码框核酸序列、由J23100启动子调控的crRNA表达框核酸序列、包含复制因子、耐受基因和负责调控LbCas12a蛋白表达的proC启动子元件的质粒骨架核酸序列。

2.如权利要求1所述的噬菌体基因组编辑载体，其特征在于：所述复制因子是大肠杆菌复制因子CloDF13。

3.如权利要求1所述的噬菌体基因组编辑载体，其特征在于：所述耐受基因是壮观霉素耐受基因SMR。

4.如权利要求1所述的噬菌体基因组编辑载体，其特征在于：所述载体具有SEQ IDNO.5所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO.5所示的序列具有70％以上同源性的序列。

5.一种构建权利要求1-4任何一项所述噬菌体基因组编辑载体的方法，其特征在于包括以下步骤：

3)以DS-SPCas质粒为模板，PCR扩增得到包含复制因子、耐受基因和proC启动子元件的质粒骨架核酸序列，该序列如SEQ ID NO.3所示；

4)通过克隆方法将上述三种核酸序列片段连接在一起，得到噬菌体基因组编辑载体。

6.含有权利要求1-4任何一项所述噬菌体基因组编辑载体的工程菌。

7.权利要求1-4任何一项所述的噬菌体基因组编辑载体、权利要求6所述的工程菌在编辑噬菌体基因组中的应用。

8.一种编辑噬菌体基因组的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将噬菌体靶向目标区域的Spacer序列克隆到权利要求1-4任何一项所述的噬菌体基因组编辑载体；

2)在线性化载体的DNA片段上拼接噬菌体突变区域和上下游同源臂，构建含有预期突变的供体质粒；

3)将1)和2)中构建的质粒共转化到宿主菌；

4)用噬菌体感染含有上述两种质粒的宿主菌，得到的重组噬菌体。

9.如权利要求8所述编辑噬菌体基因组的方法，其特征在于：所述噬菌体为T4噬菌体。

10.如权利要求8所述编辑噬菌体基因组的方法，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌。