KR20220110748A - 대립유전자의 rna-코딩된 dna-대체를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

대립유전자의 rna-코딩된 dna-대체를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20220110748A
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조셉 매튜 와츠
에런 험멜
용주 김
샤이 조슈아 라윗
데이빗 쉬와크
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페어와이즈 플랜츠 서비시즈, 인크.
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Abstract

본 발명은 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 리버스 트랜스크립타제 및 연장된 가이드 핵산을 포함하는 재조합 핵산 구축물 및 식물에서 핵산을 변형시키기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다. 제1 측면에서, 표적 핵산을 (a) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질; (b) 리버스 트랜스크립타제, 및 (c) 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 유형 II 또는 유형 V CRISPR RNA, 연장된 유형 II 또는 유형 V CRISPR DNA, 연장된 유형 II 또는 유형 V crRNA, 연장된 유형 II 또는 유형 V crDNA)과 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법이 제공된다.

Description

대립유전자의 RNA-코딩된 DNA-대체를 위한 조성물 및 방법
서열 목록의 전자적 출원에 관한 진술
37 C.F.R. § 1.821 하에 제출되고, 명칭이 1499-12WO_ST25.txt이고, 크기가 768,694 바이트이고, 2020년 11월 5일에 생성되고, EFS-웹을 통해 출원된 ASCII 텍스트 형식의 서열 목록은 종이 사본 대신 제공된다. 이 서열 목록은 그의 개시내용에 대해 본 명세서에 참조로 포함된다.
우선권 진술
본 출원은 2019년 11월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 62/930,836의 35 U.S.C. § 119 (e) 하의 우선권을 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 리버스 트랜스크립타제 및 연장된 가이드 핵산을 포함하는 재조합 핵산 구축물 및 식물에서 핵산을 변형시키기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다.
염기 편집은 시토신 및 아데닌 잔기를 각각 티민 및 구아닌으로 변화시키는 효율적인 방식인 것으로 나타났다. 이들 툴은, 강력하지만, 일부 제한, 예컨대 구경꾼 염기, 높은 PAM 밀도를 갖는 효소가 보상하는데 이용가능하지 않는 한, 소질-관련 표적에 제한된 접근성을 제공하는 작은 염기 편집 창, 시토신 및 아데닌을 각각 티민 및 구아닌 이외의 잔기로 전환시키는 제한된 능력, 및 티민 또는 구아닌 잔기를 편집하는 능력이 없음을 갖는다. 따라서, 염기 편집을 위해 이용가능한 현재 툴은 제한된다. 따라서, 보다 많은 수의 유기체에 대한 가능한 편집물의 범위를 증가시킴으로써 핵산 편집을 보다 유용하게 만들기 위해, 새로운 편집 툴이 필요하다.
발명의 요약
제1 측면에서, 표적 핵산을 (a) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질; (b) 리버스 트랜스크립타제, 및 (c) 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 유형 II 또는 유형 V CRISPR RNA, 연장된 유형 II 또는 유형 V CRISPR DNA, 연장된 유형 II 또는 유형 V crRNA, 연장된 유형 II 또는 유형 V crDNA)과 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법이 제공된다.
제2 측면에서, 제1 부위에서의 표적 핵산을 (a)(i) 제1 CRISPR-Cas 이펙터 단백질; 및 (ii) 제1 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 CRISPR RNA, 연장된 CRISPR DNA, 연장된 crRNA, 연장된 crDNA); 및 (b)(i) 제2 CRISPR-Cas 이펙터 단백질, (ii) 제1 리버스 트랜스크립타제; 및 (ii) 제1 가이드 핵산과 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법이 제공된다.
제3 측면에서, 본 발명의 발현 카세트를 식물 또는 식물 세포 내로 도입하고, 그에 의해 식물 또는 식물 세포에서 표적 핵산을 변형시키고, 변형된 표적 핵산을 포함하는 식물 또는 식물 세포를 생산하는 것을 포함하는, 식물 또는 식물 세포에서 표적 핵산을 변형시키는 방법이 제공된다.
제4 측면에서, (a) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질; (b) 리버스 트랜스크립타제, 및 (c) 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 CRISPR RNA, 연장된 CRISPR DNA, 연장된 crRNA, 연장된 crDNA; 예를 들어, 표적화된 대립유전자 가이드 (tag) 핵산 (즉, tagDNA, tagRNA))을 포함하는 복합체가 제공된다.
제5 측면에서, 5'에서 3'로 (a) 식물 특이적 프로모터 서열 (예를 들어 ZmUbi1, MtUb2, RNA 폴리머라제 II (Pol II))을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (b) 유형 V CRISPR-Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cpf1 (Cas12a), dCas12a 등)를 코딩하는 식물 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드; (c) 링커 서열; 및 (d) 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 식물 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유기체에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 발현 카세트가 제공된다.
제6 측면에서, (a) 프로모터 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (b) 연장된 RNA 가이드 서열을 포함하고, 여기서 연장된 가이드 핵산은 그의 3' 단부에 프라이머 결합 부위 및 표적 핵산 내로 혼입되는 편집물 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제 주형)을 포함하는 연장된 부분을 포함하고, 임의로 연장된 가이드 핵산은 발현 카세트에 포함되고, 임의로 연장된 가이드 핵산은 Pol II 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인, 유기체에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 발현 카세트가 제공된다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 변형된 표적 핵산을 포함하는 식물 세포, 박테리아 세포, 고세균 세포, 진균 세포, 동물 세포를 포함한 세포, 뿐만 아니라 상기 세포를 포함하는 식물, 박테리아, 고세균, 진균, 및 동물을 포함한 유기체를 추가로 제공한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 및 발현 카세트를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 이들 및 다른 측면은 하기 발명의 설명에서 보다 상세하게 제시된다.
도 1은 crRNA를 벗어나 역전사로부터의 DNA 서열의 생성 및 닉 부위 내로의 후속 통합을 나타내는 개략도를 제공한다. 연장된 가이드 crRNA (tagRNA)는 Cpf1 니카제 (cas12a 니카제)에 결합된다 (nCpf1, 상부 좌측). 대안적으로, 편집 주형을 코딩하는 연장물은 crRNA의 5'에 위치할 수 있다. crRNA의 3' 단부는 닉 부위에서 DNA에 대해 상보적이다 (비볼드체 쌍형성한 선, 상부 좌측). nCpf1은 리버스 트랜스크립타제 (RT)에 공유 연결될 수 있거나, 또는 RT는 nCpf1에 동원될 수 있고, 이 경우 다수의 리버스 트랜스크립타제 단백질이 nCpf1에 동원될 수 있다. RT는 제2 가닥 상의 DNA 닉의 3' 단부로부터 DNA를 중합하여, 게놈에 비-상보적인 뉴클레오티드 (볼드체 쌍형성한 선, 브레이스, 상부 우측), 이어서 상보적 뉴클레오티드 (비-볼드체 쌍형성한 선, 상부 우측)를 갖는 crRNA에 상보적인 DNA 서열을 생성한다. 해리시, 생성된 DNA는 3' 오버행을 갖는 연장된 ssDNA를 가지며, 이는 원래 DNA (비-볼드체 쌍형성한 선, 하부 우측)와 매우 동일한 서열이지만, 일부 비-천연 뉴클레오티드 (볼드체 쌍형성한 선, 브레이스, 하부 우측)를 갖는다. 이 플랩은 DNA 내로 혼입된 미스매칭된 뉴클레오티드가 있는 5' 오버행을 갖는 구조 (하부 좌측)와 평형에 있다. 평형은 미스매치 복구, 복구 및 복제 동안 5' 플랩의 제거를 감소시킴으로써, 및 또한 본원에 기재된 바와 같은 제1 가닥을 니킹함으로써 좌측의 구조를 향해 유도될 수 있다.
도 2는 미스매치 복구를 감소시키는 방법을 나타내는 개략도를 제공한다. 변형된 뉴클레오티드 (볼드체, 브레이스)를 갖는 최종 생성물을 형성하는데 보다 바람직한 평형을 유도하기 위해, 니카제는 RT-편집 영역 (번개 표시)의 외부의 영역 - 제2 가닥 (예를 들어, 표적 가닥 또는 상부 가닥)에서 닉으로부터의 거리에서 표적 핵산의 제1 가닥 (예를 들어, 표적 가닥 또는 하부 가닥)을 커팅하도록 지정된다 (가이드 핵산을 통해). nCpf1:crRNA 분자는 편집 버블의 어느 하나의 측 또는 둘 다의 측 상에 있을 수 있다. 제1 가닥 (파선)을 니킹하는 것은 새롭게 혼입된 뉴클레오티드가 미스매치 복구 및 복제 동안 정확한 뉴클레오티드이고, 따라서 새로운 뉴클레오티드를 갖는 최종 생성물을 선호함을 세포에게 지시한다. 바람직한 생성물을 향한 평형을 유도하는 다른 가능한 방식은 5' 플랩의 제거를 포함할 수 있다.
도 3은 본 발명의 조성물을 사용하여 핵산을 변형시키는 대안적인 방법을 나타내고, 여기서 2개의 닉에서 제2 가닥에 도입되고, RT에 의해 도입된 서열은 이중-니킹된 WT 서열을 대체하고, 그에 의해 게놈 내로 보다 효율적으로 혼입된다.
도 4. LbCas12a_R1138A는 1% TAE-아가로스 겔 상에서 분해된 시험관내에서 입증된 바와 같은 니카제이다. 슈퍼코일화된 2.8 kB 플라스미드는 이중-가닥 파단이 야생형 LbCas12a (레인 3)에 의해 생성된 때까지 2.0 kB (레인 2)의 겉보기 크기로 운행하였다.
도 5이. 콜라이(E. coli)에서 시험된 REDRAW 편집제의 배치를 나타낸다 (실시예 1 참조).
도 6은 제1 라이브러리에서 시험된 tagRNA의 형태를 나타낸다.
도 7은 REDRAW 편집에 사용하기 위한 예시 디자인된 헤어핀 서열의 구조를 나타낸다.
도 8은 항생제 저항성을 복원하는 기능정지된 aadA 유전자에서의 TGA > CTG 편집물을 입증하는 생거(Sanger) 시퀀싱 결과를 나타낸다. 편집물은 단백질 배치 SV40-MMLV-RT-XTEN-nLbCas12a-SV40 (서열식별번호(SEQ ID NO):71)을 갖는 선택 10에서의 콜로니로부터 관찰되었다.
도 9는 항생제 스트렙토마이신에 대한 저항성을 부여하는 이. 콜라이 게놈에서의 rpsL 유전자에서의 AAA > CGT 편집물을 입증하는 생거 시퀀싱 결과를 나타낸다. 편집물은 단백질 배치 SV40-MMLV-RT-XTEN-nRVRLbCas12a(H759A)-SV40 (서열식별번호:79)을 갖는 선택 2.5에서의 콜로니로부터 관찰되었다.
도 10은 항생제 저항성을 복원하는 기능정지된 aadA 유전자에서의 TGA > GAT 편집물을 입증하는 생거 시퀀싱 결과를 나타낸다. 편집물은 단백질 배치 SV40-nLbCas12a-XTEN-MMLV-RT-SV40 (서열식별번호:73)을 갖는 선택 2.25에서의 콜로니로부터 관찰되었다.
도 11은 항생제 저항성을 복원하는 기능정지된 aadA 유전자에서의 TGA > GAT 편집물을 입증하는 생거 시퀀싱 결과를 나타낸다. 편집물은 단백질 배치 SV40-MMLV-RT-XTEN-nLbCas12a(H759A)-SV40 (서열식별번호:83)을 갖는 선택 2.31에서의 콜로니로부터 관찰되었다.
도 12는 인간 세포에서 수행된 예시 편집 방법을 나타낸다 (실시예 2 참조). 패널 A는 이중 가닥 표적 핵산을 나타낸다. Cas12a 복합체 (복합체는 나타내어지지 않은 연장된 가이드 핵산을 포함함)는 임의로 5'-3' 엑소뉴클레아제 (패널 B)로 제거되는 제2 가닥 (상부 가닥, 비-표적 가닥)에서 5' 플랩을 갖는 제1 가닥 (표적 가닥, 하부 가닥)에 동원된다. 패널 C는 리버스 트랜스크립타제 MMuLV-RT (5M))가 표적 핵산 (파선 = 연장물) 상의 프라이밍 부위 또는 프라이머 (프라이머 결합 부위에 상보적)로부터 연장됨을 나타낸다. 패널 D 및 E는 미스매치 복구 및 DNA 라이게이션 및 새로운 편집된 DNA 가닥의 생성을 통한 DNA 중간체의 분해를 나타낸다.
도 13은 FANCF1 부위에서 HEK293T 세포에서 다양한 가이드 형태를 사용한 정확한 편집을 나타낸다. 구축물 명칭은 Cas12a (H759A) + RT(5M) + RecE FANCF1이다.
도 14는 DMNT1 부위에서 HEK293T 세포에서 다양한 가이드 형태를 사용한 정확한 편집을 나타낸다. 구축물 명칭은 Cas12a (H759A) + RT(5M) + DMNT1이다.
도 15는 DMNT1 부위에서 정확한 편집 활성에 대한 엑소뉴클레아제 형질감염의 효과 (엑소뉴클레아제 처리 없음에 대해 정규화됨; pUC19 = 1)를 나타낸다.
서열의 간단한 설명
서열식별번호:1 내지 20은 본 발명에 유용한 예시 Cas12a 아미노산 서열이다.
서열식별번호:21서열식별번호:22는 프로모터 및 인트론을 코딩하는 예시적인 조절 서열이다.
서열식별번호:23 내지 25는 예시 펩티드 태그 및 친화성 폴리펩티드를 제공한다.
서열식별번호:26 내지 36은 예시 RNA 동원 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드를 제공한다.
서열식별번호:37 내지 52는 예시 단일 가닥 RNA 결합 도메인 (RBD)을 제공한다.
서열식별번호:53서열식별번호:97은 예시 리버스 트랜스크립타제 서열 (M-MuLV)을 제공한다.
서열식별번호:54 내지 56은 유형 V CRISPR-Cas12a 뉴클레아제에 대한 프로토스페이서 인접 모티프 위치의 예를 제공한다.
서열식별번호:57서열식별번호:58은 본 발명의 예시 구축물을 제공한다.
서열식별번호:59서열식별번호:60은 예시 CRISPR RNA 및 예시 프로토스페이서를 제공한다.
서열식별번호:61서열식별번호:62는 예시 인트론을 제공한다.
서열식별번호:63 내지 86은 예시 REDRAW 편집제 구축물을 제공한다.
서열식별번호:87은 11 염기 쌍 (bp) 프라이머 결합 서열 및 96 bp 리버스 트랜스크립타제 주형을 갖는 tagRNA의 예를 제공한다.
서열식별번호:88 내지 91은 예시 플라스미드의 서열을 제공한다.
서열식별번호:92 내지 94는 각각 도 9 내지 11에 나타내어진 편집물과 연관된 tagRNA의 서열을 제공한다.
서열식별번호:96은 H759A의 돌연변이를 갖고 둘 다의 측 상에 NLS로 플랭킹된 예시 LbCas12a를 제공한다.
서열식별번호:98 내지 101은 예시 5'-3' 엑소뉴클레아제 폴리펩티드를 제공한다.
서열식별번호:102서열식별번호:103은 예시 DMNT1 표적 부위 및 표적 스페이서를 제공한다.
서열식별번호:104서열식별번호:105는 예시 FANCF1 표적 부위 및 표적 스페이서를 제공한다.
본 발명은 이제 본 발명의 실시양태가 나타내어진 첨부된 도면 및 실시예를 참고로 이하 기재될 것이다. 이 설명은 본 발명이 실행될 수 있는 모든 상이한 방식, 또는 본 발명에 첨가될 수 있는 모든 특색의 상세한 목록인 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 한 실시양태에 관하여 예시된 특색은 다른 실시양태에 포함될 수 있고, 특정 실시양태에 관하여 예시된 특색은 그 실시양태로부터 삭제될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 제시된 임의의 특색 또는 특색의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 또한, 본원에서 제안된 다양한 실시양태에 대한 다수의 변동 및 첨가는 본 발명으로부터 벗어나지 않는 본 개시내용의 관점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 하기 설명은 본 발명의 일부 특정 실시양태를 예시하는 것으로 의도되며, 그의 모든 순열, 조합 및 변동을 철저하게 특정하는 것으로 의도되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 본 발명의 설명에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기재하는 목적을 위한 것이며, 본 발명의 제한인 것으로 의도되지 않는다.
본원에 인용된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 참고문헌이 제시된 문장 및/또는 단락에 관한 교시내용에 대해 그 전문이 참조로 포함된다.
맥락이 달리 지시하지 않는 한, 본원에 기재된 본 발명의 다양한 특색은 임의의 조합으로 사용될 수 있음이 구체적으로 의도된다. 더욱이, 본 발명은 또한 본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 제시된 임의의 특색 또는 특색의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 예시하기 위해, 본 명세서가 조성물이 성분 A, B 및 C를 포함한다고 진술하는 경우, 임의의 A, B 또는 C, 또는 이들의 조합이 단독으로 또는 임의의 조합으로 생략되고 청구배제될 수 있음이 구체적으로 의도된다.
본 발명의 설명 및 첨부된 청구항에 사용된 단수 형태는 맥락이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다.
또한 본원에 사용된 "및/또는"은 연관된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안 ("또는")으로 해석되는 경우 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
측정가능한 값, 예컨대 양 또는 농도 등을 언급하는 경우 본원에 사용된 용어 "약"은 특정된 값의 ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%의 변동 뿐만 아니라 특정된 값을 포괄하는 것으로 의미된다. 예를 들어, "약 X" (여기서 X는 측정가능한 값임)는 X 뿐만 아니라 X의 ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%의 변동을 포함하는 것으로 의미된다. 측정가능한 값에 대해 본원에서 제공된 범위는 임의의 다른 범위 및/또는 그 안의 개별적 값을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "X 내지 Y" 및 "약 X 내지 Y"와 같은 어구는 X 및 Y를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 사용된 "약 X 내지 Y"와 같은 어구는 "약 X 내지 약 Y"를 의미하고, "약 X 내지 Y"와 같은 어구는 "약 X 내지 약 Y"를 의미한다.
본원에서 값의 범위의 나열은 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 단지, 개별적으로 범위 내에 해당하는 각각의 별개의 값을 지칭하는 약칭 방법으로서 역할을 하는 것으로 의도되며, 각각의 별개의 값은 그것이 본원에 개별적으로 나열된 것처럼 명세서에 포함된다. 예를 들어, 범위 10 내지 15가 개시되는 경우, 11, 12, 13, 및 14가 또한 개시된다.
본원에 사용된 용어 "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하는"은 진술된 특색, 정수, 단계, 작동, 요소, 및/또는 성분의 존재를 특정하지만, 하나 이상의 다른 특색, 정수, 단계, 작동, 요소, 성분, 및/또는 그의 군의 존재 또는 첨가를 불가능하게 하지 않는다.
본원에 사용된 전이적 어구 "본질적으로 이루어진"은 청구항의 범위가 청구항에 나열된 특정된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 포괄하는 것으로 해석되어야 함을 의미한다. 따라서, 본 발명의 청구항에 사용되는 경우 용어 "본질적으로 이루어진"은 "포함하는"과 등가인 것으로 해석되는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "증가시키다", "증가시키는", "증진시키다", "증진시키는", "개선시키다" 및 "개선시키는" (및 그의 문법적 파생어)은 대조군과 비교하여 적어도 약 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 초과의 상승을 기재한다.
본원에 사용된 용어 "감소시키다(reduce)", "감소된", "감소시키는", "감소", "감소시키다(diminish)" 및 "감소시키다(decrease)" (및 그의 문법적 파생어)는 예를 들어, 대조군과 비교하여 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 35%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 감소를 기재한다. 특정 실시양태에서, 감소는 검출가능한 활성 또는 양이 없거나 본질적으로 없는 것 (즉, 비유의한 양, 예를 들어, 약 10% 또는 심지어 5% 미만)을 발생시킬 수 있다.
"이종" 또는 "재조합" 뉴클레오티드 서열은 천연 발생 뉴클레오티드 서열의 비-천연 발생 다중 카피를 포함한, 그것이 도입되는 숙주 세포와 천연적으로 연관되지 않은 뉴클레오티드 서열이다.
"천연" 또는 "야생형" 핵산, 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 천연 발생 또는 내인성 핵산, 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, "야생형 mRNA"는 참조 유기체에서 천연 발생이거나 그에 대해 내인성인 mRNA이다. "상동" 핵산 서열은 그것이 도입되는 숙주 세포와 천연적으로 연관된 뉴클레오티드 서열이다.
본원에 사용된 용어 "핵산", "핵산 분자", "뉴클레오티드 서열" 및 "폴리뉴클레오티드"는 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중 가닥, 또는 그의 하이브리드인 RNA 또는 DNA를 지칭한다. 상기 용어는 또한 RNA/DNA 하이브리드를 포괄한다. dsRNA가 합성적으로 생산되는 경우, 덜 통상적인 염기, 예컨대 이노신, 5-메틸시토신, 6-메틸아데닌, 히포크산틴 등은 또한 안티센스, dsRNA, 및 리보자임 쌍형성에 사용될 수 있다. 예를 들어, 우리딘 및 시티딘의 C-5 프로핀 유사체를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 RNA에 고 친화도로 결합하고, 유전자 발현의 강력한 안티센스 억제제인 것으로 나타났다. 다른 변형, 예컨대 포스포디에스테르 백본, 또는 RNA의 리보스 당 기에서 2'-히드록시에 대한 변형은 또한 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드 서열"은 뉴클레오티드의 이종중합체 또는 핵산 분자의 5'에서 3' 단부로 이들 뉴클레오티드의 서열을 지칭하며, cDNA, DNA 단편 또는 부분, 게놈 DNA, 합성 (예를 들어, 화학적으로 합성된) DNA, 플라스미드 DNA, mRNA, 및 안티-센스 RNA (이들 중 임의의 것은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있음)를 포함한 DNA 또는 RNA 분자를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드 서열", "핵산", "핵산 분자", "핵산 구축물", "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 또한 뉴클레오티드의 이종중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 본원에서 제공된 핵산 분자 및/또는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 5'에서 3' 방향으로, 좌측에서 우측으로 제시되며, 미국 서열 규칙, 37 CFR §§1.821 내지 1.825 및 국제 지적 재산권 기구 (WIPO) 표준 ST.25에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 문자를 나타내기 위한 표준 부호를 사용하여 나타내어진다. 본원에 사용된 "5' 영역"은 폴리뉴클레오티드의 5' 단부에 가장 가까운 폴리뉴클레오티드의 영역을 의미할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 5' 영역에 있는 요소는 폴리뉴클레오티드의 5' 단부에 위치한 제1 뉴클레오티드에서 폴리뉴클레오티드를 통해 중간에 위치한 뉴클레오티드까지 어디에나 위치할 수 있다. 본원에 사용된 "3' 영역"은 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 가장 가까운 폴리뉴클레오티드의 영역을 의미할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 3' 영역에 있는 요소는 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 위치한 제1 뉴클레오티드에서 폴리뉴클레오티드를 통해 중간에 위치한 뉴클레오티드까지 어디에나 위치할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유전자"는 mRNA, 안티센스 RNA, miRNA, 안티-마이크로RNA 안티센스 올리고데옥시리보뉴클레오티드 (AMO) 등을 생산하는데 사용될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 유전자는 기능적 단백질 또는 유전자 생성물을 생산하는데 사용될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 유전자는 코딩 및 비-코딩 영역 (예를 들어, 인트론, 조절 요소, 프로모터, 인핸서, 종결 서열 및/또는 5' 및 3' 비번역된 영역) 둘 다를 포함할 수 있다. 유전자는 "단리될" 수 있으며, 이는 그의 자연 상태에서 핵산과 관련하여 통상적으로 발견되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 핵산을 의미한다. 이러한 성분은 세포 물질, 재조합 생산으로부터의 배양 배지, 및/또는 핵산을 화학적으로 합성하는데 사용되는 다양한 화학물질을 포함한다.
용어 "돌연변이"는 점 돌연변이 (예를 들어, 미스센스, 또는 넌센스, 또는 격자 이동을 발생시키는 단일 염기 쌍의 삽입 또는 결실), 삽입, 결실, 및/또는 말단절단을 지칭한다. 돌연변이가 아미노산 서열 내의 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 또는 서열 내의 1개 이상의 잔기의 결실 또는 삽입인 경우, 돌연변이는 전형적으로 원래 잔기, 이어서 서열 내의 잔기의 위치 및 새롭게 치환된 잔기의 신원을 확인함으로써 기재된다.
본원에 사용된 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 염기-쌍형성에 의한 허용적인 염 및 온도 조건 하에서의 폴리뉴클레오티드의 천연 결합을 지칭한다. 예를 들어, 서열 "A-G-T" (5'에서 3'로)는 상보적 서열 "T-C-A" (3'에서 5'로)에 결합한다. 2개의 단일-가닥 분자 사이의 상보성은 뉴클레오티드의 단지 일부가 결합하는 "부분적"일 수 있거나, 또는 이는 총 상보성이 단일 가닥 분자 사이에 존재하는 경우 완전할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 대한 유의한 효과를 갖는다.
본원에 사용된 "상보체"는 비교자 뉴클레오티드 서열과의 100% 상보성을 의미할 수 있거나, 또는 이는 100% 미만의 상보성 (예를 들어, 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 등의 상보성)을 의미할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열의 "부분" 또는 "단편"은 참조 핵산 또는 뉴클레오티드 서열에 비해 감소된 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 뉴클레오티드만큼 감소된) 길이의 및 참조 핵산 또는 뉴클레오티드 서열과 동일한 또는 거의 동일한 (예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한) 인접한 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나, 이로 본질적으로 이루어지고/거나 이로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명에 따른 이러한 핵산 단편 또는 부분은, 적절한 경우, 그것이 구성요소인 보다 큰 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 예로서, 본 발명의 가이드 핵산의 반복 서열은 야생형 유형 V CRISPR-Cas 반복 서열 (예를 들어, 야생형 CRISPR-Cas 반복부, 예를 들어, Cas12a (Cpf1), Cas12b (C2c1), Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12g, Cas12h, Cas12i, C2c4, C2c5, C2c8, C2c9, C2c10, Cas14a, Cas14b, 및/또는 Cas14c 등의 CRISPR Cas 시스템으로부터의 반복부)의 부분을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 가이드 핵산의 반복 서열은 야생형 CRISPR-Cas9 반복 서열의 부분을 포함할 수 있다.
상동성을 갖는 상이한 핵산 또는 단백질은 본원에서 "동족체"로 지칭된다. 용어 동족체는 동일한 및 다른 종으로부터의 상동 서열 및 동일한 및 다른 종으로부터의 이종상동 서열을 포함한다. "상동성"은 위치적 동일성 (즉, 서열 유사성 또는 동일성)의 퍼센트의 관점에서 2개 이상의 핵산 및/또는 아미노산 서열 사이의 유사성의 수준을 지칭한다. 상동성은 또한 상이한 핵산 또는 단백질 중에서 유사한 기능적 특성의 개념을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법은 본 발명의 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드 서열에 대한 동족체를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 "이종상동"은 종분화 동안 공통 조상 유전자로부터 발생한 상이한 종에서의 상동 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열을 지칭한다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 동족체는 본 발명의 상기 뉴클레오티드 서열과 실질적 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%)을 갖는다.
본원에 사용된 "서열 동일성"은 2개의 최적으로 정렬된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 성분, 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산의 정렬의 창 전반에 걸쳐 불변하는 정도를 지칭한다. "동일성"은 문헌 [Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988)]; [Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993)]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994)]; [Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987)]; 및 [Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)]에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "퍼센트 서열 동일성" 또는 "퍼센트 동일성"은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 경우 시험 ("대상") 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 그의 상보적 가닥)와 비교하여 참조 ("의문") 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 그의 상보적 가닥)의 선형 폴리뉴클레오티드 서열에서 동일한 뉴클레오티드의 백분율을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "퍼센트 동일성"은 참조 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 서열에서 동일한 아미노산의 백분율을 지칭할 수 있다.
2개의 핵산 분자, 뉴클레오티드 서열 또는 단백질 서열의 맥락에서 본원에 사용된 어구 "실질적으로 동일한", 또는 "실질적 동일성"은 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정된 바와 같은, 최대 상응성에 대해 비교되고 정렬된 경우, 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 그 초과의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 실질적 동일성은 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 20개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드, 약 15개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드, 약 30개의 뉴클레오티드 내지 약 40개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 60개의 뉴클레오티드, 약 70개의 뉴클레오티드 내지 약 80개의 뉴클레오티드, 약 90개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 길이, 및 그 안의 임의의 범위 내지 서열의 전장인 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 연속적 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 존재한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 적어도 약 20개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40개의 뉴클레오티드)에 걸쳐 실질적으로 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 또는 단백질 서열은 그것이 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 (또는 코딩된 단백질 서열)와 실질적으로 동일한 기능을 수행한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 한 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터 내로 들어가고, 하위서열 좌표가 필요에 따라 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기반하여 참조 서열에 비해 시험 서열(들)에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
비교 창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 스미스 및 와터만(Smith and Waterman)의 국소 상동성 알고리즘, 니들만 및 운쉬(Needleman and Wunsch)의 상동성 정렬 알고리즘, 피어슨 및 리프만(Pearson and Lipman)의 유사성에 대한 검색 방법과 같은 툴에 의해, 및 임의로 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행, 예컨대 GCG® 위스콘신 패키지(Wisconsin Package)® (악셀리스 인크.(Accelrys Inc.), 미국 캘리포니아주 샌 디에고)의 일부로서 이용가능한 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA에 의해 수행될 수 있다. 시험 서열 및 참조 서열의 정렬된 절편에 대한 "동일성 분율"은 2개의 정렬된 서열에 의해 공유된 동일한 성분의 수 나누기 참조 서열 절편, 예를 들어 전체 참조 서열 또는 참조 서열의 보다 작은 한정된 부분에서의 성분의 총 수이다. 퍼센트 서열 동일성은 동일성 분율 곱하기 100으로서 나타내어진다. 1개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열의 비교는 전장 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분에 대한 것, 또는 보다 긴 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 것일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, "퍼센트 동일성"은 또한 번역된 뉴클레오티드 서열에 대해 BLASTX 버전 2.0 및 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정될 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 서열은 또한 2개의 서열이 엄격한 조건 하에서 서로에 혼성화하는 경우 실질적으로 상보적인 것으로 간주될 수 있다. 일부 대표적인 실시양태에서, 실질적으로 상보적인 것으로 간주되는 2개의 뉴클레오티드 서열은 고도로 엄격한 조건 하에서 서로에 혼성화한다.
핵산 혼성화 실험, 예컨대 서던 및 노던 혼성화의 맥락에서 "엄격한 혼성화 조건" 및 "엄격한 혼성화 세척 조건"은 서열 의존적이며, 상이한 환경적 파라미터 하에서 상이하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침은 문헌 [Tijssen Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York (1993)]에서 발견된다. 일반적으로, 고도로 엄격한 혼성화 및 세척 조건은 한정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다.
Tm은 표적 서열의 50%가 완벽하게 매칭된 프로브에 혼성화하는 온도 (한정된 이온 강도 및 pH 하에서)이다. 매우 엄격한 조건은 특정 프로브에 대해 Tm과 동등하도록 선택된다. 서던 또는 노던 블롯에서 필터 상에 100개 초과의 상보적 잔기를 갖는 상보적 뉴클레오티드 서열의 혼성화를 위한 엄격한 혼성화 조건의 예는 42℃에서 1 mg의 헤파린을 갖는 50% 포름아미드이며, 혼성화는 밤새 수행된다. 고도로 엄격한 세척 조건의 예는 72℃에서 약 15분 동안 0.1 5M NaCl이다. 엄격한 세척 조건의 예는 65℃에서 15분 동안 0.2x SSC 세척이다 (SSC 완충제의 설명에 대해서는, 상기 문헌 [Sambrook] 참조). 종종, 배경 프로브 신호를 제거하기 위해 저 염격성 세척은 고 염격성 세척에 선행한다. 예를 들어, 100개 초과의 뉴클레오티드의 두가닥에 대한 중간 엄격성 세척의 예는 45℃에서 15분 동안 1x SSC이다. 예를 들어, 100개 초과의 뉴클레오티드의 두가닥에 대한 저 염격성 세척의 예는 40℃에서 15분 동안 4 내지 6x SSC이다. 짧은 프로브 (예를 들어, 약 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해, 엄격한 조건은 전형적으로 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 Na 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 다른 염)의 염 농도를 수반하고, 온도는 전형적으로 적어도 약 30℃이다. 엄격한 조건은 또한 불안정화제, 예컨대 포름아미드의 첨가로 달성될 수 있다. 일반적으로, 특정 혼성화 검정에서 비관련된 프로브에 대해 관찰된 것보다 2x (이상)의 신호 대 잡음 비는 특이적 혼성화의 검출을 지시한다. 엄격한 조건 하에서 서로에 혼성화하지 않는 뉴클레오티드 서열은 이들이 코딩하는 단백질이 실질적으로 동일한 경우 여전히 실질적으로 동일하다. 이는 예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 카피가 유전 암호에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 사용하여 생성되는 경우 일어날 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 재조합 핵산 구축물은 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 발현 카세트, 및/또는 벡터 (예를 들어, CRISPR-Cas 이펙터 단백질 (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질), 리버스 트랜스크립타제, 플랩 엔도뉴클레아제, 5'-3' 엑소뉴클레아제 등을 포함함/코딩함)는 유기체 (예를 들어, 특정 종에서), 임의로 동물, 식물, 진균, 고세균, 또는 박테리아에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 코돈 최적화된 핵산 구축물, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 및/또는 벡터는 코돈 최적화되지 않은 핵산 구축물, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 및/또는 벡터와 약 70% 내지 약 99.9% (예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%) 또는 그 초과의 동일성을 갖는다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구축물은 식물 및/또는 식물의 세포에서의 발현을 위해 다양한 프로모터 및/또는 다른 조절 요소와 작동적으로 회합될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구축물은 1개 이상의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 1종 이상의 프로모터, 인트론, 인핸서, 및/또는 종결자를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 인트론 (예를 들어, Ubi1 프로모터 및 인트론)과 작동가능하게 회합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인트론과 회합된 프로모터는 "프로모터 영역" (예를 들어, Ubi1 프로모터 및 인트론)으로 지칭될 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 관하여 본원에 사용된 "작동가능하게 연결된" 또는 "작동가능하게 회합된"이란, 지시된 요소가 서로와 기능적으로 관련되고, 또한 일반적으로 물리적으로 관련됨을 의미한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된" 또는 "작동가능하게 회합된"은 기능적으로 연관된 단일 핵산 분자 상의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 따라서, 제2 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열은 제1 뉴클레오티드 서열이 제2 뉴클레오티드 서열과 기능적 관계에 놓인 상황을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 뉴클레오티드 서열의 전사 또는 발현을 실행하는 경우 상기 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 회합된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 제어 서열 (예를 들어, 프로모터)은, 제어 서열이 그의 발현을 지정하도록 기능하는 한, 그것이 작동가능하게 회합된 뉴클레오티드 서열과 인접할 필요는 없음을 인정할 것이다. 따라서, 예를 들어, 개재하는 비번역된, 그러나 전사된 핵산 서열은 프로모터 및 뉴클레오티드 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터는 뉴클레오티드 서열과 "작동가능하게 연결된" 것으로 여전히 간주될 수 있다.
폴리펩티드에 관하여 본원에 사용된 용어 "연결된"은 한 폴리펩티드의 또 다른 것에의 부착을 지칭한다. 폴리펩티드는 직접적으로 (예를 들어, 펩티드 결합을 통해) 또는 링커를 통해 (N-말단 또는 C-말단에서) 또 다른 폴리펩티드에 연결될 수 있다.
용어 "링커"는 관련 기술분야에 인식되어 있으며, 2개의 분자 또는 모이어티, 예를 들어, 융합 단백질의 2개의 도메인, 예컨대, 예를 들어, DNA 결합 폴리펩티드 또는 도메인 및 펩티드 태그 및/또는 리버스 트랜스크립타제 및 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드; 또는 DNA 엔도뉴클레아제 폴리펩티드 또는 도메인 및 펩티드 태그 및/또는 리버스 트랜스크립타제 및 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드를 연결하는 화학기, 또는 분자를 지칭한다. 링커는 단일 연결 분자로 구성될 수 있거나, 또는 1개 초과의 연결 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학 모이어티, 예컨대 2가 유기 모이어티일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산일 수 있거나, 또는 이는 펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드이다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 펩티드 링커는 약 2 내지 약 100개 또는 그 초과의 아미노산의 길이, 예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 초과의 아미노산의 길이 (예를 들어, 약 2 내지 약 40, 약 2 내지 약 50, 약 2 내지 약 60, 약 4 내지 약 40, 약 4 내지 약 50, 약 4 내지 약 60, 약 5 내지 약 40, 약 5 내지 약 50, 약 5 내지 약 60, 약 9 내지 약 40, 약 9 내지 약 50, 약 9 내지 약 60, 약 10 내지 약 40, 약 10 내지 약 50, 약 10 내지 약 60개, 또는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개의 아미노산 내지 약 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 초과의 아미노산의 길이 (예를 들어, 약 105, 110, 115, 120, 130, 140, 150개 또는 그 초과의 아미노산의 길이)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 GS 링커일 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 관하여 본원에 사용된 용어 "연결된", 또는 "융합된"은 한 폴리뉴클레오티드의 또 다른 것에의 부착을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학 모이어티, 예컨대 2가 유기 모이어티일 수 있는 링커에 의해 연결될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 왓슨-크릭 염기-쌍형성을 포함한 공유 또는 비-공유 연결 또는 결합을 통해, 또는 1개 이상의 연결 뉴클레오티드를 통해 (5' 단부 또는 3' 단부에서) 또 다른 폴리뉴클레오티드에 연결되거나 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 구조의 폴리뉴클레오티드 모티프는 또 다른 폴리뉴클레오티드 서열 내에 삽입될 수 있다 (예를 들어 가이드 RNA에서 헤어핀 구조의 연장). 일부 실시양태에서, 연결 뉴클레오티드는 천연 발생 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 연결 뉴클레오티드는 비-천연 발생 뉴클레오티드일 수 있다.
"프로모터"는 프로모터와 작동가능하게 회합된 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 코딩 서열)의 전사를 제어하거나 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터에 의해 제어되거나 조절되는 코딩 서열은 폴리펩티드 및/또는 기능적 RNA를 코딩할 수 있다. 전형적으로, "프로모터"는 RNA 폴리머라제 II에 대한 결합 부위를 함유하고 전사의 개시를 지정하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일반적으로, 프로모터는 상응하는 코딩 서열의 코딩 영역의 시작부에 비해 5', 또는 상류에서 발견된다. 프로모터는 유전자 발현의 조절제로서 작용하는 다른 요소; 예를 들어, 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 이들은 TATA 박스 컨센서스 서열, 및 종종 CAAT 박스 컨센서스 서열을 포함한다 (Breathnach and Chambon, (1981) Annu. Rev. Biochem. 50:349). 식물에서, CAAT 박스는 AGGA 박스에 의해 치환될 수 있다 (Messing et al., (1983) in Genetic Engineering of Plants, T. Kosuge, C. Meredith and A. Hollaender (eds.), Plenum Press, pp. 211-227). 일부 실시양태에서, 프로모터 영역은 적어도 1개의 인트론 (예를 들어, 서열식별번호:21, 서열식별번호:22 참조)을 포함할 수 있다.
본 발명에 유용한 프로모터는 예를 들어, 재조합 핵산 분자, 예를 들어, "합성 핵산 구축물" 또는 "단백질-RNA 복합체"의 제조에 사용하기 위한 구성적, 유도성, 시간적으로 조절된, 발달적으로 조절된, 화학적으로 조절된, 조직-바람직한 및/또는 조직-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 이들 다양한 유형의 프로모터는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
프로모터의 선택은 발현을 위한 시간적 및 공간적 요건에 따라 다양할 수 있으며, 또한 형질전환되는 숙주 세포에 기반하여 다양할 수 있다. 많은 상이한 유기체에 대한 프로모터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 관련 기술분야에 존재하는 광범위한 지식에 기반하여, 적절한 프로모터는 관심의 특정 숙주 유기체에 대해 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 모델 유기체에서 고도로 구성적으로 발현된 유전자의 상류의 프로모터에 관하여 많은 것이 공지되어 있으며, 이러한 지식은 용이하게 접근되고, 적절한 경우 다른 시스템에서 실행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 식물에서 기능적인 프로모터는 본 발명의 구축물에 사용될 수 있다. 식물에서 발현을 유도하는데 유용한 프로모터의 비-제한적 예는 루비스코(RubisCo) 소형 서브유닛 유전자 1의 프로모터 (PrbcS1), 액틴 유전자의 프로모터 (팩틴(Pactin)), 니트레이트 리덕타제 유전자의 프로모터 (Pnr) 및 중복된 카르보닉 안히드라제 유전자 1의 프로모터 (Pdca1)를 포함한다 (문헌 [Walker et al. Plant Cell Rep. 23:727-735 (2005)]; [Li et al. Gene 403:132-142 (2007)]; [Li et al. Mol Biol. Rep. 37:1143-1154 (2010)] 참조). PrbcS1 및 팩틴은 구성적 프로모터이고, Pnr 및 Pdca1은 유도성 프로모터이다. Pnr은 니트레이트에 의해 유도되고, 암모늄에 의해 억제되며 (Li et al. Gene 403:132-142 (2007)), Pdca1은 염에 의해 유도된다 (Li et al. Mol Biol. Rep. 37:1143-1154 (2010)). 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 프로모터는 RNA 폴리머라제 II (Pol II) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제아 메이스(Zea mays)로부터의 U6 프로모터 또는 7SL 프로모터는 본 발명의 구축물에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제아 메이스로부터의 U6c 프로모터 및/또는 7SL 프로모터는 가이드 핵산의 발현을 유도하는데 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 글리시네 막스(Glycine max)로부터의 U6c 프로모터, U6i 프로모터 및/또는 7SL 프로모터는 본 발명의 구축물에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 글리시네 막스로부터의 U6c 프로모터, U6i 프로모터 및/또는 7SL 프로모터는 가이드 핵산의 발현을 유도하는데 유용할 수 있다.
식물에 유용한 구성적 프로모터의 예는 세스트룸 바이러스 프로모터 (cmp) (미국 특허 번호 7,166,770), 벼 액틴 1 프로모터 (Wang et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:3399-3406; 뿐만 아니라 미국 특허 번호 5,641,876), CaMV 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), CaMV 19S 프로모터 (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324), nos 프로모터 (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:5745-5749), Adh 프로모터 (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6624-6629), 수크로스 신타제 프로모터 (Yang & Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148), 및 유비퀴틴 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 유비퀴틴으로부터 유래된 구성적 프로모터는 많은 세포 유형에서 축적된다. 유비퀴틴 프로모터는 트랜스제닉 식물에 사용하기 위한 몇몇 식물 종, 예를 들어, 해바라기 (Binet et al., 1991. Plant Science 79: 87-94), 메이즈 (Christensen et al., 1989. Plant Molec. Biol. 12: 619-632), 및 아라비돕시스 (Norris et al. 1993. Plant Molec. Biol. 21:895-906)로부터 클로닝되었다. 메이즈 유비퀴틴 프로모터 (UbiP)는 트랜스제닉 단자엽식물 시스템에서 개발되었으며, 그의 서열 및 단자엽식물 형질전환을 위해 구축된 벡터는 특허 공개 EP 0 342 926에 개시되어 있다. 유비퀴틴 프로모터는 트랜스제닉 식물, 특히 단자엽식물에서의 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합하다. 추가로, 문헌 [McElroy et al. (Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991))]에 의해 기재된 프로모터 발현 카세트는 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현을 위해 용이하게 변형될 수 있으며, 단자엽식물 숙주에 사용하는데 특히 적합하다.
일부 실시양태에서, 조직 특이적/조직 바람직한 프로모터는 식물 세포에서 이종 폴리뉴클레오티드의 발현에 사용될 수 있다. 조직 특이적 또는 바람직한 발현 패턴은 녹색 조직 특이적 또는 바람직한, 뿌리 특이적 또는 바람직한, 줄기 특이적 또는 바람직한, 꽃 특이적 또는 바람직한 또는 화분 특이적 또는 바람직한 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 녹색 조직에서의 발현에 적합한 프로모터는 광합성에 관여하는 유전자를 조절하는 많은 것을 포함하며, 이들 중 많은 것은 단자엽식물 및 쌍자엽식물 둘 다로부터 클로닝되었다. 한 실시양태에서, 본 발명에 유용한 프로모터는 포스포에놀 카르복실라제 유전자로부터의 메이즈 PEPC 프로모터이다 (Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12:579-589 (1989)). 조직-특이적 프로모터의 비-제한적 예는 종자 저장 단백질 (예컨대 β-콘글리시닌, 크루시페린, 나핀 및 파세올린), 제인 또는 오일 바디 단백질 (예컨대 올레오신), 또는 지방산 생합성에 관여하는 단백질 (아실 운반체 단백질, 스테아로일-ACP 데사투라제 및 지방산 데사투라제 (fad 2-1)를 포함함)을 코딩하는 유전자, 및 배 발생 동안 발현되는 다른 핵산 (예컨대 Bce4, 예를 들어, 문헌 [Kridl et al. (1991) Seed Sci. Res. 1:209-219]; 뿐만 아니라 유럽 특허 번호 255378 참조)과 연관된 것들을 포함한다. 식물, 특히 메이즈에서 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현에 유용한 조직-특이적 또는 조직-우선적 프로모터는 뿌리, 중과피, 잎 또는 화분에서 발현을 지정하는 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 프로모터는 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO 93/07278에 개시되어 있다. 본 발명에 유용한 조직 특이적 또는 조직 바람직한 프로모터의 다른 비-제한적 예는 미국 특허 6,040,504에 개시된 면화 루비스코 프로모터; 미국 특허 5,604,121에 개시된 벼 수크로스 신타제 프로모터; 문헌 [de Framond (FEBS 290:103-106 (1991)], 시바-가이기(Ciba-Geigy)의 EP 0 452 269에 의해 기재된 뿌리 특이적 프로모터; 미국 특허 5,625,136 (시바-가이기)에 기재되고, 메이즈 trpA 유전자의 발현을 유도하는 줄기 특이적 프로모터; WO 01/73087에 개시된 세스트룸 황화 잎 말림 바이러스 프로모터; 및 벼로부터의 ProOsLPS10 및 ProOsLPS11 (Nguyen et al. Plant Biotechnol. Reports 9(5):297-306 (2015)), 메이즈로부터의 ZmSTK2_USP (Wang et al. Genome 60(6):485-495 (2017)), 토마토로부터의 LAT52 및 LAT59 (Twell et al. Development 109(3):705-713 (1990)), Zm13 (미국 특허 번호 10,421,972), 아라비돕시스로부터의 PLA2-δ 프로모터 (미국 특허 번호 7,141,424), 및/또는 메이즈로부터의 ZmC5 프로모터 (국제 PCT 공개 번호 WO1999/042587을 포함하나 이에 제한되지는 않는 화분 특이적 또는 바람직한 프로모터를 포함한다.
식물 조직-특이적/조직 바람직한 프로모터의 추가의 예는 뿌리 털-특이적 시스 -요소 (RHE) (Kim et al. The Plant Cell 18:2958-2970 (2006)), 뿌리-특이적 프로모터 RCc3 (Jeong et al. Plant Physiol. 153:185-197 (2010)) 및 RB7 (미국 특허 번호 5459252), 렉틴 프로모터 (Lindstrom et al. (1990) Der. Genet. 11:160-167; 및 Vodkin (1983) Prog. Clin. Biol. Res. 138:87-98), 옥수수 알콜 데히드로게나제 1 프로모터 (Dennis et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:3983-4000), S-아데노실-L-메티오닌 신테타제 (SAMS) (Vander Mijnsbrugge et al. (1996) Plant and Cell Physiology, 37(8):1108-1115), 옥수수 광 수확 복합체 프로모터 (Bansal et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3654-3658), 옥수수 열 충격 단백질 프로모터 (O'Dell et al. (1985) EMBO J. 5:451-458; 및 Rochester et al. (1986) EMBO J. 5:451-458), 완두콩 소형 서브유닛 RuBP 카르복실라제 프로모터 (Cashmore, "Nuclear genes encoding the small subunit of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase" pp. 29-39 In: Genetic Engineering of Plants (Hollaender ed., Plenum Press 1983; 및 Poulsen et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 205:193-200), Ti 플라스미드 만노핀 신타제 프로모터 (Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-3223), Ti 플라스미드 노팔린 신타제 프로모터 (Langridge et al. (1989), 상기 문헌), 페투니아 칼콘 이소머라제 프로모터 (van Tunen et al. (1988) EMBO J. 7:1257-1263), 콩 글리신 풍부 단백질 1 프로모터 (Keller et al. (1989) Genes Dev. 3:1639-1646), 말단절단된 CaMV 35S 프로모터 (O'Dell et al. (1985) Nature 313:810-812), 감자 파타틴 프로모터 (Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:347-354), 뿌리 세포 프로모터 (Yamamoto et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449), 메이즈 제인 프로모터 (Kriz et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 207:90-98; Langridge et al. (1983) Cell 34:1015-1022; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:6425; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449; 및 Wandelt et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2354), 글로불린-1 프로모터 (Belanger et al. (1991) Genetics 129:863-872), α-튜불린 cab 프로모터 (Sullivan et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:431-440), PEPC아제 프로모터 (Hudspeth & Grula (1989) Plant Mol. Biol. 12:579-589), R 유전자 복합체-연관된 프로모터 (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-1183), 및 칼콘 신타제 프로모터 (Franken et al. (1991) EMBO J. 10:2605-2612)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
종자-특이적 발현에 유용한 것은 완두콩 비실린 프로모터 (Czako et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 235:33-40; 뿐만 아니라 미국 특허 번호 5,625,136에 개시된 종자-특이적 프로모터이다. 성숙한 잎에서의 발현을 위한 유용한 프로모터는 노쇠의 개시에서 스위칭된 것들, 예컨대 아라비돕시스로부터의 SAG 프로모터 (Gan et al. (1995) Science 270:1986-1988)이다.
또한, 엽록체에서 기능적인 프로모터가 사용될 수 있다. 이러한 프로모터의 비-제한적 예는 박테리오파지 T3 유전자 9 5' UTR 및 미국 특허 번호 7,579,516에 개시된 다른 프로모터를 포함한다. 본 발명에 유용한 다른 프로모터는 S-E9 소형 서브유닛 RuBP 카르복실라제 프로모터 및 쿠니츠(Kunitz) 트립신 억제제 유전자 프로모터 (Kti3)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 추가의 조절 요소는 인트론, 인핸서, 종결 서열 및/또는 5' 및 3' 비번역된 영역을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 인트론은 식물에서 확인되고 그로부터 단리되며, 이어서 식물의 형질전환에 사용되도록 발현 카세트 내로 삽입된 인트론일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 인트론은 자기-삭제에 요구되는 서열을 포함할 수 있으며, 핵산 구축물/발현 카세트 내로 프레임 내에서 혼입된다. 인트론은 한 핵산 구축물에서 다수의 단백질-코딩 서열을 분리하는 스페이서로서 사용될 수 있거나, 또는 인트론은 한 단백질-코딩 서열 내부에서, 예를 들어, mRNA를 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 이들이 단백질-코딩 서열 내에서 사용되는 경우, 이들은 포함된 삭제 부위와 "프레임 내에서" 삽입된다. 인트론은 또한 발현을 개선시키거나 변형시키기 위해 프로모터와 회합될 수 있다. 예로서, 본 발명에 유용한 프로모터/인트론 조합은 메이즈 Ubi1 프로모터 및 인트론의 그것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 인트론의 비-제한적 예는 ADHI 유전자 (예를 들어, Adh1-S 인트론 1, 2 및 6), 유비퀴틴 유전자 (Ubi1), 루비스코 소형 서브유닛 (rbcS) 유전자, 루비스코 대형 서브유닛 (rbcL) 유전자, 액틴 유전자 (예를 들어, 액틴-1 인트론), 피루베이트 데히드로게나제 키나제 유전자 (pdk), 니트레이트 리덕타제 유전자 (nr), 중복된 카르보닉 안히드라제 유전자 1 (Tdca1), psbA 유전자, atpA 유전자로부터의 인트론, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시 인트론 서열은 서열식별번호:61서열식별번호:62를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산 구축물은 "발현 카세트"일 수 있거나, 또는 발현 카세트 내에 포함될 수 있다. 본원에 사용된 "발현 카세트"는 예를 들어, 본 발명의 핵산 구축물 (예를 들어, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 리버스 트랜스크립타제 폴리펩티드 또는 도메인, 플랩 엔도뉴클레아제 폴리펩티드 또는 도메인 (예를 들어, FEN)), 및/또는 5'-3' 엑소뉴클레아제)를 포함하는 재조합 핵산 분자를 의미하고, 여기서 핵산 구축물은 1종 이상의 제어 서열 (예를 들어, 프로모터, 종결자 등)과 작동가능하게 회합된다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태는 예를 들어, 본 발명의 핵산 구축물 (예를 들어, CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 도메인, 리버스 트랜스크립타제 폴리펩티드 또는 도메인, 플랩 엔도뉴클레아제 폴리펩티드 또는 도메인 및/또는 5'-3' 엑소뉴클레아제 폴리펩티드 또는 도메인을 코딩하는 본 발명의 핵산 구축물을 발현하도록 디자인된 발현 카세트를 제공한다. 본 발명의 발현 카세트가 1종 초과의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 폴리뉴클레오티드는 모든 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 단일 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 폴리뉴클레오티드는 1종 이상의 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다 (예를 들어, 3종의 폴리뉴클레오티드는 임의의 조합으로 1, 2 또는 3개의 프로모터에 의해 유도될 수 있음). 2개 이상의 별개의 프로모터가 사용되는 경우, 프로모터는 동일한 프로모터일 수 있거나, 또는 이들은 상이한 프로모터일 수 있다. 따라서, 발현 카세트에 포함되는 CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 리버스 트랜스크립타제 폴리펩티드 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 플랩 엔도뉴클레아제 폴리펩티드 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 5'-3' 엑소뉴클레아제 폴리펩티드 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 별개의 프로모터에 각각 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 이들은 임의의 조합으로 2종 이상의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 발명의 핵산 구축물을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있으며, 이는 그의 성분 중 적어도 하나가 그의 다른 성분 중 적어도 하나에 관하여 이종임을 의미한다 (예를 들어, 숙주 유기체에서 발현되는 관심의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 숙주 유기체로부터의 프로모터, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 숙주와는 상이한 유기체로부터의 것이거나, 또는 통상적으로 그 프로모터와 연관되어 발견되지 않음). 발현 카세트는 또한 천연 발생이지만 이종 발현에 유용한 재조합 형태로 얻어진 것일 수 있다.
발현 카세트는 임의로 선택된 숙주 세포에서 기능적인 전사 및/또는 번역 종결 영역 (즉, 종결 영역) 및/또는 인핸서 영역을 포함할 수 있다. 다양한 전사 종결자 및 인핸서는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 발현 카세트에 사용하기 위해 이용가능하다. 전사 종결자는 전사의 종결 및 정확한 mRNA 폴리아데닐화를 담당한다. 종결 영역 및/또는 인핸서 영역은 전사 개시 영역에 대해 천연일 수 있거나, 예를 들어, CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 유전자, 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 유전자, 플랩 엔도뉴클레아제를 코딩하는 유전자, 및/또는 5'-3' 엑소뉴클레아제를 코딩하는 유전자에 대해 천연일 수 있거나, 숙주 세포에 대해 천연일 수 있거나, 또는 또 다른 공급원에 대해 천연일 수 있다 (예를 들어, 프로모터에 대해, CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 유전자, 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 유전자, 플랩 엔도뉴클레아제를 코딩하는 유전자, 및/또는 5'-3' 엑소뉴클레아제를 코딩하는 유전자에 대해, 숙주 세포에 대해 외래 또는 이종, 또는 이들의 임의의 조합).
본 발명의 발현 카세트는 또한 형질전환된 숙주 세포를 선택하는데 사용될 수 있는 선택가능한 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "선택가능한 마커"는 발현되는 경우 마커를 발현하는 숙주 세포에 대해 별개의 표현형을 부여하고, 따라서 이러한 형질전환된 세포가 마커를 갖지 않는 것들로부터 구별되는 것을 허용하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 폴리뉴클레오티드 서열은 마커가 화학적 수단에 의해, 예컨대 선택적 작용제 (예를 들어, 항생제 등)를 사용함으로써 선택될 수 있는 소질을 부여하는지 여부, 또는 마커가 단순히 관찰 또는 시험을 통해, 예컨대 스크리닝 (예를 들어, 형광)에 의해 확인할 수 있는 소질인지 여부에 따라, 선택가능한 또는 스크리닝가능한 마커 중 어느 하나를 코딩할 수 있다. 적합한 선택가능한 마커의 많은 예는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 본원에 기재된 발현 카세트에 사용될 수 있다.
발현 카세트 외에도, 본원에 기재된 핵산 분자/구축물 및 폴리뉴클레오티드 서열은 벡터와 관련되어 사용될 수 있다. 용어 "벡터"는 핵산 (또는 핵산들)을 세포 내로 전달하거나(transferring), 전달하거나(delivering), 도입하기 위한 조성물을 지칭한다. 벡터는 전달되거나, 전달되거나 도입되는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 핵산 구축물을 포함한다. 숙주 유기체의 형질전환에 사용하기 위한 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 벡터의 일반적 부류의 비-제한적 예는 자기 전파가능하거나 동원가능할 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 이중 또는 단일 가닥 선형 또는 원형 형태의 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 파지미드 벡터, 코스미드 벡터, 포스미드 벡터, 박테리오파지, 인공 염색체, 미니서클, 또는 아그로박테리움(Agrobacterium) 2성분 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된, 또는 단순 포진 바이러스 벡터를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 정의된 바와 같은 벡터는 세포 게놈 내로의 통합에 의해 원핵생물 또는 진핵생물 숙주를 형질전환시키거나, 염색체외적으로 존재할 수 있다 (예를 들어 복제 원점을 갖는 자율 복제 플라스미드). 추가로 포함되는 것은 셔틀 벡터이며, 이는 방선균류 및 관련된 종, 박테리아 및 진핵생물 (예를 들어 고등 식물, 포유동물, 효모 또는 진균 세포)로부터 선택될 수 있는 2종의 상이한 숙주 유기체에서 자연적으로 또는 디자인에 의해 복제 가능한 DNA 비히클을 의미한다. 일부 실시양태에서, 벡터 중의 핵산은 숙주 세포에서의 전사를 위한 적절한 프로모터 또는 다른 조절 요소의 제어 하에 있고, 그에 작동가능하게 연결된다. 벡터는 다수의 숙주에서 기능하는 이중-기능적 발현 벡터일 수 있다. 게놈 DNA의 경우에, 이는 그 자신의 프로모터 및/또는 다른 조절 요소를 함유할 수 있고, cDNA의 경우에, 이는 숙주 세포에서의 발현을 위한 적절한 프로모터 및/또는 다른 조절 요소의 제어 하에 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 구축물 또는 폴리뉴클레오티드 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트는 본원에 기재된 바와 같은 및 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 벡터에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 "접촉시키다", "접촉시키는", "접촉된", 및 그의 문법적 파생어는 바람직한 반응의 성분을 바람직한 반응 (예를 들어, 형질전환, 전사 제어, 게놈 편집, 니킹, 및/또는 절단)을 수행하는데 적합한 조건 하에서 함께 놓는 것을 지칭한다. 예로서, 표적 핵산은 CRISPR-Cas 이펙터 단백질 및 리버스 트랜스크립타제가 발현되고, CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 표적 핵산에 결합하고, 리버스 트랜스크립타제가 CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 융합되거나, 또는 CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 동원되고 (예를 들어, CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 융합된 펩티드 태그 및 리버스 트랜스크립타제에 융합된 친화성 태그를 통해), 따라서, 리버스 트랜스크립타제가 표적 핵산의 부근에 위치하는 조건 하에서, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 및 리버스 트랜스크립타제 또는 이를 코딩하는 핵산 구축물과 접촉되고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시킬 수 있다. 다른 단백질-단백질 상호작용, 및 또한 RNA-단백질 상호작용 및 화학적 상호작용을 이용하는 리버스 트랜스크립타제를 동원하는 다른 방법은 사용될 수 있다.
표적 핵산에 관하여 본원에 사용된 "변형시키는" 또는 "변형"은 표적 핵산의 편집 (예를 들어, 돌연변이화), 공유 변형, 핵산/뉴클레오티드 염기의 교환/치환, 결실, 절단, 니킹, 및/또는 전사 제어를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형은 임의의 크기의 인델 및/또는 임의의 유형의 단일 염기 변화 (SNP)를 포함할 수 있다.
관심의 폴리뉴클레오티드의 맥락에서 "도입하는", "도입하다", "도입된" (및 그의 문법적 파생어)은 뉴클레오티드 서열이 세포의 내부에의 접근을 얻도록 하는 방식으로 관심의 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 및/또는 가이드 핵산)을 숙주 유기체 또는 상기 유기체의 세포 (예를 들어, 숙주 세포; 예를 들어, 식물 세포)에 제시하는 것을 의미한다.
용어 "형질전환" 또는 "형질감염"은 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 본원에 사용된 바와 같이 세포 내로의 이종 핵산의 도입을 지칭한다. 세포의 형질전환은 안정하거나 일시적일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 본 발명의 폴리뉴클레오티드/핵산 분자로 안정하게 형질전환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 본 발명의 핵산 구축물로 일시적으로 형질전환될 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 맥락에서 "일시적 형질전환"은 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입되고, 세포의 게놈 내로 통합되지 않는 것을 의미한다.
세포 내로 도입된 폴리뉴클레오티드의 맥락에서 "안정하게 도입하는" 또는 "안정하게 도입된"이란, 도입된 폴리뉴클레오티드가 세포의 게놈 내로 안정하게 혼입되고, 따라서 세포가 폴리뉴클레오티드로 안정하게 형질전환되는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "안정한 형질전환" 또는 "안정하게 형질전환된"은 핵산 분자가 세포 내로 도입되고, 세포의 게놈 내로 통합되는 것을 의미한다. 따라서, 통합된 핵산 분자는 그의 자손에 의해, 보다 특히, 다수의 연속적 세대의 자손에 의해 유전될 수 있다. 본원에 사용된 "게놈"은 핵, 미토콘드리아 및 색소체 게놈을 포함하고, 따라서 예를 들어, 엽록체 또는 미토콘드리아 게놈 내로의 핵산의 통합을 포함한다. 본원에 사용된 안정한 형질전환은 또한 염색체외적으로, 예를 들어, 미니염색체 또는 플라스미드로서 유지되는 트랜스진을 지칭할 수 있다.
일시적 형질전환은 예를 들어, 유기체 내로 도입된 1개 이상의 트랜스진에 의해 코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드의 존재를 검출할 수 있는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 웨스턴 블롯에 의해 검출될 수 있다. 세포의 안정한 형질전환은 예를 들어, 유기체 (예를 들어, 식물) 내로 도입된 트랜스진의 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 갖는 세포의 게놈 DNA의 서던 블롯 혼성화 검정에 의해 검출될 수 있다. 세포의 안정한 형질전환은 예를 들어, 숙주 유기체 내로 도입된 트랜스진의 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 갖는 세포의 RNA의 노던 블롯 혼성화 검정에 의해 검출될 수 있다. 세포의 안정한 형질전환은 또한 예를 들어, 표준 방법에 따라 검출될 수 있는 트랜스진의 표적 서열(들)과 혼성화하여, 트랜스진 서열의 증폭을 발생시키는 특이적 프라이머 서열을 채용하는, 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 다른 증폭 반응에 의해 검출될 수 있다. 형질전환은 또한 관련 기술분야에 널리 공지된 직접적 시퀀싱 및/또는 혼성화 프로토콜에 의해 검출될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 및/또는 발현 카세트는 일시적으로 발현될 수 있고/거나, 이들은 숙주 유기체의 게놈 내로 안정하게 혼입될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물 (예를 들어, DNA 결합 폴리펩티드 또는 도메인, 엔도뉴클레아제 폴리펩티드 또는 도메인, 리버스 트랜스크립타제 폴리펩티드 또는 도메인, 플랩 엔도뉴클레아제 폴리펩티드 또는 도메인 및/또는 핵산 변형 폴리펩티드 또는 도메인을 코딩하는 1종 이상의 발현 카세트)은 가이드 핵산과 함께 및 따라서 세포에서 유지된 DNA 없이 세포 내로 일시적으로 도입될 수 있다.
본 발명의 핵산 구축물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 세포의 형질전환은 핵 형질전환을 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포의 형질전환은 색소체 형질전환 (예를 들어, 엽록체 형질전환)을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 구축물은 통상적인 육종 기술을 통해 세포 내로 도입될 수 있다.
진핵생물 및 원핵생물 유기체 둘 다를 형질전환시키는 절차는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상적이며, 문헌 전반에 걸쳐 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Jiang et al. 2013. Nat. Biotechnol. 31:233-239]; [Ran et al. Nature Protocols 8:2281-2308 (2013)] 참조).
따라서 뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 수의 방식으로 숙주 유기체 또는 그의 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 방법은 이들이 유기체의 적어도 하나의 세포의 내부에의 접근을 얻는 한, 유기체 내로 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 도입하는 특정 방법에 의존하지 않는다. 1개 초과의 뉴클레오티드 서열이 도입되어야 하는 경우, 이들은 단일 핵산 구축물의 일부로서, 또는 별개의 핵산 구축물로서 어셈블리될 수 있고, 동일한 또는 상이한 핵산 구축물 상에 위치할 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열은 단일 형질전환 사건에서, 및/또는 별개의 형질전환 사건에서 관심의 세포 내로 도입될 수 있거나, 또는, 대안적으로, 관련되는 경우, 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 육종 프로토콜의 일부로서 식물 내로 혼입될 수 있다.
염기 편집은 시토신 및 아데닌 잔기를 각각 티민 및 구아닌으로 변화시키는 효율적인 방식인 것으로 나타났다. 이들 툴은, 강력하지만, 일부 제한, 예컨대 구경꾼 염기, 작은 염기 편집 창, 및 제한된 PAM을 갖는다.
세포에서 정확한 주형화된 편집을 수행하기 위해 몇몇 필수적인 단계가 있으며, 이의 각각은 함께 낮은 효율로 인해 편집을 효과적으로 수행하는 능력을 심각하게 방해할 수 있는 속도 제한을 갖는다. 예를 들어, 한 단계는 세포가 표적 부위에서 복구 사건을 개시하는 것을 유도할 것을 요구한다. 이는 전형적으로 외인적으로 제공된, 서열-특이적 뉴클레아제 또는 니카제에 의한 이중-가닥 파단 (DSB) 또는 닉을 유발함으로써 수행된다. 또 다른 단계는 복구에 사용되는 상동 주형의 국소 이용가능성을 요구한다. 이 단계는 DSB가 주형화된 편집 경로를 실행하기 위해 적격인 정확하게 바로 그 때 주형이 DSB에 근접하여 있을 것을 요구한다. 특히, 이 단계는 폭넓게 현재의 편집 기술을 갖는 속도 제한 단계인 것으로 간주된다. 추가의 단계는 주형으로부터 파단되거나 니킹된 표적 내로의 서열의 효율적인 혼입이다. 본 발명 전에, 이 단계는 전형적으로 세포의 내인성 DNA 복구 효소에 의해 제공되었다. 이 단계의 효율은 낮으며, 조작하기 곤란하다. 본 발명은 상기 기재된 단계를 수행하는데 요구되는 기능성을 조화된 방식으로 공동-국재화시킴으로써 주형화된 편집의 프로세스의 효율에 대한 많은 주요한 장애물을 우회한다.
도 1은 본 발명의 방법 및 구축물을 사용한 crRNA를 벗어나 역전사로부터의 DNA 서열의 생성 및 닉 부위 내로의 후속 통합을 나타낸다. 연장된 crRNA는 청색으로 나타내어지고, 제2 가닥 니카제 Cpf1 (Cas12a)에 결합된다 (nCpf1, 상부 좌측). 본원에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, nCpf1은 예를 들어, 펩티드를 통해 리버스 트랜스크립타제 (RT)에 공유 연결될 수 있거나, 또는 RT는 (예를 들어, 펩티드 태그에 결합하는 펩티드 태그 모티프/친화성 폴리펩티드의 사용을 통해 또는 본원에 기재된 바와 같은 화학적 상호작용을 통해) nCpf1에 동원될 수 있고, 이 경우 다수의 리버스 트랜스크립타제 단백질 (RTn)이 동원될 수 있다. sgRNA의 3' 단부는 닉 부위에서 DNA에 대해 상보적이다 (비-볼드체 쌍형성한 선, 상부 좌측). 이어서 RT는 DNA 닉의 3' 단부로부터 DNA를 중합하여, 게놈에 비-상보적 뉴클레오티드 (볼드체 쌍형성한 선, 괄호, 상부 우측), 이어서 상보적 뉴클레오티드 (비-볼드체 쌍형성한 선, 상부 우측)를 갖는 RNA에 상보적인 DNA 서열을 생성한다. 해리시, 생성된 DNA는 3' 오버행을 갖는 연장된 ssDNA를 가지며, 이는 원래 DNA (비-볼드체 쌍형성한 선, 하부 우측)와 매우 동일한 서열이지만, 일부 비-천연 뉴클레오티드 (볼드체 쌍형성한 선, 괄호, 하부 우측)를 갖는다. 이 플랩은 DNA 내로 혼입된 미스매칭된 뉴클레오티드가 있는 5' 오버행을 갖는 구조 (하부 좌측)와 평형에 있다. 이 평형은 우측에 바람직한 완벽한 쌍형성에 보다 많이 있지만, 예를 들어, 제2 가닥 (예를 들어, 표적 가닥 또는 하부 가닥)을 니킹하는 것을 포함한 다양한 방식으로 감소될 수 있도록 유도될 수 있다. 좌측의 구조는 DNA 래깅 가닥 합성에 관여하는 세포성 플랩 엔도뉴클레아제에 의해 우선적으로 절단될 수 있으며, 이는 포유동물 및 식물 세포 사이에 고도로 보존된다 (호모 사피엔스(Homo sapiens) FEN1의 아미노산 서열은 제아 메이스글리시네 막스 FEN1 둘 다와 50% 초과 동일함). 일부 실시양태에서, 플랩 엔도뉴클레아제는 비-천연/미스매칭된 뉴클레오티드를 포함하는 3' 플랩의 방향에서 평형을 유도하도록 도입될 수 있다. 보다 긴 5' 플랩은 종종 Dna2 단백질에 의해 진핵생물 세포에서 제거되어, 다시 3' 플랩 (바람직한) 생성물에 대한 평형을 유도한다 (예를 들어, 문헌 [Nucleic Acids Res. 2012 Aug;40(14):6774-86] 참조).
추가로 본 발명의 프로세스에서, 및 도 2에 예시된 바와 같이, 미스매치 복구를 감소시키고 변형된 뉴클레오티드 (볼드체, 괄호)를 갖는 최종 생성물을 형성하는데 보다 바람직하도록 평형을 유도하기 위해, Cpf1 니카제는 본원에 기재된 바와 같이 RT-편집 영역 (번개 표시)의 외부의 영역에 표적화될 수 있다. nCpf1:crRNA 분자는 편집 버블의 어느 하나의 측 또는 둘 다의 측 상에 있을 수 있다. 제1 가닥 (예를 들어, 도 2의 표적 가닥 또는 하부 가닥) (파선)을 니킹하는 것은 새롭게 혼입된 뉴클레오티드가 미스매치 복구 및 복제 동안 정확한 뉴클레오티드이고, 따라서 새로운 뉴클레오티드를 갖는 최종 생성물을 선호함을 세포에게 지시한다.
리버스 트랜스크립타제 (RT) 효소의 변이체는 편집 시스템의 온도-민감성 및 프로세싱성에 대한 유의한 효과를 가질 수 있다. RT의 천연 및 합리적으로- 및 비-합리적으로-조작된 (즉, 지정된 진화) 변이체는 식물-바람직한 온도에서 활성을 최적화하는데 및 프로세싱성 프로파일을 최적화하기 위해 유용할 수 있다.
RT 폴리펩티드에의 단백질 도메인 융합은 편집 시스템의 온도-민감성 및 프로세싱성에 대한 유의한 효과를 가질 수 있다. RT 효소는 ssRNA 결합 도메인 (RBD)에의 융합을 통해 온도-민감성, 프로세싱성, 및 주형 친화도에 대해 개선될 수 있다. 이들 RBD는 서열 특이성, 비-특이성 또는 서열 선호성을 가질 수 있다 (예를 들어, 서열식별번호:37 내지 52 참조). 다양한 친화도 분포는 상이한 세포 및 시험관내 환경에서 편집에 유익할 수 있다. RBD는 보다 많은 또는 보다 적은 뉴클레오티드를 인식하기 위해 RBD의 크기를 증가시키거나 감소시키는 것을 통해 특이성 및 결합 자유 에너지 둘 다에 있어서 변형될 수 있다. 다수의 RBD는 개별적 RBD의 조합인 친화도 분포를 갖는 단백질을 발생시킨다. 1개 이상의 RBD를 RT 효소에 첨가하는 것은 증가된 친화도, 증가된 또는 감소된 서열 특이성을 발생시키고/거나, 협동성을 촉진시킬 수 있다.
리버스 트랜스크립타제가 게놈 내로 편집물을 혼입한 후, 서열 중복성은 새롭게 합성된 편집된 서열 및 대체될 것으로 의도되는 원래 WT 서열 사이에 존재한다. 이는 표적 부위에서 5' 또는 3' 플랩 중 어느 하나를 초래하고, 이는 세포에 의해 복구되어야 한다. 편집된 가닥이 그의 상보체와 쌍형성되는 경우보다 WT 서열이 그의 상보체와 쌍형성되는 경우 더 많은 염기 쌍이 이용가능하기 때문에, 2가지 상태는 3' 플랩에 바람직한 결합 에너지와 평형으로 존재한다. 이는 3' 플랩의 프로세싱 (제거)이 편집된 잔기를 제거하고 표적을 WT 서열로 다시 되돌릴 수 있기 때문에 효율적인 편집에 불리하다. 그러나, 세포 플랩 엔도뉴클레아제, 예컨대 FEN1 또는 Dna2는 5' 플랩을 효율적으로 프로세싱할 수 있다. 따라서, 세포에 대해 천연인 5'- 플랩 엔도뉴클레아제의 기능에 의존하는 대신, 본 발명의 일부 실시양태에서 표적에서의 플랩 엔도뉴클레아제의 농도는 바람직한 평형 결과 (편집된 서열이 표적 부위에서 안정하게 혼입되게 되도록 5' 플랩에서의 WT 서열의 제거)를 추가로 선호하도록 증가될 수 있다. 이는 세포에서 유리 단백질로서 5' 플랩 엔도뉴클레아제의 과발현에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, FEN 또는 Dna2는 직접적 단백질 융합에 의해 또는 예컨대 펩티드 태그 및 친화성 폴리펩티드 쌍 (예를 들어, 썬태그 항체/에피토프 쌍)과의 비-공유 동원 또는 본원에 기재된 바와 같은 화학적 상호작용에 의한 CRISPR 복합체와의 회합에 의해 표적 부위에 활성적으로 동원될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 단백질/폴리펩티드, 및/또는 융합 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 핵산 구축물, 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터를 사용하여 표적 핵산을 변형시키는 방법을 추가로 제공한다. 방법은 생체내 시스템에서 (예를 들어, 세포에서 또는 유기체에서) 또는 시험관내 시스템 (예를 들어, 무세포)에서 수행될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 표적 핵산을 (a) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질; (b) 리버스 트랜스크립타제, 및 (c) 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 유형 II 또는 유형 V CRISPR RNA, 연장된 유형 II 또는 유형 V CRISPR DNA, 연장된 유형 II 또는 유형 V crRNA, 연장된 유형 II 또는 유형 V crDNA; 예를 들어, tagRNA, tagDNA)과 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 식물 세포에서 표적 핵산을 변형시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 리버스 트랜스크립타제, 및 연장된 가이드 핵산은 복합체를 형성할 수 있거나, 또는 복합체에 포함될 수 있으며, 이는 표적 핵산과 상호작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 표적 핵산을 (a) 제2 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 제2 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질; (b) 제2 리버스 트랜스크립타제, 및 (c) 제2 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 CRISPR RNA, 연장된 CRISPR DNA, 연장된 crRNA, 연장된 crDNA; 예를 들어, tagDNA, tagRNA)과 접촉시키고, 여기서 제2 연장된 가이드 핵산은 표적 핵산의 제1 가닥 상의 부위를 표적화하고 (스페이서는 그에 실질적으로 상보적이고/결합하고), 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 표적 핵산을 (a) 제2 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 제2 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질; (b) 제2 리버스 트랜스크립타제, 및 (c) 제2 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 CRISPR RNA, 연장된 CRISPR DNA, 연장된 crRNA, 연장된 crDNA; 예를 들어, tagDNA, tagRNA)과 접촉시키고, 여기서 제2 연장된 가이드 핵산은 표적 핵산의 제2 가닥 상의 부위를 표적화하고 (스페이서는 그에 실질적으로 상보적이고/결합하고), 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 표적 핵산을 약 20℃ 내지 42℃ (예를 들어, 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 또는 42℃, 및 그 안의 임의의 값 또는 범위)의 온도에서 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 미스매치 복구를 개선시키기 위해 추가의 폴리펩티드 및/또는 이를 코딩하는 핵산 구축물과 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 표적 핵산을 (a) CRISPR-Cas 이펙터 단백질; 및 (b) 가이드 핵산과 접촉시키고, 여기서 (i) CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 니카제 (예를 들어, nCas9, nCas12a)이고, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 의해 니킹된 제2 가닥 상의 부위로부터 5' 또는 3' 중 어느 하나인 약 10 내지 약 125개의 염기 쌍 (예를 들어, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 또는 125개의 염기 쌍, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)에 위치한 표적 핵산의 제1 가닥 상의 부위를 니킹하거나, 또는 (ii) CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 니카제 (예를 들어, nCas9, nCas12a)이고, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 의해 니킹된 제1 가닥 상의 부위로부터 약 10 내지 약 125개의 염기 쌍 (5' 또는 3' 중 어느 하나)에 위치한 표적 핵산의 제2 가닥 상의 부위를 니킹하고, 그에 의해 미스매치 복구를 개선시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 연장된 가이드 핵산은 (i) 유형 V CRISPR 핵산 또는 유형 II CRISPR 핵산 (유형 II 또는 유형 V CRISPR RNA, 유형 II 또는 유형 V CRISPR DNA, 유형 II 또는 유형 V crRNA, 유형 II 또는 유형 V crDNA) 및/또는 CRISPR 핵산 및 tracr 핵산 (예를 들어, 유형 II 또는 유형 V tracrRNA, 유형 II 또는 유형 V tracrDNA); 및 (ii) 프라이머 결합 부위 및 리버스 트랜스크립타제 주형 (RT 주형)을 포함하는 연장된 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연장된 부분은 CRISPR 핵산의 5' 단부 또는 3' 단부 중 어느 하나에 (예를 들어, 5'에서 3'로: 반복부-스페이서-연장된 부분, 또는 연장된 부분-반복부-스페이서) 및/또는 tracr 핵산의 5' 또는 3' 단부에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 연장된 가이드 핵산의 연장된 부분은 가이드의 CRISPR RNA에 대해 연장된 부분의 위치에 따라, 5'에서 3'로 RT 주형 (RTT) 및 프라이머 결합 부위 (PBS)를 포함하거나, 또는 5'에서 3'로 PBS 및 RTT를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 이중 가닥이고, 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하고, 프라이머 결합 부위는 표적 핵산의 제2 가닥 (비-표적, 상부 가닥)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 이중 가닥이고, 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하고, 프라이머 결합 부위는 표적 핵산의 제1 가닥에 결합한다 (예를 들어, 표적 가닥, CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 동원되는 동일한 가닥, 하부 가닥에 결합함). 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 이중 가닥이고, 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하고, 프라이머 결합 부위는 표적 핵산의 제2 가닥 (비-표적 가닥, CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 동원되는 것과 반대 가닥)에 결합한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 편집 리버스 트랜스크립타제 (RT)는 표적 가닥 (CRISPR RNA의 스페이서가 상보적이고 CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 동원되는 가닥)에 첨가하고, 일부 실시양태에서, 편집 리버스 트랜스크립타제 (RT)는 비-표적 가닥 (CRISPR RNA의 스페이서가 상보적이고 CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 동원되는 가닥에 상보적인 가닥)에 첨가한다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산을 (a) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질; (b) 리버스 트랜스크립타제, 및 (c) 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 유형 II 또는 유형 V CRISPR RNA, 연장된 유형 II 또는 유형 V CRISPR DNA, 연장된 유형 II 또는 유형 V crRNA, 연장된 유형 II 또는 유형 V crDNA)과 접촉시키고, 여기서 연장된 가이드 핵산은 (i) 유형 II 또는 유형 V CRISPR 핵산 (유형 II 또는 유형 V CRISPR RNA, 유형 II 또는 유형 V CRISPR DNA, 유형 II 또는 유형 V crRNA, 유형 II 또는 유형 V crDNA) 및/또는 CRISPR 핵산 및 tracr 핵산 (예를 들어, 유형 II 또는 유형 V tracrRNA, 유형 II 또는 유형 V tracrDNA); 및 (ii) 프라이머 결합 부위 및 리버스 트랜스크립타제 주형 (RT 주형)을 포함하는 연장된 부분을 포함하고, 유형 II 또는 유형 V CRISPR 핵산은 제1 가닥 (예를 들어, 표적 가닥)에 결합하는 (즉, 표적 핵산의 제1 가닥에서의 연속적 뉴클레오티드의 부분에 상보적인) 스페이서를 포함하고, 프라이머 결합 부위는 제1 가닥 (표적 가닥)에 결합하고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 제1 가닥 및 제2 가닥을 갖는 표적 핵산을 변형시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 Cas9 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 Cas12a 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 리버스 트랜스크립타제, 및 연장된 가이드 핵산은 복합체를 형성할 수 있거나, 또는 복합체에 포함된다. 일부 실시양태에서, 접촉은 표적 핵산을 5'-3' 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산은 5' 플랩 엔도뉴클레아제 (FEN), 임의로 FEN1 및/또는 Dna2 폴리펩티드와 추가로 접촉될 수 있고, 그에 의해 표적 핵산 내로 혼입되는 편집물을 포함하지 않는 5' 플랩을 제거함으로써 미스매치 복구를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, FEN 및/또는 Dna2는 표적 핵산의 존재 하에서 과발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, FEN은 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 도메인에 융합된 FEN 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 그에 의해 FEN을 표적 핵산에 동원한다. 일부 실시양태에서, Dna2는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 도메인에 융합된 Dna2 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 그에 의해 Dna2를 표적 핵산에 동원한다.
일부 실시양태에서, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 펩티드 태그 (예를 들어, 에피토프 또는 다량체화된 에피토프)에 융합된 (연결된) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질일 수 있고, FEN은 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 FEN 도메인을 포함하는 FEN 융합 단백질일 수 있고, 그에 의해 FEN을 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인, 및 표적 핵산에 동원한다. 일부 실시양태에서, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 펩티드 태그 (예를 들어, 에피토프 또는 다량체화된 에피토프)에 융합된 (연결된) 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질일 수 있고, Dna2는 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 Dna2 도메인을 포함하는 Dna2 융합 단백질일 수 있고, 그에 의해 Dna2를 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인, 및 표적 핵산에 동원한다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 펩티드 태그 (예를 들어, 에피토프 또는 다량체화된 에피토프)에 융합된 (연결된) 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질일 수 있고, FEN은 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 FEN 도메인을 포함하는 FEN 융합 단백질일 수 있고, 그에 의해 FEN을 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인, 및 표적 핵산에 동원한다. 일부 실시양태에서, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 펩티드 태그 (예를 들어, 에피토프 또는 다량체화된 에피토프)에 융합된 (연결된) 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질일 수 있고, Dna2는 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 Dna2 도메인을 포함하는 Dna2 융합 단백질일 수 있고, 그에 의해 Dna2를 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인, 및 표적 핵산에 동원한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 2종 이상의 FEN 융합 단백질 및/또는 Dna2 융합 단백질과 접촉될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 표적 핵산을 5'-3' 엑소뉴클레아제와 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산 내로 혼입되는 편집물 (비-편집된 가닥)을 포함하지 않는 5' 플랩을 제거함으로써 미스매치 복구를 개선시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 5'-3' 엑소뉴클레아제는 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에, 임의로 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 5'-3' 엑소뉴클레아제는 펩티드 태그에 융합된 5'-3' 엑소뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 그에 의해 미스매치 복구를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 5'-3' 엑소뉴클레아제는 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 5'-3' 엑소뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 펩티드 태그에 융합된 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 5'-3' 엑소뉴클레아제는 RNA 동원 모티프에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 5'-3' 엑소뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 연장된 가이드 핵산은 RNA 동원 모티프에 연결되고, 그에 의해 친화성 폴리펩티드 및 RNA 동원 모티프 사이의 상호작용을 통해 5'-3' 엑소뉴클레아제를 표적 핵산에 동원한다. 5'-3' 엑소뉴클레아제는 관심의 유기체, 세포 또는 시험관내 시스템에서 기능적인 임의의 공지된 또는 나중에 발견될 5'-3' 엑소뉴클레아제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 5'-3' 엑소뉴클레아제는 RecE 엑소뉴클레아제, RecJ 엑소뉴클레아제, T5 엑소뉴클레아제, 및/또는 T7 엑소뉴클레아제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) (균주 K12)로부터의 핵 국재화 서열 (NLS)로 둘 다의 측 상에 플랭킹된 RecE 엑소뉴클레아제 C-말단 단편이 사용될 수 있다 (서열식별번호:98). 일부 실시양태에서, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 (균주 K12)로부터의 핵 국재화 서열 (NLS)로 둘 다의 측 상에 플랭킹된 RecJ 엑소뉴클레아제가 사용될 수 있다 (서열식별번호:99). 일부 실시양태에서, 핵 국재화 서열 (NLS)로 둘 다의 측 상에 플랭킹된 T5 엑소뉴클레아제가 사용될 수 있다 (서열식별번호:100). 일부 실시양태에서, 예를 들어, 에스케리키아 파지 7로부터의 핵 국재화 서열 (NLS)로 둘 다의 측 상에 플랭킹된 T7 엑소뉴클레아제가 사용될 수 있다 (서열식별번호:101).
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 이중 가닥 파단을 감소시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 파단을 감소시키는 것은 표적 핵산의 영역에서 비-상동 단부 연결 (NHEJ)의 화학적 억제제를 도입함으로써, 또는 NHEJ 단백질을 표적화하는 CRISPR 가이드 핵산, 또는 siRNA를 도입하여 NHEJ 단백질의 발현을 일시적으로 넉-다운시킴으로써 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 융합 단백질일 수 있고/거나, 리버스 트랜스크립타제는 융합 단백질일 수 있고, 여기서 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질, 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질 및/또는 연장된 가이드 핵산은 리버스 트랜스크립타제를 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 동원하는 것을 허용하는 1종 이상의 성분에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 성분은 단백질-단백질 상호작용, 단백질-RNA 상호작용, 및/또는 화학적 상호작용을 통해 동원한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 펩티드 태그 (예를 들어, 에피토프 또는 다량체화된 에피토프)에 융합된 (연결된) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 융합 단백질일 수 있고, 리버스 트랜스크립타제는 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 (연결된) 리버스 트랜스크립타제 도메인을 포함하는 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질일 수 있고, 여기서 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 가이드 핵산과 상호작용하고, 가이드 핵산은 표적 핵산에 결합하고, 그에 의해 리버스 트랜스크립타제를 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 및 표적 핵산에 동원한다. 일부 실시양태에서, 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 펩티드 태그 (예를 들어, 에피토프 또는 다량체화된 에피토프)에 융합된 (연결된) 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 유형 II CRISPR-Cas 융합 단백질이고, FEN은 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 FEN 도메인을 포함하는 FEN 융합 단백질이고/거나, 여기서 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 펩티드 태그에 융합된 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 유형 II CRISPR-Cas 융합 단백질이고, Dna2 폴리펩티드는 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 Dna2 도메인을 포함하는 Dna2 융합 단백질이고, 임의로 여기서 표적 핵산은 2종 이상의 FEN 융합 단백질 및/또는 2종 이상의 Dna2 융합 단백질과 접촉되고, 그에 의해 FEN 및/또는 Dna2를 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인, 및 표적 핵산에 동원한다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질은 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 동원될 수 있고, 그에 의해 표적 핵산을 2종 이상의 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질과 접촉시킨다.
펩티드 태그는 GCN4 펩티드 태그 (예를 들어, 썬-태그(Sun-Tag)), c-Myc 친화성 태그, HA 친화성 태그, His 친화성 태그, S 친화성 태그, 메티오닌-His 친화성 태그, RGD-His 친화성 태그, FLAG 옥타펩티드, 스트렙 태그 또는 스트렙 태그 II, V5 태그, 및/또는 VSV-G 에피토프를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 폴리펩티드에 연결될 수 있고, 또 다른 폴리펩티드에 연결될 수 있는 상응하는 친화성 폴리펩티드가 있는 임의의 에피토프는 본 발명에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그는 펩티드 태그의 1 또는 2개 이상의 카피 (예를 들어, 에피토프, 다량체화된 에피토프 (예를 들어, 탠덤 반복부)) (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 초과의 펩티드 태그를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드는 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 scFv 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드는 아피바디, 안티칼린, 모노바디 및/또는 DARPin을 포함하나 이에 제한되지는 않는 합성 (예를 들어, 친화도 상호작용을 위해 진화됨)일 수 있다 (예를 들어, 그의 각각이 아피바디, 안티칼린, 모노바디 및/또는 DARPin에 관한 교시내용에 대해 그 전문이 참조로 포함되는 문헌 [Sha et al., Protein Sci. 26(5):910-924 (2017))]; [Gilbreth (Curr Opin Struc Biol 22(4):413-420 (2013))], 미국 특허 번호 9,982,053호 참조. 예시 펩티드 태그 서열 및 그들의 친화성 폴리펩티드는 서열식별번호:23 내지 25의 아미노산 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 연장된 가이드 핵산은 RNA 동원 모티프에 연결될 수 있고, 리버스 트랜스크립타제는 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질일 수 있고, 여기서 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질은 RNA 동원 모티프에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 리버스 트랜스크립타제 도메인을 포함할 수 있고, 연장된 가이드는 표적 핵산에 결합하고, RNA 동원 모티프는 친화성 폴리펩티드에 결합하고, 그에 의해 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질을 연장된 가이드에 동원하고, 표적 핵산을 리버스 트랜스크립타제 도메인과 접촉시킨다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질은 연장된 가이드 핵산에 동원될 수 있고, 그에 의해 표적 핵산을 2종 이상의 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질과 접촉시킨다. 예시 RNA 동원 모티프 및 그들의 친화성 폴리펩티드는 서열식별번호:26 내지 36의 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, RNA 동원 모티프는 연장된 가이드 핵산의 연장된 부분의 3' 단부 상에 위치할 수 있다 (예를 들어, 5'-3', 반복부-스페이서-연장된 부분 (RT 주형-프라이머 결합 부위)-RNA 동원 모티프). 일부 실시양태에서, RNA 동원 모티프는 연장된 부분에 내포될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 연장된 가이드 RNA 및/또는 가이드 RNA는 1개 또는 2개 이상의 RNA 동원 모티프 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 모티프; 예를 들어, 적어도 10 내지 약 25개의 모티프)에 연결될 수 있고, 임의로 여기서 2개 이상의 RNA 동원 모티프는 동일한 RNA 동원 모티프 또는 상이한 RNA 동원 모티프일 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 동원 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드는 텔로머라제 Ku 결합 모티프 (예를 들어, Ku 결합 헤어핀) 및 상응하는 친화성 폴리펩티드 Ku (예를 들어, Ku 이종이량체), 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드 Sm7, MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드 MS2 코트 단백질 (MCP), PP7 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드 PP7 코트 단백질 (PCP), SfMu 파지 Com 스템-루프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드 Com RNA 결합 단백질, PUF 결합 부위 (PBS) 및 친화성 폴리펩티드 푸밀리오(Pumilio)/fem-3 mRNA 결합 인자 (PUF), 및/또는 합성 RNA-압타머 및 상응하는 친화성 폴리펩티드로서의 압타머 리간드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, RNA 동원 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드는 MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 MS2 코트 단백질 (MCP)일 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 동원 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드는 PUF 결합 부위 (PBS) 및 친화성 폴리펩티드 푸밀리오/fem-3 mRNA 결합 인자 (PUF)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 및 핵산을 동원하기 위한 성분은 FRB - FKBP의 라파마이신-유도성 이량체화; 비오틴-스트렙타비딘; SNAP 태그; 할로 태그; CLIP 태그; 화합물에 의해 유도된 DmrA-DmrC 이종이량체; 이관능성 리간드 (예를 들어, 함께 2종의 단백질-결합 화학물질의 융합물; 예를 들어 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 화학적 상호작용을 통해 기 능하는 것들일 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질 (예를 들어, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 제1 CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 제2 CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 제3 CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 및/또는 제4 CRISPR-Cas 이펙터 단백질)은 유형 I CRISPR-Cas 시스템, 유형 II CRISPR-Cas 시스템, 유형 III CRISPR-Cas 시스템, 유형 IV CRISPR-Cas 시스템 및/또는 유형 V CRISPR-Cas 시스템으로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR-Cas 뉴클레아제는 유형 II CRISPR-Cas 시스템 또는 유형 V CRISPR-Cas 시스템으로부터의 것이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 Cas9, C2c1, C2c3, Cas12a (또한 Cpf1로 지칭됨), Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas3', Cas3", Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csnl 및 Csx12로 공지됨), Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4 (dinG), 및/또는 Csf5 뉴클레아제일 수 있고, 임의로 여기서 CRISPR-Cas 뉴클레아제는 Cas9, Cas12a (Cpf1), Cas12b, Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12g, Cas12h, Cas12i, C2c4, C2c5, C2c8, C2c9, C2c10, Cas14a, Cas14b, 및/또는 Cas14c 뉴클레아제일 수 있다.
일부 실시양태에서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 니카제 (예를 들어, Cas9 니카제 또는 Cas12a 니카제)로서 기능하는 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 그의 뉴클레아제 활성 부위 (예를 들어, Cas12a 뉴클레아제 도메인의 RuvC, HNH, 예를 들어, RuvC 부위; 예를 들어, Cas9 뉴클레아제 도메인의 RuvC 부위 및/또는 HNH 부위)에 돌연변이를 포함할 수 있다. 그의 뉴클레아제 활성 부위에 돌연변이를 갖고, 따라서, 더 이상 뉴클레아제 활성을 포함하지 않는 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 통상적으로 "죽은", 또는 "불활성화된", 예를 들어, dCas로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 그의 뉴클레아제 활성 부위에 돌연변이를 갖는 CRISPR-Cas 뉴클레아제 도메인 또는 폴리펩티드는 돌연변이를 갖지 않는 동일한 CRISPR-Cas 뉴클레아제와 비교하여 손상된 활성 또는 감소된 활성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 이중 가닥 뉴클레아제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 뉴클레아제 활성을 갖는 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 뉴클레아제 활성을 갖는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 Cas12a 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 뉴클레아제 활성을 갖는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 Cas9 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 Cas12a (Cpf1), Cas12b (C2c1), Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12g, Cas12h, Cas12i, C2c4, C2c5, C2c8, C2c9, C2c10, Cas14a, Cas14b, 및/또는 Cas14c 이펙터 단백질 및/또는 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 시스템은 단지 유형 V CRISPR 핵산을 이용하는 이펙터 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 시스템은 유형 II CRISPR-Cas 시스템과 유사하게, CRISPR 핵산 및 트랜스-활성화 CRISPR (tracr) 핵산 둘 다를 이용하는 이펙터 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 단지 상응하는 CRISPR 핵산 (예를 들어, Cas12a, Cas12a, Cas12i, Cas12h, Cas14b, Cas14c, C2c10, C2c9, C2c8, C2c4)과 함께 기능할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 상응하는 CRISPR 핵산 및 tracr 핵산 (예를 들어, Cas12b, Cas12c, Cas12e, Cas12g, Cas14a)과 함께 기능할 수 있다.
본 발명에 유용한 CRISPR 핵산은 상응하는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질과 상호작용할 수 있는 적어도 1개의 반복 서열, 및 적어도 1개의 스페이서 서열을 포함할 수 있고, 여기서 적어도 1개의 스페이서 서열은 표적 핵산 (예를 들어, 표적 핵산의 제1 가닥 또는 제2 가닥)에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR 핵산의 반복 서열은 스페이서 서열에 대해 5'에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR 핵산은 1개 초과의 반복 서열을 포함할 수 있고, 여기서 반복 서열은 스페이서의 5' 단부 및 3' 단부 둘 다에 연결된다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 CRISPR 핵산은 2개 이상의 반복부 및 1개 이상의 스페이서 서열을 포함할 수 있고, 여기서 각각의 스페이서 서열은 반복 서열과 5' 단부 및 3' 단부에서 연결된다.
본 발명에 유용한 tracr 핵산은 상응하는 CRISPR 핵산의 반복 서열에 실질적으로 상보적이고 그에 혼성화하는 제1 부분 및 상응하는 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질과 상호작용하는 제2 부분을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 이중 가닥 DNA 뉴클레아제로서 기능할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 단일 가닥 DNA 니카제로서 기능할 수 있고, 임의로 여기서 제1 가닥은 니킹된다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 단일 가닥 DNA 니카제로서 기능할 수 있고, 임의로 여기서 제2 가닥은 니킹된다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 니카제로서 기능하는 Cas12a 이펙터 단백질일 수 있고, 임의로 여기서 제1 가닥 (표적 가닥)은 니킹된다. 일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 니카제로서 기능하는 Cas12a 이펙터 단백질일 수 있고, 임의로 여기서 제2 가닥은 니킹된다.
일부 실시양태에서, Cas12a 이펙터 단백질은 LQMRNS 모티프에서 아르기닌의 돌연변이를 갖는 Cas12a 니카제일 수 있다. 이 모티프에서의 아르기닌의 돌연변이는 임의의 아미노산으로의 것일 수 있고, 그에 의해 Cas12a 니카제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 알라닌으로의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 또는 발린으로의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 알라닌으로의 돌연변이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 리신 또는 히스티딘으로의 돌연변이를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, Cas12a 이펙터 단백질은 R1138, 임의로 R1138A 돌연변이 (참조 뉴클레오티드 서열 서열식별번호:9 참조), R1137 돌연변이, 임의로 R1137A 돌연변이 (참조 뉴클레오티드 서열 서열식별번호:1 참조), 또는 R1124 돌연변이, 임의로 R1124A 돌연변이 (참조 뉴클레오티드 서열 서열식별번호:7 참조)를 포함하는 LbCas12a 니카제일 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas12a 이펙터 단백질은 R1226 돌연변이, 임의로 R1226A 돌연변이 (참조 뉴클레오티드 서열 서열식별번호:2 참조)를 포함하는 AsCas12a 니카제일 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas12a 이펙터 단백질은 R1218 돌연변이, 임의로 R1218A 돌연변이 (참조 뉴클레오티드 서열 서열식별번호:6 참조를 포함하는 FnCas12a 니카제일 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas12a 이펙터 단백질은 R1241 돌연변이, 임의로 R1241A 돌연변이 (참조 뉴클레오티드 서열 서열식별번호:14 참조를 포함하는 PdCas12a 니카제일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 감소된 단일 가닥 DNA 절단 활성 (ss DN아제 활성)을 포함할 수 있다 (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 ss DN아제 활성을 감소시키도록 (예를 들어, 야생형 또는 비-변형된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질보다 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 더 적은 ss DN아제 활성) 변형될 (돌연변이될) 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 감소된 자기-프로세싱 RN아제 활성을 포함할 수 있다 (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 자기-프로세싱 RN아제 활성을 감소시키도록 (예를 들어, 야생형 또는 비-변형된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질보다 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 더 적은 자기-프로세싱 RN아제 활성) 변형될 (돌연변이될) 수 있다. 일부 실시양태에서, 자기-프로세싱 RN아제 활성을 감소시키는 돌연변이는 서열식별번호:9의 뉴클레오티드 위치 넘버링에 관하여 잔기 위치 759에서의 히스티딘의 돌연변이, 임의로 히스티딘의 알라닌으로의 돌연변이 (H759A)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 도메인은 그의 뉴클레아제 활성 부위 (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 도메인의 RuvC, 예를 들어, Cas12a 뉴클레아제 도메인의 RuvC 부위)에 돌연변이를 포함할 수 있다. 그의 뉴클레아제 활성 부위에 돌연변이를 갖고, 따라서, 더 이상 뉴클레아제 활성을 포함하지 않는 CRISPR-Cas 뉴클레아제는 통상적으로 "불활성화된" 또는 "죽은", 예를 들어, dCas, dCas12a로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 그의 뉴클레아제 활성 부위에 돌연변이를 갖는 CRISPR-Cas 뉴클레아제 도메인 또는 폴리펩티드는 돌연변이를 갖지 않는 동일한 CRISPR-Cas 뉴클레아제와 비교하여 손상된 활성 또는 감소된 활성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 불활성화된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 니카제 (제1 가닥 니카제 및/또는 제2 가닥 니카제)로서 기능할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질일 수 있고, 여기서 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질은 리버스 트랜스크립타제에 융합된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 폴리펩티드의 C-말단에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 폴리펩티드의 N-말단에 융합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질일 수 있고, 여기서 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질은 니킹 효소 (예를 들어, Fok1, BFi1, 예를 들어, 조작된 Fok1 또는 BFiI)에 융합된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하고, 임의로 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인은 니킹 효소에 융합된 불활성화된 유형 V CRISPR-Cas 도메인일 수 있다.
일부 실시양태에서, 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 유형 II CRISPR-Cas 융합 단백질일 수 있고, 여기서 유형 II CRISPR-Cas 융합 단백질은 리버스 트랜스크립타제에 융합된 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 폴리펩티드의 C-말단에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 폴리펩티드의 N-말단에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 유형 II CRISPR-Cas 융합 단백질일 수 있고, 여기서 유형 II CRISPR-Cas 융합 단백질은 니킹 효소 (예를 들어, Fok1, BFi1, 예를 들어, 조작된 Fok1 또는 BFiI)에 융합된 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하고, 임의로 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인은 니킹 효소에 융합된 불활성화된 유형 II CRISPR-Cas 도메인일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 리버스 트랜스크립타제는 야생형 리버스 트랜스크립타제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 리버스 트랜스크립타제는 합성 리버스 트랜스크립타제일 수 있으며, 예를 들어, 문헌 [Heller et al. Nucleic Acids Research, 47(7) 3619-3630 (2019))]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 리버스 트랜스크립타제는 리버스 트랜스크립타제의 전사 기능을 개선시키도록 변형될 수 있다. 리버스 트랜스크립타제의 전사 기능은 리버스 트랜스크립타제의 프로세싱성을 개선시킴으로써 개선될 수 있고, 예를 들어, 주형에 대한 단일 결합 사건 동안 보다 많은 DNA 염기를 중합하는 리버스 트랜스크립타제의 능력을 증가시킨다 (예를 들어, 그것이 주형으로부터 떨어지기 전에) (예를 들어, 변형되지 않은 참조 리버스 트랜스크립타제와 비교하여 프로세싱성을 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 345, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 증가시킴).
일부 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제의 전사 기능은 리버스 트랜스크립타제의 주형 친화도를 개선시킴으로써 개선될 수 있다 (예를 들어, 변형되지 않은 참조 리버스 트랜스크립타제와 비교하여 주형 친화도를 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 345, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 증가시킴).
일부 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제의 전사 기능은 바람직한 온도에서 개선된 성능을 위해 리버스 트랜스크립타제의 열안정성을 개선시킴으로써 개선될 수 있다 (예를 들어, 변형되지 않은 참조 리버스 트랜스크립타제와 비교하여 열안정성을 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 345, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 증가시킴). 일부 실시양태에서, 개선된 열안정성은 약 20℃ 내지 42℃ (예를 들어, 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 또는 42℃, 및 그 안의 임의의 값 또는 범위)의 온도에서이다. 일부 실시양태에서, 개선된 열안정성을 갖는 리버스 트랜스크립타제는 M-MuLV 삼중돌연변이체 D200N+L603W+T330P 또는 M-MuLV 오중돌연변이체 D200N+L603W+T330P+T306K+W313F (참조 서열 서열식별번호:53)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Baranauskas et al. (Protein Eng. Des. Sel. 25, 657-668 (2012))]; [Anzalone et al. (Nature 576:149-157 (2019))]을 참조한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 1개 이상의 단일 가닥 RNA 결합 도메인 (RBD)에 융합될 수 있다. 본 발명에 유용한 RBD는 서열식별번호:37 내지 52 (서열식별번호:37, 서열식별번호:38, 서열식별번호:39, 서열식별번호:40, 서열식별번호:41, 서열식별번호:42, 서열식별번호:43, 서열식별번호:44, 서열식별번호:45, 서열식별번호:46, 서열식별번호:47, 서열식별번호:48, 서열식별번호:49, 서열식별번호:50, 서열식별번호:51, 및/또는 서열식별번호:52)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않고, 그에 의해 리버스 트랜스크립타제의 열안정성, 프로세싱성 및 주형 친화도를 개선시킨다.
일부 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제의 활성은 유형 V 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 폴리펩티드와 회합되어 최적 활성을 제공하기 위해 (유형 V 또는 유형 II) 유전자 편집 활성에 대해 변형될 수 있다 (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 폴리펩티드와 회합되는 경우 변형되지 않은 참조 리버스 트랜스크립타제와 비교하여 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 345, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%의 활성의 증가). 이러한 돌연변이는 RT 개시, 프로세싱성, 효소 동역학, 온도 민감성, 및/또는 오류율에 영향을 미치거나 개선시키는 것들을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드/단백질/도메인 (예를 들어, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 예를 들어, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질), 리버스 트랜스크립타제, 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 및/또는 5'-3' 엑소뉴클레아제)은 임의로 1개 이상의 프로모터 및/또는 다른 조절 서열 (예를 들어, 종결자, 오페론, 및/또는 인핸서 등)에 작동가능하게 연결된 1종 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 1종 이상의 발현 카세트 및/또는 벡터에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 조절 서열은 예를 들어, 프로모터, 오페론, 종결자, 또는 인핸서일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 조절 서열은 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조절 서열은 인트론일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 조절 서열은 예를 들어, 인트론과 작동가능하게 회합된 프로모터 또는 인트론을 포함하는 프로모터 영역일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 조절 서열은 예를 들어 유비퀴틴 프로모터 및 그의 회합된 인트론 (예를 들어, 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula) 및/또는 제아 메이스 및 그들의 회합된 인트론) (예를 들어, 인트론을 포함하는 ZmUbi1; 인트론을 포함하는 MtUb2, 예를 들어, 서열식별번호:21 또는 22) 또는 서열식별번호:74 또는 75의 인트론을 포함하는 프로모터)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 인트론을 포함하거나 그와 회합된 1개 이상의 프로모터 영역과 작동가능하게 회합된 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 도메인 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 리버스 트랜스크립타제 폴리펩티드 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 5'-3' 엑소뉴클레아제 폴리펩티드 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 플랩 엔도뉴클레아제 폴리펩티드 또는 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 임의로 여기서 프로모터 영역은 유비퀴틴 프로모터 및 인트론 ((예를 들어, 메디카고 또는 메이즈 유비퀴틴 프로모터 및 인트론, 예를 들어, 서열식별번호:21 또는 22) 또는 서열식별번호:74 또는 75의 인트론을 포함하는 프로모터)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 또는 별개의 발현 카세트에 포함될 수 있고, 임의로 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 카세트에 포함되는 경우, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단일 프로모터에 또는 2개 이상의 별개의 프로모터에 임의의 조합으로 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트에 포함될 수 있고, 여기서 CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 연장된 가이드 핵산 및/또는 가이드 핵산은 발현 카세트에 포함될 수 있고, 임의로 여기서 발현 카세트는 벡터에 포함된다. 일부 실시양태에서, 연장된 가이드 핵산을 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터는 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것과 동일한 또는 상이한 발현 카세트 및/또는 벡터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 핵산을 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터는 CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것과 동일한 또는 상이한 발현 카세트 및/또는 벡터일 수 있다.
일부 실시양태에서, 5' 플랩 엔도뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 5'-3' 엑소뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 또는 상이한 발현 카세트일 수 있는 1종 이상의 발현 카세트에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 5' 플랩 엔도뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 5'-3' 엑소뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트는 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것과 동일한 또는 상이한 발현 카세트일 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질 (예를 들어, 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질), 리버스 트랜스크립타제, 플랩 엔도뉴클레아제, 5'-3' 엑소뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 이를 포함하는 융합 단백질 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구축물, 발현 카세트 및/또는 벡터는 유기체 (예를 들어, 동물 (예를 들어, 포유동물, 곤충, 어류 등), 식물 (예를 들어, 쌍자엽 식물, 단자엽 식물), 박테리아, 고세균 등)에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 및/또는 벡터는 식물, 임의로 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 본 발명이 유용할 수 있는 예시적인 포유동물은 영장류 (인간 및 비-인간 (예를 들어, 침팬지, 비비, 원숭이, 고릴라 등)), 고양이, 개, 페렛, 거빌, 햄스터, 소, 돼지, 말, 염소, 당나귀, 또는 양을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 유기체에서의 발현을 위해 최적화된 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 발현 카세트 또는 벡터는 이를 코딩하지만 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화되지 않은 핵산 구축물, 발현 카세트 또는 벡터와 약 70% 내지 100% 동일할 (예를 들어, 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%) 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 발현 카세트 및 벡터가 제공될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서 5'에서 3'로 (a) 프로모터 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (b) 유기체에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 유형 V CRISPR-Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cpf1 (Cas12a), dCas12a 등) 또는 유형 II CRISPR-Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9, dCas9 등)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (c) 링커 서열; 및 (d) 유기체에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유기체에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 발현 카세트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 유기체는 동물, 식물, 진균, 고세균, 또는 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 유기체는 식물이고, 유형 V CRISPR-Cas 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화되고, 프로모터 서열은 식물 특이적 프로모터 서열 (예를 들어 ZmUbi1, MtUb2, RNA 폴리머라제 II (Pol II))이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 발현 카세트 및 벡터가 제공될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서 5'에서 3'로 (a) 식물 특이적 프로모터 서열 (예를 들어 ZmUbi1, MtUb2, RNA 폴리머라제 II (Pol II))을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (b) 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 (예를 들어, Cpf1 (Cas12a), dCas12a 등)을 코딩하는 식물 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드, (c) 링커 서열; 및 (d) 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 식물 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 발현 카세트가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 링커를 통해 서로에 연결된 1종 이상의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 또는 펩티드 링커일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 본원에 기재된 바와 같이, 약 2 내지 약 100개의 아미노산 (잔기)의 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 예를 들어, GS 링커일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 식물 특이적 프로모터 서열 (예를 들어 ZmUbi1, MtUb2)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (b) 연장된 가이드 핵산 서열을 포함하고, 여기서 연장된 가이드 핵산은 그의 3' 단부에 프라이머 결합 부위 및 표적 핵산 내로 혼입되는 편집물 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제 주형) (예를 들어, 5'-3' - crRNA-RTT-PBS)을 포함하는 연장된 부분을 포함하고, 임의로 연장된 가이드 핵산은 발현 카세트에 포함되고, 임의로 연장된 가이드 핵산은 Pol II 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인, 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 발현 카세트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 가이드 핵산의 연장된 부분이 5' 단부에서 CRISPR RNA에 부착되는 경우, 연장된 부분은 그의 5' 단부에 프라이머 결합 부위 및 3' 단부에서 표적 핵산 내로 혼입되는 편집물 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제 주형) (5'-3' - PBS-RTT-crRNA)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 쌍자엽 식물에서의 발현을 위해 또는 단자엽 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 1종 이상의 발현 카세트를 식물 또는 식물 세포 내로 도입하고, 그에 의해 식물 또는 식물 세포에서 표적 핵산을 변형시켜 변형된 표적 핵산을 포함하는 식물 또는 식물 세포를 생산하는 것을 포함하는, 식물 또는 식물 세포에서 표적 핵산을 변형시키는 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 표적 핵산을 포함하는 식물 세포를 재생시켜 변형된 표적 핵산을 포함하는 식물을 생산하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 유용한 CRISPR Cas9 폴리펩티드 또는 CRISPR Cas9 도메인 (예를 들어, 유형 II CRISPR Cas 이펙터 단백질)은 임의의 공지된 또는 나중에 확인될 Cas9 뉴클레아제일 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR Cas9 폴리펩티드는 예를 들어, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종 (예를 들어, 에스. 피오게네스(S. pyogenes), 에스. 써모필루스(S. thermophilus)), 락토바실루스(Lactobacillus) 종, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 종, 칸들레리아(Kandleria) 종, 류코노스톡(Leuconostoc) 종, 오에노코쿠스(Oenococcus) 종, 페디오코쿠스(Pediococcus) 종, 웨이셀라(Weissella) 종, 및/또는 올세넬라(Olsenella) 종으로부터의 Cas9 폴리펩티드일 수 있다.
Cas12a는 유형 V 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)-Cas 이펙터 단백질 또는 도메인이다. Cas12a는 보다 널리 공지된 유형 II CRISPR Cas9 이펙터 단백질과는 몇몇 측면에서 상이하다. 예를 들어, Cas9는 그의 가이드 RNA (gRNA, sgRNA) 결합 부위 (프로토스페이서, 표적 핵산, 표적 DNA)에 대해 3'인 G-풍부 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM) (3'-NGG)를 인식하는 반면, Cas12a는 표적 핵산에 대해 5'에 위치한 T-풍부 PAM (5'-TTN, 5'-TTTN을 인식한다. 사실, Cas9 및 Cas12a가 그들의 가이드 RNA에 결합하는 배향은 그들의 N 및 C 말단에 관하여 아주 거의 반대이다. 더욱이, Cas12a 이펙터 단백질은 천연 Cas9 시스템에서 발견되는 이중 가이드 RNA (sgRNA (예를 들어, crRNA 및 tracrRNA))라기 보다는 단일 가이드 RNA (gRNA, CRISPR 어레이, crRNA)를 사용하고, Cas12a는 그 자신의 gRNA를 프로세싱한다. 추가로, Cas12a의 뉴클레아제 활성은 Cas9의 뉴클레아제 활성에 의해 생성된 블런트 단부 대신 엇갈린 DNA 이중 가닥 파단을 생성하고, Cas12a는 둘 다의 DNA 가닥을 절단하기 위해 단일 RuvC 도메인에 의존하는 반면, Cas9는 절단을 위해 HNH 도메인 및 RuvC 도메인을 이용한다.
본 발명에 유용한 CRISPR Cas12a 이펙터 단백질 또는 도메인은 임의의 공지된 또는 나중에 확인될 Cas12a 뉴클레아제 (이전에 Cpf1로 공지됨)일 수 있다 (예를 들어, Cpf1 (Cas12a) 서열의 그의 개시내용에 대해 참조로 포함되는 미국 특허 번호 9,790,490 참조). 용어 "Cas12a", "Cas12a 폴리펩티드" 또는 "Cas12a 도메인"은 Cas12a의 가이드 핵산 결합 도메인 및/또는 Cas12a의 활성, 불활성, 또는 부분적으로 활성 DNA 절단 도메인을 포함하는 Cas12a, 또는 그의 단편을 포함하는 RNA-가이드된 이펙터 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 Cas12a는 뉴클레아제 활성 부위 (예를 들어, Cas12a 도메인의 RuvC 부위)에 돌연변이를 포함할 수 있다. 그의 뉴클레아제 활성 부위에 돌연변이를 갖고, 따라서, 더 이상 뉴클레아제 활성을 포함하지 않는 Cas12a 이펙터 단백질 또는 도메인은 통상적으로 죽은 또는 불활성화된 Cas12a (예를 들어, dCas12a)로 지칭된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 최적화될 또는 다르게는 변형될 (예를 들어, 불활성화) 수 있는 Cas12a 이펙터 폴리펩티드는 서열식별번호:1 내지 20 중 어느 하나 (예를 들어, 서열식별번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20)의 아미노산 서열, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다
본원에 사용된 "가이드 핵산", "가이드 RNA", "gRNA", "CRISPR RNA/DNA", "crRNA" 또는 "crDNA"는 표적 DNA (예를 들어, 프로토스페이서)에 상보적인 (및 그에 혼성화하는) 적어도 1개의 스페이서 서열, 및 특정 CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 상응하는 적어도 1개의 반복 서열 (예를 들어, 유형 V CRISPR Cas 이펙터 단백질에 대해, 반복부 또는 그의 단편 또는 부분은 유형 V Cas12a CRISPR-Cas 시스템으로부터의 것이고; 유형 II CRISPR Cas 이펙터 단백질에 대해, 반복부 또는 그의 단편 또는 부분은 유형 II Cas9 CRISPR-Cas 시스템으로부터의 것임)을 포함하는 핵산을 의미한다. 따라서, 본 발명에 유용한 CRISPR-Cas 시스템의 반복부는 예를 들어, Cas9, C2c3, Cas12a (또한 Cpf1로 지칭됨), Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas3', Cas3", Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csnl 및 Csx12로 공지됨), Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4 (dinG), 및/또는 Csf5의 CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 또는 그의 단편에 상응할 수 있고, 여기서 반복 서열은 스페이서 서열의 5' 단부 및/또는 3' 단부에 연결될 수 있다. 본 발명의 가이드 핵산의 디자인은 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 IV, 또는 유형 V CRISPR-Cas 시스템에 기반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 가이드 핵산의 디자인은 유형 V CRISPR-Cas 시스템에 기반한다.
일부 실시양태에서, Cas12a 가이드 핵산 또는 연장된 가이드 핵산은 5'에 3'로 반복 서열 (전장 또는 그의 부분 ("핸들"); 예를 들어, 슈도노트-유사 구조) 및 스페이서 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 가이드 핵산은 1개 초과의 반복 서열-스페이서 서열 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과의 반복부-스페이서 서열) (예를 들어, 반복부-스페이서-반복부, 예를 들어, 반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부-스페이서-반복부-스페이서 등)을 포함할 수 있다. 본 발명의 가이드 핵산은 합성, 인간-제조이며, 자연에서 발견되지 않는다. 가이드 핵산은 매우 길 수 있고, 압타머 (MS2 동원 전략에서와 같이)로서 또는 스페이서를 늘어뜨린 다른 RNA 구조로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이, 가이드 핵산은 편집을 위한 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 핵산은 편집 주형 (리버스 트랜스크립타제 주형)에 상보적인 그의 5' 단부 또는 3' 단부 상의 영역 또는 서열을 포함할 수 있고, 그에 의해 편집 주형을 표적 핵산 (즉, 연장된 가이드 핵산)에 동원한다. 일부 실시양태에서, 가이드 핵산은 표적 핵산 상의 프라이머 (프라이머 결합 부위)에 상보적인 그의 5' 단부 또는 3' 단부 상의 영역 또는 서열을 포함할 수 있고, 그에 의해 프라이머 결합 부위를 표적 핵산 (즉, 연장된 가이드 핵산)에 동원한다.
본원에 사용된 "반복 서열"은 예를 들어, 야생형 CRISPR Cas 유전자좌 (예를 들어, Cas9 유전자좌, Cas12a 유전자좌, C2c1 유전자좌 등)의 임의의 반복 서열 또는 본 발명의 핵산 구축물에 의해 코딩되는 CRISPR-Cas 뉴클레아제로 기능적인 합성 crRNA의 반복 서열을 지칭한다. 본 발명에 유용한 반복 서열은 CRISPR-Cas 유전자좌 (예를 들어, 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 IV, 유형 V 또는 유형 VI)의 임의의 공지된 또는 나중에 확인될 반복 서열일 수 있거나, 또는 이는 유형 I, II, III, IV, V 또는 VI CRISPR-Cas 시스템에서 기능하도록 디자인된 합성 반복부일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 반복 서열은 야생형 I CRISPR-Cas 유전자좌, 유형 II, CRISPR-Cas 유전자좌, 유형 III, CRISPR-Cas 유전자좌, 유형 IV CRISPR-Cas 유전자좌, 유형 V CRISPR-Cas 유전자좌 및/또는 유형 VI CRISPR-Cas 유전자좌로부터의 반복 서열과 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 반복 서열은 유형 V CRISPR-Cas 유전자좌의 임의의 공지된 또는 나중에 확인될 반복 서열일 수 있거나, 또는 이는 유형 V CRISPR-Cas 시스템에서 기능하도록 디자인된 합성 반복부일 수 있다. 반복 서열은 헤어핀 구조 및/또는 스템 루프 구조를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 반복 서열은 그의 5' 단부에서 슈도노트-유사 구조 (즉, "핸들")를 형성할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 반복 서열은 야생형 유형 V CRISPR-Cas 유전자좌 또는 야생형 유형 II CRISPR-Cas 유전자좌로부터의 반복 서열과 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다. 야생형 CRISPR-Cas 유전자좌로부터의 반복 서열은 확립된 알고리즘을 통해, 예컨대 CRISPRdb를 통해 제공된 CRISPR파인더를 사용하여 결정될 수 있다 (문헌 [Grissa et al. Nucleic Acids Res. 35 (Web Server issue):W52-7 or BMC Informatics 8:172 (2007)(doi:10.1186/1471-2105-8-172)] 참조). 일부 실시양태에서, 반복 서열 또는 그의 부분은 그의 3' 단부에서 스페이서 서열의 5' 단부에 연결되고, 그에 의해 반복부-스페이서 서열 (예를 들어, 가이드 RNA, crRNA)을 형성한다.
일부 실시양태에서, 반복 서열은 특정 반복부 및 반복부를 포함하는 가이드 RNA가 프로세싱되는지 비프로세싱되는지 여부에 따라 적어도 10개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 내지 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값; 예를 들어, 약)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 반복 서열은 약 10 내지 약 20, 약 10 내지 약 30, 약 10 내지 약 45, 약 10 내지 약 50, 약 15 내지 약 30, 약 15 내지 약 40, 약 15 내지 약 45, 약 15 내지 약 50, 약 20 내지 약 30, 약 20 내지 약 40, 약 20 내지 약 50, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 80, 약 50 내지 약 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
스페이서 서열의 5' 단부에 연결된 반복 서열은 반복 서열의 부분 (예를 들어, 야생형 반복 서열의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 또는 그 초과의 인접한 뉴클레오티드)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열의 5' 단부에 연결된 반복 서열의 부분은 약 5 내지 약 10개의 연속적 뉴클레오티드의 길이 (예를 들어, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 뉴클레오티드)일 수 있고, 야생형 CRISPR Cas 반복 뉴클레오티드 서열의 동일한 영역 (예를 들어, 5' 단부)과 적어도 90% 동일성 (예를 들어, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 반복 서열의 부분은 그의 5' 단부에 슈도노트-유사 구조 (예를 들어, "핸들")를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "스페이서 서열"은 표적 핵산 (예를 들어, 표적 DNA) (예를 들어, 프로토스페이서)에 상보적인 뉴클레오티드 서열이다. 스페이서 서열은 표적 핵산에 완전히 상보적이거나 실질적으로 상보적일 수 있다 (예를 들어, 적어도 약 70% 상보적 (예를 들어, 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 그 초과)). 따라서, 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 표적 핵산과 비교하여 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 미스매치를 가질 수 있으며, 미스매치는 인접하거나 비인접할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 표적 핵산에 70% 상보성을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 스페이서 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산에 80% 상보성을 가질 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 스페이서 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산 (프로토스페이서)에 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 그 초과의 상보성 등을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 표적 핵산에 100% 상보적이다. 스페이서 서열은 약 15개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)의 길이를 가질 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 스페이서 서열은 적어도 약 15개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드의 길이인 표적 핵산 (예를 들어, 프로토스페이서)의 영역에 걸쳐 완전한 상보성 또는 실질적 상보성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 약 20개의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 약 23개의 뉴클레오티드의 길이이다.
일부 실시양태에서, 가이드 RNA의 스페이서 서열의 5' 영역은 표적 DNA와 동일할 수 있는 반면, 스페이서의 3' 영역은 표적 DNA에 실질적으로 상보적일 수 있거나 (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas), 또는 가이드 RNA의 스페이서 서열의 3' 영역은 표적 DNA와 동일할 수 있는 반면, 스페이서의 5' 영역은 표적 DNA에 실질적으로 상보적일 수 있고 (예를 들어, 유형 II CRISPR-Cas), 따라서, 표적 DNA에 대한 스페이서 서열의 전체적 상보성은 100% 미만일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 시스템에 대한 가이드에서, 예를 들어, 20 뉴클레오티드 스페이서 서열의 5' 영역 (즉, 시드 영역)의 최초 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 뉴클레오티드는 표적 DNA에 100% 상보적일 수 있는 반면, 스페이서 서열의 3' 영역에서의 나머지 뉴클레오티드는 표적 DNA에 실질적으로 상보적 (예를 들어, 적어도 약 70% 상보적)이다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열의 5' 단부의 최초 1 내지 8개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 최초 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개의 뉴클레오티드, 및 그 안의 임의의 범위)는 표적 DNA에 100% 상보적일 수 있는 반면, 스페이서 서열의 3' 영역에서의 나머지 뉴클레오티드는 표적 DNA에 실질적으로 상보적 (예를 들어, 적어도 약 50% 상보적 (예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 그 초과))이다.
추가의 예로서, 유형 II CRISPR-Cas 시스템에 대한 가이드에서, 예를 들어, 20 뉴클레오티드 스페이서 서열의 3' 영역 (즉, 시드 영역)에서의 최초 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 뉴클레오티드는 표적 DNA에 100% 상보적일 수 있는 반면, 스페이서 서열의 5' 영역에서의 나머지 뉴클레오티드는 표적 DNA에 실질적으로 상보적 (예를 들어, 적어도 약 70% 상보적)이다. 일부 실시양태에서, 스페이서 서열의 3' 단부의 최초 1 내지 10개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 최초 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 뉴클레오티드, 및 그 안의 임의의 범위)는 표적 DNA에 100% 상보적일 수 있는 반면, 스페이서 서열의 5' 영역에서의 나머지 뉴클레오티드는 표적 DNA에 실질적으로 상보적 (예를 들어, 적어도 약 50% 상보적 (예를 들어, 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 그 초과 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값))이다.
일부 실시양태에서, 스페이서의 시드 영역은 약 8 내지 약 10개의 뉴클레오티드의 길이, 약 5 내지 약 6개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 약 6개의 뉴클레오티드의 길이일 수 있다.
일부 실시양태에서, 연장된 가이드 핵산은 연장된 가이드 핵산, 제1 연장된 가이드 핵산 및/또는 제2 연장된 가이드 핵산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 연장된 가이드 핵산은 (a) CRISPR 핵산 (예를 들어, CRISPR RNA, CRISPR DNA, crRNA, crDNA) 및/또는 CRISPR 핵산 및 tracr 핵산; 및 (b) 프라이머 결합 부위 및 리버스 트랜스크립타제 주형 (RT 주형)을 포함하는 연장된 부분을 포함할 수 있고, 여기서 RT 주형은 표적 핵산 내로 혼입되는 변형을 코딩한다. 일부 실시양태에서, CRISPR 핵산은 유형 II 또는 유형 V CRISPR 핵산일 수 있고/거나, tracr 핵산은 적절한 유형 II 또는 유형 V CRISPR 핵산에 상응하는 임의의 tracr일 수 있다. 연장된 가이드 핵산은 또한 표적화된 대립유전자 가이드 RNA (tagRNA))로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 CRISPR 핵산은 유형 V CRISPR 핵산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 tracr 핵산은 유형 V CRISPR tracr 핵산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 CRISPR 핵산은 유형 II CRISPR 핵산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 tracr 핵산은 유형 II CRISPR tracr 핵산일 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR 핵산 및/또는 tracr 핵산은 예를 들어, Cas9, C2c3, Cas12a (또한 Cpf1로 지칭됨), Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas3', Cas3", Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csnl 및 Csx12로 공지됨), Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4 (dinG), 및/또는 Csf5 시스템으로부터의 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 연장된 가이드의 연장된 부분은 5'에서 3'로 RT 주형 및 프라이머 결합 부위 (연장된 가이드가 CRISPR 핵산의 3' 단부에 연결되는 경우)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 연장된 가이드의 연장된 부분은 5'에서 3'로 프라이머 결합 부위 및 RT 주형 (연장된 가이드가 CRISPR 핵산의 5' 단부에 연결되는 경우)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RT 주형은 약 1개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드, 및 그 안의 임의의 범위 또는 값)의 길이, 예를 들어, 약 1개의 뉴클레오티드 내지 약 10개의 뉴클레오티드, 약 1개의 뉴클레오티드 내지 약 15개의 뉴클레오티드, 약 1개의 뉴클레오티드 내지 약 20개의 뉴클레오티드, 약 1개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드, 약 1개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드, 약 1개의 뉴클레오티드 내지 약 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오티드, 약 1개의 뉴클레오티드 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 약 5개의 뉴클레오티드 내지 약 15개의 뉴클레오티드, 약 5개의 뉴클레오티드 내지 약 20개의 뉴클레오티드, 약 5개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드, 약 5개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드, 약 5개의 뉴클레오티드 내지 약 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오티드, 약 5개의 뉴클레오티드 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 약 8개의 뉴클레오티드 내지 약 15개의 뉴클레오티드, 약 8개의 뉴클레오티드 내지 약 20개의 뉴클레오티드, 약 8개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드, 약 8개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드, 약 8개의 뉴클레오티드 내지 약 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오티드, 약 8개의 뉴클레오티드 내지 약 50개의 뉴클레오티드의 길이, 약 8개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 15개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 20개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 36개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 40개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드의 길이 및 그 안의 임의의 범위 또는 값일 수 있다. 일부 실시양태에서, RT 주형의 길이는 적어도 8개의 뉴클레오티드, 임의로 약 8개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, RT 주형의 길이는 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오티드 또는 그 미만 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 그 안의 임의의 값 또는 범위 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 뉴클레오티드의 길이 내지 약 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 뉴클레오티드의 길이일 수 있다.
본원에 사용된 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, tagRNA)의 연장된 부분의 "프라이머 결합 부위" (PBS)는 표적 핵산 상의 영역 또는 "프라이머"에 결합할 수 있는, 즉, 표적 핵산 프라이머에 상보적인 연속적 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 예로서, CRISPR Cas 이펙터 단백질 (예를 들어, 유형 II 또는 유형 V, 예를 들어, Cas 9 또는 Cas12a)은 DNA를 니킹하고/커팅하고, 커팅된 DNA의 3' 단부는 연장된 가이드 핵산의 PBS 부분에 대한 프라이머로서 작용한다. PBS는 표적 핵산의 가닥의 3' 단부에 상보적이도록 디자인되고, 표적 가닥 또는 비-표적 가닥 중 어느 하나에 결합하도록 디자인될 수 있다. 프라이머 결합 부위는 프라이머에 완전히 상보적일 수 있거나, 또는 이는 표적 핵산 상의 프라이머에 실질적으로 상보적 (예를 들어, 적어도 70% 상보적 (예를 들어, 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 그 초과))일 수 있다. 일부 실시양태에서, 연장된 부분의 프라이머 결합 부위의 길이는 약 1개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드의 길이 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드, 또는 그 안의 임의의 값 또는 범위), 약 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개의 뉴클레오티드 내지 약 50개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개의 뉴클레오티드, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값), 또는 약 25개의 뉴클레오티드 내지 약 80개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머 결합 부위는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 또는 49개의 뉴클레오티드 내지 약 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머 결합 부위의 길이는 적어도 약 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드 또는 그 초과 (예를 들어, 약 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 길이 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 연장된 가이드의 연장된 부분은 유형 II 또는 유형 V CRISPR 핵산의 5' 단부 또는 3' 단부 중 어느 하나에 (예를 들어, 5'에서 3'로: 반복부-스페이서-연장된 부분, 또는 연장된 부분-반복부-스페이서) 및/또는 tracr 핵산의 5' 또는 3' 단부에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 연장된 부분이 crRNA의 5'에 위치하는 경우, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 자기-프로세싱 RN아제 활성을 감소시키도록 (또는 제거하도록) 변형된다.
일부 실시양태에서, 연장된 가이드 핵산의 연장된 부분은 링커를 통해 유형 II 또는 유형 V CRISPR 핵산 및/또는 유형 II 또는 유형 V tracrRNA에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 약 1 내지 약 100개의 뉴클레오티드 또는 그 초과의 길이 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 길이, 및 그 안의 임의의 범위 (예를 들어, 약 2 내지 약 40, 약 2 내지 약 50, 약 2 내지 약 60, 약 4 내지 약 40, 약 4 내지 약 50, 약 4 내지 약 60, 약 5 내지 약 40, 약 5 내지 약 50, 약 5 내지 약 60, 약 9 내지 약 40, 약 9 내지 약 50, 약 9 내지 약 60, 약 10 내지 약 40, 약 10 내지 약 50, 약 10 내지 약 60, 약 40 내지 약 100, 약 50 내지 약 100개, 또는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개의 뉴클레오티드 내지 약 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 길이 (예를 들어, 약 105, 110, 115, 120, 130, 140 150개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 길이)일 수 있다.
본원에 사용된 "표적 핵산", "표적 DNA", "표적 뉴클레오티드 서열", "표적 영역", 또는 "게놈에서의 표적 영역"은 본 발명의 가이드 RNA에서의 스페이서 서열에 완전히 상보적 (100% 상보적) 또는 실질적으로 상보적 (예를 들어, 적어도 70% 상보적 (예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과))인 유기체의 게놈의 영역을 지칭한다 (예를 들어, 스페이서는 표적 핵산의 표적 가닥에 실질적으로 상보적임). CRISPR-Cas 시스템에 유용한 표적 영역은 유기체의 게놈 (예를 들어, 식물 게놈)에서의 PAM 서열에 대해 바로 3' (예를 들어, 유형 V CRISPR-Cas 시스템) 또는 바로 5' (예를 들어, 유형 II CRISPR-Cas 시스템)에 위치할 수 있다. 표적 영역은 표적 가닥 상의 PAM 서열에 바로 인접하여 위치한 적어도 15개의 연속적 뉴클레오티드 (예를 들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개의 뉴클레오티드 등)의 임의의 영역으로부터 선택될 수 있다.
"프로토스페이서 서열"은 CRISPR 반복부-스페이서 서열 (예를 들어, 가이드 RNA, CRISPR 어레이, crRNA)의 스페이서 서열에 완전히 또는 실질적으로 상보적인 (및 혼성화하는) 표적 이중 가닥 DNA 및 구체적으로 표적 핵산/표적 DNA의 부분 (예를 들어, 게놈 (예를 들어, 핵 게놈, 색소체 게놈, 미토콘드리아 게놈)에서의 표적 영역, 또는 게놈외 서열, 예컨대 플라스미드, 미니염색체 등)을 지칭한다. 따라서, 프로토스페이서 서열은 표적 핵산의 표적 가닥에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 제1 가닥 및 제2 가닥 (이중 가닥 DNA)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산에 관하여 본원에 사용된 용어 "제1 가닥"은 표적 가닥 또는 하부 가닥을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산에 관하여 사용된 용어 "제2 가닥"은 제1 가닥에 상보적인 가닥 (예를 들어, 상부 가닥 또는 비-표적 가닥)이다.
관련 기술분야에 이해되어 있는 바와 같은 및 본원에 사용된 "표적 가닥"은 스페이서가 상보적이고 CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 동원되는 이중 가닥 DNA의 가닥을 지칭하는 반면, "비-표적 가닥"은 이중 가닥 핵산에서 표적 가닥에 반대의 가닥을 지칭한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 이중 가닥 핵산의 비-표적 가닥, CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 동원되는 가닥의 반대의 가닥은 CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 의해 니킹되고, 리버스 트랜스크립타제에 의해 편집된다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 핵산의 표적 가닥, CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 동원되는 동일한 가닥은 CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 의해 니킹되고, 리버스 트랜스크립타제에 의해 편집된다.
유형 V CRISPR-Cas (예를 들어, Cas12a) 시스템 및 유형 II CRISPR-Cas (Cas9) 시스템의 경우에, 프로토스페이서 서열은 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 의해 플랭킹된다 (예를 들어, 그에 바로 인접함). 유형 IV CRISPR-Cas 시스템에 대해, PAM은 비-표적 가닥 상의 5' 단부에 및 표적 가닥의 3' 단부에 위치한다 (예로서, 하기 참조).
Figure pct00001
유형 II CRISPR-Cas (예를 들어, Cas9) 시스템의 경우에, PAM은 표적 영역의 바로 3'에 위치한다. 유형 I CRISPR-Cas 시스템에 대한 PAM은 표적 가닥의 5'에 위치한다. 유형 III CRISPR-Cas 시스템에 대한 공지된 PAM은 없다. 마카로바(Makarova) 등은 CRISPR 시스템의 모든 부류, 유형 및 하위유형에 대한 명명법을 기재한다 (Nature Reviews Microbiology 13:722-736 (2015)). 가이드 구조 및 PAM은 문헌 [R. Barrangou (Genome Biol. 16:247 (2015))]에 의해 기재되어 있다.
정준 Cas12a PAM은 T 풍부성이다. 일부 실시양태에서, 정준 Cas12a PAM 서열은 5'-TTN, 5'-TTTN, 또는 5'-TTTV일 수 있다. 일부 실시양태에서, 정준 Cas9 (예를 들어, 에스. 피오게네스) PAM은 5'-NGG-3'일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-정준 PAM은 사용될 수 있지만, 덜 효율적일 수 있다.
추가의 PAM 서열은 확립된 실험 및 컴퓨터적 접근법을 통해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 실험적 접근법은 모든 가능한 뉴클레오티드 서열에 의해 플랭킹된 서열을 표적화하고, 예컨대 표적 플라스미드 DNA의 형질전환을 통해, 표적화를 겪지 않은 서열 구성원을 확인하는 것을 포함한다 (Esvelt et al. 2013. Nat. Methods 10:1116-1121; Jiang et al. 2013. Nat. Biotechnol. 31:233-239). 일부 측면에서, 컴퓨터적 접근법은 천연 스페이서의 BLAST 검색을 수행하여 박테리오파지 또는 플라스미드에서 원래 표적 DNA 서열을 확인하고, 이들 서열을 정렬하여 표적 서열에 인접한 보존된 서열을 결정하는 것을 포함할 수 있다 (Briner and Barrangou. 2014. Appl. Environ. Microbiol. 80:994-1001; Mojica et al. 2009. Microbiology 155:733-740).
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 부위에서의 표적 핵산을 (a)(i) 제1 CRISPR-Cas 이펙터 단백질; 및 (ii) 제1 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 제1 연장된 CRISPR RNA, 제1 연장된 CRISPR DNA, 제1 연장된 crRNA, 제1 연장된 crDNA); 및 (b)(i) 제2 CRISPR-Cas 이펙터 단백질, (ii) 제1 리버스 트랜스크립타제; 및 (ii) 제1 가이드 핵산과 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 표적 핵산을 (a) 제3 CRISPR-Cas 이펙터 단백질; 및 (b) 제2 가이드 핵산과 접촉시키고, 여기서 제3 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 제2 CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 의해 니킹된 제2 가닥 상의 제2 부위로부터 약 10 내지 약 125개의 염기 쌍 (5' 또는 3' 중 어느 하나)에 위치한 표적 핵산의 제1 가닥 상의 부위를 니킹하고, 그에 의해 미스매치 복구를 개선시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 표적 핵산을 (a) 제4 CRISPR-Cas 이펙터 단백질; (b) 제2 리버스 트랜스크립타제, 및 (c) 제2 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 제2 연장된 CRISPR RNA, 제2 연장된 CRISPR DNA, 제2 연장된 crRNA, 제2 연장된 crDNA)과 접촉시키고, 여기서 제2 연장된 가이드 핵산은 표적 핵산의 제1 가닥 상의 부위를 표적화하고 (스페이서는 그에 실질적으로 상보적이고/결합하고), 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 CRISPR-Cas 이펙터 단백질 (예를 들어, 제1, 제2, 제3, 제4)은 임의의 조합으로 본원에 기재된 바와 같은 임의의 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 IV, 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 Cas9, C2c3, Cas12a (또한 Cpf1로 지칭됨), Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas3', Cas3", Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csnl 및 Csx12로 공지됨), Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4 (dinG), 및/또는 Csf5일 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 유용한 연장된 가이드 핵산은 (a) CRISPR 핵산 (CRISPR RNA, CRISPR DNA, crRNA, crDNA); 및 (b) 프라이머 결합 부위 및 리버스 트랜스크립타제 주형 (RT 주형)을 포함하는 연장된 부분을 포함할 수 있고, 여기서 RT 주형은 표적 핵산 내로 혼입되는 변형을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 연장된 가이드 핵산의 CRISPR 핵산은 표적 핵산의 제1 가닥 상의 제1 부위에 결합할 수 있는 (그에 실질적 상동성을 갖는) 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 유용한 가이드 핵산은 CRISPR 핵산 (CRISPR RNA, CRISPR DNA, crRNA, crDNA)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 가이드 핵산의 CRISPR 핵산은 표적 핵산의 제1 가닥 상의 제1 부위의 상류 (3')인 표적 핵산의 제1 가닥 상의 제2 부위에 결합하는 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 리버스 트랜스크립타제에 융합된 CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 CRISPR-Cas 융합 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 펩티드 태그에 융합된 CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 CRISPR-Cas 융합 단백질일 수 있고, 리버스 트랜스크립타제는 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 리버스 트랜스크립타제 도메인을 포함하는 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 가이드 핵산은 RNA 동원 모티프에 연결될 수 있고, 리버스 트랜스크립타제는 RNA 동원 모티프에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 리버스 트랜스크립타제 도메인을 포함하는 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산은 5'-3' 엑소뉴클레아제와 추가로 접촉될 수 있고, 임의로 여기서 5'-3' 엑소뉴클레아제는 제1 CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 융합된다. 일부 실시양태에서, 5'-3' 엑소뉴클레아제는 펩티드 태그에 융합된 5'-3' 엑소뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 제1 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 5'-3' 엑소뉴클레아제는 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 5'-3' 엑소뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 제1 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 펩티드 태그에 융합된 CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 5'-3' 엑소뉴클레아제는 RNA 동원 모티프에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 5'-3' 엑소뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 연장된 가이드 핵산은 RNA 동원 모티프에 연결된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 비-상동 단부 연결 (NHEJ)의 화학적 억제제를 도입함으로써, NHEJ 단백질을 표적화하는 CRISPR 가이드 핵산 또는 siRNA를 도입하여 NHEJ 단백질의 발현을 일시적으로 넉-다운시킴으로써, 또는 NHEJ를 방지하는 폴리펩티드 (예를 들어, Gam 단백질)를 도입함으로써 이중 가닥 파단을 감소시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, (a) 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질; (b) 리버스 트랜스크립타제, 및 (c) 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 CRISPR RNA, 연장된 CRISPR DNA, 연장된 crRNA, 연장된 crDNA; 예를 들어, tagDNA, tagRNA)을 포함하는 복합체가 제공된다.
일부 실시양태에서, 복합체의 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 펩티드 태그에 융합된 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 복합체의 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 복합체의 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 RNA 동원 모티프에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 복합체의 리버스 트랜스크립타제는 펩티드 태그에 융합된 리버스 트랜스크립타제 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 복합체의 리버스 트랜스크립타제는 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 리버스 트랜스크립타제 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 복합체의 리버스 트랜스크립타제는 RNA 동원 폴리펩티드에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 리버스 트랜스크립타제 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 복합체는 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 CRISPR RNA, 연장된 CRISPR DNA, 연장된 crRNA, 연장된 crDNA)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복합체는 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 CRISPR RNA, 연장된 CRISPR DNA, 연장된 crRNA, 연장된 crDNA)을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 복합체는 발현 카세트에 포함될 수 있고, 임의로 여기서 발현 카세트는 벡터에 포함된다.
본 발명은 5'에서 3'로 (a) 프로모터 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (b) 유기체에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 유형 V CRISPR-Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cpf1 (Cas12a), dCas12a 등) 또는 유형 II CRISPR-Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9, dCas9 등)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (c) 링커 서열; 및 (d) 유기체에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 임의로 여기서 유기체는 동물, 예컨대 인간, 식물, 진균, 고세균, 또는 박테리아인, 유기체에서의 발현을 위하 코돈 최적화된 발현 카세트를 추가로 제공한다. 5'에서 3'로 (a) 식물 특이적 프로모터 서열 (예를 들어 ZmUbi1, MtUb2, RNA 폴리머라제 II (Pol II))을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (b) 유형 V CRISPR-Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cpf1 (Cas12a), dCas12a 등)를 코딩하는 식물 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드; (c) 링커 서열; 및 (d) 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 식물 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 발현 카세트가 추가로 제공된다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트에 포함되는 리버스 트랜스크립타제는 1개 이상의 ssRNA 결합 도메인 (RBD)에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 또는 펩티드 링커일 수 있다.
본 발명은 (a) 식물 특이적 프로모터 서열 (예를 들어 ZmUbi1, MtUb2)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (b) 연장된 RNA 가이드 서열을 포함하고, 여기서 연장된 가이드 핵산은 그의 3' 단부에 프라이머 결합 부위 및 표적 핵산에 혼입되는 편집물 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제 주형)을 포함하는 연장된 부분을 포함하고, 임의로 연장된 가이드 핵산은 발현 카세트에 포함되고, 임의로 연장된 가이드 핵산은 Pol II 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인, 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 발현 카세트를 추가로 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트에 유용한 식물 특이적 프로모터는 인트론과 회합될 수 있거나, 또는 인트론을 포함하는 프로모터 영역 (예를 들어, 인트론을 포함하는 ZmUbi1; 인트론을 포함하는 MtUb2)이다.
일부 실시양태에서, 발현 카세트는 쌍자엽 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 단자엽 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 1종 이상의 발현 카세트를 식물 또는 식물 세포 내로 도입하고, 그에 의해 식물 또는 식물 세포에서 표적 핵산을 변형시켜 변형된 표적 핵산을 포함하는 식물 또는 식물 세포를 생산하는 것을 포함하는, 식물 또는 식물 세포에서 표적 핵산을 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 변형된 표적 핵산을 포함하는 식물 세포로부터 식물을 재생시켜 변형된 표적 핵산을 포함하는 식물을 생산하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 표적 핵산을 약 20℃ 내지 42℃ (예를 들어, 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 또는 42℃, 및 그 안의 임의의 값 또는 범위)의 온도에서 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 1종 이상의 폴리뉴클레오티드, 가이드 핵산, 핵산 구축물, 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
가이드 핵산과 조합으로 사용되는 경우, 본 발명의 폴리뉴클레오티드/핵산 구축물/발현 카세트는 표적 핵산을 변형시키는데 사용될 수 있다. 표적 핵산은 표적 핵산을 가이드 핵산과 접촉시키기 전에, 그와 공동으로 또는 후에 본 발명의 폴리뉴클레오티드/핵산 구축물/발현 카세트와 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 가이드 핵산은 동일한 발현 카세트 또는 벡터에 포함될 수 있고, 따라서, 표적 핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 가이드 핵산과 공동으로 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 가이드 핵산은 상이한 발현 카세트 또는 벡터에 있을 수 있고, 따라서, 표적 핵산은 가이드 핵산과의 접촉 전에, 그와 공동으로, 또는 후에 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 접촉될 수 있다.
식물, 동물, 박테리아, 고세균, 및/또는 진균을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 유기체의 표적 핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용하여 변형될 (예를 들어, 돌연변이될, 예를 들어, 염기 편집될, 절단될, 니킹될 등) 수 있다. 곤충, 어류, 조류, 양서류, 파충류, 및/또는 포유동물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 동물 또는 그의 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용하여 변형될 (예를 들어, 돌연변이될, 예를 들어, 염기 편집될, 절단될, 니킹될 등) 수 있다. 본 발명이 유용할 수 있는 예시적인 포유동물은 영장류 (인간 및 비-인간 (예를 들어, 침팬지, 비비, 원숭이, 고릴라 등)), 고양이, 개, 페렛, 거빌, 햄스터, 소, 돼지, 말, 염소, 당나귀, 또는 양을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
임의의 식물 또는 식물 부분의 표적 핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용하여 변형될 (예를 들어, 돌연변이될, 예를 들어, 염기 편집될, 절단될, 니킹될 등) 수 있다. 피자식물, 나자식물, 단자엽식물, 쌍자엽식물, C3, C4, CAM 식물, 선택식물, 양치식물 및/또는 양치식물 동류, 미세조류, 및/또는 거대조류를 포함한 임의의 식물 (또는 예를 들어, 속 또는 보다 높은 목 분류로의 식물의 그룹핑)은 본 발명의 핵산 구축물을 사용하여 변형될 수 있다. 본 발명에 유용한 식물 및/또는 식물 부분은 임의의 식물 종/변종/품종의 식물 및/또는 식물 부분일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "식물 부분"은 배, 화분, 배주, 종자, 잎, 줄기, 순, 꽃, 가지, 과실, 인, 이삭, 대, 껍질, 자루, 뿌리, 근단, 꽃밥, 식물 및/또는 식물의 부분에서 무손상인 식물 세포를 포함한 식물 세포, 식물 원형질체, 식물 조직, 식물 세포 조직 배양물, 식물 캘러스, 식물 무리 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 "순"은 잎 및 줄기를 포함한 땅 위의 부분을 지칭한다. 또한, 본원에 사용된 "식물 세포"는 세포벽을 포함하고 또한 원형질체로 지칭될 수 있는 식물의 구조적 및 생리학적 단위를 지칭한다. 식물 세포는 단리된 단일 세포의 형태일 수 있거나, 배양된 세포일 수 있거나, 또는 고등-유기체화된 단위, 예컨대, 예를 들어, 식물 조직 또는 식물 기관의 일부일 수 있다.
본 발명에 유용한 식물의 비-제한적 예는 잔디풀 (예를 들어, 블루그래스, 벤트그래스, 독보리, 김의털), 깃털 갈대풀, 좀새풀, 억새, 물대, 지팽이풀, 채소 작물, 예컨대 아티초크, 콜라비, 루콜라, 리크, 아스파라거스, 상추 (예를 들어, 결구, 잎, 로메인), 토란, 멜론 (예를 들어, 머스크멜론, 수박, 크렌쇼, 감로, 칸탈루프), 콜 작물 (예를 들어, 방울 양배추, 양배추, 콜리플라워, 브로콜리, 콜라드, 케일, 중국 양배추, 청경채), 카르도니, 당근, 나파, 오크라, 양파, 셀러리, 파슬리, 병아리콩, 파스닙, 치커리, 피망, 감자, 조롱박 (예를 들어, 매로우, 오이, 주키니, 스쿼시, 호박, 감로 멜론, 수박, 칸탈루프), 무, 건구식 양파, 루타바가, 가지, 서양우엉, 꽃상추, 샬롯, 엔다이브, 마늘, 시금치, 파, 스쿼시, 그린, 비트 (사탕무 및 사료용 비트), 고구마, 근대, 서양고추냉이, 토마토, 순무, 및 향신료; 과실 작물, 예컨대 사과, 살구, 체리, 천도복숭아, 복숭아, 배, 자두, 프룬, 체리, 마르멜로, 무화과, 너트 (예를 들어, 밤, 피칸, 피스타치오, 헤이즐넛, 피스타치오, 땅콩, 호두, 마카다미아 너트, 아몬드 등), 감귤류 (예를 들어, 귤, 금귤, 오렌지, 자몽, 탄제린, 만다린, 레몬, 라임 등), 블루베리, 블랙 라즈베리, 보이즌베리, 크랜베리, 커런트, 구스베리, 로건베리, 산딸기, 딸기, 블랙베리, 포도 (와인 및 테이블), 아보카도, 바나나, 키위, 감, 석류, 파인애플, 열대 과일, 인과, 멜론, 망고, 파파야, 및 리치, 필드 작물 식물, 예컨대 클로버, 알팔파, 티모시, 달맞이꽃, 메도우 폼, 옥수수/메이즈 (필드, 스위트, 팝콘), 홉, 호호바, 메밀, 홍화, 퀴노아, 밀, 벼, 보리, 호밀, 기장, 수수, 귀리, 라이밀, 수수, 담배, 케이폭, 콩과 식물 (콩 (예를 들어, 생두 및 건조된), 렌틸, 완두콩, 대두), 오일 식물 (유채, 카놀라, 머스타드, 퍼피, 올리브, 해바라기, 코코넛, 피마자유 식물, 코코아 빈, 땅콩, 기름 야자), 좀개구리밥, 아라비돕시스, 섬유 식물 (면화, 아마, 대마, 황마), 칸나비스(Cannabis) (예를 들어, 칸나비스 사티바(Cannabis sativa), 칸나비스 인디카(Cannabis indica), 및 칸나비스 루데랄리스(Cannabis ruderalis)), 녹나무과 (계피, 장뇌), 또는 식물, 예컨대 커피, 사탕수수, 차, 및 천연 고무 식물; 및/또는 화초 식물, 예컨대 화훼 식물, 선인장, 다육식물 및/또는 장식용 식물 (예를 들어, 장미, 튤립, 제비꽃), 뿐만 아니라 나무, 예컨대 삼림수 (활엽수 및 상록수, 예컨대 침엽수; 예를 들어, 느릅나무, 물푸레나무, 떡갈나무, 단풍나무, 전나무, 가문비나무, 삼나무, 소나무, 자작나무, 사이프러스, 유칼립투스, 버드나무), 뿐만 아니라 관목 및 다른 묘목을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물 및/또는 이를 코딩하는 발현 카세트 및/또는 벡터는 메이즈, 대두, 밀, 카놀라, 벼, 토마토, 피망, 해바라기, 산딸기, 블랙베리, 블랙 라즈베리 및/또는 체리를 변형시키는데 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 방법을 수행하는 키트 또는 키트들을 추가로 포함한다. 본 발명의 키트는 시약, 완충제, 및 혼합, 측정, 분류, 표지화 등을 위한 장치, 뿐만 아니라 표적 핵산을 변형시키는데 적절할 것인 바와 같은 지시서 등을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 1종 이상의 핵산 구축물, 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터를 그의 사용을 위한 임의적 지시서와 함께 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 CRISPR-Cas 가이드 핵산 (또는 연장된 가이드 핵산) (본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 상응함) 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 핵산/연장된 가이드 핵산은 본 발명의 1종 이상의 폴리뉴클레오티드와 동일한 발현 카세트 및/또는 벡터 상에 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 핵산/연장된 가이드 핵산은 본 발명의 1종 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것과는 별개의 발현 카세트 또는 벡터 상에 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 가이드 핵산을 코딩하는 핵산 구축물을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 구축물은 가이드 핵산의 백본 내로의 표적 핵산 서열과 동일하거나 그에 상보적인 핵산 서열의 클로닝을 위한 클로닝 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물은 코딩된 폴리뉴클레오티드 내의 1개 이상의 인트론을 코딩할 수 있는 mRNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 1종 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터는 형질전환체 (예를 들어, 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자 등을 코딩하는 핵산)를 확인하는데 유용한 1종 이상의 선택가능한 마커를 추가로 코딩할 수 있다.
본 발명은 이제 하기 실시예를 참고로 기재될 것이다. 이들 실시예는 본 발명에 대한 청구항의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 오히려 특정 실시양태를 예시하는 것으로 의도됨이 인정되어야 한다. 통상의 기술자에게 일어나는 예시화된 방법의 임의의 변동은 본 발명의 범위 내에 해당하는 것으로 의도된다.
실시예
대립유전자의 RNA-코딩된 DNA-대체 (REDRAW)는 유리 DNA 3' 단부 (어닐링 부위, AS), 및 연장된 가이드 핵산 (즉, 표적화된 대립유전자 가이드 RNA (tagRNA))로부터의 DNA:RNA 하이브리드로부터 중합하는 효소인 유형 V Cas 이펙터를 이용한다. 이들 3가지 거대분자는 협력하여 i) CRISPR 효소를 CRISPR 이펙터 및 tagRNA의 crRNA 부분을 사용하여 관심의 게놈 부위에 위치시키고, ii) DNA를 니킹하거나 커팅하여 유리 3' 단부를 생성하고, iii) DNA의 유리 3' 단부에 어닐링하는 tagRNA의 부분을 제공하고, iv) RNA-의존성 DNA 폴리머라제에 대한 주형을 제공하는 tagRNA의 부분을 제공하고, v) 효소 충돌, 자연 종결, 또는 안정한 헤어핀과 대면함으로써 역전사의 종결을 허용하도록 작용한다.
본 발명자들은 LbCas12a_R1138A의 비표적-가닥 (NTS) 니카제 버전 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MuLV)로부터의 RT를 사용하여 REDRAW 시스템을 시험하였다. LbCas12a_R1138A는 이전에 기재된 AsCas12a_R1226A 돌연변이와의 정렬에 기반한 NTS 니카제인 것으로 예상되었다. 본 발명자들은 도면 XXX에서 LbCas12a_R1138A가 정말 니카제임을 입증한다. 사용된 LbCas12a는 RN아제 (+)였거나, 또는 RN아제 활성을 방지한 돌연변이 (H759A)를 가졌다. LbCas12a_R1138A_H759A 돌연변이체를 5' 연장을 생성하는 경우 또는 3' 헤어핀을 혼입하는 경우 tagRNA의 자기-프로세싱을 방지하는데 사용하였다.
시험된 tagRNA는 5' 또는 3' 연장 중 어느 하나를 함유하는 crRNA를 함유하였다. 다양한 어닐링 부위길이를 시험하여 보다 짧은 또는 보다 긴 DNA:RNA 하이브리드가 니킹된 비-표적 가닥으로부터 형성되는 것을 허용하였다. RNA 주형의 다양한 길이를 또한 시험하였다. 마지막으로, 2가지 상이한 헤어핀을 또한 천연-발생 LbCas12a 슈도노트화된 헤어핀 디자인 및 디코이 슈도노트화된 헤어핀 디자인 내로 혼입하였다.
실시예 1
LbCas12a_R1138A 니카제 검정
LbCas12a, 이어서 뉴클레오플라스민 NLS, 및 6x 히스티딘 태그 (진위즈(GeneWiz))를 포함하는 핵산 구축물 (서열식별번호:57)을 합성하고, NcoI 및 XhoI 사이의 pET28a 벡터 내로 클로닝하여, pWISE450 (서열식별번호:58)을 생성하였다. 클로닝을 용이하게 하기 위해 Met-1 및 Ser-2 사이의 서열에 첨가된 추가의 글리신이 있었다. 본원에서 제시된 넘버링은 이 가외의 글리신을 배제한다. 이어서 R1138A 돌연변이를 퀵체인지(QuickChange) II 부위-지정 돌연변이유발 키트 (애질런트(Agilent))를 제조업체의 지시서에 따라 사용하여 생성하였다. 이어서 이들 발현 플라스미드를 BL21 (DE3) 스타(Star) 적격 이. 콜라이 세포 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)) 내로 형질전환시켰다.
BL21(DE3) 스타 세포를 루리아 브로쓰(Luria Broth) 및 50 ug/ml의 카나마이신에서 37℃에서 A600=0.5의 광학 밀도가 달성될 때까지 성장시켰다. 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 0.5 mM로 첨가하고, 단백질을 18℃에서 밤새 유도하였다. 세포를 5,000 x g에서 펠릿화하였다. 정제를 2개의 칼럼: 히스트랩(HisTrap) 칼럼, 이어서 모노S(MonoS) 칼럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare))을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 달성하였다.
CRISPR RNA (crRNA)를 서열 AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGAAUCCCUUCUGCAGCACCUGG (서열식별번호:59) (여기서 가이드 부분은 볼드체임)를 갖는 신테고(Synthego)에 의해 합성하였다.
절단되는 플라스미드는 삽입된 하기 서열을 갖는 pUC19였다: TTTCGGAATCCCTTCTGCAGCACCTGG (서열식별번호:60) (여기서 볼드체의 서열의 부분은 LbCas12a에 의해 인식되는 PAM 서열이고, 나머지 (정자체)는 프로토스페이서 서열임). pUC19 플라스미드를 XL1-블루(XL1-Blue) (애질런트) (이. 콜라이) 내로 형질전환시키고, 이어서 퀴아젠(Qiagen) 플라스미드 스핀 미니키트를 사용하여 정제하였다.
뉴클레아제 검정을 LbCas12a_R1138:crRNA:플라스미드의 10:10:1 비를 혼합함으로써 달성하고, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs) 완충제 2.1에서 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하고, 80℃에서 20분 동안 열 불활성화시키고, DNA를 염색하도록 내포된 SYBR-세이프(SYBR-Safe) 염색 (인비트로젠(Invitrogen))을 갖는 1% TAE-아가로스 겔 상으로 로딩하였다. 도 4에 나타내어진 바와 같이 시험관내 검정에서, LbCas12a_R1138A는 니카제이다. 레인 2 및 3에 나타내어진 바와 같이, 슈퍼코일화된 2.8 kB 플라스미드는 이중-가닥 파단이 야생형 LbCas12a (레인 3)에 의해 생성될 때까지 2.0 kB의 겉보기 크기로 운행하였다 (레인 2). 돌연변이체 효소 LbCas12a_R1138A는 5.0 kB의 겉보기 크기로 운행하는 니킹된 생성물을 현저하게 생성하였다. 레인 4 내지 6은 증가하는 농도의 돌연변이체 효소가 플라스미드의 일반적 뉴클레아제 소화를 발생시키는 극도로 높은 농도의 효소가 사용될 때까지 (256 nM) 비를 변경시키지 않았음을 나타낸다.
REDRAW 편집제 플라스미드 디자인 및 구축- 박테리아 스크린
REDRAW (대립유전자의 RNA-코딩된 DNA-대체) 발현 구축물을 고체 상태 합성에 의해 합성하고, NcoI 및 XhoI 제한 부위 사이에서 발현 벡터 pET28a(+) 내로 클로닝하였다. REDRAW 발현 벡터는 ColE1 복제 원점, 카나마이신 저항성 마커, 및 T7 프로모터 및 종결자의 제어 하의 REDRAW 편집제를 함유한다. REDRAW 편집제는 XTEN 또는 5R 링커를 갖는 Mu-LV 리버스 트랜스크립타제 MuLV(5M) (예를 들어, 서열식별번호:97 참조) (5개의 돌연변이를 갖는 뮤린 백혈병 바이러스 리버스 트랜스크립타제 - D200N+L603W+T330P+T306K+W313F) (Anzalone et al. Nature 576 (.7785):149-157 (2019))에 융합된 Cas12a 니카제 (R1138A) 또는 Rn아제 죽은 Cas12a 니카제 (R1138A, H759A) 중 어느 하나를 함유한다. 모든 REDRAW 편집제 서열은 이. 콜라이 코돈 최적화되었다. 시험된 REDRAW 편집제 배치는 도 5에 나타내어진다. 도 5에 제공된 2가지 배치는 리버스 트랜스크립타제에 대해 Cas12a N-말단을 가졌고, 2가지 배치는 리버스 트랜스크립타제에 대해 Cas12a C-말단을 가졌다. 시험된 배치를 5' 연장을 함유하는 tagRNA의 프로세싱을 방지하기 위한 추가의 H759A 돌연변이를 가진 Cas12a 변이체로 수립하였다.
tagRNA 플라스미드 디자인 및 구축-박테리아 스크린
tagRNA (표적화된 대립유전자 가이드 RNA) 라이브러리의 서열을 각각의 표적에 대해 고유한 리버스 트랜스크립타제 주형 및 프라이머 결합 부위와 함께 Cas12a 스페이서 및 스캐폴드 서열을 어셈블리한 알고리즘을 사용하여 디자인하였다. 표 1에 나타내어진 디자인 파라미터는 폭넓은 범위의 프라이머 결합 부위 및 리버스 트랜스크립타제 주형 길이에 걸친다. 표 3에 나타내어진 바람직한 변화를 성공적인 편집 후 항생제에 대한 저항성을 부여하도록 디자인하였다.
표 1. 제1 라이브러리에서 시험된 tagRNA의 형태
Figure pct00002
도 6은 제1 라이브러리에서의 tagRNA의 배치를 나타낸다. RTT 및 PBS를 함유하는 5' 및 3' 연장 둘 다는 라이브러리에 포함되었다.
제2 라이브러리를 3' tagRNA 연장 배치에서 스페이서의 바로 3'에 위치한 헤어핀의 존재가 REDRAW 편집을 개선시킬 것인지 여부를 추가로 평가하면서, 제1 라이브러리와 유사한 방식으로 디자인하였다. 표 2에 나타내어진 디자인 파라미터는 다시 폭넓은 범위의 프라이머 결합 부위 (PBS) 및 리버스 트랜스크립타제 주형 (RTT) 길이를 조사하지만, 또한 제1 라이브러리로부터 기능적인 것으로 밝혀진 RTT 길이의 영역에 초점을 맞춘다. RTT 및 PBS를 함유하는 5' 및 3' 연장 둘 다는 라이브러리에 포함되었다. 추가로, 디코이 헤어핀을 함유하는 변이체는 또한 제2 tagRNA 라이브러리에 포함되었다. 천연 LbCas12a 스캐폴드 서열과 유사하지만, Cas12a 단백질에 의해 인식되고 절단되지 않을 헤어핀이 바람직하였기 때문에, 도 7에 나타내어진 바와 같이, LbCas12a 헤어핀과 유사한 아키텍처를 갖는 기존의 헤어핀은 HIV-1 RNA 게놈에서 발견되었고, UA 서열의 첨가에 의해 변형되어 슈도노트를 형성하였다.
표 2. 제2 라이브러리에서 시험된 tagRNA의 형태
Figure pct00003
박테리아 스크린을 위한 tagRNA 플라스미드 구축
tagRNA 라이브러리에 대한 베이스 플라스미드를 고체 상태 합성 및 p트위스트 앰프 미디엄 카피(pTwist Amp Medium Copy) (트위스트 바이오사이언스(TWIST BIOSCIENCE)®) 내로의 홀더 단편의 클로닝에 의해 생성하였다. 플라스미드는 p15A 복제 원점 및 암피실린 저항성 마커를 함유한다. tagRNA는 합성 BbaJ23119 프로모터로부터 구성적으로 발현되고, T7 종결자에 의해 종결된다. 평가된 제1 tagRNA 라이브러리를 합성하고, 외부 판매업자 (진위즈)에 의한 tagRNA 베이스 벡터 내로 클로닝하였다. 제2 라이브러리에 대해, 올리고를 합성하고, 이어서 NEB 하이파이 어셈블리(HiFi Assembly) 키트를 제조업체의 지시서에 따라 사용하여 tagRNA 베이스 벡터 내로 클로닝하였다. 라이브러리 다양성을 라이브러리로부터의 72개의 클론의 콜로니 PCR 및 생거 시퀀싱에 의해 조사하여, 폭넓은 범위의 PBS, RTT, 및 표적이 라이브러리에 포함되었고, 실질적 편향이 없었음을 보장하였다.
리포터 플라스미드 디자인 및 구축
CloDF13 복제 원점, 클로람페니콜 저항성 마커, 및 스펙티노마이신 저항성 마커 (aadA)를 함유하는 베이스 리포터 플라스미드를 CloDF13 복제 원점 및 클로람페니콜 저항성 마커의 PCR 증폭 및 이를 PCR-증폭된 aadA 저항성 마커로 라이게이션함으로써 구축하였다. 이어서 aadA의 변이체를 함유하는 3개의 리포터 플라스미드를 BamHI 및 BglII 제한 부위 사이에서 야생형 aadA 유전자를 커팅하고, 잔기 위치 Thr61, Leu115, 또는 Asp132에 정지 코돈을 함유한 합성된 유전자 블록에서 라이게이션함으로써 구축하였다. 모든 리포터 플라스미드를 구축 후 생거 시퀀싱에 의해 확인하였다. 또한, 코딩 서열에서의 정지 코돈을 갖는 aadA 변이체를 함유하는 리포터 플라스미드를 이들을 REDRAW tagRNA 스크리닝 실험에 사용하기 전에 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신 민감성 둘 다로서 확인하였다.
REDRAW 편집에 대한 표적- 박테리아 스크린
하기 표 3에 나타내어진 5개의 표적을 REDRAW 편집 실험에서 시험하였다. 2개의 게놈 및 3개의 플라스미드 표적을 모든 경우에 사용하였다. 임의의 표적에서의 성공적인 REDRAW 편집은 숙주 유기체 (이. 콜라이)의 생존을 REDRAW 편집의 성공에 구속하는 항생제 (날리딕스산 또는 스트렙토마이신)에 대한 저항성을 발생시킨다.
표 3. 박테리아 REDRAW 편집에 대한 표적
Figure pct00004
REDRAW tagRNA 실험 - 박테리아 스크린
모든 박테리아 REDRAW tagRNA 스크리닝 실험에 대한 숙주 유기체는 이. 콜라이 BL21(DE3)이었다. 선택 실험을 수행하기 전에, 각각의 REDRAW 발현 구축물을 화학적으로 적격 BL21(DE3) 내로 제조업체의 지시서에 따라 형질전환시키고, 카나마이신을 갖는 LB 한천 플레이트 상으로 플레이팅하였다. 이어서 단일 콜로니를 형질전환 플레이트로부터 집어내고, 전기적격 세포의 배치를 이전에 개발된 방법에 따라 제조하였다 (Sambrook and Russell (Transformation of E. coli by electroporation. Cold Spring Harbor Protocols 2006.1 (2006): pdb-prot3933). 이어서 각각의 REDRAW 발현 구축물을 함유하는 적격 세포를 10 ng의 각각의 리포터 플라스미드로 전기천공하고, 37C, 225 rpm에서 SOC에서 1시간 동안 회수하고, 카나마이신 및 클로람페니콜을 갖는 LB 한천 플레이트 상으로 플레이팅하였다. 이어서 이들 플레이트로부터의 단일 콜로니를 형질전환 플레이트로부터 집어내고, 전기적격 세포의 배치를 다시 제조하였다 (Sambrook and Russell (Transformation of E. coli by electroporation. Cold Spring Harbor Protocols 2006.1 (2006): pdb-prot3933). 하기 표 4는 제1 tagRNA 라이브러리 시험을 위해 제조된 전기적격 세포의 배치를 요약한다.
표 4 - tagRNA 라이브러리 1 선택 실험을 위해 제조된 전기적격 세포
Figure pct00005
SV40 = NLS, MMLV-RT = 리버스 트랜스크립타제, XTEN = 링커, nLbCas12a = 니카제 Cas12
선택 실험을 먼저 100 ng의 tagRNA 라이브러리를 50 uL의 전기적격 세포의 각각의 배치 내로 전기천공함으로써 수행하였다. 형질전환물을 225 rpm 진탕과 함께 37℃에서 1시간 동안 회수하였다. 1시간의 회수 후, 1 uL의 회수물을 제거하고, 99 uL의 LB와 혼합하고, 적절한 항생제를 갖는 LB 한천 플레이트 상으로 플레이팅하여 형질전환 효율에 대해 점검하였다. 이어서 각각의 형질전환물의 나머지 양을 29 mL의 LB + 항생제 (게놈 선택을 위해 LB Kan/Carb, 및 플라스미드 선택을 위해 LB Kan/Carb/Cam) 및 0.5 mM IPTG에 첨가하였다. 발현 배양물을 밤새 225 rpm 진탕과 함께 37℃에서 성장시켰다.
다음 날, 각각의 발현 배양물의 OD600을 측정하였다. 각각의 발현 배양물에 대해, 1 OD를 REDRAW 발현 벡터 (Kan), tagRNA 플라스미드 (Carb), 리포터 플라스미드에 대한 항생제, 0.5 mM IPTG, 및 추가의 선택 항생제 (날리딕스산 또는 스트렙토마이신)를 함유하는 5개의 플레이트 상으로 플레이팅하였다 (플레이트 당 약 0.2 OD). 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 다음 날 아침에 성장을 관찰하였다. 콜로니가 관찰되지 않은 경우, 플레이트를 37℃에서 추가의 24시간 인큐베이션하였다.
선택 플레이트 상에서 관찰된 콜로니를 집어내고, 적절한 항생제를 갖는 플레이트 상으로 재-스트리킹하고, 이어서 콜로니 PCR로 처리하여 편집을 위해 표적화하는 유전자 및 생거 시퀀싱을 위한 tagRNA를 증폭시켰다. 생거 시퀀싱을 진위즈에 의한 콜로니 PCR 생성물 상에서 수행하였다.
제2 라이브러리의 평가를 한 가지 변형으로, 제1 tagRNA 라이브러리와 동일한 방식으로 수행하였다. 전기적격 세포의 20개의 배치를 제조하는 대신, 제2 tagRNA 라이브러리를 함유하는 전기적격 BL21(DE3)의 1개의 큰 배치를 제조하였다. 이어서 REDRAW 발현 구축물 (100 ng) 또는 REDRAW 발현 구축물 + 리포터 플라스미드 (각각 100 ng)를 tagRNA 라이브러리를 함유하는 전기적격 세포 내로 형질전환시켰다. 모든 후속 단계를 동일한 방식으로 반복하였다.
제1 tagRNA 라이브러리로의 REDRAW 편집의 평가-박테리아 스크린
제1 tagRNA 라이브러리에 대한 선택 실험으로부터 얻어진 콜로니의 수는 하기 표 5에 요악된다. 어느 게놈 선택에 대해서도 콜로니가 관찰되지 않았다 (선택 1 내지 8). 플라스미드 선택의 각각에 대해, 콜로니가 관찰되었다.
표 5. 제1 tagRNA 라이브러리 선택 실험 결과.
Figure pct00006
선택 9, 12, 15 및 18 (aadA Thr61 표적)에 대해, 박테리아의 론이 관찰되었다. 이들 플레이트로부터의 단리된 콜로니는 가양성이었다. 선택 10, 11, 13, 14, 16, 및 17 (aadA Leu115 표적 및 aadA Asp132 표적)에 대해, 적은 수의 콜로니가 플레이트 상에서 관찰되었다. 이들 플레이트 상의 콜로니는 콜로니 PCR에 의해 증폭된 tagRNA 및 표적 둘 다를 가졌고, 제조된 편집물을 확인하고 편집물에 책임 있는 tagRNA를 확인하기 위해 생거 시퀀싱을 위해 보내졌다. 선택 11, 14, 17 및 20 (aadA Asp132 표적)으로부터 평가된 모든 콜로니는 가양성이었다. 선택 10 (aadA Leu115 표적)으로부터의 다수의 콜로니는 디자인된 편집물 및 연관된 tagRNA를 가졌다. 편집된 표적의 시퀀싱 결과는 도 8에 나타내어지며, 이는 항생제 저항성을 복원하는 기능정지된 aadA 유전자에서의 TGA → CTG 편집물을 입증한다.
편집물에 책임 있는 tagRNA의 확인된 서열은 도 8에 나타내어진 편집물과 연관된다:
5' - GTTTCAAAGATTAAATAATTTCTACTAAGTGTAGATTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATGCGGCGCGTTGTTTCATCAAGGCGTACGGTCACCGTAACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCACTGCGG - 3' (서열식별번호:87).
선택 10으로부터의 단백질 배치는 하기와 같다: SV40-nCas12a-XTEN-MMLV-RT-SV40.
제2 tagRNA 라이브러리로의 REDRAW 편집의 평가- 게놈 선택 결과
제2 tagRNA 라이브러리에 대한 게놈 선택 실험으로부터 얻어진 콜로니의 수는 하기 표 6에 요약된다. rpsL 선택 플레이트 상에 콜로니가 관찰되었다.
표 6. 제2 tagRNA 라이브러리 실험 결과 - 게놈 선택을 위한 선택 플레이트 상의 콜로니
Figure pct00007
선택 2.1 내지 2.4 및 2.9 내지 2.12 (gyrA 게놈 표적)에 대해, 플레이트 상에 콜로니가 관찰되지 않았다. 선택 2.5 내지 2.8 및 2.13 내지 2.16 (rpsL 게놈 표적)에 대해, 적은 수의 콜로니가 이들 플레이트 상에 관찰되었다. 이들 플레이트 상의 콜로니를 재-스트리킹하여 모든 항생제에 대한 저항성을 확인하였다. 이어서 이들 플레이트로부터의 콜로니를 사용하여 tagRNA의 PCR 생성물 및 생거 시퀀싱을 위한 표적을 생성하였다. 생거 시퀀싱을 사용하여 제조된 편집물을 확인하고, 편집물에 책임 있는 tagRNA를 확인하였다. 선택 2.6 내지 2.8 및 2.13 내지 2.16으로부터의 모든 콜로니는 가양성이었다. 선택 2.5로부터의 한 콜로니는 디자인된 편집물 AAA 내지 CGT를 가졌으며, 이는 스트렙토마이신 저항성을 부여한다 (도 9 참조).
도 9에 나타내어진 편집물과 연관된 tagRNA의 확인된 서열은
5' - TATTTCTATAAGTGTAGATTACTCGTGTATATATACTCCGCACCGAGGTTGGTACGAACACCGGGAGTCTTTAACACGACCGCCACGGATCAGGATCACGGAGTGCTCCTGCAGGTTGTGACCTTCACCACCGATGTAGGAAGTCACTTCGAAACCGTTAGTCAGACGAACACGGCATACTTTACGCAGCGCGGAGTTCGGTTTACGAGGAGTGGTAGTATATACACGAGT- 3' 서열식별번호:92
이다.
선택 2.5로부터의 단백질 배치는 하기와 같다: SV40-MMLV-RT-XTEN-nRVRLbCas12a(H759A)-SV40.
제2 tagRNA 라이브러리로의 REDRAW 편집의 평가 - 플라스미드 선택 결과
제2 tagRNA 라이브러리에 대한 플라스미드 선택 실험으로부터 얻어진 콜로니의 수는 하기 표 7에 요약된다.
표 7.
Figure pct00008
Figure pct00009
콜로니는 Leu115 및 Asp132 선택에 대한 플레이트 상에서 관찰되었다. 선택 2.18, 2.19, 2.22, 2.25, 2.28, 2.31, 2.39, 및 2.40은 선택 플레이트 상에 콜로니를 가졌다. 이들 콜로니를 재-스트리킹하여 모든 항생제에 대한 저항성을 확인하였다. 이어서 이들을 사용하여 tagRNA의 PCR 생성물 및 생거 시퀀싱을 위한 표적을 생성하였다. 생거 시퀀싱을 사용하여 제조된 편집물을 확인하고, 편집물에 책임 있는 tagRNA를 확인하였다. 선택 2.18, 2.19, 2.22, 2.28, 2.39, 및 2.40으로부터의 모든 콜로니는 가양성이었다. 선택 2.25로부터의 4개의 콜로니 및 선택 2.31로부터의 2개의 콜로니는 도 10도 11에 나타내어진 바와 같이 디자인된 편집물 및 연관된 tagRNA를 가졌다. 선택 2.25로부터의 4개의 콜로니는 동일한 편집물 및 tagRNA를 가졌다. 선택 2.31로부터의 2개의 콜로니는 또한 동일한 편집물 및 tagRNA를 가졌다.
선택 2.25로부터의 도 10에서의 편집물과 연관된 tagRNA의 확인된 서열은
5' - TAATTTCTACTAAGTGTAGATTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGTAAGTCTCCATAGAATGGAGGACAGCGCGGAGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTTGATCAAAGCGCGGCGCGTTGTTTCATCAAGGCGTACGGTCACCGTAACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCACTGCGGAT- 3' 서열식별번호:93
이다.
선택 2.25로부터의 단백질 배치는 하기와 같다: SV40-nCas12a-XTEN-MMLV-RT-SV40.
선택 2.31로부터의 도 11에서의 편집물과 연관된 tagRNA의 확인된 서열은
5' - TAATTTCAACTAAGTGTAGATTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGTAAGTCTCCATAGAATGGAGGGCGGAGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTTGATCAAAGCGCGGCGCGTTGTTTCATCAAGGCGTACGGTCACCGTAACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCACTGCGGAT - 3' 서열식별번호:94
이다.
선택 2.31로부터의 단백질 배치는 하기와 같다: SV40-MMLV-RT-XTEN-nLbCas12a(H759)-SV40.
박테리아 세포에서의 관찰된 REDRAW 편집의 요약
하기 표 8은 이. 콜라이에서의 REDRAW 편집의 관찰된 사례의 요약을 제공한다. 각각의 예에 대해 단백질 배치 (REDRAW 편집제), 편집된 표적, tagRNA 연장의 위치 (Cas12a 헤어핀 및 가이드의 5' 또는 3'), PBS 길이, 및 RTT 길이가 기재되어 있다.
표 8. 이. 콜라이에서 관찰된 REDRAW 편집의 요약.
Figure pct00010
*디코이 헤어핀 서열: TAAGTCTCCATAGAATGGAGG 서열식별번호:95.
실시예 2. 인간 세포에서의 정확한 편집 활성
리버스 트랜스크립타제와 함께 Cas12a의 활성 형태를 사용한 추가의 접근법은 도 12에 나타내어지고 하기에 개요된다.
· 뉴클레아제 활성 Cas12a는 스페이서 - 표적 부위 상호작용을 통해 부위에 동원된다.
· Cas12a는 이중 가닥 파단을 생성한다. 임의로, 비-주형 가닥을 분해하는 5' 내지 3' 엑소뉴클레아제가 제공된다.
· 프라이밍은 tagRNA를 사용하여 일어난다. 프라이머 결합 부위 (PBS)는 주형 가닥 DNA에 상보적인 절단 부위의 우측에 대한 서열을 코딩한다.
· 리버스 트랜스크립타제 (MMuLV-RT (5M))는 표적 핵산 상의 프라이밍 부위 또는 프라이머로부터 연장되며 (파선 = 연장), 이는 새롭게 합성된 가닥 내의 바람직한 변화를 코딩한다.
· 미스매치 복구 및 DNA 라이게이션을 통한 DNA 중간체의 분해는 편집된 새로운 DNA 가닥을 생성한다.
방법:
연장된 가이드 RNA를 HEK293T 세포에서의 2개의 게놈 부위, 즉, DMNT1 및 FANCF1을 표적화하도록 디자인하였다. 프라이머 결합 부위 (PBS) 및 리버스 트랜스크립타제 주형 (RTT) 길이의 다양한 조합을 검정하였다. 가이드 RNA는 -2 및 -3 위치 (TTTV PAM을 -4 내지 -1 위치로서 카운팅함)에서 TT 내지 AA에 상응하는 표적 가이드의 PAM 영역에서의 2개의 염기 변화를 코딩하였다. 가이드 연장을 가이드 RNA의 5' 또는 3' 단부 중 어느 하나에 융합시켰다.
RN아제-죽은 돌연변이체 LbCas12a (H758A), 리버스 트랜스크립타제 (MMuLV-RT(5M)), 및 임의로 엑소뉴클레아제 (T5 엑소뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제, RecE, 및 RecJ 중 하나), 및 연장된 가이드 RNA를 코딩하는 플라스미드를 리포펙타민(Lipofectamine)™ 3000을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 70% 전면생장률로 성장된 HEK293T 세포 내로 형질감염시켰다. 세포를 3일 후에 수거하고, 유전자 편집을 차세대 시퀀싱에 의해 정량화하였다.
결과:
본 발명자들은 표적화된 둘 다의 부위에 대해 의도된 정확한 편집을 관찰하였다. 가이드 디자인에 따라, 본 발명자들은 FANCF1 부위에서 최대 0.5% 편집 (도 13) 및 DMNT1 부위에서 최대 1.7% (도 14)를 관찰하였다. 엑소뉴클레아제의 사용은 일부 가이드 디자인에서 편집 효율을 개선시켰다.
표 9. FANCF1 부위를 표적화하는데 사용된 가이드 디자인 (도 13).
Figure pct00011
표 10. DMNT1 부위를 표적화하는데 사용된 가이드 디자인 (도 14).
Figure pct00012
DMNT1 부위에서의 정확한 편집 활성에 대한 엑소뉴클레아제 형질감염의 효과는 도 15에 나타내어진다 (엑소뉴클레아제 처리 없음에 대해 정규화됨; pUC19 = 1). 엑소뉴클레아제는 일부 가이드 배치로의 편집을 개선시킨다.
상기는 본 발명을 예시하며, 그의 제한인 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 발명은 청구항의 등가물이 그 안에 포함되는 하기 청구항에 의해 한정된다.
SEQUENCE LISTING <110> Pairwise Plants Services, Inc. Watts, Joseph Matthew Hummel, Aaron Kim, Yongjoo Lawit, Shai Joshua Schwark, David <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR RNA-ENCODED DNA-REPLACEMENT OF ALLELES <130> 1499.12.WO <150> US 62/930,836 <151> 2019-11-05 <160> 105 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1228 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Lachnospiraceae bacterium <400> 1 Met Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr 1 5 10 15 Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile Asp 20 25 30 Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Lys 35 40 45 Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn Asp 50 55 60 Val Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu Asn Asn Tyr Ile Ser Leu 65 70 75 80 Phe Arg Lys Lys Thr Arg Thr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn 85 90 95 Leu Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys Gly Asn 100 105 110 Glu Gly Tyr Lys Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Ile Glu Thr Ile Leu 115 120 125 Pro Glu Phe Leu Asp Asp Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Asn Ser Phe 130 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Thr Leu Tyr Pro Gly Met Met Leu Lys Phe Gly Gly His 435 440 445 Ala Met Ala Ala Gly Leu Ser Leu Glu Glu Asp Lys Phe Lys Leu Phe 450 455 460 Gln Gln Arg Phe Gly Glu Leu Val Thr Glu Trp Leu Asp Pro Ser Leu 465 470 475 480 Leu Gln Gly Glu Val Val Ser Asp Gly Pro Leu Ser Pro Ala Glu Met 485 490 495 Thr Met Glu Val Ala Gln Leu Leu Arg Asp Ala Gly Pro Trp Gly Gln 500 505 510 Met Phe Pro Glu Pro Leu Phe Asp Gly His Phe Arg Leu Leu Gln Gln 515 520 525 Arg Leu Val Gly Glu Arg His Leu Lys Val Met Val Glu Pro Val Gly 530 535 540 Gly Gly Pro Leu Leu Asp Gly Ile Ala Phe Asn Val Asp Thr Ala Leu 545 550 555 560 Trp Pro Asp Asn Gly Val Arg Glu Val Gln Leu Ala Tyr Lys Leu Asp 565 570 575 Ile Asn Glu Phe Arg Gly Asn Arg Ser Leu Gln Ile Ile Ile Asp Asn 580 585 590 Ile Trp Pro Ile Ser Gly Gly Ser Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu 595 600 605 Phe Glu Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 610 615 <210> 100 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> exonuclease <400> 100 Met Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu 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tcgcttttcc gagcttctgg cggtctcaag cactacctac gtcagcacct gggaccccgc 240 caccgtgcgc cgggccttgc agtgggcgcg ctacctgcgc cacatccatc ggcgcttt 298 <210> 105 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> spacer sequence <400> 105 gcggatgttc caatcagtac gca 23

Claims (106)

  1. 표적 핵산을
    (a) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질;
    (b) 리버스 트랜스크립타제, 및
    (c) 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 유형 II 또는 유형 V CRISPR RNA, 연장된 유형 II 또는 유형 V CRISPR DNA, 연장된 유형 II 또는 유형 V crRNA, 연장된 유형 II 또는 유형 V crDNA)
    과 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 리버스 트랜스크립타제, 및 연장된 가이드 핵산이 복합체를 형성하거나, 복합체에 포함되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 연장된 가이드 핵산이
    (i) 유형 V CRISPR 핵산 또는 유형 II CRISPR 핵산 (유형 II 또는 유형 V CRISPR RNA, 유형 II 또는 유형 V CRISPR DNA, 유형 II 또는 유형 V crRNA, 유형 II 또는 유형 V crDNA) 및/또는 CRISPR 핵산 및 tracr 핵산 (예를 들어, 유형 II 또는 유형 V tracrRNA, 유형 II 또는 유형 V tracrDNA); 및
    (ii) 프라이머 결합 부위 및 리버스 트랜스크립타제 주형 (RT 주형)을 포함하는 연장된 부분
    을 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 연장된 부분이 CRISPR 핵산의 5' 단부 또는 3' 단부 중 어느 하나에 (예를 들어, 5'에 3'로 반복부-스페이서-연장된 부분, 또는 연장된 부분-반복부-스페이서) 및/또는 tracr 핵산의 5' 또는 3' 단부에 융합되는 것인 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 연장된 가이드 핵산의 연장된 부분이 5'에서 3'로 RT 주형 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 표적 핵산이 이중 가닥이고, 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하고, 프라이머 결합 부위가 표적 핵산의 제2 가닥 (비-표적, 상부 가닥)에 결합하는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 표적 핵산이 이중 가닥이고, 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하고, 프라이머 결합 부위가 표적 핵산의 제1 가닥에 결합하는 (예를 들어, 표적 가닥, CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 동원되는 동일한 가닥, 하부 가닥에 결합하는) 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 표적 핵산이 이중 가닥이고, 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하고, 프라이머 결합 부위가 표적 핵산의 제2 가닥 (비-표적 가닥, CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 동원되는 것과 반대 가닥)에 결합하는 것인 방법.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 약 1개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드의 길이이고, 임의로, 프라이머 결합 부위가 적어도 45개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 약 45개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드인 방법.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, RT 주형이 약 1 내지 약 100개의 뉴클레오티드의 길이이고, 임의로, RT 주형이 약 40개의 뉴클레오티드 이하의 길이인 방법.
  11. 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 가이드 RNA의 연장된 부분이 링커를 통해 CRISPR 핵산 및/또는 tracrRNA에 연결되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 링커가 1 내지 100개의 뉴클레오티드의 길이인 방법.
  13. 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 부분이 crRNA의 5'에 위치하는 경우, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 자기-프로세싱 RN아제 활성을 감소시키도록 (또는 제거하도록) 변형되는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 융합 단백질이고/거나, 리버스 트랜스크립타제가 융합 단백질이고, 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질 및/또는 연장된 가이드 핵산이 리버스 트랜스크립타제를 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 동원하는 1종 이상의 성분에 융합되고, 임의로 1종 이상의 성분이 단백질-단백질 상호작용, 단백질-RNA 상호작용, 및/또는 화학적 상호작용을 통해 동원하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 펩티드 태그 (예를 들어, 에피토프 또는 다량체화된 에피토프)에 융합된 (연결된) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 융합 단백질이고, 리버스 트랜스크립타제가 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 (연결된) 리버스 트랜스크립타제 도메인을 포함하는 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질이고, 임의로 표적 핵산이 2종 이상의 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질과 접촉되거나, 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 펩티드 태그 (예를 들어, 에피토프 또는 다량체화된 에피토프)에 융합된 (연결된) 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 융합 단백질이고, 리버스 트랜스크립타제가 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 (연결된) 리버스 트랜스크립타제 도메인을 포함하는 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질이고, 임의로 표적 핵산이 2종 이상의 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질과 접촉되는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 펩티드 태그가 GCN4 펩티드 태그 (예를 들어, 썬-태그(Sun-Tag)), c-Myc 친화성 태그, HA 친화성 태그, His 친화성 태그, S 친화성 태그, 메티오닌-His 친화성 태그, RGD-His 친화성 태그, FLAG 옥타펩티드, 스트렙 태그 또는 스트렙 태그 II, V5 태그, 및/또는 VSV-G 에피토프를 포함하는 것인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 펩티드 태그가 펩티드 태그의 2개 이상의 카피를 포함하는 것인 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 친화성 폴리펩티드가 항체, 아피바디, 안티칼린, 모노바디 및/또는 DARPin인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 항체가 scFv 항체인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 가이드 핵산이 RNA 동원 모티프에 연결되고, 리버스 트랜스크립타제가 RNA 동원 모티프에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 (연결된) 리버스 트랜스크립타제 도메인을 포함하는 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질이고, 임의로 표적 핵산이 2종 이상의 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질과 접촉되고, 임의로 연장된 가이드 RNA가 2개 이상의 RNA 동원 모티프에 연결되고, 임의로 2개 이상의 RNA 동원 모티프가 동일한 RNA 동원 모티프 또는 상이한 RNA 동원 모티프인 방법.
  21. 제1520항에 있어서, 동원 모티프가 연장된 가이드 핵산의 연장된 부분의 3' 단부 상에 위치하거나, 또는 연장된 부분에 내포되는 것인 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, RNA 동원 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드가 텔로머라제 Ku 결합 모티프 (예를 들어, Ku 결합 헤어핀) 및 Ku의 친화성 폴리펩티드 (예를 들어, Ku 이종이량체); 텔로머라제 Sm7 결합 모티프 및 Sm7의 친화성 폴리펩티드; MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 MS2 코트 단백질 (MCP), PP7 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 PP7 코트 단백질 (PCP); SfMu 파지 Com 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 Com RNA 결합 단백질; PUF 결합 부위 (PBS) 및 친화성 폴리펩티드 푸밀리오(Pumilio)/fem-3 mRNA 결합 인자 (PUF); 및/또는 합성 RNA-압타머 및 상응하는 압타머 리간드인 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 동원 모티프 및 상응하는 친화성 폴리펩티드가 MS2 파지 오퍼레이터 스템-루프 및 친화성 폴리펩티드 MS2 코트 단백질 (MCP), 및/또는 PUF 결합 부위 (PBS) 및 친화성 폴리펩티드 푸밀리오/fem-3 mRNA 결합 인자 (PUF)인 방법.
  24. 제14항에 있어서, 화학적 상호작용을 동원하는 1종 이상의 성분이 FRB - FKBP의 라파마이신-유도성 이량체화; 비오틴-스트렙타비딘; SNAP 태그; 할로 태그; CLIP 태그; 화합물에 의해 유도된 DmrA-DmrC 이종이량체; 이관능성 리간드 (예를 들어, 함께 2종의 단백질-결합 화학물질의 융합물; 예를 들어 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산을
    (a) CRISPR-Cas 이펙터 단백질; 및
    (b) 가이드 핵산
    과 접촉시키고, 여기서 (i) CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 의해 니킹된 제2 가닥 상의 부위로부터 약 10 내지 약 125개의 염기 쌍 (5' 또는 3' 중 어느 하나)에 위치한 표적 핵산의 제1 가닥 상의 부위를 니킹하거나 절단하거나, 또는 (ii) CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 의해 니킹된 제1 가닥 상의 부위로부터 약 10 내지 약 125개의 염기 쌍 (5' 또는 3' 중 어느 하나)에 위치한 표적 핵산의 제2 가닥 상의 부위를 니킹하거나 절단하고, 그에 의해 미스매치 복구를 개선시키는 것을 추가로 포함하고, 여기서 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 IV, 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산을 Dna2 폴리펩티드 및/또는 5' 플랩 엔도뉴클레아제 (FEN), 임의로 FEN1 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, FEN 및/또는 Dna2 폴리펩티드가 (표적 핵산의 존재 하에서) 과발현된 것인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, FEN이 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 도메인에 융합된 FEN 도메인을 포함하는 융합 단백질이고/거나, Dna2 폴리펩티드가 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 도메인에 융합된 Dna2 도메인을 포함하는 융합 단백질인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 펩티드 태그 (예를 들어, 에피토프 또는 다량체화된 에피토프)에 융합된 (연결된) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질이고, FEN이 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 FEN 도메인을 포함하는 FEN 융합 단백질이고/거나, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 펩티드 태그에 융합된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질이고, Dna2 폴리펩티드가 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 Dna2 도메인을 포함하는 Dna2 융합 단백질이고, 임의로 표적 핵산이 2종 이상의 FEN 융합 단백질 및/또는 2종 이상의 Dna2 융합 단백질과 접촉되고, 그에 의해 FEN 및/또는 Dna2를 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인, 및 표적 핵산에 동원하는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 펩티드 태그 (예를 들어, 에피토프 또는 다량체화된 에피토프)에 융합된 (연결된) 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 유형 II CRISPR-Cas 융합 단백질이고, FEN이 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 FEN 도메인을 포함하는 FEN 융합 단백질이고/거나, 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 펩티드 태그에 융합된 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 유형 II CRISPR-Cas 융합 단백질이고, Dna2 폴리펩티드가 펩티드 태그에 결합하는 친화성 폴리펩티드에 융합된 Dna2 도메인을 포함하는 Dna2 융합 단백질이고, 임의로 표적 핵산이 2종 이상의 FEN 융합 단백질 및/또는 2종 이상의 Dna2 융합 단백질과 접촉되고, 그에 의해 FEN 및/또는 Dna2를 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인, 및 표적 핵산에 동원하는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 1개 이상의 단일 가닥 RNA 결합 도메인 (RBD)에 융합되는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 Cas12a (Cpf1) 도메인, Cas12b (C2c1) 도메인, Cas12c (C2c3) 도메인, Cas12d (CasY) 도메인, Cas12e (CasX) 도메인, Cas12g 도메인, Cas12h 도메인, Cas12i 도메인, C2c4 도메인, C2c5 도메인, C2c8 도메인, C2c9 도메인, C2c10 도메인, Cas14a 도메인, Cas14b 도메인, 및/또는 Cas14c 도메인이거나, 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 Cas9 도메인인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 R1138A 돌연변이 (참조 뉴클레오티드 서열 서열식별번호:9 참조)를 포함하는 LbCas12a 니카제, R1226A 돌연변이 (참조 뉴클레오티드 서열 서열식별번호:2 참조)를 포함하는 AsCas12a 니카제, R1228A (참조 뉴클레오티드 서열 서열식별번호:6 참조)를 포함하는 FnCas12a 또는 R1241A 돌연변이 (참조 뉴클레오티드 서열 서열식별번호:14 참조)를 포함하는 PdCas12a 니카제인 방법.
  34. 제1항 내지 제29항 및 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 감소된 단일 가닥 DNA 절단 활성 (ss DN아제 활성)을 포함하거나, 또는 ss DN아제 활성을 감소시키도록 (또는 제거하도록) 변형된 (돌연변이된) 것인 방법.
  35. 제1항 내지 제29항 및 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 자기-프로세싱 RN아제 활성을 감소시키도록 (또는 제거하도록) 변형되고 (돌연변이되고), 임의로 돌연변이가 서열식별번호:9의 뉴클레오티드 위치 넘버링에 관하여 H759A인 방법.
  36. 제1항 내지 제29항 및 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 제거하도록 변형되거나 (예를 들어, 뉴클레아제 활성 부위에 (예를 들어, RuvC 도메인에) 돌연변이), 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 제거하도록 변형되어 (예를 들어, 뉴클레아제 활성 부위에 (예를 들어, RuvC 또는 HNH 도메인에) 돌연변이), 불활성화된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 불활성화된 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질 (예를 들어, 죽은Cas (dCas, dCas12a, dCas9)을 생산하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 불활성화된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 불활성화된 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 니카제 활성을 포함하는 것인 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 불활성화된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 불활성화된 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 니킹 효소 (예를 들어, Fok1, BFi1, 예를 들어, 조작된 Fok1 또는 BFiI)에 융합되는 것인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 리버스 트랜스크립타제에 융합된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질이거나, 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 리버스 트랜스크립타제에 융합된 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 유형 II CRISPR-Cas 융합 단백질인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 폴리펩티드 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 폴리펩티드의 C-말단에 융합되는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 폴리펩티드 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 폴리펩티드의 N-말단에 융합되는 것인 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 1개 이상의 ssRNA 결합 도메인 (RBD)에 융합되고, 그에 의해 열안정성, 프로세싱성 및 리버스 트랜스크립타제의 주형 친화도를 개선시키는 것인 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산을 5'-3' 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 5'-3' 엑소뉴클레아제가 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질에, 임의로 유형 V CRISPR-Cas 융합 단백질에 융합되거나, 또는 5'-3' 엑소뉴클레아제가 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질에, 임의로 유형 II CRISPR-Cas 융합 단백질에 융합되는 것인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 5'-3' 엑소뉴클레아제가 펩티드 태그에 융합된 5'-3' 엑소뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질이고, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질인 방법.
  46. 제43항에 있어서, 5'-3' 엑소뉴클레아제가 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 5'-3' 엑소뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질이고, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 펩티드 태그에 융합된 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질인 방법.
  47. 제43항에 있어서, 5'-3' 엑소뉴클레아제가 RNA 동원 모티프에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 5'-3' 엑소뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질이고, 연장된 가이드 핵산이 RNA 동원 모티프에 연결되는 것인 방법.
  48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 5'-3' 엑소뉴클레아제가 RecE 엑소뉴클레아제, RecJ 엑소뉴클레아제, T5 엑소뉴클레아제 또는 T7 엑소뉴클레아제인 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 비-상동 단부 연결 (NHEJ)의 화학적 억제제를 도입함으로써, 또는 NHEJ 단백질을 표적화하는 CRISPR 가이드 핵산 또는 siRNA를 도입하여 NHEJ 단백질의 발현을 일시적으로 넉-다운시킴으로써 이중 가닥 파단을 감소시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고/거나, 리버스 트랜스크립타제가 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 방법.
  51. 제25항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 방법.
  52. 제26항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 플랩 엔도뉴클레아제 (FEN)가 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 방법.
  53. 제43항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 5'-3' 엑소뉴클레아제가 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 방법.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 동일한 또는 별개의 발현 카세트에 포함되고, 임의로 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 동일한 발현 카세트에 포함되는 경우, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 단일 프로모터에 또는 2개 이상의 별개의 프로모터에 임의의 조합으로 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현 카세트에 포함되고, 임의로 CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
  56. 제54항에 있어서, 동일한 또는 별개의 발현 카세트가 동일한 또는 별개의 벡터에 포함되는 것인 방법.
  57. 제55항에 있어서, 발현 카세트가 벡터에 포함되는 것인 방법.
  58. 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 플랩 엔도뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현 카세트에 포함되고, 임의로 발현 카세트가 벡터에 포함되는 것인 방법.
  59. 제53항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 5'-3' 엑소뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현 카세트에 포함되고, 임의로 발현 카세트가 벡터에 포함되는 것인 방법.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 가이드 핵산이 발현 카세트에 포함되고, 임의로 발현 카세트가 벡터에 포함되는 것인 방법.
  61. 제25항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 핵산이 발현 카세트에 포함되고, 임의로 발현 카세트가 벡터에 포함되는 것인 방법.
  62. 제50항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질, CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 리버스 트랜스크립타제, 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 5'-3' 엑소뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터가 유기체에서의, 임의로 동물, 식물, 진균, 고세균, 또는 박테리아에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 코돈 최적화가 쌍자엽 식물에서의 발현을 위한 것인 방법.
  64. 제62항에 있어서, 코돈 최적화가 단자엽 식물에서의 발현을 위한 것인 방법.
  65. 제1 부위에서의 표적 핵산을
    (a)(i) 제1 CRISPR-Cas 이펙터 단백질; 및
    (ii) 제1 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 CRISPR RNA, 연장된 CRISPR DNA, 연장된 crRNA, 연장된 crDNA); 및
    (b)(i) 제2 CRISPR-Cas 이펙터 단백질,
    (ii) 제1 리버스 트랜스크립타제; 및
    (ii) 제1 가이드 핵산
    과 접촉시키고, 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 포함하는, 표적 핵산을 변형시키는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 연장된 가이드 핵산이
    (a) CRISPR 핵산 (CRISPR RNA, CRISPR DNA, crRNA, crDNA); 및
    (b) 프라이머 결합 부위 및 리버스 트랜스크립타제 주형 (RT 주형)을 포함하는 연장된 부분
    을 포함하는 것인 방법.
  67. 제65항 또는 제64항에 있어서, 연장된 가이드 핵산의 CRISPR 핵산이 표적 핵산의 제1 가닥 상의 제1 부위에 결합할 수 있는 (그에 실질적 상동성을 갖는) 스페이서 서열을 포함하는 것인 방법.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 핵산이 CRISPR 핵산 (CRISPR RNA, CRISPR DNA, crRNA, crDNA)을 포함하는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 제1 가이드 핵산의 CRISPR 핵산이 표적 핵산의 제1 가닥 상의 제1 부위의 상류인 표적 핵산의 제1 가닥 상의 제2 부위에 결합하는 스페이서 서열을 포함하는 것인 방법.
  70. 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 리버스 트랜스크립타제에 융합된 CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 CRISPR-Cas 융합 단백질인 방법.
  71. 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 펩티드 태그에 융합된 CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 CRISPR-Cas 융합 단백질이고, 리버스 트랜스크립타제가 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 리버스 트랜스크립타제 도메인을 포함하는 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질인 방법.
  72. 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 핵산이 RNA 동원 모티프에 연결되고, 리버스 트랜스크립타제가 RNA 동원 모티프에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 리버스 트랜스크립타제 도메인을 포함하는 리버스 트랜스크립타제 융합 단백질인 방법.
  73. 제65항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산을
    (a) 제3 CRISPR-Cas 이펙터 단백질; 및
    (b) 제2 가이드 핵산
    과 접촉시키고,
    여기서 제3 CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 제2 CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 의해 니킹된 제2 가닥 상의 제2 부위로부터 약 10 내지 약 125개의 염기 쌍 (5' 또는 3' 중 어느 하나)에 위치한 표적 핵산의 제1 가닥 상의 부위를 니킹하고, 그에 의해 미스매치 복구를 개선시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  74. 제65항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산을 5'-3' 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  75. 제65항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 5'-3' 엑소뉴클레아제가 제1 CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 융합되는 것인 방법.
  76. 제74항에 있어서, 5'-3' 엑소뉴클레아제가 펩티드 태그에 융합된 5'-3' 엑소뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질이고, 제1 CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질인 방법.
  77. 제74항에 있어서, 5'-3' 엑소뉴클레아제가 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 5'-3' 엑소뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질이고, 제1 CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 펩티드 태그에 융합된 CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질인 방법.
  78. 제74항에 있어서, 5'-3' 엑소뉴클레아제가 RNA 동원 모티프에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 5'-3' 엑소뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질이고, 연장된 가이드 핵산이 RNA 동원 모티프에 연결되는 것인 방법.
  79. 제65항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 비-상동 단부 연결 (NHEJ)의 화학적 억제제를 도입함으로써, NHEJ 단백질을 표적화하는 CRISPR 가이드 핵산 또는 siRNA를 도입하여 NHEJ 단백질의 발현을 일시적으로 넉-다운시킴으로써, 또는 NHEJ를 방지하는 폴리펩티드 (예를 들어, Gam 단백질)를 도입함으로써 이중 가닥 파단을 감소시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  80. 제65항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산을
    (a) 제4 CRISPR-Cas 이펙터 단백질;
    (b) 제2 리버스 트랜스크립타제, 및
    (c) 제2 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 CRISPR RNA, 연장된 CRISPR DNA, 연장된 crRNA, 연장된 crDNA)
    과 접촉시키고,
    여기서 제2 연장된 가이드 핵산이 표적 핵산의 제1 가닥 상의 부위를 표적화하고 (스페이서는 그에 실질적으로 상보적이고/결합하고), 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  81. 제65항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 제2 CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 제3 CRISPR-Cas 이펙터 단백질 및/또는 제4 CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 임의의 조합으로 유형 I, 유형 II, 유형 III, 유형 IV, 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질인 방법.
  82. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산을
    (a) 제2 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질;
    (b) 제2 리버스 트랜스크립타제, 및
    (c) 제2 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 CRISPR RNA, 연장된 CRISPR DNA, 연장된 crRNA, 연장된 crDNA)
    과 접촉시키고,
    여기서 제2 연장된 가이드 핵산이 표적 핵산의 제1 가닥 (표적 가닥) 또는 제2 가닥 (비-표적 가닥) 상의 부위를 표적화하고 (스페이서는 그에 실질적으로 상보적이고/결합하고), 그에 의해 표적 핵산을 변형시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  83. (a) 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 또는 유형 II CRISPR-Cas 이펙터 단백질;
    (b) 리버스 트랜스크립타제, 및
    (c) 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 CRISPR RNA, 연장된 CRISPR DNA, 연장된 crRNA, 연장된 crDNA)
    을 포함하는 복합체.
  84. 제83항에 있어서, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 펩티드 태그에 융합된 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질인 복합체.
  85. 제83항에 있어서, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질인 복합체.
  86. 제83항에 있어서, 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질이 RNA 동원 모티프에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 유형 II 또는 유형 V CRISPR-Cas 이펙터 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질인 복합체.
  87. 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 펩티드 태그에 융합된 리버스 트랜스크립타제 도메인을 포함하는 융합 단백질인 복합체.
  88. 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 펩티드 태그에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 리버스 트랜스크립타제 도메인을 포함하는 융합 단백질인 복합체.
  89. 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 RNA 동원 폴리펩티드에 결합할 수 있는 친화성 폴리펩티드에 융합된 리버스 트랜스크립타제 도메인을 포함하는 융합 단백질인 복합체.
  90. 제83항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 CRISPR RNA, 연장된 CRISPR DNA, 연장된 crRNA, 연장된 crDNA)을 추가로 포함하는 복합체.
  91. 제83항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 연장된 가이드 핵산 (예를 들어, 연장된 CRISPR RNA, 연장된 CRISPR DNA, 연장된 crRNA, 연장된 crDNA)을 추가로 포함하는 복합체.
  92. 제83항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트에 포함되고, 임의로 발현 카세트가 벡터에 포함되는 것인 복합체.
  93. 5'에서 3'로: (a) 프로모터 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
    (b) 유기체에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 유형 V CRISPR-Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cpf1 (Cas12a), dCas12a 등) 또는 유형 II CRISPR-Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9, dCas9 등)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    (c) 링커 서열; 및
    (d) 유기체에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 리버스 트랜스크립타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는, 유기체에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 발현 카세트.
  94. 제93항에 있어서, 유기체가 동물, 식물, 진균, 고세균, 또는 박테리아인 발현 카세트.
  95. 제94항에 있어서, 유기체가 식물이고, 유형 V CRISPR-Cas 뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화되고, 프로모터 서열이 식물 특이적 프로모터 서열 (예를 들어 ZmUbi1, MtUb2, RNA 폴리머라제 II (Pol II))인 발현 카세트.
  96. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 리버스 트랜스크립타제가 1개 이상의 ssRNA 결합 도메인 (RBD)에 융합되는 것인 발현 카세트.
  97. 제93항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 아미노산 또는 펩티드 링커인 발현 카세트.
  98. 제97항에 있어서, 펩티드 링커가 약 2 내지 약 100개의 아미노산 (잔기)의 길이인 발현 카세트.
  99. 제97항 또는 제98항에 있어서, 펩티드 링커가 GS 링커인 발현 카세트.
  100. (a) 식물 특이적 프로모터 서열 (예를 들어 ZmUbi1, MtUb2)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및
    (b) 연장된 핵산 가이드
    를 포함하고, 여기서 연장된 가이드 핵산은 그의 3' 단부에 프라이머 결합 부위 및 표적 핵산 내로 혼입되는 편집물 (예를 들어, 리버스 트랜스크립타제 주형)을 포함하는 연장된 부분을 포함하고, 임의로 연장된 가이드 핵산은 발현 카세트에 포함되고, 임의로 연장된 가이드 핵산은 Pol II 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인, 식물에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 발현 카세트.
  101. 제93항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 특이적 프로모터가 인트론과 회합되거나, 또는 인트론을 포함하는 프로모터 영역 (예를 들어, 인트론을 포함하는 ZmUbi1; 인트론을 포함하는 MtUb2)인 발현 카세트.
  102. 제93항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 코돈 최적화가 쌍자엽 식물에서의 발현을 위한 것인 발현 카세트.
  103. 제93항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 코돈 최적화가 단자엽 식물에서의 발현을 위한 것인 발현 카세트.
  104. 제93항 내지 제103항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 식물 또는 식물 세포 내로 도입하고, 그에 의해 식물 또는 식물 세포에서 표적 핵산을 변형시켜 [변형된 표적 핵산을 포함하는 식물 또는 식물 세포를 생산하는 것]을 포함하는, 식물 또는 식물 세포에서 표적 핵산을 변형시키는 방법.
  105. 제104항에 있어서, 변형된 표적 핵산을 포함하는 식물 세포를 재생시켜 변형된 표적 핵산을 포함하는 식물을 생산하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  106. 제1항 내지 제82항, 제104항, 및 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉이 약 20℃ 내지 42℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
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