CN113584134A

CN113584134A - 一种基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统及其方法和应用

Info

Publication number: CN113584134A
Application number: CN202111037456.1A
Authority: CN
Inventors: 张沨; 黄潮勇
Original assignee: Shandong Qibang Huikang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Kinstar Biotechnology Co ltd; Shandong Qibang Huikang Biotechnology Co ltd; Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2021-09-06
Filing date: 2021-09-06
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-09-06
Also published as: CN113584134B

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas9的等温核酸检测系统及其方法和应用，涉及核酸检测技术领域。本发明提供了一种基于CRISPR‑Cas9的等温核酸检测系统，包括逆转录酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶、Cas9蛋白、tracrRNA、crRNA和DNA探针；所述crRNA是待检测核酸序列的扩增产物；所述Cas9蛋白和tracrRNA、crRNA结合形成复合体，对DNA探针进行特异性切割并产生可检测信号。本发明首次将等温扩增技术与CRISPR‑Cas9技术相结合，将目标核酸的扩增产物作为crRNA引导Cas9特异性切割DNA探针；本发明首次利用不具有附属切割活性的Cas蛋白实现了快速核酸检测；本发明只需要一种Cas蛋白即可实现多通道核酸检测，一次性检测多个靶标序列。

Description

一种基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统及其方法和应用

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，特别涉及一种基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统及其方法和应用。

背景技术

用聚合酶链式反应(PCR)对脱氧核糖核酸(DNA)进行扩增和检测是分子检测领域最为经典和通用的方法。同样，对核糖核酸(RNA)的扩增和检测大多数是利用PCR的衍生技术逆转录PCR(RT-PCR)。RT-PCR一般分两步，第一步先利用逆转录酶将RNA反转录为cDNA，之后再以cDNA为模板进行PCR扩增。然而，PCR依赖高精密的温度循环仪，而且污染控制较为严格，因此基于PCR的核酸检测局限于中心实验室，对于现场快速检测有很大的限制。

除了PCR，基于核酸杂交的检测方法也很常用。先将DNA或RNA分子转移并固定到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用带有放射性或非放射性标记的核酸探针与靶序列通过碱基互补配对相结合，随后洗去未结合的游离探针，通过放射自显影或显色反应检测特异性结合的探针。这个方法的优点是可以一次分析大量样品，缺点是容易出现假阳性；另外，核酸杂交的反应时间较长也是一个难以克服的缺点，使得这个方法无法满足现场快速检测的需要。

近年来出现的等温扩增技术解除了核酸扩增对PCR的依赖。核酸等温扩增技术主要有四种：①环介导等温扩增(LAMP)，利用4对可特异性识别6个靶点的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，可在60-65℃条件下实现核酸快速扩增和检测(一般小于1小时)；②依赖核酸序列的扩增(NASBA),利用三种酶(逆转录酶、RNaseH和T7 RNA聚合酶)和一对特异性引物，在恒定温度下(一般为41℃)温育45-90分钟，即可完成对RNA模板的快速扩增，同时利用荧光基团标记的发夹型核酸探针进行检测；③滚环扩增(RCA)，利用DNA连接酶和DNA聚合酶，以滚环复制的模式，从一条或多条引物处进行环形模板的链置换合成，从而实现部分病毒的环状基因组的扩增；④重组酶聚合酶扩增(RPA)，利用三种酶(能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶)，在恒温条件下实现核酸的指数扩增。然而，仅仅依赖等温扩增的核酸检测方法灵敏度有限，通常无法实现10个拷贝以下的核酸分子检测。

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)是含有多个短同向重复的基因座，其被发现存在于约40％已测序的细菌基因组中和90％已测序的古生菌基因组中。CRISPR作为原核生物的适应性免疫系统发挥功能，可提供针对入侵的外源核酸的获得性免疫。原核生物通过CRISPR系统加工外源DNA，获取DNA短片段并将其整合在CRISPR系统的重复序列之间，作为CRISPR元件(间隔序列)保留对外源DNA的记忆。当同源的DNA再次入侵时，原核生物利用这些间隔序列以类似于真核生物中RNAi的方式识别并将其沉默。Cas蛋白(CRISPR相关蛋白)是CRISPR系统的重要组成部分。

Cas9、Cas12和Cas13是三种不同类型的Cas蛋白。Cas9需要在crRNA和tracrRNA两种RNA的引导下特异性切割DNA序列；Cas12只需要crRNA的引导即可特异性切割DNA序列，同时还获得了非特异性DNA切割活性；Cas13在crRNA的引导下可特异性切割RNA序列，同时还获得了非特异性RNA切割活性。

目前，研究者利用Cas12(包括Cas12a和Cas12b)和Cas13(包括Cas13a和Cas13b)的非特异性切割活性，结合核酸等温扩增技术(主要为LAMP和RPA)，开发了一系列灵敏度更高的核酸检测方法。

但是，目前基于Cas12和Cas13开发的核酸检测方法，均无法利用一种Cas蛋白实现多个目标序列的检测，这限制了这类方法的应用潜力。如何解决上述技术问题，是目前核酸检测技术领域需要解决的技术问题。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供一种基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统及其方法和应用。

本发明构思原理如下：本发明利用逆转录酶和RNA聚合酶的循环扩增作用，实现目标RNA序列的快速扩增，获得待检测核酸序列的扩增产物(RNA)；RNA扩增产物作为crRNA，与体系中的tracrRNA和Cas9蛋白结合形成复合体，特异性切割DNA探针，将RNA分子信号转化为荧光信号或胶体金信号。

需要说明的是，RNA的扩增反应和检测反应在同一反应体系中进行，实现了RNA样本的单管恒温检测；在此基础上，若目标核酸为双链DNA，则在反应前增加预变性步骤即可；若目标核酸为单链DNA，则操作方法与RNA一样。

通过设计多对特异性引物和多条特异性探针，可在单个反应体系中实现多个目标序列的同时检测。

此前，基于Cas12和Cas13开发的核酸检测方法，均是利用Cas蛋白特异性切割目标序列的扩增产物后被激活的非特异性核酸酶活性切割探针产生信号，所以无法做到利用一种Cas蛋白实现多个目标序列的检测。本发明利用Cas9蛋白的特异性核酸酶活性切割DNA探针产生信号，而Cas9蛋白特异性切割探针后不会产生非特异性核酸酶活性，所以可通过使用多个探针实现多个目标序列的检测。

具体的，本发明所采用的技术方案为：

本发明提供了一种基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统，涉及逆转录酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶、Cas9蛋白、tracrRNA、crRNA和DNA探针；所述crRNA是待检测核酸序列的扩增产物；所述Cas9蛋白和tracrRNA、crRNA结合形成复合体，对DNA探针进行特异性切割并产生可检测信号。

本发明提供了一种核酸检测试剂盒，涉及上述所述的基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统。

本发明提供了一种基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统的应用，所述基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统适用于检测人、动物、植物、微生物或病毒的核酸分子，所述核酸分子包括RNA、单链DNA或双链DNA。

本发明提供了一种基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测方法，具体步骤如下：

S1：从待检测样本中提取总核酸；

S2：将提取的总核酸加入反应液中进行等温反应，所述等温反应包括核酸扩增反应和Cas9切割反应；

S3：对步骤S2等温反应后的溶液进行结果判定，通过检测DNA探针是否被切割来判断待检测样本中是否存在目标核酸。

需要说明的是，判断检测DNA探针是否被切割的方法，包括但不限于以下方法：

(1)在合适的激发光下肉眼观察荧光；

(2)用具有荧光检测功能的仪器检测荧光信号；

(3)用胶体金侧向流动试纸条进行层析，观察杂交带。

优选的，所述等温反应在37-42℃条件下进行，反应时间为0.5-3小时。

优选的，所述反应液包括酶混合液、核酸混合液和缓冲液。

优选的，所述酶混合液包括逆转录酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶、RNA酶抑制蛋白和Cas9蛋白。

优选的，所述核酸混合液包括tracrRNA、DNA探针、扩增引物、四种脱氧核苷酸和四种核糖核苷酸。

具体的，所述逆转录酶包括但不限于莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶和鸟类成髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶；该酶能以RNA或单链DNA为模板，并在特异性引物的引导下形成互补的DNA；

具体的，所述的逆转录酶包括野生型、突变型、融合型的逆转录酶或多种逆转录酶的混合物；所述的逆转录酶优选为NEB公司的ProtoScript II逆转录酶。

具体的，所述的核糖核酸酶H具有降解DNA/RNA杂交链中RNA链的功能，可以包括野生型、突变型、融合型的核糖核酸酶H或多种核糖核酸酶H的混合物，或具有核糖核酸酶H活性的其他酶(如MMLV逆转录酶等)。

具体的，所述的RNA聚合酶包括但不限于T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶；该酶能够利用含有特定启动子的DNA片段，通过转录产生同样序列的RNA分子；

具体的，所述的RNA聚合酶包括野生型、突变型、融合型的RNA聚合酶或多种RNA聚合酶的混合物；所述的RNA聚合酶优选为T7 RNA聚合酶。

具体的，所述的RNA酶抑制蛋白为小鼠RNA酶抑制蛋白、大鼠RNA酶抑制蛋白或其他物种来源的RNA酶抑制蛋白，包括野生型、突变型、融合型的RNA酶抑制蛋白或多种RNA酶抑制蛋白的混合物。

具体的，所述的Cas9蛋白结合向导RNA后具有特异性DNA核酸酶活性，可以对特定DNA探针进行切割；所述向导RNA由crRNA和tracrRNA组成。

具体的，所述Cas9蛋白包括但不限于SpyCas9、CjeCas9、Sth1Cas9；所述Cas9蛋白包括野生型、突变型、融合型的Cas9蛋白或多种Cas9蛋白的混合物；所述的Cas9蛋白优选为SpyCas9。

在一具体实施例中，步骤S2中所述反应液包括以下成分：提取的核酸样本；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，10-100mM，pH 6-9；氯化镁(MgCl2)，1-50mM；氯化钾(KCl)，1-200mM；二硫苏糖醇(DTT)，1-100mM；二甲基亚砜(DMSO)，0.1-20％；牛血清白蛋白(BSA)，0.01-1mg/ml；dNTP，每种0.1-10mM；rNTP，每种0.1-20mM；扩增引物，1-500nM；DNA探针，0.01-10μM；tracrRNA，10-200nM；ProtoScript II逆转录酶，10-200U；核糖核酸酶H，0.05-2U；T7 RNA聚合酶，50-500U；RNA酶抑制蛋白，10-200U；SpyCas9蛋白，10-200nM。

具体的，所述tracrRNA能结合目标核酸的扩增产物，并产生可被Cas9识别并结合的二级结构。

具体的，所述DNA探针为带有标记的单链DNA分子，该探针能结合目标核酸的扩增产物，并含有可被Cas9蛋白识别的PAM序列。

需要说明的是，所述DNA探针的标记方法有两种：

(1)在Cas9切割位点的一侧用荧光基团标记，另一侧用荧光淬灭基团标记，所述荧光基团包括但不限于FAM、HEX、Cy5、TexaRed，所述荧光淬灭基团包括但不限于BHQ1、TAMRA、Dabcy1；

(2)在Cas9切割位点的一侧用生物素标记，另一侧用FITC(FAM)、DIG、TAMRA或其他具有单克隆抗体的小分子中的一种或多种标记。

具体的，所述扩增引物为一对长度为15-40碱基(与模板配对的部分)的DNA引物，其中一条引物上带有T7启动子序列，另一条引物上带有DR序列(CRISPR系统中的)或DR序列和间隔序列(CRISPR系统中的)，扩增产物长度为80-500碱基。

本发明的有益效果是：

1、高灵敏度：应用本发明可以实现10拷贝以下的核酸检测；

2、通用性：应用本发明只需要更换一对特异性引物即可用于不同核酸序列的检测，包括RNA、单链DNA和双链DNA，可方便快速开发针对不同病原体的检测试剂盒；

3、多通道：本发明只需要一种Cas蛋白即可实现多通道核酸检测，一次性检测多个目标序列，反应体系稳定，兼容性强；

4、快速：应用本发明最快可在30分钟内完成检测；

5、便捷：本发明实现了单管恒温快速高灵敏的核酸检测，在现场检测和自动化高通量检测方面具有很大的应用价值，操作简单，对仪器要求低；

6、稳定：本发明在常温下进行检测反应，反应中途不需要开盖等其他操作，提高了稳定性；

7、低假阳性：本发明利用Cas9的特异性切割活性产生可检测的信号，准确性高。

附图说明

图1为本发明设计原理的检测流程整体示意图；

图2为本发明检测RNA样本的流程示意图；

图3为本发明检测DNA样本的流程示意图；

图4为本发明对大肠杆菌lacZ基因mRNA的检测结果；

图5为本发明对大肠杆菌lacZ基因有义链DNA(单链DNA)的检测结果；

图6为本发明对大肠杆菌lacZ基因(双链DNA)的检测结果；

图7为本发明对新冠病毒SARS-Cov-2 orf1a/b基因RNA的检测结果；

图8为本发明对新冠病毒SARS-Cov-2 N基因RNA的检测结果；

图9为本发明对新冠病毒SARS-Cov-2 S基因RNA的检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非特别说明，本发明所用的试剂、耗材和设备均为本技术领域的常规试剂、耗材和设备。除非特别说明，以下实施例所用的试剂和耗材均为市购。

本发明所用的引物、探针、tracrRNA均在南京金斯瑞生物科技有限公司订购。

除非另有说明，本发明所用的涉及免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学等学科的技术均是本领域的常规技术。

实施例1：使用本发明检测RNA靶标。

选用大肠杆菌MG1655菌株lacZ基因的mRNA(Target 1)作为靶标序列，Target 1序列如SEQ ID NO.1所示；

靶标RNA的制备方法如下：

(1)PCR扩增转录模板

a)设计引物

上游引物F1，如SEQ ID NO.2所示；

下游引物R1(含T7启动子序列)，如SEQ ID NO.3所示；

b)PCR扩增

利用上述上下游引物，以大肠杆菌MG1655基因组为模板，使用高保真DNA聚合酶(NEB#M0530)对目的片段进行PCR扩增。用胶回收试剂盒(Thermo#K0691)对PCR产物进行纯化。

(2)体外转录靶标RNA

a)以上述胶回收纯化产物为模板，用T7 RNA聚合酶(NEB#M0251)在37℃过夜反应转录靶标RNA。

b)用RNA纯化试剂盒(Zymo#R1013)对转录产物进行纯化，纯化产物保存于-20℃。用NanoDrop(Thermo#ND-ONE-W)测定RNA纯化产物的浓度。用计算工具(NEBioCalculator)将RNA浓度换算成拷贝数。

等温检测所用的引物、探针和tracrRNA序列如下：

上游引物F2(含T7启动子序列)，如SEQ ID NO.4所示；

下游引物R2(含间隔序列)，如SEQ ID NO.5所示；

DNA探针P1(5’端用FAM标记，3’端用BHQ1标记)，如SEQ ID NO.6所示；

tracrRNA如，SEQ ID NO.7所示；

扩增和检测反应体系配制如下：

将纯化的靶标RNA用无核酸酶水进行梯度稀释，得到不同浓度的待检测样品(10⁵拷贝/μl，10⁴拷贝/μl，10²拷贝/μl，10拷贝/μl，5拷贝/μl，2拷贝/μl，1拷贝/μl)。

20μl反应体系：1μl不同浓度的待检测样品，4μl无核酸酶水，5μl酶混合液，5μl核酸混合液，5μl缓冲液。设置阴性对照组，在阴性对照组中，将1μl待检测样品换成1μl无核酸酶水。

酶混合液配方为：1.5μl稀释的RNase H(0.5U/μl)，2.5μl ProtoScript II逆转录酶(200U/μl)(NEB#M0368)，1.3μl T7 RNA聚合酶(1000U/μl)(NEB#M0460)，5μl RNA酶抑制蛋白(40U/μl)(NEB#M0314)，1.2μl BSA(20mg/ml)，16μl缓冲液(不含DMSO)，加无核酸酶水将体积补足至50μl。

稀释的RNase H配方为：5μl RNase H(5U/μl)(NEB#M0297)，1.2μl BSA(20mg/ml)，16μl缓冲液(不含DMSO)，加无核酸酶水将体积补足至50μl。

核酸混合液配方为：5μl tracrRNA(10μM)，8μl DNA探针(10μM)，0.5μl上游引物F2(10μM)，0.5μl下游引物F2(10μM)，0.2μl dATP(100mM)(YEASEN#10118ES74)，0.2μl dGTP(100mM)(YEASEN#10121ES74)，0.2μl dCTP(100mM)(YEASEN#10119ES74)，0.2μl dTTP(100mM)(YEASEN#10120ES74)，0.8μl rATP(100mM)(YEASEN#10129ES03)，0.8μl rGTP(100mM)(YEASEN#10132ES03)，0.8μl rCTP(100mM)(YEASEN#10130ES03)，0.8μl rUTP(100mM)(YEASEN#10131ES03)，加无核酸酶水将体积补足至50μl。

缓冲液配方为：120μl Tris-HCl(1M，pH 8.4)，20μl MgCl₂(2M)，113μl KCl(2M)，30μl DTT(1M)，450μl DMSO，加无核酸酶水将体积补足至1ml。

缓冲液(不含DMSO)配方为：120μl Tris-HCl(1M，pH 8.4)，20μl MgCl₂(2M)，113μlKCl(2M)，30μl DTT(1M)，加无核酸酶水将体积补足至1ml。

扩增和检测反应在PCR管中进行，反应温度41℃，时间1.5小时。

反应结束后，在反应液中加入180μl无核酸酶水，然后将全部液体转移至酶标板中，用酶标仪(Biotek#Synergy H1)检测荧光值。激发波长494nm，发射波长522nm。

检测结果如图3所示。应用此方法可以检测到5个拷贝的RNA分子。

实施例2：使用本发明检测单链DNA靶标。

选用大肠杆菌MG1655菌株lacZ基因的有义链DNA(Target 2)作为靶标序列，Target 2序列如SEQ ID NO.8所示

靶标DNA由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

等温检测所用的引物、探针和tracrRNA序列如下：

上游引物F2(含T7启动子)，如SEQ ID NO.4所示；

下游引物R2(含间隔序列)，如SEQ ID NO.5所示；

tracrRNA如，SEQ ID NO.7所示；

扩增和检测反应体系配制如下：

将合成的靶标DNA用无核酸酶水进行梯度稀释，得到不同浓度的待检测样品(10⁵拷贝/μl，10⁴拷贝/μl，10²拷贝/μl，10拷贝/μl，5拷贝/μl，2拷贝/μl，1拷贝/μl)。

酶混合液配方同实施例1。

核酸混合液配方同实施例1。

缓冲液配方为同实施例1。

检测结果如图4所示。应用此方法可以检测到5个拷贝的单链DNA分子。

实施例3：使用本发明检测双链DNA靶标。

选用大肠杆菌MG1655菌株lacZ基因(Target 3)作为靶标序列，Target 3序列如SEQ ID NO.9所示；

靶标DNA采用PCR制备，制备方法如下：

(1)设计引物

上游引物F3，如SEQ ID NO.10所示；

下游引物R3，如SEQ ID NO.11所示；

(2)PCR扩增

将合成的靶标DNA用无核酸酶水进行梯度稀释，得到不同浓度的待检测样品(2×10⁵拷贝/μl，2×10⁴拷贝/μl，2×10²拷贝/μl，20拷贝/μl，10拷贝/μl，4拷贝/μl，2拷贝/μl)。

等温检测所用的引物、探针和tracrRNA序列如下：

上游引物F2(含T7启动子序列)，如SEQ ID NO.4所示；

下游引物R2(含间隔序列)，如SEQ ID NO.5所示；

tracrRNA，如SEQ ID NO.7所示；

扩增和检测反应体系配制如下：

DNA单链化反应：向待检测样品中加入1/10体积的氢氧化钠(5M)进行碱变性，再加入1/10体积的盐酸(5M)进行中和，最后加入4/5体积的无核酸酶水，这时待检测样品的浓度分别为10⁵拷贝/μl，10⁴拷贝/μl，10²拷贝/μl，10拷贝/μl，5拷贝/μl，2拷贝/μl，1拷贝/μl)。

酶混合液配方同实施例1。

核酸混合液配方同实施例1。

缓冲液配方同实施例1。

检测结果如图5所示。应用此方法可以检测到10个拷贝的双链DNA分子。

实施例4：使用本发明检测新冠病毒SARS-Cov-2的orf1a/b基因RNA。

选用体外转录的orf1a/b基因(Target 4)作为靶标序列，Target 4序列如SEQ IDNO.12所示；

靶标RNA的制备方法如下：

(1)PCR扩增转录模板

a)设计引物

上游引物F4，如SEQ ID NO.13所示；

下游引物R4(含T7启动子序列)，如SEQ ID NO.14所示；

b)PCR扩增

利用上述上下游引物，以含有orf1a/b基因的质粒pXSP-15A(SEQ ID NO.15所示)为模板，使用高保真DNA聚合酶(NEB#M0530)对目的片段进行PCR扩增。用胶回收试剂盒(Thermo#K0691)对PCR产物进行纯化。

(2)体外转录靶标RNA

等温检测所用的引物、探针和tracrRNA序列如下：

上游引物F5(含T7启动子序列)，如SEQ ID NO.16所示；

下游引物R5，如SEQ ID NO.17所示；

tracrRNA，如SEQ ID NO.7所示；

扩增和检测反应体系配制如下：

酶混合液配方同实施例1。

核酸混合液配方同实施例1。

缓冲液配方同实施例1。

检测结果如图6所示。应用此方法可以检测到5个拷贝的新冠病毒SARS-Cov-2的orf1a/b基因RNA分子。

实施例5：使用本发明检测新冠病毒SARS-Cov-2的N基因RNA。

选用体外转录的N基因(Target 5)作为靶标序列，Target 5序列入SEQ ID NO.18所示；

靶标RNA的制备方法如下：

(1)PCR扩增转录模板

a)设计引物

上游引物F6，如SEQ ID NO.19所示；

下游引物R6，(含T7启动子序列)如SEQ ID NO.20所示；

b)PCR扩增

利用上述上下游引物，以含有orf1a/b基因的质粒pXSP-15B(SEQ ID NO.21所示)为模板，使用高保真DNA聚合酶(NEB#M0530)对目的片段进行PCR扩增。用胶回收试剂盒(Thermo#K0691)对PCR产物进行纯化。

(2)体外转录靶标RNA

等温检测所用的引物、探针和tracrRNA序列如下：

上游引物F7，(含T7启动子序列)如SEQ ID NO.22所示；

下游引物R7，如SEQ ID NO.23所示；

tracrRNA，如SEQ ID NO.7所示；

扩增和检测反应体系配制如下：

酶混合液配方同实施例1。

核酸混合液配方同实施例1。

缓冲液配方同实施例1。

检测结果如图7所示。应用此方法可以检测到5个拷贝的新冠病毒SARS-Cov-2的N基因RNA分子。

实施例6：使用本发明检测新冠病毒SARS-Cov-2的S基因RNA。

选用体外转录的S基因(Target 6)作为靶标序列，Target 6序列SEQ ID NO.24所示；

靶标RNA的制备方法如下：

(1)PCR扩增转录模板

a)设计引物

上游引物F8，如SEQ ID NO.25所示；

下游引物R8(含T7启动子序列)，如SEQ ID NO.26所示；

b)PCR扩增

利用上述上下游引物，以含有S基因的质粒pHCY-146(SEQ ID NO.27所示)为模板，使用高保真DNA聚合酶(NEB#M0530)对目的片段进行PCR扩增。用胶回收试剂盒(Thermo#K0691)对PCR产物进行纯化。

(2)体外转录靶标RNA

等温检测所用的引物、探针和tracrRNA序列如下：

上游引物F9(含T7启动子序列)，如SEQ ID NO.28所示；

下游引物R9，如SEQ ID NO.29所示；

tracrRNA，如SEQ ID NO.7所示；

扩增和检测反应体系配制如下：

酶混合液配方同实施例1。

核酸混合液配方同实施例1。

缓冲液配方同实施例1。

检测结果如图8所示。应用此方法可以检测到5个拷贝的新冠病毒SARS-Cov-2的S基因RNA分子。

序列表

<110> 山东启邦汇康生物技术有限公司

<120> 一种基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统及其方法和应用

<141> 2021-09-06

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 418

<212> RNA

<213> 大肠杆菌MG1655(Escherichia coli MG1655)

<400> 1

gcuaaucacg acgcgcugua ucgcuggauc aaaucugucg auccuucccg cccggugcag 60

uaugaaggcg gcggagccga caccacggcc accgauauua uuugcccgau guacgcgcgc 120

guggaugaag accagcccuu cccggcugug ccgaaauggu ccaucaaaaa auggcuuucg 180

cuaccuggag agacgcgccc gcugauccuu ugcgaauacg cccacgcgau ggguaacagu 240

cuuggcgguu ucgcuaaaua cuggcaggcg uuucgucagu auccccguuu acagggcggc 300

uucgucuggg acugggugga ucagucgcug auuaaauaug augaaaacgg caacccgugg 360

ucggcuuacg gcggugauuu uggcgauacg ccgaacgauc gccaguucug uaugaacg 418

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgttcataca gaactggcga 20

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accgccaaga ctgttaccca tcgcgtgggc gctaatcacg acgcgctgta t 51

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtattcgcaa aggatcagcg g 51

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcatagctc taaaacccga tattatttgc ccgatg 36

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tccaccgata ttatttgccc gatg 24

<210> 7

<211> 67

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg 60

gugcuuu 67

<210> 8

<211> 127

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655(ESCHERICHIA coli MG1655)

<400> 8

ccgatattat ttgcccgatg tacgcgcgcg tggatgaaga ccagcccttc ccggctgtgc 60

cgaaatggtc catcaaaaaa tggctttacc tcgctggaga gacgcgcccg ctgatccttt 120

gcgaata 127

<210> 9

<211> 127

<212> DNA

<213> 大肠杆菌MG1655(ESCHERICHIA coli MG1655)

<400> 9

tattcgcaaa ggatcagcgg gcgcgtctct ccaggtagcg aaagccattt tttgatggac 60

catttcggca cagccgggaa gggctggtct tcatccacgc gcgcgtacat cgggcaaata 120

atatcgg 127

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tattcgcaaa ggatcagcgg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccgatattat ttgcccgatg 20

<210> 12

<211> 475

<212> RNA

<213> 新冠病毒SARS-Cov-2(New Coronavirus SARS-Cov-2)

<400> 12

cguugccaca uagaucaucc aaauccuaaa ggauuuugug acuuaaaagg uaaguaugua 60

caaauaccua caacuugugc uaaugacccu guggguuuua cacuuaaaaa cacagucugu 120

accgucugcg guauguggaa agguuauggc uguaguugug aucaacuccg cgaacccaug 180

cuucagucag cugaugcaca aucguuuuua aacggguuug cgguguaagu gcagcccguc 240

uuacaccgug cggcacaggc acuaguacug augucguaua cagggcuuuu gacaucuaca 300

augauaaagu agcugguuuu gcuaaauucc uaaaaacuaa uuguugucgc uuccaagaaa 360

aggacgaaga ugacaauuua auugauucuu acuuuguagu uaagagacac acuuucucua 420

acuaccaaca ugaagaaaca auuuauaauu uacuuaagga uuguccagcu guugc 475

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcaacagctg gacaatcctt 20

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgcccacgcg atgggtaaca gtcttggcgg tcgttgccac atagatcatc c 51

<210> 15

<211> 2813

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aggattaaac aacctaaata gaggtatggt acttggtagt ttagctgcca cagtacgtct 60

acaagctggt aatgcaacag aagtgcctgc caattcaact gtattatctt tctgtgcttt 120

tgctgtagat gctgctaaag cttacaaaga ttatctagct agtgggggac aaccaatcac 180

taattgtgtt aagatgttgt gtacacacac tggtactggt caggcaataa cagttacacc 240

ggaagccaat atggatcaag aatcctttgg tggtgcatcg tgttgtctgt actgccgttg 300

ccacatagat catccaaatc ctaaaggatt ttgtgactta aaaggtaagt atgtacaaat 360

acctacaact tgtgctaatg accctgtggg ttttacactt aaaaacacag tctgtaccgt 420

ctgcggtatg tggaaaggtt atggctgtag ttgtgatcaa ctccgcgaac ccatgcttca 480

gtcagctgat gcacaatcgt ttttaaacgg gtttgcggtg taagtgcagc ccgtcttaca 540

ccgtgcggca caggcactag tactgatgtc gtatacaggg cttttgacat ctacaatgat 600

aaagtagctg gttttgctaa attcctaaaa actaattgtt gtcgcttcca agaaaaggac 660

gaagatgaca atttaattga ttcttacttt gtagttaaga gacacacttt ctctaactac 720

caacatgaag aaacaattta taatttactt aaggattgtc cagctgttgc taaacatgac 780

ttctttaagt ttagaataga cggtgacatg gtaccacata tatcacgtca acgtcttact 840

aaatacacaa tggcagacct cgtctatgct ttaaggcatt ttgatgaagg taattgtgac 900

acattaaaag aaatacttgt cacatacaat tgttgtgatg atgattattt caataaaaag 960

gactggtatg attttgtaga aaacccagat atattacgcg gagcaaaagg ccagcaaaag 1020

gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 1080

gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 1140

taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 1200

accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 1260

tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 1320

cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 1380

agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 1440

gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 1500

gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 1560

tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 1620

acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 1680

cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 1740

acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 1800

acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 1860

tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 1920

ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 1980

ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 2040

tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 2100

aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 2160

ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 2220

ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc 2280

gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 2340

gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 2400

cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 2460

actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 2520

ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct 2580

tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 2640

ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga 2700

agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 2760

aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt cta 2813

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

accgccaaga ctgttaccca tcgcgtgggc gcgcaaaccc gtttaaaaac g 51

<210> 17

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agcatagctc taaaacccga tattatttgc ccgatgtgcg gtatgtggaa aggtta 56

<210> 18

<211> 462

<212> RNA

<213> 新冠病毒SARS-Cov-2(New Coronavirus SARS-Cov-2)

<400> 18

gcaauccugc uaacaaugcu gcaaucgugc uacaacuucc ucaaggaaca acauugccaa 60

aaggcuucua cgcagaaggg agcagaggcg gcagucaagc cucuucucgu uccucaucac 120

guagucgcaa caguucaaga aauucaacuc caggcagcag uaggggaacu ucuccugcua 180

gaauggcugg caauggcggu gaugcugcuc uugcuuugcu gcugcuugac agauugaacc 240

agcuugagag caaaaugucu gguaaaggcc aacaacaaca aggccaaacu gucacuaaga 300

aaucugcugc ugaggcuucu aagaagccuc ggcaaaaacg uacugccacu aaagcauaca 360

auguaacaca agcuuucggc agacgugguc cagaacaaac ccaaggaaau uuuggggacc 420

aggaacuaau cagacaagga acugauuaca aacauuggcc gc 462

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcggccaatg tttgtaatca 20

<210> 20

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

accgccaaga ctgttaccca tcgcgtgggc gtcatcacgt agtcgcaaca g 51

<210> 21

<211> 2813

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

taaccagaat ggagaacgca gtggggcgcg atcaaaacaa cgtcggcccc aaggtttacc 60

caataatact gcgtcttggt tcaccgctct cactcaacat ggcaaggaag accttaaatt 120

ccctcgagga caaggcgttc caattaacac caatagcagt ccagatgacc aaattggcta 180

ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc 240

aagatggtat ttctactacc taggaactgg gccagaagct ggacttccct atggtgctaa 300

caaagacggc atcatatggg ttgcaactga gggagccttg aatacaccaa aagatcacat 360

tggcacccgc aatcctgcta acaatgctgc aatcgtgcta caacttcctc aaggaacaac 420

attgccaaaa ggcttctacg cagaagggag cagaggcggc agtcaagcct cttctcgttc 480

ctcatcacgt agtcgcaaca gttcaagaaa ttcaactcca ggcagcagta ggggaacttc 540

tcctgctaga atggctggca atggcggtga tgctgctctt gctttgctgc tgcttgacag 600

attgaaccag cttgagagca aaatgtctgg taaaggccaa caacaacaag gccaaactgt 660

cactaagaaa tctgctgctg aggcttctaa gaagcctcgg caaaaacgta ctgccactaa 720

agcatacaat gtaacacaag ctttcggcag acgtggtcca gaacaaaccc aaggaaattt 780

tggggaccag gaactaatca gacaaggaac tgattacaaa cattggccgc aaattgcaca 840

atttgccccc agcgcttcag cgttcttcgg aatgtcgcgc attggcatgg aagtcacacc 900

ttcgggaacg tggttgacct acacaggtgc catcaaattg gatgacaaag atccaaattt 960

caaagatcaa gtcattttgc tgaataagca tattgacgca gagcaaaagg ccagcaaaag 1020

gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 1080

gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 1140

taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 1200

accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 1260

tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 1320

cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 1380

agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 1440

gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 1500

gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 1560

tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 1620

acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 1680

cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 1740

acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 1800

acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 1860

tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 1920

ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 1980

ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 2040

tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 2100

aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 2160

ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 2220

ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc 2280

gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 2340

gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 2400

cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 2460

actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 2520

ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct 2580

tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 2640

ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga 2700

agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 2760

aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt cta 2813

<210> 22

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggctggttca atctgtcaag c 51

<210> 23

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

agcatagctc taaaacccga tattatttgc ccgatgtcat cacgtagtcg caacag 56

<210> 24

<211> 450

<212> RNA

<213> 新冠病毒SARS-Cov-2(New Coronavirus SARS-Cov-2)

<400> 24

uuuugagaga gauauuucaa cugaaaucua ucaggccggu agcacaccuu guaauggugu 60

ugaagguuuu aauuguuacu uuccuuuaca aucauauggu uuccaaccca cuaauggugu 120

ugguuaccaa ccauacagag uaguaguacu uucuuuugaa cuucuacaug caccagcaac 180

uguuugugga ccuaaaaagu cuacuaauuu gguuaaaaac aaauguguca auuucaacuu 240

caaugguuua acaggcacag guguucuuac ugagucuaac aaaaaguuuc ugccuuucca 300

acaauuuggc agagacauug cugacacuac ugaugcuguc cgugauccac agacacuuga 360

gauucuugac auuacaccau guucuuuugg uggugucagu guuauaacac caggaacaaa 420

uacuucuaac cagguugcug uucuuuauca 450

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cctggtgtta taacactgac ac 22

<210> 26

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aattctaata cgactcacta tagggagaag ggcacacctt gtaatggtgt t 51

<210> 27

<211> 2263

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ttttgagaga gatatttcaa ctgaaatcta tcaggccggt agcacacctt gtaatggtgt 60

tgaaggtttt aattgttact ttcctttaca atcatatggt ttccaaccca ctaatggtgt 120

tggttaccaa ccatacagag tagtagtact ttcttttgaa cttctacatg caccagcaac 180

tgtttgtgga cctaaaaagt ctactaattt ggttaaaaac aaatgtgtca atttcaactt 240

caatggttta acaggcacag gtgttcttac tgagtctaac aaaaagtttc tgcctttcca 300

acaatttggc agagacattg ctgacactac tgatgctgtc cgtgatccac agacacttga 360

gattcttgac attacaccat gttcttttgg tggtgtcagt gttataacac caggaacaaa 420

tacttctaac caggttgctg ttctttatca gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 480

gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 540

aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 600

ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 660

tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 720

tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 780

ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 840

tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 900

ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta 960

tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 1020

aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 1080

aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 1140

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 1200

ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 1260

acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 1320

ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 1380

gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 1440

taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 1500

tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 1560

gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 1620

cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 1680

aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 1740

cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 1800

tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 1860

gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 1920

tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 1980

gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 2040

ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 2100

cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 2160

agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 2220

gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt cta 2263

<210> 28

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aattctaata cgactcacta tagggagaag gacacctgtg cctgttaaac cat 53

<210> 29

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

agcatagctc taaaacccga tattatttgc ccgatgccag caactgtttg tggaccta 58

Claims

1.一种基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统，其特征在于，包括逆转录酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶、Cas9蛋白、tracrRNA、crRNA和DNA探针；所述crRNA是待检测核酸序列的扩增产物；所述Cas9蛋白和tracrRNA、crRNA结合形成复合体，对DNA探针进行特异性切割并产生可检测信号。

2.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统。

3.一种如权利要求1所述的基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统的应用，其特征在于，所述基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统适用于检测人、动物、植物、微生物或病毒的核酸分子。

4.一种基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测方法，具体步骤如下：

S1：从待检测样本中提取总核酸；

5.根据权利要求4所述的基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测方法，其特征在于，所述等温反应在37-42℃条件下进行，反应时间为0.5-3小时。

6.根据权利要求4所述的基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测方法，其特征在于，所述反应液包括酶混合液、核酸混合液和缓冲液。

7.根据权利要求6所述的基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测方法，其特征在于，所述酶混合液包括逆转录酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶、RNA酶抑制蛋白和Cas9蛋白。

8.根据权利要求6所述的基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测方法，其特征在于，所述核酸混合液包括tracrRNA、DNA探针、扩增引物、四种脱氧核苷酸和四种核糖核苷酸。

9.根据权利要求4所述的基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测方法，其特征在于，所述目标核酸为RNA、单链DNA或双链DNA。

10.根据权利要求4所述的基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测方法，其特征在于，检测DNA探针是否被切割的方法，包括：在合适的激发光下肉眼观察荧光，或用具有荧光检测功能的仪器检测荧光信号，或用胶体金侧向流动试纸条进行层析，观察杂交带。