CN112680550A - 一种dcas9介导检测SARS-CoV-2N基因的免疫层析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测SARS‑CoV‑2 N基因的免疫层析方法，包括：步骤1，针对靶标基因设计特异性引物及sgRNA序列；步骤2，取待测样本RNA，并加入5'端标有生物素的引物，进行RT‑RPA核酸扩增，得到扩增产物；步骤3，在扩增产物里加入dcas9蛋白及sgRNA进行反应，形成dcas9/sgRNA/SARS‑CoV‑2 N‑biotin复合物；步骤4，将反应产物加入免疫层析试纸条，即可判读结果。本发明通过信号放大后，由sgRNA/dcas9复合物再次识别靶标基因，特异性高，稳定性强，灵敏度高；且当靶标基因改变时，只需要更换引物及sgRNA序列，免疫层析试纸条则可以通用，可扩展性强。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种检测SARS-CoV-2 N基因的免疫层析方法。
背景技术
核酸检测属于分子诊断，应用分子生物学方法检测受检个体或其携带的病毒、病原体的遗传物质的结构或表达调控的变化水平，为疾病的防治、预测、诊断、治疗和预后判断提供信息和决策依据的技术。由于分子诊断技术可针对产生疾病的相关基因进行准确诊断，特异性强，灵敏度高，可应用于传染性疾病、血液筛查、遗传性疾病、肿瘤分子诊断等领域，还能在部分应用领域替代其他体外诊断技术，成为体外诊断技术中重要的发展和研究方向。
核酸检测通常结合扩增技术，将微量的特异性核酸序列放大到能够被仪器检测到的水平。传统的核酸检测有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 和逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，PCR)，前者扩增DNA，后者则扩增RNA，是目前临床应用最广泛的分子诊断技术。PCR 技术核酸扩增分三个基本反应步骤，分别是变性、退火(复性)和延伸，每完成一次这三个步骤为一个循环，一般需要进行几十个循环，耗时2至3个小时，且需要精准的温度和时间控制。RPA核酸扩增技术是一种在等温条件(37℃)下， 5-30分钟之内就可以达到目的基因扩增放大几百万倍的等温扩增技术，相比较于 PCR核酸扩增技术更快速，更易操作，有更宽阔的应用场景。
免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，胶体金标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。检测快速，方便，结果肉眼可见，具有良好的临床应用前景和意义。
CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是目前用于基因编辑中前沿的方法。CRISPR-Cas9 是基因组调控技术中灵活性最强的系统之一。Cas9 的核酸酶剪切活性取决于两个结构域:RuvC和HNH。这两个结构域分别负责切割 DNA链的两条链，并且这两个结构域能够单独地被人工点突变失活。当 RuvC 和HNH 同时处于失活状态时 ( D10A＆H840A; RuvC-＆HNH-)，Cas9 将不具有核酸酶活性，成为 dCas9(deadCas9) 。dCas9 虽然没有剪切 DNA 的能力，但仍然可以在gRNA 的引导下与特定的 DNA 序列结合。
本发明将CRISPR/Cas系统、RPA核酸扩增技术和免疫层析技术结合，建立一种快速、特异地检测SARS-CoV-2 N基因（靶标核酸）的免疫层析方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测SARS-CoV-2 N基因的免疫层析方法，该方法采用RPA等温扩增结合CRISPR/Cas9系统建立快速检测靶标核酸的的免疫层析方法，特异性好，灵敏度高，可靠性好，可用于临床现场检测。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测SARS-CoV-2 N基因的免疫层析方法，包括以下几个步骤：
步骤（1），针对SARS-CoV-2 N基因设计特异性引物及sgRNA序列；所述特异性引物的5'端标记生物素，所述sgRNA的识别序列位于扩增引物内部；
步骤（2），利用RPA等温核酸扩增技术，取待测样本RNA，并加入步骤（1）中5'端标有生物素的特异性引物，进行RT-RPA核酸扩增，得到扩增产物；
步骤（3），结合CRISPR/Cas9系统，在扩增产物里加入dcas9蛋白及步骤（1）中的sgRNA进行反应，形成dcas9/sgRNA/SARS-CoV-2 N-biotin核酸蛋白复合物；
步骤（4），将步骤（3）中的反应产物加入免疫层析试纸条，即可判读结果：若试纸条T线和C线均有红色条带，表明是阳性样品；若试纸条C线有带，T线无带，表明是阴性样品；若试纸条C线无带，则检测无效，需要重复检测。
进一步的，所述引物F序列为：5’-CAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACG-3’（SEQ IDNO:1）；所述引物R序列为：5’-CATTGCCAGCCATTCTAGCAGGAGAAGTTC-3（SEQ ID NO:2）’。
所述sgRNA序列为：
AGUUCAAGAAAUUCAACUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU（SEQ ID NO:3）。
进一步的，所述步骤（2）中，RPA核酸扩增体系为：10 uM引物F 2.4 ul，10 uM引物R2.4 ul，RPA-reacting Buffer 29.5 ul，待测样本5 ul，280 nM MgOAC 2.5 ul，100,000U/mL ProtoScript RT 1 ul，RNase Free Water 7.2 ul。
进一步的，所述所述步骤（3）中，CRISPR体系为：等温扩增产物 50 ul，100 ng/udcas9 4-8 ul，100 ng/ul sgRNA 4-8 ul，10X-Reacting Buffer 10 ul，20 U/μLSUPERase•In™ RNase Inhibitor 5 ul，RNase Free Water To 100 ul 。
本发明免疫层析试纸条包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有抗抗体，所述T线上包被有链酶亲和素；所述金标垫中含有胶体金标记的dcas9抗体（见图 1）。
采用上述技术方案，技术原理为：（1）若为阳性样品，随着信号扩增，扩增产物会被标记上生物素；（2）利用dcas9在 gRNA 的引导下与特定的 DNA 序列结合的工作原理，被生物素标记的扩增产物与dcas9蛋白/sgRNA共同孵育下形成dcas9/sgRNA/SARS-CoV-2 N-biotin复合物；（3）随着检测液横向流动，胶体金标记dcas9抗体识别步骤（2）中复合物，形成胶体金dcas9抗体/dcas9/sgRNA/SARS-CoV-2 N-biotin，检测T线为链酶亲和素，特异性识别biotin，如此，T线特异性截留带胶体金标记的复合物，形成红色条带，分析T线与C线条带情况即可鉴别样本的阳性情况。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明通过等温扩增方法对SARS-CoV-2 N基因特异性扩增放大信号后，再由sgRNA/dcas9复合物二次特异性识别靶标基因，双重特异识别程序使靶标基因的检测特异性高，稳定性强。（2）本发明建立的检测方法检出限达1 copies/ul，灵敏度高（3）本发明检测方法所检测靶基因改变时只需要更换引物及sgRNA序列，免疫层析试纸条则可以通用，可扩展性强。（4）本发明检测快速、无需大型仪器，肉眼可读的结果呈现方式使得应用方便、广泛。
附图说明
图1免疫层析试纸条示意图；其中1：底板；2：样品垫；3：金标垫，含有金标dcas9抗体；4：检测线（T线），含有链霉亲和素；5：对照线（C线），含有抗抗体（二抗）；6：反应膜；7：吸水垫。
图2 SARS-CoV-2 N基因检测结果。
具体实施方式
为了充分了解本发明的目的、特征及效果，下面结合附图、实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的保护范围不局限于下面的实施例。
试剂及耗材：
dcas9蛋白（近岸蛋白；E368-01A）、链酶亲和素（sigma；85878-1MG）、dCas9抗体（Abcam；Ab204448）、RNA提取所用试剂盒(TAKARA， 9766) 、RPA试剂盒（TwistDx Limited；TABAS03KIT）、SUPERase•In™ RNase Inhibitor（ThermoFisher；AM2694）、逆转录酶ProtoScript® II Reverse Transcriptase（NEB；M0368L）、待测样本为含有SARS-CoV-2 N基因的假病毒，由厦门致善生物科技股份有限公司提供；硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜：购自德国赛多利斯公司(SARTORIUS)。引物及sgRNA委托南京金斯瑞公司合成。
实施例 1
1、靶基因特异性引物、sgRNA设计及合成
根据SARS-CoV-2 N基因序列的特点，利用麻省理工大学张锋教授实验室提供的在线网站（http : //crispr.mit.edu /）分析可能的 sgRNA位点（PAM 序列为NGG）并筛选最优sgRNA核心序列；在已选定的sgRNA核心序列上下游约80-150bp范围内设计RPA扩增引物；并利用NCBI中的Primer-BLAST功能对引物进行分析比对，(比对网站为：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)，以保证序列唯一性。所设计的引物5'端由生物素标记（biotin）。
RPA引物设计遵循以下原则：
（1）5’端3-5个核苷酸避免聚鸟嘌呤，最好是胞嘧啶，可以促进重组；
（2）3’的3个核苷酸选择G或者C，有助于聚合酶稳定性；
（3）引物中避免出现聚嘌呤或者聚嘧啶；
（4）GC含量控制在30％-70％，引物长度控制在30-35个碱基范围内。
根据上述原则，SARS-CoV-2 N基因的引物及sgRNA序列如下：
N-F: biotin-5’-CAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACG-3’（SEQ ID NO:1）;
N-R: biotin-5’- CATTGCCAGCCATTCTAGCAGGAGAAGTTC-3’（SEQ ID NO:2）;
sgRNA-N:AGUUCAAGAAAUUCAACUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU（SEQ ID NO:3）。
将上述引物及sgRNA委托南京金斯瑞公司合成。
扩增
按照说明书提取待测样本假病毒RNA后，将RNA调整为500 copies/ul、50copies/ul、1copies/ul、RNase Free Water（0 copies/ul 阴性对照）四个分组，并按照下列表1配制RT-RPA扩增反应体系，37-42℃下进行反应20-30分钟获得等温扩增产物。
表1
| 组分 | 用量 |
| Primer—Forward（10 uM） | 2.4 ul |
| Primer—Reverse（10 uM） | 2.4 ul |
| RPA-reacting Buffer | 29.5 ul |
| 待测样本RNA | 5 ul |
| MgOAC (280 nM) | 2.5 ul |
| ProtoScript RT (100,000U/mL) | 1 ul |
| RNase Free Water | 7.2 ul |
| Total | 50ul |
3 RT-RPA扩增产物与dcas9、sgRNA反应
将RT-RPA扩增产物与dcas9、sgRNA按照下列表2配制CRISPR反应体系，37℃反应5-10分钟获得dcas9/sgRNA/SARS-CoV-2 N-biotin复合物。
表2
| 组分 | 用量 |
| 等温扩增产物 | 50 ul |
| dcas9 （100 ng/ul） | 4-8 ul |
| sgRNA（100 ng/ul） | 4-8 ul |
| 10X-Reacting Buffer | 10 ul |
| SUPERase•In™ RNase Inhibitor (20 U/μL) | 5 ul |
| RNase Free Water | To 100 ul |
4 结果检测
将步骤（3）中带有复合物的反应液加入免疫层析试纸条，即可判读结果：若试纸条T线和C线均有红色条带，表明是阳性样品；若试纸条C线有带，T线无带，表明是阴性样品；若试纸条C线无带，则检测无效，需要重复检测。N基因检测结果见图 2 。结果显示，在SARS-CoV-2 N基因拷贝数为1copies/ul时依然能准确的检测出，表明该方法的灵敏性和可靠性。
实施例2 免疫层析试纸条的制备
1、两步还原法制备胶体金
a)氯金酸溶液第一次还原：将6ml 0.0164mol/L的HAuCL4水溶液加入200ml双蒸水中，煮沸30分钟，缓慢搅拌并加入50ml 0.016mol/L柠檬酸三钠溶液。以30kHZ的频率超声振荡2分钟，冷却至室温，得到15nm粒径的胶体金原核溶液。
b)氯金酸溶液第二次还原：取第一次还原后得到的胶体金原核溶液26ml在4℃条件下，加入4℃预冷后的0.035mol/L的HAuCL4溶液，缓慢搅拌并以每秒1-2滴的速度滴加4℃预冷后的0.018mol/L的抗坏血酸与0.138g/L PVP混合液，反应1小时至溶液呈现透明酒红色，即得到40nm粒径的胶体金溶液。
、dCas9抗体胶体金预处理
a)将dCas9抗体用0.1M pH7.8的磷酸盐缓冲液稀释至浓度1mg/ml。
b)将1000ml胶体金溶液与含有500u/ml RNA酶抑制剂的100ml0.1M pH7.8的磷酸盐缓冲液混合，快速搅拌3分钟。之后，以每秒1-2滴的速度滴加稀释后的dCas9抗体溶液8ml，缓慢搅拌室温反应5分钟。
c)在上述反应液中快速加入20ml 10wt％的牛血清白蛋白溶液，缓慢搅拌室温反应5分钟。
d)将获得的溶液8000rpm/min离心20分钟，取沉淀，并收集上清，将上清12500rpm/min离心30分钟，取沉淀。将两次沉淀合并用含有0.1wt％BSA的硼酸缓冲液复溶到OD540值为14。
、胶体金纸制备
a)喷金缓冲液制备：在800ml双蒸水中加入100ml 1.0M Tris溶液，调pH至8.5。在溶液中加入3g聚乙二醇20000、2g牛血清白蛋白，2g脱脂牛奶，3g酪蛋白和0.5g叠氮钠，充分溶解，至总体积1000ml。
b)用喷金缓冲液稀释dCas9抗体胶体金，至溶液OD540值为2。
c)取7ml Tween-20，160g蔗糖，用双蒸水定容至1L，配置成玻璃纤维膜预处理液。用每30ml预处理液浸泡玻璃纤维膜261mm*220mm 30分钟后，至37℃干燥；再用OD540值为2的dCas9-gRNA胶体金溶液喷涂玻璃纤维膜，每261mm*220mm的玻璃纤维膜上喷涂20ml，干燥，制得dCas9抗体胶体金纸。
、含检测线及质控线硝酸纤维素膜的制备
将抗抗体用磷酸盐缓冲液稀释成0.5mg/ml,制得质控线(C线)溶液。所述C线上包被的抗抗体是由0.1-5mg/mL的浓度，以1- 10μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在C线上干燥后得到的。
将链酶亲和素定量为0.5mg/ml，制得检测线(T线)溶液。所述T线上包被的链酶亲和素以1-10μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在T线上干燥后得到的；
a)用点膜机喷点C、T线溶液，每1m长硝酸纤维素膜分别包被有1ml的C线和T线溶液，C线和T线间距6mm。
将滤样纸、dCas9抗体胶体金纸片、硝酸纤维素膜、吸水纸依次黏贴在胶板上，切割成宽度为4mm的试剂条。
序列表
<110> 重庆威斯腾前沿生物研究院有限责任公司
<120> 一种dcas9介导检测SARS-CoV-2N基因的免疫层析方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
cagtcaagcc tcttctcgtt cctcatcacg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
cattgccagc cattctagca ggagaagttc 30
<210> 3
<211> 100
<212> RNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
aguucaagaa auucaacucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
Claims (6)
1.一种检测SARS-CoV-2 N基因的免疫层析方法，其特征在于：包括以下几个步骤：
步骤（1），针对SARS-CoV-2 N基因设计特异性引物及sgRNA序列；所述特异性引物的5'端标记生物素，所述sgRNA的识别序列位于扩增产物内部；
步骤（2），利用RPA等温核酸扩增技术，取待测样本RNA，并加入步骤（1）中5' 端标有生物素的特异性引物，进行RT-RPA核酸扩增，得到扩增产物；
步骤（3），结合CRISPR/Cas9系统，在扩增产物里加入dcas9蛋白及步骤（1）中的sgRNA序列进行反应，形成dcas9/sgRNA/SARS-CoV-2 N-biotin蛋白核酸复合物；
步骤（4），将步骤（3）中的反应产物加入免疫层析试纸条，即可判读结果：若试纸条T线和C线均有红色条带，表明是阳性样品；若试纸条C线有带，T线无带，表明是阴性样品；若试纸条C线无带，则检测无效，需要重复检测。
2.如权利要求1所述的一种检测SARS-CoV-2 N基因的免疫层析方法，其特征在于：所述特异性引物F序列为：5’-CAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACG-3’，如SEQ ID NO:1所示；所述特异性引物R序列为：5’-CATTGCCAGCCATTCTAGCAGGAGAAGTTC-3’，如SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求1所述的一种检测SARS-CoV-2 N基因的免疫层析方法，其特征在于：所述sgRNA序列为：
AGUUCAAGAAAUUCAACUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU，如SEQ ID NO:3所示。
4.如权利要求1所述的一种检测SARS-CoV-2 N基因的免疫层析方法，其特征在于：所述步骤（2）中，RT-RPA核酸扩增体系为：10 uM引物F 2.4 ul，10 uM引物R 2.4 ul，RPA-reacting Buffer 29.5 ul，待测样本5 ul，280 nM MgOAC 2.5 ul，100,000U/mLProtoScript RT 1 ul，RNase Free Water 7.2 ul。
5. 如权利要求1所述的一种检测SARS-CoV-2 N基因的免疫层析方法，其特征在于：所述所述步骤（3）中，CRISPR体系为：等温扩增产物 50 ul，100 ng/u dcas9 4-8 ul，100 ng/ul sgRNA 4-8 ul，10X-Reacting Buffer 10 ul，20 U/μL SUPERase•In™ RNaseInhibitor 5 ul，RNase Free Water To 100 ul。
6.一种如权利要求1所述的一种检测SARS-CoV-2 N基因的免疫层析方法，其特征在于：所述步骤（4）中，免疫层析试纸条包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有抗抗体，所述T线上包被有链酶亲和素；所述金标垫中含有胶体金标记的dcas9抗体。
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