CN108396029B

CN108396029B - 一组特异性识别不同生长时期大肠杆菌o157:h7的寡核苷酸适配体

Info

Publication number: CN108396029B
Application number: CN201810190997.XA
Authority: CN
Inventors: 王周平; 邹颖; 段诺
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-03-08
Filing date: 2018-03-08
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2038-03-08
Also published as: CN108396029A

Abstract

本发明公开了一组能特异性识别不同生长时期的大肠杆菌O157:H7的寡核苷酸适配体，属于食品安全生物技术领域。本发明应用Whole cell‑SELEX技术，以不同生长时期的大肠杆菌O157:H7为靶标，经过14轮的反复筛选、亲和力和特异性试验的分析验证，获得了一组针对不同生长时期大肠杆菌O157:H7亲和性和特异性均良好的核酸适配体。该适配体在准确、快速、灵敏检测食品中大肠杆菌O157:H7方面具有广泛的应用前景。

Description

一组特异性识别不同生长时期大肠杆菌O157:H7的寡核苷酸适配体

技术领域

本发明涉及食品安全生物技术领域，尤其是涉及一种利用分子生物学技术中的SELEX技术(即指数富集的配体系统进化技术)筛选能特异性识别不同生长时期大肠杆菌O157:H7的寡核苷酸适配体。

背景技术

大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7，E.coli O157:H7)是肠出血性大肠杆菌(Enteroheamorrhagic Escherichia coli，EHEC)致病性大肠杆菌主要的致病菌株。它是一种无芽孢、有鞭毛、具有较强耐酸性且耐低温的革兰氏阴性杆菌，主要传播方式是被粪便污染的食物。

大肠杆菌0157:H7毒性极强，少于50个病原菌就可传染，表现出血性肠炎、溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等症状，死亡率高。近40年以来，大肠杆菌0157:H7中毒事件频有发生，造成了人员的死亡和大量的经济损失，因此，实现食品中大肠杆菌0157:H7准确、快速、灵敏地检测，对于预防大肠杆菌0157:H7的暴发传染、保障食品安全和保护人类健康都有极其重要的意义。

大肠杆菌O157:H7常用的检测方法包括传统平板分离培养和生理生化鉴别法、ELISA法、PCR法、荧光定量PCR法、基因芯片法等，传统的细菌培养和生化鉴定操作繁琐、耗时；PCR方法虽然快速、准确，但其影响因素复杂，且易受操作条件的影响，重复性差且无法保证其特异性；ELISA法具有特异性强、准确、灵敏的特点，但制备特异性抗体的过程复杂，耗时长，制备出的抗体稳定性差，而且检测仪器昂贵，检测灵敏度低(一般为10⁵cfu/mL)。

适配体是利用指数富集的配基系统进化技术(SELEX)从体外合成的随机核苷酸序列文库中筛选获得能够特异性识别结合靶标的一段短的单链脱氧核糖核苷酸(ssDNA)或核糖核苷酸(RNA)序列，具有靶分子范围广、高亲和力和高特异性、筛选周期短的显著特点，与抗体相比合成方便，成本低，易标记各种功能基团，不易受温度等环境因素影响，可以在长期保存过程保持很好的稳定性。这些独特优势使适配体在化学分析、医药和食品安全等领域具有广阔的应用前景。

Cell-SELEX筛选是一种基于完整细菌细胞为靶物质的筛选方法，将细菌悬浮液通过离心沉淀从而分离出结合和未结合的寡核普酸分子。近几年，已成功采用Cell-SELEX技术筛选出大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌等细菌的适配体，基于Cell-SELEX技术筛选病原致病菌、肿瘤细胞等细胞的适配体已经成为当前的研究热点。

CN106929510A提供了一种大肠杆菌O157:H7的特异性核酸适配体及应用。但是该适配体只能特异性识别对数时期大肠杆菌，并且适配体解离常数K_d为82.45±18.46nM，检测限为90cfu/mL，还不能满足检测要求。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一组特异性识别不同生长时期大肠杆菌O157:H7的寡核苷酸适配体。本发明以不同生长时期的大肠杆菌O157:H7为靶标，采用Cell-SELEX技术筛选出能特异性识别不同生长时期大肠杆菌O157:H7的寡核苷酸适配体，具有稳定性高、合成方便、易标记功能基团等特点，将广泛应用于食品中大肠杆菌O157:H7的快速检测；并且为该核酸适配体在检测食品中、环境中大肠杆菌O157:H7的应用提供科学依据和理论基础。

本发明的技术方案如下：

本申请提供了一组能同时识别调整期、对数期和稳定期的大肠杆菌O157:H7的寡核苷酸适配体，所述适配体的寡核苷酸序列为序列3、序列4所示的寡核苷酸序列。

可以在所述寡核苷酸适配体的5’端或3’端标记FAM、琉基基团、FITC、生物素。

单独或联合使用修饰或不修饰所述寡核苷酸适配体均能用于不同时期大肠杆菌O157:H7的分析检测。

本申请还提供了所述的寡核苷酸适配体在食品和临床医学中检测大肠杆菌O157:H7方面的应用。

本发明有益的技术效果在于：

本发明方法利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以不同生长时期的大肠杆菌O157:H7为靶标，筛选获得两条与靶细胞高亲和性、高特异结合的适配体Apt-4和Apt-5，可以通过荧光基团标记方法将获得的适配体转为检测探针，用于环境样品、食品中大肠杆菌O157:H7的检测，达到快速、准确诊断的目的。

与抗体相比，适配体可在体外筛选，筛选周期短，合成方便，易标记各种功能基团和报告分子，性质稳定，可长期保存使用。本发明序列是从结构显著、与大肠杆菌O157:H7结合具有不同亲和力的9条适配体序列中选取出的亲和力和特异性均较强的适配体序列，能够特异识别三种不同生长阶段(调整期、对数期、稳定期)的大肠杆菌O157:H7。与识别单一生长时期的大肠杆菌O157:H7适配体相比，本发明序列能够识别处于调整期、对数期以及稳定期三种不同时期的大肠杆菌O157:H7，具有靶标范围更广的特点，能够更灵敏地检测出环境中、食品中存在的大肠杆菌O157:H7。

本发明适配体Apt-5的检测限为：调整期检测限为16cfu/mL、对数期检测限为12cfu/mL、稳定期检测限为16cfu/mL。

附图说明

图1为基于Cell-SELEX技术筛选大肠杆菌O157:H7核酸适配体的原理图；

图2为大肠杆菌O157:H7的生长曲线图；

图3为从大肠杆菌O157:H7的9个适配体家族代表性序列中挑选出的5条Kd值较低的适配体二级结构图谱；

图4为大肠杆菌O157:H7适配体Apt-1、Apt-3、Apt-4、Apt-5、Apt-7亲和力饱和结合曲线；

图5为大肠杆菌O157:H7适配体Apt-1、Apt-3、Apt-4、Apt-5、Apt-7的特异性图；

图6为大肠杆菌O157:H7适配体Apt-4、Apt-5与三种不同时期(调整期、对数期、稳定期)的细菌流式分析图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例，通过Cell-SELEX技术筛选高特异亲和的大肠杆菌O157:H7核酸适配体及其快速检出大肠杆菌O157:H7的方法(即图1所示原理和步骤)，对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂、耗材如无特殊说明均未常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1：筛选适配体

1、合成随机单链DNA文库和引物(由美国工Integrated DNA Technologies公司完成)

随机ssDNA文库：

5’-TGA GCC CAA GCC CTG GTA TG-N40-GGC AGG TCT ACT TTG GGA TC-3’

5’羧基荧光素标记上游引物：5’-FAM-TGA GCC CAA GCC CTG GTA TG-3’

5’磷酸化下游引物：5’-P-GAT CCC AAA GTA GAC CTG CC-3’

将随机ssDNA文库和引物均用TE缓冲液配制成100uM贮存液存于-20℃备用。

2、菌种的选取与处理

(1)大肠杆菌O157:H7生长曲线的测定

将大肠杆菌O157:H7置于LB(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.4)液体培养基中培养，37℃，120r/min摇床培养，每隔一段时间测一次菌液的OD值。根据每一段时间的数值作出其生长曲线图(如图2所示)。

(2)菌种的处理

根据大肠杆菌O157:H7的生长曲线，分别取调整期(OD₆₀₀＝0.1)、对数期(OD₆₀₀＝0.3)、稳定期(OD₆₀₀＝1.2)这三个时期的菌液各300μL、500μL、200μL于离心管中，5000r/min，4℃离心5min，弃去上清，用1×结合缓冲液(1×BB)(50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)，5mmol/L KCl，100mmol/L NaCl，1mmol/L MgCl₂)清洗两遍，去除多余的培养基成分。

3、大肠杆菌O157:H7适配体的筛选

(1)ssDNA文库与靶标孵育：第一轮筛选中，ssDNA文库的投入量为1nmol，大肠杆菌为10⁸cfu/mL，孵育前，先将ssDNA文库95℃变性10min，立即冰浴10min，然后与大肠杆菌O157:H7混合，为降低非特异性结合，体系中再加入10倍于文库摩尔数的0.5％牛血清白蛋白(BSA)溶液和过量的转移RNA(tRNA)，在合适体积的结合缓冲液中混匀，37℃，120r/min摇床孵育1h，使ssDNA文库与细菌充分结合。

(2)分离结合与未结合的ssDNA：孵育完成后，5000r/min，4℃离心5min，与目标菌体相结合的ssDNA随着菌体被沉降下来，而未与目标菌体结合的ssDNA则游离在上清中，去除上清，用1×BB清洗两遍，去除与目标菌体结合能力不强的ssDNA。

(3)解离结合的ssDNA：ssDNA与目标菌体的复合物加入300μL的1×PCR缓冲液于95℃变性10min，立即冰浴10min，通过热变性将结合的ssDNA从目标菌体上解离下来，8000r/min，4℃离心5min，上清即为能与目标菌体结合的ssDNA，收集上清作为第一轮适配体库(aptamer pool)。

(4)PCR扩增：以第一轮aptamer pool为模板进行PCR扩增。扩增体系为：ssDNA1μL，浓度为10μLM的上下游引物各0.5μL，浓度为5mM的含Mg²⁺的dNTP1μL，10×PCR buffer5μL，Taq酶0.5μL，用无菌超纯水补足至50μL。PCR扩增先经过95℃变性5min，接着95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，以此条件循环12轮后72℃延伸2min，最后4℃冷却。

(5)聚丙烯酰胺凝胶电泳验证：PCR产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。酶切后的ssDNA产物采用8％变性聚丙烯酰胺凝胶(含7M尿素)进行电泳，使用凝胶成像仪成像，观察电泳条带是否单一明亮，条带是否处在80bp的位置。

(6)PCR产物的纯化及酶切与酶切产物的纯化：PCR产物采用纯化试剂盒纯化，将得到的PCR产物用纯化试剂盒纯化后，取纯化后产物，加入1/10体积的缓冲液和适量核酸外切酶混合均匀，在37℃下反应40min，75℃水浴10min灭酶停止反应。加入1/10体积3mol/L的NaAC并混匀，再加入2倍体积无水乙醇混匀，在-20℃冰箱中沉淀过夜。沉淀后的溶液经4℃，14000rpm离心15min去上清后加入200μL 70％乙醇，上下颠倒洗净沉淀，再在4℃，14000rpm离心15min，去上清，50℃干燥后加入100μL 1×TE缓冲液溶解作为下一轮筛选的文库。

筛选每增加一轮，加入BSA和tRNA溶液的摩尔数增大一倍，直至增大至8倍。为提高筛选适配体的特异性，在第5/9/12轮采用大肠杆菌、福氏痢疾杆菌、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌进行反筛。

4、克隆和测序

将第十四轮筛选得到ssDNA适配体的PCR扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行DNA序列测定，获得32条适配体序列。采用DNAMAN软件和Mfold软件分别分析32条序列的同源性信息和二级结构(如图3所示)。结合两种软件分析结果将序列分为9个家族，从每个家族中选出1条结构稳定，能级较低的序列共9条，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成5’端标记FAM的适配体，用于亲和力和特异性分析。

实施例2：适配体亲和力与特异性测试

(1)测定解离常数

将合成的9条适配体用TE缓冲液配稀释配制成10pmol/L溶液，贮存在-20℃下备用。采用BDFACS Calibur流式细胞分析仪分析9条适配体的亲和性。取不同体积的10pmol/L适配体加入500μLBB结合缓冲液中稀释为不同的浓度梯度(10，50，100，150，200nmol/L)，于95℃变性l0min，立即0℃冷却10min。将适配体溶液加入处理好的大肠杆菌O157:H7中，在37℃下缓慢振荡孵育1h。

然后用BB缓冲液清洗，重悬于500μLBB缓冲液后进行流式细胞分析。流式细胞分析中先调节空白样品(未加适配体)的荧光强度，然后在相同参数下测定样品的前向散射、侧向散射和荧光强度。样品的荧光强度百分比表征亲和性大小，利用GraphPad Prism5软件计算各适配体的解离常数K_d值如下表1所示，并绘制其饱和结合曲线(如图4所示)。

表1

(2)适配体特异性分析

选取与大肠杆菌O157:H7细胞亲和力较强即K_d值较小的5条适配体进行特异性分析，序列分别为Apt-1、Apt-3、Apt-4、Apt-5、Apt-7序列，K_d值分别18.97±1.731、16.44±2.162、15.13±0.8813、9.046±2.086、17.11±0.3174nmol/L。将100pmol Apt-1、Apt-3、Apt-4、Apt-5、Apt-7适配体溶液分别与大肠杆菌O157:H7、大肠杆菌、福氏痢疾杆菌、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌在500μLBB缓冲液中于37℃缓慢振荡孵育1h，然后用BB结合缓冲液清洗，重悬于500μLBB缓冲液中，避光混匀后进行流式细胞分析。结果显示(如图5所示)Apt-4、Apt-5分别与大肠杆菌O157:H7的结合率都接近80％，且与其他细菌的结合率较低，综合以上考虑，选择Apt-4和Apt-5这两条作为能够高特异结合大肠杆菌O157:H7的适配体。

(3)适配体分别与三种不同生长阶段的大肠杆菌O157:H7亲和力分析

选取经上述实验亲和力特异性均较好适配体，取相同体积分别与调整期(OD₆₀₀＝0.1)、对数期(OD₆₀₀＝0.3)、稳定期(OD₆₀₀＝1.2)这三个时期的菌液在500μLBB缓冲液中于37℃缓慢振荡孵育1h，然后用BB结合缓冲液清洗，重悬于500μLBB缓冲液中，避光混匀后进行流式细胞分析。结果显示(如图6所示)Apt-4、Apt-5与三种时期的大肠杆菌O157:H7均有较高的结合率。

因此通过SELEX技术筛选出的大肠杆菌O157:H7的适配体Apt-4和Apt-5都具有高亲和性和高特异性，且能识别三种不同生长阶段的大肠杆菌O157:H7，为大肠杆菌O157:H7快速、准确、灵敏检测提供重要基础，具有广泛的应用前景。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一组特异性识别不同生长时期大肠杆菌O157:H7的寡核苷酸适配体

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Apt-1

<400> 1

TGAGCCCAAG CCCTGGTATG TTACAGTATG CTACCTCTAC TTGAAGGTTG GTCGACGCGG 60

GGCAGGTCTA CTTTGGGATC 80

<210> 2

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Apt-3

<400> 2

TGAGCCCAAG CCCTGGTATG TAGTAATGGT GCGTACAGGC GACGGGGTCC AGGCTGGAGG 60

GGCAGGTCTA CTTTGGGATC 80

<210> 3

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Apt-4

<400> 3

TGAGCCCAAG CCCTGGTATG AGCCCACGGA ACACTGGTCGC GCCCACTGGT TTCTATATT 60

GGCAGGTCTA CTTTGGGATC 80

<210> 4

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Apt-5

<400> 4

TGAGCCCAAG CCCTGGTATG CGGATAACGA GGTATTCACG ACTGGTCGTC AGGTATGGTT 60

GGCAGGTCTA CTTTGGGATC 80

<210> 5

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Apt-7

<400> 5

TGAGCCCAAG CCCTGGTATG TGTGGGGTCC TGGATTATGT TTAGCGTCTT TCGCAGTGGG 60

GGCAGGTCTA CTTTGGGATC 80

Claims

1.能同时识别调整期、对数期和稳定期的大肠杆菌O157:H7的寡核苷酸适配体，其特征在于所述适配体的序列为序列3或序列4所示的寡核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的寡核苷酸适配体，其特征在于所述寡核苷酸适配体5’端或3’端标记FAM、琉基基团、FITC或生物素。

3.根据权利要求1所述的寡核苷酸适配体，其特征还在于单独或联合使用修饰或不修饰适配体均能用于不同时期大肠杆菌O157:H7的分析检测。

4.权利要求1中所述的寡核苷酸适配体在制备用于食品和临床医学中检测大肠杆菌O157:H7的试剂中的应用。