CN110093350B

CN110093350B - 一种特异性识别副溶血性弧菌的优化适配体序列及其应用

Info

Publication number: CN110093350B
Application number: CN201910042343.7A
Authority: CN
Inventors: 王周平; 孙羽菡; 段诺
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-01-17
Filing date: 2019-01-17
Publication date: 2022-10-18
Anticipated expiration: 2039-01-17
Also published as: CN110093350A

Abstract

本发明公开了一种能特异性识别副溶血性弧菌的适配体，所述适配体的核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示。本发明以副溶血性弧菌为靶标，在SELEX筛选获得的原始序列的基础上，结合剪裁，定向突变，以及LNA取代等手段，获得了能以高亲和力及特异性识别结合副溶血性弧菌的优化适配体序列，并将最优适配体用于样品中副溶血性弧菌的分离富集。本发明为副溶血性弧菌的检测提供了稳定性良好、亲和力高、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件和应用实例。

Description

一种特异性识别副溶血性弧菌的优化适配体序列及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种特异性识别副溶血性弧菌的优化适配体序列及其应用。

背景技术

副溶血性弧菌是一种兼性厌氧、嗜盐畏酸不耐热的革兰氏阴性菌，广泛分布于海水、海底沉积物及各类海产品中，如今在淡水养殖鱼类的肠道和鳃中也分离出此菌，是一种广受关注的重要的食源性致病菌，可通过生食或食用加工不彻底的水产品摄入人体内，导致食用者罹患急性肠胃炎，严重的还会引起原发性败血症危及性命。在中国，副溶血性弧菌引发的细菌性食物中毒案例已超过沙门氏菌而中居首位。随着全球变暖，海水温度不断升高，这直接导致副溶血性弧菌的进一步扩散和增殖，给海产品品质和人类健康带来严重威胁。因此，实现食品中副溶血性弧菌准确、快速和灵敏的检测，对于保障食品安全和保护人类健康都有极其重要的意义。

常用的检测副溶血性弧菌的方法包括传统平板分离培养和生理生化鉴别法、ELISA法、PCR法、荧光定量PCR法、电化学传感器法等，然而传统的细菌培养和生化鉴定工作量大，操作繁琐且耗时；ELISA法虽有良好的特异性、准确性及较高的灵敏度，但制备特异性抗体的过程仍然繁琐且耗时，制备出的抗体稳定性差，且检测仪器较为昂贵；PCR方法虽然快速、准确，但易受实验操作及周围环境的影响，无法保证其重复性及特异性。

适配体是利用指数富集的配基系统进化技术(SELEX)对人工合成的随机核苷酸序列文库进行体外筛选后获得的，能够特异性识别结合靶标的一段短的单链核苷酸序列，具有筛选周期短，亲和性高，特异性好，靶标范围广，且成本低廉等显著优点。与抗体相比合成方便，易于修饰，性能稳定，且易于保存。这些特点使得适配体在药物递送，医学诊断，食品安全等领域具有无可匹敌的优势，且已被广泛用作各类生物传感器的识别元件。

然而由SELEX过程产生的全长适配体序列含有70-100个核苷酸，其两端均包含一段用于PCR扩增的固定引物区，这部分区域的核苷酸通常并不参与靶标的识别与结合，这种非必需的核苷酸同样可能出现在序列随机区中，它们可能形成各种二级结构从而降低适配体的靶结合构象稳定性，且较长的序列会带来较低的产率和较高的合成成本。因此，在实际使用中，在保留适配体亲和性能的前提下，获得适配体最短序列大有裨益。此外，PCR扩增偏差和由实验操作导致的文库多样性降低也可能影响适配体的结合特性。所以除剪裁外，其他 SELEX后优化方法，例如随机或定点突变，锁核酸(LNA)取代，以及多价适配体等也被采用，以提高适配体的性能。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种特异性识别副溶血性弧菌的优化适配体序列及其应用。本发明以副溶血性弧菌为靶标，在SELEX 筛选获得的原始序列的基础上，结合剪裁，定向突变，以及LNA取代等手段，获得了能以高亲和力及特异性识别结合副溶血性弧菌的优化适配体序列，并将最优适配体用于样品中副溶血性弧菌的分离富集。本发明为副溶血性弧菌的检测提供了稳定性良好、亲和力高、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件和应用实例。

本发明的技术方案如下：

一种能特异性识别副溶血性弧菌的适配体，所述适配体的核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示。

一种能特异性识别副溶血性弧菌的适配体，还包含使用LNA进行末端修饰的适配体。

一种能特异性识别副溶血性弧菌的适配体，还包含可提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，或用于形成组合物的亲和配基、巯基修饰基。

一种能特异性识别副溶血性弧菌的适配体的应用，用于食品或临床医学中检测副溶血性弧菌。

本发明的目的是提供一种新的优化的适配体，其合成、处理、表征操作如下：

1.适配体的合成

由上海生工生物工程技术服务有限公司合成5’端FAM基团标记的适配体，用于亲和特性分析，合成无标记适配体序列用于稳定性分析，合成生物素化适配体用于捕获样品中副溶血性弧菌。

2.菌种的处理

取对数期(OD₆₀₀＝0.3)的菌液1mL于离心管中，5000r/min，4℃离心5min，弃去上清，用1×结合缓冲液(1×BB)(50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)，5mmol/L KCl，100mmol/LNaCl，1mmol/L MgCl₂)清洗两遍，去除多余的培养基成分。

3.适配体序列的表征

(1)适配体亲和力分析

将合成的适配体用TE缓冲液配稀释配制成100μM溶液，贮存在-20℃下备用。采用BDFACS Calibur流式细胞分析仪分析适配体的亲和性。取不同体积的 100μM适配体加入500μL BB缓冲液中稀释为不同的浓度梯度(0，25，50，100， 125，200nmol/L)，于95℃变性8min，立即冰浴冷却8min。将适配体溶液加入处理好的副溶血性弧菌中，在37℃下缓慢振荡孵育45min。

然后用BB缓冲液清洗，重悬于500μL BB缓冲液后进行流式细胞分析。流式细胞分析中先调节空白样品(未添加适配体)的荧光强度，然后在相同参数下测定样品的前向散射、侧向散射和荧光强度。样品的荧光强度百分比表征亲和性大小，利用GraphPad Prism5软件计算各适配体的解离常数K_d值并绘制其饱和结合曲线。

(2)适配体特异性分析

将100pmol适配体溶液分别与副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、福氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、和蜡样芽孢杆菌在500μLBB 缓冲液中于37℃缓慢振荡孵育45min，然后用BB缓冲液清洗，重悬于500μL BB缓冲液中，避光混匀后进行流式细胞分析。

(3)适配体稳定性分析

候选适配体95℃变性8min，立即冰浴8min，并加入100μL(0.5％)BSA 以降低非特异性结合(600μL体系)，然后将这些序列与副溶血性弧菌(10⁸ cfu/mL)于室温下分别孵育240，360，480，600，720，840min，往适配体与目标菌体的复合物中加入100μL的1×PCR缓冲液于95℃变性8min，立即冰浴8min，通过热变性将结合上的适配体从目标菌体上解离下来，8000r/min，4℃离心5min，收集上清。所有样品同时进行2％琼脂糖凝胶电泳，观察谱带强度降至空白对照的一半的孵育时间，将此时间定义为其半衰期。

本发明方法以副溶血性弧菌为靶标，在SELEX筛选获得的原始适配体序列的基础上，利用剪裁和定向突变获得1条与靶细胞高亲和性、高特异性结合的适配体A4，在其3’末端使用LNA取代三个核苷酸后，可在保持其亲和特性的同时，获得理想的稳定性。在此基础上，将该适配体序列结合磁性纳米颗粒 (MNP)，可特异性分离富集样品中的副溶血性弧菌。该适配体是副溶血性弧菌的新型识别元件，具有灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的优势，并能应用于多种检测方法的构建。

本发明有益的技术效果在于：

(1)本发明适配体与抗体相比，适配体可在体外筛选，筛选周期短，合成方便，易标记各种功能基团和报告分子，性质稳定，可长期保存使用；

(2)本发明适配体序列是基于原始序列的二级结构，通过剪裁，定向突变，以及LNA取代等手段获得的亲和力和特异性均较强的适配体序列，能够特异识别副溶血性弧菌；

(3)与筛选获得的原始副溶血性弧菌适配体相比，本发明适配体序列具有理想的亲和力，良好的特异性，更强的稳定性，更高的产率，以及较低的合成成本，能够更灵敏地检测、分离出环境、食品中存在的副溶血性弧菌。

附图说明

图1是通过剪裁和定点突变获得的副溶血性弧菌适配体的二级结构图谱；

图2是剪裁和定点突变获得的适配体的亲和力饱和结合曲线；

图3是剪裁和定点突变获得的适配体的特异性图；

图4是通过LNA取代获得的副溶血性弧菌适配体的二级结构图谱；

图5是通过LNA取代获得的适配体的特异性图；

图6是通过LNA取代获得的适配体的亲和力饱和结合曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1适配体序列的剪裁和定向突变

剪裁和定向突变序列二级结构如图1所示。A3P是通过SELEX技术筛选得到的副溶血性弧菌原始适配体序列，包含87个碱基，在其基础上去除两端引物区，获得序列A1(SEQ.ID.No.2)。考虑到A1的结构也相对较为复杂，在其两端分别裁剪部分核苷酸获得序列A2(SEQ.ID.No.3)。观察到A2序列的茎部区域存在碱基错配现象，且据报道碱基错配可能会影响适配体二级结构的稳定性，影响适配体的亲和性能，所以对A2的茎部进行定向突变，使其完全碱基互补配对产生A3(SEQ.ID.No.4)。在A3的5’和3’端分别裁剪一个核苷酸，获得序列 A4(SEQ.ID.No.1)。此后在A4的基础上继续进行两端同时剪裁获得序列A5(SEQ.ID.No.5)和A6(SEQ.ID.No.6)。

序列饱和结合曲线如图2所示，各序列K_d值总结于下表1。序列A4(SEQ.ID. No.1)具有最小的K_d值，即对靶标副溶血性弧菌具有最佳的亲和性，且较原序列A3P而言，K_d值从50.76±8.92nM降低到28.65±3.05nM，亲和力大大提高；在对序列A2进行单碱基定向突变后，序列的亲和力有所提高；序列A5和A6 的亲和力则明显较差，远低于原始序列。

表1

特异性测定结果如图3所示，由图3可以看出A1、A2、A3和A4分别与副溶血性弧菌的结合率都接近或超过80％，与其他细菌的结合率都在20％以内；而序列A5和A6与副溶血性弧菌的结合率则在40％左右，和福氏痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌的结合率也较高，超过了20％；综合以上考虑，选择在保持序列亲和特性的前提下具有最少碱基数的A4作为能够高特异结合副溶血性弧菌的适配体序列进行后续实验。

实施例2适配体序列的LNA取代

在通过剪裁获得的最优序列A4(SEQ.ID.No.1)的基础上，对其茎部区域进行LNA取代，以期获得具备良好亲和特性及理想稳定性的适配体序列。首先在 A4的茎部末端分别用LNA取代一对，两对，及三对核苷酸依次获得A4-1(A4 的第1和21位碱基进行LNA取代)，A4-2(A4的第1、2、20和21位碱基进行LNA取代)和A4-3(A4的第1，2，3，19，20和21位碱基进行LNA取代)，序列二级结构如图4所示。虽然他们的特异性结果(图5所示)较为理想，但亲和力结果(饱和结合曲线如图6所示，K_d值总结于下表2)显示这三条序列的 K_d值处于同一数量级，且亲和力明显小于原始序列A4。重点关注表3中该组序列的稳定性结果，发现较于A4，仅取代一对核苷酸的序列A4-1的半衰期并没有明显变化，仍为480min；取代两对核苷酸后，A4-2的半衰期延长到了600min；而当序列中三对核苷酸被同时取代时，序列半衰期更是达到了840min。

考虑其他的LNA取代形式。对序列A4的3’和5’末端，分别进行三个连续核苷酸的LNA取代，依次获得A4-4(A4的第19，20和21位碱基进行LNA取代)和A4-5(A4的第1，2和3位碱基进行LNA取代)。他们的亲和力结果显示，3’末端被LNA取代的A4-4对靶标的亲和力极佳，与序列A4相当；此外其特异性结果也很理想；重点在于其稳定性方面得到了明显改善，相较于A4，A4-4 的半衰期显著延长至600min，已能满足大部分现实场景下快速检测环境和食品中副溶血性弧菌的实际需求。而5’末端被LNA取代的A4-5，虽特异性和稳定性方面与A4-4基本一致，亲和力结果却并不令人满意，K_d值为470.4±47.32nM，远高于原始序列。

表2

表3

因此，通过剪裁和定点突变获得了能特异性识别副溶血性弧菌的序列A4(SEQ.ID.No.1)，具有极佳的亲和力与特异性，在其3’末端使用LNA取代三个核苷酸后，可在保持其亲和特性的同时，使其稳定性显著提高，足以满足大部分场景下的现实需求，为副溶血性弧菌快速、准确、灵敏检测提供重要基础。

实施例3适配体功能化磁珠捕获样品中副溶血性弧菌的应用

(1)适配体功能化磁珠的制备

将链霉亲和素修饰的磁珠洗涤并重悬于2×B&W缓冲液中至终浓度为5 mg/mL。将等体积生物素化的优化适配体加入到磁珠悬浮液中至终浓度为1μM，随后在37℃温育10min。使用外加磁场收集磁珠并用1×B&W缓冲液洗涤两次以去除体系中过量的适配体。将适配体包被的磁珠于PBS缓冲液中在4℃下保存以备将来使用。

(2)适配体功能化磁珠对不同细菌捕获效率的测定

取1mL对数期(OD₆₀₀＝0.3)的细菌菌液于离心管中，梯度稀释至合适浓度。将制备的适配体包被的磁珠(0.1mg)用1×B&W缓冲液洗涤两次并加入稀释菌液中，于37℃下缓慢震荡孵育1h。孵育后，借助外部磁场分离、分别收集磁珠捕获的细菌以及上清液中未捕获的细菌，并将捕获的细菌再次分散于1×BB 缓冲液中。通过在显微镜下分别三次计数5μL的菌悬液以及收集的上清液中包含的细菌数目来确定磁珠的捕获效率。捕获效率＝捕获细菌数/(捕获细菌数+上清中细菌数)*100％。

表4

由表4结果可见，该适配体功能化磁珠对样品中副溶血性弧菌的捕获效率为70.67±8.65％，而对其他菌种的捕获效率均不超过20％，具有良好的特异性，可有效分离富集样品中的副溶血性弧菌，为将该优化适配体序列应用于其他检测方法中提供了可行性验证，具有广泛的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种特异性识别副溶血性弧菌的优化适配体序列及其应用

<130> 1

<141> 2019-01-15

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> A4

<400> 1

caacgaaaca gtgactcgtt g 21

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> A1

<400> 2

ctaaaaatgg gcaaagaaac agtgactcgt tga 33

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> A2

<400> 3

gcaaagaaac agtgactcgt tga 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> A3

<400> 4

gcaacgaaac agtgactcgt tga 23

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> A5

<400> 5

aacgaaacag tgactcgtt 19

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> A6

<400> 6

acgaaacagt gactcgt 17

Claims

1.一种能特异性识别副溶血性弧菌的适配体，其特征在于，所述适配体的核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示。

2.根据权利要求1所述的适配体，其特征在于，所述适配体的第19，20和21位碱基进行LNA取代。

3.根据权利要求1所述的适配体，其特征在于，还包含可提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，或用于形成组合物的亲和配基、巯基修饰基。

4.一种权利要求1～3任一项所述适配体的应用，其特征在于，用于食品中检测副溶血性弧菌。