CN108120703A - 一种生物传感器及其检测副溶血性弧菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于适配体识别量子点标记分子马达生物传感检测副溶血性弧菌的方法。通过将pH敏感型量子点荧光纳米材料标记在载色体表面作为为信号探针，特异性识别副溶血性弧菌的适配体为识别探针。利用“ε亚基抗体‑生物素‑亲和素‑5’端生物素化的副溶血性弧菌适配体”系统将识别探针与F0F1‑ATPase分子马达连接构建F0F1‑ATPase分子马达适配体传感系统。该方法对于副溶血性弧菌的最低检测限可达到7cfu/mL，且可应用于虾肉样品中副溶血性弧菌的检测，结果准确可靠。

Description

一种生物传感器及其检测副溶血性弧菌的方法

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，尤其是涉及一种基于适配体-量子点-分子马达生物传感器检测副溶血性弧菌的方法。

背景技术

副溶血性弧菌是一种嗜盐性细菌，广泛存在于虾蟹、贝类等海产品以及海水和海底沉积物中。人们误食了被副溶血性弧菌感染的食物后会引发急性胃肠炎、腹泻、败血症等，对人们的身体健康造成巨大危害。目前由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件已超越沙门氏菌中毒事件，特别是在沿海地区，由副溶血性弧菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的60％以上，由副溶血性弧菌引发的食源性疾病爆发是当前面临的重要公共卫生问题之一。鉴于此我国制定了对水产制品、水产调味品中副溶血性弧菌数量的限量标准，为n＝5，c＝1，m＝100cfu/g(mL)，M＝1000cfu/g(mL)。因此建立准确、灵敏、快速的副溶血性弧菌检测技术对于保障食品安全具有重要意义。

目前常规用于副溶血性弧菌的检测方法，主要有传统的微生物检验技术、分子生物学技术和免疫学检测方法等。传统的检测方法耗时长，操作繁琐，已无法满足食品安全检测快速、简便的要求；分子生物学技术虽然能缩短检验时间，但前期需要提取细菌总DNA，检测对象为目的DNA而不是菌体本身，检测结果需进行数据转换；免疫学方法具有特异性强、灵敏度高、易于观察等优点，但抗体作为识别分子易受外界条件影响，稳定性低。为了克服以上缺陷，迫切需要发展灵敏、特异、快速和简便的检测手段来监控副溶血性弧菌，以保障人们的食品安全。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种生物传感器及其检测副溶血性弧菌的方法。本方法灵敏度高、特异性强、操作方便，在食品安全检测领域将具有广阔的应用前景。

本发明的技术方案如下：

一种生物传感器，通过将pH敏感型量子点荧光纳米材料标记在载色体表面作为为信号探针，特异性识别副溶血性弧菌的适配体为识别探针，构建适配体-量子点-分子马达生物传感系统。

所述的生物传感器的具体制备方法为：

(1)从深红红螺菌中提取得到载色体，该载色体含有F0F1-ATPase分子马达；

(2)将pH敏感型量子点荧光纳米材料标记在载色体表面作为为信号探针；所述pH敏感型荧光量子点的激发波长585nm，发射波长610nm。

(3)以特异性识别副溶血性弧菌的适配体为识别探针，通过ε亚基抗体-生物素-亲和素-5’端生物素化的副溶血性弧菌适配体系统将识别探针与F0F1-ATPase分子马达连接，构建得到F0F1-ATPase分子马达适配体生物传感器。

本发明有益的技术效果在于：

本发明所检测对象为副溶血性弧菌菌体本身，所采用的识别分子为能特异性结合副溶血性弧菌整体菌的适配体，通过适配体空间结构与副溶血性弧菌的契合实现识别与捕获。当体系中存在副溶血性弧菌时，适配体特异性与副溶血性弧菌结合，使得F0F1-ATPase的负荷增加，引起旋转速度下降，ATP合成速率减慢，从而导致泵出载色体外的质子流速下降，载色体外H⁺浓度减小，继而引起pH值升高，量子点荧光强度随之增强。

以585nm进行激发，测定610nm处荧光信号强度，通过监测荧光强度的变化实现对副溶血性弧菌的检测。通过对不同浓度的副溶血性弧菌的检测，建立标准曲线，达到对含副溶血性弧菌样品进行定量检测的目的。具体检测原理如图1所示。

本发明以适配体作为识别元件，相比于免疫分析法中使用抗体作为识别元件，适配体稳定性好，制备成本低，易于标记且标记后不影响其活性，同时对目标菌体具有高度亲和力和高度选择性，在很大程度上提高了检测的准确性。

本发明以整体菌作为检测对象，相比于检测细菌DNA，本方法更加准确，便捷。本发明将适配体与分子马达联用，构建适配体-F0F1-ATPase分子马达生物传感器，用于副溶血性弧菌的检测，可大大缩短检出时间，具有快速、经济等优点，具有广阔的应用前景。

本发明中利用量子点作为分子马达转动速率变化的指示信号，较之于有机染料，量子点具有量子产率高，光稳定性好的优势，能实现对副溶血性弧菌高灵敏检测，其检测限可达到7cfu/mL。

附图说明

图1为本发明生物传感器检测副溶血性弧菌的方法的原理示意图；

图2为量子点荧光强度与pH值的关系图；

图3为不同浓度副溶血性弧菌引起的荧光强度变化光谱图；

图4为相对荧光强度与副溶血性弧菌浓度的线性关系图；

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述，但不能作为对本发明的限定。

实施例1：生物传感器的制备

(1)载色体的制备：

采用胰蛋白胨大豆液体培养基培养深红红螺菌ATCC 11170(购自美国菌种保藏中心)，于26℃，静置培养72h。然后于4℃，5000r/min离心30min收集菌体。用提取缓冲液(20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，100mmol/L NaCl，2mmol/L MgCl₂，1mmol/L DTT)重悬菌体，4℃，8000r/min离心10min，除去上清液。沉淀用上述提取缓冲液重悬(约1g加入10mL提取缓冲液)，再加入PMSF(终浓度为1mmol/L)，于冰上超声破碎30min。将破碎菌体于4℃，25000r/min离心90min，取上清液继续于4℃，50000r/min离心90min，沉淀即为载色体，该载色体含有F0F1-ATPase分子马达。

(2)荧光量子点标记载色体的制备：

取200μL上述制备所得载色体于离心管中，加入100μL荧光量子点(1×10¹⁵/μL)混匀，室温避光孵育1.5h，于4℃，15000r/min离心30min，收集沉淀，用PBS重复清洗沉淀3次以去除多余的荧光量子点。最后将沉淀重悬于300μL PBS中，即为荧光量子点标记的载色体。

(3)生物素标记ε亚基抗体的制备：

取生物素(2μmol/L)和ε亚基抗体(0.1mg/mL)按1:10的体积比混合，室温孵育30min，即制备得到生物素标记ε亚基抗体。

(4)分子马达适配体传感器的构建：

取300μL荧光量子点标记的载色体于离心管中，加入上述制备所得生物素标记的ε亚基抗体(40μL)，加入PBS缓冲液补足1mL，37℃孵育1h，然后于4℃，15000r/min离心30min，弃上清液，沉淀重悬于500μL PBS中；加入2μL亲和素(1mg/mL)，加入PBS缓冲液补足1mL，室温下缓慢振摇反应3h，然后于4℃，15000r/min离心30min，弃上清液，沉淀重悬于500μL PBS中；加入50μL生物素修饰的副溶血性弧菌适配体(10μM)(序列为：5’-biotin-TCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACT-3’)，加入PBS缓冲液补足1mL，室温下缓慢振摇反应1h，然后于4℃，15000r/min离心30min，弃上清液，沉淀重悬于300μL PBS中，即制备得适配体-分子马达复合物。

(5)检测体系pH值：

本发明中选用的量子点为pH敏感型量子点。如图2所示，在pH值6.0～9.0之间，量子点荧光强度随pH值的增加而增强；同时考虑到适配体与目标物的最佳结合环境为中性偏碱，因此在本发明中所采用的缓冲液其pH值为8.0。

(6)副溶血性弧菌的检测：

取不同浓度的副溶血性弧菌菌液，加入至适配体-分子马达复合物中进行孵育，然后加入ATP合成缓冲液启动反应。当体系中存在副溶血性弧菌时，适配体特异性与副溶血性弧菌结合，使得F0F1-ATPase的负荷增加，引起旋转速度下降，ATP合成速率减慢，从而导致泵出载色体外的质子流速下降，载色体外H+浓度减小，继而引起pH值升高，量子点荧光强度随之增强，从而通过监测荧光强度的变化实现对副溶血性弧菌的检测。

实施例2：副溶血性弧菌标准检测曲线的建立

取300μL适配体-分子马达复合物，加入100μL不同浓度的副溶血性弧菌菌液，于37℃孵育1h，然后于4℃，15000r/min离心30min，弃上清液；加入30μL ATP合成缓冲液(0.1mM三甲基甘氨酸，10％丙三醇，5mM NaH₂PO₄，5mM MgCl₂，ADP 0.35mM，NADH 2mM，pH 9.0)于37℃孵育10min，接着加入450μL PBS，混合均匀，测定荧光强度(激发波长585nm，发射波长610nm)。如图3所示，当体系中不存在目标菌种时，分子马达F0F1-ATPase的负荷没有变化，因此此时荧光强度最小；当体系中存在副溶血性弧菌时，适配体特异性与副溶血性弧菌结合，使得F0F1-ATPase的负荷增加，引起旋转速度下降，ATP合成速率减慢，从而导致泵出载色体外的质子流速下降，载色体外H+浓度减小，继而引起pH值升高，量子点荧光强度随之增强。如图4所示，副溶血性弧菌在1.4×10¹to 1.4×10⁶cfu/mL浓度范围内，与610nm处相对荧光强度呈良好的线性关系，线性方程为y＝134.25x-85.809(R²＝0.9936)，最低检出限为7cfu/mL。

实施例3：虾肉样品中副溶血性弧菌的检测

从本地超市购买新鲜虾，以无菌操作打开外壳，取虾肉样品25g绞碎，与225mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水混合均质10min，然后用0.45μm滤膜过滤，取上清液200μL至离心管作为实际样品，共取4个样品，加入已知浓度的副溶血性弧菌(该浓度为平板计数法所得)，接着加入300μL适配体-分子马达复合物，于37℃孵育1h，然后于4℃，15000r/min离心30min，弃上清液；加入30μL ATP合成缓冲液(0.1mM三甲基甘氨酸，10％丙三醇，5mM NaH₂PO₄，5mMMgCl₂，0.35mM ADP，2mM NADH，pH 9.0)于37℃孵育30min，接着加入470μL PBS，混合均匀，测定荧光强度(激发波长585nm，发射波长610nm)。结果如表1所示，本发明方法得出的检测结果与平板计数法无显著差异，回收率在92％～102％之间。

表1虾肉样品中副溶血性弧菌的检测结果

实施例4：本发明检测方法的灵敏度

将实施例3的NO.1样品(即加入了2.0×10²cfu/mL浓度的副溶血性弧菌的待测液)分别稀释5倍、10倍、20倍，用本发明生物传感器测定荧光强度(激发波长585nm，发射波长610nm)。结果如表2所示。

表2

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种生物传感器，其特征在于：通过将pH敏感型量子点荧光纳米材料标记在载色体表面作为为信号探针，特异性识别副溶血性弧菌的适配体为识别探针，构建适配体-量子点-分子马达生物传感系统。

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于具体制备方法为：

(1)从深红红螺菌中提取得到载色体，该载色体含有F0F1-ATPase分子马达；

(2)将pH敏感型量子点荧光纳米材料标记在载色体表面作为为信号探针；

(3)以特异性识别副溶血性弧菌的适配体为识别探针，通过ε亚基抗体-生物素-亲和素-5’端生物素化的副溶血性弧菌适配体系统将识别探针与F0F1-ATPase分子马达连接，构建得到F0F1-ATPase分子马达适配体生物传感器。

3.根据权利要求1或2所述的生物传感器，其特征在于所述pH敏感型荧光量子点的激发波长585nm，发射波长610nm。