CN105466896A - 核酸适配体功能化磁纳米颗粒分离富集-激光诱导荧光检测金黄色葡萄球菌 - Google Patents

核酸适配体功能化磁纳米颗粒分离富集-激光诱导荧光检测金黄色葡萄球菌 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种核酸适配体功能化磁纳米颗粒分离富集金黄色葡萄球菌并利用激光诱导荧光技术在线检测的方法。本方法以核酸适配体修饰磁纳米颗粒作为捕获探针，加入金黄色葡萄球菌，以另一条荧光标记的核酸适配体为信号探针形成夹心结构。采用毛细管为分离通道、流体拖曳力为驱动力，通过恒定磁场实现分离富集，激光诱导荧光在线荧光检测，根据荧光峰面积变化对金黄色葡萄菌进行定量分析。本发明为金黄色葡萄球菌的检测提供了一种新方法，具有灵敏度高、操作简单、检测周期短和检测限低等优点。

Description

核酸适配体功能化磁纳米颗粒分离富集-激光诱导荧光检测金黄色葡萄球菌
技术领域：
本发明属于食品安全和医疗诊断领域，具体涉及一种核酸适配体修饰磁纳米粒子分离富集金黄色葡萄球菌并利用激光诱导荧光在线检测的方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一种革兰氏阳性致病菌，分布广泛，存在于空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。国内外多起由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件使得人们更加关注致病菌的检测。2011年，我国卫生部实施《食品安全国家标准速冻面米制品》(GB19295－2011)，允许金葡菌限量存在。因此，建立快速有效的金黄色葡萄球菌检测技术对食品安全具有重要意义。
目前金黄色葡萄球菌的检测方法主要包括传统的培养方法和近年发展起来的快速检测方法。传统的培养方法主要是根据国标法对细菌进行分离培养和生化鉴别。但是此方法耗时且灵敏度低，很难满足现今评价食品中微生物安全性的要求。近年来，人们采用免疫学、生物传感和分子生物学等先进技术对食品中致病微生物进行快速检测方法的研究，包括纸片法、PCR技术、酶联免疫吸附法等。
核酸适配体是通过指数富集配体的系统进化技术(SELEX)筛选，针对目标物具有高亲和力和特异性的核苷酸序列片段。与抗体相比，适配体具有靶标更广泛、易于合成和化学修饰、稳定性好和可扩增等优点。磁纳米材料在磁场作用下能实现分离以及对样品的富集，可有效提高分析检测的灵敏度和准确性。近年来，许多研究将磁纳米材料结合核酸适配体应用于致病菌的检测。但是其中一些存在检测灵敏度低、检测时间长及操作复杂等问题。
激光诱导荧光技术是指检测激光照射样品后的荧光发射的方法，具有时间响应快、灵敏度高、干扰小等优点。因此，有必要建立一种核酸适配体功能化磁纳米颗粒分离富集金黄色葡萄球菌并利用激光诱导荧光技术在线灵敏检测的方法。
发明内容：
本发明目的在于提供一种核酸适配体功能化磁纳米颗粒分离富集金黄色葡萄球菌，并利用激光诱导荧光在线的方法。本发明采用的技术方案为：将金黄色葡萄球菌适配体修饰在磁纳米颗粒表面，该材料可以快速识别并捕获待测样品中的金黄色葡萄球菌；再将捕捉到的金黄色葡萄球菌与FAM标记的适配体进行结合，实现夹心结构的荧光标记；将磁纳米-金黄色葡萄球菌-FAM夹心结构复合体注射入毛细管中，利用磁场进行富集；撤掉磁场，以恒定流速推动复合体通过激光诱导荧光检测池得到一定荧光峰面积；在一定范围内金黄色葡萄球菌的浓度与荧光峰面积的趋势呈线性相关，以达到对金黄色葡萄球菌定量检测的目的。
具体步骤为：
(1)制备核酸适配体功能化的磁纳米颗粒
取500μL氨基化三氧化二铁于离心管中，加入1.5mL戊二醛PB溶液避光反应2h，再PB缓冲液清洗3次。然后加入适量亲和素室温震荡孵育6h，用超纯水清洗3次，得到亲和素功能化磁纳米颗粒。再取240μL上述亲和素功能化磁纳米超声分散20min，加入10μL生物素化核酸适配体，室温震荡孵育30min，用TE缓冲液清洗3次后得到核酸适配体功能化的磁纳米颗粒。
(2)激光诱导荧光在线检测金黄色葡萄球菌
取30μL核酸适配体功能化的磁纳米颗粒加入等体积FAM标记的核酸适配体和金黄色葡萄球菌菌悬液，室温振荡孵育30min，利用泵将混合物注射入毛细管中，加恒定磁场进行分离富集，然后撤掉磁场，继续以恒定流速将复合体推入激光诱导荧光检测池中进行荧光检测，得到一定荧光峰面积值。
取30μL核酸适配体功能化的磁纳米颗粒加入等体积FAM标记的核酸适配体和金黄色葡萄球菌菌悬液，再加入480μLTE缓冲液，使反应体系体积增大，即金黄色葡萄球菌稀释5倍，如上述方法进行检测，得到一定荧光峰面积值与金黄色葡萄球菌浓度呈线性相关，可对其进行定量检测。
本发明与现有技术相比，其显著优点是：
(1)核酸适配体修饰磁纳米颗粒特异性识别金黄色葡萄球菌并对其进行分离富集，提高了检测的准确性、稳定性和方法的特异性。
(2)结合激光诱导荧光检测技术实现在线检测，背景信号低，提高了检测方法的灵敏度并缩短了检测时间。
(3)对金黄色葡萄球菌的检测限较低，达到3CFU/mL。
附图说明：
附图1为：金黄色葡萄球菌在线检测示意图。
附图2为：核酸适配体功能化磁纳米颗粒捕获金黄色葡萄球菌TEM表征图：(a)磁纳米颗粒(b)磁纳米颗粒结合金黄色葡萄球菌。
附图3为：金黄色葡萄球菌检测过程色谱图。
附图4为：不同浓度金黄色葡萄球菌与荧光峰面积的关系曲线(a)反应体系总体积为120μL(b)反应体系总体积为600μL。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步地描述：
(1)利用戊二醛交联法将氨基化的磁纳米颗粒与亲和素偶联。取500μL氨基化三氧化二铁于离心管中，超声分散10min。加入1.5mL戊二醛PB溶液避光反应2h，再PB缓冲液清洗3次。然后加入适量亲和素室温震荡孵育6h，用超纯水清洗3次，得到亲和素功能化磁纳米颗粒，分散于超纯水中。
(2)通过亲和素-生物素系统将生物素化的核酸适配体与亲和素功能化的磁纳米颗粒结合，即将核酸适配体修饰到磁纳米颗粒表面。取240μL功能亲和素功能化磁纳米超声分散20min，加入10μL生物素化核酸适配体，室温震荡孵育30min，磁性分离，用TE缓冲液清洗3次后得到核酸适配体功能化的磁纳米颗粒，分散于TE缓冲液中。
(3)金黄色葡萄球菌在线检测反应条件测优化。对磁纳米颗粒浓度、两条核酸适配体探针浓度和恒定检测流速进行优化。优化结果显示：磁纳米浓度为1.0mg/mL、核酸适配体探针浓度分别为100nM和120nM、检测流速为90mm/min时，可获得方法的最佳结果。
(4)金黄色葡萄球菌标准检测曲线的建立。将不同浓度金黄色葡萄球菌菌悬液与核酸适配体功能化的磁纳米颗粒和荧光标记的核酸适配体混合孵育，进行激光诱导荧光在线检测。实验结果为：在最优条件下，金黄色葡萄球菌浓度在6.7～6.7×104CFU/mL范围内与荧光峰面积呈良好的线性关系，R2＝0.9872，检测限为3CFU/mL。
(5)实际水样品中金黄色葡萄球菌的检测：对饮用水和自来水分装和灭菌后，再加入金黄色葡萄球菌，使其成为不同浓度水样品中的菌悬液。取30μL上述菌悬液与等体积核酸适配体功能化磁纳米颗粒和FAM标记的核酸适配体进行混合孵育，按照本方法进行检测并根据标准曲线求得对应的金黄色葡萄球菌浓度，同时将平板计数法作为对照实验进行比较，检测结果参见表1。
表1实际水样品中金黄色葡萄球菌的检测结果

Claims (7)

1.一种核酸适配体功能化磁纳米颗粒分离富集金黄色葡萄球菌并利用激光诱导荧光技术在线检测的方法，其特征在于：将生物素化金黄色葡萄球菌适配体修饰到磁纳米颗粒表面，对金黄色葡萄球菌进行分离富集；将另外一条荧光标记的金黄色葡萄球菌适配体作为信号探针与磁纳米和金黄色葡萄球菌组装成夹心结构；以毛细管为分离通道、流体拖曳力为驱动力，结合激光诱导荧光技术对金黄色葡萄球菌进行在线快速检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物素化核酸适配体序列为：Biotin-TCCCTACGGCGCTAACCTCCCAACCGCTCCACCCTGCCTCCGCCTCGCCACCGTGCTACAAC。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的荧光标记的核酸适配体序列为：FAM-GCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATCCCACAGCTACGTCAA。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核酸适配体-磁纳米复合体的制备是通过戊二醛交联作用，在氨基化三氧化二铁表面修饰醛基，再与亲和素表面氨基连接，即将亲和素修饰到磁纳米表面，再通过生物素-亲和素系统将合成的生物素化适配体结合到磁纳米颗粒表面。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的检测过程为：将磁纳米-金黄色葡萄球菌-FAM夹心复合体注入毛细管中，加恒定磁场达到分离富集的效果，去除磁场后以恒定流速将复合物推入检测池，用激光诱导荧光仪进行检测，根据荧光峰面积变化对金黄色葡萄球菌进行在线快速检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的恒定磁场采用永磁铁。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的将磁纳米-金黄色葡萄球菌-FAM夹心复合体注入毛细管中可以用泵或者注射器。
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