CN113866408B - 基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌o157：h7的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，包括：取核酸适配体功能化的纳米富集磁珠作为捕获探针，捕获反应体系中存在靶细菌，进行孵育后通过磁分离器回收磁珠适配体‑靶细菌；然后向其中加入核酸适配体功能化的量子点；在磁场作用下富集磁珠，将沉淀重悬于缓冲液中使用荧光化学分析仪测定荧光强度，根据荧光强度确定食源性肠道致病菌O157：H7的菌落总数。本发明将功能化量子点应用于食品中E.coli O157:H7检测，结合核酸适配体功能化磁珠富集方法，最终建立E.coli O157:H7高效快速检测方法。

Description

基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致 病菌O157：H7的方法
技术领域
本发明涉及一种基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157： H7的方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)，也称之为大肠杆菌，是人和动物肠道中最主要、 数量最多的细菌，属于革兰氏阴性菌。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原(O)、鞭毛 抗原(H)和表面抗原(K)，后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大 肠杆菌分为150多型，绝大多数的大肠杆菌是不具有致病性的，而少部分的大肠杆菌却能够 引起胃肠道、泌尿系统或中枢神经系统的疾病，称为致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli，EPEC)。其中最具代表性的就是代号为O157:H7的大肠杆菌，它是EHEC(肠 出血性大肠杆菌)家族中的一员。O157:H7感染后的主要症状正是出血性腹泻，严重者可伴发 溶血尿毒综合征，危及生命。由于O157:H7危害较大，且可经食物和饮用水在人群中广泛传 播，O157:H7被列为常规检测项目。
现在用于大肠埃希氏菌检测的常规方法包括选择性培养方法、以分子生物学为基础的检 测方法、免疫学检测方法和近年来兴起的生物传感器检测技术等。虽然这些方法是当前最基 础和常见的检测方法，但是各自存在不足之处，比如操作过程复杂、耗费时间较长、灵敏度和特异性不高、重复性较差等，因此建立高效快速检测方法是有效预防大肠杆菌病、保障公 共卫生安全的必要基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种基于核酸适配体、纳米粒 子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，将功能化量子点应用于食品中 E.coli O157:H7检测，结合核酸适配体功能化磁珠富集方法，优化食品中E.coliO157:H7检测 条件，最终建立E.coli O157:H7高效快速检测方法。
为解决上述技术问题，本发明提供一种基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食 源性肠道致病菌O157：H7的方法，包括：
以E.coli O157:H7为靶标，经过多轮筛选富集，获得特异性结合E.coli O157:H7的核酸 适配体；
对所构建的A5适配体进行生物素修饰，通过链酶亲和素和生物素之间的结合反应，获 得核酸适配体功能化的纳米富集磁珠；
对所构建的A4适配体进行量子点修饰，通过共价修饰制备得到核酸适配体功能化的量 子点；
取核酸适配体功能化的纳米富集磁珠作为捕获探针，捕获反应体系中存在靶细菌，进行 孵育后通过磁分离器回收磁珠适配体-靶细菌；然后向其中加入核酸适配体功能化的量子点， 进行孵育结合；在磁场作用下富集磁珠，将沉淀重悬于缓冲液中使用荧光化学分析仪测定荧光强度，根据荧光强度确定食源性肠道致病菌O157：H7的菌落总数。
进一步地，所述A5适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述A4适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述核酸适配体功能化的纳米富集磁珠的制备方法为：
采用共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒子；
将Fe3O4磁性纳米粒子分散于乙醇水溶液中，超声混合，加入氨丙基三乙氧基硅烷，机 械搅拌并充入氮气保护，室温反应7～10h，然后用磁铁进行磁分离，清洗、干燥后得到氨基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子；
基于戊二醛法制备亲和素化氨基磁珠；
在A5核酸适配体的5’端进行生物素标记得到功能化的核酸适配体；
将亲和素化氨基磁珠和功能化的核酸适配体混合，得到核酸适配体功能化的纳米富集磁 珠。
进一步地，所述共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒子的步骤如下：将浓度为0.12mol/LFeSO4·7H2O和浓度为0.2mol/L FeCl3·6H2O溶于去离子水溶液中，机械搅拌混合，并且通入 氮气，充分去除溶液中的溶解氧后，逐滴加入浓度为2.5mol/L的氢氧化钠溶液，使溶液pH 达到11，在室温下1000rpm剧烈搅拌30min，水解产生的Fe3O4磁性纳米粒子以磁铁分离，分别用蒸馏水、去离子水、无水乙醇依次清洗各五次，60℃下真空干燥12h，得到Fe3O4磁 性纳米粒子。
进一步地，所述戊二醛法制备亲和素化氨基磁珠的步骤如下：称取5mg氨基化磁珠溶解 于5mL 10mM磷酸盐缓冲液中超声20min；向体系中加入1.25mL 25％戊二醛，室温缓慢振荡 1h，在磁铁的作用下富集分离Fe3O4并用PBS清洗3次以去除物理性吸附的戊二醛；向Fe3O4磁性粒子加入500ul 1mg/mL的链霉亲和素，室温缓慢振荡6h；在磁铁作用下富集分离亲和 素化氨基磁铁，舍弃含有游离亲和素的上清，用PBS反复清洗；向亲和素化氨基磁珠中加入 5m L 10mg/m L的BSA室温缓慢振荡6h以封闭未反应的和非特异性结合位点，在磁铁作 用下富集分离磁性粒子并反复清洗，最终重悬于5mL 10mM的PBS中，置于4℃保存备 用。
进一步地，所述核酸适配体功能化的量子点的制备方法为：ZNS：Mn量子点加入60uL EDC和30uL NHS，避光振荡30min活化量子点表面的羧基基团，接着加入氨基化修饰的A4 适配体，量子点与适配体的摩尔比为1:10，振荡反应1h，加入乙醇胺继续反应2h，封闭量子点表面未反应的羧基基团，得到核酸适配体功能化的量子点。
进一步地，所述食源性肠道致病菌O157:H7菌落总数与荧光强度之间的关系为：IF＝1.8286x+3.1916，R2＝0.9951，IF指荧光信号强度，x指检测用细菌的菌落总数对数值，线 性检测范围是13～1.3×106CFU/mL，检出限为13CFU/mL。
纳米磁颗粒，又称纳米磁珠，是一种新型的磁性纳米材料，它不仅具有粒径小、比表面 积大、偶联容量高等特点，而且还具有超顺磁作用，可以在外力磁场下聚集和固定，因此可 以将特定基团修饰的物质偶联在其表面，用于物质的分离和筛选。本发明将修饰有生物素的适配体与纳米磁珠偶联，形成可以捕获靶细菌的复合物。利用生物素和链霉亲和素可以高特 异性结合的特点，首先我们将筛选出的靶细菌适配体进行生物素化修饰，然后选取链霉亲和 素包被的纳米磁珠，从而使适配体连接到磁珠表面。结合形成的磁珠-适配体作为捕获探针将 具有多级放大作用，可以捕获更多的靶细菌。再向反应体系中加入以荧光FITC标记的适配 体作为荧光指示探针，体系中捕获的细菌再结合游离的荧光标记的适配体，从而构建了磁珠 适配体-靶细菌-荧光适配体的三明治夹心结构。利用荧光化学分析仪检测体系的荧光强度变 化，最终实现对肠出血性大肠杆菌O157:H7的定性定量检测，其基本原理如附图8所示。
本发明所达到的有益效果：
1.本发明对所构建适配体进行生物素修饰，通过链酶亲和素和生物素之间的结合反应， 获得核酸适配体功能化的纳米富集磁珠，应用核酸适配体功能化的纳米富集磁珠对食品中 E.coli O157:H7进行富集，具有高效低成本的优势。
2.本发明通过共价修饰制备得到核酸适配体功能化的量子点，应用于E.coliO157:H7的特 异性结合及荧光检测，具有高特异性、高灵敏度、靶分子范围广、稳定性好、易于体外大量 合成且成本低等优点，已经被广泛应用众多领域。
附图说明
图1是本发明的流程图；
图2是各轮筛选产物PCR扩增后的凝胶电泳图，其中，泳道1：Marker；泳道2：第6 轮筛选产物；泳道3：第8轮筛选产物；泳道4：第10轮筛选产物；泳道5：第11轮筛 选产物；泳道6：第12轮筛选产物；
图3是M-Fold软件模拟核酸适配体A1(a)、A2(b)、A3(c)、A4(d)、A5(e)的二级结构；
图4是核酸适配体A5、A1、A0的结合曲线；
图5是适配体-细菌结合荧光强度分析图；
图6是TEM表征磁性纳米粒子(a)与链霉亲和素-磁性纳米粒子(b)；
图7是E.coli O157:H7检测线性相关关系图；
图8是本发明的基本原理图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术 方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1.大肠杆菌O157：H7的核酸适配体构建及筛选
1.大肠杆菌O157：H7的核酸适配体粗筛
具体筛选步骤如下：
(1)首轮筛选，取物质的量为200pmol单链随机DNA寡核苷酸模板，用结合缓冲液(pH＝7.6)稀释到500μL，95℃热变性10min后，迅速置于0℃冰水中冰浴10min，置 于常温30min。
(2)将冰浴后的单链随机DNA寡核苷酸模板与200μL大肠杆菌O157：H7混合，置 于室温下振摇60min。在6000rmp下离心5min，弃上清液。用400μL清洗缓冲液清洗 三次。目的是将未结合大肠杆菌O157：H7的单链随机DNA寡核苷酸模板洗去。
(3)取离心分离后得到的沉淀物，加入10μL洗脱缓冲液(Elution Buffer，pH＝8.0)， 90℃高温下振摇10min，在6000rmp下离心5min，取上清液，弃沉淀，重复此步骤2次，上清液中即含有筛选得到的单链DNA寡核苷酸。
(4)以得到的上清液为模板，优化聚合酶链反应条件，加入5μL PCR Buffer，3μLMgCl2溶液，1μL 2.5mM dNTP，2μL 10mM上游引物，2μL 10mM下游引物，2μL模 板，0.5U Taqpolymerase，加去离子水补足至50μL。PCR扩增条件为：94℃，5min变性； 94℃45s，60℃45s，72℃40s，18个循环；72℃10min延伸。将扩增得到的筛选 产物，经95℃热变性10min，迅速置于0℃冰浴10min，双链DNA解离变成单链DNA， 作为下一轮筛选的单链DNA寡核苷酸文库。重复以上步骤11次。
(5)取第6、8、10、11、12轮筛选的上清液，PCR扩增后纯化测序。
基于传统的大肠杆菌O157：H7核酸适配体筛选进行了12轮筛选。为了得到高亲和性 的大肠杆菌O157：H7核酸适配体，随着筛选轮数的增加，筛选条件要求越来越严格，参考已报导的筛选条件优化，基于传统的大肠杆菌O157：H7核酸适配体各轮筛选的具体条件如表1所示。
表1.核酸适配体筛选条件
2.琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物
(1)制备20mL浓度为2％琼脂糖凝胶溶液：称取0.4g琼脂糖置于锥形瓶，加入20 mL1×TBE缓冲液，混匀，在锥形瓶瓶口贴上保鲜膜以防止水分蒸发，微波炉用中低火加热2min至溶液完全沸腾2～3次，琼脂糖完全融化，即制成2％琼脂糖凝胶。静置冷却至 60～70℃，往琼脂糖凝胶内滴加1μL左右核酸染料DNA 4S Green，混匀。
(2)胶板制备：取电泳槽内的内槽，清洗干净后，放入制胶玻璃板中。将冷却到60～70℃ 的琼脂糖凝胶缓慢的倒入内槽玻璃板上，使琼脂糖凝胶分散开，室温下静置直至琼脂糖凝胶 完全凝固，垂直拔下梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1×TBE缓冲液至没过胶板。
(3)加样：在点样板上添加5μL DNA样品和1μL上样缓冲，分别将混合样品琼脂 糖凝胶中。
(4)电泳：将加样后的琼脂糖凝胶进行电泳，电压为150V，电泳时间约30min。当上样缓冲液跑至琼脂糖凝胶约2/3的距离时，关闭电源。
PCR的扩增质量是大肠杆菌O157：H7核酸适配体的筛选成功的重要因素。筛选的结果 初步用琼脂糖凝胶电泳来表征，如果每一轮筛选之后将提取出的结合DNA作PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳表征，凝胶上均有目的条带，且杂条带较少，那么理论上认为本轮筛选成功， 可以进行下一轮的筛选。每一轮的筛选产物提取出来后均进行PCR扩增，并用琼脂糖凝胶 电泳表征后显示有目的条带，方可进行下一轮筛选。将第6、8、10、11、12轮筛选产物PCR扩增后用琼脂糖凝胶电泳表征，观察每一轮PCR产物条带的正确性。如图2所示，泳道6为Marker，泳道1为第6轮筛选产物PCR扩增后的dsDNA琼脂糖凝胶电泳图，泳道2为 第8轮筛选产物PCR扩增后的dsDNA琼脂糖凝胶电泳图，泳道3为为第10轮筛选产物 PCR扩增后的dsDNA琼脂糖凝胶电泳图，泳道4为第11轮筛选产物PCR扩增后的dsDNA 琼脂糖凝胶电泳图，泳道4为第12轮筛选产物PCR扩增后的dsDNA琼脂糖凝胶电泳图。 可知，第6、8、10、11、12轮筛选产物的电泳条带均在99bp左右，且产物非特异性扩增少。
3.PCR扩增产物纯化
按北京康为世纪有限公司DNA纯化回收试剂盒指导说明纯化DNA。首先将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，称取凝胶重量。向凝胶胶块中加入3倍凝胶重量的BufferPC。50℃孵育10分钟，其间不断温和地上下颠倒离心管，以确保胶块充分溶解。加入1倍 凝胶体积的异丙醇，上下颠倒混匀。用3M醋酸钠(pH 5.0)将pH值调到5-7。其次，向 已装入收集管中的吸附柱中加入200μL Buffer PS，室温放置2分钟，12000rpm转速下离 心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将步骤(1)中所得溶液加 入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm转速下离心30-60s，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入750μL Buffer PW，室温静置2～5min。 12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。12000rpm转速下离心1min，倒掉收集管中的废液。
4.大肠杆菌O157：H7核酸适配体测序与软件模拟：
将第6、8、10、11、12轮筛选产物PCR扩增后用北京康为世纪有限公司DNA纯化回 收试剂盒纯化回收后，在大肠杆菌中克隆表达，取大肠杆菌菌液1mL放于干净灭菌的离心 管中，封膜后委托上海生物工程技术有限公司进行高通量测序。利用M-fold软件对测序得 到的核酸适配体进行二级结构模拟分析，分析核酸适配体的最小自由能，可能形成的二级结构，以及与目标物结合时可能形成的三维空间构象。
将第6、8、10、11、12轮筛选产物PCR扩增，使用北京康为世纪公司的DNA纯化 回收试剂盒纯化后，委托合肥工业大学生物与食品工程学院刘永胜教授课题组克隆、表达， 并送至上海生工生物有限公司测序，测序得到的大肠杆菌O157：H7核酸适配体序列、碱基 数目及最小自由能dG汇总如表2所示。
表2.大肠杆菌O157：H7核酸适配体汇总
参考表2，对核酸适配体的序列进行一级同源性分析，可知对核酸适配体A1-A5，其中A/T 碱基逐渐减少，G/C碱基逐渐增多，自由能也是由大变小。可知，随着每一轮筛选的增加， A/T碱基的含量逐渐降低，G/C碱基的含量逐渐增高，有利于核酸适配体形成稳定的三维构 象。除了G/C碱基增高外，核酸适配体形成二级结构的最小自由能也逐渐降低。说明随着 每一轮筛选的增加，核酸适配体的二级结构也逐渐稳定。
由于核酸适配体是通过形成特定的三维结构来识别结合目标物，因此分析核酸适配体可 能形成的二级结构也十分重要。核酸适配体的二级结构主要以茎环、发夹、G-四面体结构为 主。茎环结构是指单链DNA由于碱基间的互补配对，配对碱基间的双链区形成“茎”，茎多 由3个及3个以上的G/C或者A/T配对组成，而不能配对的单链区部分则突出形成“环”。茎能稳定支持核酸适配体的二级空间结构；而环则通过氢键、碱基堆积、疏水作用等发生折叠，形成能与目标物分子特异性性结合的结合位点。我们用M-Fold软件模拟分析核酸适配体A1、A2、A3、A4、A5的二级结构。由图3可知，5个核酸适配体的二级结构以 发夹、茎环为主，其中茎环结构为主要结构。A1的最小自由能为-1.51，A2的最小自由能为 -4.93，A3的最小自由能为-6.00，A4的最小自由能为-6.63，A5的最小自由能为-6.80。一般 来说，自由能越小，核酸适配体的二级结构越稳定，随着每一轮筛选的增加，核酸适配体也越稳定。可知，A3、A4、A5二级结构的稳定性较好。
5.大肠杆菌O157：H7核酸适配体亲和常数的测定
根据M-fold软件模拟核酸适配体的二级结构，从已筛选的核酸适配体中选取dG自由 能较低的核酸适配体。FITC荧光标记的核酸适配体(FITC-aptamer)探针订购于上海生工生 物工程公司。将FITC-aptamer用TE缓冲液稀释到7个不同浓度(0nM，5nM，10nM， 25nM，50nM，100nM，150nM)，与一定量的大肠杆菌O157：H7孵育45min，在6000 rmp下离心5min，弃上清液。加入500μL结合缓冲液，震荡重新分散大肠杆菌O157：H7， 离心分离5min，弃上清液，重复此步骤3次，取离心后的沉淀物，分散到100μL的超出 水中，测其荧光强度。通过Origin v8.0软件制得各个FITC-aptamer浓度下的饱和结合曲线图，通过模拟非线性回归分析获得解离常数Kd值。非线性回归方程为：
其中，F是大肠杆菌O157：H7在一定浓度FITC-aptamer下的荧光强度，F0指大肠杆菌 O157：H7在无FITC-aptamer下的荧光强度，Kd为解离常数，A为系数，A与Kd可从Originv8.0中获得。
根据M-Fold软件模拟的二级结构特点，从5个核酸适配体中选取一个自由能(dG)最低的序列和一个自由能(dG)最高的序列以及一条随机序列，分别是A5，A1，A0，测定 大肠杆菌O157：H7核酸适配体的亲和常数。亲和常数是核酸适配体能够识别和结合的最低 目标物浓度，亲和常数越小，所需浓度越低，亲和性越大，是确定核酸适配体性质的重要参 数之一。测定方法主要参考Jaytry Mehta等。
将不同浓度(0nM，5nM，10nM，25nM，50nM，100nM，150nM)FITC荧光标记 的大肠杆菌O157：H7核酸适配体(A5，A1，A0)与大肠杆菌O157：H7结合孵育一段时间， 经离心分离、洗涤后，通过酶标仪在522nm处检测FITC的荧光强度。用Origin v8.0软件模拟非线性拟合图制得饱和结合曲线图，如图4所示，A5的Kd值为1.366+0.278nM，A1的 Kd值为2.259+0.910nM，A0的Kd值为3.897+2.068nM。可知，Kd值A0>A1>A5，解 离常数Kd值越低，核酸适配体亲和性越好，说明大肠杆菌O157：H7核酸适配体A5的亲 和力最高，选取A5为本次筛选的最佳核酸适配体，A4次之。
6.大肠杆菌O157：H7核酸适配体特异性分析
将挑选出的适配体标记FITC荧光基团，然后分别与106CFU/mL的E.coli O157:H7、大肠杆菌ATCC 25922、福氏志贺氏菌CICC 21534、鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50115、粪肠球 菌粪肠球菌ATCC 29212在封闭中混匀，37℃避光孵育1h，将适配体分别与106CFU/mL的 靶细菌和消减细菌在封闭缓冲液中混合，于37℃摇床避光孵育1h，每个样品设置3组实验 组和对照组(即不加FITC荧光适配体，加入等体积的1×PBS缓冲液，其他均与实验组相 同)，经过洗脱、离心等步骤获得菌体-适配体复合物，加入1×PBS缓冲液将菌体-适配体沉 淀重悬。
使用荧光化学分析仪检测时，操作步骤具体如下：
(1)首先将荧光化学分析仪与电脑相连接，打开仪器后，设置检测参数，选
取激发波长和发射波长分别为485nm和535nm；
(2)将空白的黑色酶标板进行扫描检测，以确定空白值；
(3)分别取各组的样品悬浮液个200μl加入到黑色酶标板中上机检测，测得体系荧光值；
FITC标记的适配体A5(25pmol)分别与1×106的E.coli O157:H7、大肠杆菌标准菌株 25922(ATCC)、福氏志贺氏菌21534(CICC)、鼠伤寒沙门氏菌50115(CMCC)和粪肠 球菌29212(ATCC)孵育结合后，用荧光化学分析仪检测适配体对靶细菌的特异性。
荧光化学分析仪检测细菌与适配体结合后的荧光强度，结果如图5所示。分别以未加入 荧光适配体A5的组作为对照组，在图5中用绿色表示；以加入荧光适配体的组作为实验 组，在图5中用红色代表。根据结果图可以看出，五种细菌的基底荧光值很低，均小于0.7， 可以认为基底值不会对结果有显著的影响。大肠杆菌标准菌株、福式志贺氏菌、粪肠球菌和 沙门氏菌的实验组及其对应的对照组荧光强度基本没有差异或差异较小，而E.coli O157:H7 与适配体孵育结合后，荧光强度达到14以上。与E.coli O157:H7对照组相比，实验组体系 的荧光值大幅度提高，说明标记荧光的适配体A5与E.coli O157:H7结合率较高，而与其他4种细菌结合率很低或没有结合。由此可以判断适配体A5具有一定的特异性识别以及结合 E.coli O157:H7的能力。
实施例2.磁性纳米粒子的制备及核酸适配体功能化
本文采用氢氧化钠溶液水解六水合三氯化铁(FeCl3·6H2O)与七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)的混合溶液制备Fe3O4纳米粒子，又称共沉淀法制备MNP，其化学原理为 2Fe3++Fe2++8OH-→Fe3O4↓+4H2O，应当严格控制铁离子Fe3+与亚铁离子Fe2+的比例为2:1。
共沉淀法合成Fe3O4磁性纳米粒子的步骤如下：将浓度为0.12mol/L FeSO4·7H2O和浓度 为0.2mol/L FeCl3·6H2O溶于去离子水溶液中，机械搅拌混合，并且通入氮气，充分去除溶液 中的溶解氧后，逐滴加入浓度为2.5mol/L的氢氧化钠溶液，使溶液pH达到11，在室温下 1000rpm剧烈搅拌30min，水解产生的Fe3O4磁性纳米粒子以磁铁分离，分别用蒸馏水、去 离子水、无水乙醇依次清洗各五次，60℃下真空干燥12h，得到Fe3O4磁性纳米粒子。
将10mg真空干燥后的Fe3O4磁性纳米粒子分散于乙醇和水的体积比为100：1的乙醇水 溶液中，超声20min混合；加入2mL氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，机械搅拌并充入氮 气保护，室温反应7～10h，然后用磁铁进行磁分离，分别用蒸馏水、去离子水、无水乙醇依 次清洗3次，60℃下真空干燥12h，得到氨基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子。利用透射电子 显微镜(TEM)对氨基化磁珠进行表征。
选择得到的最优核酸适配体构建捕获探针，A5的5’端进行生物素标记得到功能化的核 酸适配体，作为捕获探针，标记工作由上海生工完成。
实施例3.亲和素化纳米磁珠及功能化量子点的制备
基于戊二醛法制备亲和素化氨基磁珠的具体方法参照Wu等的方法，稍有改动，具体如 下：称取5mg氨基化磁珠溶解于5mL 10mM磷酸盐缓冲液中超声20min；向体系中加入1.25mL 25％戊二醛，室温缓慢振荡1h，在磁铁的作用下富集分离Fe3O4并用PBS清洗3次以去除物 理性吸附的戊二醛；向Fe3O4磁性粒子加入500ul 1mg/mL的链霉亲和素，室温缓慢振荡6h； 在磁铁作用下富集分离亲和素化氨基磁铁，舍弃含有游离亲和素的上清，用PBS反复清洗； 向亲和素化氨基磁珠中加入5m L 10mg/m L的BSA室温缓慢振荡6h以封闭未反应的和非特异性结合位点，在磁铁作用下富集分离磁性粒子并反复清洗，最终重悬于5mL 10mM 的PBS中，置于4℃保存备用。利用紫外光谱和红外图谱对亲和素成功连接氨基磁珠进行表征。
图6分别示出磁性纳米粒子与链霉亲和素-磁性纳米粒子的场发射透射电子显微镜图 (TEM)。从图6a可看出，MNP主要为球形结构，粒子的直径从50nm～100nm，平均粒径 约75nm左右，粒子具有良好的分散性，形状规则，分布均匀。从图6b可看出，在MNP表 面偶联链霉亲和素后，MNP的粒径，形貌未发生变化，链霉亲和素的偶联不影响MNP的生 物功能。在黑色的MNP外面包裹着薄薄的一层浅色的链霉亲和素层，可知链霉亲和素成功 的偶联在MNP表面。
ZNS：Mn量子点(1nmol)加入60uL(50mmol/L)EDC和30uL(25mmol/L)NHS避光 振荡30min活化量子点表面的羧基基团，接着加入氨基化修饰的A4适配体(量子点与适配 体的摩尔比为1:10)，轻微振荡反应1h，加入乙醇胺继续反应2h，封闭量子点表面未反应 的羧基基团，得功能化量子点。
实施例4.基于适配体的E.coli O157：H7检测方法的建立
取200μl磁珠-适配体作为捕获探针，捕获反应体系中存在107CFU/mL的靶细菌，总得孵育体积为300μl，使用旋转混合仪孵育时间30min；然后通过磁分离器回收磁珠适配体-靶细菌，每次磁分离时间为3min，使磁颗粒复合物完全被回收，使用1×PBS缓冲液洗涤三次，以去除未与捕获探针结合的细菌，然后向其中加入量子点修饰的适配体，与37℃孵育结合1h，在磁场作用下富集磁珠，使用1×PBS缓冲液洗涤三次以去除未与靶细菌结合的荧光适配体，最后将沉淀重悬于300μl 1×PBS缓冲液中使用荧光化学分析仪测定荧光强度(激发 波长485nm，发射波长535nm)。
实施例5.检测方法的灵敏度分析
分别取100μl不同浓度梯度的E.coli O157:H7菌液进行平板培养计数，参照之前的方法 分别将不同浓度的菌液加入到反应体系中，使用荧光化学分析仪测得相应荧光强度值。使用 软件Origin 8.0分析荧光值与平皿培养菌落数的关系，并且绘制相关曲线，确定最低检测限。
在最佳的实验条件下，探索E.coli O157:H7菌落总数与荧光强度之间的关系。结果如图 7所示，实验测得的荧光值与相对应的细菌平皿培养计数呈线性关系，并且相关性良好。E.coli O157:H7荧光检测与平皿计数线性相关方程为IF＝1.8286x+3.1916(R2＝0.9951)，线性检测 范围是13～1.3×106CFU/mL，检出限为13CFU/mL。
根据实验中建立的E.coli O157:H7荧光检测方法，测定食品样品均质液中含有不同浓度 的菌液的荧光强度，计算出相对的细菌菌落数，然后与平皿培养计数结果相对比，最后计算 E.coli O157:H7的回收效率，结果见表3。对于加标的食品样品进行检测，食品样品中 E.coliO157:H7回收率最高达到96％以上。实验构建的E.coli O157:H7荧光检测方法对于实际样品的检测具有可行性，但食品的色度对于检测系统有一定的影响，需要进一步验证和调 整荧光检测方法，以达到对实际样品准确检测的目的。
表3.食品样品中肠出血性大肠杆菌O157:H7检测回收率
实施例6.模拟样品检测
根据国内外文献报道的关于感染E.coli O157:H7事件可知，易受E.coli O157:H7污染 的食品主要是肉类、带叶蔬菜等食品，因此随机选取了生猪肉、生羊肉和生青菜作为食品样 品。每种食品采集毛重约为250g，将采集的食品样本于实验室4℃保存，并于2h内按照国 家标准方法对样本进行处理。参照GB 4789.36-2016的方法对采集的食品样品进行处理。按照建立的荧光检测E.coli O157:H7的方法对食品样品处理液以及相对应的E.coliO157:H7 加标样品进行检测。
本发明以大肠杆菌O157：H7为靶分子，利用传统的SELEX筛选技术，从体外构建一个总长99nt(中间随机序列为59nt)的DNA随机文库，经过12轮筛选，成功筛选到针 对大肠杆菌O157：H7的高亲和力、高特异性的核酸适配体。将筛选得到的核酸适配体利用 分子克隆技术，将第6、8、10、11、12轮的PCR产物进行连接、转化、克隆、测序，得 到A1，A2，A3，A4，A5等5条大肠杆菌O157：H7核酸适配体。分析5条大肠杆菌O157： H7核酸适配体的一级序列，发现随着每一轮筛选的增加，核酸适配体的A/T逐渐降低，G/C 含量逐渐增加，说明G/C含量有利于二级结构的形成与稳定，确定A3，A4，A5稳定性最 好。模拟5条大肠杆菌O157：H7核酸适配体的二级结构，均以茎环结构为主，从中选取一 个自由能(dG)最低的序列和一个自由能(dG)最高的序列以及一条随机序列，分别是A5， A1，A0。检测A5，A1，A0三条核酸适配体的亲和常数，得知，A5的Kd值为1.366+0.278nM，A1的Kd值为2.259+0.910nM，A0的Kd值为3.897+2.068nM，选取A5为本次 筛选的最佳核酸适配体，用生物素修饰，构建功能化捕获探针；A4用量子点修饰后构建功 能化检测探针。
利用所筛选适配体建立的检测大肠杆菌O157：H7快速检测方法，在检测浓度13-1.3×106CFU/mL(R2＝0.9951)之间具有良好线性，并且LOD可达到13CFU/mL。同时该方法良好适 用于猪肉等食品样本中大肠杆菌O157：H7的检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为 本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京海关动植物与食品检测中心
<120> 基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
ctgcgatcaa gttacgcacc tcgccatgtt ccccgcccgg catgtgttat gcccctgtg 59
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
gttgggtgcg gcgggagggt cccatcggaa accaagctgt gctgagattt ttccgcgat 59

Claims (6)

1.基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，包括：
以E.coli O157:H7 为靶标，经过多轮筛选富集，获得特异性结合E.coli O157:H7的核酸适配体；
对所构建的A5适配体进行生物素修饰，通过链酶亲和素和生物素之间的结合反应，获得核酸适配体功能化的纳米富集磁珠，所述A5适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
对所构建的A4适配体进行量子点修饰，通过共价修饰制备得到核酸适配体功能化的量子点，所述A4适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
取核酸适配体功能化的纳米富集磁珠作为捕获探针，捕获反应体系中存在靶细菌，进行孵育后通过磁分离器回收磁珠适配体-靶细菌；然后向其中加入核酸适配体功能化的量子点，进行孵育结合；在磁场作用下富集磁珠，将沉淀重悬于缓冲液中使用荧光化学分析仪测定荧光强度，根据荧光强度确定食源性肠道致病菌O157：H7的菌落总数。
2.根据权利要求1所述的基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，所述核酸适配体功能化的纳米富集磁珠的制备方法为：
采用共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒子；
将Fe3O4磁性纳米粒子分散于乙醇水溶液中，超声混合，加入氨丙基三乙氧基硅烷，机械搅拌并充入氮气保护，室温反应7～10 h，然后用磁铁进行磁分离，清洗、干燥后得到氨基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子；
基于戊二醛法制备亲和素化氨基磁珠；
在A5核酸适配体的5’端进行生物素标记得到功能化的核酸适配体；
将亲和素化氨基磁珠和功能化的核酸适配体混合，得到核酸适配体功能化的纳米富集磁珠。
3.根据权利要求2所述的基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，所述共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒子的步骤如下：将浓度为0.12 mol/L FeSO4• 7H2O和浓度为0.2 mol/L FeCl3•6H2O溶于去离子水溶液中，机械搅拌混合，并且通入氮气，充分去除溶液中的溶解氧后，逐滴加入浓度为2.5 mol/L的氢氧化钠溶液，使溶液pH达到11，在室温下1000 rpm剧烈搅拌30 min，水解产生的Fe3O4磁性纳米粒子以磁铁分离，分别用蒸馏水、去离子水、无水乙醇依次清洗各五次，60 ℃下真空干燥12h，得到Fe3O4磁性纳米粒子。
4.根据权利要求2所述的基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，所述戊二醛法制备亲和素化氨基磁珠的步骤如下：称取5mg氨基化磁珠溶解于5mL 10mM磷酸盐缓冲液中超声20min；向体系中加入1.25mL 25%戊二醛，室温缓慢振荡1h，在磁铁的作用下富集分离Fe3O4并用PBS清洗3次以去除物理性吸附的戊二醛；向Fe3O4磁性粒子加入500ul 1mg/mL的链霉亲和素，室温缓慢振荡6 h；在磁铁作用下富集分离亲和素化氨基磁铁，舍弃含有游离亲和素的上清，用PBS反复清洗；向亲和素化氨基磁珠中加入5 mL 10 mg/mL 的 BSA室温缓慢振荡 6 h 以封闭未反应的和非特异性结合位点，在磁铁作用下富集分离磁性粒子并反复清洗，最终重悬于 5 mL 10 mM 的PBS 中，置于 4℃保存备用。
5.根据权利要求1所述的基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，所述核酸适配体功能化的量子点的制备方法为：ZNS：Mn量子点加入60 uL EDC和30uL NHS，避光振荡30min活化量子点表面的羧基基团，接着加入氨基化修饰的A4适配体，量子点与适配体的摩尔比为1:10，振荡反应1 h，加入乙醇胺继续反应2 h，封闭量子点表面未反应的羧基基团，得到核酸适配体功能化的量子点。
6.根据权利要求1所述的基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌O157：H7的方法，其特征在于，所述食源性肠道致病菌 O157:H7菌落总数与荧光强度之间的关系为：IF=1.8286x+3.1916，R2=0.9951，IF指荧光信号强度，x指检测用细菌的菌落总数对数值，线性检测范围是 13～1.3×106 CFU/mL，检出限为13 CFU/mL。
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