CN111235233B - 一种基于适配体识别-hcr反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用 - Google Patents

一种基于适配体识别-hcr反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111235233B
CN111235233B CN202010069476.6A CN202010069476A CN111235233B CN 111235233 B CN111235233 B CN 111235233B CN 202010069476 A CN202010069476 A CN 202010069476A CN 111235233 B CN111235233 B CN 111235233B
Authority
CN
China
Prior art keywords
aptamer
staphylococcus aureus
reaction
solution
hcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010069476.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111235233A (zh
Inventor
卢春霞
高晓旭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangtze Normal University
Original Assignee
Yangtze Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangtze Normal University filed Critical Yangtze Normal University
Priority to CN202010069476.6A priority Critical patent/CN111235233B/zh
Publication of CN111235233A publication Critical patent/CN111235233A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111235233B publication Critical patent/CN111235233B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种基于适配体识别‑HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法，检测方法包括：（1）制备DNA功能化纳米金探针；（2）制备适配体修饰磁性纳米颗粒；（3）合成用于杂交链式反应体系的发夹探针；（4）制备HCR反应产物；（5）检测靶标。本发明具有恒温扩增、灵敏度高、成本低等优点，具有良好的应用前景。

Description

一种基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检 测方法及其应用
技术领域
本发明涉及食品安全检测领域，具体涉及一种基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用。
背景技术
随金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. au）在自然界中普遍存在，是引起食源性疾病的主要病原菌之一，常污染乳和乳制品、肉和肉制品、禽蛋类制品、沙拉、糕点等食品。金黄色葡萄球菌在20~37℃之间繁殖4~8 h即可分泌肠毒素（Staphylococcalenterotoxins, SEs），是引起金黄色葡萄球菌食物中毒的主要致病因子。据统计，在世界由金葡菌肠毒素引起的食物中毒的事件在细菌性食物中毒的总事件中约占25%~45%。
目前，针对食源性致病菌的鉴定和检测方法主要基于三个原理：1）微生物培养法；2）特异性DNA杂交；3）基于抗原-抗体识别技术。其中，传统的微生物培养法耗时长、效率低，不能及时检出食品中的病原菌，无法满足快速检测需求。基于特异性DNA杂交的PCR技术和核酸探针技术具有较高的灵敏度，但对工作人员和检测设备的要求较高。虽然免疫分析技术在以上方面得到了很大改观，但抗体的制备需要免疫动物、成本高、抗体易失活。因此，迫切需要发展高灵敏、成本低、实用性强的食源性致病菌快速检测技术。
近些年，核酸适配体（Aptamer）作为新型识别分子逐渐成为研究热点，其本质是一段单链寡核苷酸折叠成发夹、茎环、假结体及G-四链体等二级或三级结构，通过氢键、范德华力等与靶分子相互作用而形成稳定的复合物，其空间结构的多样性几乎可以与所有种类的靶分子（细胞因子、蛋白、生物毒素、金属离子、小分子物质、细胞、微生物等）发生结合。与传统的抗体相比，具有适应范围广；高亲和力和高特异性，不受免疫条件和免疫原性限制；制备简单，可体外人工合成；变性与复性可逆，性质稳定；易于标记和保存等优点。
杂交链式反应（Hybridization chain reaction, HCR）是一种没有酶参与的体外核酸等温信号放大技术。由于HCR反应具有不需要酶参与、反应易控制、成本低，常温下即可进行反应，不需要大型仪器和专业人员，输出信号多样化等优点，使其在分析检测领域得到广泛应用。
发明内容
要解决的技术问题：针对现有技术的不足，本发明提出了基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法，实现食品中食源性致病菌的高灵敏、低成本、简单、快速检测。
技术方案：一种基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法，包括以下步骤：
（1）制备DNA 功能化纳米金探针：
将巯基修饰金黄色葡萄球菌适配体2（SH-apt 2）和引发链（SH-Trigger probe）修饰在纳米金（AuNPs）表面，得到DNA修饰的纳米金探针（Apt2-AuNPs-TP），其中引发链包含与发夹探针H1的部分序列互补的d序列；
（2）制备适配体修饰磁性纳米颗粒：
通过戊二醛法将氨基化的Fe3O4磁纳米颗粒与链霉亲和素（SA）偶联，通过生物素-亲和素系统，将生物素（Biotin）修饰的金黄色葡萄球菌适配体1（Bio-apt1）固定于SA修饰的磁性纳米颗粒（MB）表面，得到适配体功能化的磁性纳米颗粒（Apt1-MB）；
（3）合成用于杂交链式反应体系的发夹探针：
根据杂交链式反应原理，合成用于杂交链式反应的发夹探针H1和发夹探针H2 的序列，其中，H1包括a、b、c三个部分，a的部分序列与c序列互补成双链作为H1发夹结构的茎部，b序列与引发链d序列互补；H2包括a’、 b’、c’三部分，其中a’的部分序列和c’序列互补成双链作为H2发夹结构的茎部，H1的a序列与H2的a’序列互补，H2的c’序列与H1的c序列互补，并将发夹探针H1和发夹探针H2的一端标记生物素，得到生物素化发夹探针H1和生物素化发夹探针H2（Bio-H1和Bio-H2）；
（4）制备HCR 反应产物：
将生物素化发夹探针H1和生物素化发夹探针H2（Bio-H1和Bio-H2），与步骤（1）中制备的Apt2-AuNPs-TP探针混合，引发交链式反应（HCR），在纳米金表面生成杂交链式反应产物（Apt2- AuNPs -HCR）；
（5）检测靶标：
将步骤（2）中制备Apt1-MB置于杂交液中，与金黄色葡萄球菌混合，孵育，加入反应产物Apt2- AuNPs -HCR，孵育，加入链霉亲和素标记的辣根过氧化酶（SA-HRP）溶液，TMB显色，加入终止液终止反应，根据吸光值大小与金黄色葡萄球菌浓度的对应关系，获得待测液中黄色葡萄球菌的浓度。
优选的，所述步骤（1）中金黄色葡萄球菌适配体2核苷酸序列为5’-TCCCTACGGCGCTAACCCCCCCAGTCCGTCCTCCCAGCCTCACACCGCCACCGTGCTACAAC-3’， 其5’端具有巯基修饰基团；引发链核苷酸序列为5’- AAAAAAAAAATGGAGTGAAGGCGCATACCTCTTT -3’，其5’端具有巯基修饰基团；所述步骤（2）中金黄色葡萄球菌适配体1核苷酸序列为5’-TCCCTACGGCGCTAACCTCCCAACCGCTCCACCCTGCCTCCGCCTCGCCACCGTGCTACAAC-3’，适配体5’端标记biotin；所述步骤（3）中，所述发夹探针H1的核苷酸序列为5’- GAAGGCGCATACCTCTTTAATTGGAAAGAGGTATGCGCCTTCACTCCA-3’，其5’端标记有biotin；发夹探针H2核苷酸序列为5’-CCAATTAAAGAGGTATGCGCCTTCTGGAGTGAAGGCGCATACCTCTTT-3’，其3’端标记有biotin；
优选的，所述步骤（1）中纳米金粒子的粒径为15~25 nm。
优选的，所述步骤（2）中Fe3O4磁性纳米颗粒的粒径为30~50 nm，Fe3O4磁性纳米颗粒与SA的偶联比为20：1（mg/mg），加入生物素化金黄色葡萄球菌适配体1的终浓度为100nM~500nM。
优选的，所述的步骤（4）中Bio-H1：Bio-H2的摩尔比为1:1，杂交反应时间为1~2h；
优选的，所述的步骤（5）中杂交液为0.01 mol/L PBS，Apt1-MB与金黄色葡萄球菌孵育时间为30~50 min，反应产物的孵育时间为30~50 min，SA-HRP浓度为0.01~0.05 U/mL，终止液为2.0 mol/L 的H2SO4溶液。
上述基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法在食品安全、环境监测中的检测应用。
本发明的检测原理如下：
首先，将Bio-H1和Bio-H2与Apt2- AuNPs-TP混合，引发杂交链式反应（HCR），生成带有许多生物素的长链 DNA；金黄色葡萄球菌的适配体1借助Bio-SA系统固定在Fe3O4磁珠表面，并与之后加入的金黄色葡萄球菌特异性结合，再与金纳米粒子表面的适配体2结合，在磁珠表面形成MB-apt1/靶标/apt2-AuNPs-HCR夹心复合物，当加入SA-HRP后，HCR双链上的Biotin与SA-HRP结合，HRP 催化 TMB 底物显色，最后实现可视化检测，通过目标物加入后吸光值的变化而实现目标物的定量检测（图1）。
有益效果：本发明具有以下有益效果：
（1）灵敏度高：经过结合纳米材料的比表面积和小尺寸效应，杂交链式反应及酶催化两次信号放大效应，以及磁珠的高效分离效应，从而降低基质干扰，更大限度地提高了检测灵敏度。
（2）操作简单：不需昂贵的仪器和繁琐的检测步骤，全过程在恒温条件下进行，操作简单。
（3）成本低：适配体及杂交链可体外人工合成，克服了抗体制备周期长、成本高的缺点，降低了生产成本。
附图说明：
图1为本发明检测原理示意图；
图2为金纳米粒子的透射电镜图；
图3为Fe3O4磁性纳米颗粒透射电镜图；
图4 为比色检测金黄色葡萄球菌的标准曲线图；
图5 为方法特异性验证图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对发明进一步阐述，以便本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定而不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所用适配体（Chang et al. Scientific Reports, 2013, 3:1863-1869）、引发链、发夹DNA均由上海生物工程技术有限公司合成。
实施例1：基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法的建立，包括如下具体步骤：
（1）DNA 修饰金纳米探针的制备：将1 mL 合成的20 nm的纳米金粒子用K2CO3溶液调pH值至8.0，在10000 r/min的条件下离心将其浓缩10倍；分别取10 μL巯基修饰的适配体2（SH-apt2，1 μM）和引发链（TP，5 μM）加入到4 μL 三-（2-甲酰乙基）膦盐酸盐（TCEP, 1mM）溶液中，避光反应1 h后加入到胶体金溶液中，偶联反应2 h，然后加入10 uL dATP（100μM）溶液，室温反应1 h，加入NaCl溶液使其终浓度为80 mM，4℃老化处理过夜；1000 rpm/min，4℃离心10 min，弃上清，得到Apt 1-AuNPs-TP探针，悬浮于100 μL PBS复溶，4 ℃保存；
（2）适配体修饰磁性纳米颗粒的制备：在30 mL 乙二醇中加入6.5g 的1, 6-己二胺，2.0 g 无水醋酸钠（CH3COONa）和1.0 g 六水合三氯化铁（FeCl3·6H2O），50℃搅拌，得胶体溶液，将溶液转移到50 mL 带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，198℃反应6 h。冷却至室温，弃上层液体，去离子水冲出下层固体物质，磁分离收集，分别用去离子水和乙醇洗涤2 次，50℃干燥5-10 h，得到氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒，见图3。
称取10 mg氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒分散于 5 mL 0.01 M PBS中，超声分散15min，加入 1.25 mL 25% 的戊二醛溶液，混合溶液室温下振荡孵育 2 h，磁分离，弃上清，用0.01 mol/L PBS 洗三次，重悬于0.01 M PBS 中，超声分散，加入链霉亲和素，使其浓度为0.5 mg/mL，室温下振荡孵育 12 h，磁分离，PBS洗涤后，悬浮于1.0 mL PBS中，得到表面修饰有链霉亲和素的磁珠（SA-MB）。
取1 mL SA-MB，加入 100 nM的生物素化适配体1（Bio-apt1），37 ℃ 反应2h，磁分离，弃上清，用0.01 M PBS洗涤以去除多余的适配体，最后将得到的适配体功能磁纳米颗粒（Apt1-MB）重悬于1 mL PBS 缓冲液中，4 ℃保存。
（3）HCR 反应产物制备：取浓度为10 μM Bio-H1和Bio-H2，沸水加热5分钟，室温冷却2小时，形成发夹结构，然后将Bio-H1、Bio-H2与apt 2-AuNPs-TP探针按着一定体积比（1:1:1）混合，室温杂交反应 2 h，得HCR反应产物，备用。
（4）金黄色葡萄球菌比色传感器的构建：取含Apt1-MB（10 mg/mL）50μL，加入50 μL不同浓度的金黄色葡萄球菌标准菌株溶液（0、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107cfm/mL），37 ℃孵育30 min，磁分离，PBS洗涤，重悬于100 μL PBS溶液中，加入50 μLHCR反应产物，37℃孵育30 min，磁分离，PBS洗涤，加入100 μL SA-HRP（0.05 U/mL）溶液，室温反应30 min，磁分离，PBS洗涤，每孔加入100 μL TMB，避光显色10 min，加入100μL 终止液（2.0 mol/L 的H2SO4），酶标仪450 nm测吸光值。以金黄色葡萄球菌的浓度的对数为横坐标，以吸光值为纵坐标作图，利用软件绘制标准曲线，建立回归方程，图4为该方法测定的标准曲线：y=0.271x-0.349, R= 0.996，线性范围为102-106 cfu/mL，检测限为10 cfu/mL。
实施例2：基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测牛奶样品
（1）待测样品制备：无菌操作取牛奶样 25 mL加入到质袋中，然后加入25 mL的无菌生理盐水，9000 r/min均质2 min，得到待测样品溶液。
（2）样品检测：取Apt1-MB（10 mg/mL）50μL，添加到酶标板孔中，加入50 μL待测溶液，37 ℃孵育 30 min，磁分离，PBS洗涤，重悬于100 μL PBS溶液中，加入50 μL HCR反应产物，37℃孵育 30 min，磁分离，PBS洗涤，加入100 μL SA-HRP（0.5 μg/mL）溶液，室温反应30min，磁分离，PBS洗涤，每孔加入100 μL TMB，避光显色10 min加入，最后加入100 μL 终止液（2.0 mol/L 的H2SO4），酶标仪450nm 测吸光值，代入标准曲线计算样品中金黄色葡萄球菌含量。
实施例3 ：基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法特异性验证
取含有Apt1-MB（10 mg/mL）的PBS缓冲液添加到酶标板孔中，每孔50μL，分别加入50μL浓度为104 cfu/mL的鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌、痢疾志贺氏菌等标准菌株菌悬液，37 ℃孵育1 h。磁分离，PBS洗涤，重悬于100 uL PBS溶液中，加入50uL HCR反应产物，37℃孵育30 min，磁分离，PBS洗涤。加入100 uL SA-HRP（0.5ug/mL）溶液，室温反应30 min，磁分离，PBS洗涤。每孔加入100 uL TMB，避光显色10min加入，最后加入100 μL 终止液（2.0 mol/L 的H2SO4），酶标仪450nm测吸光值。由图5可知，本发明检测方法的特异性良好，金黄色葡萄球菌的吸光值显著高于其他致病菌的吸光值。
序列表
<110> 长江师范学院
<120> 一种基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用
<130> 2020.01.20
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 1
shtccctacg gcgctaaccc ccc 23
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 2
shaaaaaaaa aatggagtga aggcgcatac ctcttt 36
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 3
tccctacggc gctaacctcc caaccgctcc accctgcctc cgcctcgcca ccgtgctaca 60
ac 62
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 4
gaaggcgcat acctctttaa ttggaaagag gtatgcgcct tcactcca 48
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 5
ccaattaaag aggtatgcgc cttctggagt gaaggcgcat acctcttt 48

Claims (6)

1.一种基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法，所述检测方法为非疾病诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备DNA 功能化纳米金探针：
将巯基修饰的金黄色葡萄球菌适配体2和引发链修饰在纳米金表面，得到DNA修饰的纳米金粒子探针，其中，所述金黄色葡萄球菌适配体2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，适配体2的5’端具有巯基修饰基团；所述引发链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，引发链的5’端具有巯基修饰基团；
(2)制备适配体修饰磁性纳米颗粒：
通过戊二醛法将氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒与链霉亲和素偶联，通过生物素-亲和素系统，将生物素化金黄色葡萄球菌适配体1固定于链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒表面，得到适配体功能化的磁性纳米颗粒，其中，所述金黄色葡萄球菌适配体1的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，适配体1的5’端标记有biotin；
(3)合成用于杂交链式反应体系的发夹探针：
根据杂交链式反应原理，合成用于杂交链式反应的发夹探针H1和发夹探针H2的序列，并将发夹探针H1和发夹探针H2的一端标记生物素，得到生物素化发夹探针Bio-H1和生物素化发夹探针Bio-H2，其中，所述发夹探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，其5’端标记有biotin；所述发夹探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，其3’端标记有biotin；
(4)制备HCR 反应产物：
将步骤（3）中合成的生物素化发夹探针Bio-H1和生物素化发夹探针Bio-H2，与步骤（1）中制备的DNA 功能化纳米金探针混合，引发杂交链式反应，在纳米金表面生成杂交链式反应产物，其中，生物素化发夹探针Bio-H1和生物素化发夹探针Bio-H2，与步骤（1）中制备的DNA 功能化纳米金探针的体积比为1:1:1；
(5)检测靶标：
将步骤（2）中制备的适配体功能化的磁性纳米颗粒置于杂交液中，杂交液为0.01 mol/L PBS，与金黄色葡萄球菌混合，孵育，加入HCR反应产物，孵育，加入链霉亲和素标记的辣根过氧化酶溶液，TMB显色，加入终止液终止反应，终止液为2.0 mol/L 的H2SO4溶液，根据吸光值大小与金黄色葡萄球菌浓度的对应关系，获得待测液中金黄色葡萄球菌的浓度。
2.根据权利要求1所述基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中纳米金粒子的粒径为15~25 nm。
3.根据权利要求1所述基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中Fe3O4磁性纳米颗粒的粒径为30~50 nm，Fe3O4磁性纳米颗粒与链霉亲和素的偶联质量比为20:1，加入生物素化金黄色葡萄球菌适配体1的终浓度为100nM~500nM。
4.根据权利要求1所述基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中杂交链式反应的时间为1~2h。
5.根据权利要求1所述基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法，其特征在于：所述步骤（5）中杂交液的pH值为7.4，适配体功能化的磁性纳米颗粒与金黄色葡萄球菌的孵育时间为30~60 min，反应产物的孵育时间为30~60 min，链霉亲和素标记的辣根过氧化酶溶液的浓度为0.01~0.05 U/mL。
6.如权利要求1～5任一项所述基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法在食品安全、环境监测中的检测应用。
CN202010069476.6A 2020-01-21 2020-01-21 一种基于适配体识别-hcr反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用 Active CN111235233B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010069476.6A CN111235233B (zh) 2020-01-21 2020-01-21 一种基于适配体识别-hcr反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010069476.6A CN111235233B (zh) 2020-01-21 2020-01-21 一种基于适配体识别-hcr反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111235233A CN111235233A (zh) 2020-06-05
CN111235233B true CN111235233B (zh) 2023-07-18

Family

ID=70879741

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010069476.6A Active CN111235233B (zh) 2020-01-21 2020-01-21 一种基于适配体识别-hcr反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111235233B (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113249443B (zh) * 2021-05-20 2023-06-16 中国科学技术大学 基于dna自组装的预制放大单元的扩增检测方法
CN113176243B (zh) * 2021-06-08 2022-07-29 江苏大学 一种食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法
CN113466445B (zh) * 2021-06-30 2023-06-30 陕西师范大学 基于杂交链式-酶显色反应检测Hg2+和Ag+的生物传感器及其制备方法和应用
CN113702308B (zh) * 2021-08-25 2024-01-30 青岛大学 用于大肠杆菌检测的适配体纳米比色生物传感器及应用
CN114354701B (zh) * 2021-12-15 2024-02-13 宁波大学 基于目标触发连续多级信号放大检测金黄色葡萄球菌的电化学传感器的制备方法及其应用
CN114675032B (zh) * 2022-01-17 2023-12-05 吉林大学 试剂盒、制备方法及其在检测动物旋毛虫病中的应用
CN114563568A (zh) * 2022-03-01 2022-05-31 浙江省轻工业品质量检验研究院 大肠杆菌-金葡菌生物传感器及其应用
CN114763572B (zh) * 2022-04-01 2024-07-23 海南医学院 一种登革病毒ns1基因片段裸眼检测平台及制备方法
CN114875178B (zh) * 2022-05-11 2024-04-12 山东大学 一种基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系及检测方法
CN116804673B (zh) * 2023-06-20 2024-03-01 江南大学 集成多价适配体和多功能纳米酶的致病菌侧流层析检测方法
CN116794013A (zh) * 2023-06-25 2023-09-22 上海上药杏灵科技药业股份有限公司 一种银杏酮酯总混样品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108977502A (zh) * 2018-06-26 2018-12-11 吉林大学 一种灵敏快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素b的检测方法
CN109207567A (zh) * 2018-09-26 2019-01-15 江南大学 一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108977502A (zh) * 2018-06-26 2018-12-11 吉林大学 一种灵敏快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素b的检测方法
CN109207567A (zh) * 2018-09-26 2019-01-15 江南大学 一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Aptamer-Based Lateral Flow Test Strip for the Simultaneous Detection of Salmonella typhimurium, Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus;Chunxia Lu等;《Analytical Letters》;20190917;第53卷(第4期);第646-659页 *
基于适配体识别-杂交链式反应可视化检测金黄色葡萄球菌;卢春霞等;《食品与发酵工业》;20210611;第48卷(第2期);第274-279页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111235233A (zh) 2020-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111235233B (zh) 一种基于适配体识别-hcr反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用
Zou et al. Rapid detection of Salmonella in milk by biofunctionalised magnetic nanoparticle cluster sensor based on nuclear magnetic resonance
AU2020205292B2 (en) Biosensor for detection of salmonella typhimurium and its application
WO2011144012A1 (zh) 一种快速检测微生物的磁性荧光试剂盒及其制备方法和使用方法
CN113866408B (zh) 基于核酸适配体、纳米粒子和量子点标记检测食源性肠道致病菌o157：h7的方法
CN111351943B (zh) 一种基于适配体识别-hcr反应的牛早孕快速检测方法及应用
CN111139288B (zh) 基于适配体识别-杂交链式反应同时检测金黄色葡萄球菌肠毒素a、b的荧光传感器
CN106568951A (zh) 基于核酸适配体的大肠杆菌o157：h7胶体金试纸条及检测方法
Ye et al. An electrochemical immunoassay for Escherichia coli O157: H7 using double functionalized Au@ Pt/SiO2 nanocomposites and immune magnetic nanoparticles
CN102928590A (zh) 一种快速检测沙门氏菌的荧光量子点筛选分离检测试剂盒
Zhao et al. Rapid detection of Cronobacter sakazakii in dairy food by biofunctionalized magnetic nanoparticle based on nuclear magnetic resonance
CN109655609B (zh) 铂-纳米花及其制备方法和应用
Ding et al. A fluorescent biosensor based on quantum dot–labeled streptavidin and poly-l-lysine for the rapid detection of Salmonella in milk
Sun et al. A nonenzymatic optical immunoassay strategy for detection of Salmonella infection based on blue silica nanoparticles
Wang et al. Sensitive immunoassay of Listeria monocytogenes with highly fluorescent bioconjugated silica nanoparticles probe
Jin et al. NMR rapid detection of Salmonella in milk based on ultra-small iron oxide nanobiosensor
Shan et al. Bilinear Staphylococcus aureus detection based on suspension immunoassay
CN105950471B (zh) 一种基于免疫磁珠技术快速捕获克罗诺杆菌的方法及应用
Duan et al. Preparation of immunomagnetic iron-dextran nanoparticles and application in rapid isolation of E. coli O157: H7 from foods
CN107084976A (zh) 一种基于适配体识别和过氧化物模拟酶可视化检测沙门氏菌的方法
Ye et al. An ultrasensitive sandwich immunoassay with a glucometer readout for portable and quantitative detection of Cronobacter sakazakii
CN111796092B (zh) 基于pH响应的异色纳米颗粒、含有该纳米颗粒的致病菌检测试剂盒及检测方法
CN110564816B (zh) 基于免疫双标记胶体金探针与杂交链式扩增检测单增李斯特菌的试剂盒和应用及检测方法
CN113376371B (zh) 一种铂壳金核纳米酶介导的磁弛豫传感信号放大系统的构建方法及其应用
CN114705854A (zh) 一种检测沙门氏菌的适体生物传感器及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant