CN114875178B - 一种基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系及检测方法 - Google Patents
一种基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114875178B CN114875178B CN202210512078.6A CN202210512078A CN114875178B CN 114875178 B CN114875178 B CN 114875178B CN 202210512078 A CN202210512078 A CN 202210512078A CN 114875178 B CN114875178 B CN 114875178B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chain reaction
- hybridization chain
- cov
- sars
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 69
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 43
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 21
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 21
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 32
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims description 13
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 7
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 8
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 7
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 7
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101000666833 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 20.8 kDa protein in FGF-VUBI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000977027 Azospirillum brasilense Uncharacterized protein in nodG 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000962005 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 23.6 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 101000785191 Drosophila melanogaster Uncharacterized 50 kDa protein in type I retrotransposable element R1DM Proteins 0.000 description 1
- 101000747704 Enterobacteria phage N4 Uncharacterized protein Gp1 Proteins 0.000 description 1
- 101000861206 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) Uncharacterized protein EF_A0048 Proteins 0.000 description 1
- 101000769180 Escherichia coli Uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- -1 Gold nucleic acid Chemical class 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101000976301 Leptospira interrogans Uncharacterized 35 kDa protein in sph 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241001089723 Metaphycus omega Species 0.000 description 1
- 101000658690 Neisseria meningitidis serogroup B Transposase for insertion sequence element IS1106 Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101000748660 Pseudomonas savastanoi Uncharacterized 21 kDa protein in iaaL 5'region Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101000584469 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P1 Proteins 0.000 description 1
- 101000818096 Spirochaeta aurantia Uncharacterized 15.5 kDa protein in trpE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000766081 Streptomyces ambofaciens Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in unstable DNA locus Proteins 0.000 description 1
- 101000804403 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HIT-like protein Synpcc7942_1390 Proteins 0.000 description 1
- 101000750910 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator Synpcc7942_2319 Proteins 0.000 description 1
- 101000644897 Synechococcus sp. (strain ATCC 27264 / PCC 7002 / PR-6) Uncharacterized protein SYNPCC7002_B0001 Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 101000916336 Xenopus laevis Transposon TX1 uncharacterized 82 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001000760 Zea mays Putative Pol polyprotein from transposon element Bs1 Proteins 0.000 description 1
- 101000678262 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 10988 / DSM 424 / LMG 404 / NCIMB 8938 / NRRL B-806 / ZM1) 65 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960004407 chorionic gonadotrophin Drugs 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000009351 contact transmission Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000010460 detection of virus Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002343 gold Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009597 pregnancy test Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 229940071240 tetrachloroaurate Drugs 0.000 description 1
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 150000004684 trihydrates Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种基于杂交链式反应的SARS‑CoV‑2检测体系及检测方法。所述检测体系包括连接器、杂交链式反应发夹探针1、杂交链式反应发夹探针2、纳米金粒子和盐溶液。本发明还提供了利用该检测体系检测SARS‑CoV‑2的方法。本发明提供了一种基于杂交链式反应的SARS‑CoV‑2检测体系,以DNA三联体为识别导向,结合杂交链反应,设计连接器和杂交链式反应发夹探针,利用杂交链反应产物和纳米金粒子亲和力较弱的特性,实现了可视化的SARS‑CoV‑2检测,并且本发明的检测体系具有干扰因素少、价格便宜和稳定性好的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系及检测方法,属于生物检测技术领域。
背景技术
新型冠状病毒感染症(COVID-19)在全球范围内迅速蔓延,对公共卫生造成严重威胁,对人们的日常生活产生重大影响。它是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染引起的,SARS-CoV-2是属于冠状病毒科的单链RNA病毒,主要传播途径为呼吸道飞沫和接触传播。及时、准确地发现病毒是控制疫情和早治疗感染病例的关键。虽然实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)是最常见的检测SARS-CoV-2的方法,但由于其需要将病毒RNA通过逆转录酶转化为互补DNA(cDNA),且周转时间较长,因此需要进一步开发替代的检测分析技术。此外,由污染引物二聚产生的假阳性结果或由DNA聚合酶失活产生的假阴性结果也会影响检测的可靠性。对专业设备、专有试剂和受过培训的人员的需求会进一步限制该方法的推广。
由于qPCR设备的使用受限,降低了诊断效率,为大规模测试中巨大的检测需求带来了压力。一个主要的问题是尽量降低对精确温度变化和实时监测所必需的设备的要求。近年来,基于等温DNA扩增的新冠病毒核酸检测方法被设计出来,如环介导等温扩增(LAMP),其产生的茎环DNA有多个反向重复的目标和CRISPR/Cas系统,其结合靶区后导致DNA裂解。信号输出多为荧光信号,如荧光强度、最大荧光阈值时间或荧光极性等。为了使输出信号更容易测量以及可视化,最近开发了比色测定方法,如怀孕试验条带上的LAMP介导染色和CRISPR/Cas12a介导的纳米颗粒聚集。在这类检测方法中蛋白质酶是必需的,例如LAMP中的DNA聚合酶或CRISPR中的Cas12a蛋白,因此它有酶失活的风险,需要更严格的反应条件。而某些酶对DNA的专一作用,靶RNA片段在大多数情况下仍需逆转录。此外,低聚核苷酸需要用官能团进行标记,需要繁琐的修饰步骤,例如,将胺化DNA与人绒毛膜促性腺激素结合,或将硫代DNA修饰到纳米颗粒上,需要几天的制备时间。在一定程度上,使操作更加复杂,延迟了检测时间,增加了检测成本。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系及检测方法。
一种基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系,包括连接器、杂交链式反应发夹探针1、杂交链式反应发夹探针2、纳米金粒子和盐溶液;
所述连接器的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;
所述杂交链式反应发夹探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;
所述杂交链式反应发夹探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
根据本发明优选的,所述纳米金粒子的制备方法如下:
配制浓度为38.8mM的柠檬酸钠水溶液,配制浓度为1mM的HAuCl4水溶液;将HAuCl4水溶液加热至沸腾,然后一边搅拌一边将柠檬酸钠水溶液加入至HAuCl4水溶液中,在加热沸腾状态下,反应10min,反应完成后再搅拌15min,冷却至25℃,过滤,得到纳米金粒子(AuNPs)。
根据本发明优选的,所述盐溶液为NaCl溶液。
一种SARS-CoV-2检测试剂盒,所述试剂盒包括上述基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系。
根据本发明优选的,所述试剂盒中连接器的工作液浓度为100nM,杂交链式反应发夹探针1的工作液浓度为400nM、杂交链式反应发夹探针2的工作液浓度为400nM、纳米金粒子的工作浓度为3nM,盐溶液的工作浓度为50nM。
根据本发明优选的,所述工作液的溶剂为HEPES缓冲液,所述HEPES缓冲液的浓度为10mM。
利用上述检测体系或检测试剂盒检测SARS-CoV-2的方法,包括步骤如下:
(1)将杂交链式反应发夹探针1和杂交链式反应发夹探针2在95℃下加热2min,得到退火后的杂交链式反应发夹探针1和杂交链式反应发夹探针2;
(2)将退火后的杂交链式反应发夹探针1、杂交链式反应发夹探针2、连接器和待测样本混合,在37℃下孵育3h;然后将孵育后的混合物加入到纳米金粒子溶液中,在37℃下孵育3~8min,继续加入盐溶液,当孵育液显示紫色,则待测样本中包含SARS-CoV-2。
根据本发明优选的,步骤(2)中,所述孵育后的混合物和纳米金粒子溶液的体积比为1:11。
在本发明中,杂交链式反应发夹探针1简称为H1,杂交链式反应发夹探针2简称H2。
本发明检测SARS-CoV-2的技术原理如下:
如图1所示,本申请发明人从SARS-CoV-2病毒基因组开放阅读框和核衣壳选择两个RNA基因片段ORF1ab和N,核苷酸序列分别如SEQ ID No.4所示和SEQ ID No.5所示。然后根据这两个基因片段设计了连接器connector(SEQ ID No.1)、H1(SEQ ID No.2)和H2(SEQID No.3)。连接器connector与ORF1ab的3'端结构域和N的5'端结构域杂交,诱导产生DNA三联体,ORF1ab的5'端结构域和N的3'端结构域保持未杂化,它们结合在一起形成一个暴露区域,作为一个检测立足点。H1的单链尾部和部分茎部区域与立足点互补。当通过立足点进攻DNA三联体时,H1和H2之间的杂交链式反应(HCR)被触发,两个发夹交替打开,产生有缺口的双螺旋长链。由于嵌入的碱基和宏观链的长度,生成的HCR产物对未修饰的纳米金粒子(AuNPs)表现出较弱的亲和力,DNA螺旋长链不能吸附到AuNPs上并提供保护,在高盐浓度下不能稳定纳米金粒子,导致纳米粒子在高盐浓度下聚集发生颜色变化。因此,当ORF1ab和N同时存在时,可以观察到颜色转变为紫色。仅ORF1ab或N存在时不能形成位点来触发HCR扩增,大量的H1和H2通过尾部的锻炼吸附到AuNPs上,保护AuNPs不受盐诱导的聚集,并保持溶液红色,从而可以根据溶液颜色来判断待测样本中是否包含SARS-CoV-2。
本发明的有益效果如下:
1、本发明提供了一种基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系,以DNA三联体为识别导向,结合杂交链反应,设计连接器和杂交链式反应发夹探针,利用杂交链反应产物和纳米金粒子亲和力较弱的特性,实现了可视化的SARS-CoV-2检测,并且本发明的检测体系具有干扰因素少、价格便宜和稳定性好的优点。
2、本发明提供的检测方法选择性良好,灵敏度高,在缺少任何一个序列的情况下,颜色不会改变,能以单核苷酸特异性区分目标序列。利用本发明的体系或试剂盒进行检测时,不需要逆转录步骤,避免了酶、标记或修饰的使用,结果可视化,减少了对复杂设备的需求,为SARS-CoV-2病毒检测提供一种方便、经济、快速、可靠的方法。
附图说明
图1为本发明杂交链式反应可视化检测核酸标志物的原理示意图。
图2为天然聚丙烯酰胺凝胶电泳验证DNA三联体的形成结果图。
泳道M:500bp DNA标记;泳道1:ORF1ab序列;泳道2:N序列;泳道3:connector序列;泳道4:ORF1ab+N+connector。
图3为琼脂糖凝胶电泳对H1/H2的最佳茎长与立足点触发杂交链反应的研究结果图。
泳道1、2:茎长为13个碱基对的H1/H2发夹;泳道3、4:茎长为15个碱基对的H1/H2;泳道5、6:茎长为17个碱基对的H1/H2发夹。泳道7:50bp DNA ladder。
图4为用琼脂糖凝胶电泳法对最佳HCR反应时间的研究结果图。
泳道1:H1+H2;泳道2到5:HCR反应时间分别为1h、2h、3h和4h;泳道6:50bp DNAladder。
图5为AuNPs的紫外-可见吸收光谱(A)、透射电子显微镜图像(B)和AuNP溶液的照片(C)。
图6为本发明检测体系在检测浓度为33nM的SARS-CoV-2病毒基因片段和浓度为0nM的SARS-CoV-2病毒基因片段的紫外-可见吸收光谱(A)、动态光散射表征(B)和AuNP溶液的颜色变化照片(C)。
图7为本发明检测体系在检测梯度浓度为0、20/3、40/3、20、80/3、33nM的SARS-CoV-2病毒的紫外-可见吸收光谱图(A)、紫外吸收比与病毒双基因片段浓度的关系图(B)和可视化溶液颜色变化图(C)。
图8为杂交链式反应的反应产物随ORF1ab和N浓度增加的变化规律的研究结果图。
泳道1:H1+H2+0.25×connector;泳道2:H1+H2+0.25×connector+0.15×(ORF1ab+N);泳道3:H1+H2+0.25×connector+0.20×(ORF1ab+N);泳道4:H1+H2+0.25×connector+0.25×(ORF1ab+N);泳道5:50bp DNA ladder。
图9为无SARS-CoV-2病毒基因片段、单ORF1ab或N的SARS-CoV-2病毒基因片段、SARS-CoV-2病毒基因片段的可视化观察结果图(A)和ORF1ab序列单碱基突变的可视化观察结果图(B)。
图中,0为不含有ORF1ab或N,1为含有ORF1ab或N。
图10为本发明检测体系在检测无SARS-CoV-2病毒基因片段、单ORF1ab或N的SARS-CoV-2病毒基因片段、SARS-CoV-2病毒基因片段紫外-可见吸收光谱图。
图11为通过琼脂糖凝胶电泳方法对病毒基因片段的不同存在情况引发HCR反应的研究结果图。
泳道1:H1+H2+0.25×connector;泳道2:H1+H2+0.25×(connector+ORF1ab);泳道3:H1+H2+0.25×(connector+N);泳道4:H1+H2+0.25×(connector+ORF1ab+N);泳道5:50bpDNA ladder。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明,但本发明的保护范围并不仅限于此。
凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
试剂和原料
DNA序列(表S1)由生工生物工程股份有限公司(上海,中国)合成和纯化。
琼脂糖和4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)购自阿拉丁生化科技有限公司(上海,中国)。
40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺(19:1)溶液,过硫酸铵(APS),N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED),Tris,乙二胺四乙酸四钠(EDTA),购自生工生物工程股份有限公司(上海,中国)。
SYBR Gold核酸凝胶染料购自赛默飞世尔科技公司。
四氯金酸氢(Ⅲ)三水合物(HAuCl4·3H2O)和柠檬酸钠购自Sigma-Aldrich公司(密苏里州,美国)。
所有其他试剂均为分析纯,按原样使用。在整个实验过程中,使用了从UP水净化系统获得的超纯水(18.25MΩ·cm)。
500bp DNA marker购自生工生物工程股份有限公司(上海,中国)。
50bp DNA ladder购自宝日生物医学技术有限公司(北京)。
TU-1901光谱仪(普析,中国)记录紫外可见吸收光谱。染色的聚丙烯酰胺凝胶在GelDocTM XR+成像系统(Bio-RAD Laboratories Inc.,美国)上成像。在纳米粒度电位仪(Malvern,英国)上进行了动态光散射(DLS)测量。透射电子显微镜(TEM)测量在加速电压为200kV的JSM-6700F透射电子显微镜上进行(JEOL,日本)。其它如无特殊说明,均可从商业途径获得。
表1.实施例中使用的寡核苷酸序列
表1中,在ORF1ab和N序列中斜体标记的碱基代表协同立足点的两个部分。ORF1ab和connector序列之间的互补碱基为宋体小四,N和connector序列之间的互补碱基用粗体标记。上标13、15和17分别代表不同茎长的H1和H2发夹,茎部分用下标标注。ORF1ab中不匹配的碱基用粗体标记。ORF1ab中被删除的碱基用短划线标记。ORF1ab中插入的碱基用粗体标记,原始碱基用粗体标记。
实施例1
本发明根据NCBI数据库已经公开的SARS-CoV-2病毒基因组信息(NCBI参考序列:NC_045512.2),从开放阅读框和核衣壳选择两个RNA基因片段ORF1ab(SEQ ID No.4)和N(SEQ ID No.5),然后根据这两个基因片段设计了连接器Connector,引发序列Initiator和三组杂交链式反应发夹探针,分别为H113和H213、H115和H215、H117和H217,具体序列如表1所示。然后由生工生物工程股份有限公司(上海,中国)合成和纯化。
实施例2验证DNA三联体的形成
1、聚丙烯酰胺凝胶电泳
通过混合6.25mL 40%的丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液(19:1),5mL 1×TBE缓冲液(89mM Tris,89mM硼酸,2mM EDTA,pH 8.0),13.75mL的超纯水,180μL 0.1g/mL APS和18μLTEMED制备10%聚丙烯酰胺凝胶。取ORF1ab序列、N序列、connector序列和ORF1ab+N+connector序列各6μL,分别与4μL HEPES缓冲液(10mM HEPES,300mM NaCl,pH 7.0)和2μL 6×loading Buffer混合,将2μL的混合液注入凝胶孔中。凝胶在1×TBE缓冲液中,在4℃,150v下的条件下运行5h,用1×SYBR Gold染色30min后,用成像系统成像,结果如图2所示。
由图2可知,连接器connector与ORF1ab的3'端结构域和N的5'端结构域杂交,诱导产生DNA三联体。
实施例3
1、DNA与RNA溶液的制备与储存
在TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0)中制备表1中所述序列的浓缩DNA原液,用HEPES缓冲液(10mM HEPES,300mM NaCl,pH 7.0)稀释至工作液浓度。
浓缩方法:将核酸序列溶于管上所标识微升数的TE缓冲溶液中,用紫外吸收光谱法测定浓缩液浓度。
将H113和H213、H115和H215、H117和H217在95℃下加热2min,缓慢冷却至室温。将退火后的H113和H213、H115和H215、H117和H217保存在4℃备用。
2、H1和H2的选择
将浓度为400nM的H113和H213、H115和H215、H117和H217在HEPES缓冲液中分别与浓度为100nM的连接器connector、浓度为100nM的ORF1ab、浓度为100nM的N混合,在37℃的条件下反应3h,形成了DNA三联体触发的聚合反应,将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果如图3所示。
由图3可知,茎长为13个碱基对的H1/H2发夹在没有和存在DNA三联体的情况下均可聚合;茎长为15个碱基对的H1/H2发夹在没有DNA三复合体时不杂交,而在有DNA三复合体时聚合;茎长为17个碱基对的H1/H2发夹在没有DNA三联体的情况下不杂交,在有DNA三联体的情况下很少聚合。因此选择H115和H215作为发夹探针,以下实施例中H1和H2均指H115和H215。
3、最佳反应时间的确定
将浓度为400nM的退火后H15和H215与浓度为100nM的连接器connector、浓度为100nM的ORF1ab、浓度为100nM的N在HEPES缓冲液中混合,在37℃的条件下孵育1h、2h、3h和4h,然后将孵育产物进行琼脂糖凝胶,结果如图4所示。
由图4可知,最佳反应时间为3h。
实施例4
1、纳米金粒子的制备方法如下:
配制10mL浓度为38.8mM的柠檬酸钠水溶液,配制100mL浓度为1mM的HAuCl4水溶液;将HAuCl4水溶液加热至沸腾,然后一边剧烈搅拌一边将柠檬酸钠水溶液快速加入至HAuCl4水溶液中,在加热沸腾状态下,反应10min,反应完成后再搅拌15min,冷却至25℃,通过0.22μm过滤器过滤,得到纳米金粒子(AuNPs)。
2、透射电子显微镜表征
在碳包覆铜栅上加入一滴纳米金粒子溶液,室温干燥,制备用于TEM表征的样品。在加速电压为200kV的JSM-6700F透射电子显微镜上进行表征。
本实施例AuNPs的紫外-可见吸收光谱如图5A所示,透射电子显微镜(TEM)图像如图5B所示,AuNP溶液的照片如图5C所示。
由图5A、图5B和图5C可知,AuNPs合成成功,AuNPs溶液颜色为红色。
实施例5
一种基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系或检测试剂盒,包括连接器connector、杂交链式反应发夹探针1(H1)、杂交链式反应发夹探针2(H2)、AuNPs和NaCl溶液。
所述连接器connector的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;所述H1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;所述H2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
所述连接器connector的工作液浓度为100nM,H1的工作液浓度为400nM、H2的工作液浓度为400nM、AuNPs的工作浓度为3nM,NaCl溶液的工作浓度为50nM。
利用SARS-CoV-2检测体系或检测试剂盒检测SARS-CoV-2的方法,包括步骤如下:
(1)将H1和H2在95℃下加热2min,得到退火后的H1和H2;
(2)将退火后的H1、H2、连接器connector和待测样本混合,在37℃下孵育3h;然后将孵育后的4μL混合物加入到44μL的AuNPs溶液中,在37℃下孵育5min,继续加入5.34μL的NaCl溶液,当孵育液显示紫色,则待测样本中包含SARS-CoV-2。
分别以浓度为33nM的SARS-CoV-2病毒基因片段和浓度为0nM的SARS-CoV-2病毒基因片段作为待测样本,按照上述方法进行检测,并对最终反应液进行动态光散射表征,结果如图6所示。
动态光散射表征方法如下:将50μL的反应液加入到50μL的一次性比色皿(Sarstedt,德国)中,在纳米粒度电位仪上进行了动态光散射表征,并测量。
由图6可知,浓度为33nM的SARS-CoV-2病毒基因片段在550~700nm处的吸光度明显高于浓度为0nM的SARS-CoV-2病毒基因片段(图6A),浓度为33nM的SARS-CoV-2病毒基因片段和浓度为0nM的SARS-CoV-2病毒基因片段的动态光散射表征相比说明了在加入SARS-CoV-2病毒后AuNPs有明显的聚集(图6B),浓度为33nM的SARS-CoV-2病毒基因片段的反应液颜色为紫色(+),浓度为0nM的SARS-CoV-2病毒基因片段的反应液颜色为红色(-)(图6C)。
分别以梯度浓度为0、20/3、40/3、20、80/3、33nM的SARS-CoV-2病毒作为待测样本,按照上述方法进行检测,检测结果如图7所示。
由图7可知,本发明检测体系的检测线为2nM。
实施例6
1、将H1、H2、connector、ORF1ab和N分别按照以下浓度进行杂交链式反应,反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果如图8所示。
①400nM H1+400nM H2+100nM connector;
②400nM H1+400nM H2+100nM connector+60nM ORF1ab+60nM N;
③400nM H1+400nM H2+100nM connector+80nM ORF1ab+80nM N;
④400nM H1+400nM H2+100nM connector+100nM ORF1ab+100nM N;
由图8可知,当ORF1ab和N浓度和connector为1:1的时候,H1和H2被完全反应。
2、将H1、H2、connector、ORF1ab和N分别按照以下浓度进行杂交链式反应,反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果如图11所示。
①400nM H1+400nM H2+100nM connector;
②400nM H1+400nM H2+100nM connector+100nM ORF1ab;
③400nM H1+400nM H2+100nM connector+100nM N;
④400nM H1+400nM H2+100nM connector+100nM ORF1ab+100nM N;
由图11可知,在ORF1ab和N双靶标核酸序列的存在下,HCR反应才能被触发。
实施例7
1、分别以无SARS-CoV-2病毒基因片段(SARS-CoV-2病毒浓度为0nM)、仅含ORF1ab的SARS-CoV-2病毒基因片段(浓度为33nM)、仅含N的SARS-CoV-2病毒基因片段(浓度为33nM)和SARS-CoV-2病毒基因片段(浓度为33nM)作为待测样本,按照实施例5所述方法进行检测,检测结果如图9A,其反应液进行紫外-可见吸收光谱图如图10所示。
由图9A可知,本发明的检测体系对含有ORF1ab+N的SARS-CoV-2病毒基因片段具有特异性,只有ORF1ab+N时,反应液显示紫色,无ORF1ab或N、仅含有ORF1ab或N,均显示红色。图10进一步说明了单个靶标核酸序列ORF1ab或N不能引起变色。
2、分别以ORF1ab发生碱基错配的SARS-CoV-2病毒基因片段(ORF1ab-Mismatched,表1,浓度为33nM)、ORF1ab发生碱基缺失的SARS-CoV-2病毒基因片段(ORF1ab-Deleted,表1,浓度为33nM)、ORF1ab发生碱基插入的SARS-CoV-2病毒基因片段(ORF1ab-Inserted,表1,浓度为33nM)和SARS-CoV-2病毒基因片段(matched,浓度为33nM)作为待测样本,按照上实施例5所述方法进行检测,检测结果如图9B所示。
由图9B可知,ORF1ab序列发生碱基错配、缺失和插入的SARS-CoV-2病毒基因片段也均显示红色,SARS-CoV-2病毒基因片段显示紫色。说明单个靶标核酸序列ORF1ab发生碱基错配、缺失和插入后也不能引起变色,保证了检测准确率。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系及检测方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccgtctgcgg tatgtgagaa tggctggcaa tg 32
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agttctcctg ctgaaaggtt atggccctaa ctaccataac ctttcagc 48
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccataacctt tcagcaggag aactgctgaa aggttatggt agttaggg 48
<210> 4
<211> 28
<212> RNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 4
ccauaaccuu uccacauacc gcagacgg 28
<210> 5
<211> 28
<212> RNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 5
cauugccagc cauucuagca ggagaacu 28
Claims (5)
1.一种基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系,其特征在于,包括连接器、杂交链式反应发夹探针1、杂交链式反应发夹探针2、ORF1ab序列、N序列、纳米金粒子和盐溶液;
所述连接器的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;
所述杂交链式反应发夹探针1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;
所述杂交链式反应发夹探针2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;
所述ORF1ab序列的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;
所述N序列的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示;
所述盐溶液为NaCl溶液;所述连接器的工作液浓度为100nM,杂交链式反应发夹探针1的工作液浓度为400nM、杂交链式反应发夹探针2的工作液浓度为400nM、ORF1ab序列的工作液浓度为100nM,N序列的工作液浓度为100nM、纳米金粒子的工作浓度为3nM,盐溶液的工作浓度为50nM。
2.如权利要求1所述的基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系,其特征在于,所述纳米金粒子的制备方法如下:
配制浓度为38.8mM的柠檬酸钠水溶液,配制浓度为1mM的HAuCl4水溶液;将HAuCl4水溶液加热至沸腾,然后一边搅拌一边将柠檬酸钠水溶液加入至HAuCl4水溶液中,在加热沸腾状态下,反应10min,反应完成后再搅拌15min,冷却至25℃,过滤,得到纳米金粒子。
3.如权利要求1所述的基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系,其特征在于,所述工作液的溶剂为HEPES缓冲液,所述HEPES缓冲液的浓度为10 mM。
4.利用权利要求1所述的检测体系以非诊断目的检测SARS-CoV-2的方法,包括步骤如下:
(1)将杂交链式反应发夹探针1和杂交链式反应发夹探针2在95℃下加热2 min,得到退火后的杂交链式反应发夹探针1和杂交链式反应发夹探针2;
(2)将退火后的杂交链式反应发夹探针1、杂交链式反应发夹探针2、连接器和待测样本混合,在37℃下孵育3h;然后将孵育后的混合物加入到纳米金粒子溶液中,在37℃下孵育3~8min,继续加入盐溶液,当孵育液显示紫色,则待测样本中包含SARS-CoV-2。
5.如权利要求4所述的以非诊断目的检测SARS-CoV-2的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述孵育后的混合物和纳米金粒子溶液的体积比为1:11。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210512078.6A CN114875178B (zh) | 2022-05-11 | 2022-05-11 | 一种基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210512078.6A CN114875178B (zh) | 2022-05-11 | 2022-05-11 | 一种基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系及检测方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114875178A CN114875178A (zh) | 2022-08-09 |
CN114875178B true CN114875178B (zh) | 2024-04-12 |
Family
ID=82676578
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210512078.6A Active CN114875178B (zh) | 2022-05-11 | 2022-05-11 | 一种基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系及检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114875178B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116004911A (zh) * | 2022-10-17 | 2023-04-25 | 山东大学 | 一种用于检测SARS-CoV-2的试纸条及其制备和检测方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111235233A (zh) * | 2020-01-21 | 2020-06-05 | 长江师范学院 | 一种基于适配体识别-hcr反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用 |
CN111676317A (zh) * | 2020-06-05 | 2020-09-18 | 南京大学 | 一种基于DNA纳米支架快速检测SARS-CoV-2的方法 |
US10815539B1 (en) * | 2020-03-31 | 2020-10-27 | Diasorin S.P.A. | Assays for the detection of SARS-CoV-2 |
CN114032339A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-02-11 | 湖南工程学院 | 一种检测鼻咽癌的超支化杂交链式反应信号放大体系、试剂盒和检测方法 |
-
2022
- 2022-05-11 CN CN202210512078.6A patent/CN114875178B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111235233A (zh) * | 2020-01-21 | 2020-06-05 | 长江师范学院 | 一种基于适配体识别-hcr反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用 |
US10815539B1 (en) * | 2020-03-31 | 2020-10-27 | Diasorin S.P.A. | Assays for the detection of SARS-CoV-2 |
CN111676317A (zh) * | 2020-06-05 | 2020-09-18 | 南京大学 | 一种基于DNA纳米支架快速检测SARS-CoV-2的方法 |
CN114032339A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-02-11 | 湖南工程学院 | 一种检测鼻咽癌的超支化杂交链式反应信号放大体系、试剂盒和检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
杂交链式反应技术结合纳米材料用于核酸检测的研究进展;刘永新;袁旦;陈沁;钮冰;;中国材料进展;20200415(04);第77-83页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114875178A (zh) | 2022-08-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106947838B (zh) | 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
CN108774639B (zh) | 一种定向聚合的荧光探针pcr | |
Eun et al. | Molecular beacons: a new approach to plant virus detection | |
CN111690773A (zh) | 利用新型Cas酶进行目标核酸检测的方法和系统 | |
WO2022042568A1 (zh) | 基于crispr技术进行多重核酸检测的方法 | |
CN107022651B (zh) | 一种快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒及其检测方法 | |
CN108220480B (zh) | 一种用于特异性检测hpv18的rpa荧光定量引物对、探针及试剂盒 | |
CN113046475B (zh) | 一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物及试剂盒 | |
CN111876469B (zh) | 利用核酸类似物进行靶核酸检测的方法 | |
WO2022012423A1 (zh) | 利用含有无碱基间隔物的核酸检测器检测靶核酸的方法 | |
CN113502335A (zh) | 一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用 | |
CN114875178B (zh) | 一种基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系及检测方法 | |
WO2023279042A2 (en) | Compositions and methods for detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 variants | |
KR20190041237A (ko) | 뎅기 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도 | |
CN114480583A (zh) | 比色生物传感器及其制备方法和检测新型冠状病毒的方法 | |
WO2017090915A1 (ko) | 유전성 난청 검출용 pna 프로브 및 이를 이용한 유전성 난청 검출방법 | |
CN113846168B (zh) | 一种原发性肝癌的分子标记物的检测试剂及其应用 | |
CN113774141B (zh) | 一种用于双位点顺反式突变检测的引物、探针组合物及其应用 | |
CN114875180A (zh) | 一种用于SARS-CoV-2检测的DNA步行器及其制备方法 | |
CN116254371A (zh) | 一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合及其应用 | |
CN114134208B (zh) | 荧光定量pcr试剂盒、反应系统及核酸定量检测方法 | |
CN110894550A (zh) | 鳗鲡疱疹病毒(hva)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN109266723A (zh) | 稀有突变检测方法、其试剂盒及应用 | |
Zhang et al. | Colorimetric detection of RNA fragments based on associated toehold-mediated reaction and gold nanoparticles | |
CN112941239A (zh) | 一种快速检测牛结节性皮肤病病毒引物对、探针及试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |