CN114032339A

CN114032339A - 一种检测鼻咽癌的超支化杂交链式反应信号放大体系、试剂盒和检测方法

Info

Publication number: CN114032339A
Application number: CN202111578512.2A
Authority: CN
Inventors: 张何; 肖凯婷; 曾家豪; 傅昕; 张培柔
Original assignee: Hunan Institute of Engineering
Current assignee: Hunan Institute of Engineering
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2041-12-22
Also published as: CN114032339B

Abstract

本发明提供了一种检测鼻咽癌的超支化杂交链式反应信号放大体系、试剂盒和检测方法，涉及基因检测技术领域。本发明所述信号放大体系，以DNA三链分子为识别导向，结合超支化杂交链式反应信号放大技术，利用分子间裂分G‑四链体‑血红素DNA酶的催化特性，进行比色分析，具有操作简单、不依赖于大型设备、灵敏度高、选择性好和抗干扰性强等优点，在血浆样本中仍然保持良好的性能，为循环核酸检测提供了一种新的方法。

Description

一种检测鼻咽癌的超支化杂交链式反应信号放大体系、试剂盒和检测方法

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测鼻咽癌的超支化杂交链式反应信号放大体系、试剂盒和检测方法。

背景技术

鼻咽癌(nasopharyneal carcinoma NPC)是一种好发于鼻咽腔上皮粘膜部位的恶性肿瘤。EB病毒(EBV)是Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，认为该病毒是多种恶性肿瘤(如鼻咽癌)的可能病因之一。因此目前对于鼻咽癌的早期发现和预防，在进行检测时，有诸如酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫荧光法、实时荧光定量PCR技术、原位杂交技术、影像组学分析法、电化学法和比色分析法等。在这些方法中，免疫学法虽然操作方便，但是敏感度较低；原位杂交法结果清晰稳定，但是过程繁琐，耗时较长；实时荧光定量PCR技术灵敏度较高，但是特异性不高，容易出现假阳性；而且在有关EVB的检测时，需要以提取的核酸为模板进行检测，无法可视化监测。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测鼻咽癌的超支化杂交链式反应信号放大体系、试剂盒和检测方法，超支化杂交链式反应(HB-HCR)信号放大体系大大提高杂交链式反应的效率，实现对目标分子的超灵敏检验，选择性高，稳定性好。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测鼻咽癌的超支化杂交链式反应信号放大体系，所述信号放大体系包括识别探针REB、引发序列、超级发夹SH1、超级发夹SH2、传统发夹H1、传统发夹H2、单链辅助原件L1和单链辅助原件L2；

所述识别探针REB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引发序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述超级发夹SH1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述超级发夹SH2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述传统发夹H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述传统发夹H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述单链辅助原件L1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述单链辅助原件L2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了一种检测鼻咽癌的试剂盒，所述试剂盒包括上述的信号放大体系。

优选的，所述试剂盒中还包括阳性对照EBV-DNA，所述EBV-DNA的核苷酸序列如SEQID NO.9所示。

优选的，所述试剂盒中识别探针REB的工作液浓度为10μM，引发序列initiator的工作液浓度为10μM，超级发夹SH1的工作液浓度为1μM，超级发夹SH2的工作液浓度为1μM，传统发夹H1的工作液浓度为1μM，传统发夹H2的工作液浓度为1μM，单链辅助原件L1的工作液浓度为1μM，单链辅助原件L2的工作液浓度为1μM。

优选的，所述工作液的溶剂为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L。

本发明还提供了基于上述试剂盒的非诊疗目的检测样本中EBV-DNA存在的方法，包括以下步骤：(1)将引发序列的工作液与识别探针REB的工作液按1:(1～3)的体积比混合，升温至95℃后保持5min，第一梯度降温至25℃后孵育3h，得DNA三链；

分别将超级发夹SH1和超级发夹SH2升温至95℃后保持5min，第二梯度降温至25℃后孵育2.5h，得超级发夹SH1探针和超级发夹SH2探针；

分别将传统发夹H1和传统发夹H2升温至90℃后保持5min，第三梯度降至25℃后孵育1.5h，得传统发夹H1探针和传统发夹H2探针；

(2)将所述DNA三链稀释10倍后和待测样本混合，25℃孵化2.5h后，与超级发夹SH1探针、超级发夹SH2探针、传统发夹H1探针、传统发夹H2探针、单链辅助原件L1的工作液和单链辅助原件L2的工作液混合，25℃孵化2.5h，得超支化杂交链式反应体系；

(3)在黑暗条件下将超支化杂交链式反应体系分别与血红素DNA酶混合后孵化30min，形成G-四链体-血红素DNA酶；

(4)将G-四链体-血红素DNA酶与H₂O₂和ABTS混合后，25℃孵育8min，当孵育液显示绿色，则待测样本中包含EBV-DNA。

优选的，步骤(1)第一梯度降温包括：85℃10min，70℃10min，60℃10min，45℃10min，35℃10min；

所述第二梯度降温包括：85℃5min，70℃5min，60℃15min，50℃15min，40℃15min；

所述第三梯度降温包括：80℃5min，70℃5min，55℃5min，40℃15min，30℃15min，28℃15min。

优选的，步骤(2)所述DNA三链稀释10倍后与待测样本混合的体积比均为2:1；

待测样本的体积与超级发夹SH1探针、超级发夹SH2探针、传统发夹H1探针、传统发夹H2探针、单链辅助原件L1的工作液和单链辅助原件L2的工作液的体积相同。

优选的，所述待测样本包括血液。

优选的，在步骤(4)所述25℃孵育后，还包括离心提取上清液，测定420nm处的吸光度，利用基于阳性对照EBV-DNA构建的标准曲线，测算待测样本中EBV-DNA的浓度。

有益效果：本发明提供了一种检测鼻咽癌的超支化杂交链式反应信号放大体系，以DNA三链分子为识别导向，结合超支化杂交链式反应信号放大技术，利用分子间裂分G-四链体-血红素DNA酶的催化特性，进行比色分析，可实现定性和定量检测。利用本发明所述信号放大体系或试剂盒进行检测时，由于反应体系中不包含任何的蛋白酶，因此检测体系干扰因素少、价格便宜、稳定性好，可直接利用血浆样本进行检测，具有操作简单、不依赖于大型设备、灵敏度高、选择性好和抗干扰性强等优点，为循环核酸检测提供了一种新的方法。在本发明实施例中，利用所述信号放大体系进行EBV-DNA的定量检测时，只有在EBV-DNA存在时才会有较高的信号值，可用于循环核酸的检测，并且选择性良好，灵敏度高，检出限0.0083fM(S/N＝3)。

附图说明

图1为本发明所述信号放大体系的检测原理图；

图2为实施例1中信号放大体系的检测可行性分析结果图；

图3为实施例1中所述信号放大体系针对不同病毒DNA的选择性分析结果图；

图4为实施例1中所述信号放大体系的检测性能分析结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种检测鼻咽癌的超支化杂交链式反应信号放大体系，所述体系包括识别探针REB、引发序列(initiator)、超级发夹SH1、超级发夹SH2、传统发夹H1、传统发夹H2、单链辅助原件L1和单链辅助原件L2；

本发明所述的核苷酸序列列于表1，其中下划线表示发夹茎部序列。

表1本发明及实施例中所涉及到的探针和基因

本发明所述试剂盒中优选还包括阳性对照EBV-DNA，所述EBV-DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。在本发明中，所述试剂盒中各试剂以工作液形式存在，溶剂优选为PBS缓冲液，且PBS缓冲液的浓度优选为0.01M。

在本发明中，利用所述PBS缓冲液对各探针和序列进行溶解，从而得到工作液，所述识别探针REB的工作液浓度优选为10μM，引发序列initiator的工作液浓度优选为10μM，超级发夹SH1的工作液浓度优选为1μM，超级发夹SH2的工作液浓度优选为1μM，传统发夹H1的工作液浓度优选为1μM，传统发夹H2的工作液浓度优选为1μM，单链辅助原件L1的工作液浓度优选为1μM，单链辅助原件L2的工作液浓度优选为1μM。

在本发明中，Epstein-Barr病毒(EBV)为疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属的成员，EBV是传染性单核细胞增多症的病原体，更为重要的是，EBV与鼻咽癌、儿童淋巴瘤的发生有密切相关性，被列为可能致癌的人类肿瘤病毒之一。利用本发明所述试剂盒可直接检测血液中是否含有EBV以及浓度。

本发明所述试剂盒的检测原理优选如图1所示，基于DNA三链分子为识别导向构建出一种超支化杂交链式反应信号放大技术，借助分子间裂分G-四链体-血红素DNA酶的催化特性，从而完成对循环EBV-DNA的超敏感检测。具体的：首先是DNA三链分子(REB-initiator)的构建，它由识别探针REB与引发序列两部分组成，识别探针序列与循环EBV-DNA的3’端反向互补，其两端的延伸序列是富含嘧啶碱基的序列，而引发序列中包含一段富含嘌呤的序列，通过Watson-Crick和Hoogsteen的碱基互补配对原则形成DNA三链分子，当目标序列存在时，DNA三链分子的环部结构会与目标序列形成DNA双链，其刚性结构会使引发序列从DNA三链发夹中释放出来。由此，进入由两个超级发夹(SH1和SH2)，两个传统发夹(H1和H2)和两条单链辅助原件(L1和L2)组成的纳米组装体系中，其中超级发夹SH1的5’端设计3×GGG，3’端设计了1×GGG，SH2的5’端设计1×GGG，3’端设计了3×GGG，由于超级发夹(SH1和SH2)探针在形成茎部结构时一组GGG被包含在茎部区域，避免自发形成分子内G-四链体，其次超级发夹(SH1和SH2)双链茎部的中间伸出两个凸出环(对于SH1是C(AATCGA)和f(GAGAGG)；对于SH2是g(ACTGAC)和h(ACCATA))。在没有引发序列的条件下，超级发夹的热稳定性对于避免自发错误的打开至关重要，如果凸起环中没有碱基对，则具有16nt中间环足够长，足以允许其它单链通过链式置换反应在环中结合进一步打开其他发夹，从而造成假阳性，所以手动设计的两个碱基对，将它们的茎部分开成两个区域，每个区域具有8bp，发夹能稳定共存。

暴露出游离的引发序列initiator，其3’端先与传统发夹H1的5’端粘性末端相结合，并触发杂交链式置换反应，打开H1的茎部序列并释放出3’端，发夹H1释放的3’端序列与超级发夹SH15’端粘性末端继续触发杂交链式置换反应，并释放出凸起环序列c和f，在单链辅助物L1的作用下，释放出e(CATGTTA)和d*(CATCAAGCTCAGG)序列，超级发夹SH1暴露出来的序列f和b*(GGAGTAGAGCTGA)充当引发序列，可再次与传统发夹H1发生杂交链式反应形成一维线性结构initiator·H1·SH1·L1·H1·SH1，暴露出的序列e和d*能与超级发夹SH2的5’端粘性末端触发杂交链式置换反应释放出凸起环序列g和h，形成组合体initiator·H1·SH1·L1·H1·SH1·SH2，在单链辅助物L2作用下，触发杂交链式反应，释放出序列a*(GAATGCT)、b*、h和d*，超级发夹SH2暴露出的h和d*序列充当引发序列，可再次与传统发夹H2发生杂交链式反应，周而复始形成二维线性结构(initiator·H1·SH1·L1·H1·SH1)n·SH2·L2·H2·SH2。同理，超级发夹SH2暴露出的a*，b*序列能与SH1的5’端的粘性末端杂交，再次触发杂交链式反应，从而形成3层分支的DNA组装结构{[(initiator·H1·SH1·L1·H1·SH1)n·SH2·L2·H2·SH2]n·SH1·L1·H1·SH1}n。随着反应的进行，最后可以形成n层分支的DNA组装结构{[(initiator·H1·SH1·L1·H1·SH1)n·SH2·L2·H2·SH2]n·SH1·L1·H1·SH1}n······。

由于超级发夹SH1和SH2的5’端与3’端都包含有GGG序列，通过杂交链式反应相互拉近并折叠，加入血红素DNA酶(Hemin)后，易形成G-四链体-血红素DNA酶，显示出过氧化氢酶的催化活性，该酶能催化H₂O₂与ABTS的化学反应，产生带有绿色阳离子的自由基的ABTS·⁺，于A420nm处有最大吸收峰。

(3)在黑暗条件下将超支化杂交链式反应体系与血红素DNA酶混合后孵化30min，形成G-四链体-血红素DNA酶；

本发明首先构建DNA三链和发夹探针，所述探针REB、引发序列、超级发夹SH1和SH2、传统发夹H1和H2及单链辅助原件L1和L2，均由上海生工生物工程股份有限公司合成，并制备成冻干粉，在应用前优选利用PBS缓冲液配制成工作液。本发明所述PBS缓冲液优选由200mM NaCl、2.5mM MgCl₂和20mM KCl组成，pH＝6.2。本发明所述DNA三链和发夹探针在制备时，优选均需要升温至对应温度保持5min，而后梯度降温至25℃，所述梯度降温优选包括：DNA三链的梯度降温优选包括：85℃10min，70℃10min，60℃10min，45℃10min，35℃10min；

超级发夹的梯度降温优选包括：85℃5min，70℃5min，60℃15min，50℃15min，40℃15min；

传统发夹的梯度降温优选包括：80℃5min，70℃5min，55℃5min，40℃15min，30℃15min，28℃15min。

本发明基于所述DNA三链、发夹探针和单链辅助原件L1和L2进行超支化杂交链式反应，所述DNA三链稀释10倍后和待测样本混合的体积比优选均为2:1；待测样本的体积与超级发夹SH1探针、超级发夹SH2探针、传统发夹H1探针、传统发夹H2探针、单链辅助原件L1的工作液和单链辅助原件L2的工作液的体积优选相同。本发明所述体系中没有蛋白酶的参与，成本低、稳定性好，并且抗干扰能力强，因此可直接用于检测人血浆中的循环核酸。

本发明在进行超支化杂交链式反应后，优选构建G-四链体-血红素DNA酶，并进行比色分析，所述G-四链体-血红素DNA酶的构建优选在黑暗条件下完成，且所述hemin的加入体积优选与待测样本体积相同，且所述hemin的浓度优选为20μM。

本发明在构建完成G-四链体-血红素DNA酶后，优选与H₂O₂和ABTS进行混合25℃孵育，所述G-四链体-血红素DNA酶与H₂O₂和ABTS的体积比优选为10:45:45，并且H₂O₂的浓度优选为10mM，ABTS的浓度优选为10mM。本发明在所述25℃孵育后进行比色，如孵育液表现出绿色，则认定样本中包含有EBV-DNA，从而完成定性检测。

在本发明中，当所述孵育液中因颜色过浅而无法肉眼观察时，或需进行定量检测时，优选在所述25℃孵育结束后离心提取上清液，测定420nm处的吸光度，利用基于阳性对照EBV-DNA构建的标准曲线，测算待测样本中EBV-DNA的浓度。本发明所述离心优选在25℃下，以8000r/min的转速离心5min。

本发明优选利用所述阳性对照EBV-DNA的梯度浓度构建标准曲线，所述梯度浓度的设置优选包括0aM、2aM、8aM、10aM、0.1fM、20fM、30fM、40fM、50fM、60fM和1pM，且所述0aM用等体积的PBS缓冲液代替。本发明所述阳性对照EBV-DNA的测定方法优选与待测样本相同，在此不再赘述。本发明优选利用UV-1800紫外分光光度计进行测试，定义ΔA₄₂₀＝A₄₂₀－A₀，其中A₄₂₀为样品的测量值，A₀为EBV-DNA浓度为0时候的背景值。本发明基于所述ΔA₄₂₀构建标准曲线，ΔA₄₂₀＝0.002C+0.1309，线性相关系数R²＝0.9945，其中C为浓度(fmol/L)。

下面结合实施例对本发明提供的一种检测鼻咽癌的超支化杂交链式反应信号放大体系、试剂盒和检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一、材料

委托上海生工生物工程股份有限公司合成表1所示的序列。

二、实验步骤

1、REB-initiatorDNA三链形成预处理

用0.01M PBS(pH＝6.2，200mM NaCl，2.5mM MgCl₂，20mM KCl)缓冲溶液将DNA探针REB和initiator冻干粉均配置成10μM溶液。分别移取10μM initiator与10μM REB按体积比2:1混匀在200μL的离心管中，于PCR加热至95℃，5min，然后梯度降至25℃(85℃10min，70℃10min，60℃10min，45℃10min，35℃10min)，且于25℃下孵育3h，充分形成DNA三链，4℃保存备用。

2、寡聚核苷酸序列预处理

用0.01M PBS缓冲溶液将DNA探针SH1、SH2、H1、H2、L1和L2冻干粉均配置成1μM的溶液。分别移取100μL SH1和100μL SH2于不同200μL的离心管中，PCR上孵育，加热至95℃，维持5min，然后梯度降至25℃(85℃5min，70℃5min，60℃15min，50℃15min，40℃15min)，且于25℃下孵育2.5h。

分别移取100μL H1和100μL H2于不同200μL的离心管中，PCR上孵育，加热至90℃，5min，再梯度降至25℃(80℃5min，70℃5min，55℃5min，40℃15min，30℃15min，28℃15min)，且在25℃下孵育1.5h，形成发夹探针，4℃保存备用。

3、超支化杂交链式反应的形成

将步骤1中的DNA三链(REB-initiator)稀释10倍后，移取10μL于200μL灭菌离心管中，加入5μL不同浓度的EBV-DNA，(空白组用等体积的PBS缓冲液代替)，25℃下孵化2.5h，释放出initiator，然后再加入1μM SH1、1μM SH2、1μM H1、1μM H2、1μM L1和1μM L2六种探针各5μL于PCR中混匀，25℃下孵化2.5h。

4、G-四链体-血红素DNA酶的形成和比色分析

将上述反应体系置于黑暗条件下，加入5μL 20μM hemin，避光孵化30min，使其形成G-四链体-血红素DNA酶。分别移取各浓度EBV-DNA离心管中G-四链体-血红素DNA酶10μL置于新灭菌离心管中，加入45μL 10mM H₂O₂和45μL 10mMABTS，充分搅拌，25℃孵育8min，之后离心分离，取上清液50μL，于UV-1800紫外分光光度计进行测试，在A₄₂₀处有最大吸收峰(定义ΔA₄₂₀＝A₄₂₀－A₀，其中A₄₂₀为样品在420nm处的测量值，A₀为EBV-DNA浓度为0时候的背景值)。

三、可行性分析

为了考察该方法对EBV-DNA检测的可行性，设计3组实验进行验证：

第1组只加入45μLABTS，第2组为空白组，靶DNA用等体积的PBS缓冲液代替，第3组是在第2组的基础上加入1aM EBV-DNA作为实验组。1～3组中未说明的条件都与实验组保持一致。

结果如图2所示，第1组ABTS自我氧化产生的信号背景，在A₄₂₀处的信号值较低；第2组为空白组，少量游离的引发序列(initiator)触发了超支化杂交链式反应后，形成了G-四链体-血红素DNA酶，产生了一定的背景值。第3组由于EBV-DNA触发了杂交链式反应形成一定浓度的G-四链体-血红素DNA酶，产生了较高的信号值。该结果证明只有EBV-DNA存在时信号值较高，该体系可用于循环核酸的检测。

四、选择性分析

为了考察该传感技术检测EBV-DNA的选择性，实验选择了1pM EBV-DNA、CT-DNA(a)、CT-DNA(b)、CT-DNA(c)、CT-DNA(d)、CT-DNA(e)以及XG-DNA七种病毒DNA，在同一最优条件下，分别在A₄₂₀处测得各自信号值(背景值A₀为DNA病毒DNA浓度为0时所测的信号值)，6次平行实验。

结果如图3所示，加入1pM EBV-DNA反应完成后的信号值ΔA₄₂₀明显高于等浓度的其他病毒DNA，实验表明，该技术对EBV-DNA具有较高的选择性。

五、定量分析

在最优的实验条件下，实现对EBV-DNA标准样品的定量检测。

结果如图4中(a)所示，随着EBV-DNA浓度增加，反应体系中生成的ABTS·⁺颜色(绿色)逐渐加深。图4中(b)显示，浓度分别为0aM、2aM、8aM、10aM、0.1fM、20fM、30fM、40fM、50fM、60fM和1pM EBV-DNA的紫外收曲线。如图4中(c)显示，当EBV-DNA浓度低于1pM时，在ΔA₄₂₀处的吸收峰值随着EBV-DNA浓度的增加而增大，在1pM以后趋于饱和，达到最高吸收峰值，随后信号值略有波动，但总体趋于稳定。图4中(d)所示，EBV-DNA浓度在0.01fM-50fM之间有较好的线性趋势，且曲线回归方程为ΔA420＝0.002C_(EBV-DNA)+0.1309，线性相关系数R²＝0.9945，检出限为0.0083fM(S/N＝3)。该检测方法实现了对EBV-DNA的超灵敏检测，EBV-DNA浓度(0.01fM、0.1fM、2fM、20fM、30fM、40fM、50fM)均平行重复6次实验。

六、血液中循环核酸检测

为考察该方法在实际样品检测中的检测性能，以人来源的血浆为检测目标，采用标准加入法，配置成浓度分别为0.1fM、1fM、10fM EBV-DNA血浆。实验结果如表2所示，实际样品检测的平均回收率为95.0％～104.7％之间，相对标准偏差(RSD)在3.0％～8.3％之间。说明该传感技术对血浆样品中的EBV-DNA，有较好的检测性能。

表2血浆样品中加标回收实验结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 湖南工程学院

<120> 一种检测鼻咽癌的超支化杂交链式反应信号放大体系、试剂盒和检测方法

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctctctcgtt ctatttccac tgccccattc tctctc 36

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtagagctga gagagg 16

<210> 3

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgggcgggaa gggagtagag ctgagagagg catcaagctc aggcatgtta cctgagcttg 60

atgaatcgat cagctctact ccagcattca gggt 94

<210> 4

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgggataaca tgcctgagct tgatgactga ctcagctcta ctccgaatgc tggagtagag 60

ctgaaccata catcaagctc agggaaggga gggt 94

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctctctcag ctctacgaat gctggagtag agctga 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catcaagctc aggcatgtta gagcttgatg tatggt 36

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcgattcatc aagctcagg 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggagtagagc tgagtcagt 19

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aatggggcag tggaaataga ac 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aatctaccag tggaaataga ac 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aatactacag tggaaataga ac 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aattcagcag tggaaataga ac 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aatatagcag tggaaataga ac 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aatgatccag tggaaataga ac 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

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Claims

1.一种检测鼻咽癌的超支化杂交链式反应信号放大体系，所述信号放大体系包括识别探针REB、引发序列、超级发夹SH1、超级发夹SH2、传统发夹H1、传统发夹H2、单链辅助原件L1和单链辅助原件L2；

所述识别探针REB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引发序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述超级发夹SH1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述超级发夹SH2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述传统发夹H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述传统发夹H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述单链辅助原件L1的核苷酸序列如SEQID NO.7所示，所述单链辅助原件L2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.一种检测鼻咽癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的信号放大体系。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照EBV-DNA，所述EBV-DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中识别探针REB的工作液浓度为10μM，引发序列的工作液浓度为10μM，超级发夹SH1的工作液浓度为1μM，超级发夹SH2的工作液浓度为1μM，传统发夹H1的工作液浓度为1μM，传统发夹H2的工作液浓度为1μM，单链辅助原件L1的工作液浓度为1μM，单链辅助原件L2的工作液浓度为1μM。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述工作液的溶剂为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L。

6.基于权利要求2～5任一项所述试剂盒非诊疗目的检测样本中EBV-DNA存在的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将引发序列的工作液与识别探针REB的工作液按1:(1～3)的体积比混合，升温至95℃后保持5min，第一梯度降温至25℃后孵育3h，得DNA三链；

分别将超级发夹SH1和超级发夹SH2升温至95℃后保持5min，分别第二梯度降温至25℃后孵育2.5h，分别得超级发夹SH1探针和超级发夹SH2探针；

分别将传统发夹H1和传统发夹H2升温至90℃后保持5min，分别第三梯度降至25℃后孵育1.5h，分别得传统发夹H1探针和传统发夹H2探针；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述第一梯度降温包括：85℃10min，70℃10min，60℃10min，45℃10min，35℃10min；

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述DNA三链稀释10倍后与待测样本混合的体积比均为2:1；

9.根据权利要求6或8所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述待测样本包括血液。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(4)所述25℃孵育后，还包括离心提取上清液，测定420nm处的吸光度，利用基于阳性对照EBV-DNA构建的标准曲线，测算待测样本中EBV-DNA的浓度。