CN116018409A - 聚合酶反应性催化核酸纳米结构 - Google Patents

聚合酶反应性催化核酸纳米结构 Download PDF

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Abstract

本发明涉及对聚合酶活性有反应的信号传导催化核酸纳米结构、其使用方法、包含其的装置和试剂盒。更具体地，本发明提供了一种催化信号传导纳米结构，其包含DNA酶/RNA酶如G‑四链hemin和聚合酶反应元件。所述聚合酶反应元件的聚合酶延伸消除所述DNA酶/RNA酶的催化活性。所述催化核酸纳米结构可以在集成电路中单独使用或与可将分子信号转换为聚合酶活性的靶标识别纳米结构配对使用。

Description

聚合酶反应性催化核酸纳米结构
技术领域
本发明涉及对聚合酶活性有反应的信号传导催化核酸纳米结构、其使用方法、包含其的装置和试剂盒。更具体地，本发明提供了一种包含DNA酶/RNA酶和刺激反应元件的敏感的催化信号传导纳米结构，所述刺激反应元件可以在集成电路中单独使用或与可将分子信号转化为聚合酶活性的靶标识别纳米结构配对使用。
背景技术
核酸的检测在例如诊断中具有广泛的应用。已在临床实验室中越来越多地采用核酸技术以提供有关感染的前所未有的分子信息[Niemz,A.,Ferguson,T.M.和Boyle,D.S.Trends Biotechnol 29:240-250(2011)；Nong,R.Y.,等人,Expert Rev Proteomics9:21-32(2012)；Zumla,A.等人Lancet Infect Dis 14:1123-1135(2014)]。
当前对病原体核酸的检测几乎仅在大型集中式临床实验室中进行。这种有限的成就源于与常规技术相关的高复杂性和成本。商业测定主要利用了聚合酶链式反应(PCR)来扩增和检测特定的DNA靶标。此类系统不仅需要大型专用设备来进行PCR热循环和荧光测量，而且还需要经过培训的人员操作它。已经开发出先进的等温扩增测定法来减轻仪器对温度循环的需求，但是，这些测定法有其自身的局限性。例如，环介导的等温扩增(LAMP)具有严格的序列要求并且不易推广[Zhao,Y.等人,Chem Rev 115:12491-12545(2015)]。重要的是，与其他核酸扩增方法一样，LAMP易于产生假阳性(例如，来自引物二聚体形成)。可替代地，可以使用序列特异性信号传导探针(例如荧光Taqman报告物)来提高检测准确性；然而，这些探针昂贵且用法复杂[Gardner,S.N.等人,J Clin Microbiol 41:2417-2427(2003)]。由于每段DNA靶标在靶标扩增过程中的偶联信号传导都需要专用的序列特异性探针，因此所述方法变得成本越来越高，并且难以进行多重化或执行复杂计算[Juskowiak,B.Anal Bioanal Chem 399:3157-3176(2011)]。
需要一种改进的分子平台以实现对核酸和其他靶分子的快速、可视化和模块化检测。
发明内容
本发明涉及反应性催化核酸纳米结构。这些结构可以被制成对聚合酶活性以及各种其他刺激和靶标有反应。所述结构的核心包含DNA酶/RNA酶以及不同的刺激反应元件，所述DNA酶/RNA酶是能够进行特定化学反应的催化核酸。作为例子，本发明人设计并开发了纳米结构以并入G-四链体Hemin DNA酶和聚合酶反应元件，并证明了所述结构对于生成多模式读数的性能和兼容性。通过并入可将分子信号转换为聚合酶活性的独立反应元件，所述系统测量不同的分子靶标和/或其组合，并在不同的环境条件下显示出稳健的性能。本发明提供了一种用于信号传导的新型催化纳米结构，其具有改进的敏感性、得到结果的速度和稳健性。
在第一方面，提供了一种包含DNA酶/RNA酶和刺激反应元件的催化核酸纳米结构。应理解，在本发明中存在许多已知的可用于信号传导的DNA酶/RNA酶。
在一些实施方案中，所述DNA酶/RNA酶可以选自：
核糖核酸酶，如核糖核酸酶8-17、核糖核酸酶10-23或Dz10-66脱氧核酶；
脱氧核糖核酸酶，如10MD5脱氧核酶或9NL27脱氧核酶；
过氧化物酶，如G-四链体Hemin；
具有连接活性的酶，如E47脱氧核酶；
磷酸酶，如14WM9脱氧核酶；
酰胺水解物，如AmideAm1脱氧核酶；以及
RNA分支酶，如9F7脱氧核酶或7S11脱氧核酶。
在优选的实施方案中，所述DNA酶/RNA酶是G-四链体Hemin DNA酶，优选地，所述G-四链体Hemin DNA酶包含以下核苷酸序列：
5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGA-3’(SEQ ID NO:1)。
在一些实施方案中，所述刺激反应元件包含在存在聚合酶的情况下抑制DNA酶/RNA酶活性的聚合酶反应元件。
在一些实施方案中，所述聚合酶反应元件缺乏发夹结构。在优选的实施方案中，所述聚合酶反应元件包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列：
5'-CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGC-3'(SEQ ID NO:2)
5’-GCTATCGACAATGCGTT-3’(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中，所述聚合酶反应元件具有内部发夹结构。
在一些实施方案中，所述信号传导纳米结构的聚合酶反应元件或自引发部分包含以下核酸序列：
5’-AACGCATTGTCGATAGCTCAGCTGTCTGAGCTATCGACAATGCGTT-3’(SEQ ID NO:10)。
在一些实施方案中，所述催化核酸纳米结构包含G-四链体Hemin DNA酶并且包含选自以下的核酸序列：
5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGCTCTGTCGCTATCGACAATGCGTT-3’(SEQ ID NO:4)；
5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGCTCTGTCGCTATCGACAATGCGTTAGCAT-3’(SEQ ID NO:5)；
5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGCTCTGTCGCTATCGACAATGCGTTAGCATCCC-3’(SEQ ID NO:6)；
5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGCTCTGTCGCTATCGACAATGCGTTAGCATCCCTCCC-3’(SEQ ID NO:7)；
5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGCTCTGTCGCTATCGACAATGCGTTAGCATCCCTCCCTCCC-3’(SEQ ID NO:8)；以及
5’-CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGCTCTGTCGCTATCGACAATGCGTTAGCATCCCTCCCTCCCTCCCAG-3’(SEQ ID NO:9)。
应理解，SEQ ID NO:4至9内的中间序列旨在落入本发明的范围内。
在一些实施方案中，当存在内部发夹结构时，聚合酶反应元件的聚合酶延伸消除了催化活性。
在一些实施方案中，所述DNA酶/RNA酶活性是过氧化物酶活性。
在一些实施方案中，通过不同的方式检测过氧化物酶底物的活性，所述方式包括但不限于比色、荧光、电化学或发光手段。
根据本发明的另一方面，提供了一种检测测试样品中聚合酶活性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供测试样品；
(b)提供包含根据本发明的任何方面的催化核酸纳米结构的组合物；
(c)在存在DNA酶/RNA酶底物和任选的信号显影试剂的情况下使a)中的所述样品与b)中的所述组合物接触；
(d)检测信号显影，其中信号的强度与所述样品中聚合酶活性的量相反。
在一些实施方案中，所述测试样品包含聚合酶，如DNA聚合酶。
根据本发明的另一方面，提供了一种检测样品中靶分子的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供测试样品；
(b)提供包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含适于识别所述样品中的所述靶分子的DNA聚合酶特异性DNA适体
(c)提供包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含具有保守序列区和可变序列区的DNA聚合酶特异性DNA适体，其中所述可变序列区包含与所述反向体寡核苷酸的一部分互补并且与其形成双链体的至少10个核苷酸的突出端区段，其中所述反向体寡核苷酸适于以比所述可变双链体区更高的亲和力识别所述样品中的所述靶分子；
(d)使所述测试样品与(b)或(c)的所述组合物接触，其中所述靶分子结合至：
(i)(b)中的所述适体的识别序列区促进稳定的适体-DNA聚合酶复合物的形成，从而抑制DNA聚合酶活性；或者
(ii)(c)中的所述反向体寡核苷酸使所述识别纳米结构不稳定，从而使所述DNA聚合酶从所述DNA适体的抑制中释放出来；
(e)提供根据本发明的任何方面的催化核酸纳米结构；
(f)在存在DNA酶/RNA酶底物和任选的信号显影试剂的情况下接触来自步骤(b)或(c)的所述纳米结构；
(g)检测信号显影，其中信号强度指示：
(i)当使用组合物(b)时，所述样品中存在靶分子；或
(ii)当使用组合物(c)时，所述样品中不存在靶分子。
在PCT申请专利申请PCT/SG2019/050328(公布为WO 2020/009660)中描述并定义了合适的识别纳米结构，将其内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，所述识别纳米结构的DNA聚合酶特异性DNA适体保守序列区包含核酸序列5’-CAATGTACAGTATTG-3’(SEQ ID NO:18)。
在一些实施方案中，所述反向体寡核苷酸比所述适体双链体区长至少一个核苷酸。优选地，所述反向体寡核苷酸的长度为所述适体双链体区的约两倍。
在一些实施方案中，约一半反向体寡核苷酸长度形成适体-反向体双链体，并且约一半形成突出端区段。
在一些实施方案中，根据本发明的任何方面的方法进一步包括提供与靶核酸互补的第二识别纳米结构用于双链体检测，所述靶核酸与所述样品中的第一识别纳米结构的靶核酸不同。
在一些实施方案中，错配被引入到所述可变序列区双链体中以赋予强序列特异性，其可用于紧密相关的靶核酸的多重检测，如用于对病毒进行亚型分析。
在一些实施方案中，所述靶标是至少一种选自DNA、RNA、PNA和其他核酸类似物的核酸。
在一些实施方案中，所述靶标是至少一种与非人类或人类疾病、遗传变体、法医学、菌株鉴定、环境和/或食物污染相关的核酸。
在一些实施方案中，所述靶标是病原体。在一些实施方案中，所述病原体是病毒。
在一些实施方案中，所述测试样品包含选自DNA、RNA、PNA、蛋白质、脂质、小分子和代谢物及其修饰的靶分子。
根据本发明的另一方面，提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含核酸的样品；
(b)提供包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含具有保守序列区和可变序列区的DNA聚合酶特异性DNA适体，其中所述可变序列区包含与所述样品中的靶核酸互补的至少10个核苷酸的突出端区段；或者
(c)提供包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含DNA聚合酶特异性DNA适体和反向体寡核苷酸，其中所述适体具有保守序列区和可变序列区，其中所述可变序列区包含与所述反向体寡核苷酸的一部分互补并与其形成双链体的至少10个核苷酸的突出端区段，其中所述反向体寡核苷酸比所述适体-反向体双链体长至少一个核苷酸，并具有与所述样品中的靶核酸互补的超过10个核苷酸；(d)使包含核酸的所述样品与(b)或(c)的所述组合物接触，其中靶核酸结合至：
(i)(b)中的所述适体的可变序列区促进稳定的适体-DNA聚合酶复合物的形成，从而抑制DNA聚合酶活性；或者
(ii)(c)中的所述反向体寡核苷酸使所述识别纳米结构不稳定，从而使所述DNA聚合酶从所述DNA适体的抑制中释放出来；
(e)提供根据本发明的任何方面的催化核酸纳米结构；
(f)在存在DNA酶/RNA酶底物和任选的信号显影试剂的情况下接触来自步骤(d)的所述纳米结构；
(g)检测信号显影，其中信号强度指示：
(i)在使用组合物(b)时，所述样品中存在靶核酸；或者
(ii)在使用组合物(c)时，所述样品中不存在靶核酸。
根据本发明的另一方面，提供了一种装置，所述装置包含固定在表面上的根据本发明的任何方面的催化核酸纳米结构。
在一些实施方案中，所述装置包含：
(i)在第1位置处的根据权利要求10所述的含有至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物b)或组合物c)；
(ii)附接在第2位置处的根据本发明的任何方面的催化核酸纳米结构；以及
(iii)中间级，其用于将所述检测纳米结构与样品核酸混合以将活性酶释放至所述第2位置。
在一些实施方案中，所述装置选自微流体装置和侧流装置。
在一些实施方案中，所述装置包含电极。
根据本发明的另一方面，提供了一种核酸检测试剂盒，所述核酸检测试剂盒含有：
(a)包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含具有保守序列区和可变序列区的DNA聚合酶特异性DNA适体，其中所述可变序列区包含与靶核酸互补的至少10个核苷酸的突出端区段；和/或
(b)包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含DNA聚合酶特异性DNA适体和反向体寡核苷酸，其中所述适体具有保守序列区和可变序列区，其中所述可变序列区包含与所述反向体寡核苷酸的一部分互补并与其形成双链体的至少10个核苷酸的突出端区段，其中所述反向体寡核苷酸比所述适体-反向体双链体长至少一个核苷酸并且具有与靶核酸互补的超过10个核苷酸；任选地
(c)根据本发明的任何方面的催化核酸纳米结构；任选地
(d)DNA酶/RNA酶底物，以及任选地
(e)信号显影试剂。
根据本发明的另一方面，提供了一种分子检测试剂盒，所述分子检测试剂盒含有：
(a)包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含具有保守序列区和可变序列区的DNA聚合酶特异性DNA适体，其中所述可变序列区包含与所述反向体寡核苷酸的一部分互补并且与其形成双链体的至少10个核苷酸的突出端区段，其中所述反向体寡核苷酸适于以比所述可变双链体区更高的亲和力识别所述样品中的所述靶分子；
(b)根据本发明的任何方面的催化核酸纳米结构；任选地
(c)DNA酶/RNA酶底物，以及任选地
(d)信号显影试剂。
附图说明
图1显示了具有不同信号传导元件的DNA酶纳米结构的活性。在孵育之前(a)和在与DNA聚合酶一起孵育30分钟后(b)或不与DNA聚合酶一起孵育(c)的DNA酶纳米结构的活性。实验一式三份地进行，并且使用t检验与邦费罗尼校正计算显著性。n.s.意指校正的p值>0.05，**<0.005，****<0.00005。
图2显示了在延伸至给定核苷酸(SEQ ID NO:4至9)之后的DNA酶信号传导纳米结构的反应性。实验一式三份地进行。
图3显示了信号传导纳米结构的读数的类型。这些图表示在具有信号传导纳米结构(黑色)和不具有信号传导纳米结构(白色)的情况下由底物产生的信号。表2进一步解释了读数的类型。电化学测量是用表面固定的纳米结构进行的，其他读数是用基于溶液的纳米结构进行的。实验一式三份地进行。
图4a和图4b显示了对于不同聚合酶测定条件的信号传导纳米结构读数。a)对于不同DNA聚合酶稀释度(1x、10x、100x和无聚合酶)的信号测定的时间过程。b)当用不同量的抑制酶活性的污染物(HCl)加标时，与DNA聚合酶一起孵育30分钟后来自信号传导纳米结构的信号。实验一式三份地进行。
图5显示了对于不同底物的识别纳米结构情况。对于不同靶标的信号传导纳米结构配置。DNA/RNA(分别为左侧和中间)涉及靶标识别元件，所述靶标识别元件与其互补序列配对并杂交。蛋白质、小分子识别涉及适体，所述适体折叠以结合至其靶标(右侧)。示意图底部的图显示了来自与信号传导纳米结构对不同量的靶标偶联的测定的信号。实验一式三份地进行。
图6a和图6b显示了测定敏感性度和速度。a)与信号传导纳米结构对其特异性靶标和加扰序列偶联的测定的滴定曲线。b)对于1010特异性和加扰靶标的时间过程实验。实验一式三份地进行。
图7显示了固定的纳米结构保留功能性。非固定的识别纳米结构(左侧)和表面固定的识别纳米结构(中间两个，不同配置)都能够保持其特异性和敏感性特性(左侧，无靶标＝无信号；右侧，有靶标＝高信号)。仅表面对照(右侧)不具有此特性(在具有或不具有靶标的情况下有高信号)，表明其为识别纳米结构的特性而不是表面的特性。实验一式三份地进行。
具体实施方式
为了方便起见，将在本说明书中提及的文后参考书目以参考文献列表的形式列出并且附加在实施例的末尾处。将此类书目参考文献的全部内容通过引用并入本文。
定义
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。为方便起见，在此收集了在说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。
必须指出的是，除非上下文另外清楚地指出，否则如在本文以及在所附权利要求书中所用的，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”以及“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个靶序列”包括多个此类靶序列，并且提及“一种酶”是提及本领域技术人员已知的一种或多种酶及其等同物，等等。
如本文所用，术语“适体”是指单链DNA或RNA分子。适体能够以高亲和力和特异性结合各种分子，如DNA、蛋白质或小分子。例如，如本文所用，在不存在靶DNA、蛋白质或小分子的情况下，所述适体与聚合酶强烈结合以抑制聚合酶活性。
如本文所用，短语“核酸”或“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或其任何片段；基因组或合成起源的DNA或RNA(其可以是单链或双链的并且可以表示正义链或反义链)；肽核酸(PNA)；或任何DNA样或RNA样材料。
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指至少约6个核苷酸至60个核苷酸、优选地约15至30个核苷酸、最优选地约20至25个核苷酸的核酸序列，其可用于PCR扩增或杂交测定或微阵列中。如本文所用，术语“寡核苷酸”基本上等同于术语“扩增子”、“引物”、“寡聚体”和“探针”，与这些术语在本领域中通常被定义一样。所述识别纳米结构可以包含反向体寡核苷酸。
如本文所用，术语“反向体序列”或“反向体寡核苷酸”是指与靶核酸序列互补的寡核苷酸，其一部分参与形成双链体并且一部分参与突出端。本文显示，双链体和突出端序列各自具有20个核苷酸的较长序列通过稳定适体与DNA聚合酶的结合来稳健地产生其抑制作用。可在环境温度下在互补靶标存在下去除这种抑制作用。反向体序列的存在/不存在确定识别元件的功能状态(例如，开或关状态)。在反向体序列存在下，聚合酶活性用靶标开启；在反向体序列不存在下，聚合酶活性可以用靶标关闭。
如本文所用，术语“可变序列区”是指在识别纳米结构中决定对靶序列的序列特异性(即，限定可以被识别的靶序列)的区域。反向体序列和适体序列的一部分被包含在此可变序列区内。可以更改此区域以能够检测新靶标。当不使用反向体时，“可变序列区”是指适体上与靶核酸互补的突出端区段。
如本文所用，术语“样品”以其最广泛含义使用。例如，疑似含有人乳头瘤病毒(HPV)基因组序列(包括但不限于HPV 6、16、18、31、33和5)的生物样品可包括体液；细胞提取物、从细胞中分离的染色体、细胞器或膜；细胞；基因组DNA、RNA或cDNA(在溶液中或与固体支持物结合)；组织；组织印迹；等。
应当理解，可以对本发明中使用的寡核苷酸进行结构和/或化学修饰，以例如在执行本发明的方法期间延长其在可能含有核酸酶的样品中的活性，或改善在试剂盒中的贮藏期限。因此，可对根据本发明使用的适体和/或反向体和/或信号传导纳米结构或任何寡核苷酸引物或探针进行化学修饰。在一些实施方案中，所述结构和/或化学修饰包括添加标签，例如荧光标签、放射性标签、生物素、5'尾部；在合成期间添加硫代磷酸酯(PS)键、2'-O-甲基修饰和/或亚磷酰胺C3间隔基。
如本文所用，术语“包含”或“包括”应解释为详细说明如所提到的所述特征、整数、步骤或组分的存在，但不排除一个或多个特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。然而，在本公开文本的上下文中，术语“包含”或“包括”也包括“由……组成”。词语“包含(comprising)”的变化形式，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”以及“包括(including)”的变化形式，例如“包括(include)”和“包括(includes)”具有相应变化的含义。
实施例
大体上遵循本领域已知的并且未具体描述的标准分子生物学技术，如Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,纽约(2012)中所述。
实施例1
反应性催化核酸纳米结构的设计
本发明人设计并开发了用于具有催化活性的核酸纳米结构；这些催化活性通过并入刺激反应元件而具有反应性。具体地，我们开发了核心结构以包含DNA酶/RNA酶以及并入的刺激反应元件，所述DNA酶/RNA酶是能够进行特定化学反应的催化核酸[Li,W.等人,Nucleic Acids Research 44:7373-7384(2016)]。在一个例子中，我们开发了三维DNA结构以并入具有过氧化物酶活性的G-四链体Hemin DNA酶(SEQ ID NO:1)。
本发明人进一步设计并优化了聚合酶活性反应元件在纳米结构(SEQ ID NO:4至9)中的并入。因此，所产生的纳米结构含有聚合酶活性的结合位点以及内在催化结构域(SEQ ID NO:2和3、SEQ ID NO:4至9)，并且对聚合酶活性有反应以改变其催化过氧化物酶活性。具体地，反应元件为聚合酶活性提供底物，从而展开并破坏催化活性。虽然已知二级和更高级DNA结构抑制聚合酶活性[Nelms,B.L.和Labosky,P.A.Scientific Reports 1:106(2011)]，但我们证明了在不存在聚合酶活性反应元件的情况下设计的纳米结构不干扰聚合酶活性。在并入聚合酶活性反应元件后，在不存在聚合酶活性的情况下保留了纳米结构的催化活性。在存在聚合酶活性的情况下，纳米结构的催化活性被破坏(图1)。在测试的聚合酶反应元件中，最好的设计具有内部发夹结构，我们假设这可以通过自引发增加聚合酶反应元件的稳定性(图1)(SEQ ID No:10)。本发明人通过调节反应元件5'突出端的长度进一步优化了反应元件的设计以及其相对于催化结构域的位置以使纳米结构对聚合酶活性高度反应。在优化的设计(SEQ ID NO:4)中，几个碱基的聚合酶延伸足以完全破坏催化活性；由于催化活性的任何降低导致指数式信号降低，因此设计的纳米结构对聚合酶活性变得高度敏感(图2)。表1中提供了纳米结构和靶序列的列表。
表1：纳米结构和靶序列
Figure BDA0003969363360000071
Figure BDA0003969363360000081
实施例2
催化活性的多模式读数
纳米结构的催化活性可以用作信号传导元件，并通过各种底物来测定以用于快速的环境温度检测。它还可以适于不同的读数模式，包括但不限于比色、荧光、电化学和发光(表2、图3)。
表2：信号传导纳米结构的读数类型
试剂 读数类型
3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐 比色
2,2'-次偶氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) 比色
3,3',5'5'-四甲基联苯胺 比色
10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪 荧光
- 电化学
5-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮 发光
比色读数具有高移植性的益处。通过将纳米结构固定在电极上，所述系统产生高度敏感的可移植读数。
实施例3
聚合酶量和/或活性的检测
对于设计的纳米结构(SEQ ID NO:4)，其催化活性可以用于直接测量聚合酶量。我们将含有纳米结构的溶液与不同量的聚合酶混合，然后在固定时间点取等分试样以测量DNA酶活性。随着时间的推移，具有较少聚合酶的反应具有较慢的DNA酶活性衰减，因为较低量的酶不能破坏同样多的DNA酶结构(图4a)。这可以用于检测DNA聚合酶的量，例如测定纯化的重组酶的产量。所述系统还可以用于测定聚合酶活性(激活或抑制)(图4b)，例如用于测定不同量的化学添加剂对固定量的酶的活性的影响。
实施例4
不同刺激的检测
通过将这些催化纳米结构与其他反应性纳米结构和其他触发DNA聚合酶可用性和/或活性的机制偶联，我们可以创建一种系统，所述系统是反应性的并且特别测量各种不同溶液环境(例如，细胞裂解物、化学缓冲液)中的各种其他刺激和靶分子，包括但不限于DNA、RNA、蛋白质、脂质、小分子、代谢物和修饰。为了证明这一点，我们使用了专门设计的识别纳米结构(SEQ ID NO:11和12)，其对特异性核酸靶标(SEQ ID NOs:13and 14，分别为人肌动蛋白βDNA和RNA)具有反应性以激活/失活DNA聚合酶[通过引用并入本文的PCT专利公开号WO 2020/009660；Ho,N.R.Y.等人,Nature Communications 9:3238(2018)]，并使其偶联在催化核酸纳米结构的上游。所述集成系统可以以相同的效率检测DNA和RNA靶标。通过使具有适体的识别纳米结构适应于特定的蛋白质靶标，该系统还可以用于检测蛋白质或小分子靶标。我们设计了一种识别纳米结构，其通过将对于该蛋白质的适体并入反向体序列(SEQ ID NO:16和17)中而对EPCAM蛋白具有反应性。当我们添加更多表达所述蛋白质的细胞时，我们观察到渐增量的聚合酶活性(图5)。通过将反应性DNA酶纳米结构固定至电极表面，由DNA酶活性产生的电子可以迅速穿梭至电极，从而产生可测量的电流。这种电化学读数使我们能够检测DNA酶活性的微小变化。通过将其与识别纳米结构偶联，我们能够检测到少至101个拷贝的特异性靶标，且即使使用1011个拷贝的加扰序列(SEQ ID NO:15)也无信号(图6a)。信号可以在几分钟内与加扰靶标区分开，并且在短至20分钟内达到饱和(图6b)。
实施例5
用于功能性控制的固定化纳米结构
可以在表面固定不同的纳米结构以控制它们在不同环境中的功能性和功能性的相继次序。具体地，可以将本文所述的纳米结构固定在不同的表面上，如可以使用金、聚苯乙烯和二氧化硅。这些表面通过各种常见的生物缀合反应(如碳二亚胺、琥珀酰亚胺或二硫醇交联、金-硫醇或亲和素-生物素)进行功能化。通过包含接头和表面处理基团(例如，聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷))，可以优化表面密度和分子构型以实现功能性控制和表面模式化。例如，使用实施例4中描述的识别人β肌动蛋白基因的固定化识别纳米结构(SEQ ID NO:11和12)，我们证明了所述固定不影响其结合和抑制DNA聚合酶的功能。没有固定化纳米结构的相同表面无法使聚合酶失活，这表明其是识别纳米结构的特性。重要的是，固定化识别纳米结构能够结合至其编程的靶核酸序列，并以可比较的能力激活聚合酶(图7)。纳米结构也可以固定在不同的分子构型中(图7)，从而实现功能性的相继次序(信息流)。这种固定实现了阵列类型模式化以用于检测不同靶标[Yeh,E.C.等人,Sci Adv 3:e1501645(2017)]，并且改善了在原本抑制各种纳米结构功能性的不同环境(例如，裂解缓冲液、洗涤剂、乙二胺四乙酸或生物样品的组分，如IgG、血红蛋白、蛋白酶和肝素)中的分析性能[Zumla,A.等人,Lancet Infect Dis 14:1123-1135(2014)]。因此，这种系统能够直接检测样品，而不需要大量的纯化步骤。
序列表
<110> 新加坡国立大学
新加坡科技研究局
<120> 聚合酶反应性催化核酸纳米结构
<130> SP102527WO
<150> SG10202003188S
<151> 2020-04-07
<160> 18
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G-四链体Hemin DNA酶
<400> 1
ctgggaggga gggaggga 18
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚合酶反应性元件1
<400> 2
ctgggaggga gggagggaat gctaacgcat tgtcgatagc 40
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚合酶反应性元件2
<400> 3
gctatcgaca atgcgtt 17
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G-四链体Hemin DNA酶催化纳米结构1
<400> 4
ctgggaggga gggagggaat gctaacgcat tgtcgatagc tctgtcgcta tcgacaatgc 60
gtt 63
<210> 5
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G-四链体Hemin DNA酶催化纳米结构2
<400> 5
ctgggaggga gggagggaat gctaacgcat tgtcgatagc tctgtcgcta tcgacaatgc 60
gttagcat 68
<210> 6
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G-四链体Hemin DNA酶催化纳米结构3
<400> 6
ctgggaggga gggagggaat gctaacgcat tgtcgatagc tctgtcgcta tcgacaatgc 60
gttagcatcc c 71
<210> 7
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G-四链体Hemin DNA酶催化纳米结构4
<400> 7
ctgggaggga gggagggaat gctaacgcat tgtcgatagc tctgtcgcta tcgacaatgc 60
gttagcatcc ctccc 75
<210> 8
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G-四链体Hemin DNA酶催化纳米结构5
<400> 8
ctgggaggga gggagggaat gctaacgcat tgtcgatagc tctgtcgcta tcgacaatgc 60
gttagcatcc ctccctccc 79
<210> 9
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G-四链体Hemin DNA酶催化纳米结构6
<400> 9
ctgggaggga gggagggaat gctaacgcat tgtcgatagc tctgtcgcta tcgacaatgc 60
gttagcatcc ctccctccct cccag 85
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号传导纳米结构的自引发部分
<400> 10
aacgcattgt cgatagctca gctgtctgag ctatcgacaa tgcgtt 46
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 识别纳米结构1
<400> 11
tgcaaggccg gcttcgcggg caatgtacag tattg 35
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 识别纳米结构2
<400> 12
cccgcgaagc cggccttgca catgccggag ccgttgtcga 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶核酸1
<400> 13
tcgacaacgg ctccggcatg tgcaaggccg gcttcgcggg 40
<210> 14
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶核酸2
<400> 14
ucgacaacgg cuccggcaug ugcaaggccg gcuucgcggg 40
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 加扰序列
<400> 15
gagtaccgcc ccccggtttg gtacggcggc ggtgcgacaa 40
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EPCAM适体/反向体
<400> 16
cagacgcaac ctctgtagtg caatgtacag tattg 35
<210> 17
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EPCAM适体/反向体 2
<400> 17
cactacagag gttgcgtctg tcccacgttg tcatgggggg ttggcctg 48
<210> 18
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 保守序列
<400> 18
caatgtacag tattg 15
发明内容
本发明的优点包括：
1.与非催化纳米结构相比，改进的速度和敏感性；
2.改进的性能，且在不同的环境中具有不同的读数方式以增强移植性；
3.在原本抑制不同的纳米结构功能的不同环境中改进的分析性能；
参考文献
1.Gardner,S.N.,Kuczmarski,T.A.,Vitalis,E.A.&Slezak,T.R.Limitations ofTaqMan PCR for detecting divergent viral pathogens illustrated by hepatitisA,B,C,and E viruses and human immunodeficiency virus.J Clin Microbiol 41,2417-2427(2003).
2.Ho,N.R.Y.et al.Visual and modular detection of pathogen nucleicacids with enzyme–DNA molecular complexes.Nature Communications 9,3238(2018).
3.Juskowiak,B.Nucleic acid-based fluorescent probes and theiranalytical potential.Anal Bioanal Chem 399,3157-3176(2011).
4.Li,W.et al.Insight into G-quadruplex-hemin DNAzyme/RNAzyme:adjacentadenine as the intramolecular species for remarkable enhancement of enzymaticactivity.Nucleic acids research 44,7373-7384(2016).
5.Niemz,A.,Ferguson,T.M.&Boyle,D.S.Point-of-care nucleic acid testingfor infectious diseases.Trends Biotechnol 29,240-250(2011).
6.Nelms,B.L.&Labosky,P.A.A predicted hairpin cluster correlates withbarriers to PCR,sequencing and possibly BAC recombineering.Scientific Reports1,106(2011).
7.Nong,R.Y.,Gu,J.,Darmanis,S.,Kamali-Moghaddam,M.&Landegren,U.DNA-assisted protein detection technologies.Expert Rev Proteomics 9,21-32(2012).
8.Yeh,E.C.et al.Self-powered integrated microfluidic point-of-carelow-cost enabling(SIMPLE)chip.Sci Adv 3,e1501645(2017).
9.Zhao,Y.,Chen,F.,Li,Q.,Wang,L.&Fan,C.Isothermal Amplification ofNucleic Acids.Chem Rev 115,12491-12545(2015).
10.Zumla,A.et al.Rapid point of care diagnostic tests for viral andbacterial respiratory tract infections--needs,advances,and futureprospects.Lancet Infect Dis 14,1123-1135(2014).

Claims (16)

1.一种包含DNA酶/RNA酶和刺激反应元件的催化核酸纳米结构。
2.根据权利要求1所述的催化核酸纳米结构，其中所述DNA酶/RNA酶选自：
核糖核酸酶，如核糖核酸酶8-17、核糖核酸酶10-23或Dz10-66脱氧核酶；
脱氧核糖核酸酶，如10MD5脱氧核酶或9NL27脱氧核酶；
过氧化物酶，如G-四链体Hemin；
具有连接活性的酶，如E47脱氧核酶；
磷酸酶，如14WM9脱氧核酶；
酰胺水解物，如AmideAm1脱氧核酶；以及
RNA分支酶，如9F7脱氧核酶或7S11脱氧核酶。
3.根据权利要求1或2所述的催化核酸纳米结构，其中所述刺激反应元件包含在存在聚合酶的情况下抑制所述DNA酶/RNA酶活性的聚合酶反应元件。
4.根据权利要求3所述的催化核酸纳米结构，其中所述聚合酶反应元件具有内部发夹结构。
5.根据权利要求4所述的催化核酸纳米结构，其中所述聚合酶反应元件的聚合酶延伸消除催化活性。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的催化核酸纳米结构，其中所述DNA酶/RNA酶活性是过氧化物酶活性。
7.根据权利要求6所述的催化核酸纳米结构，其中通过不同的方式检测过氧化物酶底物的活性，所述方式包括但不限于比色、荧光、电化学或发光手段。
8.一种检测测试样品中聚合酶活性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供测试样品；
(b)提供包含根据权利要求3至7中任一项所述的催化核酸纳米结构的组合物；
(c)在存在DNA酶/RNA酶底物和任选的信号显影试剂的情况下使a)中的所述样品与b)中的所述组合物接触；
(d)检测信号显影，其中信号的强度与所述样品中聚合酶活性的量相反。
9.一种检测样品中的靶分子的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供测试样品；
(b)提供包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含适于识别所述样品中的所述靶分子的DNA聚合酶特异性DNA适体；
(c)提供包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含具有保守序列区和可变序列区的DNA聚合酶特异性DNA适体，其中所述可变序列区包含与所述反向体寡核苷酸的一部分互补并且与其形成双链体的至少10个核苷酸的突出端区段，其中所述反向体寡核苷酸适于以比所述可变双链体区更高的亲和力识别所述样品中的所述靶分子；
(d)使所述测试样品与(b)或(c)的所述组合物接触，其中所述靶分子结合至：
(i)(b)中的所述适体的识别序列区促进稳定的适体-DNA聚合酶复合物的形成，
从而抑制DNA聚合酶活性；或者
(ii)(c)中的所述反向体寡核苷酸使所述识别纳米结构不稳定，从而使所述DNA聚合酶从所述DNA适体的抑制中释放出来；
(e)提供根据权利要求3至7中任一项所述的催化核酸纳米结构；
(f)在存在DNA酶/RNA酶底物和任选的信号显影试剂的情况下接触来自步骤(b)或(c)的所述纳米结构；
(g)检测信号显影，其中信号强度指示：
(i)当使用组合物(b)时，所述样品中存在靶分子；或
(ii)当使用组合物(c)时，所述样品中不存在靶分子。
10.一种检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含核酸的样品；
(b)提供包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含具有保守序列区和可变序列区的DNA聚合酶特异性DNA适体，其中所述可变序列区包含与所述样品中的靶核酸互补的至少10个核苷酸的突出端区段；或者
(c)提供包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含DNA聚合酶特异性DNA适体和反向体寡核苷酸，其中所述适体具有保守序列区和可变序列区，其中所述可变序列区包含与所述反向体寡核苷酸的一部分互补并与其形成双链体的至少10个核苷酸的突出端区段，其中所述反向体寡核苷酸比所述适体-反向体双链体长至少一个核苷酸，并具有与所述样品中的靶核酸互补的超过10个核苷酸；
(d)使包含核酸的所述样品与(b)或(c)的所述组合物接触，其中靶核酸结合至：
(i)(b)中的所述适体的可变序列区促进稳定的适体-DNA聚合酶复合物的形成，
从而抑制DNA聚合酶活性；或者
(ii)(c)中的所述反向体寡核苷酸使所述识别纳米结构不稳定，从而使所述DNA聚合酶从所述DNA适体的抑制中释放出来；
(e)提供根据权利要求3至7中任一项所述的催化核酸纳米结构；
(f)在存在DNA酶/RNA酶底物和任选的信号显影试剂的情况下接触来自步骤(d)的所述纳米结构；
(g)检测信号显影，其中信号强度指示：
(i)在使用组合物(b)时，所述样品中存在靶核酸；或者
(ii)在使用组合物(c)时，所述样品中不存在靶核酸。
11.一种装置，所述装置包含固定在表面上的根据权利要求1至7中任一项所述的催化核酸纳米结构。
12.根据权利要求11所述的装置，所述装置包含：
(i)在第一位置处的根据权利要求10所述的含有至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物b)或组合物c)；
(ii)附接在第二位置处的根据权利要求3至7中任一项所述的催化核酸纳米结构；以及
(iii)中间级，其用于将所述检测纳米结构与样品核酸混合，以将活性酶释放至所述第二位置。
13.根据权利要求11或12所述的装置，所述装置选自微流体装置和侧流装置。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的装置，所述装置包含电极。
15.一种核酸检测试剂盒，所述核酸检测试剂盒含有：
(a)包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含具有保守序列区和可变序列区的DNA聚合酶特异性DNA适体，其中所述可变序列区包含与靶核酸互补的至少10个核苷酸的突出端区段；和/或
(b)包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含DNA聚合酶特异性DNA适体和反向体寡核苷酸，其中所述适体具有保守序列区和可变序列区，其中所述可变序列区包含与所述反向体寡核苷酸的一部分互补并与其形成双链体的至少10个核苷酸的突出端区段，其中所述反向体寡核苷酸比所述适体-反向体双链体长至少一个核苷酸并且具有与靶核酸互补的超过10个核苷酸；任选地
(c)根据权利要求3至7中任一项所述的催化核酸纳米结构；任选地
(d)DNA酶/RNA酶底物，以及任选地
(e)信号显影试剂。
16.一种分子检测试剂盒，所述分子检测试剂盒含有：
(a)包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含具有保守序列区和可变序列区的DNA聚合酶特异性DNA适体，其中所述可变序列区包含与所述反向体寡核苷酸的一部分互补并且与其形成双链体的至少10个核苷酸的突出端区段，其中所述反向体寡核苷酸适于以比所述可变双链体区更高的亲和力识别所述样品中的所述靶分子；
(b)根据权利要求3至7中任一项所述的催化核酸纳米结构；任选地
(c)DNA酶/RNA酶底物，以及任选地
(d)信号显影试剂。
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