KR20210049782A - 효소-지원 나노기술을 이용한 핵산의 시각적 및 모듈식 검출 - Google Patents

효소-지원 나노기술을 이용한 핵산의 시각적 및 모듈식 검출 Download PDF

Info

Publication number
KR20210049782A
KR20210049782A KR1020217003384A KR20217003384A KR20210049782A KR 20210049782 A KR20210049782 A KR 20210049782A KR 1020217003384 A KR1020217003384 A KR 1020217003384A KR 20217003384 A KR20217003384 A KR 20217003384A KR 20210049782 A KR20210049782 A KR 20210049782A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
nucleic acid
nanostructure
dna polymerase
inverter
Prior art date
Application number
KR1020217003384A
Other languages
English (en)
Inventor
후이린 샤오
니콜라스 루이 유안 호
Original Assignee
내셔널 유니버시티 오브 싱가포르
에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르, 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 filed Critical 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르
Publication of KR20210049782A publication Critical patent/KR20210049782A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/42—Integrated assemblies, e.g. cassettes or cartridges
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/04—Exchange or ejection of cartridges, containers or reservoirs
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0663—Stretching or orienting elongated molecules or particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/16—Reagents, handling or storing thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0825—Test strips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0883—Serpentine channels
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • B01L2400/049—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics vacuum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/205—Aptamer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/149—Particles, e.g. beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device

Abstract

본 발명은 표적 인식 및 시각적 신호 증폭을 분리하기 위해 - 2개의 독립적인 효소-DNA 나노구조 - 쉽게 조정 가능한 인식 요소 및 민감한 범용 신호전달 요소의 집적 회로를 사용하여 핵산의 특정 검출을 위한 방법 및 장치를 제공한다. 인식 요소는 DNA 폴리머라제 효소, DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 압타머 및 인버터 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 표적 핵산의 존재 하에, 인버터 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산에 결합하고 DNA 압타머에 의한 억제로부터 DNA 폴리머라제 효소를 방출한다. 이어서, 활성화된 DNA 폴리머라제는 표지된 dNTP 및 신호 발달 시약의 존재 하에 DNA 폴리머라제에 반응을 보이는 자기-프라이밍 부분을 포함하는 신호전달 나노구조와 접촉되며, 여기서, 활성화된 DNA 폴리머라제 효소가 표지된 dNTP를 자기-프라이밍된 부분에 추가한 후, 신호 발달 시약이 표지된 dNPT에 결합할 것이다.

Description

효소-지원 나노기술을 이용한 핵산의 시각적 및 모듈식 검출
본 발명은 효소-지원(enzyme-assisted) 나노기술을 이용한 핵산 검출에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 표적 인식 및 시각적 신호 증폭(visual signal amplification)을 분리하기 위해 - 2개의 독립적인 효소-DNA 나노구조 - 쉽게 조정 가능한 인식 요소(recognition element) 및 민감한 범용 신호전달 요소(universal signaling element)의 집적 회로를 사용하여 핵산의 특정 검출을 위한 방법 및 장치를 제공한다.
병원체 핵산의 검출은 감염 진단 및 관리에 광범위하게 적용된다. 긴 처리 시간 (즉, 수일)이 수반하고 종-특이적 프로토콜 (예를 들어, 박테리아 대 바이러스)을 필요로 하는 통상의 병원체 배양의 대안으로서, 핵산 기술이 임상 실험실에서 점점 더 많이 채택되어 감염 (및 그 이상)에 대한 전례없는 분자 정보를 제공하고 있다 [ Niemz, A., Ferguson, T. M. & Boyle, D. S. Trends Biotechnol 29: 240-250 (2011); Nong, R. Y., et al., Expert Rev Proteomics 9: 21-32 (2012); Zumla, A. et al. Lancet Infect Dis 14: 1123-1135 (2014)]. 예를 들어, 핵산-기반 인간 유두종 바이러스 (HPV) 검사는 현대 자궁경부암 검사에 필수적이다. 가장 흔한 성 매개 감염병인 HPV는 자궁경부암의 주요 원인이다 [Crosbie, E. J., et al., Lancet 382: 889-899 (2013)]. HPV의 >100개 아형이 있으며, 그 중 15개는 높은 악성 위험으로 간주된다 [Bouvard, V. et al. Lancet Oncol 10: 321-322 (2009)]. HPV 감염은 전 세계적인 유행병이며; 대부분은 양성이지만, 이들 감염 중 일부는 진행되어 치명적인 자궁경부암을 유발할 수 있다. 이 복합적 병인론, 발암 및 질환 진행은 두 가지 인자: 1) 특정 HPV 분자 아형으로부터의 감염, 및 2) 감염의 지속성과 주로 관련이 있다 [Bodily, J. & Laimins, L. Trends Microbiol 19: 33-39 (2011); Schiffman, M. et al. Nat Rev Dis Primers 2: 16086 (2016)].
병원체 핵산의 현재 검출은, 거의 독점적으로 대규모 중앙집중적(centralized) 임상 실험실에서 수행된다. 이러한 제한된 범위는 기존 기술과 연관이 있는 높은 복잡성 및 비용으로부터 발생한다. HPV 검출의 경우에, 상용 검정은 주로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR, 예를 들어, 코바스(Cobas) HPV)에 영향을 주어 특정 DNA 표적을 증폭하고 검출한다 [Rao, A. et al. J Clin Microbiol 51: 1478-1484 (2013); Cui, M. et al. J Clin Microbiol 52: 2210-2211 (2014)]. 이러한 시스템은, PCR 열적 순환(thermal cycling) 및 형광 측정을 위해 부피가 크고 특수한 장비를 필요로 할뿐만 아니라, 조작할 훈련된 인력도 필요로 한다. 고급 등온 증폭 검정은 온도 순환에 대한 기기 요구를 완화하기 위해 개발되었으며; 그럼에도 불구하고, 이들 검정은 그 자체 한계를 갖는다. 예를 들어, 루프-매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification) (LAMP)은 엄격한 서열 요구사항을 가지며 쉽게 일반화될 수 없다 [Zhao, Y., et al., Chem Rev 115: 12491-12545 (2015)]. 중요하게는, 다른 핵산 증폭 접근법과 마찬가지로, LAMP는 허위-양성 (예를 들어, 프라이머-이량체 형성으로부터)이 발생하기 쉽다. 대안으로, 서열-특이적 신호전달 프로브(signaling probe) (예를 들어, 형광 타크만(Taqman) 리포터)를 사용하여 검출 정확도를 개선할 수 있을 것이나; 이들 프로브는 비용이 많이 들고 구현하기 복잡하다 [Gardner, S. N., et al., J Clin Microbiol 41: 2417-2427 (2003)]. DNA 표적의 각각의 조각(piece)은 표적 증폭 동안 결합된(coupled) 신호전달을 위한 전용, 서열-특이적 프로브를 필요로 하기 때문에, 상기 접근법은 점점 더 비용이 많이 들고 복잡한 계산을 수행하거나 멀티플렉싱(multiplexing)하기가 도전적인 과제가 된다 [Juskowiak, B. Anal Bioanal Chem 399: 3157-3176 (2011)].
핵산의, 신속한, 시각적 및 모듈식(modular) 검출을 가능하게 하는 분자 플랫폼(molecular platform)이 필요하다.
표적 핵산 증폭에 의존하는 대신에, 본 발명의 기술은 직접적이고 독립적인 표적 하이브리드형성(hybridization)로부터 시각적 신호를 기하급수적으로 증진시킨다. 핵산의 시각적 식별을 위한 효소-지원 나노기술(enzyme-assisted nanotechnology for visual identification of nucleic acids) (enVision)로 불리며, 본 발명은 표적 인식 및 시각적 신호 증폭을 분리하기 위해 - 2개의 독립적인 효소-DNA 나노구조 - 쉽게 조정 가능한 인식 요소 및 민감한 범용 신호전달 요소의 집적 회로로 이루어진다. DNA 나노구조는 다양한 효소 활성을 용이하게 하기 위해 안정적인 3차원 입체형태를 보유하도록 설계될 수 있고, 밀접하게 패킹되어 있는 경우에도, 독립적인 조작을 가능하게 하는, 최소한의 혼선(cross-talk)을 갖도록 설계될 수 있기 때문에 기능적 요소로서 선택되었다 [Lee, H. et al. Nat Nanotechnol 7: 389-393 (2012); Wang, L., et al., Nucleic Acids Res 45: 12090-12099 (2017); Li, J., et al., Nat Chem 9: 1056-1067 (2017)].
제1 측면에서
(a) 핵산을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 적어도 1종의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 1종의 인식 나노구조(recognition nanostructure)포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 여기서 인식 나노구조가 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 갖는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 압타머(aptamer)를 포함하며, 여기서 가변 서열 영역이 샘플에서 표적 핵산에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트(overhang segment)를 포함하는 것인 단계; 또는
(c) 적어도 1종의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 1종의 인식 나노구조를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 여기서 인식 나노구조가 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 압타머 및 인버터(inverter) 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 압타머가 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 가지며, 여기서 가변 서열 영역이 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함하고, 상기 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부와 듀플렉스(duplex)를 형성하며, 여기서 인버터 올리고뉴클레오티드가 압타머-인버터 듀플렉스보다 적어도 1개의 뉴클레오티드가 더 길어서, 인버터 오버행을 생성하고, 샘플에서 표적 핵산에 상보적인 10개 초과의 뉴클레오티드를 갖는 것인 단계;
(d) 핵산을 포함하는 샘플을 (b) 또는 (c)의 조성물과 접촉시키는 단계로서, 여기서 표적 핵산이 다음에 결합하는 것인 단계:
(i) (b)에서의 압타머의 가변 서열 영역이 안정한 압타머-DNA 폴리머라제 효소 복합체의 형성을 촉진하여, DNA 폴리머라제 효소 활성을 억제하는 것; 또는
(ii) (c)에서의 인버터 올리고뉴클레오티드가 인식 나노구조를 불안정하게 하여, DNA 압타머에 의한 억제로부터 DNA 폴리머라제 효소를 방출하는 것;
(e) 단계 (d)로부터 활성 DNA 폴리머라제 효소에 반응성인 신호전달 나노구조를 제공하는 단계로서, 여기서 신호전달 나노구조가 DNA 폴리머라제 효소에 반응을 보이는 자기-프라이밍 부분(self-priming portion)을 포함하는 것인 단계;
(f) 신호전달 나노구조를 표지된 올리고뉴클레오티드 (dNTP) 및 신호 발달 시약(signal development reagent)의 존재 하에 단계 (d)로부터의 활성 DNA 폴리머라제 효소와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 활성화된 DNA 폴리머라제 효소가 표지된 올리고뉴클레오티드를 신호전달 나노구조에 추가하고 신호 발달 시약이 자기-프라이밍된 부분에 혼입된 표지된 올리고뉴클레오티드에 결합하는 것인 단계;
(g) 신호 발달을 검출하는 단계로서, 여기서 신호의 강도가 다음을 나타내는 것인 단계;
(i) 조성물 (b)를 사용할 때 샘플 중 표적 핵산의 부재; 또는
(ii) 조성물 (c)를 사용할 때 샘플 중 표적 핵산의 존재
를 포함하는, 샘플에서 표적 핵산을 검출하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서 DNA 폴리머라제 효소는 그로부터 원래 단리된 호열성 박테리아 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)의 이름을 딴 내열성 DNA 폴리머라제인 Taq 폴리머라제이다.
일부 실시양태에서 DNA 압타머 보존된 서열 영역은 핵산 서열 5'-CAATGTACAGTATTG-3' (서열 번호: 153)를 포함한다.
일부 실시양태에서 인버터 올리고뉴클레오티드는 압타머 듀플렉스 영역보다 적어도 1개의 뉴클레오티드가 더 길다. 바람직하게는, 인버터 올리고뉴클레오티드는 압타머 듀플렉스 영역의 길이의 약 2배이다.
일부 실시양태에서, 인버터 올리고뉴클레오티드 길이의 약 절반은 압타머-인버터 듀플렉스를 형성하고 약 절반은 오버행 세그먼트를 형성한다.
일부 실시양태에서 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은, 듀플렉스 검출을 위해, 샘플에서 제1 인식 나노구조의 표적 핵산과 상이한 표적 핵산에 상보적인 제2 인식 나노구조를 제공하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서 방법은 다중 검출(multiplex detection)을 위해, 각각이 샘플에서 다른 인식 나노구조의 표적 핵산과 상이한 표적 핵산에 상보적인 인버터 서열을 갖는 것인 추가 인식 나노구조(들)를 제공한다. 다중-유전자좌 HPV 검출에 적합한 압타머 및 인버터 올리고뉴클레오티드 서열의 예를 표 4에 나타냈다.
일부 실시양태에서 pan 검출에 유용한, 표적 핵산 서열 가변성을 수용하기 위해 미스매치(mismatch)를 인버터 올리고뉴클레오티드 오버행에 도입한다. HPV의 pan 검출에 적합한 압타머 및 인버터 올리고뉴클레오티드 서열의 예를 표 2에 나타냈다.
일부 실시양태에서 바이러스 아형결정(subtyping)과 같이 밀접하게 관련된 표적 핵산의 다중 검출에 유용한, 강한 서열 특이성(specificity)을 부여하기 위해 미스매치를 가변 서열 영역 듀플렉스에 도입한다. HPV 아형결정에 적합한 압타머 및 인버터 올리고뉴클레오티드 서열의 예를 표 2에 나타냈다.
일부 실시양태에서 방법은 다중 검출을 위해, 샘플에서 제1 인식 나노구조의 표적 핵산과 상이한 1종 이상의 표적 핵산에 상보적인 1종 이상의 추가 인식 나노구조를 제공하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서 인식 나노구조 각각은 AND, OR, NOT, NAND 및 NOR을 포함하는 군으로부터 선택된 논리 게이트(logic gate)를 형성하기 위해 각각의 인식 나노구조의 DNA 압타머: 인버터 올리고뉴클레오티드: DNA 폴리머라제 효소 비의 조합을 포함한다. HPV의 논리 게이트 검출에 적합한 압타머 및 인버터 올리고뉴클레오티드 서열의 예를 표 5에 나타냈다.
일부 실시양태에서 인식 나노구조 및 DNA 압타머: 인버터 올리고뉴클레오티드: 각각의 인식 나노구조의 DNA 폴리머라제 효소 비의 조합은 다음을 포함하는 군 (i) 내지 (v)로부터 선택된다:
(i) AND 논리 게이트를 형성하기 위해 각각 1: 1: 0.5 DNA 압타머: 인버터 올리고뉴클레오티드: DNA 폴리머라제 효소 비를 갖는 2개의 나노구조;
(ii) OR 논리 게이트를 형성하기 위해 각각 1: 1: 1 DNA 압타머: 인버터 올리고뉴클레오티드: DNA 폴리머라제 효소 비를 갖는 2개의 나노구조;
(iii) NOT 논리 게이트를 형성하기 위해 1: 0: 1을 갖는 1개의 나노구조;
(iv) NAND 게이트를 형성하기 위해 각각 1: 0: 1 DNA 압타머: 인버터 올리고뉴클레오티드: DNA 폴리머라제 효소 비를 갖는 2개의 나노구조; 및
(v) NOR 게이트를 형성하기 위해 각각 1: 0: 0.5 DNA 압타머: 인버터 올리고뉴클레오티드: DNA 폴리머라제 효소 비를 갖는 2개의 나노구조.
일부 실시양태에서 상기에 기재된 바와 같은 논리 게이트 군 (i) 내지 (v)의 조합은 2개 초과의 표적이 검출될 수 있게 한다.
일부 실시양태에서 논리 함수는 분자 계산을 수행하기 위해 사용될 수 있는데, 예컨대 여기서 OR 함수는 검출 커버리지(detection coverage)를 개선하고/하거나 AND 함수는 검출 특이성을 개선한다.
일부 실시양태에서 신호전달 나노구조의 자기-프라이밍 부분은 핵산 서열: 5'-AGCAGGCAGTTACGGGCTGGTGCGATGAGAGACGCGGAGTGTGGCGGCC
GGATAGTAATGACTGCGACCGGTGTACCAGTGGCGTGAGGCAGGTCGTGA
GGCGGCGTACGTAGAGCGTTGAGCAGGATGCCAACAGTCGATCAGGACGA
GTGCTAACGCATTGTCGATAGCTCAGCTGTCTGAGCTATCGACAATGCGTT-3' (서열 번호: 5)을 포함한다.
일부 실시양태에서 표적은 DNA, RNA, PNA 및 다른 핵산 유사체를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 1종의 핵산이다.
일부 실시양태에서 표적은 비-인간 또는 인간 질환, 유전적 변이체, 포렌식(forensic), 균주 식별(strain identification), 환경 및/또는 식품 오염과 연관된 적어도 1종의 핵산이다.
일부 실시양태에서 표적은 병원체이다. 일부 실시양태에서 병원체는 바이러스이다. 바이러스의 비제한적인 예는 본 발명의 방법에 따라 검출 및/또는 특성화될 수 있는 본원에 나타낸 바와 같은 HPV이다.
일부 실시양태에서 신호전달 단계에서 사용되는 dNTP 표지는 비오틴이다.
일부 실시양태에서 신호 발달 시약은 아비딘 또는 그의 유도체를 포함하는 융합 단백질, 및 HRP, 베타-락타마제, 아밀라제, 베타-갈락토시다제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 군으로부터 선택된 효소, 및 DAB, TMB, ABTS, 니트로세핀(nitrocefin), 루미놀(luminol), 전분 및 아이오딘을 포함하나 이에 제한되지는 않는 군으로부터 선택된 각각의 기질(substrate)을 포함하고, 여기서 신호가 측정될수 있고 색상, 형광, 발광 또는 전기화학적 변화로서 정량화될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서 단계 (a) 전에 샘플에서 표적 핵산의 증폭이 선행된다.
일부 실시양태에서 샘플에서 표적 핵산의 증폭은 중첩된(nested) 비대칭 PCR 또는 등온 증폭 방법에 의한 것이다.
일부 실시양태에서 검출 및 신호전달 단계는 물리적으로 및/또는 공간적으로 분리된다.
일부 실시양태에서 검출 및 신호전달 나노구조는 기질에 부착된다.
일부 실시양태에서 신호전달 나노구조는 비드(bead)에 부착된다.
일부 실시양태에서, 검출 및 신호전달 나노구조는 미세유체 장치(microfluidic device) 또는 측면 유동 장치(lateral flow device)에 부착된다.
일부 실시양태에서, 방법 단계 a) 내지 e) 중 하나 이상이 16℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서 수행된다. 일부 실시양태에서 단계 d) 내지 g)는 16℃ 내지 40℃ 범위의 온도에서 수행된다.
일부 바람직한 실시양태에서 방법 단계 a) 내지 e) 중 하나 이상이 주위 온도에서 수행된다. 일부 바람직한 실시양태에서 단계 d) 내지 g)는 주위 온도에서 수행된다.
일부 실시양태에서 단계 a) 내지 d)는 단계 e) 내지 g)와 무관하다. 자극에 반응하여 효소 활성을 방출하는 대안적 메커니즘은 a) 내지 d) 단계에서 사용될 수 있다. 대안적 메커니즘은 그의 억제제, 온도 변화, 대안적 DNAzyme 등과의 근접성을 통한 효소 억제를 포함할 수 있다. 효소 활성을 판독하는 대안적 메커니즘은 단계 a) 내지 d)의 활성화 후 상이한 자극의 검출을 위해 단계 e) 내지 g)에서 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 다음 핵산 서열을 포함하는 자기-프라이밍 부분을 포함하는 단리된 신호전달 나노구조 핵산이 제공된다:
5'-AGCAGGCAGTTACGGGCTGGTGCGATGAGAGACGCGGAGTGTGGCGGCC
GGATAGTAATGACTGCGACCGGTGTACCAGTGGCGTGAGGCAGGTCGTGA
GGCGGCGTACGTAGAGCGTTGAGCAGGATCCAACAGTCGATCAGGACGA
GTGCTAACGCATTGTCGATAGCTCAGCTGTCTGAGCTATCGACAATGCGTT-3' (서열 번호: 5).
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 제1 위치에서 앞서 정의된 바와 같은, 상기 조성물 b) 또는 조성물 c), 제2 위치에서 부착된 앞서 정의된 바와 같은, 상기 신호전달 나노구조, 및 상기 검출 나노구조를 샘플 핵산과 혼합하여 활성 효소를 상기 제2 위치로 방출하는 중간 스테이지(intermediate stage)를 포함하는 장치가 제공된다.
일부 실시양태에서 중간 스테이지는 제1 및 제2 위치를 연결하는 유체 채널(fluid channel)이다.
상기에 따른 장치는, 부분적으로 상이한 효소 활성의 지속시간을 최적화하기 때문에, 본 발명에 따른 샘플에서 특정 핵산을 검출하는 방법의 반응 속도론 및 민감도(sensitivity)를 개선한다.
본 발명에 따른 대안적인 장치 구성은 제1 위치에 있는 상기 검출 및 상기 신호전달 나노구조를 포함하며, 여기서 신호전달 나노구조는 비드에 부착되고 제1 위치에서 검출 나노구조와 혼합되며, 그 후 비드는 그 위치에서 또는 제2 위치에서 제자리에 포획되어 그의 주어진 위치에서 활성 효소를 방출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 장치는 미세유체 장치 및 측면 유동 장치를 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 장치는 앞서 기재된 바와 같은 미세유체 장치이다. 이러한 장치의 예를 도 1, 도 6 및 도 7에 나타냈다. 도 1 및 도 6을 참조하면, 일부 실시양태에서 제1 위치는 시험할 샘플이 미세유체 장치에 로딩되고 미리 로딩된 검출 나노구조와 접촉하는 위치일 수 있음을 이해할 것이다. 이어서 샘플 및 검출 나노구조는 중간 유체 채널을 통과하면서 혼합 및 상호 작용할 수 있으며, 이에 따라 양성 검출은 활성 폴리머라제를 방출한다. 이어서 활성 효소는 고정된(immobilized) 범용 신호전달 나노구조가 미리 로딩된 제2 위치 (반응 챔버)로 진입하여, 여기서 상기 효소가, 표지된 올리고뉴클레오티드 및 신호 개발 시약을 포함하는 신호전달 분자의 생성을 중합하여 혼입된 표지된 올리고뉴클레오티드에 결합한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면,
(a) 적어도 1종의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 1종의 인식 나노구조를 포함하는 조성물로서, 여기서 인식 나노구조가 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 갖는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DN 압타머를 포함하며, 여기서 가변 서열 영역이 표적 핵산에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함하는 것인 조성물; 및/또는
(b) 적어도 1종의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 1종의 인식 나노구조를 포함하는 조성물로서, 여기서 인식 나노구조가 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 압타머 및 인버터 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 압타머가 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 가지며, 여기서 가변 서열 영역이 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함하고, 상기 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부와 듀플렉스를 형성하며, 여기서 인버터 올리고뉴클레오티드가 압타머-인버터 듀플렉스보다 적어도 1개의 뉴클레오티드가 더 길고 표적 핵산에 상보적인 10개 초과의 뉴클레오티드를 갖는 것인 조성물; 및/또는
(c) 활성 DNA 폴리머라제 효소에 반응성인 신호전달 나노구조로서,신호전달 나노구조가 DNA 폴리머라제 효소에 반응을 보이는 자기-프라이밍 부분을 포함하는 것인 상기 나노구조; 및/또는
(d) 표지된 올리고뉴클레오티드 (dNTP) 및 신호 발달 시약으로서, 여기서 활성 DNA 폴리머라제 효소가 표지된 올리고뉴클레오티드를 신호전달 나노구조에 추가하고 신호 발달 시약이 자기-프라이밍된 부분에 혼입된 표지된 올리고뉴클레오티드에 결합하는 것인 상기 dNTP 및 신호 발달 시약
을 포함하는 핵산 검출 키트가 제공된다.
일부 실시양태에서 본 발명의 핵산 검출 키트는 본 발명의 임의의 측면에 따라 앞서 정의된 바와 같은 (a) 내지 (d)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 검출 키트는 본 발명의 임의의 측면에 따라 앞서 정의된 바와 같은 장치로 구성된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면,
(a) 대상체로부터 핵산을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 적어도 1종의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 1종의 인식 나노구조를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 여기서 인식 나노구조가 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 갖는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 압타머를 포함하며, 여기서 가변 서열 영역이 샘플에서 표적 핵산에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함하는 것인 단계; 또는
(c) 적어도 1종의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 1종의 인식 나노구조를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 여기서 인식 나노구조가 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 압타머 및 인버터 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 압타머가 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 가지며, 여기서 가변 서열 영역이 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함하고, 상기 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부와 듀플렉스를 형성하며, 여기서 인버터 올리고뉴클레오티드가 압타머-인버터 듀플렉스보다 적어도 1개의 뉴클레오티드가 더 길어서, 인버터 오버행을 생성하고, 샘플에서 표적 핵산에 상보적인 10개 초과의 뉴클레오티드를 갖는 것인 단계;
(d) 핵산을 포함하는 샘플을 (b) 또는 (c)의 조성물과 접촉시키는 단계로서, 여기서 표적 핵산이 다음에 결합하는 것인 단계:
(i) (b)에서의 압타머의 가변 서열 영역이 안정한 압타머-DNA 폴리머라제 효소 복합체의 형성을 촉진하여, DNA 폴리머라제 효소 활성을 억제하는 것; 또는
(ii) (c)에서의 인버터 올리고뉴클레오티드가 인식 나노구조를 불안정하게 하여, DNA 압타머에 의한 억제로부터 DNA 폴리머라제 효소를 방출하는 것;
(e) 단계 (d)로부터 활성 DNA 폴리머라제 효소에 반응성인 신호전달 나노구조를 제공하는 단계로서, 여기서 신호전달 나노구조가 DNA 폴리머라제 효소에 반응을 보이는 자기-프라이밍 부분을 포함하는 것인 단계;
(f) 신호전달 나노구조를 표지된 올리고뉴클레오티드 (dNTP) 및 신호 발달 시약의 존재 하에 단계 (d)로부터의 활성 DNA 폴리머라제 효소와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 활성화된 DNA 폴리머라제 효소가 표지된 올리고뉴클레오티드를 신호전달 나노구조에 추가하고 신호 발달 시약이 자기-프라이밍된 부분에 혼입된 표지된 올리고뉴클레오티드에 결합하는 것인 단계;
(g) 신호 발달을 검출하는 단계로서, 여기서 신호의 강도가 다음을 나타내는 것인 단계;
(i) 조성물 (b)를 사용할 때 샘플 중 표적 핵산의 부재; 또는
(ii) 조성물 (c)를 사용할 때 샘플 중 표적 핵산의 존재
(h) 샘플 중 표적 핵산의 존재가 검출되는 경우 대상체가 질환을 갖는 것으로 진단하는 것
을 포함하는, 대상체에서 질환을 진단하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 질환은 병원성 질환이다. 일부 실시양태에서 질환은 HPV-관련이다.
일부 실시양태에서, HPV는 표 2, 표 4 및 표 5에 열거된 1종 이상의 압타머 및/또는 인버터 올리고뉴클레오티드를 사용하여 검출된다.
본 발명의 임의의 측면에 따르면, 압타머 및/또는 인버터 및/또는 신호전달 나노구조 올리고뉴클레오티드 중 적어도 1종은 그의 천연 핵산으로부터 구조적으로 및/또는 화학적으로 변형된다.
일부 실시양태에서, 상기 구조 및/또는 화학적 변형은 합성 동안 포스포로티오에이트 (PS) 결합의 부가, 2'-O-메틸 변형, 포스포라미다이트 C3 스페이서 및 5' 부가 예컨대 아미노, 티올, 아크릴다이트 또는 아지드 기를 포함하는 군으로부터 선택된다.
도 1은 병원체 핵산의 시각적 및 모듈식 검출을 나타낸다. (a) enVision 시스템은 표적 인식, 표적-독립적 신호전달, 및 시각적 검출을 가능하게 하는 일련의 효소-DNA 나노구조로 이루어진다. 나노구조는 신호절달로부터 인식을 분리하도록 설계되어 있다. 인식 나노구조는 불활성화 압타머와 Taq DNA 폴리머라제로 구성된, 하이브리드 복합체이다. 상보적인 표적 DNA의 존재 하에, 복합체는 해리되어 폴리머라제 활성을 활성화시킨다. 활성 폴리머라제는 표적-독립적 방식으로, 범용 자기-프라이밍 신호전달 나노구조를 연장하도록 진행한다. 변형된 데옥시뉴클레오티드 (dNTP)를 혼입하여 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP)를 신호전달 나노구조에 고정한다. 광학 기질의 추가 직후, 시각적 신호를 효소적으로 증진시키고, 육안으로 검출하고 스마트폰 카메라로 정량화할 수 있다. 사진 (인셋(inset))은 스마트폰 애플리케이션에서 표적 DNA의 부재 (-) 및 다양한 (+) 양의 존재 하에 대상 DNA가있을 때 실제 시각적 판독의 예를 나타낸다. (b) enVision 미세유체 시스템의 개략도. 플랫폼은 모듈식 enVision 워크플로우(workflow)를 보완하도록 설계되어 있다. 입구에 특정 인식 나노구조가 미리 로딩된, 독립 검정 카세트(Independent assay cassettes)는 필요에 따라 공통 신호전달 카트리지(common signaling cartridge)에 장착할 수 있다. 공통 카트리지는 표적-독립적 신호전달 및 시각적 검출을 위해 내장된 멤브레인(embedded membrane)에 고정된, 범용 신호전달 나노구조를 수용한다. 카세트 슬라이딩 방향은 화살표에 의해 표시된다. (c) 다목적 검정 통합(versatile assay integration) 및 병렬 처리(parallel processing)를 위해 개발된, 미세유체 enVision 프로토타입(prototype)의 사진.
도 2는 enVision을 사용한 핵산 정량화를 나타낸다. (a) 인식 나노구조 조립(assembly) 및 활성. 인식 나노구조를 조립하고 상보적 또는 스크램블된(scrambled) 표적 DNA 서열과 함께 인큐베이션하여, 결과적인 폴리머라제 회합 및 활성을 결정하였다. (상단) 분자 결합의 실시간 센서그램(sensorgram). 일련의 조작, 즉 압타머 고정, 폴리머라제 첨가, 및 표적 DNA 서열과의 인큐베이션을 수행하였다. 분자 결합은 폴리머라제 회합을 결정하기 위해 생체-층 간섭법(bio-layer interferometry)을 통해 현장에서 모니터링하였다. (하단) 타크만 검정 (타크만 프로브의 5' 엑소뉴클레아제 분해의 형광 측정)을 사용하여 병렬 실험을 통해 각각의 조작의 말미에 상응하는 폴리머라제 활성을 결정하였다. 상보적 표적 DNA와 함께 인큐베이션 직후 폴리머라제 활성의 완전한 회수에 주목한다. (b) 신호전달 나노구조 활성. 비교 실험에서, 자기-프라이밍 신호전달 나노구조 및 그의 유사한-크기의 선형 템플릿(template)을 동일한 농도의 활성 DNA 폴리머라제로 처리하였다. 폴리머라제 활성은 시작 프라이밍된 부위(starting primed site)로부터 떨어진 상이한 뉴클레오티드 위치에서, 상이하게 배치된 타크만 프로브의 5' 엑소뉴클레아제 분해를 통해 결정하였다 (위치는 흑색 중심을 가진 회색 점으로 표시됨). (c) enVision 시스템의 검출 민감도. 검출 한계 (점선)는 알려진 양의 표적 DNA를 적정하고 그의 연관 시각적 신호를 측정함으로써 결정하였다. 모든 시각적 신호를 스마트폰을 통해 획득하였다. (d) 다양한 양의 표적 DNA에 대한 enVision 및 형광 측정 간의 상관관계. 시각적 신호는 형광 신호 (R 2 = 0.9828)와 잘 매치되었으며 더 넓은 동적 범위를 나타냈다. 모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 데이터는 평균 ± s.d.로 표시하였다. a.u.= 임의 단위(arbitrary unit).
도 3은 enVision의 프로그래밍 가능성을 나타낸다. (a) 프로그래밍 가능한 인식 나노구조의 개략도. 하이브리드 구조는 DNA 폴리머라제 (pol)를 불활성화하기 위해 결합하는 보존된 서열 영역, 및 표적 DNA에 상보적으로 만들 수 있는 가변 영역 (듀플렉스 및 오버행 세그먼트)으로 이루어진다. 일정한 축적 비율로 그려지지 않았다. (b) 가변 영역에서 표적 미스매치의 영향. 가변 영역에 대해 다양한 수의 미스매치를 갖도록 설계된 합성 DNA 표적을, 인식 나노구조와 함께 인큐베이션하였다. 모든 신호는 상보적 DNA 표적의 신호에 대해 정규화하였다 (0 미스매치). 듀플렉스 영역에 대한 미스매치는 유의하게 더 낮은 신호를 생성하였다 (*P < 0.05, ** P < 0.005, ***P < 0.0005, n.s. 유의하지 않음, 스튜던트 t 검정(Student's t test)). (c) Pan-HPV 인식. HPV 컨센서스 게놈(consensus genome)에 따라 2개의 pan-HPV 인식 나노구조를 개발하여, 6개의 HPV 아형으로부터 수득된 DNA 표적에 대해 서로 상이한 수의 미스매치를 보유하였다. 모든 미스매치를 듀플렉스 및 오버행 영역에 매핑하였다. 오버행 영역에서 더 많은 미스매치를 수용한 나노구조 1은, 더 양호한 pan-인식 능력을 나타냈다. 모든 신호를 상보적 DNA 표적의 신호에 대해 정규화하였다 (양성). (d) 특정 HPV 아형결정에 대한 enVision 및 qPCR 측정의 비교. 특정 나노구조를 민감한 듀플렉스 영역 내에 함유된 서열 변이를 가진 HPV 게놈의 매우 가변적인 영역에 따라 설계하였다. 상이한 HPV 아형으로부터의 DNA 표적을 enVision 스마트폰 플랫폼을 통한 색상 강도(color intensity) (왼쪽)를 통해 그리고 SYBR®-그린(Green) qPCR 시스템을 통한 사이클 카운트(cycle count) (오른쪽)를 통해 측정하였다. 모든 신호를 적절한 대조군 (즉, 템플릿-무함유 대조군으로서 물)에 비해 획득하였다. 각각의 검출 시스템으로부터의 신호를 검정 성능 비교를 위해 히트 맵(heat maps) 형태로 전반적으로 제시하였다. 모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 데이터는 (b) 및 (c)에서 평균 ± s.d.로 표시하였다.
도 4는 다중-유전자좌 커버리지를 위한 다중화된(multiplexed) enVision을 나타낸다. (a) HPV 게놈 맵의 신규 프로브 유전자좌. HPV 게놈은 7개의 초기 발현된 (E) 유전자와 2개의 캡시드 단백질 (L) 유전자로 구성된다. 신규 나노구조 인식 프로브는 각각 E1, L1 및 L2 유전자좌를 식별하기 위해 각각의 HPV 아형에 대해 설계되었다. (b) 높은-커버리지, 다중-유전자좌 검출을 위한 다중화된 enVision 검정. CaSki 세포 (왼쪽, HPV 16-양성) 및 HeLa 세포 (오른쪽, HPV 18-양성)로부터 수득된 게놈 DNA를 개별 인식 프로브 (각각 E1, L1 및 L2) 또는 3개의 프로브의 풀(pool) (조합됨)과 함께 직접 인큐베이션하여 세포 HPV 감염 상태를 결정하였다. 조합된 프로브는 개별화된 검정의 임의의 것과 비교하여 유의하게 더 높은 신호를 나타냈다 (*P < 0.0005, n.s. 유의하지 않음, 스튜던트 t 검정; n.d. 검출되지 않음). 모든 신호를 그의 각각의 조합된 신호에 대한 백분율로서 정규화하였다. (c) 세포주에서 HPV 아형결정. 세포주로부터의 게놈 DNA를 상이한 HPV 아형에 대한 다중화된 enVision 검정을 사용하여 직접 프로파일링하였다. 측정은 이전 문헌에 보고된 바와 같이, 세포주의 알려진 HPV 감염과 밀접한 상관관계가 있다 (짙은 회색: 존재, 밝은 회색: 부재). 모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 데이터는 평균 ± s.d.로 표시하였다
도 5는 환자 샘플의 분자 프로파일링을 나타낸다. (a) HPV 16 및 HPV 18 신호는 임상 자궁경관내 브러시 샘플 (n = 35)로부터 측정하였다. L1-특정 신호를 임상 황금 표준(clinical gold standard)과 비교하기 위해 나타냈다. 모든 임상 검체에 대한 다중-유전자좌 측정에 대해서는 도 19를 참조한다. (b) HPV 16 및 HPV 18 L1 유전자좌 검정의 수신자 조작자 특성(Receiver operator characteristic) (ROC) 곡선을 사용하여 검출 정확도를 결정하였다. HPV 16 검정은 92.9% 민감도 (13/14) 및 90.5% 특이성 (19/21)을 나타냈고 HPV 18 검정은 유덴 지수(Youden's index) 컷오프(cutoff)에서 83.3% 민감도 (5/6) 및 100% 특이성 (29/29)을 나타냈다. (c) 유전자좌-특정 HPV 16 enVision 검정 (L1, L2 및 E1 유전자좌 검정)을 모든 환자에서 수행하였다. L1-양성 (왼쪽) 및 L1-음성 (오른쪽) 환자로부터의 대표적인 예를 나타냈다. L1-음성 환자의 하위집합에서, L2 및 E1 유전자좌 검정의 포함은 검출 커버리지를 개선하여 이전에 검출할 수 없었던 감염을 식별할 수 있을 것이라는 점에 주목한다. 이는 독립적인 타크만® 형광 분석을 통해 추가로 검증되었으며, 이는 모든 시험된 임상 검체에서 enVision 결과와 높은 유사성(concordance)을 나타냈다 (도 20 참조). 모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 데이터는 평균 ± s.d.로 표시하였다. AUC, 곡선하 면적.
도 6은 enVision 미세유체 플랫폼의 개략도를 나타낸다. 플랫폼의 (a) 분해조립 개략도 및 (b) 단면 측면도. 플랫폼은 특유한 검정 카세트 및 공통 신호전달 카트리지를 포함한다. 각각의 검정 카세트는 특유한 인식 나노구조가 미리 로딩되어 있으며 혼합을 개선하기 위해 구불구불한(serpentine) 마이크로채널을 포함한다. 폴리카르보네이트 멤브레인은 신호전달 나노구조를 고정하기 위해 공통 카트리지에 내장된다. 샘플 입구로부터 공통 출구(common outlet)로의 유체 흐름은 철수 격막(withdrawal septum)에 의해 작동되며, 화살표에 의해 표시된다.
도 7은 본 발명에 따른 장치의 조작 개략도를 나타낸다.
도 8은 인식 나노구조의 활성을 나타낸다. (a) 다양한 양의 억제 압타머를 고정된 양의 폴리머라제 (5 유닛(unit))에 첨가하여 억제 효과를 최대화하면서 인식 나노구조를 복합화하는 최적의 비를 결정하였다. (b) 최적화된 나노구조 복합체에 대해, 본 발명자는 상이한 양의 상보적 DNA 표적뿐만 아니라 스크램블된 올리고뉴클레오티드 서열을 대조군으로서 인큐베이션하였다. 상보적 표적만이 폴리머라제 활성 (바아(bar))에서 강력하고 비례적으로 증가하였으며, 스크램블된 올리고뉴클레오티드 서열은 무시할 수 있는 활성 (기준선에서)을 생성하였다 (*P < 0.05, ***P < 0.0005, **** P < 0.00005, 스튜던트 t 검정))는 점에 주목한다. 모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 데이터는 평균 ± s.d.로 표시하였다
도 9는 신호전달 나노구조의 어닐링을 나타낸다. (a) 헤어핀 신호전달 나노구조 및 그의 상당한-크기의 선형 대응물 (과잉 프라이머 포함)을 실온에서 8% 고유 겔 전기영동을 통해 분해되었다. 각각의 샘플에서 프라이밍된 및 프라이밍되지 않은 분획의 밴드 강도를 분석하였다 (***** P < 0.000005, 스튜던트 t 검정). (b) 자기-프라이밍 신호전달 나노구조 및 그의 선형 대응물의 용융 곡선 분석. 이중-가닥 DNA의 해리 특성을 평가하기 위해 반응 온도가 증가함에 따라 SYBR® 녹색 형광 강도를 기록하였다. 점선은 각각의 핵산의 관찰된 융점 (Tm)을 나타낸다. 나노구조는 그의 선형 대응물 (과잉 프라이머 포함)과 비교하여 더 높은 Tm을 나타냈다. 모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 데이터는 (a)에서 평균 ± s.d.로 표시하였다.
도 10은 시각적 및 형광 판독을 나타낸다. (a) 효소 반응의 최적화. 본 발명자는 DNA 폴리머라제 (DNA pol, 상단) 및 HRP (하단)의 실시간 활성을, 대조군 (물)과 다양한 양의 DNA 표적의 존재 하에 측정하였다. 폴리머라제 활성을 타크만® 검정 (타크만® 프로브의 5' 엑소뉴클레아제 분해에 대한 형광 측정)을 통해 결정하였고, 한편 HRP 활성을 스마트폰 강도 측정을 통해 결정하였다. 폴리머라제 활성은 장치 조작의 단계 1 내지 단계 3에 상응하고 HRP 활성은 단계 4에 상응한다 (도 7 참조). 따라서 이들 효소 반응에 대한 최적화된 지속시간은 각각 ~ 20분 및 3분에서 결정하였다. (b) enVision 판독의 예시적 영상 (상단), 그레이스케일로의 영상 전환 후 예시적 영상 (중간) 및 그레이스케일 픽셀 강도의 분포 (하단). 각각의 스폿 영상의 평균 픽셀 강도는 신호 정량화 및 정규화에 사용되었다. (c) enVision 시스템의 시각적 검출 민감도. 검출 한계 (점선)는 알려진 양의 표적 DNA (비대칭 증폭 없음)를 직접 적정하고 enVision 플랫폼을 통해 실온에서 그의 연관 시각적 신호를 측정함으로써 결정하였다. 모든 시각적 신호는 스마트폰을 통해 획득하였다. (d) 형광 검출 민감도. 검출 한계 (점선)는 알려진 양의 표적 DNA를 인식 나노구조로 직접 적정함으로써 결정하였다. 폴리머라제 활성은 형광 타크만® 프로브의 그의 5' 엑소뉴클레아제 분해를 통해 측정하였다. 모든 형광 신호는 상용 qPCR 형광 검출기를 통해 획득하였다. 모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 데이터는 평균 ± s.d.로 표시하였다. a.u., 임의 단위.
도 11은 중첩된 비대칭 증폭을 나타낸다. (a) 중첩된 증폭의 개략도. 극소량의 샘플에 대해 단일-가닥 DNA의 집단을 크게 확장하기 위해, 중첩된 비대칭 PCR 증폭을 사용하였다. 샘플은 동일하게 농축된 이중 프라이머의 존재 하에 먼저 기하급수적으로 증폭시킨 후에, 과잉 단일 프라이머를 사용하여, 선형으로 증폭시켰다. (b) 중첩된 비대칭 증폭의 효율성. 합성 HPV16 서열의 (1) 1 pmole, (2) 100 fmole, (3) 10 fmole, (4) 1 fmole, (5) 100 amole, (6) 10 amole, (7) 1 amole 및 (8) 템플릿 무함유 대조군으로부터의 증폭 생성물을 8% PAGE 겔에서 분석하였다. 위쪽 화살표는 더 큰 이중-가닥 생성물을 나타내며, 한편 아래쪽 화살표는 단일-가닥 생성물에 상응한다.
도 12는 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA)을 나타낸다. (a) NASBA의 개략도. DNA 표적을 먼저 T7 RNA 폴리머라제를 통해 RNA 전사 및 단일-가닥 RNA 증폭을 위해 프라이밍하였다. 이어서 RNA 생성물은 단일-가닥 DNA 생성물을 생산하기 위해 RNA 소화에 적용되기 전에 cDNA로 역전사되었다. (b) NASBA의 효율성. 합성 HPV16 서열의 (1) 1 pmole, (2) 100 fmole, (3) 10 fmole, (4) 1 fmole, (5) 100 amole, (6) 10 amole, (7) 1 amole, 및 (8) 템플릿 무함유 대조군으로부터의 증폭 생성물을 8% PAGE 겔에서 분석하였다. 화살표는 DNA 생성물의 예상 크기를 나타낸다.
도 13은 SYBR® 그린 qPCR 반응의 용융 곡선 분석을 나타낸다. (a) HPV 6, (b) HPV 11, (c) HPV 16, (d) HPV 18, (e) HPV 31, (f) HPV 33, (g) HPV 58, 및 (h) HPV 66 서열의 프라이머 쌍에 대한 용융 곡선. 각각의 프라이머 세트를 표적 템플릿 (파선), 다른 HPV 아형의 오프-타겟(off-target) 템플릿 (실선), 또는 템플릿 무함유 대조군 (물, 파선-점선)에 대해 시험하였다. 모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 평균 형광 강도의 선 플롯으로 표시하였다.
도 14는 직접적인 RNA 검출을 나타낸다. 본 발명자는 상이한 HPV 아형의 DNA (왼쪽) 및 RNA (오른쪽)의 직접 검출을 위해 개발된 enVision 검정 (즉, HPV 16 및 HPV 18 검정)을 시험하였다. 모든 RNA 표적을 cDNA 전환 없이 직접 사용하였다. 표적은 상보적 또는 오프-타겟으로서 간주되었다. enVision 검정은 DNA 표적의 신호와 필적하는 신호로, RNA 표적의 특이적 및 직접 검출을 나타냈으며 한편 오프-타겟 신호는 둘 다에 대한 기준선에 가까웠다. 모든 신호를 상대적 비교를 위해 각각의 검정의 양성 DNA 신호에 대해 정규화하였다. 모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 데이터는 평균 ± s.d.로 표시하였다
도 15는 enVision 논리 게이트를 나타낸다. 각각의 나노구조에서 상이한 성분 (즉, 압타머, 인버터 및 폴리머라제)의 비뿐만 아니라 인식 나노구조의 조합을 변경함으로써, 본 발명자는 하기 논리 계산을 프로그래밍하였다: (a) AND 게이트, (b) OR 게이트, (c) HPV 16용 NOT 게이트, (d) HPV 18용 NOT 게이트, (e) NAND 게이트, 및 (f) NOR 게이트. 설계된 각각의 게이트에 대해, 구성을 설정하는 데 사용되는 성분이 설명되어 있다 (각각의 패널의 오른쪽 상단). 각각의 게이트를 HPV 16 (표적 1) 및 HPV 18 (표적 2)로부터 단리된, 상이한 조합의 DNA 표적으로 시험하였다. 모든 표적 조합 및 그의 예상 컴퓨터 출력을 상응하는 진리표 (각각의 패널의 왼쪽 하단)에 요약되어 있다. 관찰된 enVision 신호 (각각의 패널의 오른쪽 하단)는 예상 출력과 양호한 일치를 나타냈다. 모든 신호를 이전에 기재된 바와 같이 적절한 대조군 (표적-무함유 대조군)으로 정규화하였다. 검출 임계값을 초과하는 정규화된 신호 (즉, 배경 신호보다 3x s.d. 더 높음)는 실제 신호 (회색 막대)로 간주되었으며; 그렇지 않으면 거짓 신호로 칭해졌다 (흑색 막대). 모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 데이터는 평균 ± s.d.로 표시하였다.
도 16은 enVision OR 및 AND 논리 게이트를 사용하여 다수의 표적의 조합을 검출하는 방법을 나타낸다. 각각의 나노구조에서 상이한 성분 (즉, 압타머, 인버터 및 폴리머라제)의 비뿐만 아니라 인식 나노구조의 조합을 변경함으로써, 본 발명자는 다수의 표적을 동시에 검출하는 논리 게이트의 사용을 나타낸다. 모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 데이터는 평균 ± s.d.로 표시하였다.
도 17은 게놈 DNA의 다중화된 증폭을 나타낸다. CaSki 게놈 DNA로부터의 증폭 생성물의 전체 겔 전기영동도. 게놈 DNA는 상이한 HPV 16 유전자좌 프라이머: (1) E1, (2) L1, (3) L2, (4) E1, L1 및 L2의 조합된 프라이머, 뿐만 아니라 (5) 프라이머 없음의 존재 하에 증폭되었다. 레인(Lane) 7은 15 bp DNA 래더(ladder)로 로딩되었다. 화살표는 50 bp 밴드(band)의 위치를 나타낸다.
도 18은 게놈 DNA의 다중화된 enVision 검출을 나타낸다. 동일한 양의 세포 게놈 DNA (상단: CaSki, 중간: HeLa, 하단: C33-a)를 상이한 HPV 아형 (왼쪽: HPV 16, 오른쪽: HPV 18)에 대한 특정 인식 나노구조와 함께 직접 인큐베이션하였다. 샘플을 개별 인식 나노구조 (즉, E1, L1 및 L2) 또는 동시에 3개 구조의 풀 (조합됨)로 처리하였다. 모든 신호를 각각의 HPV 아형에 대해 관찰된 최대 신호의 백분율로서 정규화하였다. 다중화된 측정은 이전 문헌에 의해 보고된 바와 같이, 세포주의 알려진 HPV 감염과 밀접한 상관관계가 있다 (수평 회색 막대: 존재, 수평 흰백색 막대: 부재). 단일 유전자좌 측정은 양성 감염 (예를 들어, HeLa, HPV 18 유전자좌 L2)을 놓칠 수 있다는 점에 주목한다. 모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 데이터는 평균 ± s.d.로 표시하였다.
도 19는 enVision과 LAMP 설계 및 성능의 비교를 나타낸다. (a) 상이한 HPV 아형에서 E1, L1 및 L2 유전자좌의 매우 가변적인 영역에서 발견되는 프로브 옵션의 비교. enVision 시스템 (왼쪽)뿐만 아니라 LAMP (오른쪽)에 대한 프로브 옵션을 확인하였다. enVision 플랫폼은 더 많은 프로브 선택을 생성하였을 뿐만 아니라 시험된 모든 영역에 대한 포괄적인 커버리지를 제공하였다. (b) enVision 성능 (왼쪽)과 세포 게놈 DNA에서 HPV 아형결정에 대한 최상위 LAMP 프라이머 세트 (오른쪽)의 것과의 비교. EnVision은 83.3% 민감도 (5/6) 및 100% 특이도 (12/12)을 가졌으며, 한편 LAMP는 50.0% 민감도 (3/6) 및 75.0% 특이성 (9/12)을 가졌다. 다중-유전자좌 측정은 알려진 감염의 상이한 세포주에 걸쳐 이루어졌다. 모든 신호를 이전에 기재된 바와 같이 적절한 대조군 (표적-무함유 대조군)으로 정규화하였다. enVision 기술만이 알려진 세포 감염 상태와 비교하여, 정확한 HPV 아형결정을 나타냈다 (수평 회색 막대: 존재, 수평 백색 막대: 부재)라는 점에 주목한다. LAMP는 유의한 위양성(false positives)을 나타냈다 (예를 들어, CaSki 세포, HPV 18; HeLa 세포, HPV 16). 모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 데이터는 평균 ± s.d.로 표시하였다.
도 20은 임상 샘플에서 다중화된 enVision 검출을 나타낸다. HPV 16 (상단 패널) 및 HPV 18 (하단 패널)의 분자 아형결정을 위해 임상 자궁경관내 브러시 샘플 (n = 35명의 환자)에서 높은-커버리지의 다중-유전자좌 enVision 검정 (E1, L1 및 L2의 동시 검출)을 수행하였다. 모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 데이터는 평균 ± s.d.로 표시하였다.
도 21은 타크만® 형광 검정을 사용한 임상 검증을 나타낸다. 타크만® 검정은 각각 HPV 16 E1, L1 및 L2 유전자좌를 검출하도록 설계되었다. 모든 임상 검증 검정은 qPCR 분석으로 수행되었다. 각각의 GAPDH 발현으로 정규화함으로써 각각의 샘플에 대해 상대 정량을 수행하였다. 데이터는 이전에 검출할 수 없었던 감염을 식별하기 위해 enVision 플랫폼으로 검출된 신호와 밀접한 상관관계가 있다 (도 5c 참조)는 점에 주목한다. 모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 데이터는 평균 ± s.d.로 표시하였다.
도 22는 듀플렉스 세그먼트에서 다양한 수의 뉴클레오티드를 가진 압타머에 의한 DNA 폴리머라제 억제의 효율을 나타낸다. 효율은 듀플렉스 세그먼트에서 약 20개 뉴클레오티드에서 정체 상태를 유지하기 시작한다. 모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 데이터는 평균 ± s.d.로 표시하였다.
본 발명의 이점은 여러 가지이다. 첫째, 감지 메커니즘- 상기 기술은 표적 하이브리드형성 직후 즉시 활성화되어 상당한 신호 증진을 전달한다. 이중-효소 신호전달 캐스케이드 (예를 들어, DNA 폴리머라제 및 호스래디시 퍼옥시다제)를 혼입함으로써, 상기 기술은 다양한 표적의 시각적 검출을 위한 효소 둘 다의 활성으로부터 이익을 얻는다. 표적 핵산 증폭의 부재 하에도, enVision 플랫폼은 육안으로 볼 수 있고 스마트폰에 의해 정량화할 수 있는 빠르고 민감한 색상 판독을 생성한다. 이러한 감지 메커니즘으로 인해, 상기 기술은 광범위한 장비를 필요로 하지 않으면서, 상이한 유형의 핵산을 정확하고 직접 탐출하도록 적용될 수 있을 것이다 (예를 들어, DNA 및 RNA, cDNA 전환 필요 없음). 둘째, 검정 프로그램 가능성 - 신호전달로부터 인식을 분리함으로써, 상기 기술은 모듈식 검출 및 다양한 통합을 가능하게 한다. 신규 검정은 고도로 프로그래밍 가능한 인식 요소에서만 단일 서열 영역을 변형함으로써 쉽게 설계될 수 있으며 논리 계산을 수행하도록 구성될 수 있을 것이다. 범용 신호전달 요소는 모든 시각적 측정에 사용될 수 있다. 구성 가능한 미세유체 플랫폼에서 구현된 경우, enVision 기술은 따라서 높은 검출 민감도 및 프로그래밍 가능성을 나타내어, 실온에서 감염된 세포로부터의 다양한 병원체 핵산을 시각적으로 프로파일링할 수 있게 하였다. 단일 반응의 다중-유전자좌 다중화를 통해, 본 발명자는 다양한 바이러스-숙주 게놈 통합 유전자좌를 조사하기 위해 높은-커버리지의 enVision 시스템을 추가로 개발하였다. HPV를 임상 모델로서 사용하여, 본 발명자는 아형간 분화뿐만 아니라 아형내 검출 커버리지를 개선함으로써, 환자 자궁경내 샘플에서 감염의 분자-유형결정(molecular-typing)을 위한 기술의 임상적 유용성을 입증하였다.
본 명세서에서 언급된 서지학적 참고문헌은 편의를 위해 참고문헌 목록의 형태로 열거하고 실시예의 말미에 첨가하였다. 이러한 서지학적 참고분헌의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 과학기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어는 편의를 위해 여기에 수집된다.
본원에 그리고 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나"("a", "an") 및 "그"("the")는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 언급대상을 포함한다는 점에 주목하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "표적 서열"에 대한 언급은 복수개의 이러한 표적 서열을 포함하고, "효소"에 대한 언급은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 1종 이상의 효소 및 그의 등가물 등에 대한 언급이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "압타머"는 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 압타머는 높은 친화도와 특이성으로 다양한 분자를 결합할 수 있다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, DNA 압타머는, 표적 DNA의 부재 하에, 폴리머라제와 강하게 결합하여 폴리머라제 활성을 억제한다.
본원에 사용된 바와 같은 어구 "핵산" 또는 "핵산 서열"은, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 단편을 지칭하며, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 지칭하며, 펩티드 핵산 (PNA), 또는 임의의 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 적어도 약 6개의 뉴클레오티드 내지 60개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 15 내지 30개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 약 20 내지 25개의 뉴클레오티드의 핵산 서열을 지칭하며, 이는 PCR 증폭에서 또는 하이브리드형성 검정 또는 마이크로어레이에서 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 용어 "앰플리머(amplimer)", "프라이머", "올리고머", 및 "프로브"와 실질적으로 동일하며, 이들 용어는 관련 기술분야에 통상적으로 정의된 바 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인버터 서열" 또는 "인버터 올리고뉴클레오티드"는 표적 핵산 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 지칭하며, 그 중 일부는 듀플렉스 형성에 관여하고 일부는 오버행에 관여한다. 본원에 듀플렉스 및 오버행 서열에 대해 각각 20개 뉴클레오티드의 더 긴 서열이 DNA 폴리머라제 효소에 결합하는 압타머를 안정화시킴으로써 그의 억제 효과를 강건하게 생성하는 것으로 나타났다. 이 억제 효과는 주위 온도에서 상보적 표적의 존재 하에 제거될 수 있다. 인버터 서열의 존재/부재는 인식 요소의 기능 상태 (예를 들어, 온(on) 또는 오프(off) 상태)를 결정한다. 그의 존재 하에, 폴리머라제 활성은 표적과 함께 켜지고; 그의 부재 하에, 폴리머라제 활성은 표적과 함께 꺼질 수 있다. 도 3a는 폴리머라제, 압타머 및 인버터 배열의 개략도를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "가변 서열 영역"은 표적 서열에 대한 서열 특이성을 결정하는 영역을 지칭한다 (즉, 인식될 수 있는 표적 서열을 정의한다). 인버터 서열 및 일부의 압타머 서열은 이 가변 서열 영역에 함유된다. 이 영역을 변화시켜 신규 표적의 검출을 가능하게 할 수 있다. 인버터가 사용되지 않는 경우 "가변 서열 영역"은 표적 핵산에 상보적인 압타머 상의 오버행 세그먼트를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "샘플"은 그의 가장 넓은 의미로 사용된다. 예를 들어, HPV 6, 16, 18, 31, 33, 및 5를 포함하나 배타적이지는 않은 HPV 게놈 서열을 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플은, 체액; 세포, 염색체, 세포기관, 또는 세포로부터 단리된 멤브레인의 추출물; 세포; 게놈 DNA, RNA, 또는 cDNA (용액내 또는 고체 지지체에 결합됨); 조직; 조직 프린트(tissue print) 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 올리고뉴클레오티드가, 예를 들어, 본 발명의 방법을 수행하는 동안, 잠재적으로 뉴클레아제를 함유하는 샘플에서 활성을 연장하기 위해, 또는 키트의 저장-수명을 개선하기 위해 구조적으로 및/또는 화학적으로 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 사용되는 압타머 및/또는 인버터 및/또는 신호전달 나노구조 또는 임의의 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브는 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 구조적 및/또는 화학적 변형은 합성 동안, 형광 태그(fluorescent tag), 방사성 태그와 같은 태그의 추가, 비오틴, 5' 테일(tail), 포스포로티오에이트 (PS) 결합의 추가, 2'-O-메틸 변형 및/또는 포스포라미다이트 C3 스페이서를 포함한다.
예를 들어, 신호전달 올리고뉴클레오티드는 5' 아미노 기와의 부착 화학을 위해 변형되었다. 티올, 아크릴다이트, 아지드 등과 같은 다른 부착 변형은 5' 말단에서 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함한"은 언급된 바와 같이 서술된 특색, 정수, 단계 또는 성분의 존재를 특정하는 것으로 해석되어야 하나, 하나 이상의 특색, 정수, 단계 또는 성분, 또는 그의 군의 존재 또는 추가를 배제하지 않다. 그러나, 본 개시내용의 맥락에서, 용어 "포함하는" 또는 "포함한"은 또한 "로 이루어지는"을 포함한다. "포함하다" 및 "포함한다"와 같은 단어 "포함하는", 및 "포함하다" 및 "포함한다"와 같은 "포함한"의 변형은, 상응하는 다양한 의미를 갖는다.
실시예
관련 기술분야에 공지되어 있고 구체적으로 설명되지 않은 표준 분자 생물학 기술은 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, New York (2012)]에 기재된 바와 같이 일반적으로 따랐다.
실시예 1
방법
인식 나노구조 특성화
모든 서열은 표 1 내지 표 7에서 찾을 수 있으며 인테그레이티드 DNA 테크놀로지즈(Integrated DNA Technologies) (IDT)로부터 구입하였다. 인식 나노구조를 제조하기 위해, 본 발명자는 50 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 및 50 mM 완충제 (pH 8.5)의 완충제에 DNA 압타머와 인버터 올리고뉴클레오티드의 동일한 몰비를 혼합하였다. 혼합물을 95℃에서 5분 동안 인큐베이션하고 반응이 25℃에 도달할 때까지 0.1℃/ss로 서서히 냉각 후, Taq DNA 폴리머라제 (GoTaq®, 프로메가(Promega))를 첨가하여 하이브리드 복합체를 형성하였다. DNA 표적의 존재 하에 인식 나노구조의 조립 및 활성을 특성화하기 위해, 다양한 농도의 표적 올리고뉴클레오티드를 이 혼합물에 첨가하였다. 복합체의 실시간 연관성 및 해리 역학은 생체-층 간섭법 (폴 포르테비오(Pall Fortebio))에 의해 측정하였다. 간단히 말하자면, 미리 조립된 비오틴-압타머는 스트렙타비딘-기능화된 간섭계 센서(interferometry sensor)에 고정하였다. 간단한 세척 단계 후, Taq 폴리머라제를 첨가하고; 이에 뒤이어 표적 올리고뉴클레오티드와 인큐베이션하였다. 모든 결합 데이터 (생체층의 광학 두께 변화)를 파장 이동으로서 연속적으로 측정하였다. 본 발명자는 타크만® 프로브 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))의 5' 엑소뉴클레아제 분해를 통해 폴리머라제 활성을 추가로 측정하였다. 타크만® 프로브의 존재 하에, 2분마다 형광 판독물을 취하고, 기재된 바와 같이 정규화하여 (하기 데이터 정규화 참조) 결과적인 폴리머라제 활성을 비교하였다.
신호전달 나노구조 특성화
유사한 크기의 선형 템플릿의 것과 비교하여, 신호전달 나노구조의 안정성을 두 가지 상이한 방식으로 결정하였다. 먼저, 본 발명자는 실온에서 반응 둘 다 (즉, 나노구조 및 선형 템플릿)을 어닐링하고, 겔 전기영동을 통해 각각의 반응에서 프라이밍된 분획 대 프라이밍되지 않은 분획을 분석하였다. 둘째, 올리고뉴클레오티드를 10,000X 희석된 SYBR® 그린 I 염료 (인비트로겐(Invitrogen))와 혼합하고, 반응을 90℃로 가열하고, 1.6℃/s로 45℃로 빠르게 냉각하고, 삽입된(intercalated) 형광 강도 (어플라이드 바이오시스템즈)를 시각화하면서 0.075℃/s로 서서히 90℃로 가열함으로써 용융 곡선 분석을 수행하였다. 본 발명자는 타크만® analysis. 타크만® 분석을 통해 폴리머라제 활성을 개선하는 신호전달 나노구조의 능력을 추가로 결정하였다. 폴리머라제 활성은 시작 프라이밍된 부위로부터 떨어진 상이한 뉴클레오티드 위치에서, 상이하게 배치된 타크만® 프로브 (어플라이드 바이오시스템즈)의 5' 엑소뉴클레아제 분해를 통해 결정하였다.
enVision 장치 제작
4개의 검정 카세트 및 공통 카트리지를 포함하는 프로토타입 enVision 장치를 각각 폴리디메틸실록산 (PDMS, 다우 코닝(Dow Corning)) 및 폴리(메틸 메타크릴 레이트) (PMMA)로부터 제작하였다. 각각의 검정 카세트를 PDMS 조각의 2개의 층을 함께 플라즈마 결합하여 (50 mTorr, 50 W, 1분) 제작하였다. 200 μm 두께의 캐스트 몰드(cast mold)는 SU-8 포토레지스트(photoresist)와 실리콘 웨이퍼를 사용하는 기존의 포토리소그래피(photolithography)를 통해 제조하였다. 반응 챔버 및 마이크로채널을 경화되지 않은 PDMS (10:1 엘라스토머 베이스(base) 대 경화제 비)를 캐스트 몰드에 부어 복제하였다. 중합체 경화 (30분 동안 75℃) 후, 2개의 PDMS 조각을 함께 조립하였다. 공통 카트리지는 CO2 레이저 절제 (유니버설 레이저 시스템즈(Universal Laser Systems))에 의해 제작하였다. 0.2 μm의 기공 크기를 가진 4개의 폴리카르보네이트 멤브레인 (아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids))을 열적으로 함께 결합된 (30분 동안 125℃) 두 PMMA 층 사이에 내장시켰다. 나노포트(NanoPort)™ 조립 (업처치 사이언티픽.(Upchurch Scientific.))를 유체 연결을 허용하기 위해 공통 카트리지의 출구에 부착시켰다.
신호전달 나노구조 고정
아민-변형된 올리고뉴클레오티드 (IDT)를 기능화를 위해 사용하였다. 올리고뉴클레오티드를 미세유체 장치에 고정하기 위해, 폴리스티렌 비드를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 정착(anchoring)시키기 위한 표면적을 증가시켰다. 3 μm 카르복실산-변형된 폴리스티렌 비드 (스페로테크(Spherotech))를 MES 완충제 (써모 피셔 사이언티픽(써모 피셔 Scientific))에 재현탁되기 전에 PBS 완충제에서 세척하였다. 비드를 EDC/술포-NHS (피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology))로 15분 동안 실온에서 활성화하였고, PBS 완충제에서 과잉 5' 아민-변형된 올리고뉴클레오티드와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 비드를 원심분리를 통해 세척하고 10 mM Tris-EDTA 완충제에 재현탁시켰다.
장치 제조
조작을 위해 장치를 제조하기 위해, 비드-고정 신호전달 나노구조뿐만 아니라 변형된 dNTP 반응 혼합물을 공통 카트리지에 동결건조하였다. 모든 장치를 동결건조 전에 에탄올 및 PBS 완충제로 플러싱하였다. 간단히 말하자면, dATP, dGTP, dTTP, 및 25% dCTP: 75% 비오틴-16-아미노알릴-2'-dCTP (트리링크 바이오테크놀로지즈(Trilink biotechnologies))를 혼합함으로써 4 mM 스톡 dNTP 반응 혼합물을 제조하였다. 50 μg의 DNA-기능화된 폴리스티렌 비드 (3 μm, 상기와 같이 제조)를 20 μl의 dNTP 혼합물 중에서 장치 폴리카르보네이트 멤브레인에 도입하고, 진공 하에 30분 동안 건조시켰다 (랩콘코 프리존(Labconco FreeZone)).
enVision 플랫폼의 조작
조작 단계는 도 7에 설명되어 있다. 핵산 샘플을, pH 8.5에서 50 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 및 50 mM Tris-HCl을 포함하는 완충제에, 각각 조립된 인식 나노구조로 미리 로딩된 개별 검정 카세트의 입구에 첨가하였다. 이어서, 검정 카세트를 상기에 기재된 바와 같이 제조된, 공통 신호전달 카트리지에 장착하였다. 검정 최적화를 위해, 시린지(syringe) 펌프 (하버드 인스트루먼츠(Harvard Instruments))를 사용하여 공통 카트리지 출구에서 음압을 가하여 모든 4개의 검정 카세트에서 병렬 유체 이동을 작동하였다. 각각의 반응 혼합물은 효과적인 혼합 및 폴리머라제 활성화 (10 μl/min, 1분)를 위해 구불구불한 채널을 통과한 후, 반응 챔버에 진입할 것이다. 이어서 용액을 DNA-기능화된 폴리스티렌 비드 및 dNTP 반응 혼합물의 존재 하에 20분 동안 인큐베이션하였다. 비드를 과잉 PBS 완충제 (10 μl/min, 3분)에서 플러싱한 후, 스트렙타비딘-HRP (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 3분) 및 3,3'-디아미노벤지딘 기질 (DAB, 써모 피셔 사이언티픽, 3분)과 함께 인큐베이션하였다.
enVision 워크플로우의 중요한 단계는 주로 인큐베이션 및 세척이었으며, 여기서 정확한 유량이 불필요해짐에 따라, 따라서 본 발명자는 철수 격막 (써모 피셔(Thermo Fisher))을 사용하여 음압을 통해 유체 이동을 작동시킬 수 있을 것이다. 모든 반응은 실온에서 완료되었고, 적절한 음성 대조군이 포함되었다. 샘플 및 대조군의 시각적 판독을 모바일 스마트폰 (삼성(Samsung))을 사용하여 직접 영상화하였다. 컬러 영상을 그레이스케일로 전환하고, 포획된(trapped) 신호전달 DNA 비드를 가진 각각의 멤브레인 영역의 평균(average) (평균(mean)) 흑색 픽셀 강도를 신호의 수치 정량화에 사용하였다.
데이터 정규화
Figure pct00001
여기서
Figure pct00002
(표적, t i ) = 주어진 시점 (t i )에서 표적에 대한 정규화된 신호 강도;
I (표적 또는 대조군, t i ) = 주어진 시점 (t i )에서 표적 또는 대조군에 대한 원시 신호 강도(raw signal intensity) ;
I (표적 또는 대조군, t o ) = 시간 0 (t o )에서 표적 또는 대조군에 대한 원시 신호 강도
본 발명자는 샘플의 신호 강도 차이 (시각적 색상 또는 형광)를 주어진 시점 (t i ) 및 그의 초기 강도 (t o )에서 취한 강도의 차이로서 계산하였다. 이어서 이 값을 동시에 시행된 대조군 샘플 (표적-무함유 대조군)의 값으로 정규화하였다.
Figure pct00003
(대조군 t i )를 데이터 표시를 위해 0으로 크기를 조정하였다.
서열 설계
HPV 게놈 서열은 하기 참조 번호를 통해 진뱅크(GenBank)로부터 수득하였다 (HPV 6: AF092932.1, HPV 11: FR872717.1, HPV 16: K02718.1, HPV 18: AY262282.1, HPV 31: J04353.1, HPV 33: M12732.1, HPV 58: D90400.1, HPV 66: U31794.1). 클러스탈 오메가(Clustal Omega) 소프트웨어를 사용하여 다중 서열 정렬을 수행하였다 [Sievers, F. et al. Mol Syst Biol 7: 539 (2011)]. 생성된 서열 정렬로부터, 본 발명자는 각각 pan-인식 및 아형-특이적 인식 나노구조를 설계하기 위해 고도로 보존되고 발산하는 서열을 정의하였다. 간단히 말하자면, 본 발명자는 덜 보존된 영역 (20 bp, <6 개의 비-동일 염기쌍)에 의해 즉시 상류 또는 하류에 있는 플랭크된(flanked) 고도로 보존된 영역 (20 bp, <3 개의 비-동일 염기쌍)을 식별하였다. 본 발명자는 본 발명자의 pan-HPV 인식 나노구조의 인식 도메인을 형성하기 위해 가장 보존된 모티프를 선택하였다. 아형-특이적 인식 나노구조를 설계하기 위해, 본 발명자는 매우 발산하는 영역 (40 bp, <12 개의 동일한 염기쌍)의 위치를 찾았다. 유사한 접근법을 사용하여 HPV 게놈의 L1, L2 및 E1 유전자에서 발산 영역을 정의하고, 검출 커버리지를 개선하기 위해 각각의 HPV 아형에 대한 유전자좌-특이적 인식 나노구조를 설계하였다. 설계된 모든 서열을 표들에서 찾을 수 있다.
미스매치 특성화
인식 나노구조에서 듀플렉스 및 오버행 영역의 미스매치 민감도를 평가하기 위해, 본 발명자는 상보적 DNA 표적에서 2개의 뉴클레오티드 간격마다 염기쌍을 무작위로 돌연변이시키고 결과적인 신호 변화를 측정하기 위해 enVision 플랫폼을 사용하였다. 인식 나노구조의 pan-HPV 검출 능력을 결정하기 위해, 본 발명자는 6개의 HPV 아형 (HPV 6, 16, 18, 31, 33, 및 58)의 서열뿐만 아니라 완전히 상보적인 서열 (양성 대조군)을 표적 서열로서 사용하였다. 본 발명자는 미스매치된 뉴클레오티드를 듀플렉스 및 오버행 영역에 각각 매핑하고 생성된 신호 변화를 측정하였다.
비대칭 증폭
극소량의 샘플의 경우에, 본 발명자는 중첩된 비대칭 PCR 증폭을 통해 단일-가닥 DNA를 제조하였다. 증폭은 <1 이내에 완수될 수 있을 것이다. 기하급수적 증폭을 위해, 2.5 mM dNTP를 함유하는 1X GoTaq® 완충제에서 0.8 μM의 정방향 및 역방향 프라이머 (IDT), 및 5 유닛의 GoTaq® DNA 폴리머라제 (프로메가)를 사용하였다. 이에 뒤이어 2.5 mM dNTP를 함유하는 1X GoTaq® 완충제에서 GoTaq® DNA 폴리머라제 (프로메가)의 존재 하에, 과도한 역방향 프라이머만 사용하는, 선형 비대칭 PCR 증폭이 이어졌다. 하기 열순환 조건을 전체 공정에 사용하였다: 5분 동안 95℃, 35 사이클의 30초 동안 95℃ 및 60초 동안 52℃, 및 마지막 4℃ 유지 단계. PCR 용액을 모든 후속 측정에 직접 사용하였다.
등온 비대칭 증폭
등온 비대칭 증폭을 달성하기 위해, 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA)을 채택하였다. 전체 프로세스가 <1 이내에 완료될 수 있을 것이다. 본 발명자는 4 μM의 정방향 및 역방향 프라이머 (IDT) 각각, 80 유닛의 T7 RNA 폴리머라제, 1 유닛의 RNase H, 80 유닛의 GoScript™ 역전사효소, 및 1 유닛의 RNase 억제제 (프로메가)를 2.5 mM dNTPs, 5 mM NTPs, 6 mM MgCl2, 5 mM DTT, 및 15% DMSO를 함유하는 1X 전사 최적화된 완충제에서 사용하였다. 샘플 첨가 직후, 혼합물을 37℃에서 45분 동안 유지 한 후, 75℃로 가열하여 반응을 중단시켰다.
SYBR® qPCR 비교
이 비교를 수행하기 위해 HPV 아형-특정 서열을 사용하였다. 합성 올리고뉴클레오티드의 아형-특정 검출을 상기 기재된 바와 같이 enVision 플랫폼에서 수행하였다. qPCR 실험 (어플라이드 바이오시스템즈)의 경우, 본 발명자는 각각의 HPV 아형에 대해 동일한 표적 서열에 걸쳐 있는 특정 PCR 프라이머 쌍을 설계하였다. 간단히 말하자면, 100 fmol의 합성 템플릿을 2.5 mM dNTP 및 0.8 μM 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 1X GoTaq® 완충제에서 5 유닛의 GoTaq® DNA 폴리머라제 (프로메가)와, 하기 열적 순환 프로토콜을 사용하여 혼합하였다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40 사이클의 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 48℃. 모든 qPCR 분석에 이어서 0.075℃/s의 램프(ramp) 속도로 50℃에서 95℃로 증가시키는 용융 곡선 단계를 거쳐 임의의 비특이적 증폭을 결정하였다. qPCR 반응에서 어떤 프라이머 이량체도 형성되지 않았음을 보장하기 위해 모든 프라이머 검정에 대해 템플릿-무함유 대조군 (물)을 포함시켰다. qPCR 임계값 사이클 (Ct) 신호는 각각의 프라이머 쌍/템플릿 조합에 대해 결정하였다. 각각의 qPCR 프라이머 검정에 의해 생성된 신호는 검정 특이성을 결정하기 위해 검정에 대해 시험된 모든 표적에 걸쳐 정규화하였다.
직접 RNA 검출
본 발명자는 T7 RNA 폴리머라제 (뉴질랜드 바이오랩스(New England Biolabs))를 통해 RNA 표적을 제조하였다. 간단히 말하자면, T7 프로모터 프라이머 (표 3) (1 pmol)를 가진 어닐링된 DNA 템플릿을 2시간 동안 37℃에서 1X 완충제에서 T7 RNA 폴리머라제와 함께 인큐베이션한 후, 2 유닛의 RNase-비함유 DNase I (프로메가) 2 유닛을 첨가하고 41℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 생성된 RNA를 0.3 M 아세트산나트륨에 침전시켰다. 이 혼합물을 1 부피의 이소프로판올로 처리하고 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션한 후, 원심분리하였다 (4℃에서 30분 동안 12,000 g). 펠렛을 칠링된 에탄올 (75%)로 2회 세척하고, 이전과 같이 원심분리하고, 실온에서 공기-건조시켰다. 뉴클레아제-미함유 물에 용해되었을 때, 최종 RNA 농도는 흡광도 측정 (나노드롭(Nanodrop), 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))을 통해 결정하였다. 직접 RNA 검출을 위해, 본 발명자는 제조된 RNA 표적을, 1 유닛의 SUPERase RNase 억제제 (SUPERase.In™; 써모 피셔)의 존재 하에, enVision 시스템에 첨가하였다. 모든 검출 및 데이터 정규화를 상기에 기재된 바와 같이 수행하였다.
enVision 논리 게이트 구축
모든 논리 게이트 구성 및 성분을 각각 도 15 및 표 5에 요약하였다. 간단히 말하자면, 본 발명자는 미리 조립된 인식 나노구조를 사용하여 AND, OR, NOT, NAND 및 NOR 기능을 입증하였다. 상이한 게이트를 구축에 있어서, 본 발명자는 사용된 인식 나노구조의 조합뿐만 아니라 각각 하이브리드 나노구조의 성분 (즉, DNA 압타머: DNA 인버터: Taq 폴리머라제)의 비를 다양화하여 구별되는 계산 기능을 프로그래밍하였다. 구체적으로, AND 게이트를 제조하기 위해, 2개의 인식 나노구조를 사용하고 각각은 그의 성분을 비 (1: 1: 0.5); OR 게이트 - 2개의 구조 (1: 1: 1); NOT 게이트 - 1개의 구조 (1: 0: 1); NAND 게이트 - 2개의 구조 (1: 0: 1); 및 NOR 게이트 - 2개의 구조 (1: 0: 0.5)로 혼합하였다. 모든 인식 나노구조는 이전에 기재된 바와 같이 미리 조립하였다. 범용 신호전달 나노구조는 모든 논리 게이트에서 통상적으로 사용하였다. 본 발명자는 진리표에 기재된 바와 같이, 상이한 조합의 DNA 표적으로 게이트 구성을 시험하고, enVision 신호를 예상 출력과 비교하였다. 신호는 상기에 기재된 바와 같이 정규화하였다. 검출 임계값 (즉, 배경 신호의 >3X s.d.)을 초과하는 정규화된 신호를 실제 신호로 간주하였으며; 그렇지 않으면 그렇지 않으면 거짓 신호로 칭해졌다.
세포 배양 및 DNA 추출
모든 인간 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 수득하였다; CaSki (ATCC CRL-1550), SiHa (ATCC HTB-35), HeLa (ATCC CCL-2), PZ-HPV-7 (ATCC CRL2221). CaSki 세포를 RMPI-1640에서 성장시켰다. SiHa, HeLa, 및 C33-a는 10% FBS 및 페니실린-스트렙토마이신 (코닝)이 보충된 이글스 최소 필수 배지(Eagle's Minimal Essential Medium)에서 성장시켰다. PZ-HPV-7는 소 뇌하수체 추출물 및 인간 재조합 표피 성장 인자가 보충된 케라티노사이트 혈청 미함유 배지(Keratinocyte Serum Free Medium) (ATCC)에서 성장시켰다. 모든 세포주를 시험하고 미코플라스마(mycoplasma) 오염이 없었다 (미코얼라트(MycoAlert)® 미코플라스마 검출 키트(Mycoplasma Detection Kit), 론자(Lonza)). 게놈 DNA는 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 DNeasy Blood & Tissue Kit™ (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 80%-90% 전면생장(confluent) 세포 배양으로부터 추출하였다.
LAMP와의 비교
'서열 설계' 섹션에서 확인된, HPV 게놈의 동일한 발산 영역에서, 본 발명자는 자동화 온라인 LAMP 프라이머 설계 서버 (PrimerExplorer.jp)를 디폴트 설정과 함께 사용하여 [Tomita, N., et al., Nat Protoc 3: 877-882 (2008)] 가능한 LAMP 증폭 프라이머를 확인하였다. 본 발명자는 소프트웨어에 의해 복귀된 바와 같은, LAMP 프라이머 세트의 수를, 동일한 영역에서 설계될 수 있는 enVision 인식 나노구조의 수와 비교하였다. 후속 기능성 시험을 위해, 본 발명자는 최상위 LAMP 프라이머 세트의 성능을 enVision 시스템과 추가로 비교하였다. 각각의 LAMP 증폭을 위해, 본 발명자는 프라이머 세트에 0.2 μM의 각각의 프라이머를 사용하고 알려진 HPV 감염 세포주로부터 추출한 100 ng의 정제된 게놈 DNA을 사용하였다. 이 혼합물을 1X 등온 증폭 완충제 II, 6 mM MgSO4, 2.5 mM dNTP에서 8 유닛의 Bst 2.0 DNA 폴리머라제 (뉴질랜드 바이오랩스)와 함께 70℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 증폭 생성물은 PCR 클린업 스핀 컬럼(cleanup spin column) (뉴질랜드 바이오랩스)을 통해 정제하고 겔 전기영동을 통해 정량화하였다.
임상 샘플 처리
BD 슈어패쓰(SurePath)™ 액체-기반 Pap 시험 용액에 고정된, 자궁경관내 브러시 샘플을 35명의 개인으로부터 수집하였다. 본 발명자는 이들 임상 샘플로부터 DNA를 추출하기 위해 변형된 프로토콜과 함께 QIAamp® DNA FFPE 조직 키트 (퀴아젠)를 사용하였다. 간단히 말하자면, 샘플을 2.5 ml 멸균 PBS 완충제, 2.5 ml 완충제 ATL, 및 80 μl 프로테이나제 K와 혼합하여 상기 브러시를 덮고, 56℃에서 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 후, 액체를 수집하고 90℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 3.5 ml 완충제 AL 및 3.5 ml 100% 에탄올을 샘플에 첨가하였다. 이 혼합물을 추출 컬럼에 통과시키고, 500 μl의 완충제 AW1 및 완충제 AW2로 순차적으로 세척하였다. 최종적으로 원심분리를 통해 컬럼을 건조시키고 DNA 샘플을 50 μl의 완충제 ATE에 용리시켰다. 추출된 게놈 DNA를 'enVision 플랫폼의 조작'에 기재된 바와 같이 검정에서 직접 사용하거나 '비대칭 증폭'에 기재된 바와 같이 처리하였으며, 잔여 임상 샘플의 경우에만 해당된다. 모든 임상 샘플에 대해, GAPDH 하우스키핑 유전자 (어플라이드 바이오시스템즈)의 타크만® PCR 분석을 통해 추출된 DNA의 품질을 결정하였다. 모든 임상 측정을 익명화 및 맹검 방식으로 수행하였다.
겔 전기영동
DNA 샘플을 적절한 양의 6X 로딩 염료 (써모 피셔)로 희석하고 100 V에서 TAE 완충제 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))와 함께 8% 폴리아크릴아미드 겔에서 시행하였다. 겔은 TAE 완충제에서 10,000배 희석하여 SYBR® 그린 I로 5분 동안 염색한 후 겔 영상화기 (Bio-Rad)에서 시각화하였다. 생성된 밴드의 강도 및 면적 (부피)은 ImageLab의 내장 알고리즘(in-bult algorithm) (Bio-Rad)을 사용하여 계산하였다.
통계 분석
모든 측정을 삼중으로 수행하였으며, 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시하였다. 모든 유의성 시험을 양측 스튜던트 t 검정을 통해 수행하였다. 샘플-간 비교를 위해, 여러 쌍의 샘플을 각각 시험하고, 생성된 P 값을 본페로니 보정(Bonferroni correction)을 사용하여 여러 가설 시험에 대해 조정하였다. 조정된 P < 0.05를 갖는 값은 유의한 것으로서 결정하였다. 임상 연구를 위한 수신자 조작자 특성 (ROC) 곡선을 환자 프로파일링 데이터로부터 생성하고 민감도 대 (1-특이성)를 플롯팅하여 구축하였으며, 곡선하 면적 (AUC)의 값을 사다리꼴 규칙을 사용하여 계산하였다. 본 발명자는 임상 보고서 (즉, 코바스 HPV)를 분류기 (진 양성(true positives) 및 진 음성(true negatives))으로서 사용하였다. 각각의 마커에 대한 최적 임계값은 상응하는 ROC 곡선의 왼쪽-상단 부분 (완벽한 감도 또는 특이성)에 가장 가까운 지점으로부터 확립하였다. 검출 민감도, 특이성 및 정확도는 표준 공식을 사용하여 계산하였다. 통계 분석을 R-패키지 (버전 3.4.2)를 사용하여 수행하였다.
실시예 2
enVision 플랫폼
enVision 플랫폼은 일련의 효소-지원 DNA 나노구조로 이루어져 세 가지 기능 단계: DNA 표적 인식, 표적-독립적 신호 증진, 및 시각적 검출을 달성한다 (도 1a). 나노구조의 직교 서열 설계를 사용하면, 표적 인식이 신호 증진으로부터 분리된다. 인식 단계에서, 인식 요소는 특유한 하이브리드 나노구조이다. 이것은 Taq DNA 폴리머라제에 결합된 변형된 DNA 압타머로 이루어진다 [Dang, C. & Jayasena, S. D. J Mol Biol 264: 268-278 (1996); Park, K. S. et al. Sci Adv 2: e1600300 (2016)]. 표적 DNA의 부재 하에, 압타머는 폴리머라제와 강하게 결합하여 폴리머라제 활성을 억제한다. 상보적 표적 DNA의 존재 하에, 표적 하이브리드형성 직후, 하이브리드는 해리되어 폴리머라제 활성을 활성화시킨다. 신호전달 단계에서, 활성 폴리머라제는 표적-독립적인 방식으로, 범용, 자기-프라이밍 나노구조를 연장한다. 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP)를 신호전달 구조에 고정하기 위해 (dNTP)를 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드의 혼입을 통해, 시각적 신호를 효소적으로 생성하여 육안으로 검출할 수 있으며 스마트폰을 통해 쉽게 정량화할 수 있다. 삽입물 (도 1a, 오른쪽)은 스마트폰에 의해 영상화한 바와 같이 실제 검정 출력의 예를 나타낸다.
enVision 검정의 검출 프로그램 가능성 및 모듈성(modularity)을 보완하기 위해, 예를 들어, 4개의 검정 카세트를 유지할 수 있는 구성 가능한 미세유체 플랫폼을 구현하였다 (도 1b). 구체적으로, 두 성분을 통합하였다: (i) 독립 검정 카세트, 및 (ii) 공통 신호 카트리지. 각각의 검정 카세트는 특정 DNA 인식 나노구조로 미리 로딩하였으며, 필요에 따라 다목적 검정 통합을 가능하게 하기 위해 플러깅할 수 있을 것이다. 공통 홀더 카트리지는, 표적-독립적 신호전달 및 시각적 검출을 위해, 폴리카르보네이트 멤브레인에 고정된 범용 신호전달 요소를 수용하였다. 유체 흐름 및 샘플 혼합은 마이크로채널의 병렬 회로 (도 6)를 통해 수행하였으며, 검정 절차를 간소화하기 위해 카트리지의 공통 출구에서 음압에 의해 작동되었다 (도 7). 도 1c는 병원체 DNA 표적의 임상적 검출을 위해 개발된 프로토타입 장치를 나타낸다. 이 시스템 구획화는 검정 모듈성 (즉, 필요에 따라 통합)을 개선하고 임상 적용을 위해 구현을 단순화한다 (즉, 균일 한 표면 고정 및 단일 흐름 작동) [Shao, H. et al. Nat Commun 6: 6999 (2015)].
실시예 3
핵산의 시각적 정량화를 위한 최적화된 검정
기능 인식 및 신호 요소로서 각각 DNA 나노구조의 성능을 평가하였다. 인식 나노구조의 경우, 폴리머라제는 변형된 압타머와 회합하여 하이브리드 복합체를 형성하였다 (도 2a, 상단). 이 최적화된 복합체는 무시할 수 있는 폴리머라제 활성을 나타냈다 (도 8a). 상보적 표적 DNA의 존재 하에, 하이브리드 구조가 해리되고 폴리머라제 활성이 완전히 회복되었다 (도 2a, 하단). 본 발명자는 이러한 인식 및 활성화가 높은 염기 서열 특이성을 나타낸다는 것을 밝혀냈으며, 상보적 표적만이 강한 폴리머라제 활성을 결과하며, 한편 스크램블된 올리고뉴클레오티드 서열은 무시할만한 활성을 생성하였기 때문이다 (도 8b).
본 발명자는 또한 범용 인식 요소를 자기-프라이밍 나노구조로서 추가로 설계하였다. 유사한-크기의 선형 대응물과 비교하여, 구조는, 아마도 실온에서 그의 우수한 프라이밍 효율로 인해 (도 9), 증진된 폴리머라제 점유 및 활성을 나타냈다 (도 2b). 나노구조의 조립 및 특성화를 최적화하는 데 사용되는 모든 서열을 표 1에서 찾을 수 있다.
Figure pct00004
Figure pct00005
* 타크만® 프로브는 FAM/ZEN 마커 없이 서열 목록에 열거되어 있다.
시각적 검출을 가능하게 하기 위해, 활성화된 폴리머라제를 사용하여 신호전달 나노구조를 연장하고 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP)를 비오틴화된 뉴클레오티드 (비오틴-16-AA-dCTP)를 통해 혼입하였다. 광학 기질의 존재 하에, HRP 활성이 갈색 침전물로 빠르게 현상되었다. 적정 분석에서, 관찰된 색상 강도는 표적 DNA의 양의 증가와 상관관계가 있을 수 있을 것이다. 스마트폰 카메라로 영상화했을 때, 시각적 검정은 0.260 fmol의 표적 DNA (도 10c)의 검출 한계 (LOD)를 나타냈으며 상기 검정은 실온에서 30분 만큼 단시간에 완료될 수 있을 것이다. LOD는 효율적인 비대칭 증폭 (도 11)과의 통합을 통해 7.205 amol의 표적 DNA (도 2c)로 추가로 개선될 수 있다. 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA)을 통한 등온 비대칭 증폭 [ Pardee, K. et al. Cell 165: 1255-1266 (2016)]이 또한 혼입되어 실제 적용을 개선할 수 있을 것이다 (도 12). 증폭에 사용된 모든 프라이머 및 표적은 표 1에서 찾을 수 있다. 검출 민감도는 현장 진료(point-of-care) 스마트폰 판독으로 결정하였으며; 모든 과정 (비대칭 증폭 및 NASBA 포함)은 <2시간에 완수되었다. 시각적 신호를 표준 형광 신호와 연관시키기 위해, 본 발명자는 FAM-변형 뉴클레오티드로 유사한 실험을 수행하였다 (도 10d). enVision 시각적 검정은 형광 신호 포화 (R2 = 0.983)를 설명하는 로지스틱 기능과 밀접한 상관관계가 있었다 (도 2d). 고농도의 DNA 표적에서 포화된 형광 측정과 비교할 때, enVision 플랫폼은 이들 표적 농도에서 구별 가능하고 정량 가능한 시각적 신호를 생성하기 위해 더 넓은 동적 범위를 나타냈다. 본 발명자는 시각적 동적 범위의 이러한 확장을 enVision 기술에 이중 효소적 신호전달 (즉, DNA 폴리머라제 및 HRP 캐스케이드)의 혼입의 결과로 본다.
실시예 4
enVision의 프로그래밍 가능성
핵산의 시각적 검출을 위한 분석을 설계하기 위해. 본 발명자는 인식 나노구조의 프로그래밍 가능성을 조사하였다. 하이브리드 구조는 접혀서 DNA 폴리머라제에 결합하고 억제하는 보존된 서열 영역, 및 표적 DNA에 상보적으로 만들어질 수 있는 가변 영역 (즉, 듀플렉스 및 오버행 세그먼트)으로 이루어진다 (도 3a). 인식 나노구조의 가변 영역과 표적 DNA 사이의 미스매치를 유도함으로써, 본 발명자는 듀플렉스 영역이 오버행 영역과 비교하여, 서열 미스매치에 대해 더 높은 민감도를 나타냄을 확인하였다 (도 3b). 따라서 듀플렉스 영역은 강력한 서열 특이성을 부여할 수 있을 것이며, 한편 오버행 영역은 pan-검출에 유용한 특색인, 더 많은 서열 가변성을 수용할 수 있을 것이다.
이 설계 원리는 2개의 pan-HPV 인식 나노구조를 개발함으로써 검증하였다 (도 3c). 구조는 HPV 컨센서스 게놈에 대해 매칭시킴으로써 설계되었으며, 6개의 HPV 아형으로부터 DNA 표적에 대한 다양한 수의 미스매치를 함유하였다 (표 2). 모든 미스매치된 영역을 매핑함으로써, 본 발명자는 오버행 영역에서 더 많은 미스매치를 수용한 Pan-HPV 나노구조 1이 컨센서스 게놈의 더 양호한 pan-검출 능력을 나타냄을 밝혀냈다. 듀플렉스 영역에서 더 많은 미스매치를 함유한 Pan-HPV 나노구조 2는 일반적으로 감소된 신호를 나타냈으며, 이는 검정 특이성을 부여하는 데 듀플렉스 영역의 중요성을 나타낸다.
다음으로, 본 발명자는 HPV 아형결정을 위한 특정 나노구조를 설계하였다. 본 발명자는 HPV 아형 (즉, HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 58, 및 66)의 특정 분화를 위한 신규 인식 나노구조 군을 설계하기 위해 HPV 게놈의 매우 가변적인 영역을 식별하였으며 (도 3d, 왼쪽 ); 서열 가변성을 민감한 듀플렉스 영역 내에 함유되도록 설계하였다. 표적 증폭 및 검출을 위해 한 쌍의 프라이머를 필요로 하는, 기존의 qPCR 분석과 비교하여, enVision 인식 나노구조는 단일 프로브 서열 (즉, 가변 영역)에 의해 특이성이 결정되기 때문에, 쉽게 조정될 것이다. 본 발명자는 이 프로그래밍 가능성을 사용하여 신규 특정 HPV 아형결정 나노구조 (표 2)를 신속하게 설계하고 이를 enVision 기술과 통합하였다.
Figure pct00006
Figure pct00007
본 발명자가 동일한 HPV DNA 표적 (표 3)을 검출하기 위해 PCR 프라이머를 설계 한 비교 분석에서, enVision 플랫폼은 더 양호한 특이성을 나타냈으며 (도 3d, 왼쪽), 한편 SYBR® 그린-기반 qPCR은 더 많은 위양성을 산출하였는데 (도 3d, 오른쪽), qPCR 분석에서 비특이적 증폭으로 인한 것일 수 있다 (도 13). 중요하게는, 감지 메커니즘 (즉, enVision이 하이브리드형성-활성화 신호 증진을 통해 검출하고 qPCR이 핵산 표적 증폭을 통해 검출한다)의 차이로 인해, 본 발명자는 enVision 기술이, 효소 적합성(enzyme compatibility)을 보장하기 위해 RNA 표적의 qPCR 검출을 위한 전제 조건인, 어떤 역전사를 필요로 하지 않으면서도, 특정 HPV RNA 표적을 직접 구별할 수 있음을 추가로 입증하였다 (도 14). RNA 표적을 전사하는 데 사용되는 모든 서열은 표 3에서 찾을 수 있다.
Figure pct00008
Figure pct00009
실시예 5
증진된 검출 커버리지를 위한 다중화된 검정
검출 커버리지를 개선하기 위해, 이는 다중화된 enVision 검정을 단일 챔버에서 동시에 수행할 수 있는지 여부를 결정하였다. 임상 HPV 검정은 전형적으로 감염 결정을 위해 바이러스 게놈의 단일 영역 (L1 유전자좌)을 검출하지만, 숙주 세포로의 부분 바이러스 게놈 통합이 또한 가능하며 암 성장을 야기할 수 있다 [Williams, V. M., et al., Future Virol 6: 45-57 (2011); McBride, A. A. & Warburton, A. PLoS Pathog 13: e1006211 (2017)]. HPV 바이러스 게놈에서 보존되지 않은 영역을 사용하여, 다양한 enVision 인식 나노구조가 E1, L1 및 L2 유전자좌를 검출하여 검출 커버리지를 개선하도록 설계하였다 (도 4a; 표 4).
Figure pct00010
Figure pct00011
이들 모듈식 인식 나노구조는 단일 반응 챔버에서, 상이한 논리 게이트 (예를 들어, OR, AND, NOT, NAND 및 NOR)로 쉽게 구성되어, 프로그래밍 가능한 계산을 수행하고 DNA 표적의 상이한 조합으로부터 시각적 판독을 가능하게 할 수 있을 것이다 (도 15; 표 5). 모듈식 인식 나노구조는 또한 다양한 논리 게이트 구성에서 복수개의 표적을 검출하도록 쉽게 구성될 수 있다 (도 16; 표 2).
Figure pct00012
검출 커버리지를 증진시키기 위해, 각각의 HPV 아형 (예를 들어, HPV 16 및 HPV 18)에 대해, 본 발명자는 그의 세 가지 유형의 유전자좌-특이적 나노구조 (즉, E1, L1 및 L2 유전자좌)를 혼합하여 단일 반응에서 OR 논리 게이트 구성을 산출하였다. 본 발명자는 PCR 분석을 통해 독립적으로 검증된, 자궁경부암 세포주의 게놈 DNA를 사용하여 이 높은 커버리지, 다중 유전자좌 HPV 검출을 직접 시험하였다 (도 17). 본 발명자의 데이터는 다중화된 enVision 검정이, 각각 E1, L1 및 L2 인식 프로브를 사용한 개별화된 검출과 비교하여, 검출 신호를 추가로 증진시킬 수 있음을 나타냈다 (도 4b). 중요하게는, 진-양성이 상당한 신호 증진을 나타냈으나, 음성 샘플은 이 다중화된 접근법으로 최소한의 배경 신호 변화를 나타냈다 (도 18).
다중화된 enVision 검정을 사용하여, 본 발명자는 다음으로 인간 자궁경부암 세포주에서 HPV 프로파일링을 수행하였다 (도 4c). 모든 실험을 어떤 사전-증폭도 없이, 세포 게놈 DNA로부터 직접 실온에서 수행하였다. 다중화된 enVision 분석은 신호 증진을 개선했을뿐만 아니라, 단일 유전자좌 검출과 비교하여, 세포의 감염 상태 및 아형을 정확하게 식별하기 위해 검출 커버리지를 확장하였다 (도 18). 본 발명자의 결과적인 측정은 공개된 문헌 연구와 밀접한 상관관계가 있다 [Adey, A. et al. Nature 500: 207-211 (2013); Meissner, J. D. J Gen Virol 80: 1725-1733 (1999); Yee, C., et al., Am J Pathol 119: 361-366 (1985)]: CaSki 및 SiHa 세포는 HPV 16에 대해서만 상당한 신호를 나타냈으며, 한편 HeLa 및 PZ-HPV-7은 HPV 18에 대해서만 양성 신호를 나타냈다.
본 발명자는 인간 암 세포주의 HPV 프로파일링을 위해, 또 다른 등온 검출 기술, 즉 LAMP에 대하여 enVision 성능을 추가로 벤치마킹하였다. HPV 게놈의 동일한 분산 영역 (도 4a)에 대해, 본 발명자는 공개된 기준을 적용하여 [Tomita, N., et al., Nat Protoc 3: 877-882 (2008); Song, J. et al. Anal Chem 88: 7289-7294 (2016)] 각각의 HPV 아형에 대해, 각각 E1, L1 및 L2 유전자좌에 대한 LAMP 프라이머 세트를 설계하였다 (세부 사항은 방법 참조). 모든 LAMP 서열 정보는 표 6에서 찾을 수 있다.
Figure pct00013
Figure pct00014
최상위 LAMP 프라이머는 LAMP 반응 동안 자유 에너지의 변화인 그의 ΔG로부터 결정되었다.
LAMP의 제한된 프라이머 옵션과 비교하여, enVision 기술은 상당히 더 많은 프로브 선택을 생성할 뿐만 아니라 시험된 모든 아형 및 유전자좌에 대한 포괄적인 커버리지를 제공하였다 (도 19a). 본 발명자는 알려진 감염 세포주로부터 단리된 게놈 DNA를 사용하여, enVision 기술의 성능을 최상위 LAMP 프라이머 세트와 비교하였다 (도 19b). enVision 기술만이 정확한 HPV 아형결정을 나타냈으며, 한편 LAMP는 상당한 위양성을 나타냈다 (예를 들어, CaSki 세포, HPV 18; HeLa 세포, HPV 16).
실시예 6
임상 샘플의 HPV 프로파일링
HPV 감염을 검출하고 아형결정을 하는 데 enVision 플랫폼의 임상적 유용성을 시험하기 위해, 본 발명자는 두 가지 질문: (1) enVision 플랫폼이 HPV 감염을 검출하는 데 얼마나 정확한 지, 및 (2) 검정 커버리지를 개선하여 이전에 검출할 수 없었던 감염을 식별할 수 있는 지를 해결하는 것을 목표로 실행가능성 연구를 수행하였다.
임상 자궁경관내 브러시 샘플을 사용하여, 본 발명자는 enVision 검정을 수행하여 HPV 감염 상태를 결정하였다. 본 발명자는 환자 샘플 (n = 35)을 획득하고 enVision 플랫폼을 사용하여 환자 게놈에서 HPV 16 및 HPV 18 L1 유전자좌를 측정하여 (도 5a), 기존의 황금 표준에 대해 직접 비교하도록 하였다 (즉, 단지 qPCR 분석을 통한 L1 유전자좌에 대해 시험하는 코바스 HPV [Gardner, S. N., et al., J Clin Microbiol 41: 2417-2427 (2003)]). enVision 플랫폼은 임상 보고서 (HPV 16, AUC = 0.965; HPV 18, AUC = 0.944)에서 높은 검출 정확도를 달성하였다 (도 5b).
본 발명자는 또한 이들 임상 샘플에서 L1 유전자좌, L2 및 E1 유전자좌 통합에 더하여, 높은-커버리지의 다중-유전자좌 enVision 검정을 사용하여 측정하였다 (도 20). HPV 16 L1-양성 임상 샘플에서, 본 발명자는 다른 검출 유전자좌에 대해 증진된 시각적 신호를 계속 관찰하였다. 흥미롭게도, L1-음성 샘플의 하위집합에서, 높은-커버리지의 enVision 시스템이 특정 L2 및/또는 E1 유전자좌 통합을 검출하였다 (도 5c). 본 발명자는 독립적인 타크만® 형광 분석 (표 4)을 설계하여, 이 발견을 추가로 검증하였으며, 이는 모든 시험된 임상 검체에서 enVision 결과와 높은 유사성을 나타냈다 (도 21). 결과는 다중화된 enVision 플랫폼이 검출 커버리지를 개선하여 이전에 검출할 수 없었던 감염을 식별할 수 있을 것임을 나타낸다.
본 명세서에서 명백하게 이전에 공개된 문서의 어떤 목록 또는 논의도 이러한 문서가 최신 기술의 일부이거나 통상의 일반 상식이라는 점을 반드시 인정하는 것으로 간주해서는 안된다.
논의
일련의 효소-지원 DNA 나노구조를 통합함으로써, enVision 플랫폼은 육안으로 다양한 병원체 핵산을 민감하고 다양하게 검출할 수 있게 한다. 핵산 증폭 기술과 비교하여, enVision은 직접적인 표적 하이브리드형성 및 독립적인 시각적 신호 증진을 통해 검출한다. 따라서 상기 기술은 임상 적용에 매우 적합하다: (1) 캐스캐이딩(cascading) 신호 증진은 표적 하이브리드형성 직후 육안으로 빠르고 민감한 색상 판독을 생산한다 (표적 증폭의 필요 없이). 따라서 전체 검정은 실온에서 수행할 수 있으며 스마트폰으로 쉽게 정량화할 수 있으며; (2) DNA 나노구조는 인식 및 신호전달 기능성을 효과적으로 분리하여 고도로 프로그래밍 가능한 검출 및 논리 계산을 가능하게 하며; (3) 미세유체 통합은 검정 모듈성을 보완하고 반응 속도를 높인다. 임상 황금 표준 및 다른 등온 검출 기술과 비교하여, enVision 플랫폼은 우수한 감도 및 특이성을 나타낼 뿐만 아니라, 최소한의 장비 요건으로 다양한 능력 (예를 들어, 직접적인 RNA 검출, 논리 계산 및 검정 모듈성)도 제공하였다 (표 7).
Figure pct00015
CI, 신뢰 구간. a: Rao, A. et al. J Clin Microbiol 51: 1478-1484 (2013); b: Lucchi, N. W. et al. Sci Rep 6: 36808 (2016); c: Lee, J. S., et al., Biomed Res Int 2013, 8 (2013); d: Kang, L. N. et al. J Clin Microbiol 52: 1954-1961 (2014).
개발된 기술의 과학적 및 임상적 적용은 잠재적으로 광범위하다. 인식 나노구조는, 매우 저렴한 비용으로, 쉽게 조정되어, 유사한 효율을 가진 상이한 표적 서열을 검출할 수 있다 (즉, 새로운 세트의 기존 프라미어 또는 전용 화학적-변형 프라이머를 필요로 하는 대신에, 통상의 뉴클레오티드로 이루어진 단지 단일 프로브 서열이 조정할 필요가 있다). 신호전달 나노구조는 범용이며 모든 표적 서열에 사용할 수 있다. 이러한 모듈성은 신규 검정 개발을 용이하게 할 뿐만 아니라, 분자 계산을 수행하기 위한 프로그래밍 가능한 구성을 가능하게 한다. 따라서 본 발명자는 상기 기술이 면역 검출 (즉, RNA 바이러스)을 피하는 빠른 바이러스 돌연변이 [Schotte, L. et al., Antimicrob Agents Chemother 59: 4695-4706 (2015)] 뿐만 아니라 다수의 바이러스-숙주 게놈 통합 [Cheung, J. L., et al., J Infect Dis 194: 1706-1712 (2006)]을 조사하는 데 특히 유용할 것으로 예상한다. 임상적으로, enVision 기술의 시각적 검출 및 낮은 장비 요건은 기술을 커뮤니티 클리닉 및 자원-제한 환경에서 현장 진료 검출 워크플로우에 매우 적합하게 한다.
본 발명자는 현재 기술을 증진시키기 위해 몇몇 기술적 변형이 이루어질 수 있을 것으로 추가로 예상한다. 첫째, 현재의 유체공학 (즉, 4개의 검정 카세트)은 점점 더 작은 챔버를 수용하도록 쉽게 수정할 수 있을 것이다. 현재의 핵산 처리가 오프칩(off-chip)으로 수행되기 때문에, 추가 샘플 제조 모듈을 또한 통합하여 핵산 추출 및 처리를 가능하게 하여, 플랫폼의 임상적 유용성을 증진시킬 수 있다 [Adey, A. et al. Nature 500: 207-211 (2013)]. 이러한 신규 설계는 다수의 병원체 핵산의 실제적, 어레이 유형의 시각적 검출을 가능하게 할 것이다. 둘째, 이 현재의 검출 플랫폼에서는, 스마트폰과 수정된 조명 시스템을 사용하여 시각적 판독을 영상화하고 분석하였다. 스마트폰이 보편적이 되고 있고 더 많은 분석 능력을 보유하고 있기 때문에 [Laksanasopin, T. et al. Sci Transl Med 7: 273re1 (2015); Nemiroski, A. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 111: 11984-11989 (2014); Paterson, A. S. et al. Lab Chip 17: 1051-1059 (2017)], 본 발명자는 스마트폰에서 직접 추가 영상 보정 및 분석 알고리즘을 구현하여 조명 차이를 자동으로 보정하고 실세계(real-world) 적용을 위한 색상 강도를 정량화할 수 있을 것으로 예상한다.
참고문헌
1. Adey, A. et al. The haplotype-resolved genome and epigenome of the aneuploid HeLa cancer cell line. Nature 500, 207-211 (2013).
2. Bodily, J. & Laimins, L. A. Persistence of human papillomavirus infection: keys to malignant progression. Trends Microbiol 19, 33-39 (2011).
3. Bouvard, V. et al. A review of human carcinogens--Part B: biological agents. Lancet Oncol 10, 321-322 (2009).
4. Cheung, J. L., Lo, K. W., Cheung, T. H., Tang, J. W. & Chan, P. K. Viral load, E2 gene disruption status, and lineage of human papillomavirus type 16 infection in cervical neoplasia. J Infect Dis 194, 1706-1712 (2006).
5. Crosbie, E. J., Einstein, M. H., Franceschi, S. & Kitchener, H. C. Human papillomavirus and cervical cancer. Lancet 382, 889-899 (2013).
6. Cui, M. et al. Clinical performance of Roche Cobas 4800 HPV Test. J Clin Microbiol 52, 2210-2211 (2014).
7. Dang, C. & Jayasena, S. D. Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. J Mol Biol 264, 268-278 (1996).
8. Gardner, S. N., Kuczmarski, T. A., Vitalis, E. A. & Slezak, T. R. Limitations of TaqMan PCR for detecting divergent viral pathogens illustrated by hepatitis A, B, C, and E viruses and human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol 41, 2417-2427 (2003).
9. Juskowiak, B. Nucleic acid-based fluorescent probes and their analytical potential. Anal Bioanal Chem 399, 3157-3176 (2011).
10. Kang, L. N. et al. Optimal positive cutoff points for care HPV testing of clinician- and self-collected specimens in primary cervical cancer screening: an analysis from rural China. J Clin Microbiol 52, 1954-1961 (2014).
11. Laksanasopin, T. et al. A smartphone dongle for diagnosis of infectious diseases at the point of care. Sci Transl Med 7, 273re1 (2015).
12. Lee, H. et al. Molecularly self-assembled nucleic acid nanoparticles for targeted in vivo siRNA delivery. Nat Nanotechnol 7, 389-393 (2012).
13. Lee, J. S., Song, J. J., Deaton, R. & Kim, J.-W. Assessing the Detection Capacity of Microarrays as Bio/Nanosensing Platforms. Biomed Res Int 2013, 8 (2013).
14. Li, J., Green, A. A., Yan, H. & Fan, C. Engineering nucleic acid structures for programmable molecular circuitry and intracellular biocomputation. Nat Chem 9, 1056-1067 (2017).
15. Lucchi, N. W. et al. Evaluation of the Illumigene Malaria LAMP: A Robust Molecular Diagnostic Tool for Malaria Parasites. Sci Rep 6, 36808 (2016).
16. McBride, A. A. & Warburton, A. The role of integration in oncogenic progression of HPV-associated cancers. PLoS Pathog 13, e1006211 (2017).
17. Meissner, J. D. Nucleotide sequences and further characterization of human papillomavirus DNA present in the CaSki, SiHa and HeLa cervical carcinoma cell lines. J Gen Virol 80, 1725-1733 (1999).
18. Nemiroski, A. et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A 111, 11984-11989 (2014).
19. Niemz, A., Ferguson, T. M. & Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol 29, 240-250 (2011).
20. Nong, R. Y., Gu, J., Darmanis, S., Kamali-Moghaddam, M. & Landegren, U. DNA-assisted protein detection technologies. Expert Rev Proteomics 9, 21-32 (2012).
21. Pardee, K. et al. Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell 165, 1255-1266 (2016).
22. Park, K. S. et al. Rapid identification of health care-associated infections with an integrated fluorescence anisotropy system. Sci Adv 2, e1600300 (2016).
23. Paterson, A. S. et al. A low-cost smartphone-based platform for highly sensitive point-of-care testing with persistent luminescent phosphors. Lab Chip 17, 1051-1059 (2017).
24. Rao, A. et al. Development and Characterization of the cobas Human Papillomavirus Test. J Clin Microbiol 51, 1478-1484 (2013).
25. Schiffman, M. et al. Carcinogenic human papillomavirus infection. Nat Rev Dis Primers 2, 16086 (2016).
26. Schotte, L. et al. Characterization of Poliovirus Neutralization Escape Mutants of Single-Domain Antibody Fragments (VHHs). Antimicrob Agents Chemother 59, 4695-4706 (2015).
27. Shao, H. et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nat Commun 6, 6999 (2015).
28. Sievers, F. et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol 7, 539 (2011).
29. Song, J. et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Anal Chem 88, 7289-7294 (2016).
30. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H. & Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc 3, 877-882 (2008).
31. Wang, L., Meng, Z., Martina, F., Shao, H. & Shao, F. Fabrication of circular assemblies with DNA tetrahedrons: from static structures to a dynamic rotary motor. Nucleic Acids Res 45, 12090-12099 (2017).
32. Williams, V. M., Filippova, M., Soto, U. & Duerksen-Hughes, P. J. HPV-DNA integration and carcinogenesis: putative roles for inflammation and oxidative stress. Future Virol 6, 45-57 (2011).
33. Yee, C., Krishnan-Hewlett, I., Baker, C. C., Schlegel, R. & Howley, P. M. Presence and expression of human papillomavirus sequences in human cervical carcinoma cell lines. Am J Pathol 119, 361-366 (1985).
34. Zhao, Y., Chen, F., Li, Q., Wang, L. & Fan, C. Isothermal Amplification of Nucleic Acids. Chem Rev 115, 12491-12545 (2015).
35. Zumla, A. et al. Rapid point of care diagnostic tests for viral and bacterial respiratory tract infections--needs, advances, and future prospects. Lancet Infect Dis 14, 1123-1135 (2014).
SEQUENCE LISTING <110> National University of Singapore Agency for Science, Technology and Research <120> VISUAL AND MODULAR DETECTION OF NUCLEIC ACIDS WITH ENZYME-ASSISTED NANOTECHNOLOGY <130> IPA210076-SG <150> SG 10201805745P <151> 2018-07-03 <160> 153 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition nanostructure characterization aptamer sequence <400> 1 aagtatctgt aataaagtca caatgtacag tattg 35 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition nanostructure characterization inverter sequence <400> 2 tgactttatt acagatactt ctacaacccc ggtaccatct 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition nanostructure characterization complementary target <400> 3 agatggtacc ggggttgtag aagtatctgt aataaagtca 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition nanostructure characterization scrambled target <400> 4 agtagaacgc gatggtacag gcactgcagg gtccatgtca 40 <210> 5 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signalling nanostructure characterization self-priming template <400> 5 agcaggcagt tacgggctgg tgcgatgaga gacgcggagt gtggcggccg gatagtaatg 60 actgcgaccg gtgtaccagt ggcgtgaggc aggtcgtgag gcggcgtacg tagagcgttg 120 agcaggatgc caacagtcga tcaggacgag tgctaacgca ttgtcgatag ctcagctgtc 180 tgagctatcg acaatgcgtt 200 <210> 6 <211> 174 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signalling nanostructure characterization linear template <400> 6 agcaggcagt tacgggctgg tgcgatgaga gacgcggagt gtggcggccg gatagtaatg 60 actgcgaccg gtgtaccagt ggcgtgaggc aggtcgtgag gcggcgtacg tagagcgttg 120 agcaggatgc caacagtcga tcaggacgag tgctaacgca ttgtcgatag ctca 174 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signalling nanostructure characterization linear template primer <400> 7 tgagctatcg acaatgcgtt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10bp Taqman probe <400> 8 ctgatcgact gttggcatcc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 20bp Taqman probe <400> 9 ttggcatcct gctcaacgct 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 30bp Taqman probe <400> 10 tgctcaacgc tctacgtacg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 50bp Taqman probe <400> 11 gccgcctcac gacctgcctc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 100bp Taqman probe <400> 12 tatccggccg ccacactccg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 130bp Taqman probe <400> 13 cgcaccagcc cgtaactgcc 20 <210> 14 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' amine universal signalling nanostructure <400> 14 gcggcgtacg tagagcgttg agcaggatgc caacagtcga tcaggacgag tgctaacgca 60 ttgtcgatag ctcagctgtc tgagctatcg acaatgcgtt 100 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complementary target overhang 2 mismatch <400> 15 agatggtacc gcggttgtat aagtatctgt aataaagtca 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complementary target overhang 4 mismatch <400> 16 agatagtgcc gcggttgtat aagtatctgt aataaagtca 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complementary target overhang 6 mismatch <400> 17 agatagtgca gcggttatat aagtatctgt aataaagtca 40 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complementary target overhang 8 mismatch <400> 18 acatagtgca gcggctatat aagtatctgt aataaagtca 40 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complementary target overhang 10 mismatch <400> 19 acgtagtgca gcagctatat aagtatctgt aataaagtca 40 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complementary target overhang 12 mismatch <400> 20 acgtagtgta gcagctatct aagtatctgt aataaagtca 40 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complementary target duplex 2 mismatch <400> 21 agatggtacc ggggttgtag aattatctgt aatagagtca 40 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complementary target duplex 4 mismatch <400> 22 agatggtacc ggggttgtag aattagctgt actagagtca 40 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complementary target duplex 6 mismatch <400> 23 agatggtacc ggggttgtag tattagctct actagagtca 40 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complementary target duplex 8 mismatch <400> 24 agatggtacc ggggttgtag tattcgctct actagagtaa 40 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complementary target duplex 10 mismatch <400> 25 agatggtacc ggggttgtag tattcgctct acaagattaa 40 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Complementary target duplex 12 mismatch <400> 26 agatggtacc ggggttgtag tattcgcact acaagattac 40 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 forward primer <400> 27 atggattata tgatatttat gc 22 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 reverse primer <400> 28 ctgataaaga tgtagagg 18 <210> 29 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 product <400> 29 ctgataaaga tgtagagggt acagatggta ccggggttgt agaagtatct gtaataaagt 60 catctgcata aatatcatat aatccat 87 <210> 30 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 NASBA forward primer <400> 30 aattctaata cgactcacta tagggagaag ggcagcctca cctacttcta tta 53 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 NASBA reverse primer <400> 31 aaagatgtag agggtacaga 20 <210> 32 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 NASBA product <400> 32 gcagcctcac ctacttctat taataatgga ttatatgata tttatgcaga tgactttatt 60 acagatactt ctacaacccc ggtaccatct gtaccctcta catcttt 107 <210> 33 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 1 aptamer <400> 33 tttaaataat ctggatattt caatgtacag tattg 35 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 1 inverter <400> 34 aaatatccag attatttaaa aatggctgca 30 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 1 complementary positive target <400> 35 cataaggatc tgcagccatt tttaaataat ctggatattt 40 <210> 36 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 1 HPV 06 Target <400> 36 catatgggtc tgcagccatt tgtaaataat ctggatattt 40 <210> 37 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 1 HPV 16 Target <400> 37 catatggttc tgacaccatt ttaatataat ctggatattt 40 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 1 HPV 18 Target <400> 38 cataaggatc tgcagacatt tgtaaataat caggatattt 40 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 1 HPV 31 Target <400> 39 catatggctc agcaaccatt ttaagataat ctggatattt 40 <210> 40 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 1 HPV 33 Target <400> 40 catatggctc agcaaccatt ttaagataat ctggatattt 40 <210> 41 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 1 HPV 58 Target <400> 41 cataaggttc actggccatt tttaaataat ctggatattt 40 <210> 42 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 2 aptamer <400> 42 aaataattgt gcctcagagg caatgtacag tattg 35 <210> 43 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 2 inverter <400> 43 cctctgaggc acaattattt aataaaccat attggctaca 40 <210> 44 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 2 complementary positive target <400> 44 tgtagccaat atggtttatt aaataattgt gcctcagagg 40 <210> 45 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 2 HPV 06 Target <400> 45 tgtagccaat atggcttatt aaacaattgt gcctcagagg 40 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 2 HPV 16 Target <400> 46 tgtaaccaat aaggtttatt gaatatttgg gcatcagagg 40 <210> 47 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 2 HPV 18 Target <400> 47 tgtaaccaat atggtttatt aaacaactgg gagtcagagg 40 <210> 48 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 2 HPV 31 Target <400> 48 tgcatccaat atggtttatt aaaaatttgt gcatctgaag 40 <210> 49 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 2 HPV 33 Target <400> 49 tgtagccaat atggcttatt aaataactga gattcggaag 40 <210> 50 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-HPV nanostructure 2 HPV 58 Target <400> 50 tgtagccaat aaggcttatt aaataattgt gattctgagg 40 <210> 51 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 06 aptamer <400> 51 taatgtcagg ttcaaaagat caatgtacag tattg 35 <210> 52 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 06 inverter <400> 52 atcttttgaa cctgacatta accctaccca acaccctgtt 40 <210> 53 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 06 target <400> 53 aacagggtgt tgggtagggt taatgtcagg ttcaaaagat 40 <210> 54 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 11 aptamer <400> 54 cagggatagg gtcaaatggt caatgtacag tattg 35 <210> 55 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 11 inverter <400> 55 accatttgac cctatccctg accctgtcca acattctgtt 40 <210> 56 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 11 target <400> 56 aacagaatgt tggacagggt cagggatagg gtcaaatggt 40 <210> 57 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 aptamer <400> 57 aagtatctgt aataaagtca caatgtacag tattg 35 <210> 58 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 inverter <400> 58 tgactttatt acagatactt ctacaacccc ggtaccatct 40 <210> 59 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 target <400> 59 agatggtacc ggggttgtag aagtatctgt aataaagtca 40 <210> 60 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 aptamer <400> 60 gcactgcagg gtccatgtca caatgtacag tattg 35 <210> 61 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 inverter <400> 61 tgacatggac cctgcagtgc ctgtaccatc gcgttctact 40 <210> 62 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 target <400> 62 agtagaacgc gatggtacag gcactgcagg gtccatgtca 40 <210> 63 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 31 aptamer <400> 63 tatccacagt aaaatcagtg caatgtacag tattg 35 <210> 64 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 31 inverter <400> 64 cactgatttt actgtggata cacctgccac acataatgtt 40 <210> 65 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 31 target <400> 65 aacattatgt gtggcaggtg tatccacagt aaaatcagtg 40 <210> 66 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 33 aptamer <400> 66 tgtgtacatt atccacatcg caatgtacag tattg 35 <210> 67 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 33 inverter <400> 67 cgatgtggat aatgtacaca ccccaatgca acactcatac 40 <210> 68 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 33 target <400> 68 gtatgagtgt tgcattgggg tgtgtacatt atccacatcg 40 <210> 69 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 58 aptamer <400> 69 catgtatagt atcagcatcg caatgtacag tattg 35 <210> 70 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 58 inverter <400> 70 cgatgctgat actatacatg attttcagag tcctctgcac 40 <210> 71 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 58 target <400> 71 gtgcagagga ctctgaaaat catgtatagt atcagcatcg 40 <210> 72 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 66 aptamer <400> 72 tgggtgcctc atcatcaata caatgtacag tattg 35 <210> 73 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 66 inverter <400> 73 tattgatgat gaggcaccca tttcatttcg tcagtctggt 40 <210> 74 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 66 target <400> 74 accagactga cgaaatgaaa tgggtgcctc atcatcaata 40 <210> 75 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 06 forward primer <400> 75 gaagatacat ttgatattta tgc 23 <210> 76 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 06 reverse primer <400> 76 attaggtgtg gaagttaa 18 <210> 77 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 06 product <400> 77 gaagatacat ttgatattta tgctgaatct tttgaacctg acattaaccc tacccaacac 60 cctgttacaa atatatcaga tacatattta a 91 <210> 78 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 11 forward primer <400> 78 acacgtttga tatttatgc 19 <210> 79 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 11 reverse primer <400> 79 tattaggtgt ggaggta 17 <210> 80 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 11 product <400> 80 acacgtttga tatttatgct gaaccatttg accctatccc tgaccctgtc caacattctg 60 ttacacagtc ttatcttacc tccacaccta ata 93 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 forward primer <400> 81 acttgtttga tatatatgca 20 <210> 82 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 reverse primer <400> 82 gcgaatattt aaaaaatgc 19 <210> 83 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 product <400> 83 acttgtttga tatatatgca gatgacatgg accctgcagt gcctgtacca tcgcgttcta 60 ctacctcctt tgcatttttt aaatattcgc 90 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 31 forward primer <400> 84 ggcttatatg acatttatgc 20 <210> 85 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 31 reverse primer <400> 85 actgtacagc agtagaa 17 <210> 86 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 31 product <400> 86 ggcttatatg acatttatgc agacactgat tttactgtgg atacacctgc cacacataat 60 gtttcccctt ctactgctgt acagt 85 <210> 87 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 33 forward primer <400> 87 gtttgtatga tgtttatgc 19 <210> 88 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 33 reverse primer <400> 88 ttgcaaacgt actgtat 17 <210> 89 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 33 product <400> 89 gtttgtatga tgtttatgct gacgatgtgg ataatgtaca caccccaatg caacactcat 60 acagtacgtt tgcaa 75 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 58 forward primer <400> 90 tggactttat gatatttatg c 21 <210> 91 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 58 reverse primer <400> 91 gcaaaggacg tatgt 15 <210> 92 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 58 product <400> 92 tggactttat gatatttatg ctgacgatgc tgatactata catgattttc agagtcctct 60 gcactcacat acgtcctttg c 81 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 66 forward primer <400> 93 gcctatatga tatttatgca 20 <210> 94 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 66 reverse primer <400> 94 aggtaattgt gcagaa 16 <210> 95 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 66 product <400> 95 gcctatatga tatttatgca aatattgatg atgaggcacc catttcattt cgtcagtctg 60 gtgctacacc ttctgcacaa ttacct 86 <210> 96 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L2 template <400> 96 tctaatacga ctcactatag agatggtacc ggggttgtag aagtatctgt aataaagtca 60 <210> 97 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L2 template complement <400> 97 tgactttatt acagatactt ctacaacccc ggtaccatct ctatagtgag tcgtattaga 60 <210> 98 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 L2 template <400> 98 tctaatacga ctcactatag agtagaacgc gatggtacag gcactgcagg gtccatgtca 60 <210> 99 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 L2 template complement <400> 99 tgacatggac cctgcagtgc ctgtaccatc gcgttctact ctatagtgag tcgtattaga 60 <210> 100 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 E1 aptamer <400> 100 caaccacccc cacttccacc caatgtacag tattg 35 <210> 101 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 E1 inverter <400> 101 ggtggaagtg ggggtggttg cagtcagtac agtagtggaa 40 <210> 102 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 E1 target <400> 102 ttccactact gtactgactg caaccacccc cacttccacc 40 <210> 103 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L1 aptamer <400> 103 gtttctgaag tagatatggc caatgtacag tattg 35 <210> 104 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L1 inverter <400> 104 gccatatcta cttcagaaac tacatataaa aatactaact 40 <210> 105 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L1 target <400> 105 agttagtatt tttatatgta gtttctgaag tagatatggc 40 <210> 106 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L2 aptamer <400> 106 aagtatctgt aataaagtca caatgtacag tattg 35 <210> 107 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L2 inverter <400> 107 tgactttatt acagatactt ctacaacccc ggtaccatct 40 <210> 108 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L2 target <400> 108 agatggtacc ggggttgtag aagtatctgt aataaagtca 40 <210> 109 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 E1 aptamer <400> 109 tgtgcccccg ttgtctatag caatgtacag tattg 35 <210> 110 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 E1 inverter <400> 110 ctatagacaa cgggggcaca gagggcaaca acagcagtgt 40 <210> 111 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 E1 target <400> 111 acactgctgt tgttgccctc tgtgcccccg ttgtctatag 40 <210> 112 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 L1 aptamer <400> 112 aggtacagga gactgtgtag caatgtacag tattg 35 <210> 113 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 L1 inverter <400> 113 ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg atgctaccaa 40 <210> 114 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 L1 target <400> 114 ttggtagcat catattgccc aggtacagga gactgtgtag 40 <210> 115 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 L2 aptamer <400> 115 gcactgcagg gtccatgtca caatgtacag tattg 35 <210> 116 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 L2 inverter <400> 116 tgacatggac cctgcagtgc ctgtaccatc gcgttctact 40 <210> 117 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 L2 target <400> 117 agtagaacgc gatggtacag gcactgcagg gtccatgtca 40 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 E1 forward primer <400> 118 caacgtgttg cgattggtgt 20 <210> 119 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 E1 reverse primer <400> 119 accattcccc atgaacatgc ta 22 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 E1 Taqman probe <400> 120 acacccagta tagctgacag 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV L1 forward primer <400> 121 cacctaatgg ctgaccacga 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L1 reverse primer <400> 122 acttgcagtt ggacatccct 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L1 Taqman probe <400> 123 cacctacaca ggcccaaacc 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L2 forward primer <400> 124 ttggaacagg gtcgggtaca 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L2 reverse primer <400> 125 gaagggccca caggatctac 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L2 Taqman probe <400> 126 tgggaacaag gcctcccaca 20 <210> 127 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 NOT aptamer <400> 127 tgactttatt acagatactt caatgtacag tattg 35 <210> 128 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 NOT aptamer <400> 128 tgacatggac cctgcagtgc caatgtacag tattg 35 <210> 129 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 E1 LAMP Forward Internal Primer <400> 129 tggcgccctt ctacctgtaa acagcgggta tggcaata 38 <210> 130 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 E1 LAMP Back Internal Primer <400> 130 caccatgtag tcagtatagt ggtgtttcac taacaccctc tcc 43 <210> 131 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 E1 LAMP Forward Primer 3 <400> 131 agagctgcaa aaaggaga 18 <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 E1 LAMP Back Primer 3 <400> 132 gtgtttggca tatagtgtgt c 21 <210> 133 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L1 LAMP Forward Internal Primer <400> 133 tggcagcaca taatgacata tttgtggtaa ccaactattt gttactgt 48 <210> 134 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L1 LAMP Back Internal Primer <400> 134 aactttaagg agtacctacg acatgagtta aggttatttt gcacagt 47 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L1 LAMP Forward Primer 3 <400> 135 ccacaataat ggcatttgtt g 21 <210> 136 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L1 LAMP Back Primer 3 <400> 136 atgtatgtat gtcataacgt ctg 23 <210> 137 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L2 LAMP Forward Internal Primer <400> 137 ccggggttgt agaagtatct gtaatctcac ctacttctat taataatgga 50 <210> 138 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L2 LAMP Back Internal Primer <400> 138 taccatctgt accctctaca tctttggaat attgtatgca ccacca 46 <210> 139 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L2 LAMP Forward Primer 3 <400> 139 catatactac cacttcacat gc 22 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 16 L2 LAMP Back Primer 3 <400> 140 aatgggtata tcaggacctg 20 <210> 141 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 E1 LAMP Forward Internal Primer <400> 141 tgaatctgtg ttgcttccac ttcgcggctg tttacaatat caga 44 <210> 142 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 E1 LAMP Back Internal Primer <400> 142 aacatggcgg caatgtatgt agtgtctaca ctgctgttgt tg 42 <210> 143 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 E1 LAMP Forward Primer 3 <400> 143 tagtgggcag aaaaaggc 18 <210> 144 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 E1 LAMP Back Primer 3 <400> 144 attgctattg tcacttgtac c 21 <210> 145 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 L1 LAMP Forward Internal Primer <400> 145 aatcatattc ctcaacatgt ctgctctcct gtacctgggc aat 43 <210> 146 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 L1 LAMP Back Internal Primer <400> 146 actttaactg cagatgttat gtcctaccaa agttccaatc ctcta 45 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 L1 LAMP Forward Primer 3 <400> 147 caatatgtgc ttctacacag t 21 <210> 148 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 L1 LAMP Back Primer 3 <400> 148 tccaccaaac tagtagttgg 20 <210> 149 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 L2 LAMP Forward Internal Primer <400> 149 aaggaggtag tagaacgcga tgcttgtttg atatatatgc agatgac 47 <210> 150 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 L2 LAMP Back Internal Primer <400> 150 tgcatttttt aaatattcgc ccactggagg ttaaagggac cgt 43 <210> 151 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 L2 LAMP Forward Primer 3 <400> 151 ctttagtatc tgccacgga 19 <210> 152 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 L2 LAMP Back Primer 3 <400> 152 tacaggcaca tcccaaga 18 <210> 153 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer conserved sequence <400> 153 caatgtacag tattg 15

Claims (32)

  1. (a) 핵산을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 적어도 1종의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 1종의 인식 나노구조(recognition nanostructure)를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 여기서 인식 나노구조가 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 갖는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 압타머(aptamer)를 포함하며, 여기서 가변 서열 영역이 샘플에서 표적 핵산에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트(overhang segment)를 포함하는 것인 단계; 또는
    (c) 적어도 1종의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 1종의 인식 나노구조를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 여기서 인식 나노구조가 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 압타머 및 인버터 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 압타머가 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 가지며, 여기서 가변 서열 영역이 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함하고, 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부와 듀플렉스(duplex)를 형성하며, 여기서 인버터 올리고뉴클레오티드가 압타머-인버터 듀플렉스보다 적어도 1개의 뉴클레오티드가 더 길고 샘플에서 표적 핵산에 상보적인 10개 초과의 뉴클레오티드를 갖는 것인 단계;
    (d) 핵산을 포함하는 샘플을 (b) 또는 (c)의 조성물과 접촉시키는 단계로서, 여기서 표적 핵산이 다음에 결합하는 것인 단계:
    (i) (b)에서의 압타머의 가변 서열 영역이 안정한 압타머-DNA 폴리머라제 효소 복합체의 형성을 촉진하여, DNA 폴리머라제 효소 활성을 억제하는 것; 또는
    (ii) (c)에서의 인버터 올리고뉴클레오티드가 인식 나노구조를 불안정하게 하여, DNA 압타머에 의한 억제로부터 DNA 폴리머라제 효소를 방출하는 것;
    (e) 단계 (d)로부터 활성 DNA 폴리머라제 효소에 반응성인 신호전달(signalling) 나노구조를 제공하는 단계로서, 여기서 신호전달 나노구조가 DNA 폴리머라제 효소에 반응을 보이는 자기-프라이밍 부분(self-priming portion)을 포함하는 것인 단계;
    (f) 신호전달 나노구조를 표지된 올리고뉴클레오티드 (dNTP) 및 신호 발달 시약(signal development reagent)의 존재 하에 단계 (d)로부터의 활성 DNA 폴리머라제 효소와 접촉시키는 단계로서, 여기서 활성화된 DNA 폴리머라제 효소가 표지된 올리고뉴클레오티드를 신호전달 나노구조에 추가하고 신호 발달 시약이 자기-프라이밍된 부분에 혼입된 표지된 올리고뉴클레오티드에 결합하는 것인 단계;
    (g) 신호 발달을 검출하는 단계로서, 여기서 신호의 강도가 다음을 나타내는 것인 단계;
    (i) 조성물 (b)를 사용할 때 샘플 중 표적 핵산의 부재; 또는
    (ii) 조성물 (c)를 사용할 때 샘플 중 표적 핵산의 존재
    를 포함하는, 샘플에서 표적 핵산을 검출하는 방법.
  2. (a) 대상체로부터 핵산을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 적어도 1종의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 1종의 인식 나노구조를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 여기서 인식 나노구조가 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 갖는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 압타머를 포함하며, 여기서 가변 서열 영역이 샘플에서 표적 핵산에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함하는 것인 단계; 또는
    (c) 적어도 1종의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 1종의 인식 나노구조를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 여기서 인식 나노구조가 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 압타머 및 인버터 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 압타머가 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 가지며, 여기서 가변 서열 영역이 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함하고, 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부와 듀플렉스를 형성하며, 여기서 인버터 올리고뉴클레오티드가 압타머-인버터 듀플렉스보다 적어도 1개의 뉴클레오티드가 더 길고 샘플에서 표적 핵산에 상보적인 10개 초과의 뉴클레오티드를 갖는 것인 단계;
    (d) 핵산을 포함하는 샘플을 (b) 또는 (c)의 조성물과 접촉시키는 단계로서, 여기서 표적 핵산이 다음에 결합하는 것인 단계:
    (i) (b)에서의 압타머의 가변 서열 영역이 안정한 압타머-DNA 폴리머라제 효소 복합체의 형성을 촉진하여, DNA 폴리머라제 효소 활성을 억제하는 것; 또는
    (ii) (c)에서의 인버터 올리고뉴클레오티드가 인식 나노구조를 불안정하게 하여, DNA 압타머에 의한 억제로부터 DNA 폴리머라제 효소를 방출하는 것;
    (e) 단계 (d)로부터 활성 DNA 폴리머라제 효소에 반응성인 신호전달 나노구조를 제공하는 단계로서, 여기서 신호전달 나노구조가 DNA 폴리머라제 효소에 반응을 보이는 자기-프라이밍 부분을 포함하는 것인 단계;
    (f) 신호전달 나노구조를 표지된 올리고뉴클레오티드 (dNTP) 및 신호 발달 시약의 존재 하에 단계 (d)로부터의 활성 DNA 폴리머라제 효소와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 활성화된 DNA 폴리머라제 효소가 표지된 올리고뉴클레오티드를 신호전달 나노구조에 추가하고 신호 발달 시약이 자기-프라이밍된 부분에 혼입된 표지된 올리고뉴클레오티드에 결합하는 것인 단계;
    (g) 신호 발달을 검출하는 단계로서, 여기서 신호의 강도가 다음을 나타내는 것인 단계;
    (i) 조성물 (b)를 사용하는 경우 샘플 중 표적 핵산의 부재; 또는
    (ii) 조성물 (c)를 사용하는 경우 샘플 중 표적 핵산의 존재;
    (h) 샘플 중 표적 핵산의 존재가 검출되는 경우 환자가 질환을 갖는 것으로 진단하는 것
    을 포함하는, 대상체에서 질환을 진단하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, DNA 압타머 보존된 서열 영역이 5'-CAATGTACAGTATTG-3' (서열번호: 153)에 제시된 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인버터 올리고뉴클레오티드가 압타머 듀플렉스 영역보다 적어도 1개의 뉴클레오티드가 더 긴 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 인버터 올리고뉴클레오티드 길이가 약 35 내지 45개, 바람직하게는 약 40개 뉴클레오티드인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인버터 올리고뉴클레오티드 길이의 대략 절반이 압타머-인버터 듀플렉스를 형성하고 대략 절반이 오버행 세그먼트를 형성하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 검출(multiplex detection)을 위해, 샘플에서 제1 인식 나노구조의 표적 핵산과 상이한 1종 이상의 표적 핵산에 상보적인 1종 이상의 추가 인식 나노구조를 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 인식 나노구조 각각이 AND, OR, NOT, NAND 및 NOR을 포함하는 군으로부터 선택된 논리 게이트(logic gate)를 형성하는 비로 DNA 압타머: 인버터 올리고뉴클레오티드: DNA 폴리머라제 효소의 조합을 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, DNA 압타머: 인버터 올리고뉴클레오티드: 각각의 인식 나노구조의 DNA 폴리머라제 효소 비의 조합이 다음을 포함하는 군 (i) 내지 (v)로부터 선택된 것인 방법:
    (i) AND 논리 게이트를 형성하기 위해 각각 1: 1: 0.5 DNA 압타머: 인버터 올리고뉴클레오티드: DNA 폴리머라제 효소 비를 갖는 2개의 나노구조;
    (ii) OR 논리 게이트를 형성하기 위해 각각 1: 1: 1 DNA 압타머: 인버터 올리고뉴클레오티드: DNA 폴리머라제 효소 비를 갖는 2개의 나노구조;
    (iii) NOT 논리 게이트를 형성하기 위해 1: 0: 1을 갖는 1개의 나노구조;
    (iv) NAND 게이트를 형성하기 위해 각각 1: 0: 1 DNA 압타머: 인버터 올리고뉴클레오티드: DNA 폴리머라제 효소 비를 갖는 2개의 나노구조; 및
    (v) NOR 게이트를 형성하기 위해 각각 1: 0: 0.5 DNA 압타머: 인버터 올리고뉴클레오티드: DNA 폴리머라제 효소 비를 갖는 2개의 나노구조.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 신호전달 나노구조의 자기-프라이밍 부분이 서열번호: 5에 제시된 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, dNTP 표지(label)가 비오틴(biotin)인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 발달 시약이 아비딘 또는 그의 유도체를 포함하는 융합 단백질, 및 HRP, 베타-락타마제, 아밀라제, 베타-갈락토시다제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 군으로부터 선택된 효소, 및 DAB, TMB, ABTS, 니트로세핀(nitrocefin), 루미놀(luminol), 전분 및 아이오딘을 포함하나 이에 제한되지는 않는 군으로부터 선택된 각각의 기질(substrate)을 포함하고, 여기서 신호가 측정되고 색상, 형광, 발광 또는 전기화학적 변화로서 정량화될 수 있으나 이에 제한되지는 않는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 표적이 비-인간 또는 인간 질환, 유전적 변이체, 포렌식(forensic), 균주 식별(strain identification), 환경 및/또는 식품 오염과 연관된 적어도 1종의 핵산인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 표적이 적어도 1종의 병원체 핵산인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 전에 샘플에서 표적 핵산의 증폭이 선행되는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 샘플에서 표적 핵산의 증폭이 중첩된(nested) 비대칭 PCR 또는 등온 증폭 방법에 의한 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 및 신호전달 단계가 물리적으로 분리되는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 및 신호전달 나노구조가 기질에 부착되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 신호전달 나노구조가 비드(bead)에 부착되는 것인 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 검출 및 신호전달 나노구조가 미세유체 장치(microfluidic device) 또는 측면 유동 장치(latral flow device)에 부착되는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d) 내지 g), 바람직하게는 단계 a) 내지 g)가 16℃ 내지 40℃ 범위의 온도, 바람직하게는 주위 온도에서 수행되는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산이 HPV 핵산인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 압타머 및 인버터 올리고뉴클레오티드가 표 2, 표 4 또는 표 5에 기재된 것들로부터 선택된 것인 방법.
  24. (i) 제1 위치에서, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 정의한 바와 같은, 적어도 1종의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 1종의 인식 나노구조를 포함하는, 조성물 b) 또는 조성물 c);
    (ii) 제2 위치에서 부착된, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 정의한 바와 같은, 활성 DNA 폴리머라제 효소에 반응을 보이는 자기-프라이밍 부분을 포함하는 신호전달 나노구조; 및
    (iii) 상기 검출 나노구조를 샘플 핵산과 혼합하여 활성 효소를 상기 제2 위치로 방출하는 중간 스테이지(intermediate stage)
    를 포함하는 장치.
  25. 제24항에 있어서, 미세유체 장치 및 측면 유동 장치를 포함하는 군으로부터 선택된 장치.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 장치가
    (i) 하나 이상의 검정 카세트(assay cassette)를 수용하도록 구성된 공통 신호전달 카트리지(cartridge)로서, 여기서 카트리지가 신호전달 나노구조를 고정하기 위해 내장된(embedded) 멤브레인(membrane)을 가진 베이스(base), 및 하나 이상의 검정 카세트 각각에서 상기 제2 위치와 유체 연결(fluid connection)을 만드는 공통 출구를 포함하는 것인 카트리지;
    (ii) 각각 제1 위치에서, 입구 및 적어도 1종의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 1종의 인식 나노구조; 상기 검출 나노구조를 샘플 핵산과 혼합하여 활성 효소를 상기 제2 위치로 방출하기 위한, 제1 위치와 제2 위치 사이의 유체 연결에 있는 중간 스테이지 마이크로채널을 포함하는 하나 이상의 검정 카세트
    를 포함하는 미세유체 장치로서;
    여기서, 장치가 조립(assembly)되어 사용 중인 경우, 철수 격막(withdrawal septum)에 의해 작동되는, 샘플 입구로부터 공통 출구로의 유체 흐름이 있는 것인, 장치.
  27. (a) 적어도 1종의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 1종의 인식 나노구조를 포함하는 조성물로서, 여기서 인식 나노구조가 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 갖는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 압타머를 포함하며, 여기서 가변 서열 영역이 표적 핵산에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함하는 것인 조성물; 및/또는
    (b) 적어도 1종의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 1종의 인식 나노구조를 포함하는 조성물로서, 여기서 인식 나노구조가 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 압타머 및 인버터 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 압타머가 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 가지며, 여기서 가변 서열 영역이 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함하고, 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부와 듀플렉스를 형성하며, 여기서 인버터 올리고뉴클레오티드가 압타머-인버터 듀플렉스보다 적어도 1개의 뉴클레오티드가 더 길고 표적 핵산에 상보적인 10개 초과의 뉴클레오티드를 갖는 것인 조성물; 임의로
    (c) 활성 DNA 폴리머라제 효소에 반응성인 신호전달 나노구조로서, 여기서 신호전달 나노구조가 DNA 폴리머라제 효소에 반응을 보이는 자기-프라이밍 부분을 포함하는 것인 신호전달 나노구조; 및/또는
    (d) 표지된 뉴클레오티드 (dNTP) 및 신호 발달 시약으로서, 여기서 활성 DNA 폴리머라제 효소가 표지된 뉴클레오티드를 신호전달 나노구조에 추가하고 신호 발달 시약이 자기-프라이밍된 부분에 혼입된 표지된 뉴클레오티드에 결합하는 것인 dNTP 및 신호 발달 시약
    을 포함하는 핵산 검출 키트(nucleic acid detection kit).
  28. 제27항에 있어서, (a) 내지 (d)가 이전에 기재된 것들 중 어느 하나에 따라 정의된 바와 같은 것인 핵산 검출 키트.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 장치로 구성된 핵산 검출 키트.
  30. 제27항에 있어서, 압타머 및/또는 인버터 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나가 그의 천연 핵산으로부터 구조적으로 및/또는 화학적으로 변형된 것인 핵산 검출 키트.
  31. 제30항에 있어서, 상기 구조적 및/또는 화학적 변형이 합성 동안, 형광 태그(fluorescent tag), 방사성 태그와 같은 태그의 추가, 비오틴, 5' 테일(tail), 포스포로티오에이트 (PS) 결합의 추가, 2'-O-메틸 변형 및/또는 포스포라미다이트 C3 스페이서(spacer)를 포함하는 군으로부터 선택된 것인, 핵산 검출 키트.
  32. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 방법에서의, 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항의 핵산 검출 키트의 용도.
KR1020217003384A 2018-07-03 2019-07-02 효소-지원 나노기술을 이용한 핵산의 시각적 및 모듈식 검출 KR20210049782A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SG10201805745P 2018-07-03
SG10201805745P 2018-07-03
PCT/SG2019/050328 WO2020009660A1 (en) 2018-07-03 2019-07-02 Visual and modular detection of nucleic acids with enzyme-assisted nanotechnology

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210049782A true KR20210049782A (ko) 2021-05-06

Family

ID=69060998

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217003384A KR20210049782A (ko) 2018-07-03 2019-07-02 효소-지원 나노기술을 이용한 핵산의 시각적 및 모듈식 검출

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20210130870A1 (ko)
EP (1) EP3818176A4 (ko)
JP (2) JP7449269B2 (ko)
KR (1) KR20210049782A (ko)
CN (1) CN113039284A (ko)
AU (1) AU2019298075A1 (ko)
CA (1) CA3105625A1 (ko)
SG (1) SG11202013188QA (ko)
WO (1) WO2020009660A1 (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230159990A1 (en) * 2020-04-07 2023-05-25 National University Of Singapore Responsive, catalytic nucleic nanostructures
CN116783305A (zh) * 2020-09-25 2023-09-19 新加坡国立大学 具有可调功能稳定性的核酸纳米结构
CN117120633A (zh) * 2021-02-02 2023-11-24 新加坡国立大学 用于直接且灵敏地检测sars-cov-2的通过过渡状态分子开关的催化放大
CN113201582B (zh) * 2021-04-01 2023-08-15 南京邮电大学 一种基于磁颗粒及等温核酸扩增方法组装的比色传感器及其制备方法和应用
CN113481205B (zh) * 2021-07-30 2023-11-03 杭州凡泰生物科技有限公司 一种hpv18类病毒颗粒的核酸适配体hpv1801及其应用
WO2023031247A1 (en) * 2021-09-01 2023-03-09 Ludwig-Maximilians-Universität München Activatable dna polymerase
GB2621159A (en) * 2022-08-04 2024-02-07 Wobble Genomics Ltd Methods of preparing processed nucleic acid samples and detecting nucleic acids and devices therefor
CN116769975B (zh) * 2023-08-15 2023-11-24 江苏美克医学技术有限公司 Hpv检测引物组、试剂盒及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101719285B1 (ko) 2014-11-04 2017-03-23 한국과학기술원 표적 물질에 의해 조절되는 핵산 중합효소 활성을 이용한 생체물질의 검출 및 정량 방법

Also Published As

Publication number Publication date
EP3818176A1 (en) 2021-05-12
JP2024038093A (ja) 2024-03-19
SG11202013188QA (en) 2021-01-28
US20210130870A1 (en) 2021-05-06
JP7449269B2 (ja) 2024-03-13
CN113039284A (zh) 2021-06-25
EP3818176A4 (en) 2022-04-27
WO2020009660A1 (en) 2020-01-09
JP2021529540A (ja) 2021-11-04
CA3105625A1 (en) 2020-01-09
AU2019298075A1 (en) 2021-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20210049782A (ko) 효소-지원 나노기술을 이용한 핵산의 시각적 및 모듈식 검출
Ho et al. Visual and modular detection of pathogen nucleic acids with enzyme–DNA molecular complexes
US9689047B2 (en) Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
CN111448311A (zh) 基于多效应子crispr的诊断系统
Lee et al. DhITACT: DNA hydrogel formation by isothermal amplification of complementary target in fluidic channels
Fujita et al. Novel one-tube-one-step real-time methodology for rapid transcriptomic biomarker detection: signal amplification by ternary initiation complexes
Asadi et al. The mechanism and improvements to the isothermal amplification of nucleic acids, at a glance
Zhou et al. Coupling CRISPR/Cas12a and recombinase polymerase amplification on a stand-alone microfluidics platform for fast and parallel nucleic acid detection
CN104020291B (zh) 一种基于酶联免疫分析的hpv核酸检测试剂盒及其应用
KR20140029825A (ko) 표적물질의 결합에 의한 압타머 구조 변화 특성을 이용한 등온 핵산 증폭방법 및 이를 이용한 초고감도 생체물질 검출방법
CN110885906A (zh) 用于检测人乳头瘤病毒核酸的组合物和方法
US9617606B2 (en) Oligonucleotide for HIV detection, HIV detection kit, and HIV detection method
US20230159990A1 (en) Responsive, catalytic nucleic nanostructures
WO2013189306A1 (en) Methods and compositions for assessing copy number of target polynecleotides
Zhang et al. Detection of nucleic acids with a novel stem-loop primer rolling circle amplification technique
CN114729347A (zh) 未分化标记基因高灵敏度检测法
CN106048080B (zh) 一种快速筛查hpv亚型的引物和方法
US20220220536A1 (en) Compositions and methods of using a dna nanoswitch for the detection of rna
WO2018156906A1 (en) System and method for purifying and amplifying nucleic acids
Wang et al. Nested phosphorothioated hybrid primer-mediated isothermal amplification for specific and dye-based subattomolar nucleic acid detection at low temperatures
CN106191314B (zh) 一种dna病毒的lamp检测试剂盒、检测方法及应用
Varela Rolling Circle Amplification (RCA) On-Chip towards COVID-19 molecular diagnostics
Pumford et al. Developments in integrating nucleic acid isothermal amplification and detection systems for
Azimzadeh et al. CRISPR-Powered Microfluidics in Diagnostics: A Review of Main Applications. Chemosensors 2022, 10, 3
WO2023164694A2 (en) ONE-POT ENDONUCLEOLYTICALLY EXPONENTIATED ROLLING CIRCLE AMPLIFICATION BY CRISPR-CAS12a