CN106048080B - 一种快速筛查hpv亚型的引物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多种HPV亚型的筛查方法，特别涉及一种非诊断、治疗目的的快速筛查多种HPV亚型的引物和方法。引物为F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4或与上述引物对的核苷酸互补序列。本发明操作简单，不需要探针和饱和荧光染料即可通过熔解曲线分析方法鉴定多种HPV亚型，降低了人工和试剂成本，检测速度快且通量高，实现一种引物检测多种样本，检测过程2个小时即可完成；全程闭关操作，避免交叉污染；灵敏度好，特异性强，准确性高，重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及多种HPV亚型的筛查方法，特别涉及一种非诊断、治疗目的的快速筛查多种HPV亚型的引物和方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)为一组乳头瘤病毒科的双链环状小DNA病毒，与多种良性和恶性的粘膜和皮肤上皮肿瘤性病变相关。根据感染部位的不同将HPV分为嗜皮肤组和嗜黏膜组两大类：嗜黏膜组又根据感染后诱发病变的良恶性不同，分为诱发上皮组织恶性增生的高危型HPV和诱发上皮组织良性增生的低危型HPV，高危型HPV感染与宫颈癌及癌前病变的发生密切相关，此外还与阴道、肛门、阴唇、阴茎及口咽癌及癌前病变的发生相关，常见的高危型如HPV 16，18，31，33，35，45，52，58，68等均可引起不同程度的病变；低危型HPV通常与生殖道肛门等疣状病变相关，常见的低危型有HPV 6，11，42，43，44和81。由于HPV变异性高，目前已知的HPV分型有118种，其中2/3为嗜皮肤组HPV，嗜黏膜型仅占1/3；而慢性持续性高危型HPV感染是宫颈癌发生的主要诱因。
宫颈癌目前已成为全球第二大女性癌症，发病率及致死率都非常高，已有研究显示，在宫颈癌患者的病理检测中几乎均存在不同的高危型HPV感染，HPV感染无任何临床症状，约50％～90％的HPV感染可在感染后的数月至2年内被免疫系统清除，如果在间隔一年以上的时间连续两次检测出同一高危型的HPV DNA则被认为是持续性感染.，只有慢性持续性高危型HPV感染，才能最终演变为宫颈癌，因此HPV的筛查及分型检测在疾病的预防及诊断中起到至关重要的作用。
现阶段HPV不能在传统的细胞培养液中培养，而直接病毒学诊断技术如电子显微镜和免疫组织化学，对HPV的检测缺少敏感性和特异性，目前，临床检测HPV分型常用方法为HPV抗原抗体检测、反向点杂交法及基因芯片检测法等，但抗体的产生常出现在HPV长期感染后，且检测结果存在假阳性，其分析准确性不足，而反向点杂交法及芯片法操作复杂繁琐，价格昂贵且需要专业技术人员操作。
因此，为了减少人力物力财力的消耗，为了更加准确快速对的检测HPV的方法。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明提供一种非诊断、治疗目的的快速筛查多种HPV亚型的引物和方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种快速筛查HPV亚型的引物，引物为F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4或与上述引物对的核苷酸互补序列；
其中，F1：5'-TGTGCAGTACCAGTGACGAG-3'；
R1：5'-CTGACGGTTGGACGTTTG-3'；
F2：5'-GGTAAACACCCAACACAAGCC-3'；
R2：5'-AAGAGCGGCCTAAGCACTG-3'。
F3：5'-ACTAAGTATGCATGGACC-3'
R3：5'-ACATAGAAGGTCAACCGG-3'
F4：5'-CATCCTGAACCAACTGACCTA-3'
R4：5'-TCCTCGTCTGAGCTGTCAC-3'
所述引物对F1/R1或与F1/R1引物对核苷酸互补序列为扩增HPV 16、18、53、59、6和68型中的一种或几种的引物对。
所述引物对F2/R2或与F2/R2引物对核苷酸互补序列为扩增HPV 33、52、53和58型中的一种或几种的引物对。
所述引物对F3/R3或与F3/R3引物对核苷酸互补序列为扩增HPV 18和68型的引物对。
所述引物对F4/R4或与F4/R4引物对核苷酸互补序列为扩增HPV 33、52和58型的引物对。
一种快速筛查HPV亚型的方法，采用权利要求1所述引物对对待检测样品进行qPCR扩增，对扩增所得产物获得熔解曲线及样品的Tm值，进而检测确定待测样品HPV亚型。
所述扩增反应体系为：
所述扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火30s；循环40次。
所述熔解曲线分析反应程序为：65℃到95℃以0.2℃/步的速率进行熔解曲线分析。
所述对获得扩增所得产物获得熔解曲线，获得的熔解曲线峰型图中峰型曲线的最高点为DNA双链的半数解链温度，其所对应的横坐标温度即为其Tm值，并由产物Tm值与各HPV亚型的Tm比对，进而确定待测样品HPV亚型。
具体为：
1)引物对F1/R1或与F1核苷酸互补序列/与R1核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为76.5℃，则样本中含有HPV16。
2)引物对F1/R1或与F1核苷酸互补序列/与R1核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为79.5℃，则样本中含有HPV53。
3)引物对F1/R1或与F1核苷酸互补序列/与R1核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为86℃，则样本中含有HPV6。
4)引物对F1/R1或与F1核苷酸互补序列/与R1核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为81.5℃，则样本中含有HPV59。
5)引物对F3/R3或与F3核苷酸互补序列/与R3核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为76.2℃，则样本中含有HPV18。
6)引物对F3/R3或与F3核苷酸互补序列/与R3核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为77.8℃，则样本中含有HPV68。
7)引物对F2/R2或与F2核苷酸互补序列/与R2核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为80℃，则样本中含有HPV33。
8)引物对F4/R4或与F4核苷酸互补序列/与R4核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为75.6℃，则样本中含有HPV52。
9)引物对F4/R4或与F4核苷酸互补序列/与R4核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为74.4℃，且引物对F2/R2或与F2核苷酸互补序列/与R2核苷酸互补序列未扩增出TM值为80℃的产物，则样本中含有HPV58。
一种HPV亚型检测试剂盒，试剂盒包括所述权利要求1所述引物对、qPCR反应混合液、超纯水和阳性对照。
其中，qPCR反应混合液为SYBR super mix(来自bio-rad)；阳性对照为含有待检测HPV亚型的目的片段的质粒DNA。
含有待检测HPV亚型的目的片段的质粒DNA的制备：(1)扩增含有目的片段的靶序列(KOD-Plus-Neo(TOYOBO)试剂盒)。(2)目的片段胶回收及纯化(回收试剂盒，AXYGEN，USACode：AP-GX-50)。(3)将目的片段与载体pUC19连接(快速DNA连接试剂盒：碧云天，中国)。(4)转化宿主大肠杆菌，固体培养基培养。(5)PCR鉴定阳性克隆。(6)测序检测质粒序列质量，确保插入序列正确。
本发明的有益效果是：
1.本发明建立一种基于qPCR技术快速筛查多种HPV亚型的引物和方法，该方法是一种通过qPCR扩增检测技术得到产物，其特点是通过熔解曲线分析不同产物Tm值，本发明不需要探针及饱和荧光染料，即可完成对HPV亚型鉴定，检测速度快且通量高，其成本仅为探针花费的20％，并且实现一对引物检测多种样本，减少了样本使用量，检测过程2个小时即可完成；全程闭关操作，避免交叉污染；灵敏度好，特异性强，准确性高，重复性好；操作简单，降低了人工和试剂成本。
2.本发明所涉及的引物，对HPV 6、16、18、33、52、53、58、59和68有很好地的扩增性，并能进行亚型鉴定，有助于提高PCR的效率，有助于快速筛查HPV感染及特异性检测HPV亚型。
3.本发明所涉及的引物特异性好，除可以与HPV 6、16、18、33、52、53、58、59和68结合外，不与人基因组DNA结合，特异性扩增HPV 6、16、18、33、52、53、58、59和68的DNA，有利于提高本发明对HPV鉴定分析的正确性。
4.本发明所涉及的方法是对扩增产物进行熔解曲线分析，根据不同产物的Tm值对HPV亚型进行检测及鉴定。
附图说明
图1为本发明实施例提供的引物F3/R3或与F3核苷酸互补序列/与R3核苷酸互补序列检测标准样品的扩增曲线图；
图2为本发明实施例提供的引物F3/R3或与F3核苷酸互补序列/与R3核苷酸互补序列检测标准样品的标准化熔解曲线图；
图3为本发明实施例提供的引物F3/R3或与F3核苷酸互补序列/与R3核苷酸互补序列检测标准样品的峰型化熔解曲线图；
图4为本发明实施例提供的引物F1/R1或与F1核苷酸互补序列/与R1核苷酸互补序列检测待测样品的峰型化溶解曲线图；
图5为本发明实施例提供的引物F2/R2或与F2核苷酸互补序列/与R2核苷酸互补序列检测待测样品的峰型化溶解曲线图
图6为本发明实施例提供的引物F3/R3或与F3核苷酸互补序列/与R3核苷酸互补序列检测待测样品的峰型化溶解曲线图；
图7为本发明实施例提供的引物F4/R4或与F4核苷酸互补序列/与R4核苷酸互补序列检测待测样品的峰型化溶解曲线图；
图8为本发明实施例提供的引物特异性凝胶电泳图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
本发明方法为先从样品中提取病毒DNA作为模板，利用所设计的引物进行qPCR扩增，同时得到熔解曲线，该方法根据HRM实验原理，同一引物扩增不同亚型的样本，得到不同Tm值，从而根据Tm值鉴定HPV亚型。
实施例
(1)PCR引物
1)HPV 16、18、53、59、6和68型的引物为F1/R1或与F1核苷酸互补序列/与R1核苷酸互补序列：
根据对HPV 16、18、53、59、6和68型基因保守序列进行分析，获得引物碱基序列SEQID NO：1和SEQ ID NO：2；其，均能够特异性地扩增HPV 16、18、53、59、6和68型，其碱基序列如下所示。
SEQ ID NO：1(F1)：5'-TGTGCAGTACCAGTGACGAG-3'
SEQ ID NO：2(R1)：5'-CTGACGGTTGGACGTTTG-3'
2)HPV 33、52、53和58型引物为F2/R2或与F2核苷酸互补序列/与R2核苷酸互补序列：
根据对HPV 33、52、53和58型基因保守序列进行分析，获得的引物碱基序列SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4；其，均能够特异性地扩增HPV 33、52、53和58型，其碱基序列如下所示。
SEQ ID NO：3(F2)：5'-GGTAAACACCCAACACAAGCC-3'
SEQ ID NO：4(R2)：5'-AAGAGCGGCCTAAGCACTG-3'
3)HPV 18和68型的引物为F3/R3或与F3核苷酸互补序列/与R3核苷酸互补序列：
根据对HPV 18和68型基因保守序列进行分析，获得的引物碱基序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；其，均能够特异性地扩增HPV 18和68型，其碱基序列如下所示。
SEQ ID NO：5(F3)：5'-ACTAAGTATGCATGGACC-3'
SEQ ID NO：6(R3)：5'-ACATAGAAGGTCAACCGG-3'
4)HPV 33、52和58型引物为F4/R4或与F4核苷酸互补序列/与R4核苷酸互补序列：
根据对HPV 33、52和58型基因保守序列进行分析，获得的引物碱基序列SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8；其，均能够特异性地扩增HPV33、52和58型，其碱基序列如下所示。
SEQ ID NO：7(F4)：5'-CATCCTGAACCAACTGACCTA-3'
SEQ ID NO：8(R4)：5'-TCCTCGTCTGAGCTGTCAC-3'
(2)标准样品的制备及其标准曲线
1)标准样品的制备：
为了验证本发明方法可行性与可靠性，同时构建标准质粒，作为后续对待测样品检测的阳性对照，HPV各型标准品可根据现有技术制备获得。
2)标准样qPCR扩增及操作步骤
分别以上述获得的HPV 6、16、18、33、52、53、58、59和68型标准样品为DNA模板，使用AXYGEN(USA)质粒提取试剂盒提取并纯化质粒，nanodrop超微量分光光度计计算定量拷贝数，梯度稀释成107，106，105，104，103，102，101数量级，分别进行qPCR扩增反应和分析；
以引物对引物F3/R3或与F3核苷酸互补序列/与R3核苷酸互补序列扩增18为例；
qPCR扩增反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火30s；循环40次；对上述获得扩增产物并以65℃到95℃以0.2℃/步的速率获得熔解曲线；并由其扩增曲线可得到该引物对HPV18的检测灵敏度达到102(参见图1)。
3)标准样品熔解曲线结果分析
通过上述引物F3/R3扩增HPV18标准样品获得的熔解曲线，将其峰型图中峰型曲线的最高点为DNA双链的半数解链温度，其所对应的横坐标温度即为扩增产物Tm值为76.2℃(参见图2和图3)；
(3)待测样品制备及亚型鉴定
1)取40份待测样本，分别提取各自DNA：使用QIAGEN(德国)DNA MINI KIT提取组织的protocol进行DNA提取，最后使用100微升AE buffer溶解DNA，即为待测样本DNA溶液。所得到的DNA样本溶液可直接进行后续qPCR HPV分子检测
2)分别以提取的DNA为模板，分别进行qPCR扩增，扩增反应体系为：
其中引物F及引物R分别为F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4、与F1核苷酸互补序列/与R1核苷酸互补序列或与F2核苷酸互补序列/与R2核苷酸互补序列、与F3核苷酸互补序列/与R3核苷酸互补序列或与F4核苷酸互补序列/与R4核苷酸互补序列。
扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火30s；循环40次。对上述获得扩增产物并以65℃到95℃以0.2℃/步的速率获得熔解曲线。
3)对扩增产物进行熔解曲线分析
通过对40份待测样本获得的熔解曲线，将其峰型图中峰型曲线的最高点为DNA双链的半数解链温度，其所对应的横坐标温度即为扩增产物Tm值，并根据Tm值得差异，确定可能的HPV亚型。
1)引物对F1/R1或与F1核苷酸互补序列/与R1核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为76.5℃，则样本中含有HPV16。
2)引物对F1/R1或与F1核苷酸互补序列/与R1核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为79.5℃，则样本中含有HPV53。
3)引物对F1/R1或与F1核苷酸互补序列/与R1核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为86℃，则样本中含有HPV6。
4)引物对F1/R1或与F1核苷酸互补序列/与R1核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为81.5℃，则样本中含有HPV59。
5)引物对F3/R3或与F3核苷酸互补序列/与R3核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为76.2℃，则样本中含有HPV18。
6)引物对F3/R3或与F3核苷酸互补序列/与R3核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为77.8℃，则样本中含有HPV68。
7)引物对F2/R2或与F2核苷酸互补序列/与R2核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为80℃，则样本中含有HPV33。
8)引物对F4/R4或与F4核苷酸互补序列/与R4核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为75.6℃，则样本中含有HPV52。
9)引物对F4/R4或与F4核苷酸互补序列/与R4核苷酸互补序列经过qPCR扩增后，其产物TM值为74.4℃，且引物对F2/R2或与F2核苷酸互补序列/与R2核苷酸互补序列未扩增出TM值为80℃的产物，则样本中含有HPV58。
由上述可见引物对F1/R1或与F1核苷酸互补序列/与R1核苷酸互补序列经过qPCR扩增待测样本，可检测出HPV16、18、53、59和6型，结果见图4。
引物对F2/R2或与F2核苷酸互补序列/与R2核苷酸互补序列经过qPCR扩增待测样本，可检测出HPV 52、53、58和33型，结果见图5。
引物对F3/R3或与F3核苷酸互补序列/与R3核苷酸互补序列经过qPCR扩增待测样本，可检测出HPV 18和68型，结果见图6。
引物对F4/R4或与F4核苷酸互补序列/与R4核苷酸互补序列经过qPCR扩增待测样本，可检测出HPV33、52和58型，结果见图7。同时由上述Tm值鉴定待测样本亚型，并对鉴定的样本进行反向点杂交法验证，结果显示，该引物组检测出的HPV亚型与反向点杂交法检测(向华国,曾锦婷,何婉意,黎国.PCR-反向点杂交基因分型与实时荧光定量PCR检测人乳头瘤病毒研究[J].中国病原生物学杂志.2012(05))结果一致(参见表1)。
表1 40例待测样本检测结果
| 检出HPV亚型 | 本专利引物组检测例数 | 反向点杂交检测例数 |
| HPV 6 | 2 | 2 |
| HPV 16 | 11 | 11 |
| HPV 18 | 8 | 8 |
| HPV 33 | 2 | 2 |
| HPV 52 | 3 | 3 |
| HPV 53 | 1 | 1 |
| HPV 58 | 4 | 4 |
| HPV 59 | 2 | 2 |
| HPV 68 | 3 | 3 |
| 其他亚型 | 4 | 4 |
| 总数 | 40 | 40 |
(4)特异性实验
对上述建立的引物作特异性检测，其中人β-actin的引物核苷酸序列如下所示。
P1：5'-GGCAAAGTTCCCAAGCACAG-3'
P2：5'-AATGAGTGACTGCCTGGGTG-3'
提取人急性B淋巴白血病细胞DNA，以所提取的DNA为模板，分别用上述实施例的F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4引物及β-actin进行PCR反应，反应步骤如下：
将PCR产物进行凝胶电泳分析(参见图8)。
由图8可知，其中，M为Marker(D15000+2000DNA marker)，泳道1-4分别为1：阴性对照，2：β-actin扩增产物，3：引物F1/R1扩增产物，4：引物F2/R2扩增产物，5：引物F3/R3扩增产物，6：引物F4/R4扩增产物，凝胶电泳结果显示，只有β-actin泳道有电泳条带，而其它样品均未出现电泳条带，表明所设计的引物特异性高适合用于HPV筛查。
Claims (6)
1.一种快速筛查HPV亚型的引物组，其特征在于：引物为F1/ R1、F2/ R2、F3/R3、F4/R4或与上述引物对的核苷酸互补序列；
其中，F1：5'- TGTGCAGTACCAGTGACGAG -3'；
R1：5'- CTGACGGTTGGACGTTTG -3'；
F2：5'- GGTAAACACCCAACACAAGCC -3'；
R2：5'- AAGAGCGGCCTAAGCACTG -3'。
F3：5'- ACTAAGTATGCATGGACC -3'
R3：5'- ACATAGAAGGTCAACCGG -3'
F4：5'- CATCCTGAACCAACTGACCTA -3'
R4：5'- TCCTCGTCTGAGCTGTCAC -3'。
2.按权利要求1所述的快速筛查HPV亚型的引物组，其特征在于：所述引物对F1/ R1或与F1/ R1引物对核苷酸互补序列为扩增HPV 16、18、53、59、6和68型中的一种或几种的引物对。
3.按权利要求1所述的快速筛查HPV亚型的引物组，其特征在于：所述引物对F2/ R2或与F2/ R2引物对核苷酸互补序列为扩增HPV 33、52、53和58型中的一种或几种的引物对。
4.按权利要求1所述的快速筛查HPV亚型的引物组，其特征在于：所述引物对F3/ R3或与F3/ R3引物对核苷酸互补序列为扩增HPV 18和68型的引物对。
5.按权利要求1所述的快速筛查HPV亚型的引物组，其特征在于：所述引物对F4/ R4或与F4/ R4引物对核苷酸互补序列为扩增HPV 33、52和58型的引物对。
6.一种 HPV 亚型检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括所述权利要求1所述引物组、qPCR反应混合液、超纯水和阳性对照。
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