CN113063943A - 用于检测高危型hpv病毒的试剂盒及检测方法 - Google Patents

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CN113063943A CN202110362640.7A CN202110362640A CN113063943A CN 113063943 A CN113063943 A CN 113063943A CN 202110362640 A CN202110362640 A CN 202110362640A CN 113063943 A CN113063943 A CN 113063943A
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于检测高危型HPV病毒的试剂盒及检测方法。用于检测高危型HPV病毒的试剂盒是由恒温扩增区、金标制备区和胶体金试纸条组成；恒温扩增区是由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂是由解旋酶、单链DNA结合蛋白、Klenow‑I DNA聚合酶、四种dNTP混合物和buffer组成，第二试剂为HPV特异性扩增引物溶液；金标制备区包括胶体金标记的dCas9蛋白溶液和gRNA溶液；胶体金试纸条是由被衬底板、样品垫、金标垫、基膜和吸水垫组成，被衬底板上从左到右依次设置有样品垫、金标垫、基膜和吸水垫。本发明操作便捷并有效提高了检测特异性及反应灵敏度。

Description

用于检测高危型HPV病毒的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于检测高危型HPV病毒的试剂盒及检测方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是球形DNA病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。在世界范围妇女中，宫颈癌(CC)及其癌前病变是列第三位的非常普遍的恶性疾病。最常见的宫颈癌发病因素为高危型HPV感染，其中HPV16、HPV18型与宫颈癌发病的关系最为密切。HPV16感染主要导致宫颈鳞癌，HPV18感染主要导致宫颈腺癌。我国宫颈癌新发病例约为6.2万例，占全球新发病例的12％，死亡病例约3万例，占全球死亡病例的11％。现已明确宫颈癌与高级别宫颈鳞状上皮内病变(HSIL，包括CINⅡ/Ⅲ级)的发生、发展主要由高危型HPV持续感染所致。在发达国家由于宫颈癌筛查制度的建立与完善，子宫颈浸润癌的发病率和死亡率已大幅度下降，但在广大发展中国家，要在短期内进行大规模、覆盖广泛、高质量的宫颈癌普查存在较大困难。我国总体人群筛查率处于低水平，2010年全国城市平均子宫颈癌筛查率为29.1％，农村仅为16.9％。HPV DNA检测多采用qPCR技术以提高HPV检出率，但其检测成本相对较高，有特殊检测设备的要求，限制了其临床应用。
核酸检测技术近年来发展迅速，尤其是在分子诊断POCT领域。其中，荧光PCR(qPCR)特异性强、灵敏度高，可以定量对病原体进行检测，但热循环过程需要热循环仪，热循环仪体积大、价格高、耗时长，使其在基层的推广和现场检测受到了极大的限制。恒温扩增技术不需要加热循环，在恒定温度下即可使新合成的DNA模板退火变性而引发进一步扩增反应，具备价格低廉、检测快速等优势，更适合于进行基层推广和现场检测。恒温扩增技术中依赖解旋酶的恒温基因扩增(Helicase-dependent amplification,HDA)是美国NewEngland Biolabs的研究人员模拟动物体内DNA的复制机制，发明的一种体外恒温基因扩增技术，与其它恒温扩增技术相比，引物设计简单，操作便捷，不需要昂贵的PCR仪，更适合在基层实验室推广应用。
先前研究证实，CRISPR/Cas系统是近年来兴起的一项靶向基因编辑工具，已广泛用于动植物、细菌、真菌、寄生虫等的靶向基因编辑。在众多类型的CRISPR/Cas系统当中，CRISPR/dCas9系统已被证实可用于核酸检测，具备灵敏高效、制备简单、成本低廉等诸多优势。但目前尚无将其应用于高危型HPV DNA检测的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测高危型HPV病毒的试剂盒，灵敏性高、特异性强且价格低廉；本发明同时提供了检测方法。
本发明所述的用于检测高危型HPV病毒的试剂盒是由恒温扩增区、金标制备区和胶体金试纸条组成；
恒温扩增区是由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂是由解旋酶、单链DNA结合蛋白、Klenow-I DNA聚合酶、四种dNTP混合物和buffer组成，第二试剂为HPV特异性扩增引物溶液；
金标制备区包括胶体金标记的dCas9蛋白溶液和gRNA溶液；
胶体金试纸条是由被衬底板、样品垫、金标垫、基膜和吸水垫组成，被衬底板上从左到右依次设置有样品垫、金标垫、基膜和吸水垫；
基膜上从左到右依次设置有T1线、T2线和C线，其中，C线上包被有dCas9抗体，T1线上包被有16型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物，T2线上包被有18型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物。
所述的HPV特异性扩增引物来源于HPV基因组的多态性的L1区域内。
所述的HPV特异性扩增引物为16型HPV的扩增引物和18型HPV的扩增引物的混合物，16型HPV的扩增引物为F：CACAAACATATATTATCATGC和R：CAGTATCAACCATATCACCATC，18型HPV的扩增引物为F：CACAAGCATATTTTATCATGC和R：CAGTATCTACCATATCACCATC。
所述的胶体金标记的dCas9蛋白溶液中dCas9具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。
所述的gRNA为HPV16 gRNA和HPV18 gRNA的混合物，HPV16 gRNA和HPV18 gRNA的摩尔比为1：1，HPV16 gRNA序列为GTAGGTCGTGGTCAGCCATT，HPV18 gRNA序列为GCCCAGTGTTCCCCAATAGC。HPV16 gRNA序列如SEQ ID NO.5所示，HPV18 gRNA序列如SEQ IDNO.6所示。
所述的金标制备区还包括无RNase1.5mlEP管和无RNase1ml带刻度吸管。
所述的16型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物中16型HPV基因片段序列为AAAAAACCTAACAATAACAAAATATTAG，如SEQ ID NO.7所示。
所述的18型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物中18型HPV基因片段序列为CCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA，如SEQ ID NO.8所示。
所述的dCas9抗体为购自Abcam的货号为ab191468的抗体。
所述的第一试剂组成如下：
Figure BDA0003006217520000031
buffer为25mmol/L Tris-HCL、12mmol/L KCL、50mmol/L NaCL和5mmol/L MgSO4，pH＝7.4。
采用本发明所述的用于检测高危型HPV病毒的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
(1)从待检样品中提取HPV病毒基因组；
(2)将HPV病毒基因组、第一试剂和第二试剂混合后进行恒温扩增，得到扩增产物；
(3)将胶体金标记的dCas9蛋白溶液和gRNA溶液混合，恒温孵育后滴入金标垫中；
(4)将步骤(2)得到的扩增产物滴入样品垫中，待15-30min后观察结果；
(5)结果判断：
如果T1线和C线同时出现，则为16型HPV阳性；
如果T2线和C线同时出现，则为18型HPV阳性；
如果只有C线出现，则为16型HPV阴性，18型HPV阴性；
如果C线不出现，则结果无效。
步骤(2)中所述的HPV病毒基因组、第一试剂和第二试剂的体积比为5-8:40-50:5-8。
步骤(2)中所述的恒温扩增温度为37℃，恒温扩增时间为75-90min。
步骤(3)中所述的胶体金标记的dCas9蛋白溶液和gRNA溶液的体积比为1:1。
步骤(3)中所述的恒温孵育温度为37℃，恒温孵育时间为30-35min。
HPV病毒基因组的提取是采用上海康朗生物科技有限公司的DNA/RNA提取试剂盒进行提取，所得HPV病毒基因组DNA无蛋白、核酸酶或其它杂质的污染，可直接用于PCR、酶切、杂交、反转录等分子生物学实验。
本发明采用依赖解旋酶的恒温扩增技术(HDA)，先用解旋酶解开双链DNA，再依靠单链DNA结合蛋白(SSB)与模板单链结合，使模板单链处于单链状态并保护它的完整性，引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶催化下扩增，新生成的双链DNA产物作为底物进入下一轮扩增。本发明提供了一种简单有效，不需要复杂设备，在基层实验室就能推广应用的快速简便的核酸扩增技术。
本发明利用CRISPR/dCas9基因编辑技术中失去DNA切割活性的dCas9蛋白，通过dCas9蛋白在特定gRNA(crRNA)介导下与16型和18型HPV基因的特异结合，提供一种灵敏性高、特异性强、价格低廉且可在数分钟内对大量待测DNA样本进行快速筛查的高危型HPV检测试剂盒。
本发明利用dCas9-gRNA精确识别目标DNA序列的能力，筛选到特异靶向16型和18型HPV保守基因序列片段且亲和力强的gRNA，开创性的以dCas9-gRNA与DNA特异识别的方式取代了常用的通过抗原抗体结合所开发的胶体金检测，从而避免了因抗体灵敏性和特异性差异所导致的检测结果差异，对找不到抗体的HPV病毒同样有效。将胶体金标记的dCas9蛋白溶液和gRNA(crRNA)在检测前以体积比1：1混合制备成dCas9-gRNA蛋白核酸复合物，滴入到金标垫中，现用现配，有效保证了产品的稳定性和灵敏度。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种采用恒温扩增技术联合CRISPR/dCas9技术检测高危型HPV病毒的检测试剂盒，以恒温扩增技术取代了常规的PCR反应程序，并以dCas9-gRNA与DNA特异识别的方式取代了常用的通过抗原抗体结合所开发的胶体金检测，操作便捷，并有效提高了检测特异性及反应灵敏度。
附图说明
图1是本发明的用于检测高危型HPV病毒的试剂盒的结构示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
用于检测高危型HPV病毒的试剂盒是由恒温扩增区、金标制备区和胶体金试纸条组成。
恒温扩增区是由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂是由10ug/mL解旋酶、5ug/mL单链DNA结合蛋白、4U/ml Klenow-I DNA聚合酶、50umol/L四种dNTP混合物和buffer(25mmol/LTris-HCL、12mmol/L KCL、50mmol/L NaCL、5mmol/L MgSO4，pH＝7.4)组成，第二试剂为2umol/L的HPV特异性扩增引物溶液。
HPV特异性扩增引物为16型HPV的扩增引物和18型HPV的扩增引物的混合物，16型HPV的扩增引物为F：CACAAACATATATTATCATGC和R：CAGTATCAACCATATCACCATC，18型HPV的扩增引物为F：CACAAGCATATTTTATCATGC和R：CAGTATCTACCATATCACCATC。16型HPV的扩增引物和18型HPV的扩增引物的摩尔比为1:1。16型HPV的扩增引物、18型HPV的扩增引物与无菌水配成浓度为2umol/L的HPV特异性扩增引物溶液。
金标制备区是由胶体金标记的dCas9蛋白溶液、gRNA(crRNA)溶液、无RNase1.5mlEP管和无RNase1ml带刻度吸管组成。
胶体金标记的dCas9蛋白溶液的制备方法是将0.01wt.％的HAuCl4溶液加热煮沸后加入1wt.％的柠檬酸三钠溶液直至溶液的颜色完全变为透明的红色时，继续回流10min后停止加热，冷却至室温，即得到胶体金；取1mL制取好的胶体金，用1wt.％的K2CO3调节pH值到8.0，加入15μg的dCas9蛋白，混合均匀，室温反应40min；加入5wt.％的BSA至终浓度为0.1wt.％，静置30min；先用低速(1500×g)离心15分钟，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀；然后用10000×g离心30分钟；仔细吸出上清，沉淀物用0.1mL含1wt.％BSA的0.1M PBS(pH7.4)复溶，加入5wt.％叠氮钠至终浓度为0.05wt.％，4℃保存，即得。
胶体金标记的dCas9蛋白溶液中dCas9的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
gRNA(crRNA)溶液的制备方法是将30ng/mL的gRNA(crRNA)溶解在含有3mol/L的NaAc且pH为5.2的缓冲液中，即得gRNA(crRNA)溶液。
gRNA(crRNA)溶液中gRNA为HPV16 gRNA和HPV18 gRNA的混合物，HPV16 gRNA和HPV18 gRNA的摩尔比为1：1，HPV16 gRNA序列为GTAGGTCGTGGTCAGCCATT，HPV18 gRNA序列为GCCCAGTGTTCCCCAATAGC。HPV16 gRNA序列如SEQ ID NO.5所示，HPV18 gRNA序列如SEQ IDNO.6所示。
胶体金试纸条是由被衬底板、样品垫、金标垫、基膜和吸水垫组成，被衬底板上从左到右依次设置有样品垫、金标垫、基膜和吸水垫；基膜上从左到右依次设置有T1线、T2线和C线，其中，C线上包被有dCas9抗体，T1线上包被有16型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物，T2线上包被有18型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物。
16型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物中16型HPV基因片段序列为AAAAAACCTAACAATAACAAAATATTAG，如SEQ ID NO.7所示。
18型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物中18型HPV基因片段序列为CCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA，如SEQ ID NO.8所示。
包被有16型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物的T1线的制备方法是将16型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物溶液以20-50μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在T1线上干燥，即得；其中，16型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物溶液的制备方法是将合成的16型HPV基因片段400-600ng加入到8-12wt.％牛血清白蛋白5ul中室温孵育30分钟，即得16型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物溶液。
包被有18型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物的T2线的制备方法是将18型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物溶液以20-50μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在T2线上干燥，即得；其中，18型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物溶液的制备方法是将合成的18型HPV基因片段400-600ng加入到8-12wt.％牛血清白蛋白5ul中室温孵育30分钟，即得18型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物溶液。
dCas9抗体为购自Abcam的货号为ab191468的抗体。
包被有dCas9抗体的C线的制备方法是将0.1-5mg/mL的dCas9抗体溶液以20-50μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在C线上干燥，即得。
T1线和T2线的间距为2.0-5.0mm，C线和T2线的间距为2.0-5.0mm。
采用用于检测高危型HPV病毒的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
(1)应用上海康朗生物科技有限公司的DNA/RNA提取试剂盒，从患者的宫颈分泌物中提取HPV病毒基因组；
(2)将提取的HPV病毒基因组5ul、第一试剂40ul和第二试剂5ul混合，37℃恒温扩增80min，得到扩增产物；
(3)将胶体金标记的dCas9蛋白溶液50ul和gRNA(crRNA)溶液50ul用无RNase1ml带刻度吸管加入至无RNase1.5mlEP管中混合，37℃恒温孵育30min，得到胶体金标记的dCas9-gRNA蛋白核酸复合物，将获得的胶体金标记的dCas9-gRNA蛋白核酸复合物100ul滴入至金标垫中；
(4)将步骤(2)得到的扩增产物20ul滴入样品垫中，待15min后观察结果；
(5)结果判断：
如果T1线和C线同时出现，则为16型HPV阳性；
如果T2线和C线同时出现，则为18型HPV阳性；
如果只有C线出现，则为16型HPV阴性，18型HPV阴性；
如果C线不出现，则结果无效。
灵敏度与特异性实验：
从用RT-PCR方法检测16型HPV感染呈阳性的拭子标本中选取34份，18型HPV感染呈阳性的拭子标本中选取39份，呈阴性的拭子标本中选取85份，并用本发明的试剂盒进行检测，检测结果见表1和表2。
表1用本发明的试剂盒检测16型HPV-PCR方法呈阳性的拭子标本的检测结果
Figure BDA0003006217520000061
由表1可知，在34份16型HPV-PCR方法呈阳性的标本中，本发明试剂盒检测结果显示33份阳性；在85份PCR方法呈阴性的标本中，本发明试剂盒检测结果显示83份呈16型HPV阴性。
表2用本发明的试剂盒检测18型HPV-PCR方法呈阳性的拭子标本的检测结果
Figure BDA0003006217520000071
由表2可知，在39份18型HPV-PCR方法呈阳性的标本中，本发明试剂盒检测结果显示36份阳性；在85份PCR方法呈阴性的标本中，本发明试剂盒检测结果显示84份呈18型HPV阴性。
与RT-PCR相比对，本发明试剂盒检测的灵敏度、特异性、阳性预测值及阴性预测值见表3。
表3本发明试剂盒检测的灵敏度、特异性、阳性预测值及阴性预测值
检测方法 灵敏度 特异性 阳性预测值 阴性预测值
16型HPV检测 33/34＝97.1％ 83/85＝97.6％ 33/35＝94.3％ 83/84＝98.8％
18型HPV检测 36/39＝92.3％ 84/85＝98.8％ 36/37＝97.3％ 84/87＝96.6％
计算公式：
灵敏度＝真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％。
特异性＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％。
阳性预测值＝真阳性人数/(真阳性人数+假阳性人数)*100％。
阴性预测值＝真阴性人数/(真阴性人数+假阴性人数)*100％。
以上实施例中所用的试剂均为商购得到，例如：dCas9蛋白购自广州博徕斯生物科技股份有限公司(Bio-lifesci)；dCas9抗体购自Abcam，货号为ab191468，16型HPV基因片段、18型HPV基因片段和gRNA由上海生工生物工程股份有限公司合成，DNA/RNA提取试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司，单链DNA结合蛋白购自北京百奥莱博科技有限公司，解旋酶、Klenow-I DNA聚合酶、四种dNTP混合物和buffer均购自深圳子科生物。
序列表
<110> 淄博市中心医院
<120> 用于检测高危型HPV病毒的试剂盒及检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
cacaaacata tattatcatg c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
cagtatcaac catatcacca tc 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
cacaagcata ttttatcatg c 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
cagtatctac catatcacca tc 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
gtaggtcgtg gtcagccatt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
gcccagtgtt ccccaatagc 20
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 7
aaaaaaccta acaataacaa aatattag 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
cctgcaggtg gtggcaataa gcaggata 28
<210> 9
<211> 1368
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 9
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys
1010 1015 1020
Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser
1025 1030 1035 1040
Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu
1045 1050 1055
Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile
1060 1065 1070
Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser
1075 1080 1085
Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly
1090 1095 1100
Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile
1105 1110 1115 1120
Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser
1125 1130 1135
Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly
1140 1145 1150
Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile
1155 1160 1165
Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala
1170 1175 1180
Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys
1185 1190 1195 1200
Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser
1205 1210 1215
Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr
1220 1225 1230
Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His
1250 1255 1260
Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val
1265 1270 1275 1280
Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys
1285 1290 1295
His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu
1300 1305 1310
Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp
1315 1320 1325
Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp
1330 1335 1340
Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile
1345 1350 1355 1360
Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1365

Claims (10)

1.一种用于检测高危型HPV病毒的试剂盒，其特征在于由恒温扩增区、金标制备区和胶体金试纸条组成；
恒温扩增区是由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂是由解旋酶、单链DNA结合蛋白、Klenow-IDNA聚合酶、四种dNTP混合物和buffer组成，第二试剂为HPV特异性扩增引物溶液；
金标制备区包括胶体金标记的dCas9蛋白溶液和gRNA溶液；
胶体金试纸条是由被衬底板、样品垫、金标垫、基膜和吸水垫组成，被衬底板上从左到右依次设置有样品垫、金标垫、基膜和吸水垫；
基膜上从左到右依次设置有T1线、T2线和C线，其中，C线上包被有dCas9抗体，T1线上包被有16型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物，T2线上包被有18型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物。
2.根据权利要求1所述的用于检测高危型HPV病毒的试剂盒，其特征在于所述的HPV特异性扩增引物为16型HPV的扩增引物和18型HPV的扩增引物的混合物，16型HPV的扩增引物为F：CACAAACATATATTATCATGC和R：CAGTATCAACCATATCACCATC，18型HPV的扩增引物为F：CACAAGCATATTTTATCATGC和R：CAGTATCTACCATATCACCATC。
3.根据权利要求1所述的用于检测高危型HPV病毒的试剂盒，其特征在于所述的胶体金标记的dCas9蛋白溶液中dCas9具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的用于检测高危型HPV病毒的试剂盒，其特征在于所述的gRNA为HPV16 gRNA和HPV18 gRNA的混合物，HPV16 gRNA和HPV18 gRNA的摩尔比为1：1，HPV16 gRNA序列为GTAGGTCGTGGTCAGCCATT，HPV18 gRNA序列为GCCCAGTGTTCCCCAATAGC。
5.根据权利要求1所述的用于检测高危型HPV病毒的试剂盒，其特征在于所述的金标制备区还包括无RNase1.5mlEP管和无RNase1ml带刻度吸管。
6.根据权利要求1所述的用于检测高危型HPV病毒的试剂盒，其特征在于所述的16型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物中16型HPV基因片段序列为AAAAAACCTAACAATAACAAAATATTAG。
7.根据权利要求1所述的用于检测高危型HPV病毒的试剂盒，其特征在于所述的18型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物中18型HPV基因片段序列为CCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA。
8.一种采用权利要求1-7任一所述的用于检测高危型HPV病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)从待检样品中提取HPV病毒基因组；
(2)将HPV病毒基因组、第一试剂和第二试剂混合后进行恒温扩增，得到扩增产物；
(3)将胶体金标记的dCas9蛋白溶液和gRNA溶液混合，恒温孵育后滴入金标垫中；
(4)将步骤(2)得到的扩增产物滴入样品垫中，待15-30min后观察结果；
(5)结果判断：
如果T1线和C线同时出现，则为16型HPV阳性；
如果T2线和C线同时出现，则为18型HPV阳性；
如果只有C线出现，则为16型HPV阴性，18型HPV阴性；
如果C线不出现，则结果无效。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的恒温扩增温度为37℃，恒温扩增时间为75-90min。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于步骤(3)中所述的恒温孵育温度为37℃，恒温孵育时间为30-35min。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117074668A (zh) * 2022-10-31 2023-11-17 安徽艾赛尔智能科技有限公司 Hpv病毒分型检测试剂盒及其制备方法

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