CN116970743A - 无核酸提取等温扩增结合CRISPR/Cas12a对LSDV的DNA和RNA检测试剂盒 - Google Patents

无核酸提取等温扩增结合CRISPR/Cas12a对LSDV的DNA和RNA检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无核酸提取等温扩增结合CRISPR/Cas12a对LSDV的DNA和RNA检测试剂盒，在室温下，裂解液在3min内完成对样本的裂解，释放核酸。快速裂解液简化了核酸提取和纯化步骤，并缩短了检测时间。等温扩增技术RT‑ERA和依赖Bst 3.0DNA Polymerase的LAMP实现对DNA和RNA的扩增，此特性实现了病毒侵染的早期检测。CRISPR/Cas12a系统对扩增产物特异性地识别并实现二次信号放大来增强方法的特异性和灵敏度。基于裂解液的RT‑ERA‑CRISPR/Cas12a和LAMP‑CRISPR/Cas12a检测平台的检测限低至2.169×101copies·μL‑1和1.29×10‑ 1TCID50。两大检测平台不需要热循环仪器，在等温条件下就可以快速和灵敏地完成核酸提取、扩增和检测。因此，两种方法对病毒的识别和监测、海关口岸、养殖场、基层动物疫病防控机构的现场快速检查具有重要意义。

Description

无核酸提取等温扩增结合CRISPR/Cas12a对LSDV的DNA和RNA 检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物病毒检测领域，具体涉及两种等温扩增技术RT-ERA和LAMP以及CRISPR/Cas12a系统的检测方法。
背景技术
牛结节性皮肤病病毒(LSDV)引起牛结节性皮肤病，是一种急性或者亚急性的传染病。患病牛会发烧，厌食，淋巴肿大，有皮肤结节，产奶量急剧下降，甚至不育和流产。LSDV传染性极强并且发病率高，给畜牧业和国际贸易带来了巨大的损失，甚至对小农户产生致命打击。世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health)将其归类为须报告的动物流行性疾病，中国农业部将其归类为2类动物疫病。然而，目前还没有明确的有效的治疗方法，因此牛和潜在携带者的临床诊断和隔离在感染预防和控制中起着至关重要的作用。对病毒的监测对于识别和控制病毒感染和传播变得越来越重要。
目前，聚合酶链反应(PCR)以及以PCR为基础的变温扩增是主要的LSDV检测手段，比如实时荧光定量PCR(qPCR)和巢式PCR。但他们都需要依靠精密的热循环器和训练有素的人员。这些对技术人员、昂贵的仪器和超净工作台的要求是对大规模检测和实时检测的挑战，特别是在资源有限的地区。近年来，等温扩增作为一种简便的核酸检测方法得到了发展。尤其是环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)和重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)以及酶促重组等温扩增技术(Enzymatic Recombinase Amplification，ERA)。LAMP依赖4个引物和Bst DNA polymerase在60-65℃靶标6个区域。RPA和ERA利用重组酶、单链结合蛋白以及DNA polymerase在37℃快速扩增DNA。据报道LAMP和ERA以及RPA灵敏度与PCR相似。由于他们在等温条件下反应不依赖大型热循环仪器，快速和灵敏的特点，很快成为受欢迎的DNA扩增技术。相比与以PCR为系列的扩增方法，等温扩增克服了技术和经济上的严格要求以及耗时长的缺点，他们成为了田间友好型检测方法。
扩增后的检测方法对检测的灵敏度和特异性有很大影响。通常采用荧光染料或者探针。但研究表明荧光染料可能会抑制双链DNA或者RNA的扩增。并且荧光染料不能解决非特异性扩增的问题，很容易产生假阳性。而探针方法仅能线性放大，在灵敏度上没有好的提升。CRISPR/Cas12a系统凭借其顺式切割和反式切割活性可以提高灵敏度和特异性。具体而言，Cas12a通过PAM位点和crRNA互补的方式找到靶标。结合靶标后，Cas12a的两大活性被激活，分别切割靶标和附近任意的单链DNA。其特异地识别靶标，可以识别正确的扩增产物，很大程度上解决了非特异性扩增带来的假阳性问题。CRISPR/Cas12a的反式切割活性实现了信号放大的目的，单个靶标激活Cas12a去切割多个单链DNA。因此，CRISPR/Cas12a与等温扩增技术相结合是特异的、灵敏的和简便的核酸检测方法，是非常适合point-of-care检测。
然而复杂的DNA或RNA提取程序和较长的周转时间限制了这些方法在快速和现场病毒检测中的应用。核酸提取是核酸检测的重要前提。由于多数聚合酶对pH、温度、和扩增抑制剂敏感。因此目前的核酸扩增或者核酸检测所用的试剂对核酸的纯度有高的要求。具体而言，未经过纯化的样本中带有大量的扩增抑制剂及干扰物质，甚至蛋白酶，使得聚合酶失活或者活性降低。为了降低干扰，各类核酸提取和纯化的试剂盒以及方法不断发展。比如，带硅胶膜的试管(GeneJET Whole Blood isolation kit,Thermo Scientific)、无硅胶膜的单管提取(KAPA Express Extract Kit)和苯酚-氯仿提取。研究表明，单管的效果最好。依据此，建立了单管萃取用于牛产前性别的无创的qPCR方法。另外，为了降低成本，一些自制的裂解液被开发，比如利用蛋白酶K和EDTA裂解组织，但是蛋白酶K对于多酶扩增体系是有损害的，并且需要很长的孵育时间。还有高温提取方法，比如75℃的高温或者phosphate-buffered saline(PBS,pH＝7.4)在98℃孵育10min用于释放核酸。这些方法需要额外的步骤来提高温度达到核酸释放的目的。并且方法需要核酸粗纯化的步骤。这是耗时和耗力的。而在另一项研究中表明，酸碱裂解方法的效果要高于高温裂解。但是强酸强碱对后续的步骤或多或少有影响。因此，研究新型的无需高温、不影响扩增的核酸提取免纯化的方法对核酸检测是至关重要的。
发明内容
本发明开发了无核酸提取的等温扩增结合CRISPR/Cas12a对牛结节性皮肤病病毒DNA和RNA检测试剂盒。裂解液在室温条件下快速裂解样本，释放核酸，无需繁冗的核酸提取和纯化步骤。等温扩增RT-ERA技术利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶快速地扩增DNA。此外，RT-ERA还包含反转录酶，因此它可以同时扩增DNA和RNA。在病毒侵染细胞的过程中，通常首先利用细胞中的原理大量转录RNA和翻译出复制DNA需要的蛋白。因此RNA是病毒的早期检测的重要靶标。另外，利用Bst 3.0DNAPolymerase进行LAMP反应，它不仅具有更快的DNA扩增效率，且具有RNA扩增能力。对扩增抑制剂有更大的耐受力。因此RT-ERA和LAMP均可以扩增DNA和RNA。这在病毒的早期检测非常重要。此外，CRISPR/Cas12a系统被介导成为终端信号输出模式，来提高方法的特异性和灵敏度。因此，依赖裂解液的RT-ERA-CRISPR/Cas12a和LAMP-CRISPR/Cas12a的实际检测限低至2.169×101copies·μL-1和1.29×10- 1TCID50。快速室温裂解液分别与RT-ERA-CRISPR/Cas12a和LAMP-CRISPR/Cas12a检测平台结合，极大地简化了实验步骤，节省了时间和试剂成本。在等温条件下，两大检测平台可以快速地、特异地和灵敏地检测LSDV，方法在核酸检测中具有广阔的应用前景。目前国内外尚无基于快速室温裂解液的RT-ERA-CRISPR/Cas12a和LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法。因此，建立了室温快速的裂解液结合等温、快速和灵敏的检测方法对病毒的早期检测有重要意义。
为获得对LSDV更快速和灵敏的检测方法，本发明提供了基于快速室温裂解液的RT-ERA-CRISPR/Cas12a和LAMP-CRISPR/Cas12a的两大检测平台准确鉴定LSDV。第一个目的是选择和等温扩增兼容的室温、快速的裂解液，可直接用于扩增，无需核酸提取和纯化；第二个目的是基于以上引物和crRNA构建可以同时扩增DNA和RNA的等温扩增方法，实现病毒的早期检测，并不依赖大型精准的热循环仪器，降低成本。第三个目的是为提高灵敏度，构建快速、灵敏和特异的方法用于LSDV检测。
为了实现上述第一个目的，本发明采用的技术方案是：无核酸提取等温扩增结合CRISPR/Cas12a对LSDV的DNA和RNA检测试剂盒，包括裂解体系中的裂解缓冲液和稳定缓冲液，等温扩增结合CRISPR/Cas12a平台中的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的F3引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的B3引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的FIP引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的BIP引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的crRNA和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示ssDNAreporter。
所述裂解体系包括2-40μL血液样本或者细胞悬液、20μL裂解液和20μL稳定液。裂解体系包括以下步骤：
裂解样本：RoomTemp Sample Lysis Kit包含裂解液和稳定液。2-40μL血液样本或者细胞悬液添加到20μL裂解液(Lysis Buffer)中，涡旋混匀，低速瞬时离心收集至离心管底，室温放置3min。加入20μL稳定液(Stabilizing Buffer)，涡旋混匀，低速瞬时离心收集至离心管底，用于后续实验。
进一步，所述等温扩增结合CRISPR/Cas12a平台为RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台或LAMP-CRISPR/Cas12a平台。
进一步，所述RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台包括RT-ERA和CRISPR/Cas12a体系，所述RT-ERA体系包括：10～20μM F3引物和B3引物各2.5μL，20μL溶解液，20μL ddH2O，一管冻干粉，混匀后分装为2管，每管20μL，每管中加入2μL样本和1.5μL激活剂，在37℃反应40min；所述CRISPR/Cas12a系统包含4μL RT-ERA产物、2μL 0.5～2μM Cas12a、2μL 0.5～2μM crRNA、1μL10～20μM ssDNAreporter，9μL ddH2O和2μL 10×Reaction buffer。
更进一步，所述F3引物和B3引物的浓度为15μM，Cas12a的浓度为0.5μM，crRNA的浓度为0.5μM，ssDNAreporter的浓度为15μM。
检测方法包括以下步骤：
RT-ERA-CRISPR/Cas12a检测平台包含RT-ERA和CRISPR/Cas12a体系。RT-ERA体系包括：15μM F3引物和B3引物各2.5μL，20μL溶解液，20μL ddH2O，一管冻干粉，混匀后分装为2管，每管20μL。每管中加入2μL样本和1.5μL激活剂。它在37℃反应40min。取4μL产物加入CRISPR/Cas12a系统。CRISPR/Cas12a系统包含2μL 0.5μM Cas12a、2μL 0.5μM crRNA、1μL15μMssDNAreporter，9μL ddH2O和2μL 10×Reaction buffer。在G8荧光仪中37℃下收集荧光信号。
结果判定：出现荧光信号为阳性，无荧光信号为阴性。
进一步，所述LAMP-CRISPR/Cas12a平台包括LAMP和CRISPR/Cas12a体系，所述LAMP体系包括5μM F3引物和B3引物各1μL，20～40μM FIP引物和BIP引物各1μL，1μL 8U·μL-1Bst3.0DNAPolymerase，3.5μL 10mM dNTP，1.5μL 100mM MgSO4，2.5μL 10×IsoAmp BufferII，2μL样本和10.5μL ddH2O；60℃反应50min；所述CRISPR/Cas12a系统包括4μL LAMP产物、2μL 0.5～2μM Cas12a、2μL 0.5～2μM crRNA、1μL 10～20μM ssDNAreporter，9μL ddH2O和2μL 10×Reaction buffer。
更进一步，所述FIP引物和BIP引物的浓度为20μM，Cas12a的浓度为1μM，crRNA的浓度为1μM，ssDNAreporter的浓度为15μM。
检测方法包括以下步骤：
LAMP-CRISPR/Cas12a检测平台包含LAMP和CRISPR/Cas12a体系。LAMP体系包含5μMF3引物和B3引物各1μL，20μM FIP引物和BIP引物各1μL，1μL 8U·μL-1Bst3.0 DNAPolymerase，3.5μL 10mM dNTP，1.5μL 100mM MgSO4，2.5μL 10×IsoAmp Buffer II，2μL样本和10.5μL ddH2O。混合物在60℃反应50min。取4μL产物加入CRISPR/Cas12a系统。CRISPR/Cas12a系统包含2μL 1μM Cas12a、2μL 1μM crRNA、1μL 15μM ssDNA reporter，9μL ddH2O和2μL 10×Reaction buffer。在G8荧光仪中37℃下收集荧光信号。
结果判定：出现荧光信号为阳性，无荧光信号为阴性。
在VARV B22R基因上，LSDV比SPPV和GTPV多36-38bp。根据此差异，设计了RT-ERA和LAMP的引物和crRNA，如下所示：
SEQ ID NO.1的核苷酸序列为：ACAAAGAATCGTAAAATGT。
SEQ ID NO.2的核苷酸序列为：TGTTGTAAATTAATATGATCAAC。
SEQ ID NO.3的核苷酸序列为：
GAGCAATTTATTTCTTTGTATTAAA-TTTTAAAAAAAGAAAAAAAAAAGGCATTA。
SEQ ID NO.4的核苷酸序列为：
AGAAAGCAATACACACAATCTAT-AGTGAATAATGAACTCAGT
SEQ ID NO.5的核苷酸序列为：
AAUUUCUACUAAGUGUAGAUUAAAAAAAGAAAAAAAAAAAG。
SEQ ID NO.6的核苷酸序列为：
FAM-TATTATT-BHQ1
本发明的优点包括：(1)、两个检测平台实现了无核酸提取和纯化，简化核酸检测步骤，缩短时间和降低成本；(2)、两个检测平台均可以对DNA和RNA检测，无需额外的步骤，实现了病毒的早期检测；(3)、等温扩增：RE-ERA和LAMP均可以在恒温条件下反应，其中RT-ERA可以在低温条件下反应，与CRISPR/Cas12a可以更好的兼容。方法不依赖大型仪器，更适合point-of-care检测；(4)、高灵敏度：两大检测平台基于高效的等温扩增和灵敏的CRISPR/Cas12a，实现了2次信号放大，检测限低至2.169×101copies·μL-1和1.29×10- 1TCID50。(5)高特异性：针对VARV B22R基因上LSDV独有的区域设计引物和crRNA，使得RT-ERA和LAMP具备高的特异性，CRISPR/Cas12a系统消除了非特异性带来的影响，因此两大检测平台具有高的特异性；(6)、用途广和可编程性：两大检测平台不仅可以检测LSDV，通过改变引物和crRNA序列，可以实现对多种DNA或者RNA病毒检测。
附图说明
图1(A)裂解液性能验证；(B)裂解液结合RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台对不同体积的血液检测；
图2 RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台的条件优化；(A)温度优化；(B)引物浓度优化；(C)扩增时间优化；(D)Cas12a浓度优化；(E)crRNA浓度优化；(F)ssDNA reporter浓度优化；
图3 LAMP-CRISPR/Cas12a平台的条件优化；(A)温度优化；(B)引物浓度优化；(C)扩增时间优化；(D)Cas12a浓度优化；(E)crRNA浓度优化；(F)ssDNA reporter浓度优化；
图4 RT-ERA-CRISPR/Cas12a和LAMP-CRISPR/Cas12a平台的性能；(A)RT-ERA-CRISPR/Cas12a对不同浓度的质粒检测；(B)和(C)RT-ERA-CRISPR/Cas12a对来自不同浓度病毒的DNA和RNA检测；(D)SN/T-5197-2019标准方法对不同浓度的病毒检测；(E)和(F)LAMP-CRISPR/Cas12a对来自不同浓度病毒的DNA和RNA检测；
图5(A)和(B)裂解液结合RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台对不同浓度的LSDV-Xinjiang-2019和LW1959病毒裂解和检测；(D)和(E)RT-ERA-CRISPR/Cas12a和LAMP-CRISPR/Cas12a平台的特异性；
图6(A)和(B)RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台检测DNA和RNA的重复性；(D)和(E)LAMP-CRISPR/Cas12a平台检测DNA和RNA的重复性；
图7 RT-ERA-CRISPR/Cas12a和LAMP-CRISPR/Cas12a检测平台以及SN/T-5197-2019标准方法检测40个真实样本的热图。
具体实施方式
本发明的原理是：快速、灵敏和早期地检测LSDV对预防和控制疫情具有重要意义。在此，本发明建立了裂解液结合RT-ERA-CRISPR/Cas12a和裂解液结合LAMP-CRISPR/Cas12a检测平台实现DNA和RNA检测。具体而言，裂解液可以在室温条件下，在3min内完成对血液样本的裂解。裂解液中包含了大量的保护性蛋白和稳定因子，可以保护等温扩增的聚合酶的活性。因此，在3min的裂解后，样本可以直接用于RT-ERA和LAMP。其中，RT-ERA不仅含有DNA聚合酶，单链结合蛋白和重组酶，还有反转录酶，因此它不仅可以扩增DNA还可以扩增RNA。另外，LAMP反应采用Bst 3.0 DNA Polymerase用于扩增。Bst3.0 DNA Polymerase具有对DNA或RNA模板的5’-3’聚合酶活性和强链置换活性。它不仅具有在高浓度DNA扩增抑制剂中扩增的强大性能，而且反转录酶的活性也显著增强。因此RT-ERA和LAMP均具备扩增DNA和RNA的能力。这对病毒检测具有重要意义。由于病毒入侵细胞内，首先利用细胞内的组分进行转录和翻译，产生大量扩增所需的酶类，进而复制病毒的基因组。因此病毒转录产生的RNA是早期检测的靶标。而对于裂解液处理的粗样本中含有DNA和RNA，具有二者扩增能力的检测方法更具有早期检测能力。综上，裂解液结合RT-ERA或者LAMP的方法是被需要的。此外，我们用CRISPR/Cas12a作为终端信号输出模式，由于CRISPR/Cas12a依赖protospaceradjacent motif(PAM)位点和特异的CRISPR RNA(crRNA)，可以增强方法的特异性和简化操作。并且，Cas12a蛋白具有反式切割活性，在识别靶标后可以切割大量的单链DNA。基于此活性，CRISPR/Cas12a可以实现二次信号放大，提高方法的灵敏度。综上，基于裂解液，等温扩增RT-ERA和LAMP分别结合CRISPR/Cas12a系统的检测平台RT-ERA-CRISPR/Cas12a和LAMP-CRISPR/Cas12a不仅简化了核酸提取纯化步骤，而且具备DNA和RNA同时检测能力。更重要的是，两个检测平台可以在等温条件下反应，不依赖大型温控仪器，在短时间内实现灵敏和特异的检测。
实施例1，RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台的可行性探究
由于裂解液当中含有大量的裂解样本的试剂，可能对扩增环境的pH以及扩增酶的活性有影响。但稳定剂中含有大量的保护蛋白和稳定因子可以保护DNA聚合酶。首先探索裂解液是否可用于RT-ERA试剂。如图1(A)，利用裂解液裂解实际样本血液，可以看到明显的信号，说明裂解液具备裂解样本和释放核酸的能力。用裂解液稀释的核酸和同浓度的核酸被检测，他们的荧光信号几乎重合，说明裂解液对扩增几乎没有影响。接着，在裂解阳性样本的同时，添加同浓度的核酸作为混合物，它的荧光强度明显高于同浓度的核酸和阳性样本的信号，这说明在裂解液中，RT-ERA的产量与浓度相关。综上，说明裂解液与RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台是兼容的。这极大地缩短检测的整体时间和试剂成本。接着，我们对不同体积的血液进行验证。如图1(B)，随着体积的增加，荧光强度增大，说明血液增多，其中负载的病毒更多，因此由裂解液释放的核酸增加，导致RT-ERA的产物增多。但是当体积超过40μL，荧光强度不再增加，这可能是20μL的裂解液最大的裂解量为40μL血液。因此，在后续实验，40μL样本量作为最佳的样本量。相比与传统的核酸提取方法，需要的样本量大大降低。更重要的是，方法不需要复杂的核酸提取步骤，并且裂解液可以在室温条件下3分钟完成样本处理，缩短了操作时间。此外，平台的另外一个优势在于裂解液释放的核酸包含DNA和RNA。LSDV侵染细胞的过程中，首先在细胞质转录基因，为了更快地复制DNA，它会大量表达RNA。因此检测RNA可以实现更早期和灵敏地检测病毒的目的。而RT-ERA不仅可以对DNA的扩增，还能反转录RNA成DNA和扩增。因此，裂解液结合RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台可以实现早期和灵敏的病毒检测。
实施例2，RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台的条件优化
为获得最佳的反应效果，一些反应条件需要被优化。首先，RT-ERA的温度，引物浓度和反应时间影响它的效率。如图2(A)，当温度到40℃时，荧光差值ΔF(ΔF指实验组和对照组的荧光差值)达到最大，因此40℃作为最佳的反应温度。图2(B)展示引物浓度达到15μM，ΔF不再增加，因此15μM是最佳的引物浓度。图2(C)显示RT-ERA的反应时间在40min时，ΔF达到最大，而随着时间的延长，ΔF下降，这是因为长的时间会产生大量产物，会抑制CRISPR/Cas12a的剪切效率。因此，最佳的反应时间为40min。
CRISPR/Cas12a作为终端信号输出方式，Cas12a、crRNA和ssDNA reporter的浓度影响反应效率。如图2(D)、2(E)和2(F)，当他们的浓度分别达到0.5μM、0.5μM和15μM时，ΔF达到最大，因此它们作为最佳的反应浓度。
实施例3，LAMP-CRISPR/Cas12a平台的条件优化
LAMP反应在较高温度60-65℃下反应。如图3(A)，从58℃增加到60℃，ΔF增加，而随着温度再次升高，ΔF降低，这是因为反应效率不仅取决于酶活性，引物与靶标的结合效率也会影响扩增结果。因此，60℃作为最佳反应温度。另外，FIP和BIP引物的浓度影响产率，图3(B)显示当引物浓度达到20μM，荧光强度达到最大，继续增加浓度，ΔF没有明显变化。因此20μM是最佳的FIP和BIP引物的浓度。LAMP反应时间影响产量。由于过量的产物会抑制CRISPR/Cas12a的活性，如图3(C)，在50min，ΔF达到最大，因此50min作为后续的扩增时间。
Cas12a、crRNA和ssDNA reporter的浓度决定着CRISPR/Cas12a系统的效率。如图3(D)、3(E)和3(F)，当浓度达到1μM、1μM和15μM时，ΔF达到最大，因此它们作为最佳的反应浓度。
实施例4、RT-ERA-CRISPR/Cas12a和LAMP-CRISPR/Cas12a平台的性能
为了验证两个平台的性能，不同浓度的病毒的核酸被检测。首先，不同浓度的含有VARV B22R基因的质粒被检测。如图4(A)，随着质粒的浓度从2.169×107降低到2.169×101copies·μL-1，荧光强度不断降低。这说明RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台具有靶标浓度依赖性。其实际检测限LOD低至2.169×101copies·μL-1。接着，对被不同浓度的病毒侵染的细胞进行DNA和RNA提取。如图4(B)，随着浓度从1.29×104TCID50降低到1.29×10-2TCID50，荧光强度降低。浓度低至1.29×10-1TCID50时，荧光强度与对照组相似，因此它对DNA检测的检测限为1.29×100TCID50。对RNA检测，图4(C)也呈现出相同的趋势从1.29×104到1.29×10- 2TCID50，当浓度低至1.29×10-2TCID50时，荧光强度与对照组相似，因此它对DNA检测的检测限为1.29×10-1TCID50。相同的方法检测来自相同浓度的样本的DNA和RNA，而对RNA的检测限低于DNA，这可能是因为在病毒侵染细胞的过程中，表达的RNA比复制的DNA多，导致RNA的信号高于DNA。为了验证这一猜测，基于LAMP-CRISPR/Cas12a平台检测DNA和RNA。图4(E)，浓度从1.29×105降低到1.29×10-2TCID50，荧光强度随之降低，其中1.29×10-1TCID50的荧光强度与对照的荧光有明显差异，因此该平台检测DNA的检测限低至1.29×10-1TCID50。对RNA检测时，图4(F)也呈现出了相同的趋势，其实际检测限也是1.29×10-1TCID50。但在每个浓度下，RNA的信号均高于DNA，这验证了RNA的量高于DNA。此外，标准方法SN/T-5197-2019qPCR检测不同浓度的病毒。如图4(D)，随着浓度从1.29×106降低到1.29×101TCID50，Ct值不断增大。其实际检测限为1.29×101TCID50。与qPCR相比，RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台的检测限低10 -100倍，而LAMP-CRISPR/Cas12a平台的检测限低100倍。更重要的是，这两种方法可以在等温条件下反应，不依赖昂贵的精准的温控仪器，并且反应更加快速、灵敏和特异。RT-ERA与依赖Bst.DNA聚合酶3.0的LAMP相比，二者均可以对DNA和RNA进行扩增，他们的扩增效率相似，但RT-ERA的引物设计更加简单，且反应温度更低，与CRISPR/Cas12a系统更好的兼容。因此，RT-ERA-CRISPR/Cas12a更容易被广泛应用。
利用裂解液对含有不同浓度病毒的细胞溶液直接裂解进行RT-ERA反应，如图5(A)，对不同浓度的Xinjiang-2019LSDV株检测，从浓度2.58×105降低到2.58×10-1TCID50，荧光强度不断降低。浓度低至2.58×10-1TCID50的荧光强度与对照相似，因此方法对Xinjiang-2019LSDV株的实际检测限低至2.58×100TCID50。另外，RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台对LW1959株检测，浓度从1.41×104降低到1.41×10-1TCID50，荧光强度随之降低。其实际检测限低至1.41×100TCID50。因此，平台对裂解液样本的实际检测限低至100TCID50，它仍然比标准方法qPCR低。说明RT-ERA-CRISPR/Cas12a方法具有高的灵敏度，在实际应用中更具有优势。
实施例5、两个检测平台的特异性
在VARV B22R基因上，LSDV比SPPV和GTPV多36-38bp。根据此差异，RT-ERA和LAMP的引物和crRNA被设计。如图5(D)和5(E)，在RT-ERA-CRISPR/Cas12a和LAMP-CRISPR/Cas12a平台中，仅有LSDV出现明显的荧光强度，而其他病毒没有信号，说明两种检测方法对LSDV有强的特异性，与其他病毒没有交叉。
实施例6、两个检测平台的重复性
RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台对同一浓度DNA和RNA进行多次重复实验，如图6(A)和6(B)，5次实验的荧光曲线非常靠近，说明他们的重复性非常高。对30min的荧光值进行相对标准偏差(relative standard deviation；RSD)计算，得到DNA和RNA的RSD分别为4.73％和4.33％。LAMP-CRISPR/Cas12a平台同样具有高的重复性，因为5次实验的荧光曲线基本重合，RSD分别为0.013％，0.043％。综上，两种方法的RSD均小于5％，因此具有高的重复性，可以用于实际检测。
实施例7、实际样本检测
利用RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台和LAMP-CRISPR/Cas12a平台对40个血液样本检测。40μL血液与20μL裂解液混合，用于后续扩增反应。如图7，13个样本为阳性，27个样本为阴性。样本1、2、3、4、5、11、12、13、14、19、20、30和31有强的荧光信号，而其他样本没有信号。为了验证两个平台的准确度，标准方法SN/T-5197-2019 qPCR被用来检测样本。结果显示qPCR结果与两种方法输出的结果一致。因此，两种方法具有高的准确率，具有实际应用潜力。

Claims (8)

1.无核酸提取等温扩增结合CRISPR/Cas12a对LSDV的DNA和RNA检测试剂盒，其特征在于，包括裂解体系中的裂解缓冲液和稳定缓冲液，等温扩增结合CRISPR/Cas12a平台中的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的F3引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的B3引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的FIP引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的BIP引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的crRNA和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示ssDNA reporter。
2.根据权利要求1所述无核酸提取等温扩增结合CRISPR/Cas12a对LSDV的DNA和RNA检测试剂盒，其特征在于：所述等温扩增结合CRISPR/Cas12a平台为RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台或LAMP-CRISPR/Cas12a平台。
3.根据权利要求2所述无核酸提取等温扩增结合CRISPR/Cas12a对LSDV的DNA和RNA检测试剂盒，其特征在于：所述RT-ERA-CRISPR/Cas12a平台包括RT-ERA和CRISPR/Cas12a体系，所述RT-ERA体系包括：10～20μM F3引物和B3引物各2.5μL，20μL溶解液，20μL ddH2O，一管冻干粉，混匀后分装为2管，每管20μL，每管中加入2μL样本和1.5μL激活剂，在37℃反应40min；所述CRISPR/Cas12a系统包含4μL RT-ERA产物、2μL 0.5～2μM Cas12a、2μL 0.5～2μM crRNA、1μL 10～20μM ssDNA reporter，9μL ddH2O和2μL10×Reaction buffer。
4.根据权利要求3所述无核酸提取等温扩增结合CRISPR/Cas12a对LSDV的DNA和RNA检测试剂盒，其特征在于：所述F3引物和B3引物的浓度为15μM，Cas12a的浓度为0.5μM，crRNA的浓度为0.5μM，ssDNA reporter的浓度为15μM。
5.根据权利要求2所述无核酸提取等温扩增结合CRISPR/Cas12a对LSDV的DNA和RNA检测试剂盒，其特征在于：所述LAMP-CRISPR/Cas12a平台包括LAMP和CRISPR/Cas12a体系，所述LAMP体系包括5μM F3引物和B3引物各1μL，20～40μM FIP引物和BIP引物各1μL，1μL 8U·μL-1Bst 3.0DNA Polymerase，3.5μL 10mM dNTP，1.5μL 100mM MgSO4，2.5μL 10×IsoAmpBuffer II，2μL样本和10.5μL ddH2O；60℃反应50min；所述CRISPR/Cas12a系统包括4μLLAMP产物、2μL 0.5～2μM Cas12a、2μL 0.5～2μM crRNA、1μL10～20μM ssDNA reporter，9μL ddH2O和2μL 10×Reaction buffer。
6.根据权利要求2所述无核酸提取等温扩增结合CRISPR/Cas12a对LSDV的DNA和RNA检测试剂盒，其特征在于：所述FIP引物和BIP引物的浓度为20μM，Cas12a的浓度为1μM，crRNA的浓度为1μM，ssDNA reporter的浓度为15μM。
7.根据权利要求1-6任一项所述无核酸提取等温扩增结合CRISPR/Cas12a对LSDV的DNA和RNA检测试剂盒，其特征在于：所述裂解体系包括2-40μL血液样本或者细胞悬液、20μL裂解液和20μL稳定液。
8.根据权利要求1-6任一项所述无核酸提取等温扩增结合CRISPR/Cas12a对LSDV的DNA和RNA检测试剂盒，其特征在于：结果判定：出现荧光信号为阳性，无荧光信号为阴性。
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