KR20230004558A - 폴리머라제-반응성 촉매 핵산 나노구조체 - Google Patents

폴리머라제-반응성 촉매 핵산 나노구조체 Download PDF

Info

Publication number
KR20230004558A
KR20230004558A KR1020227038489A KR20227038489A KR20230004558A KR 20230004558 A KR20230004558 A KR 20230004558A KR 1020227038489 A KR1020227038489 A KR 1020227038489A KR 20227038489 A KR20227038489 A KR 20227038489A KR 20230004558 A KR20230004558 A KR 20230004558A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nanostructure
nucleic acid
recognition
inverter
dna polymerase
Prior art date
Application number
KR1020227038489A
Other languages
English (en)
Inventor
후이린 샤오
유안 첸
노아 리안디퓨트라 선다
루이 유안 니콜라스 호
Original Assignee
내셔널 유니버시티 오브 싱가포르
에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르, 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 filed Critical 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르
Publication of KR20230004558A publication Critical patent/KR20230004558A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/122—Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/127—DNAzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/128—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes processing or releasing ribozyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/205—Aptamer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/9005—Enzymes with nucleic acid structure; e.g. ribozymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/91245—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • G01N2333/9125—Nucleotidyltransferases (2.7.7) with a definite EC number (2.7.7.-)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 폴리머라제 활성에 반응하는 신호전달 촉매 핵산 나노구조체, 이의 사용 방법, 이를 포함하는 장치 및 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 G-사중가닥 hemin, 및 폴리머라제-반응성 요소와 같은, DNAzyme/RNAzyme을 포함하는 효소 신호전달 나노구조체를 제공한다. 폴리머라제-반응성 요소의 폴리머라제 신장은 DNAzyme/RNAzyme의 활성을 제거한다. 촉매 핵산 나노구조체는 집적 회로에서, 분자 신호를 폴리머라제 활성으로 변환할 수 있는 표적 인식 나노구조체와 쌍을 이루거나 단독으로 사용될 수 있다.

Description

폴리머라제-반응성 촉매 핵산 나노구조체
본 발명은 폴리머라제 활성에 반응하는 신호전달 촉매 핵산 나노구조체(nanostructure), 이의 사용 방법, 이를 포함하는 장치(device) 및 키트(kit)에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 집적 회로에서 분자 신호를 폴리머라제 활성으로 변환할 수 있는 표적 인식 나노구조체와 쌍을 이루거나 단독으로 사용될 수 있는 DNAzyme/RNAzyme 및 자극 반응성 요소를 포함하는 민감한 촉매 신호전달 나노구조체를 제공한다.
핵산의 검출은, 예를 들면, 진단에서 광범위하게 적용된다. 핵산 기술은 감염에 대한 전례없는 분자 정보를 제공하기 위해 임상 실험실에서 점점 더 많이 채택되고 있다[Niemz, A., Ferguson, T. M. & Boyle, D. S. Trends Biotechnol 29: 240-250 (2011); Nong, R. Y., et al., Expert Rev Proteomics 9: 21-32 (2012); Zumla, A. et al. Lancet Infect Dis 14: 1123-1135 (2014)].
현재 병원체 핵산의 검출은 대규모 중앙 집중식 임상 실험실에서 거의 독점적으로 수행된다. 이러한 제한된 범위는 기존 기술과 관련된 높은 복잡성과 비용으로 인해 발생한다. 상업적 분석은 주로 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 활용하여 특정 DNA 표적을 증폭하고 검출한다. 이러한 시스템은 PCR 열 사이클링 및 형광 측정을 위해 부피가 크고 특수화된 장비를 필요로 할 뿐만 아니라 이를 작동하기 위해 숙련된 직원을 필요로 한다. 고급 등온 증폭 분석은 온도 사이클링을 위한 기기 요구를 완화하기 위해 개발되었다; 그럼에도 불구하고, 이러한 분석은 이들 자체의 한계를 갖는다. 예를 들면, 루프-매개 등온 증폭(LAMP)은 엄격한 시퀀스 요건을 가지며 쉽게 일반화할 수 없다[Zhao, Y., et al., Chem Rev 115: 12491-12545 (2015)]. 중요하게도, 다른 핵산 증폭 접근법과 마찬가지로, LAMP는 위양성(예를 들어, 프라이머-이량체 형성으로부터)의 경향이 있다. 대안적으로, 서열-특이적 신호전달 프로브(예를 들어, 형광 Taqman 리포터)를 사용하여 검출 정확도를 개선할 수 있다; 그러나, 이러한 프로브는 비용이 많이 들고 구현하기 복잡하다[Gardner, S. N., et al., J Clin Microbiol 41: 2417-2427 (2003)]. DNA 표적의 각 조각은 표적 증폭 동안 결합된 신호 전달을 위한 전용의 서열-특이적 프로브를 필요로 하기 때문에, 접근 방식은 다중화 또는 복잡한 계산을 수행하기 위해 점점 더 많은 비용이 들고 어려워진다[Juskowiak, B. Anal Bioanal Chem 399: 3157-3176 (2011)].
핵산 및 기타 표적 분자의 신속하고 시각적이며 모듈화된 검출(modular detection)을 가능하게 하는 개선된 분자 플랫폼(molecular platform)이 필요하다.
본 발명은 반응성인 촉매 핵산 나노구조체에 관한 것이다. 이러한 구조체는 폴리머라제 활성과 다양한 기타 자극 및 표적에 반응하도록 만들어질 수 있다. 구조체의 코어는 특정 화학 반응을 수행할 수 있는 촉매 핵산인 DNAzymes/RNAzyme 뿐만 아니라 상이한 자극-반응성 요소를 포함한다. 예로서, 본 발명자들은 G-사중가닥(G-quadruplex) Hemin DNAzyme 및 폴리머라제-반응성 요소를 통합하는 나노구조체를 설계 및 개발하였으며 다중-모달 판독값을 생성하기 위한 구조체의 성능 및 상용성을 입증하였다. 분자 신호를 폴리머라제 활성으로 변환할 수 있는 독립적인 반응성 요소를 통합함으로써, 시스템은 상이한 분자 표적 및/또는 이들의 조합을 측정하고, 상이한 환경 조건하에서 강력한 성능을 입증한다. 본 발명은 개선된 감도, 결과에 이르는 속도(speed to result), 및 강건성(robustness)을 갖는 신호전달을 위한 신규한 촉매 나노구조체를 제공한다.
제1 측면에서, DNAzyme/RNAzyme 및 자극 반응성 요소(stimulus responsive element)를 포함하는 촉매 핵산 나노구조체가 제공된다. 본 발명에서 신호전달(signaling)에 사용될 수 있는 다수의 공지된 DNAzyme/RNAzyme이 있음을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, DNAzyme/RNAzyme은 다음을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다:
리보뉴클레아제 8-17, 리보뉴클레아제 10-23 또는 Dz10-66 데옥시리보자임과 같은 리보뉴클레아제;
10MD5 데옥시리보자임 또는 9NL27 데옥시리보자임과 같은 데옥시리보뉴클레아제;
G-사중가닥(quadruplex) Hemin과 같은 퍼옥시다제;
E47 데옥시리보자임과 같은 결찰 활성(ligation activity)을 갖는 효소;
14WM9 데옥시리보자임과 같은 포스파타제;
AmideAm1 데옥시리보자임과 같은 아미드 가수분해제; 및
9F7 데옥시리보자임 또는 7S11 데옥시리보자임과 같은 RNA 분지 효소(branching enzyme).
바람직한 실시양태에서 DNAzyme/RNAzyme은 G-사중가닥 Hemin DNAzyme이고, 바람직하게는, G-사중가닥 Hemin DNAzyme은 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
5'-CTGGGAGGGAGGGAGGGA-3' (서열 번호 1).
일부 실시양태에서, 자극 반응성 요소는 폴리머라제의 존재하에 DNAzyme/RNAzyme 활성을 억제하는 폴리머라제-반응성 요소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리머라제-반응성 요소는 헤어핀 구조(hairpin structure)가 부족하다. 바람직한 실시양태에서 폴리머라제-반응성 요소는 서열 번호 2 및 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
5'-CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGC-3' (서열 번호 2)
5'-GCTATCGACAATGCGTT-3' (서열 번호 3).
일부 실시양태에서, 폴리머라제-반응성 요소는 내부 헤어핀 구조를 갖는다.
일부 실시양태에서, 신호전달 나노구조체의 폴리머라제-반응성 요소 또는 자가-프라이밍 부분(self-priming portion)은 핵산 서열을 포함한다:
5'- AACGCATTGTCGATAGCTCAGCTGTCTGAGCTATCGACAATGCGTT-3' (서열 번호 10).
일부 실시양태에서, 촉매 핵산 나노구조체는 G-사중가닥 Hemin DNAzyme을 포함하고 다음을 포함하는 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다:
5'-CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGCTCTGTCGCTATC
GACAATGCGTT-3' (서열 번호 4);
5'-CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGCTCTGTCGCTAT
CGACAATGCGTTAGCAT-3' (서열 번호 5);
5'-CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGCTCTGTCGCTAT
CGACAATGCGTTAGCATCCC-3' (서열 번호 6);
5'-CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGCTCTGTCGCTAT
CGACAATGCGTTAGCATCCCTCCC-3' (서열 번호 7);
5'-CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGCTCTGTCGCTAT
CGACAATGCGTTAGCATCCCTCCCTCCC-3' (서열 번호 8); 및
5'-CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGCTCTGTCGCTAT
CGACAATGCGTTAGCATCCCTCCCTCCCTCCCAG-3' (서열 번호 9).
서열 번호 4 내지 9 내의 중간 서열은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 이해될 것이다.
일부 실시양태에서, 내부 헤어핀 구조가 존재할 때 폴리머라제-반응성 요소의 폴리머라제-신장은 촉매 활성을 제거한다.
일부 실시양태에서, DNAzyme/RNAzyme 활성은 퍼옥시다제 활성이다.
일부 실시양태에서, 퍼옥시다제 기질의 활성은 비색, 형광, 전기화학적 또는 발광 수단을 포함하지만 이에 제한되지 않는 상이한 방식에 의해 검출된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 다음의 단계들을 포함하여, 시험 샘플에서 폴리머라제 활성을 검출하는 방법이 제공된다:
(a) 시험 샘플을 제공하는 단계;
(b) 본 발명의 임의의 측면에 따른 촉매 핵산 나노구조체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
(c) DNAzyme/RNAzyme 기질 및, 임의로, 신호 발생 시약(signal development reagent)의 존재하에 a)의 샘플을 b)의 조성물과 접촉시키는 단계;
(d) 신호 발생을 검출하는 단계(여기서, 신호의 강도는 샘플에서 폴리머라제 활성의 양에 반비례한다).
일부 실시양태에서, 시험 샘플은 DNA 폴리머라제와 같은 폴리머라제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 다음의 단계들을 포함하여, 샘플에서 표적 분자를 검출하는 방법이 제공된다:
(a) 시험 샘플을 제공하는 단계;
(b) 적어도 하나의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 하나의 인식 나노구조체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계(여기서, 인식 나노구조체는 샘플에서 상기 표적 분자를 인식하도록 적응된 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 앱타머(enzyme-specific DNA aptamer)를 포함한다);
(c) 적어도 하나의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 하나의 인식 나노구조체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계(여기서, 인식 나노구조체는 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 갖는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 앱타머를 포함하고, 여기서 가변 서열 영역은 인버터(inverter) 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트(overhang segment)를 포함하고 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부와 이중체(duplex)를 형성하며, 여기서 인버터 올리고뉴클레오티드는 가변 이중체 영역보다 더 높은 친화도로 샘플에서 상기 표적 분자를 인식하도록 적응된다);
(d) 시험 샘플을 (b) 또는 (c)의 조성물과 접촉시키는 단계(여기서,
(i) (b)의 앱타머의 인식 서열 영역에 결합하는 표적 분자는 안정한 앱타머-DNA 폴리머라제 효소 복합체의 형성을 촉진하여 DNA 폴리머라제 효소 활성을 억제하거나;
(ii) (c)의 인버터 올리고뉴클레오티드에 결합하는 표적 분자는 인식 나노구조체를 불안정하게 하여 DNA 앱타머에 의한 억제로부터 DNA 폴리머라제 효소를 해제한다);
(e) 본 발명의 임의의 측면에 따른 촉매 핵산 나노구조체를 제공하는 단계;
(f) DNAzyme/RNAzyme 기질 및, 임의로, 신호 발생 시약의 존재하에 단계 (b) 또는 (c)로부터의 나노구조체를 접촉시키는 단계;
(g) 신호 발생을 검출하는 단계(여기서, 신호의 강도는
(i) 조성물 (b)를 사용하는 경우 샘플에서 표적 분자의 존재; 또는
(ii) 조성물 (c)를 사용하는 경우 샘플에서 표적 분자의 부재를 나타낸다).
적합한 인식 나노구조체는 제WO 2020/009660호로 공개된 PCT 출원 특허 출원 제PCT/SG2019/050328호에 기술되고 정의되며, 이의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 인식 나노구조체의 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 앱타머 보존된 서열 영역은 핵산 서열 5'-CAATGTACAGTATTG-3' (서열 번호 18)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인버터 올리고뉴클레오티드는 앱타머 이중체 영역보다 긴 적어도 하나의 뉴클레오티드이다. 바람직하게는, 인버터 올리고뉴클레오티드는 앱타머 이중체 영역의 약 2배 길이이다.
일부 실시양태에서, 인버터 올리고뉴클레오티드 길이의 약 절반은 앱타머-인버터 이중체를 형성하고 약 절반은 오버행 세그먼트를 형성한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 이중체 검출을 위해 샘플 내의 제1 인식 나노구조체의 표적 핵산과는 상이한 표적 핵산에 상보적인 제2 인식 나노구조체를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 불일치(mismatch)는 가변 서열 영역 이중체에 도입되어 강력한 서열 특이성을 부여하며, 이는 밀접하게 관련된 표적 핵산의 다중 검출을 위해, 예를 들어 바이러스 서브타이핑(subtyping)에 유용하다.
일부 실시양태에서, 표적은 DNA, RNA, PNA 및 기타 핵산 유사체를 포함하는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 핵산이다.
일부 실시양태에서, 표적은 비인간 또는 인간 질환, 유전적 변이체, 법의학, 균주 식별, 환경 및/또는 식품 오염과 관련된 적어도 하나의 핵산이다.
일부 실시양태에서, 표적은 병원체이다. 일부 실시양태에서 병원체는 바이러스이다.
일부 실시양태에서, 시험 샘플은 DNA, RNA, PNA, 단백질, 지질, 소분자 및 대사산물 및 이들의 변형을 포함하는 그룹으로부터 선택된 표적 분자를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 다음의 단계를 포함하여, 샘플에서 표적 핵산을 검출하는 방법이 제공된다:
(a) 핵산을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 적어도 하나의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 하나의 인식 나노구조체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계(여기서, 인식 나노구조체는 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 갖는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 앱타머를 포함하고, 여기서 가변 서열 영역은 샘플의 표적 핵산에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함한다); 또는
(c) 적어도 하나의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 하나의 인식 나노구조체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계(여기서, 인식 나노구조체는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 앱타머 및 인버터 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 앱타머는 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 갖고, 여기서 가변 서열 영역은 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함하고 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부와 이중체를 형성하며, 여기서 인버터 올리고뉴클레오티드는 앱타머-인버터 이중체보다 적어도 하나의 뉴클레오티드가 더 길고 샘플의 표적 핵산에 상보적인 10개 이상의 뉴클레오티드를 갖는다);
(d) 핵산을 포함하는 샘플을 (b) 또는 (c)의 조성물과 접촉시키는 단계(여기서,
(i) (b)의 앱타머의 가변 서열 영역에 결합하는 표적 핵산은 안정한 앱타머-DNA 폴리머라제 효소 복합체의 형성을 촉진하여 DNA 폴리머라제 효소 활성을 억제하거나;
(ii) (c)의 인버터 올리고뉴클레오티드에 결합하는 표적 핵산은 인식 나노구조체를 불안정하게 하여 DNA 앱타머에 의한 억제로부터 DNA 폴리머라제 효소를 해제한다);
(e) 본 발명의 임의의 측면에 따른 촉매 핵산 나노구조체를 제공하는 단계;
(f) DNAzyme/RNAzyme 기질 및, 임의로, 신호 발생 시약의 존재하에 단계 (d)로부터의 나노구조체를 접촉시키는 단계;
(g) 신호 발생을 검출하는 단계(여기서, 신호의 강도는
(i) 조성물 (b)를 사용하는 경우 샘플에서 표적 핵산의 존재; 또는
(ii) 조성물 (c)를 사용하는 경우 샘플에서 표적 핵산의 부재를 나타낸다).
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 표면에 고정된 본 발명의 임의의 측면에 따른 촉매 핵산 나노구조체를 포함하는 장치가 제공된다.
일부 실시양태에서, 장치는 다음을 포함한다:
(i) 제1 위치에 제10항에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 하나의 인식 나노구조체를 포함하는 조성물 b) 또는 조성물 c);
(ii) 제2 위치에 부착된, 본 발명의 임의의 측면에 따른 촉매 핵산 나노구조체; 및
(iii) 상기 검출 나노구조체를 샘플 핵산과 혼합하여 활성 효소를 상기 제2 위치로 방출하기 위한 중간 스테이지.
일부 실시양태에서, 장치는 미세유체 장치 및 측방 유동 장치를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 장치는 전극을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 다음을 포함하는 핵산 검출 키트가 제공된다;
(a) 적어도 하나의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 하나의 인식 나노구조체를 포함하는 조성물(여기서, 인식 나노구조체는 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 갖는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 앱타머를 포함하고, 여기서 가변 서열 영역은 표적 핵산에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함한다); 및/또는
(b) 적어도 하나의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 하나의 인식 나노구조체를 포함하는 조성물(여기서, 인식 나노구조체는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 앱타머 및 인버터 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 앱타머는 보존된 서열 영역과 가변 서열 영역을 갖고, 여기서 가변 서열 영역은 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함하고 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부와 이중체를 형성하며, 여기서 인버터 올리고뉴클레오티드는 앱타머-인버터 이중체보다 적어도 하나의 뉴클레오티드가 더 길고 표적 핵산에 상보적인 10개 이상의 뉴클레오티드를 갖는다); 임의로
(c) 본 발명의 임의의 측면에 따른 촉매 핵산 나노구조체; 임의로
(d) DNAzyme/RNAzyme 기질 및, 임의로,
(e) 신호 발생 시약.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 다음을 포함하는 분자 검출 키트가 제공된다;
(a) 적어도 하나의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 하나의 인식 나노구조체를 포함하는 조성물(여기서, 인식 나노구조체는 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 갖는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 앱타머를 포함하고, 여기서 가변 서열 영역은 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함하고 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부와 이중체를 형성하며, 여기서 인버터 올리고뉴클레오티드는 가변 이중체 영역보다 더 높은 친화도로 샘플에서 상기 표적 분자를 인식하도록 적응된다);
(b) 본 발명의 임의의 측면에 따른 촉매 핵산 나노구조체; 임의로
(c) DNAzyme/RNAzyme 기질 및, 임의로,
(d) 신호 발생 시약.
도 1은 상이한 신호전달 요소를 갖는 DNAzyme 나노구조체의 활성을 보여준다. 배양 전(a) 및 DNA 폴리머라제와 함께(b) 또는 DNA 폴리머라제 없이(c) 배양 30분 후 DNAzyme 나노구조체의 활성. 실험은 삼중으로 수행되었으며 본페로니 보정을 사용한 t-검정을 사용하여 유의도를 계산하였다. n.s.는 보정된 p 값 > 0.05, ** < 0.005, **** < 0.00005를 의미한다.
도 2는 주어진 뉴클레오티드(서열 번호 4 내지 9)로 연장 후 DNAzyme 신호전달 나노구조체의 반응성을 보여준다. 실험은 삼중으로 수행되었다.
도 3은 신호전달 나노구조체에 대한 판독 유형을 보여준다. 그래프는 신호전달 나노구조체가 있는(검은색) 및 신호전달 나노구조체가 없는(흰색) 기질에 의해 생성된 신호를 나타낸다. 판독 유형은 표 2에 추가로 설명되어 있다. 전기화학 측정은 표면 고정된 나노구조체로 수행되었고, 다른 판독은 용액-기반 나노구조체로 수행되었다. 실험은 삼중으로 수행되었다.
도 4a 및 4b는 상이한 폴리머라제 분석 조건에 대한 신호 나노구조체 판독을 보여준다. a) 상이한 DNA 폴리머라제 희석액(1x, 10x, 100x, 및 폴리머라제 없음)에 대한 신호 분석의 시간 경과. b) 효소 활성을 억제하는 상이한 양의 오염물질(HCl)을 첨가했을 때 30분 동안 DNA 폴리머라제와 함께 배양한 후 신호전달 나노구조체로부터의 신호. 실험은 삼중으로 수행되었다.
도 5는 상이한 기판에 대한 인식 나노구조체 조건을 보여준다. 상이한 표적에 대한 신호전달 나노구조체 구성. DNA/RNA(각각 왼쪽 및 중앙)는 염기쌍을 형성하고 상보적 서열에 혼성화하는 표적 인식 요소를 포함한다. 단백질, 소분자 인식은 이의 표적에 결합하기 위해 접히는 앱타머를 포함한다(오른쪽). 도식 하단의 그래프는 상이한 양의 표적에 대한 신호전달 나노구조체에 결합된 분석으로부터의 신호를 보여준다. 실험은 삼중으로 수행되었다.
도 6a 및 6b는 분석 감도 및 속도를 보여준다. a) 특정 표적 및 스크램블된 서열에 대한 신호전달 나노구조체에 결합된 분석에 대한 적정 곡선. b) 1010개의 특이하고 스크램블된 표적에 대한 시간 경과 실험. 실험은 삼중으로 수행되었다.
도 7은 고정된 나노구조체가 기능을 보존함을 보여준다. 고정되지 않은 인식 나노구조체(왼쪽) 및 표면 고정된 인식 나노구조체(가운데 두 개, 다른 구성)는 둘 다 이들의 특이성 및 감도 특성을 보존할 수 있다(왼쪽, 표적 없음 = 신호 없음, 오른쪽, 표적 있음 = 높은 신호). 표면 단독 대조군(오른쪽)은 이러한 특성(표적 유무에 관계없이 높은 신호)을 갖지 않으며, 이는 이것이 표면이 아닌 인식 나노구조체의 특성임을 보여준다. 실험은 삼중으로 수행되었다.
본 명세서에서 언급된 참고문헌은 편의상 참고문헌 목록의 형태로 열거되고 실시예의 끝에 추가된다. 이러한 참고문헌의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어는 편의를 위해 여기에 수집된다.
본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다는 것을 주지해야 한다. 따라서, 예를 들면, "표적 서열"에 대한 언급은 복수의 이러한 표적 서열을 포함하고, "효소"에 대한 언급은 당업계의 숙련가들에게 공지된 하나 이상의 효소 및 이들의 등가물에 대한 언급 등이다.
본원에 사용된 용어 "앱타머"는 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 앱타머는 DNA, 단백질 또는 작은 분자와 같은 다양한 분자를 높은 친화도와 특이도로 결합할 수 있다. 예를 들면, 본원에 사용된 바와 같이, 표적 DNA, 단백질 또는 소분자의 부재하에서, 앱타머는 폴리머라제와 강하게 결합하여 폴리머라제 활성을 억제한다.
본원에 사용된 "핵산" 또는 "핵산 서열"이라는 문구는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA에 대한 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 임의의 단편을 지칭하며, 펩티드 핵산(PNA) 또는 임의의 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질에 대한 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 PCR 증폭 또는 혼성화 분석 또는 마이크로어레이에 사용될 수 있는 적어도 약 6개 뉴클레오티드 내지 60개 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 15개 내지 30개 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 약 20개 내지 25개 뉴클레오티드의 핵산 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 "증폭기", "프라이머", "올리고머" 및 "프로브"라는 용어와 실질적으로 동등하며, 이러한 용어는 당업계에서 일반적으로 정의된다. 인식 나노구조체는 인버터 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인버터 서열" 또는 "인버터 올리고뉴클레오티드"는 표적 핵산 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 지칭하며, 그 중 일부는 이중체 형성에 관여하고 일부는 오버행에 관여한다. 본원에서 이중체 및 오버행 서열 각각에 대해 20개 뉴클레오티드의 더 긴 서열은 DNA 폴리머라제 효소에 대한 앱타머 결합을 안정화시킴으로써 이의 억제 효과를 강력하게 생성하는 것으로 보여진다. 이러한 억제 효과는 주변 온도에서 상보적 표적의 존재하에서 제거될 수 있다. 인버터 서열의 존재/부재는 인식 요소의 기능 상태(예를 들어, 온 또는 오프 상태)를 결정한다. 이의 존재하에서, 폴리머라제 활성은 표적으로 켜지고; 이의 부재하에서, 폴리머라제 활성은 표적으로 꺼질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "가변 서열 영역"은 인식 나노구조체 상의 표적 서열에 대한 서열 특이성을 결정하는(즉, 인식될 수 있는 표적 서열을 정의하는) 영역을 지칭한다. 인버터 서열과 앱타머 서열의 일부는 이러한 가변 서열 영역 내에 포함된다. 이 영역을 변경하여 새 표적을 검출할 수 있다. 인버터가 사용되지 않는 경우 "가변 서열 영역"은 표적 핵산에 상보적인 앱타머 상의 오버행 세그먼트를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "샘플"은 가장 넓은 의미로 사용된다. 예를 들면, HPV 6, 16, 18, 31, 33 및 5를 포함하지만 이에 제한되지 않는 인유두종 바이러스(HPV) 게놈 서열을 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플은 체액; 세포, 염색체, 세포소기관 또는 세포로부터 단리된 막으로부터의 추출물; 세포; (용액으로 또는 고체 지지체에 결합된) 게놈 DNA, RNA 또는 cDNA; 조직; 조직 프린트 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 본 발명의 방법을 수행하는 동안 잠재적으로 뉴클레아제를 함유하는 샘플에서 활성을 연장하거나 키트의 저장 수명을 개선하기 위해 구조적으로 및/또는 화학적으로 변형될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 사용되는 앱타머 및/또는 인버터 및/또는 신호전달 나노구조체 또는 임의의 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브는 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 구조적 및/또는 화학적 변형은 합성 동안의 태그, 예를 들어 형광 태그, 방사성 태그, 비오틴, 5' 꼬리, 포스포로티오에이트(PS) 결합의 추가, 2'-O-메틸 변형 및/또는 포스포르아미다이트 C3 스페이서의 추가를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "포함하는(comprising)" 또는 "포함하는(including)"은 언급된 특징, 정수, 단계 또는 구성요소의 존재를 명시하는 것으로 해석되어야 하지만, 하나 이상의 특징, 정수, 단계 또는 구성요소, 또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 그러나, 본 개시내용과 관련하여, 용어 "포함하는(comprising)" 또는 "포함하는(including)"은 또한 "로 구성된(consisting of)"을 포함한다. "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)"와 같은 단어 "포함하는(comprising)" 및 "포함하다(include)" 및 "포함하다(includes)"와 같은 "포함하는"의 변형은 상응하게 다양한 의미를 갖는다.
실시예
당업계에 공지되어 있고 구체적으로 기술되지 않은 표준 분자 생물학 기술은 일반적으로 문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(2012)]에 기술된 바를 따랐다.
실시예 1
반응성 촉매 핵산 나노구조체의 설계
본 발명자들은 촉매 활성을 보유하도록 핵산 나노구조체를 설계 및 개발하였다; 이러한 촉매 활동은 자극-반응성 요소의 통합을 통해 반응하게 된다. 구체적으로, 본 발명자들은 특정 화학 반응을 수행할 수 있는 촉매 핵산인 DNAzymes/RNAzyme[Li, W. et al., Nucleic Acids Research 44: 7373-7384 (2016)] 및 통합된 자극-반응성 요소를 포함하는 코어 구조를 개발하였다. 하나의 예에서, 본 발명자들은 퍼옥시다제 활성을 갖는 G-사중가닥 Hemin DNAzyme(서열 번호 1)을 포함하는 3차원 DNA 구조를 개발하였다.
본 발명자들은 나노구조체(서열 번호 4 내지 9)에 폴리머라제 활성-반응성 요소의 혼입을 추가로 설계하고 최적화하였다. 따라서 생성된 나노구조체는 폴리머라제 활성을 위한 결합 부위 뿐만 아니라 고유 촉매 도메인(서열 번호 2 및 3, 서열 번호 4 내지 9)을 모두 함유하며, 폴리머라제 활성에 반응하여 이들의 촉매적 퍼옥시다제 활성을 변화시킨다. 구체적으로, 반응성 요소는 폴리머라제 활성을 위한 기질을 제공하여 언폴딩(unfolding)시키고 촉매 활성을 파괴한다. 2차 및 고차 DNA 구조가 폴리머라제 활성을 억제하는 것으로 알려져 있지만[Nelms, B. L. and Labosky, P. A. Scientific Reports 1: 106 (2011)], 본 발명자들은, 폴리머라제 활성-반응성 요소의 부재하에서, 설계된 나노구조체가 폴리머라제 활성을 방해하지 않음을 보여주었다. 폴리머라제 활성-반응성 요소의 통합 후, 폴리머라제 활성의 부재하에서, 나노구조체의 촉매 활성이 보존된다. 폴리머라제 활성의 존재하에서, 나노구조체의 촉매 활성이 파괴된다(도 1). 시험된 폴리머라제-반응성 요소 중에서, 최상의 설계는 내부 헤어핀 구조를 가지며, 이것이 자체-프라이밍을 통해 폴리머라제 반응성 요소의 안정성을 증가시킬 수 있다고 가정한다(도 1)(서열 번호 10). 본 발명자들은 반응성 요소 5' 오버행의 길이를 조정하여 나노구조체가 폴리머라제 활성에 대해 반응성이게 함으로써 촉매 도메인에 대한 반응성 요소의 설계 및 위치를 추가로 최적화하였다. 최적화된 설계(서열 번호 4)에서, 몇 가지 염기의 폴리머라제 신장이 촉매 활성을 완전히 파괴하기에 충분하였다; 촉매 활성의 감소는 지수적 신호 감소를 초래하므로 설계된 나노구조체는 폴리머라제 활성에 매우 민감하게 된다(도 2). 나노구조체 및 표적 서열의 목록은 표 1에 제공되어 있다.
표 1: 나노구조체 및 표적 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 2
촉매 활성의 다중- 모달 판독(Multi-modal readout)
나노구조체의 촉매 활성은 신호전달 요소로서 사용될 수 있으며, 신속한 주변 온도 검출을 위해 다양한 기질을 통해 분석될 수 있다. 이것은 또한 비색(colorimetric), 형광, 전기화학 및 발광을 포함하지만 이에 제한되지 않는 상이한 판독 양식에 맞게 조정될 수 있다(표 2, 도 3).
표 2: 신호전달 나노구조체에 대한 판독 유형
Figure pct00003
비색 판독값은 높은 휴대성의 이점을 갖는다. 전극에 나노구조체를 고정함으로써, 시스템은 매우 민감하고 휴대 가능한 판독값을 생성한다.
실시예 3
폴리머라제 양 및/또는 활성의 검출
설계된 나노구조체(서열 번호 4)로, 이의 촉매 활성을 사용하여 폴리머라제 양을 직접 측정할 수 있다. 본 발명자들은 나노구조체를 함유하는 용액을 상이한 양의 폴리머라제와 혼합한 다음 고정된 시점에서 DNAzyme 활성을 측정하기 위해 분취량을 취했다. 더 적은 양의 효소는 그 만큼의 DNAzyme 구조를 파괴할 수 없기 때문에 더 적은 폴리머라제를 사용한 반응은 시간이 지남에 따라 DNAzyme 활성을 더 느리게 붕괴하였다(도 4a). 이것은, 예를 들면, 정제된 재조합 효소의 수율을 결정하는 것과 같이 DNA 폴리머라제의 양을 검출하는 데 사용될 수 있다. 상기 시스템은 또한, 예를 들면, 고정된 양의 효소 활성에 대한 상이한 양의 화학 첨가제의 효과를 결정하는 데 있어서 폴리머라제 활성(활성화 또는 억제)을 결정하기 위해(도 4b) 사용될 수 있다.
실시예 4
상이한 자극의 검출
이러한 촉매적 나노구조체를 다른 반응성 나노구조체 및 DNA 폴리머라제 이용 가능성 및/또는 활성을 유발하는 기타 메커니즘과 결합함으로써, 본 발명자들은 반응성이 있고 특히 각종 상이한 용액 환경(예를 들어, 세포 용해물, 화학적 완충액)에서 DNA, RNA, 단백질, 지질, 소분자, 대사산물 및 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 다른 자극 및 표적 분자를 측정하는 시스템을 생성할 수 있다. 이를 입증하기 위해, 본 발명자들은 DNA 폴리머라제를 활성화/비활성화하기 위해 특정 핵산 표적(각각 서열 번호 13 및 14, 인간 액틴 베타, DNA 및 RNA)에 반응성인 특별히 설계된 인식 나노구조체(서열 번호 11 및 12)를 사용하였고[본원에 참고로 포함된 PCT 특허 공개 제WO 2020/009660호; Ho, N. R. Y. et al., Nature Communications 9: 3238 (2018)], 이를 촉매 핵산 나노구조체의 상류에 결합시켰다. 통합된 시스템은 동일한 효율로 DNA 및 RNA 표적을 검출할 수 있다. 특정 단백질 표적에 대해 앱타머로 인식 나노구조체를 적응함으로써, 이 시스템은 단백질 또는 소분자 표적을 검출하는 데에도 사용될 수 있다. 본 발명자들은 인버터 서열(서열 번호 16 및 17)에 해당 단백질에 대한 앱타머를 통합함으로써 EPCAM 단백질에 반응성인 인식 나노구조체를 설계하였다. 단백질을 발현하는 더 많은 세포를 추가함에 따라, 폴리머라제 활성의 양이 증가하는 것을 관찰하였다(도 5). 반응성 DNAzyme 나노구조체를 전극의 표면에 고정함으로써, DNAzyme 활성으로부터 생성된 전자가 전극으로 빠르게 왕복하여 측정 가능한 전류를 생성할 수 있다. 이러한 전기화학적 판독으로 DNAzyme 활성의 미세한 변화를 검출할 수 있었다. 이를 인식 나노구조체와 결합함으로써, 본 발명자들은 스크램블된 서열(서열 번호 15)의 1011개 카피로도 신호가 없는 특정 표적의 101개 카피를 검출할 수 있었다(도 6a). 신호는 몇 분 안에 스크램블된 표적과는 구별될 수 있으며, 20분 이내에 포화에 도달할 수 있다(도 6b).
실시예 5
기능 제어를 위한 고정화된 나노구조체
상이한 나노구조체를 상이한 환경 및 기능의 순차적 순서에서 이들의 기능을 제어하기 위해 표면 고정화시킬 수 있다. 구체적으로, 본원에 기술된 나노구조체는 금, 폴리스티렌과 같은 상이한 다른 표면에 고정될 수 있으며, 실리카가 사용될 수 있다. 이러한 표면은 카보디이미드, 석신이미드, 또는 디티올 가교결합, 금-티올 또는 아비딘-비오틴과 같은 다양한 일반적인 생체접합(bioconjugation) 반응을 통해 기능화된다. 링커 및 표면 처리 그룹(예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리(에틸렌 옥사이드))의 포함을 통해, 표면 밀도 및 분자 구성을 최적화하여 기능 제어 및 표면 패턴화를 달성할 수 있다. 예를 들면, 인간 베타 액틴에 대한 유전자를 인식하는 실시예 4에 기술된 고정화된 인식 나노구조체(서열 번호 11 및 12)를 사용하여, 본 발명자들은 고정화가 DNA 폴리머라제에 결합하고 억제하는 기능에 영향을 미치지 않음을 입증한다. 고정된 나노구조체가 없는 동일한 표면은 폴리머라제를 비활성화할 수 없었으며, 이는 이것이 인식 나노구조체의 특성임을 입증한다. 중요하게도, 고정된 인식 나노구조체는 이의 프로그래밍된 표적 핵산 서열에 결합할 수 있었고 필적하는 능력으로 폴리머라제를 활성화할 수 있었다(도 7). 나노구조체는 또한 다른 분자 구성으로 고정될 수 있으며(도 7), 이에 의해 기능의 순차적 순서(정보 흐름)가 가능해진다. 이러한 고정화는 다양한 표적의 검출을 위한 어레이형 패턴화를 가능하게 하고, 다양한 나노구조체 기능(예를 들어, 용해 완충액, 세제, 에틸렌디아민테트라아세트산, 또는 IgG, 헤모글로빈, 프로테아제 및 헤파린과 같은 생물학적 샘플의 성분)을 억제할 수 있는 다양한 환경에서 분석 성능을 개선한다[Zumla, A. et al., Lancet Infect Dis 14: 1123-1135 (2014)]. 따라서 이러한 시스템은 광범위한 정제 단계를 필요로 하지 않으면서 샘플을 직접 검출할 수 있다.
요지
본 발명의 이점은 다음을 포함한다::
1. 비-촉매적 나노구조체를 능가하는 개선된 속도 및 감도;
2. 향상된 휴대 가능성(portability)을 위해, 상이한 환경에서, 다양한 판독 방식을 갖는 개선된 성능;
3. 다른 나노구조체 기능을 억제하는, 상이한 환경에서 개선된 분석 성능;
참고문헌
1. Gardner, S. N., Kuczmarski, T. A., Vitalis, E. A. & Slezak, T. R. Limitations of TaqMan PCR for detecting divergent viral pathogens illustrated by hepatitis A, B, C, and E viruses and human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol 41, 2417-2427 (2003).
2. Ho, N. R. Y. et al. Visual and modular detection of pathogen nucleic acids with enzyme-DNA molecular complexes. Nature Communications 9, 3238 (2018).
3. Juskowiak, B. Nucleic acid-based fluorescent probes and their analytical potential. Anal Bioanal Chem 399, 3157-3176 (2011).
4. Li, W. et al. Insight into G-quadruplex-hemin DNAzyme/RNAzyme: adjacent adenine as the intramolecular species for remarkable enhancement of enzymatic activity. Nucleic acids research 44, 7373-7384 (2016).
5. Niemz, A., Ferguson, T. M. & Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol 29, 240-250 (2011).
6. Nelms, B. L. & Labosky, P. A. A predicted hairpin cluster correlates with barriers to PCR, sequencing and possibly BAC recombineering. Scientific Reports 1, 106 (2011).
7. Nong, R. Y., Gu, J., Darmanis, S., Kamali-Moghaddam, M. & Landegren, U. DNA-assisted protein detection technologies. Expert Rev Proteomics 9, 21-32 (2012).
8. Yeh, E. C. et al. Self-powered integrated microfluidic point-of-care low-cost enabling (SIMPLE) chip. Sci Adv 3, e1501645 (2017).
9. Zhao, Y., Chen, F., Li, Q., Wang, L. & Fan, C. Isothermal Amplification of Nucleic Acids. Chem Rev 115, 12491-12545 (2015).
10. Zumla, A. et al. Rapid point of care diagnostic tests for viral and bacterial respiratory tract infections--needs, advances, and future prospects. Lancet Infect Dis 14, 1123-1135 (2014).
SEQUENCE LISTING <110> National University of Singapore Agency for Science, Technology and Research <120> Responsive, Catalytic Nucleic Acid Nanostructures <130> SP102527WO <150> SG10202003188S <151> 2020-04-07 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex Hemin DNAzyme <400> 1 ctgggaggga gggaggga 18 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polymerase-responsive element 1 <400> 2 ctgggaggga gggagggaat gctaacgcat tgtcgatagc 40 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polymerase-responsive element 2 <400> 3 gctatcgaca atgcgtt 17 <210> 4 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex Hemin DNAzyme catalytic nanostructure 1 <400> 4 ctgggaggga gggagggaat gctaacgcat tgtcgatagc tctgtcgcta tcgacaatgc 60 gtt 63 <210> 5 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex Hemin DNAzyme catalytic nanostructure 2 <400> 5 ctgggaggga gggagggaat gctaacgcat tgtcgatagc tctgtcgcta tcgacaatgc 60 gttagcat 68 <210> 6 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex Hemin DNAzyme catalytic nanostructure 3 <400> 6 ctgggaggga gggagggaat gctaacgcat tgtcgatagc tctgtcgcta tcgacaatgc 60 gttagcatcc c 71 <210> 7 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex Hemin DNAzyme catalytic nanostructure 4 <400> 7 ctgggaggga gggagggaat gctaacgcat tgtcgatagc tctgtcgcta tcgacaatgc 60 gttagcatcc ctccc 75 <210> 8 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex Hemin DNAzyme catalytic nanostructure 5 <400> 8 ctgggaggga gggagggaat gctaacgcat tgtcgatagc tctgtcgcta tcgacaatgc 60 gttagcatcc ctccctccc 79 <210> 9 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-quadruplex Hemin DNAzyme catalytic nanostructure 6 <400> 9 ctgggaggga gggagggaat gctaacgcat tgtcgatagc tctgtcgcta tcgacaatgc 60 gttagcatcc ctccctccct cccag 85 <210> 10 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Self-priming portion of signaling nanostructure <400> 10 aacgcattgt cgatagctca gctgtctgag ctatcgacaa tgcgtt 46 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition nanostructure 1 <400> 11 tgcaaggccg gcttcgcggg caatgtacag tattg 35 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recognition nanostructure 2 <400> 12 cccgcgaagc cggccttgca catgccggag ccgttgtcga 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target nucleic acid 1 <400> 13 tcgacaacgg ctccggcatg tgcaaggccg gcttcgcggg 40 <210> 14 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target nucleic acid 2 <400> 14 ucgacaacgg cuccggcaug ugcaaggccg gcuucgcggg 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scrambled sequence <400> 15 gagtaccgcc ccccggtttg gtacggcggc ggtgcgacaa 40 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPCAM aptamer/inverter <400> 16 cagacgcaac ctctgtagtg caatgtacag tattg 35 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPCAM aptamer/inverter 2 <400> 17 cactacagag gttgcgtctg tcccacgttg tcatgggggg ttggcctg 48 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Conserved sequence <400> 18 caatgtacag tattg 15

Claims (16)

  1. DNAzyme/RNAzyme 및 자극 반응성 요소(stimulus responsive element)를 포함하는 촉매 핵산 나노구조체(catalytic nucleic acid nanostructure).
  2. 제1항에 있어서, DNAzyme/RNAzyme이
    리보뉴클레아제 8-17, 리보뉴클레아제 10-23 또는 Dz10-66 데옥시리보자임과 같은 리보뉴클레아제;
    10MD5 데옥시리보자임 또는 9NL27 데옥시리보자임과 같은 데옥시리보뉴클레아제;
    G-사중가닥(G-quadruplex) Hemin과 같은 퍼옥시다제;
    E47 데옥시리보자임과 같은 결찰 활성(ligation activity)을 갖는 효소;
    14WM9 데옥시리보자임과 같은 포스파타제;
    AmideAm1 데옥시리보자임과 같은 아미드 가수분해제; 및
    9F7 데옥시리보자임 또는 7S11 데옥시리보자임과 같은 RNA 분지 효소(RNA branching enzyme)를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 촉매 핵산 나노구조체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 자극 반응성 요소가 폴리머라제의 존재하에 DNAzyme/RNAzyme 활성을 억제하는 폴리머라제-반응성 요소를 포함하는 촉매 핵산 나노구조체.
  4. 제3항에 있어서. 폴리머라제-반응성 요소가 내부 헤어핀 구조를 갖는 촉매 핵산 나노구조체.
  5. 제4항에 있어서. 폴리머라제-반응성 요소의 폴리머라제 신장이 촉매 활성을 제거하는 촉매 핵산 나노구조체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, DNAzyme/RNAzyme 활성이 퍼옥시다제 활성인 촉매 핵산 나노구조체.
  7. 제6항에 있어서, 퍼옥시다제 기질의 활성이 비색(colorimetric), 형광, 전기화학적 또는 발광 수단을 포함하지만 이에 제한되지 않는 상이한 방식(modality)에 의해 검출되는 촉매 핵산 나노구조체.
  8. (a) 시험 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 촉매 핵산 나노구조체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
    (c) DNAzyme/RNAzyme 기질 및, 임의로, 신호 발생 시약(signal development reagent)의 존재하에 a)의 샘플을 b)의 조성물과 접촉시키는 단계;
    (d) 신호 발생을 검출하는 단계(여기서, 신호의 강도는 샘플에서 폴리머라제 활성의 양에 반비례한다)를 포함하여, 시험 샘플에서 폴리머라제 활성을 검출하는 방법.
  9. (a) 시험 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 적어도 하나의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 하나의 인식 나노구조체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계(여기서, 인식 나노구조체는 샘플에서 상기 표적 분자를 인식하도록 적응된 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 앱타머(aptamer)를 포함한다);
    (c) 적어도 하나의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 하나의 인식 나노구조체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계(여기서, 인식 나노구조체는 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 갖는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 앱타머를 포함하고, 여기서 가변 서열 영역은 인버터(inverter) 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트(overhang segment)를 포함하고 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부와 이중체를 형성하며, 여기서 인버터 올리고뉴클레오티드는 가변 이중체 영역보다 더 높은 친화도(affinity)로 샘플에서 상기 표적 분자를 인식하도록 적응된다);
    (d) 시험 샘플을 (b) 또는 (c)의 조성물과 접촉시키는 단계(여기서,
    (i) (b)의 앱타머의 인식 서열 영역에 결합하는 표적 분자는 안정한 앱타머-DNA 폴리머라제 효소 복합체의 형성을 촉진하여 DNA 폴리머라제 효소 활성을 억제하거나;
    (ii) (c)의 인버터 올리고뉴클레오티드에 결합하는 표적 분자는 인식 나노구조체를 불안정하게 하여 DNA 앱타머에 의한 억제로부터 DNA 폴리머라제 효소를 해제한다);
    (e) 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 촉매 핵산 나노구조체를 제공하는 단계;
    (f) DNAzyme/RNAzyme 기질 및, 임의로, 신호 발생 시약의 존재하에 단계 (b) 또는 (c)로부터의 나노구조체를 접촉시키는 단계;
    (g) 신호 발생을 검출하는 단계(여기서, 신호의 강도는
    (i) 조성물 (b)를 사용하는 경우 샘플에서 표적 분자의 존재; 또는
    (ii) 조성물 (c)를 사용하는 경우 샘플에서 표적 분자의 부재를 나타낸다)를 포함하여, 샘플에서 표적 분자를 검출하는 방법.
  10. (a) 핵산을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 적어도 하나의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 하나의 인식 나노구조체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계(여기서, 인식 나노구조체는 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 갖는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 앱타머를 포함하고, 여기서 가변 서열 영역은 샘플의 표적 핵산에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함한다); 또는
    (c) 적어도 하나의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 하나의 인식 나노구조체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계(여기서, 인식 나노구조체는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 앱타머 및 인버터 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 앱타머는 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 갖고, 여기서 가변 서열 영역은 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함하고 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부와 이중체를 형성하며, 여기서 인버터 올리고뉴클레오티드는 앱타머-인버터 이중체보다 적어도 하나의 뉴클레오티드가 더 길고 샘플의 표적 핵산에 상보적인 10개 이상의 뉴클레오티드를 갖는다);
    (d) 핵산을 포함하는 샘플을 (b) 또는 (c)의 조성물과 접촉시키는 단계(여기서,
    (i) (b)의 앱타머의 가변 서열 영역에 결합하는 표적 핵산은 안정한 앱타머-DNA 폴리머라제 효소 복합체의 형성을 촉진하여 DNA 폴리머라제 효소 활성을 억제하거나;
    (ii) (c)의 인버터 올리고뉴클레오티드에 결합하는 표적 핵산은 인식 나노구조체를 불안정하게 하여 DNA 앱타머에 의한 억제로부터 DNA 폴리머라제 효소를 해제한다);
    (e) 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 촉매 핵산 나노구조체를 제공하는 단계;
    (f) DNAzyme/RNAzyme 기질 및, 임의로, 신호 발생 시약의 존재하에 단계 (d)로부터의 나노구조체를 접촉시키는 단계;
    (g) 신호 발생을 검출하는 단계(여기서, 신호의 강도는
    (i) 조성물 (b)를 사용하는 경우 샘플에서 표적 핵산의 존재; 또는
    (ii) 조성물 (c)를 사용하는 경우 샘플에서 표적 핵산의 부재를 나타낸다)를 포함하여, 샘플에서 표적 핵산을 검출하는 방법.
  11. 표면에 고정된 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 촉매 핵산 나노구조체를 포함하는 장치(device).
  12. 제11항에 있어서,
    (i) 제1 위치에, 제10항에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 하나의 인식 나노구조체를 포함하는 조성물 b) 또는 조성물 c);
    (ii) 제2 위치에 부착된, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 촉매 핵산 나노구조체; 및
    (iii) 상기 검출 나노구조체를 샘플 핵산과 혼합하여 활성 효소를 상기 제2 위치로 방출하기 위한 중간 스테이지를 포함하는 장치.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 미세유체 장치(microfluidic device) 및 측방 유동 장치(lateral flow device)를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 장치.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 전극을 포함하는 장치.
  15. (a) 적어도 하나의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 하나의 인식 나노구조체를 포함하는 조성물(여기서, 인식 나노구조체는 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 갖는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 앱타머를 포함하고, 여기서 가변 서열 영역은 표적 핵산에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함한다); 및/또는
    (b) 적어도 하나의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 하나의 인식 나노구조체를 포함하는 조성물(여기서, 인식 나노구조체는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 앱타머 및 인버터 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 앱타머는 보존된 서열 영역과 가변 서열 영역을 갖고, 여기서 가변 서열 영역은 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함하고 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부와 이중체를 형성하며, 여기서 인버터 올리고뉴클레오티드는 앱타머-인버터 이중체보다 적어도 하나의 뉴클레오티드가 더 길고 표적 핵산에 상보적인 10개 이상의 뉴클레오티드를 갖는다); 임의로
    (c) 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 촉매 핵산 나노구조체; 임의로
    (d) DNAzyme/RNAzyme 기질 및, 임의로,
    (e) 신호 발생 시약을 포함하는 핵산 검출 키트(kit).
  16. (a) 적어도 하나의 DNA 폴리머라제 효소 및 적어도 하나의 인식 나노구조체를 포함하는 조성물(여기서, 인식 나노구조체는 보존된 서열 영역 및 가변 서열 영역을 갖는 DNA 폴리머라제 효소-특이적 DNA 앱타머를 포함하고, 여기서 가변 서열 영역은 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 적어도 10개의 뉴클레오티드인 오버행 세그먼트를 포함하고 인버터 올리고뉴클레오티드의 일부와 이중체를 형성하며, 여기서 인버터 올리고뉴클레오티드는 가변 이중체 영역보다 더 높은 친화도로 샘플에서 상기 표적 분자를 인식하도록 적응된다);
    (b) 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 촉매 핵산 나노구조체; 임의로
    (c) DNAzyme/RNAzyme 기질 및, 임의로,
    (d) 신호 발생 시약을 포함하는 분자 검출 키트.
KR1020227038489A 2020-04-07 2021-04-07 폴리머라제-반응성 촉매 핵산 나노구조체 KR20230004558A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SG10202003188S 2020-04-07
SG10202003188S 2020-04-07
PCT/SG2021/050194 WO2021206635A1 (en) 2020-04-07 2021-04-07 Polymerase-responsive catalytic nucleic acid nanostructures

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230004558A true KR20230004558A (ko) 2023-01-06

Family

ID=78026170

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227038489A KR20230004558A (ko) 2020-04-07 2021-04-07 폴리머라제-반응성 촉매 핵산 나노구조체

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230159990A1 (ko)
EP (1) EP4133082A4 (ko)
JP (1) JP2023521752A (ko)
KR (1) KR20230004558A (ko)
CN (1) CN116018409A (ko)
WO (1) WO2021206635A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102661292B1 (ko) * 2021-09-09 2024-04-30 포항공과대학교 산학협력단 금속 이온 반응성 dna 중합 효소 스위치 및 이에 의해 제어되는 등온 증폭 방법
CN114591983B (zh) * 2022-04-12 2023-07-21 中山大学 一种基于dna纳米技术的蛋白质邻近标记方法及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11202013188QA (en) * 2018-07-03 2021-01-28 Nat Univ Singapore Visual and modular detection of nucleic acids with enzyme-assisted nanotechnology
CN109439659A (zh) * 2018-11-13 2019-03-08 湖南工程学院 一种核酸适体核酶序列
CN109837356B (zh) * 2019-03-14 2019-10-25 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN116018409A (zh) 2023-04-25
EP4133082A1 (en) 2023-02-15
EP4133082A4 (en) 2024-05-08
JP2023521752A (ja) 2023-05-25
WO2021206635A1 (en) 2021-10-14
US20230159990A1 (en) 2023-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pumford et al. Developments in integrating nucleic acid isothermal amplification and detection systems for point-of-care diagnostics
JP7449269B2 (ja) 酵素利用ナノテクノロジーを用いた、モジュール方式の視覚的な核酸検出
DE60036307D1 (de) Fluoreszenzintensitätstest für duplex- und triplex-nukleinsäurehybridisierung in lösung unter verwendung von fluoreszenzinterkalatoren
KR20210038541A (ko) 핵산 검출 방법
KR20230004558A (ko) 폴리머라제-반응성 촉매 핵산 나노구조체
JP2012055311A (ja) 増幅用一般バッファー
Zhang et al. Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method: a feasibility study
CN113403424A (zh) 基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法及试剂盒
Agrawal et al. Rapid detection of SARS-CoV-2 with Cas13
Li et al. A simple and rapid method to assay SARS-CoV-2 RNA based on a primer exchange reaction
US20120100526A1 (en) Identification and differentiation of nucleic acid sequence using temperature-dependent hybridization
JP7030051B2 (ja) ２以上の標的核酸を検出するためのプライマーセット、キット及び方法
EP1668158B1 (en) Rna detection and quantitation
CN115232865A (zh) 基于适配体和CRISPR/Cas12a系统的生物传感器、组合物、试剂盒及其用途
US20220220536A1 (en) Compositions and methods of using a dna nanoswitch for the detection of rna
Peeters et al. Specific magnetic isolation for direct detection of HPV16
US20240043945A1 (en) Catalytic amplification by transition-state molecular switches for direct and sensitive detection of sars-cov-2
US20110318740A1 (en) Reduced Interference from Single Strand Binding Proteins
Pumford et al. Developments in integrating nucleic acid isothermal amplification and detection systems for
JP2024506277A (ja) 脱塩基核酸を有する配列変換及びシグナル増幅ｄｎａ、並びにそれを使用する検出方法
CN113817873A (zh) 一种用于新冠病毒d614g突变的检测方法及试剂盒
JP2007330134A (ja) 核酸の検出方法