CN113403424A

CN113403424A - 基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN113403424A
Application number: CN202110589822.8A
Authority: CN
Inventors: 黄黎珍; 何昌生; 莫国圣; 杜红丽; 林采玲; 万延斌; 武鹭婷; 左青霞; 冯东燕; 许万青; 孙琪; 谢震燊; 庄镇豪
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2021-05-28
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2041-05-28
Also published as: CN113403424B

Abstract

本发明公开一种基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法及试剂盒，属于生物技术领域。本发明通过LbaCas12/crRNA系统的单碱基分辨率能力，通过分别设计针对新冠病毒的非突变的靶点N501和突变靶点Y501的501‑crRNA‑W以及501‑crRNA‑M，对样品分子进行检测，只需要一台PCR仪或者恒温装置和简易荧光读取装置，当使用两个crRNA同时检测同一个样品的时候，可快速、有效区分待测核酸样品是非突变株还是突变株，同时具有高特异性、高灵敏度以及低成本的特点，更加广泛适用于各种分子诊断实验室。本发明对新冠病毒疫情防控具有重要意义。

Description

基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于快速检测新冠病毒 (SARS-CoV-2)和突变株(N501Y突变)的方法及试剂盒，具体是利用 Cas12a/crRNA特异性快速检测SARS-CoV-2和变异株的N501Y突变。

背景技术

随着感染人数增多，SARS-CoV-2突变也逐渐增加累加。N501Y突变是位于新冠病毒(SARS-CoV-2)S蛋白上的单碱基突变(S基因上1501A>T)。N501Y 突变是新冠病毒突变中的一个关键突变，有研究表明N501Y突变提高了病毒进入细胞的效率，从而增加病毒的传染性。此外，N501Y变异还会降低新冠康复者血清的中和能力，对于新冠疫情的防控与治疗带来非常大的不稳定性。

目前检测新冠病毒突变的主要方法仍然是通过全基因组测序(WGS)或者 Sanger测序的方法进行，不仅速度慢且不适合所有分子诊断实验室。因此开发一种快速的、灵敏的、便捷的、低成本的新冠病毒突变N501Y的检测方法及试剂盒对于本领域疫情防控与治疗、新冠突变株的早期发现具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于 CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法。该方法是一种利用LbaCas12a/crRNA系统进行新冠病毒和突变株的N501Y突变的检测方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的试剂盒，包括LbaCas12a、针对非突变株N501的特异性501-crRNA-W序列、针对突变株Y501 的特异性501-crRNA-M序列、针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-RAA引物或RT-PCR引物、报告单链DNA分子；

为了更好的实现本发明，所述试剂盒可结合RT-RAA、RT-RPA等恒温扩增技术或着逆转录PCR(RT-PCR)技术进行新冠病毒核酸的逆转录以及扩增；

优选的，所述试剂盒还包括A Buffer、NEBuffer2.1、RNase Inhibitor、冻干 RT-RAA反应微球、MgAc。

所述的N501的特异性501-crRNA-W序列如SEQ ID NO：1所示，Y501的特异性501-crRNA-M序列如SEQ ID NO：2所示，与传统crRNA设计不同，该序列是通过引入突变并进行筛选后获得的高特异且高灵敏序列。

所述的针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-RAA引物为501-RT-RAA-F/R 引物组(SEQ ID NO：3～4)，所述RT-RAA引物是通过新冠病毒高通量序列比对，分析引物候选区域的突变频率，结合新冠病毒分子流行病学特征及RT-RAA 引物需求筛选出来的高效特异序列；

所述的针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-PCR引物为501-RT-PCR-F/R 引物组(SEQ ID NO：5～6)，所述RT-PCR引物是通过新冠病毒高通量序列比对，分析引物候选区域的突变频率，结合新冠病毒分子流行病学特征及RT-PCR 引物需求筛选出来的高效特异序列；

所述的501-RT-RAA-F/R引物组用于扩增含有与501-crRNA-W和/或 501-crRNA-M互补的核酸片段；

所述的501-RT-PCR-F/R引物组用于扩增含有于501-crRNA-W和/或 501-crRNA-M互补的核酸片段；

所述的报告单链DNA分子为SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。

一种基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：

(1)针对新冠病毒野生株以及突变株的基因组序列，设计非突变N501和突变Y501位点特异性的501-crRNA-W和501-crRNA-M序列，与传统crRNA 设计不同，该序列是通过引入突变并进行筛选后获得的高特异且高灵敏序列。设计的crRNA序列如序列表中SEQ IDNO：1～2所示，再构建501-crRNA-W 和501-crRNA-M体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；

(2)针对步骤(1)所述的新冠病毒的非突变N501及突变靶点Y501设计 RT-RAA引物，所述RT-RAA引物是通过新冠病毒高通量序列比对，统计每个碱基的突变频率，筛选出来的突变频率低(小于千分之一)的序列。再根据RT-RAA 引物设计原则，从这些突变频率低且特异的序列中筛选并验证得到扩增效率好且特异性高的序列作为RT-RAA引物，引物序列如序列表中SEQ ID NO：3～4 所示，对待测核酸样品进行RT-RAA反应，获得RT-RAA反应产物；或者，针对步骤(1)所述的新冠病毒的非突变N501以及突变靶点Y501设计RT-PCR引物，所述RT-PCR引物是通过新冠病毒高通量序列比对，统计每个碱基的突变频率，筛选出来的突变频率低(小于万分之一)的序列。再根据RT-PCR引物设计原则，从这些突变频率低且特异的序列中筛选并验证得到扩增效率好且特异性高的序列作为RT-PCR引物，引物序列如序列表中SEQ ID NO：5～6所示，对待测核酸样品进行RT-PCR反应，获得RT-PCR反应产物；

(3)将步骤(1)所述的纯化后的crRNA体外转录产物或合成的 501-crRNA-W和/或501-crRNA-M分子、步骤(2)所述RT-RAA或者RT-PCR 反应产物、LbaCas12a、报告单链DNA分子以适当比例混合于适当体系中进行反应；通过反应进程中连续动力学研究，选取最优反应时间；

(4)反应产物通过侧流免疫层析试纸或荧光检测获得检测结果。

优选的，步骤(1)中，新冠病毒野生株基因组的NCBI登录号为NC_045512.2，突变株参考基因序列的NCBI登录号为MW803161.1。

优选的，步骤(1)中所述的将设计的501-crRNA-W和501-crRNA-M序列的合成方法为：构建501-crRNA-W和501-crRNA-M体外转录载体并进行体外转录和纯化，或直接化学合成，但不限于此。

优选的，步骤(2)中所述的待测核酸样品可以为从临床样本中抽提的核酸，或者以其他核酸检测手段中样本处理方法处理过的样品。

优选的，步骤(3)中所述的LbaCas12a可以由重组表达和纯化获得或使用 NEB的LbaCase12a产品；

优选的，步骤(3)中的报告单链DNA分子设计：用于侧流免疫层析试纸检测时，两端分别带有Digoxin和Biotin基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-Digoxin-NNNNNNNNNNNN-Biotin-3′(SEQ ID NO：7)，但不限于此；

用于荧光检测时，两端分别带有FAM和BHQ1基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-BHQ1-3′(SEQ ID NO：8)，但不限于此。

优选的，用于侧流免疫层析试纸检测时，步骤(3)中所述的反应体系为40μL 体系中，50～250nM LbaCas12a，100～500nM 501-crRNA-W和/或501-crRNA-M， 2nM～4nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor(TaKaRa)，5～20μL RT-RAA 反应产物或者RT-PCR反应产物，1×NEBuffer2.1；其中，LbaCas12a与501-crRNA-W和/或501-crRNA-M的摩尔比为1：2；

进一步优选的，用于侧流免疫层析试纸检测时，步骤(3)中所述的反应体系为40μL体系中，50nM LbaCas12a，100nM 501-crRNA-W和/或501-crRNA-M， 2nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor(TaKaRa)，5μL RT-RAA反应产物或者RT-PCR反应产物，1×NEBbuffer2.1；

优选的，用于荧光检测时，步骤(3)中所述的反应体系为20μL体系中， 50～250nMLbaCas12a，100～500nM 501-crRNA-W和/或501-crRNA-M，500～ 1000nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor(TaKaRa)，2.5～10μL RT-RAA 反应产物或者RT-PCR反应产物，1×NEBbuffer2.1；其中，LbaCas12a与 501-crRNA-W和/或501-crRNA-M的摩尔比为1：2；

进一步优选的，用于荧光检测时，步骤(3)中所述的反应体系为20μL体系中，50nMLbaCas12a，100nM 501-crRNA-W和/或501-crRNA-M，500nM报告单链DNA分子，10U RNaseinhibitor(TaKaRa)，2.5μL RT-RAA反应产物或者 RT-PCR反应产物，1×NEBbuffer2.1；

优选的，步骤(3)中的反应体系可以进行冻干，冻干方法为将配制好的反应体系(不含RT-RAA反应产物或RT-PCR反应产物)置于-80℃冰箱冷冻过夜后，-50℃真空干燥12h；用于荧光检测时，冻干后的反应体系使用方法为用10～ 17.5μL无RNA酶水溶解冻干反应体系，加入2.5～10μL RT-RAA反应产物或 RT-PCR反应产物后进行反应；用于侧流免疫试纸条检测时，冻干后反应体系使用方法为用20～35μL的无RNA酶水溶解冻干反应体系，加入5～20μL RT-RAA 反应产物或RT-PCR反应产物后进行反应。

优选的，步骤(3)中所述的反应的条件为37℃反应20～60分钟；更优选为30分钟。

优选的，步骤(4)中侧流免疫层析试纸的设计：侧流免疫层析试纸采用商业化侧向层析检测试纸条(Magigen)，在侧流免疫层析试纸上依次有上样区， Gold-NP抗地高辛抗体区，链霉亲和素条带(即检测带条带)，抗抗体条带(即质控带)。

优选的，步骤(4)中的侧流免疫层析试纸的检测方法为将试纸上样区浸泡至步骤(3)反应体积中，室温孵育5min后肉眼读取检测条带强度；或者其他侧流试纸按照对应的显色方法进行。

优选的，步骤(4)中的荧光检测所用的检测装置可以为常用的酶标仪或任何能在FAM荧光通道上进行荧光激发并检测的荧光检测装置。

更优选的，步骤(4)中的荧光检测采用的检测条件为使用波长492nm的激发光激发荧光，在波长522nm处检测荧光强度。

本发明的机理是：

LbaCas12酶在特征性crRNA序列引导下可靶向与其互补的DNA，激活其顺式反应活性，同时激活其反式切割活性，非特异性切割荧光或生物素标记的单链DNA探针分子，从而可以通过荧光或者侧流免疫试纸条检测。

本发明通过LbaCas12/crRNA系统的单碱基分辨率能力，通过分别设计针对新冠病毒的非突变的靶点N501和突变靶点Y501的501-crRNA-W以及 501-crRNA-M，当使用两个crRNA同时检测同一个样品的时候，根据检测结果的差异可有效区分待测核酸样品是非突变株还是突变株。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明相对于现有检测新冠病毒N501Y突变的测序方法而言，利用 LbaCas12a/crRNA对样品分子进行检测，只需要一台PCR仪或者恒温装置和简易荧光读取装置，可快速从新冠病毒阳性样品中区分N501Y突变株，同时具有高特异性、高灵敏度以及低成本的特点，更加广泛适用于各种分子诊断实验室。本发明可快速有效地区分新冠病毒非突变株和突变株，对新冠病毒疫情防控具有重要意义。

附图说明

图1是新冠病毒针对非突变株(WT)N501和突变株(MT)Y501所设计地特异性501-crRNA-W和501-crRNA-M对应地靶点及其PAM(TTTN)序列设计。

图2是实施例1中RT-PCR-Cas12a核酸检测系统荧光法检测新冠病毒N501 非突变株和Y501突变株的结果；其中，检测样品是不同浓度的Y501(MT)， RT-RCR扩增引物采用SEQID NO：5～6所示序列；n＝3，靶点核酸浓度为 10^-14M，10^-15M，10^-16M，10^-17M，BC(空白对照)，误差线：±SD，****：p<0.0001。

图3是实施例1中RT-RAA-Cas12a核酸检测系统荧光法检测新冠病毒N501 非突变株和Y501突变株的结果；其中，检测样品是不同浓度的Y501(MT)， RT-RAA扩增引物采用SEQID NO：3～4所示序列；n＝3，靶点核酸浓度为 10^-16M，10^-17M，BC(空白对照)，误差线：±SD，****：p<0.0001。

图4是实施例2中RT-PCR-Cas12a核酸检测系统侧流试纸法检测新冠病毒N501非突变株和Y501突变株的结果；其中，检测样品是不同浓度的Y501(MT)， RT-PCR扩增引物采用SEQ ID NO：5～6所示序列；靶点核酸浓度为10^-13M， 10^-14M，10^-15M，10^-16M，BC(空白对照)；W和M分别对应的是501-crRNA-W 和501-crRNA-M。

图5是实施例2中RT-RAA-Cas12a核酸检测系统侧流试纸法检测新冠病毒 N501非突变株和Y501突变株的结果；其中，检测样品是不同浓度的Y501(MT)， RT-RAA扩增引物采用SEQ ID NO：3～4所示序列；靶点核酸浓度为10^-13M， 10^-14M，10^-15M，10^-16M，BC(空白对照)；W和M分别对应的是501-crRNA-W 和501-crRNA-M。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。

实施例1：

本发明实施例中，基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒非突变和突变株特征序列核酸，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：

(1)针对新冠病毒(SARS-CoV-2)非突变N501(密码子AAT)和突变 Y501(密码子TAT)分别设计其特征性的501-crRNA-W和501-crRNA-M，与传统crRNA设计不同，该序列是通过引入突变并进行筛选后获得的高特异且高灵敏序列，如图1和表1中SEQ ID NO：1～2所示，再构建501-crRNA-W和 501-crRNA-M的转录载体，然后转录并纯化。

表1crRNA序列及RT-RAA引物、RT-PCR引物序列

名称		序列
			501-crRNA-W	SEQ ID NO：1	UUUC caUcccacuaaugguguu
501-crRNA-M	SEQ ID NO：2	UUUC caUcccacuUaugguguu
			501-RT-RAA-F	SEQ ID NO：3	cctgtatagattgtttaggaagtctaatctc
501-RT-RAA-R	SEQ ID NO：4	cctgttaaaccattgaagttgaaattgacac
			501-RT-PCR-F	SEQ ID NO：5	ctcaaaccttttgagagaga
501-RT-PCR-R	SEQ ID NO：6	atgtctctgccaaattgttg

具体的，crRNA体外转录的方法为：在以下体系中37℃反应16小时： Nuclease-free water加至20μL，NTP各1.5μL，10×reaction buffer 1.5μL，Template DNA 1μg，T7RNA Polymerase Mix 1.5μL。

具体的，crRNA转录产物的纯化方法为：转录产物用DNaseI(TaKaRa)处理15分钟后，使用NEB RNA Cleanup Kit试剂盒或者其他的RNA纯化试剂盒纯化转录后的crRNA。

(2)针对已发表的新冠病毒基因组(基因组序列信息来源于GISAID各国提交的新冠病毒序列(截止至2021年01月13日)，共360482条序列。 https://www.gisaid.org/)序列，在501-crRNA-W/M靶点附近选择相对保守且特异的区域作为RT-RAA的引物，所述RT-RAA引物是通过新冠病毒高通量序列比对，统计每个碱基的突变频率，筛选出来的突变频率低(小于千分之一)的序列。再根据RT-RAA引物设计原则，从这些突变频率低且特异的序列中筛选并验证得到扩增效率好且特异性高的序列作为RT-RAA引物，表1中SEQ ID NO：3～4所示。

待测核酸样品预处理方法为取样品溶液2μL进行RT-RAA扩增，所得的扩增产物即处理的核酸样品；本实施例中涉及待测核酸样品为体外转录的包含设计的靶向片段的RNA分子。

RT-RAA反应体系：50μL体系中，上游引物(501-RT-RAA-F)400nM，下游引物(501-RT-RAA-R)400nM，A Buffer(购自众测生物有限公司)41.5μL，待测核酸样品模板2μL。将上述体系混合后加至冻干RT-RAA反应微球，加入醋酸镁MgAc 280mM 2.5μL后37℃以启动反应。

或者，针对已经发表的新冠病毒基因组序列，在501-crRNA-W/M靶点附近选择相对保守且特异的区域作为RT-PCR的引物，所述RT-PCR引物是通过新冠病毒高通量序列比对，统计每个碱基的突变频率，筛选出来的突变频率低(小于万分之一)的序列。再根据RT-PCR引物设计原则，从这些突变频率低且特异的序列中筛选并验证得到扩增效率好且特异性高的序列作为RT-PCR引物，表1 中SEQ ID NO：5～6所示。

待测核酸样品预处理方法为取样品溶液18.5μL进行RT-PCR扩增，所得的扩增产物即处理的核酸样品；本实施例中涉及待测核酸样品为体外转录的包含设计的靶向片段的RNA分子。

RT-PCR反应体系：50μL体系中，上游引物(501-RT-PCR-F)400nM，下游引物(501-RT-PCR-R)400nM，25μL 2×Buffer mix(包含缓冲体系和dNTP)，2.5μL enzyme mix(包含逆转录酶、RNA酶抑制剂以及DNA聚合酶)，和18.5μL 待测核酸模板。

RT-PCR反应程序：50℃30min；94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s， 30个循环；72℃5min；4℃保存。

(3)报告单链DNA分子的设计：两端分别带有FAM和BHQ1基团的12 碱基随机单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-BHQ1-3′(SEQ ID NO：8)。

(4)将上述501-crRNA-W或501-crRNA-M体外转录产物、处理的核酸样品、LbaCas12a、报告单链DNA分子以适当比例混合于适当体系中进行反应。

(5)反应体系为：20μL体系中，50nM LbaCas12a，100nM 501-crRNA-W(或 501-crRNA-M)，500nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor(TaKaRa)， 2.5μL处理的核酸样品，1×NEBbuffer2.1。反应体系在37℃反应30分钟。

(6)反应产物在荧光检测装置，使用波长492nm的激发光激发荧光，在波长522nm处检测荧光强度以获得检测结果。

(7)以RT-PCR扩增引物(SEQ ID NO：5～6)为例，结果如图2所示，表明靶标核酸浓度在10^-16M及以上通过本检测方法可有效区分非突变N501型和突变Y501型新冠病毒。

(8)以RT-RAA扩增引物(SEQ ID NO：3～4)为例，结果如图3所示，表明靶标核酸浓度在10^-16M及以上通过本检测方法可有效区分非突变N501型和突变Y501型新冠病毒。

实施例2：

具体的，crRNA转录产物的纯化方法为：转录产物用DNaseI(TaKaRa)处理15分钟后，使用NEB RNA Cleanup Kit试剂盒或者其他RNA纯化试剂盒纯化转录后的crRNA。

(2)针对已发表的新冠病毒基因组序列，在501-crRNA-W/M靶点附近选择相对保守且特异的区域作为RT-RAA的引物，所述RT-RAA引物是通过新冠病毒高通量序列比对，统计每个碱基的突变频率，筛选出来的突变频率低(小于千分之一)的序列。再根据RT-RAA引物设计原则，从这些突变频率低且特异的序列中筛选并验证得到扩增效率好且特异性高的序列作为RT-RAA引物，表1中SEQ ID NO：3～4所示。

RT-RAA反应体系：50μL体系中，上游引物(501-RT-RAA-F)400nM，下游引物(501-RT-RAA-R)400nM，A Buffer 41.5μL，待测核酸样品模板2μL。将上述体系混合后加至冻干RT-RAA反应微球，加入醋酸镁MgAc 280mM 2.5μL 后37℃以启动反应。

RT-PCR反应体系：50μL体系中，上游引物(501-RT-PCR-F)400nM，下游引物(501-RT-PCR-R)400nM，25μL 2×Buffer mix(包含缓冲体系和dNTP)， 2.5μL enzyme mix(包含逆转录酶、RNA酶抑制剂以及DNA聚合酶)，和18.5μL 待测核酸模板。

(3)报告单链DNA分子的设计：两端分别带有Digoxin和Biotin基团的 12碱基随机单链DNA分子5′-Digoxin-NNNNNNNNNNNN-Biotin-3′(SEQ ID NO：7)。

(5)反应体系为：40μL体系中，50nM LbaCas12a，100nM 501-crRNA-W(或 501-crRNA-M)，2nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor(TaKaRa)，5μL 处理的核酸样品，1×NEBbuffer2.1。反应体系在37℃反应30分钟。

(6)将侧流免疫层析试纸上样区浸泡至上述反应混合液中室温孵育5min，肉眼读取试纸条带以获得检测结果。

(7)以RT-PCR扩增引物(SEQ ID NO：5～6)为例，结果如图4所示，表明靶标核酸浓度在10^-15M及以上通过本检测方法可有效区分N501非突变型和Y501突变型新冠病毒。

(8)以RT-RAA扩增引物(SEQ ID NO：3～4)为例，结果如图5所示，表明靶标核酸浓度在10^-15M及以上通过本检测方法可有效区分N501非突变型和Y501突变型新冠病毒。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法及试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 501-crRNA-W

<400> 1

uuuccauccc acuaauggug uu 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 501-crRNA-M

<400> 2

uuuccauccc acuuauggug uu 22

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 501-RT-RAA-F

<400> 3

cctgtataga ttgtttagga agtctaatct c 31

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 501-RT-RAA-R

<400> 4

cctgttaaac cattgaagtt gaaattgaca c 31

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 501-RT-PCR-F

<400> 5

ctcaaacctt ttgagagaga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 501-RT-PCR-R

<400> 6

atgtctctgc caaattgttg 20

<210> 7

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(1)

<223> Digoxin修饰

<220>

<221> modified_base

<222> (12)..(12)

<223> Biotin修饰

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 7

nnnnnnnnnn nn 12

<210> 8

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(1)

<223> FAM修饰

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(1)

<223> BHQ1修饰

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 8

nnnnnnnnnn nn 12

Claims

1.一种基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的试剂盒，其特征在于：包括LbaCas12a、针对非突变株N501的特异性501-crRNA-W序列、针对突变株Y501的特异性501-crRNA-M序列、针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-RAA引物或RT-PCR引物、报告单链DNA分子；

所述的N501的特异性501-crRNA-W序列如SEQ ID NO：1所示，Y501的特异性501-crRNA-M序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-RAA引物为SEQ ID NO：3～4所示的501-RT-RAA-F/R引物组；

所述的针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-PCR引物为SEQ ID NO：5～6所示的501-RT-PCR-F/R引物组；

所述的501-RT-RAA-F/R引物组用于扩增含有与501-crRNA-W和/或501-crRNA-M互补的核酸片段；

所述的501-RT-PCR-F/R引物组用于扩增含有于501-crRNA-W和/或501-crRNA-M互补的核酸片段。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的试剂盒，其特征在于：

所述的报告单链DNA分子为SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。

3.一种基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法，其特征在于：该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：

(1)针对新冠病毒野生株以及突变株的基因组序列，设计非突变N501和突变Y501位点特异性的501-crRNA-W和501-crRNA-M序列，设计的crRNA序列如序列表中SEQ ID NO：1～2所示，再构建501-crRNA-W和501-crRNA-M体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；

(2)针对步骤(1)所述的新冠病毒的非突变N501及突变靶点Y501设计RT-RAA引物，引物序列如序列表中SEQ ID NO：3～4所示，对待测核酸样品进行RT-RAA反应，获得RT-RAA反应产物；或者，针对步骤(1)所述的新冠病毒的非突变N501以及突变靶点Y501设计RT-PCR引物，引物序列如序列表中SEQ ID NO：5～6所示，对待测核酸样品进行RT-PCR反应，获得RT-PCR反应产物；

(3)将步骤(1)所述的纯化后的crRNA体外转录产物或合成的501-crRNA-W和/或501-crRNA-M分子、步骤(2)所述RT-RAA或者RT-PCR反应产物、LbaCas12a、报告单链DNA分子以适当比例混合于适当体系中进行反应；

4.根据权利要求3所述的基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法，其特征在于：

步骤(3)中的报告单链DNA分子设计：用于侧流免疫层析试纸检测时，两端分别带有Digoxin和Biotin基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-Digoxin-NNNNNNNNNNNN-Biotin-3′，见SEQ ID NO：7；

用于荧光检测时，两端分别带有FAM和BHQ1基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-BHQ1-3′，见SEQ ID NO：8。

5.根据权利要求3或4所述的基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法，其特征在于：

用于侧流免疫层析试纸检测时，步骤(3)中所述的反应体系为40μL体系中，50～250nMLbaCas12a，100～500nM 501-crRNA-W和/或501-crRNA-M，2nM～4nM报告单链DNA分子，10URNase inhibitor，5～20μL RT-RAA反应产物或者RT-PCR反应产物，1×NEBuffer2.1；其中，LbaCas12a与501-crRNA-W和/或501-crRNA-M的摩尔比为1：2；

用于荧光检测时，步骤(3)中所述的反应体系为20μL体系中，50～250nM LbaCas12a，100～500nM 501-crRNA-W和/或501-crRNA-M，500～1000nM报告单链DNA分子，10U RNaseinhibitor，2.5～10μL RT-RAA反应产物或者RT-PCR反应产物，1×NEBbuffer2.1；其中，LbaCas12a与501-crRNA-W和/或501-crRNA-M的摩尔比为1：2。

6.根据权利要求5所述的基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法，其特征在于：

用于侧流免疫层析试纸检测时，步骤(3)中所述的反应体系为40μL体系中，50nMLbaCas12a，100nM 501-crRNA-W和/或501-crRNA-M，2nM报告单链DNA分子，10U RNaseinhibitor，5μL RT-RAA反应产物或者RT-PCR反应产物，1×NEBbuffer2.1；

用于荧光检测时，步骤(3)中所述的反应体系为20μL体系中，50nM LbaCas12a，100nM501-crRNA-W和/或501-crRNA-M，500nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor，2.5μLRT-RAA反应产物或者RT-PCR反应产物，1×NEBbuffer2.1。

7.根据权利要求3或4所述的基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法，其特征在于：

步骤(3)中的反应体系进行冻干，冻干方法为将配制好的不含RT-RAA反应产物或RT-PCR反应产物的反应体系置于-80℃冰箱冷冻过夜后，-50℃真空干燥12h；用于荧光检测时，冻干后的反应体系使用方法为用10～17.5μL无RNA酶水溶解冻干反应体系，加入2.5～10μLRT-RAA反应产物或RT-PCR反应产物后进行反应；用于侧流免疫试纸条检测时，冻干后反应体系使用方法为用20～35μL的无RNA酶水溶解冻干反应体系，加入5～20μL RT-RAA反应产物或RT-PCR反应产物后进行反应。

8.根据权利要求3或4所述的基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的反应的条件为37℃反应20～60分钟。

9.根据权利要求3或4所述的基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法，其特征在于：

步骤(4)中的侧流免疫层析试纸的检测方法为将试纸上样区浸泡至步骤(3)反应体积中，室温孵育5min后肉眼读取检测条带强度；或者其他侧流试纸按照对应的显色方法进行；

步骤(4)中的荧光检测所用的检测装置为酶标仪或任何能在FAM荧光通道上进行荧光激发并检测的荧光检测装置。

10.根据权利要求9所述的基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法，其特征在于：

步骤(4)中的荧光检测采用的检测条件为使用波长492nm的激发光激发荧光，在波长522nm处检测荧光强度。