CN113817873A - 一种用于新冠病毒d614g突变的检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种用于新冠病毒d614g突变的检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于新冠病毒D614G突变的检测方法及试剂盒，属于生物技术领域。本发明通过LbaCas12/crRNA系统的单碱基分辨率能力，通过分别设计针对新冠病毒的非突变的靶点D614和突变靶点G614的614‑crRNA‑W以及614‑crRNA‑M，对样品分子进行检测，只需要一台PCR仪或者恒温装置和简易荧光读取装置，当使用两个crRNA分别检测同一个样品的时候，可快速、有效区分待测核酸样品是非突变株还是突变株，同时具有高特异性、高灵敏度以及低成本的特点，更加广泛适用于各种分子诊断实验室。本发明可快速有效地区分新冠病毒非突变株和突变株，对新冠病毒疫情防控具有重要意义。

Description

一种用于新冠病毒D614G突变的检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测新冠病毒(SARS-CoV-2)D614G突变的快速检测方法及试剂盒，具体是利用Cas12a/crRNA特异性快速检测SARS-CoV-2变异株的D614G突变。
背景技术
如今，随着新冠感染人数的增多，SARS-CoV-2突变也逐渐增加。该SARS-CoV-2病毒在人群中的大流行会导致突变的出现并积累，从而改变发病机制、毒性和/或传播性的突变。最近的研究发现，SARS-CoV-2毒株的刺突糖蛋白(S蛋白)中，在614号位编码天冬氨酸(D)的基因突变成了编码甘氨酸(G)的基因，即：D614G。该突变最早发现于英国的SARS-CoV-2变异株中，并很快在全球扩散，成为现今主要流行的突变株。而且，研究表明D614G比疫情最初流行的野生型病毒株复制更快速，更易传播。原因在于，D614G突变增强S蛋白切割能力，其结合ACE2并融合进入细胞的可能性更大。这使得病毒有更强感染能力，极大增强其在人群中的传染性。另外，该突变还可使康复患者血清中和效应大幅降低，增大了COVID-19的后续治疗难度。
总而言之，新冠病毒S蛋白的D614G突变改变了S蛋白甚至是整个病毒的免疫原性，进而降低了康复期患者血清对病毒的敏感性。亟需一种快速高效识别新冠病毒D614G突变的方法。但目前，检测新冠病毒突变的主要方法仍然是通过全基因组测序(WGS)或者sanger测序的方法进行，不仅速度慢且不适合所有分子诊断实验室。因此，开发一种快速的、灵敏的、便捷的、低成本的新冠病毒突变检测方法及试剂盒对于本领域疫情防控、新冠突变株的早期发现具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种用于新冠病毒D614G突变的检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种用于新冠病毒D614G突变的检测方法。该方法是一种利用LbaCas12a/crRNA系统进行新冠病毒D614G突变的检测方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种用于新冠病毒D614G突变的快速检测试剂盒，包括LbaCas12a、针对非突变株D614的特异性614-crRNA-W序列、针对突变株G614的特异性614-crRNA-M序列、针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-RAA引物或RT-PCR引物、报告单链DNA分子；
为了更好的实现本发明，所述试剂盒可结合RT-RAA、RT-RPA等恒温扩增技术或着逆转录PCR(RT-PCR)技术进行新冠病毒核酸的逆转录以及扩增；
优选的，所述试剂盒还包括A Buffer、NEBuffer2.1、RNase Inhibitor、冻干RT-RAA反应微球、MgAc。
所述的D614的特异性614-crRNA-W序列如SEQ ID NO：1所示，G614的特异性614-crRNA-M序列如SEQ ID NO：2所示；
所述的针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-RAA引物为614-RT-RAA-primer F/R引物组(SEQ ID NO：3～4)；
所述的针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-PCR引物为614-RT-PCR-primer F/R引物组(SEQ ID NO：5～6)；
所述的614-RT-RAA-primer F/R引物组用于扩增含有与614-crRNA-W和/或614-crRNA-M互补的核酸片段；
所述的614-RT-PCR-primerF/R引物用于扩增含有于614-crRNA-W和/或614-crRNA-M互补的核酸片段；
所述的报告单链DNA分子为SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。
一种用于新冠病毒D614G突变的快速检测方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
(1)针对新冠病毒野生株以及突变株的基因组序列，设计非突变D614和突变G614位点特异性的614-crRNA-W和614-crRNA-M序列，与传统crRNA设计不同，该序列是通过引入突变并进行筛选后获得的高特异且高灵敏序列。设计的crRNA序列如序列表中SEQ ID NO：1～2所示，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；
(2)针对步骤(1)所述的新冠病毒的非突变D614及突变靶点G614设计RT-RAA引物，引物序列如序列表SEQ ID NO：3～4所示，对待测核酸样品进行RT-RAA反应，获得RT-RAA反应产物；或者，针对步骤(1)所述的新冠病毒的非突变D614以及突变靶点G614设计RT-PCR引物，序列如序列表SEQ ID NO：5～6所示，对待测核酸样品进行RT-PCR反应，获得RT-PCR反应产物；
(3)将步骤(1)所述的纯化后的crRNA体外转录产物或合成的614-crRNA-W或614-crRNA-M分子、步骤(2)所述RT-RAA或者RT-PCR反应产物、LbaCas12a、报告单链DNA分子以适当比例混合于适当体系中进行反应；
(4)反应产物通过荧光或侧流免疫层析试纸检测获得检测结果。
优选的，步骤(1)中，新冠病毒野生株基因组的NCBI登录号为NC_045512.2，突变株参考基因序列的NCBI登录号为MZ773928.1。
优选的，步骤(1)中所述的将设计的614-crRNA-W和614-crRNA-M序列的合成方法为：构建614-crRNA-W和614-crRNA-M序列体外转录载体并进行体外转录和纯化，或直接化学合成，但不限于此。
优选的，步骤(2)中所述的待测核酸样品可以为从临床样本中抽提的核酸，或者以其他核酸检测手段中样本处理方法处理过的样品。
优选的，步骤(3)中所述的LbaCas12a可以由重组表达和纯化获得或使用NEB的LbaCase12a产品；
优选的，步骤(3)中的报告单链DNA分子设计：用于侧流免疫层析试纸检测时，两端分别带有Digoxin和Biotin基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-Digoxin-NNNNNNNNNNNN-Biotin-3′(SEQ ID NO：7)，但不限于此；
用于荧光检测时，两端分别带有FAM和BHQ1基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-BHQ1-3′(SEQ ID NO：8)，但不限于此。
优选的，用于侧流免疫层析试纸检测时，步骤(3)中所述的反应体系为40μL体系中，50～250nM LbaCas12a，100～500nM 614-crRNA-W或614-crRNA-M，2～4nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor(TaKaRa)，5～20μL RT-RAA反应产物或者RT-PCR反应产物，1×NEBuffer2.1；其中，LbaCas12a与614-crRNA-W或614-crRNA-M的摩尔比为1：2；
进一步优选的，用于侧流免疫层析试纸检测时，步骤(3)中所述的反应体系为40μL体系中，50nM LbaCas12a，100nM 614-crRNA-W或614-crRNA-M，2nM报告单链DNA分子，10URNase inhibitor(TaKaRa)，5μL RT-RAA反应产物或者RT-PCR反应产物，1×NEBbuffer2.1；
优选的，用于荧光检测时，步骤(3)中所述的反应体系为20μL体系中，50～250nMLbaCas12a，100～500nM 614-crRNA-W或614-crRNA-M，500～1000nM报告单链DNA分子，10URNase inhibitor(TaKaRa)，2.5～10μL RT-RAA反应产物或者RT-PCR反应产物，1×NEBbuffer2.1；其中，LbaCas12a与614-crRNA-W或614-crRNA-M的摩尔比为1：2；
进一步优选的，用于荧光检测时，步骤(3)中所述的反应体系为20μL体系中，50nMLbaCas12a，100nM 614-crRNA-W或614-crRNA-M，500nM报告单链DNA分子，10U RNaseinhibitor(TaKaRa)，2.5μL RT-RAA反应产物或者RT-PCR反应产物，1×NEBbuffer2.1；
优选的，步骤(3)中的反应体系可以进行冻干，冻干方法为将配制好的反应体系(不含RT-RAA反应产物或RT-PCR反应产物)置于-80℃冰箱冷冻过夜后，-50℃真空干燥12h；用于荧光检测时，冻干后的反应体系使用方法为用10～17.5μL无RNA酶水溶解冻干反应体系，加入2.5～10μL RT-RAA反应产物或RT-PCR反应产物后进行反应；用于测流免疫试纸条检测时，冻干后反应体系使用方法为用20～35μL的无RNA酶水溶解冻干反应体系，加入5～20μL RT-RAA反应产物或RT-PCR反应产物后进行反应。
优选的，步骤(3)中所述的反应的条件为37℃反应20～60分钟；更优选为30分钟。
优选的，步骤(4)中侧流免疫层析试纸的设计：测流免疫层析试纸采用商业化侧向层析检测试纸条(Magigen)，在侧流免疫层析试纸上依次有上样区，Gold-NP抗地高辛抗体区，链霉亲和素条带(即检测带条带)，抗抗体条带(即质控带)。
优选的，步骤(4)中的侧流免疫层析试纸的检测方法为将试纸上样区浸泡至步骤(3)反应体积中，室温孵育5min后肉眼读取检测条带强度；或者其他侧流试纸按照对应的显色方法进行。
优选的，步骤(4)中的荧光检测所用的检测装置可以为常用的酶标仪或任何能在FAM荧光通道上进行荧光激发并检测的荧光检测装置。
更优选的，步骤(4)中的荧光检测采用的检测条件为：使用波长492nm的激发光激发荧光，在波长522nm处检测荧光强度。
本发明的机理是：
LbaCas12酶在特征性crRNA引导下可靶向与其互补的DNA，激活其顺式反应活性，同时激活其反式切割活性，非特异性切割荧光或生物素标记的单链DNA探针分子，从而可以通过荧光或者测流免疫试纸条检测。
本发明通过LbaCas12/crRNA系统的单碱基分辨率能力，通过分别设计针对新冠病毒的非突变的靶点D614和突变靶点G614的614-crRNA-W以及614-crRNA-M，当使用两个crRNA分别检测同一个样品的时候，根据检测结果的差异可有效区分待测核酸样品是非突变株还是突变株。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明相对于现有检测新冠病毒D614G突变的测序方法而言，利用LbaCas12a/crRNA对样品分子进行检测，只需要一台PCR仪或者恒温装置和简易荧光读取装置，可快速从新冠病毒阳性样品中区分D614G突变株，同时具有高特异性、高灵敏度以及低成本的特点，更加广泛适用于各种分子诊断实验室。本发明可快速有效地区分新冠病毒非突变株和突变株，对新冠病毒疫情防控具有重要意义。
附图说明
图1是新冠病毒针对非突变D614(WT)和突变G614(MT)所设计地特异性614-crRNA-W和614-crRNA-M对应地靶点及其PAM(TTTN)序列设计；电泳图是体外验证crRNA的切割有效性及特异性，向D614非突变或G614突变底物中加入614-crRNA-W和614-crRNA-M检测体系，或者不加入crRNA的NC对照组检测体系。
图2是实施例1中RT-RAA-Cas12a核酸检测系统荧光法检测新冠病毒D614非突变株和G614突变株的结果；其中，检测样品是不同浓度的G614(MT)，RT-RAA扩增引物采用SEQ IDNO：3～4所示序列；n＝3，靶点核酸浓度为10-16M，10-17M；BC(空白对照)，误差线：±SD，****：p<0.0001。
图3是实施例1中RT-PCR-Cas12a核酸检测系统荧光法检测新冠病毒D614非突变株和G614突变株结果；其中，检测样品是不同浓度的G614(MT)，RT-PCR扩增引物采用SEQ IDNO：5～6所示序列；n＝3，靶点核酸浓度为10-14M，10-15M，10-16M，10-17M，BC(空白对照)，误差线：±SD，**：p<0.01。
图4是实施例2中RT-RAA-Cas12a核酸检测系统侧流试纸法检测新冠病毒D614非突变株和G614突变株的结果；其中，检测样品是不同浓度的G614(MT)，RT-PCR扩增引物采用SEQ ID NO：3～4所示序列；靶点核酸浓度为10-14M，10-15M，10-16M，10-17M，BC(空白对照)；W和M分别对应的是614-crRNA-W和614-crRNA-M。
图5是实施例2中RT-PCR-Cas12a核酸检测系统侧流试纸法检测新冠病毒D614非突变株和G614突变株的结果；其中，检测样品是不同浓度的G614(MT)，RT-PCR扩增引物采用SEQ ID NO：5～6所示序列；靶点核酸浓度为10-14M，10-15M，10-16M，BC(空白对照)；W和M分别对应的是614-crRNA-W和614-crRNA-M。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1：
本发明实施例中，基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒非突变和突变株特征序列核酸，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
(1)针对新冠病毒非突变D614(密码子GGA)和突变G614(密码子GGG)分别设计其特征性的614-crRNA-W和614-crRNA-M，与传统crRNA设计不同，该序列是通过引入突变并进行筛选后获得的高特异且高灵敏序列，如图1和表1中SEQ ID NO：1～2所示，再构建614-crRNA-W和614-crRNA-M的转录载体，然后转录并纯化。
表1 crRNA序列及RT-RAA引物、RT-PCR引物序列
名称 序列
614-crRNA-W SEQ ID NO：1 ucaCgauguuaacugcac
614-crRNA-M SEQ ID NO：2 ucaCgGuguuaacugcac
614-RT-RAA-primer F SEQ ID NO：3 cacttgagattcttgacattacaccatgttc
614-RT-RAA-primer R SEQ ID NO：4 cattagaacctgtagaataaacacgccaagtag
614-RT-PCR-primer F SEQ ID NO：5 caacaatttggcagagacat
614-RT-PCR-primer R SEQ ID NO：6 cctgtagaataaacacgccaa
具体的，crRNA体外转录的方法为：在以下体系中37℃反应16小时：Nuclease-freewater加至20μL，NTP各1.5μL，10×reaction buffer 1.5μL，Template DNA 1μg，T7 RNAPolymerase Mix 1.5μL。
具体的，crRNA转录产物的纯化方法为：转录产物用DNaseI(TaKaRa)处理15分钟后，使用NEB RNA Cleanup Kit试剂盒或者其他的RNA纯化试剂盒纯化转录后的crRNA。
验证设计的crRNA靶点切割有效性，在20μL体系中，50nM LbaCas12a，100nM 614-crRNA-W或614-crRNA-M，5nM D614非突变(D614-WT)或G614突变(G614-MT)线性化DNA双链，10U RNase inhibitor(TaKaRa)，1×NEBbuffer2.1。反应条件为37℃，60min。反应完成后，取适量反应体系进行凝胶电泳。结果如图1所示，表明设计的614-crRNA-W或614-crRNA-M可有效区分D614非突变和G614突变DNA靶标。
其中，线性化DNA双链为包含设计的靶向片段的DNA分子。
(2)针对已发表的新冠病毒基因组(基因组序列信息来源于GISAID各国提交的新冠病毒序列(截止至2021年01月13日)，共360482条序列。https://www.gisaid.org/)序列，在614-crRNA-W/M靶点附近选择相对保守且特异的区域作为RT-RAA的引物，表中SEQ IDNO：3～4所示。
待测核酸样品预处理方法为取样品溶液2μL进行RT-RAA扩增，所得的扩增产物即处理的核酸样品；本实施例中涉及待测核酸样品为体外转录的包含设计的靶向片段的RNA分子。
RT-RAA反应体系：50μL体系中，上游引物(614-RT-RAA-primer F)400nM，下游引物(614-RT-RAA-primer R)400nM，A Buffer(购自众测生物有限公司)41.5μL，待测核酸样品模板2μL。将上述体系混合后加至冻干RT-RAA反应微球，加入醋酸镁MgAc 280mM 2.5μL后37℃以启动反应。
或者，针对已经发表的新冠病毒基因组序列，在614-crRNA-W/M靶点附近选择相对保守且特异的区域作为RT-PCR的引物，表中SEQ ID NO：5～6所示。
待测核酸样品预处理方法为取样品溶液18.5μL进行RT-PCR扩增，所得的扩增产物即处理的核酸样品；本实施例中涉及待测核酸样品为体外转录的包含设计的靶向片段的RNA分子。
RT-PCR反应体系：50μL体系中，上游引物(614-RT-PCR-primer F)400nM，下游引物(614-RT-PCR-primer R)400nM，25μL 2×Buffer mix(包含缓冲体系和dNTP)，2.5μLenzyme mix(包含逆转录酶、RNA酶抑制剂以及DNA聚合酶)，和18.5μL待测核酸模板。
RT-PCR反应程序：50℃30min；94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min；4℃保存。
(3)报告单链DNA分子的设计：两端分别带有FAM和BHQ1基团的12碱基随机单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-BHQ1-3′(SEQ ID NO：8)。
(4)将上述614-crRNA-W或614-crRNA-M体外转录产物、处理的核酸样品、LbaCas12a、报告单链DNA分子以适当比例混合于适当体系中进行反应。
(5)反应体系为：20μL体系中，50nM LbaCas12a，100nM 614-crRNA-W(或614-crRNA-M)，500nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor(TaKaRa)，2.5μL处理的核酸样品，1×NEBbuffer2.1。反应体系在37℃反应30分钟。
(6)反应产物在荧光检测装置，使用波长492nm的激发光激发荧光，在波长522nm处检测荧光强度以获得检测结果。
(7)以RT-RAA扩增引物(SEQ ID NO：3～4)为例，结果如图2所示，表明靶标核酸浓度在10-17M及以上通过本检测方法可有效区分非突变D614型和突变G614型新冠病毒。
(8)以RT-PCR扩增引物(SEQ ID NO：5～6)为例，结果如图3所示，表明靶标核酸浓度在10-17M及以上通过本检测方法可有效区分非突变D614型和突变G614型新冠病毒。
实施例2：
本发明实施例中，基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒非突变和突变株特征序列核酸，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
(2)针对新冠病毒非突变D614(密码子GGA)和突变G614(密码子GGG)分别设计其特征性的614-crRNA-W和614-crRNA-M，图1和表1中SEQ ID NO：1～2所示，再构建614-crRNA-W和614-crRNA-M的转录载体，然后转录并纯化。
具体的，crRNA体外转录的方法为：在以下体系中37℃反应16小时：Nuclease-freewater加至20μL，NTP各1.5μL，10×reaction buffer 1.5μL，Template DNA 1μg，T7 RNAPolymerase Mix 1.5μL。
具体的，crRNA转录产物的纯化方法为：转录产物用DNaseI(TaKaRa)处理15分钟后，使用NEB RNA Cleanup Kit试剂盒或者其他RNA纯化试剂盒纯化转录后的crRNA。
(2)针对已发表的新冠病毒基因组序列，在614-crRNA-W/M靶点附近选择相对保守且特异的区域作为RT-RAA的引物，表中SEQ ID NO：3～4所示。
待测核酸样品预处理方法为取样品溶液2μL进行RT-RAA扩增，所得的扩增产物即处理的核酸样品；本实施例中涉及待测核酸样品为体外转录的包含设计的靶向片段的RNA分子。
RT-RAA反应体系：50μL体系中，上游引物(614-RT-RAA-primer F)400nM，下游引物(614-RT-RAA-primer R)400nM，A Buffer 41.5μL，待测核酸样品模板2μL。将上述体系混合后加至冻干RT-RAA反应微球，加入醋酸镁MgAc 280mM2.5μL后37℃以启动反应。
或者，针对已经发表的新冠病毒基因组序列，在614-crRNA-W/M靶点附近选择相对保守且特异的区域作为RT-PCR的引物，表中SEQ ID NO：5～6所示。
待测核酸样品预处理方法为取样品溶液18.5μL进行RT-PCR扩增，所得的扩增产物即处理的核酸样品；本实施例中涉及待测核酸样品为体外转录的包含设计的靶向片段的RNA分子。
RT-PCR反应体系：50μL体系中，上游引物(614-RT-PCR-primer F)400nM，下游引物(614-RT-PCR-primer R)400nM，25μL 2×Buffer mix(包含缓冲体系和dNTP)，2.5μLenzyme mix(包含逆转录酶、RNA酶抑制剂以及DNA聚合酶)，和18.5μL待测核酸模板。
RT-PCR反应程序：50℃30min；94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s,30个循环；72℃5min；4℃保存。
(3)报告单链DNA分子的设计：两端分别带有Digoxin和BHQ1基团的12碱基随机单链DNA分子5′-Digoxin-NNNNNNNNNNNN-Biotin-3′(SEQ ID NO：7)。
(4)将上述614-crRNA-W或614-crRNA-M体外转录产物、处理的核酸样品、LbaCas12a、报告单链DNA分子以适当比例混合于适当体系中进行反应。
(5)反应体系为：40μL体系中，50nM LbaCas12a，100nM 614-crRNA-W(或614-crRNA-M)，2nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor(TaKaRa)，5μL处理的核酸样品，1×NEBbuffer2.1。反应体系在37℃反应30分钟。
(6)将测流免疫层析试纸上样区浸泡至上述反应混合液中室温孵育5min，肉眼读取试纸条带以获得检测结果。
(7)以RT-RAA扩增引物(SEQ ID NO：3～4)为例，结果如图4所示，表明靶标核酸浓度在10-15M及以上通过本检测方法可有效区分D614非突变型和G614突变型新冠病毒。
(8)以RT-PCR扩增引物(SEQ ID NO：5～6)为例，结果如图5所示，表明靶标核酸浓度在10-15M及以上通过本检测方法可有效区分D614非突变型和G614突变型新冠病毒。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种用于新冠病毒D614G突变的检测方法及试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 614-crRNA-W
<400> 1
ucacgauguu aacugcac 18
<210> 2
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 614-crRNA-M
<400> 2
ucacgguguu aacugcac 18
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 614-RT-RAA-primer F
<400> 3
cacttgagat tcttgacatt acaccatgtt c 31
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 614-RT-RAA-primer R
<400> 4
cattagaacc tgtagaataa acacgccaag tag 33
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 614-RT-PCR-primer F
<400> 5
caacaatttg gcagagacat 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 614-RT-PCR-primer R
<400> 6
cctgtagaat aaacacgcca a 21
<210> 7
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<222> (1)..(1)
<223> Digoxin修饰
<220>
<222> (12)..(12)
<223> Biotin修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 7
nnnnnnnnnn nn 12
<210> 8
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<222> (1)..(1)
<223> FAM修饰
<220>
<222> (12)..(12)
<223> BHQ1修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 8
nnnnnnnnnn nn 12

Claims (10)

1.一种用于新冠病毒D614G突变的检测试剂盒，其特征在于：包括LbaCas12a、针对非突变株D614的特异性614-crRNA-W序列、针对突变株G614的特异性614-crRNA-M序列、针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-RAA引物或RT-PCR引物、报告单链DNA分子；
所述的D614的特异性614-crRNA-W序列如SEQ ID NO：1所示，G614的特异性614-crRNA-M序列如SEQ ID NO：2所示；
所述的针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-RAA引物为如SEQ ID NO：3～4所示的614-RT-RAA-primer F/R引物组；所述的614-RT-RAA-primer F/R引物组用于扩增含有与614-crRNA-W和/或614-crRNA-M互补的核酸片段；
所述的针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-PCR引物为如SEQ ID NO：5～6所示的614-RT-PCR-primer F/R引物组；所述的614-RT-PCR-primerF/R引物用于扩增含有于614-crRNA-W和/或614-crRNA-M互补的核酸片段。
2.根据权利要求1所述的用于新冠病毒D614G突变的检测试剂盒，其特征在于：
所述的报告单链DNA分子为SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。
3.一种用于新冠病毒D614G突变的检测方法，其特征在于：该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
(1)针对新冠病毒野生株以及突变株的基因组序列，设计非突变D614和突变G614位点特异性的614-crRNA-W和614-crRNA-M序列，设计的crRNA序列如序列表中SEQ ID NO：1～2所示，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；
(2)针对步骤(1)所述的新冠病毒的非突变D614及突变靶点G614设计RT-RAA引物，引物序列如序列表SEQ ID NO：3～4所示，对待测核酸样品进行RT-RAA反应，获得RT-RAA反应产物；或者，针对步骤(1)所述的新冠病毒的非突变D614以及突变靶点G614设计RT-PCR引物，序列如序列表SEQ ID NO：5～6所示，对待测核酸样品进行RT-PCR反应，获得RT-PCR反应产物；
(3)将步骤(1)所述的纯化后的crRNA体外转录产物或合成的614-crRNA-W或614-crRNA-M分子、步骤(2)所述RT-RAA或者RT-PCR反应产物、LbaCas12a、报告单链DNA分子以适当比例混合于适当体系中进行反应；
(4)反应产物通过荧光或侧流免疫层析试纸检测获得检测结果。
4.根据权利要求3所述的用于新冠病毒D614G突变的检测方法，其特征在于：
步骤(3)中的报告单链DNA分子设计：用于侧流免疫层析试纸检测时，两端分别带有Digoxin和Biotin基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-Digoxin-NNNNNNNNNNNN-Biotin-3′，见SEQ ID NO：7；
用于荧光检测时，两端分别带有FAM和BHQ1基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-BHQ1-3′，见SEQ ID NO：8。
5.根据权利要求3或4所述的用于新冠病毒D614G突变的检测方法，其特征在于：
用于侧流免疫层析试纸检测时，步骤(3)中所述的反应体系为40μL体系中，50～250nMLbaCas12a，100～500nM 614-crRNA-W或614-crRNA-M，2～4nM报告单链DNA分子，10U RNaseinhibitor，5～20μL RT-RAA反应产物或者RT-PCR反应产物，1×NEBuffer2.1；其中，LbaCas12a与614-crRNA-W或614-crRNA-M的摩尔比为1：2；
用于荧光检测时，步骤(3)中所述的反应体系为20μL体系中，50～250nM LbaCas12a，100～500nM 614-crRNA-W或614-crRNA-M，500～1000nM报告单链DNA分子，10U RNaseinhibitor，2.5～10μL RT-RAA反应产物或者RT-PCR反应产物，1×NEBbuffer2.1；其中，LbaCas12a与614-crRNA-W或614-crRNA-M的摩尔比为1：2。
6.根据权利要求5所述的用于新冠病毒D614G突变的检测方法，其特征在于：
用于侧流免疫层析试纸检测时，步骤(3)中所述的反应体系为40μL体系中，50nMLbaCas12a，100nM 614-crRNA-W或614-crRNA-M，2nM报告单链DNA分子，10U RNaseinhibitor，5μL RT-RAA反应产物或者RT-PCR反应产物，1×NEBbuffer2.1；
用于荧光检测时，步骤(3)中所述的反应体系为20μL体系中，50nM LbaCas12a，100nM614-crRNA-W或614-crRNA-M，500nM报告单链DNA分子，10U RNase inhibitor，2.5μL RT-RAA反应产物或者RT-PCR反应产物，1×NEBbuffer2.1。
7.根据权利要求3或4所述的用于新冠病毒D614G突变的检测方法，其特征在于：
步骤(3)中的反应体系进行冻干，冻干方法为将配制好的不含RT-RAA反应产物或RT-PCR反应产物的反应体系置于-80℃冰箱冷冻过夜后，-50℃真空干燥12h；用于荧光检测时，冻干后的反应体系使用方法为用10～17.5μL无RNA酶水溶解冻干反应体系，加入2.5～10μLRT-RAA反应产物或RT-PCR反应产物后进行反应；用于测流免疫试纸条检测时，冻干后反应体系使用方法为用20～35μL的无RNA酶水溶解冻干反应体系，加入5～20μL RT-RAA反应产物或RT-PCR反应产物后进行反应。
8.根据权利要求3或4所述的用于新冠病毒D614G突变的检测方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的反应的条件为37℃反应20～60分钟。
9.根据权利要求3或4所述的用于新冠病毒D614G突变的检测方法，其特征在于：
步骤(4)中的侧流免疫层析试纸的检测方法为将试纸上样区浸泡至步骤(3)反应体积中，室温孵育5min后肉眼读取检测条带强度；或者其他侧流试纸按照对应的显色方法进行；
步骤(4)中的荧光检测所用的检测装置为酶标仪或任何能在FAM荧光通道上进行荧光激发并检测的荧光检测装置。
10.根据权利要求9所述的用于新冠病毒D614G突变的检测方法，其特征在于：
步骤(4)中的荧光检测采用的检测条件为使用波长492nm的激发光激发荧光，在波长522nm处检测荧光强度。
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