KR102555330B1 - SARS-CoV-2 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 SARS-CoV-2의 진단방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신종 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)의 감염 여부를 진단하기 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 및 이를 이용하여 신종 코로나바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 신종 코로나바이러스에 감염된 세포에서 가장 풍부하게 존재하는 리더 (leader) 서열을 타겟으로 하여 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머를 포함하는 신종 코로나바이러스의 감염 여부를 진단하기 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 및 이를 이용하여 신종 코로나바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신종 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)의 감염 여부를 진단하기 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 및 이를 이용하여 신종 코로나바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 신종 코로나바이러스에 감염된 세포에서 가장 풍부하게 존재하는 리더 (leader) 서열을 타겟으로 하여 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머를 포함하는 신종 코로나바이러스의 감염 여부를 진단하기 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트 및 이를 이용하여 신종 코로나바이러스의 감염 여부를 진단하는 방법에 관한 것이다.
코로나바이러스 (Coronavirus)는 약 27-32 kb 정도의 (+) strand RNA genome 단일 조각으로 구성된 바이러스로서 사람과 다른 포유동물들에 분포한다. 코로나바이러스는 복제와 전사과정을 거쳐서 게놈-RNA (genome-RNA)와 3' 말단에 공통의 mRNA를 가지는 서브게놈 RNA (subgenomic RNA) 6~8개를 생산한다고 알려져 있다 (Imbert I et al.; A second, non-canonical RNA-dependent RNA polymerase in SARS Coronavirus. The EMBO Journal. 2006, 25:4933-4942).
대부분의 사람에서 코로나바이러스 감염은 가벼운 증상을 나타내나 감염력이 높아 지난 20여 년간 10,000명 이상의 사람에 SARS (중증호흡기증후군, 치사율 10%) 코로나바이러스 및 MERS (중동호흡기증후군, 치사율 37%) 코로나바이러스가 감염되었다 (Chaolin Huang, Yeming Wang, Xingwang Li, Lili Ren, Jianping Zhao, Yi Hu et al.; Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet 2020).
다만, 최근에 발견된 신종 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 감염증은 2019년 12월 1일 중국에서 발견 (Chaolin Huang, Yeming Wang, Xingwang Li, Lili Ren, Jianping Zhao, Yi Hu et al.; Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet 2020) 되어 2019년 12월 12일 최초 보고된 급성 호흡기 증후군으로, 발열과 기침, 호흡곤란, 비정형 폐렴 등의 증세를 보인다.
2020년 1월부터는 중국 국외로도 광범위하게 전파되었으며, 중국내 춘절 연휴를 전후하여 빠른 전염으로 감염자 급증, 우한시 도시 기능 전체가 마비되는 등 우려할 사태로 발전하고 있다.
일반적으로 바이러스의 게놈을 분석하는 데는 SSP-PCR (Single Specific Primer-Polymerase Chain Reaction), 실시간 PCR, PCR-RFLP (PCR-restriction fragment length polymorphism analysis) 및 시퀀싱 등의 방법이 사용되고 있다. SARS-CoV-2의 감염 여부 진단은 1차로 판코로나바이러스 검사를 통해 코로나바이러스 검출 여부를 확인하고, 이후 실시간 PCR과 시퀀싱 방법이 접목된 방법을 사용하였다. 이에 따라, 감염 여부 진단 시간이 24시간 이상 걸리는 문제가 있었다.
최근에 미국 질병관리본부와 WHO에서는 검사시간을 단축하기 위하여 RT-실시간 PCR (reverse transcription-real time PCR)법을 개발하여 공급하고 있다 (Real time RT-PCR Panel for detection 2019-Novel Coronavirus. Centers for Disease Control and Prevention, Respiratory Viruses Branch, Division of Viral Diseases). 미국 질병관리본부가 개발한 검사법은 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid) 단백질을 만드는 N 유전자의 3군데 부위를 증폭하는 방법이다. WHO에서 개발한 방법은 스크리닝과 확진이 동시에 가능한 단일 단계 실시간 PCR (One-step real time PCR) 방법으로 기존 사스 관련 바이러스와 서열 일치도가 높은 E 유전자 부위를 스크리닝을 위한 목적으로 사용하고, SARS-CoV-2 감염 여부 확진을 위해서 SARS-CoV-2를 특이적으로 검출할 수 있는 RdRP (RNA dependent RNA polymerase) 유전자를 증폭하는 방식이다 (도 1).
그러나, E gene 및 RdRP 유전자는 바이러스 감염 세포내에서 존재량이 낮기 때문에 실험적 에러나 검체의 RNA 안전성에 따라 검출이 불가능한 경우가 있을 수 있다.
또한, 미국 질병관리본부와 WHO에서는 RNA 검체 적합성 판정을 위한 내부 대조군 유전자로 사람 RNase P 유전자를 사용하였으며, RNase P cDNA를 증폭하기 위한 프라이머 및 프로브 서열을 공개한 바 있다. 그러나, 본 출원 발명자는 공개된 프라이머 및 프로브 서열은 RNA 스플라이싱을 고려하지 않고 첫번째 엑손 내부를 타겟하는 프라이머로, 게놈 DNA에 적용시 위양성 증폭이 발생할 수 있음을 확인하였다. 검사현장에서 검체로부터 RNA 추출시 게놈 DNA가 완벽히 제거되지 않는 경우가 빈번하므로, 검체적합성 판정에 에러가 발생할 수 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 SARS-CoV-2 감염 여부 진단을 위해 초기 감염세포내에 가장 풍부하게 존재하는 리더 서열을 타겟으로 하는 새로운 검출방법을 개발하였다. 또한, 게놈 DNA 유래 위양성 증폭이 발생하지 않도록 RNA 스플라이싱을 고려하여 내부 대조군 RNase P 유전자에 대한 프라이머를 제작하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술에 대한 정보는 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 앞서 언급한 종래기술의 문제점을 인식하고, 정확하면서도 위양성 발생없이 SARS-CoV-2 감염 여부를 진단할 수 있는 조성물, 키트 및 이를 이용한 진단방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 10의 서열을 포함하는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 리더 (leader)를 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머를 포함하는 코로나바이러스 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 코로나바이러스 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이, 서열번호 10의 서열을 포함하는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 리더 (leader)를 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머를 샘플에 처리하는 단계를 포함하는 코로나바이러스 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명을 통해, 빠른 시간 내에 결과 확인이 가능하여 신종 코로나바이러스 감염 여부를 신속하게 진단할 수 있으며, 위양성이 발생하지 않도록 함으로써 정확한 진단이 가능하다.
도 1는 WHO 권고에 따른 신종 코로나바이러스 진단을 위한 유전자를 나타낸 것이다.
도 2는 코로나바이러스 서브-게놈 RNA (sub-genomic RNA)가 발현되는 기작을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 SARS-CoV-2 리더 RNA 서열을 RT-qPCR을 수행하여 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 SARS-CoV-2 RNA로부터 리더 서열을 RT-qPCR을 수행하여 증폭한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 RNase P 유전자 구조 및 본 발명의 핵산 올리고머가 증폭하는 부위를 나타낸 것이다.
도 5b는 RNase P 유전자를 RT-qPCR을 수행하여 증폭한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 코로나바이러스 서브-게놈 RNA (sub-genomic RNA)가 발현되는 기작을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 SARS-CoV-2 리더 RNA 서열을 RT-qPCR을 수행하여 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 SARS-CoV-2 RNA로부터 리더 서열을 RT-qPCR을 수행하여 증폭한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 RNase P 유전자 구조 및 본 발명의 핵산 올리고머가 증폭하는 부위를 나타낸 것이다.
도 5b는 RNase P 유전자를 RT-qPCR을 수행하여 증폭한 결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 출원의 발명자들은 SARS-CoV-2 감염 여부 진단을 위해 초기 감염세포내에 가장 풍부하게 존재하는 리더 서열을 타겟으로 하는 새로운 검출방법을 통해 신종 코로나바이러스 감염 여부를 신속 및 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
이러한 관점에서, 본 발명은 서열번호 10의 서열을 포함하는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 리더 (leader)를 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머를 포함하는 코로나바이러스 진단용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 10의 서열을 포함하는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 리더 (leader)를 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머를 샘플에 처리하는 단계를 포함하는 코로나바이러스 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
상기 리더 서열과 관련하여, 코로나바이러스 중 게놈 RNA와 전사 발현된 서브 게놈 mRNA (subgenomic mRNA)들은 5' 말단에 약 72~77 bp로 구성된 리더 서열을 공통으로 가지고 있으며, 이는 코로나바이러스의 독특한 특징으로서 바이러스 서열 중 감염세포에서 가장 풍부하게 존재하는 타겟이다. 이는 코로나바이러스의 모든 서브 게놈 RNA는 게놈 RNA의 5' 말단로부터 유도된 약 72 bp에 해당하는 리더 서열 (leader RNA)이 각 서브 게놈 RNA의 5' 말단에 결합하는 리더 조이닝 (leader joining) 현상을 나타내기 때문이다.
따라서, 리더 서열은 세포내에서 바이러스 유전자 중 가장 복제수가 높으며, N 단백질을 코딩하는 서브 게놈 RNA의 복제수가 그 다음으로 높다. 따라서, 경미한 증상의 초기감염에서 낮은 양으로 존재하는 코로나바이러스의 효과적인 검출을 위해서는 리더 서열을 검출의 표적으로 이용하는 것이 가장 효과적이라 할 수 있다.
본 명세서에서 핵산 올리고머는 핵산을 단량체로 하여 중합하여 생성되는 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 물질을 의미할 수 있다. 상기 핵산 올리고머는 프라이머 또는 프로브로 기능할 수 있다.
본 명세서에서 '프라이머'는 적합한 온도 및 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머는 증폭될 유전자 로커스의 각 가닥과 "대체적으로" 상보성을 가지도록 제작될 수 있다. 이는 중합반응을 수행하는 조건에서 프라이머가 대응하는 핵산 가닥과 하이브리다이제이션 되기에 충분한 상보성을 가지는 것을 의미한다.
하나의 실시예에서, 서열번호 10의 서열을 포함하는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 리더를 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머는 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열을 포함하는 프라이머일 수 있다.
상기 프라이머는 예를 들어, PCR을 위해 정방향 및 역방향 프라이머를 쌍으로 만들어서 동시에 사용할 수 있다. 서열번호 10의 서열을 포함하는 SARS-CoV-2 리더 서열을 특이적으로 증폭하는 정방향 프라이머로 예를 들어, 서열번호 1의 서열을 포함할 수 있다. 상기 역방향 프라이머로 예를 들어, 서열번호 2의 서열을 포함할 수 있다.
또한, RNA 스플라이싱을 고려하여 내부 대조군 RNase P 유전자에 대한 프라이머를 제작하여 게놈 DNA 유래 위양성 증폭이 발생하지 않음을 확인하였다.
내부 대조군 유전자는 RNA 검체 적합성 판정을 위한 올리고뉴클레오티드로, 표적 유전자와 상보성이 없을 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서 종래 내부 대조군 유전자로 사람 RNase P 유전자를 사용하였다.
CDC에 의해 공개된 RNase P cDNA를 증폭하기 위한 프라이머 및 프로브 서열은 RNA 스플라이싱을 고려하지 않고 첫번째 엑손 내부를 타겟하는 프라이머로, 게놈 DNA에 적용시 위양성 증폭이 발생할 수 있음을 확인하였다. 검사현장에서 검체로부터 RNA 추출시 게놈 DNA가 완벽히 제거되지 않는 경우가 빈번하므로, 검체적합성 판정에 에러가 발생할 수 있다.
하나의 실시예에서, 서열번호 11의 서열을 포함하는 RNase P를 특이적으로 증폭할 수 있는 핵산 올리고머를 추가로 포함할 수 있다.
상기 핵산 올리고머는 예를 들어, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 서열을 포함하는 프라이머일 수 있다. 본원발명에 따른 프라이머는 두번째 엑손의 5'부위에 상보적인 서열을 타겟으로 하여, 게놈 DNA에 적용시 위양성 증폭이 발생하지 않음을 확인하였다.
상기 프라이머는 예를 들어, PCR을 위해 정방향 및 역방향 프라이머를 쌍으로 만들어서 동시에 사용할 수 있다. 서열번호 11의 서열을 포함하는 RNase P를 특이적으로 증폭하는 정방향 프라이머로 예를 들어, 서열번호 7의 서열을 포함할 수 있다. 상기 역방향 프라이머로 예를 들어, 서열번호 8의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 핵산 올리고머에 의해 특이적으로 증폭된 코로나바이러스 리더 또는 RNase P 산물에 상보적으로 혼성화할 수 있는 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
상기 프로브와 관련하여, 특정 조건에서 증폭 산물과 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
혼성화 반응에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 조건은 혼성화 되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 혼성화 되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 혼성화 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려 조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에 고정화되어 있는지의 여부이다.
매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(혼성화 조건); 실온의 0.2X SSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2X SSC/0.1% SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건). 세척 과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 혼성화 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 혼성화에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.
하나의 실시예에서, 상기 증폭된 코로나바이러스 리더에 상보적으로 혼성화할 수 있는 프로브는 예를 들어, 서열번호 3의 서열을 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 내부 대조군으로 사용된 상기 증폭된 RNase P 산물에 상보적으로 혼성화할 수 있는 프로브는 서열번호 9의 서열을 포함할 수 있다.
경우에 따라서, 프로브는 검출할 수 있도록 표지되며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.
상기 증폭 산물의 양은 형광신호에 의해 검출할 수 있다. 프로브가 결합된 증폭산물의 이중 나선 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(intercalator)을 사용하는 인터컬레이팅(Intercalating)법, 5' 말단은 형광물질, 3' 말단은 소광자(quencher)로 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법 등이 있다.
본원발명에 따른 증폭은 역전사 효소 (Reverse transcriptase)를 이용하여 실-시간 정량 증폭 예를 들어 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-Time PCR)을 통해 수행될 수 있으며, 실시간 중합효소연쇄반응에 있어 PCR 증폭 산물의 양은 형광 신호에 의해 검출할 수 있다. 실시간 중합효소연쇄반응이 진행되면서 증가하는 폴리뉴클레오티드 양에 따라 형광 신호의 세기가 증가하게 되고, 증폭 사이클 횟수에 따른 형광 신호 세기를 나타내는 증폭 프로파일(amplification profile) 곡선을 얻게 된다.
증폭 프로파일 곡선은 일반적으로 실질적인 폴리뉴클레오티드 양이 반영되지 않은 배경의 형광신호가 나타나는 베이스라인(baseline) 영역, 폴리뉴클레오티드 생성물량의 증가에 따른 형광신호 증가가 나타나는 지수적 영역(exponential region), 및 PCR 반응이 포화 상태에 이르러 형광신호 세기의 증가가 나타나지 않는 정체 상태 영역(plateau region)으로 나누어 진다.
통상적으로 베이스라인 영역에서 지수적 영역으로 넘어가는 지점, 즉 PCR 증폭 산물량이 형광으로 검출 가능한 양에 도달한 때의 형광신호 세기를 임계값(threshold)이라고 하고 증폭 프로파일 곡선에서 임계값에 대응되는 증폭 사이클 횟수를 임계 사이클(threshold cycle: Ct)값이라고 한다.
상기 Ct값을 측정하고 표준물질에 대한 Ct(threshold cycle)값을 기반으로 농도가 결정된 표준곡선을 분석하여, 증폭된 유전자의 농도를 확인함으로써, 메틸화 특이적 민감도 및/또는 특이도를 결정할 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 검체는 의심 환자 또는 진단 대상 개개인 또는 개개인 유래의 체액, 세포주, 조직 배양 등에서 얻어지는 폭넓은 범위의 모든 생물학적 체액을 포함할 수 있고, 예를 들어 하기도의 가래, 상기도의 구인두도말물 및/또는 비인두도말물, 배양검체, 조직검체 또는 혈액 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 검체로부터 핵산을 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 핵산의 추출은 예를 들어 상업화 되어 공급되고 있는 다양한 키트 또는 추출 시약을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
하나의 실시예에서, 상기 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 시약을 포함하는 용기, 핵산 올리고머를 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 경우에 따라서, 유전자 증폭 산물 각각을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 용기를 추가로 포함할 수 있다.
상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 경우에 따라, 중합효소, 버퍼, 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 핵산 증폭 PCR 반응을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 다양한 버퍼 및 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 키트에서 특정 반응을 위해 사용되는 시약, 버퍼 또는 반응물의 최적량은 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 앞서 언급된 프라이머 또는 프로부 각각을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: SARS-CoV-2 검출 및 내부대조유전자 검출용 프라이머 및 프로브 설계
SARS-CoV-2 (GenBank No. MN988668.1: 서열번호 12)의 리더 서열 cDNA (서열번호 10) 및 또한 내부대조유전자 RNase P (서열번호 11)의 증폭을 위한 프라이머 및 프로브는 Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) 프로그램을 이용하여 설계하였다 (표 1).
[표 1] 프라이머 및 프로브 서열
실시예 2: SARS-CoV-2 Leader 및 RNase P 유전자 RNA 합성
SARS-CoV-2의 리더 서열에 해당하는 RNA를 합성하기 위하여 SARS-CoV-2 중 리더 서열 72 bp (서열번호 10)를 포함하는 110 bp (서열번호 13)에 해당하는 DNA를 합성하였다 (NeoProbe, 한국). RNase P 유전자 (GenBank No. NC_000010.11: 서열번호 14)의 RNA를 합성하기 위하여 RNase P 서열에 해당하는 180 bp DNA (서열번호 2)를 합성하였다. 각 합성된 DNA의 5'말단에는 T7 프로모터 서열을 연결하여 in vitro transcription 방법으로 RNA를 제작하였다.
(1)
In vitro
transcription (IVT)
두 개의 주형 PCR 산물을 50 ng씩 사용하여 MEGAScriptTM T7 Transcruption kit, Invitrogen)를 사용하여 제조사 지침에 따라 아래와 같이 수행하였다.
[표 2]
2시간 동안의 반응이 끝난 후, 잔여 DNA 제거를 위해 DNase 4 ㎕를 첨가하고, 37℃에서 15분간 반응하였다. 합성된 리더 및 RNase P RNA는 QIAamp RNeasy mini kit (Qiagen)를 이용하여 제조사 지침에 따라 정제하였다. 최종적으로 합성된 RNA는 50 ㎕ RNase-free DW로 용출하였다.
실시예 3: 역전사 중합효소 실시간 SARS-CoV-2 Leader cDNA 및 RNase P cDNA 검출
RT-qPCR은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 반응액의 조성은 아래 표와 같으며, RT-qPCR 반응은 AB 7500 Fast (ThermoFisher, USA) 장비를 사용하였다. 첫 번째 역전사단계 (Reverse transcription; RT)에서 RNA에 상보적인 cDNA를 만들고, 두 번째 실시간 PCR (qPCR) 단계에서 cDNA를 증폭하였다.
[표 3] RT-qPCR 반응액 조성
*TOPreal One-step RT-qPCR kit (enzynomics, 한국)
[표 4] RT-qPCR 조건
(1) SARS-CoV-2 Leader RNA 서열 검출 결과
SARS-CoV-2 Leader RNA 서열에 상보적인 cDNA 검출을 확인하기 위하여 Leader RNA (104 copies), In vitro transcription에 사용한 Leader DNA (104 copies), human genomic DNA (10 ng) 및 human total RNA (10 ng)을 사용하여 One-step RT-qPCR을 수행하였다 (도 3). 그 결과, Leader cDNA 및 Leader DNA에서만 증폭이 확인되었고, 나머지 주형들에서의 비특이적인 증폭은 없는 것을 확인하였다 (표 5).
[표 5] SARS-CoV-2 Leader RNA 검출결과
실제 SARS-CoV-2 Leader RNA의 증폭 여부를 확인하기 위하여, 한국국가병원체자원은행에서 한국인에서 분리한 SARS-CoV-2를 배양하여 분리한 RNA를 사용하였다. One-Step RT-qPCR은 상기와 동일한 방법으로 수행하였다. 시험결과, SARS-CoV-2의 Leader RNA가 정상적으로 증폭되는 것을 확인하였다 (도 4, 표 6)
[표 6] SARS-CoV-2 RNA로부터 Leader RNA 검출결과
(2) RNase P RNA 검출 결과
RNA 검체 적합성 판정을 위한 내부대조군 유전자는 사람 RNase P 유전자를 사용하였다. RNase P RNA를 증폭하기 위한 프라이머 및 프로브는 미국 질병관리본부가 공개한 서열이 있으나, 본 출원의 발명자가 확인한 결과 RNA 스플라이싱을 고려하지 않고 첫 번째 엑손 내부에서 프라이머가 제작되어, 게놈 DNA에서 위양성 증폭이 발생하였다.
이는 검체로부터 RNA 추출시 게놈 DNA가 완벽히 제거되지 않는 경우가 빈번하므로, 검체적합성 판정에 에러가 발생할 수 있기 때문에 본 발명자들은 이런 문제를 해결하기 위하여 RNA 스플라이싱을 고려하여 게놈 DNA 유래 위양성 증폭이 발생하지 않도록 신규 역방향 프라이머를 제작하였다.
도 5a에서와 같이, RNase P 유전자는 총 36.6 kb 정도의 서열로 구성된 유전자로 총 11개의 엑손으로 구성되어 있다.
미국 질병관리본부가 제공하는 RNase P 유전자 서열에 해당하는 프라이머 및 프로브는 전부 RNA 스플라이싱을 고려하지 않고 첫 번째 엑손에 해당하는 부위에서 제작되어 사람 게놈 DNA를 대상으로 증폭하였을 때, 위양성 증폭이 일어났다 (도 5b의 (a)). 반면에 본 발명자들이 개발한 역방향 프라이머를 사용한 경우에는 인간 게놈 DNA로부터 위양성 증폭이 발생하지 않았다 (도 5b의 (b)).
따라서, 본 발명자는 약 2.8 kb 떨어진 두 번째 엑손의 5' 부위에 상보적인 부위에 대한 역방향 프라이머를 신규로 제작함으로써 게놈 DNA에 의한 위양성 증폭 문제를 해결하였다. IVT한 RNase P RNA와 사람 전체 RNA를 대상으로 증폭한 결과, 정상적인 증폭이 일어남을 확인하였다 (표 7).
[표 7] RNase P 유전자 증폭 결과
실시예 4: 리더 서열을 이용한 SARS-CoV-2 진단능력 평가
서열번호 10의 리더 서열을 이용한 SARS-CoV-2의 진단능력을 평가하기 위하여 영남대학교 병원 (IRB No. YUMC 2020-07-001)에 보관중인 이미 SARS-CoV-2 진단결과를 알고 있는 상기도 검체 (음성 180예, 양성 76예)로부터 QIAamp Viral RNA Mini kit (Qiagen, Cat. No: 52904 or 52906)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 RNA를 추출하였다. RNase P 유전자를 내부 대조군으로 사용하였다 (표 8의 IC CT값 참조).
SARS-CoV-2 감염여부를 진단하기 위하여 RT-qPCR은 실시예 3에 기술된 방법으로 수행하였다 (표 8).
표 8. 리더 서열을 이용한 SARS-CoV-2 RT-qPCR 결과
리더 서열을 이용한 SARS-CoV-2 진단결과, 민감도는 100% (76/76) 그리고 특이도는 100% (180/180)로 우수함을 확인하였다 (표 9). 따라서, 리더 서열을 이용한 SARS-CoV-2 진단의 유효성이 있을 확인하였다.
표 9. 리더 서열을 이용한 SARS-Co시험의료기기 민감도 및 특이도
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> GENOMICTREE, INC.
<120> Composition For Detecting SARS-CoV-2, Kit For Detecting the Same
and Method of Detecting SARS-CoV-2 Using the Same
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<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 1
attaaaggtt tataccttcc cagg 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2
cgtttagaga acagatctac aag 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 3
taacaaacca accaactttc gatct 25
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 4
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 5
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 6
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 7
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 8
tgatagcaac aactgaatag c 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 9
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<210> 10
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 10
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cg 72
<210> 11
<211> 200
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<400> 11
tgtttgcaga tttggacctg cgagcgggtt ctgacctgaa ggctctgcgc ggacttgtgg 60
agacagccgc tcaccttggc tattcagttg ttgctatcaa tcatatcgtt gactttaagg 120
aaaagaaaca ggaaattgaa aaaccagtag ctgtttctga actcttcaca actttgccaa 180
ttgtacaggg aaaatcaaga 200
<210> 12
<211> 29881
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-COV-2 Synthetic Sequence
<400> 12
ttaaaggttt ataccttccc aggtaacaaa ccaaccaact ttcgatctct tgtagatctg 60
ttctctaaac gaactttaaa atctgtgtgg ctgtcactcg gctgcatgct tagtgcactc 120
acgcagtata attaataact aattactgtc gttgacagga cacgagtaac tcgtctatct 180
tctgcaggct gcttacggtt tcgtccgtgt tgcagccgat catcagcaca tctaggtttc 240
gtccgggtgt gaccgaaagg taagatggag agccttgtcc ctggtttcaa cgagaaaaca 300
cacgtccaac tcagtttgcc tgttttacag gttcgcgacg tgctcgtacg tggctttgga 360
gactccgtgg aggaggtctt atcagaggca cgtcaacatc ttaaagatgg cacttgtggc 420
ttagtagaag ttgaaaaagg cgttttgcct caacttgaac agccctatgt gttcatcaaa 480
cgttcggatg ctcgaactgc acctcatggt catgttatgg ttgagctggt agcagaactc 540
gaaggcattc agtacggtcg tagtggtgag acacttggtg tccttgtccc tcatgtgggc 600
gaaataccag tggcttaccg caaggttctt cttcgtaaga acggtaataa aggagctggt 660
ggccatagtt acggcgccga tctaaagtca tttgacttag gcgacgagct tggcactgat 720
ccttatgaag attttcaaga aaactggaac actaaacata gcagtggtgt tacccgtgaa 780
ctcatgcgtg agcttaacgg aggggcatac actcgctatg tcgataacaa cttctgtggc 840
cctgatggct accctcttga gtgcattaaa gaccttctag cacgtgctgg taaagcttca 900
tgcactttgt ccgaacaact ggactttatt gacactaaga ggggtgtata ctgctgccgt 960
gaacatgagc atgaaattgc ttggtacacg gaacgttctg aaaagagcta tgaattgcag 1020
acaccttttg aaattaaatt ggcaaagaaa tttgacacct tcaatgggga atgtccaaat 1080
tttgtatttc ccttaaattc cataatcaag actattcaac caagggttga aaagaaaaag 1140
cttgatggct ttatgggtag aattcgatct gtctatccag ttgcgtcacc aaatgaatgc 1200
aaccaaatgt gcctttcaac tctcatgaag tgtgatcatt gtggtgaaac ttcatggcag 1260
acgggcgatt ttgttaaagc cacttgcgaa ttttgtggca ctgagaattt gactaaagaa 1320
ggtgccacta cttgtggtta cttaccccaa aatgctgttg ttaaaattta ttgtccagca 1380
tgtcacaatt cagaagtagg acctgagcat agtcttgccg aataccataa tgaatctggc 1440
ttgaaaacca ttcttcgtaa gggtggtcgc actattgcct ttggaggctg tgtgttctct 1500
tatgttggtt gccataacaa gtgtgcctat tgggttccac gtgctagcgc taacataggt 1560
tgtaaccata caggtgttgt tggagaaggt tccgaaggtc ttaatgacaa ccttcttgaa 1620
atactccaaa aagagaaagt caacatcaat attgttggtg actttaaact taatgaagag 1680
atcgccatta ttttggcatc tttttctgct tccacaagtg cttttgtgga aactgtgaaa 1740
ggtttggatt ataaagcatt caaacaaatt gttgaatcct gtggtaattt taaagttaca 1800
aaaggaaaag ctaaaaaagg tgcctggaat attggtgaac agaaatcaat actgagtcct 1860
ctttatgcat ttgcatcaga ggctgctcgt gttgtacgat caattttctc ccgcactctt 1920
gaaactgctc aaaattctgt gcgtgtttta cagaaggccg ctataacaat actagatgga 1980
atttcacagt attcactgag actcattgat gctatgatgt tcacatctga tttggctact 2040
aacaatctag ttgtaatggc ctacattaca ggtggtgttg ttcagttgac ttcgcagtgg 2100
ctaactaaca tctttggcac tgtttatgaa aaactcaaac ccgtccttga ttggcttgaa 2160
gagaagttta aggaaggtgt agagtttctt agagacggtt gggaaattgt taaatttatc 2220
tcaacctgtg cttgtgaaat tgtcggtgga caaattgtca cctgtgcaaa ggaaattaag 2280
gagagtgttc agacattctt taagcttgta aataaatttt tggctttgtg tgctgactct 2340
atcattattg gtggagctaa acttaaagcc ttgaatttag gtgaaacatt tgtcacgcac 2400
tcaaagggat tgtacagaaa gtgtgttaaa tccagagaag aaactggcct actcatgcct 2460
ctaaaagccc caaaagaaat tatcttctta gagggagaaa cacttcccac agaagtgtta 2520
acagaggaag ttgtcttgaa aactggtgat ttacaaccat tagaacaacc tactagtgaa 2580
gctgttgaag ctccattggt tggtacacca gtttgtatta acgggcttat gttgctcgaa 2640
atcaaagaca cagaaaagta ctgtgccctt gcacctaata tgatggtaac aaacaatacc 2700
ttcacactca aaggcggtgc accaacaaag gttacttttg gtgatgacac tgtgatagaa 2760
gtgcaaggtt acaagagtgt gaatatcact tttgaacttg atgaaaggat tgataaagta 2820
cttaatgaga agtgctctgc ctatacagtt gaactcggta cagaagtaaa tgagttcgcc 2880
tgtgttgtgg cagatgctgt cataaaaact ttgcaaccag tatctgaatt acttacacca 2940
ctgggcattg atttagatga gtggagtatg gctacatact acttatttga tgagtctggt 3000
gagtttaaat tggcttcaca tatgtattgt tctttctacc ctccagatga ggatgaagaa 3060
gaaggtgatt gtgaagaaga agagtttgag ccatcaactc aatatgagta tggtactgaa 3120
gatgattacc aaggtaaacc tttggaattt ggtgccactt ctgctgctct tcaacctgaa 3180
gaagagcaag aagaagattg gttagatgat gatagtcaac aaactgttgg tcaacaagac 3240
ggcagtgagg acaatcagac aactactatt caaacaattg ttgaggttca acctcaatta 3300
gagatggaac ttacaccagt tgttcagact attgaagtga atagttttag tggttattta 3360
aaacttactg acaatgtata cattaaaaat gcagacattg tggaagaagc taaaaaggta 3420
aaaccaacag tggttgttaa tgcagccaat gtttacctta aacatggagg aggtgttgca 3480
ggagccttaa ataaggctac taacaatgcc atgcaagttg aatctgatga ttacatagct 3540
actaatggac cacttaaagt gggtggtagt tgtgttttaa gcggacacaa tcttgctaaa 3600
cactgtcttc atgttgtcgg cccaaatgtt aacaaaggtg aagacattca acttcttaag 3660
agtgcttatg aaaattttaa tcagcacgaa gttctacttg caccattatt atcagctggt 3720
atttttggtg ctgaccctat acattcttta agagtttgtg tagatactgt tcgcacaaat 3780
gtctacttag ctgtctttga taaaaatctc tatgacaaac ttgtttcaag ctttttggaa 3840
atgaagagtg aaaagcaagt tgaacaaaag atcgctgaga ttcctaaaga ggaagttaag 3900
ccatttataa ctgaaagtaa accttcagtt gaacagagaa aacaagatga taagaaaatc 3960
aaagcttgtg ttgaagaagt tacaacaact ctggaagaaa ctaagttcct cacagaaaac 4020
ttgttacttt atattgacat taatggcaat cttcatccag attctgccac tcttgttagt 4080
gacattgaca tcactttctt aaagaaagat gctccatata tagtgggtga tgttgttcaa 4140
gagggtgttt taactgctgt ggttatacct actaaaaagg ctggtggcac tactgaaatg 4200
ctagcgaaag ctttgagaaa agtgccaaca gacaattata taaccactta cccgggtcag 4260
ggtttaaatg gttacactgt agaggaggca aagacagtgc ttaaaaagtg taaaagtgcc 4320
ttttacattc taccatctat tatctctaat gagaagcaag aaattcttgg aactgtttct 4380
tggaatttgc gagaaatgct tgcacatgca gaagaaacac gcaaattaat gcctgtctgt 4440
gtggaaacta aagccatagt ttcaactata cagcgtaaat ataagggtat taaaatacaa 4500
gagggtgtgg ttgattatgg tgctagattt tacttttaca ccagtaaaac aactgtagcg 4560
tcacttatca acacacttaa cgatctaaat gaaactcttg ttacaatgcc acttggctat 4620
gtaacacatg gcttaaattt ggaagaagct gctcggtata tgagatctct caaagtgcca 4680
gctacagttt ctgtttcttc acctgatgct gttacagcgt ataatggtta tcttacttct 4740
tcttctaaaa cacctgaaga acattttatt gaaaccatct cacttgctgg ttcctataaa 4800
gattggtcct attctggaca atctacacaa ctaggtatag aatttcttaa gagaggtgat 4860
aaaagtgtat attacactag taatcctacc acattccacc tagatggtga agttatcacc 4920
tttgacaatc ttaagacact tctttctttg agagaagtga ggactattaa ggtgtttaca 4980
acagtagaca acattaacct ccacacgcaa gttgtggaca tgtcaatgac atatggacaa 5040
cagtttggtc caacttattt ggatggagct gatgttacta aaataaaacc tcataattca 5100
catgaaggta aaacatttta tgttttacct aatgatgaca ctctacgtgt tgaggctttt 5160
gagtactacc acacaactga tcctagtttt ctgggtaggt acatgtcagc attaaatcac 5220
actaaaaagt ggaaataccc acaagttaat ggtttaactt ctattaaatg ggcagataac 5280
aactgttatc ttgccactgc attgttaaca ctccaacaaa tagagttgaa gtttaatcca 5340
cctgctctac aagatgctta ttacagagca agggctggtg aagctgctaa cttttgtgca 5400
cttatcttag cctactgtaa taagacagta ggtgagttag gtgatgttag agaaacaatg 5460
agttacttgt ttcaacatgc caatttagat tcttgcaaaa gagtcttgaa cgtggtgtgt 5520
aaaacttgtg gacaacagca gacaaccctt aagggtgtag aagctgttat gtacatgggc 5580
acactttctt atgaacaatt taagaaaggt gttcagatac cttgtacgtg tggtaaacaa 5640
gctacaaaat atctagtaca acaggagtca ccttttgtta tgatgtcagc accacctgct 5700
cagtatgaac ttaagcatgg tacatttact tgtgctagtg agtacactgg taattaccag 5760
tgtggtcact ataaacatat aacttctaaa gaaactttgt attgcataga cggtgcttta 5820
cttacaaagt cctcagaata caaaggtcct attacggatg ttttctacaa agaaaacagt 5880
tacacaacaa ccataaaacc agttacttat aaattggatg gtgttgtttg tacagaaatt 5940
gaccctaagt tggacaatta ttataagaaa gacaattctt atttcacaga gcaaccaatt 6000
gatcttgtac caaaccaacc atatccaaac gcaagcttcg ataattttaa gtttgtatgt 6060
gataatatca aatttgctga tgatttaaac cagttaactg gttataagaa acctgcttca 6120
agagagctta aagttacatt tttccctgac ttaaatggtg atgtggtggc tattgattat 6180
aaacactaca caccctcttt taagaaagga gctaaattgt tacataaacc tattgtttgg 6240
catgttaaca atgcaactaa taaagccacg tataaaccaa atacctggtg tatacgttgt 6300
ctttggagca caaaaccagt tgaaacatca aattcgtttg atgtactgaa gtcagaggac 6360
gcgcagggaa tggataatct tgcctgcgaa gatctaaaac cagtctctga agaagtagtg 6420
gaaaatccta ccatacagaa agacgttctt gagtgtaatg tgaaaactac cgaagttgta 6480
ggagacatta tacttaaacc agcaaataat agtttaaaaa ttacagaaga ggttggccac 6540
acagatctaa tggctgctta tgtagacaat tctagtctta ctattaagaa acctaatgaa 6600
ttatctagag tattaggttt gaaaaccctt gctactcatg gtttagctgc tgttaatagt 6660
gtcccttggg atactatagc taattatgct aagccttttc ttaacaaagt tgttagtaca 6720
actactaaca tagttacacg gtgtttaaac cgtgtttgta ctaattatat gccttatttc 6780
tttactttat tgctacaatt gtgtactttt actagaagta caaattctag aattaaagca 6840
tctatgccga ctactatagc aaagaatact gttaagagtg tcggtaaatt ttgtctagag 6900
gcttcattta attatttgaa gtcacctaat ttttctaaac tgataaatat tataatttgg 6960
tttttactat taagtgtttg cctaggttct ttaatctact caaccgctgc tttaggtgtt 7020
ttaatgtcta atttaggcat gccttcttac tgtactggtt acagagaagg ctatttgaac 7080
tctactaatg tcactattgc aacctactgt actggttcta taccttgtag tgtttgtctt 7140
agtggtttag attctttaga cacctatcct tctttagaaa ctatacaaat taccatttca 7200
tcttttaaat gggatttaac tgcttttggc ttagttgcag agtggttttt ggcatatatt 7260
cttttcacta ggtttttcta tgtacttgga ttggctgcaa tcatgcaatt gtttttcagc 7320
tattttgcag tacattttat tagtaattct tggcttatgt ggttaataat taatcttgta 7380
caaatggccc cgatttcagc tatggttaga atgtacatct tctttgcatc attttattat 7440
gtatggaaaa gttatgtgca tgttgtagac ggttgtaatt catcaacttg tatgatgtgt 7500
tacaaacgta atagagcaac aagagtcgaa tgtacaacta ttgttaatgg tgttagaagg 7560
tccttttatg tctatgctaa tggaggtaaa ggcttttgca aactacacaa ttggaattgt 7620
gttaattgtg atacattctg tgctggtagt acatttatta gtgatgaagt tgcgagagac 7680
ttgtcactac agtttaaaag accaataaat cctactgacc agtcttctta catcgttgat 7740
agtgttacag tgaagaatgg ttccatccat ctttactttg ataaagctgg tcaaaagact 7800
tatgaaagac attctctctc tcattttgtt aacttagaca acctgagagc taataacact 7860
aaaggttcat tgcctattaa tgttatagtt tttgatggta aatcaaaatg tgaagaatca 7920
tctgcaaaat cagcgtctgt ttactacagt cagcttatgt gtcaacctat actgttacta 7980
gatcaggcat tagtgtctga tgttggtgat agtgcggaag ttgcagttaa aatgtttgat 8040
gcttacgtta atacgttttc atcaactttt aacgtaccaa tggaaaaact caaaacacta 8100
gttgcaactg cagaagctga acttgcaaag aatgtgtcct tagacaatgt cttatctact 8160
tttatttcag cagctcggca agggtttgtt gattcagatg tagaaactaa agatgttgtt 8220
gaatgtctta aattgtcaca tcaatctgac atagaagtta ctggcgatag ttgtaataac 8280
tatatgctca cctataacaa agttgaaaac atgacacccc gtgaccttgg tgcttgtatt 8340
gactgtagtg cgcgtcatat taatgcgcag gtagcaaaaa gtcacaacat tgctttgata 8400
tggaacgtta aagatttcat gtcattgtct gaacaactac gaaaacaaat acgtagtgct 8460
gctaaaaaga ataacttacc ttttaagttg acatgtgcaa ctactagaca agttgttaat 8520
gttgtaacaa caaagatagc acttaagggt ggtaaaattg ttaataattg gttgaagcag 8580
ttaattaaag ttacacttgt gttccttttt gttgctgcta ttttctattt aataacacct 8640
gttcatgtca tgtctaaaca tactgacttt tcaagtgaaa tcataggata caaggctatt 8700
gatggtggtg tcactcgtga catagcatct acagatactt gttttgctaa caaacatgct 8760
gattttgaca catggtttag ccagcgtggt ggtagttata ctaatgacaa agcttgccca 8820
ttgattgctg cagtcataac aagagaagtg ggttttgtcg tgcctggttt gcctggcacg 8880
atattacgca caactaatgg tgactttttg catttcttac ctagagtttt tagtgcagtt 8940
ggtaacatct gttacacacc atcaaaactt atagagtaca ctgactttgc aacatcagct 9000
tgtgttttgg ctgctgaatg tacaattttt aaagatgctt ctggtaagcc agtaccatat 9060
tgttatgata ccaatgtact agaaggttct gttgcttatg aaagtttacg ccctgacaca 9120
cgttatgtgc tcatggatgg ctctattatt caatttccta acacctacct tgaaggttct 9180
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gagtctaaca aaaagtttct gcctttccaa caatttggca gagacattgc tgacactact 23280
gatgctgtcc gtgatccaca gacacttgag attcttgaca ttacaccatg ttcttttggt 23340
ggtgtcagtg ttataacacc aggaacaaat acttctaacc aggttgctgt tctttatcag 23400
gatgttaact gcacagaagt ccctgttgct attcatgcag atcaacttac tcctacttgg 23460
cgtgtttatt ctacaggttc taatgttttt caaacacgtg caggctgttt aataggggct 23520
gaacatgtca acaactcata tgagtgtgac atacccattg gtgcaggtat atgcgctagt 23580
tatcagactc agactaattc tcctcggcgg gcacgtagtg tagctagtca atccatcatt 23640
gcctacacta tgtcacttgg tgcagaaaat tcagttgctt actctaataa ctctattgcc 23700
atacccacaa attttactat tagtgttacc acagaaattc taccagtgtc tatgaccaag 23760
acatcagtag attgtacaat gtacatttgt ggtgattcaa ctgaatgcag caatcttttg 23820
ttgcaatatg gcagtttttg tacacaatta aaccgtgctt taactggaat agctgttgaa 23880
caagacaaaa acacccaaga agtttttgca caagtcaaac aaatttacaa aacaccacca 23940
attaaagatt ttggtggttt taatttttca caaatattac cagatccatc aaaaccaagc 24000
aagaggtcat ttattgaaga tctacttttc aacaaagtga cacttgcaga tgctggcttc 24060
atcaaacaat atggtgattg ccttggtgat attgctgcta gagacctcat ttgtgcacaa 24120
aagtttaacg gccttactgt tttgccacct ttgctcacag atgaaatgat tgctcaatac 24180
acttctgcac tgttagcggg tacaatcact tctggttgga cctttggtgc aggtgctgca 24240
ttacaaatac catttgctat gcaaatggct tataggttta atggtattgg agttacacag 24300
aatgttctct atgagaacca aaaattgatt gccaaccaat ttaatagtgc tattggcaaa 24360
attcaagact cactttcttc cacagcaagt gcacttggaa aacttcaaga tgtggtcaac 24420
caaaatgcac aagctttaaa cacgcttgtt aaacaactta gctccaattt tggtgcaatt 24480
tcaagtgttt taaatgatat cctttcacgt cttgacaaag ttgaggctga agtgcaaatt 24540
gataggttga tcacaggcag acttcaaagt ttgcagacat atgtgactca acaattaatt 24600
agagctgcag aaatcagagc ttctgctaat cttgctgcta ctaaaatgtc agagtgtgta 24660
cttggacaat caaaaagagt tgatttttgt ggaaagggct atcatcttat gtccttccct 24720
cagtcagcac ctcatggtgt agtcttcttg catgtgactt atgtccctgc acaagaaaag 24780
aacttcacaa ctgctcctgc catttgtcat gatggaaaag cacactttcc tcgtgaaggt 24840
gtctttgttt caaatggcac acactggttt gtaacacaaa ggaattttta tgaaccacaa 24900
atcattacta cagacaacac atttgtgtct ggtaactgtg atgttgtaat aggaattgtc 24960
aacaacacag tttatgatcc tttgcaacct gaattagact cattcaagga ggagttagat 25020
aaatatttta agaatcatac atcaccagat gttgatttag gtgacatctc tggcattaat 25080
gcttcagttg taaacattca aaaagaaatt gaccgcctca atgaggttgc caagaattta 25140
aatgaatctc tcatcgatct ccaagaactt ggaaagtatg agcagtatat aaaatggcca 25200
tggtacattt ggctaggttt tatagctggc ttgattgcca tagtaatggt gacaattatg 25260
ctttgctgta tgaccagttg ctgtagttgt ctcaagggct gttgttcttg tggatcctgc 25320
tgcaaatttg atgaagacga ctctgagcca gtgctcaaag gagtcaaatt acattacaca 25380
taaacgaact tatggatttg tttatgagaa tcttcacaat tggaactgta actttgaagc 25440
aaggtgaaat caaggatgct actccttcag attttgttcg cgctactgca acgataccga 25500
tacaagcctc actccctttc ggatggctta ttgttggcgt tgcacttctt gctgtttttc 25560
agagcgcttc caaaatcata accctcaaaa agagatggca actagcactc tccaagggtg 25620
ttcactttgt ttgcaacttg ctgttgttgt ttgtaacagt ttactcacac cttttgctcg 25680
ttgctgctgg ccttgaagcc ccttttctct atctttatgc tttagtctac ttcttgcaga 25740
gtataaactt tgtaagaata ataatgaggc tttggctttg ctggaaatgc cgttccaaaa 25800
acccattact ttatgatgcc aactattttc tttgctggca tactaattgt tacgactatt 25860
gtatacctta caatagtgta acttcttcaa ttgtcattac ttcaggtgat ggcacaacaa 25920
gtcctatttc tgaacatgac taccagattg gtggttatac tgaaaaatgg gaatctggag 25980
taaaagactg tgttgtatta cacagttact tcacttcaga ctattaccag ctgtactcaa 26040
ctcaattgag tacagacact ggtgttgaac atgttacctt cttcatctac aataaaattg 26100
ttgatgagcc tgaagaacat gtccaaattc acacaatcga cggttcatcc ggagttgtta 26160
atccagtaat ggaaccaatt tatgatgaac cgacgacgac tactagcgtg cctttgtaag 26220
cacaagctga tgagtacgaa cttatgtact cattcgtttc ggaagagaca ggtacgttaa 26280
tagttaatag cgtacttctt tttcttgctt tcgtggtatt cttgctagtt acactagcca 26340
tccttactgc gcttcgattg tgtgcgtact gctgcaatat tgttaacgtg agtcttgtaa 26400
aaccttcttt ttacgtttac tctcgtgtta aaaatctgaa ttcttctaga gttcctgatc 26460
ttctggtcta aacgaactaa atattatatt agtttttctg tttggaactt taattttagc 26520
catggcagat tccaacggta ctattaccgt tgaagagctt aaaaagctcc ttgaacaatg 26580
gaacctagta ataggtttcc tattccttac atggatttgt cttctacaat ttgcctatgc 26640
caacaggaat aggtttttgt atataattaa gttaattttc ctctggctgt tatggccagt 26700
aactttagct tgttttgtgc ttgctgctgt ttacagaata aattggatca ccggtggaat 26760
tgctatcgca atggcttgtc ttgtaggctt gatgtggctc agctacttca ttgcttcttt 26820
cagactgttt gcgcgtacgc gttccatgtg gtcattcaat ccagaaacta acattcttct 26880
caacgtgcca ctccatggca ctattctgac cagaccgctt ctagaaagtg aactcgtaat 26940
cggagctgtg atccttcgtg gacatcttcg tattgctgga caccatctag gacgctgtga 27000
catcaaggac ctgcctaaag aaatcactgt tgctacatca cgaacgcttt cttattacaa 27060
attgggagct tcgcagcgtg tagcaggtga ctcaggtttt gctgcataca gtcgctacag 27120
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tgtacagtaa gtgacaacag atgtttcatc tcgttgactt tcaggttact atagcagaga 27240
tattactaat tattatgagg acttttaaag tttccatttg gaatcttgat tacatcataa 27300
acctcataat taaaaattta tctaagtcac taactgagaa taaatattct caattagatg 27360
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ttttaaaaga accttgctct tctggaacat acgagggcaa ttcaccattt catcctctag 27540
ctgataacaa atttgcactg acttgcttta gcactcaatt tgcttttgct tgtcctgacg 27600
gcgtaaaaca cgtctatcag ttacgtgcca gatcagtttc acctaaactg ttcatcagac 27660
aagaggaagt tcaagaactt tactctccaa tttttcttat tgttgcggca atagtgttta 27720
taacactttg cttcacactc aaaagaaaga cagaatgatt gaactttcat taattgactt 27780
ctatttgtgc tttttagcct ttctgctatt ccttgtttta attatgctta ttatcttttg 27840
gttctcactt gaactgcaag atcataatga aacttgtcac gcctaaacga acatgaaatt 27900
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gtcatgtact caacatcaac catatgtagt tgatgacccg tgtcctattc acttctattc 28020
taaatggtat attagagtag gagctagaaa atcagcacct ttaattgaat tgtgcgtgga 28080
tgaggctggt tctaaatcac ccattcagta catcgatatc ggtaattata cagtttcctg 28140
tttacctttt acaattaatt gccaggaacc taaattgggt agtcttgtag tgcgttgttc 28200
gttctatgaa gactttttag agtatcatga cgttcgtgtt gttttagatt tcatctaaac 28260
gaacaaacta aaatgtctga taatggaccc caaaatcagc gaaatgcacc ccgcattacg 28320
tttggtggac cctcagattc aactggcagt aaccagaatg gagaacgcag tggggcgcga 28380
tcaaaacaac gtcggcccca aggtttaccc aataatactg cgtcttggtt caccgctctc 28440
actcaacatg gcaaggaaga ccttaaattc cctcgaggac aaggcgttcc aattaacacc 28500
aatagcagtc cagatgacca aattggctac taccgaagag ctaccagacg aattcgtggt 28560
ggtgacggta aaatgaaaga tctcagtcca agatggtatt tctactacct aggaactggg 28620
ccagaagctg gacttcccta tggtgctaac aaagacggca tcatatgggt tgcaactgag 28680
ggagccttga atacaccaaa agatcacatt ggcacccgca atcctgctaa caatgctgca 28740
atcgtgctac aacttcctca aggaacaaca ttgccaaaag gcttctacgc agaagggagc 28800
agaggcggca gtcaagcctc ttctcgttcc tcatcacgta gtcgcaacag ttcaagaaat 28860
tcaactccag gcagcagtag gggaacttct cctgctagaa tggctggcaa tggcggtgat 28920
gctgctcttg ctttgctgct gcttgacaga ttgaaccagc ttgagagcaa aatgtctggt 28980
aaaggccaac aacaacaagg ccaaactgtc actaagaaat ctgctgctga ggcttctaag 29040
aagcctcggc aaaaacgtac tgccactaaa gcatacaatg taacacaagc tttcggcaga 29100
cgtggtccag aacaaaccca aggaaatttt ggggaccagg aactaatcag acaaggaact 29160
gattacaaac attggccgca aattgcacaa tttgccccca gcgcttcagc gttcttcgga 29220
atgtcgcgca ttggcatgga agtcacacct tcgggaacgt ggttgaccta cacaggtgcc 29280
atcaaattgg atgacaaaga tccaaatttc aaagatcaag tcattttgct gaataagcat 29340
attgacgcat acaaaacatt cccaccaaca gagcctaaaa aggacaaaaa gaagaaggct 29400
gatgaaactc aagccttacc gcagagacag aagaaacagc aaactgtgac tcttcttcct 29460
gctgcagatt tggatgattt ctccaaacaa ttgcaacaat ccatgagcag tgctgactca 29520
actcaggcct aaactcatgc agaccacaca aggcagatgg gctatataaa cgttttcgct 29580
tttccgttta cgatatatag tctactcttg tgcagaatga attctcgtaa ctacatagca 29640
caagtagatg tagttaactt taatctcaca tagcaatctt taatcagtgt gtaacattag 29700
ggaggacttg aaagagccac cacattttca ccgaggccac gcggagtacg atcgagtgta 29760
cagtgaacaa tgctagggag agctgcctat atggaagagc cctaatgtgt aaaattaatt 29820
ttagtagtgc tatccccatg tgattttaat agcttcttag gagaatgaca aaaaaaaaaa 29880
a 29881
<210> 13
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leader Synthetic Sequence
<400> 13
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc 110
<210> 14
<211> 4251
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rnase P Synthetic Sequence
<400> 14
atgggacttc agcatggcgg tgtttgcaga tttggacctg cgagcgggtt ctgacctgaa 60
ggctctgcgc ggacttgtgg agacagccgc tcaccttggc tattcagttg ttgctatcaa 120
tcatatcgtt gactttaagg aaaagaaaca ggaaattgaa aaaccagtag ctgtttctga 180
actcttcaca actttgccaa ttgtacaggg aaaatcaaga ccaattaaaa ttttaactag 240
attaacaatt attgtctcgg atccatctca ctgcaatgtt ttgagagcaa cttcttcaag 300
ggcccggctc tatgatgttg ttgcagtttt tccaaagaca gaaaagcttt ttcatattgc 360
ttgcacacat ttagatgtgg atttagtctg cataactgta acagagaaac taccatttta 420
cttcaaaaga cctcctatta atgtggcgat tgaccgaggc ctggcttttg aacttgtcta 480
tagccctgct atcaaagact ccacaatgag aaggtataca atttccagtg ccctcaattt 540
gatgcaaatc tgcaaaggaa agaatgtaat tatatctagt gctgcagaaa ggcctttaga 600
aataagaggg ccatatgacg tggcaaatct aggcttgctg tttgggctct ctgaaagtga 660
cgccaaggct gcggtgtcca ccaactgccg agcagcgctt ctccatggag aaactagaaa 720
aactgctttt ggaattatct ctacagtgaa gaaacctcgg ccatcagaag gagatgaaga 780
ttgtcttcca gcttccaaga aagccaagtg gtctcactct gtcacccagg ctggagtgca 840
gtggcacaat ctcggctcac tgcaaccttt gcctcttggg ctcaagccat cctcccacct 900
cagcctccca agaactagaa ttcaacaaag acaacttttg atctctcatc agagagatca 960
tactcccaag aacaggcttt gacccttctt taaaagagga ttgtcctggg ctgatgagag 1020
tcactttacc tgaagatacc tgggaagttt tgtctcctct gaggttggcc catggccagt 1080
gactgatgca ggacattaca gcctggccca ctggcctcgg tggtacaatt tatgctcctg 1140
agcaccccat gggattacgc tgtgtgtgga tttctcctga aaccacatat ttgcctcttc 1200
tgccctgttc tgttttttct cattccctta tagaggactc tcagtaagtc acttacacaa 1260
gaatcctaat ttgaaatgct gcttccagga gacctgactt agaaaattgg acaaataaag 1320
ttgatttttt taaatgtcca gtaacatgaa gatgctgaac tttcctagtc atttaggggg 1380
aaatcaccac aaatatatct ggctgatcag gttgaaagtt aaaagaaaaa aagatttata 1440
aagtgggtat tttcaagatg gtgtggaggg agatacaatt tgatgcaagt cttatacttt 1500
tgatgtcaat ttattcttca gaaataactg gttaattata aagggtggat ggataaggat 1560
attcactgca acaatgtctt aaatgtgaaa atggaaacaa cctaaatacc caataataac 1620
aggattaaat aattcattgt acattaaaag aatactgtct ataaagatgt ctagaataag 1680
ttgttcagtt gaagttgtaa agctaaatac acaataccca taatgtgcac agaaataatc 1740
agaatgtcat gaaaccagga ttattggtga tgtgttgctt cctttgttac tcatttctgt 1800
attggcataa tgagtattgg gtgttcaaga ggagggggaa ggaagtatga cagatgttat 1860
ggggaaaaag caaagtacaa caggaagaca ccttggggga actaatagaa tctaaggact 1920
caaggatggc ttcctggagg aaatacagct agaacaaagg ggaggaatga gaagtgatgt 1980
gatggcgtgg agtgggctgt agtgggaaga agagtcttcc agggagctgg cacagtatgt 2040
gaaaacagta aagcaagtgc ctggattttt taaggaactg aaaatttagt tgagttgaaa 2100
tttagagttt ggctaggaag gttatgagag ataagaataa agagttaaca gcagccagat 2160
tttaaggatt ttataagaca tttttaggag tttttatttc atcctgagag aaatgtgaag 2220
ccatcgaagg gttgaaagag gagagtgagt tgatcagcat tgcattttag aaaaatccct 2280
ctatctgcaa cttgaaaaac attctggagg taagcaagcc tggaggccag gagcctagga 2340
gggctatttg atccagatga gaagtaatgg tgacctgaac tagggcagag gcacctagga 2400
ttggaaaaca tggacagatc acagcactac ttatgtagta tacttggtaa gacctggttg 2460
tttaaaagag aaggatgagg gaaagaaggt caaaaacaac ttctaggact ctccattggc 2520
cagtgtggtg tgcccttcac tgaagagcaa acacaaaatg aaagattgtg ggcaaagagt 2580
tgagtcagtg agaaggcaag gagagaacct tataaaaaaa ttgactatgt gattaaaaac 2640
ttaaaaattt cccccaacgt gtttatcttt tccattagca gaaataacta agagttgtct 2700
taattctaat gggatttatt ccatattgtc tctcatgccc tctacctagt tattagtgca 2760
aatatttata tgtggcaaca taaaactttt taactcttta ttctcttctc tcgtgtaccc 2820
tcccagctct ttaggggagg tggatttgag gcagatacca taaagaaaag ttggtcacat 2880
ggtggtaaca cgttgaagtt atgccacatg agacatcagc actggcaaga gaaatgtctg 2940
tgttgtagat gtttcacttg gaagaaattg aaggaccctg agccttaaaa gtctgacaaa 3000
cttaagccag gacccctgtg gggaaggtag aggggccaac aaacaagatt gggagtcaga 3060
gagataacaa tgaaatcccc aatgcctgtg ggaggtggac tccctggatt agtactagac 3120
agaaaaggta caaaaatatt tcaaaccatt ctcacaactc tatatgtgtc tatgaccaga 3180
taactggaag accttctggt tatggactat gcgtatacac tctcccagat agttagaggc 3240
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cacttactgc ctcacttaac gacagggata cgttctgaaa ggtgcatcat taggcggttt 3600
tgttgtgtga acatcacaga gtgttactta cacaaaccta aatgatacag cctactaaac 3660
acctaggcta tatgagcaat acagcctatt gctcttaggc ttcaaacttg tacgacatgt 3720
cactgtactg aatactgtag gcaactataa cacagtggta agtatattgt gtatctaaac 3780
aaacatagaa aaggtaatgc actgtactat gatgttacaa cagctaggat gttgctatca 3840
atagaaattt ttcagcttca ttttattttt atgggaccac ctttgtatat gtggttcatt 3900
gttggccgaa acaccattct gtggcacatg actatgtatt tattcctcat tattccttta 3960
atattcatct cttccaggag ggcatgtcat ggacaatctc tttttcttac cacaggtctt 4020
aggacctggc ctagcacctg gccaagaact actggcatac ctccttttat tgtgcttcaa 4080
tttattgtgc tttgcaaata ctgaattttt tacaagttga agatttgtgg cacctctgta 4140
accagcaagt ctattggtgc cattttttca acatcatgtg cctgtttcct gtctcgctca 4200
tgtcacattt tggtaatttt cacaatatta aaaacttttt cattattatt a 4251
Claims (10)
- 서열번호 10의 서열을 포함하는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 리더 (leader)를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하고, 상기 프라이머에 의해 특이적으로 증폭된 코로나바이러스 SARS-CoV-2 리더 서열의 산물에 상보적으로 혼성화할 수 있는 서열번호 3의 서열을 포함하는 프로브를 포함하는, 코로나바이러스 SARS-CoV-2 진단용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 따른 조성물을 포함하는 코로나바이러스 SARS-CoV-2 진단용 키트.
- 서열번호 10의 서열을 포함하는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 리더 (leader)를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머; 및 상기 프라이머에 의해 특이적으로 증폭된 코로나바이러스 SARS-CoV-2 리더 서열의 산물에 상보적으로 혼성화할 수 있는 서열번호 3의 서열을 포함하는 프로브를 샘플에 처리하는 단계를 포함하는 코로나바이러스 SARS-CoV-2 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제6항에 있어서, 상기 증폭은 RT-qPCR (Quantitative reverse transcription PCR)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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