JP2022544015A - ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓでの標的化されたＲＮＡ切断 - Google Patents

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓでの標的化されたＲＮＡ切断 Download PDF

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Abstract

本発明は、コロナウイルスまたはインフルエンザウイルスなどのウイルスＲＮＡを標的とするための、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）などのＲＮＡを調節するためのタンパク質、核酸、システム、及び方法を提供する。【選択図】図１１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月２３日に出願された米国仮出願第６２／８７７，４１５号、２０２０年３月２７日に出願された米国仮出願第６３／０００，７３７号、２０２０年３月２７日に出願された米国仮出願第６３／０００，７５７号、及び２０２０年７月１５日に出願された米国仮出願第６３／０５２，２８２号の優先権を主張し、それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ヒトの単一遺伝子疾患は、タンデムヌクレオチドリピート配列の異常な拡張から生じる可能性があり、これは、ＲＮＡに転写されるとき、ミスフォールディングし、毒性の核病巣に凝集する可能性がある。リピートを含有するＲＮＡの核内保持により、必須のＲＮＡ結合タンパク質が隔離されることで、それらの正常な発現が崩壊され、広範なスプライシング欠陥が誘導される可能性がある。これらの障害の中で最も一般的なものは、筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）であり、これは、ヒト筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’ＵＴＲにおける非コードＣＴＧリピート拡張の発現から生じる疾患である。
集中的な努力にもかかわらず、ＤＭ１を治療するために設計された現在承認された療法はない。ＣＵＧリピートを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、毒性ＲＮＡのレベルを低減させ、動物モデルにおけるＭＢＮＬタンパク質の結合及び隔離を崩壊するために使用されている。しかしながら、ヒト骨格筋における治療有効レベルでのこれらの分子の送達については、重大な課題が残っている。細菌由来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ＤＮＡエンドヌクレアーゼを使用したゲノム編集アプローチが、ＤＭＰＫ遺伝子座を直接編集するために採用されている。しかしながら、ＣＴＧゲノムリピートの５’または３’末端のいずれかでのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集は、大きく、制御不能な配列欠失を誘導する可能性があり、リピート拡張に隣接する二重ガイドＲＮＡの使用は、毒性を残す頻繁な配列反転をもたらす可能性がある。ＤＮＡを操作するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９アプローチは、生殖細胞系列編集のリスクにより、非効率的で論争的なままであるため、活性リボヌクレアーゼに融合された非活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を使用してリピートＲＮＡを標的とする代替アプローチが、細胞において有効であることが最近示されている。しかし、このアプローチはいくつかの理由で非効率的である可能性がある。１）ｄＣａｓ９は、ＤＮＡに対する親和性を保持し、ＲＮＡへの結合に関して競合する可能性がある、２）ｄＣａｓ９融合タンパク質の大きなサイズが、インビボまたは核局在化におけるそれらの送達を制限する場合がある、３）ｄＣａｓ９は、オフターゲットＲＮＡ切断の機会を増加させ可能性のある短いガイドＲＮＡを利用し、及び４）それらは、効率的に結合するためのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とし、それはほとんどのヒトリピート拡張配列においては存在しない。したがって、ＤＭ１患者における毒性核ＲＮＡを標的とする効率的な治療戦略の開発については、重大な課題が残る。
コロナウイルスは、エンベロープで覆われた、一本鎖ＲＮＡウイルスであり、自然界に蔓延しており、動物集団及びヒト集団の両方において病原性である。ウシコロナウイルスは、ウシの下痢、成牛の冬季赤痢の主な原因であり、ウシ呼吸器疾患の顕著な割合を引き起こす。ヒトにおいては、コロナウイルスは病原性呼吸器疾患、特にＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、及び最近ではＣＯＶＩＤ－１９を誘導し、これらは世界的な大流行になる可能性がある。現在、ヒトのコロナウイルス感染症を治療するために利用できるワクチンはない。動物において、年齢、ワクチン非応答者、及びウイルス変異などのワクチンの有効性を制限する要因は、コロナウイルス関連の死亡及び疾患を予防するための代替の標的化された治療薬の必要性を浮き彫りにしている。
哺乳動物のガイドＲＮＡ発現カセットは、概して、ガイド配列を含むアニーリングされたオリゴヌクレオチドを、哺乳動物のＰｏｌ ＩＩＩプロモーター、ダイレクトリピート、及び６つ以上のＴのターミネーターからなるカセットにクローニングすることによって作製される。一般的に、複数のガイドＲＮＡは、追加のＰｏｌ ＩＩＩプロモーターカセットを添加することによって発現されるが、これは、ベクターの複雑性及びサイズを著しく増加させる可能性がある。タンデムｃｒＲＮＡアレイの生成は、ベクターのサイズ要件を著しく減少させるであろうが、長いアレイのヌクレオチド合成は、ＤＲ配列のサイズ及びリピート性質により禁止されている。したがって、当技術分野において、ＲＮＡを調節及び／または切断するための組成物、送達システム及び方法が必要とされている。
一態様において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を提供する。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ガイド配列を含み、ガイド配列は、コロナウイルスゲノムｍＲＮＡ配列またはコロナウイルスサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的である。一実施形態において、ガイド配列は、コロナウイルスリーダー配列、コロナウイルスＳ配列、コロナウイルスＥ配列、コロナウイルスＭ配列、Ｎ配列、またはコロナウイルスＳ２Ｍ配列に実質的に相補的である。一実施形態において、ガイド配列は、配列番号３０８～３１４、３１６～３２１、及び３２６～３２７から選択される配列と少なくとも８０％相同な配列に実質的に相補的である。一実施形態において、ガイド配列は、配列番号３５６～３９１から選択される配列と少なくとも８０％相同な配列を含む。
一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列をさらに含む。一実施形態において、ＤＲ配列は、ガイド配列から３’にある。一実施形態において、ＤＲ配列は、配列番号２９１～３００から選択される配列を含む。
一実施形態において、本開示は、コロナウイルスゲノムｍＲＮＡ配列またはコロナウイルスサブゲノムｍＲＮＡに実質的に相補的である本開示のガイド配列を含むｃｒＲＮＡを少なくとも２つ含むタンデムアレイを提供する。一実施形態において、各ｃｒＲＮＡは、ガイド配列及びダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含み、各ＤＲ配列は異なる。一実施形態において、タンデムアレイは、配列番号４０２と少なくとも８０％同一の配列を含む。
一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ガイド配列を含み、ガイド配列は、インフルエンザウイルスゲノムＲＮＡ配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムＲＮＡ配列に実質的に相補的である。一実施形態において、ガイド配列は、インフルエンザウイルスＰＢ２配列、インフルエンザウイルスＰＢ１配列、インフルエンザウイルスＰＡ配列、インフルエンザウイルスＮＰ配列、またはインフルエンザウイルスＭ配列に実質的に相補的である。一実施形態において、ガイド配列は、配列番号３２８～３４から選択される配列と少なくとも８０％相同な配列に実質的に相補的である。
一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列をさらに含む。一実施形態において、ＤＲ配列は、ガイド配列から３’にある。一実施形態において、ＤＲ配列は、配列番号２９１～３００から選択される配列を含む。
一実施形態において、本開示は、インフルエンザウイルスゲノムＲＮＡ配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムＲＮＡ配列に実質的に相補的な本開示のガイド配列を含むｃｒＲＮＡを少なくとも２つ含むタンデムアレイを提供する。一実施形態において、各ｃｒＲＮＡは、ガイド配列及びダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含み、各ＤＲ配列は異なる。一実施形態において、タンデムアレイは、配列番号４０３または４０４と少なくとも８０％同一の配列を含む。
一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ガイド配列を含み、ガイド配列は、拡張されたＲＮＡリピートに実質的に相補的である。一実施形態において、拡張されたリピートは、ＣＴＧリピート、ＣＣＴＧリピート、ＧＧＧＣＣリピート、ＣＡＧリピート、ＣＧＧリピート、ＡＴＴＣＴリピート、またはＴＧＧＡＡリピートである。一実施形態において、ガイド配列は、配列番号３０１～３０６から選択される配列と少なくとも８０％相同な配列に実質的に相補的である。一実施形態において、ガイド配列は、配列番号３４８～３５４から選択される配列と少なくとも８０％相同な配列を含む。
一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列をさらに含む。一実施形態において、ＤＲ配列は、ガイド配列から３’にある。一実施形態において、ＤＲ配列は、配列番号２９１～３００から選択される配列を含む。
一実施形態において、本開示は、拡張されたＲＮＡリピートに実質的に相補的である本開示のガイド配列を含むｃｒＲＮＡを少なくとも２つ含むタンデムアレイを提供する。一実施形態において、各ｃｒＲＮＡは、ガイド配列及びダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含み、各ＤＲ配列は異なる。
一実施形態において、本開示は、本開示のｃｒＲＮＡまたはタンデムアレイを含む組成物を提供する。一実施形態において、組成物は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３である。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号１～４６から選択される配列と少なくとも８０％同一の配列を含む。
一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、局在化シグナルをさらに含む。一実施形態において、局在化シグナルは、ＮＥＳであり、ＮＥＳは、配列番号７５～７６と少なくとも８０％同一の配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり、ＮＬＳは、配列番号６７～７４及び４２７～１０３９と少なくとも８０％同一の配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルは、配列番号７７～８３と少なくとも８０％同一の配列を含む。
一態様において、本開示は、標的化されたＲＮＡ切断のための送達システムを提供する。一実施形態において、送達システムは、パッケージングプラスミド、転移プラスミド、及びエンベローププラスミドを含み、パッケージングプラスミドは、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含み、転移プラスミドは、ｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸配列及びＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を含み、エンベローププラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、エンベロープタンパク質は、コロナウイルススパイク糖タンパク質である。一実施形態において、エンベロープタンパク質は、配列番号１７２～１８３から選択される配列と少なくとも８０％同一の配列を含む。一実施形態において、エンベロープタンパク質は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質及びインフルエンザウイルスＮＡタンパク質から選択される１つ以上のタンパク質を含む。
一態様において、本開示は、コロナウイルス感染症を治療するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、対象に、（１）コロナウイルスゲノムｍＲＮＡ配列もしくはコロナウイルスサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的であるガイド配列を含むｃｒＲＮＡ、またはコロナウイルスゲノムｍＲＮＡ配列もしくはコロナウイルスサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的であるガイド配列を各々含む２つ以上のｃｒＲＮＡを含むタンデムアレイと、（２）Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸とを投与することを含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、コロナウイルスゲノムＲＮＡまたはコロナウイルスサブゲノムＲＮＡに結合し、Ｃａｓタンパク質は、コロナウイルスゲノムＲＮＡまたはコロナウイルスサブゲノムＲＮＡを切断する。
一態様において、本開示は、インフルエンザウイルス感染症を治療するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、対象に、（１）インフルエンザウイルスゲノムＲＮＡ配列もしくはインフルエンザウイルスサブゲノムＲＮＡ配列に実質的に相補的であるガイド配列を含むｃｒＲＮＡ、またはインフルエンザウイルスゲノムＲＮＡ配列もしくはインフルエンザウイルスサブゲノムＲＮＡ配列に実質的に相補的であるガイド配列を各々含む２つ以上のｃｒＲＮＡを含むタンデムアレイと、（２）Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸とを投与することを含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、インフルエンザゲノムＲＮＡまたはインフルエンザサブゲノムＲＮＡに結合し、Ｃａｓタンパク質は、コロナウイルスゲノムＲＮＡまたはインフルエンザサブゲノムＲＮＡを切断する。
一態様において、本開示は、拡張されたＲＮＡリピートに関連する疾患または障害を治療するための方法を提供し、方法は、（１）拡張されたＲＮＡリピートに実質的に相補的であるガイド配列を含むｃｒＲＮＡ、または拡張されたＲＮＡリピートに実質的に相補的であるガイド配列を各々含む２つ以上のｃｒＲＮＡを含むタンデムアレイと、（２）Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸とを投与することを含む。一実施形態において、疾患または障害は、筋緊張性ジストロフィー１型、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、ハンチントン病様２、脆弱Ｘ関連振戦失調症候群、脊髄小脳失調症１、脊髄小脳失調症２、脊髄小脳失調症３、脊髄小脳失調症６、脊髄小脳失調症７、脊髄小脳失調症１７、脊髄小脳失調症８、脊髄小脳失調症１０、脊髄小脳失調症３１、球脊髄性筋萎縮症、及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症からなる群から選択される。
一態様において、本開示は、２つ以上のｃｒＲＮＡを含むタンデムアレイを提供する。一実施形態において、各ｃｒＲＮＡは、ガイド配列及びダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含み、各ＤＲ配列は異なる。一実施形態において、各ＤＲ配列は、配列番号２９１～３００から個別に選択される配列を含む。
一態様において、本開示は、ウイルス感染症を治療するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、対象に、請求項４５～４７のうちのいずれかのタンデムアレイと、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸とを投与することを含み、タンデムアレイは、ウイルスＲＮＡに実質的に相補的である１つ以上のｃｒＲＮＡを含む。
一態様において、本開示は、融合タンパク質を提供する。一実施形態において、融合タンパク質は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び（ｂ）核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３である。一実施形態において、Ｃａｓ１３は、配列番号１～４６から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む。一実施形態において、ＮＬＳは、配列番号６７～７４及び４２７～１０３９から選択される配列、またはそのバリアントを含む。一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１５０、１５１、１６１、及び１６２から選択される配列、またはそのバリアントを含む。一実施形態において、本開示は、Ｃａｓタンパク質及び局在化シグナルを含む、本開示の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
一態様において、本開示は、対象において標的ＲＮＡの数を減少させるか、または標的ＲＮＡを切断するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、対象に、Ｃａｓタンパク質及びＮＬＳを含む本開示の融合タンパク質、またはＣａｓタンパク質及びＮＬＳをコードする本開示の核酸分子と、標的ＲＮＡにおけるＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）酸とを投与することを含む。
一態様において、本開示は、融合タンパク質を提供する。一実施形態において、融合タンパク質は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び（ｂ）蛍光タンパク質を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ｄＣａｓ１３である。一実施形態において、Ｃａｓ１３は、配列番号４７～４８から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む。一実施形態において、融合タンパク質は、局在化シグナルまたは輸出シグナルをさらに含む。一実施形態において、局在化シグナルは、ＮＬＳであり、ＮＬＳは、配列番号６７～７４及び４２７～１０３９から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む。一実施形態において、局在化シグナルは、核輸出シグナル（ＮＥＳ）であり、ＮＥＳは、配列番号７４～７５から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む。一実施形態において、局在化シグナルは、配列番号６７～８３もしくは４２７～１０３９から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む。一実施形態において、蛍光タンパク質は、ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｓｆＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ（１－１０）、ｓｆＧＦＰ（１－１０）－Ｌ－（１１）、及び７×Ｓ１１からなる群から選択される。一実施形態において、蛍光タンパク質は、配列番号４９～５６から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む。一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号８４～１４９から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む。一実施形態において、本開示は、Ｃａｓタンパク質、蛍光タンパク質、及び任意選択で局在化シグナルを含む、本開示の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
一態様において、本開示は、対象において標的ＲＮＡを可視化する方法を提供する。一実施形態において、方法は、対象に、Ｃａｓタンパク質及び蛍光タンパク質を含む本開示の融合タンパク質、またはＣａｓタンパク質及び蛍光タンパク質をコードする本開示の核酸分子と、標的ＲＮＡにおけるＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）酸とを投与することを含む。
一態様において、本開示は、融合タンパク質を提供する。一実施形態において、融合タンパク質は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び（ｂ）局在化シグナルを含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３である。一実施形態において、Ｃａｓ１３は、配列番号１～４６から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む。一実施形態において、局在化シグナルは、ＮＬＳであり、ＮＬＳは、配列番号６７～７４及び４２７～１０３９から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む。一実施形態において、局在化シグナルは、核輸出シグナル（ＮＥＳ）であり、ＮＥＳは、配列番号７４～７５から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む。一実施形態において、局在化シグナルは、配列番号６７～８３もしくは４２７～１０３９から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む。一実施形態において、本開示は、Ｃａｓタンパク質及び局在化シグナルを含む、本開示の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
一態様において、本開示は、対象において標的ＲＮＡの数を減少させるか、または標的ＲＮＡを切断するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、対象に、Ｃａｓタンパク質及び局在化シグナルを含む本開示の融合タンパク質、またはＣａｓタンパク質及び局在化シグナルをコードする本開示の核酸分子と、標的ＲＮＡにおけるＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）酸とを投与することを含む。
一態様において、本開示は、合成コロナウイルスエンベロープタンパク質を提供する。一実施形態において、タンパク質は、配列番号１７２～１８３から選択されるアミノ酸配列、またはそれらのバリアントを含む。一実施形態において、本開示は、本開示の合成コロナウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸分子を提供する。
一態様において、本開示は、含むタンパク質または核酸を送達するための送達システムを提供する。一実施形態において、送達システムは、パッケージングプラスミド、転移プラスミド、及びエンベローププラスミドを含み、パッケージングプラスミドは、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含み、転移プラスミドは、送達されるタンパク質または核酸をコードする核酸配列を含み、エンベローププラスミドは、本開示の合成コロナウイルスエンベロープをコードする核酸配列を含む。
一態様において、本開示は、遺伝子またはタンパク質を呼吸器、血管、腎臓、または心血管の細胞型に送達する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、細胞に、本開示の送達システムを施すことを含む。
毒性ＲＮＡ病巣の可視化のための堅牢な核局在化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３融合タンパク質の開発を実証する実験結果を示す。図１Ａは、Ｎ末端３×ＦＬＡＧ及びＴｙ１ ＮＬＳならびにＣ末端ｅＧＦＰをコードする触媒的に死んだＰｓｐＣａｓ１３ｂ（ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ）の設計を示す。Ｆ－３×ＦＬＡＧエピトープ、ＮＬＳ－Ｔｙ１核局在化配列、ｐＡ－ＳＶ４０ポリアデニル化配列。 毒性ＲＮＡ病巣の可視化のための堅牢な核局在化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３融合タンパク質の開発を実証する実験結果を示す。図１Ｂは、９６０ＣＴＧリピート拡張を有するヒトＤＭＰＫ（エクソン１１～１５）のＣ末端ゲノム断片をコードするＤＴ９６０ベクターの構成要素を示す図を示す。 毒性ＲＮＡ病巣の可視化のための堅牢な核局在化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３融合タンパク質の開発を実証する実験結果を示す。図１Ｃは、ＣＡＧｘ９ ｃｒＲＮＡの設計及びＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡによるその予測される標的化を図示する。 毒性ＲＮＡ病巣の可視化のための堅牢な核局在化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３融合タンパク質の開発を実証する実験結果を示す。図１Ｄは、ＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡを発現するＣＯＳ７細胞における非標的化またはＣＡＧｘ９ ｃｒＲＮＡのいずれかで標的化されたｈｉｌｉｇｈｔＲ緑色の細胞局在を示す代表的な画像を示す。スケールバー、１０μｍ。 図２Ａ及び図２Ｂを含み、ＣＵＧｅｘｐ 病巣及びＭＢＮＬ１とのｈｉｌｉｇｈｔＲ緑色の共局在化を実証する実験結果を示す。図２Ａは、ＣＡＧｘ９ ｃｒＲＮＡで標的化された場合、抗ＦＬＡＧ抗体を使用した免疫組織化学を使用して、ＦＩＳＨを使用して検出されるＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡとともに共局在化したｈｉｌｉｇｈｔＲ赤色を検出したことを示す。図２Ｂは、ＣＡＧｘ９ ｃｒＲＮＡで標的化された非標的化ｃｒＲＮＡでは標的化されていない場合、ＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡ病巣を発現するＣＯＳ７細胞中のｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＢＮＬ１と共局在化したＨｉｌｉｇｈｔＲ緑色を示す。スケールバー、１０μｍ。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３による毒性ＲＮＡ病巣の分解を実証する実験結果を示す。図３Ａは、Ｔｙ１ ＮＬＳをコードする活性なＰｓｐＣａｓ１３ｂ（ｅｒａｓｅＲ）の共発現が、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＢＮＬ１によって検出された３つのフレームすべてにおいて標的配列で設計されたＣＡＧ ｃｒＲＮＡで標的化した場合に、ＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡを発現する細胞におけるＲＮＡ病巣の数を有意に減少させたことを示す。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３による毒性ＲＮＡ病巣の分解を実証する実験結果を示す。図３Ｂは、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＢＮＬ１によって検出された病巣を示すｅｒａｓｅＲによって標的化された細胞の代表的な顕微鏡写真を示し、これらは、数が顕著に減少し、より淡く見える。スケールバー、１０μｍ。＊＊＝ｐ値＜０．０１、＊＊＊＝ｐ値＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ値＜０．０００１。 ＣＯＳ７細胞における誘導されたＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡ病巣の検出を実証する実験結果を示す。図４Ａは、ＣＡＧリピートアンチセンスプローブを有するＦＩＳＨを使用して検出された、９６０コピーのＣＵＧリピートで誘導されたＲＮＡ病巣を発現するＣＯＳ７細胞を示す。ＡＦ４８８－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８。 ＣＯＳ７細胞における誘導されたＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡ病巣の検出を実証する実験結果を示す。図４Ｂは、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＢＮＬ１融合タンパク質を使用して検出されたように、ＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡの発現が、ＭＢＮＬ１の病巣への局在化を誘導することを示す。 ＣＯＳ７細胞における誘導されたＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡ病巣の検出を実証する実験結果を示す。図４Ｃは、ＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡを発現するＣＯＳ７細胞における、非標的化またはＣＡＧｘ９ ｃｒＲＮＡのいずれかによってガイドされるｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ｈｉｌｉｇｈｔＲ赤色）の局在化を示す。スケールバー、１０μｍ。 スプライシングスペックルを有するｈｉｌｉｇｈｔＲ緑色の共局在化を実証する実験結果を示す。以前の報告と一致して、抗ＳＣ－３５抗体を使用して検出したように、ＣＡＧｘ９ ｃｒＲＮＡで標的化されたｈｉｌｉｇｈｔＲ緑色によって印付けされた、スプライシングスペックルと共局在化したＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡ病巣。スケールバー、１０μｍ。 触媒的に死んだＣａｓ１３（ｄＣａｓ１３）は、ＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡ病巣の数を有意に低減させないことを実証する実験結果を示す。ＣＡＧｘ９ ｃｒＲＮＡで標的化されたｄＰｓｐＣａｓ１３ｂの発現は、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＢＮＬ１によって検出されるように、細胞当たりのＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡ病巣の数を有意に減少させない。ｎｓ－有意ではない。 図７Ａ～図７Ｄを含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３によるＤＭ１の治療的調節を実証する図を示す。図７Ａは、筋緊張性ジストロフィー１型が、ヒトＤＭＰＫ遺伝子の３’非コードＵＴＲにおけるＣＵＧリピートの拡張及び発現によって引き起こされることを示す。このＣＵＧの拡張は、ＲＮＡ結合タンパク質のＭＢＮＬファミリーに結合して隔離する安定したヘアピン構造を形成し、代替スプライシング及びポリアデニル化における広範な欠陥をもたらす。図７Ｂは、ＣＵＧリピートがアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）によって誘導される切断に耐性があることを示すが、ＡＳＯは、ＭＢＮＬ１タンパク質の結合を遮断するために成功裏に使用されている。しかしながら、治療上有効なレベルのＡＳＯをヒト組織に送達するためには、多くの課題が残る。図７Ｃは、ｃｒＲＮＡによるｄＣａｓ１３ガイドの特異的結合、または潜在的なｃｒＲＮＡ単独が、ＭＢＮＬタンパク質を遮断し、スプライシング及びポリアデニル化欠損を救出する役割を果たすことができるか、または蛍光タンパク質と組み合わせた場合、ＣＵＧリピートＲＮＡ病巣を強調することができることを示す。図７Ｄは、触媒的に活性なＣａｓ１３を使用して、ＭＢＮＬの隔離だけでなく毒性ペプチドのＲＡＮ依存的翻訳などの他の潜在的なＣＵＧリピートに誘導される病態を予防するためにＣＵＧリピートＲＮＡを切断及び分解することができることを示す。 筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）は、８，０００人に１人で発生する遺伝性多系統の進行性衰弱性疾患であり、特定の集団においては５００人に１人という高い発症率であり、ＤＭ１患者の約８０％で心臓合併症が発症し、主な死因であることを示す概略図を示す。ＤＭ１は、ヒトジストロフィー筋緊張症タンパク質キナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の非コード３’非翻訳領域におけるＣＵＧトリヌクレオチドリピートの拡張及び発現から生じる。約５０を超えるＣＵＧリピートを有する変異体ＤＭＰＫｍＲＮＡは、毒性核ＲＮＡ病巣を形成し、これは、ＲＮＡ結合タンパク質のｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ様（ＭＢＮＬ）ファミリーのメンバーを隔離することによって、正常なＤＭＰＫ発現を妨げ、代替スプライシングにおける広範な欠陥を誘導する。ＤＭ１発症の基礎となる多数の崩壊された筋肉遺伝子により、患者は、しばしば心房及び心室不整脈、拡張型心筋症、ならびに心筋線維症を含む、種々の臨床的心臓表現型を示す。ＲＮＡ結合ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３は、堅牢な非古典的核局在化シグナル（ｈｉｌｉｇｈｔＲ及びｅｒａｓｅＲ）で局在化された場合、細胞内の毒性核ＲＮＡ病巣を可視化し、分解するために使用され得る。 ＤＭ１のマウスモデルにおける心臓機能の治療的救出を実証する実験結果を示す。図９Ａは、ＣＵＧ９６０心臓ＤＭ１マウスモデルの生成を示す。 ＤＭ１のマウスモデルにおける心臓機能の治療的救出を実証する実験結果を示す。図９Ｂは、ＣＵＧ９６０心臓ＤＭ１マウスモデルの生成を示す。 ＤＭ１のマウスモデルにおける心臓機能の治療的救出を実証する実験結果を示す。図９Ｃは、ｅｒａｓｅＲ ＡＡＶ構築物の図を示す。 ＤＭ１のマウスモデルにおける心臓機能の治療的救出を実証する実験結果を示す。図９Ｄは、ＡＡＶ９を使用した心臓特異的遺伝子送達及び発現を実証する実験結果を示す。 ＤＭ１のマウスモデルにおける心臓機能の治療的救出を実証する実験結果を示す。図９Ｅは、ＤＭ１心臓における細胞及び電気的異常のＣＵＧｅｘｐＲＮＡ逆転を標的とするｅｒａｓｅＲ ＡＡＶの送達を示す。 ｄＣａｓ１３でのＲＮＡ可視化及び融合タンパク質局在化を増強するための戦略を示す。図１０Ａは、単一の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と触媒的に不活性なＣａｓ１３（ｄＣａｓ１３）との融合を示す概略図を示し、それは細胞内の核ＲＮＡリピート病巣の特異的可視化に使用され得る。 ｄＣａｓ１３でのＲＮＡ可視化及び融合タンパク質局在化を増強するための戦略を示す。図１０Ｂは、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、またはｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ Ｃｈｅｒｒｙ）に固有の蛍光相補性を使用して、ｄＣａｓ１３に蛍光タンパク質を再構成する（例えば、相補対ｓｆＧＦＰ１－１０及びｓｆＧＦＰ１１）ことができることを示す概略図を示す。 ｄＣａｓ１３でのＲＮＡ可視化及び融合タンパク質局在化を増強するための戦略を示す。図１０Ｃは、小さな非蛍光構成要素のタンデム会合を使用して、ｄＣａｓ１３に標的化されたＲＮＡのシグナル対ノイズ比を増加させる可能性を有するｄＣａｓ１３に対する蛍光タンパク質の大きなタンデムアレイを再構成することができることを示す概略図を示す。 ｄＣａｓ１３でのＲＮＡ可視化及び融合タンパク質局在化を増強するための戦略を示す。図１０Ｄは、このアプローチが、相補的な蛍光融合タンパク質（例えば、ｓｆＧＦＰ１－１０）への融合として共発現される場合、融合タンパク質（タンパク質「Ｘ」）を標的化するために同様に有用であり得ることを示す概略図を示す。 コロナウイルスゲノム及びサブゲノムｍＲＮＡの概略図を示す。 ｅｒａｓｅＲプラットフォームの概略図を示す。 偽型化された統合欠損レンチウイルスベクターによる送達の概略図を示す。 ガイドＲＮＡ試験、レンチウイルス産生、及び細胞標的化の概略図を示す。図１４Ａは、５’及び３’ＣｏＶ標的配列をコードするルシフェラーゼレポート構築物の設計の概略図を示す。 ガイドＲＮＡ試験、レンチウイルス産生、及び細胞標的化の概略図を示す。図１４Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３構成要素をコードするレンチウイルス構築物を、ウイルスエンベロープタンパク質、例えば、ＡＣＥ２受容体発現細胞への侵入のための特異性を提供するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス由来のスパイク糖タンパク質で偽型化した非統合レンチウイルス粒子にパッケージングすることができることを実証する概略図を示す。これにより、「コロナウイルス標的化された」細胞型に特異的な標的化を可能になる。 ガイドＲＮＡ試験、レンチウイルス産生、及び細胞標的化の概略図を示す。図１４Ｃは、形質導入後、非統合レンチウイルスエピソームの処理及び形成は、ＣｏＶゲノム及びサブゲノムウイルスｍＲＮＡの急性の標的化された分解のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３構成要素の一過性発現を可能にすることを実証する概略図を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リーダー配列の保存及び標的部位を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リーダーｃｒＲＮＡのタイリングを示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リーダー配列を標的とする、検証されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ガイドＲＮＡを示す。図１７Ａは、ＳＡＲＳ－２－ＣｏＶリーダー配列及びｃｒＲＮＡ標的部位の位置を含有するルシフェラーゼレポーターを示す概略図を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リーダー配列を標的とする、検証されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ガイドＲＮＡを示す。図１７Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リーダー配列を標的とするタイリングｃｒＲＮＡの配列アラインメントを示す。転写調節配列（ＴＲＳ）は黄色で強調される。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リーダー配列を標的とする、検証されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ガイドＲＮＡを示す。図１７Ｃは、非標的化ｃｒＲＮＡに対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リーダー配列（ｃｒＲＮＡ Ａ～Ｇ）またはルシフェラーゼコード配列（Ｌｕｃ）を標的とするｃｒＲＮＡを有する細胞におけるＣｏＶリーダーＬｕｃレポーター活性の堅牢なノックダウンを実証する細胞ベースのルシフェラーゼアッセイを示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ステムループ様２（Ｓ２Ｍ）配列を標的とする、検証されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ガイドＲＮＡを示す。図１８Ａは、ＳＡＲＳ－２－ＣｏＶ Ｓ２Ｍ配列及びｃｒＲＮＡ標的部位の位置を含有するルシフェラーゼレポーターを示す概略図を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ステムループ様２（Ｓ２Ｍ）配列を標的とする、検証されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ガイドＲＮＡを示す。図１８Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２Ｍ配列を標的とするタイリングｃｒＲＮＡの配列アラインメントを示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ステムループ様２（Ｓ２Ｍ）配列を標的とする、検証されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ガイドＲＮＡを示す。図１８Ｃは、非標的化ｃｒＲＮＡに対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２Ｍ配列（ｃｒＲＮＡ Ａ～Ｆ）またはルシフェラーゼコーディング配列（Ｌｕｃ）を標的とするｃｒＲＮＡを有する細胞におけるＣｏＶ Ｓ２Ｍ Ｌｕｃレポーター活性の堅牢なノックダウンを実証する細胞ベースのルシフェラーゼアッセイを示す。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｃｒＲＮＡアレイのワンステップ指向性会合を示す。Ａは、典型的には、単一のＣａｓ１３タンパク質ならびに複数のスペーサー及びダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含有するＣＲＩＳＰＲアレイからなる、細菌ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３遺伝子座のゲノム組織化を示す概略図である。Ｂは、各機能的ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡが、スペーサー及びダイレクトリピートを含むように処理されることを実証する概略図である。スペーサー配列は標的配列に対するアンチセンスであり、標的特異性を提供するが、ＤＲ配列はＣａｓ１３タンパク質への結合のためのハンドルとして機能する。Ｃは、哺乳動物のｃｒＲＮＡ発現カセットが、典型的には、所望のスペーサー配列を含むアニーリング及びライゲーションオリゴヌクレオチドによって構築されることを示す概略図である。Ｄは、ＤＲのループ領域内の容認可能なヌクレオチド置換を利用する場合、複数のガイドＲＮＡが、順序付けられたアレイにおいて効率的に生成されることを実証する概略図である。Ｅは、アレイ会合のために利用され得るＰｓｐＣａｓ１３ｂＤＲのループ領域内の潜在的な容認可能なヌクレオチド置換を示す。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｃｒＲＮＡアレイのワンステップ指向性会合を示す。Ａは、典型的には、単一のＣａｓ１３タンパク質ならびに複数のスペーサー及びダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含有するＣＲＩＳＰＲアレイからなる、細菌ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３遺伝子座のゲノム組織化を示す概略図である。Ｂは、各機能的ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡが、スペーサー及びダイレクトリピートを含むように処理されることを実証する概略図である。スペーサー配列は標的配列に対するアンチセンスであり、標的特異性を提供するが、ＤＲ配列はＣａｓ１３タンパク質への結合のためのハンドルとして機能する。Ｃは、哺乳動物のｃｒＲＮＡ発現カセットが、典型的には、所望のスペーサー配列を含むアニーリング及びライゲーションオリゴヌクレオチドによって構築されることを示す概略図である。Ｄは、ＤＲのループ領域内の容認可能なヌクレオチド置換を利用する場合、複数のガイドＲＮＡが、順序付けられたアレイにおいて効率的に生成されることを実証する概略図である。Ｅは、アレイ会合のために利用され得るＰｓｐＣａｓ１３ｂＤＲのループ領域内の潜在的な容認可能なヌクレオチド置換を示す。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｃｒＲＮＡアレイのワンステップ指向性会合を示す。Ａは、典型的には、単一のＣａｓ１３タンパク質ならびに複数のスペーサー及びダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含有するＣＲＩＳＰＲアレイからなる、細菌ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３遺伝子座のゲノム組織化を示す概略図である。Ｂは、各機能的ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡが、スペーサー及びダイレクトリピートを含むように処理されることを実証する概略図である。スペーサー配列は標的配列に対するアンチセンスであり、標的特異性を提供するが、ＤＲ配列はＣａｓ１３タンパク質への結合のためのハンドルとして機能する。Ｃは、哺乳動物のｃｒＲＮＡ発現カセットが、典型的には、所望のスペーサー配列を含むアニーリング及びライゲーションオリゴヌクレオチドによって構築されることを示す概略図である。Ｄは、ＤＲのループ領域内の容認可能なヌクレオチド置換を利用する場合、複数のガイドＲＮＡが、順序付けられたアレイにおいて効率的に生成されることを実証する概略図である。Ｅは、アレイ会合のために利用され得るＰｓｐＣａｓ１３ｂＤＲのループ領域内の潜在的な容認可能なヌクレオチド置換を示す。 図２０Ａ～図２０Ｃを含み、Ｃａｓ１３ｂダイレクトリピート（ＤＲ）における非必須ループ残基の同定及び検証を示す。図２０Ａは、ＰｓｐＣａｓ１３ｂダイレクトリピートのＴ１７位及びＴ１８位でのすべての可能な変異を示す。図２０Ｂは、ルシフェラーゼレポーター及びｃｒＲＮＡ標的部位の位置を示す図である。図２０Ｃは、個々のＤＲループ変異を含有する２つの独立したガイドＲＮＡでのルシフェラーゼ活性のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂノックダウンを実証する実験結果を示す。 ガイドＲＮＡアレイを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ルシフェラーゼレポーターの標的化されたノックダウンを示す。図２１Ａは、単一または三重ガイドＲＮＡアレイのいずれかをコードするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３発現カセットをコードするレンチウイルス遺伝子転移プラスミドを示す図である。 ガイドＲＮＡアレイを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ルシフェラーゼレポーターの標的化されたノックダウンを示す。図２１Ｂは、５’及び３’ＵＴＲ内の複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス配列を含有するルシフェラーゼレポーターの概略図である。 ガイドＲＮＡアレイを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ルシフェラーゼレポーターの標的化されたノックダウンを示す。図２１Ｃは、陰性対照の非標的化ｃｒＲＮＡ（ＮＣ）に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ルシフェラーゼレポーターを標的とする単一の（ＬＤＲ－Ｄ）または三重のガイドＲＮＡ（ＬＤＲ－Ｄ／Ｎ－Ｂ／Ｓ２Ｍ－Ｄ）によって駆動される、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ＲＮＡ標的化構成要素の発現を介した相対的ルシフェラーゼ活性ノックダウンを実証する実験結果を示す。 ＡＡＶウイルスベクターにパッケージングされ得る三重ガイドＲＮＡをコードするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３発現カセットの概略図である。 図２３Ａ及び図２３Ｂを含み、インフルエンザウイルスの概略図である。図２３Ａは、インフルエンザウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の概略図である。インフルエンザは、８つのｖＲＮＡセグメントからなる、エンベロープ化されたネガティブセンスＲＮＡウイルスである。図２３Ｂは、インフルエンザウイルス粒子の概略図である。８つのｖＲＮＡはすべて、宿主細胞の結合及び融合のためのウイルスタンパク質ＨＡ及びＮＡを利用するエンベロープ化されたウイルス内にパッケージングされている。 インフルエンザを標的とするパッケージング及び送達するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ＲＮＡ編集構成要素の概略図である。図２４Ａは、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡアレイ及びＣａｓ１３タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３編集構成要素が、ウイルス遺伝子療法ベクター、例えば、統合欠損レンチウイルスベクターにパッケージングされ得ることを実証する概略図である。インフルエンザＮＡ及びＨＡエンベロープタンパク質を有するレンチウイルスベクターの偽型化は、インフルエンザウイルスによって標的化される宿主細胞へ送達するための方法の１つである。 インフルエンザを標的とするパッケージング及び送達するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ＲＮＡ編集構成要素の概略図である。図２４Ｂは、ウイルスベクター融合及び送達時に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３構成要素の発現が、ｖＲＮＡまたはウイルスｍＲＮＡの標的化された分解をもたらすことを実証する概略図である。ｖＲＮＡの標的化のために、Ｃａｓ１３タンパク質の堅牢な核局在化が必要である可能性がある。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ、－ｂ、及び－ｄの亜型間のＤＭ１ルシフェラーゼレポーターの比較ノックダウンを実証する実験結果を示す。図２５Ａは、ルシフェラーゼレポーターｐＧＬ３Ｐの３’ＵＴＲに位置する９６０ＣＵＧリピートをコードするヒトＤＭＰＫエクソン１５配列を含有するＤＭ１ルシフェラーゼレポーター（ｐＧＬ３Ｐ－ＤＴ９６０）を示す概略図である。ＣＵＧリピートを標的とするルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）及びＣＡＧ ｃｒＲＮＡについての相対標的部位が示される。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ、－ｂ、及び－ｄの亜型間のＤＭ１ルシフェラーゼレポーターの比較ノックダウンを実証する実験結果を示す。図２５Ｂは、ｅｒａｓｅＲ（ＰｓｐＣａｓ１３ｂ－Ｔｙ１ ＮＬＳ）、ＲｆｘＣａｓ１３ｄ（ＣａｓＲｘ－ＮＬＳ）、及びＬｗＣａｓ１３ａについて示される、ルシフェラーゼ及びＣＵＧリピートを標的とするｐＧＬ３Ｐ－ＤＴ９６０のノックダウンについての相対的なルシフェラーゼレポーター活性を示す。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３亜型による毒性核ＲＮＡ病巣の標的化されたクリアランスを実証する実験結果を示す。図２６Ａは、ＣＵＧ拡張リピート、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ－Ｔｙ１ＮＬＳの９６０コピーを含有するＲＮＡの発現によって誘導される、毒性核ＲＮＡ病巣の相対的なノックダウンを示す。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３亜型による毒性核ＲＮＡ病巣の標的化されたクリアランスを実証する実験結果を示す。図２６Ｂは、ＣＵＧ拡張リピート、ＲｆｘＣａｓ１３ｄ（ＣａｓＲｘ－ＮＬＳ）の９６０コピーを含有するＲＮＡの発現によって誘導される、毒性核ＲＮＡ病巣の相対的ノックダウンである。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３亜型による毒性核ＲＮＡ病巣の標的化されたクリアランスを実証する実験結果を示す。図２６Ｃは、ＣＵＧ拡張リピート、ＬｗＣａｓ１３ａの９６０コピーを含有するＲＮＡの発現によって誘導される、毒性核ＲＮＡ病巣の相対的ノックダウンである。核病巣をｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＢＮＬ１融合タンパク質の共発現により標識し、共焦点顕微鏡を用いて画像化した。 図２７Ａ及び図２７Ｂを含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクエンベロープタンパク質を有するレンチウイルスベクターの偽型化を実証する実験結果を示す。図２７Ａは、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＣｏＶスパイクタンパク質を有するレンチウイルスの偽型化のためにＮ末端及びＣ末端修飾（４ＬＶ）が必要であることを実証する概略図である。図２７Ｂは、野生型（ＷＴ）ＣｏＶスパイクタンパク質が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはヒトＡＣＥ２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＣＥ２－ＨＥＫ２９３Ｔ）の形質導入のためのレンチウイルスの偽型化に適していないことを実証する実験結果を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒトＡＣＥ２受容体の発現は、４ＬＶ偽型化されたレンチウイルスベクターによる形質導入に必要かつ十分である。ＶＳＶ－Ｇエンベロープにより、ＡＣＥ２発現とは独立して、インビトロでの多くの細胞型の広範な形質導入のためのレンチウイルスの偽型化が可能になる。
一態様において、本開示は、コロナウイルスまたはインフルエンザウイルスなどのウイルスＲＮＡを標的化するための新規ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を提供する。例えば、一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、コロナウイルスゲノムｍＲＮＡ、コロナウイルスサブゲノムｍＲＮＡ、インフルエンザウイルスゲノムＲＮＡ、またはインフルエンザウイルスサブゲノムＲＮＡに実質的に相補的であるガイド配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、コロナウイルスリーダー配列、コロナウイルスＳ配列、コロナウイルスＥ配列、コロナウイルスＭ配列、Ｎ配列、またはコロナウイルスＳ２Ｍ配列に実質的に相補的であるガイド配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、インフルエンザウイルスＰＢ２配列、インフルエンザウイルスＰＢ１配列、インフルエンザウイルスＰＡ配列、インフルエンザウイルスＮＰ配列、またはインフルエンザウイルスＭ配列に実質的に相補的であるガイド配列を含む。
一態様において、本開示は、ｃｒＲＮＡタンデムアレイを提供する。一実施形態において、タンデムアレイは、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、または８つ以上のｃｒＲＮＡ配列を含む。一実施形態において、タンデムｃｒＲＮＡアレイ中の各ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含む。各ｃｒＲＮＡアレイのＤＲ配列は、異なり得る。例えば、一実施形態において、ＤＲ配列のうちの少なくとも１つは、ポリＴストレッチにおいて単一の変異を含む。
一態様において、本開示は、標的化されたＲＮＡ切断を提供する新規のタンパク質の開発に基づく。一実施形態において、融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質、及び任意選択で局在化シグナルを含む。これらのタンパク質により、標的化されたＲＮＡ切断を提供するＣａｓタンパク質の特異的局在が可能になる。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ結合活性を有する。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３である。一実施形態において、局在化シグナルは、核局在化シグナル、核輸出シグナル、またはタンパク質を、細胞外に、もしくは、核小体、リボソーム、小胞、粗面小胞体、ゴルジ装置、細胞骨格、滑面小胞体、ミトコンドリア、液胞、細胞質、リソソーム、もしくは中心小体などの細胞小器官に局在化させる他の局在化シグナルである。
一態様において、本開示は、標的化されたＲＮＡ可視化を提供する新規の融合タンパク質の開発に基づく。一実施形態において、融合タンパク質は、触媒的に死んだＣａｓタンパク質、蛍光タンパク質、及び任意選択で局在化シグナルを含む。一実施形態において、融合タンパク質は、蛍光タンパク質の視覚化能力と、触媒的に死んだＣａｓのプログラム可能なＤＮＡ標的化能力とを組み合わせる。これらの融合タンパク質により、標的化されたＲＮＡ可視化を提供するＣａｓタンパク質の特異的局在が可能になる。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ結合活性を有する。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ｄＣａｓ１３である。一実施形態において、局在化シグナルは、核局在化シグナル、核輸出シグナル、またはタンパク質を、細胞外に、もしくは、核小体、リボソーム、小胞、粗面小胞体、ゴルジ装置、細胞骨格、滑面小胞体、ミトコンドリア、液胞、細胞質、リソソーム、もしくは中心小体などの細胞小器官に局在化させる他の局在化シグナルである。
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
概して、本明細書で使用される命名法、ならびに、細胞培養、分子遺伝学、有機化学、及び核酸化学、及びハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当技術分野において周知であり、一般的に使用されているものである。
核酸及びペプチド合成については、標準的な技術が使用される。本技術及び手順は、概して、当技術分野における従来の方法及び様々な一般的な参考文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ）に従って実施され、これらは、本文書全体で提供される。
本明細書で使用される命名法、及び以下に記載される分析化学及び有機合成において使用される実験手順は、当技術分野において周知であり、一般的に採用されているものである。標準的な技術またはその修正は、化学合成及び化学分析に使用される。
本発明の文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び同様の用語は、本明細書において別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。
本明細書で使用される「約」は、量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合、特定された値からの±２０％、または±１０％、または±５％、または±１％、または±０．１％の変動を包含することを意味し、そのような変動は、開示された方法を実施するために適切である。
「アンチセンス」とは、特に、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コード鎖の核酸配列、または非コード鎖と実質的に相同な配列を指す。本明細書で定義されるように、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列がＤＮＡ分子のコード鎖のコード部分のみに相補的である必要はない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコード鎖上に特定された調節配列に相補的であり得、調節配列はコード配列の発現を制御する。
「疾患」は、動物が恒常性を維持できず、疾患が改善されない場合、動物の健康状態が悪化し続ける、動物の健康状態である。
対照的に、動物における「障害」は、動物が恒常性を維持することができるが、その障害がない場合よりも動物の健康状態が好ましくない健康状態である。未治療のままでは、障害は、必ずしも動物の健康状態のさらなる低下を引き起こさない。
疾患または障害は、疾患または障害の徴候もしくは症状の重症度、患者が経験するそのような徴候もしくは症状の頻度、またはその両方が低減する場合、「緩和される」。
「コードする」とは、ヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）の定義された配列またはアミノ酸の定義された配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチド配列の固有の特性、またはそれから得られる生物学的特性を指す。したがって、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞または他の生物学系においてタンパク質を産生する場合、その遺伝子は、タンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に提供されるヌクレオチド配列であるコード鎖、及び遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方は、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると称され得る。
「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書で互換的に使用され、インビトロまたはインビボのいずれかに関わらず、本明細書に記載の方法に適した任意の動物または細胞を指す。一実施形態において、対象は、脊椎動物及び無脊椎動物を含む。無脊椎動物には、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ及びＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓが含まれるが、これらに限定されない。脊椎動物には、霊長類、げっ歯類、家畜、または狩猟動物が含まれるが、これらに限定されない。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク（例えば、アカゲザル）が含まれるが、これらに限定されない。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、及びハムスターが含まれるが、これらに限定されない。家畜及び狩猟動物は、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種（例えば、家ネコ）、イヌ種（例えば、イヌ、キツネ、オオカミ）、トリ種（例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ）、及び魚（例えば、ゼブラフィッシュ、トラウト、ナマズ及びサーモン）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。特定の非限定的な実施形態において、患者、対象または個体は、ヒトである。
抗体に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、試料中の特定の抗原を認識するが、他の分子を実質的に認識しないか、またはそれに結合しない抗体を意味する。例えば、１つの種由来の抗原に特異的に結合する抗体は、１つ以上の種由来のその抗原にも結合し得る。しかし、そのような種間反応性は、それ自体が特異的としての抗体の分類を変えるものではない。別の例において、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原の異なる対立遺伝子型にも結合し得る。しかしながら、このような交差反応性は、それ自体が特異的としての抗体の分類を変えるものではない。
いくつかの例では、「特異的結合」または「特異的な結合」という用語は、抗体、タンパク質、またはペプチドと第２の化学種との相互作用に関して使用され得、相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味し、例えば、抗体は、概して、タンパク質ではなく特定のタンパク質構造を認識し、特定のタンパク質構造に結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」及び抗体を含有する反応において、エピトープＡ（または遊離、非標識Ａ）を含有する分子の存在は、抗体に結合した標識されたＡの量を低減させる。
遺伝子の「コード領域」は、遺伝子の転写によって産生されるｍＲＮＡ分子のコード領域とそれぞれ相同または相補的である、遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基及び遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドからなる。
ｍＲＮＡ分子の「コード領域」はまた、ｍＲＮＡ分子の翻訳中に転移ＲＮＡ分子の抗コドン領域と一致するか、または終止コドンをコードするｍＲＮＡ分子のヌクレオチド残基からなる。したがって、コード領域は、ｍＲＮＡ分子によってコードされる成熟タンパク質において存在しないアミノ酸残基（例えば、タンパク質輸出シグナル配列におけるアミノ酸残基）についてのコドンを含むヌクレオチド残基を含み得る。
本明細書で使用される「相補的」とは核酸を指し、２つの核酸鎖の領域間または同じ核酸鎖の２つの領域間の配列相補性の広範な概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、第２の核酸領域の残基がチミンまたはウラシルである場合、第１の領域に逆平行であるその残基と特異的水素結合（「塩基対形成」）を形成することができることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、第２の核酸鎖の残基がグアニンである場合、第１の鎖に逆平行のその残基と塩基対形成することができることが知られている。核酸の第１の領域は、２つの領域が逆平行様式で配置され、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２の領域の残基と塩基対形成することができる場合、同じまたは異なる核酸の第２の領域に相補的である。一実施形態において、第１の領域が第１の部分を含み、第２の領域が第２の部分を含み、それにより、第１の部分及び第２の部分が逆平行様式で配置される場合、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、第２の部分におけるヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。一実施形態において、第１の部分のすべてのヌクレオチド残基が、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。
本明細書で使用される「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸として定義される。
本明細書で使用される「発現」という用語は、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳として定義される。
本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、転写されることができる遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。いくつかの場合では、次いで、ＲＮＡ分子はタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合では、これらの配列は、例えば、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、リボザイムなどの産生において翻訳されない。発現ベクターは、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の転写及びおそらくは翻訳に必要な核酸配列を指す、様々な制御配列を含有することができる。転写及び翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、他の機能も果たす核酸配列を含有し得る。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、当業者によって理解される当技術分野の用語であり、変異体またはバリアント形態と区別される自然界で発生する生物、株、遺伝子、または特徴の典型的な形態を意味する。
用語「相同性」は、ある程度の相補性を指す。部分的相同性または完全相同性（すなわち同一性）が存在し得る。相同性は、しばしば配列解析ソフトウェアを使用して測定される（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ．１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ．Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、挿入、及び他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって、類似の配列を一致させる。保存的置換は、典型的には、以下の群内の置換を含む。グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドからなるかどうか、ならびにホスホジエステル連結、またはホスホトリエステル、ホスホルアミダート、シロキサン、カルボナート、カルボキシメチルエステル、アセトアミダート、カルバマート、チオエーテル、架橋ホスホルアミダート、架橋メチレンホスホナート、ホスホロチオアート、メチルホスホナート、ホスホロジチオナート、架橋ホスホロチオナートもしくはスルホン連結、及びそのような連結の組み合わせなどの修飾された連結からなるかどうかにかわらず、任意の核酸を意味する。核酸という用語はまた、生物学的に生じる５つの塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）以外の塩基で構成される核酸も具体的に含む。「核酸」という用語は、典型的には、大きなポリヌクレオチドを指す。
ポリヌクレオチド配列を説明するために、従来の表記が本明細書で使用される。一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は、５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左端方向は、５’方向と称される。
発生期のＲＮＡ転写産物へのヌクレオチドの５’から３’への付加の方向は、転写方向と称される。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は、「コード鎖」と称され、ＤＮＡ上の参照点に対して５’に位置するＤＮＡ鎖上の配列は、「上流配列」と称され、ＤＮＡ上の参照点に対して３’にあるＤＮＡ鎖上の配列は、「下流配列」と称される。
本発明の文脈において、一般的に生じる核酸塩基についての以下の略語が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合で連結されるアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含むことができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、この用語は、当技術分野では、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーなどとしても一般に称される短鎖、及び当技術分野では一般にタンパク質として称される、多くの種類が存在するより長鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ生物活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質などが含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはこれらの組み合わせが含まれる。
本明細書で使用される「ＲＮＡ」という用語は、リボ核酸として定義される。
「バリアント」という用語は、本明細書で使用される場合、それぞれ参照核酸配列またはペプチド配列に由来する配列が異なるが、参照分子の必須生物学的特性を保持する核酸配列またはペプチド配列である。核酸バリアントの配列の変化は、参照核酸によってコードされるペプチドのアミノ酸配列を変えない場合もあれば、アミノ酸置換、付加、欠失、融合及び切断をもたらす場合もある。ペプチドバリアントの配列の変化は、参照ペプチド及びバリアントの配列が全体的に密接に類似し、多くの領域において同一であるように典型的には限定的または保存的である。バリアント及び参照ペプチドは、任意の組み合わせで１つ以上の置換、付加、欠失によってアミノ酸配列が異なり得る。核酸またはペプチドのバリアントは、対立遺伝子バリアントなどの天然に生じるものであってもよく、または天然に生じることが知られていないバリアントであってもよい。核酸及びペプチドの非天然に生じるバリアントは、変異誘発技術によって、または直接合成によって作製され得る。
「ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用され得る物質の組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが当技術分野において既知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞内への核酸の転移を促進する非プラスミド化合物及び非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるがこれに限定されない。
範囲：本開示を通して、本発明の様々な態様は、範囲形式で提示され得る。範囲形式の説明は、単に利便性及び簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内のすべての可能な部分的な範囲及び個々の数値を具体的に開示したとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分的な範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６などを具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
タンパク質
一態様において、本開示は、標的化されたＲＮＡ切断を提供する新規編集タンパク質の開発に基づく。いくつかの実施形態において、タンパク質は、局在化シグナルを含む。一実施形態において、局在化シグナルは、標的ＲＮＡが位置する部位にタンパク質を局在化させる。一実施形態において、タンパク質は、核内のＲＮＡを標的とするために核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。一実施形態において、タンパク質は、細胞質内のＲＮＡを標的とするために核輸出シグナル（ＮＥＳ）を含む。他の局在化シグナルを使用して（及び当技術分野で既知である）、ミトコンドリアなどの細胞小器官内のＲＮＡを標的化することができる。他の実施形態において、タンパク質は、細胞質内のＲＮＡを標的とするためにＮＬＳを含まない。一実施形態において、タンパク質は、精製及び／または検出タグを含む。
本開示はまた、編集タンパク質及び蛍光タンパク質の新規の融合物を提供する。一実施形態において、融合タンパク質は、蛍光タンパク質の視覚化能力と、触媒的に死んだＣａｓのプログラム可能な核酸標的化能力とを組み合わせる。一実施形態において、融合タンパク質は、核内のＲＮＡを標的とするために核局在化シグナルを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、細胞質内のＲＮＡを標的とするために核輸送シグナル（ＮＥＳ）を含む。他の実施形態において、融合タンパク質は、細胞質内のＲＮＡを標的とするためにＮＬＳを含まない。他の局在化シグナルを使用して（及び当技術分野で既知である）、ミトコンドリアなどの細胞小器官内のＲＮＡを標的化することができる。一実施形態において、融合タンパク質は、リンカーを含む。一実施形態において、リンカーは、Ｃａｓタンパク質及び蛍光タンパク質を連結する。一実施形態において、融合タンパク質は、精製及び／または検出タグを含む。
ＥｒａｓｅＲ
一態様において、本開示は、標的化されたＲＮＡ切断を提供し、かつ効果的に送達される新規の編集タンパク質の開発に基づく。いくつかの実施形態において、タンパク質は、局在化シグナルを含む。一実施形態において、局在化シグナルは、標的ＲＮＡが位置する部位にタンパク質を局在化させる。一実施形態において、タンパク質は、精製及び／または検出タグを含む。一実施形態において、タンパク質は、精製及び／または検出タグを含む。
編集タンパク質
一実施形態において、編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）タンパク質、及びＤＮＡまたはＲＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を含むが、これらに限定されない。
Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＳｐＣａｓ９、ＳｔＣａｓ９、ＮｍＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１、ＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９、ＶＱＲ ＳｐＣａｓ９、ｘＣａｓ９ ３．７、それらのホモログ、それらオルソログ、またはそれらの改変バージョンが挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡまたはＲＮＡ切断活性を有する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、標的配列内及び／または標的配列の相補体内などの標的配列の位置における核酸分子の１つまたは両方の鎖の切断を指向する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドからの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００塩基対またはそれよりも多くの塩基対内の１つまたは両方の鎖の切断を指向する。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３、またはＣｐｆ１である。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、触媒的に欠損である（ｄＣａｓ）。
一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ結合活性を有する。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３である。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ短縮、ＡｄｍＣａｓ１３ｄ、ＡｓｐＣａｓ１３ｂ、ＡｓｐＣａｓ１３ｃ、ＢｍａＣａｓ１３ａ、ＢｚｏＣａｓ１３ｂ、ＣａｍＣａｓ１３ａ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、Ｃｇａ２Ｃａｓ１３ａ、ＣｇａＣａｓ１３ａ、ＥｂａＣａｓ１３ａ、ＥｒｅＣａｓ１３ａ、ＥｓＣａｓ１３ｄ、ＦｂｒＣａｓ１３ｂ、ＦｎｂＣａｓ１３ｃ、ＦｎｄＣａｓ１３ｃ、ＦｎｆＣａｓ１３ｃ、ＦｎｓＣａｓ１３ｃ、ＦｐｅＣａｓ１３ｃ、ＦｕｌＣａｓ１３ｃ、ＨｈｅＣａｓ１３ａ、ＬｂｆＣａｓ１３ａ、ＬｂｍＣａｓ１３ａ、ＬｂｎＣａｓ１３ａ、ＬｂｕＣａｓ１３ａ、ＬｓｅＣａｓ１３ａ、ＬｓｈＣａｓ１３ａ、ＬｓｐＣａｓ１３ａ、Ｌｗａ２ｃａｓ１３ａ、ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＬｗｅＣａｓ１３ａ、ＰａｕＣａｓ１３ｂ、ＰｂｕＣａｓ１３ｂ、ＰｇｉＣａｓ１３ｂ、ＰｇｕＣａｓ１３ｂ、Ｐｉｎ２Ｃａｓ１３ｂ、Ｐｉｎ３Ｃａｓ１３ｂ、ＰｉｎＣａｓ１３ｂ、Ｐｐｒｃａｓ１３ａ、ＰｓａＣａｓ１３ｂ、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ＲａＣａｓ１３ｄ、ＲａｎＣａｓ１３ｂ、ＲｃｄＣａｓ１３ａ、ＲｃｒＣａｓ１３ａ、ＲｃｓＣａｓ１３ａ、ＲｆｘＣａｓ１３ｄ、ＵｒＣａｓ１３ｄ、ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ＿Ａ１３３Ｈ、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ＿Ａ１０５８Ｈ、ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ短縮、ｄＡｄｍＣａｓ１３ｄ、ｄＡｓｐＣａｓ１３ｂ、ｄＡｓｐＣａｓ１３ｃ、ｄＢｍａＣａｓ１３ａ、ｄＢｚｏＣａｓ１３ｂ、ｄＣａｍＣａｓ１３ａ、ｄＣｃａＣａｓ１３ｂ、ｄＣｇａ２Ｃａｓ１３ａ、ｄＣｇａＣａｓ１３ａ、ｄＥｂａＣａｓ１３ａ、ｄＥｒｅＣａｓ１３ａ、ｄＥｓＣａｓ１３ｄ、ｄＦｂｒＣａｓ１３ｂ、ｄＦｎｂＣａｓ１３ｃ、ｄＦｎｄＣａｓ１３ｃ、ｄＦｎｆＣａｓ１３ｃ、ｄＦｎｓＣａｓ１３ｃ、ｄＦｐｅＣａｓ１３ｃ、ｄＦｕｌＣａｓ１３ｃ、ｄＨｈｅＣａｓ１３ａ、ｄＬｂｆＣａｓ１３ａ、ｄＬｂｍＣａｓ１３ａ、ｄＬｂｎＣａｓ１３ａ、ｄＬｂｕＣａｓ１３ａ、ｄＬｓｅＣａｓ１３ａ、ｄＬｓｈＣａｓ１３ａ、ｄＬｓｐＣａｓ１３ａ、ｄＬｗａ２ｃａｓ１３ａ、ｄＬｗａＣａｓ１３ａ、ｄＬｗｅＣａｓ１３ａ、ｄＰａｕＣａｓ１３ｂ、ｄＰｂｕＣａｓ１３ｂ、ｄＰｇｉＣａｓ１３ｂ、ｄＰｇｕＣａｓ１３ｂ、ｄＰｉｎ２Ｃａｓ１３ｂ、ｄＰｉｎ３Ｃａｓ１３ｂ、ｄＰｉｎＣａｓ１３ｂ、ｄＰｐｒＣａｓ１３ａ、ｄＰｓａＣａｓ１３ｂ、ｄＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ｄＲａＣａｓ１３ｄ、ｄＲａｎＣａｓ１３ｂ、ｄＲｃｄＣａｓ１３ａ、ｄＲｃｒＣａｓ１３ａ、ｄＲｃｓＣａｓ１３ａ、ｄＲｆｘＣａｓ１３ｄ、またはｄＵｒＣａｓ１３ｄである。追加のＣａｓタンパク質は、当技術分野において既知である（例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１８，１７３：６６５－６７６ ｅ１４，Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２０１８，７：３２７－３３９ ｅ５、Ｃｏｘ，Ｄ．Ｂ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７，３５８：１０１９－１０２７、Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５５０：２８０－２８４、Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７，３５６：４３８－４４２、及びＥａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２０１７，６６：３７３－３８３ ｅ３、それらは参照により本明細書に組み込まれる）
一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号１～４８のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号１～４６のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号１～４８のうちの１つの配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号１～４６のうちの１つの配列を含む。
局在化シグナル
いくつかの実施形態において、タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核輸出シグナル（ＮＥＳ）または他の局在化シグナルなどの局在化シグナルを含有して、ミトコンドリアなどの細胞小器官に局在化するか、または細胞質内に局在化させ得る。一実施形態において、局在化シグナルは、標的ＲＮＡが位置する部位にタンパク質を局在化させる。
核局在シグナル
一実施形態において、タンパク質は、ＮＬＳを含む。一実施形態において、ＮＬＳは、レトロトランスポゾンＮＬＳである。一実施形態において、ＮＬＳは、Ｔｙ１、酵母ＧＡＬ４、ＳＫＩ３、Ｌ２９もしくはヒストンＨ２Ｂタンパク質、ポリオウイルス大型Ｔタンパク質、ＶＰ１もしくはＶＰ２キャプシドタンパク質、ＳＶ４０ＶＰ１もしくはＶＰ２キャプシドタンパク質、アデノウイルスＥｌａもしくはＤＢＰタンパク質、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質、肝炎ウイルスコア抗原もしくは哺乳動物ラミン、ｃ－ｍｙｃ、ｍａｘ、ｃ－ｍｙｂ、ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＡ、ｊｕｎ、Ｔａｘ、ステロイド受容体もしくはＭｘタンパク質、ヌクレオプラスミン（ＮＰＭ２）、ヌクレオホスミン（ＮＰＭ１）、またはサルウイルス４０（「ＳＶ４０」）Ｔ抗原に由来する。一実施形態において、ＮＬＳは、Ｔｙ１もしくはＴｙ１由来ＮＬＳ、Ｔｙ２もしくはＴｙ２由来ＮＬＳ、またはＭＡＫ１１もしくはＭＡＫ１１由来ＮＬＳである。一実施形態において、Ｔｙ１ ＮＬＳは、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、Ｔｙ２ ＮＬＳは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＭＡＫ１１ ＮＬＳは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＮＬＳは、配列番号６７～７４及び４２７～１０３９のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、ＮＬＳは、配列番号６７～７４及び４２７～１０３９のうちの１つの配列を含む。
一実施形態において、ＮＬＳは、Ｔｙ１様ＮＬＳである。例えば、一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲＸモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｎ末端にＫＫＲＸモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｃ末端にＫＫＲモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲＸ及びＫＫＲモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｎ末端にＫＫＲＸモチーフ及びＣ末端にＫＫＲモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、少なくとも２０アミノ酸を含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、２０～４０アミノ酸を含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、配列番号４２７～１０３９のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、ＮＬＳは、配列番号４２７～１０３９のうちの１つの配列を含み、配列は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０個以上の挿入、欠失、または置換を含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、配列番号４２７～１０３９のうちの１つの配列を含む。
一実施形態において、ＮＬＳは、同じＮＬＳの２つのコピーを含む。例えば、一実施形態において、ＮＬＳは、第１のＴｙ１由来ＮＬＳ及び第２のＴｙ１由来ＮＬＳの多量体を含む。
核輸出シグナル
一実施形態において、タンパク質は、核輸出シグナル（ＮＥＳ）を含む。一実施形態において、ＮＥＳは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端に結合される。一実施形態において、ＮＥＳは、細胞質ＲＮＡを標的化するために、タンパク質を細胞質に局在させる。一実施形態において、ＮＥＳは、配列番号７５または７６と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＮＥＳは、配列番号７５または７６のアミノ酸配列を含む。
細胞小器官局在化シグナル
一実施形態において、タンパク質は、タンパク質を細胞小器官に局在させる局在化シグナルを含む。一実施形態において、局在化シグナルは、タンパク質を、核小体、リボソーム、小胞、粗面小胞体、ゴルジ装置、細胞骨格、滑面小胞体、ミトコンドリア、液胞、細胞質、リソソーム、または中心小体に局在化させる。いくつかの局在化シグナルは、当技術分野において既知である。
一実施形態において、タンパク質は、タンパク質を細胞小器官または細胞外に局在させる局在化シグナルを含む。一実施形態において、局在化シグナルは、タンパク質を、核小体、リボソーム、小胞、粗面小胞体、ゴルジ装置、細胞骨格、滑面小胞体、ミトコンドリア、液胞、細胞質、リソソーム、または中心小体に局在化させる。
いくつかの局在化シグナルは、当技術分野において既知である。例示的な局在化シグナルとしては、１×ミトコンドリア標的化配列、４×ミトコンドリア標的化配列、分泌シグナル配列（ＩＬ－２）、ミリスチル化、カルセクエストリンリーダー、ＫＤＥＬ保持、及びペルオキシソーム標的化配列が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、局在化シグナルは、配列番号７７～８３と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルは、配列番号７７～８３の配列を含む。
精製及び／または検出タグ
いくつかの実施形態において、タンパク質は、精製及び／または検出タグを含有し得る。一実施形態において、タグは、タンパク質のＮ末端上にある。一実施形態において、タグは、３×ＦＬＡＧタグである。一実施形態において、タグは、配列番号６６と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、タグは、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。
ＥｒａｓｅＲタンパク質
一実施形態において、本開示のタンパク質は、核、細胞小器官、細胞質、または細胞外に効果的に送達され、標的化されたＲＮＡ切断を可能にする。一実施形態において、タンパク質は、配列番号１５０～１７１のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、タンパク質は、配列番号１５０～１７１のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
ＨｉＬｉｇｈｔＲ
本開示はまた、編集タンパク質及び蛍光タンパク質の新規の融合物を提供する。一実施形態において、融合タンパク質は、蛍光タンパク質の視覚化能力と、触媒的に死んだＣａｓのプログラム可能なＤＮＡ標的化能力とを組み合わせる。一実施形態において、融合タンパク質は、核内のＲＮＡを標的とするために核局在化シグナルを含む。一実施形態において、融合タンパク質は、細胞質内のＲＮＡを標的とするために核輸送シグナル（ＮＥＳ）を含む。他の実施形態において、融合タンパク質は、細胞質内のＲＮＡを標的とするためにＮＬＳを含まない。他の局在化シグナルを使用して（及び当技術分野で既知である）、ミトコンドリアなどの細胞小器官内のＲＮＡを標的化することができる。一実施形態において、融合タンパク質は、リンカーを含む。一実施形態において、リンカーは、Ｃａｓタンパク質及び蛍光タンパク質を連結する。一実施形態において、融合タンパク質は、精製及び／または検出タグを含む。
編集タンパク質
一実施形態において、編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）タンパク質、及びＤＮＡまたはＲＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を含むが、これらに限定されない。
Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＳｐＣａｓ９、ＳｔＣａｓ９、ＮｍＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１、ＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９、ＶＱＲ ＳｐＣａｓ９、ｘＣａｓ９ ３．７、それらのホモログ、それらオルソログ、またはそれらの改変バージョンが挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡまたはＲＮＡ切断活性を有する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、標的配列内及び／または標的配列の相補体内などの標的配列の位置における核酸分子の１つまたは両方の鎖の切断を指向する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドからの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００塩基対またはそれよりも多くの塩基対内の１つまたは両方の鎖の切断を指向する。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３、またはＣｐｆ１である。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、触媒的に欠損である（ｄＣａｓ）。
一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ結合活性を有する。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３である。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ短縮、ＡｄｍＣａｓ１３ｄ、ＡｓｐＣａｓ１３ｂ、ＡｓｐＣａｓ１３ｃ、ＢｍａＣａｓ１３ａ、ＢｚｏＣａｓ１３ｂ、ＣａｍＣａｓ１３ａ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、Ｃｇａ２Ｃａｓ１３ａ、ＣｇａＣａｓ１３ａ、ＥｂａＣａｓ１３ａ、ＥｒｅＣａｓ１３ａ、ＥｓＣａｓ１３ｄ、ＦｂｒＣａｓ１３ｂ、ＦｎｂＣａｓ１３ｃ、ＦｎｄＣａｓ１３ｃ、ＦｎｆＣａｓ１３ｃ、ＦｎｓＣａｓ１３ｃ、ＦｐｅＣａｓ１３ｃ、ＦｕｌＣａｓ１３ｃ、ＨｈｅＣａｓ１３ａ、ＬｂｆＣａｓ１３ａ、ＬｂｍＣａｓ１３ａ、ＬｂｎＣａｓ１３ａ、ＬｂｕＣａｓ１３ａ、ＬｓｅＣａｓ１３ａ、ＬｓｈＣａｓ１３ａ、ＬｓｐＣａｓ１３ａ、Ｌｗａ２ｃａｓ１３ａ、ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＬｗｅＣａｓ１３ａ、ＰａｕＣａｓ１３ｂ、ＰｂｕＣａｓ１３ｂ、ＰｇｉＣａｓ１３ｂ、ＰｇｕＣａｓ１３ｂ、Ｐｉｎ２Ｃａｓ１３ｂ、Ｐｉｎ３Ｃａｓ１３ｂ、ＰｉｎＣａｓ１３ｂ、Ｐｐｒｃａｓ１３ａ、ＰｓａＣａｓ１３ｂ、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ＲａＣａｓ１３ｄ、ＲａｎＣａｓ１３ｂ、ＲｃｄＣａｓ１３ａ、ＲｃｒＣａｓ１３ａ、ＲｃｓＣａｓ１３ａ、ＲｆｘＣａｓ１３ｄ、ＵｒＣａｓ１３ｄ、ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ＿Ａ１３３Ｈ、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ＿Ａ１０５８Ｈ、ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ短縮、ｄＡｄｍＣａｓ１３ｄ、ｄＡｓｐＣａｓ１３ｂ、ｄＡｓｐＣａｓ１３ｃ、ｄＢｍａＣａｓ１３ａ、ｄＢｚｏＣａｓ１３ｂ、ｄＣａｍＣａｓ１３ａ、ｄＣｃａＣａｓ１３ｂ、ｄＣｇａ２Ｃａｓ１３ａ、ｄＣｇａＣａｓ１３ａ、ｄＥｂａＣａｓ１３ａ、ｄＥｒｅＣａｓ１３ａ、ｄＥｓＣａｓ１３ｄ、ｄＦｂｒＣａｓ１３ｂ、ｄＦｎｂＣａｓ１３ｃ、ｄＦｎｄＣａｓ１３ｃ、ｄＦｎｆＣａｓ１３ｃ、ｄＦｎｓＣａｓ１３ｃ、ｄＦｐｅＣａｓ１３ｃ、ｄＦｕｌＣａｓ１３ｃ、ｄＨｈｅＣａｓ１３ａ、ｄＬｂｆＣａｓ１３ａ、ｄＬｂｍＣａｓ１３ａ、ｄＬｂｎＣａｓ１３ａ、ｄＬｂｕＣａｓ１３ａ、ｄＬｓｅＣａｓ１３ａ、ｄＬｓｈＣａｓ１３ａ、ｄＬｓｐＣａｓ１３ａ、ｄＬｗａ２ｃａｓ１３ａ、ｄＬｗａＣａｓ１３ａ、ｄＬｗｅＣａｓ１３ａ、ｄＰａｕＣａｓ１３ｂ、ｄＰｂｕＣａｓ１３ｂ、ｄＰｇｉＣａｓ１３ｂ、ｄＰｇｕＣａｓ１３ｂ、ｄＰｉｎ２Ｃａｓ１３ｂ、ｄＰｉｎ３Ｃａｓ１３ｂ、ｄＰｉｎＣａｓ１３ｂ、ｄＰｐｒＣａｓ１３ａ、ｄＰｓａＣａｓ１３ｂ、ｄＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ｄＲａＣａｓ１３ｄ、ｄＲａｎＣａｓ１３ｂ、ｄＲｃｄＣａｓ１３ａ、ｄＲｃｒＣａｓ１３ａ、ｄＲｃｓＣａｓ１３ａ、ｄＲｆｘＣａｓ１３ｄ、またはｄＵｒＣａｓ１３ｄである。追加のＣａｓタンパク質は、当技術分野において既知である（例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１８，１７３：６６５－６７６ ｅ１４、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２０１８，７：３２７－３３９ ｅ５、Ｃｏｘ，Ｄ．Ｂ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７，３５８：１０１９－１０２７、Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５５０：２８０－２８４、Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７，３５６：４３８－４４２、及びＥａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２０１７，６６：３７３－３８３ ｅ３、それらは参照により本明細書に組み込まれる）
一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号１～４８のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号１～４８のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号１～４８のうちの１つのバリアントの配列を含み、バリアントは、Ｃａｓタンパク質を触媒的に不活性化する。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、１つ以上の挿入、欠失、または置換を有する配列番号１～４６のうちの１つの配列を含み、１つ以上の挿入、欠失、または置換は、Ｃａｓタンパク質を触媒的に不活性化する。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号１～４８のうちの１つの配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号４７～４８のうちの１つの配列を含む。
蛍光タンパク質
一実施形態において、蛍光タンパク質は、ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＢＮＬ１、ｓｆＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ（１－１０）、ｓｆＧＦＰ（１－１０）－Ｌ－（１１）、７ｘＳ１１、ｓｆＣｈｅｒｒｙ、Ｓ１１、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、青色蛍光タンパク質、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＴａｇＢＦＰ、シアン色蛍光タンパク質、ｅＣＦＰ、ｍＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ－Ｉｓｈｉ Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１（Ｔｅａｌ）、黄色蛍光タンパク質、ＥＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ｍＢａｎａｎａ、橙色蛍光タンパク質、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ－Ｔａｎｄｅｍ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、赤色蛍光タンパク質、ｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｄＫｅｉｍａ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、またはＡＱ１４３である。
一実施形態において、蛍光タンパク質は、ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｓｆＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ（１－１０）、ｓｆＧＦＰ（１－１０）－Ｌ－（１１）、ｓｆＣｈｅｒｒｙ、または７ｘＳ１１である。一実施形態において、蛍光タンパク質は、配列番号４９～５６のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、蛍光タンパク質は、配列番号４９～５６のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
局在化シグナル
いくつかの実施形態において、タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核輸出シグナル（ＮＥＳ）または他の局在化シグナルなどの局在化シグナルを含有して、ミトコンドリアなどの細胞小器官に局在化するか、または細胞質内に局在化させ得る。一実施形態において、局在化シグナルは、標的ＲＮＡが位置する部位にタンパク質を局在化させる。
核局在シグナル
一実施形態において、融合タンパク質は、ＮＬＳを含む。一実施形態において、ＮＬＳは、レトロトランスポゾンＮＬＳである。一実施形態において、ＮＬＳは、Ｔｙ１、酵母ＧＡＬ４、ＳＫＩ３、Ｌ２９もしくはヒストンＨ２Ｂタンパク質、ポリオウイルス大型Ｔタンパク質、ＶＰ１もしくはＶＰ２キャプシドタンパク質、ＳＶ４０ＶＰ１もしくはＶＰ２キャプシドタンパク質、アデノウイルスＥｌａもしくはＤＢＰタンパク質、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質、肝炎ウイルスコア抗原もしくは哺乳動物ラミン、ｃ－ｍｙｃ、ｍａｘ、ｃ－ｍｙｂ、ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＡ、ｊｕｎ、Ｔａｘ、ステロイド受容体もしくはＭｘタンパク質、ヌクレオプラスミン（ＮＰＭ２）、ヌクレオホスミン（ＮＰＭ１）、またはサルウイルス４０（「ＳＶ４０」）Ｔ抗原に由来する。一実施形態において、ＮＬＳは、Ｔｙ１もしくはＴｙ１由来ＮＬＳ、Ｔｙ２もしくはＴｙ２由来ＮＬＳ、またはＭＡＫ１１もしくはＭＡＫ１１由来ＮＬＳである。一実施形態において、Ｔｙ１ ＮＬＳは、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、Ｔｙ２ ＮＬＳは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＭＡＫ１１ ＮＬＳは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＮＬＳは、配列番号６７～７４及び４２７～１０３９のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、ＮＬＳは、配列番号６７～７４及び４２７～１０３９のうちの１つの配列を含む。
一実施形態において、ＮＬＳは、Ｔｙ１様ＮＬＳである。例えば、一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲＸモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｎ末端にＫＫＲＸモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｃ末端にＫＫＲモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲＸ及びＫＫＲモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｎ末端にＫＫＲＸモチーフ及びＣ末端にＫＫＲモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、少なくとも２０アミノ酸を含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、２０～４０アミノ酸を含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、配列番号４２７～１０３９のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、ＮＬＳは、配列番号４２７～１０３９のうちの１つの配列を含み、配列は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０個以上の挿入、欠失、または置換を含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、配列番号４２７～１０３９のうちの１つの配列を含む。
一実施形態において、ＮＬＳは、同じＮＬＳの２つのコピーを含む。例えば、一実施形態において、ＮＬＳは、第１のＴｙ１由来ＮＬＳ及び第２のＴｙ１由来ＮＬＳの多量体を含む。
核輸出シグナル
一実施形態において、融合タンパク質は核輸出シグナル（ＮＥＳ）を含む。一実施形態において、ＮＥＳは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端に結合される。一実施形態において、ＮＥＳは、細胞質ＲＮＡを標的化するために融合タンパク質を細胞質に局在させる。一実施形態において、ＮＥＳは、配列番号７５または７６と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＮＥＳは、配列番号７５または７６のアミノ酸配列を含む。
細胞小器官局在化シグナル
一実施形態において、融合タンパク質は、融合タンパク質を細胞小器官に局在させる局在化シグナルを含む。一実施形態において、局在化シグナルは、タンパク質を、核小体、リボソーム、小胞、粗面小胞体、ゴルジ装置、細胞骨格、滑面小胞体、ミトコンドリア、液胞、細胞質、リソソーム、または中心小体に局在化させる。いくつかの局在化シグナルは、当技術分野において既知である。
一実施形態において、融合タンパク質は、融合タンパク質を細胞小器官または細胞外に局在化させる局在化シグナルを含む。一実施形態において、局在化シグナルは、タンパク質を、核小体、リボソーム、小胞、粗面小胞体、ゴルジ装置、細胞骨格、滑面小胞体、ミトコンドリア、液胞、細胞質、リソソーム、または中心小体に局在化させる。
いくつかの局在化シグナルは、当技術分野において既知である。例示的な局在化シグナルとしては、１×ミトコンドリア標的化配列、４×ミトコンドリア標的化配列、分泌シグナル配列（ＩＬ－２）、ミリスチル化、カルセクエストリンリーダー、ＫＤＥＬ保持、及びペルオキシソーム標的化配列が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、局在化シグナルは、配列番号７７～８３と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルは、配列番号７７～８３の配列を含む。
リンカー
一実施形態において、タンパク質は、リンカーペプチドを含む。一実施形態において、リンカーペプチドは、Ｃａｓタンパク質及び蛍光タンパク質を連結する。一実施形態において、リンカーペプチドは、Ｃａｓタンパク質のＣ末端及び蛍光タンパク質のＮ末端に接続される。一実施形態において、リンカーは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端及び蛍光タンパク質のＣ末端に接続される。
一実施形態において、リンカーペプチドは、配列番号５７～６５のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、リンカーペプチドは、配列番号５７～６５のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
精製及び／または検出タグ
いくつかの実施形態において、タンパク質は、精製及び／または検出タグを含有し得る。一実施形態において、タグは、タンパク質のＮ末端上にある。一実施形態において、タグは、３×ＦＬＡＧタグである。一実施形態において、タグは、配列番号６６と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、タグは、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。
ＨｉｌｉｇｈｔＲ融合タンパク質
一実施形態において、融合タンパク質は、蛍光タンパク質の視覚化能力と、触媒的に死んだＣａｓのプログラム可能なＤＮＡ標的化能力とを組み合わせる。したがって、一実施形態において、本開示の融合タンパク質は、視覚化を提供し、一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号８４～１４９のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号８４～１４９のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
タンパク質、ペプチド及び融合タンパク質
本開示のタンパク質は、化学的方法を使用して作製され得る。例えば、タンパク質は、固相技術（Ｒｏｂｅｒｇｅ Ｊ Ｙ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２－２０４）によって合成され、樹脂から切断され、分取高速液体クロマトグラフィーによって精製され得る。自動合成は、例えば、ＡＢＩ ４３１ Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、製造業者によって提供される指示に従って達成され得る。
本開示のタンパク質は、組換えタンパク質発現を使用して作製され得る。本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で本発明の核酸を含み、これは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択された、発現される核酸配列に作動可能に連結される１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結される」とは、目的とするヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳システムでの、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞での）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されることを意味するよう企図されている。
「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むよう企図されている。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列には、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向するもの及びある特定の宿主細胞のみでのヌクレオチド配列の発現を指向するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。当業者であれば、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることを理解するであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって本明細書に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを産生し得る。
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞におけるバリアントタンパク質の産生のために設計され得る。例えば、本発明のタンパク質は、細菌細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写及び翻訳され得る。
原核生物におけるタンパク質の発現は、多くの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて行われる。融合ベクターは、いくつかのアミノ酸をそれにコードされるタンパク質に、組換えタンパク質のアミノ末端またはＣ末端に付加する。そのような融合ベクターは、典型的には、次の３つの目的を果たす。（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させる、（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を増加させる、及び（ｉｉｉ）親和性精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助ける。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解的切断部位が融合部分及び組換えタンパク質の接合部に導入されて、融合タンパク質の精製後に融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。そのような酵素、及びそれらの同族認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ、ＴＥＶ、及びエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１－４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ）、及びｐＲＩＴＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が含まれ、それぞれ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを標的組換えタンパク質に融合させる。
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）及びｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０－８９）が挙げられるが、これは正確ではなく、ｐＥＴ１１ａ－ｄはＮ末端Ｔ７タグを有する。
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌においてタンパク質を発現することである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９－１２８を参照されたい。別の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるものであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変えることである（例えば、Ｗａｄａ，ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１－２１１８を参照されたい）。本発明の核酸配列のそのような変更は、標準のＤＮＡ合成技術によって行うことができる。コドンバイアスを解決するための別の戦略は、ＢＬ２１コドンプラス細菌株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＲｏｓｅｔｔａ細菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用することによるものであり、これらの株は、希少なＥ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ遺伝子の余分なコピーを含有する。
別の実施形態において、本開示のタンパク質をコードする発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９－２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３－９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３－１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
あるいは、本発明のポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞内で産生され得る。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６－２１６５）及びｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１－３９）が含まれる。
さらに別の実施形態において、本開示の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞で発現される。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト胎児網膜細胞、及び多くの他の細胞が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７－１９５）、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＵＢ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルス調節要素によって提供される。例えば、一般に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルス、及びサルウイルス４０に由来する。原核細胞及び真核細胞の両方に適切な他の発現システムについては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の１６及び１７章を参照されたい。
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指向することができる（例えば、組織特異的調節要素を使用して核酸を発現させる）。組織特異的調節要素は当技術分野で既知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的、Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－２７７）、リンパ球特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３）及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９－７４０、Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１－７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモータ－、Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３－５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されたプロモーター、例えば、ｍｕｒｉｎｅｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４－３７９）及びアルファフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７－５４６）も包含される。
本発明はまた、本明細書に開示されるタンパク質と実質的な相同性を有するタンパク質の任意の形態を含むと解釈されるべきである。一実施形態において、「実質的に相同」であるタンパク質は、本明細書で開示される融合タンパク質のアミノ酸配列と約５０％相同、約７０％相同、約８０％相同、約９０％相同、約９１％相同、約９２％相同、約９３％相同、約９４％相同、約９５％相同、約９６％相同、約９７％相同、約９８％相同、または約９９％相同である。
あるいは、タンパク質は、組換え手段によって、またはより長いポリペプチドからの切断によって作製され得る。タンパク質の組成は、アミノ酸分析または配列決定によって確認され得る。
本発明によるタンパク質のバリアントは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存された、または保存されていないアミノ酸残基で置換されており、そのような置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードによってコードされているものであってもよく、もしくはそうでないものであってもよいもの、（ｉｉ）１つ以上の修飾されたアミノ酸残基、例えば、置換基の結合によって修飾された残基があるもの、（ｉｉｉ）ペプチドが本発明のタンパク質の代替スプライシングバリアントであるもの、（ｉｖ）ペプチドの断片及び／または（ｖ）タンパク質が、リーダー配列もしくは分泌配列、または精製（例えば、Ｈｉｓタグ）もしくは検出（例えば、Ｓｖ５エピトープタグ）のために用いられる配列などの別のペプチドと融合されるもの、であり得る。断片は、元の配列のタンパク質分解切断（多部位タンパク質分解を含む）を介して生成されるペプチドを含む。バリアントは、翻訳後に、または化学的に修飾されてもよい。そのようなバリアントは、本明細書の教示から当業者の範囲内であるとみなされる。
当技術分野において既知であるように、２つの融合タンパク質間の「類似性」は、アミノ酸配列及び１つのポリペプチドのその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。バリアントは、元の配列とは異なるペプチド配列を含むように定義される。一実施形態において、バリアントは、目的のセグメント当たり４０％未満の残基において元の配列と異なるか、目的のセグメント当たり２５％未満の残基において元の配列と異なるか、目的のセグメント当たり１０％未満の残基で異なるか、または目的のセグメント当たりわずか数の残基において元のタンパク質配列とは異なり、同時に、元の配列の機能性及び／または幹細胞の骨芽細胞系統への分化を刺激する能力を保持するのに十分に元の配列と相同である。本発明は、元のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％類似または同一であるアミノ酸配列を含む。２つのペプチド間の同一性の程度は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズム及び方法を用いて決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用することによって決定され得る［ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）］。
本開示のタンパク質は、翻訳後修飾され得る。例えば、本発明の範囲内に含まれる翻訳後修飾には、シグナルペプチド切断、糖鎖付加、アセチル化、イソプレニル化、タンパク質分解、ミリストイル化、タンパク質折り畳み、タンパク質分解処理などが含まれる。いくつかの修飾または処理の事象は、追加の生物学的機構の導入を必要とする。例えば、シグナルペプチド切断及び中心糖鎖付加などの処理イベントは、イヌのミクロソーム膜またはゼノパス卵抽出物（米国特許第６，１０３，４８９号）を標準の翻訳反応に添加することによって調べられる。
本開示のタンパク質は、翻訳後修飾によって、または翻訳中に非天然アミノ酸を導入することによって形成される非天然アミノ酸を含み得る。タンパク質翻訳中に非天然アミノ酸を導入するための様々なアプローチが利用可能である。
本開示のタンパク質は、Ｒｅｅｄｉｊｋら（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １１（４）：１３６５，１９９２）に記載されている方法など従来の方法を使用してリン酸化され得る。
本発明の融合タンパク質の環状誘導体もまた、本発明の一部である。環化は、タンパク質が他の分子と会合するためのより好ましい立体配座を想定することを可能にし得る。環化は、当技術分野で既知の技術を使用して達成され得る。例えば、ジスルフィド結合は、遊離スルフヒドリル基を有する２つの適切な間隔の構成要素の間に形成され得、またはアミド結合は、１つの構成要素のアミノ基と別の構成要素のカルボキシル基との間に形成され得る。環化は、Ｕｌｙｓｓｅ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７，８４６６－８４６７によって記載されているように、アゾベンゼン含有アミノ酸を使用して達成され得る。結合を形成する構成要素は、アミノ酸の側鎖、非アミノ酸構成要素、または２つの組み合わせであってもよい。本発明の一実施形態において、環状ペプチドは、正しい位置にベータターンを含み得る。ベータターンは、アミノ酸Ｐｒｏ－Ｇｌｙを正しい位置に付加することによって、本発明のペプチドに導入することができる。
上記のようなペプチド結合連結を含有する環状ペプチドよりも柔軟な環状タンパク質を産生することが望ましい場合がある。より柔軟なペプチドは、ペプチドの右及び左の位置にシステインを導入し、２つのシステイン間にジスルフィド架橋を形成することによって調製され得る。２つのシステインは、ベータシートを変形させず、回転しないように配置される。ペプチドは、ジスルフィド連結の長さ及びベータシート部分におけるより少ない数の水素結合の結果として、より柔軟である。環状ペプチドの相対的な柔軟性は、分子動力学シミュレーションによって決定され得る。
本発明はまた、Ｃａｓ１３及びＲＮａｓｅタンパク質を含む融合タンパク質を含むペプチドに関し、融合タンパク質自体は、標的タンパク質に融合されるか、または標的タンパク質に統合され、及び／またはキメラタンパク質を所望の細胞構成要素もしくは細胞型もしくは組織に指向することができる標的化ドメインである。キメラタンパク質は、追加のアミノ酸配列またはドメインを含有してもよい。キメラタンパク質は、様々な構成要素が異なる供給源に由来するという意味で組換えであり、したがって、それ自体は天然で一緒に見出されない（すなわち、異種である）。
一実施形態において、標的化ドメインは、膜スパニングドメイン、膜結合ドメイン、または、例えば、小胞もしくは核と会合するようにタンパク質を指向する配列であり得る。一実施形態において、標的化ドメインは、ペプチドを特定の細胞型または組織に標的化することができる。例えば、標的ドメインは、標的組織の細胞表面抗原に対する細胞表面リガンドまたは抗体であり得る。標的化ドメインは、本発明のペプチドを細胞構成要素へ標的化し得る。
本発明のペプチドは、従来技術によって合成され得る。例えば、ペプチドまたはキメラタンパク質は、固相ペプチド合成を使用した化学合成によって合成され得る。これらの方法は、固相または溶液相合成方法のいずれかを採用する（例えば、固相合成技術については、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ，ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉｌｌ．（１９８４）及びＧ．Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔｏｒｓ Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ Ｖｏｌ．２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０，ｐｐ．３－２５４、ならびに液相合成技術については、Ｍ Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ １９８４及びＥ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｒｓ，Ｖｏｌ １を参照されたい）。例として、本発明のペプチドを、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相化学を使用して、Ｎ－フルオレニルメトキシ－カルボニル－Ｏ－ベンジル－Ｌ－ホスホスレオニン誘導体としてホスホスレオニンを直接組み込んで合成してもよい。
他の分子とコンジュゲートされた本発明のペプチドまたはキメラタンパク質を含むＮ末端またはＣ末端融合タンパク質は、組換え技術を通じて、ペプチドまたはキメラタンパク質のＮ末端またはＣ末端、ならびに所望の生物学的機能を有する選択されたタンパク質または選択可能なマーカーの配列を融合することによって調製され得る。得られる融合タンパク質は、本明細書に記載の選択されたタンパク質またはマーカータンパク質に融合されたタンパク質を含有する。融合タンパク質を調製するために使用され得るタンパク質の例としては、免疫グロブリン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、血球凝集素（ＨＡ）、及び短縮されたｍｙｃが挙げられる。
本発明のペプチドは、生物学的発現システムを使用して開発され得る。これらのシステムの使用により、ランダムペプチド配列の大規模なライブラリーの産生及び特定のタンパク質に結合するペプチド配列についてのこれらのライブラリーのスクリーニングが可能となる。ランダムペプチド配列をコードする合成ＤＮＡを適切な発現ベクターにクローニングすることによってライブラリーを産生してもよい（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ １９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１、Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４、Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ １９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８を参照されたい）。ライブラリーを、重複するペプチドの同時合成によって構築してもよい（米国特許第４，７０８，８７１号を参照されたい）。
本発明のペプチド及びキメラタンパク質は、塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸などの無機酸、またはギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸、ベンゼンスルホン酸、及びトルエンスルホン酸などの有機酸と反応することによって、薬学的塩に変換され得る。
核酸
一態様において、本開示は、標的化されたＲＮＡ切断を提供する編集タンパク質をコードする新規核酸分子である。いくつかの実施形態において、核酸分子は、局在化シグナルをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルは、標的ＲＮＡが位置する部位にタンパク質を局在化させる。一実施形態において、核酸分子は、核内のＲＮＡを標的とするために核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、核酸分子は、細胞質内のＲＮＡを標的とするために核輸出シグナル（ＮＥＳ）をコードする核酸配列を含む。他の局在化シグナルを使用して（及び当技術分野で既知である）、ミトコンドリアなどの細胞小器官内のＲＮＡを標的化することができる。他の実施形態において、核酸分子は、細胞質内のＲＮＡを標的とすために局在化シグナルをコードする核酸配列を含まない。一実施形態において、核酸分子は、精製及び／または検出タグをコードする核酸配列を含む。
本開示はまた、編集タンパク質及び蛍光タンパク質の融合をコードする新規核酸分子を提供する。一実施形態において、融合タンパク質は、蛍光タンパク質の視覚化能力と、触媒的に死んだＣａｓのプログラム可能なＤＮＡ標的化能力とを組み合わせる。一実施形態において、核酸分子は、核内のＲＮＡを標的とするために核局在化シグナルをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、核酸分子は、細胞質内のＲＮＡを標的とするために核輸出シグナル（ＮＥＳ）をコードする核酸配列を含む。他の実施形態において、核酸分子は、細胞質内のＲＮＡを標的とすために局在化シグナルをコードする核酸配列を含まない。他の局在化シグナルを使用して（及び当技術分野で既知である）、ミトコンドリアなどの細胞小器官内のＲＮＡを標的化することができる。一実施形態において、核酸分子は、リンカーをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、リンカーは、Ｃａｓタンパク質及び蛍光タンパク質を連結する。一実施形態において、核酸分子は、精製及び／または検出タグをコードする核酸配列を含む。
本開示はまた、本開示のタンパク質を標的ＲＮＡに標的化するための、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む標的化核酸も提供する。
ＥｒａｓｅＲ
一態様において、本開示は、標的化されたＲＮＡ切断を提供する編集タンパク質をコードする新規核酸分子である。いくつかの実施形態において、核酸分子は、局在化シグナルをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルは、標的ＲＮＡが位置する部位にタンパク質を局在化させる。したがって、本開示は、標的化されたＲＮＡ切断のための局在化可能なタンパク質をコードする核酸分子を提供する。
編集タンパク質
一実施形態において、核酸分子は、編集タンパク質をコードする配列核酸を含む。一実施形態において、編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）タンパク質、及びＤＮＡまたはＲＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を含むが、これらに限定されない。
Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＳｐＣａｓ９、ＳｔＣａｓ９、ＮｍＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１、ＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９、ＶＱＲ ＳｐＣａｓ９、ｘＣａｓ９ ３．７、それらのホモログ、それらオルソログ、またはそれらの改変バージョンが挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡまたはＲＮＡ切断活性を有する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、標的配列内及び／または標的配列の相補体内などの標的配列の位置における核酸分子の１つまたは両方の鎖の切断を指向する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドからの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００塩基対またはそれよりも多くの塩基対内の１つまたは両方の鎖の切断を指向する。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３、またはＣｐｆ１である。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、触媒的に欠損である（ｄＣａｓ）。
一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ結合活性を有する。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３である。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ短縮、ＡｄｍＣａｓ１３ｄ、ＡｓｐＣａｓ１３ｂ、ＡｓｐＣａｓ１３ｃ、ＢｍａＣａｓ１３ａ、ＢｚｏＣａｓ１３ｂ、ＣａｍＣａｓ１３ａ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、Ｃｇａ２Ｃａｓ１３ａ、ＣｇａＣａｓ１３ａ、ＥｂａＣａｓ１３ａ、ＥｒｅＣａｓ１３ａ、ＥｓＣａｓ１３ｄ、ＦｂｒＣａｓ１３ｂ、ＦｎｂＣａｓ１３ｃ、ＦｎｄＣａｓ１３ｃ、ＦｎｆＣａｓ１３ｃ、ＦｎｓＣａｓ１３ｃ、ＦｐｅＣａｓ１３ｃ、ＦｕｌＣａｓ１３ｃ、ＨｈｅＣａｓ１３ａ、ＬｂｆＣａｓ１３ａ、ＬｂｍＣａｓ１３ａ、ＬｂｎＣａｓ１３ａ、ＬｂｕＣａｓ１３ａ、ＬｓｅＣａｓ１３ａ、ＬｓｈＣａｓ１３ａ、ＬｓｐＣａｓ１３ａ、Ｌｗａ２ｃａｓ１３ａ、ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＬｗｅＣａｓ１３ａ、ＰａｕＣａｓ１３ｂ、ＰｂｕＣａｓ１３ｂ、ＰｇｉＣａｓ１３ｂ、ＰｇｕＣａｓ１３ｂ、Ｐｉｎ２Ｃａｓ１３ｂ、Ｐｉｎ３Ｃａｓ１３ｂ、ＰｉｎＣａｓ１３ｂ、Ｐｐｒｃａｓ１３ａ、ＰｓａＣａｓ１３ｂ、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ＲａＣａｓ１３ｄ、ＲａｎＣａｓ１３ｂ、ＲｃｄＣａｓ１３ａ、ＲｃｒＣａｓ１３ａ、ＲｃｓＣａｓ１３ａ、ＲｆｘＣａｓ１３ｄ、ＵｒＣａｓ１３ｄ、ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ＿Ａ１３３Ｈ、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ＿Ａ１０５８Ｈ、ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ短縮、ｄＡｄｍＣａｓ１３ｄ、ｄＡｓｐＣａｓ１３ｂ、ｄＡｓｐＣａｓ１３ｃ、ｄＢｍａＣａｓ１３ａ、ｄＢｚｏＣａｓ１３ｂ、ｄＣａｍＣａｓ１３ａ、ｄＣｃａＣａｓ１３ｂ、ｄＣｇａ２Ｃａｓ１３ａ、ｄＣｇａＣａｓ１３ａ、ｄＥｂａＣａｓ１３ａ、ｄＥｒｅＣａｓ１３ａ、ｄＥｓＣａｓ１３ｄ、ｄＦｂｒＣａｓ１３ｂ、ｄＦｎｂＣａｓ１３ｃ、ｄＦｎｄＣａｓ１３ｃ、ｄＦｎｆＣａｓ１３ｃ、ｄＦｎｓＣａｓ１３ｃ、ｄＦｐｅＣａｓ１３ｃ、ｄＦｕｌＣａｓ１３ｃ、ｄＨｈｅＣａｓ１３ａ、ｄＬｂｆＣａｓ１３ａ、ｄＬｂｍＣａｓ１３ａ、ｄＬｂｎＣａｓ１３ａ、ｄＬｂｕＣａｓ１３ａ、ｄＬｓｅＣａｓ１３ａ、ｄＬｓｈＣａｓ１３ａ、ｄＬｓｐＣａｓ１３ａ、ｄＬｗａ２ｃａｓ１３ａ、ｄＬｗａＣａｓ１３ａ、ｄＬｗｅＣａｓ１３ａ、ｄＰａｕＣａｓ１３ｂ、ｄＰｂｕＣａｓ１３ｂ、ｄＰｇｉＣａｓ１３ｂ、ｄＰｇｕＣａｓ１３ｂ、ｄＰｉｎ２Ｃａｓ１３ｂ、ｄＰｉｎ３Ｃａｓ１３ｂ、ｄＰｉｎＣａｓ１３ｂ、ｄＰｐｒＣａｓ１３ａ、ｄＰｓａＣａｓ１３ｂ、ｄＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ｄＲａＣａｓ１３ｄ、ｄＲａｎＣａｓ１３ｂ、ｄＲｃｄＣａｓ１３ａ、ｄＲｃｒＣａｓ１３ａ、ｄＲｃｓＣａｓ１３ａ、ｄＲｆｘＣａｓ１３ｄ、またはｄＵｒＣａｓ１３ｄである。追加のＣａｓタンパク質は、当技術分野において既知である（例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１８，１７３：６６５－６７６ ｅ１４，Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２０１８，７：３２７－３３９ ｅ５、Ｃｏｘ，Ｄ．Ｂ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７，３５８：１０１９－１０２７、Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５５０：２８０－２８４、Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７，３５６：４３８－４４２、及びＥａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２０１７，６６：３７３－３８３ ｅ３、それらは参照により本明細書に組み込まれる）
一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１～４８のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１～４８のうちの１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１～４６のうちの１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１８８～１９１のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の核酸配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１８８～１９１のうちの１つの核酸配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１８８～１９０のうちの１つの核酸配列を含む。
局在化シグナル
いくつかの実施形態において、核酸分子は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核輸出シグナル（ＮＥＳ）または細胞質もしくはミトコンドリアなどの細胞小器官に局在するための他の局在化シグナルなどの局在化シグナルをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルは、標的ＲＮＡが位置する部位にタンパク質を局在化させる。
核局在シグナル
一実施形態において、核酸分子は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、ＮＬＳは、レトロトランスポゾンＮＬＳである。一実施形態において、ＮＬＳは、Ｔｙ１、酵母ＧＡＬ４、ＳＫＩ３、Ｌ２９もしくはヒストンＨ２Ｂタンパク質、ポリオウイルス大型Ｔタンパク質、ＶＰ１もしくはＶＰ２キャプシドタンパク質、ＳＶ４０ＶＰ１もしくはＶＰ２キャプシドタンパク質、アデノウイルスＥｌａもしくはＤＢＰタンパク質、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質、肝炎ウイルスコア抗原もしくは哺乳動物ラミン、ｃ－ｍｙｃ、ｍａｘ、ｃ－ｍｙｂ、ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＡ、ｊｕｎ、Ｔａｘ、ステロイド受容体もしくはＭｘタンパク質、ヌクレオプラスミン（ＮＰＭ２）、ヌクレオホスミン（ＮＰＭ１）、またはサルウイルス４０（「ＳＶ４０」）Ｔ抗原に由来する。
一実施形態において、ＮＬＳは、Ｔｙ１もしくはＴｙ１由来ＮＬＳ、Ｔｙ２もしくはＴｙ２由来ＮＬＳ、またはＭＡＫ１１もしくはＭＡＫ１１由来ＮＬＳである。一実施形態において、Ｔｙ１ ＮＬＳは、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、Ｔｙ２ ＮＬＳは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＭＡＫ１１ ＮＬＳは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＮＬＳをコードする核酸配列は、配列番号６７～７４及び４２７～１０３９のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、ＮＬＳをコードする核酸配列は、配列番号６７～７４及び４２７～１０３９のうちの１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態において、ＮＬＳは、Ｔｙ１様ＮＬＳである。例えば、一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲＸモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｎ末端にＫＫＲＸモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｃ末端にＫＫＲモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲＸ及びＫＫＲモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｎ末端にＫＫＲＸモチーフ及びＣ末端にＫＫＲモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、少なくとも２０アミノ酸を含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、２０～４０アミノ酸を含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳをコードする核酸配列は、配列番号４２７～１０３９の１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳをコードする核酸配列は、配列番号４２７～１０３９のうちの１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、配列は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０個以上の挿入、欠失、または置換を含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳをコードする核酸配列は、配列番号４２７～１０３９のうちの１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態において、ＮＬＳをコードする核酸配列は、同じＮＬＳの２つのコピーをコードする。例えば、一実施形態において、核酸配列は、第１のＴｙ１由来ＮＬＳ及び第２のＴｙ１由来ＮＬＳの多量体をコードする。
一実施形態において、ＮＬＳをコードする核酸配列は、配列番号２０１と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の核酸配列を含む。一実施形態において、ＮＬＳをコードする核酸配列は、配列番号２０１の核酸配列を含む。
核輸出シグナル
一実施形態において、核酸分子は、核輸出シグナル（ＮＥＳ）をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、ＮＥＳは、細胞質ＲＮＡを標的化するために、タンパク質を細胞質に局在させる。一実施形態において、ＮＥＳをコードする核酸配列は、配列番号７５または７６と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする配列を含む。一実施形態において、ＮＥＳをコードする核酸配列は、配列番号７５または７６のアミノ酸配列をコードする配列を含む。
一実施形態において、ＮＥＳをコードする核酸配列は、配列番号２０２または２０３と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、ＮＥＳをコードする核酸配列は、配列番号２０２または２０３の配列を含む。
細胞小器官局在化シグナル
一実施形態において、核酸分子は、タンパク質を細胞小器官または細胞外に局在化させる局在化シグナルをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルは、タンパク質を、核小体、リボソーム、小胞、粗面小胞体、ゴルジ装置、細胞骨格、滑面小胞体、ミトコンドリア、液胞、細胞質、リソソーム、または中心小体に局在化させる。いくつかの局在化シグナルは、当技術分野において既知である。
例示的な局在化シグナルとしては、１×ミトコンドリア標的化配列、４×ミトコンドリア標的化配列、分泌シグナル配列（ＩＬ－２）、ミリスチル化、カルセクエストリンリーダー、ＫＤＥＬ保持、及びペルオキシソーム標的化配列が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、核酸分子は、局在化シグナルをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルは、タンパク質を細胞小器官または細胞外に局在させる。一実施形態において、局在化シグナルをコードする核酸配列は、配列番号７７～８３のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルをコードする核酸配列は、配列番号７７～８３のうちの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。
一実施形態において、局在化シグナルをコードする核酸配列は、配列番号２０４～２１０のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルをコードする核酸配列は、配列番号２０４～２１０のうちの１つの配列を含む。
精製及び／または検出タグ
一実施形態において、核酸分子は、精製及び／または検出タグをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、タグは、タンパク質のＮ末端上にある。一実施形態において、タグは、３×ＦＬＡＧタグである。一実施形態において、精製及び／または検出タグをコードする核酸配列は、配列番号６６と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする。一実施形態において、精製及び／または検出タグをコードする核酸配列は、配列番号６６のアミノ酸配列をコードする。
一実施形態において、精製及び／または検出タグをコードする核酸配列は、配列番号１９４と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、精製及び／または検出タグをコードする核酸配列は、配列番号２００の配列を含む。
ＥｒａｓｅＲタンパク質
一実施形態において、核酸分子は、本開示のタンパク質をコードする核酸配列を含み、これは、核、細胞小器官、細胞質、または細胞外に効果的に送達され、標的化されたＲＮＡ切断を可能にする。一実施形態において、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１５０～１７１のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする。一実施形態において、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１５０～１７１のうちの１つのアミノ酸配列をコードする。
一実施形態において、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２７１～２９０のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２７１～２９０のうちの１つの配列を含む。
ＨｉＬｉｇｈｔＲ
本開示はまた、編集タンパク質及び蛍光タンパク質の融合をコードする新規核酸分子を提供する。一実施形態において、融合タンパク質は、蛍光タンパク質の視覚化能力と、触媒的に死んだＣａｓのプログラム可能な核酸標的化能力とを組み合わせる。いくつかの実施形態において、核酸分子は、局在化シグナルをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルは、標的ＲＮＡが位置する部位にタンパク質を局在化させる。したがって、本開示は、局在化可能なＲＮＡの視覚化のためのタンパク質をコードする核酸分子を提供する。
編集タンパク質
一実施形態において、核酸分子は、編集タンパク質をコードする配列核酸を含む。一実施形態において、編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）タンパク質、及びＤＮＡまたはＲＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を含むが、これらに限定されない。
Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＳｐＣａｓ９、ＳｔＣａｓ９、ＮｍＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１、ＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９、ＶＱＲ ＳｐＣａｓ９、ｘＣａｓ９ ３．７、それらのホモログ、それらオルソログ、またはそれらの改変バージョンが挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡまたはＲＮＡ切断活性を有する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、標的配列内及び／または標的配列の相補体内などの標的配列の位置における核酸分子の１つまたは両方の鎖の切断を指向する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドからの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００塩基対またはそれよりも多くの塩基対内の１つまたは両方の鎖の切断を指向する。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３、またはＣｐｆ１である。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、触媒的に欠損である（ｄＣａｓ）。
一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ結合活性を有する。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３である。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ短縮、ＡｄｍＣａｓ１３ｄ、ＡｓｐＣａｓ１３ｂ、ＡｓｐＣａｓ１３ｃ、ＢｍａＣａｓ１３ａ、ＢｚｏＣａｓ１３ｂ、ＣａｍＣａｓ１３ａ、ＣｃａＣａｓ１３ｂ、Ｃｇａ２Ｃａｓ１３ａ、ＣｇａＣａｓ１３ａ、ＥｂａＣａｓ１３ａ、ＥｒｅＣａｓ１３ａ、ＥｓＣａｓ１３ｄ、ＦｂｒＣａｓ１３ｂ、ＦｎｂＣａｓ１３ｃ、ＦｎｄＣａｓ１３ｃ、ＦｎｆＣａｓ１３ｃ、ＦｎｓＣａｓ１３ｃ、ＦｐｅＣａｓ１３ｃ、ＦｕｌＣａｓ１３ｃ、ＨｈｅＣａｓ１３ａ、ＬｂｆＣａｓ１３ａ、ＬｂｍＣａｓ１３ａ、ＬｂｎＣａｓ１３ａ、ＬｂｕＣａｓ１３ａ、ＬｓｅＣａｓ１３ａ、ＬｓｈＣａｓ１３ａ、ＬｓｐＣａｓ１３ａ、Ｌｗａ２ｃａｓ１３ａ、ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＬｗｅＣａｓ１３ａ、ＰａｕＣａｓ１３ｂ、ＰｂｕＣａｓ１３ｂ、ＰｇｉＣａｓ１３ｂ、ＰｇｕＣａｓ１３ｂ、Ｐｉｎ２Ｃａｓ１３ｂ、Ｐｉｎ３Ｃａｓ１３ｂ、ＰｉｎＣａｓ１３ｂ、Ｐｐｒｃａｓ１３ａ、ＰｓａＣａｓ１３ｂ、ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ＲａＣａｓ１３ｄ、ＲａｎＣａｓ１３ｂ、ＲｃｄＣａｓ１３ａ、ＲｃｒＣａｓ１３ａ、ＲｃｓＣａｓ１３ａ、ＲｆｘＣａｓ１３ｄ、ＵｒＣａｓ１３ｄ、ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ＿Ａ１３３Ｈ、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ＿Ａ１０５８Ｈ、ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ短縮、ｄＡｄｍＣａｓ１３ｄ、ｄＡｓｐＣａｓ１３ｂ、ｄＡｓｐＣａｓ１３ｃ、ｄＢｍａＣａｓ１３ａ、ｄＢｚｏＣａｓ１３ｂ、ｄＣａｍＣａｓ１３ａ、ｄＣｃａＣａｓ１３ｂ、ｄＣｇａ２Ｃａｓ１３ａ、ｄＣｇａＣａｓ１３ａ、ｄＥｂａＣａｓ１３ａ、ｄＥｒｅＣａｓ１３ａ、ｄＥｓＣａｓ１３ｄ、ｄＦｂｒＣａｓ１３ｂ、ｄＦｎｂＣａｓ１３ｃ、ｄＦｎｄＣａｓ１３ｃ、ｄＦｎｆＣａｓ１３ｃ、ｄＦｎｓＣａｓ１３ｃ、ｄＦｐｅＣａｓ１３ｃ、ｄＦｕｌＣａｓ１３ｃ、ｄＨｈｅＣａｓ１３ａ、ｄＬｂｆＣａｓ１３ａ、ｄＬｂｍＣａｓ１３ａ、ｄＬｂｎＣａｓ１３ａ、ｄＬｂｕＣａｓ１３ａ、ｄＬｓｅＣａｓ１３ａ、ｄＬｓｈＣａｓ１３ａ、ｄＬｓｐＣａｓ１３ａ、ｄＬｗａ２ｃａｓ１３ａ、ｄＬｗａＣａｓ１３ａ、ｄＬｗｅＣａｓ１３ａ、ｄＰａｕＣａｓ１３ｂ、ｄＰｂｕＣａｓ１３ｂ、ｄＰｇｉＣａｓ１３ｂ、ｄＰｇｕＣａｓ１３ｂ、ｄＰｉｎ２Ｃａｓ１３ｂ、ｄＰｉｎ３Ｃａｓ１３ｂ、ｄＰｉｎＣａｓ１３ｂ、ｄＰｐｒＣａｓ１３ａ、ｄＰｓａＣａｓ１３ｂ、ｄＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ｄＲａＣａｓ１３ｄ、ｄＲａｎＣａｓ１３ｂ、ｄＲｃｄＣａｓ１３ａ、ｄＲｃｒＣａｓ１３ａ、ｄＲｃｓＣａｓ１３ａ、ｄＲｆｘＣａｓ１３ｄ、またはｄＵｒＣａｓ１３ｄである。追加のＣａｓタンパク質は、当技術分野において既知である（例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１８，１７３：６６５－６７６ ｅ１４、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２０１８，７：３２７－３３９ ｅ５、Ｃｏｘ，Ｄ．Ｂ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７，３５８：１０１９－１０２７、Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５５０：２８０－２８４、Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７，３５６：４３８－４４２、及びＥａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２０１７，６６：３７３－３８３ ｅ３、それらは参照により本明細書に組み込まれる）
一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１～４８のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１～４８のうちの１つのバリアントのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、バリアントは、Ｃａｓタンパク質を触媒的に不活性化する。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、１つ以上の挿入、欠失、または置換を有する配列番号１～４６のうちの１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、１つ以上の挿入、欠失、または置換は、Ｃａｓタンパク質を触媒的に不活性化する。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１～４８のうちの１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号４７～４８のうちの１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１８２～１８５のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の核酸配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１８８～１９０のうちの１つのバリアントを含み、バリアントは、コードされたＣａｓタンパク質を触媒的に不活性化する。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１８８～１９１のうちの１つの核酸配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１９０～１９１のうちの１つの核酸配列を含む。
蛍光タンパク質
一実施形態において、核酸分子は、蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、蛍光タンパク質は、ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＢＮＬ１、ｓｆＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ（１－１０）、ｓｆＧＦＰ（１－１０）－Ｌ－（１１）、ｓｆＣｈｅｒｒｙ、７ｘＳ１１、Ｓ１１、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、青色蛍光タンパク質、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＴａｇＢＦＰ、シアン色蛍光タンパク質、ｅＣＦＰ、ｍＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ－Ｉｓｈｉ Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１（Ｔｅａｌ）、黄色蛍光タンパク質、ＥＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ｍＢａｎａｎａ、橙色蛍光タンパク質、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ－Ｔａｎｄｅｍ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、赤色蛍光タンパク質、ｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｄＫｅｉｍａ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、またはＡＱ１４３である。
一実施形態において、蛍光タンパク質は、ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｓｆＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ（１－１０）、ｓｆＧＦＰ（１－１０）－Ｌ－（１１）、ｓｆＣｈｅｒｒｙまたは７ｘＳ１１である。一実施形態において、蛍光タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号４９～５６のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする配列を含む。一実施形態において、蛍光タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号４９～５６のうちの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。
一実施形態において、蛍光タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１９２～１９５のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の核酸配列を含む。一実施形態において、蛍光タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１９２～１９５のうちの１つの核酸配列を含む。
局在化シグナル
いくつかの実施形態において、核酸分子は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核輸出シグナル（ＮＥＳ）または細胞質もしくはミトコンドリアなどの細胞小器官に局在するための他の局在化シグナルなどの局在化シグナルをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルは、融合タンパク質を標的ＲＮＡが位置する部位に局在化させる。
核局在シグナル
一実施形態において、核酸分子は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、ＮＬＳは、レトロトランスポゾンＮＬＳである。一実施形態において、ＮＬＳは、Ｔｙ１、酵母ＧＡＬ４、ＳＫＩ３、Ｌ２９もしくはヒストンＨ２Ｂタンパク質、ポリオウイルス大型Ｔタンパク質、ＶＰ１もしくはＶＰ２キャプシドタンパク質、ＳＶ４０ＶＰ１もしくはＶＰ２キャプシドタンパク質、アデノウイルスＥｌａもしくはＤＢＰタンパク質、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質、肝炎ウイルスコア抗原もしくは哺乳動物ラミン、ｃ－ｍｙｃ、ｍａｘ、ｃ－ｍｙｂ、ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＡ、ｊｕｎ、Ｔａｘ、ステロイド受容体もしくはＭｘタンパク質、ヌクレオプラスミン（ＮＰＭ２）、ヌクレオホスミン（ＮＰＭ１）、またはサルウイルス４０（「ＳＶ４０」）Ｔ抗原に由来する。
一実施形態において、ＮＬＳは、Ｔｙ１もしくはＴｙ１由来ＮＬＳ、Ｔｙ２もしくはＴｙ２由来ＮＬＳ、またはＭＡＫ１１もしくはＭＡＫ１１由来ＮＬＳである。一実施形態において、Ｔｙ１ ＮＬＳは、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、Ｔｙ２ ＮＬＳは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＭＡＫ１１ ＮＬＳは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＮＬＳをコードする核酸配列は、配列番号６７～７４及び４２７～１０３９のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、ＮＬＳをコードする核酸配列は、配列番号６７～７４及び４２７～１０３９のうちの１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態において、ＮＬＳは、Ｔｙ１様ＮＬＳである。例えば、一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲＸモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｎ末端にＫＫＲＸモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｃ末端にＫＫＲモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲＸ及びＫＫＲモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｎ末端にＫＫＲＸモチーフ及びＣ末端にＫＫＲモチーフを含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、少なくとも２０アミノ酸を含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳは、２０～４０アミノ酸を含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳをコードする核酸配列は、配列番号４２７～１０３９の１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳをコードする核酸配列は、配列番号４２７～１０３９のうちの１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、配列は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０個以上の挿入、欠失、または置換を含む。一実施形態において、Ｔｙ１様ＮＬＳをコードする核酸配列は、配列番号４２７～１０３９のうちの１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態において、ＮＬＳをコードする核酸配列は、同じＮＬＳの２つのコピーをコードする。例えば、一実施形態において、核酸配列は、第１のＴｙ１由来ＮＬＳ及び第２のＴｙ１由来ＮＬＳの多量体をコードする。
一実施形態において、ＮＬＳをコードする核酸配列は、配列番号２０１と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の核酸配列を含む。一実施形態において、ＮＬＳをコードする核酸配列は、配列番号２０１の核酸配列を含む。
核輸出シグナル
一実施形態において、核酸分子は、核輸出シグナル（ＮＥＳ）をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、ＮＥＳは、細胞質ＲＮＡを標的化するために融合タンパク質を細胞質に局在させる。一実施形態において、ＮＥＳをコードする核酸配列は、配列番号８０２または８０３と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする配列を含む。一実施形態において、ＮＥＳをコードする核酸配列は、配列番号７５または７６のアミノ酸配列をコードする配列を含む。
一実施形態において、ＮＥＳをコードする核酸配列は、配列番号２０２または２０３と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、ＮＥＳをコードする核酸配列は、配列番号２０２または２０３の配列を含む。
細胞小器官局在化シグナル
一実施形態において、核酸分子は、融合タンパク質を細胞小器官または細胞外に局在化する局在化シグナルをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルは、タンパク質を、核小体、リボソーム、小胞、粗面小胞体、ゴルジ装置、細胞骨格、滑面小胞体、ミトコンドリア、液胞、細胞質、リソソーム、または中心小体に局在化させる。いくつかの局在化シグナルは、当技術分野において既知である。
例示的な局在化シグナルとしては、１×ミトコンドリア標的化配列、４×ミトコンドリア標的化配列、分泌シグナル配列（ＩＬ－２）、ミリスチル化、カルセクエストリンリーダー、ＫＤＥＬ保持、及びペルオキシソーム標的化配列が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、核酸分子は、局在化シグナルをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルは、融合タンパク質を細胞小器官または細胞外に局在化させる。一実施形態において、局在化シグナルをコードする核酸配列は、配列番号７７～８３と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルをコードする核酸配列は、配列番号７７～８３のアミノ酸配列をコードする配列を含む。
一実施形態において、局在化シグナルをコードする核酸配列は、配列番号２０４～２１０と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、局在化シグナルをコードする核酸配列は、配列番号２０４～２１０の配列を含む。
精製及び／または検出タグ
一実施形態において、核酸分子は、精製及び／または検出タグをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、タグは、融合タンパク質のＮ末端上にある。一実施形態において、タグは、３×ＦＬＡＧタグである。一実施形態において、精製及び／または検出タグをコードする核酸配列は、配列番号６６と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする。一実施形態において、精製及び／または検出タグをコードする核酸配列は、配列番号６６のアミノ酸配列をコードする。
一実施形態において、精製及び／または検出タグをコードする核酸配列は、配列番号２００と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、精製及び／または検出タグをコードする核酸配列は、配列番号２００の配列を含む。
リンカー
一実施形態において、核酸分子は、リンカーペプチドをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、リンカーは、Ｃａｓタンパク質及び蛍光タンパク質を連結する。一実施形態において、リンカーは、Ｃａｓタンパク質のＣ末端及び蛍光タンパク質のＮ末端に接続される。一実施形態において、リンカーは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端及び蛍光タンパク質のＣ末端に接続される。
一実施形態において、リンカーペプチドをコードする核酸配列は、配列番号５７～６５のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする。一実施形態において、リンカーペプチドをコードする核酸配列は、配列番号５７～６５のうちの１つのアミノ酸配列をコードする。
一実施形態において、リンカーペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１９６～１９９のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、リンカーペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１９６～１９９のうちの１つの配列を含む。
ＨｉｌｉｇｈｔＲ融合タンパク質
一実施形態において、核酸分子は、本開示の融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、これは、核、細胞小器官、細胞質、または細胞外に効果的に送達され、標的化されたＲＮＡ切断を可能にする。一実施形態において、融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号８４～１４９のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列をコードする。一実施形態において、融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号８４～１４９のうちの１つのアミノ酸配列をコードする。
一実施形態において、融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２１１～２７０のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を含む。一実施形態において、融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２１１～２７０のうちの１つの配列を含む。
標的化核酸及びＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）
一態様において、本開示は、Ｃａｓを標的ＲＮＡに標的化するためのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を提供する。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ガイド配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート配列と、ガイド配列もしくはスペーサー配列と融合または連結したガイド配列とを含む。一実施形態において、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列から上流（すなわち５’）に位置し得る。他の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列から下流（すなわち、３’）に位置し得る。
いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ステムループを含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、単一のステムループを含む。一実施形態において、ダイレクトリピート配列は、ステムループを形成する。一実施形態において、ダイレクトリピート配列は、単一のステムループを形成する。
一実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、１５～３５ｎｔである。一実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、少なくとも１５ヌクレオチドである。一実施形態において、スペーサー長は、１５～１７ｎｔ、例えば、１５、１６、もしくは１７ｎｔ、１７～２０ｎｔ、例えば、１７、１８、１９、もしくは２０ｎｔ、２０～２４ｎｔ、例えば、２０、２１、２２、２３、もしくは２４ｎｔ、２３～２５ｎｔ、例えば、２３、２４、もしくは２５ｎｔ、２４～２７ｎｔ、例えば、２４、２５、２６、もしくは２７ｎｔ、２７～３０ｎｔ、例えば、２７、２８、２９、もしくは３０ｎｔ、３０～３５ｎｔ、例えば、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５ｎｔ、または３５ｎｔ以上である。
概して、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイゼーションするのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列であり、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を志向する。いくつかの実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して適切にアラインメントされる場合、約５０％以上、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％またはそれより多くである。最適なアライメントは、配列をアライメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定され得、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＸ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎから入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔから入手可能）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、約５ヌクレオチド長以上、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長、またはそれより長いヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、約７５ヌクレオチド長未満、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長、またはそれより短いヌクレオチド長のである。好ましくは、ガイド配列は、１０ ３０ヌクレオチド長である。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を指向するガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって評価され得る。例えば、試験されるガイド配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素は、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成要素をコードするベクターでのトランスフェクションなどよって対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得、続いて、本明細書に記載のサーベイヤーアッセイなどによって、標的配列内の優先切断の評価が行われる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験されるガイド配列及び試験されるガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素を提供し、試験ガイド配列と対照ガイド配列の反応の間の標的配列での結合または切断速度を比較することによって、試験管内で評価され得る。他のアッセイが可能であり、当業者に生じるであろう。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのいくつかの実施形態において、ガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％以上、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、もしくは１００％であり得、ガイドもしくはＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡは、約５ヌクレオチド長以上、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチド長、もしくはそれより長いヌクレオチド長であり得、またはガイドもしくはＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡは、約７５未満、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド長、またはそれより短いヌクレオチド長であり得、有利には、ｔｒａｃｒＲＮＡは、３０または５０ヌクレオチド長である。しかしながら、本開示の態様は、オフターゲット相互作用を低減すること、例えば、低い相補性を有する標的配列と相互作用するガイドを低減することである。実際、実施例において、８０％超～約９５％の相補性、例えば、８３％～８４％または８８～８９％または９４～９５％の相補性を有する標的配列とオフターゲット配列とを区別することができるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをもたらす変異を本開示が含むことが示されている（例えば、１８ヌクレオチドを有する標的と、１、２、または３ミスマッチを有する１８ヌクレオチドのオフターゲットとを区別すること）。したがって、本開示の文脈では、ガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性の程度は、９４．５％超または９５％または９５．５％または９６％または９６．５％または９７％または９７．５％または９８％または９８．５％または９９％または９９．５％または９９．９％または１００％である。オフターゲットは、配列とガイドとの間で１００％未満または９９．９％または９９．５％または９９％または９９％または９８．５％または９８％または９７．５％または９７％または９６．５％または９６％または９５．５％または９５％または９４．５％または９４％または９３％または９２％または９１％または９０％または８９％または８８％または８７％または８６％または８５％または８４％または８３％または８２％または８１％または８０％の相補性であり、オフターゲットが、配列とガイドとの間で１００％未満または９９．９％または９９．５％または９９％または９９％または９８．５％または９８％または９７．５％または９７％または９６．５％または９６％または９５．５％または９５％または９４．５％の相補性であることが有利である。
一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、コロナウイルスゲノムｍＲＮＡ配列またはコロナウイルスサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的なものを含む。例えば、一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、コロナウイルのスリーダー配列、Ｓ配列、Ｅ配列、Ｍ配列、Ｎ配列、またはＳ２Ｍ配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、コロナウイルスのリーダー配列、Ｎ配列、またはＳ２Ｍ配列に実質的に相補的な配列を含む。
一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３０７～３２７から選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列に実質的に相補的である配列、またはそれらの断片を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３０７～３２７から選択される配列に実質的に相補的である配列、またはそれらの断片を含む。
一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３０８～３１４、３１６～３２１、及び３２６～３２７から選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３０８～３１４、３１６～３２１、及び３２６～３２７から選択される配列に実質的に相補的である配列を含む。
一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３５６～３９１から選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３５６～３９１から選択される配列を含む。
一実施形態において、本開示は、インフルエンザウイルス配列に実質的に相補的な配列を有するｃｒＲＮＡを提供する。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、インフルエンザウイルスゲノムｍＲＮＡ配列またはサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的なものを含む。例えば、一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、インフルエンザウイルスのＰＢ２配列、ＰＢ１配列、ＰＡ配列、ＨＡ配列、ＮＰ配列、ＮＡ配列、Ｍ配列またはＮＳ配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、インフルエンザウイルスのＰＢ２配列、ＰＢ１配列、ＰＡ配列、ＮＰ配列、またはＭ配列に実質的に相補的な配列を含む。
一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３２８～３４７から選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列に実質的に相補的である配列、またはそれらの断片を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３２８～３４７から選択される配列に実質的に相補的である配列、またはそれらの断片を含む。
一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ウイルスＲＮＡ配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ポジティブセンスウイルスＲＮＡ配列の配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ネガティブセンスウイルスＲＮＡ配列の配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３９２～４０１から選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３９２～４０１から選択される配列を含む。
一実施形態において、本開示は、拡張されたＲＮＡリピートに実質的に相補的な配列を有するｃｒＲＮＡを提供する。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、拡張されたＣＵＧリピートに実質的に相補的な配列を含む。例えば、ＲＮＡリピートには、ＣＴＧリピート、ＣＣＴＧリピート、ＧＧＧＣＣリピート、ＣＡＧリピート、ＣＧＧリピート、ＡＴＴＣＴリピート、及びＴＧＧＡＡリピートが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３０１～３０６から選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列に実質的に相補的である配列、またはそれらの断片を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３０１～３０６から選択される配列に実質的に相補的である配列、またはそれらの断片を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３４８～３５４から選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３４８～３５４から選択される配列を含む。
一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含む。一実施形態において、ＤＲ配列は、標的配列に実質的に相補的な配列の５’である。例えば、一実施形態において、ＤＲ配列は、コロナウイルスゲノムｍＲＮＡ配列またはコロナウイルスサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的な配列の５’である。一実施形態において、ＤＲ配列は、インフルエンザウイルスゲノムＲＮＡ配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムＲＮＡ配列に実質的に相補的な配列の５’である。一実施形態において、ＤＲ配列は、拡張されたＲＮＡリピート配列に実質的に相補的な配列の５’である。一実施形態において、ＤＲ配列は、標的配列へのＣａｓ１３標的化の活性、Ｃａｓ１３触媒活性、またはそれらの両方を増強する。例えば、一実施形態において、ＤＲ配列は、変異を含む。例えば、一実施形態において、ＤＲ配列は、Ｔ１７Ｃ点変異を含む。一実施形態において、ＤＲ配列は、Ｔ１８Ｃ点変異を含む。一実施形態において、ＤＲ配列は、配列番号３４８～３４１から選択される配列と少なくとも８０％相同な配列の５’である。
一実施形態において、ＤＲ配列は、標的配列に実質的に相補的な配列の３’である。例えば、一実施形態において、ＤＲ配列は、コロナウイルスゲノムｍＲＮＡ配列またはコロナウイルスサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的な配列の３’である。一実施形態において、ＤＲ配列は、インフルエンザウイルスゲノムｍＲＮＡ配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的な配列の３’である。一実施形態において、ＤＲ配列は、拡張されたＲＮＡリピート配列に実質的に相補的な配列の３’である。一実施形態において、ＤＲ配列は、配列番号３４８～３４１から選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列の３’である。
一実施形態において、５’または３’ＤＲ配列の選択は、使用されるＣａｓタンパク質オルソログに依存する。一実施形態において、ＤＲ配列は、配列番号２９１～３０３から選択される配列を含む。
タンデムアレイ
一実施形態において、本開示は、タンデムｃｒＲＮＡアレイを提供する。一実施形態において、タンデムｃｒＲＮＡアレイは、単一のプロモーターが複数のｃｒＲＮＡの発現を駆動することを可能にする。一実施形態において、タンデムアレイは、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、または８つ以上のｃｒＲＮＡ配列を含む。
一実施形態において、タンデムｃｒＲＮＡアレイ中の各ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列及びスペーサー配列を含む。一実施形態において、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列から上流（すなわち５’）に位置し得る。他の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列から下流（すなわち、３’）に位置し得る。
一実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号２９１～２９３のうちの１つの配列を含む。一実施形態において、ダイレクトリピート配列は、ポリＴストレッチ内に単一の変異を含む。例えば、一実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号２９４～２００から選択される配列を含む。
一実施形態において、タンデムｃｒＲＮＡアレイ中の各ｃｒＲＮＡは、異なるダイレクトリピート配列を含む。例えば、一実施形態において、ダイレクトリピートのループ領域内のヌクレオチド置換、複数のガイドＲＮＡは、効率的に生成された順序付けられたｃｒＲＮＡのアレイを提供する。
一実施形態において、タンデムアレイは、ゲノムコロナウイルスＲＮＡ配列及び／またはサブゲノムコロナウイルスＲＮＡ配列に実質的に相補的な配列を含むｃｒＲＮＡを少なくとも２つ以上含む。一実施形態において、タンデムアレイは、配列番号３０７～３２７から選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列に実質的に相補的であるもの、またはそれらの断片を含むｃｒＲＮＡを少なくとも２つ以上含む。一実施形態において、タンデムアレイは、配列番号３５６～３９１から選択される配列と少なくとも８０％相同な配列を含むｃｒＲＮＡを少なくとも２つ以上含む。一実施形態において、タンデムアレイは、配列番号４０２と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列を含む。一実施形態において、タンデムアレイは、配列番号４０２の配列を含む。
一実施形態において、タンデムアレイは、ゲノムコロナウイルスＲＮＡ配列及び／またはサブゲノムコロナウイルスＲＮＡ配列に実質的に相補的な配列を含むｃｒＲＮＡを少なくとも２つ以上含む。一実施形態において、タンデムアレイは、配列番号３２８～３４７から選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列に実質的に相補的であるもの、またはそれらの断片を含むｃｒＲＮＡを少なくとも２つ以上含む。一実施形態において、タンデムアレイは、配列番号３９２～４０１から選択される配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列を含むｃｒＲＮＡを少なくとも２つ以上含む。一実施形態において、タンデムアレイは、配列番号４０３または４０４と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列を含む。一実施形態において、タンデムアレイは、配列番号４０３または４０４の配列を含む。
核酸
本開示の単離された核酸配列は、例えば、遺伝子を発現する細胞由来のライブラリーをスクリーニングすることによって、またはそれを含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することによって、またはそれを含む細胞及び組織から標準的な技術を使用して直接単離することによってなどの当技術分野で既知の多くの組換え方法のうちのいずれかを使用して得ることができる。あるいは、目的の遺伝子は、クローニングではなく、合成によって産生され得る。
単離された核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むがこれらに限定されない、任意の種類の核酸を含むことができる。例えば、一実施形態において、組成物は、例えば、本開示のタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子を含む、単離されたＤＮＡ分子を含む。一実施形態において、組成物は、本開示のタンパク質またはそれらの機能的断片をコードする単離されたＲＮＡ分子を含む。
本発明の核酸分子は、細胞培養のための血清または増殖培地における安定性を改善するように修飾され得る。修飾を付加して、安定性、機能性、及び／または特異性を向上させ、本発明の核酸分子の免疫刺激特性を最小限に抑えることができる。例えば、安定性を高めるために、３’残基を分解に対して安定化することができ、例えば、それらをプリンヌクレオチド、特にアデノシンヌクレオチドまたはグアノシンヌクレオチドからなるように選択することができる。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、２’－デオキシチミジンによるウリジンの置換が容認され、分子の機能に影響を及ぼさない。
本発明の一実施形態において、核酸分子は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド類似体を含有し得る。例えば、末端は、修飾されたヌクレオチド類似体を組み込むことによって安定化され得る。
ヌクレオチド類似体の非限定的な例としては、糖及び／または骨格が修飾されたリボヌクレオチドが挙げられる（すなわち、リン酸糖骨格への修飾を含む）。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル連結は、窒素または硫黄ヘテロ原子のうちの少なくとも１つを含むように修飾され得る。例示的な骨格が修飾されたリボヌクレオチドにおいては、隣接するリボヌクレオチドに接続するホスホエステル基は、例えばホスホチオアート基の修飾された基によって置き換えられる。例示的な糖が修飾されたリボヌクレオチドにおいては、２’ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＯＮから選択される基によって置き換えられ、Ｒは、Ｃ１－Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
修飾の他の例は、核酸塩基が修飾されたリボヌクレオチド、すなわち、天然に生じる核酸塩基の代わりに少なくとも１つの非天然に生じる核酸塩基を含有するリボヌクレオチドである。塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性を遮断するように修飾され得る。例示的な修飾された核酸塩基としては、５位で修飾されたウリジン及び／またはシチジン、例えば５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシン及び／またはグアノシン、例えば８－ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば７－デアザ－アデノシン；Ｏ－及びＮ－アルキル化されたヌクレオチド、例えばＮ６－メチルアデノシンが好適であり、これらが挙げられるが、これらに限定されない。上記の修飾を組み合わせてもよいことに留意すべきである。
いくつかの事例では、核酸分子は、以下の化学修飾のうちの少なくとも１つを含む。１つ以上のヌクレオチドの２’－Ｈ、２’－Ｏ－メチル、または２’－ＯＨ修飾。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼに対する耐性が増強され得る。ヌクレアーゼ耐性の増加について、核酸分子は、例えば、２’－修飾されたリボース単位及び／またはホスホロチオエート連結を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多くの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾されるか、または置き換えられ得る。ヌクレアーゼ耐性の増加について、本発明の核酸分子は、２’－Ｏ－メチル、２’－フッ素、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－アミノ、及び／またはホスホロチオアート連結を含み得る。ロックされた核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、例えば２’－４’－エチレン架橋された核酸、及び２－アミノ－Ａ、２－チオ（例えば、２－チオ－Ｕ）、Ｇ－クランプ修飾などの特定の核酸塩基修飾はまた、標的に対する結合親和性を増加させることができる。
一実施形態において、核酸分子は、２’－修飾されたヌクレオチド、例えば、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）を含む。一実施形態において、核酸分子は、少なくとも１つの２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドを含み、いくつかの実施形態において、核酸分子のすべてのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、以下の特性のうちの１つ以上を有する。
本明細書で議論される核酸剤には、そうでなければ修飾されていないＲＮＡ及びＤＮＡ、ならびに例えば、有効性を改善するために修飾されたＲＮＡ及びＤＮＡ、ならびにヌクレオシド代理物のポリマーが含まれる。修飾されていないＲＮＡは、核酸の構成要素、すなわち、糖、塩基、及びリン酸部分が、天然に生じるもの、またはヒトの体内で天然に生じるものと同じであるか、または本質的に同じである分子を指す。当技術分野は、希少または珍しいが、天然に存在するＲＮＡを修飾されたＲＮＡと称してきた。例えば、Ｌｉｍｂａｃｈら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４，２２：２１８３－２１９６）を参照されたい。そのような希少または珍しいＲＮＡは、しばしば修飾されたＲＮＡと称され、典型的には、転写後修飾の結果であり、本明細書で使用される修飾されていないＲＮＡという用語内にある。修飾されたＲＮＡは、本明細書で使用される場合、核酸の構成要素のうちの１つ以上、すなわち、糖、塩基、及びリン酸部分が、天然に生じるものとは異なるか、またはヒトの体内に生じるものとは異なる分子を指す。それらは「修飾されたＲＮＡ」と称されるが、それらはもちろん、修飾のために、厳密には、ＲＮＡではない分子を含む。ヌクレオシド代理物は、ハイブリダイゼーションがリボリン酸骨格、例えば、リボリン酸骨格の非荷電模倣物で見られるものと実質的に類似するように、塩基が正しい空間関係で提示されることを可能にする非リボリン酸構築物でリボリン酸骨格が置き換えられる分子である。
本発明の核酸の修飾は、リン酸基、糖基、骨格、Ｎ末端、Ｃ末端、または核酸塩基のうちの１つ以上に存在し得る。
本発明はまた、本発明の単離された核酸が挿入されたベクターも含む。当技術分野は、本発明において有用な適切なベクターで満たされている。
簡潔にまとめると、本開示のタンパク質をコードする天然または合成核酸の発現は、典型的には、本開示のタンパク質またはその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。使用されるベクターは、複製、及び任意選択的で、真核細胞における統合に適している。典型的なベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及び所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。
本発明のベクターも、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用して、核酸免疫化及び遺伝子療法に使用され得る。遺伝子送達のための方法は、当技術分野において既知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，３９９，３４６号、第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号を参照されたい。別の実施形態において、本発明は、遺伝子療法ベクターを提供する。
本発明の単離された核酸は、多くの種類のベクターにクローニングされ得る。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングされ得る。特に関心のあるベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。
さらに、ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ならびに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが含まれるがこれらに限定されない。概して、適切なベクターは、少なくとも１つの生物における機能的な複製の起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択可能なマーカーを含有する（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び米国特許６，３２６，１９３号）。
送達システム及び方法
一態様において、本開示は、新規のレンチウイルスパッケージング及び送達システムの開発に関する。レンチウイルス粒子は、タンパク質としてウイルス酵素を送達する。このようにして、レンチウイルス酵素は短寿命であるため、細胞の全寿命を通じての長期発現によるオフターゲット編集の可能性を制限する。したがって、一実施形態において、本開示は、遺伝子または遺伝物質を送達するための新規の送達システムを提供する。
それらの必要な活性が短期間でのみ必要とされることを考慮すると、レンチウイルス粒子中のタンパク質としての編集構成要素または従来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集構成要素の組み込みは有利である。したがって、一実施形態において、本開示は、レンチウイルス送達システム、ならびに本発明の組成物を送達する方法、遺伝子材料を編集する方法、及びレンチウイルス送達システムを使用する核酸送達方法を提供する。
一実施形態において、送達システムは、（１）パッケージングプラスミド、（２）転移プラスミド、及び（３）エンベローププラスミドを含む。一実施形態において、送達システムは、（１）パッケージングプラスミド、（２）エンベローププラスミド、及び（３）ＶＰＲプラスミドを含む。一実施形態において、パッケージングプラスミドは、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質は、触媒的に死んだインテグラーゼを含む。一実施形態において、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質は、Ｄ１１６Ｎ及びＤ６４Ｖから選択される変異を含む。
一実施形態において、転移プラスミドは、ｃｒＲＮＡ配列及び本開示のＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態において、転移プラスミドは、ｃｒＲＮＡ配列及びＣａｓタンパク質を含む本開示のタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、転移プラスミドは、ｃｒＲＮＡ配列、ならびにＣａｓタンパク質及び局在化シグナルを含む本開示のタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、転移プラスミドは、ｃｒＲＮＡ配列、ならびにＣａｓタンパク質及び、ＮＬＳ、ＮＥＳ、または他の局在化シグナルを含む本開示のタンパク質をコードする核酸配列を含む。
例えば、一実施形態において、転移プラスミドは、コロナウイルスゲノムｍＲＮＡ配列またはコロナウイルスサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的であるｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸配列、及び本開示のＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、コロナウイルスゲノムｍＲＮＡ配列またはコロナウイルスサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的であるｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸配列は、配列番号３５６～３９１とと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１～４６及び１５０～１７１のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同なアミノ酸配列をコードする配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１８８～１９０及び２７１～２９０のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列を含む。一実施形態において、転移プラスミドは、配列番号４０５～４０７の配列を含む。
一実施形態において、転移プラスミドは、インフルエンザウイルスゲノムｍＲＮＡ配列またはサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的であるｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸配列、及び本開示のＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、インフルエンザウイルスゲノムｍＲＮＡ配列またはサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的であるｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸配列は、配列番号３９２～４０１と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列を含む配列をコードする。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１～４６及び１５０～１７１のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同なアミノ酸配列をコードする配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１８８～１９０及び２７１～２９０のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列を含む。
一実施形態において、転移プラスミドは、ｃｒＲＮＡ配列、ならびにＣａｓタンパク質及び蛍光タンパク質を含む本開示の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、転移プラスミドは、ｃｒＲＮＡ配列、ならびにＣａｓタンパク質、蛍光タンパク質及び局在化シグナルを含む本開示のタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、転移プラスミドは、ｃｒＲＮＡ配列、ならびにＣａｓタンパク質、蛍光タンパク質及びＮＬＳ、ＮＥＳ、または他の局在化シグナルを含む本開示のタンパク質をコードする核酸配列を含む。
１つの実施形態において、転移プラスミドは、ｃｒＲＮＡアレイ配列及び本開示のＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態において、転移プラスミドは、ｃｒＲＮＡアレイ配列及びＣａｓタンパク質を含む本開示のタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、転移プラスミドは、ｃｒＲＮＡアレイ配列、ならびにＣａｓタンパク質及び局在化シグナルを含む本開示のタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、転移プラスミドは、ｃｒＲＮＡアレイ配列、ならびにＣａｓタンパク質及びＮＬＳ、ＮＥＳ、または他の局在化シグナルを含む本開示のタンパク質をコードする核酸配列を含む。
例えば、一実施形態において、転移プラスミドは、コロナウイルスゲノムｍＲＮＡ配列またはコロナウイルスサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的である２つ以上のｃｒＲＮＡ配列を含むタンデムアレイをコードする核酸配列、及び本開示のＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、タンデムアレイをコードする核酸配列は、配列番号４０２と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列をコードする配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１～４６及び１５０～１７１のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同なアミノ酸配列をコードする配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１８８～１９０及び２７１～２９０のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列を含む。一実施形態において、転移プラスミドは、配列番号３９６の配列を含む。
一実施形態において、転移プラスミドは、インフルエンザウイルスゲノムｍＲＮＡ配列またはサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的である２つ以上のｃｒＲＮＡ配列を含むタンデムアレイをコードする核酸配列、及び本開示のＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、タンデムアレイをコードする核酸配列は、配列番号４０３または４０４と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列をコードする配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１～４６及び１５０～１７１のうちの１つと少なくとも８０％相同なアミノ酸配列をコードする配列を含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１８８～１９０及び２７１～２９０のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列を含む。
一実施形態において、転移プラスミドは、ｃｒＲＮＡアレイ配列、ならびにＣａｓタンパク質及び蛍光タンパク質を含む本開示の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、転移プラスミドは、ｃｒＲＮＡアレイ配列、ならびにＣａｓタンパク質、蛍光タンパク質、及び局在化シグナルを含む本開示のタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、転移プラスミドは、ｃｒＲＮＡアレイ配列、ならびにＣａｓタンパク質、蛍光タンパク質及びＮＬＳ、ＮＥＳ、または他の局在化シグナルを含む本開示のタンパク質をコードする核酸配列を含む。
１つの実施形態において、転移プラスミドは、遺伝子をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態において、転移プラスミドは、治療的遺伝子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子は、野生型遺伝子である。
一実施形態において、エンベローププラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、エンベロープタンパク質は、所望の細胞型に基づいて選択され得る。一実施形態において、エンベローププラスミドは、ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、エンベローププラスミドは、小胞性口内炎ウイルスｇタンパク質（ＶＳＶ－ｇ）エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、エンベローププラスミドは、配列番号１８４のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同なアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、エンベローププラスミドは、配列番号１８４のうちの１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態において、エンベローププラスミドは、コロナウイルスタンパク質またはコロナウイルスタンパク質由来タンパク質をコードする核酸配列を含む。例えば、一実施形態において、エンベローププラスミドは、配列番号１７２～１８３のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同なアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、エンベローププラスミドは、配列番号１７２～１８３のうちの１つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
一実施形態において、コロナウイルス由来のウイルスエンベロープタンパク質は、レンチウイルスベクターの偽型化には効率的ではない。したがって、一実施形態において、本開示はまた、レンチウイルスベクターの偽型化に使用するための新規のコロナウイルスエンベロープタンパク質を提供する。一実施形態において、コロナウイルスエンベロープタンパク質は、配列番号１７２～１８３のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同なアミノ酸配列を含む。一実施形態において、コロナウイルスエンベロープタンパク質は、配列番号１７２～１８３のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、ＶＰＲプラスミドは、ＶＰＲ、及び本開示のＣａｓタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、ＶＰＲプラスミドは、ＶＰＲ、ならびにＣａｓタンパク質及び蛍光タンパク質を含む本開示のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。
一実施形態において、パッケージングプラスミド、転移プラスミド、及びエンベローププラスミドは、細胞に導入される。一実施形態において、細胞は、パッケージングプラスミドによってコードされるｇａｇ－ｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を転写及び翻訳して、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質を産生する。一実施形態において、細胞は、エンベローププラスミドのエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を転写及び翻訳して、エンベロープタンパク質を産生する。一実施形態において、細胞は、転移プラスミドのｃｒＲＮＡ配列またはｃｒＲＮＡアレイをコードする核酸配列を転写して、ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡアレイを産生する。一実施形態において、細胞は、転移プラスミドのＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質及び蛍光タンパク質をコードする核酸配列を転写及び翻訳して、ＣａｓまたはＣａｓ融合タンパク質を産生する。
一実施形態において、転写された転移プラスミド及びｇａｇ－ｐｏｌタンパク質は、レンチウイルスベクターにパッケージングされる。一実施形態において、レンチウイルスベクターは、細胞培地から収集される。一実施形態において、ウイルス粒子は標的細胞を形質導入し、転写されたｃｒＲＮＡ及びＣａｓタンパク質は切断され、翻訳され、それによってＣａｓタンパク質及びｃｒＲＮＡを生成し、ｃｒＲＮＡはＣａｓタンパク質に結合し、それをｃｒＲＮＡ配列に実質的に相補的な配列を有するＲＮＡに指向する。
一実施形態において、パッケージングプラスミド、転移プラスミド、及びエンベローププラスミドは、細胞に導入される。一実施形態において、細胞は、パッケージングプラスミドによってコードされるｇａｇ－ｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を転写及び翻訳して、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質を産生する。一実施形態において、細胞は、エンベローププラスミドのエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を転写及び翻訳して、エンベロープタンパク質を産生する。一実施形態において、細胞は、遺伝子をコードする核酸配列を転写して、遺伝子を産生する。一実施形態において、細胞は、転移プラスミドの遺伝子をコードする核酸配列を転写及び翻訳して、タンパク質を産生する。
一実施形態において、転写された転移プラスミド及びｇａｇ－ｐｏｌタンパク質は、レンチウイルスベクターにパッケージングされる。一実施形態において、レンチウイルスベクターは、細胞培地から収集される。一実施形態において、ウイルス粒子は、標的細胞を形質導入し、転写された遺伝子は、細胞に送達され、ゲノムに挿入される。
一実施形態において、転写された転移プラスミド及びｇａｇ－ｐｏｌタンパク質は、レンチウイルスベクターにパッケージングされる。一実施形態において、レンチウイルスベクターは、細胞培地から収集される。一実施形態において、ウイルス粒子は、標的細胞を形質導入し、転写及び翻訳された遺伝子は、細胞に送達される。
一実施形態において、遺伝子またはタンパク質は、呼吸器、血管、腎臓、または心血管の細胞型に送達される。したがって、一実施形態において、エベロープタンパク質は、コロナウイルスに由来する。一実施形態において、コロナウイルスエンベロープタンパク質は、配列番号１７２～１８３のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同なアミノ酸配列を含む。一実施形態において、コロナウイルスエンベロープタンパク質は、配列番号１７２～１８３のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
さらに、哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、多くの追加のウイルスベースのシステムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当技術分野で既知の技術を使用して、ベクターに挿入され、レトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスを単離し、対象の細胞にインビボまたはエクスビボのいずれかで送達することができる。いくつかのレトロウイルスシステムが当技術分野で既知である。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが当技術分野で既知である。一実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。
例えば、レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期的で安定的な組み込み及び娘細胞におけるその増殖を可能にするので、長期的な遺伝子移入を達成するため野に適切なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターよりもさらなる利点を有する。これらはまた、低免疫原性というさらなる利点を有する。
一実施形態において、組成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターを含む。「ＡＡＶベクター」という用語は、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、及びＡＡＶ－９を含むがこれらに限定されない、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味する。ＡＡＶベクターは、様々な障害の治療のための強力な遺伝子送達ツールとなっている。ＡＡＶベクターは、病原性の欠如、最小限の免疫原性、及び安定かつ効率的な手法で有糸分裂後細胞を形質導入する能力を含む、遺伝子療法に理想的に適合させるいくつかの特徴を有する。ＡＡＶ血清型、プロモーター、及び送達方法の適切な組み合わせを選択することによって、ＡＡＶベクター内に含有される特定の遺伝子の発現を、１つ以上の種類の細胞に特異的に標的化することができる。
例えば、一実施形態において、ＡＡＶベクターは、コロナウイルスゲノムｍＲＮＡ配列またはコロナウイルスサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的であるｃｒＲＮＡを含む。一実施形態において、ＡＡＶベクターは、コロナウイルスゲノムｍＲＮＡ配列またはコロナウイルスサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的な２つ以上のｃｒＲＮＡを含むｃｒＲＮＡアレイを含む。一実施形態において、ＡＡＶベクターは、配列番号４０９と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同な配列を含む。一実施形態において、転移プラスミドは、配列番号４０９の配列を含む。
一実施形態において、ＡＡＶベクターは、インフルエンザウイルスゲノムＲＮＡ配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムＲＮＡ配列に実質的に相補的なｃｒＲＮＡを含む。一実施形態において、移入プラスミドは、インフルエンザウイルスゲノムＲＮＡ配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムＲＮＡ配列に実質的に相補的な２つ以上のｃｒＲＮＡを含むｃｒＲＮＡアレイを含む。
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ野生型遺伝子のうちの１つ以上、好ましくはｒｅｐ遺伝子及び／またはｃａｐ遺伝子の全部または一部を欠失させることができるが、機能的な隣接するＩＴＲ配列を保持する。高度な相同性にもかかわらず、異なる血清型は、異なる組織への向性を有する。ＡＡＶ１の受容体は不明であるが、ＡＡＶ１は、ＡＡＶ２よりも効率的に骨格及び心筋を形質導入することが知られている。ほとんどの研究は、ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接するベクターＤＮＡが、代替の血清型のカプシドにパッケージングされている偽型化されたベクターで行われているため、生物学的差異が、ゲノムではなくカプシドに関連していることは明らかである。最近の証拠は、ＡＡＶ１キャプシドにパッケージングされたＤＮＡ発現カセットが、ＡＡＶ２キャプシドにパッケージングされたものよりも心筋細胞の形質導入において効率が少なくとも１ｌｏｇ１０高いことを示している。一実施形態において、ウイルス送達システムは、アデノ随伴ウイルス送達システムである。アデノ随伴ウイルスは、血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型４（ＡＡＶ４）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）、または血清型９（ＡＡＶ９）のものであり得る。
ベクターへの会合のための望ましいＡＡＶ断片には、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３及び超可変領域を含むｃａｐタンパク質、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０を含むｒｅｐタンパク質、ならびにこれらのタンパク質をコードする配列が含まれる。これらの断片は、様々なベクターシステム及び宿主細胞において容易に利用され得る。そのような断片は、単独で、他のＡＡＶ血清型配列もしくは断片と組み合わせて、または他のＡＡＶもしくは非ＡＡＶウイルス配列由来の要素と組み合わせて使用され得る。本明細書で使用される場合、人工ＡＡＶ血清型は、非天然に生じるカプシドタンパク質を有するＡＡＶを含むがこれに限定されない。そのような人工カプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を使用して、異なる選択されたＡＡＶ血清型、同じＡＡＶ血清型の非連続部分、非ＡＡＶウイルス源、または非ウイルス源から得られ得る異種配列と組み合わせて、任意の適切技術によって生成され得る。人工ＡＡＶ血清型は、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、または「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得るが、これらに限定されない。したがって、１つ以上のタンパク質の発現に適切な例示的なＡＡＶ、または人工的なＡＡＶとしては、とりわけＡＡＶ２／８（米国特許第７，２８２，１９９号を参照されたい）、ＡＡＶ２／５（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈから入手可能）、ＡＡＶ２／９（国際特許公開第ＷＯ２００５／０３３３２１号）、ＡＡＶ２／６（米国特許第６，１５６，３０３号）、及びＡＡＶｒｈ８（国際特許公開第ＷＯ２００３／０４２３９７号）が挙げられる。
ある特定の実施形態において、ベクターはまた、プラスミドベクターでトランスフェクションされた細胞において、または本発明により産生されたウイルスに感染した細胞において、その転写、翻訳、及び／または発現を可能にする様式で導入遺伝子と作動可能に連結される従来の制御要素を含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子に連続している発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するためにトランスに作用するか、または離れて作用する発現制御配列との両方が含まれる。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター、及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡ処理シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；及び必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列が含まれる。天然の、構成的、誘導性、及び／または組織特異的プロモーターを含む多くの発現制御配列が当分野で既知であり、利用することができる。
追加のプロモーター要素、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の上流３０～１１０ｂｐの領域に位置するが、多くのプロモーターは、開始部位の下流にも機能的要素を含有することが最近示されている。要素が互いに反転または移動した場合プロモーターの機能が維持されるように、多くの場合、プロモーター要素間の間隔は柔軟である。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいては、活性が低下し始める前に、プロモーター要素間の間隔を５０ｂｐまで増大することができる。プロモーターに応じて、個々の要素が協調的にまたは独立して機能して転写を活性化することができると思われる。
適切なプロモーターの一例は、即時初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結した任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することが可能な強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかしながら、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端リピート（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス即時初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーターなどこれらに限定されないがヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列も使用され得る。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定される必要はない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用により、その発現が所望されるときに作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができるか、または発現が所望されないときに発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクター上に見出されるエンハンサー配列はまた、そこに含まれる遺伝子の発現も調節する。典型的には、エンハンサーは、遺伝子の転写を増強するためにタンパク質因子と結合する。エンハンサーは、それが調節する遺伝子の上流または下流に位置し得る。エンハンサーは、特異的に細胞または組織型における転写を増強するために組織特異的であってもよい。一実施形態において、本発明のベクターは、ベクター内に存在する遺伝子の転写を促進するための１つ以上のエンハンサーを含む。
本発明の融合タンパク質の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、選択可能なマーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたはそれらの両方を含有し、ウイルスベクターを介してトランスフェクションまたは感染させようとする細胞集団由来の発現細胞の同定及び選別を容易にすることができる。他の態様において、選択可能なマーカーは、別個のＤＮＡ上で担持され得、同時トランスフェクション手順で使用され得る。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の両方は、適切な調節配列に隣接して、宿主細胞における発現を可能にし得る。有用な選択マーカーには、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクションされた細胞を同定するため、及び調節配列の機能性を評価するために使用される。概して、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物または組織においてに存在しないか、またはレシピエント生物または組織によって発現されない遺伝子であり、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって示されるポリペプチドをコードする。ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時間に、レポーター遺伝子の発現をアッセイする。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。適切な発現システムは周知であり、既知の技術を使用して調製し得るか、または商業的に入手し得る。概して、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’隣接領域を有する構築物は、プロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用され得る。
遺伝子を細胞に導入及び発現するための方法は、当技術分野において既知である。発現ベクターの観点で、ベクターは、当技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターを、宿主細胞に、物理的、化学的、または生物学的手段によってトランスフェクションすることができる。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクター及び／または外来性核酸を含む細胞を産生するための方法は当技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入のための例示的な方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡベクター及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、及び特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照されたい。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースシステムなどのコロイド分散システムが含まれる。インビトロ及びインビボでの送達ビヒクルとしての使用のための例示的なコロイドシステムは、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
非ウイルス送達システムが利用される場合、例示的な送達ビヒクルは、リポソームである。脂質製剤の使用は、宿主への核酸の導入（インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）のために企図される。別の態様において、核酸は、脂質と関連し得る。脂質に関連する核酸は、リポソームの水性内部に封入され、リポソームの脂質二重層内に分散され、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方に関連する連結分子を介してリポソームに結合され、リポソームに捕捉され、リポソームと複合体形成され、脂質を含有する溶液中に分散され、脂質と混合され、脂質と組み合わされ、脂質中に懸濁液として含有され、ミセルに含有されるか、またはミセルと複合体形成され、またはそれ以外で脂質と関連し得る。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中で任意の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、ミセルとして二層構造に存在し得るか、または「崩壊した」構造を有し得る。これらはまた、溶液中に単純に分散されてもよく、サイズまたは形状が均一ではない凝集体を形成する可能性もある。脂質は、天然発に生じるか、または合成の脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質には、細胞質内で天然に生じる脂肪滴だけでなく、長鎖脂肪族炭化水素ならびに、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドを含むそれらの誘導体を含有する化合物のクラスが含まれる。
使用に適切な脂質を商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから得ることができ、ジセチルリン酸塩（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から得ることができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質の貯蔵液は、約－２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりも容易に蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される様々な単一及び多層脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質二層膜及び内側水性媒体を有する小胞状構造を有することを特徴とすることができる。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。過剰な水性媒体中にリン脂質が懸濁されると自発的に形成される。脂質構成要素は、閉じた構造が形成される前に自己再配列を受け、脂質二重層の間に水及び溶解した溶質を閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５－１０）。しかしながら、通常の小胞状構造とは異なる溶液中の構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造であると推測でき、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在し得る。リポフェクトアミン－核酸複合体も企図される。
外来性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイが実施され得る。そのようなアッセイには、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）によって、または本明細書に記載のアッセイによって、特定のペプチドの存在または非存在を検出するなどの「生化学的」アッセイが含まれ、本発明の範囲に含まれる薬剤を同定する。
システム
一態様において、本発明は、対象におけるＲＮＡ転写産物の数を減少させるためのシステムを提供する。一実施形態において、システムは、１つ以上のベクターにおいて、タンパク質をコードする核酸配列であって、タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び任意選択で、ＮＬＳ、ＮＥＳ、または細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む、タンパク質をコードする核酸配列と、ｃｒＲＮＡをコードする核酸配列とを含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ＲＮＡ転写産物における標的ＲＮＡ配列に実質的にハイブリダイゼーションする。一実施形態において、Ｃａｓをコードする核酸配列及びｃｒＲＮＡをコードする核酸配列は、同じベクターにある。一実施形態において、タンパク質をコードする核酸配列及びｃｒＲＮＡをコードする核酸配列は、異なるベクターにある。
一実施形態において、タンパク質をコードする核酸配列は、（１）配列番号１～４６のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列と、（２）任意選択で、配列番号６７～８３及び４２７～１０３９のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列と、を含む。一実施形態において、タンパク質をコードする核酸配列は、（１）配列番号１～４６のうちの１つのアミノ酸をコードする核酸配列と、（２）任意選択で、配列番号６７～８３及び４２７～１０３９のうちの１つのアミノ酸をコードする核酸配列と、を含む。一実施形態において、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１５０～１７１のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１５０～１７１のうちの１つのアミノ酸をコードする核酸配列を含む。
一態様において、本発明は、対象におけるＲＮＡ転写産物を可視化するためのシステムを提供する。一実施形態において、システムは、１つ以上のベクターにおいて、融合タンパク質をコードする核酸配列であって、タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、蛍光タンパク質及び任意選択で、ＮＬＳ、ＮＥＳ、または細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む、タンパク質をコードする核酸配列と、ｃｒＲＮＡをコードする核酸配列とを含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ＲＮＡ転写産物における標的ＲＮＡ配列に実質的にハイブリダイゼーションする。一実施形態において、Ｃａｓをコードする核酸配列及びｃｒＲＮＡをコードする核酸配列は、同じベクターにある。一実施形態において、融合タンパク質をコードする核酸配列及びｃｒＲＮＡをコードする核酸配列は、異なるベクターにある。
一実施形態において、融合タンパク質をコードする核酸配列は、（１）配列番号４７～４８のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列と、（２）配列番号４９～５６のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列と、（３）任意選択で、配列番号６７～８３及び４２７～１０３９のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列と、を含む。一実施形態において、融合タンパク質をコードする核酸配列は、（１）配列番号４７～４８のうちの１つのアミノ酸をコードする核酸配列と、（２）配列番号４９～５６のうちの１つのアミノ酸をコードする核酸配列と、（３）配列番号６７～８３及び４２７～１０３９のうちの１つのアミノ酸をコードする核酸配列とを含む。一実施形態において、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号８４～１４９のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号８４～１４９のうちの１つのアミノ酸をコードする核酸配列を含む。
組成物及び製剤
一態様において、本発明は、対象におけるＲＮＡ転写産物の数を減少させるための組成物を提供する。一実施形態において、組成物は、融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳ、または細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む。一実施形態において、組成物は、ｃｒＲＮＡを含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ＲＮＡ転写産物における標的ＲＮＡ配列に実質的にハイブリダイゼーションする。一実施形態において、組成物は、ｃｒＲＮＡアレイを含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡアレイは、ＲＮＡ転写産物中の標的ＲＮＡ配列に実質的にハイブリダイゼーションする２つ以上の配列を含む。
一実施形態において、組成物は、（１）配列番号１～４６のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列と、（２）任意選択で、配列番号６７～８３及び４２７～１０３９のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列と、を含むタンパク質を含む。一実施形態において、組成物は、（１）配列番号１～４６のうちの１つのアミノ酸と、（２）任意選択で配列番号６７～８３及び４２７～１０３９のうちの１つのアミノ酸と、を含むタンパク質を含む。
一実施形態において、組成物は、配列番号１５０～１７１のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。一実施形態において、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１５０～１７１のうちの１つのアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。
一態様において、本発明は、対象におけるＲＮＡ転写産物の数を減少させるための組成物を提供する。一実施形態において、組成物は、融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、蛍光タンパク質及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳ、または細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ＲＮＡ転写産物における標的ＲＮＡ配列に実質的にハイブリダイゼーションする。一実施形態において、組成物は、ｃｒＲＮＡアレイを含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡアレイは、ＲＮＡ転写産物中の標的ＲＮＡ配列に実質的にハイブリダイゼーションする２つ以上の配列を含む。
一実施形態において、組成物は、（１）配列番号４７～４８のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列と、（２）配列番号４９～５６のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列と、（３）任意選択で、配列番号６７～８３及び４２７～１０３９のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列と、を含む融合タンパク質を含む。一実施形態において、組成物は、（１）配列番号４７～４８のうちの１つのアミノ酸と、（２）配列番号４９～５６のうちの１つのアミノ酸と、（３）配列番号６７～８３及び４２７～１０３９のうちの１つのアミノ酸と、を含む融合タンパク質を含む。
一実施形態において、組成物は、配列番号８４～１４９のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。一実施形態において、融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号８４～１４９のうちの１つのアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。
本開示はまた、本開示の方法を実施するための本開示の医薬組成物の使用を包含する。そのような医薬組成物は、対象への投与に適切な形態の本発明の少なくとも１つの調節物質（例えば、阻害剤または活性化剤）組成物またはそれらの塩からなり得るか、または医薬組成物は、本発明の少なくとも１つの調節物質（例えば、阻害剤または活性化剤）組成物またはその塩と、１つ以上の薬学的に許容される担体、１つ以上の追加の成分、もしくはこれらのいくつかの組み合わせとを含み得る。本発明の化合物は、当技術分野で周知であるように、生理学的に許容される陽イオンまたは陰イオンと組み合わせるなど、生理学的に許容される塩の形態で医薬組成物中に存在し得る。
一実施形態において、本発明の方法を実施するのに有用な医薬組成物は、１ｎｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を送達するように投与され得る。別の実施形態において、本発明を実施するのに有用な医薬組成物は、１ｎｇ／ｋｇ／日～５００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を送達するように投与され得る。
本発明の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体、及び任意の追加の成分の相対的な量は、治療される対象の同一性、サイズ、及び状態に応じて、かつさらに組成物を投与する経路に応じて変化する。例示として、組成物は、０．１％～１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
本発明の方法に有用な医薬組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻腔内、口腔、眼科、または別の投与経路のために適切に開発され得る。本発明の方法内で有用な組成物は、哺乳動物の皮膚または任意の他の組織に直接投与され得る。他の企図される製剤としては、リポソーム調製物、活性成分を含有する再封入赤血球、及び免疫学的に基づく製剤が挙げられる。投与経路（複数可）は、当業者にとって容易に明らかであり、治療される疾患の種類及び重症度、治療される獣医またはヒト対象の種類及び年齢などを含む任意の数の要因に依存する。
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で知られている、または今後開発される任意の方法によって調製され得る。概して、このような調製方法は、活性成分を担体または１つ以上の他の副成分と会合させるステップ、次いで、必要または望ましい場合、産物を所望の単回または複数回投与単位に成形またはパッケージングするステップを含む。
本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、概して、対象に投与される活性成分の投薬量、またはそのような投薬量の便利な画分、例えば、そのような投薬量の２分の１もしくは３分の１に等しい。単位剤形は、単回の１日の用量または複数回の１日の用量（例えば、１日当たり約１～４回以上）のうちの１つであってもよい。複数回の１日用量を使用する場合、単位剤形は、各用量について同一であっても異なっていてもよい。
一実施形態において、本発明の組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を使用して製剤化される。一実施形態において、本発明の医薬組成物は、治療有効量の本発明の化合物またはコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む。有用な薬学的に許容される担体には、グリセロール、水、生理食塩水、エタノール、ならびに、リン酸塩及び有機酸の塩などの他の薬学的に許容される塩溶液が含まれるがこれらに限定されない。これら及び他の薬学的に許容される担体の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９１，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）に記載されている。
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒サイズを維持することによって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌剤及び抗真菌剤によって達成され得る。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、塩化ナトリウム、またはマンニトール及びソルビトールなどの多価アルコールが組成物中に含まれる。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを含めることによってもたらされ得る。一実施形態において、薬学的に許容される担体は、ＤＭＳＯ単独ではない。
製剤は、従来の賦形剤、すなわち、経口、膣、非経口、経鼻、静脈、皮下、経腸、または当技術分野に既知の任意の他の適切な投与方法に適切な薬学的に許容される有機または無機担体物質との混合物中で用いられ得る。医薬製剤は、滅菌され得、所望される場合、補助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧緩衝液に影響を与えるための塩、着色剤、香味剤及び／または芳香物質などと混合され得る。これらはまた、所望される場合に、他の活性剤、例えば、他の鎮痛剤と組み合わせてもよい。
本明細書で使用される場合、「追加の成分」には、以下のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。賦形剤、表面活性剤、分散剤、不活性希釈剤、造粒剤及び崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤、防腐剤、ゼラチンなどの生理学的に分解可能な組成物、水性ビヒクル及び溶媒、油性ビヒクル及び溶媒、懸濁剤、分散剤または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、緩衝剤、塩、増粘剤、充填剤、乳化剤、抗酸化剤、抗生物質、抗真菌剤、安定剤、ならびに薬学的に許容されるポリマーまたは疎水性材料。本発明の医薬組成物に含まれ得る他の「追加の成分」は、当技術分野で既知であり、例えば、Ｇｅｎａｒｏ，ｅｄ．（１９８５，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に記載されており、それは参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の組成物は、組成物の総重量に対して約０．００５重量％～２．０重量％の防腐剤を含み得る。防腐剤は、環境中の汚染物質に曝露した場合に腐敗を予防するために使用される。本発明に従って有用な防腐剤の例としては、ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミド尿素、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な防腐剤は、約０．５％～２．０％のベンジルアルコール及び０．０５％～０．５％のソルビン酸の組み合わせである。
一実施形態において、組成物は、抗酸化剤及び化合物の分解を阻害するキレート剤を含む。いくつかの化合物の例示的な抗酸化剤は、組成物の総重量に対して約０．０１重量％～０．３重量％の範囲のＢＨＴ、ＢＨＡ、α－トコフェロール及びアスコルビン酸、ならびに０．０３重量％～０．１重量％の範囲のＢＨＴである。一実施形態において、キレート剤は、組成物の総重量に対して０．０１重量％～０．５重量％で存在する。例示的なキレート剤としては、約０．０１％～０．２０％の重量範囲のエデト酸塩（例えば、エデト酸二ナトリウム）及びクエン酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、キレート剤は、組成物の総重量に対して０．０２重量％～０．１０重量％の範囲である。キレート剤は、製剤の貯蔵寿命に有害であり得る組成物中の金属イオンをキレートするのに有用である。ＢＨＴ及びエデト酸二ナトリウムは、それぞれいくつかの化合物のための例示的な抗酸化剤及びキレート剤であるが、したがって、他の適切かつ等価な抗酸化剤及びキレート剤が、当業者に既知であろうように、置換されてもよい。
液体懸濁液は、水性または油性ビヒクル中の活性成分の懸濁を達成するために従来の方法を使用して調製され得る。水性ビヒクルには、例えば、水、及び等張生理食塩水が含まれる。油性ビヒクルには、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、落花生、オリーブ、ゴマ、またはココナッツ油などの植物油、分画された植物油、及び液体パラフィンなどの鉱物油が含まれる。液体懸濁液は、懸濁剤、分散剤または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、防腐剤、緩衝剤、塩、香料、着色剤、及び甘味剤を含むがこれらに限定されない１つ以上の追加の成分をさらに含み得る。油性懸濁液は、増粘剤をさらに含み得る。既知の懸濁剤には、ソルビトールシロップ、水素化食用脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アカシアガム、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体が含まれるが、これらに限定されない。既知の分散剤または湿潤剤としては、レシチンなどの天然に生じるリン脂質、アルキレンオキシドと、脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステル、または脂肪酸及びヘキシトール無水物に由来する部分エステル（例えば、それぞれ、ポリオキシエチレンステアラート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）との縮合産物が含まれるが、これらに限定されない。既知の乳化剤には、レシチン、及びアカシアが含まれるが、これらに限定されない。既知の防腐剤には、メチルパラヒドロキシ安息香酸塩、エチルパラヒドロキシ安息香酸塩、またはｎ－プロピルパラヒドロキシ安息香酸塩、アスコルビン酸、及びソルビン酸が含まれるが、これらに限定されない。既知の甘味剤には、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース、及びサッカリンが含まれる。油性懸濁液のための既知の増粘剤には、例えば、蜜蝋、硬質パラフィン、及びセチルアルコールが含まれる。
水性または油性溶媒中の活性成分の液体溶液は、液体懸濁液と実質的に同じ方法で調製することができ、主要な違いは、活性成分が溶媒中に懸濁されるのではなく溶解されることである。本明細書で使用される場合、「油性」液体は、炭素含有液体分子を含み、水よりも極性の低い性質を示す液体である。本発明の医薬組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して記載されている成分の各々を含み得るが、懸濁剤は必ずしも活性成分の溶媒中への溶解を助けるものではないことを理解されたい。水性溶媒には、例えば、水、及び等張生理食塩水が含まれる。油性溶媒には、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、落花生、オリーブ、ゴマ、またはココナッツ油などの植物油、分画された植物油、及び液体パラフィンなどの鉱物油が含まれる。
本発明の医薬製剤の粉末製剤及び顆粒製剤は、既知の方法を使用して調製され得る。そのような製剤は、対象に直接投与され得、例えば、錠剤を形成するために、カプセルを充填するために、または水性もしくは油性ビヒクルを添加することによって水性もしくは油性懸濁液もしくは溶液を調製するために使用され得る。これらの製剤の各々は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、及び防腐剤のうちの１つ以上をさらに含み得る。充填剤及び甘味剤、香味剤、または着色剤などの追加の賦形剤もまた、これらの製剤に含まれ得る。
本発明の医薬組成物はまた、水中油型エマルションまたは油中水型エマルションの形態で調製、パッケージング、または販売され得る。油性相は、オリーブ油もしくは落花生油などの植物油、液体パラフィンなどの鉱物油、またはそれらの組み合わせであり得る。そのような組成物は、アカシアガムまたはトラガカントガムなどの天然に生じるガム、大豆またはレシチンホスファチドなどの天然に生じるホスファチド、ソルビタンモノオレアートなどの脂肪酸及びヘキシトール無水物の組み合わせに由来するエステルまたは部分エステル、ならびにそのような部分エステルとポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートなどのエチレンオキシドとの縮合生成物などの１つ以上の乳化剤をさらに含み得る。これらのエマルションはまた、例えば、甘味剤または香味剤を含む追加の成分を含有し得る。
材料に化学組成物を含浸またはコーティングするための方法は、当技術分野において既知であり、化学組成物を表面上に堆積または結合する方法、材料の合成中に（すなわち、生理学的に分解可能な材料で）材料の構造に化学組成物を組み込む方法、及びその後の乾燥の有無にかかわらず、吸収性材料に水性または油性溶液または懸濁液を吸収する方法を含むが、これらに限定されない。
投与のレジメンは、有効量を構成するものに影響を与える可能性がある。治療製剤は、疾患の診断の前または後のいずれかで対象に投与されてもよい。さらに、いくつかの分割された投薬量、及び互い違いの投与量は、毎日または連続して投与され得るか、または用量は連続的に注入され得るか、またはボーラス注射であり得る。さらに、治療製剤の投与量は、治療的または予防的状況の緊急性によって示されるように、比例して増加または減少させ得る。
哺乳動物、例えば、ヒトを含む対象に本発明の組成物を投与することは、既知の手順を使用して、疾患を予防または治療するのに有効な投薬量及び期間で実施され得る。治療効果を達成するために必要な治療化合物の有効量は、採用される特定の化合物の活性；投与時間；化合物の排泄速度；治療期間；化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、または材料；治療される対象の疾患または障害の状態、年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態、及び以前の病歴、ならびに医学分野で周知の同様の因子などの要因に応じて変化し得る。投薬量レジメンは、最適治療応答を提供するように調整され得る。例えば、いくつかの分割用量が毎日投与され得るか、または用量は、治療状況の緊急性によって示されるように比例的に低減し得る。本発明の治療化合物の有効用量範囲の非限定的な例は、約１～５，０００ｍｇ／ｋｇの体重／日である。当業者であれば、過度の実験をすることなく、関連する因子を研究し、治療化合物の有効量に関する決定を下すことができるであろう。
化合物は、対象に、１日に数回程度の頻度で投与されてもよく、または、１日１回、週１回、２週間に１回、１ヶ月に１回などのより少ない頻度で、または、数ヶ月に１回、もしくは１年に１回もしくはそれ以下のさらに少ない頻度で与されてもよい。１日当たりの化合物投与量は、非限定的な例では、毎日、隔日、２日毎、３日毎、４日毎、または５日毎に投与され得ることが理解される。例えば、隔日の投与では、１日当たり５ｍｇの用量は、月曜日に開始して、第１の後続の１日当たり５ｍｇの用量は水曜日に投与され、第２の後続の１日当たり５ｍｇの用量は金曜日に投与されるなどであり得る。用量の頻度は、当業者には容易に明らかであり、治療される疾患の種類及び重症度、動物の種類及び年齢などであるがこれらに限定されない任意の数の因子に依存するであろう。
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、対象に対して毒性を有さずに、特定の対象、組成物、及び投与様式に対する所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るように変えられ得る。
当技術分野の通常の技術を有する医師、例えば、医師または獣医は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定及び処方することができる。例えば、医師または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで医薬組成物に採用される本発明の化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることができる。
特定の実施形態において、投与の容易さ、及び投薬量の均一性のために、単位剤形に化合物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療される対象のため単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な薬学的ビヒクルと関連して所望の治療効果を産生するように計算された所定の量の治療化合物を含有する。本発明の単位剤形は、（ａ）達成されるべき治療化合物及び特定の治療効果の特有の特徴、ならびに（ｂ）対象における疾患の治療のためにそのような治療化合物を調合／製剤化する技術分野に固有の制限によって左右され、かつそれらに直接依存する。
一実施形態において、本発明の組成物は、１日当たり１回～５回以上の範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、毎日１回、２日に１回、３日に１回から週１回、及び２週間に１回を含むがこれらに限定されない範囲の投薬量で対象に投与される。本発明の様々な併用組成物の投与頻度は、年齢、治療される疾患または障害、性別、全体的な健康、及び他の要因を含むがこれらに限定されない多くの要因に応じて対象毎によって異なることは、当業者にとって容易に明らかであろう。したがって、本発明は、任意の特定の投与レジメンに限定されると解釈されるべきではなく、任意の対象に投与される正確な投薬量及び組成物は、対象についてのすべての他の要因を考慮に入れて、主治医によって決定される。
投与のための本発明の化合物は、約１ｍｇ～約１０，０００ｍｇ、約２０ｍｇ～約９，５００ｍｇ、約４０ｍｇ～約９，０００ｍｇ、約７５ｍｇ～約８，５００ｍｇ、約１５０ｍｇ～約７，５００ｍｇ、約２００ｍｇ～約７，０００ｍｇ、約３０５０ｍｇ～約６，０００ｍｇ、約５００ｍｇ～約５，０００ｍｇ、約７５０ｍｇ～約４，０００ｍｇ、約１ｍｇ～約３，０００ｍｇ、約１０ｍｇ～約２，５００ｍｇ、約２０ｍｇ～約２，０００ｍｇ、約２５ｍｇ～約１，５００ｍｇ、約５０ｍｇ～約１，０００ｍｇ、約７５ｍｇ～約９００ｍｇ、約１００ｍｇ～約８００ｍｇ、約２５０ｍｇ～約７５０ｍｇ、約３００ｍｇ～約６００ｍｇ、約４００ｍｇ～約５００ｍｇ、及びそれらの間の任意の全体的または部分的な増分の範囲であり得る。
いくつかの実施形態において、本発明の化合物の用量は、約１ｍｇ～約２，５００ｍｇである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物において使用される本発明の化合物の用量は、約１０，０００ｍｇ未満、または約８，０００ｍｇ未満、または約６，０００ｍｇ未満、または約５，０００ｍｇ未満、または約３，０００ｍｇ未満、または約２，０００ｍｇ未満、または約１，０００ｍｇ未満、または約５００ｍｇ未満、または約２００ｍｇ未満、または約５０ｍｇ未満である。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の第２の化合物（すなわち、本発明の組成物によって治療されるものと同じまたは別の疾患を治療するために使用される薬物）の用量は、約１，０００ｍｇ未満、または約８００ｍｇ未満、または約６００ｍｇ未満、または約５００ｍｇ未満、または約４００ｍｇ未満、または約３００ｍｇ未満、または約２００ｍｇ未満、または約１００ｍｇ未満、または約５０ｍｇ未満、または約４０ｍｇ未満、または約３０ｍｇ未満、または約２５ｍｇ未満、または約２０ｍｇ未満、または約１５ｍｇ未満、または約１０ｍｇ未満、または約５ｍｇ未満、または約２ｍｇ未満、または約１ｍｇ未満、または約０．５ｍｇ未満、ならびにそれらの任意の全体または部分的な増分である。
一実施形態において、本発明は、治療有効量の本発明の化合物またはコンジュゲートを単独でまたは第２の薬剤と組み合わせて保持する容器と、対象における疾患の１つ以上の症状を治療、予防、または低減するために化合物またはコンジュゲートを使用するための説明書とを含むパッケージングされた医薬組成物に関する。
「容器」という用語は、医薬組成物を保持するための任意の容器を含む。例えば、一実施形態において、容器は、医薬組成物を含むパッケージングである。他の実施形態において、容器は、医薬組成物を含有するパッケージングではなく、すなわち、容器は、パッケージングされた医薬組成物またはパッケージングされていない医薬組成物及び医薬組成物の使用のための説明書を含有する箱またはバイアルなどの容器である。さらに、パッケージング技術は当技術分野において周知である。医薬組成物の使用のための説明書は、医薬組成物を含有するパッケージングに含まれ得、したがって、説明書は、パッケージングされた産物との機能的関係の増加を形成することを理解されたい。しかしながら、説明書は、例えば、対象において疾患を治療または予防すること、または造影剤もしくは診断剤を対象に送達することなど、その意図された機能を実施する化合物の能力に関する情報を含んでもよいことを理解する必要がある。
本発明の組成物のいずれかの投与経路には、経口、経鼻、非経口、舌下、経皮、経粘膜（例えば、舌下、舌、（経）頬、及び（径）鼻）、膀胱内、十二指腸内、胃内、直腸、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、または投与が含まれる。
適切な組成物及び剤形には、例えば、錠剤、カプセル剤、カプレット剤、丸剤、ゲルキャップ剤、トローチ剤、分散剤、懸濁剤、溶液剤、シロップ剤、顆粒剤、ビーズ剤、経皮パッチ剤、ゲル剤、粉末剤、ペレット剤、マグマ剤、ロゼンジ剤、クリーム剤、ペースト剤、石膏剤、ローション剤、ディスク剤、坐剤、経鼻投与または経口投与用の液体スプレー剤、吸入用の乾燥粉末剤またはエアロゾル化製剤、膀胱内投与用の組成物及び製剤などが含まれる。本発明において有用であろう製剤及び組成物は、本明細書に記載の特定の製剤及び組成物に限定されないことを理解される必要がある。
ＲＮＡを診断及び可視化する方法
一態様において、本開示は、対象においてＲＮＡを可視化する方法を提供する。例えば、一実施形態において、方法は、対象において核ＲＮＡを可視化する方法を提供する。一実施形態において、核ＲＮＡは、異常な核ＲＮＡである。一実施形態において、方法は、対象において細胞質ＲＮＡを可視化する方法を提供する。一実施形態において、方法は、対象において細胞小器官局在化ＲＮＡを可視化する方法を提供する。例えば、一実施形態において、方法は、核小体、リボソーム、小胞、粗面小胞体、ゴルジ装置、細胞骨格、滑面小胞体、ミトコンドリア、液胞、細胞質、リソソーム、または中心小体に局在化するＲＮＡの視覚化を提供する。一実施形態において、方法は、細胞膜関連ＲＮＡの視覚化を提供する。一実施形態において、方法は、細胞外ＲＮＡの減少の視覚化を提供する。
一実施形態において、方法は、（Ａ）対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、蛍光タンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子、またはＣａｓタンパク質、蛍光タンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示の融合タンパク質と、（２）ＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイをコードする核酸分子、またはＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイと、を投与することと、（Ｂ）核ＲＮＡを可視化することと、を含む。
一実施形態において、方法は、（Ａ）（１）Ｃａｓタンパク質、蛍光タンパク質、及び任意選択で局在化配列を含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子と、（２）ＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイ、またはＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイをコードする核酸分子と、を投与することと、（Ｂ）核ＲＮＡを可視化することと、を含む。
一実施形態において、本方法は、（Ａ）（１）Ｃａｓタンパク質、蛍光タンパク質、及び任意選択で局在化配列を含む本開示のタンパク質と、（２）ＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイ、またはＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイをコードする核酸分子と、を投与することと、（Ｂ）核ＲＮＡを可視化することと、を含む。
一実施形態において、対象は、細胞である。一実施形態において、細胞は、原核細胞または真核細胞である。一実施形態において、細胞は、真核細胞である。一実施形態において、細胞は、植物、動物、または真菌細胞である。一実施形態において、細胞は、植物細胞である。一実施形態において、細胞は、動物細胞である。一実施形態において、細胞は、酵母細胞である。
一実施形態において、対象は、哺乳動物である。例えば、一実施形態において、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、ラット、またはマウスである。一実施形態において、対象は、非哺乳動物対象である。例えば、一実施形態において、対象は、ゼブラフィッシュ、ミハエ、または回虫である。
一実施形態において、ＲＮＡは、インビトロで可視化される。一実施形態において、ＲＮＡは、インビボで可視化される。一実施形態において、ＲＮＡは、核ＲＮＡ病巣である。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ヒト筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＣＴＧリピート拡張に相補的な配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３４８～３５４のうちの１つの配列を含む。
一実施形態において、本発明は、異常なＲＮＡに関連する疾患または障害を診断する方法を提供する。一実施形態において、異常なＲＮＡは、核ＲＮＡである。一実施形態において、異常なＲＮＡは、核内ＲＮＡ病巣である。一実施形態において、異常なＲＮＡは、細胞質ＲＮＡである。一実施形態において、異常なＲＮＡは、細胞小器官局在化ＲＮＡである。例えば、一実施形態において、異常なＲＮＡは、核小体、リボソーム、小胞、粗面小胞体、ゴルジ装置、細胞骨格、滑面小胞体、ミトコンドリア、液胞、細胞質、リソソーム、または中心小体に局在化する。一実施形態において、異常なＲＮＡは、細胞膜関連ＲＮＡである。一実施形態において、異常なＲＮＡは、細胞外ＲＮＡである。
一実施形態において、方法は、（Ａ）対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、蛍光タンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子、またはＣａｓタンパク質、蛍光タンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示の融合タンパク質と、（２）異常なＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイをコードする核酸分子、または異常なＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイと、を投与することと、（Ｂ）核ＲＮＡを可視化することと、（Ｃ）異常なＲＮＡが存在する場合の疾患または障害を診断することと、を含む。
一実施形態において、方法は、（Ａ）対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、蛍光タンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子と、（２）異常なＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイをコードする核酸分子、または異常なＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイと、を投与することと、（Ｂ）核ＲＮＡを可視化することと、（Ｃ）異常なＲＮＡが存在する場合の疾患または障害を診断することと、を含む。
一実施形態において、方法は、Ａ）対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、蛍光タンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質と、（２）異常なＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイをコードする核酸分子、または異常なＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイと、を投与することと、（Ｂ）核ＲＮＡを可視化することと、（Ｃ）異常なＲＮＡが存在する場合の疾患または障害を診断することと、を含む。
一実施形態において、対象は、細胞である。一実施形態において、細胞は、原核細胞または真核細胞である。一実施形態において、細胞は、真核細胞である。一実施形態において、細胞は、植物、動物、または真菌細胞である。一実施形態において、細胞は、植物細胞である。一実施形態において、細胞は、動物細胞である。一実施形態において、細胞は、酵母細胞である。
一実施形態において、対象は、哺乳動物である。例えば、一実施形態において、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、ラット、またはマウスである。一実施形態において、対象は、非哺乳動物対象である。例えば、一実施形態において、対象は、ゼブラフィッシュ、ミハエ、または回虫である。
ＲＮＡを減少させる方法及び治療方法
一態様において、本開示は、対象においてＲＮＡの数を減少させる方法を提供する。例えば、一実施形態において、方法は、対象において核ＲＮＡの数を減少させる。一実施形態において、核ＲＮＡは、異常な核ＲＮＡである。一実施形態において、方法は、対象において細胞質ＲＮＡの数を減少させる。一実施形態において、方法は、対象において細胞小器官局在化ＲＮＡの数を減少させる。例えば、一実施形態において、方法は、核小体、リボソーム、小胞、粗面小胞体、ゴルジ装置、細胞骨格、滑面小胞体、ミトコンドリア、液胞、細胞質、リソソーム、または中心小体に局在化するＲＮＡを減少させる。一実施形態において、方法は、細胞膜関連ＲＮＡを減少させる。一実施形態において、方法は、細胞外ＲＮＡを減少させる。
一実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子、またはＣａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示の融合タンパク質と、（２）ＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイをコードする核酸分子、またはＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイと、を投与することを含む。
一実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子と、（２）ＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイをコードする核酸分子、またはＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイと、を投与することを含む。
一実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示の融合タンパク質と、（２）ＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイをコードする核酸分子、またはＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡアレイと、を投与することを含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡは細胞質性である。そのような実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質を含む本開示のタンパク質、またはＣａｓタンパク質を含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子と、（２）標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡをコードする核酸分子、または標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡと、を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡは細胞質性である。そのような実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質及びＮＥＳを含む本開示のタンパク質、またはＣａｓタンパク質及びＮＥＳを含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子と、（２）標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡをコードする核酸分子、または標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡと、を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、核性である。そのような実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質及びＮＬＳを含む本開示のタンパク質、またはＣａｓタンパク質及びＮＬＳを含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子と、（２）標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡをコードする核酸分子、または標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡと、を対象に投与することを含む。
一実施形態において、対象は、細胞である。一実施形態において、細胞は、原核細胞または真核細胞である。一実施形態において、細胞は、真核細胞である。一実施形態において、細胞は、植物、動物、または真菌細胞である。一実施形態において、細胞は、植物細胞である。一実施形態において、細胞は、動物細胞である。一実施形態において、細胞は、酵母細胞である。
一実施形態において、対象は、哺乳動物である。例えば、一実施形態において、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、ラット、またはマウスである。一実施形態において、対象は、非哺乳動物対象である。例えば、一実施形態において、対象は、ゼブラフィッシュ、ミハエ、または回虫である。
一実施形態において、核ＲＮＡの量は、インビトロで低減される。一実施形態において、核ＲＮＡの量は、インビボで低減される。
一実施形態において、核ＲＮＡは、核ＲＮＡ病巣である。一実施形態において、核ＲＮＡ病巣は、ＣＵＧリピートを含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ＣＵＧリピート拡張に相補的な配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ＣＴＧリピート拡張に相補的な配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ヒト筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＣＴＧリピート拡張に相補的な配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３４８～３５４のうちの１つの配列を含む。
一態様において、本発明は、異常なＲＮＡに関連する疾患または障害を有する対象を治療する方法を提供する。一実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子、またはＣａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質と、（２）核ＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡをコードする核酸分子、または核ＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ分子と、を投与することを含む。
一実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子と、（２）核ＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡをコードする核酸分子、または核ＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ分子と、を投与することを含む。
一実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質と、（２）核ＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡをコードする核酸分子、または核ＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ分子と、を投与することを含む。
一実施形態において、異常な核ＲＮＡに関連する疾患または障害は、筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病様２（ＨＤＬ２）、脊髄小脳失調症８、３１及び１０（ＳＣＡ８、ＳＣＡ３１、ＳＣＡ１０）、ならびに脆弱Ｘ関連振戦失調症候群（ＦＸＴＡＳ）からなる群から選択される。
一実施形態において、異常な核ＲＮＡは、毒性核ＲＮＡ病巣である。１つの実施形態において、疾患または障害は、毒性核ＲＮＡ病巣筋緊張性ジストロフィー１型に関連する。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ヒト筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’ＵＴＲにおけるＣＴＧリピート拡張に相補的な配列を含む。一実施形態において、ｃｒＲＮＡは、配列番号３４８～３５４からなる群から選択される配列を含む。
一態様において、本発明は、対象において標的ＲＮＡの切断する方法を提供する。一実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子、またはＣａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質と、（２）標的ＲＮＡにおけるＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡをコードする核酸分子、または標的ＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ分子と、を投与することを含む。
一実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子と、（２）標的ＲＮＡにおけるＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡをコードする核酸分子、または標的ＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ分子と、を投与することを含む。
一実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質と、（２）標的ＲＮＡにおけるＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡをコードする核酸分子、または標的ＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ分子と、を投与することを含む。
一態様において、本発明は、増加した遺伝子発現に関連する疾患または障害を治療する方法を提供する。一実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子、またはＣａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質と、（２）遺伝子のＲＮＡ転写産物におけるＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡをコードする核酸分子、または遺伝子のＲＮＡ転写産物における標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ分子と、を投与することを含む。
一実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子と、（２）遺伝子のＲＮＡ転写産物におけるＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡをコードする核酸分子、または遺伝子のＲＮＡ転写産物における標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ分子と、を投与することを含む。
一実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質と、（２）遺伝子のＲＮＡ転写産物におけるＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡをコードする核酸分子、または遺伝子のＲＮＡ転写産物における標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ分子と、を投与することを含む。
一態様において、本発明は、ＲＮＡに関連する疾患または障害を治療する方法を提供する。例えば、一実施形態において、本発明は、ＲＮＡウイルス感染症を治療する方法を提供する。一実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子、またはＣａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質と、（２）ウイルスＲＮＡにおけるＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡをコードする核酸分子、またはウイルスＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ分子と、を投与することを含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質はｃｒＲＮＡに結合し、ｃｒＲＮＡは標的ＲＮＡ配列に結合し、ＣａｓはＲＮＡ配列を切断し、それによってウイルスタンパク質の翻訳及び発現を予防する。
一実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質をコードする核酸分子と、（２）ウイルスＲＮＡにおけるＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡをコードする核酸分子、またはウイルスＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ分子と、を投与することを含む。
一実施形態において、方法は、対象に、（１）Ｃａｓタンパク質、及び任意選択でＮＬＳ、ＮＥＳもしくは細胞小器官局在化シグナルなどの局在化配列を含む本開示のタンパク質と、（２）ウイルスＲＮＡにおけるＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡをコードする核酸分子、またはウイルスＲＮＡにおける標的ＲＮＡ配列に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡ分子と、を投与することを含む。
治療方法及び使用方法
本発明は、対象において疾患もしくは障害を治療し、疾患もしくは障害の症状を低減し、及び／または疾患もしくは障害を発症するリスクを低減する方法を提供する。例えば、一実施形態において、本発明の方法は、哺乳動物において疾患もしくは障害を治療し、疾患もしくは障害の症状を低減し、及び／または疾患もしくは障害を発症するリスクを低減する。一実施形態において、本発明の方法は、植物において疾患もしくは障害を治療し、疾患もしくは障害の症状を低減し、及び／または疾患もしくは障害を発症するリスクを低減する。一実施形態において、本発明の方法は、酵母菌において疾患もしくは障害を治療し、疾患もしくは障害の症状を低減し、及び／または疾患もしくは障害を発症するリスクを低減する。
一実施形態において、対象は、細胞である。一実施形態において、細胞は、原核細胞または真核細胞である。一実施形態において、細胞は、真核細胞である。一実施形態において、細胞は、植物、動物、または真菌細胞である。一実施形態において、細胞は、植物細胞である。一実施形態において、細胞は、動物細胞である。一実施形態において、細胞は、酵母細胞である。
一実施形態において、対象は、哺乳動物である。例えば、一実施形態において、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、ラット、またはマウスである。一実施形態において、対象は、非哺乳動物対象である。例えば、一実施形態において、対象は、ゼブラフィッシュ、ミハエ、または回虫である。
一実施形態において、疾患または障害は、遺伝子座における１つ以上の変異によって引き起こされる。したがって、一実施形態において、疾患または障害は、ｍＲＮＡ転写産物を予防または低減するか、またはタンパク質の翻訳を予防または低減する要素を介して、治療され、低減され得るか、またはリスクを低減され得る。したがって、一実施形態において、方法は、ＲＮＡ転写産物の操作を含む。
一実施形態において、疾患または障害は、異常なＲＮＡによって引き起こされる。したがって、一実施形態において、疾患または障害は、ＲＮＡ転写産物を予防または低減する要素を介して、治療され、低減され得るか、またはリスクを低減され得る。したがって、一実施形態において、方法は、ＲＮＡ転写産物の操作を含む。
一実施形態において、方法は、対象に、（１）本開示のタンパク質または本開示のタンパク質をコードする核酸分子と、（２）遺伝子における標的領域に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含む１つ以上のｃｒＲＮＡと、を投与することを含み、遺伝子はＲＮＡ転写産物をコードする。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ転写産物を切断する。一実施形態において、方法は、対象に、（１）本開示のタンパク質または本開示のタンパク質をコードする核酸分子と、（２）ＲＮＡ転写産物における標的領域に相補的な配列を含む１つ以上のｃｒＲＮＡと、を投与することを含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ転写産物を切断する。
一実施形態において、疾患または障害は、異常なＲＮＡまたはＲＮＡ転写の増加に関連する。例えば、一実施形態において、疾患または障害は、内分泌疾患である。例えば、一実施形態において、内分泌疾患には、βサラセミア、新生児糖尿病、ＩＰＥＸ症候群、Ｍａｙｅｒ－Ｒｏｋｉｔａｎｓｋｉ－Ｋｕｓｔｅｒ－Ｈａｕｓｅｒ症候群、視床下部－下垂体－副腎軸調節障害、副腎機能障害、性腺機能障害、異所性クッシング症候群、子癇前症、糖尿病性腎症、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、及びＩＧＦ－１欠損症が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、疾患または障害は、腫瘍形成疾患である。例えば、一実施形態において、腫瘍形成疾患には、マントル細胞リンパ腫、遺伝性及び散在性副甲状腺腫瘍、髄様甲状腺癌、増殖性状態、結腸直腸癌、神経膠芽腫、慢性リンパ性白血病、及び乳癌が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、疾患または障害は、神経学的疾患または障害である。例えば、一実施形態において、神経学的疾患には、パーキンソン病、眼咽頭筋ジストロフィー、ハンチントン病、ファブリー病、脆弱Ｘ症候群、脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳失調症、髄小脳失調症１、脊髄小脳失調症２、脊髄小脳失調症３、脊髄小脳失調症６、脊髄小脳失調症７、脊髄小脳失調症８、脊髄小脳失調症１０、脊髄小脳失調症１７、脊髄小脳失調症３１、及びアルツハイマー病が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、疾患または障害は、血液学的疾患または障害である。例えば、一実施形態において、血液学的疾患には、βサラセミア、及びαサラセミアが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、疾患または障害は、感染症または免疫学的疾患もしくは障害である。例えば、一実施形態において、感染症または免疫学的疾患には、Ｂ細胞分化、Ｔ細胞活性化、全身性エリテマトーデス、Ｗｉｓｋｏｔｔ－Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、変形性関節症、強皮症、及びＩＰＥＸ症候群が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、疾患または障害は、筋骨格系疾患または障害である。例えば、一実施形態において、感染症または免疫学的疾患は、筋緊張性ジストロフィー１型、球脊髄性筋萎縮症、及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症を含む。
例示的な疾患または障害ならびに対応する標的としては、表１に列挙されるものが挙げられるが、これらに限定されない。追加の疾患及び障害ならびに対応する遺伝子は、当技術分野において、例えば、Ｒｅｈｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｆｒｏｎｔ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４：５３（２０１３）、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．３２：４１３－４２１（２０１７）、及びＣｕｒｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｕｓ ５：５０８－５１９（２０１４）において既知であり、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Figure 2022544015000002
Figure 2022544015000003
一実施形態において、疾患または障害は、ウイルス感染症である。したがって、一実施形態において、疾患または障害は、ウイルスｍＲＮＡ転写産物を予防または低減するか、またはウイルスタンパク質の翻訳を予防または低減する要素を介して、治療され、低減され得るか、またはリスクを低減され得る。したがって、一実施形態において、方法は、ウイルスＲＮＡ転写産物の操作を含む。
一実施形態において、方法は、対象に、（１）本開示のタンパク質または本開示のタンパク質をコードする核酸分子と、（２）ＲＮＡ転写産物に相補的なヌクレオチド配列を含む１つ以上のｃｒＲＮＡと、を投与することを含む。一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ウイルスＲＮＡ転写産物を切断する。
一実施形態において、ウイルスは、ＲＮＡウイルスである。一実施形態において、ウイルスは、そのライフサイクル中にＲＮＡを産生する。一実施形態において、ウイルスは、ヒトウイルス、植物ウイルス、または動物ウイルスである。例示的なウイルスとしては、アデノウイルス科、アデノウイルス科、アルファフレキシウイルス科、アネロウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス科、アスファルウイルス科、アストロウイルス科、ベニウイルス科、ベタフレキシウイルス科、ビルナウイルス科、ボルナウイルス科、ブロモウイルス科、カリシウイルス科、カウリモウイルス科、サーコウイルス科、クロステロウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ジェミニウイルス科、ハンタウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘペウイルス科、ヘルペスウイルス科、キタウイルス科、ルテオウイルス科、ナイロウイルス科、ナノウイルス科、ニミウイルス科、オルトミウイルス科、パラミクソウイルス科、フェヌイウイルス科、ピコルナウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポスピウイルス科、ポティウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、レトロウイルス、ラブドウイルス科、セコウイルス科、トガウイルス科、トンブスウイルス科、トスポウイルス科、ティモウイルス科、及びビルガウイルス科のウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、例示的なウイルスとしては、アフリカブタ熱、トリＥ型肝炎、トリ伝染性喉頭気管炎、トリ腎炎ウイルス、竹モザイクウイルス、バナナバンチートップウイルス、ムギ斑葉モザイクウイルス、オオムギ黄化萎縮ウイルス、ジャガイモ葉巻きウイルス、ボルナ病、ブロムモザイクウイルス、コムギ、カリフラワーモザイクウイルス、チクングニア熱、東部ウマ脳炎ウイルス、シトラスレプロシス（Ｃｉｔｒｕｓ ｌｅｐｒｏｓｉｓ）、柑橘突然死関連ウイルス、柑橘トリステザウィルス、ココナッツカダンカダンウイロイド、カーリートップウイルス、アフリカキャッサバモザイクウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、デング熱、黄熱病、ウエストナイル、ジカ、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、ブタ繁殖及び呼吸障害症候群ウイルス、ウマ伝染性貧血、口蹄疫、口蹄疫、エンテロウイルス、ライノウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（家禽）、伝染性膵臓壊死症（サーモン）、伝染性イヌ肝炎、家禽のアビアデノウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、サル痘、ナイロビヒツジ病、ニューカッスル病ウイルス（家禽）、ノーウォークウイルス、ジャガイモウイルスＹを含む作物に害を及ぼすウイルスの多数の例、ブタサーコウイルス２、くちばし及び羽毛病ウイルス（家禽）、ジャガイモウイルスＭ、狂犬病ウイルス、呼吸器及び腸内アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、イネ縞葉壊死ウイルス、リフトバレー熱、ロタウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ、羊痘ウイルス、ランピースキン病ウイルス、シンノンブレウイルス、アンデスウイルス、ＳＶ４０、タバコ輪斑ウイルス、トマトブッシースタントウイルス、トマト黄化壊疽ウイルス、トルクテノウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、ウイルス性出血性敗血症（マス）、及び白斑症候群ウイルス（エビ）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、例示的なウイルスとしては、霊長類Ｔリンパ球向性ウイルス１、霊長類Ｔリンパ球向性ウイルス２、霊長類Ｔリンパ球向性ウイルス３、ヒト免疫不全ウイルス１、ヒト免疫不全ウイルス２、サル泡沫状ウイルス、ヒトピコビルナウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、チャングイノラウイルス、グレートアイランドウイルス、レボンボウイルス、オルンゴウイルス、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ、バンナウイルス、ボルナ病ウイルス、ビクトリア湖マールブルグウイルス、レストンエボラウイルス、スーダンエボラウイルス、タイ森林エボラウイルス、ザイールウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス２、ヒトパラインフルエンザウイルス４、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス１、ヒトパラインフルエンザウイルス３、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、麻疹ウイルス、ヒト呼吸器多核体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、チャンディプラウイルス、イスファハンウイルス、ピリウイルス、水疱性口内炎アラゴアスウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、水疱性口内炎ニュージャージーウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス、デュベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリリッサウイルス１、ヨーロッパコウモリリッサウイルス２、モコラウイルス、狂犬病ウイルス、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マチュポウイルス、ピチンデウイルス、サビアウイルス、ホワイトウォーターアロヨウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ブワンバウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、カラパルウイルス、カツウイルス、グアマウイルス、グアロアウイルス、カイリウイルス、マリツバウイルス、オリボカウイルス、オロポーシェウイルス、シュニウイルス、タカイウマウイルス、ウェオミヤウイルス、アンデスウイルス、バイユーウイルス、ブラッククリーク運河ウイルス、Ｄｏｂｒａｖａ－Ｂｅｌｇｒａｄｅウイルス、ハンタンウイルス、ラグナネグラウイルス、ニューヨークウイルス、プーマラウイルス、ソウルウイルス、シンノンブレウイルス、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、ダグベウイルス、カンディルウイルス、プンタトロウイルス、リフトバレー熱ウイルス、サシチョウバエ熱ナポリウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、ドホリウイルス、トゴトウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＮＬ６３、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、ＳＡＲＳコロナウイルス、ヒトトロウイルス、ヒトエンテロウイルスＡ、ヒトエンテロウイルスＢ、ヒトエンテロウイルスＣ、ヒトエンテロウイルスＤ、ヒトライノウイルスＡ、ヒトライノウイルスＢ、ヒトライノウイルスＣ、脳心筋炎ウイルス、タイロウイルス、Ａ型ウマライノウイルス、口蹄疫ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトパレコウイルス、リュンガンウイルス、アイチウイルス、ヒトアストロウイルス、ヒトアストロウイルス２、ヒトアストロウイルス３、ヒトアストロウイルス４、ヒトアストロウイルス５、ヒトアストロウイルス６、ヒトアストロウイルス７、ヒトアストロウイルス８、ノーウォークウイルス、サッポロウイルス、アロアウイルス、バンジウイルス、デングウイルス、イルヘウスウイルス、日本脳炎ウイルス、ココベラウイルス、キャサヌル森林病ウイルス、ルーピングイルウイルス、マレーバレー脳炎ウイルス、ウンタヤウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ポワッサンウイルス、リオブラボーウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ウスツウイルス、ウェッセルスブロンウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、バーマ森林ウイルス、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エバーグレイズウイルス、ゲタウイルス、マヤロウイルス、ムカンボウイルス、オニョンニョンウイルス、ピクスナウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ワタロアウイルス、風疹ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、例示的なウイルスとしては、アカガエルヘルペスウイルス１、アカガエルヘルペスウイルス２、アカガエルヘルペスウイルス３、ウナギヘルペスウイルス１、コイヘルペスウイルス１、コイヘルペスウイルス２、コイヘルペスウイルス３、チョウザメヘルペスウイルス２、アメリカナマズヘルペスウイルス１、アメリカナマズヘルペスウイルス２、サケヘルペスウイルス１、サケヘルペスウイルス２、サケヘルペスウイルス３、トリアルファヘルペスウイルス（Ｇａｌｌｉｄ ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）１、インコアルファヘルペスウイルス１、カモアルファヘルペスウイルス１、ハトアルファヘルペスウイルス１、トリアルファヘルペスウイルス２、トリアルファヘルペスウイルス３、シチメンチョウアルファヘルペスウイルス１、ペンギンアルファヘルペスウイルス１、ウミガメアルファヘルペスウイルス５、リクガメアルファヘルペスウイルス３、クモザルアルファヘルペスウイルス１、ウシアルファヘルペスウイルス２、オナガザルアルファヘルペスウイルス２、ヒトアルファヘルペスウイルス１、ヒトアルファヘルペスウイルス２、ウサギアルファヘルペスウイルス４、マカクアルファヘルペスウイルス１、カンガルーアルファヘルペスウイルス１、カンガルーアルファヘルペスウイルス２、チンパンジーアルファヘルペスウイルス３、ヒヒアルファヘルペスウイルス２、オオコウモリアルファヘルペスウイルス１、リスザルアルファヘルペスウイルス１、ウシアルファヘルペスウイルス１、ウシアルファヘルペスウイルス５、バッファローアルファヘルペスウイルス１、イヌアルファヘルペスウイルス１、ヤギアルファヘルペスウイルス１、オナガザルアルファヘルペスウイルス９、シカアルファヘルペスウイルス１、シカアルファヘルペスウイルス２、ウマアルファヘルペスウイルス１、ウマアルファヘルペスウイルス３、ウマアルファヘルペスウイルス４、ウマアルファヘルペスウイルス８、ウマアルファヘルペスウイルス９、ネコアルファヘルペスウイルス１、ヒトアルファヘルペスウイルス３、クジラアルファヘルペスウイルス１、アザラシアルファヘルペスウイルス１、イノシシアルファヘルペスウイルス１、ウミガメアルファヘルペスウイルス６、ヨザルベータヘルペスウイルス１、オマキザルベータヘルペスウイルス１、オナガザルベータヘルペスウイルス５、ヒトベータヘルペスウイルス５、マカクベータヘルペスウイルス３、マカクベータヘルペスウイルス８、マンドリルベータヘルペスウイルス１、チンパンジーベータヘルペスウイルス２、ヒヒベータヘルペスウイルス３、ヒヒベータヘルペスウイルス４、リスザルベータヘルペスウイルス４、マウスベータヘルペスウイルス１、マウスベータヘルペスウイルス２、マウスベータヘルペスウイルス８、ゾウベータヘルペスウイルス１、ゾウベータヘルペスウイルス４、ゾウベータヘルペスウイルス５、ヒトベータヘルペスウイルス７、ヒトベータヘルペスウイルス６Ａ、ヒトベータヘルペスウイルス６Ｂ、マカクベータヘルペスウイルス９、マウスベータヘルペスウイルス３、イノシシベータヘルペスウイルス２、テンジクネズミベータヘルペスウイルス２、ツパイベータヘルペスウイルス１、コモンマーモセットガンマヘルペスウイルス３、オナガザルガンマヘルペスウイルス１４、ゴリラガンマヘルペスウイルス（Ｇｏｒｉｌｌｉｎｅ ｇａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）１、ヒトガンマヘルペスウイルス４、マカクガンマヘルペスウイルス４、マカクガンマヘルペスウイルス１０、チンパンジーガンマヘルペスウイルス１、ヒヒガンマヘルペスウイルス１、オランウータンガンマヘルペスウイルス２、アルセラフィンガンマヘルペスウイルス１、アルセラフィンガンマヘルペスウイルス２、ウシガンマヘルペスウイルス６、ヤギガンマヘルペスウイルス２、アンテロープガンマヘルペスウイルス１、ヒツジガンマヘルペスウイルス２、イノシシガンマヘルペスウイルス３、イノシシガンマヘルペスウイルス４、イノシシガンマヘルペスウイルス５、ウマガンマヘルペスウイルス２、ウマガンマヘルペスウイルス５、ネコガンマヘルペスウイルス１、アナグマガンマヘルペスウイルス１、アザラシガンマヘルペスウイルス３、ヒナコウモリガンマヘルペスウイルス１、クモザルガンマヘルペスウイルス２、クモザルガンマヘルペスウイルス３、ウシガンマヘルペスウイルス４、キヌゲネズミガンマヘルペスウイルス２、ヒトガンマヘルペスウイルス８、マカクガンマヘルペスウイルス５、マカクガンマヘルペスウイルス８、マカクガンマヘルペスウイルス１１、マカクガンマヘルペスウイルス１２、マウスガンマヘルペスウイルス４、マウスガンマヘルペスウイルス７、リスザルガンマヘルペスウイルス２、ウマガンマヘルペスウイルス７、アザラシガンマヘルペスウイルス２、Ｓａｇｕｉｎｉｎｅガンマヘルペスウイルス１、イグアナヘルペスウイルス２、Ｈａｌｉｏｔｉｄヘルペスウイルス１、イホダガキヘルペスウイルス１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＫＭＬ３９、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＡＧ３、ＤｉｃｋｅｙａウイルスＬｉｍｅｓｔｏｎｅ、ＤｉｃｋｅｙａウイルスＲＣ２０１４、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＣＢＡ１２０、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＰｈａｘＩ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａウイルス３８、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＤｅｔ７、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＧＧ３２、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＰＭ１０、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＦＰ１０、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＨ１９、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＪ３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＫＷＢＳＥ４３－６、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルス０５０７ＫＮ２１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐＳ１１０、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＭａｙ、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＭｅｎｌｏｗ、ＳｅｒｒａｔｉａウイルスＩＭＥ２５０、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＥａ２８０９、ＳｅｒｒａｔｉａウイルスＭＡＭ１、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＡｃｉｂｅｌ００７、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＡＢ３、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＡｂＫＴ２１ＩＩＩ、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＡｂｐ１、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＡｃｉ０７、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＡｃｉ０８、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＡＳ１１、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＡＳ１２、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＦｒｉ１、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＩＭＥ２００、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＰＤ６Ａ３、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＰＤＡＢ９、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスｐｈｉＡＢ１、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＳＨ－Ａｂ１５５１９、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＳＷＨＡｂ１、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＳＷＨＡｂ３、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＷＣＨＡＢＰ５、ＡｃｉｎｔｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＢ１、ＡｃｉｎｔｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＢ２、ＡｃｉｎｔｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＢ５、ＡｃｉｎｔｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＤ２、ＡｃｉｎｔｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＰ１、ＡｃｉｎｔｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＰ２、ＡｃｉｎｔｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスｐｈｉＡＢ６、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＰｅｔｔｙ、ＶｉｂｒｉｏウイルスＶｃ１、ＶｉｂｒｉｏウイルスＡ３１８、ＶｉｂｒｉｏウイルスＡＳ５１、ＶｉｂｒｉｏウイルスＶｐ６７０、ＭａｒｉｎｏｍｏｎａｓウイルスＣＢ５Ａ、ＭａｒｉｎｏｍｏｎａｓウイルスＣＰＰ１ｍ、ＶｉｂｒｉｏウイルスＶＥＮ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＡｃｈｅｌｏｕｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＡｌｐｈｅｕｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＮｅｒｔｈｕｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＮｊｏｒｄ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスｕｌｉｇｏ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＣ１７１、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰＰ１６、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰＰＷＳ１、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰＰＷＳ２、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＣＢ５、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＣｌｉｃｋｚ、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスｆＭ１、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＧａｓｐｏｄｅ、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＫｈｌｅｎ、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＫｏｏｔ、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＬｅｌｉｄａｉｒ、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＮｏｂｂｙ、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰｅａｔ１、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰｈｏｒｉａ、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰＰ９０、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＺｅｎｉｖｉｏｒ、ＤｉｃｋｅｙａウイルスＢＦ２５－１２、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＮＶ３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルス１３０－１１３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルス１５ｐｙｏ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＡｂ０５、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＡＢＴＮＬ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＤＬ６２、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスｋＦ７７、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＬＫＤ１６、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＬＵＺ１９、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＭＰＫ６、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＭＰＫ７、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＮＦＳ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰＡＸＹＢ１、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスｐｈｉＫＭＶ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰＴ２、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰＴ５、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＲＬＰ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＬＫＡ１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスｆ２、Ａｅｒｏｍｏｎａｓウイルス２５ＡｈｙｄＲ２ＰＰ、ＡｅｒｏｍｏｎａｓウイルスＡＳ７、ＡｅｒｏｍｏｎａｓウイルスＺＰＡＨ７、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＩＳＡＯ８、ＡｅｒｏｍｏｎａｓウイルスＡｈｐ１、ＡｅｒｏｍｏｎａｓウイルスＣＦ７、ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒウイルスＤｅｖＣＤ２３８２３、ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒウイルスＧＡＰ２２７、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳｐｐ１６、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＲ８－０１、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスｆＨｅＹｅｎ３０１、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＰｈｉ８０－１８、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＡｒｎｏ１６０、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰＰ２、ＰｒｏｔｅｕｓウイルスＰＭ８５、ＰｒｏｔｅｕｓウイルスＰＭ９３、ＰｒｏｔｅｕｓウイルスＰＭ１１６、ＰｒｏｔｅｕｓウイルスＰｍ５４６０、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰＰ１、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＥｒａ１０３、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＳ２、ＬｅｌｌｉｏｔｔｉａウイルスｐｈＤ２Ｂ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ＣｒＲｐ３、ＥｓｃｈｅｒｃｈｉａウイルスＬＬ１１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＡＡＰＥｃ６、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＡＣＧＣ９１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＢ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＣ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＫ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＫ１－５、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＫ１Ｅ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｍｕｔＰＫ１Ａ２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＶＥｃ３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＵＡＢ７８、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＢＰ１２Ｂ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＰ６、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスＢｐＡＭＰ１、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＲＳＰＩ１、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＲＳＢ１、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＲｓｏＰ１ＩＤＮ、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスＪＧ０６８、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＲＳＪ２、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＲＳＪ５、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＲＳＰＩＩ１、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＢｕｃｏ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＭｉｎｏｒｎａ、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＡｌｔｏＧａｏ、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＢＯ１Ｅ、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＦ１９、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫ２４４、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐ２、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＰ３４、Ｋ
ｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＰＲｉｏ２０１５、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐＳ２、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐＶ４１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐＶ４８、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐＶ７１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐＶ７４、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐＶ４７５、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＰＶ８１１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスｍｙＰＳＨ１２３５、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＳＵ５０３、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＳＵ５５２Ａ、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＳＦＮ６Ｂ、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＫＤＡ１、ＰｒｏｔｅｕｓウイルスＰＭ１６、ＰｒｏｔｅｕｓウイルスＰＭ７５、ＤｉｃｋｅｙａウイルスＤａｇｄａ、ＤｉｃｋｅｙａウイルスＫａｔｂａｔ、ＤｉｃｋｅｙａウイルスＬｕｋｓｅｎ、ＤｉｃｋｅｙａウイルスＭｙｓｔｅｒｉｏｎ、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＡＰ１０、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＦＥ４４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルス２８５Ｐ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＢＡ１４、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＰ４８３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＰ６９４、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＳ５２３、ＫｌｕｙｖｅｒａウイルスＫｖｐ１、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰＰ７４、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＢＰ１２Ａ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＢＳＰ１６１、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＡ７、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＢｅｒｌｉｎ、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＰＹＰＳ５０、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＹｅｐｅ２、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＹｅｐｆ、ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＣＲ８、ＶｉｂｒｉｏウイルスＩＣＰ３、ＶｉｂｒｉｏウイルスＮ４、ＶｉｂｒｉｏウイルスＶＰ４、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＥａｐ１、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＬ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＳＲＴ７、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルス１７Ａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスｇｈ１、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＨｅｎｎｉｎｇｅｒ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＫＮＰ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰｆ１ＥＲＺ２０１７、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰｈｉＰＳＡ２、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰｈｉＰｓａ１７、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰＰＰＬ１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスｓｈｌ２、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＷＲＴ、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスｆＰＳ９、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスｆＰＳ５３、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスｆＰＳ５９、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスｆＰＳ５４ｏｃｒ、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＪａｒｉｌｏ、ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＣＲ４４ｂ、ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＳＨ３、ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＳＨ４、ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒウイルスＤｅｖ２、ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒウイルスＧＷ１、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＥｃｐＹＺＵ０１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＥｃｏＤＳ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＦ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＧＡ２Ａ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＩＭＭ００２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＫ１Ｆ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＬＭ３３Ｐ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＰＥ３－１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＲｏ４５ｌｗ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＳＴ３１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＶｅｃ１３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＹＺ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＺＧ４９、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＳＦＰＨ２、ＭｏｒｇａｎｅｌｌａウイルスＭｍＰ１、ＭｏｒｇａｎｅｌｌａウイルスＭＰ２、ＤｉｃｋｅｙａウイルスＪＡ１０、ＤｉｃｋｅｙａウイルスＮｉｎｕｒｔａ、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰＰ４７、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰＰ８１、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰＰＷＳ４、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰＰｐＷ４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルス２２ＰｆｌｕＲ６４ＰＰ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＩＢＢＰＦ７Ａ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰｆ１０、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰＦＰ１、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰｈｉＳ１、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＵＮＯＳＬＷ１、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰｓｐＹＺＵ０８、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＫ３０、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルス２０４４－３０７ｗ、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＢＩＳ３３、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＨｅｎｕ１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＩＬ３３、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＩＭＥ２０５、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＩＭＥ３２１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫ５、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫ１１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫ５－２、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫ５－４、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＮ１－１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＮ３－１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＮ４－１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐ１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＰ３２、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＰ３２ｉ１９２、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＰ３２ｉ１９４、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＰ３２ｉ１９５、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＰ３２ｉ１９６、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスｋｐｓｓｋ３、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐＶ２８９、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐＶ７６３、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐＶ７６６、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐＶ７６７、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＰｈａｒｒ、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＰＲＡ３３、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＳＨＫｐ１５２２３４、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＳＨＫｐ１５２４１０、ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＣＦＰ１、ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＳＨ１、ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＳＨ２、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＥ２、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＥ３、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＫＰＮ３、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａウイルスＴ７Ｍ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＥＣＡ２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＬＬ２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＴ３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＴ３Ｌｕｒｉａ、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａウイルス１０１６４－３０２、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＧ－ＪＬ２、Ｓｅｒｒａｔｉａウイルス２０５０Ｈ２、ＳｅｒｒａｔｉａウイルスＳＭ９－３Ｙ、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＡＰ５、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＹｅＦ１０、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＹｅＯ３－１２、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａウイルスＩＭＥ３９０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルス１３ａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルス６４７９５ｅｃ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＣ５、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＣＩＣＣ８０００１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＥｂｒｉｏｓ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＥＧ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＨＺ２Ｒ８、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＨＺＰ２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＮ３０、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＮＣＡ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＴ７、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａウイルス３Ａ８７６７、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＶｉ０６、ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓウイルスＩＭＥ１５、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＹｐＰＹ、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＹｐｓＰＧ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰｈｉ１５、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＤＵＰＰＩＩ、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＣＢＰ４２、ＡｑｕａｍｉｃｒｏｂｉｕｍウイルスＰ１４、ＡｓｈｉウイルスＳ４５Ｃ４、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＡｔｕｐｈ０２、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＡｔｕｐｈ０３、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＡｐ１、ＡｙａｑウイルスＳ４５Ｃ１８、ＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＳ１２０－１、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＡｎｄｒｏｍｅｄａ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＢｆ７、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＪ８－６５、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＬｉｄｔｓｕｒ、ＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓウイルスＮＡＴＬ１Ａ７、ＣｈｏｓウイルスＫＭ２３Ｃ７３９、ＲｈｉｚｏｂｉｕｍウイルスＲＨＥｐｈ０２、ＲｈｉｚｏｂｉｕｍウイルスＲＨＥｐｈ０８、ＲｈｉｚｏｂｉｕｍウイルスＲＨＥｐｈ０９、ＶｉｂｒｉｏウイルスＣｙｃｌｉｔ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＰＧＴ２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＰｈｉＫＴ、ＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓウイルスＨ４－４、ＦｏｕｓｓウイルスＳ４６Ｃ１０、ＦｕｓｓウイルスＳ３０Ｃ２８、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＥＣＢＰ５、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰＰ９９、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＤＵＲＰＩ、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＲｓｏＰ１ＥＧＹ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ 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ｐｐＹＺＵ０５、ＶｉｂｒｉｏウイルスＣｅｔｏ、ＶｉｂｒｉｏウイルスＴｈａｌａｓｓａ、ＶｉｂｒｉｏウイルスＪＳＦ１０、ＶｉｂｒｉｏウイルスＪＳＦ１２、Ｖｉｂｒｉｏウイルスｐｈｉ３、ＶｉｂｒｉｏウイルスｐＶｐ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＥＰＳ７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｍａｒ００３Ｊ３、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｓａｕｓ１３２、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａウイルス１２３、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａウイルス３２９、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａウイルス１１８９７０ｓａｌ２、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＬＶＲ１６Ａ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳ１１３、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳ１１４、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳ１１６、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳ１２４、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳ１２６、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳ１３２、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳ１３３、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳ１４７、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳｅａｆｉｒｅ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＨ９、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＴＧ２、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳｔｉｔｃｈ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳｗ２、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスｐｈｉＲ２０１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＡＫＦＶ３３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＢＦ２３、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｃｈｅｅ２４、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＤＴ５７１２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＤＴ５７Ｃ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＦＦＨ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＧｏｓｔｙａ９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＨ８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｍａｒ００４ＮＰ２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＯＳＹＳＰ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｐｈｉＡＰＣＥｃ０３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｐｈｉＬＬＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｓｌｕｒ０９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＴ５、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＮＲ０１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳ１３１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳｈｉｖａｎｉ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＰ０１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＰ３、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＰＣ３５、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＳＨＳＭＬ４５、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＳＳＰ１、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＤＵＰＰＶ、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＭｙ１、ＰｒｏｔｅｕｓウイルスＰＭ１３５、ＰｒｏｔｅｕｓウイルスＳｔｕｂｂ、ＶｉｂｒｉｏウイルスＰＧ０７、ＶｉｂｒｉｏウイルスＶｓｐＳｗ１、ＡｅｒｏｍｏｎａｓウイルスＡｈＳｚｑ１、ＡｅｒｏｍｏｎａｓウイルスＡｈＳｚｗ１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＩＭＥ２６０、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＳｕｇａｒｌａｎｄ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＩＭＥ５４２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＡＣＧＭ１２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＥＣ３ａ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＤＴＬ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＩＭＥ２５３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＲｔｐ、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＳｆ１２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｐｈｉＥＢ４９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＡＨＰ４２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＡＨＳ２４、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＡＫＳ９６、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＣ１１９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＥ４１ｃ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＥｂ４９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＪｋ０６、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＫＰ２６、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｐｈｉＪＬＡ２３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＲｏｇｕｅ１、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＳｄ１、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスｐＳｆ１、ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＤＫ２０１７、ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＳａｚｈ、ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＳｔｅｖｉｅ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＬＬ５、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＴＬＳ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａウイルス３６、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＰＨＢ０７、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスｐｈＳＥ２、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＰ１２６、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＹＳＰ２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルス９５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｍａｒ００１Ｊ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｍａｒ００２Ｊ２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＳＥＣｐｈｉ２７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｓｗａｎ０１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＩＭＥ３４７、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＳＲＴ８、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＡＤＢ２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＢＩＦＦ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＩＭＥ１８、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＪＭＰＷ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＪＭＰＷ２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＳＨ２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＴ１、Ｓｈｉｇｅｌｌａウイルス００８、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＩＳＦ００１、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＰＳｆ２、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＳｆｉｎ１、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＳＨ６、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＳｈｆｌ１、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＩＳＦ００２、ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒウイルスＥｓｐ２９４９－１、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＥｃＬ１、ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒウイルスＰｈｉＣＳ０１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＥＳＣＯ４１、ＰａｎｔｏｅａウイルスＡＡＳ２３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＮＢＤ２、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＦ２０、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルス１５１３、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＧＨＫ３、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＬＰＮ１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＯＸ１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＰ３６、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐＣｏｌ１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐＫＴ２１ｐｈｉ１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＰＮ 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、ＭａｎｎｈｅｉｍｉａウイルスＰＨＬ１０１、ＡｅｒｏｍｏｎａｓウイルスｐｈｉＯ１８Ｐ、ＶｉｂｒｉｏウイルスＣａｎｏｅ、ＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓウイルスＣ５ａ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＤｏｂｂｙ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスｐｈｉＣＴＸ、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＥｔＧ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルス１８６、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＰｓＰ３、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＥＮ１、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＥＮＴ９０、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルス４ＬＶ２０１７、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＦｅｌｓ２、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＲＥ２０１０、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＥＮ８、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳｏｐＥｐｈｉ、ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓウイルスＨＰ１、ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓウイルスＨＰ２、ＶｉｂｒｉｏウイルスＫａｐｐａ、ＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａウイルスＦ１０８、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスＫＳ１４、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスＡＰ３、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスＫＳ５、ＶｉｂｒｉｏウイルスＫ１３９、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスＳＴ７９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｆｉＡＡ９１ｓｓ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＰ２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｐｒｏ１４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｐｒｏ４８３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＷｐｈｉ、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＬ４１３Ｃ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスｐｈｉ３、ＳａｌｉｎｉｖｉｂｒｉｏウイルスＳＭＨＢ１、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルス３ＬＶ２０１７、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＥＮ４、ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒウイルスＥＳＳＩ２、ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓウイルスＳｍｐ１３１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＦＳＬＳＰ００４、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスＫＬ３、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスｐｈｉ５２２３７、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスｐｈｉＥ１２２、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスｐｈｉＥ２０２、ＶｉｂｒｉｏウイルスＰＶ９４、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＰ８８、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＢｐ７、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＩＭＥ０８、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＪＳ１０、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＪＳ９８、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＭＸ０１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＱＬ０１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＶＲ５、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＷＧ０１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＶＲ７、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＶＲ２０、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＶＲ２５、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＶＲ２６、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＳＰ１８、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＭｅｌｖｉｌｌｅ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳ１６、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＴＭＬ１９８、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＴＰ４ａ、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＪＤ１８、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＰＫＯ１１１、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＰＧ７、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＣＣ３１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＥＣＤ７、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＧＥＣ３Ｓ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＪＳＥ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｐｈｉ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＲＢ４９、ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＣＦ１、ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＭｅｒｌｉｎ、ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＭｏｏｎ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＡＰＣＥｃ０１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＨＰ３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＨＸ０１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＪＳ０９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＯ１５７ｔｐ３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＯ１５７ｔｐ６、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＰｈＡＰＥＣ２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＲＢ６９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＳＴ０、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＳＨＳＭＬ５２１、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＵＴＡＭ、ＶｉｂｒｉｏウイルスＫＶＰ４０、Ｖｉｂｒｉｏウイルスｎｔ１、ＶｉｂｒｉｏウイルスＶａｌＫＫ３、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＥａｐ３、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＰ１５、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫＰ２７、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＭａｔｉｓｓｅ、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＭｉｒｏ、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＰＭＢＴ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＡＲ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＣ４０、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＣＦ２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＥ１１２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＥＣＭＬ１３４、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＨＹ０１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＨＹ０３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＩｍｅ０９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＲＢ３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＲＢ１４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｓｌｕｒ０３、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｓｌｕｒ０４、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＴ４、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＰｓｓ１、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＳｆ２１、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＳｆ２２、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＳｆ２４、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＳＨＢＭＬ５０１、ＳｈｉｇｅｌｌａウイルスＳｈｆｌ２、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＤ１、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＰＳＴ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルス１３３、Ａｅｒｏｍｏｎａｓウイルス６５、ＡｅｒｏｍｏｎａｓウイルスＡｅｈ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＲＢ１６、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＲＢ３２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＲＢ４３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルス４２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＡｖ０５、ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒウイルスＣＲ３、ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒウイルスＣＲ８、ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒウイルスＣＲ９、ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒウイルスＰＢＥＳ０２、ＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスｐｈｉＴＥ、ＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒウイルスＧＡＰ３１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルス４ＭＧ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＰＶＰＳＥ１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＳＥ１２１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＡＰＥＣｃ０２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＦＦＨ２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＦＶ３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＪＥＳ２０１３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＭｕｒｉｃａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｓｌｕｒ１６、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＶ５、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＶ１８、ＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＡｂｏｕｏ、ＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＤａｖｉｅｓ、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＭｂＣＭ１００、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＤｅｉｍｏｓ、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＤｅｓｅｒｔｆｏｘ、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＥａ３５－７０、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＲＡＹ、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＳｉｍｍｙ５０、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＳｐｅｃｉａｌＧ、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＳｈＭ２、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫ６４－１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＲａＫ２、ＤｉｃｋｅｙａウイルスＡＤ１、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＡｌｅｘａｎｄｒａ、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＬＢＲ４８、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＣＡＭ１、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＣＢＷＭ１、ＶｉｂｒｉｏウイルスＡｐｈｒｏｄｉｔｅ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルス１２１Ｑ、ＥｓｃｈｉｅｒｉｃｈｉａウイルスＰＢＥＣＯ４、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＡＣ２０１４ｆＳｙｎ７８０３Ｃ８、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＡＣＧ２０１４ｆ、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＡＣＧ２０１４ｆＳｙｎ７８０３ＵＳ２６、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＴＩＭ５、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰａＢＧ、ＲｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒａウイルスＢａｒｂａ１８Ａ、ＲｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒａウイルスＢａｒｂａ１９Ａ、ＲｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒａウイルスＢａｒｂａ２１Ａ、ＲｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒａウイルスＢａｒｂａ５Ｓ、ＲｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒａウイルスＢａｒｂａ８Ｓ、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスＢｃｅｐＭｕ、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスｐｈｉＥ２５５、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＢｅｌｌａｍｙ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＧＭＡ６、Ａｅｒｏｍｏｎａｓウイルス４４ＲＲ２、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＡｌｉｃｅ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢｘｚ１、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＤａｎｄｅｌｉｏｎ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＨｙＲｏ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＩ３、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＬｕｋｉｌｕ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＮａｐｐｙ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＳｅｂａｔａ、ＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢｒｉｇｉｔ、ＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳｙｎ３３、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＲＩＭ１２－０１、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＲＩＭ１２－０６、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＲＩＭ１２－０８、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＥＮ３４、ＡｃｉｄｏｖｏｒａｘウイルスＡＣＰ１７、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓウイルスＣａｒｐａｓｉｎａ、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓウイルスＸｃＰ１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスｐｆ１６、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＣＡＭ３、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＲＳＦ１、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＲＳＬ２、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＷＡＭ２、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＤｅｒｂｉｃｕｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＥＬ、ＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍウイルスＭ７、ＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍウイルスＭ１２、ＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍウイルスＮ３、ＳｅｒｒａｔｉａウイルスＢＦ、ＹｅｒｓｉｎｉａウイルスＹｅｎ９－０４、ＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＥｐｏｎａ、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＡｓｅｓｉｎｏ、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＥａＨ２、ＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓウイルスＭＥＤ４－２１３、ＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓウイルスＰＨＭ１、ＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓウイルスＰＨＭ２、ＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＦＣＬ２、ＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＦＣＶ１、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＫＩＬ２、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＫＩＬ４、ＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａウイルスＧＦ２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＧｏｓｌａｒ、ＨａｌｏｍｏｎａｓウイルスＨＡＰ１、ＶｉｂｒｉｏウイルスＶＰ８８２、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＬｂ、ＥｒｗｉｎｉａウイルスＥａＨ１、ＩｏｄｏｂａｃｔｅｒウイルスＰＬＰＥ、ＤｅｌｆｔｉａウイルスＰｈｉＷ１４、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＪＤ００１、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐＶ５２、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＫｐＶ８０、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＣＶＭ１０、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＥＣＯＯ７８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｅｐ３、ＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＪｉｍｍｅｒ、ＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＯｓｉｒｉｓ、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＣＡＭ９、ＲｈｉｚｏｂｉｕｍウイルスＲＨＥｐｈ４、ＦａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＬａｇａｆｆｅ、ＳｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓウイルスＳＰ４、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳｙｎ３０、ＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓウイルスＰＴＩＭ４０、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＳＫＳ１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＺＣＳＥ２、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍウイルスｐｈｉＣ２、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍウイルスｐｈｉＣＤ２７、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍウイルスｐｈｉＣＤ１１９、Ｅｒｗｉｎｉａ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ｄｏｍｏｎａｓウイルスＡｂ０９、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＬＩＴ１、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰＡ２６、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＫＰＰ２１、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＬＵＺ７、Ｖｉｂｒｉｏウイルス４８Ｂ１、Ｖｉｂｒｉｏウイルス５１Ａ６、Ｖｉｂｒｉｏウイルス５１Ａ７、Ｖｉｂｒｉｏウイルス５２Ｂ１、ＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓウイルスＭｘ８、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＰａｇｅ、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＰａｌｍｅｒ、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＰａｓｃａｌ、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＰｏｎｙ、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＰｏｏｋｉｅ、ＢｒｕｃｅｌｌａウイルスＰｒ、ＢｒｕｃｅｌｌａウイルスＴｂ、ＢｏｒｄｅｔｅｌｌａウイルスＢＰＰ１、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスＢｃｅｐＣ６Ｂ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒウイルス１９６１Ｐ、ＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒウイルスＫＨＰ３０、ＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒウイルスＫＨＰ４０、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスｐｈＣＤａ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＳｋａｒｐｒｅｔｔｅｒ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＳｏｒｔｓｎｅ、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａウイルスＩＭＥ２７９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｐｈｉＶ１０、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＥｐｓｉｌｏｎ１５、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＰＮ１Ｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＮＶ１、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＵＦＶＰ２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＰＴＸＵ０４、ＨａｍｉｌｔｏｎｅｌｌａウイルスＡＰＳＥ１、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＫＳＹ１、ＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍウイルスＷＭＰ３、ＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍウイルスＷＭＰ４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルス１１９Ｘ、ＲｏｓｅｏｂａｃｔｅｒウイルスＳＩＯ１、ＶｉｂｒｉｏウイルスＶｐＶ２６２、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＥＬＢ２０、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＲ４、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＡｍｅｌａ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスｐｈｉＣＡＭ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＡａｒｏｎｏｃｏｌｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＣａｌｉｂｕｒｎ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＤａｎｚｉｎａ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＨｙｄｒａ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＩｚｚｙ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＬａｎｎｉｓｔｅｒ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＬｉｋａ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＳｕｊｉｄａｄｅ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＺｅｍｌｙａ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスｐｈｉＨａｕ３、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＡｃａｄｉａｎ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢａｅｅ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＲｅｐｒｏｂａｔｅ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＡｄａｗｉ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢａｎｅ１、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢｒｏｗｎＣＮＡ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＣｈｒｉｓｎｍｉｃｈ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＣｏｏｐｅｒ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＪＡＭａＬ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＮｉｇｅｌ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＳｔｉｎｇｅｒ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＶｉｎｃｅｎｚｏ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＺｅｍａｎａｒ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＡｐｉｚｉｕｍ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＭａｎａｄ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＯｌｉｎｅ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＯｓｍａｘｉｍｕｓ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰｇ１、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＳｏｔｏ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＳｕｆｆｏｌｋ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＡｔｈｅｎａ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢｅｒｎａｒｄｏ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＧａｄｊｅｔ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰｉｐｅｆｉｓｈ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＧｏｄｉｎｅｓ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＲｏｓｅｂｕｓｈ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＴＡ１７ａ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢａｂｓｉｅｌｌａ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢｒｕｊｉｔａ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＨａｗｋｅｙｅ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰｌｏｔ、ＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒウイルスＣｃｒＢＬ９、ＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒウイルスＣｃｒＳＣ、ＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒウイルスＣｃｒＣｏｌｏｓｓｕｓ、ＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒウイルスＣｃｒＰＷ、ＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒウイルスＣｃｒＢＬ１０、ＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒウイルスＣｃｒＲｏｇｕｅ、ＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒウイルスｐｈｉＣｂＫ、ＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒウイルスＳｗｉｆｔ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＰ３１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＡＧ１１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＥｎｔ１、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスｆ１８ＳＥ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＪｅｒｓｅｙ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＬ１３、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＬＳＰＡ１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＥ２、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＥＴＰ３、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＥＴＰ７、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＥＴＰ１３、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＰ１０１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳＳ３ｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスｗｋｓｌ３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＫ１Ｇ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＫ１Ｈ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＫ１ｉｎｄ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＫ１ｉｎｄ２、ＥｓｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＧｏｌｅｓｔａｎ、ＲａｏｕｌｔｅｌｌａウイルスＲＰ１８０、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＡｓａｐａｇ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＢＥＮｔｈｅｒｄｕｎｔｈａｔ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＧｅｔａｌｏｎｇ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＫｅｎｎａ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＨｏｒｕｓ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＰｈｉｓｔｏｒｙ、ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃウイルスＬｍｄ１、ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃウイルスＬＮ０３、ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃウイルスＬＮ０４、ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃウイルスＬＮ１２、ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃウイルスＬＮ６Ｂ、ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃウイルスＰ７９３、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃウイルス１Ａ４、ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃウイルスＬｎ８、ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃウイルスＬｎ９、ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃウイルスＬＮ２５、ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃウイルスＬＮ３４、ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃウイルスＬＮＴＲ３、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢｏｎｇｏ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＲｅｙ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢｕｔｔｅｒｓ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＭｉｃｈｅｌｌｅ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＣｈａｒｌｉｅ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰｉｐｓｑｕｅａｋｓ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＸｅｎｏ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰａｎｃｈｉｎｏ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰｈｒａｎｎ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＲｅｄｉ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＳｋｉｎｎｙｐ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＢａｘｔｅｒＦｏｘ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＹｅｅｚｙ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＫｉｔａ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＮｙｍｐｈａｄｏｒａ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＺｉｒｉｎｋａ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢｉｇｎｕｚ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢｒｕｓａｃｏｒａｍ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＤｏｎｏｖａｎ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＦｉｓｈｂｕｒｎｅ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＪｅｂｅｋｓ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＭａｌｉｔｈｉ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰｈａｙｏｎｃｅ、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＢ２、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＬｅｎｕｓ、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＮｙｓｅｉｄ、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＳＡＣ１２、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＬｄｌ１、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＶｉＳｏ２０１８ａ、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＭａｅｎａｄ、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＰ１、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＳａｔｙｒ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＡｂｂｅｙＭｉｋｏｌｏｎ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＡｂ１８、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＡｂ１９、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰａＭｘ１１、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスＡＨ２、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＡｍｉｇｏ、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｉａウイルスＭｏｌｉｖｉａ、ＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＡｎａｔｏｌｅ、ＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢ３、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＡｎｄｒｅｗ、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＡｎｄｒｏｍｅｄａ、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＢｌａｓｔｏｉｄ、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＣｕｒｌｙ、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＥｏｇｈａｎ、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＦｉｎｎ、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＧｌｉｔｔｅｒｉｎｇ、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＲｉｇｇｉ、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＴａｙｌｏｒ、ＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＡｐｐａ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＡｐｒｉｃｏｔ、ＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＡｒｍｓｔｒｏｎｇ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＡｔｔｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＡｔｔｏｏｍｉ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＡｕｓｔｉｎｔａｔｉｏｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＩｄｉｄｓｕｍｔｉｎｗｏｎｇ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＰａｐａｙａＳａｌａｄ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＢａｎｔａｍ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢａｒｎｙａｒｄ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＫｏｎｓｔａｎｔｉｎｅ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰｒｅｄａｔｏｒ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＢ３、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＪＢＤ６７、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＪＤ１８、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰＭ１０５、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢｅｒｎａｌ１３、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＢｅｔｔｅｒＫａｔｚ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＢｉｎｇ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓウイルス１３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓウイルス７７、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓウイルス１０８ＰＶＬ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＢｏｗｓｅｒ、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＢｒｉｄｇｅｔｔｅ、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＣｏｎｓｔａｎｃｅ、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＥｉｌｅｅｎ、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＪｕｄｙ、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＰｅａｓ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＢｒｉｔｂｒａｔ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢｒｏｎ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＦａｉｔｈ１、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＪｏｅＤｉｒｔ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＲｕｍｐｅｌｓｔｉｌｔｓｋｉｎ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓウイルス８５８、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓウイルス２９７２、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＡＬＱ１３２、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＯ１２０５、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳｆｉ１１、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＤ３１１２、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＤＭＳ３、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＦＨＡ０４８０、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＬＰＢ１、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＭＰ２２、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＭＰ２９、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＭＰ３８、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰＡ１ＫＯＲ、Ｃｅｌｌｕｌｏｐｈ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ｅｒｉｃｈｉａウイルスＮ１５、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓウイルスＲＥＲ２、ＲｈｉｚｏｂｉｕｍウイルスＰ１０６Ｂ、ＳｔｒｅｐｏｍｙｃｅｓウイルスＤｒｇｒｅｙ、ＳｔｒｅｐｏｍｙｃｅｓウイルスＲｉｍａ、ＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＨｅｎｄｒｉｘ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＦｒｙｂｅｒｇｅｒ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＲｏｎａｌｄｏ、ＡｅｒｏｍｏｎａｓウイルスｐＩＳ４Ａ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＲｏｗａ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＲｕｔｈｙ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＪａｙ２Ｊａｙ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＭｉｌｄｒｅｄ２１、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＮｏｏｔＮｏｏｔ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＰａｒａｄｉｄｄｌｅｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＰｅｅｂｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＳａｍｉｓｔｉ１２、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＳＭ１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＳａｍＷ、ＸｙｌｅｌｌａウイルスＳａｌｖｏ、ＸｙｌｅｌｌａウイルスＳａｎｏ、ＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒウイルスＳａｎｓａ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓウイルスＢＣ６１１、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓウイルスＩＭＥＥＦ１、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＡＰ６、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓウイルスＶＤ１３、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＰＱＳ１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＳａｓｈａ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢＦＫ２０、ＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＴｐ８４、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＳｃａｐ１、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＳｃｈｎａｂｅｌｔｉｅｒ、ＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＳｃｈｕｂｅｒｔ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルス７３、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＡｂ２６、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＫａｋｈｅｔｉ２５、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＣａｊａｎ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＳｅｕｒａｔ、ＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒウイルスＳｅｕｓｓ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳＥＰ９、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳｅｘｔａｅｃ、ＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＤｉｖａ、ＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＨｂ１０ｃ２、ＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＲａｎｉ、ＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＳｈｅｌｌｙ、ＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＳｉｔａｒａ、ＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＷｉｌｌｏｗ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルス７１２、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＡＳＣＣ１９１、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＡＳＣＣ２７３、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＡＳＣＣ２８１、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＡＳＣＣ４６５、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＡＳＣＣ５３２、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＢｉｂｂ２９、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスｂＩＬ１７０、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＣＢ１３、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＣＢ１４、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＣＢ１９、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＣＢ２０、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスｊｊ５０、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＰ２、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＰ００８、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスｓｋ１、ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓウイルスＳｌ４、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＳｌａｓｈ、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＳｔａｈｌ、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＳｔａｌｅｙ、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＳｔｉｌｌｓ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＢａｃｈｉｔａ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＣｌｕｂＬ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＳｍｏｏｔｈｉｅ、ＡｒｔｈｏｂａｃｔｅｒウイルスＳｏｎａｌｉ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＳｏｕｐｓ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＳｔｒｏｓａｈｌ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＷａｉｔ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＳｏｕｒ、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＳＰｂｅｔａ、ＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＨｙｐｅｒｉｏｎ、ＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＳｑｕａｓｈ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスｐｈｉ６４４２、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスｐｈｉ１０２６ｂ、ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａウイルスｐｈｉＥ１２５、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒウイルス８３－２４、ＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒウイルスＪＷＸ、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒウイルスＴａｎｋ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＳｕｚｙ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＴｅｒａｐｉｎ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＴＧ１、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＡｎａｙａ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＡｎｇｅｌｉｃａ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＣｒｉｍＤ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＦｉｏｎｎｂｈａｒｔｈ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＪＡＷＳ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＬａｒｖａ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＭａｃｎＣｈｅｅｓｅ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＰｉｘｉｅ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＴＭ４、ＴｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａウイルスＴＩＮ２、ＴｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａウイルスＴＩＮ３、ＴｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａウイルスＴＩＮ４、ＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒウイルスＲｃＳｐａｒｔａｎ、ＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒウイルスＲｃＴｉｔａｎ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＴｏｒｔｅｌｌｉｎｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓウイルス４７、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓウイルス３ａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓウイルス４２ｅ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓウイルスＩＰＬＡ３５、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓウイルスｐｈｉ１２、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓウイルスｐｈｉＳＬＴ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルス３２ＨＣ、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓウイルスＴｒｉｎａ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＴｒｉｎｅ、ＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＴｒｉｐｐ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルス１Ｈ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルス２３Ｔ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルス２Ａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルス６Ｈ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＬｉｌｂｏｏｂｏｏ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＶａｓｈ、ＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＶｅｇａｓ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＶｅｎｄｅｔｔａ、ＰａｒａｃｏｃｃｕｓウイルスＳｈｐａ、ＰａｎｔｏｅａウイルスＶｉｄ５、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＢ１２５１、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒウイルスＲ３１７７、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＢｒａｎｄｏｎｋ１２３、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＬｅｎｎｏｎ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＶｉｖｉ２、ＢｏｒｄｅｔｅｌｌａウイルスＣＮ１、ＢｏｒｄｅｔｅｌｌａウイルスＣＮ２、ＢｏｒｄｅｔｅｌｌａウイルスＦＰ１、ＢｏｒｄｅｔｅｌｌａウイルスＭＷ２、ＢａｃｉｌｌｕｓウイルスＷｂｅｔａ、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓウイルスＷｅａｓｅｌ、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＷｉｌｄｃａｔ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＢｉｌｌｎｙｅ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＴｗｉｓｔｅｒ６、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＷｉｚａｒｄ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＨｏｔｏｒｏｂｏ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＷｏｅｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＴＰ１６０４、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓウイルスＹＤＮ１２、ＲｏｓｅｏｂａｃｔｅｒウイルスＲＤＪＬ１、ＲｏｓｅｏｂａｃｔｅｒウイルスＲＤＪＬ２、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓウイルスＯＰ１、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓウイルスＸｏｐ４１１、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓウイルスＸｐ１０、ＡｒｔｈｏｂａｃｔｅｒウイルスＹａｎｇ、ＡｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａウイルスｐｈｉＪｌ００１、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＬＫＯ４、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＭ６、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＭＰ１４１２、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰＡＥ１、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＹｕａ、ＧｏｒｄｏｎｉａウイルスＹｖｏｎｎｅｔａｓｔｉｃ、ＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＺｅｔａ１８４７、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓウイルスＲＧＬ３、ＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓウイルスＬｉｌｙ、ＶｉｂｒｉｏウイルスＣＴＸｐｈｉ、ＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍウイルスＢ５、ＶｉｂｒｉｏウイルスＫＳＦ１、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓウイルスＣｆ１ｃ、Ｖｉｂｒｉｏウイルスｆｓ１、ＶｉｂｒｉｏウイルスＶＧＪ、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＲＳ５５１、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＲＳ６０３、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＲＳＭ１、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＲＳＭ３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＩｆ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＭ１３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＩ２２、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａウイルスＩＫｅ、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＰＥ２２６、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰｆ１、ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓウイルスＰＳＨ１、ＲａｌｓｔｏｎｉａウイルスＲＳＳ１、Ｖｉｂｒｉｏウイルスｆｓ２、ＶｉｂｒｉｏウイルスＶＦＪ、ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓウイルスＳＭＡ６、ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓウイルスＳＭＡ９、ＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓウイルスＳＭＡ７、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓウイルスＰｆ３、ＴｈｅｒｍｕｓウイルスＯＨ３、ＶｉｂｒｉｏウイルスＶｆＯ３Ｋ６、ＶｉｂｒｉｏウイルスＶＣＹ、ＶｉｂｒｉｏウイルスＶｆ３３、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓウイルスＸｆ１０９、ＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａウイルスＬ５１、ＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａウイルスＳＶＴＳ２、ＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａウイルスＣ７４、ＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａウイルスＲ８Ａ２Ｂ、ＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａウイルスＳｋＶ１ＣＲ２３ｘ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスａｌｐｈａ３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＩＤ２１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＩＤ３２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＩＤ６２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＮＣ２８、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＮＣ２９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＮＣ３５、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｐｈｉＫ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＳｔ１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＷＡ４５、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＧ４、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＩＤ５２、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスＴａｌｍｏｓ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａウイルスｐｈｉＸ１７４、ＢｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏウイルスＭＡＣ１、ＢｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏウイルスＭＨ２Ｋ、ＣｈｌａｍｙｄｉａウイルスＣｈｐ１、ＣｈｌａｍｙｄｉａウイルスＣｈｐ２、ＣｈｌａｍｙｄｉａウイルスＣＰＡＲ３９、ＣｈｌａｍｙｄｉａウイルスＣＰＧ１、ＳｐｉｒｏｐｌａｓｍａウイルスＳｐＶ４、Ｂｏｍｂｙｘ 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ｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｃｈａｌｃｉｔｅｓヌクレオポリヘドロウイルス、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓヌクレオポリヘドロウイルス、Ｃｌａｎｉｓ ｂｉｌｉｎｅａｔａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｃｏｎｄｙｌｏｒｒｈｉｚａ ｖｅｓｔｉｇｉａｌｉｓヌクレオポリヘドロウイルス、Ｃｒｙｐｔｏｐｈｌｅｂｉａ ｐｅｌｔａｓｔｉｃａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｃｙｃｌｏｐｈｒａｇｍａ ｕｎｄａｎｓヌクレオポリヘドロウイルス、Ｅｃｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｅｐｉｐｈｙａｓ ｐｏｓｔｖｉｔｔａｎａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｐｓｅｕｄｏｃｏｎｓｐｅｒｓａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｈｅｍｉｌｅｕｃａ ｓｐｅｃｉｅｓヌクレオポリヘドロウイルス、Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｈｙｐｏｓｉｄｒａ ｔａｌａｃａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｌａｍｂｄｉｎａ ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｌｅｕｃａｎｉａ ｓｅｐａｒａｔａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｌｏｎｏｍｉａ ｏｂｌｉｑｕａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ多ヌクレオポリヘドロウイルス、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｘｙｌｉｎａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ多ヌクレオポリヘドロウイルス、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａヌクレオポリヘドロウイルスＡ、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａヌクレオポリヘドロウイルスＢ、Ｍａｒｕｃａ ｖｉｔｒａｔａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｍｙｔｈｉｍｎａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａヌクレオポリヘドロウイルスＡ、Ｍｙｔｈｉｍｎａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａヌクレオポリヘドロウイルスＢ、Ｏｐｅｒｏｐｈｔｅｒａ ｂｒｕｍａｔａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｏｒｇｙｉａ ｌｅｕｃｏｓｔｉｇｍａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ多ヌクレオポリヘドロウイルス、Ｏｘｙｐｌａｘ ｏｃｈｒａｃｅａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｐｅｒｉｄｒｏｍａ ｓａｕｃｉａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｐｅｒｉｇｏｎｉａ ｌｕｓｃａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｅｍｐｔａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ多ヌクレオポリヘドロウイルス、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ多ヌクレオポリヘドロウイルス、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓヌクレオポリヘドロウイルス、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｓｕｃｒａ ｊｕｊｕｂａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｔｈｙｓａｎｏｐｌｕｓｉａ ｏｒｉｃｈａｌｃｅａヌクレオポリヘドロウイルス、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ｓｉｎｇｌｅヌクレオポリヘドロウイルス、Ｕｒｂａｎｕｓ ｐｒｏｔｅｕｓヌクレオポリヘドロウイルス、Ｗｉｓｅａｎａ ｓｉｇｎａｔａヌクレオポリヘドロウイルス、Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ ｏｒａｎａグラニュロウイルス、Ａｇｒｏｔｉｓ ｓｅｇｅｔｕｍグラニュロウイルス、Ａｒｔｏｇｅｉａ ｒａｐａｅグラニュロウイルス、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａグラニュロウイルス、Ｃｌｏｓｔｅｒａ ａｎａｃｈｏｒｅｔａグラニュロウイルス、Ｃｌｏｓｔｅｒａ ａｎａｓｔｏｍｏｓｉｓグラニュロウイルスＡ、Ｃｌｏｓｔｅｒａ ａｎａｓｔｏｍｏｓｉｓグラニュロウイルスＢ、Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ ｍｅｄｉｎａｌｉｓグラニュロウイルス、Ｃｒｙｐｔｏｐｈｌｅｂｉａ ｌｅｕｃｏｔｒｅｔａグラニュロウイルス、Ｃｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａグラニュロウイルス、Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓグラニュロウイルス、Ｅｐｉｎｏｔｉａ ａｐｏｒｅｍａグラニュロウイルス、Ｅｒｉｎｎｙｉｓ ｅｌｌｏグラニュロウイルス、Ｈａｒｒｉｓｉｎａ ｂｒｉｌｌｉａｎｓグラニュロウイルス、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａグラニュロウイルス、Ｌａｃａｎｏｂｉａ ｏｌｅｒａｃｅａグラニュロウイルス、Ｍｏｃｉｓ ｌａｔｉｐｅｓグラニュロウイルス、Ｍｙｔｈｉｍｎａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａグラニュロウイルスＡ、Ｍｙｔｈｉｍｎａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａグラニュロウイルスＢ、Ｐｈｔｈｏｒｉｍａｅａ ｏｐｅｒｃｕｌｅｌｌａグラニュロウイルス、Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａグラニュロウイルス、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａグラニュロウイルス、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａグラニュロウイルス、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａグラニュロウイルス、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉグラニュロウイルス、Ｘｅｓｔｉａ ｃ－ｎｉｇｒｕｍグラニュロウイルス、Ｃｕｌｅｘ ｎｉｇｒｉｐａｌｐｕｓ核多角体ウイルス、Ｎｅｏｄｉｐｒｉｏｎ ｌｅｃｏｎｔｅｉ核多角体ウイルス、マツノキハバタ核多角体病ウイルス、アキディアヌス両側ウイルス、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ桿菌状ウイルス１、フラボバクテリウムウイルスＦＬｉＰ、スルフォロブス紡錘形ウイルス１、スルフォロブス紡錘形ウイルス２、スルフォロブス紡錘形ウイルス４、スルフォロブス紡錘形ウイルス５、スルフォロブス紡錘形ウイルス７、スルフォロブス紡錘形ウイルス８、スルフォロブス紡錘形ウイルス９、アキディアヌス紡錘形ウイルス１、スルフォロブス紡錘形ウイルス６、パイロバクルム球形ウイルス、サーモプロテウステナックス球状ウイルス１、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｎｅｗｚｅａｌａｎｄｉｃｕｓ液滴型ウイルス、アエロピュルムペルニックス卵形ウイルス１、ソルタープロウイルスＨｉｓ１、Ｇｌｏｓｓｉｎａヒトロサウイルス、ムスカヒトロサウイルス、白斑症候群ウイルス、Ｇｒｙｌｌｕｓ ｂｉｍａｃｕｌａｔｕｓ ｎｕｄｉｖｉｒｕｓ、Ｏｒｙｃｔｅｓ ｒｈｉｎｏｃｅｒｏｓ ｎｕｄｉｖｉｒｕｓ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ ｎｕｄｉｖｉｒｕｓ、スルフォロブス楕円体ウイルス１、アコレプラズマウイルスＬ２、Ａｐａｎｔｅｌｅｓ ｃｒａｓｓｉｃｏｒｎｉｓブラコウイルス、Ａｐａｎｔｅｌｅｓ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａｅブラコウイルス、Ａｓｃｏｇａｓｔｅｒ ａｒｇｅｎｔｉｆｒｏｎｓブラコウイルス、Ａｓｃｏｇａｓｔｅｒ ｑｕａｄｒｉｄｅｎｔａｔａブラコウイルス、Ｃａｒｄｉｏｃｈｉｌｅｓ ｎｉｇｒｉｃｅｐｓブラコウイルス、Ｃｈｅｌｏｎｕｓ ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓブラコウイルス、Ｃｈｅｌｏｎｕｓ ｂｌａｃｋｂｕｒｎｉブラコウイルス、Ｃｈｅｌｏｎｕｓ ｉｎａｎｉｔｕｓブラコウイルス、Ｃｈｅｌｏｎｕｓ ｉｎｓｕｌａｒｉｓブラコウイルス、Ｃｈｅｌｏｎｕｓ ｎｅａｒ ｃｕｒｖｉｍａｃｕｌａｔｕｓブラコウイルス、Ｃｈｅｌｏｎｕｓ ｔｅｘａｎｕｓブラコウイルス、Ｃｏｔｅｓｉａ ｃｏｎｇｒｅｇａｔａブラコウイルス、Ｃｏｔｅｓｉａ ｆｌａｖｉｐｅｓブラコウイルス、Ｃｏｔｅｓｉａ 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ｐｉｌｏｓｕｌｕｓイクノウイルス、Ｈｙｐｏｓｏｔｅｒ ｒｉｖａｌｉｓイクノウイルス、Ｏｌｅｓｉｃａｍｐｅ ｂｅｎｅｆａｃｔｏｒイクノウイルス、Ｏｌｅｓｉｃａｍｐｅ ｇｅｎｉｃｕｌａｔａｅイクノウイルス、Ｓｙｎｅｔａｅｒｉｓ ｔｅｎｕｉｆｅｍｕｒイクノウイルス、アルファポルトグロボウイルスＳＰＶ２、スルフォロブスアルファポルトグロボウイルス１、アップルディンプルフルーツウイロイド、アップルスカースキンウイロイド、オーストラリアブドウウイロイド、柑橘類ベントリーフウイロイド、柑橘類矮性ウイロイド、シトラスウイロイドＶ、シトラスウイロイドＶＩ、グレープバイン黄色スペックルウイロイド１、グレープバイン黄色スペックルウイロイド２、梨ブリスター潰瘍ウイロイド、柑橘類樹皮クラッキングウイロイド、ココナッツカダンカダンウイロイド、ココナッツティナンガジャウイロイド、ホップ潜伏ウイロイド、Ｃｏｌｅｕｓ ｂｌｕｍｅｉウイロイド１、Ｃｏｌｅｕｓ ｂｌｕｍｅｉウイロイド２、Ｃｏｌｅｕｓ ｂｌｕｍｅｉウイロイド３、ダリア潜伏ウイロイド、ホップスタントウイロイド、菊スタントウイロイド、柑橘類外皮ウイロイド、コルムネア潜伏ウイロイド、イレシネウイロイド１、コショウチャットフルーツウイロイド、ジャガイモやせいもウイロイド、トマト頂端スタントウイロイド、トマト退緑萎縮症ウイロイド、トマトプランタマッチョウイロイド、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍコイル型ウイルス、ニトマーウイルスＮＳＶ１、カッコウアザミ葉巻Ｂｕｅａベータサテライト、カッコウアザミ葉巻カメルーンベータサテライト、カッコウアザミ黄葉巻ベータサテライト、カッコウアザミ黄色葉脈ベタサテライト、カッコウアザミ黄色葉脈インドベータサテライト、カッコウアザミ黄色葉脈スリランカベータサテライト、アルテルナンテーラ黄色葉脈ベータサテライト、アンドログラフィス黄色葉脈葉巻ベータサテライト、ベンディ黄色葉脈モザイクベータサテライト、Ｃａｒｄｉｏｓｐｅｒｍｕｍ黄色葉巻ベータサテライト、チリ葉巻ベータサテライト、チリ葉巻ジャウンプールベータサテライト、チリ葉巻スリランカベータサテライト、コットン葉巻ゲジラベータサテライト、コットン葉巻マルタンベータサテライト、クロトン黄色葉脈モザイクベータサテライト、ユーパトリアム黄色葉脈ヒヨドリバナ、ヒヨドリバナ黄色葉脈モザイクヒヨドリバナベータサテライト、フレンチビーン葉巻ベータサテライト、Ｈｅｄｙｏｔｉｓ黄色モザイクベータサテライト、ハニーサックル黄色葉脈ベータサテライト、ハニーサックル黄色葉脈モザイクベータサテライト、Ｍａｌｖａｓｔｒｕｍ葉巻ベータサテライト、Ｍａｌｖａｓｔｒｕｍ葉巻Ｇｕａｎｇｄｏｎｇベータサテライト、ミラビリス葉巻ベータサテライ
ト、ツルレイシ黄色モザイクベータサテライト、マンビーン黄色モザイクベータサテライト、オクラ葉巻オマーンベータサテライト、パパイヤ葉巻ベータサテライト、パパイヤ葉巻チャイナベータサテライト、パパイヤ葉巻インドベータサテライト、リンコシア黄色モザイクベータサテライト、ローズ葉巻ベータサテライト、Ｓｉｅｇｅｓｂｅｃｋｉａ黄色葉脈ベータサテライト、タバコ巻シュートベータサテライト、タバコ葉巻ベータサテライト、タバコ葉巻日本ベータサテライト、タバコ葉巻パトナベータサテライト、トマト葉巻バンガロールベータサテライト、トマト黄化葉巻バングラデシュベータサテライト、トマト黄化葉巻ベータサテライト、トマト葉巻チャイナベータサテライト、トマト葉巻Ｇａｎｄｈｉｎａｇａｒベータサテライト、トマト葉巻Ｊａｖａベータサテライト、トマト葉巻Ｊｏｙｄｅｂｐｕｒベータサテライト、トマト葉巻ラグナベータサテライト、トマト葉巻ラオスベータサテライト、トマト葉巻マレーシアベータサテライト、トマト葉巻ネパールベータサテライト、トマト葉巻パトナベータサテライト、トマト葉巻フィリピンベータサテライト、トマト葉巻スリランカベータサテライト、トマト葉巻イエメンベータサテライト、トマト黄葉巻チャイナベータサテライト、トマト黄葉巻ラジャスタンベータサテライト、トマト黄葉巻山東ベータサテライト、トマト黄葉巻タイベータサテライト、トマト黄葉巻ベトナムベータサテライト、トマト黄葉巻ユンナンベータサテライト、ヴェルノニア黄色葉脈ベータサテライト、ヴェルノニア黄色葉脈フジアンベータサテライト、クロトン黄色葉脈デルタサテライト、Ｍａｌｖａｓｔｒｕｍ葉巻デルタサテライト、シダ黄金黄色葉脈デルタサテライト１、シダ黄金黄色葉脈デルタサテライト２、シダ黄金黄色葉脈デルタサテライト３、サツマイモ葉巻デルタサテライト１、サツマイモ葉巻デルタサテライト２、サツマイモ葉巻デルタサテライト３、トマト葉巻デルタサテライト、トマト黄葉歪みデルタサテライト１、トマト黄葉歪みデルタサテライト２、パイロバクルム糸状ウイルス１、サーモプロテウステナックスウイルス１、デルタ肝炎ウイルス、Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓａ Ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓｑｕａｍａ ＤＮＡウイルス０１、及びＲｈｉｚｉｄｉｏｍｙｃｅｓウイルス。他のウイルスは、ＩＣＴＶマスター種リスト（ｈｔｔｐｓ：／／ｔａｌｋ．ｉｃｔｖｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／ｆｉｌｅｓ／ｍａｓｔｅｒ－ｓｐｅｃｉｅｓ－ｌｉｓｔｓ／ｍ／ｍｓｌ／９６０１）に含まれ、これは参照により本明細書に組み込まれる。
アミノ酸及び核酸配列
表２は、アミノ酸及び核酸配列の要約を提供する。


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実施例
以下の実施例を参照することにより、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、例示のみを目的として提供され、別途指定されない限り、限定的であることを企図しない。したがって、本発明が以下の実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
さらなる説明なしに、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明を作製及び利用し、特許請求される方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を具体的に指摘するものであり、いかなる方法でも本開示の残りの部分を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例１：ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３による毒性核ＲＮＡ病巣の標的化
ここに提示されるデータは、堅牢な非古典的核局在化シグナルを有するＲＮＡ結合ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３が、本明細書にそれぞれｈｉｌｉｇｈｔＲ及びｅｒａｓｅＲと称されるアプローチである、可視化または切断のために、毒性核ＲＮＡ遺伝子座を効率的に標的化することができることを実証している。ＨｉｌｉｇｈｔＲは、触媒的に死んだＣａｓ１３ｂ（ｄＣａｓ１３）を蛍光タンパク質と組み合わせて、生細胞の核中のＣＵＧリピートＲＮＡ病巣を直接可視化し、病巣数の定量化及び病巣動態の観察を可能にする。ＥｒａｓｅＲは、核ＣＵＧリピートＲＮＡを標的とするＣａｓ１３ｂの固有のエンドリボヌクレアーゼ活性を利用して、核病巣を崩壊する。これらの研究は、筋緊張性ジストロフィー１型の同定または治療のいずれかのために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３で毒性核ＲＮＡ病巣を直接標的化する可能性を実証する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３システムの効率的かつ配列プログラム可能な性質は、ゲノム編集の関連するリスクなしに、他のヒト核ＲＮＡ障害の迅速な標的化及び操作を可能にする。
細菌由来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３システムは、ＲＮＡに特異的に結合し、ＲＮＡを切断するためのエンドリボヌクレアーゼとして機能し、ＤＮＡ結合ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関連する生殖細胞系列編集のリスクを回避する。Ｃａｓ１３の２つのヌクレアーゼドメイン内の単一残基変異により、効率的な標的化のためのＰＡＭ配列の必要なしに、哺乳動物システムにおいてプログラム可能なＲＮＡ結合親和性を保持する触媒的に非活性化された酵素（ｄＣａｓ１３）が生成される。サイズが大きく、固有の局在化シグナルの欠如により、Ｃａｓ９及びＣａｓ１３の融合タンパク質は両方とも、哺乳動物核に非効率的に局在化されている。ＲＮＡの標的切断及びポリアデニル化を誘導するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３の新規な適応を記載した最近の前刷り原稿において、酵母Ｔｙ１レトロトランスポゾンに由来する非古典的核局在化シグナル（ＮＬＳ）が同定され、これは、Ｃａｓ１３の堅牢な核局在化を促進する。Ｔｙ１ ＮＬＳの強力な活性は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３での可視化及び切断の両方について、核ＲＮＡの効率的な標的化を達成し得ることを示唆した。
毒性ＲＮＡ病巣は、ＤＭ１の細胞の特徴である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３を使用して核ＲＮＡを可視化するために、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５－１２５由来の触媒的に死んだＶＩ－Ｂ Ｃａｓ１３ｂ酵素（ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ）と、Ｃ末端増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質であるｍＣｈｅｒｒｙのいずれかとを組み合わせて融合タンパク質を設計した（図１Ａ）。３ｘＦＬＡＧエピトープタグ（Ｆ）及びＴｙ１核局在化配列（Ｔｙ１ ＮＬＳ）をｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ融合タンパク質のＮ末端に付加して、効率的な核局在化を促進した。以下、ｈｉｌｉｇｈｔＲ緑色またはｈｉｌｉｇｈｔＲ赤色と称する（図１Ａ）。毒性ＲＮＡ病巣は、ＤＭ１の細胞の特徴であり、拡張されたＣＵＧリピートを発現する導入遺伝子の発現によって、多くの細胞型において誘導される可能性がある。ＤＭ１を有する患者において見出される核ＲＮＡ病巣を模倣するために、ヒトＤＭＰＫ３’ＵＴＲ（ＤＴ９６０）中に９６０ＣＵＧリピートを含有するベクターを利用した（図１Ｂ）。ＤＴ９６０構築物は、細胞中のＲＮＡ病巣形成を再集計するのに十分であり、アンチセンス（ＣＡＧ）リピートプローブを使用した蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、またはｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＢＮＬ１融合タンパク質で検出することができる（図１Ａ及び図１Ｂ）。ｈｉｌｉｇｈｔＲ融合タンパク質をＣＵＧリピートに標的化するために、９つのＣＵＧリピートとハイブリダイゼーションすることが予測される、アンチセンスＣＡＧリピート標的配列（ＣＡＧｘ９）を含有するＰｓｐＣａｓ１３ｂ適合ｃｒＲＮＡを設計した（図１Ｃ）。ＣＡＧｘ９リピートｃｒＲＮＡによってガイドされ、ｈｉｌｉｇｈｔＲ緑色及び赤色は完全に核局在化され、ＤＴ９６０ベクターによって生成された核ＲＮＡ病巣を強調した（図１Ｄ及び図４）。対照的に、ｈｉｌｉｇｈｔＲ構築物及び非標的化ｃｒＲＮＡの共発現は、広範囲で非局在化核蛍光をもたらした（図１Ｄ及び図１Ｃ）。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲートＣＡＧオリゴヌクレオチドプローブ（ＡＦ４８８－ＣＡＧｘ７）と共局在化したｈｉｌｉｇｈｔＲ緑色で標識した核病巣はＦＩＳＨを使用して検出された（図２Ａ）。以前の報告と一致して、ＭＢＮＬ１タンパク質と共局在したｈｉｌｉｇｈｔＲグリーンで標識された核病巣はｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＢＮＬ１融合タンパク質を使用して検出され、スプライシングスペックルと部分的に共局在化された核病巣は、ＳＣ－３５に特異的な抗体で検出された（図２Ｂ及び図５）。これらの結果は、ｈｉｌｉｇｈｔＲがＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡ病巣を正確に検出することを実証している。
ＣＵＧ ｅｘｐ ＲＮＡ病巣は、その固有のエンドリボヌクレアーゼ活性を使用して、毒性ＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡの標的化された切断に有用であり得ることを示唆した。Ｃａｓ１３は、哺乳動物及び植物細胞におけるｍＲＮＡ転写産物の特異的切断に有用であることが示されている。Ｃａｓ１３エンドリボヌクレアーゼ活性がＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡ病巣を切断するのに十分であるかどうかを決定するために、部位指向性変異誘発を使用してＰｓｐＣａｓ１３ｂの触媒変異を再活性化することによって、ｈｉｌｉｇｈｔＲ緑色融合タンパク質を改変した。驚くべきことに、活性化されたｈｉｌｉｇｈｔＲ緑色は、非標的化ガイドＲＮＡと比較して、ｃｒＲＮＡを標的化するＣＡＧｘ９を使用して、ＲＮＡ病巣の数を有意に低減させなかった。しかしながら、Ｎ末端Ｔｙ１ ＮＬＳを含有するが、Ｃ末端ｅＧＦＰを欠く活性化ＰｓｐＣａｓ１３ｂ（本明細書ではｅｒａｓｅＲと称する）は、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＮＢＬ１融合タンパク質を用いて定量化されたＲＮＡ病巣の数及び強度の有意な低減をもたらした（図３Ａ及び図３Ｂ）。標的部位の隣接配列は、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼ活性化に影響を及ぼすことができるため、ＣＡＧｘ９ ｃｒＲＮＡを、他の２つのリーディングフレーム（ＣＡＧｘ９－ｆ２及びＣＡＧｘ９－ｆ３）において試験した。３つすべてのＣＡＧｘ９ ｃｒＲＮＡによって導かれるＥｒａｓｅＲは、非標的化ｃｒＲＮＡと比較して、細胞当たりのＲＮＡ病巣の数及び強度の有意な低減をもたらした（図３Ａ及び図３Ｂ）。さらに、Ｎ末端Ｔｙ１ ＮＬＳを含有し、Ｃ末端ｅＧＦＰを欠く触媒的に死んだＰｓｐＣａｓ１３ｂは、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＮＢＬ１融合タンパク質を使用して定量化されたＲＮＡ病巣の数及び強度を有意に低減させなかった（図６）。これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３がＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡ病巣を崩壊するのに十分であることを初めて実証している。
現在、筋緊張性ジストロフィーまたは他のヒトＲＮＡリピート拡張障害のための利用可能な治療的処置は存在しないが、ＲＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの急速な進行は、ＤＭ１を治療するための標的化アプローチがすぐに達成可能であるという希望を提供する。ＡＳＯは、スプライシング因子と毒性ＲＮＡ病巣との間の結合を崩壊するのに非常に効率的であるが、これらのアプローチは、不適切な送達方法によって現在制限されている。さらに、ＤＭＰＫまたはＭＢＮＬ発現を回復させるための遺伝子療法アプローチは、ＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡの結果として生じる機能欠損の優性細胞傷害性の獲得を救出するのに不十分である。したがって、ＣＵＧ ＲＮＡの標的化された崩壊は、ＲＮＡ誘発性疾患を低減または予防するための有望な戦略である。強力な非古典的Ｔｙ１ ＮＬＳによって局在化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３を使用して、可視化及び標的化された分解の両方についてＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡ病巣を効率的に標的化できることが本明細書で実証される。Ｔｙ１ ＮＬＳは、酵母ＬＴＲ－レトロトランスポゾンに由来し、それは細胞質におけるＲＮＡ中間体の逆転写、それに続くゲノム複製のための核におけるプロウイルスＤＮＡコピーの統合を使用する。細胞分裂中に開放有糸分裂を行う高等真核生物とは対照的に、酵母は閉鎖有糸分裂を行い、その間、核エンベロープは無傷のままである。Ｔｙ１の生合成中、レトロトランスポゾンゲノム複合体の核内移入は、能動的核内移入を必要とし、したがって、レトロトランスポジションに必要とされる堅牢なＮＬＳを含有する。興味深いことに、核エンベロープを保持する静止状態の哺乳動物細胞において、同様に、Ｃａｓタンパク質による核ＲＮＡの効率的な標的化にＴｙ１ ＮＬＳが必要とされる可能性がある。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３のプログラム可能な性質により、ｃｒＲＮＡ標的配列の単純な修飾を通じて、ｈｉｌｉｇｈｔＲ及びｅｒａｓｅＲが、他の核ＲＮＡの研究及び切断、または筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病様２（ＨＤＬ２）、脊髄小脳失調症８、３１、及び１０（ＳＣＡ８、ＳＣＡ３１、ＳＣＡ１０）、ならびに脆弱Ｘ関連振戦失調症候群（ＦＸＴＡＳ）などの他のリピート拡張障害に容易に適合することができる。短いタンデムリピート配列を直接標的化する他のシステム（ＡＳＯまたはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）と同様に、非病原性の短いリピートモチーフを含有する他のヒトｍＲＮＡ転写産物のオフターゲット切断の可能性が残る。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３融合タンパク質でのマイクロサテライトＲＮＡの分解のための、または他の形態のＲＮＡ操作による特有のＤＭＰＫ配列を標的化することは、毒性ＲＮＡ疾患の治療のためのさらなるアプローチを提供し得る。
次に材料及び方法を説明する。
合成ＤＮＡ及びクローニング
ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂに融合したＮ末端３ｘＦＬＡＧ及びＴｙ１ ＮＬＳを含有する哺乳動物発現ベクターを修飾して、Ｃ末端増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）またはｍＣｈｅｒｒｙ赤色蛍光タンパク質をコードした。すべてのｃｒＲＮＡは、３０ヌクレオチド長で、ｐＣ０００４３におけるｈＵ６プロモーターからの効率的な転写のために５’Ｇで開始するように設計された。陰性対照の非標的化ｃｒＲＮＡは、先に記載されている。ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＢＮＬ発現プラスミドを生成するために、ヒトＭＢＮＬ１のコード配列を設計し、ｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として会合のために合成し、ＣＳ２ｍＣｈｅｒｒｙ哺乳動物発現プラスミドにクローニングした。
細胞培養及び免疫組織化学
ＣＯＳ７細胞株を、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃でペニシリン／ストレプトマイシンを含む１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中で維持した。細胞を６ウェルプレート中のガラスカバースリップに播種し、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って一過性にトランスフェクションした。一過性にトランスフェクションされたＣＯＳ７細胞を、ＤＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒド中で１５分間固定し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中でブロックし、１％ＢＳＡ中の一次抗体とともに、室温で４時間インキュベーションした。使用した一次抗体は、１：１０００の抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ１８６４）及び１：１０００の抗ＳＣ－３５（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１８２６）であった。続いて、細胞を、室温で３０分間、１％ＢＳＡ中のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８または５９４コンジュゲート二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）とともにインキュベーションした。ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｈ－１２００）を含有する抗退色蛍光増大培地を使用してカバースリップを取り付け、共焦点顕微鏡を使用して撮像した。
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
トランスフェクション後、細胞を氷冷１００％メタノール中で－２０℃で１０分間固定し、次いでＤＰＢＳで２回洗浄し、洗浄緩衝液［２×ＳＳＣ ｐＨ７．０、１０％ホルムアミド］で１回洗浄した。続いて、細胞を、１００ｎＭの最終プローブ濃度を有するハイブリダイゼーション緩衝液［１０％デキストラン硫酸塩、２×ＳＳＣ ｐＨ７．０、１０％ホルムアミド］中のプローブとハイブリダイゼーションした。細胞を３７℃で一晩ハイブリダイゼーションした。次いで、細胞を３７℃で洗浄緩衝液中で３０分間１回洗浄し、次いで、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）を有するＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄでスライド上に取り付け、共焦点顕微鏡を使用して撮像した。プローブは、５’Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８染料とコンジュゲートし、ＨＰＬＣ（ＩＤＴ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製された２１量体ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号３０３））であった。
実施例２：消去剤によるＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡの標的化された分解
筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）は、８，０００人に１人で発生する遺伝性多系統の進行性衰弱性疾患であり、特定の集団においては５００人に１人という高い発症率であり、ＤＭ１患者の約８０％で心臓合併症が発症し、主な死因である。ＤＭ１は、ヒトジストロフィー筋緊張症タンパク質キナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の非コード３’非翻訳領域におけるＣＵＧトリヌクレオチドリピートの拡張及び発現から生じる（図８）。約５０を超えるＣＵＧリピートを有する変異体ＤＭＰＫ ｍＲＮＡは、毒性核ＲＮＡ病巣を形成し、これは、ＲＮＡ結合タンパク質のｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ様（ＭＢＮＬ）ファミリーのメンバーを隔離することによって、正常なＤＭＰＫ発現を妨げ、代替スプライシングにおける広範な欠陥を誘導する（図８）。ＤＭ１発症の基礎となる多数の崩壊された筋肉遺伝子により、患者は、しばしば心房及び心室不整脈、拡張型心筋症、ならびに心筋線維症を含む、種々の臨床的心臓表現型を示す。現在、ＤＭ１を治療するための承認された療法は存在せず、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を使用してリピート病巣を標的化する以前のアプローチは、成人ヒト心筋及び骨格筋への非効率的な送達のために依然として困難である。
実施例１で実証されたように、ＲＮＡ結合ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３は、堅牢な非古典的核局在化シグナルで局在化された場合、細胞内の毒性核ＲＮＡ病巣を可視化し、分解するために使用され得、ツールはｈｉｌｉｇｈｔＲ及びｅｒａｓｅＲと名付けられる（図８）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ技術は、従来の遺伝子療法交代戦略を使用しては矯正することができないヒトＲＮＡ疾患の治療のために標的化された治療薬を開発することができるという希望を提供する。しかしながら、毒性ＲＮＡ病巣の分解が、心臓におけるＤＭ１の病因を予防するのに十分であるか、またはＤＭ１に関連する細胞及び電気的リモデリングが可逆的であるかは、依然として不明である。ＤＭ１のマウス心臓モデルにおけるｅｒａｓｅＲを有する毒性ＲＮＡ病巣の標的化された分解は、正常なＲＮＡスプライシングを回復することによって心臓遺伝子発現及びポンプ機能を改善する（図８）。本明細書に記載されるように、ｅｒａｓｅＲは、ＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡをインビボで崩壊するための効率的かつ特異的なツールとして開発され、ＤＭ１のマウス心臓モデルにおいてｅｒａｓｅＲを使用して治療転帰を決定する。
毒性核病巣は、Ｃａｓ１３によって標的化され得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３システムは、ＲＮＡのみに結合し、標的ＲＮＡを切断するための特異的エンドリボヌクレアーゼとして機能し、ＤＮＡ結合ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関連する生殖細胞系列編集のリスクを回避する。しかし、それらのサイズが大きく、固有の局在化シグナルの欠如により、Ｃａｓ１３の融合タンパク質は哺乳動物核に非効率的に局在化されている。最近、発明者らは、Ｃａｓ１３の堅牢な核局在化を促進する酵母Ｔｙ１レトロトランスポゾンに由来する非古典的核局在化シグナル（ＮＬＳ）を同定した。Ｔｙ１ ＮＬＳの強力な活性は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３を使用した可視化または切断のいずれかについて、核ＲＮＡの効率的な標的化を達成し得ることを示唆した。
核リピートＲＮＡが生細胞中で可視化され得ることを決定するために、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５－１２５由来の触媒的に死んだＶＩ－Ｂ Ｃａｓ１３ｂ酵素（ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ）及びＣ末端増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を使用して融合タンパク質を設計した（図１Ａ）。ＤＭ１を有する患者において見出される核ＲＮＡ病巣を模倣するために、ヒトＤＭＰＫ３’ＵＴＲ（ＤＴ９６０）中に９６０ＣＵＧリピートを含有するベクターの一過性発現を使用した（図１Ｂ）。ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ－ｅＧＦＰ融合タンパク質をＣＵＧリピートに標的化するために、９つのＣＵＧリピートとハイブリダイゼーションすることが予測される、ＣＡＧリピート標的配列を含有するＰｓｐＣａｓ１３ｂ適合ｃｒＲＮＡを設計した（図１Ｃ）。ＣＡＧリピートｃｒＲＮＡによってガイドされ、ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂ－ｅＧＦＰの共トランスフェクションは完全に核局在化され、ＤＴ９６０の発現由来の特異的に生成された核ＲＮＡ病巣を強調した（図１Ｄ）。対照的に、非標的化ｃｒＲＮＡでの共発現は、広範囲にわたる非局在化核蛍光をもたらした（図１Ｄ）。Ｃａｓ１３のＣＵＧ ＲＮＡ病巣に対する効率的な核標的化は、その固有のエンドリボヌクレアーゼ活性を使用して、ＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡの標的化された切断のための有用なツールであり得ることを示唆した。
ＥｒａｓｅＲはインビトロで毒性ＲＮＡ病巣を分解することができる
Ｔｙ１ ＮＬＳを含有する活性化されたＰｓｐＣａｓ１３ｂは、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭＮＢＬ１を使用して検出されるように、ＲＮＡ病巣の数及び強度の有意な低減をもたらした（図３Ａ及び図３Ｂ）。周囲の標的配列は、Ｃａｓ１３ヌクレアーゼ活性に影響を及ぼす可能性があるため、ｃｒＲＮＡは、３つすべてのリーディングフレームにおいて試験され、すべてのＣＡＧｘ９ ｃｒＲＮＡは、細胞当たりのＲＮＡ病巣の数の有意な低減をもたらした（図３）。これらのデータは、ｅｒａｓｅＲが、インビトロでヒトＤＭＰＫ遺伝子においてＣＵＧｅｘｐによって誘導される毒性ＲＮＡ病巣を効率的に低減させることを示す。
これらの研究は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３がＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡを標的化及び分解するのに十分であり、ＤＭ１を治療するための新規の治療的アプローチの開発への明確な経路を提供することを最初に実証したものである。追加の研究は、ＤＭ１の心臓ヒト化マウスモデルにおける毒性ＲＮＡ病巣のｅｒａｓｅＲの切断及び有効性を向上させるパラメータを決定するために厳密に設計及び制御される。重要なことに、本明細書で開発及び試験されるツールは、ヒトＤＭ１患者に送達され得るものと同一である。
ｅｒａｓｅＲでのＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡの標的化された分解
複数の変数が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３エンドリボヌクレアーゼ活性化の切断効率に影響を及ぼす可能性があり、最終的には、ＤＭ１を治療するためのｅｒａｓｅＲの切断の効率性及び治療的可能性を強調することになるだろう。ここに提示されたデータは、ｅｒａｓｅＲがすでにＲＮＡ病巣を有意に分解することができることを示したが、Ｃａｓ１３タンパク質、ｃｒＲＮＡガイド、及び／または標的配列への修飾によって切断効率をさらに向上させることができるかどうかは、ここで決定される。細胞におけるＲＮＡ病巣の低減を、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ｍＣｈｅｒｒｙタグ付けされたＭＢＮＬ１を使用した蛍光、ＤＴ９６０転写産物に特異的なプライマーを使用した定量的リアルタイムＰＣＲを使用して分析する。
種々のＣａｓ１３ファミリーメンバー。ＥｒａｓｅＲは、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５－１２５由来のＣａｓ１３ｂを利用し（ＰｓｐＣａｓ１３ｂ）、これは先にＲＮＡ塩基編集のための最も堅牢なＣａｓ１３メンバーであることが示されていた。しかしながら、Ｃａｓ１３システムは４つの主要なファミリー（Ｃａｓ１３Ａ～Ｄ）によって構成され、ＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡ病巣を分解するために異なる切断活性を提供する可能性がある。したがって、代表的なＣａｓ１３タンパク質を、ＣＳＸ発現ベクターへのＮ末端Ｔｙ１ ＮＬＳ融合物でクローニングし、それらの相対的切断効率をＰｓｐＣａｓ１３ｂと比較して決定する。
ガイドＲＮＡ長。天然に生じるすべてのＣａｓ１３ ＣＲＩＳＰＲアレイは、特定のスペーサー長及びダイレクトリピート長を有し、スペーサー長は、ＲＮＡ標的配列のサイズに対応する。ＰｓｐＣａｓ１３を用いた初期研究は、内因性スペーサーサイズと一致する３０ヌクレオチドのスペーサー長を利用した。しかしながら、スペーサー長は、標的配列認識、切断活性化、またはＣａｓ１３酵素のタンデムリピート配列へのパッキングに影響を及ぼし得る。したがって、より短い（２５ｎｔ）、及びより長い（３５、４０、４５、５０、５５及び６０ｎｔｓ）長さでｃｒＲＮＡを試験することによって、スペーサー長が、病巣の分解に影響を与えるかどうかを試験する。
付属タンパク質によるＣＲＩＳＰＲ切断活性による活性化。いくつかのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ファミリーは、切断効率を阻害するか、または増強する役割を果たす、より小さなＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質とクラスター化されている。以前にＣａｓ１３ｂ切断活性を増強することが示されているＣｓｘ２８の共発現が、発明者らの細胞システムアッセイを使用してＲＮＡ病巣の分解を増強するかどうかを決定する。
ｅｒａｓｅＲによるＲＮＡ病巣の低減がインビボでＤＭ１心血管表現型を改善するかどうかの決定。
９６０ＣＵＧリピート（ＣＵＧ９６０）を有するヒトＤＭＰＫ遺伝子をコードするＴｅｔ誘導性導入遺伝子を有する心臓ＤＭ１マウスモデルを使用し、心臓特異的ｔＴＡ導入遺伝子（Ｍｙｈ６－ｔＴＡ）を使用して誘導する（図９）。この構築物の発現は、ＭＢＮＬ関連ＲＮＡ病巣形成、スプライシング欠陥、ならびに拡張型心筋症、不整脈及び収縮性欠陥を含む心機能障害を誘発することが以前に示されている。簡潔に述べると、ＣＵＧ９６０ホモ接合マウスをヘミ接合ｔＴＡマウスと交配して、バイトランスジェニック子孫（ＣＵＧ９６０及びＭｙｈ６－ｔＴＡ）ならびに単一のトランスジェニック（ＣＵＧ９６０）対照を生成する（図９Ａ及び図９Ｂ）。
マウスにおけるＡＡＶ９ウイルスを用いた心筋細胞特異的遺伝子送達。ＡＡＶ９血清型ウイルスは、心臓における遺伝子の送達及び発現のための有望な治療用ベクターである。ＥｒａｓｅＲ及びガイドＲＮＡ発現カセットを、ＡＡＶ９ウイルスパッケージングプラスミドにサブクローニングし、高力価ウイルスを生成する（図９Ｃ）。これらの研究のために、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ及びＣＡＧｘ９ガイドＲＮＡを使用したｅｒａｓｅＲを使用する。心筋細胞特異的発現のためにニワトリ心臓トロポニンＴプロモーター（ｃＴｎＴ）によって駆動されるルシフェラーゼをコードするＡＡＶ９ウイルス（ｐＡＡＶ：ｃＴＮＴ：：ルシフェラーゼ）は、生後１０日目（Ｐ１０）の新生児に腹腔内注射し、１０週間後に１５０μｇ／ｇのルシフェリンを使用して可視化した場合、堅牢な心臓特異的発現を示した（図９Ｄ）。Ｐ１０において、３．７５ｅ１１ ｇｃ／ｍＬのＡＡＶを、６匹の雄及び６匹の雌のＣＵＧ９６０：ｔＴＡバイトランスジェニックマウス、ならびに同数の雄及び雌の単一のトランスジェニック対照において、浅側頭静脈を介して注入する。注射の１２週間後に測定（下記参照）を行う。ＥｒａｓｅＲ処置マウスは、改善された心機能を示す（図９Ｅ）。
ｅｒａｓｅＲ処置が心エコー図及び心電図によって心機能を改善するかどうかの決定。ＳＩＧ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃｓ Ｖｅｖｏ２１００を使用した２次元心エコー図法によるＡＡＶ媒介性ｅｒａｓｅＲ注入の１２週間後に連続心エコー図法を実施する。心拍数（ＨＲ）、短縮率（ＦＳ）、駆出率（ＥＦ）、及び左心室寸法の測定値を記録し、比較した。短縮率（％ＦＳ）は、心機能の障害を示すために使用され、４０％未満の％ＦＳは、心筋症を示すために使用される。麻酔したマウスのＥＣＧ測定は、ＡｄＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＢｉｏＡｍｐ ＥＣＧ装置を使用して測定する。ＥＣＧ記録を各動物について１０分間捕捉し、ＬａｂＣｈａｒｔ７ソフトウェアを使用して解析する。ＰＲ及びＱＲＳ間隔の長さは、ＤＭ１では延長されるため、これには特に注意が払われる。
ｅｒａｓｅＲ処置されたＤＭ１心臓における心臓組織学及びＲＮＡ病巣の評価。心エコー図及びＥＣＧ測定の後、パラフィン包埋による組織学的分析のために心臓を収集する。Ｈ＆Ｅ染色を使用して、肉眼解剖学と心筋細胞の形態の差異を可視化する。心臓の成長の変化を同定するために、形態測定には、心臓重量対体重、心臓重量対脛骨長、左心室後壁厚、及び心室中隔厚が含まれる。１２週齢で、非侵襲的心臓モニタリング実験を実施した後、半分のマウスからの心臓を組織学的に採取し、半分の心臓をｑＲＴ－ＰＣＲを使用して分析して、ＣＵＧ９６０導入遺伝子のノックダウン及びスプライシングの救出を決定する。５’Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８染料とコンジュゲートした２１ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いて、１２週目にＦＩＳＨによって核病巣を調べる。核は、ＤＡＰＩで対比染色される。ＥｒａｓｅＲ処置マウスは、核病巣を顕著に低減させ、毒性ＲＮＡのレベルを減少させた。
ＤＭ１のために開発されたモデルは、表現型の重症度が大きく変わりる可能性があり、性別特有の違いは、心臓表現型及び心臓電気生理学の転帰を妨げる可能性がある。男性ＤＭ１患者は、ＤＭ１症状を呈する可能性が高く、女性患者よりも心臓伝導障害を発症するリスクが高い。性別特有の違いの重要性を考慮して、両方の性別が調べられる。
統計的方法。スチューデントのｔ検定は、単一の処置を比較するために適用される。複数の生理学的及び生化学的アッセイを、一元配置または反復測定ＡＮＯＶＡを使用して解析する。事後解析（すなわち、Ｎｅｗｍａｎ－Ｋｅｕｌｓ）を実施する。
実施例３：ｄＣａｓ１３でのＲＮＡ可視化及び融合タンパク質局在化の強化
ｄＰｓｐＣａｓ１３ｂと強化ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）とを融合し、Ｔｙ１ ＮＬＳと組み合わせることで、核ＲＮＡ病巣の堅牢で特異的な視覚化が可能になった（図１０Ａ）。マイクロサテライトリピート拡張されたＲＮＡ病巣の視覚化のために、バックグラウンドを超える標的ＲＮＡシグナル強度は、１）リピートＲＮＡ配列内の複数のＲＮＡ標的配列、及び２）核病巣内のシグナルの病巣濃度によって補助される。特有のまたは低コピーのＲＮＡ配列を標的とする視覚化用途は、伝統的に、シグナル対ノイズ比が低いことによって妨げられる。本明細書では、１）ｄＣａｓ１３標的化されたＲＮＡのシグナル対ノイズ比を増強するか、または融合タンパク質の標的ＲＮＡ配列への局在化を増加させるＣａｓ１３についてのアプローチを記載する。
このアプローチは、ＧＦＰと同様であり、１１本のベータ鎖のベータバレル構造からなるｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰに固有の蛍光相補性に依存する。ｓｆＧＦＰからの第１１のベータ鎖を欠失させると、蛍光活性を失うが、第１１のベータ鎖は、蛍光を回復させるためにシスまたはトランスで送達され得る。さらに、第１１の鎖は、最初の１０個のベータ鎖をコードするｓｆＧＦＰと共発現させると、タンパク質上の小さなタグとして機能し、ＧＦＰ融合タンパク質を再構成することができる（図１０Ｂ）。Ｓ１１鎖のタンデムア会合は、ｄＣａｓ１３標的化されたＲＮＡのシグナル対ノイズ比を増加させる可能性を有する（図１０Ｃ）。さらに、このアプローチは、目的のタンパク質への融合をコードするｓｆＧＦＰ１－１０と共発現した場合に、より多数の融合タンパク質（プロテインＸ）を標的化するために同様に有用であり得る（図１０Ｄ）。
実施例４：統合欠損レンチウイルスベクターで送達されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３によるコロナウイルスＲＮＡの標的化された破壊
ここに提示されるデータは、１）必須及び保存されたコロナウイルスＲＮＡ配列を標的とする有効なＣＲＩＳＰＲ－ガイドＲＮＡを同定すること、２）堅牢なコロナウイルスＲＮＡ切断のための最も堅牢なガイドＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３プラットフォームを同定すること、ならびに３）コロナウイルススパイクタンパク質で偽型化された非統合レンチウイルスベクターを役立てることに対するアプローチとして、ＲＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３プラットフォームを使用することの有効性を実証している。これらの実験は、コロナウイルス感染症を治療するための新規の標的された治療薬の開発への主要な第一歩を表す。特に、このアプローチの迅速なプログラム可能性及び送達は、多様なコロナウイルス株またはインフルエンザなどの他の感染性ＲＮＡウイルスを標的にするように適合され得る。
コロナウイルスのライフサイクル
コロナウイルスゲノムは、キャップされ、ポリアデニル化された大きな（約３０ｋｂ）一本鎖ｍＲＮＡによってコードされ、宿主タンパク質による翻訳を可能にする。コロナウイルスゲノムはＲＮＡ中間体を介して完全に複製され、全長ゲノムｍＲＮＡとネストされたサブゲノムｍＲＮＡの両方を生成し、多数のウイルスタンパク質の発現を可能にする。
標的化
コロナウイルス複製及び転写の結果、５’配列（リーダー）及び３’配列（Ｓ２ＭまたはヌクレオカプシドＯＲＦ）は、ゲノム及びすべてのサブゲノムＲＮＡに共通である（図１１）。これらの配列は、広範な有効性の能力を有するガイドＲＮＡの設計の機会を提供する。タイリングＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ領域におけるコロナウイルス標的配列を含有するルシフェラーゼレポーターｍＲＮＡを使用して、細胞ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験する。
切断
コロナウイルス標的配列のＲＮＡ切断の有効性及び特異性は、新強化されたガイドＲＮＡ発現構築物及び／またはＣＲＩＳＰＲアレイで、新規のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３システム（ｅｒａｓｅＲプラットフォーム）を利用して、上記のアッセイにおいて決定される（図１２）。
送達
レンチウイルスベクターは、エンベロープ化されており、異なるウイルスエンベロープタンパク質で偽型化されて、ウイルスの向性を変えることができる（図１３）。ＡＣＥ２発現細胞型を形質導入するためのコロナウイルスエンベロープスパイクタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクターの有効性及び安定性を決定する。非統合の第３世代レンチウイルスベクターは、触媒的に不活性なインテグラーゼを使用して産生され、永続的な発現がなく、ウイルスＲＮＡクリアランスのための安全かつ一過性の発現アプローチを提供する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３構成要素をコードするレンチウイルス構築物を、ウイルスエンベロープタンパク質で偽型化された非統合レンチウイルス粒子にパッケージングすることができる。例えば、レンチウイルス粒子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス由来のスパイク糖タンパク質で偽型化することができ、これは、ＡＣＥ２受容体発現細胞への侵入に対する特異性を提供する。（図１４Ｂ）。これにより、「コロナウイルス標的化された」細胞型に特異的な標的化を可能になる。形質導入後、非統合レンチウイルスエピソームの処理及び形成は、ＣｏＶゲノム及びサブゲノムウイルスｍＲＮＡの急性の標的化された分解のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３構成要素の一過性発現を可能にする（図１４Ｃ）。
ＳＡＲＳ－２－ＣｏＶ Ｓ２Ｍ配列を含有するルシフェラーゼレポーターを使用した。（図１７Ａ）。ＣｏＶリーダー配列を標的化する７つのｃｒＲＮＡを設計した。（図１７Ｂ）。細胞ベースのルシフェラーゼアッセイは、非標的化ｃｒＲＮＡに対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リーダー配列（ｃｒＲＮＡ Ａ～Ｇ）またはルシフェラーゼコード配列（Ｌｕｃ）を標的とするｃｒＲＮＡを有する細胞におけるＣｏＶリーダーＬｕｃレポーター活性の堅牢なノックダウンを実証している（図１７Ｃ）。
さらに、ＳＡＲＳ－２－ＣｏＶ Ｓ２Ｍ配列を含有するルシフェラーゼレポーターを使用した。（図１８Ａ）。ＳＡＲＳ－２－ＣｏＶ Ｓ２Ｍ配列を標的とする６つのｃｒＲＮＡを設計した。（図１８Ｂ）。細胞ベースのルシフェラーゼアッセイは、非標的化ｃｒＲＮＡに対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２Ｍ配列（ｃｒＲＮＡ Ａ～Ｆ）またはルシフェラーゼコード配列（Ｌｕｃ）を標的とするｃｒＲＮＡを有する細胞におけるＣｏＶ Ｓ２Ｍ Ｌｕｃレポーター活性の堅牢なノックダウンを実証している（図１８Ｃ）。
実施例５：ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ ｃｒＲＮＡアレイのワンステップ指向性会合
ここに提供されるデータは、ＤＲ配列内のヌクレオチド置換を含有する複数のアニーリングされたオリゴ対の直接ライゲーションによってｃｒＲＮＡアレイを生成するためのアプローチの設計及び検証を実証している（図１９Ｄ）。この迅速な会合アプローチを使用して、３つのスペーサー配列についてのタンデム順序付けられたアレイを効率的に生成し、これは、顕著には、ＤＲ配列内にポリＴストレッチを含有せず、それによって、完全長アレイ転写を促進する。これらの位置での他の潜在的なヌクレオチド置換を考慮すると、ＤＲ Ｔストレッチを欠く最大７つのｃｒＲＮＡのアレイは、単一ステップで会合することができるか、またはＤＲ Ｔストレッチが含まれる場合、最大８つのｃｒＲＮＡのアレイで会合することができる（図１９Ｅ）。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ガイドＲＮＡは、タンデムアレイにおける細菌種において天然に生じし、その後、Ｃａｓ１３媒介性切断によって単一のガイドに処理される（図１９Ａ）。この切断活性は、標的ＲＮＡ切断活性から分離可能であり、したがって、「触媒的に死んだ」（ｄＣａｓ１３）は、このｃｒＲＮＡ処理能力を保持する。多くのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ダイレクトリピートは、哺乳動物細胞において、ｈＵ６などの一般的に使用されるＰｏｌ ＩＩＩプロモーターからの単一またはタンデム全長ｃｒＲＮＡ発現を阻害する可能性を有する４～５ヌクレオチドのポリＴ配列を含有する（図１９Ｂ）。結晶学的研究は、ポリＴストレッチがダイレクトリピート（ＤＲ）のループ領域で生じること、及び少なくとも１つのＴヌクレオチドが空間に突出することを明らかにし、それがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３結合または切断において重要な役割を果たさないことを示唆している。本明細書に示されるように、このＴストレッチ内の２つの位置の変異、Ｔ１７ＣまたはＴ１８Ｃは、ｄＣａｓ１３またはＣａｓ１３媒介活性を阻害しない。したがって、これらの変化を利用して、ＤＲ配列内に多様性を生成し、多重的、指向性クローニングを可能にすることができる。
哺乳動物のガイドＲＮＡ発現カセットは、概して、スペーサー配列を含むアニーリングされたオリゴヌクレオチドを、哺乳動物のＰｏｌ ＩＩＩプロモーター、ダイレクトリピート、及び６つ以上のＴのターミネーターからなるカセットにクローニングすることによって作製される（図１９Ｃ）。一般的に、複数のガイドＲＮＡは、追加のＰｏｌ ＩＩＩプロモーターカセットを添加することによって発現されるが、これは、ベクターの複雑性及びサイズを著しく増加させる可能性がある。タンデムｃｒＲＮＡアレイの生成は、ベクターのサイズ要件を著しく減少させるであろうが、長いアレイのヌクレオチド合成は、ＤＲ配列のサイズ及びリピート性質により禁止されている。
実施例６：ＣＲＩＳＰＲ ｃｒＲＮＡアレイでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス配列の増強されたノックダウン
実施例４は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス配列をコードするルシフェラーゼレポーターの堅牢なノックダウンが可能なＣＲＩＳＰＲガイド－ＲＮＡの設計及び検証を実証している。実施例５は、Ｃａｓ１３ｂダイレクトリピートのループ領域内の非必須残基における塩基置換を利用する、タンデムｃｒＲＮＡアレイの方向性会合のためのクローニング戦略の開発を実証している（図１９Ｅ及び図２０Ａ）。ここに提示されるデータは、これらの２つのループ残基（Ｔ１７及びＴ１８）内のすべての可能な塩基変異が、ルシフェラーゼコード配列（Ｌｕｃ－ａ及びＬｕｃ－ｂ）を標的化する２つの独立したガイドＲＮＡに対するルシフェラーゼレポーターｍＲＮＡのガイドＲＮＡ標的化及びノックダウンに悪影響を及ぼさないことを実証している（図２０Ｂ）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス配列を標的とする単一または三重ｃｒＲＮＡアレイを有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３をコードするレンチウイルス遺伝子転移ベクターを開発した。（図２１Ａ）。ルシフェラーゼレポーターｍＲＮＡの５’ＵＴＲ領域及び３’ＵＴＲ領域の両方でコードされる、リーダー及びＮタンパク質ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス標的配列を含有するルシフェラーゼレポーターを構築した（図２１Ｂ）。ここに提示されるデータは、レンチウイルス伝達ベクターにおいてコードされる単一のプロモーターからの複数のガイドＲＮＡの発現が、単一のガイドＲＮＡの発現と比較して、より大きなルシフェラーゼ活性ノックダウンをもたらすことを示す（図２１Ｃ）。これらの結果は、単一のウイルスゲノムを標的化する複数のガイドＲＮＡを使用するためのより大きな有効性を実証し、複数のガイドＲＮＡが、ランダムな変異誘発を通じて、または治療的選択によって生じ得るウイルスの「脱出」をさらに防止し得るというさらなる利点を有する。
さらに、三重ガイドアレイをコードするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３発現カセットは、ＡＡＶベクター内にパッケージングされるのに十分小さく、これは有用な代替的なウイルス遺伝子療法の送達方法であり得る（図２２）。
実施例７：ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３でのインフルエンザウイルス亜型の標的化
実施例４及び６は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３がコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス配列をコードするルシフェラーゼレポーターの発現を効率的にノックダウンすることができることを実証している。複製特性に基づいて、単一ガイドＲＮＡは、すべてのコロナウイルスゲノム及びサブゲノムＲＮＡを標的とするように設計され得る。さらに、単一のプロモーターから発現されるアレイにおける複数のガイドＲＮＡの発現は、ウイルスレポーターノックダウンの増強をもたらした。
コロナウイルスと同様に、インフルエンザウイルスは、動物及びヒトの両方に感染し、世界的な大流行になる可能性が非常に高い、エンベロープ化されたＲＮＡウイルスである。コロナウイルスとは対照的に、インフルエンザウイルスは、８つの独立したウイルスＲＮＡセグメントからなり、脊椎動物の核内に局在化し、複製する（図２３Ａ）。ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）セグメントは、少なくとも１０のタンパク質をコードし、それはウイルス複製酵素、構造タンパク質、及び宿主細胞の結合及び融合に必要なエンベロープ糖タンパク質をコードする。複数セグメントのウイルスＲＮＡゲノムは、ウイルスセグメントが感染細胞内のウイルス亜型間で容易に切り替えられ得るため、迅速な変異及びウイルス選択を可能にする。これにより、エンベロープタンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）によって分類される、多様な数のインフルエンザ亜型がもたらされている。これらの特徴は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３によるインフルエンザウイルスＲＮＡの標的化された分解に対する特有の課題を提示する。
ここで提示されるデータは、最近重大なヒト疾患を引き起こし、世界的な流行になる重大な可能性を保持する４つの主要なインフルエンザＡウイルス亜型（Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２及びＨ７Ｎ９）を標的とし得るｃｒＲＮＡの設計を提示する。これらの４つの亜型にわたるウイルスタンパク質コード配列の複数の配列アラインメントを使用して、保存されたセグメントを、８つのウイルスセグメントのうちの５つについて同定した（表３）。ＨＡ及びＮＡ遺伝子についての亜型にわたる大きく保存されたウイルス配列は、同定されず、宿主免疫への回避を可能にするそれらの急速な進化と一致する。これらの５つの領域について、ガイドＲＮＡを、ネガティブセンスウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）またはポジティブセンスウイルスタンパク質コードｍＲＮＡのいずれかを標的にするように設計した。ガイドＲＮＡアレイを、単一のＰｏｌ ＩＩＩプロモーターから５つすべてのｃｒＲＮＡを発現するように設計した。
レンチウイルス遺伝子転移ベクター（またはＡＡＶなどの代替遺伝子療法ベクター）内にＣＲＩＳＰＲガイドアレイ及びＣａｓ１３発現カセットをコードすることは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３構成要素を脊椎動物細胞に送達及び発現するための単一粒子の生成を可能にするであろう（図１４）。ＮＡ及びＨＡエンベロープタンパク質を有するレンチウイルスベクターの偽型化を利用して、気道上皮などのインフルエンザウイルスによって感染される特定の細胞型を標的化することができる。
Figure 2022544015000032
Figure 2022544015000033
実施例８：種々のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３亜型による毒性核ＲＮＡ病巣の相対的ノックダウン
現在、細菌において４つのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３亜型が同定されており（Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、及びＣａｓ１３ｄ）、タンパク質配列類似性及び亜型特異的遺伝子座の特徴に従って分類されている。すべてのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３亜型は、小さいＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）によってガイドされ、それらの触媒ＲＮａｓｅ活性に必要な２つのＨＥＰＮドメインを含有する。各亜型についてのＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡは、Ｃａｓ１３結合のためのハンドルとして機能する特有のダイレクトリピート（ＤＲ）配列と、標的ＲＮＡ認識のための異なる最適なスペーサー配列長（例えば、ＰｓｐＣａｓ１３ｂについては３０ｎｔ、ＲｆｘＣａｓ１３ｄについては２２ｎｔ、ＬｗＣａｓ１３ａについては２８ｎｔ）からなる。同様に、スペーサー及びＤＲ配列の相対的な向きは、各亜型に対して特有である（例えば、Ｃａｓ１３ｂは３’ＤＲをコードするが、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｃ及びＣａｓ１３ｄは５’ＤＲをコードする）。現在、３つのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３亜型（Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ及びＣａｓ１３ｄ）のファミリーメンバーは、哺乳動物細胞において発現される場合にＲＮＡノックダウンに有効であることが示されているが、ガイドＲＮＡ標的化効率またはＣａｓ１３タンパク質安定性に起因し得る異なるノックダウン効率を示す可能性がある。後者については、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ亜型は、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰに融合しない限り、哺乳動物細胞において安定性が低いことが示されており、ＲｆｘＣａｓ１３ｄなどのいくつかのＣａｓ１３ｄファミリーメンバーは、細胞質に局在する場合、切断する効率が低下する。
毒性核ＲＮＡ病巣の分解におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３亜型（Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、及びＣａｓ１３ｄ）の相対的な切断効率を決定するために、ガイドＲＮＡを各亜型に特異的に設計して、３’ＵＴＲに位置する拡張されたＣＵＧ ＲＮＡリピートを含有するルシフェラーゼレポーター（ｐＧＬ３Ｐ－ＤＴ９６０）を標的にした（図２５Ａ）。ヒト筋緊張性ジストロフィーの特徴である拡張されたＣＵＧリピートは、必須のＭＢＮＬスプライシング因子を隔離する核ＲＮＡ病巣を誘導する。発明者らは、両方のルシフェラーゼコーディング配列（Ｌｕｃ－Ａ及びＬｕｃ－Ｂ）を標的化する各亜型のためのガイドＲＮＡ、ならびにＣＵＧリピートの３つのフレームすべてを標的化するガイド（ＣＡＧ Ｆ１、ＣＡＧ Ｆ２、及びＣＡＧ Ｆ３）を設計した。興味深いことに、堅牢なＴｙ１ ＮＬＳと融合したＰｓｐＣａｓ１３ｂ（ｅｒａｓｅＲ）及びＳＶ４０ＮＬＳの２つのコピーと融合した及びＲｆｘＣａｓ１３ｄ（ＣａｓＲｘ－ＮＬＳ）は、ルシフェラーゼ標的化ｃｒＲＮＡまたはＣＵＧ標的化ｃｒＲＮＡのいずれかで標的化した場合、ｐＧＬ３Ｐ－ＤＴ９６０レポーターの堅牢なノックダウンを示した。ＬｗＣａｓ１３ａは、最小量のレポーター活性ノックダウンを示した。Ｃａｓ１３ｄ亜型のより小さいサイズは、分裂中の細胞において古典的な核局在化配列によってそれらの局在化を可能にするが、しかしながら、堅牢なＴｙ１ ＮＬＳの付加は、核ＲＮＡを標的化するために、Ｃａｓ１３ｄ（またはＣａｓ１３ａ）の核局在化及び切断効率をさらに向上させ得る。総合すると、これらのデータは、核局在化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ及び核局在化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｄ亜型が、毒性核リピートＲＮＡをノックダウンするのに有効であることを実証している。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３亜型が毒性核ＲＮＡ病巣を分解できるかどうかを直接評価するために、発明者らは、哺乳動物細胞における核ＲＮＡ病巣の堅牢な形成を誘導するヒトＤＭＰＫ ＲＮＡ（ＤＴ９６０）の状況下で、９６０コピーのＣＵＧ拡張されたＲＮＡリピートを発現するプラスミドとＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３亜型を共発現させた。以前の結果と一致して、堅牢なＴｙ１ ＮＬＳと融合したＰｓｐＣａｓ１３ｂ（ｅｒａｓｅＲ）及びＳＶ４０ＮＬＳの２つのコピーと融合したＲｆｘＣａｓ１３ｄ（ＣａｓＲｘ－ＮＬＳ）は、ＣＵＧリピートに特異的なｃｒＲＮＡ（ＣＡＧ－Ｆ１、ＣＡＧ－Ｆ２、ＣＡＧ－Ｆ３）を使用して標的化した場合、非標的化ｃｒＲＮＡ（ＮＴ）に対して、細胞当たりの病巣数の有意な減少をもたらした（図２６Ａ及び２６Ｂ）。興味深いことに、ＬｗＣａｓ１３ａは、非標的化ガイドと比較して、核病巣の数に有意な減少を示さなかった（図２６Ｃ）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｂ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｄ亜型は、哺乳動物細胞における毒性核病巣を効率的に分解することができる。
実施例９：レンチウイルスベクターの偽型化を増強するためのＣｏＶスパイク修飾
コロナウイルス及びレンチウイルスはともに、形質導入中にウイルスと宿主細胞膜との間で宿主細胞特異性及び融合の両方を提供する膜結合スパイクエンベロープタンパク質をコードするエンベロープ化されたＲＮＡウイルスである。驚くべきことに、レンチウイルスは、他のウイルス、例えば、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、バキュロウイルス及びコロナウイルス由来のエンベロープタンパク質を利用して、改変された宿主細胞向性を提供する可能性を有する。しかしながら、コロナウイルス（ＣｏＶ）由来のウイルスエンベロープタンパク質は、Ｎ及びＣ末端修飾を有しないレンチウイルスベクターの偽型化には効率的ではなく（図２７Ａ）、これは、これらのウイルスが異なる宿主細胞分泌経路を介して生成されるという事実に起因すると考えられる。ここに提示されるデータは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１由来のスパイクタンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方の修飾が、ウイルス宿主受容体ＡＣＥ２の発現にも依存する、ヒト細胞への偽型化されたレンチウイルスベクターの効率的な形質導入に必要であることを実証している（図２７Ｂ）。同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質で偽型化されたレンチウイルスベクターのＡＣＥ２依存性形質導入にも、Ｎ末端及びＣ末端修飾が必要である（図２７Ｂ）。これらには、ヒトＣＤ５由来のシグナルペプチドの付加、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２細胞質尾部の２７アミノ酸切断が含まれる。
偽型化されたレンチウイルスベクターは、感染性因子によって標的とされる特定の治療的細胞型へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３の送達に使用することができる。おそらく最も利用されているウイルスエンベロープタンパク質であるＶＳＶ－Ｇは、ＡＣＥ２発現に依存せずに、培養物中の多様な細胞型に堅牢に侵入することを可能にするが、ＶＳＶ－Ｇ宿主受容体の基底対頂端細胞表面上の位置に起因して、インビボでの多くの細胞型の形質導入は効率が低くなる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の顕著な感染性及びそのＡＣＥ２受容体との強力な相互作用は、ＣｏＶスパイクタンパク質を利用することが、呼吸器、血管、腎臓、及び心血管細胞型を含むヒトにおける治療的に有益な組織を形質導入する特有の能力を提供し得ることを示唆する。
ＡＣＥ２－ＨＥＫ２９３Ｔ安定した細胞株の生成
ブラスチジン耐性遺伝子を担持し、ＥＦ１ａプロモーターでＡＣＥ２を発現するように改変されたヒトＡＣＥ２発現カセット（ＥＦ１ａ－ｈＡＣＥ２－Ｂｌａｓｔ）の一過性トランスフェクション及び抗生物質選択を使用して、安定したＡＣＥ２発現細胞を作製した。選択後に非ＡＣＥ２発現細胞をさらに排除するために、改変ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクエンベロープタンパク質で偽型化したピューロマイシン抗生物質耐性遺伝子をコードするレンチウイルス（４ＬＶ）を形質導入した。このアプローチのために、ピューロマイシンをコードするレンチウイルスの形質導入は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の特異性のためにＡＣＥ２発現細胞にのみ許容され、これによりブラスチジン及びピューロマイシンでのその後の安定した選択が可能となり、連続希釈を使用してクローニングされた。
本明細書に引用されるあらゆる特許、特許出願、及び公開物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して開示されているが、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態及び変形形態が当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべてのそのような実施形態及び等価の変形を含むと解釈されることが企図される。

Claims (95)

  1. ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって、前記ガイド配列が、コロナウイルスゲノムｍＲＮＡ配列またはコロナウイルスサブゲノムｍＲＮＡ配列に実質的に相補的である、ｃｒＲＮＡ。
  2. 前記ガイド配列が、コロナウイルスリーダー配列、コロナウイルスＳ配列、コロナウイルスＥ配列、コロナウイルスＭ配列、Ｎ配列、またはコロナウイルスＳ２Ｍ配列に実質的に相補的である、請求項１に記載のｃｒＲＮＡ。
  3. 前記ガイド配列が、配列番号３０８～３１４、３１６～３２１、及び３２６～３２７から選択される配列と少なくとも８０％相同な配列に実質的に相補的である、請求項１または２に記載のｃｒＲＮＡ。
  4. 前記ガイド配列が、配列番号３５６～３９１から選択される配列と少なくとも８０％相同な配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
  5. 前記ｃｒＲＮＡが、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
  6. 前記ＤＲ配列が、前記ガイド配列から３’にある、請求項５に記載のｃｒＲＮＡ。
  7. 前記ＤＲ配列が、配列番号２９１～３００から選択される配列を含む、請求項５または６に記載のｃｒＲＮＡ。
  8. 請求項１～７のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡを少なくとも２つ含む、タンデムアレイ。
  9. 各前記ｃｒＲＮＡが、ガイド配列及びダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含み、各前記ＤＲ配列が異なる、請求項８に記載のタンデムアレイ。
  10. 前記タンデムアレイが、配列番号４０２と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項８に記載のタンデムアレイ。
  11. 請求項１～８のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡまたは請求項９もしくは１０に記載のタンデムアレイを含む、組成物。
  12. 前記組成物が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１３である、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１～４６から選択される配列と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１２または１３に記載の組成物。
  15. 前記Ｃａｓタンパク質が、局在化シグナルまたは輸出シグナルをさらに含む、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 前記Ｃａｓタンパク質が、ＮＥＳを含み、前記ＮＥＳが、配列番号７５～７６と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
  17. 前記Ｃａｓタンパク質が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み、前記ＮＬＳが、配列番号６７～７４及び４２７～１０３９と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
  18. 前記Ｃａｓタンパク質が、局在化シグナルを含み、前記局在化シグナルが、配列番号７７～８３と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
  19. ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって、前記ガイド配列が、インフルエンザウイルスゲノムＲＮＡ配列またはインフルエンザウイルスサブゲノムＲＮＡ配列に実質的に相補的である、ｃｒＲＮＡ。
  20. 前記ガイド配列が、インフルエンザウイルスＰＢ２配列、インフルエンザウイルスＰＢ１配列、インフルエンザウイルスＰＡ配列、インフルエンザウイルスＮＰ配列、またはインフルエンザウイルスＭ配列に実質的に相補的である、請求項１９に記載のｃｒＲＮＡ。
  21. 前記ガイド配列が、配列番号３２８～３４７から選択される配列と少なくとも８０％相同な配列に実質的に相補的である、請求項１９または２０に記載のｃｒＲＮＡ。
  22. 前記ガイド配列が、配列番号３９２～４０１から選択される配列と少なくとも８０％相同な配列を含む、請求項１９に記載のｃｒＲＮＡ。
  23. 前記ｃｒＲＮＡが、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列をさらに含む、請求項１９～２２のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
  24. 前記ＤＲ配列が、前記ガイド配列から３’にある、請求項２３に記載のｃｒＲＮＡ。
  25. 前記ＤＲ配列が、配列番号２９１～３００から選択される配列を含む、請求項２３または２４に記載のｃｒＲＮＡ。
  26. 請求項１９～２５のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡを少なくとも２つ含む、タンデムアレイ。
  27. 各前記ｃｒＲＮＡが、ガイド配列及びダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含み、各前記ＤＲ配列が異なる、請求項２６に記載のタンデムアレイ。
  28. 前記タンデムアレイが、配列番号４０３または４０４と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項２６に記載のタンデムアレイ。
  29. 請求項１９～２５のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡまたは請求項２６～２８のいずれか１項に記載のタンデムアレイを含む、組成物。
  30. 前記組成物が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１３である、請求項３０に記載の組成物。
  32. 前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１～４６から選択される配列と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項３０または３１に記載の組成物。
  33. 前記Ｃａｓタンパク質が、局在化シグナルをさらに含む、請求項３０～３２のいずれか１項に記載の組成物。
  34. 前記Ｃａｓタンパク質が、ＮＥＳを含み、前記ＮＥＳが、配列番号７５～７６と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項３３に記載の組成物。
  35. 前記Ｃａｓタンパク質が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み、前記ＮＬＳが、配列番号６７～７４及び４２７～１０３９と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項３３に記載の組成物。
  36. 前記Ｃａｓタンパク質が、局在化シグナルを含み、前記局在化シグナルが、配列番号７７～８３と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項３３に記載の組成物。
  37. パッケージングプラスミド、転移プラスミド、及びエンベローププラスミドを含む送達システムであって、前記パッケージングプラスミドが、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記転移プラスミドが、ｃｒＲＮＡ配列をコードする核酸配列及びＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記エンベローププラスミドが、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む、送達システム。
  38. 前記エンベロープタンパク質が、コロナウイルススパイク糖タンパク質である、請求項３７に記載の送達システム。
  39. 前記エンベロープタンパク質が、配列番号１７２～１８３から選択される配列と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項３７または３８に記載の送達システム。
  40. 前記エンベロープタンパク質が、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質及びインフルエンザウイルスＮＡタンパク質から選択される１つ以上のタンパク質を含む、請求項３７に記載の送達システム。
  41. コロナウイルス感染症を治療するための方法であって、対象に、請求項１～７のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡまたは請求項８～１０のいずれか１項に記載のタンデムアレイと、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸とを投与することを含む、前記方法。
  42. 前記ｃｒＲＮＡが、コロナウイルスゲノムＲＮＡまたはコロナウイルスサブゲノムＲＮＡに結合し、前記Ｃａｓタンパク質が、前記コロナウイルスゲノムＲＮＡまたは前記コロナウイルスサブゲノムＲＮＡを切断する、請求項４１に記載の方法。
  43. インフルエンザウイルス感染症を治療するための方法であって、対象に、請求項１９～２５のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡまたは請求項２６～２８のいずれか１項に記載のタンデムアレイと、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸とを投与することを含む、方法。
  44. 前記ｃｒＲＮＡが、インフルエンザゲノムＲＮＡまたはインフルエンザサブゲノムＲＮＡに結合し、前記Ｃａｓタンパク質が、コロナウイルスゲノムＲＮＡまたは前記インフルエンザサブゲノムＲＮＡを切断する、請求項４３に記載の方法。
  45. ２つ以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む、タンデムアレイ。
  46. 各前記ｃｒＲＮＡが、ガイド配列及びダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含み、各前記ＤＲ配列が異なる、請求項４５に記載のタンデムアレイ。
  47. 各前記ＤＲ配列が、配列番号２９１～３００から個別に選択される配列を含む、請求項４６に記載のタンデムアレイ。
  48. ウイルス感染症を治療するための方法であって、対象に、請求項４５～４７のいずれか１項に記載のタンデムアレイと、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸とを投与することを含み、前記タンデムアレイが、ウイルスＲＮＡに実質的に相補的である１つ以上のｃｒＲＮＡを含む、方法。
  49. ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び
    ｂ）核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、融合タンパク質。
  50. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１３である、請求項４９に記載の融合タンパク質。
  51. 前記Ｃａｓ１３が、配列番号１～４６から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む、請求項４９または５０に記載の融合タンパク質。
  52. 前記ＮＬＳが、配列番号６７～７４及び４２７～１０３９から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  53. 前記融合タンパク質が、配列番号１５０、１５１、１６１、及び１６２から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む、請求項４９～５２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  54. 請求項４９～５３のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
  55. 対象において標的ＲＮＡの数を減少させるか、または標的ＲＮＡを切断する方法であって、前記対象に、請求項４９～５３のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項５４に記載の核酸分子と、前記標的ＲＮＡにおけるＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）酸とを投与することを含む、方法。
  56. ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び
    ｂ）蛍光タンパク質を含む、融合タンパク質。
  57. 前記Ｃａｓタンパク質が、触媒的に死んだＣａｓ１３（ｄＣａｓ１３）である、請求項５６に記載の融合タンパク質。
  58. 前記ｄＣａｓ１３が、配列番号４７～４８から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む、請求項５７に記載の融合タンパク質。
  59. 前記融合タンパク質が、局在化シグナルまたは輸出シグナルをさらに含む、請求項５６～５８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  60. 前記局在化シグナルまたは前記輸出シグナルが、配列番号６７～８３及び４２７～１０３９から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む、請求項５９に記載の融合タンパク質。
  61. 前記蛍光タンパク質が、ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｓｆＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ（１－１０）、ｓｆＧＦＰ（１－１０）－Ｌ－（１１）、及び７×Ｓ１１からなる群から選択される、請求項５６～６０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  62. 前記蛍光タンパク質が、配列番号４９～５６から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む、請求項５６～６１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  63. 前記融合タンパク質が、配列番号８４～１４９から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む、請求項５６～６２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  64. 請求項６５～６３のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
  65. 対象において標的ＲＮＡを可視化する方法であって、前記対象に、請求項５６～６３のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項６４に記載の核酸分子と、ガイド配列酸を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とを投与することであって、前記ガイド配列が、前記標的ＲＮＡにおけるＲＮＡ配列に実質的に相補的である、前記投与することと、前記標的ＲＮＡを可視化することと、を含む、方法。
  66. ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び
    ｂ）局在化シグナルまたは輸出シグナルを含む、融合タンパク質。
  67. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１３である、請求項６６に記載の融合タンパク質。
  68. 前記Ｃａｓ１３が、配列番号１～４６から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む、請求項６７に記載の融合タンパク質。
  69. 前記局在化シグナルまたは前記輸出シグナルが、配列番号６７～８３及び４２７～１０３９から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む、請求項６６～６８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  70. 前記融合タンパク質が、配列番号１５０～１７１から選択される配列、またはそれらのバリアントを含む、請求項６６～６９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  71. 請求項６６～７０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
  72. 対象において標的ＲＮＡの数を減少させるか、または標的ＲＮＡを切断する方法であって、前記対象に、請求項６６～７０のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項７１に記載の核酸分子と、ガイド配列酸を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とを投与することであって、前記ガイド配列が、前記標的ＲＮＡにおけるＲＮＡ配列に実質的に相補的である、前記投与することと、前記標的ＲＮＡを可視化することと、を含む、方法。
  73. 合成コロナウイルスエンベロープタンパク質であって、前記タンパク質が、配列番号１７２～１８３から選択されるアミノ酸配列、またはそれらのバリアントを含む、前記合成コロナウイルスエンベロープタンパク質。
  74. 請求項７３に記載の合成コロナウイルスエンベロープタンパク質をコードする、核酸分子。
  75. パッケージングプラスミド、転移プラスミド、及びエンベローププラスミドを含む、タンパク質または核酸を送達するための送達システムであって、前記パッケージングプラスミドが、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含み、前記転移プラスミドが、送達される前記タンパク質または前記核酸をコードする核酸配列を含み、前記エンベローププラスミドが、請求項７３に記載の合成コロナウイルスエンベロープをコードする核酸配列を含む、送達システム。
  76. 遺伝子またはタンパク質を呼吸器、血管、腎臓、または心血管の細胞型に送達する方法であって、前記細胞に請求項７５に記載の送達システムを施すことを含む、方法。
  77. ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって、前記ガイド配列が、拡張されたＲＮＡリピートに実質的に相補的である、ｃｒＲＮＡ。
  78. 前記拡張されたリピートが、ＣＴＧリピート、ＣＣＴＧリピート、ＧＧＧＣＣリピート、ＣＡＧリピート、ＣＧＧリピート、ＡＴＴＣＴリピート、及びＴＧＧＡＡリピートからなる群から選択される、請求項７７に記載のｃｒＲＮＡ。
  79. 前記ガイド配列が、配列番号３０１～３０６から選択される配列と少なくとも８０％相同な配列に実質的に相補的である、請求項７７または７８に記載のｃｒＲＮＡ。
  80. 前記ガイド配列が、配列番号３４８～３５４から選択される配列と少なくとも８０％相同な配列を含む、請求項７７～７９のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
  81. 前記ｃｒＲＮＡが、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列をさらに含む、請求項７７～８０のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡ。
  82. 前記ＤＲ配列が、前記ガイド配列から３’にある、請求項８１に記載のｃｒＲＮＡ。
  83. 前記ＤＲ配列が、配列番号２９１～３００から選択される配列を含む、請求項８１または８２に記載のｃｒＲＮＡ。
  84. 請求項７７～８３のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡを少なくとも２つ含む、タンデムアレイ。
  85. 各前記ｃｒＲＮＡが、ガイド配列及びダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含み、各前記ＤＲ配列が異なる、請求項８４に記載のタンデムアレイ。
  86. 請求項７７～８３のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡまたは請求項８４もしくは８５に記載のタンデムアレイを含む、組成物。
  87. 前記組成物が、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項８６に記載の組成物。
  88. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１３である、請求項８７に記載の組成物。
  89. 前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１～４６から選択される配列と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項８７または８８に記載の組成物。
  90. 前記Ｃａｓタンパク質が、局在化シグナルまたは輸出シグナルをさらに含む、請求項８７～８９のいずれか１項に記載の組成物。
  91. 前記局在化シグナルが、ＮＥＳであり、前記ＮＥＳが、配列番号７５～７６と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項９０に記載の組成物。
  92. 前記局在化シグナルが、核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり、前記ＮＬＳが、配列番号６７～７４及び４２７～１０３９と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項９０に記載の組成物。
  93. 前記局在化シグナルが、配列番号７７～８３と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項９０に記載の組成物。
  94. 拡張されたＲＮＡリピートに関連する疾患または障害を治療する方法であって、請求項７７～８３のいずれか１項に記載のｃｒＲＮＡまたは請求項８４もしくは８５に記載のタンデムアレイと、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸とを投与することを含む、方法。
  95. 前記疾患または前記障害が、筋緊張性ジストロフィー１型、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、ハンチントン病様２、脆弱Ｘ関連振戦失調症候群、脊髄小脳失調症１、脊髄小脳失調症２、脊髄小脳失調症３、脊髄小脳失調症６、脊髄小脳失調症７、脊髄小脳失調症１７、脊髄小脳失調症８、脊髄小脳失調症１０、脊髄小脳失調症３１、球脊髄性筋萎縮症、及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症からなる群から選択される、請求項９４に記載の方法。
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